NL8200828A

NL8200828A - N-acyl-polypeptiden en werkwijzen voor het bereiden en toepassen van deze polypeptiden.

Info

Publication number: NL8200828A
Application number: NL8200828A
Authority: NL
Original assignee: Sandoz Ag
Priority date: 1981-03-06
Filing date: 1982-03-02
Publication date: 1982-10-01
Also published as: DE3207311A1; ES8400082A1; IL65167A0; FI820689L; IL65167A; US4435385A; GB2095261B; FR2501199A1; ES510167A0; ES8503642A1; AU8116482A; PT74526B; NZ199911A; PT74526A; ES522916A0; DK81082A; IT1189229B; GR78227B; CA1188682A; FI820689A7

Description

r* — ......... ' it s Λ / / N-acyl-polypeptiden en werkwijzen voor het bereiden en toepassen van deze polypeptiden.

De uitvinding heeft betrekking op nieuwe N-acyl-polypeptiden , werkwijzen voor hun bereiding, farmaceutische preparaten die deze N-acyl-polypeptiden bevatten en hun toepassing als geneesmiddel.

5 De uitvinding heeft in het bijzonder betrekking op N-acyl-polypeptiden met formule 1-, waarin "Acyl" de acylrest vaneen organisch of anorganisch zuur is, A een waterstofatoom of een alkylgroep met 1-3 koolstofatomen voorstelt, ^ N-CH{Z)-CO- a) . een (L)- of (D)-fenylalaninerest waarvan de 10 ring desgewenst gesubstitueerd is door halogeen,. NO^, NH,,, OH, alkyl met 1-3 koolstofatomen en/of alkoxy met 1-3 koolstofatomen , of.

b) de rest van een natuurlijk a-aminozuur ( dat verschilt van die welke hiervoor onder a) zijn gedefinieerd,

15 of van een overeenkomstig (D)-aminozuur, weergeeft, waarbij Z

in ✓ N-CH(Z)-C0- het overblijvende van deze a) of b) rest is, B -Phe-, waarvan de ring desgewenst door halogeen, NO^, NH^, OH, alkyl met 1-3 koolstofatomen en/of alkoxy met 1-3 koolstof-• atomen is gesubstitueerd, C -Trp- of (D)-Trp-, desgewenst 20 a-N-gemethyleerd en waarvan de benzeenring desgewenst gesubstitueerd is door halogeen, NO^, , OH, alkyl met 1-3 koolstof atomen en/of alkoxy met 1-3 koolstofatomen, D -Lys-, dat desgewenst ge a-N-methyleerd en desgewenst ε-Ν-C ^ ^ gealkyleerd is, E de rest van een natuurlijk α-aminozuur óf van een overeen-25 ’> komstig (D)-aminozuur, welke rest desgewenst ge-a-N-methyleerd is en F een groep met formule -C00R1, -CHgOR^, een groep met formule 2 of 3 voorstellen, waarin een waterstofatoom of een alkylgroep met 1-3 koolstofatomen, een waterstofatoom of de rest van een fysiologisch aanvaardbare, fysiologisch hydrolyseer-30 bare ester, een waterstofatoom, een alkylgroepmet 1-3 koolstofatomen, een fenylgroep of een Cj_1Q fenylalkylgroep, een waterstofatoom, een alkylgroep met 1-3 koolstofatomen, of, indien 8200828 - 2 - u ï f een waterstofatoom of een methylgroep is, eveneens een groep met formule -CH(R,_)-X, een waterstofatoom, een -(CH^g-ÖH of -(CHgJ^-OH groep of de substituent gehecht aan het α-koolstofatoom van een natuurlijk α-aminozuur en 5 X een groep met formule -COOR^, -CH20R2 of een groep met formule b weergeven, waarin R^ en R2 de hiervoor aangegeven ï betekenissen hebben, Ry een waterstofatoom of een alkylgroep met 1-3 koolstofatomen en Rg een waterstofatoom, een alkylgroep met 1-3 koolstofatomen, een fenylgroep of een ^ fenylalkyl-10 groep voorstellen, waarbij de -CH(R^)-X groep de (D)— of (L)~ configuratie heeft en en Y2 elk een waterstofatoom vormen of tezamen een direkte binding vormen, waarbij de resten op de 2- en 7-plaats elk onafhankelijk van elkaar de (L)- of (D)-configuratie bezitten, onder de voorwaarde dat 15 i) de (L)- en/of (D)-cysteineresten slechts op de 2- en 7-plaatsen aanwezig zijn, en ii) "Acyl" geen hiervoor gedefinieerde ^N-CH(Z)-C0- rest mag voorstellen waarin de a-aminogroep ongesubstitueerd is of mono- of di-C alkyl gesubstitueerd is, 20 alsmede de zoutvormen en complexen daarvan.

In deze beschrijving en conclusies wordt met "halogeen" fluor, chloor en broom bedoeld. Volgens de gangbare praktijk bezitten de aminozuurresten aangeduid door afkortingen, zoals bijvoorbeeld -Phe-, -Cys-, de (L)-configuratie, tenzij 25 anders aangegeven.

Acylresten, zoals "Acyl", omvatten in het bijzonder de acylresten van organische carbonzuren, sulfonzuren, sulfaminezuren en carbonzuren,.alsmede hun derivaten. Geschikte acylresten zijn bijvoorbeeld de groepen: 30 1. R^CO-, waarin R"3· een alifatische, cyclo- alifatische, aromatische of heterocyclische groep, in het bijzonder een alkylgroep met 1-20 koolstofatomen, een alkenylgroep met 3-20 koolstofatomen, .een alkinylgroep met 3-20 koolstof-atomen, een fenylgroep, een nafthylgroep of een ^(fenylalkyl) 35 groep voorstelt, 8200828 • 6 . * - 3 - 2. R^SOg-, waarin R11 een alkylgroep met 1-10 koolstofatomen, een fenylgroep of een C ^ (fenylalkyl)groep voorstelt, 3. R^^O-CO-, waarin een alkylgroep met 5 1-10 koolstofatomen of een c γ_ -| 0 (f enylalkyl) groep voorstelt en

Een groep met formule 5, 6 of 7, waarin IV

R een waterstofatoom, een alkylgroep met 1-10 koolstofatomen, een fenylgroep of een C^q (fenylalkylgroep) en RV een 10 waterstofatoom of een alkylgroep met 1-10 koolstofatomen voor stellen.

Alifatische groepen, zoals voorgesteld door R^, kunnen zowel verzadigd als onverzadigd en vertakt of onvertakt zijn. Eveneens kunnen alkyl-, alkenyl- en alkinylgroepen, 15 evenals de alkylgedeelten van fenylalkylgroepen aangeduid als

IV

R -R alle zowel vertakt als onvertakt zijn. Verder kunnen

I V

alle groepen weergegeven door R -R desgewenst andere substi-

' . ' IV

tuenten bevatten. Geschikte groepen voorgesteld door R - R

zijn ongesubstitueerd.

20 In de N-acyl-polypeptiden met formule 1 verdienen de volgende betekenissen of combinaties daarvan de voorkeur: 5. "Acyl" is een R^CO- of R^SO^-groep, zoals gedefinieerd onder 1. en 2. hiervoor. Het-verdient vooral 25 aanbeveling indien "Acyl" een R^CO-groep is.

5.1 Indien "Acyl" een RIC0- groep voorstelt, is R* bij voorkeur een alkylgroep met 1-15 koolstofatomen,een fenylgroep of een ^^(fenylalkyl)groep,in het bijzonder een alkylgroep met 1-15 koolstofatomen.

30 5.2 Indien "Acyl" een RIIS02- groep weergeeft, II * is R bij voorkeur een alkylgroep met 1-10 koolstofatomen of een fenylgroep die desgewenst gesubstitueerd is door alkyl met 1-3 koolstofatomen, in het bijzonder fenyl of mono- of di-C _ alkyl gesubstitueerde fenyl. Het verdient vooral aan-

TT

35 beveling indien R een alkylgroep met 1-10 koolstofatomen is.

» te - u - 6. A is een waterstofatoom of een methylgroep, in het bijzonder een waterstofatoom.

7.1 Indien^N-CH(Z)-CO- de onder a) aangegeven betekenis heeft, is dit bij voorkeur een (L)- of (D)-fenyl- 5 alanine of (L)— of (D)-tyrosinerest (waarbij Z benzyl of p-OH-benzyl voorstelt), vooral een (D)-fenylalaninerest.

7.2 Indien deZ)-CO-groep betekenis b) heeft, is de gedefinieerde rest bij voorkeur lipofiel. Aanbevolen resten b) zijn dientengevolge resten waarin Z een alkylgroep met to 3, bij voorkeur H, of meer koolstofatomen is, in het bijzonder de (L)- of (D)-leucine en (L)- of (D)-nor-leucineresten (in welk geval Z resp, iso- en n-butyl is).

7.3 Het verdient vooral aanbeveling dat de ^N-CH(Z)-C0- groep betekenis a) heeft.

15 8. 3 stelt -Phe- voor.

9. C geeft -(D)Trp weer.

10. D is -Lys- of -MeLys-, in het bijzonder -Lys-.

11. E is de rest van een natuurlijk a-aminozuur, in het bijzonder -Thr-.

20 12. F is een groep met formule 2, in het bijzonder een groep met formule 8 (in welk geval een waterstofatoom of de methylgroep is. In het laatste geval heeft het -GH(R^)-X gedeelte bij voorkeur de L-configuratie.

12,1 stelt bij voorkeur een waterstofatoom voor.

25 12,2 Als substituent aan het a-koolstofatoom van een natuurlijk aminozuur (dat wil zeggen met formule H2N-CH(R5)-COOH), stelt R5 bij voorkeur -CHgOH, -CH(CH3)-0H, isobutyl of benzyl voor, of is Rj. -(CHgJg-OH of -(CHg^OH. Ze is in het bijzonder -CHgOH of -CH(CH3)0H.

30 12.3 X is bij voorkeur een groep met formule U

of -CHg-ORg, in het bijzonder met formule -CHgOR^ en Rg is bij voorkeur een waterstofatoom of heeft een hierna onder 13 aangegeven betekenis. Het verdient vooral aanbeveling dat R2 een waterstofatoom is.

35 13. Als rest van een fysiologisch aanvaardbare, 8200828 * -.

- 5 - fysiologisch hydrolyseerbare ester is R^ bij voorkeur HCO, C2-12~ alliylcar^ony1»een c3 ^ 2fenyl^kylcartonylsroep of de benzoylgroep.

1¾. Bij voorkeur hebben de resten op de 2- en 5 7-plaatsen de (L)-configuratie.

15. Het verdient aanbeveling dat Y1 en Yg tezamen een direkte binding vormen.

Een bijzonder belangrijke groep N-acyl-poly-peptiden met formule 1 zijn die waarin "Acyl" een acyirest

10 waarin een alifatisch gedeelte> (bijvoorbeeld als R^, R’*"*’, R

IV . *' . . . .

of R van de hiervoor gedefinieerde groepen 1.-4.; met tenminste 7, bij voorkeur tenminste 8 koolstofatomen, zijn opgenomenj voorstelt, welke verbindingen van dit type (hierna aangeduid als "N-acyl-polypeptiden van type-T") 15 gekenmerkt zijn door een langduriger werking bij sub-cutane toediening. Aanbevolen F-acyl-polypeptiden van het T-type zijn die waarin MAcyl" een R^CO- of R^SCL- groep, in het

I 7 I

bijzonder een R CO- groep, voorstelt, waarin R een alkylgroep met 7 t/m 15 koolstofatomen, bij voorkeur een alkylgroep met 20 7 t/m 10 koolstofatomen, vooral een alkylgroep met 8-15 koolstof- atomen, in het bijzonder een alkylgroep met 8-10 koolstofatomen en R^ een alkylgroep met 7 t/m 10 koolstof atomen, in het bijzonder een alkylgroep met 8-10 koolstofatomen, voorstellen.

Vooral aanbevolen worden H-acyl-polypeptiden van het T-type, 25 waarbij de overblijvende resten in formule 1 de hiervoor onder 6-15 vermelde betekenissen hebben.

De H-acyl-polypeptiden volgens de uitvinding kunnen in zoutvorm of in de vorm van complexen daarvan bestaan.

Zuuradditiezouten kunnen bijvoorbeeld worden gevormd met 30 organische zuren, polymeerzuren en anorganische zuren. Onder dergelijke zuuradditiezoutvormen vallen bijvoorbeeld de hydro- chloriden en acetaten. Onder complexen worden verbindingen van een bekend type, gevormd uit,verbindingen met formule 1

, I

onder toevoeging van anorganische materialen, bijvoorbeeld 35 anorganische zouten of hydroxyden, zoals calcium- en zinkzouten 8200828 4 » - 6 - en/of toevoeging van pólymere organische materialen, verstaan.

De onderhavige uitvinding verschaft eveneens een werkwijze voor het bereiden van de verbindingen volgens de uitvinding. Deze verbindingen kunnen worden bereid volgens 5 methoden die bekend zijn op peptidegebied of volgens voor de hand liggende, chemische equivalenten daarvan, bijvoorbeeld volgens een werkwijze die omvat: a) het verwijderen van de beschermende groep of groepen van een beschermd N-acylpolypeptide met de in 10 formule 1 aangegeven volgorde, b) het aan elkaar verbinden van twee peptide-eenheden via een amidebinding, waarbij elk van de peptide-eenheden tenminste één aminozuur-of aminoalkoholrest in beschermde of onbeschermde vorm bevat en de peptide-eenheden 15 zodanig zijn, dat een al of niet beschermd N-acyl-polypeptide * t met de in formule 1 aangegeven volgorde wordt verkregen en, indien nodig, de werkwijze van stap a) wordt uitgevoerd, c) het omzetten van de F-groep van een al of niet beschermd N-acyl-polypeptide met de in formule 1 aange- 20 geven volgorde in een andere groep F en, indien nodig, het uitvoeren van de werkwijze van stap a), d) het oxyderen van een N-acyl-polypeptide met formule 1, waarin Y^ en Yg elk een waterstofatoom voorstellen tot een N-acyl-polypeptide met formule 1, waarin Y en 25 Y2 tezamen een direkte binding vormen, en het winnen van het aldus verkregen N-acyl-polypeptide in vrije of zoutvorm of als een complex daarvan.

De hiervoor beschreven werkwijze kan bijvoorbeeld analoog aan de werkwijzen beschreven in de hierna 30 volgende voorbeelden worden uitgevoerd. Voor zover het bereiden van de uitgangsmaterialen niet in het bijznnder is beschreven, zijn de verbindingen bekend of kunnen volgens in de stand der techniek bekende methoden worden bereid en gezuiverd.

In de hierna volgende voorbeelden zijn de - 20 35 /"a7jj - waarden niet gecorrigeerd. De volgende afkortingen 8200828

« -V

4 - τ ~ werden toegepast:

AcOH = azijnzuur

AcOEt = ethylacetaat BOC = tert.-butoxycarbonyl 5 BTFA = borium-t ri s-t r ifluorae et aat DCCI = dicyclohexylcarbodiimide DMF = N, N-dimet hylformami de HOBT = N-hydroxybenzotriazool

Leu-ol = de leucinol rest 10 met formule 9 MBzl = p-methoxybenzyl

Me = methyl

MeOH = methanol NEt^ = triethylamine 15 >

PheipNO^) = p-N02~fenylalanine TFA = trifluorazijnzuur THF = tetrahydrofuran

Thr-ol = de threoninolrest met formule 10 20 Z - benzyloxycarbonyl

Voorbeeld I: __ CH„-{CH»)Q-C0-(D)Phe-Cys-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol, 3 _;_;__ 7,1 g CH^-(CHg)g-CO(D)Phe-Cys-(MBzl)-Phe-(D)Trp-

Lys(Z)-Thr-Cys-(MBzl)-Thr-ol en 5¼ ml thioanisool werden bij 25 0°C opgelost in 120 ral TFA. Daarna koelde men de oplossing af tot -1Q°C, voegde 92 ml ongeveer 2M. BTFA in TFA toe en roerde d$ oplossing 1,5 uur bij een temperatuur tussen -10°C en -5°C.

Het verkregen reaktiemengsel werd daarna onder roeren en bij -7Ö°C toegevoegd aan ^00 ml absolute MeOH en na 5 min. geroerd met een mengsel van 200 ml HCl/ethylether (λ- 5N) in 9 liter absolute ethylether.

Men filtreerde het neergeslagen prodükt af, waste het met ethylether en loste het onmiddellijk daarna op in 16 liter van een mengsel van dioxan en water (7:3). Vervolgens voegde men onder roeren ItN.NH^OH toe totdat de pH een waarde 8200828 4 * - 8 - tussen 7 en 7,5 bereikte en roerde de oplossing in een open vat totdat een onderzoek op -SH-groepen negatief was (bijvoorbeeld volgens de methode van Ellmann).

Men stelde de pH door toevoegen van verdund 5 zoutzuur in tussen ongeveer 3 en !(, concentreerde de oplossing onder verminderde druk en lyofiliseerde. Het verkregen ruwe produkt werd chromatografisch gezuiverd over silicagel, onder toepassing van een mengsel van CHCl^, MeOH, AcOH en water als elutiemiddeli Fraktiës die het gewenste produkt bevatten werden 10 samengevoegd, verdund met water, geconcentreerd en gelyofiliseerd, waardoor men de in de titel genoemde verbinding in zuivere vorm verkreeg.

/"«75° = -^3,7° (c = 0,92 in 95 % AcOH).

Het uitgangsmateriaal werd als volgt bereid: 15 a) BOC-Cys(MBzl)-Thr-ol.

Men voegde 2,1 ml N-methylmorfoline onder roeren toe aan een oplossing van 6,3 g Boc-Cys(MBzl)-OH in 50 ml THF> gevolgd door het bij -15°C toedruppelen van 2,4 ml van de isobutylesterivan chloormierezuur. Na 5 min. roeren 20 bij -15°C voegde men een oplossing van 3,3 g H-Thr-ol.hydrochloride en k,1 ml N-methylmorfoline in 30 ml DMF, die van te voren tot -10°C was gekoeld, toe. Men roerde het reaktiemengsel 2 uren bij 0°C en daarna nog 2 uren bij kamertemperatuur. Vervolgens voegde men 50 ml van een 10 %'s KHCO^-oplossing toe 25 en concentreerde het geheel onder verminderde druk· Na verdunnen met AcOEt, driemaal wassen met 2N-citroenzuur, 3x met een KHCO^-oplossing en eenmaal met een natriumchlorideoplossing, droogde men de organische fase boven natriumsulfaat en dampte deze onder verminderde druk in, waardoor men de in de titel 30 genoemde verbinding verkreeg: /"α7^° = -31° (c " 1,3 in DMF).

b) H-Cys(MBzl)-Thr-ol*trifluoracetaat«

Men loste 7,1 g BOC-Cys(MBzl)-Thr-ol en 5 ml thioanisool op in 25 ml methyleenchloride. Daarna voegde men 35 de oplossing toe aan 50 ml TFA en liet haar 20 min. staan bij 8200828 - 9 - r v •ί kamertemperatuur. Vervolgens verdunde men het mengsel met ongeveer 1,5 1 ethylether, filtreerde het neergeslagen produkt af en droogde het, waardoor men dein de titel genoemde verbinding verkreeg: 5 /"<x7jj° = 8,3 (c * 1,1 in 95 % AcOH); smpt. = 152°C.

c) BOC-Thr-Cys(MBzl)-Thr-ol Men druppéde 5,9 ml van de isobutylester van chloormierezuur toe aan een oplossing van 9,7 g Boc-Thr-OH en 9Λ ral N-methyl-morfoline in 50 ml THF, die van te voren 10 tot -25°C was gekoeld. Daarna roerde men de oplossing 5 min.

bij -15°C en voegde een oplossing van 20 g H-Cys(MBzl)-Thr-ol trifluoracetaat en 9,8 ml N-methylmorfoline in 50 ml THF, die van te voren tot -10°C was gekoeld, toe. Vervolgens roerde men het reaktiemengsel 2 uren bij 0°C en 2 uren bij kamer-15 temperatuur. Daarna voegde men 20 ml van een 10 %'s KHCO^-oplossing toe en concentreerde het mengsel onder verminderde druk. Het produkt werd verdund met AcOEt en gewassen met 2N-citroenzuur, een 10 %'s KHCO^-oplossing en daarna met een 30 %'s natriumchlorideoplossing. De AcOEt-fase werd boven 20 natriumsulfaat gedroogd en onder verminderde druk ingedampt en het verkregen residu werd herkristalliseerd uit een mengsel van MeOH, AcOEt en hexaan. De in de titel genoemde verbinding werd na verder filtreren, wassen met ether en drogen verkregen: /"a7p° = -23° U = 1 in DMF); smpt. = 117°C.

25 d) H-Thr-Cys(MBzl)-Thr-ol trifluoracetaat 150 ml TFA werden toegevoegd aan een oplossing van 16 g BOC-Thr-Cys(MBzl)-Thr-ol en 17 ml thioanisool in 100 ml methyleenchloride, van te voren gekoeld tot 0°C. Men liet dit mengsel 20 min. staan bij kamertemperatuur en roerde 30 het in ethylether. Daarna filtreerde men het neergeslagen produkt af, waste het met ethylether en droogde het, waardoor men de in de titel genoemde verbinding verkreeg: Γα7^° = +0,6° (c = 1 in 95 % AcOH); smpt.: * 72°C, e) B0C-(D)Trp-Iys(Z)-0Me 35 Men voegde 9,8 ml NEt^, 11,8 g Η0ΒΤ en 21,3 g 8200828 - 10 - B0C-(D)Trp-0H toe aan 23,3 g H-Lys(Z)-0Me.hydrochloride in 300 ml DMF en koelde deze oplossing af tot -15°C. Daarna voegde men 15,6 g DCCI in 50 ml DMF toe en roerde het reaktie-mengsel ongeveer 16 uren bij 0°C, gevolgd door 2 uren bij 5 kamertemperatuur. Vervolgens verdunde men het reaktiemengsel met een mengsel van AcOEt en ethylether en filtreerde het dicyclohexylureum af. Daarna waste men het filtraat met 2N citroenzuur, water, een 10 %'s KHCO^-oplossing en een 30 %'s natriumchlorideoplossing. Vervolgens droogde men de 10 organische fase boven natriumsulfaat en concentreerde in sterke mate onder verminderde druk. Kristallisatie vond plaats door toevoeging van een mengsel van ethylether en hexaan en hët produkt werd afgefiltreerd, gewassen met een mengsel van ethylether en hexaan en gedroogd, waardoor men de in de titel 15 genoemde verbinding verkreeg:

/"a7^° = -12,6° (c = 1 in DMF); smpt.: = 1 i+0°C

f) H-(D)Trp-Lys(Z)-0Me hydrochloride

Men voegde 150 ml TFA toe aan 30 g B0C-(D)Trp-Lys (Z)-QMe in 150 ml metbyleenchloride, die van te voren tot 0°C 20 was afgekoeld. Daarna roerde men het geheel ^0 min. bij kamertemperatuur en voegde het daarna toe aan 30 ml HC1 in ethylether (ongeveer 5N) in h liter ethylether. Na krachtig roeren filtreerde men het neerslag af, waste het met ethylether en droogde het, waardoor men de in de titel genoemde 25 verbinding verkreeg: /"a7p° = -½° (c = 1 in 95 % AcOH); smpt. = 101°C.

g) BOC-Phe-(D)Trp-Lys(Z)-OMe

Men voegde 9,5 ml NEt^, 13 g HOBT en 17 g BOC-Phe-OH toe aan 35 g H-(D)Trp-Lys(Z)-0Me.hydrochloride in 30 350 ml DMF. Men koelde de oplossing af tot -20°C en voegde 11+ ,5 g DCCI opgelost in 50 ml DMF toe. Daarna roerde men het reaktiemengsèl ongeveer 18 uren bij 0°C en vervolgens 1 dag bij kamertemperatuur. Men filtreerde het neergeslagen dicyclo-hexyl-ureum af en concentreerde het filtraat, verdunde met 35 methanol en voegde water toe totdat een neerslag ontstond.

8200828 - 11 -

Na filtreren waste men het residu met een mengsel van methanol en water (Π: 1) en droogde het, waardoor men de in de titel genoemde verbinding verkreeg: Γα7β° = +1,1° (c - 1 in DMF); sopt. = 1Ö0°C.

5 h) BOC-Phe-(D)Trp-Lys(Z)-OH

Men voegde 26 ml 1N NaOH toe aan een suspensie van 16 g BOC-Phe-(D)Trp-Lys(Z)-0Me in een mengsel van dioxan en water (8:2) en roerde het reaktiemengsel 1,5 uur bij kamertemperatuur. Daarna verdunde men de verkregen oplossing door 10 toevoegen van water tot ongeveer 500 ml en concentreerde vervolgens onder verminderde druk. Men stelde de pH door toevoegen, onder roeren, van 1N.HC1 in tussen 1,5 en 2, filtreerde het neergeslagen produkt af, waste het met water tot neutrale reaktie en droogde het, waardoor men de in de titel genoemde 15 verbinding verkreeg: /”a7^° =+7,6° (c = 1 in DMF); ontleding bij 85-90°C.

i) BOC-Phe-(D)Trp-Lys(Z)-Thr-Cys(MBzl)-Tar-ol Men voegde 2,5 ml NEt^, 11,2 g 20 B0C-Phe-(D)Trp-Lys(Z)-0H en U g HOBT toe aan 9 g H-Thr-Cys(MBzl)-Tnr-ol trifluoracetaat in 100 ml DMF. Daarna voegde men bij -20°C 3,7 g DCCI in 10 ml DMF aan de oplossing toe en roerde het geheel ongeveer 18 uren bij 0°C en 2 uren bij kamertemperatuur. Men filtreerde het neergeslagen dicyclo-25 hexyl-ureum af, concentreerde het filtraat onder verminderde druk en verdunde met methanol. Vervolgens voegde men water toe totdat het produkt begon neer te slaan. Het neerslag werd afgefiltreerd, gewassen met een mengsel van methanol en water (U: 1) en gedroogd, waardoor men de in de titel genoemde ver-30 binding verkreeg:

/~a7^ = -1U° (c = 1 in DMF); smpt. - 135°C

j) H-Pne-(D)Trp-Lys(Z)-Thr-Cys(MBzl)-Thr-ol hydrochloride

Men loste 13 g BQC-Phe-(D)Trp-Lys(Z)-Thr-Cys(MBzl)-35 Thr-ol op in 60 ml koude TFA/H^O (15:1) en liet de oplossing 8200828 - 12 - 30 min. staan bij kamertemperatuur. Daarna roerde men het reaktiemengsel in een mengsel dat 3 liter ethylether en 20 ml HC1 in ethylether (^5N) bevatte en filtreerde het neergeslagen produkt af, waste het met ethylether en droogde het, waardoor 5 men de in de titel genoemde verbinding verkreeg: /”a7^ = -3° (c = 1 in DMF); ontleding bij 110°c.

k) B0C-(D)Phe-Cys(MBzl)-OH Men voegde 7,73 g B0C-(D)Phe-0NP toe aan een oplossing van ^,Ö3 g H-Cys-(MBzl)-OH in een mengsel van 100 ml 10 dioxan en water (7:3) en 20 ml 1N.;Jia0H en roerde het verkregen reaktiemengsel 20 uren bij kamertemperatuur. Daarna verdunde men het reaktiemengsel met water en verwijderde het dioxan onder verminderde druk. Men waste de waterfase met ether en stelde de pH door toevoegen van HC1 in op 2. Men extraheerde 15 het neergeslagen produkt met een mengsel van AcOEt en ethylether, waste de organische fase met water, droogde boven natriumsulfaat en dampte onder verminderde druk in, waardoor men de in de titel genoemde verbinding als een schuim verkreeg: Γα7p° * -17° (c = 0,9 in DMF).

20 l) H-(D)Phe-Cys(MBzl)-OH hydrochloride

Men loste 5 g B0C-(D)Phe-Cys(MBzl)-0H op in 80 ml TFA en 10 ml water, waarna men de oplossing ^5 min. liet staan bij kamertemperatuur. Men verdunde de oplossing met ethylether en voegde 20 ml van een mengsel van ethylether en 25 HC1 («V/5N) toe, filtreerde het neerslag af, waste het met ethylether en droogde het, waardoor men de in de titel genoemde verbinding verkreeg: Γα7^° = -38,5° (c = 0,93 in 95 % AcOH); smpt. - 189°C.

30 m) CH_-(CEL) Q-C0-(D)Phe-Cys (MBzl)-OH

3 2 o

Men voegde 23,3 ml Hi.NaOH toe aan 10,0 g H-(D)Phe-Cys(MBzl)-OH.hydrochloride in 100 ml dioxan. Daarna druppelde men onder roeren 7 ml CH^CH^JgCOCl toe, onder gelijktijdige toevoeging van W.iJaOH, waarbij de pH op 8 35 werd gehouden. Vervolgens werd het verkregen reaktiemengsel 8200828 - 13 - nog 20 uren bij kamertemperatuur geroerd.Vervolgens werd de pH van het reaktiemengsel door toevoegen van 1+N.HC1 ingesteld op 2, het reaktiemengsel onder verminderde druk geconcentreerd, verdund met water en geextraheerd met AcOEt. Men waste de 5 organische fase met water, droogfe boven natriumsulfaat en dampte onder verminderde druk in. Het reaidu werd chromatografisch over silicagel, onder toepassing van een mengsel van methyleen-chloride en methanol als elutiemiddel, gezuiverd, waardoor men de in de titel genoemde verbinding verkreeg: 10 /~a7?° = -19,3° (o = 2,6 in BMF). sapt. = 12^°C.

- - D

n) CH3-(CH2)8-CO-(D)Phe-eys(MBzl)-Phe-(D)Trp-Lys(Z)-Thr-Cys(MBzl)aThr-ol

Men voegde 0,7 ml N-methylmorfoline toe aan een oplossing van 5*7 g H-Phe-(D)Trp-Lys(Z)-Thr-Cys(MBzl)-Thr-ol.

15 hydrochloride, 0,8 g HOBT en 2,7 g CH3-(CH2)g-C0-(D)Phe-Cys(MBzl)-0H in 60 ml DMF, Daarna koelde men de oplossing af tot -15°C, voegde 1,20 g DCCI in 10 ml DMF toe en roerde het reaktiemengsel 70 uren bij een temperatuur tussen 0 en ^°C. Men filtreerde het neergeslagen dicyclohexyl-ureum af, verdunde het filtraat met 20 MeOH en voegde onder roeren water toe totdat het produkt neersloeg. Het filtreren geschiedde na ongeveer 2 uren, waarna men het residu uitwaste met een mengsel van MeOH en water (2:1) en droogde onder verminderde druk, waardoor men de in de titel genoemde verbinding verkreeg: 25 /"a7^° - -20,5° (c = 0,8 in DMF).

De volgende verbindingen werden analoog aan de werkwijze van voorbeeld I bereid (alle vermelde verbindingen in de vorm van het acetaat): 30 8200828 - 14-

Acy 1- (D) Phe-Cys-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol «. Pfi

voorbeeld "Acyl" /“a7f in 95 % AcOH

no.

II CH3CO- -42,8° (c = 0,5) III CH3(CH2)uC0- -35,8° (c = 0,53) IV CH3(CH2)6C0- -34,0° (c = O.fcO) V CH3(CH2)7C0- -35,6° (c = 0,69) VI CH3(CH2)10C0- -36,5° (c = 0,50) VII CH3(CH2)12C0- -27,3° (c = 0,50) VIII t.C^-CO- -24,0° (c = 1,0) IX Q-C0- -33,0° (c = 1,0) X · CH3-^^-S02~ -14,3° (c = 1,0) XI Cgiyra-CO- -32,2° (c = 0,46) XII D(+)-Biotinyl -16,9° (c = 1,0) XIII CH3(CH2)9S02- -31,0° (c = 0,5) 8200828 - 15 - i-—-r

Acyl-A-Cys-B-(D)Trp-Lys-Thr-Cys-F

voorbeeld "Acyl” A B F

no.

XIV CH^CHg^CO- -(D)Phe(pïïOg)- -Phe- -Thr-ol XV CH3(CH2)10CO- -(D)Nle- -Phe- -Thr-ol XVI ClUCHjxCO- -(D)Phe- -Phe(pNCL)- -Thr-ol 3 2 0 2 XVII CH3(CH2)12C0- -(D)Phe- -Phe- -(D)Thr-NH2 XVIII CH3(CH2)12CO- -(D)Phe- -Phe- -Phe-OMe XIX CH3(CH2)12CO- -(D)Phe- -Phe- -Leu-ol

Voorbeeld XX

Ging men op analoge wijze te werk als beschreven in de voorbeelden I-XIX, echter zonder de laatste oxydatiestap, dan werden N-acyl-polypeptiden met rechte keten die overeenkomen met elk van de genoemde afzonderlijke monocyciische poly-peptiden (dat wil zeggen waarin de -Cys-resten op de 2- en 7-plaatsen niet verknoopt zijn) verkregen. Zonder de laatste oxydatiestap van de werkwijze van voorbeeld I werd dus het N-acyl-polypeptide met rechte keten en formule CH3-(CHg)Q-CO-(D)Phe-Cys-Phe-(D)Trp-Lys~Thr-Cys-Thr-ol (acetaat) Γα7η° in 95 % AcOH = -33,8°; (c = Qtk2).

m* me verkregen.

De N-acyl-polypeptiden volgens de uitvinding evenals hun farmaceutisch aanvaardbare zouten en complexen vertonen waaidevolle farmacologische eigenschappen, zoals uit proeven op dieren blijkt. In het bijzonder hebben ze een GH-secretie remmende werking, zoals bijvoorbeeld blijkt uit de verlaging van de serum GH-spiegels bij ratten.

Deze proef wordt uitgevoerd onder toepassing van mannetjesratten onder Nembutal-narcose. De N-acyl-poly-peptideproefverbinding, wordt s.c. toegediend in variërende, 8200828 - 16 - logaritmisch verspringende doses in het trajekt van ongeveer 0,1 tot 1000 yug/kg, onder toepassing van tenminste U ratten per dosis. 6o min. na de toediening werden de ratten onthoofd, het bloed verzameld en de serum GH-spiegel bepaald door radio-5 immunologische proeven.

De hiervoor beschreven proef kan worden aangepast voor het bepalen van de doeltreffendheid gedurende langdurige tijdsperioden, bijvoorbeeld door 6 of 18 uren na het toedienen de ratten te onthoofden. N-acyl-polypeptiden van het T-type, 10 zoals hiervoor gedefinieerd, zijn van bijzonder belang, omdat ze bij de hiervoor beschreven proef bij toediening in een dosering binnen het hiervoor genoemde trajekt gedurende langdurige tijdsperiodenxen tot 18 uren aktief zijn.

De genoemde N-acyl-polypeptiden, zouten en 15 complexen daarvan zijn daardoor geïndiceerd voor toepassing bij het behandelen van ziekten met een etiologie die een overmaat GH-secretie inhoudt of daarmee gepaard gaat, bijvoorbeeld voorhet behandelen van diabetes mellitus en angiopathie, evenals van acromegalie.

20 De genoemde N-acyl-polypeptiden, zouten en complexen daarvan remmen eveneens de secretie van de maag en pancreas, zoals uit standaardproeven op dieren blijkt, bijvoorbeeld volgens de methode beschreven door Doepfner en med.,

Triangle 16, 2, 105 (1977) en door Konturek en med., Scand.

25 J. Gastroent. ¢), ^23 (1971) eveneens in doseringen in het trajekt van 0,1 tot 1000 ^ig/kg.

De genoemde N-acyl-polypeptiden, zouten en complexen daarvan zijn dus verder geïndiceerd voor toepassing bij het behandelen van maag-darmstoornissen, bijvoorbeeld van 30 maagzweren, maag-darmbloedingen en acute pancreatitis.

Voor de hiervoor genoemde toepassingen ligt een geïndiceerde dagelijkse dosis tussen ongeveer 0,01 mg en ongeveer 1Ö0 mg N-acyl-polypeptide, geschikt in afzonderlijke doses 2 tot b malen daags in een eenheidsdoseringsvorm of in 35 een langzaam vrijkomende vorm toegediend. Geschikte eenheids- ___________* 8200828 -17- doseringsvormen bevatten ongeveer 0,0025 mg tot ongeveer 50 mg van een N~acyl-polypeptide volgens de uitvinding of een equivalente hoeveelheid van een farmaceutisch aanvaardbaar zout of corajdex daarvan, desgewenst tezamen met een vast of 5 vloeibaar farmaceutisch verdunningsmiddel of drager.

De onderhavige uitvinding verschaft dus eveneens 1) een N-acyl-polypeptide volgens de uitvinding en/of een farmaceutisch aanvaardbaar zout en/of complex daarvan voor toepassing als geneesmiddel, (bijvoorbeeld als remmer van de 10 GH-secretie bij het behandelen van ziekten met een etiologie die een overmaat van GH-secretie omvat of daarmee gepaard gaat, zoals diabetes mellitus, angiopathie en acromegalie of voor toepassing als remmer van de secretie in de maag of pancreas voor het behandelen van maag-darmstoornissen, zoals maagzweren, 15 maag-darmbloedingen en acute pancreatitis) evenals 2) farmaceutische preparaten die een N-acyl-polypeptide volgens de uitvinding en/of een farmaceutisch aanvaardbaar· zout en/of een complex daarvan bevatta% tezamen met een farmaceutisch aanvaardbaar verdunningsmiddel of een drager daarvoor.

20 De uitvinding heeft eveneens betrekking op een werkwijze voor het bereiden van farmaceutische preparaten door éên of een aantal N-acy1-polypeptiden volgens de uitvinding, en/of een farmaceutisch aanvaardbaar zout en/of complex daarvan, in een voor een dergelijke toepassing geschikte 25 toedieningsvorm te brengen en op de onder toepassing van deze werkwijze verkregen gevormde geneesmiddelen.

8200828

Claims

15 NOg, NBg, OH, alkyl met 1-3 koolstofatomen en/of alkoxy met 1-3 koolstofatomen, C -Trp- of (D)-Trp-, desgewenst ge-a-N-methyleerd en waarvan de benzeenring desgewenst gesubstitueerd λ is door halogeen, NOg, NHg, OH, alkyl met 1-3 koolstofatomen en/of alkoxy met 1-3 koolstofatomen, D -Lys-, desgewenst ge-ct- methy- 20 leerd en desgewenst ge e-N-C^ ^ alkyleerd, E de rest van een natuurlijk α-aminozuur of van een overeenkomstig fö}-amino- zuur,. welke rest desgewenst ge-a-N-methyleerd is, F een groep met formule -COOR^, CHgORg, een groep met formule 2 of een groep met formule 3, waarin R^ een waterstofatoom of een alkylgroep 25 met 1-3 koolstofatomen, Rg een waterstofatoom of de rest van een fysiologisch aanvaardbare, fysiologisch hydrolyseerbare ester, R^ een waterstofatoom, een alkylgroep met 1-3 koolstof- atomen, een fenylgroep of een C~_,Qfenylalkylgroep, R, een met 1-3 koolstpfa.tomen, 4 waterstofatoom, een alkylgroep/, of, mdien R^ een waterstof- 30 atoom of een methylgroep is, eveneens een groep met formule -CH(R,_)-X, R^ een waterstofatoom, een -(CHg)g-OH of -(CHg^-ÖH groep of een substituent die aan het o-koolstofatoom van een natuurlijk α-aminozuur is gehecht en X een -C00R^ of-CHgöRg groep of een groep met formule U, waarin R^ en Rg de hiervoor 35 aangegeven betekenissen hebben, Rg een waterstofatoom of een 8200828 4 - 19 - alkylgroep met 1-3 koolstofatomen en R^ een waterstofatoom, een alkylgroep met 1-3 koolstofatomen, een fenylgroep of een C^, 1Q fenylalkylgroep zijn, voorstellen, waarbij de -CH(R^)-X groep de (ü)- of (L)-configuratie bezitten en 5 Y^ en Yg elk een waterstofatoom vormen of tezamen een direkte binding vormen, waarbij de resten op de 2- en 7-plaats, onafhankelijk van elkaar, de (L·)- of (D)-configuratie bezitten, onder de voorwaarden dat: i) de (L)- en/of (D)-cysteineresten slechts 10 op de 2- en 7-plaatsen aanwezig zijn, en ii) "Acyl" niet als een hiervoor gedefinieerde rest ^N-CH(Z)-C0- aanwezig is waarin de α-aminogroep ongesubstitueerd of mono- of di-C^_12 alkyl gesubstitueerd is, alsmede de zoutvormen en complexen daarvan. 15 2. N-acyl-polypeptiden volgens conclusie 1, I II waarin "Acyl” een groep met formule R CO- cfR SO . I . . d voorstelt, waarin R een alifatische, cycloalifatische, aromatische of heterocyclische groep, in het bijzonder een alkylgroep met 1-20 koolstofatomen, een alkenylgroep met 3-20 20 koolstofatomen, een alkinylgroep met 3-20 koolstofatomen, een fenylgroep, een nafthylgroep of een C fenylalkylgroep, \ (— 1 u in het bijzonder een alkylgroep met 1-15 koolstofatomen, een fenylgroep of een ^ (fenylalkyl) groep en R een alkylgroep met 1-10 koolstofatomen, een fenylgroep of een 25 Cj .jq(fenylalkyl) groep weergeven, evenals de zoutvormen en complexen daarvan.

3. N-acyl-polypeptiden volgens conclusie 2, waarin R^ een alkylgroep met 7-15 koolstofatomen, in het bijzonder een alkylgroep met 8-15 koolstofatomen, en R^ een alkylgroep 30 met 7-10 koolstofatomen, in het bijzonder een alkylgroep met 8-10 koolstofatomen, voorstellen, alsmede de zoutvormen en complexen daarvan. 1». N-acyl-polypeptiden volgens conclusies 2 of 3, waarin"Acyl" een K^CO- groep is, alsmede de zoutvormen en 35 complexen daarvan. 8200828 - 20 -

5. N-acyl-polypeptiden volgens conclusie 1, alsmede de zuuradditiezoutvormen en complexen daarvan.

6. Een N-acyl-polypeptide volgens conclusie 1 met formule * ·

5 CH3(CH2)8-C0-(D)Phe-Cys-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol alsmede de zoutvormen en complexen daarvan. T. Werkwijze voor het bereiden van'een polypeptide, met het kenmerk, dat men een N-acyl-polypeptide als gedefinieerd in conclusie 1 bereidt door 10 a) de beschermende groep of groepen van een beschermd N-acyl-polypeptide met de in formule 1 aangegeven volgorde verwijderen, b) twee peptide-eenheden, welke elk tenminste een aminozuur- of aminoalkoholrest in een al of niet beschermde te 15 vorm bevatten via een amidebinding met elkaar verbinden, waarbij de peptide-eenheden zodanig zijn, dat een al of niet beschermd N-acyl-polypeptide met de in conclusie 1 aangegeven volgorde wordt verkregen, en, indien nodig, werkwijze stap a) uit te voeren, 20 c) groep F van een al of niet beschermd N-acyl- polypeptide met de in formule 1 aangegeven volgorde in een andere groep F om te zetten en, indien nodig, werkwijzestap a) uit te voeren, d) een N-acyl-polypeptide met formule 1 als 25 gedefinieerd in conclusie 1, waarin en Yg elk waterstof voorstellen, te oxyderen tot een N-acyl-polypeptide met formule 1 als gedefinieerd in conclusie 1, waarin Y^ en Y2 tezamen een direkte binding vormen en het aldus verkregen N-acyl-polypeptide in vrije vorm, zoutvorm of een complex daarvan te 30 winnen.

8. Farmaceutisch preparaat, dat een of een aantal N-acyl-polypeptiden volgens conclusies 1-6, en/of een farmaceutisch aanvaardbaar zout en/of een complex daarvan bevat.

9. Farmaceutisch preparaat volgens conclusie 8, 35 dat tevens een farmaceutisch aanvaardbaar verdunningsmiddel ______ 8200828 - 21 - en/of drager bevat.

10. Werkwijze voor het bereiden van een farmaceutisch preparaat, met het kenmerk, dat men een N-acyl-polypeptide sds gedefinieerd in conclusie 1, en/of een farma- 5 ceutisch aanvaardbaar zout en/of complex daarvan in een voor een dergelijke toepassing geschikte toedieningsvorm brengt.

11. Gevormde therapeutische preparaten, verkregen onder toepassing van een werkwijze volgens conclusie 10.

12. Werkwijze voor het behandelen van kwalen 10 met een etiologie die omvat of gepaard gaat met een overmaat van GH-secretie of voor toepassing als remmer van de maag-of pancreas-secretie, met het kenmerk» dat men aan een patient die hieraan lijdt een farmaceutisch preparaat volgens een der voorgaande conclusies toedient.

13. Werkwijzen als beschreven in de beschrijving en/of voorbeelden. / 8200828