NL8004791A

NL8004791A - Verbinding met anthelminthische en acaricide werking.

Info

Publication number: NL8004791A
Application number: NL8004791A
Authority: NL
Original assignee: Sankyo Co
Priority date: 1979-08-23
Filing date: 1980-08-25
Publication date: 1981-02-25
Also published as: US4346171A; AU3081484A; FR2463773A1; JPH0217555B2; GB2056986A; ES494435A0; DE3031756C2; NZ194742A; JPS5632481A; IL60861A; ES8106177A1; SU1011055A3; IT8068315A0; GB2056986B; MX6259E; BR8005337A; HU189473B; DE3031756A1; FR2463773B1; IL60861A0

Description

\ -1- * Λ

A

803293/BZ/vL

Korte aanduiding: Verbinding met anthelminthische en acaricide werking

De uitvinding heeft betrekking op een nieuwe met B-41D aangeduide verbinding, bereid door kweken van micro-organismen van het geslacht Streptomyces, met waardevolle acaricide en anthelminthische werking.

Volgens het Britse octrooischrift 1.390.336 leveren micro-orga-5 nismen van het geslacht Streptomyces, in het bijzonder de Streptomyces stam B-41-146 (Ferm 1438), de antibiotische stof B-41, die in negen verschillende bestanddelen kan worden gesplitst die in de beschrijving met A^, Ag, Α^, A^, B^, Bg, Bg, en Cg zijn aangegeven. Later heeft men gevonden dat vier andere verbindingen met gelijksoortige struktuur kunnen 10 worden verkregen door dezelfde Streptomyces stam te kweken. De struktuur en de eigenschappen van deze dertien verbindingen zijn o.a. beschreven in J. Antibiotics 29 (3), biz. 76-14 tot 76-l6 en 29 (6), blz. 76-35 tot 76-42.

Het Britse octrooischrift 1.390.336 vermeldt dat het complex van 15 de gezamenlijke B-41-stoffen alsmede elke stof afzonderlijk insecticide-en acaricide-eigenschappen bezit. Het Amerikaanse octrooischrift 4.144.352 vermeldt dat deze en aanverwante verbindingen eveneens anthelminthische werkzaamheid bezitten. In het Amerikaanse octrooischrift 1)-.1¼.352 worden de B-4 1 -verbindingen aangeduid met ,,milbeInycinen,,. Ter 20 vereenvoudiging worden in de onderhavige beschrijving deze bekende verbindingen eveneens met "milbemycinen" aangeduid, hoewel het duidelijk is dat een aantal van deze verbindingen dezelfden zijn als de verbindingen waaruit B—1 bestaat, die in het Britse octrooischrift 1.390.336 zijn beschreven. In de Amerikaanse octrooischriften 4.093.629 en 4.134.973 25 zijn verschillende milbemycinederivaten beschreven.

De dertien milbemycineverbindingen die men bereiden kan door kweken van Streptomyces B—4l—146 bezitten de formules 1, 2 en 3 van het formuleblad. Milbemycine a. bezit de struktuur met formule 1. De bete- 1 i"103 4 5 .. .

kems van de groepen E , B , R , R en R zijn m tabel A weergegeven, 30 waarin bovendien indien van toepassing de overeenkomstige in het Britse octrooischrift 1.390.336 gebruikte B-41-aanduiding is aangegeven. Van de dertien bekende door de Streptomyces stam B—41—146 gevormde verbindingen bezitten de milbemycinen een struktuur die het meest met de nieuwe B-41D-verbinding volgens de onderhavige uitvinding overeenkomt en waar- 1 5 35 van de betekenis van de groepen R -R met betrekking tot verbinding B-41 eveneens in tabel A zijn aangegeven.

8004791 -2-

Ih deze tabel worden de volgende afkortingen gebruikt: MH stelt een 2-methylhexanoyloxygroep met formule 1+ van het formuleblad en PC een 2-pyrrolylcarbonyloxymethylgroep met formule 5 Tan het for- 5 muleblad voor.

TABEL A

Milbemycine R1 R2 R3 R^ R5 B-41 α1 Η H CH3 CH3 OH A3 a2 Η H CH3 CH3 0CH3 B2 10 a3 Η H C2H5 CH3 OH A^ Η H Q£L CH3 0CH3 B3 «5 OH MH CH3 CH3 OH A2 a, OH MH CH_ 0Ho 0CHo B, o 3 3 3 1

ct7 OH MH C2H5 CH3 OH

15 ct„ OH MH C_Hc CH_ OCH_ o 2 5 3 3 Η H CH3 PC OH C1 a10 Η H C2H5 PC OH C2

Η H CH(CH3)2 CH3 OH D

De struktuur van milbemycine 3. en 3„ is weergegeven met formu- 6 ' ^ 20 le 2 van het formuleblad, waarin R voor milbemycine 3 ^ een methylgroep en voor milbemycine 32 een ethylgroep voer stelt. Milbemycine 3^ komt overeen met de verbinding B-U1A^ van het Britse octrooischrift 1.390.336.

De struktuur van milbemycine 33 is weergegeven met formule 3 van het formuleblad.

25 Aanvraagster heeft nu een nieuwe verbinding gevonden, die men vol gens dezelfde fermentatiemethode als die welke voor de bereiding van milbemycinen wordt toegepast, kan bereiden, maar waarvan de acaricide en anthelminthische werking beter is.

De onderhavige uitvinding heeft derhalve betrekking op de verbin- 30 ding B-41D met formule 6 van het formuleblad.

De uitvinding heeft eveneens betrekking op een werkwijze voor de bereiding van verbinding B-U1D door kweken van een de verbinding B-L1D vormend micro-organisme van het geslacht Streptomyces in een daarvoor geschikt kweekmedium en scheiden van verbinding B-1+1D van het kweekmedium.

35 De uitvinding heeft verder betrekking op een werkwijze voor de 8004791 + · -3- bereiding van een anthelmi'nthische en acaricide-samenstelling, waarbij een de verbinding B-l)1D-vormend micro-organisme van het geslacht Streptomyces in een daarvoor geschikt medium gekweekt wordt en het medium geconcentreerd en gezuiverd wordt onder vorming van een samenstelling die 5 tenminste 25 gew.$ verbinding B-U1D bevat.

Verbinding B-1)1D met de bovengenoemde formule bezit de volgende fysische en chemische eigenschappen: (1) Uiterlijk: amorf poeder of kristallen.

(2) Elementair analyse 10 Berekend voor G^E^O^: C, 71,09?; H, 8,80$; 0, 20,11$.

Gevonden: C, 71,^0$; H, 8,82$; 0, 20,22$.

(3) Molecuulgewicht: 556.

{b) Ultravioletabsorptiespectrum: zie fig. 1 van de tekening.

15 Absorptiemaxima bij 237 m^u (schouder, & = 29^00) en 2^3 m^u (ε = 30500).

(5) Infraroodabsorptiespectrum (KBr tablet): zie fig. 2 van de tekening .

(6) Kernmagnetisch res.onantiespeetrum bij 100 MHz in CDCl^ met tetra-20 methylsilaan als inwendige standaard: zie fig. 3 van de tekening.

(7) Oplosbaarheid: gemakkelijk in ethylacetaat, aceton, ethanol en methanol oplosbaar.

Nauwelijks oplosbaar in water.

(8) Dunne-laag—chromatografie op silicagel (Kieselgel 60 F Merck 25 Co.), ontwikkeld met een mengsel van dioxan en tetrachloorkoolstof in de volumeverhouding 18 : 82:

Rf-waarde = 0,1)-0.

Men kan verbinding B-1)-1D bereiden door een micro-organismen van het geslacht Streptomyces, in het bijzonder Streptomyces B-b\-lb6 30 (Ferm 1U38) te kweken. De morfologische, kweek- en fysiologische eigenschappen alsmede de taxonomische eigenschappen van stam B—U1—1k6 zijn nauwkeurig in het Britse octrooischrift 1.390.336 beschreven. Deze stam is gedeponeerd bij het Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science en Technology, Ministry of International Trade and 35 Industry, Japan, alwaar' het verkrijgbaar is onder nummer Ferm 11)-38 (ook bekend als "Bikoken-kinki 11)38").

Zoals bekend neigt Streptomyces tot natuurlijke mutaties en tot en ft l 7 o 1 -lj~ mutaties bij toepassing van kunstmatige behandelingen zoals bij voorbeeld ultraviolette bestraling, ioniserende bestraling of chemische behandeling. Dit geldt ook voor de B-^1-ll*6-stam die volgens de werkwijze der onderhavige uitvinding gebruikt -wordt. Hieruit volgt dat elke B-U1D vormende 5 mutant van de beschreven Streptomyces-stam B-M-1U6 voor de bereiding van de verbinding volgens de uitvinding gebruikt kan worden.

Men kan de verbinding volgens de onderhavige uitvinding bereiden door kweken van Streptomyces-stam B—U1—1b6 in een daarvoor geschikt medium en winnen van de verkregen verbinding uit het fermentatiemengsel.

10 Alle bekende voor de kweek van micro-organismen van het geslacht

Streptomyces tot nu toe gebruikte voedingsmiddelen kunnen hierbij gebruikt worden. In het algemeen moet een dergelijk kweekmedium, zoals bekend, tenminste een bron van assimileerbare koolstof en een bron van assimileerbare stikstof bevatten. Geschikte koolstofbronnen zijn glucose, saccha-15 rose, zetmeel, glycerine, moutextract, melasse en sojabonenolie. In het bijzonder wordt aan glucose als koolstofbron de voorkeur gegeven, bij voorkeur in een hoeveelheid van maximaal 8%, of beter nog van 6-8 w/v# van het kweekmedium. Naast glucose gebruikt men bij voorkeur al dan niet met elkaar vermengd: lactose en/of maltose en/of maïszetmeel (bij voor-20 keur in een hoeveelheid van 0,5-2 w/v%) als extra koolstofbron. Om de pH-waarde constant te houden voegt men bij voorkeur tijdens de gehele kweek-periode extra glucose toe.

Geschikte stikstofbronnen zijn sojabonenmeel, ontkiemende tarwe, vleesextrakt, pepton, verse gist, maiskweekvloeistof, ammoniumsulfaat en 25 ammoniumnitraat. In het bijzonder verdient als stikstofbron een mengsel van sojabonenmeel en taptemelk, bij voorkeur 0,5 tot 1 w/v# sojabonenmeel en 1-2 w/v% taptemelk, de voorkeur. Desgewenst kan een aminozuur (bij voorbeeld glycine of arginine) aan het kweekmedium warden toegevoegd.

Verder kan men desgewenst organische zouten, zoals calciumcarbo-30 naat, natriumchloride, kaliumchloride of fosfaten toevoegen, terwijl ook andere organische of anorganische verbindingen kunnen worden toegevoegd die dienen om de microben groei te bevorderen en de vorming van de gewenste verbinding te stimuleren.

Verrassend goede opbrengsten aan verbinding B-iHD verkrijgt men 35 met een kweekmedium dat 6-8 w/v$ glucose, 0,5-2 w/v$ lactose en/of maltose en/of maïszetmeel; 0,5-1 w/v# sojabonenmeel, en 1-2 w/v# taptemelk bevat.

8004791 -5-

Hoewel elke bekende werkwijze voor het kweken van Streptomyces stam B-U1-1U6, bij voorbeeld voor de fermentatie ter bereiding van andere biologisch werkzame stoffen, toegepast kan worden wordt aan vloeistof kweken en in het bijzonder ondergedompelde kweken de meeste voor-5 keur gegeven. De kweek wordt bij voorkeur aëroob uitgevoerd bij uiteenlopende temperaturen, bij voorbeeld 22-30°C en bij voorkeur ongeveer 28°C. De produktie van de gewenste B-l· 1 D-verbinding bereikt na een kweek van 5-10 dagen een maximum, zowel onder schudden als in een tank.

De analyse van verbinding B-41D in het kweekmedium kan als volgt worden uitgevoerd. Men brengt een bekende hoeveelheid, bij voorbeeld 3 g, 10 van het kweekmedium in een kleine proefbuis, waaraan men 10 ml aceton toevoegt, extraheert het mengsel door schudden en centrifugeert daarna. Aan de aldus verkregen bovenstaande oplossing voegt men in totaal 10 ml aceton toe. De verkregen oplossing wordt op een tevoren vast ges tel de plaats op een dunne-laag-chromatografieplaat aangebracht (silicagel, 15 bij voorbeeld Kieselgel 60 van E. Merck) met een hoeveelheid van bij voorbeeld 10-20 ^u liter. Men ontwikkelt de plaat vervolgens b uren met een mengsel van dioxan en tetrachloorkoolstof in de volumeverhouding 18:82. Het monster wordt daarna met een dunne-laag-chromatografiescanner met dubbele golflengte bij 2¾ 5 m^u (blanco bij 380 nyu) onderzocht.

20 De absorptie wordt vergeleken met die van een bekend standaardmonster van de verbinding, waaruit de hoeveelheid van verbinding B-Md kan worden berekend.

Men kan verbinding B-UlD uit het kweekmedium winnen met een natuurlijk adsorptiemiddel (bij voorbeeld actieve kool, aluminiumoxyde 25 of silicagel), een synthetisch adsorptiemiddel (bij voorbeeld Diaion ÏÏP-20, van Mitsubishi Chemical Industrie, Limited), een absorptiemiddel (bij voorbeeld Avicel, van Asahi Chemical Industry Co., Limited of fil-terpapier), een ionenuitwisselend hars, een ionenuitwisselend gelfilter of dergelijke. De winning kan echter het beste op de volgende wijze wor-30 den uitgevoerd.

Eerst wordt het fermentatiemedium met een filterhulpmiddel (bij voorbeeld diatomeeënaarde) gefiltreerd, waarbij een koek ontstaat die men vervolgens met methanol extraheert om de gewenste verbinding in een water-methanoloplossing op te lossen. Vervolgens voegt men aan de wate-35 rige methanoloplossing water toe en extraheert de verkregen oplossing met hexaan. Men scheidt de hexaanfase af en concentreert door indampen 8004791 -6- onder verminderde druk onder vorming van een olie-achtige stof die de gewenste B-MD-ver binding bevat. Men brengt de olie-achtige stof in een kolom die silicagel bevat (bij voorbeeld Wakogel C-200) en elueert met een geschikt mengsel, bij voorbeeld hexaan en aceton in de volumeverhou-5 ding 95 = 5 waarbij men frakties verzamelt die de gewenste verbinding bevatten. Deze frakties concentreert men door indampen onder verminderde druk, waardoor men opnieuw een olie-achtige stof verkrijgt die men in een kleine hoeveelheid methanol oplost, en op een Sephadex LH-20-kolom brengt (handelsmerk van een produkt van Pharmacia Co.) en elueert met 10 methanol. Men verzamelt de frakties die de gewenste verbinding bevatten, verwijdert het oplosmiddel en lost het residu op in een kleine hoeveelheid methanol. Men voegt water aan het mengsel toe en laat bij kamertemperatuur staan. De verkregen B-^1 D-verbinding is schuimvormig en kan tot een amorf poeder verbrokkelt worden. Bij herkristallisatie uit een mengsel 15 van hexaan en ethylacetaat in de volumeverhouding 20:1 verkrijgt men verbinding B-U1D in de vorm van kleine bij 186-188°C smeltende naalden.

Hoewel de verbinding B-41D op de bovenbeschreven wijze voor gebruik afgescheiden en gezuiverd kan worden, kan men de zuivering op elk gewenst moment onderbreken en het ruwe produkt, dat een mengsel van 20 milbemycinen en verbinding B-U1D bevat, gebruiken. Als een mengsel van twee of meer van dergelijke onvolledig gescheiden verbindingen gebruikt wordt behoeft men slechts te zuiveren totdat bij een concentratie van 5 ppm een 100^-ige acaricidewerking ontstaat. Het gehalte aan verbinding B-MD in het ruwe mengsel bedraagt in dit geval bij voorkeur tenminste 25 25 gew.$, of beter nog 50 gew.$, terwijl de rest uit verontreinigingen uit het kweekmedium en andere milbemycinen bestaat.

De verbinding volgens de onderhavige uitvinding bezit een verhoogde acaricidewerking tegen volwassen mijten en de eieren van mijten, bij voorbeeld de gespikkelde spinmijt (Tetranyctaus urticae), Europese rode 30 mijt (Panonychus ulmi), de rode citrusmijt (Panonychus citri) en roest-mijten (bij voorbeeld van de geslachten Aculops of Aculus), die op vruchten, groenten en bloemen parasiteren. De verbinding is ook * werkzaam tegen mijten van de geslachten Ixodidae, Dermanyssidae en Sarcoptidae, die op dieren parasiteren. De verbinding is bovendien buitengewoon werkzaam te-35 gen ectoparasieten zoals Oestrus, Lucilia, Hypoderma, Gasterophilus, vlooien, luizen enz., alsmede tegen de hygiëne bedreigende insekten (bij voorbeeld kakkerlakken of vliegen) en voor de land- en tuinbouw 8004791 -7- schadelijke insekten, "bij voorbeekd plantluizen en larven van insekten van de groep Lepidoptera. Verder is de verbinding werkzaam tegen nematodes, "bij voorbeeld die van het geslacht Meloidogyne, en mijten zoals die van het geslacht Rhizoglyphus die in de aarde voorkomen.

5 Als acaricide of insecticidepreparaat, wordt de verbinding vol gens de uitvinding bij voorkeur verdund met een drager tot bij voorbeeld poeders, grove poeders, korrels, fijne korrels, bevoehtigbare poeders, emulgeerbare concentraten of oliën.

De voor dergelijke preparaten gebruikte dragers kunnen synthetisch 10 of natuurlijk, organisch of anorganisch zijn waarbij men in het algemeen alle gewoonlijk aan insecticiden of acarieiden toegevoegd dragers kan gebruiken om het werkzame bestanddeel gemakkelijker met het te behandelen voorwerp (bij voorbeeld plant, mijt of schadelijk insekt) in aanraking te brengen of om het opslaan, transport of de behandeling van 15 het werkzaam bestanddeel te vergemakkelijken.

Voorbeelden van geschikte vaste dragers zijn: anorganische stoffen, bij voorbeeld klei, talk, diatomeeënaarde, kaolien, bentoniet, cal-ciumcarbonaat of synthetische ealciumsilicaat; natuurlijke of synthetische harsen, bij voorbeeld eumaroonharsen, alkydharsen en polyvinylchlo-20 riden; wassen, bij voorbeeld, cyanabauwas en paraffinewas; schillen van noten, bij voorbeeld walnotenschillen, en sojabonenmeel.

Voorbeelden van geschikte vloeibare dragers zijn: water, alcoholen, bij voorbeeld ethanol of isopropanol; glycolen, bij voorbeeld ethyleenglycol; glycolethers, bij voorbeeld ethyleenglycolmonofenylether 25 of diethyleenglycolmonoethylether; ketonen, bij voorbeeld aceton, methyl-isobutylketon, cyclohexanon, acetofenon of isoforon; ethers, bij voorbeeld tetrahydrofuran of dioxan; aromatische koolwaterstoffen, bij voorbeeld benzeen, tolueen, xyleen of methylnafthaleen; gechloreerde koolwaterstoffen, bij voorbeeld trichloorethyleen of tetrachloorkoolstof; en 30 lage, gemiddeld of hoog kokende aardoliefrakties die kerosine, lichte oliën of aromatische koolwaterstoffen bevatten.

De verbinding volgens de uitvinding kan eveneens als aerosol worden toegepast, in welk geval de drager een drijfmiddel is. Geschikte drijfmiddelen zijn gasvormige fluorkoolstoffen (inbegrepen die met het 35 handelsmerk "Freon”), vloeibaar gemaakte aardgas, dimethylether of vinyl-chloridemonomeer.

Desgewenst kan het preparaat een oppervlakte-aktief middel bevat- o η Π A 7 Q 1 -8- ten om de aktieve "binding te emulgeren, te dispergeren, te "bevochtigen of te spreiden, waarbij het oppervlakte aktieve middel ionogeen of niet ionogeen kan zijn. Voorbeelden van geschikte anionogene oppervlakte-aktieve middelen zijn: de natrium- en calciumzouten van lignolsulfonzuur, 5 de natrium- en kaliumzouten van oliezuur; de natriumzouten van lauryl-sulfonzuur en de natrium- en calciumzouten van dodecylbenzeensulfonzuur. Voorbeelden van geschikte kationogene oppervlakte-aktieve middelen zijn de hogere alifatische aminen en condensaten van hogere alifatische aminen met ethyleenoxyde. Voorbeelden van geschikte niet-ionogene oppervlakte-10 aktieve middelen zijn: de glyceriden van vetzuren, saccharose-esters van vetzuren, condensaten van ethyleenoxyde met hogere alifatische alcoholen, de condensaten van ethyleenoxyde met hogere vetzuren, de condensaten van ethyleenoxyde met alkylfenolen of alkylnaftholverbindingen en de copolymer en van ethyleenoxyde en propyleenoxyde.

15 De acaricide of insecticide preparaten volgens de uitvinding kun nen subsidiair of bovendien een beschermende colloid bevatten, (bij voorbeeld gelatine, arabische gom, caseine, polyvinylalcohol of carboxy-methyleellulose) of een thixotropisch middel (bij voorbeeld natriumpoly-fosforaat of bentoniet). Het preparaat kan ook andere verbindingen met 20 acaricide werking bevatten, bij voorbeeld 2-(1-methylpropyl)~ht6-dinitro-fenyl-β,β-dimethylacrylaat, di- (jD-chloorfenyl)cyclopropylcarbinyl, ÏT'-(U-chloor-2-methylfenyl)-N,N-dimethylformamidine, 2, U, V ,5-tetrachloor-difenylsulfon, 1,1-bis(p-chloorfenyl)-2,2,2-trichloorethanol, 2-sec-bu-tylf enyl-N-methylcarbamaat, m-tolyl-N-methylcarbamaat of minerale olie 25 om de werkzaamheid van het preparaat te verhogen, waarbij in scmmige gevallen een synergistische werking kan worden verwacht.

Het is vanzelfsprekend ook mogelijk de verbinding volgens de onderhavige uitvinding te vermengen met andere fungiciden, herbiciden, de plantengroei regelende middelen, aantrekkingsmiddelen of kunstmest.

30 Verbinding B-^1D is ook zeer werkzaam als parasiticide bij de be handeling van mensen en dieren. De in het algemeen met "parasitisme" aangeduide ziekten worden in lijken veroorzaakt door meercellige organismen algemeen aangeduid met Helminthes. Parasieten kunnen vee, pluimvee en huisdieren (bij voorbeeld varkens, schapen, geiten, koeien, paarden, 35 honden, katten en kippen) epidemisch aantasten en zware economische schalde toebrengen. Van de Helminthes kan een groep parasieten bekend als de Nanatodae zich in het bijzonder onder verschillende dieren verspreiden 8004791 c * -9- en vaak ernstige infekties veroorzaken. Voorbeelden van Hernatodae die de bovengenoemde dieren infekteren zijn:

Haemonchus;

Trichostrongylus; 5 Ostertagia;

Hematodirus;

Cooperia;

Ascaris;

Bunostomum; 10 Qesophagostomum;

Chabertia;

Trichuris;

Strongylus;

Trichonema; 15 Dictyocaulus;

Capillaria;

Heterakis;

Toxocara;

Ascaridia; 20 Oxyuris;

Ancylostoma;

Uncinaria;

Toxascaris;

Parascaris; 25 Strongyloides.

Sommige parasieten van het geslacht Ifematodlrus, Cooperia en Qesophagostomum tasten de ingewanden aan, terwijl de parasieten van het geslacht Hemonchus en Ostertagia maagaandoeningen veroorzaken en de parasieten van het geslacht Dictyocaulus in de longen voorkomen. Parasieten 30 van de familie Filariidae of Setariidae worden in het hart, de bloedvaten en weefsels en organen, bij voorbeeld het subcutaanweefsel en de lymfevaten gevonden.

De verbinding volgens de uitvinding bezit een breed werkingsspectrum tegen vele endoparasieten in verschillende dieren en is bij voor-35 beeld werkzaam tegen parasieten van de geslachten Dirofilaria bij honden, Nematospiroides, Syphacia en Aspiculuris bij knaagdieren.

Verbinding B-MD is ook werkzaam tegen verschillende parasieten 8004791 -10- die mensen infekteren. Voorbeelden van dergelijke parasieten die in de spijsverteringsorganen van de mens voorkomen zijn:

Ancylostoma;

Necator; 5 Asearis;

Strongyloides;

Trichinella;

Capillar ia;

Trichuris; en 10 Enterobius.

Andere medisch belangrijke parasieten die in het bloed, weefsels of in organen met uitzondering van de spijsverteringsorganen voorkomen behoren tot de geslachten Wuchereria, Brugia, Onchocerca en Loa van de familie Filariidae, Dracuneulus van de familie Drachunculidae en 15 Stronglylodies en Trichininella, die opvallen omdat zij gewoonlijk ecto-parasieten maar in de spijsverteringsorganen vaak endopar asieten zijn.

Als verbinding B-U1D als parasiticide voor mens en dier moet worden gebruikt verdient orale toediening als drank of capsule de voorkeur.

De samenstelling kan uit een waterige oplossing of een oplossing in een 20 ander geschikt niet giftig oplosmiddel bestaan, of uit een suspensie of dispersie die een suspensiehulpmiddel en een bevochtigingsmiddel, bij voorbeeld bentoniet, of andere bestanddelen bevat, alsmede in de meeste gevallen een schuimwerend middel. Bij voorkeur bevat de drank de werkzame verbinding in een hoeveelheid van 0,01 tot 0,5 gev.% of beter nog 0,01 25 tot 0,1 gew.%.

Men kan verbinding B-U1D ook als eenheidsdosis toedienen, bij voorbeeld in de vorm van droge vaste capsules, pillen of tabletten die een bepaalde hoeveelheid werkzame verbinding bevatten. Deze samenstellingen bereidt men door de werkzame verbinding met een of meer fijne poedervor-30 mige materialen homogeen te vermengen, bij voorbeeld een verdunningsmid-del, een vulmiddel, een het uiteenvallen bevorderend middel of een bindmiddel (bij voorbeeld zetmeel, lactose, talk, magnesiumstearaat of plantaardige gom). Het gewicht van en het gehalte aan werkzaam bestanddeel in een dergelijke eenheidsdoses kan zeer sterk uiteenlopen, afhankelijk van 35 het te behandelen dier, de infektiegraad, het type parasiet en het lichaamsgewicht van het dier.

Men kan verbinding B-MD aan dieren toedienen door gelijkmatig in 8004791 -11- het voer te dispergeren, of op het voer te strooien, of eventueel in de vorm van tabletten. Om een bevredigende anti-parasitaire werking te verkrijgen, moet het voer 0,0001 tot 0,02 gew.% werkzame verbinding bevatten.

5 Men kan verbinding B-41D ook in een vloeibare drager oplossen of dispergeren en parenteraal aan dieren toedienen door injekteren in de proventriculus, de spieren, de longen of onder de huid. Yoor parenterale toediening bestaat de drager bij voorkeur uit plantaardige olie, bij voorbeeld aardnotenolie of katoenzaadolie, en bedraagt de hoeveelheid 10 werkzame verbinding bij voorkeur 0,05 tot 50 gew.% van het preparaat.

Plaatselijke toediening van verbinding B-41D is ook mogelijk, waarvoor men de werkzame verbinding bij voorkeur met een geschikte drager vermengt, bij voorbeeld dimethylsulfoxyde of een koolwaterstofoplosmiddel.

Het aldus verkregen preparaat kan direkt op de huid van het dier, bij 15 voorbeeld door versproeien,worden aangebracht.

De voor de beste resultaten optimale hoeveelheid B-41D-'verbinding is afhankelijk van het te behandelen dier, de parasitaire infektie en de infektiegraad, maar men dient in het algemeen en bij voorkeur 0,01 tot 100 mg per kg lichaamsgewicht toe, of beter nog, bij orale toediening, 20 0,1 tot 50 mg/kg. De verbinding kan in een dosering of in verschillende doseringen worden toegediend waarbij men meestal het dier relatief kort bij voorbeeld 1-5 dagen, behandelt.

De uitvinding wordt nu aan de hand van de volgende voorbeelden toegelicht, waarbij voorbeeld I en II de bereiding van verbinding B-41D, 25 de voorbeelden III-VI de acaricidesamenstellingen van de verbinding, voorbeelden VII-IX de acaricidewerking en de voorbeelden X-XIV de anthelmin-thische werking toelichten.

Voorbeeld I

Bereiding van verbinding B-41D.

30 Men brengt 600 ml van een voor-kweekmedium, dat 2 w/v% glucose, 1 w/v% sojabonenmeel, 0,5 wh% maiskweekvloeistof (een produkt van Corn Products Co.) en 0,2% natriumchloride bevat, in een Erlenmeyer-kolf van 2 liter. Men ent het medium met een omgebogen platinadraad waarvan de lus Streptomyces-sporen van de stam B-41-146 bevat en kweekt 48 uren bij 35 27°C. Daarna wordt de inhoud van twee van dergelijke 2 liter Erlenmeyer- kolven in een fermentatie-vat met een inhoud van 30 liter overgebracht, die 20 liter intensief gesteriliseerd voedingsmedium bevat, dat b w/vfo 8004791 -12- glucose, 1 w/v$ sojabonenmeel, 0,5 w/v$ maïszetmeel, 1 w/v$ taptemelk, 0,2 w/v$ maiskweekvloeistof en 0,3$ natriumchloride bevat. De pH van het medium bedraagt vöör sterilisatie 7,2-7,5- De kweek wordt 10 dagen bij o 2 28 C onder een inwendige druk van 0,5 kg/cm gexncubeerd.

5 Hierna wordt 20 liter van het kweekmedium met zwavelzuur op pH 3 ingesteld, waarna men het mengsel na toevoeging van 1 kg van het filter-hulpmiddel Celite (handelsmerk) onder druk filtreert onder vorming van ongeveer 3 kg van een koek. Deze koek extraheert men met 15 liter methanol en filtreert het extrakt. 15 liter van de aldus verkregen methanol-10 oplossing verdunt men met 5 liter water en extraheert met 20 liter hexaan. De aldus verkregen hexaanoplossing droogt men boven watervrij natrium-sulfaat en dampt vervolgens in onder verminderde druk op een waterbad met een temperatuur van 4θ-4·5°0, waardoor men 22 g olie-achtig produkt verkrijgt.

15 Het olie-achtige produkt wordt in 30 ml hexaan opgelost en op een kolom, die 2 kg met hexaan in evenwicht gebrachte silicagel bevat, geadsorbeerd. Men elueert de kolom met een mengsel van hexaan en aceton in de volumeverhouding 95:5 en verkrijgt 2 liter van een fraktie die de gewenste verbinding bevat en die men onder verminderde druk op een water-20 bad met een temperstuur van 4θ-4·5°0 indampt onder vorming van 550 mg van een olie-achtig produkt. Men lost het produkt op in 1 ml methanol en brengt de oplossing over op een kolom die 200 ml met methanol in evenwicht gebrachte Sephadex (handelsmerk) LH-20 bevat. Men elueert de kolom met methanol en verkrijgt 65 ml van een fraktie die de gewenste verbin-25 ding bevat. Deze fraktie wordt door verdampen onder verminderde druk bij 45°C geconcentreerd en het verkregen residu lost men op in 2 ml methanol, waarna men de methanoloplossing met 2 ml water verdunt. Men laat het mengsel bij kamertemperatuur staan en verkrijgt 110 mg van de verbinding B-41D in de vorm van een amorf poeder met de hierboven beschreven eigen-30 schappen.

Voorbeeld II

Bereiding van verbinding B-41D.

Men ent een 2 liter kolf, die 600 ml voor-kweekmedium bevat bestaande uit 1 w/v$ saccharose, 0,35 v/v$ polypepton en 0,05 v/v$ dikalium-35 orthofosfaat met een omgebogen platinadraad waarvan de lus sporen van de Streptomyces-stam B-41-146 bevat, waarna men het micro-organisme 48 uren bij 27°C kweekt. De inhoud van drie van dergelijke kolven wordt in een 600 liter fermentatietank overgebracht waarin zich 300 liter van een inten- 8004791 -13- sief gesteriliseerd kweekmedium bevindt, dat 8 ν/γ% glucose, 1 w/v$ soja-bonenmeel, 0,5 w/v# maïszetmeel, 1 w/v/ taptemelk, 0,2 w/v$ maiskweek-vloeistof, 0,3 w/v$ natriumchloride en 0,05 w/v$ calciumcarbonaat bevat. De pH van het medium wordt op 7,2-7,5 gehouden. Men kweekt 12 dagen bij 5 28°C onder roeren met een omwentelingssnelheid van 150-200 o.p.m. en een 3 inwendige druk van 0,5-1 kg/cm .

Ha deze periode bedraagt de hoeveelheid verbinding B-U1D in het medium 180 yUg/1 . Men brengt 300 liter van het verkregen kweekmedium door toevoeging van zwavelzuur op pH 3, waarna men 15 hg Celite-filterhulpmid-10 del toevoegt en het mengsel onder druk filtreert onder vorming van een ^0 kg wegende koek. De koek wordt met 200 liter methanol geëxtraheerd en gefiltreerd. Aan het methanolextrakt voegt men 150 liter water toe en extraheert het verkregen mengsel tweemaal met telkens 250 liter hexaan.

Men droogt de verkregen hexaanoplossing boven watervrij natriumsulfaat 15 en concentreert door verdampen onder verminderde druk op een waterbad met een temperatuur van U0-k5°C en verkrijgt 350 g olie.

Men lost de olie op in ^-00 ml hexaan en adsorbeert op een kolom die 3 kg tevoren met hexaan in evenwicht gebrachte silicagel bevat. Men elu-eert de kolom met een mengsel van hexaan en aceton in de volumeverhouding 20 95:5 en verkrijgt 8 liter van een eluaatfraktie die de gewenste verbin ding bevat. Men concentreert de fraktie door verdampen onder verminderde druk op een waterbad met een temperatuur van kO-k5°C en verkrijgt 33 g ruwe kristallen. Men lost de kristallen op in een mengsel van hexaan en ethylacetaat in de volumeverhouding 20:1, waaruit men herkristalliseert 25 onder vorming, van 17 ,U g verbinding B-U1D, in de vorm van kleurloze naalden die bij 186-188°C smelten,met de hierboven genoemde eigenschappen. Voorbeeld III Poeder.

Men voegt 10 gew.delen verbinding B-^1D in de vorm van een amorf 30 poeder toe aan, en vermengt homogeen met 5 delen witte was. Aan dit mengsel voegt men 50 gew.delen talk en 35 gew.delen klei toe, vermengt homogeen, maalt 3 maal fijn in een hamermolen, en vermengt opnieuw homogeen tot een poeder.

Voorbeeld IV

35 Bevochtigbaar poeder.

Men mengt Uo gew.delen van verbinding B-MD in de vorm van een amorf poeder met 20 gew.delen witte was. Men voegt 5 gew.delen natrium— 8004791 -1U- dodecylbenzeensulfonaat, 2 gew.delen polyvinylalcohol en 33 gew. delen klei toe en mengt homogeen. Men maalt het mengsel 3 x fijn in een hamer-molen en vermengt opnieuw homogeen onder vorming van een bevochtigbaar poeder.

5 Voorbeeld V

Emulgeerbaar concentraat.

Men vermengt 3 gew.delen van verbinding B-U1D in de vorm van een amorf poeder, 7 gew.delen polyoxyethyleennonylfenylether, 3 gew.delen calciumdodecylbenzeensulfonaat en 87 gew.delen xyleen en filtreert onder 10 vorming van een oplossing die als emulgeerbaar concentraat kan worden gebruikt .

Voorbeeld VI

Preparaat op basis van olie.

Men lost 10 gew.delen van verbinding B-^1D in de vorm van een 15 amorf poeder op in 10 gew.delen xyleen, voegt 80 gew.delen machine-olie aan de oplossing toe en filtreert het mengsel onder vorming van een preparaat op basis van olie.

Voorbeeld VII

Acaricide werking tegen de gespikkelde spinmijt (Tetranychus urticae).

20 Men bereidt volgens de werkwijze beschreven in voorbeeld V een 3 gew.%’s emulgeerbaar concentraat. Men verdunt het concentraat met water en verkrijgt de in tabel B aangegeven concentratie van de werkzame verbinding. Men bespuit Cowpea-blaadjes, waarop zich vrouwelijke volwassen Tetranychus urticae bevinden, met 5 cc proefoplossing per 2 blaadjes met 25 behulp van een sproeier van het Mizuho type (in de handel gebracht door Mizuho Rikagaku Kikai Co. Limited). Men laat de blaadjes aan de lucht drogen en laat in een thermostatisch geregelde kamer 72 uren bij 25°C staan, waarna men de sterfte onder de mijten berekend. Het aantal volwassen mijten bedroeg 30-35 per blaadje waarbij per proef 2 blaadjes zijn 30 gebruikt.

De proef is uitgevoerd met verbinding B-41D, en met milbemycine a.| en (B-^+IA^ en A^ uit het Britse octrooischrift 1.390.336) en met het bekende landbouwmijtbestrijdingsmiddel Kelthaan [handelsmerkt van een middel op basis van 1,1- bis(chloorfenyl)-2,2,2-trichloormethanol] 35 als blanco. De resultaten zijn samengevat in tabel B in de vorm van het sterftepercentage van de volwassen insekten.

8004791

TABEL B

-15-

Proefverbinding Concentratie van de proefoplossing (ppm) 30 10 3 1 0,3

Verbinding B-1+1D 100 100 100 89 32 5 Milbemycine 100 85 ^3 11 0

Milbemycine 100 90 ^5 8 1

Kelthaan 7¼ 25 3

Voorbeeld VIII

Acaricidewerking ten opzichte van eieren van de gespikkelde spinmijt 10 (Tetranychus nrticae).

Bij deze proef gebruikt men 1 dag oude eieren van de Tetranychus urticae, die op de blaadjes van de cowpea zijn gelegd. Men behandelt de bladeren met'de verbinding volgens de uitvinding en de andere in voorbeeld VII genoemde verbindingen. Het aantal eieren per blad bedraagt ongeveer 15 100. Twee weken na de behandeling wordt het aantal niet uitgekomen eieren geteld en de resultaten zijn in tabel G als percentage van het totaal aantal eieren weergegeven.

TABEL C

Proefverbinding Concentratie van de proefoplossing (ppa) 20 _30 10 3_1_0*3_

Verbinding B-41D 100 100 96 52 10

Milbemycine 98 85 60 30 0

Milbemycine 93 89 55 20 5

Kelthaan 19 0 0

25 Voorbeeld IX

Acaricidewerking ten opzichte van de rode citrusmijt (Panonychus citri).

Men past de in voorbeeld VII beschreven werkwijze toe, waarbij men echter moerbijbladeren met vrouwelijke volwassen rode eitrusmijten gebruikt. De resultaten zijn in tabel D samengevat.

8004791

TABEL D

-16-

Pr oef verb inding Concentratie van de proef oplossing (ppm) _12_3_1_0j3_OJ_0,03

Verbinding B-VlD 100 100 100 95 90 50 5 Milbemycine 100 98 82 68 55 3

Milbemycine 10° 95 82 70 J

Keltbaan 75

Naast de in tabel D weergegeven resultaten is een Kelthaan-emulsie met een concentratie van 30 ppm onderzocht. De sterfte bedraagt echter 10 zelfs bij deze concentratie slechts 93$.

Uit de resultaten volgt dat verbinding B-^1D vergeleken met milbemycine en a^» die op hun beurt aanzienlijk beter zijn dan de bekende acaricide Kelthaan, een zeer sterke acaricidewerking bezit.

Voorbeeld Σ 15 Anthelminthische werking ten opzichte van Nematospiroides dubius.

Vier weken oude mannelijke muizen van de KFVL-stam, elk met een gewicht van ongeveer 18-22 g, worden oraal geïnfekteerd met Nematospiroides dubius . De muizen worden daarop in groepen van 5 dieren verdeeld en ontvangen 5-7 dagen na de infektie voedsel dat de proefverbinding met de in 20 tabel E aangegeven hoeveelheid bevat, waarna zij onbehandeld voedsel ontvangen. De dieren worden 1U dagen na de infektie gedood en het aantal parasieten in de dunne darm geteld en met een blanco-groep, die op dezelfde wijze geïnfekteerd doch niet behandeld is, vergeleken. De anthelmin-thische werking is in tabel E weergegeven.

8004791

TABEL E

-17-

ProefverLinding ' Hoeveelheid in het Anthelminthische werking ______voedsel__________ 0,05% 100$ 5 Verbinding B-1*11’ o,005« 100« 0,0005$ 96$

Mengsel van

Milhemycine α2 en 0,03$ 32$

Mengsel van 10 Milhemycine ot^-dg, 0,03$ 27,6$ V “ίο en 31

De in tahel E aangegeven resultaten tonen aan dat verbinding B-^ID een anthelminthische werking bezit die ongeveer tweemaal sterker is dan die van de daarmee vergeleken milbemycinemengsels.

15 Voorbeeld XI

Anthelminthische werking ten opzichte van Toxoeara cati.

De bij deze proef gebruikte dieren zijn 18 katjes, (3 mannetjes en 15 vrouwtjes) met een lichaamsgewicht van 1,6-3 kg die op natuurlijke wijze met Toxoeara cati geinfekteerd zijn. Aan de katjes is oraal een 20 enkele dosering van de in olijfolie gedispergeerde verbinding B-*t-1D in de volgende hoeveelheden toegediend: 2 katjes kregen 5 mg van de verbinding per kg lichaamsgewicht; 3 katjes 2,5 mg/kg; 2 katjes 1 mg/kg: 3 katjes 0,5 mg/kg; 3 katjes 0,25 mg/kg; 2 katjes 0,1 mg/kg en 3/bf(^ mg/kg. Vö6r de behandeling be-draagt de EPG (d.w.z. het aantal eieren per g uitwerpselen) 150-16,250. Een week na de behandeling is de EPG van alle katjes 0 en het totale aantal tijdens deze week verwijderde wormen 2-Uo. Bij autopsie blijkt dat alle katjes volledig vrij van wormen zijn.

Voorbeeld XII

30 Anthelminthische werking ten opzichte van Toxoeara canis.

De bij deze proef gebruikte dieren zijn 13 jonge honden (3 mannetjes en 10 vrouwtjes) met een lichaamsgewicht van 1,2-13,7 kg, die op natuurlijke wijze met Toxoeara canis geinfekteerd zijn. Elk jong dier ontvangt oraal een enkele dosis van de in olijfolie gedispergeerde verbin-35 ding B-41D in de volgende hoeveelheden: 8004791 -18- 1 hondje ontving 5 mg per kg lichaamsgewicht; 2 hondjes 0,25 mg/kg; U hondjes 0,1 mg/kg; 3 hondjes 0,05 mg/kg; 2 hondjes 0,025 mg/kg en één hondje 0,01 mg/kg. Voor de behandeling bedraagt de EPG: 100-18,UOO.

Eén week na de behandeling is de EPG nul voor alle hondjes en is het to-5 tale aantal tijdens deze week verwijderde wormen 2-36 per hondje. Bij autopsie blijkt dat alle hondjes geheel vrij van wormen zijn.

Voorbeeld XIII

Anthelminthische werking ten opzichte van Trichuris vulpis.

De voor deze proef gebruikte dieren zijn 5 honden (2 vrouwtjes .10 en 3 mannetjes) met een lichaamsgewicht van 6,2-11,5 kg en een leeftijd vanaf 2 tot 3 jaar. Elk dier ontvangt oraal een enkelvoudige dosis van 1 of 5 mg per kg lichaamsgewicht van verbinding B-U1D in de vorm van een met gelatine beklede capsule. De honden zijn op natuurlijke wijze met Trichuris vulpis geïnfekteerd. Voor de behandeling bedraagt de EPG: 15 100-3.500 en 1 week na de behandeling 0-200 en het totale aantal tijdens deze week verwijderde wormen is 8-^51. Bij de autopsie blijkt het aantal achtergebleven wormen 0-33 te zijn, d.w.z. een verwijderingspercentage van 92-100$, Zoals bekend zijn infekties van Trichuris vulpis in de blinde darm bijzonder moeilijk te bestrijden zodat het hoge percentage 20 verkregen met een enkelvoudige en naar verhouding lage dosering van de verbinding volgens de uitvinding op een uiterst werkzame en waardevolle werking ten opzichte van deze parasieten wijst.

Voorbeeld XIV

Anthelminthische werking ten opzichte van Ancylostoma canium.

25 De voor deze proef gebruikte dieren zijn 5 honden (2 vrouwtjes en 3 mannetjes) met een lichaamsgewicht van 7-11,5 kg en een leeftijd van 2 tot 3 jaren. Alle honden blijken op natuurlijke wijze met Ancylostoma canium geïnfekteerd te zijn. Elke hond krijgt oraal een enkelvoudige dosis van verbinding B-^1D toegediend, in de vorm van een met gelatine be-30 klede capsule, in de volgende hoeveelheden: 2 honden ontvangen 0,5 mg per kg lichaamsgewicht, 2 honden 1 mg/kg en 1 hond 5 mg/kg lichaamsgewicht. V66r de behandeling bedraagt de EPG: 200-1550. Een week na de behandeling is de EPG nul en bedraagt bij alle honden het totale aantal tijdens deze week verwijderde wormen U—82 per hond. Bij autopsie blijkt 35 dat alle honden geheel vrij zijn van wormen.

8004791

Claims

1. Verbinding B-41D met formule 6 van het formuleblad.

2. Werkwijze voor de bereiding van de verbinding B-41D , met .het kenmerk, dat een de verbinding B-U1D vormend micro-organisme van het geslacht Streptomyces in een daarvoor geschikt kweek-5 medium gekweekt wordt en de aldus verkregen B-~^1D-verbinding van het kweekmedium gescheiden wordt.

3. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat het micro- organisme de Streptomyces-stam B—Ui—1 is. l·. Werkwijze volgens conclusie 2 of 3, met het kenmerk, dat het kweek-10 medium glucose als koolstofbron bevat.

5. Werkwijze volgens conclusie U, met het kenmerk, dat glucose in een hoeveelheid tot 8 w/v$ aanwezig is.

6. Werkwijze volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat 6-8 w/v$ glucose aanwezig is. 15 7· Werkwijze volgens één of meer der conclusies b, 5 en 6, met het kenmerk, dat het kweekmedium bovendien 0,5-2 w/v# lactose en/of maltose en/of maïszetmeel, bevat.

8. Werkwijze volgens één of meer der conclusies 2-7, met het kenmerk, dat het kweekmedium sojabonenmeel en taptemelk als stikstofbron bevat. 20 9· Werkwijze volgens conclusie 8, met het kenmerk, dat het sojabonen meel in een hoeveelheid van 0,5-1 w/v% en de taptemelk in een hoeveelheid van 1-2 w/y% van het kweekmedium aanwezig is.

10. Werkwijze volgens één of meer der conclusies 2-9, met het kenmerk, dat de kweek bij een temperatuur van 22-30°C wordt uitgevoerd. 25 -11. Werkwijze volgens conclusie 10, met het kenmerk, dat de temperatuur ongeveer 28°C bedraagt.

12. Werkwijze volgens één of meer der conclusies 2-11, met het kenmerk, dat het kweekmedium gezuiverd wordt onder vorming van een mengsel met anthelminthische en acaricide werking dat tenminste 25 gevr.% van verbin- 30 ding B-U1D bevat.

13. Werkwijze volgens conclusie 12, met het kenmerk, dat bij het zuiveren een mengsel ontstaat dat ongeveer 50 gew.% van verbinding B-1|1D bevat. 1U. Werkwijze volgens êên of meer der conclusies 2-11, met het kenmerk, 35 dat bij het zuiveren van het kweekmedium een vrijwel zuivere verbinding 8004791 -20- B-U1D verkregen wordt.

15· Preparaat met acaricide en insecticide-werking, met het kenmerk, dat men het preparaat bereidt door concentreren en zuiveren van het kweekmedium, verkregen door het kweken van de Streptomyces-stam B-M-1U6, 5 totdat het gehalte van verbinding B-Md tenminste 25 gew.$ bedraagt.

16. Preparaat volgens conclusie 15» met het kenmerk, dat het gehalte aan verbinding B-41D ongeveer 50 gev.% bedraagt. 8004791