NL8101068A - REAGENT AND METHOD FOR DETERMINING ALDOLASE OF THE HUMAN MUSCLE TYPE. - Google Patents
REAGENT AND METHOD FOR DETERMINING ALDOLASE OF THE HUMAN MUSCLE TYPE. Download PDFInfo
- Publication number
- NL8101068A NL8101068A NL8101068A NL8101068A NL8101068A NL 8101068 A NL8101068 A NL 8101068A NL 8101068 A NL8101068 A NL 8101068A NL 8101068 A NL8101068 A NL 8101068A NL 8101068 A NL8101068 A NL 8101068A
- Authority
- NL
- Netherlands
- Prior art keywords
- aldolase
- muscle type
- antibody
- human muscle
- reagent
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
N.0. 29.94½N.0. 29.94½
Reagens en werkwijze voor de bepaling van aldolase van het mense-lijke spiertype.__Reagent and method for the determination of human muscle aldolase.
De onderhavige uitvinding heeft betrekking op reagentia en een werkwijze voor de bepaling van aldolase van het menselijke spiertype.The present invention relates to reagents and a method for the determination of human muscle type aldolase.
Aldolase is een algemene uitdrukking voor de enzymen, die de 5 aldolcondensatie en de splitsing tussen dihydroxyacetonfosfaat en een verscheidenheid aldehyden katalyseren.Aldolase is a general expression for the enzymes, which catalyze the aldol condensation and the cleavage between dihydroxyacetone phosphate and a variety of aldehydes.
Aldolase volgens de onderhavige uitvinding is bedoeld voor een fructose difosfaat aldolase (E.C. 4* 1· 2. 13· fructose-1, β-fosfaat D-glycelaldehyd-3-fosfaat lyase) dat omkeerbaar fruc-10 tose-1,6-difosfaat tot dihydroxyacetonfosfaat en D-glycelaldehyd- 3-fosfaat ontleedt. Dit enzym neemt de hoofdstroom van het glyco-lysesysteem in en verdeelt zich in het bijzonder in hoofdzaak in de spier en draagt daarbij in aanzienlijke mate bij aan het ener-giemetabolisme· 15 Zoogdieraldolase bevat drie typen isoenzymen, dat wil zeg gen het spiertype (A type), het levertype (B type) en het hersen-type (C type). Het is bekend dat de opbouwverhouding van deze isoenzymen varieert volgens de metamorfose van het levende lichaam, zoals differentiatie van de foetale rattelever, kankervorming van 20 het organisme van de mens, de rat en dergelijke·Aldolase according to the present invention is intended for a fructose diphosphate aldolase (EC 4 * 1 · 2. 13 · fructose-1, β-phosphate D-glycelaldehyde-3-phosphate lyase) which is reversible fruc-10 tose-1,6-diphosphate decomposes to dihydroxyacetone phosphate and D-glycelaldehyde 3-phosphate. This enzyme takes up the major flow of the glycolysis system and in particular distributes mainly in the muscle, thereby contributing significantly to the energy metabolism · 15 Mammalian aldolase contains three types of isoenzymes, ie the muscle type (A type), the liver type (B type) and the brain type (C type). It is known that the build-up ratio of these isoenzymes varies according to the metamorphosis of the living body, such as differentiation of the fetal rat liver, cancer formation of the human organism, the rat and the like.
Er zijn twee gebruikelijke methoden bekend voor de bepaling van het aldolase van het menselijke spiertype, waarvan een de elektroforetische methode is en de andere een methode is, die de meting inhoudt van de ontledingsactiviteiten van twee substraten, 25 dat wil zeggen fructose-1,6-difosfaat (FDP) en fructose-1-fosfaat (FIP) voor aldolase, [FDP-ALD activiteit en FIP-ALD activiteit!]* waarbij de activiteitsverhouding (FDP/FIP) bepaald wordt.Two conventional methods are known for the determination of the human muscle type aldolase, one of which is the electrophoretic method and the other is one which involves the measurement of the decomposition activities of two substrates, ie fructose-1,6 diphosphate (FDP) and fructose-1-phosphate (FIP) for aldolase, [FDP-ALD activity and FIP-ALD activity!] * determining the activity ratio (FDP / FIP).
Deze methoden houden echter verschillende problemen in.However, these methods pose several problems.
Bij de elektroforese-methode is het probleem, dat de gemi-30 greerde punten van de menselijke aldolase isoenzymen zo dicht bij elkaar geplaatst zijn, dat de onderscheiding moeilijk is en een nauwkeurige kwantitatieve bepaling niet kan worden bereikt.The problem with the electrophoresis method is that the migrated points of the human aldolase isoenzymes are placed so close together that discrimination is difficult and accurate quantification cannot be achieved.
Bij de meetmethode van de activiteitsverhouding FDP/FIP, wordt er op gewezen, dat de uitvoering bijzonder ingewikkeld is 35 voor de meting van de FIP-ALD activiteit, hetgeen gepaard gaat met een niet-kwantitatieve bepaling.In the method of measuring the activity ratio FDP / FIP, it is pointed out that the implementation is particularly complicated for the measurement of the FIP-ALD activity, which is accompanied by a non-quantitative determination.
8101068 ί· Λ 28101068 ί Λ 2
Onlangs is er een werkwijze vermeld voor de bepaling van aldolase door middel van een radioimmunoproef door concurrentie (dubbele antilichaammethode). Bij vergelijking met de hiervoor vermelde methoden is deze methode meer uitstekend in de gevoelig-5 heid en ook in de kwantificering· Echter heeft deze methode enkele nadelen, doordat een grote hoeveelheid van het tweede antilichaam vereist is voor de scheiding van B en F, alsmede is de hanterings-methode zelf van de scheiding zeer gecompliceerd, hetgeen resulteert in eisen van een lange tijdsperiode en veel arbeidskosten.Recently, a method has been reported for the determination of aldolase by a radioimmunoassay by competition (double antibody method). Compared to the above methods, this method is more excellent in sensitivity and also in quantification. However, this method has some drawbacks in that a large amount of the second antibody is required for the separation of B and F, as well as the handling method itself of the separation is very complicated, resulting in demands of a long period of time and high labor costs.
10 Er is verder een verschijnsel waargenomen van niet-specifieke reactie.Furthermore, a phenomenon of nonspecific reaction has been observed.
De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een met radio-isotoop gemerkt aldolase antilichaam van het spiertype en een werkwijze voor de bepaling van het aldolase van het menselijke 15 spiertype door middel van een radioimmunoproef volgens de zogenaamde ,,sandwich-imethode,, onder toepassing van het hiervoor vermelde aldolase antilichaam als reagens. Volgens deze werkwijze kunnen verschillende nadelen bij de bekende werkwijzen worden opgelost of verminderd. Meer in het bijzonder is de werkwijze van de onderha-20 vige uitvinding opmerkelijk zowel wat betreft de gevoeligheid voor • de bepaling als de kwantitatieve kant van de zaak. Obk bij vergelijking met de dubbele antilichaam-methode wordt de werkwijze van de onderhavige uitvinding gekenmerkt door de punten, dat het tweede antilichaam niet vereist is; de scheidingsmethode voor B en F 25 eenvoudig en doelmatig is en de niet specifieke reactie buitenge woon gering is.The present invention relates to a radioisotope-labeled muscle type aldolase antibody and a method for the determination of the human muscle type aldolase by a radioimmunoassay according to the so-called "sandwich method" using the aforementioned aldolase antibody as a reagent. According to this method, various disadvantages can be solved or reduced in the known methods. More particularly, the method of the present invention is noteworthy both in its sensitivity to the assay and the quantitative side. Obk when compared to the double antibody method, the method of the present invention is characterized by the points that the second antibody is not required; the separation method for B and F 25 is simple and effective and the nonspecific reaction is extremely small.
Volgens de zogenaamde sandwich-methode van de onderhavige uitvinding wordt de bepaling van het aldolase van het menselijke spiertype uitgevoerd volgens de volgende trappen: 30 (a) het in aanraking brengen van een monster met een onoplosbaar gemaakt aldolase antilichaam van het spiertype, gevolgd door afscheiding van de vaste fase, (b) het in aanraking brengen van de vaste fase met een met een radioisotoop gemerkt aldolase antilichaam van het spier-type, 35 gevolgd door afscheiding van de vaste fase en (c) bepaling van de radioactiviteit van de vaste fase.According to the so-called sandwich method of the present invention, the determination of the human muscle type aldolase is performed according to the following steps: (a) contacting a sample with an insolubilized muscle type aldolase antibody, followed by secretion of the solid phase, (b) contacting the solid phase with a radioisotope-labeled aldolase antibody of the muscle type, followed by secretion of the solid phase and (c) determination of the radioactivity of the solid phase .
Het volgende zal meer in het bijzonder deze methode toelichten.The following will more specifically explain this method.
Bij de trap (a) wordt een antilichaam, onoplosbaar gemaakt ^0 door combinatie met een drager, tezamen met een monster» zoals S' φ 3 serum, enz. gexncubeerd, zodat het antigeen (aldolase van het menselijke spiertype) in het monster kan reageren met het onoplosbaar gemaakte antilichaam· Nadat de reactie voorbij is wordt de reactieoplossing verwijderd en wordt de vaste fase gewassen met 5 een bufferoplossing, gedestilleerd water* een fysiologische zoutoplossing of dergelijke.At step (a), an antibody, insolubilized ^ 0 by combination with a carrier, is incubated together with a sample, such as S 'φ 3 serum, etc., so that the antigen (human muscle type aldolase) can enter the sample reacting with the insolubilized antibody · After the reaction is over, the reaction solution is removed and the solid phase is washed with a buffer solution, distilled water *, physiological saline or the like.
Bij trap (b) wordt de bij trap (a) verkregen vaste fase tezamen met een met een radioisotoop gemerkt antilichaam gexncubeerd* daarin resulterend* dat het met radioisotoop gemerkte antilichaam 10 gecombineerd wordt met het antigeen* dat vooraf gecombineerd was met het onoplosbaar gemaakte antilichaam. Nadat de reactie voorbij is wordt de reactieoplossing verwijderd en wordt de vaste fase met een bufferoplossing, gedestilleerd water, een fysiologische zoutoplossing of dergelijke gewassen.In step (b), the solid phase obtained in step (a) is incubated together with a radioisotope-labeled antibody * resulting in * that the radioisotope-labeled antibody 10 is combined with the antigen * previously combined with the insolubilized antibody . After the reaction is over, the reaction solution is removed and the solid phase is washed with a buffer solution, distilled water, physiological saline or the like.
15 Bij trap (c) wordt de radioactiviteit van de bij trap (b) verkregen vaste fase bepaald onder toepassing van een bekend type scintilatie teller, enz..At stage (c), the radioactivity of the solid phase obtained at stage (b) is determined using a known type of scintilation counter, etc.
De radioactiviteit van het standaard antigeen is vooraf gemeten met dit bepalingssysteem om een standaardkromme van de hoe-20 veelheid antigeen tegen de radioactiviteit op te stellen. De radioactiviteit van een monster wordt gemeten met hetzelfde bepalingssysteem en vervolgens wordt de hoeveelheid antigeen in het monster bepaald uit de standaardkromme.The radioactivity of the standard antigen has been pre-measured with this assay system to produce a standard curve of the amount of antigen against the radioactivity. The radioactivity of a sample is measured with the same assay system, and then the amount of antigen in the sample is determined from the standard curve.
De bijgevoegde figuur laat een standaardkromme zien van het 25 aldolase van het menselijke spiertype verkregen volgens de radio-immunoproef in voorbeeld 11.The accompanying figure shows a standard curve of the human muscle type aldolase obtained according to the radioimmunoassay in Example 11.
De volgende beschrijving licht het reagens toe voor de met de onderhavige werkwijze te gebruiken bepaling en het aldolase antilichaam van het spiertype toe te passen bij de bereiding van het 30 reagens.The following description illustrates the reagent for the assay to be used with the present method and to use the muscle type aldolase antibody in the preparation of the reagent.
A) Het aldolase antilichaam van het spiertypeA) The aldolase muscle type antibody
Antiserum wordt verkregen door aldolase van het spiertype van een zoogdier zoals mens, konijn, hond, aap, enz. bij een ander dier te immuniseren.Antiserum is obtained by immunizing the muscle type aldolase of a mammal such as human, rabbit, dog, monkey, etc. in another animal.
33 Het immune dier wordt bij voorkeur gekozen uit vogelsoorten, omdat aldolasen van het spiertype geen wezenlijk immunologisch verschil tussen de zoogdieren laten zien. Voorbeelden van vogels die de voorkeur verdienen zijn hoenders, kalkoenen, eenden en dergelijke.The immune animal is preferably selected from avian species, because muscle type aldolases do not show a substantial immunological difference between the mammals. Preferred examples of birds are fowl, turkeys, ducks and the like.
kO Bij de zuivering van het verkregen antiserum kan een werkwij- 8101068 .. τ · * ze gebruikt worden, die de toevoeging van het geïnactiveerde serum van het dier, dat de bron van het aldolase van het spier-is typeren de verwijdering door absorptie van het andere onzuivere antilichaam, een affiniteitschromatografie onder toepassing van 5 een drager gecombineerd met het aldolase van het spiertype en dergelijke, inhoudt· B) Met radioisotoop gemerkt aldolase antilichaam van het spiertypekO In the purification of the obtained antiserum, a method can be used which typifies the addition of the inactivated serum of the animal, which is the source of the aldolase of the muscle, the removal by absorption of the other impure antibody, an affinity chromatography using a carrier combined with the muscle type aldolase and the like, · B) Radioisotope-labeled muscle type aldolase antibody
Het merken van het aldolase antilichaam van het spiertype 10 door middel van een radioisotoop kan volgens elke gebruikelijke methode worden bereikt·Labeling of the muscle type 10 aldolase antibody by radioisotope can be accomplished by any conventional method
Bijvoorbeeld wordt het merken uitgevoerd volgens de chloor- 125 131 amine T methode onder toepassing van J, J, enz. als het radioisotoop of een dergelijke methode.For example, the labeling is performed according to the chlorine-125 131 amine T method using J, J, etc. as the radioisotope or the like method.
15 C) Het onoplosbaar gemaakte aldolase antilichaam van het spiertypeC) The insolubilized muscle type aldolase antibody
Als drager wordt gebruik gemaakt van een onoplosbare vaste stof, die gecombineerd kan worden met een antilichaam. Tot voorbeelden van dergelijke vaste stoffen behoren bijvoorbeeld poly-20 styreen, cellulose, agarose, glas, verknoopt dextran, metaal, enz.. Er kan een vorm vermeld worden zoals een buis, een microtiter-plaat, een poeder, een bol, een schijf, een plaat, een foelie, enz..An insoluble solid, which can be combined with an antibody, is used as the carrier. Examples of such solids include, for example, poly-styrene, cellulose, agarose, glass, cross-linked dextran, metal, etc. There may be mentioned a form such as a tube, a microtiter plate, a powder, a sphere, a disc , a plate, a foil, etc.
Bij de polystyreen microtiter-plaat kan het antilichaam gecombineerd worden met het wandoppervlak van de plaat, wanneer het 25 antilichaam op geschikte wijze verdund is met een bufferoplossing of dergelijke, waarna de verdunde oplossing aan de plaat wordt toegevoegd en het geheel tenslotte wordt bewaard.In the polystyrene microtiter plate, the antibody can be combined with the wall surface of the plate when the antibody is suitably diluted with a buffer solution or the like, after which the diluted solution is added to the plate and the whole is finally stored.
De voorafgaande beschrijvingen zijn gedaan met betrekking tot de sandwich-methode, maar het aldolase van het menselijke spier-30 type kan ook bepaald worden volgens de immunoradiometrische proef onder toepassing van een met radioisotoop gemerkt aldolase antilichaam van het spiertype, dat het reagens van de onderhavige uitvinding is. Deze werkwijze omvat de reactie van het met radioisotoop gemerkte antilichaam met een monster (antigeen), gevolgd 35 door scheiding van het met radioisotoop gemerkte antilichaam-anti-geen-reagens (B) van niet-omgezet met radioisotoop gemerkte antilichaam (F) en de bepaling van de radioactiviteit van zowel (B) als (F). Als methode voor de scheiding van (B) en (F) kan de gel-filtratie-methode, de absorptiemethode door middel van onoplosbaar ifO gemaakt antigeen, enz. vermeld worden. .The foregoing descriptions have been made with respect to the sandwich method, but the human muscle type aldolase can also be determined by the immunoradiometric assay using a radioisotope-labeled muscle type aldolase antibody which is the reagent of the present invention. This method involves reaction of the radioisotope-labeled antibody with a sample (antigen), followed by separation of the radioisotope-labeled antibody anti-no reagent (B) from unreacted radioisotope-labeled antibody (F) and the determination of the radioactivity of both (B) and (F). As the method for the separation of (B) and (F), the gel filtration method, the absorption method by insoluble ifO rendered antigen, etc. can be mentioned. .
8101068 /8101068 /
De volgende experimenten en voorbeelden zullen de onderhavige uitvinding toelichten#The following experiments and examples will illustrate the present invention #
Experiment 1Experiment 1
Aldolase antilichaam van het menselijke spiertype 5 1 mg aldolase van het menselijke spiertype werd opgelost in 0,5 ml van een fysiologische zoutoplossing en de oplossing werd gemengd met het gelijke volume van een compleet toevoegsel volgens Freund. Hep produkt werd geïmmuniseerd door subcutane injectie bij een hoender (witte Leghorn) met intervallen van 1 week, 10 zodat de injecties tot vijfmaal kunnen bedragen. Eén week na de laatste immunisering werd het bloed verzameld uit de hoender, waarbij een anti-serum werd verkregen.Human muscle type aldolase antibody 5 mg of the human muscle type aldolase was dissolved in 0.5 ml of physiological saline and the solution was mixed with the equal volume of a complete Freund additive. The product was immunized by subcutaneous injection into a chicken (white Leghorn) at 1 week intervals, so that the injections can be up to five times. One week after the last immunization, blood was collected from the chicken to obtain an anti-serum.
TMTM
10 g Sepharose 4B— (handelsmerk van Pharmacia Fine Chemicals ABj agarose), dat geactiveerd was met broomcyanide en 15 10 mg aldolase van het menselijke spiertype werden een nacht bij10 g Sepharose 4B— (trademark of Pharmacia Fine Chemicals ABj agarose), which was activated with cyanogen bromide, and 10 mg human muscle type aldolase were left overnight
If°C bewaard in 15 ml van een 0,1 molaire bufferoplossing van na-triumcarbonaat (pH 9*0).If ° C stored in 15 ml of a 0.1 molar buffer solution of sodium carbonate (pH 9 * 0).
De verkregen Sepharose gel gecombineerd met het aldolase van het menselijke spiertype werd in een kolom gepakt en gewassen 20 met 0,05 molair van een tris-zoutzuur-bufferoplossing (pH 8,0), die 0,5 N natriumchloride bevatte. Aan deze kolom werd het hiervoor vermelde aldolase anti-serum van het menselijke spiertype toegevoegd en het anti-serum werd uitgestroomd met 0,05 molaire tris-zoutzuur-bufferoplossing (pH 8,0), die 0,5 N natriumchloride 25 bevatte. Daarna werd een 0,1 molaire oplossing van natriumcarbo-naat in water aan de kolom toegevoegd om het aldolase antilichaam van het menselijke spiertype te elueren. De fractie van het anti-lichaam-eluaat werd aan dialyse onderworpen met een 0,05 molaire tris-zoutzuur-bufferoplossing (pH 8,0), waarbij 3 mg aldolase 30 antilichaam van het menselijke spiertype verkregen werden.The resulting Sepharose gel combined with the human muscle type aldolase was packed in a column and washed with 0.05 molar of a tris hydrochloric acid buffer solution (pH 8.0) containing 0.5 N sodium chloride. To this column, the aforementioned human muscle type aldolase anti-serum was added and the anti-serum was spouted with 0.05 molar tris hydrochloric acid buffer solution (pH 8.0) containing 0.5 N sodium chloride. Then, a 0.1 molar aqueous solution of sodium carbonate was added to the column to elute the human muscle type aldolase antibody. The fraction of the antibody eluate was dialyzed with a 0.05 molar tris hydrochloric acid buffer solution (pH 8.0) to obtain 3 mg of human muscle type aldolase 30 antibody.
Experiment 2Experiment 2
Onoplosbaar gemaakt aldolase antilichaam van het menseli.jke spiertypeInsolubilized aldolase antibody of the human muscle type
Aan elk van de holten aangebracht op een polystyreen micro-35 titerplaat werden telkens 200^,ul oplossing van het aldolase antilichaam van het menselijke spiertype toegevoegd, dat was ingesteld op 0D-ort = 0,10 en het geheel werd een nacht bij k°C 2o0 m jo.200 µl solution of the aldolase antibody of the human muscle type, which was set at 0D -ort = 0.10, was added to each of the cavities on a polystyrene micro-35 titre plate and the whole was left overnight at k °. C 2o0 m jo.
bewaard. De oplossing werd van de plaat verwijderd. De plaat werd met gedestilleerd water gewassen, waarbij de micro-titerplaat ge-Z*0 combineerd met het aldolase antilichaam van het menselijke spier- 8101068 b type werd verkregen.kept. The solution was removed from the plate. The plate was washed with distilled water to yield the micro-titer plate Z-0 combined with the aldolase antibody of the human muscle 8101068 b type.
Voorbeeld I 125Example I 125
Met J-gemerkt aldolase antilichaam van het menselijke spier-typ® 125 5 Na «J van 250^u curie (IQ^ul), 0,5 M fosfaatbuffer (pH 7j4) (12 ,5^ul), aldolase antilichaam van het menselijke spiertype (1,85 mg/ml) (10yUl) en chlooramine-T (3 mg/ml) (12,5^u1) werden 20 seconden met elkaar omgezet in een kleine proefbuis, die met een polysiloxan bekleed is. Nadat de reactie voorbij was werden 10 6 mg/ml (25yUl) natriummetabisulfiet aan het mengsel toegevoegdJ-labeled aldolase antibody of the human muscle typ® 125 5 Na «J of 250 µl curia (100 µl), 0.5 M phosphate buffer (pH 7 µ4) (12.5 µl), aldolase antibody of the human muscle type (1.85 mg / ml) (10 µL) and chloramine-T (3 mg / ml) (12.5 µL) were converted for 20 seconds in a small test tube coated with a silicone. After the reaction was completed, 6 mg / ml (25 µL) sodium metabisulfite was added to the mixture
om de reactie te doen ophouden. Aan het verkregen mengsel werden kaliumjodide (50 mg/ml) (12,5yUl) en 2 % ei albumine (250yUl) in een 0,05 molaire fosfaatbuffer toegevoegd. Het geheel werd vervolgens onderworpen aan asen gelfiltratie door middel van Sephadex TMto stop the reaction. Potassium iodide (50 mg / ml) (12.5 µL) and 2% egg albumin (250 µL) in a 0.05 molar phosphate buffer were added to the resulting mixture. The whole was then subjected to ash gel filtration using Sephadex ™
15 G-25~~ (handelsmerk van Pharmacia Fine Chemicals AB; verknoopt 125 dextran), zodat het vrije J kan worden verwijderd. Aldus werd 125 met J gemerkt aldolase antilichaam van het menselijke spiertype verkregen, waarvan de specifieke activiteit 11,6^u curie/yUg was.15 G-25 ~~ (trademark of Pharmacia Fine Chemicals AB; 125 dextran cross-linked) so that the free J can be removed. Thus, 125 J-labeled aldolase antibody of the human muscle type was obtained, the specific activity of which was 11.6 µ curie / µUg.
20 Voorbeeld IIExample II
Radioimmunoproef (sandwich-methode)Radio immunoassay (sandwich method)
Aan elk vah de holten, die verschaft waren op een microti terplaat gecombineerd met aldolase antilichaam van het menselijke spiertype, werden respectievelijk 100^ul van de standaard-op-25 lossing van aldolase van het menselijke spiertype toegevoegd. Het geheel werd 2 uren bij 37°G omgezet. Nadat de reactie voorbij was werd de bovenstaande laag verwijderd en werd de rest driemaal gewassen met een fysiologische zoutoplossing. Aan de gewassen hol- 125 ten werden vervolgens respectievelijk lOO^ul van met J gemerkt 30 aldolase antilichaam van het menselijke spiertype toegevoegd (ongeveer 200.000 cpm). Het geheel werd 16 uren bij kamertemperatuur omgezet. Nadat de reactie voorbij was werd de bovenstaande laag verwijderd* De rest werd driemaal met een fysiologische zoutoplossing gewassen. Nadat het aanwezige water grondig was uitge-35 put, werd de plaat gesneden en werden de respectievelijke holte-gedeelten van elkaar gescheiden. De afzonderlijke evenmatige hoeveelheden werden respectievelijk in kleine proefbuizen geplaatst. De radioactiviteit werd geteld met een bekende scintilatie-teller. Zoals aangegeven in de figuur werd de standaardkromme ver-40 kregen, waarin ongeveer 8 - 1000 ng/ml als meettrajecten waren 8101068 7 uitgezet. In de figuur geeft de horizontale as (logaritme) de concentratie (ng/ml) van aldolase van het menselijke spiertype en de vertikale as de radioactiviteit (cpm) aan.To each of the wells provided on a microtiter plate combined with human muscle type aldolase antibody were added 100 µl of the standard solution of human muscle type aldolase, respectively. The whole was reacted at 37 ° G for 2 hours. After the reaction was over, the supernatant was removed and the residue was washed three times with physiological saline. To the washed cavities were then added 100 µl of J-labeled human muscle type aldolase antibody (approximately 200,000 cpm). The whole was reacted at room temperature for 16 hours. After the reaction was over, the supernatant was removed. The residue was washed three times with physiological saline. After the water present was thoroughly exhausted, the plate was cut and the respective cavity portions separated. The individual aliquots were placed in small test tubes, respectively. The radioactivity was counted with a known scintilation counter. As indicated in the figure, the standard curve was obtained, in which about 8-1000 ng / ml were plotted as measurement ranges. In the figure, the horizontal axis (logarithm) indicates the concentration (ng / ml) of human muscle type aldolase and the vertical axis indicates radioactivity (cpm).
Aldolasen van het menselijke spiertype in verschillende men-5 selijke sera werden vervolgens bepaald door middel van het hiervoor vermelde proefsysteem. Aldus werden de gegevens waargenomen» dat aldolase van het menselijke spiertype van 25 normale individuen 165 - bO ng/ml bedroegen» die alle minder waren dan 210 ng/ml* Daarentegen vertoonden de aldolasen van het menselijke 10 spiertype van 20 kankerpatiënten hogere waarden dan 210 ng/ml, uitgesloten twee voorbeelden. De 20 kankerpatiënten betroffen 7 hepatomae, 8 maagkankerpatienten, 3 dikke darm kankerpatiënten en 2 leverkankerpatienten.Human muscle type aldolases in various human sera were then determined by the aforementioned test system. Thus, the human muscle type aldolase from 25 normal individuals was observed to be 165 - bO ng / ml, all of which were less than 210 ng / ml * In contrast, the human muscle aldolases of 20 cancer patients showed higher values than 210 ng / ml, two examples excluded. The 20 cancer patients involved 7 hepatomae, 8 gastric cancer patients, 3 colon cancer patients and 2 liver cancer patients.
81010688101068
Claims (4)
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2799680A JPS56125667A (en) | 1980-03-07 | 1980-03-07 | Reagent for measurement and measuring method for human muscle type aldolase |
| JP2799680 | 1980-03-07 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NL8101068A true NL8101068A (en) | 1981-10-01 |
Family
ID=12236425
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NL8101068A NL8101068A (en) | 1980-03-07 | 1981-03-05 | REAGENT AND METHOD FOR DETERMINING ALDOLASE OF THE HUMAN MUSCLE TYPE. |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS56125667A (en) |
| BE (1) | BE887828A (en) |
| CA (1) | CA1141291A (en) |
| CH (1) | CH651933A5 (en) |
| DE (1) | DE3107268A1 (en) |
| FR (1) | FR2477573A1 (en) |
| GB (1) | GB2071318B (en) |
| IT (1) | IT1136853B (en) |
| NL (1) | NL8101068A (en) |
| SE (1) | SE8101404L (en) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4649039A (en) * | 1984-07-03 | 1987-03-10 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Radiolabeling of methionine-containing proteins and peptides |
| JPH0672893B2 (en) * | 1985-08-16 | 1994-09-14 | 富士薬品工業株式会社 | Determination of human prolyl hydroxylase in human blood by radioimmunoassay. |
| WO2006067792A2 (en) * | 2004-12-22 | 2006-06-29 | Yeda Research And Development Co. Ltd. At The Weizmann Institute Of Science | Aldolase autoantigens useful in diagnosis and treatment of alzheimer's disease |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5648894A (en) * | 1979-09-25 | 1981-05-02 | Eisai Co Ltd | Reagent for measuring human muscular aldolase and its determination |
-
1980
- 1980-03-07 JP JP2799680A patent/JPS56125667A/en active Pending
-
1981
- 1981-02-26 DE DE19813107268 patent/DE3107268A1/en not_active Withdrawn
- 1981-03-02 CH CH1389/81A patent/CH651933A5/en not_active IP Right Cessation
- 1981-03-03 FR FR8104174A patent/FR2477573A1/en active Pending
- 1981-03-04 IT IT20117/81A patent/IT1136853B/en active
- 1981-03-04 SE SE8101404A patent/SE8101404L/en unknown
- 1981-03-05 NL NL8101068A patent/NL8101068A/en not_active Application Discontinuation
- 1981-03-06 GB GB8107059A patent/GB2071318B/en not_active Expired
- 1981-03-06 CA CA000372438A patent/CA1141291A/en not_active Expired
- 1981-03-06 BE BE0/204036A patent/BE887828A/en not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3107268A1 (en) | 1982-01-07 |
| IT8120117A0 (en) | 1981-03-04 |
| BE887828A (en) | 1981-07-01 |
| CH651933A5 (en) | 1985-10-15 |
| CA1141291A (en) | 1983-02-15 |
| IT1136853B (en) | 1986-09-03 |
| GB2071318B (en) | 1983-08-24 |
| SE8101404L (en) | 1981-09-08 |
| GB2071318A (en) | 1981-09-16 |
| JPS56125667A (en) | 1981-10-02 |
| FR2477573A1 (en) | 1981-09-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI60720C (en) | FOERFARANDE OCH MEDEL FOER BESTAEMNING AV AKTIVITETEN AV KREATINKINAS-MB | |
| Cohn | [107] Methods of isolation and characterization of mono-and polynucleotides by ion exchange chromatography | |
| US4366242A (en) | Method and agent for the immunological determination of enzymes | |
| EP0070033B1 (en) | Quantitative determination of adenosine | |
| JPH10511776A (en) | Receptor: free ligand (Reland) complex and assays and kits based thereon | |
| NL8101068A (en) | REAGENT AND METHOD FOR DETERMINING ALDOLASE OF THE HUMAN MUSCLE TYPE. | |
| JPH0138479B2 (en) | ||
| US4237044A (en) | Antibodies against creatinekinase-M8 and process for the production thereof | |
| US4808522A (en) | Enzyme immunoassays using inorganic pyrophosphatase | |
| JPH0215827B2 (en) | ||
| CA1158549A (en) | Enzyme-labelled muscle type aldolase antibody | |
| Mendicino et al. | Role of enzyme interactions in the regulation of gluconeogenesis: phosphorylation of fructose 1, 6-bisphosphatase and phosphofructokinase by kidney protein kinase | |
| Bârzu et al. | Spectrophotometric method for assay of mitochondrial oxygen uptake: II. Simultaneous determination of mitochondrial swelling, respiration, and phosphate esterification | |
| JPH079428B2 (en) | Immunoassay method | |
| CN112904009A (en) | Magnetic microsphere detection kit for detecting glycosylated CD59 and application thereof | |
| US4330620A (en) | Method and reagent for the determination of creatine kinase MB | |
| Braun | Approaches to the top advances in analytical chemistry, 1935–1985 | |
| US5460975A (en) | Diphenylmethane derivatives, process for their production and their use for the displacement of iodothyronines from proteins which bind them | |
| Eckert | Radioimmunoassay | |
| EP0137822B1 (en) | Specific antibody to the native form of 2'5'-oligonucleotides, the method of preparation and the use as reagents in immunoassays or for binding 2'5'-oligonucleotides in biological systems | |
| EA012438B1 (en) | A method and kit for determination of thymidine kinase activity and use thereof | |
| JPS6140066B2 (en) | ||
| NO860167L (en) | PROCEDURE FOR DETERMINING THE ACTIVITY OF THE BLOOD COMPLEMENT SYSTEM. | |
| JPH0815261A (en) | Method for producing immunoassay material | |
| RU2203495C2 (en) | Method for liposomal immunoassay for detecting analytes in sample |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A85 | Still pending on 85-01-01 | ||
| BV | The patent application has lapsed |