NL8003761A

NL8003761A - Tripeptiden, werkwijze ter bereiding ervan, alsmede farmaceutische preparaten die de tripeptiden bevatten.

Info

Publication number: NL8003761A
Application number: NL8003761A
Authority: NL
Original assignee: Rhone Poulenc Ind
Priority date: 1979-06-29
Filing date: 1980-06-27
Publication date: 1980-12-31
Also published as: IT1131847B; JPS5645447A; SE448301B; DE3024369A1; ZA803886B; FR2460289A1; GB2053230B; IE49950B1; AU546524B1; FR2460289B1; CH647789A5; JPH0159275B2; LU82569A1; DK154434B; BE884076A; DK277180A; IE801340L; NZ194178A; US4916119A; GB2053230A

Description

* J

"S* N.O. 29.119 -1- s"’’ *'

Tripeptiden, werkwijzen ter bereiding ervan, alsmede farmaceutische preparaten die IfëVpeptiden bevatten.

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op nieuwe tripepti-den met de algemene formule 1, eventueel hun toxische zouten, werkwijzen ter bereiding ervan en farmaceutische preparaten die de tri-peptiden bevatten.

5 De bacteriewanden, bijvoorbeeld de mycobacteriewanden zijn in hoofdzaak samengesteld uit een peptidoglycaan gevormd uit N-acetyl-muraminezuur waarop peptiden zijn gefixeerd, die de L Ala-D Glu-DAP-keten bevatten. Aan de andere kant zijn de bacteriewanden zeer rijk aan lipiden, waarvan bepaalde vrij en extraheerbaar zijn en andere . 10 gebonden zijn aan de struktuur van de wand en worden gevormd door mycolzuren (α-vertakte en β-gehydroxyleerde reuzevetzuren). Het geheel van de bestanddelen van de celwand vormt een covalente struktuur bestaande uit een peptidoglycaan en een arabinogalactaanmyco-laat met elkaar verbonden door fosfodiësterverbindingen. Deze bacte-15 riewanden leveren het grootste deel van de biologische eigenschappen van de gehele cellen op, wanneer zij verenigd zijn met een minerale of plantaardige olie en worden toegediend na in suspensie gebracht te zijn in een fysiologische oplossing,

In de Belgische octrooischriften 821.385, 852.348 en 852.349 20 zijn peptiden beschreven gekoppeld met N-acetylmuraminezuur, die de L Ala-D Glu- of L Ser-D Glu-keten bevatten en die werkzaam zijn als immunologische toevoegsels en als anti-infektiemiddelen.

In het Franse octrooischrift 75*24440, gepubliceerd onder nummer 2.320.107, worden koppelingsprodukten beschreven tussen een vet-25 zuur en een heptapeptidesaccharide geïsoleerd uit een mypbacterie, die een was ’’D” bevat en die kan worden voorgesteld door formule 2, waarin in het bijzonder NAG N-acetylglucosamine, NAM N-acetylmura-minezuur en R een alkylgroep met 9-17 koolstofatomen voorstellen.

Deze produkten zijn de immunologische toevoegsels van de pro-30 duktie van antilichamen en van de vertraagde hypersensibiliteit, die in staat zï^jn alleen te werken, dat wil zeggen zonder dat het noodzakelijk is:'ze toe te dienen in olieachtige oplossing.

Al deze produkten worden gekenmerkt door de aanwezigheid van N-acetylmuraminezuur, dat volgens KASUMOTO c.s., Tetrahedron Letters, 35 49* (1978) 4899» beschouwd wordt als verbonden met de immunologische activiteit.

Gevonden werd nu, dat de peptiden met de algemene formule 1 800 3 7 61 ✓ -2- f Λ* .

niettegenstaande de afwezigheid van N-acetylmuraminezuur, opmerkelijke ondersteunende en immunolo-stimulerende eigenschappen bezitten. Aan de andere kant kunnen deze verbindingen, die goed gedefinieerd zijn, gemakkelijk verkregen worden met een voldoende zuiver-5 heid, die vereist is voor therapeutische toepassing.

In de algemene formule 1 stellen de symbolen R, die gelijk of verschillend kunnen zijn, een waterstofatoom of een vetzuurrest voor, met dien verstande, dat ten minste één van de symbolen R een vetzuurrest voorstelt, 10 stelt het symbool R^ een hydroxyl-, amino- of alkoxygroep, waarvan het alkyldeel 1 - 4 koolstofatomen bevat en eventueel gesubstitueerd is met een fenyl- of nitrofenylgroep, voor en stellen de symbolen R£ en R^, die gelijk of verschillend kunnen zijn, een waterstofatoom of een carboxyl-, carbamoyl- of alkoxycarbonyl-15 groep, waarvan het alkyldeel 1-4 koolstofatomen bevat en eventueel gesubstitueerd is met een fenyl- of nitrofenylgroep, voor, met dien verstande, dat de symbolen en R^ niet gelijktijdig een waterstofatoom kunnen voorstellen, en met dien verstande, dat het alanine in de L-vorm is, het glutamine-20 zuur in de D-vorm is, het lysine, wanneer één van de symbolen R^ of R^ een waterstofatoom voorstelt, in de L-vorm is en het 2.6-diamino-pimelinezuur of derivaten ervan, wanneer de symbolen R^ en R^, die gelijk of verschillend kunnen zijn, een carboxyl-, carbamoyl- of al-koxycarbonylgroep voorstellen, in de D.D; L.L; DD.LL (racemisch) of 25 D.L (meso) Twaan is.

Onder een vetzuurrest dient men een alkanoylgroep met 1-45 koolstofatomen, eventueel gesubstitueerd met een hydroxyl-, fenyl-of cyclohexylgroep, een alkenoylgroep met 5-50 koolstofatomen, die meer dan één dubbele binding kan bevatten of een mycolzuurrest, zo-50 als ontmoet wordt in de struktuur van de bacteriewand van mycobac-teriën, Nocardia of corynebacteriën, te verstaan.

Volgens de onderhavige uitvinding kunnen de nieuwe tripeptiden met de algemene formule 1 verkregen worden volgens de methoden, die in het algemeen toegepast worden bij de peptidesynthese. De verschil-55 lende reacties worden in het werk gesteld na blokkering door geschikte beschermende groepen van de amine- of zuurfunkties, die niet aan de reacties moeten deelnemen en worden gevolgd door deblokkering van deze groepen. Heer in het bijzonder kunnen de nieuwe tripeptiden met de algemene formule 1 verkregen worden door inwerking van een dipep-40 tide met de algemene formule 5i waarin R^ een vetzuurrest of een be- 800 37 61 I » -3- schermende groep van de aminegroep, zoala de benzyloxycarbonylgroep of de tert.butyloxycarbonylgroep voorstelt en R^ een aminogroep of een alkoxygroep met 1-4 koolstofatomen, eventueel gesubstitueerd met een fenyl- of nitrofenylgroep voorstelt, op een aminozuur met de 5 algemene formule 4, waarin R^ en Ry die gelijk of verschillend kunnen zijn, een waterstofatoom of een carboxyl-, carbamoyl- of alkoxy-carbonylgroep, waarvan het alkyldeel 1-4 koolstofatomen bevat en eventueel gesubstitueerd is met een fenyl- of nitrofenylgroep, voorstellen, met dien verstande, dat R^ en R^ niet gelijktijdig een wa-10 terstofatoom kunnen voorstellen en Rc een vetzuurrest of een bescher-mende groep van de aminogroep voorstelt, zoals de benzyloxycarbonylgroep of de tert.butyloxycarbonylgroep, met dien verstande, dat ten minste één van de symbolen R^ van de formules 3 en 4 een vetzuurrest voorstelt, eventueel gevolgd door vervanging: 15 - van de groep R^, wanneer deze een beschermende groep va^aminogroep voorstelt door een waterstofatoom, - van de groep R^, wanneer deze een alkoxygroep met 1 - 4 kóolstof-atomen, eventueel gesubstitueerd met een fenyl— of nitrofenylgroep voorstelt, door een hydroxylgroep, en 20 - van de groepen R^ en R^, wanneer deze een alkoxycarbonylgroep voorstellen, waarvan het alkyldeel 1-4 koolstofatomen bevat eventueel gesubstitueerd met een fenyl- of nitrofenylgroep, door een carboxylgroep.

In het algemeen is het noodzakelijk de vrije zuurgroep van het 25 dipeptide met de algemene formule 3, voorafgaande aan de inwerking daarvan op het aminozuur met de algemene formule 4, te activeren.

Bij voorkeur is het geactiveerde derivaat van het dipeptide met de algemene formule 3 een gemengd anhydride, in situ bereid door inwerking van een alkylhalogeenformiaat, zoals isobutylchloorformiaat, 30 op het dipeptide met de algemene formule 3* De condensatie van het geactiveerde derivaat wordt uitgevoerd in een organisch oplosmiddel zoals dioxan, tetrahydrofuran, chloroform, tolueen of dimethylform-amide of in een waterbevattend organisch milieu bij aanwezigheid van een base (mineraal zoals natriumhydroxide, of organisch zoals tri-35 ethylamine) bij een temperatuur tussen -10 en +30°C.

De eventuele vervanging van de R^-groep door een waterstofatoom en de groepen R^ door een hydroxylgroep en R^ en R^ door een carboxylgroep kan worden uitgevoerd volgens de bekende methoden afhankelijk van de aard van de beschermende groepen. Het is bijzonder 40 doelmatig de groepen R^, R^, R^ en R^zHanig te kiezen, dat hun ver-

Ortrt T 7 l -4-

S

vanging door een hydroxyl- of carboxylgroep, al naar de gevallen, of een waterstofatoom kan worden uitgevoerd in een enkele fase. Tot dit doel is het geschikt de groep R^ te kiezen uit de benzyloxy- of ni-trobenzyloxygroepen en de groepen R£» R^ en R^ uit de benzyloxycarbo-5 nyl- of nitrobenzyloxycarbonylgroepen. Onder deze omstandigheden wordt de vervanging van deze groepen uitgevoerd door hydrogenolyse door te werk te gaan in een geschikt organisch oplosmiddel, zoals azijnzuur (eventueel gemengd met een ander oplosmiddel zoals methanol) of in een waterbevattend organisch oplosmiddel bij aanwezigheid van een 10 katalysator, zoals palladium, bijvoorbeeld palladium-op-kool, bij een temperatuur van ongeveer 20°C en onder een druk van ongeveer 101 kPa.

Het dipeptide met de algemene formule 3 kan verkregen worden door inwerking van een geactiveerd derivaat van het L-alanine met de 15 algemene formule 5» waarin R^ zoals hiervoor gedefinieerd is, op een derivaat van het D-glutaminezuur met de algemene formule 6, waarin R^ zoals hiervoor gedefinieerd is, onder de omstandigheden, zoals hiervoor beschreven voor de inwerking van een dipeptide met de algemene formule 3 op een aminozuur met de algemene formule 20 Het dipeptide met de algemene formule 3« waarin R^ een vetzuur- rest voorstelt, kan verkregen worden door inwerking van een geactiveerd derivaat van een vetzuur met de algemene formule 7» waarin R'-CO- een vetzuurrest voorstelt, zoals hiervoor gedefinieerd, op een dipeptide met de algemene formule Q, waarin R^ zoals hiervoor 25 gedefinieerd is.

Als geactiveerd derivaat van het zuur met de algemene formule 7, is het bijzonder doelmatig een zuurhalogenide of een gemengd anhydride te gebruiken, dat in het algemeen in situ bereid wordt door inwerking van een alkylhalogeenformiaat, zoals isobutylchloorformi-30 aat, op het zuur met het de algemene formule 7 bij aanwezigheid van een base.

Wanneer men het zuur met de algemene formule 7 toepast in de vorm van een zuurhalogenide, meer in het bijzonder het chloride, verloopt de reactie in een organisch oplosmiddel, zoals diëthylether 33 of dichloormethaan, bij aanwezigheid van een base (mineraal zoals natriumhydroxide, of organisch zoals triëthylamine) bij een temperatuur tussen 0 en 30°C. In het algemeen wordt het dipeptide met de algemene formule 8 toegepast in de vorm van een zout, zoals het chloorhydraat.

hO Wanneer men het zuur met de algemene formule 7 toepast in de 800 3 7 61 , ' ' -5- ► 4 vorm van gemengd anhydride, verloopt de reactie onder de hiervoor beschreven omstandigheden voor de inwerking van een dipeptide met de algemene formule 3 op het aminozuur met de algemene formule 4. In het algemeen wordt het dipeptide met de algemene formule 8 toege-5 past in de vorm van een zout, zoals het chloorhydraat.

Het aminozuur met de algemene formule 4, waarin B^ een carbamo- ylgroep voorstelt, B^ een carboxylgroep voorstelt en B^ een benzyl- oxycarbonylgroep voorstelt, dat wil zeggen het (D)-monoamide van het benzyloxycarbonyl(D)-meso-2.6-diaminopimelinezuur, kan bereid worden 10 volgens de werkwijze beschreven in het Belgische octrooischrift 821.385.

Het aminozuur met de algemene formule 4, waarin een carbamo- ylgroep voorstelt, B^ een carboxylgroep voorstelt en B^ een vetzuur- rest of een beschermende groep van de aminogroep in de D.D of L.L 15 racemische vorm voorstelt, kan bereid worden uit het overeenkomstige 2.6-diarainopimelinezuur. Tot dit doel bereidt men volgens de bekende methode de benzylester van het 2.6-dibenzyloxycarbonylaminopimeline-zuur, dat mono-verzeept wordt volgens de techniek beschreven door A. ABENDT c.s., Boczniki Chemii Ann. Soc. Chim. Polonorum, 48, (1974) 20 1305, [Chem. Abstr., 82, (1975), 31497 g], daarna omgezet, door inwerking van ammoniakale methanol, tot het monoamide met de algemene formule 9» waarin Z een benzyloxycarbonylgroep voorstelt, die na hy-drogenolyse bij aanwezigheid van palladium-op-kool het 2.6-diamino-pimelaminezuur geeft. Door inwerking van een koperzout, zoals koper-25 (Il)bromide of basisch kopercarbonaat, op het 2,6-diaminopimelamine-zuur, ontstaat een complex, dat kan worden voorgesteld door formule 10, waarin de aminogroep op de α-plaats van de carbamoylgroep geacy-leerd kan zijn door inwerking van een geactiveerd derivaat van een zuur met de algemene formule 7» bij voorkeur een halogenide, zoals 30 het chloride, of beschermd door inwerking van een alkyl- of benzyl-halogeenformiaat. Het aldus gevormde complex wordt door inwerking van waterstofsulfide ontleed, waarbij het aminozuur met de algemene formule 4 verkregen wordt, waarin ^ een carbamoylgroep voorstelt, fi^ een carboxylgroep voorstelt en B^ zoals hiervoor gedefinieerd is.

35 Het aminozuur met de algemene formule 4, waarin fi£ een carboxyl groep voorstelt, B^ een carbamoylgroep voorstelt en B,. een vetzuur-rest of een beschermende groep van de aminogroep in de D.D, L.L, DD.LL (racemisch) of D.L (meso) vorm voorstelt, kan bereid worden uit het overeenkomstige 2.6-diaminopimelinezuur. Tot dit doel be-40 reidt men het koper(II)complex met de algemene formule 10, waarin de 800 3761 -6- aminorest op de α-plaats van de carbamoylgroep beschermd kan zijn door inwerking van een alkyl- of benzylhalogeenformiaat. Het aldus gevormde complex wordt ontleed door inwerking van waterstofsulfide, waarbij het aminozuur met de algemene formule 4 verkregen wordt, 5 waarin een carbamoylgroep voorstelt, R^ een carboxylgroep voor- stelt en R^ een beschermende groep van de arainogroep voorstelt. De aminorest op de α-plaats van de carboxylgroep kan beschermd zijn met een vetzuurrest of met een beschermende groep van de aminogroep, die verschilt van Rj.. Na verwijdering van de beschermende groep voorge-10 steld door R^ verkrijgt men de verbinding met de algemene formule 4, waarin R? een carboxylgroep voorstelt, R, een carbamoylgroep voor- ^ ^ _ /een yetzuurrest of J* stelt en R^/een beschermende groep van de aminogroep voorstelt.

Het aminozuur met de algemene formule 4, waarin de symbolen R2 en R^ identiek zijn en elk een carboxyl-, carbamoyl- of alkoxycarbo-15 nylgroep voorstellen, waarvan het alkyldeel 1 - 4 koolstofatomen bevat, eventueel gesubstitueerd met een fenyl- of nitrofenylgroep, en R^ een vetzuurrest of een beschermende groep van de aminogroep in de D.D, L.L, DD.LL (racemisch) of D.L (meso) vorm voorstelt, kan bereid worden uit een aminozuur met de algemene formule 4, waarin R2 20 en R^ zoals hiervoor gedefinieerd zijn en R^ een waterstofatoom voorstelt door monoblokkage van één van de twee aminogroepen volgens de methode beschreven door E. BRICAS c.s., Biochemistry, 9» (1970), 823.

Het aminozuur met de algemene formule 4, waarin de symbolen R2 25 en R^, die verschillend zijn, een carbamoyl- of alkoxycarbonylgroep voorstellen, waarvan het alkyldeel 1-4 koolstofatomen bevat, eventueel gesubstitueerd met een fenyl- of nitrofenylgroep, en R^ een beschermende groep van de aminogroep voorstelt in de D.D, L.L, DD.LL (racemisch) of D.L (meso) vorm, kan verkregen worden uit een amino-30 zuur met de algemene formule 4, waarin de symbolen R2, R^ en R^ zoals hiervoor gedefinieerd zijn en de aminogroep op de α-plaats van het symbool R^ beschermd is door een beschermende groep van de ami-negroep verschillend van R^, door verwijdering van deze beschermende groep, zonder R^ te beïnvloeden.

35 Het produkt met de algemene formule 4, waarin de aminogroep op de α-plaats van het symbool R^ beschermd is door een beschermende groep van de aminogroep wordt verkregen, na verestering van een verbinding met de algemene formule 4, waarin één van de symbolen R2 of R^ een carboxylgroep voorstelt en het andere symbool een carbamoyl-40 groep voorstelt, door blokkering van de aminogroep onder de gebrui- 800 3 7 61 -7- kelijke omstandigheden.

Het aminozuur met de algemene formule 4, waarin R^ een vet zuurrest of een beschermende groep van de aminogroep voorstelt, en - R^ een waterstofatoom voorstelt en R^ een carboxyl-, carbamoyl- of 5 alkoxycarbonylgroep voorstelt, waarvan het alkyldeel 1-4 kool- stofatomen bevat, eventueel gesubstitueerd met een fenyl- of ni-trofenylgroep, of - R^ een carboxyl-, carbamoyl- of alkoxycarbonylgroep voorstelt, waarvan het alkyl eel 1-4 koolstofatomen bevat , eventueel ge- 10 substitueerd met een fenyl- of nitrofenylgroep, en R^ een waterstofatoom voorstelt, kan bereid worden volgens bekende methoden uitgaande van het lysine.

Het derivaat van het L-alanine met de algemene formule 5, waarin R^ een vetzuurrest voorstelt, kan verkregen worden door inwerking 15 van een zuur met de algemene formule 7 of een geactiveerd derivaat van dit zuur op het L-alanine, waarvan de zuurgroep eventueel beschermd is in de vorm van een ester, gevolgd door, wanneer het geval zich voordoet, verwijdering van de beschermende groep van de zuurgroep.

20 Wanneer de zuurgroep van het L-alanine beschermd is, wordt de condensatie van het zuur met de algemene formule 7 in het algemeen uitgevoerd bij aanwezigheid van een condensatiemiddel, zoals dicyclo-hexylcarbodiimide, door te werk te gaan in een organisch oplosmiddel, zoals dichloormethaan of dimethylformamide, bij een temperatuur tus-25 sen -10 en +30°C.

Wanneer de zuurgroep van het L-alanine vrij is, is het noodzakelijk het zuur met de algemene formule 7» voorafgaande aan de inwerking op het L-alanine te activeren. Als geactiveerd derivaat van het zuur met de algemene formule 7 is het bijzonder doelmatig een 30 zuurhalogenide of een gemengd anhydride te gebruiken. Men gaat dan te werk onder de hiervoor beschreven omstandigheden voor de inwerking van een zuur met de algemene formule'7 op het dipeptide met de algemene formule 8,

Het dipeptide met de algemene formule 8 kan verkregen worden 35 door condensatie van het L-alanine, waarvan de aminogroep beschermd is, met het D-glutaminezuur of derivaten ervan volgens de gewoonlijk in de peptidechemie toegepaste methoden, gevolgd door verwijdering van de beschermende groep van de aminogroep.

Meer in het bijzonder kunnen de nieuwe tripeptiden met de alge-40 mene formule 1 verkregen worden door inwerking van een geactiveerd 800 3 7 61 ,; -8- derivaat van het L-alanine met de algemene formule 5 op een dipep-tide met de algemene formule 11» waarin R2» B^» R^ en R^zoals hiervoor gedefinieerd zijn, met dien verstande, dat ten minste één van de symbolen R^ van de formules 5 en 11 een vetzuurrest voorstelt, 5 onder de hiervoor beschreven omstandigheden voor de inwerking van een dipeptide met de algemene formule 3 op een aminozuur met de algemene formule 4, eventueel gevolgd door vervanging: - van de groep R^, wanneer deze een beschermende groep van de amino-groep voorstelt, door een waterstofatoom, 10 - van de groep R^, wanneer deze een alkoxygroep voorstelt met 1-4 koolstofatomen, eventueel gesubstitueerd met een fenyl- of nitro-fenylgroep, door een hydroxylgroep, en - van de groepen R^ en/of R^, wanneer deze een alkoxycarbonylgroep voorstellen, waarvan het alkyldeel 1-4 koolstofatomen bevat, 15 eventueel gesubstitueerd met een fenyl- of nitrofenylgroep, door een carboxylgroep, volgens de bekende methoden, zonder de rest van het molecuul te beïnvloeden.

Het dipeptide met de algemene formule 11 kan verkregen worden 20 door inwerking van een derivaat van het D-glutaminezuur met de algemene formule 12, waarin R^ zoals hiervoor gedefinieerd is en Y een beschermende groep van de aminegroep voorstelt, zoals de tert.butyl-oxycarbonylgroep, op een aminozuur met de algemene formule 4, gevolgd door vervanging van de beschermende groep Y zonder de rest 25 van het molecuul te beïnvloeden.

Meer in het bijzonder kunnen de nieuwe tripeptiden met de algemene formule 1 verkregen worden door inwerking van een zuur met de algemene formule 7 op een tripeptide met de algemene formule 13» waarin de symbolen R2, R^ en R^ zoals hiervoor gedefinieerd zijn en 30 de symbolen .Rg, die gelijk of verschillend kunnen zijn, een waterstofatoom of de groep R^ zoals hiervoor gedefinieerd voorstellen, waarbij ten minste één van de symbolen Rg een waterstofatoom voorstelt, onder de hiervoor beschreven omstandigheden voor de inwerking van een zuur met de algemene formule 7 op het dipeptide met de 35 algemene formule 8, eventueel gevolgd door de vervanging: - van de groep Rg, wanneer deze een beschermende groep van de aminegroep voorstelt, door een waterstofatoom, - van de groep R^, wanneer deze een alkoxygroep met 1-4 koolstofatomen voorstelt, eventueel gesubstitueerd met een fenyl- of ni- 40 trofenylgroep, door een hydroxylgroep, en 800 3 7 61 -9- - de groepen en/of Ry wanneer deze een alkoxycarbonylgroep met 1-4- koolstofatomen voorstellen, eventueel gesubstitueerd met een fenyl- of nitrofenylgroep, door een carboxylgroep zonder de rest van het molecuul te beïnvloeden, 5 De onderhavige uitvinding heeft eveneens betrekking op een werk wijze ter bereiding van de tripeptiden met de algemene formule 1 volgens de peptidesynthese van Merrifield in de vaste fase.

Deze werkwijze bestaat in hoofdzaak uit het fixeren op een geschikte drager van het aminozuur met de algemene formule 14·, waarin 10 één van de symbolen R^ en ^3 eeja carboxylgroep voorstelt en het andere symbool een waterstofatoom of een carbamoyl- of alkoxycarbonylgroep voorstelt, waarvan het alkyldeel 1-4· koolstofatomen bevat, eventueel gesubstitueerd met een fenyl- of nitrofenylgroep, Rj. een vetzuurrest of een beschermende groep van de aminegroep voorstelt en 15 B^ een beschermende groep van de aminegroep voorstelt, met dien verstande dat, wanneer R,- en R^ elk een beschermende groep van de aminegroep voorstellen, deze beschermende groepen verschillend zijn, daarna, na deblokkering van de door de groep R^ beschermde aminegroep, de condensatie van: 20 8 - hetzij het D-glutaminezuur, waarvan de amino- en a-carboxyl- groepen op geschikte wijze beschermd zijn, dat wil zeggen de verbinding met de algemene formule 15» waarin Ry zoals hiervoor gedefinieerd is en R^ een aminogroep of alkoxygroep met 1-4- koolstofatomen, eventueel gesubstitueerd met een fenyl- of nitrofenylgroep, 25 voorstelt, daarna, na deblokkering van de door de groep B,., beschermde aminogroep hetzij een derivaat van het L-alanine met de algemene formule 16, waarin Ry zoals hiervoor gedefinieerd is, daarna, na deblokkering van de door B^ beschermde aminogroep, eventueel het vetzuur met de algemene formule 7» hetzij een derivaat van het L-alanine 30 met de algemene formule 17» waarin R een vetzuurrest voorstelt, - hetzij het dipeptide met de algemene formule 18, waarin R^ zoals hiervoor gedefinieerd is en Rg een vetzuurrest of een beschermende groep van de aminogroep voorstelt, met dien verstande, dat wanneer Rg een beschermende groep van de aminogroep voorstelt, deze ver-35 schillend is van de beschermende groep R^ van de verbinding met de algemene formule 14· en dat in dat geval, men vervolgens eventueel het zuur met de algemene formule 7 laat reageren na deblokkering van de door de groep Rg beschermde aminegroep, gevolgd door scheiding van het verkregen produkt van zijn drager en eliminering, indien 4-0 noodzakelijk, van de beschermende groepen van de amino- en carboxyl- onn 17 61 : -10-groepen.

Volgens een variant van de werkwijze is het mogelijk op een geschikte drager het dipeptide met de algemene formule 19 te fixeren, waarin B^, fi^ en fi^ zoals hiervoor gedefinieerd zijn en B^ een 5 beschermende groep van de aminogroep voorstelt, met dien verstande, dat, wanneer B^ en B^ elk een beschermende groep van de aminogroep voorstellen, deze beschermende groepen verschillend zijn, daarna, na deblokkering van de door B^ beschermde aminogroep, de condensatie van: 10 - hetzij een derivaat van het L-alanine met de algemene formule 16, daarna, na deblokkering van de door beschermde aminogroep, eventueel het vetzuur met de algemene formule 7, - hetzij een derivaat van het L-alanine met de algemene formule 171 gevolgd door scheiding van het verkregen produkt van zijn drager 15 en indien noodzakelijk verwijdering van de beschermende groepen van de amino- en carboxylgroepen.

Volgens een andere variant van de werkwijze is het mogelijk het tripeptide met de algemene formule 20 op een geschikte drager te fixeren, in welke formule B£, B^t B^ en B^ zoals hiervoor gedefini-20 eerd zijn en B^ een beschermende groep van de aminogroep voorstelt, met dien verstande dat, wanneer B^ en B^q elk een beschermende groep van de aminogroep voorstellen, deze groepen verschillend zijn, daarna, na deblokkering van de door B1Q beschermde aminogroep, de condensatie van het zuur met de algemene formule 7i daarna scheiding van 25 het verkregen produkt van zijn drager en verwijdering, indien noodzakelijk, van de beschermende groepen van de amine- en carboxylgroepen.

De dragers, die bijzonder goed geschikt zijn, zijn de gechloor-methyleerde of gehydroxymethyleerde styreen-divinylbenzeencopolyme-30 ren. Bij voorkeur wordt het gechloormethyleerde styreen-divinylben-zeencopolymeer (98-2 of 99-1) gebruikt.

De fixatie van het aminozuur met de algemene formule 14 of van het dipeptide met de algemene formule 19 of van het tripeptide met de algemene formule 20 op de gechloormethyleerde drager wordt vol-35 gens de gebruikelijke methoden uitgevoerd, in het bijzonder, door het aminozuur, het dipeptide of het tripeptide in oplossing in een organisch oplosmiddel, zoals ethanol, en bij aanwezigheid van een zuurbindend middel, zoals triëthylamine, te laten reageren. Het is bijzonder doelmatig het reactiemengsel te verwarmen tot een tempera-40 tuur in de buurt van de kooktemperatuur van het oplosmiddel.

800 3 7 61 ; -11-

In de hiervoor beschreven methoden verloopt de condensatie van de aminozuren, peptiden of zuren op een aminozuur of een peptide gefixeerd op een geschikte drager, volgens de gebruikelijke methoden, die in de peptidechemie worden toegepast. Hetzelfde is het geval met 5 betrekking tot de blokkering van de groepen, die niet aan de reacties mogen deelnemen, eventueel gevolgd door hun deblokkering.

De beschermende groepen van de aminsgroepen van het aminozuur met de algemene formule 14, van het dipeptide met de algemene formule 19 of va- het tripeptide met de algemene formule 20 dienen op 10 een zodanige wijze te worden gekozen, dat hun verwijdering verloopt zonder de aminozuur-dragerbinding te beïnvloeden. In het bijzonder dienen de groepen R^, Rg, R^ en R1Q te verschillen van de groep R^ wanneer deze laatste een beschermende groep van de aminogroep voorstelt en dienen zodanig te zijn, dat hun verwijdering verloopt zon-15 der de beschermende groep R^ en de binding peptide-drager te beïnvloeden.

In het algemeen worden zij, wanneer de groepen R£, R^ of R^ es-tergroepen voorstellen, zodanig gekozen, dat tijdens de verbreking van de binding peptide-drager, zij hetzij behouden kunnen worden, 20 hetzij omgezet kunnen worden tot carboxyl- of carbamoylgroepen, afhankelijk van het feit of de verbreking een zure hydrolyse, een al-coholyse of een ammonolyse zal zijn.

Meer in het bijzonder wordt de peptide-dragerbinding, die van benzylaard is, verbroken door behandeling met behulp van een meng-25 sel van waterstofbromide en trifluorazijnzuur.

De nieuwe tripeptiden met de algemene formule 1 kunnen eventueel gezuiverd worden volgens fysische methoden (zoals kristallisatie of chromatografie) of chemische methoden (zoals vorming van een zout, kristallisatie daarvan, daarna ontleding).

50 De nieuwe verbindingen volgens de uitvinding kunnen worden om gezet tot additiezouten met zuren of tot metaalzouten of tot addi-tiezouten met organische basen, afhankelijk van de aard van de sub-stituenten.

De additiezouten met de zuren kunnen verkregen worden door in-55 werking van de nieuwe verbindingen op zuren in een geschikt oplosmiddel. In het algemeen lost men de verbinding op in water door toevoeging van de theoretische hoeveelheid van het zuur, waarna men de verkregen oplossing lyofiliseert.

De metaalzouten of de additiezouten met de organische basen *K5 kunnen verkregen worden door inwerking van de nieuwe verbindingen op onn τ7 fil -12- de basen in een geschikt oplosmiddel. In het algemeen lost men het produkt in water op door toevoeging van de theoretische hoeveelheid base, waarna men de verkregen oplossing lyofiliseert.

De nieuwe verbindingen volgens de uitvinding zijn ondersteu-5 ningsmiddelen en stimuleringsmiddelen van de immuniteit: zij verhogen de hypersensibiliteitsreacties en/of de produktie van circulerende antilichamen ten opzichte van de antigenen, waarmee zij worden toegediend en zij stimuleren op niet specifieke wijze de verde-digingsreacties tegen bepaalde infekties (bijvoorbeeld de infektie 10 van de muis met de intracellulaire bacterie Listeria monocytogenes).

In vitro zijn zij actief bij molaire concentraties, die in het algemeen liggen tussen 10” en 10 , in het bijzonder bij de volgen de proeven:

- stimulering van de ADN-synthese (mitogeen vermogen) volgens de 15 techniek van G. MARCHAL, Ann. Immunol. (Inst. Pasteur), 125 C

(1974), 519» - stimulering van de allogene reactie (histo-onverenigbaarheidsre-actie) volgens de techniek van R.W. DUTTON, J. exp. Med., 122, (1966), 759 en A.B. PECK en F.H. BACH, J. Immunol. Methods, 3, 20 (1973), 147, - stimulering van de antilichaamproduktie volgens de techniek van P.H. KLESIUS, Proc.Soc. exp. Biol. Med. (N.Y.), 135 (1970), 155 en H. VAN DIJK en N. BLOKSMA, J. Immunol. Methods, 14 (1977), 325, - vermeerdering van het aantal fagocytaire macrofagen volgens de 25 techniek van J. MICHL c.s., J. exp. Med., 144 (1976), 1465, - stimulering van de zure fosfatase en N-acetylglucosamidinase-acti-viteit (lysosomiale enzymen van de macrofagen) bij afwezigheid van een vermeerdering van het melkdeshydrogenase volgens de techniek van P. DAVIES c.s., J. exp. Med., 139 (1974), 1262.

30 In vivo bij de muis bij doseringen tussen 1 en 30 mg/kg verho gen zij de vertraagde hypersensibiliteit en de antilichaamproduktie in het bijzonder volgens de techniek van T.E. MILLER c.s., J. Nath. Cancer Inst., 51_» (1973), 1669-

Bij de cavia vermeerderen zij de hypersensibiliteitsreactie en 35 de produktie van antilichamen tegen rundergammaglobuline gekoppeld met dinitrofenolhapteen volgens de techniek van F. FLOC'H c.s., Immunol. Communie., 7 (1978), 41.

Bij de muis stimuleren zij de verdedigingsreacties tegen de infektie van de muis met Listeria monocytogenes bij doseringen tussen 40 1 en 100 mg/kg volgens de techniek van R.M. FAUVE en B. HEVIN, C.R.

800 3761 -13-

Acad. Sci. (D), 285 0977), 1589.

Bij de muis stimuleren zij het elimineringsvermogen van de col-loidale koolstof door het reticulo-endotheliale systeem volgens de techniek van B.N. HALPERN c.s., Ann. Institut Pasteur, 80 (1951)« 5 582.

Bij het konijn, bij doseringen in het algemeen gelegen tussen 0,1 en 3 og/kg, stimuleren zij de vorming van serumachtige griep-antivirus antilichamen volgens de techniek van G.H. WEBNER c.s.,

Biomedicine, 22, (1975)» 440.

10 Van zeer bijzonder belang zijn de tripeptiden met de algemene formule 1, waarin R^ een hydroxylgroep of een alkoxygroep met 1 - 4 koolstofatomen voorstelt, R^ een waterstofatoom of een carbamoyl-groep°-1ï^eeen carboxylgroep of alkoxycarbonylgroep voorstelt, waarvan het alkyldeel 1-4 koolstofatomen bevat, het symbool R, gebon-15 den aan de L-alanylrest een alkanoylgroep met 8 - 16 koolstofatomen is en het symbool R, gebonden aan de aminogroep op de α-plaats van de groep R^ een waterstofatoom is. Zeer bijzonder interessant zijn de verbindingen met de algemene formule 1, waarin B^ een hydroxylgroep voorstelt, R£*een carbamoylgroep voorstelt, R^ een carboxyl-. 20 groep voorstelt en de symbolen R zoals hiervoor gedefinieerd zijn.

De volgende voorbeelden, die als niet beperkend zijn gegeven, laten zien hoe de uitvinding in de praktijk kan worden gebracht.

De verkregen verbindingen kunnen complexen vormen met alkalime-taal- en aardalkalimetaalzouten; het gevolg is, dat de resultaten 25 van de elementairanalyse van de verbindingen duidelijk kan afwijken van de theoretische waarden. Evenwel wordt de struktuur van de verbindingen bevestigd door de verhouding C/N, die in overeenstemming is met de theorie, door het gehalte aan aminozuren en door hun homogeniteit bij chromatografie over een dunne laag silicagel.

20 Voorbeeld I.

Men voegt 1,88 cm^ isobutylchloorformiaat toe aan een op 10°C

gehouden oplossing van 7,03 g benzyl N-lauroyl L-alanyl-a-D-gluta- maat in een mengsel van 280 cm^ dioxan en 2,0 cm^ triethylamine. Het mengsel wordt gedurende 20 minuten bij 10°C geroerd, waarna men een 35 oplossing van 4,04 g N-$-benzyloxycarbonyl-L-lysine in een mengsel 3 3 van 30 cm dioxan en 14,4 cnr 1N natriumhydroxide toevoegt. Het re-actiemengsel wordt 20 uren bij ongeveer 18°C geroerd. Het gevormde onoplosbare bestanddeel wordt opgelost door toevoeging van 280 cm water. De verkregen oplossing wordt nog gedurende één uur geroerd, 40 daarna op een pH van 3 gebracht door toevoeging van 20 cnr^ 1N water- 800 37 61 -14- stofchloride. Het gevormde onoplosbare bestanddeel wordt door filtra- 3 tie afgescheiden, met 20 cm water gewassen en onder een verminderde druk van 0,04 kPa bij 20°C gedroogd. Men verkrijgt op deze wijze 7,72 g van een witte vaste stof, die men aan een chromatografische 5 behandeling onderwerpt over een kolom met een diameter van 3i5 cm, die 230 g neutraal silicagel bevat. Men elueert achtereenvolgens met 3 700 cm van een mengsel van aceton en cyclohexaan in de volumeverhou- ding 9ί1» 1,1 liter aceton en 1,7 liter methanol onder het winnen 3 van frakties van 100 cm . De frakties 22 - 35 worden verenigd, onder 10 een verminderde druk van 2,7 kPa bij 45°C tot droog geconcentreerd. Men verkrijgt op deze wijze 5»97 g Ν-α-[θ -benzyl-N-(N-lauroyl-L-alanyl)-^-D-glutamyl] N-£-benzyloxycarbonyl-L-lysine.

Hf = 0,84 [silicagel; n-butanol-pyridine-azijnzuur-water (50/ 20/6/24 in volumedelen)].

A

15 Men lost 1,77 g Ν-α-[θ -benzyl-N-(N-lauroyl-L-alanyl)-)T-D-glu- tamyl] N-£-benzyloxycarbonyl-L-lysine in 177 cm·'* methanol op. Men voegt· 1,77 g palladium-op-kool (3¾ palladium) toe, waarna men een lichte waterstofstroom gedurende 4 uren laat passeren. Na filtratie, concentratie tot droog van het filtraat, wordt de achtergebleven 20 olie opgenomen met 20 cnr aceton. Men verkrijgt op deze wijze 1,06 g van een witte vaste stof, die men herkristalliseert uit een mengsel 3 3 van 12 cm ethanol en 24 cm aceton. Men verkrijgt op deze wijze 0,9 g N-a-[N-(N-lauroyl-L-alanyl)-Jf-D-glutamyl] L-lysine dat bij 180 - 186°C smelt (pasteuze smelt).

25 Hf = 0,29 [silicagel; n-butanol-pyridine-azijnzuur-water (50/ 20/6/24 in volumedelen)].

Analyses berekend %i C 59»07 H 9*15 N 10,60 gevonden : C 58»4 & 8,8 N 10,0.

Na totale hydrolyse openbaart de analyse op de Technicon auto-30 analyse-inrichting de aanwezigheid van de volgende aminozuren:

Ala i 1,02 (theorie = 1)

Glu : 1,00 (theorie =1)

Lys : 0,89 (theorie =1).

Het benzyl N-lauroyl L-alanyl-a-D-glutamaat kan volgens één van 35 de twee volgende methoden bereid worden: a) Aan een oplossing van 12,75 g van het chloorhydraat van benzyl L-alanyl-a-D-glutamaat in 75 cm^ 1N natriumhydroxide, voegt men gelijktijdig in 37 minuten 8 g lauroylchloride opgelost in 75 cm^ ether en 37»4 cm^ 1N NaOH toe op een zodanige wijze, dat de pH van 40 het reactiemengsel tussen 8 en 9 gehouden wordt. Het mengsel wordt 800 37 61 -15- één uur en 20 minuten geroerd. Na het decanteren wordt de waterbe- 3 vattende fase op een pH van 2 gebracht door toevoeging van 60 cnr 3 1N waterstofchloride en driemaal met in totaal 300 cm ethylacetaat geëxtraheerd. De verenigde organische extrakten worden met 25 cm^ 5 water gewassen, met watervrij natriumsulfaat gedroogd en tot droog geconcentreerd onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 45°C. Men verkrijgt op deze wijze 7,4 g van een witte vaste stof, die men aan een chromatografische behandeling onderwerpt over 80 g neutraal si-licagel aanwezig in een kolom met een diameter van 2 cm. Men elueert 3 10 achtereenvolgens met 100 cm van een mengsel van ethylacetaat en methanol in de volumeverhouding 8 : 2 en 200 cm·^ van een mengsel van ethylacetaat en methanol in gelijke volumeverhouding, waarbij men frakties van 50 cm^ wint. De fraktie 1 wordt tot droog geconcentreerd onder een verminderde druk van 2*7 kPa bij 45°C. Men verkrijgt op 15 deze wijze 2 g benzyl N-lauroyl L-alanyl-a-D-glutamaat, dat bij 130°C smelt. De frakties 2-4 worden op dezelfde wijze tot droog geconcentreerd en aan een chromatografische behandeling onderworpen over 100 g neutraal silicagel (0,063 - 0,20 mm) aanwezig in een kolan 3 met een diameter van 2 cm. Men elueert met 250 cm aceton onder het 20 winnen van frakties van 25 cm^. De frakties 1 en 2 worden tot droog geconcentreerd onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 45°C. Men verkrijgt op deze wijze 4,07 g benzyl N-laiiroyl L-alanyl-a-D-gluta-maat, dat bij 130°C smelt, waarvan de eigenschappen de volgende zijn: Rf s 0,9 [silicagel; n-butanol-pyridine-azijnzuur-water (50/20/ 25 6/24 in volumedelen)].

Analyse: berekend %·. C 66,10 H 8,63 N 5»71 gevonden : C 66,3 H 8,8 N 5,6.

3 b) Men voegt 31 cm isobutylchloorformiaat toe aan een oplossing, gehandhaafd op een temperatuur van ongeveer 10°C, van 47t75 g 30 laurinezuur in 3 liter dioxan en 33,3 cm triethylamine. Het mengsel wordt gedurende 20 minuten bij 10OC geroerd, daarna voegt men in 10 minuten een tot 10°C gekoelde oplossing van 88,95 g van het chloor-hydraat van benzyl L-alanyl-a-D-glutamaat, in een mengsel van 1 liter dioxan, 476 cm^ water en 476 cm''’ 1N natriumhydroxide toe. Het 35 mengsel wordt één uur bij 10°C geroerd, daarna gedurende 18 uren bij een temperatuur van ongeveer 20°C; het mengsel wordt vervolgens verdund door toevoeging van 4 liter water, op een pH van 2 gebracht door toevoeging van 1N waterstofchloride (ongeveer 475 cm^) en 2 uren op 0°C gehouden. Het verkregen neerslag wordt door filtratie 3 3 40 afgescheiden, achtereenvolgens gewassen met 500 cm water en 500 cm 800 3 7 61 -lb- ether» daarna onder een verminderde druk van 2»7 kPa bij 20°C gedroogd. Het produkt wordt gesuspendeerd in 800 cm^, gedurende één uur geroerd, door filtratie afgescheiden en tweemaal met in totaal 3 200 cm ether gewassen. Na drogen onder een verminderde druk van 5 2,7 kPa bij 20°C verkrijgt men 71»79 g benzyl N-lauroyl L-alanyl-a-D-glutamaat, dat bij 130°C smelt.

Hf = 0,77 [silicagel; ethylacetaat-methanol (4/1 in volumede-len)].

Het chloorhydraat van benzyl L-alanyl-a-D-glutamaat kan op de 10 volgende wijze bereid worden:

Men lost 97»16 g benzyl N-tert.butyloxycarbonyl L-alanyl-a-D- 3 glutamaat op in 970 cm van een watervrije oplossing van 1,7 N water-stofchloride in azijnzuur. Men roert gedurende 2 uren, daarna voegt men snel 3»8 liter watervrije ether toe en men laat gedurende 2 uren 13 bij 0°C met rust. Het olieachtige neerslag, dat wordt gevormd, wordt gescheiden van de bovenstaande laag door decanteren, wordt opgelost in 500 cm^ aceton; de aldus verkregen oplossing wordt onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 50°C tot droog geconcentreerd. Men verkrijgt op deze wijze 88,9 g van het chloorhydraat van benzyl L-20 alanyl-a-D-glutamaat.

Het benzyl N-tert.butyloxycarbonyl L-alanyl-a-D-glutamaat kan bereid worden volgens de methode van E. BHICAS c.s., Biochemistry 9» (1970), 823.

Het N-£-benzyloxycarbonyl-L-lysine kan bereid worden volgens de 25 methode van A. NEUBERGEE c.s., Biochem. J., 37 (1943)» 515.

Voorbeeld II, 3 o

Men voegt 0,65 cm isobutylchloorformiaat toe aan een op -10 C

gehouden oplossing van 2,45 g benzyl N-lauroyl L-alanyl-a-D-gluta- maat in een mengsel van 80 cm tetrahydrofuran en 0,70 cnr triethyl- 30 amine. Het mengsel wordt gedurende 20 minuten bij -10°C geroerd, daarna voegt men een op -10°C gekoelde oplossing toe van 2,24 g van het chloorhydraat van benzyl N-£-benzyloxycarbonyl-L-lysinaat in een ~z -z ^ mengsel van 40 cnr tetrahydrofuran en 0,77 cnr triethylamine. Het reactiemengsel wordt gedurende 2 uren bij -10°C geroerd en daarna 35 gedurende 2 dagen bij ongeveer 20°C. Men concentreert vervolgens het reactiemengsel tot droog onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 40°C. De verkregen witte vaste stof wordt opgenomen in 100 cm·^ ethyl-acetaat bij 40°C, fijngewreven tot verpoedering, afgescheiden door 3 filtratie, opnieuw fijngewreven in 50 cm 0,1N waterstofchloride, 40 afgescheiden door filtratie en onder een verminderde druk van 0,04 800 37 61 -17- kPa gedroogd. Men verkrijgt op deze wijze 2,69 g benzyl Ν-α-[ 0 - ' benzyl-N-/lauroyl-L-alanyl)-y-D-glutamyl] N-£-benzyloxycarbonyl-L-lysinaat.

Rf = 0,80 [silicagel; ethylacetaat-methanol (9/1 in volumede-5 len)].

•Men lost 2,65 g benzyl Ν-α-[θ -benzyl-N-(N-lauroyl-L-alanyl)-y-D-glutamyl] N-£-benzyloxycarbonyl-L-lysinaat op in 265 cm^ azijnzuur. Men voegt 2,65 g palladium-op-kool (3% palladium) toe en men laat een lichte waterstofstroom gedurende 3 uren passeren. Na fil-10 tratie en concentratie tot droog van het filtraat onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 50°C verkrijgt men 1,81 g N-a-[N-(N-lauroyl-L-alanyl)-y-D-glutamyl] L-lysine identiek aan het bij voorbeeld I verkregen produkt.

Het benzyl N-g-benzyloxycarbonyl-L-lysinaat kan bereid worden 15 volgens de methode van T, Shiba c.s., Buil. Chem. Soc. Japan, 33, (1960), 1721.

Voorbeeld III,

Men voegt 3*17 cm^ isobutylchloorformiaat toe aan een op 10°C

gehouden oplossing van 11,96 g benzyl N-lauroyl L-alanyl-α-D-gluta- 3 3 . 20 maat in een mengsel van 490 cnr dioxan en 3*43 cnr triethylamine. De oplossing wordt gedurende 20 minuten bij 10°C geroerd, daarna voegt men een oplossinjjjjS^an 8,87 g N^-benzyloxycarbonyl-DD.LL-2.6-diamino- pimelaminezuur van 88,8# (perchloorzuurbepaling) in een mengsel van 3 3 219 cnr water en 24,4 cnr 1N natriumhydroxide. Het reactiemengsel 25 wordt gedurende 2 uren bij een temperatuur van ongeveer 10°C geroerd en daarna gedurende 15 uren bij een temperatuur van ongeveer 20°C; het reactiemengsel wordt vervolgens gefiltreerd. Aan het filtraat voegt men 360 cm^ water toe en men scheidt door filtratie een gevormd licht onoplosbaar bestanddeel af. Het filtraat wordt op een 3 30 pH van 2 gebracht door toevoeging van 49 cm 1N waterstofchloride.

Het gevormde neerslag wordt door filtratie afgescheiden, driemaal 3 met in totaal 750 cm water gewassen en gedroogd. Men verkrijgt op deze wijze 16,3 g van een wit poeder, dat men aan een chromatografi-sche behandeling onderwerpt over 800 g neutraal silicagel (0,0635 -35 0,20 mm) aanwezig in een kolom met een diameter van 6 cm. Daartoe lost men de 16,3 g poeder op in 800 cm^ methanol en aan de verkregen oplossing voegt men 160 g Fontainebleau-zand toe. Men verdampt het mengsel onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 60°C tot droog en het aldus verkregen residu wordt op de silicagelkolom gebracht. Men 40 elueert achtereenvolgens met 1 liter ethylacetaat, 4 liter van een 800 3 7 61 «, 18 mengsel van ethylacetaat en methanol in de volumeverhouding 9:1» 7 liter van een mengsel van ethylacetaat en methanol in de volumever-houding 85:15 en 4 liter van een mengsel van ethylacetaat en methanol in de volumeverhouding 1:1 onder het winnen van frakties van 5 250 cm^. De frakties 45-60 worden verenigd en tot droog geconcen treerd onder een verminderde druk van 2,7 kPa hij 60°C. Men ver- p 1 krijgt op deze wijze 9>4 g N [0 -benzyl-N-(N-lauroyl-L-alanyl)-/-D-glutamyl] N^-benzyloxycarbonyl-DL.LL-2.6-diamino-pimalaminezuur.

Rf = 0,83 [silicagel; n-butanol-pyridine-azijnzuur-water (50/ 10 20/6/24 in volumedelen)].

Men lost 4,07 g N -[o -benzyl-N-(N-lauroyl-L-alanyl)- /-D-gluta-myl] N -benzyloxycarbonyl-DD.LL-2.6-diamino-pimelinezuur op in 200 cm^ azijnzuur. Men voegt 4 g palladium-op-kool {3% palladium) toe en men laat een geringe waterstofstroom gedurende 7 uren doorgaan. Na 15 filtratie en concentratie tot droog van het filtraat onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 60°C, wordt de verkregen schuim opge- 3

nomen met in totaal 45 cm methylcyclohexaan en telkens droog gemaakt onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 60°C. Het aldus verkregen poeder wordt onder een verminderde druk van 0,04 kPa bij 50°C

2 20 gedroogd. Men verkrijgt 2,76 g N-(N-lauroyl-rL-alanyl-Jf-D-glutamyl)-DD.IL-2.6-diamino-pimelaminezuur.

Rf = 0,48 (silicagel, azijnzuur)

Analyse: berekend %·, C 56,72 H 8,64 N 12,25 gevonden %x C 55>4 H 8,5 N 10,9* 25 Na totale hydrolyse openbaart de analyse op de Technicon auto- analyse-inrichting de aanwezigheid van de volgende aminozuren:

Ala 1,00 (theorie = 1)

Dap 0,99 (theorie = 1)

Glu 1,05 (theorie = 1).

g 30 Het N-benzyloxycarbonyl-DD.LL-2.6-diamino-pimelaminezuur kan op de volgende wijze bereid worden:

Aan een oplossing van 9,7 g van het diehloorhydraat van DD.LL- 2 2.6-diaminopimelaminezuur in 63 cm water, dat op een pH van 10 is 3 gebracht door toevoeging van 37 cm 1N natriumhydroxide, voegt men 55 4,35 g koper(il)bromide opgelost in 44 cm^ water toe. Men roert het reactiemengsel gedurende 2 uren bij ongeveer 20°C. Men scheidt door filtratie een licht onoplosbaar bestanddeel af, daarna koelt men het filtraat tot een temperatuur tussen -3 en 0°C. Men voegt 9,2 g na-triumwaterstofcarbonaat toe en vervolgens druppelsgewijze in 30 mi-40 nuten 7,9 cm^ benzylchloorformiaat. Het reactiemengsel wordt gedu- 800 37 61 18a rende 18 uren bij een temperatuur ran ongeveer 20°C geroerd. Het gevormde blauwe precipitaat wordt door filtratie afgescheiden, met 15 5 3 3 cm water, tweemaal met in totaal 30 cm ethanol en 15 cm ether ge- 800 3 7 61 -19- wassen. Na drogen onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 50°C verkrijgt men 9*6 g van het koper(II)complex van het N^-benzyloxy-carbonyl-DD.LL-2.6-diaminopimelaminezuur, dat men toevoegt aan 60 cm^ 1N waterstofchloride. Men roert gedurende één uur bij een tem-5 peratuur van ongeveer 20°C. Een onoplosbaar bestanddeel wordt door 3 filtratie afgescheiden. Aan het filtraat voegt men 30 cm methanol toe, waarna men een waterstofsulfidestroom gedurende 90 minuten laat doorgaan. Men laat gedurende 16 uren met rust. De verkregen zwarte 2 suspensie wordt gefiltreerd en viermaal met in totaal 160 cnr water 10 gewassen. De verenigde filtraten worden geconcentreerd tot een vo- 3 o lume van 30 cm onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 50 C, op een pH van 9 gebracht door toevoeging van 7*5 cm'* triethylamine, verdund door toevoeging van 20 cra^ water en op een pïï van 6 gebracht door toevoeging van 5»5 cm3 1N waterstofchloride. De aldus verkregen 15 witte suspensie wordt 2 uren bij 0°C bewaard. Het produkt, dat door filtratie wordt afgescheiden, wordt achtereenvolgens gewassen met 3 3 20 cm water en 20 cm ethanol en onder een verminderde druk ge-droogd. Men verkrijgt op deze wijze 5*8 g N -benzyloxycarbonyl-DD.LL- 2.6-diaminopimelaminezuur van 96% (perchloorzuurbepaling).

20 Het dichloorhydraat van het DD.LL-2.6-diaminopimelaminezuur kan op de volgende wijze bereid worden:

Men lost g DD.LL-2.6-dibenzyloxycarbonylaminopimelaminezuur op in een mengsel van 1,6 liter methanol en 14,6 cm'* geconcentreerd zoutzuur (d = 1,19). Men voegt 83 g palladium-op-kool (3% palladium) 25 toe en men laat een waterstofstroom gedurende 10 uren doorgaan. Na filtratie en concentratie tot droog van het filtraat onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 60°C verkrijgt men 40,5 g van het dichloorhydraat van het DD.LL-2.6-diaminopimelaminezuur in de vorm van een schuim.

30 Het DD.LL-2,6-dibenzyloxycarbonylaminopimelaminezuur kan op de volgende wijze bereid worden:

Men lost 168 g van de monobenzylester van DD.LL-2.6-dibenzyloxy-carbonylaminopimel^--inezuur op in 1,68 liter methanol. Men koelt deze oplossing tot 0°C en men verzadigt met ammoniak. Zodra de oplos-35 sing verzadigd is giet men deze over in drie autoclaven van 1 liter. Na deze autoclaven te hebben gesloten bewaard men deze gedurende 40 uren bij ongeveer 20°C. Na ontgassing wordt de verkregen oplossing onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 60°C geconcentreerd. Het residu wordt opgelost in 2 liter water en de verkregen oplossing 40 wordt op een pH van 2 gebracht door toevoeging van 4N waterstofchlo- 800 3 7 61 -20- ride, Er ontstaat een gomachtig precipitaat, dat men isoleert door decanteren, fijnwrijft met 2 liter ether, door filtratie scheidt, 3 tweemaal met in totaal 400 cm ether en tweemaal met in totaal 400 cm-^ water wast. Na droging verkrijgt men 83,5 g DD.LL-2.6-dibenzyl-5 oxycarbonylaminopimelaminezuur, dat bij 145 - 150°C smelt.

Rf = 0,69 [silicagel; n-butanol-water-geconcentreerde ammoniak (VVV1 in volumedelen)].

De monobenzylester van het DD.LL-2.6-dibenzyloxycarbonylaraino-pimel—inezuur kan bereid worden volgens de methode van A. ARENDT 10 c.s., Roczniki Chemii Ann. Soc. Chim. Polonorum 48, (1974), 1305, [Chem. Abstr., 82, (1975), 31497 g].

Voorbeeld IV,

Men voegt 0,81 cm''* isobutylchloorformiaat toe aan een op -5°C

gehouden oplossing van 2,5 g N-lauroyl L-alanyl-D-isoglutamine in 15 150 cm^ dimethylformamide en 0,87 cm^ triëthylamine. Het mengsel wordt gedurende 20 minuten bij -5°C geroerd, daarna voegt men een tot +2°C gekoelde oplossing toe van 2,02 g N^-benzyloxycarbonyl- DD.LL-2.6-diaminopimelaminezuur in een mengsel van 62,5 cm^ water en 6,25 cm^ in natriumhydroxide. Het reactiemengsel wordt gedurende één 20 uur bij 0°C geroerd, daarna gedurende 18 uren bij ongeveer 20°C en vervolgens gefiltreerd. Het filtraat, verdund door toevoeging van 300 cm^ water, wordt op een pH van 1 gebracht door toevoeging van 3 15 cm 1N waterstofchloride. Het verschenen neerslag wordt afgescheiden door filtratie, driemaal met in totaal 30 cm^ water gewassen en 25 daarna gedroogd. Men verkrijgt op deze wijze 2,03 g van een witte vaste stof, waaraan men 680 mg van een produkt verkregen onder ana- 3 loge omstandigheden toevoegt. Het mengsel wordt opgelost in 30 cm azijnzuur, dat 5 g neutraal silicagel (0,04 - 0,063 mm) bevat. Men concentreert tot droog, daarna brengt men het residu op een kolom 30 met een diameter van 2 cm, die 60 g neutraal silicagel (0,04 - 0,063 mm) bevat. Men elueert achtereenvolgens met 400 cm·'* van een mengsel van ethylacetaat en azijnzuur in de voluraeverhouding 9:1, 3é0 cm^ van een mengsel van ethylacetaat en azijnzuur in de volumeverhouding 8:2, 240 cm^ van een mengsel van ethylacetaat en azijnzuur in 3 35 de volumeverhouding '70, 160 cm van een mengsel van ethylacetaat en azijnzuur in de volumeverhouding 1:1 en 480 cm^ azijnzuur onder het winnen van frakties van 40 cm^, De frakties 17-49 worden verenigd en tot droog geconcentreerd. Men verkrijgt op deze 1,78 g N -[N-(N-lauroyl-L-alanyl)-D-isoglutaminyl] N^-benzyloxycarbonyl-DD.LL-2.6-40 diaminopimelaminezuur.

800 37 61 ~eL I-

Ef = 0,65 [silicagel; ethylacetaat-azijnzuur (3/1 in volumede- len)].

2 •Men lost 1,76 g N -[N-(N-lauroyl-L-alanyl)-D-isoglutaminyl]- 6 3 N -benzyloxycarbonyl-DD.LL-2.6-diaminopimelaminezuur op in 80 car 5 azijnzuur. Men voegt 1,76 g palladium-op-kool (J>% palladium) toe en daarna laat men gedurende 2,5 uren een waterstofstroom doorgaan. Na .

3 filtratie wordt het filtraat geconcentreerd tot ongeveer 5 cm en verdund door toevoeging van 100 cm^ ether. Het gevormde neerslag 3 wordt door filtratie afgescheiden, tweemaal met in totaal 40 cm 2 10 ether gewassen en gedroogd. Men verkrijgt op deze wijze 1,37 g N -[N-( N-lauroyl-L-alany1)-D-isoglutaminyl]-DD.LL-2.6-diaminopimelami-nezuur.

Rf = 0,40 [silicagel; n-butanol-pyridine-azijnzuur-water (50/20/ 6/24 in volumedelen)].

15 Het N-lauroyl L-alanyl-D-isoglutamine kan op de volgende wijze bereid wordeni

Men lost 6,6 g benzyl N-lauroyl L-alanyl-D-isoglutaminaat op in 3 330 cm azijnzuur. Men voegt 6,6 g palladium-op-kool (3¾ palladium) toe, daarna laat men een langzame stroom waterstofgas gedurende 2 20 uren doorstromen. Na filtratie van het reactiemengsel giet men het filtraat in 3 liter water. Na 2 uren bij 0°C met rust gelaten te zijn wordt het verschenen neerslag door filtratie afgescheiden, tweemaal met in totaal 80 cm^ water gewassen en daarna gedroogd. Men verkrijgt op deze wijze 5*16 g produkt, waaraan men 0,5 g van een onder 25 analoge omstandigheden verkregen produkt toevoegt. Dit mengsel wordt in 90 cm^ kokende methanol opgelost en aan de verkregen oplossing voegt men 45 cm^ water toe. Na 2 uren op een temperatuur van ongeveer 20°C te zijn gehouden worden de verschenen kristallen door fil- 3 tratie afgescheiden, tweemaal met in totaal 60 cm water gewassen en 30 onder een verminderde druk van 2,7 kPa gedroogd. Men verkrijgt op deze wijze 5»1 g N-lauroyl L-alanyl-D-isoglutamine, dat bij 163°C smelt.

Rf = 0,18 [silicagel; ethylacetaat-methanol (4/1 in volumedelen)].

35 -Analyse* berekend %i C 60,12 H 9»33 N 10,52 gevonden : C60,2 H9,5 N 10,9«

Het benzyl N-lauroyl L-alanyl-D-isoglutaminaat kan op de volgende wijze bereid worden* 3 o

Men voegt 2,5^ cnr isobutylchloorformiaat toe aan een op 0 C

40 gehouden oplossing van 3,9 g laurinezuur in 156 cm^ watervrije tolu- 800 3 7 61 3 -22- een en 2,7 cm triethylamine. Het mengsel wordt gedurende 20 minuten bij 0°C geroerd, daarna voegt men een tot 0°C gekoelde oplossing van 6,7 g van het chloorhydraat van benzyl L-alanyl-D-isoglutaminaat in 32 cm^ water en 2,7 cm^ triethylamine toe. Het reactiemengsel wordt 5 gedurende 65 uren bij een temperatuur van ongeveer 20°C geroerd. Men verkrijgt een reactiemassa met een gelatineus uiterlijk, waaraan men 150 cra^ ethylacetaat toevoegt. Het neerslag wordt door filtratie af- 3 gescheiden, met 30 cm water gewassen en daarna gedroogd. Men verkrijgt 7»6 g benzyl N-lauroyl L-alanyl-D-isoglutaminaat in de vorm •10 van een wit poeder. De waterbevattende fase van het voorafgaande fil-traat wordt tweemaal met in totaal 100 cm-^ ethylacetaat geëxtraheerd, deze ethylacetaatfase wordt verenigd met de organische fase van het filtraat, met 125 cm^ 0,1N waterstofchloride en 120 cm^ water gewassen, met magnesiumsulfaat gedroogd en daarna onder een verminderde 15 druk van 2,7 kPa bij 50°C tot droog geconcentreerd. Men verkrijgt weer 1,5 g benzyl N-lauroyl L-alanyl-D-isoglutaminaat. Het produkt (7,6 g en 1,5 g) wordt herkristalliseerd uit 120 cm^ methanol. Men verkrijgt op deze wijze 6,6 g benzyl N-lauroyl L-alanyl-D-isoglutaminaat, dat bij 169°C smelt.

20 Hf = 0,13 [silicagel; ethylacetaat.].

Het chloorhydraat van benzyl L-alanyl-D-isoglutaminaat kan bereid worden volgens de methode van S. KUSUMOTO, Buil. Chem. Soc.

Japan 49 (1976), 533.

Voorbeeld V,

25 Men voegt 0,91 cm^ isobutylchloorformiaat toe aan een op 0°C

gehouden oplossing van 3,04 g benzyl N-octanoyl L-alanyl-a-D-gluta-maat in 150 cm"'’ tetrahydrofuran en 0,98 cm^ triethylamine. Het mengsel wordt gedurende 20 minuten bij 0°C geroerd, daarna voegt men o 6 een tot 2 C gekoelde oplossing toe van 2,26 g N -benzyloxycarbonyl- 30 DD.LL-2.6-diaminopimelfnezuur in een mengsel van 70 cm^ water en 3 7 cm 1N natriumhydroxide. Het reactiemengsel wordt gedurende één uur bij 0°C geroerd en daarna gedurende 20 uren bij een temperatuur van ongeveer 20°C. De tetrahydrofuran wordt vervolgens onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 50°C verdampt. Het concentraat wordt ver- 35 dund door toevoeging van 50 cm^ water en op een pH van 1 gebracht 3 door toevoeging van 10 cm 1N waterstofchloride. Het verkregen witte neerslag wordt door filtratie afgescheiden, driemaal met in totaal 3 75 cm water gewassen en daarna gedroogd. Men verkrijgt op deze wijze 4,73 g van een witte vaste stof, die aan een chromatografische be-40 handeling wordt onderworpen over een kolom met een diameter van 2,2 8 0 0 3 7 61 -23- cm, die 100 g neutraal silicagel (0,0*f - 0,063 mm) bevat. Tot dat 3 doel wordt het produkt opgelost in 20 cm azijnzuur. Aan de verkregen oplossing voegt men 10 g neutraal silicagel toe en concentreert men onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 50°C. Het aldus ver-3 kregen residu wordt op de kolom gebracht en men elueert achtereenvolgens met 280 cm^ ethylacetaat, 360 cm·^ van een mengsel van ethyl- 3 acetaat en azijnzuur in de volumeverhoudmg 9i1* 200 cm van een mengsel van ethylacetaat en azijnzuur in de volumeverhouding 8:2, 3 1βθ cm van een mengsel van ethylacetaat en azijnzuur in de volume- 3 10 verhouding 1:1 onder het winnen van frakties van *t0 cm . De verenig-, de frakties 13 - 23 worden tot droog geconcentreerd onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 30°C. Men verkrijgt een olie, die in ether vast wordt. Na scheiding door filtratie en drogen verkrijgt men N^-fO^-benzyl-N-iN-octanoyl L-alanyl)-/-D-glutamyl]-N^-benzyl-15 oxycarbonyl-DD.LL-2.6-diaminopimelaminezuur.

Hf a 0,68 [silicagel; ethylacetaat-azijnzuur (3:1 in volumede-len)].

<Men lost 2,82 g N^-[0^-benzyl-N-(N-octanoyl-L-alanyl)-Y-D-glu- g * tamyl]-N°-benzyloxycarbonyl-DD.LL-2.6-diaminopimelaminezuur op in 20 80 cm· azijnzuur. Men voegt 2,82 g palladium-op-kool (3# palladium) toe, waarna men gedurende 2,3 uren een waterstofstroom laat doorgaan.

3

Na filtratie wordt het filtraat tot ongeveer 3 cm geconcentreerd onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 50°C en verdund door toe- 3 voeging van 100 cm ether. Men verkrijgt een neerslag, dat door fil- 3 25 tratie wordt afgescheiden, met 20 cnr ether wordt gewassen en daarna 2 wordt gedroogd. Men verkrijgt op deze wijze 2,0 g N -[N-(N-octanoyl-L-alanyl)- y-D-glutamyl]-DD.LL-2.6-diaminopimelaminezuur, dat bij 160 - 16**°C smelt (pasteuze smelting).

Hf = 0,30 [silicagel; n-butanol-pyridine-azijnzuur-water (50/ 30 20/6/2** in volumedelen)].

Analyse: berekend C 53»58 H 8,02 N 13*38 gevonden : C 53*05 H 8,17 N 13*06.

Na totale hydrolyse openbaart de analyse op de Technicon auto-analyse-inrichting de aanwezigheid van de volgende aminozuren: 35 Ala 1,00 (theorie =1)

Dap 0,95 (theorie =1)

Glu 1,02 (theorie = 1).

Het benzyl N-octanoyl L-alanyl-a-D-glutamaat kan op de volgende wijze bereid worden:

*f0 Men voegt 3*6 cm^ isobutylchloorformiaat toe aan een op -1°C

800 3761 -24- gehouden oplossing van 3*95 g octaanzuur in 140 cra^ tetrahydrofuran en 3,8 cm^ triëthylamine. Het mengsel wordt gedurende 20 uren bij -1°C geroerd, daarna voegt men een tot 0°C gekoelde oplossing van 9,45 g van het chloorhydraat van benzyl L-alanyl-a-D-glutamaat in 3 een mengsel van 3b-8 cur 1N natriumhydroxide en 30 cm water toe.

Het reactiemengsel wordt één uur bij -1°C geroerd en daarna gedurende 20 uren bij ongeveer 20°C. Het mengsel wordt op een pH van 1 gebracht door toevoeging van 1N waterstofchloride. Het tetrahydrofuran wordt onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij b3°C verdampt, daar-10 na wordt het concentraat geëxtraheerd met 100 cm^ ethylacetaat. De aldus verkregen organische fase wordt tweemaal met in totaal 50 cm^ 1N waterstofchloride en 25 cm^ van een verzadigde oplossing van na-triumchloride gewassen en onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij b3°C tot droog geconcentreerd. Men verkrijgt op deze wijze 10 g van 15 een lichtgele olie, die aan een chromatografische behandeling onderworpen wordt op een kolom met een diameter van 2,5 cm, die 200 g neutraal silicagel (0,063 - 0,20 mm) bevat. Men elueert met ethylacetaat onder het winnen van frakties van 100 cm^. De verenigde frakties 7-9 worden onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 45°C tot 20 droog geconcentreerd. Het verkregen residu wordt fijngewreven in 100 cm^ van een mengsel van ether en petroleumether (kookpunt 33 -60°C (1/4 in volumedelen), door filtratie afgescheiden en gedroogd. Men verkrijgt op deze wijze 3,27 g benzyl N-octanoyl L-alanyl-a-D-glutamaat in de vorm van een wit poeder.

25 Hf = 0,56 [silicagel; ethylacetaat-methanol (8/2 in volumede len)].

Voorbeeld VI.

3 o

Men voegt 0,70 cnr isobutylchloorformiaat toe aan een op 2 C

gehouden oplossing van 2,91 g benzyl N-palmitoyl L-alanyl-a-D-gluta-30 maat in 120 cm^ tetrahydrofuran en 0,75 cm^ triëthylamine. Het mengsel wordt gedurende 20 minuten bij 2°C geroerd, daarna voegt men een tot 2°C gekoelde oplossing toe van 1,726 g N^-benzyloxycarbonyl-DD.LL-2.6-diaminopimelaminezuur in een mengsel van 53,4 cm^ water en 5,34 cm^ 1N natriumhydroxide. Het reactiemengsel wordt gedurende één 35 uur bij 2°C geroerd en daarna gedurende 18 uren bij een temperatuur van ongeveer 20°C. De tetrahydrofuran wordt onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 50°C verdampt. Het concentraat wordt verdund 3 door toevoeging van 50 cm water en op een pH van 1 gebracht door toevoeging van 10 cm^ 1N waterstofchloride. Het verkregen witte neer-40 slag wordt door filtratie afgescheiden, driemaal met in totaal 75 cm^ 800 37 61 -25- water gewassen en gedroogd. Men verkrijgt op deze wijze 4,15 g van een witte vaste stof, die aan een chromatografische behandeling onderworpen wordt op een kolom met een diameter van 5 cm, die 85 g neutraal silicagel (0,04 - 0,063 mm) bevat. Hiertoe wordt het produkt 5 opgelost in azijnzuur bij 600C. Aan de verkregen oplossing voegt men 10 g neutraal silicagel toe, waarna men onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 50°C concentreert. Het aldus verkregen residu wordt op de kolom gebracht en men elueert achtereenvolgens met 520 cm^ ethylacetaat, 360 cra^ van een mengsel van ethylacetaat en 3 10 azijnzuur in de volumeverhouding 9ί1, 320 cm van een mengsel van ethylacetaat en azijnzuur in de volumeverhouding 8:2 onder het winnen van frakties van 40 cm^. De verenigde frakties 14-22 worden onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 50°C tot droog geconcentreerd.

15 Het verkregen residu wordt fijngewreven in 50 cm^ ether, afge scheiden door filtratie en gedroogd. Men verkrijgt op deze wijze 2,20 g N^-[0^-benzyl-N-(N-palmitoyl-L-alanyl)-y-D-glutamyl]-N^-benzyloxycarbonyl-DD.LL-2.6-diaminopimelaminezuur.

Hf = 0,75 [silicagel; ethylacetaat-azijnzuur (3/1 in volumede-20 len)].

•Men lost 2,14 g N^-[01-benzyl-N-(N-palmitoyl-L-alanyl)-Y-D-glutamyl]-N^-benzyloxycarbonyl-DD.LL-2.6-diaminopimelaminezuur op in 80 cm"'* azijnzuur. Men voegt 2,14 g palladium-op-kool (3¾ palladium) toe, waarna men een langzame waterstofstroom gedurende 2,5 uren laat 25 doorgaan. Na filtratie wordt het filtraat geconcentreerd tot ongeveer 5 cra^ onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 50°C en daarna verdund door toevoeging van 100 cm^ ether. Men verkrijgt een neerslag, dat door filtratie wordt afgescheiden, tweemaal met in totaal 3 20 cm ether wordt gewassen en gedroogd. Men verkrijgt op deze wijze 30 1,58 g N2_[N-(N-palmitoyl-L-alanyl)-)f'-D-glutamyl]-DD.LL-2.6-diamino-pimelaminezuur.

Rf = 0,30 [silicagel; n-butanol-pyridine-azijnzuur-water (50/ 20/6/24 in volumedelen)].

Het benzyl N-palmitoyl L-alanyl-a-D-glutamaat kan op de volgende 35 wijze bereid wordeni

Men voegt 3,6 cm^ isobutylchloorformiaat toe aan een op 0°C gehouden oplossing van 7»03 g palmitinezuur in 140 cm^ tetrahydrofuran en 3,8 cm^ triëthylamine. Het mengsel wordt gedurende 20 minuten bij 0°C geroerd, daarna voegt men een tot 0°C gekoelde oplossing toe van 40 9»45 g van het chloorhydraat van benzyl L-alanyl-a-D-glutamaat in 800 3761 ; -26- 3 3 een mengsel van 5½,8 cnr 1N natriumhydroxide en 30 cm water. Het re- actiemengsel wordt gedurende één uur bij 0°C geroerd en daarna 18 uren bij ongeveer 20°C; vervolgens wordt het mengsel op een pH van 1 gebracht door toevoeging van 70 cm^ 1N waterstofchloride. Het ge- 5 vormde neerslag wordt door filtratie afgescheiden, vijfmaal met in 3 totaal 200 cm water gewassen en gedroogd. Men verkrijgt op deze wijze 12,11 g van een wit poeder, dat aan een chromatografische behandeling wordt onderworpen over een kolom met een diameter van 2,5 cm, die 200 g neutraal silicagel (0,063 - 0,20 mm) bevat. Men elueert 3 3 10 achtereenvolgens met 200 cm ethylacetaat, 300 cm van een mengsel van ethylacetaat en methanol in de volumeverhouding 9:11 1,6 liter van een mengsel van ethylacetaat en methanol in de volumeverhouding 8:2, kOQ cm^ van een mengsel van ethylacetaat en methanol in de volumeverhouding 6:½ onder het winnen van frakties van 100 cm^. De ver-15 enigde frakties 5-23 worden onder een verminderde druk van 2,7 kPa tij 45°C tot droog geconcentreerd. Men verkrijgt op deze wijze 5,18 g van een vaste stof, die men in 50 cm^ kokende ether gedurende 30 minuten fijnwrijft. Na afkoelen tot een temperatuur van ongeveer 20°C wordt het onoplosbare bestanddeel door filtratie afgescheiden, 20 driemaal met in totaal 75 cm^ ether gewassen en daarna gedroogd. Men verkrijgt op deze wijze 2,9½ g benzyl N-palmitoyl L-alanyl-a-D-gluta-maat.

Ef = 0,77 [silicagel; ethylacetaatJ.

Voorbeeld VII.

3 o

25 Men voegt 1,3 cm isobutylchloorformiaat toe aan een op -5 C

gehouden oplossing van 4,9l/l&nzyl N-lauroyl L-alanyl-a-D-glutamaat in een mengsel van 250 cm^ tetrahydrofuran en 1,½ cm^ triëthylamine.

Het mengsel wordt gedurende 20 minuten bij -5°C geroerd, daarna voegt men een tot 0°C gekoelde oplossing toe van het chloorhydraat 3 30 van methyl N-£-benzyloxycarbonyl-L-lysinaat in een mengsel van 10 cm 3 1N natriumhydroxide en 10 cm water. Het reactiemengsel wordt gedu_ rende 10 minuten bij -5°C geroerd en daarna gedurende ½ dagen bij een temperatuur van ongeveer 20°C. Vervolgens wordt het reactiemengsel op een pH van 1 gebracht door toevoeging van 20 cm3 1N water-35 stofchloride. Men verdampt de tetrahydrofuran door concentratie onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 45°C. Het concentraat wordt vijfmaal geëxtraheerd met in totaal 150 cm^ chloroform. De verenigde chloroformextrakten worden gewassen met ^fO cm^ 0,1N waterstof chloride en met natriumsulfaat gedroogd. Na concentratie tot droog on-kO der een verminderde druk van 2,7 kPa bij 50°C verkrijgt men een 800 37 61 3 -27- lichtgele olie, die men oplost in 60 cm chloroform, die 15 g neutraal silicagel (0,04 - 0,063 mm) bevat. Men concentreert het mengsel tot droog en men brengt het geheel op een kolom met een diameter van 3 cm, die 150 g neutraal silicagel (0,04 - 0,063 mm) bevat.

5 Men elueert achtereenvolgens met 2,5 liter ethylacetaat en 400 cm^ van een mengsel van ethylacetaat en azijnzuur in de volumeverhouding 95i5 onder het winnen van frakties van 100 cm^. De verenigde frak-ties 6-27 worden onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 50°C tot droog geconcentreerd. Men verkrijgt op deze wijze 3»47 g methyl 10 Ν-α-[θ -benzyl-N-(N-lauroyl-L-alanyl)-y-D-glutamyl]-N-f-benzyloxy-carbonyl-L-lysinaat in de vorm van een wit poeder.·

Hf = 0,70 [silicagel; ethylacetaat-azijnzuur (95/5 in volumede-len)].

• Rf = 0,40 [silicagel; ethylacetaat],

A

15 Men lost 3,43 g methyl Ν-α-[θ -benzyl-N-(N-lauroyl-L-alanyl)-y- D-glutamyl]-N-6-benzyloxycarbonyl-L-lysinaat op in 70 cm^ azijnzuur. Men voegt 3,43 g palladium-op-kool (3# palladium) toe, waarna men een geringe waterstofstroom gedurende 2 uren laat doorgaan. De katalysator wordt door filtratie afgescheiden, tweemaal met in totaal 20 20 cm^ azijnzuur gewassen, de verenigde filtraten worden onder een verminderde druk van 2,7 kPa hij 50°C tot droog geconcentreerd. Het aldus verkregen residu wordt fijngewreven in 50 cm^ ether. Men verkrijgt op deze wijze een poeder, dat men door filtratie afscheidt en aan de lucht droogt. Men verkrijgt op deze wijze 1,89 g methyl N-a-25 [N-(N-lauroyl-L-alanyl)-y-D-glutamyl]-L-lysinaat.

Rf = 0,50 [silicagel; n-butanol-pyridine-azijnzuur-water (50/ 20/6/24 in volumedelen)].

Rf = 0,29 (silicagel; azijnzuur).

Voorbeeld VIII.

3

30 Men voegt 1,6 cnr isobutylchloorformiaat toe aan een op -5°C

gehouden oplossing van 6,07 g benzyl N-lauroyl L-alanyl-a-D-gluta- 3 3 maat in een mengsel van 280 cnr tetrahydrofuran en 1,74 cm tri-ethylamine. Het mengsel wordt gedurende 20 minuten bij -5°C geroerd; daarna voegt men een tot 3°C gekoelde oplossing toe van 4 g N^-35 benzyloxycarbonyl-meso-2(L),6(D)-diaminopimelaminezuur in een mengsel van 12,4 cm^ 1N natriumhydroxide en 124 cm^ water. Het reactie-mengsel wordt gedurende 10 minuten bij 0°C geroerd en daarna gedurende 70 uren bij ongeveer 20°C. Het reactiemengsel wordt vervolgens op een pH van 1 gebracht door toevoeging van 20 cm·^ 1N waterstof-40 chloride. Men verdampt de tetrahydrofuran door concentratie onder 800 3 7 61 : -28- een verminderde druk van 2,7 kPa bij 50°C, In het concentraat heeft men een wit neerslag, dat men door filtratie afscheidt, driemaal met 3 in totaal 150 cm 0,1N waterstofchloride en driemaal met in totaal 3 150 cm water wast en onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 5 20°C droogt. Men verkrijgt op deze wijze 9 »15 g van een wit poeder, 3 dat men oplost in 100 cnr azijnzuur, dat 20 g neutraal silicagel (0,04 - 0,063 mm) bevat. Men concentreert het mengsel tot droog en men brengt het geheel op een kolom met een diameter van 5 cm, die 400 g neutraal silicagel (0,04 - 0,063 mm) bevat, 10 Men elueert achtereenvolgens met: 1,6 liter ethylacetaat, 900 cm^ van een mengsel van ethylacetaat en azijnzuur in de volume- verhouding 97»5:2,5» 3 1200 cm van een mengsel van ethylacetaat en azijnzuur in de volume- 15 verhouding 95*5» 3 900 cm van een mengsel van ethylacetaat en azijnzuur in de volume-verhouding 92,5/7»5» 900 cm^ van een mengsel van ethylacetaat en azijnzuur in de volume- verhouding 90:10, 3 20 300 cnr van een mengsel van ethylacetaat en azijnzuur in de volume-verhouding 85:15» 3200 cm^ van een mengsel van ethylacetaat en azijnzuur in de volume-verhouding 80:20, onder het winnen van frakties van 100 cm5. De verenigde frakties 61 25 - 90 worden onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 50°C tot droog geconcentreerd. De verkregen witte vaste stof wordt tweemaal met in totaal 100 cm^ ether gewassen en onder een verminderde druk 2 van 0,4 kPa bij 60°C gedroogd. Men verkrijgt op deze wijze 6,3 g N-[01-benzyl-N-(N-lauroyl-L-alanyl)-Jr-D-glutamyl]-N^-benzyloxycarbo-30 nyl-meso-2(L).6(D)-diaminopimelaminezuur.

Rf = 0,77 [silicagel; ethylacetaat-azijnzuur (3:1 in volumede-len)].

•Men lost 8,2 g N^-[o1-benzyl-N-(N-lauroyl-L-alanyl)-'^-D-gluta-myl]-N^-benzyloxycarbonyl-meso-2(L),6(D)-diaminopimelaminezuur op in 35 225· cnr azijnzuur. Men voegt 8,2 g palladium-op-kool {3% palladium) toe en men laat gedurende 3»5 uren een lichte waterstofstroom doorgaan. Na filtratie en concentratie tot droog van het filtraat onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 50°C, wordt de verkregen olie fijngewreven in 100 cm ether tot totale verpoedering, door filtra-40 tie afgescheiden en onder een verminderde druk van 0,04 kPa bij 50°C

n f» n .? 7 61 -29- gedroogd. Men verkrijgt op deze wijze 5*9/fïoeder. 0,9 g t'an dit poeder wordt opgelost in azijnzuur en gefiltreerd over een kolom van neutraal silicagel (0,04 - 0,063 mm) met een diameter van 2 cm en een hoogte van 2 cm. Het filtraat wordt onder een verminderde druk 5 van 2,7 kPa bij 50°C geconcentreerd. Het residu wordt opgenomen met 50 cm^ ether, door filtratie afgescheiden en onder een verminderde druk van 0,04 kPa bij 55°C gedroogd. Men verkrijgt op deze wijze Λ „ 0,75 g w -[n~(N-lauroyl-L-alanyl )-*ƒ-D-glutamyl]-meso-2(L). 6( D)-dia-minopimelaminezuur.

10 Hf = 0,38 [silicagel; n-butanol-pyridine-azijnzuur-water (50/ 20/6/24 in volumedelen)].

Analyse: berekend %i C 56,72 H 8,64 N 12,25 gevonden : 052,8 H 8,1 N 11,6.

Zwavelzuuras: 6,9$.

15 Na totale hydrolyse openbaart de analyse op de Technicon auto- analyse-inrichting de aanwezigheid van de volgende aminozuren:

Ala = 1,02 (theorie =1)

Dap = 0,96 (theorie =1)

Glu = 1,00 (theorie =1).

20 Het N -benzyloxycarbonyl-meso-2(L).6(D)-diaminopimelaminezuur kan bereid worden volgens de werkwijze beschreven in het Belgische octrooischrift 821.385.

Voorbeeld IX.

3 o

Men voegt 0,65 cm isobutylchloorformiaat toe aan een op -5 C

25 gehouden oplossing van 2,383 g benzyl N-undecanoyl L-alanyl-a-D-glu- tamaat in een mengsel van 100 cm^ tetrahydrofuran en 0,7 cm^ tri- ethylamine. Het mengsel wordt gedurende 30 minuten tej -5°C geroerd, o Ί ï®** ( 'S 6 daarna voegt men een tot 0 C gekoelde oplossing toe van/N -benzyl- oxycarbonyl-LL.DD-2.6-diaminopimelaminezuur in een mengsel van 5 3 3 30 cm 1N natriumhydroxide en 50 cm water. Het reactiemengsel wordt gedurende enkele minuten bij 0°C geroerd en daarna gedurende 40 uren bij ongeveer 20°C. Het reactiemengsel wordt vervolgens op een pH van 1 gebracht door toevoeging van 10 cm^ 1N waterstofchloride. Men verdampt de tetrahydrofuran onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 35 50°C. In het concentraat heeft men een neerslag, dat men door filtratie afscheidt, driemaal met in totaal 60 cm^ 0,1N waterstofchlo-3 Na ride en 20 cm water wast. drogen onder een verminderde druk van 0,04 kPa bij 20°C verkrijgt men 3»66 g witte vaste stof, die men oplost in 20 cm^ azijnzuur, dat 10 g neutraal silicagel (0,04 - 0,063 40 mm) bevat. Men concentreert het mengsel onder een verminderde druk 80037 61 -30- van 2,7 kPa bij 50°C tot droog en men brengt het geheel op een kolom met een diameter van 3,5 cm, die 75 g neutraal silicagel (0,04 -0,063 π®) bevat.

Men elueert achtereenvolgens met: 5 600 cm^ van een mengsel van ethylacetaat en cyclohexaan in de volume-verhouding 1:1, 3 600 cm van een mengsel van ethylacetaat en cyclohexaan in de volume-verhouding 3:1, 400 cm^ ethylacetaat, 10 600 cm^ van een mengsel van ethylacetaat en azijnzuur in de volume-verhouding 95*5, 500 cm^ van een mengsel van ethylacetaat enazijnzuur in de volumever- houding 9*1» 3 1200 cm van een mengsel van ethylacetaat en azijnzuur in de volume-15 verhouding 85:15» onder het winnen van frakties van 100 cm^. De verenigde frakties 22 - 32 worden onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 50°C tot droog geconcentreerd. De verkregen amorfe vaste stof wordt opgenomen met 80 cm^ ether, fijngewreven tot totale verpoedering, afgescheiden 20 door filtratie en gedroogd onder een verminderde druk van 0,04 kPa. Men verkrijgt op deze wijze 2,58 g N -[0-benzyl-N-(N-undecanoyl-L-alanyl)-^-D-glutamyl]-N^-benzyloxycarbonyl-LL.DD-2.6-diaminopimelami-nezuur.

Hf = 0,62 [silicagel? ethylacetaat-azijnzuur (9/1 in voluraede-25 len)].

•Men lost 2,55 g N^-[01-benzyl-N-(N-undecanoyl-L-alanyl)-y-D-glutamyl]~N -benzyloxyearbonyl-LL.DD-2.6-diaminopimelaminezuur op in 35 cm^ azijnzuur. Men voegt 2,55 g palladium-op-kool (3# palladium) toe en men laat gedurende 2,5 uren een geringe zuurstofstroom door-30 gaan, De katalysator wordt door filtratie afgescheiden en driemaal met in totaal 30 cm^ azijnzuur gewassen. Het filtraat wordt onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 50°C tot droog geconcentreerd.

De amorfe vaste stof wordt opgenomen met 50 cm^ ether, gefiltreerd, en onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 20°C gedroogd. Men 35 verkrijgt op deze wijze 1,87 g N -[N-(N-undecanoyl-L-alanyl)-/-D-glutamyl]-LL.DD-2.6-diaminopimelaminezuur.

Hf s 0,75 (silicagel? azijnzuur).

Het benzyl N-undecanoyl L-alanyl-a-D-glutamaat kan op de volgende wijze bereid worden:

kO Men voegt 3,56 cm^ isobutylchloorformiaat toe aan een op -5°C

800 3761 -31- gehouden oplossing van 5,1 g undecaanzuur in een mengsel van 140 cm^ x tetrahydrofuran en 3,84 cnr triëthylamine. Het mengsel wordt gedurende 20 minuten bij -5°C geroerd, daarna voegt men een tot 0°C gekoelde oplossing van 9,45 g van het chloorhydraat van benzyl L-ala-5 nyl-a-D-glutamaat in een mengsel van 54,8 cm^ 1N natriumhydroxide en 30 cm^ water toe. Het reactiemengsel wordt gedurende 10 minuten bij -5°C geroerd en daarna gedurende 20 uren bij ongeveer 20°C. Het reactiemengsel wordt vervolgens op een pH van 1 gebracht door toevoeging van 60 cm^ 1N waterstofchloride. Men verdampt de tetrahydrofu-10 ran door concentratie onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 50°C. Het concentraat wordt tweemaal met in totaal 80 cm^ ethylace- 3 taat geëxtraheerd, De verenigde ethylacetaatfasen worden met 40 cm water gewassen en met natriumsulfaat gedroogd. Na filtratie en concentratie tot droog onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 30°C, 13 verkrijgt men 11,89 g olie, die men aan een chromatografische behandeling onderwerpt over een kolom met een diameter van 4,5 cm, die 250 g neutraal silicagel (0,04 - 0,063 mm) bevat. Men elueert met 3 ethylacetaat onder het winnen van frakties van 100 cm , De verenigde frakties 3-5 worden onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 20 20°C tot droog geconcentreerd. Men verkrijgt op deze wijze 5,85 g van een pasteuze vaste stof, die men aan een chromatografische behandeling onderwerpt over een kolom met een diameter van 3,2 cm, die 115 g neutraal silicagel (0,04 - 0,063 mm) bevat. Men elueert achtereenvolgens met 1 liter van een mengsel van ethylacetaat en cyclohex-25 aan in de volumeverhouding 1:1, 1,7 liter ethylacetaat en 600 cm^ van een mengsel van ethylacetaat en azijnzuur in de volumeverhouding 99:1 onder het winnen van frakties van 100 cm^. De verenigde frakties 11-30 worden onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 50°C tot droog geconcentreerd. Men verkrijgt op deze wijze 2,47 g 30 benzyl N-undecanoyl L-alanyl-a-D-glutamaat in de vorm van een witte vaste stof.

Bf = 0,71 [silicagel; ethylacetaat-azijnzuur (9/1 ia volumede-len)].

Voorbeeld X, 3 o

35 Men voegt 0,69 cm isobutylchloorformiaat toe aan een op -5 C

gehouden oplossing van 2,57 g benzyl N-lauroyl L-alanyl-a-D-gluta- 3 3 maat in een mengsel van 120 cnr tetrahydrofuran en 0,74 cm tri-ethylamine. Het mengsel wordt gedurende 20 minuten bij -5°C geroerd, daarna voegt men een tot 0°C gekoelde oplossing toe van 1,7 g N -40 benzyIbxycarbonyl-LL-2.6-diaminopimelaminezuur in een mengsel van 800 37 61 -32- 3 3 5,25 cm 1N natriumhydroxide en 35 cm water. Het reactiemengsel wordt gedurende 20 minuten bij -3°C geroerd» daarna gedurende 20 uren bij ongeveer 20°C. Vervolgens brengt men de pH op 2 door toevoeging van 20 cm^ 1N waterstofchloride. Het gevormde neerslag wordt 5 door filtratie afgescheiden, driemaal met in totaal 60 cm^ 0,1 N waterstofchloride en driemaal met in totaal 60 cm^ water gewassen.

Na drogen aan de vrije lucht verkrijgt men 3,97 g wit poeder, dat men aan een chromatografische behandeling onderwerpt over 200 g neutraal silicagel (0,04· - 0,063 mm) aanwezig in een kolom met een dia-10 meter van 3,8 cm.

Men elueert achtereenvolgens meti 600 cm^ ethylacetaat, 300 cm^ van een mengsel van ethylacetaat en azijnzuur in de volume-verhouding 95*5» 15 800 cm^ van een mengsel van ethylacetaat en azijnzuur in de volume-verhouding 9*1, onder het winnen van frakties van 50 cm^. De verenigde frakties 24· -30 worden onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 50°C tot droog geconcentreerd. De verkregen olie wordt opgenomen in 100 ci^ ether, 20 fijngewreven tot een totale verpoedering, door filtratie afgescheiden en onder een verminderde druk van 0,04· kPa gedroogd. Men ver- 2 Λ krijgt op deze wijze 1,24- g N -[0 -benzy 1-N-(N-lauroy 1-L-alany 1 )-^-D-glutamyl]-N^-benzyloxycarbonyl-LL-2.6-diaminopimelaminezuur.

Ef s 0,85 [silicagel; n-butanol-pyridine-azijnzuur-water (50/ 25 20/6/24· in volumedelen)].

Ef = 0,76 [silicagel; ethylacetaat-azijnzuur (3/1 in volumedelen)].

2 • Het N -[N-(N-lauroyl-L-alanyl)-y-D-glutamyl]-LL-2.6-diaminopimelaminezuur kan op de volgende wijze bereid worden: 30 Men lost 1,36 g N^-[0^-benzy1-N-(N-lauroyl-L-alanyl)-y-D-gluta-myl]-N -benzyloxycarbonyl-LL-2.6-diaminopimelaminezuur op in 4-0 cm*7 azijnzuur. Men voegt 1,4· g palladium-op-kool (3# palladium) toe en men laat een geringe waterstofstroom gedurende 4 uren doorgaan. Na filtratie en concentratie van het filtraat tot droog onder een ver-35 minderde druk van 2,7 kPa bij 55°C, wordt de verkregen olie opgenomen met 100 cm^ ether, tot totale verpoedering fijngewreven, door filtratie afgescheiden en aan de lucht gedroogd. Men verkrijgt op deze wijze 0,96 g N -[N-(N-lauroyl-L-alanyl)-y-D-glutamyl]-LL-2.6-diaminopimelaminezuur.

40 Ef = 0,38 [silicagel; n-butanol-pyridine-azijnzuur-water (50/ 8003761 -33- 20/6/24 in volumedelen)].

Het N -benzyloxycarbonyl-LL-2.6-diaminopimelaminezuur kan op de volgende wijze bereid worden:

Aan een oplossing van 5 g van het»chloorhydraat van LL-2.6-dia- 3 5 minopimelaminezuur in 15 cm water, op een pH van 10 gebracht door 3 toevoeging van 45 cm 1N natriumhydroxide, voegt men 2,14 g koper-(Il)bromide opgelost in 20 cm^water toe. Men roert het reactiemeng-sel gedurende 2 uren bij ongeveer 20°C. Men scheidt door filtratie een licht onoplosbaar bestanddeel af, daarna koelt men het filtraat 10 tot een temperatuur tussen -3°C en 0°C. Men voegt 4,8 g natriumwater-stofcarbonaat toe en vervolgens druppelsgewijze in 30 minuten 4,1 cm^ benzylchloorformiaat. Het reactiemengsel wordt gedurende 18 uren bij een temperatuur van ongeveer 20°C geroerd. Het gevormde blauwe neerslag wordt door filtratie afgescheiden, driemaal met in totaal 90 3 3 15 cm water, driemaal met 'in totaal 90 cnr ethanol en driemaal met in 3 totaal 90 cm ether gewassen. Na drogen onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 50°C verkrijgt men 4,18 g van het koper(II)complex van het N6-benzyloxycarbonyl-LL-2.6-diaminopimelaminezuur, dat men toevoegt aan 28 cnr 1N waterstofchloride. Men roert gedurende één 20 uur bij een temperatuur van ongeveer 20°C. Een onoplosbaar bestanddeel wordt door filtratie afgescheiden. Aan het filtraat voegt men 14 cm? methanol toe, daarna laat men een waterstofsulfidestroom gedurende 6 uren doorgaan. Men laat gedurende 16 uren met rust. De verkregen zwarte suspensie wordt gefiltreerd en driemaal met in totaal 25 15 cm^ water gewassen. De verenigde filtraten worden geconcentreerd 3 tot een volume van 10 cm onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 50°C, op een pH van 7 gebracht door toevoeging van 5 cm^ triethylami-ne en op een pH van 6,8 gebracht door toevoeging van 5 cm^ 1N waterstof chloride. De aldus verkregen witte suspensie wordt gedurende 2 30 uren bij 0°C bewaard. Het produkt, dat door filtratie wordt afge- 3 scheiden, wordt achtereenvolgens driemaal met in totaal 30 cm water, driemaal met in totaal 30 cm^ ethanol en driemaal met in totaal 30 cm^ ether gewassen. Na drogen tot 60°C onder een verminderde druk van c 0,04 kPa verkrijgt men 1,78 g N -benzyloxycarbony1-L.L-2.6-diamino-35 pimelaminezuur.

[α]ρ20° = +11° (c = 1, 1N HC1).

Rf· = 0,4-5 [silicagel; n-butanol-pyridine-azijnzuur-water (50/ 20/6/24 in volumedelen)].

Het dichloorhydraat van het L.L-2.6-diaminopimelaminezuur kan 40 op de volgende wijze bereid worden: 800 37 61 -34-

Men lost 17 g L.L-2.6-dibenzyloxycarbonylaminopimelaminezuur op 3 3 in een mengsel van 30 cm methanol en 5»9 cm geconcentreerd zoutzuur (d = 1,19). Men voegt 17 g palladium-op-kool (3# palladium) toe en men laat een waterstofstroom gedurende 4 uren doorgaan. Na 5 filtratie en concentratie van het filtraat tot droog onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 55°C verkrijgt men 8,8 g van het di-chloorhydraat van het L,L-2.6-diaminopimelaminezuur in de vorm van een schuim.

Het L.L-2.6-dibenzyloxycarbonylaminopimelaminezuur kan op de 10 volgende wijze bereid worden:

Men lost 19 gZ£enzyl L.L-2.6-N^.N^-dibenzyloxycarbonyldiamino- pimelaat op in 190 cm^ methanol. Men koelt deze oplossing tot 0°C en men verzadigt met ammoniak. Zodra de oplossing verzadigd is giet men de oplossing over in een autoclaaf van 1 liter. Na deze autoclaaf ge- 15 sloten te hebben bewaart men deze gedurende 6 dagen bij ongeveer 20°C. Na ontgassing wordt de aldus verkregen oplossing onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 50°C geconcentreerd. Het residu wordt opgelost in 230 cm^ water en de verkregen oplossing wordt op een pH van 2 gebracht door toevoeging van 30 cm 4N waterstofchlori- 3 - 20 de en driemaal met in totaal 300 cm ethylacetaat geextraheerd; deze organische fase wordt met 100 cm^ van een verzadigde oplossing van natriumchloride gewassen, met natriumsulfaat gedroogd en onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 50°C tot droog geconcentreerd. Men verkrijgt op deze wijze 17 g L.L-2.6-dibenzyloxycarbonylaminopimela-25 minezuur in de vorm van een olie.

Hf = 0,68 [silicagel; n-butanol-pyridine-azijnzuur-water (30/ 20/6/24 in volumedelen)J» 2 6

Het zuur benzyl L.L-2.6-N .N -dibenzyloxycarbonyldiaminopime- laat kan op de volgende wijze bereid worden: 2 ^ 30 Men lost 55 g benzyl L.L-2.6-N .N -dibenzyloxycarbonyldiamino- 3 o pimelaat op in 400 cm benzylalcohol van 40 C. Vervolgens giet men op deze gedurende één uur op 40°C gehouden oplossing, een oplossing van 4,8 g kaliumhydroxide in korrels van 86# in 400 cm^ benzylalcohol in 6,5 uren. Men zet de roerbehandeling van het reactiemilieu 35 bij ongeveer 20°C gedurende 16 uren voort, vervolgens concentreert men onder een verminderde druk van 0,066 kPa bij 90°C tot droog.

Men verkrijgt op deze wijze een olie, die men oplost in 1 liter water en driemaal met in totaal 900 cm3 ethylacetaat extraheert. De aldus geëxtraheerde waterbevattende fase wordt op een pH van 2 ge- 3 40 bracht door toevoeging van 45 cm 4N waterstofchloride en driemaal «00 3 7 61 -35- met in totaal 1,5 liter ethylacetaat geëxtraheerd, De aldus verkregen ethylacetaatfase wordt met 500 cm^ van een verzadigde oplossing van natriumchloride gewassen en met watervrij natriumsulfaat gedroogd. Na scheiding door filtratie van het natriumsulfaat voegt men 5 17 cm^ dicyclohexylamine toe en men concentreert onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 4-0°C tot droog. Men verkrijgt een gele 3 3 olie, die men oplost in 100 cm ethanol, waaraan men 100 cm water toevoegt. Na 20 uren bij 0°C met rust te zijn gelaten, verkrijgt men een witte vaste stof, die men door filtratie afscheidt, twee- 10 maal met in totaal 100 cm·^ water wast en opneemt in een mengsel van 3 3 200 cm ethylacetaat en 200 cm water. Men zuurt de waterbevattende fase aan door toevoeging van 40 cm^ van een 1N oplossing van methaan- sulfonzuur. Na decanteren wordt de organische fase tweemaal met in 3 totaal 100 cnr water gewassen, met watervrij natriumsulfaat ge- 15 droogd en bij 2,7 kPa bij 50°C tot droog geconcentreerd'. Men ver- 2 6 krijgt op deze wijze 15 g zuur benzyl L.L-2.6-N.N -dibenzyloxycar-bony^ïifeïaat in de vorm van een olie.

Rf = 0,76 [silicagel; n-butanol-pyridine-azijnzuur-water (50/ 20/6/24- in volumedelen)].

2 6 20 Het dibenzyl L.L-2-.6-N .N -dibenzyloxycarbonyldiaminopimelaat kan op de volgende wijze bereid worden: 3

Aan een driehalskolf van 500 cm , voorzien van een centrale roerinrichting en een Dean-Stark-val, voegt men een mengsel toe van 2 6 4-4-,7 g L.L-2.6-N .N -dibenzyloxycarbonyldiaminopimelinezuur, 3 g 3 3 25 p-tolueensulfonzuur, 30 cm benzylalcohol en 300 cm tolueen. Men kookt het reactiemengsel 5 uren onder terugvloeikoeling. Vervolgens scheidt men na 16 uren roeren bij 20°C het witte onoplosbare be- z standdeel af door filtratie, wast tweemaal met in totaal 4-00 cnr van een 5-procentige oplossing van natriumcarbonaat in water en tweemaal 30 met in totaal 4-00 cnr water. Na drogen aan de lucht verkrijgt men 2 6 55»4- g dibenzyl L.L-2.6-N *N -dibenzyloxycarbonyldiaminopimelaat, dat bij 118°C smelt.

Rf = 0,53 [silicagel; azijnzuur-ethylacetaat (8/2 in volumedelen)].

35 -Het L.L-2.6-N^.N^-dibenzyloxycarbonyldiaminopimelinezuur kan bereid worden volgens de methode van A. ARENDT c.s., Roczniki Chemii Ann. Soc. Chim. Polonorum 4-8, (1974-), 635.

Voorbeeld XI.

Men voegt 0,91 cm^ isobutylchloorformiaat toe aan een op 0°G

4-0 gehouden oplossing van 3,14- g benzyl N-(3.5»5-trimethylhexanoyl)- 8003761 -36- L-alanyl-a-D-glutamaat in een mengsel van 150 cm^ tetrahydrofuran en 0,98 cm^ triëthylamine. Het mengsel wordt gedurende 20 minuten bij 0°C geroerd, daarna voegt men een tot 0°C gekoelde oplossing van 2,263 g N^-benzyloxycarbonyl-DD.LL-2.6-diaminopimelaminezuur in een 3 , 3 3 mengsel van 7 cm 1N natriumhydroxide en 70 cm water toe. Het reac-tiemengsel wordt gedurende één uur bij 0°G geroerd en daarna gedurende 20 uren bij ongeveer 22°C. Vervolgens verwijdert men door filtratie een licht onoplosbaar bestanddeel en brengt men de pH op 1 3 door toevoeging van 12 cm 1N waterstofchloride. Men verdampt het 10 tetrahydrofuran onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 30°C. Het concentraat wordt driemaal met in totaal 150 cm^ ethylacetaat geëxtraheerd. De verenigde ethylacetaatfasen worden met 20 cm^ 0,1 N water stof chloride gewassen en met natriumsulfaat gedroogd. Na concentratie tot droog onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 50°C, 15 verkrijgt men 15,14 g van een amorfe vaste stof, die men oplost in 60 cm^ van een mengsel van ethylacetaat en azijnzuur in de volume-verhouding 1:1, dat 10 g neutraal silicagel (0,04 - 0,063 mm) bevat. Men concentreert het mengsel tot droog onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 30°C en men brengt het geheel op een kolom met een 20 diameter van 3 cm, die 100 g neutraal silicagel (0,04 - 0,063 mm) bevat. Men elueert achtereenvolgens met: 3 400 cnr ethylacetaat, 200 cm^ van een mengsel van ethylacetaat en azijnzuur in de volume-verhouding 9 s 1 » 25 200 cm^ van een mengsel van ethylacetaat en azijnzuur in de volume-verhouding 8:2, 160 cm^ van een mengsel van ethylacetaat en azijnzuur in de volume-verhouding 6:4, 240 cm^ van een mengsel van ethylacetaat en azijnzuur in de volume-30 verhouding 1:1, onder het winnen van frakties van 40 cm^. De verenigde frakties 15 - 25 worden onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 50°C tot droog 3 geconcentreerd. De verkregen olie wordt opgenomen met 50 cm ether, fijngewreven tot verpoedering, afgescheiden door filtratie en onder 35 een verminderde druk van 0,04 kPa gedroogd. Men verkrijgt op deze wijze 2,85 g N2-jo^-benzyl-N-ÊN-O^.S-trimethylhexanoyD-L-alanylJ-y-D-glutamylj; -N^-benzyloxycarbonyl-DD.LL-2.6-diaminopimelaminezuur·.

Hf = 0,32 [silicagel; ethylacetaat-azijnzuur (3/1 in volumede-len)].

40 -Men lost 2,76 g N2-^0/*-benzyl-N-[N-(3.5.3-trimethylhexanoyl)-L- 800 3 7 61 -37- alanyl]-Y-D-glutamylJ-N^-benzyloxycarbonyl-DD.LL-2.6-diaminopimela-minezuur op in 100 cm·^ azijnzuur. Men voegt 2»76 g palladium-op-kool (3% palladium) toe en men laat een geringe waterstofstroom gedurende 2,5 uren doorgaan. Na filtratie en concentratie tot droog van het 3 filtraat onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 50°C wordt de 3 olie fijngewreven in 30 cm ether. Men verkrijgt een neerslag, dat door filtratie wordt afgescheiden en onder een verminderde druk van 0,04 kPa bij 20°C wordt gedroogd. Men verkrijgt op deze wijze 2,07 g N^-[n-[N-(3·5·5-trimethylhexanoy1)-L-alanyl]-/-D-glutamy ij -DD.LL-2.6-10 diaminopimelaminezuur.

Rf = 0,32 [silicagel; n-butanol-pyridine-azijnzuur-water (50/ 20/6/24 in volumedelen)].

Rf = 0,31 [silicagel; azijnzuur].

Men voegt 4,3 cm^ isobutylchloorformiaat toe aan een op -6°C 15 gehouden oplossing van 7,59 g N-(3-5*3-trimethylhexanoyl)-L-alanine in een mengsel van 400 cm^ tetrahydrofuran en 4,63 cm^ triëthylamine. Het mengsel wordt gedurende 20 minuten bij -6°C geroerd, vervolgens voegt men een tot 3°C gekoelde oplossing toe van 9,06 g van het chloorhydraat van benzyl α-D-glutamaat in een mengsel van 66,2 cm^ 20 1N natriumhydroxide en 14 cm^ water. Het reactiemengsel wordt gedurende 15 minuten bij -5°C geroerd en daarna gedurende 66 uren bij ongeveer 18°C; het mengsel wordt vervolgens op een pH van 1 gebracht door toevoeging van 75 cnr 1N waterstofchloride. Men verdampt de tetrahydrofuran onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 50°C. Het 3 25 concentraat wordt vijfmaal met in totaal 200 cm ethylacetaat geex- 3 traheerd. De verenigde ethylacetaatfasen worden met 40 cm 0,1 N waterstofchloride gewassen en met magnesiumsulfaat gedroogd. Na filtratie en concentratie tot droog onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 50°C, verkrijgt men 14,8 g olie, die men oplost in 50 cm^ 30 ethylacetaat, dat 30 g neutraal silicagel (0,04 - 0,063 mm) bevat.

Men concentreert het mengsel onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 50°C tot droog en men brengt het geheel op een kolom met een diameter van 2,8 cm, die 280 g neutraal silicagel (0,04 - 0,063 mm) bevat. Men elueert achtereenvolgens met 2 liter cyclohexaan, 1 liter 35 van een mengsel van cyclohexaan en ethylacetaat in de volumeverhou-ding 95:5, 1,5 liter van een mengsel van cyclohexaan en ethylacetaat in de volumeverhouding 90:10, 5 liter van een mengsel van cyclohexaan en ethylacetaat in de volumeverhouding 80:20, 1,5 liter van een mengsel van cyclohexaan en ethylacetaat in de volumeverhou-40 ding 70:30 en 3,5 liter van een mengsel van cyclohexaan en ethylace- 800 37 61 -38- taat in de volumeverhouding 50:50 onder het winnen van frakties van 500 cm^. De frakties 23 - 29 worden verenigd en onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 50°C tot droog geconcentreerd. Men verkrijgt op deze wijze 10,86 g benzyl N-(3.5*5-trimethylhexanoyl) L-alanyl-a-D-5 glutamaat in de vorm van een olie, die kristalliseert.

Hf = 0,37 [silicagel; ethylacetaat].

Het N-(3.5.5-trimethylhexanoyl) L-alanine kan op de volgende wijze bereid worden:

Men voegt 6,5 cm^ isobutylchloorformiaat toe aan een op -5°C

10 gehouden oplossing van 7,912 g 3.5«5-trimethylhexaanzuur in een meng-3 3 sel van 125 cnr tetrahydrofuran en 7 cm triethylamine. Het mengsel wordt gedurende 20 minuten bij -50°C geroerd, daarna voegt men een tot 5°C gekoelde oplossing toe van k,k95 g L-alanine in 50 cm3 1N natriumhydroxide. Het reactiemengsel wordt gedurende 10 minuten bij 15 0°C geroerd en daarna gedurende 18 uren bij ongeveer 25°C. Men verdampt vervolgens de tetrahydrofuran onder een verminderde druk van o 3 2,7 kPa bij 50 C. Het concentraat wordt tweemaal met in totaal kO cnr ether geëxtraheerd, op een pH van 1 gebracht door toevoeging van 3 . 55 cm 1N waterstofchloride. Het olieachtige precipitaat, dat ont- 20 staat, wordt vijfmaal met in totaal 250 cm^ ethylacetaat geëxtraheerd. De ethylacetaatfasen worden verenigd, met 25 cm3 van een verzadigde oplossing van natriumchloride gewassen en met magnesiumsul-faat gedroogd. Na filtratie en concentratie onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 50°C tot droog verkrijgt men 11,79 g olie, die 3 25 men oplost in kO cm ethylacetaat, dat 20 g neutraal silicagel (0,063 - 0,20 mm) bevat. Men concentreert het mengsel onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 50°C tot droog en men brengt het geheel op een kolom met een diameter van 3 cm, die 120 g neutraal silicagel (0,063 - 0,20 mm) bevat. Men elueert achtereenvolgens met 3 3 30 600 cm cyclohexaan, 300 cnr van een mengsel van cyclohexaan en ethylacetaat in de volumeverhouding 95'·51 300 cm^ van een mengsel van cyclohexaan en ethylacetaat in de volumeverhouding 90:10, 300 3 cm van een mengsel van cyclohexaan en ethylacetaat in de volumeverhouding van 80:20, 700 cm^ van een mengsel van cyclohexaan en ethyl-35 acetaat in de volumeverhouding van 50:50, 300 cm·^ ethylacetaat en 300 cm^ van een mengsel van ethylacetaat en methanol in de volume- 3 verhouding 90:10 onder het winnen van frakties van 100 cm . De verenigde frakties 17 - 28 worden tot droog geconcentreerd onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij ^5°0. Men verkrijgt op deze wijze ^0 10,16 g olie, die men oplost in 25 co^ ether. Door toevoeging van 800 3761 3 -39- 150 cm petroleumether verkrijgt men een olie» die men door decanteren afscheidt. Na drogen onder een verminderde druk van 0»027 kPa verkrijgt men 7,59 g N-(3«5.5-trimethylhexanoyl) L-alanine. fif = 0,43 [silicagel; ethylacetaat].

5 Voorbeeld XII.

3 o

Men voegt 0,56 cm isobutylchloorformiaat toe aan een op -5 C

gehouden oplossing van 2,12 g benzyl N-lauroyl L-alanyl-a-D-gluta- 3 3 maat in een mengsel van 86 cnr tetrahydrofuran en 0,6 cnr triethyl-amine. Het mengsel wordt gedurende 30 minuten bij -5°C geroerd, daar-10 na voegt men een tot 2°C gekoelde oplossing toe van 1,25 g N -tert,-butyloxycarbonyl-DD.LL-2.6-diaminopimelaminezuur in een mengsel van 4,32 cnr'* 1N natriumhydroxide en 43 cm^ water. Het reactiemengsel wordt gedurende enkele minuten bij -5°C en daarna gedurende 18 uren bij ongeveer 20°C geroerd. Vervolgens wordt het mengsel aangezuurd 15 door toevoeging van 50 cm^ van een verzadigde oplossing van citroenzuur. Men verdampt de tetrahydrofuran door concentratie onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 50°C. Het concentraat wordt vijfmaal met in totaal 200 cra^ ethylacetaat geëxtraheerd. De verenigde 3 ethylacetaatfasen worden met 25 cm water gewassen en daarna met na-20 triumsulfaat gedroogd. Na concentratie tot droog onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 50°C verkrijgt men een olie, die men oplost in een mengsel van 50 cnT* ethylacetaat en 10 cm^ azijnzuur, dat 10 g neutraal silicagel (0,04 - 0,063 mm) bevat. Men concentreert het mengsel onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 50°C tot droog en 25 brengt het geheel op een kolom met een diameter van 2 cm, die 50 g neutraal silicagel (0,04 - 0,063 mm) bevat.

Men elueert achtereenvolgens met: 3 200 cm ethylacetaat, 280 cm^ van een mengsel van ethylacetaat en azijnzuur in de volume-30 verhouding 95*5» 320 cm^ van een mengsel van ethylacetaat en azijnzuur in de volume-verhouding 9*1 3 onder het winnen van frakties van 40 cnr. De verenigde frakties 5 - 13 worden onder een verminderde druk van 2,7 kPa "bij 50°C geconcen- 6 r 1 35 treerd. Men verkrijgt op deze wijze 2,23 g N -[0 -benzyl-N-(N-lauro- Λ yl-L-alanyl)-y-D-glutamyl]-N -tert,butyloxycarbonyl-LL.DD-2.6-dia-minopimelaminezuur in de vorm van een olie.

Rf = 0,39 [silicagel; ethylacetaat-azijnzuur (9/1 in volumede-len)].

40 'Men lost 2,19 g N^-[0^-benzyl-N-(N-lauroyl-L-alanyl)-y-D-gluta- 800 3 7 61 -if o- 2 mylJ-N -tert.butyloxycarbonyl-DD.LL-2.6-diaminopimelaminezuur op in 3 22 cm van een watervrije verzadigde oplossing van waterstofchloride in azijnzuur. Men laat gedurende 3 uren bij 20°C in contact en vervolgens concentreert men onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 3 50°C tot droog. Men verkrijgt op deze wijze 1,74 g van het chloorhy-draat van Ν^-[θ^-benzyl-N-(N-lauroyl-L-alanyl)-/-D-glutamyl]-DD.LL- 2.6- diaminopimelaminezuur in de vorm van een gedeeltelijk gekristalliseerde olie.

Rf = 0,47 [silicagel; n-butanol-pyridine-azijnzuur-water (50/ 10 20/6/2½ in volumedelen)].

Rf = 0,26 [silicagel; azijnzuur], 2

Het N -tert.butyloxycarbonyl-DD-.LL-2.6-diaminopimelaminezuur kan op de volgende wijze bereid worden.

2 β

Men lost 4 g N -tert.butyloxycarbonyl-N -benzyloxyearbonyl-15 DD.LL-2.6-diaminopimelaminezuur op in 100 cm^ azijnzuur. Men voegt 4 g palladium-op-kool (3# palladium) toe en laat een zwakke stroom waterstof gedurende 3 uren doorgaan. De katalysator wordt door filtratie afgescheiden, met 10 cm^ azijnzuur gewassen en de verenigde filtraten worden onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 50°C ge- 20 concentreerd. Het aldus verkregen olieachtige residu wordt fijnge- 3 wreven in 50 cm ether tot totale verpoedering. Men verkrijgt op de- 2 ze wijze na filtratie en drogen 3 g N -tert.butyloxycarbonyl-DD.LL- 2.6- diaminopimelaminezuur.

Bf = 0,34 [silicagel; azijnzuur], 25 Voorbeeld XIII,

Men voegt in 20 minuten 1 g {o^-benzyl-O^-succinimido-N-fN-CB-pentyl-3-hydroxynonanoyl)-L-alanyl]j-D-glutaminezuur opgelost in 10 cm^ 1.2-dimethoxyethaan toe aan·een op 8°G gehouden oplossing van 0,52 g DD.LL-N^-benzyloxycarbonyl-2.6-diaminopimelaminezuur in een 30 mengsel van 1,6 cm^ 1N natriumhydroxide en 5 cm^ water. Het reactie- mengsel wordt gedurende 24 uren bij 20°C geroerd, vervolgens op een 3 pH van 1 gebracht door toevoeging van 2 cm 1N waterstofchloride. Na 3 uren roeren bij 20°C wordt het gevormde neerslag door filtratie afgescheiden, driemaal met in totaal 30 cm^ water gewassen en onder een 35 verminderde druk van 2,7 kPa bij 20°C gedroogd. Men verkrijgt op deze wijze 1,1 g wit poeder, dat men aan een chromatografische behandeling onderwerpt over een kolom met een diameter van 1,7 cm, die 22 g neutraal silicagel (0,04 - 0,063 mm) bevat. Men elueert achtereenvolgens met: 40 110 cm^ ethylacetaat, 800 3761 41 60 cm van een mengsel van ethyüacetaat en azijnzuur in de volume-verhouding 95*5» 180 cm'’ van een mengsel van ethylacetaat en azijnzuur in de volume-verhouding 9 s1, 3 5 80 cm azijnzuur.

De verenigde frakties 24 - 38 worden onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 60°0 tot droog geconcentreerd. De verkregen amorfe vaste stof wordt opgenomen in 10 cm^ ether, door filtratie afgescheiden en 3 met 10 cm ether gewassen. Na drogen onder een verminderde druk van 10 2,7 kPa bij 20°0 verkrijgt men 0,4 g N^-£o1-benzyl-N-[N-(2-n-pentyl- 3-hydroxynonanoyl)-L-alanyl]-/-D-glutamylj-N^-benzyloxycarbonyl-DD.II-2.6-diaminopimelaminezuur.

Rf = 0,72 [silicagel; ethyalacetaat-azijnzuur (9/1 in volumede-del)].

15 Men voegt 0,4 g N 0 -benzyl-N-[N- (2-n-pentyl-3-hydroxynonano- tl)-L-alanyl]-/-D-glut amylJ-N^-benzyloxycarbonyl-DD.LL-2.6-diamino- 3 pimelaminezuur toe aan 10 cm azijnzuur. Men voegt 0,4 g palladium-op-kool (3% palladium) toe en men laat een zwakke waterstofstroom gedurende 1,25 uren doorgaan. Na filtratie van het reactiemilieu en 20 concentratie tot droog van het filtraat onder een verminderde druk o 3 van 2,7 kPa bij 50 C, krijgt men een olie, die men opneemt met 20 cm diisopropylether, fijnwrijft tot totale verpoedering en door filtratie afscheidt. Na drogen onder een verminderde druk van 2,7 kPa ver-krijgt men 280 mg N -£N-[-(2-n-pentyl-3-hydroxynonanoyl)-L-alanyl]-25 J-D-glutamylJ-DD.LL-2.6-diaminopimelaminezuur.

Rf = 0,39[silicagel; n-butanol-pyridine-azijnzuur-water (50/20/ 6/24 in volumedelen)].

Het (01 -benzyl-0^-succinimido-N-[-( 2-n-pentyl-5-hydroxynonano-yl)-L-alanyl]J-D-glutaminezuur kan op de volgende wijze bereid wor-30 den:

Men voegt in 10 minuten 7)4 g dicyclohexylcarbodiimide opgelost 3 o in 85 cm 1.2-dimethoxyethaan toe aan een op 0 C gehouden oplossing van 17,4 h benzyl N-(2-n-pentyl-3-hydroxynonanoyl)-L-alanyl-a-D-glu- tamaat en 3»86 g N-hydroxysuccinimide in 170 cm 1.2-dimethoxyethaan.

35 Het reactiemilieu wordt gedurende 3>5 uren bij 0°C geroerd en daarna 800 3 7 61 -Λ2- gedurende 16 uren bij 4°C bewaard. Vervolgens voegt men 2 cm^ azijnzuur toe en men roert gedurende één uur bij 20°C. Het gevormde neerslag wordt door filtratie afgescheiden en driemaal met in totaal 75 cm^ 1.2-dimethoxyethaan gewassen. Het filtraat wordt onder een 5 verminderde druk van 2,7 kPa bij 60°C tot droog geconcentreerd. Het concentraat wordt opgenomen met 300 cm^ ethylacetaat. Na één uur bewaren bij 20°C wordt het gevormde neerslag door filtratie afgeschei- 3 den en tweemaal met in totaal 50 cm diisopropylether gewassen. Het filtraat wordt onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 50°C tot f 1 10 droog geconcentreerd. Men verkrijgt op deze wijze 22,8 g |0 -benzyl-0^-succinimido-N-[N-(2-n-pentyl-3-hydroxynonanoyl)-L-alanyl]j-D-glutaminezuur in de vorm van een oranjeachtige olie.

Bf = 0,77 [silicagel; ethylacetaat].

Het benzyl N-(2-n-pentyl-3-hydroxynonanoyl)-L-alanyl-a-D-gluta-15 maat kan op de volgende wijze bereid worden:

Men voegt in één uur en 10 minuten 27,5 g 2-n-pentyl-3-hydroxy- 3 nonanoaat van succinimide opgelost in 644 cm 1.2-dimethoxyethaan toe aan een op 7°C gehouden oplossing van 27,8 g van het chloorhy- 3 draat van benzyl L-alanyl-a-D-glutamaat in een mengsel van 245 cm 20 water en 22,9 cm^ triëthylamine. Het reactiemengsel wordt gedurende 20 uren bij 20°G bewaard en daarna gedurende 5 uren bij 60°C. Men verdampt vervolgens het 1.2-dimethoxyethaan onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 50°C; het concentraat wordt op een pH van 1 ge- 3 bracht door toevoeging van 150 cnr 1N waterstofchloride en wordt 25 vijfmaal met in totaal 1,5 liter ethylacetaat geëxtraheerd. De verenigde organische fasen worden driemaal met in totaal 750 cm^ water gewassen met natriumsulfaat gedroogd en onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 60°C tot droog geconcentreerd. Men verkrijgt op deze wijze 38,6 g olie, die men in 200 cm^ ethylacetaat oplost. Men voegt 30 13 g dicyclohexylamine toe. Na een rustperiode van 20 uren bij 4°C wordt de gevormde witte vaste stof door filtratie afgescheiden, tweemaal met in totaal ^0 cm^ ethylacetaat en tweemaal met in totaal 200 3 cm ether gewassen en onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 20°C gedroogd. Men verkrijgt op deze wijze 22,k g van een wit poeder, 35 waaraan men 1,9 g, verkregen bij een soortgelijke werkwijze»toe- 3 voegt. Men lost dit mengsel op in 500 cnr water; men voegt aan de wa- 3 3 terbevattende oplossing 200 cnr ethylacetaat en 150 cm van een verzadigde oplossing van citroenzuur toe. Men scheidt de organische fase af, extraheert de waterbevattende fase tweemaal met in totaal 40 MX) cm·^ ethylacetaat. De verenigde ethylacetaatfasen worden tweemaal 800 37 61 -JO- met in totaal 200 cm^ water gewassen» met natriumsulfaat gedroogd en onder een verminderde druk van 2»7 kPa bij 60°C tot droog geconcentreerd. Men verkrijgt op deze wijze 17Λ g benzyl N-(2-n-pentyl-3-hydroxynonanoyl) L-alanyl-a-D-glutamaat, in de vorm van een beige 5 pasta.

Rf = 0,25 [silicagel; ethylacetaat].

Het 2-n-pentyl-3-hydroxynonanoaat van succinimide kan op de volgende wijze bereid worden:

Men voegt in 40 minuten 27 g dicyclohexylcarbodiimide opgelost 10 in 300 cm^ 1,2-dimethoxyethaan toe aan een op 0°C gehouden oplossing van 29»1 g 2-n-pentyl-3-hydroxynonaanzuur en 14,1 g N-hydroxysuccin-imide in 300 cm^ 1.2-dimethoxyethaan. Het reactiemengsel wordt 3 uren bij 0°C geroerd en vervolgens 21 uren bij 4°C bewaard. Het gevormde neerslag wordt door filtratie afgescheiden en tweemaal met in 15 totaal 100 cm^ 1.2-dimethoxyethaan gewassen. Het filtraat wordt onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 50°C tot droog geconcentreerd. Het concentraat wordt opgenomen met een mengsel van 300 cm^ 3 o diisopropylether en 3 cm azijnzuur. Na 2 uren bewaren bij 20 C wordt het gevormde neerslag door filtratie afgescheiden en tweemaal met in •z 20 totaal 40 cnr diisopropylether gewassen. Het filtraat wordt onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 50°C tot droog geconcentreerd. Men verkrijgt op deze wijze 42,6 g 2-n-pentyl-3-hydroxynonanoaat van succinimide in de vorm van een gele olie.

Het 2-n-pentyl-3-hydroxynonaanzuur kan bereid worden volgens 25 de methode van E. LEDERER c.s., Buil. Soc. Chim. 1952, 413.

Voorbeeld XIV.

Aan een oplossing van 25 g N-a-tert.butyloxycarbonyl-N-f-benzyl-oxycarbonyl-L-lysine in 250 cm^ ethanol, voegt men 150 g gechloor-methyleerd styreen-divinylbenzeen (98/2) copolymeer toe, dat 1 milli-30 equivalent chloor per gram bevat. Men roert het reactiemengsel gedurende 3 minuten bij 20°C en vervolgens voegt men 9»2 cm^ triëthyl-amine toe en roert men het reactiemilieu gedurende 48 uren bij 78°C. Het polymeer wordt gefiltreerd, achtereenvolgens driemaal met in totaal 750 cm^ ethanol en driemaal met in totaal 750 cm^ dichloorme-35 thaan gewassen en daarna onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 50°C gedroogd. Men verkrijgt op deze wijze 160,9 g N-a-tert.butyl-oxycarbonyl-N-f-benzyloxycarbonyl-L-lysyl-polymeer.

Het D-glutaminezuur wordt op het L-lysyl-polymeerderivaat gebonden door de volgorde van de volgende handelingen in een reactor 40 uit te voeren, die voorzien is van een roerinrichting en in de bodem 8003761 -¥f- ervan een glasfrit.

1) Men voert drie opeenvolgende wasbehandelingen van het polymeer uit met telkens 100 cm^ dichloormethaan. Elke toevoeging van oplosmiddel wordt gevolgd door een roerbehandeling gedurende 3 mi- 3 nuten en daarna een centrifugebehandeling.

2) De beschermende tert.butyloxycarbonylgroep van het lysine wordt vervolgens verwijderd door toevoeging van 100 cm·^ van een mengsel van trifluorazijnzuur en dichloormethaan in de volumeverhouding 1:1, roeren gedurende 20 minuten gevolgd door centrifugeren.

10 3) De hars wordt dan achtereenvolgens gewassen met: a) driemaal 100 cm^ dichloormethaan, b) driemaal 100 cm^ methanol, 3 c) driemaal 100 cm dichloormethaan, onder roeren gedurende 3 minuten na elke toevoeging van oplosmiddel 15 en een telkens uitgevoerde centrifugebehandeling.

k) Men neutraliseert vervolgens het polymeer door toevoeging van 100 cm^ van een mengsel van dichloormethaan en N-methylmorfoline in de volumeverhouding 9*1« roeren gedurende 10 minuten, daarna centrifugeren.

20 5) De hars wordt vervolgens gewassen met: 3 driemaal 100 cnr dichloormethaan onder roeren gedurende 3 minuten na elke toevoeging van oplosmiddel en telkens centrifugeren.

6) Men voegt dan achtereenvolgens toe: 25 a) 5Λ g benzyl N-tert.butyloxycarbonyl-a-D-glutamaat opge- 3 lost in 50 cm dichloormethaan en men roert gedurende 10 minuten, 3 b) 3*3 g dieyclohexylcarbodiimide opgelost in 50 cnr dichloormethaan en men roert gedurende 20 uren en centrifugeert.

7) Men wast de hars achtereenvolgens met: 30 a) driemaal 100 cm^ dichloormethaan, b) driemaal 100 cm^ azijnzuur, c) driemaal 100 cm^ dichloormethaan, onder roeren gedurende 3 minuten na elke toevoeging van oplosmiddel

,-J

en telkens centrifugeren. Men verkrijgt op deze wijze het Na-(0 -35 benzyl-N-tert.butyloxycarbonyl-y-D-glutamyl)-N-€-benzyloxycarbonyl-L-lysyl-polymeer.

Het alanine wordt op het dipeptide-polymeer gebonden door de bewerkingen 1 tot en met 7 te herhalen. De bewerking nummer 6 wordt als volgt gemodificeerd: 40 men voegt achtereenvolgens toe: 8003761 -45- a) 3»05 g N-tert.butyloxycarbonyl-L-alanine opgelost in 50 onP dichloormethaan en men roert gedurende 10 minuten, b) 3,3 g dicyclohexylcarbodiimide opgelost in 50 cm^ dichloormethaan en men roert gedurende 20 uren en centrifugeert.

5 Men verkrijgt op deze wijze het Να-[θ -benzyl-N-(N-tert.butyl- oxycarbonyl-L-alanyD-y-D-glutamylj-N-f-benzyloxycarbonyl-L-lysyl-polymeer.

Het palmitinezuur wordt op het tripeptide-polymeer gebonden door de bewerkingen 1 tot en met 7 te herhalen, De bewerking nr 6 10 wordt als volgt gemodificeerd:

Men voegt achtereenvolgens toe: a) 4,2 g palmitinezuur opgelost in 50 cm^ dichloormethaan en men roert gedurende 10 minuten, b) 3,3 g dicyclohexylcarbodiimide opgelost in 50 cm^ dichloor-15 methaan en men roert gedurende 20 uren en centrifugeert.

Men verkrijgt op deze wijze het Να-[θ -benzyl-N-(N-palmitoyl- L-alanyl)-^-D-glutamyl]-N-£-benzyloxycarbony1-L-lysyl-polymeer.

3

Dit polymeer wordt gesuspendeerd in 150 cm trifluorazijnzuur, dat aanwezig is in een reactor, die voorzien is van een roerinrich-20 ting en in de bodem ervan een gefrit glasfilter. Door deze suspensie laat men een stroom waterstofbromide gedurende 90 minuten gaan. Vervolgens centrifugeert men de hars en wast men deze driemaal met in totaal 300 cm^ azijnzuur onder roeren gedurende 3 minuten na elke toevoeging van het azijnzuur en telkens centrifugeren. De filtraten 25 worden verenigd en onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 50°C tot droog geconcentreerd. De aldus verkregen olie wordt opgenomen in 3 50 cm ethylacetaat. Er ontstaat een neerslag, dat wordt afgescheiden door filtratie en tweemaal wordt gewassen met in totaal 60 cm^ ether. Het neerslag is hygroscopisch en wordt opgelost in 50 cm^ 30 azijnzuur, dat 7 g neutraal silicagel (0,04 - 0,063 mm) bevat. Men concentreert onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 50°C tot droogt en men brengt op een kolom met een diameter van 2,6 cm, die 70 g neutraal silicagel (0,04 - 0,063 mm) bevat.

Men elueert achtereenvolgens met: 3 35 700 cm van een mengsel van ethylacetaat en azijnzuur in de volume-verhouding 9*1» 1700 cm^ van een mengsel van ethylacetaat en azijnzuur in de volume-verhouding 8:2, 600 cm^ van een mengsel van ethylacetaat en azijnzuur in de volume-40 verhouding 7*3, 800 37 61 -46- 2400 cm van een mengsel van ethylacetaat en azijnzuur in de volume-verhouding 1:1, 600 cm'’ van een mengsel van ethylacetaat en azijnzuur in de volume-verhouding 2:8, en 5 1100 cm^ azijnzuur, onder het winnen van frakties van 100 cm^. De verenigde frakties 53 - 70 worden onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 50°C tot droog geconcentreerd. Men verkrijgt op deze wijze 1,28 g van een amorfe vaste stof, die men oplost in 50 cm^ azijnzuur, dat 2,4 g 10 neutraal silicagel (0,04 - 0,063 mm) bevat. Men concentreert het mengsel onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 50°C tot droog en brengt op een kolom met een diameter van 1,5 cm, die 24 g neutraal silicagel (0,04 - 0,063 mm) bevat. Men elueert achtereenvolgens met: 15 300 cm^ van een mengsel van ethylacetaat en azijnzuur in de volume-verhouding 7:3* 150 cm'’ van een mengsel van ethylacetaat en azijnzuur in de volume-verhouding 6:4, 300 cm^ van een mengsel van ethylacetaat en azijnzuur in de volume-20 verhouding 1:1, 250 cm'’ van een mengsel van ethylacetaat en azijnzuur in de volume-verhouding 4:6, 350 cm^ van »een mengsel van ethylacetaat en azijnzuur in de volume-verhouding 3^7* 25 350 cm^ van een mengsel van ethylacetaat en azijnzuur in de volume- verhouding 2:8, 3 200 cm van een mengsel van ethylacetaat en azijnzuur in de volume-verhouding 1:9* en 3 · 3 200 cm azijnzuur onder het winnen van frakties van 50 cm .

30 De verenigde frakties 25 - 42 worden onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 50oC tot droog geconcentreerd. De verkregen amorfe vaste stof wordt opgenomen in 30 cm^ ethylacetaat, door filtratie afge- 3 3 scheiden, met 20 cm ethylacetaat en 20 cm ether gewassen. Na drogen onder een verminderde druk van 0,04 kPa bij 50°C verkrijgt men 35 0,52 g N-a-[N-(N-palmitoyl-L-alanyl)-y-D-glutamyl]-L-lysine.

fif = 0,30 [silicagel; n-butanol-pyridine-azijnzuur-water (50/ 20/6/24 in volumedelen)].

Analyse: berekend #: C 54,13 H 8,63 N 8,42 gevonden : C 54,9 H 8,6 N 8,7· 40 Zwavelzuuras = 1,7#, 800 3761 -47-

Na totale hydrolyse openbaart de analyse op de Technicon auto-analyse-inrichting de aanwezigheid van de volgende aminozuren:

Ala 0,99 (theorie =1)

Glu 1,00 (theorie =1) 5 Lys 1,02 (theorie = 1).

De onderhavige uitvinding heeft eveneens betrekking op farmaceutische preparaten, die ten minste één verbinding volgens de uitvinding tezamen met één of meer verenigbare en farmaceutische aanvaardbare verdunningsmiddelen of versnijdingsmiddelen bevatten. Deze 10 preparaten kunnen gebruikt worden als ondersteuningsmiddelen van vaccins of als niet specifieke stimuleringsmiddelen van anti-infek-tie- en anti-tumorimmuniteit.

Gebruikt als ondersteuningsmiddelen van vaccins worden de verbindingen volgens de uitvinding tegelijkertijd en langs dezelfde 15 weg toegediend als het antigeen (virusachtig, bacterieachtig,parasitair of van andere aard) waartegen men bij het geïmmuniseerde individu (mens of huisdier) de celluV'aire immuniteitsreacties (hypergevoeligheid van het vertraagde type) of de produktie van circulerende of plaatselijke antilichamen wenst te verhogen.

20 De verbindingen worden toegediend bij relatief geringe dose ring (in de ordegrootte van mg), gemengd met het antigeen en langs dezelfde weg (intramusculair, subcutaan, intraveneus, intranasaal, oraal). Indien noodzakelijk kunnen het produkt en het antigeen geëmulgeerd zijn in een geschikt olieachtig versnijdingsmiddel of op-25 genomen in liposomen.

Als niet specifieke immunostimuleringsmiddelen worden zij toegediend bij doseringen tussen 0,1 en 50 mg/kg langs parenterale (intraveneus, subcutaan, intramusculair), intranasale, orale, rectale of eventueel intratumorale weg.

30 Als vaste preparaten voor orale toediening kunnen tabletten, pillen, poeders of granules gebruikt worden. In deze preparaten is het werkzame produkt gemengd met één of meer verdunningsmiddelen zoals saccharose, lactose of amidon. Deze preparaten kunnen eveneens andere verbindingen bevatten dan de verdunningsmiddelen, bijvoor-35 beeld een glijmiddel, zoals magnesiumstearaat.

Als vloeibare preparaten voor orale toediening kan men farmaceutisch aanvaardbare emulsies, oplossingen, suspensies, siropen of elixers gebruiken, die inerte verdunningsmiddelen bevatten, zoals water of paraffineolie. Deze preparaten kunnen verbindingen anders 40 dan de verdunningsmiddelen bevatten, bijvoorbeeld bevochtigingsmid- 800 37 61 -48- delen, zoetstoffen of aroma's.

De preparaten voor parenterale toediening kunnen steriele wa-terbevattende oplossingen, suspensies of emulsies zijn. Als drager in deze laatstgenoemde gevallen kan men polyethyleenglycol, propy-5 leenglycol, plantaardige oliën, in het bijzonder olijfolie en inje-teerbare organische esters, bijvoorbeeld ethyloleaat, toepassen.

Deze preparaten kunnen eveneens toevoegsels bevatten, in het bijzonder bevochtigingsmiddelen, emulgeermiddelen of dispergeermiddelen.

De sterilisatie kan op verschillende wijzen plaats hebben, bij-10 voorbeeld met behulp van een bacteriologisch filter, door het opnemen in het preparaat van steriliserende middelen of door verhitting. Zij kunnen eveneens bereid worden in de vorm van vaste preparaten, die steriel gemaakt worden door bijvoorbeeld bestraling, die kunnen worden opgelost in steriel water of gedispergeerd in elk ander ste-15 riel injekteerbaar milieu, eventueel op het tijdstip van toepassing.

De preparaten voor intranasale toediening kunnen steriele water-bevattende oplossingen, suspensies of emulsies zijn, die eventueel verenigd kunnen zijn met een verenigbaar drijfmiddel.

De preparaten voor rectale toediening zijn suppositoria, die 20 naast het werkzame produkt versnijdingsmiddelen kunnen bevatten, zoals cacaoboter of suppo-cire.

De volgende voorbeelden, die niet beperkend zijn, lichten een preparaat volgens de uitvinding toe.

Voorbeeld A.

25 Men bereidt volgens de gebruikelijke techniek een oplossing, die langs intraveneuze weg toegediend kan worden, met de volgende samenstelling: N2- (N-laur oyl-L-alany 1- j^-D-glutamy 1) -DD. LL-2.6-diaminopimelaminezuur 0,5 g 3 30 injekteerbare opgeloste stof 5 cm .

Voorbeeld B.

Men bereidt volgens de gebruikelijke techniek een oplossing, die langs intraveneuze weg toegediend kan worden, met de volgende samenstelling: 35 methyl-N-a-[N-(N-lauroyl-L-alanyl)-)f-D-glutamyl]- L-lysinaat 0,5 g injekteerbare opgeloste stof 5 cm^.

800 3761

Claims

1. Tripeptide, gekenmerkt door de algemene formule 1, waarin de symbolen E, die gelijk of verschillend kunnen zijn, een waterstofatoom of een vetzuurrest voorstellen, met dien verstande, 5 dat ten minste één van de symbolen E een vetzuurrest voorstelt, het symbool R^ een hydroxyl-, amino- of alkoxygroep voorstelt, waarvan het alkyldeel 1-4 koolstofatomen bevat en eventueel gesubstitueerd is met een fenyl- of nitrofenylgroep, de symbolen Ej en R^, die gelijk of verschillend kunnen zijn, een waterstofatoom of een carboxyl··, 10 carbamoyl- of alkoxycarbonylgroep voorstellen, waarvan het alkyldeel 1-4 koolstofatomen bevat en eventueel gesubstitueerd is met een fenyl- of nitrofenylgroep, met dien verstande, dat de symbolen en R^ niet gelijktijdig een waterstofatoom kunnen voorstellen, en met dien verstande, dat het alanine in de L-vorm is, het glutamine-15 zuur in de D-vorm is, het lysine, wanneer één van de symbolen R^ of R^ een waterstofatoom voorstelt, in de L-vorm is en het 2.6-diamino-pimelinezuur of derivaten ervan, wanneer de symbolen 2^ en R^, die gelijk of verschillend kunnen zijn, een carboxyl-, carbamoyl- of alkoxycarbonylgroep voorstellen, in de D.D-, L.L-, DD.LL (racemisch)-20 of D.L (meso)-vorm is, alsmede de zouten ervan.

2 I 2 jl Cc.h2)3 hn4h-coo h2n-ch-co-r4 2n / I X // CHpCH-—CO — NH — CH — R 'Cu I // X OCO CH NHg ^—NH —CH —Rg (CH2)3 H2N—CO—CH—NHg iL. Ά. Y — NH — CH— CO— R4 Rg —NH —CH—CO —NH —CH —CO—R4 CH2CI^— C00H CH3 CH2CH2— C0 —NH — CH — R3 Cch2)3 J4, Rg— NH — CH —Rg R-— NH — CH— R, 1L

2. I 4 I ch3 CHgCHg—cooh (ch2)3 Z—NH —CH-CO—NHg 800 37 61 to. Η,Ν—CH—CO—NH0

2. Tripeptide volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de vetzuurrest een alkanoylgroep is met 1-45 koolstofatomen, eventueel gesubstitueerd met een hydroxyl-, fenyl- of cyclohexyl-groep, een alkenoylgroep is met 3-30 koolstofatomen en meer dan 25 één dubbele binding kan bevatten, of een mycolzuurrest is.

3» Werkwijze ter bereiding van een tripeptide, met het kenmerk , dat men een verbinding met de algemene formule 1, waarin de symbolen de bij conclusie 1 vermelde betekenissen bezitten, op een op zichzelf bekende wijze bereidt.

4. Werkwijze ter bereiding van een tripeptide, met het kenmerk , dat men een verbinding met formule 1, waarin de symbolen de bij conclusie 1 vermelde betekenissen bezitten bereidt, doordat men een dipeptide met de algemene formule 3, waarin R^ een vetzuurrest of een beschermende groep van de aminogroep voorstelt en R^ 35 een aminogroep of een alkoxygroep met 1-4 koolstofatomen, eventueel gesubstitueerd met een benzyl- of nitrobenzylgroep voorstelt, laat inwerken op een aminozuur met de algemene formule 4, waarin 2^ en R^ zoals bij conclusie 1 gedefinieerd zijn, en R^ een vetzuurrest of een beschermende groep van de aminogroep voorstelt, met dien ver-40 stande, dat ten minste één van de symbolen R^ van de formules van 800 3761 -50- het dipeptide en van het hiervoor gedefinieerde aminozuur een vet-zuurrest voorstelt, waarna men eventueel - de groep R,., wanneer deze een beschermende groep van de aminogroep voorstelt, door een waterstofatoom vervangt, 5. de groep R^, wanneer deze een alkoxygroep met 1-4 koolstofatomen, eventueel gesubstitueerd met een fenyl- of nitrofenylgroep voorstelt, door een hydroxylgroep vervangt, - de groepen R^ en R^, wanneer deze een alkoxycarbonylgroep voorstellen, waarin het alkyldeel 1-4 koolstofatomen bevat, eventueel ge- 10 substitueerd met een fenyl- of nitrofenylgroep, vervangt door een carboxylgroep, en het verkregen produkt, eventueel in de vorm van een zout, isoleert,

5 I * ! 4 CH3 CHgCHg — COOH JL JL

5. Werkwijze ter bereiding van een verbinding volgens conclusie 1 of 2i met het kenmerk, dat men een geactiveerd deri-15 vaat van het L-alanine met de algemene formule 5, waarin R^ een vet-zuurrest of een beschermende groep van de aminogroep voorstelt, laat reageren met een dipeptide met de algemene formule 11, waarin R^ en R^ gedefinieerd zijn volgens conclusie 1, R^ een aminogroep of een alkoxygroep met 1-4 koolstofatomen, eventueel gesubstitueerd met 20 een fenyl- of nitrofenylgroep, voorstelt en R^ een vetzuurrest of een beschermende groep van de aminogroep voorstelt, met dien verstande, dat ten minste één van de symbolen R,- van de formules van het alaninederivaat en het dipeptide, zoals hiervoor gedefinieerd, een vetzuurrest voorstelt, waarna men eventueel 25 - de groep R^, wanneer deze een beschermende groep van de amino-groep voorstelt, door een waterstofatoom vervangt, - de groep R^, wanneer deze een alkoxygroep met 1-4 koolstofatomen, eventueel gesubstitueerd met een fenyl- of nitrofenylgroep, vervangt door een hydroxylgroep en 30. de groepen R^ en/of R^, wanneer deze een alkoxycarbonylgroep voorstellen, waarin het alkyldeel 1-4 koolstofatomen bevat, eventueel gesubstitueerd met een fenyl- of nitrofenylgroep, vervangt door een carboxylgroep, en het verkregen produkt, eventueel in de vorm van een zout,isoleert,

6. Werkwijze ter bereiding van een verbinding volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat men een zuur met de algemene formule 7» waarin R'-CO- een vetzuurrest voorstelt, of een geactiveerd derivaat' van dit zuur laat inwerken op een tripeptide met de algemene formule 131 waarin R£ en R^ de bij conclusie 1 vermelde 40 betekenissen bezitten, R^ een aminogroep of een alkoxygroep met 1 - 800 3 7 61 -51- 4 koolstofatomen, eventueel gesubstitueerd met een fenyl- of nitro-fenylgroep voorstelt, en de symbolen Rg, die gelijk of verschillend * kunnen zijn, een waterstofatoom of een vetzuurreet of een bescher mende groep van de aminogroep voorstelt, waarbij ten minste één van 5 de symbolen Rg een waterstofatoom voorstelt, waarna men eventueel - de groep R^, wanneer deze een beschermende groep van de aminogroep voorstelt, vervangt door een waterstofatoom, - de groep R^, wanneer deze een alkoxygroep met 1-4 koolstofatomen, eventueel gesubstitueerd met een fenyl- of nitrofenylgroep voor- 10 stelt, vervangt door een hydroxylgroep, en - de groepen R^ en/of R^, wanneer deze een alkoxycarbonylgroep met 1 - 4 koolstofatomen, eventueel gesubstitueerd met een fenyl- of nitrofenylgroep voorstellen, vervangt door een carboxylgroep en het verkregen produkt, eventueel in de vorm van een zout, isoleert.

7. I 8 I I CH3 CH3 CH3 CHgCHg—COOH 1&. R„— NH—CH— CO—Ri 9 I 4 & CHgCHg— CO —NH—CH— R3 (chJ- R._—NH —CH—CO—NH —CH—CO —R, I 6 3

7 I 3 (CH2)3 R?—NH —CH —CO —R4 Rj— NH —CH — Rg CHgCHg— COOH JG^ JjL 1&.

7. Werkwijze ter bereiding van een verbinding volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat men op een geschikte drager het aminozuur met de formule 14, waarin één van de symbolen en Rj een carboxylgroep en het andere symbool een waterstofatoom of een carbamoyl- of alkoxycarbonylgroep voorstelt, waarin het alkyldeel 20 1 - 4 koolstofatomen bevat, eventueel gesubstitueerd met een fenyl-of nitrofenylgroep, R^ een vetzuurrest of een beschermende groep van de aminogroep voorstelt en R^ een beschermende groep van de amino-groep voorstelt, met dien verstande, dat R^ en Ry elk een beschermende groep van de aminegroep voorstellen^elke beschermende groepen ver-25 schillend zijn, fixeert en vervolgens na deblokkering van derdoor de Rrj -groep beschermende aminogroep een condensatie uitvoert met: - hetzij een derivaat van het D-glutaminezuur met de algemene formule : 1.5» waarin Ry, zoals hiervoor gedefinieerd is en R^ een aminogroep of alkoxygroep met 1-4 koolstofatomen, eventueel gesubstitueerd met 50 een fenyl- of nitrofenylgroep voorstelt, waarna men, na deblokkering van de door de groep Ry beschermende aminogroep een condensatie uitvoert met: ; - hetzij een derivaat van het L-alanine met de algemene formule 16, waarin Ry zoals hiervoor gedefinieerd is daarna na deblokkering van 55 öLe door Rybeschermende aminogroep, het vetzuur met de algemene formule 7 waarin R'-CO-, een vetzuurrest voorstelt, zoals gedefinieerd in de conclusie 1 of 2, - hetzij een derivaat van het L-alanine met de algemene formule 17, · waarin R een vetzuurrest voorstelt, 40 800 3 7 61 -52- - hetzij het dipeptide met de algemene formule 18, waarin R^ zoals hiervoor gedefinieerd is en Rg een vetzuurrest of een beschermende groep van de amin®groep voorstelt, met dien verstande, dat wanneer Rg een beschermende groep van de aminogroep voorstelt, deze verschilt 5 van de beschermende groep R^, zoals hiervoor gedefinieerd, daarna na deblokkering van de door.Eg..beschermde aminogroep, het zuur met de algemene formule R'-CO-OH zoals hiervoor gedefinieerd, daarna het verkregen produkt van zijn dragepêcheidt, eventueel de beschermende groepen van de amine- en carboxylgroepen verwijdert en het verkregen 10 produkt eventueel in de vorm van een zout isoleert.

8. Werkwijze ter bereiding van een verbinding volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat men op een geschikte drager het dipeptide met de algemene formule 19 fixeert, in welke formule één van de symbolen Rg en R^ een carboxylgroep voorstelt en 15 het andere symbool een carbamoyl- of alkoxycarbonylgroep voorstelt, waarvan het alkyldeel 1-4 koolstofatomen bevat, eventueel gesubstitueerd met een fenyl- of nitrofenylgroep, R^ een amino- of alkoxy-groep met 1-4 koolstofatomen, eventueel gesubstitueerd met een fenyl- of nitrofenylgroep, voorstelt, R^ een vetzuurrest of een be-20 schermende groep van de aminogroep voorstelt en R^ een beschermende groep van de aminogroep voorstelt, met dien verstande dat, wanneer R- en Rq elk een beschermende groep van de aminogroep voorstellen, 7 7 deze beschermende groepen verschillend zijn, waarna men door deblokkering van de door RQ beschermde aminogroep,een condensatie uit- 7 25 voert mets - hetzij een derivaat van het L-alanine met de algemene formule 16, waarin Ry een vetzuurrest of een beschermende groep van de aminogroep voorstelt, daarna na deblokkering van de door Ey beschermde aminogroep ') eventueel het vetzuur met de algemene formule 7» waarin

50 R'-CO- een vetzuurrest voorstelt zoals gedefinieerd in de conclusie 1 of 2, - hetzij een derivaat van het L-alanine met de algemene formule 17» waarin R een vetzuurrest voorstelt, daarna het verkregen produkt van zijn drager scheidt, eventueel de beschermende groepen van de amijje- 55 en carboxylgroepen verwijdert en het verkregen produkt, eventueel in de vorm van een zout, isoleert.

9. Werkwijze ter bereiding van een verbinding volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat men op een geschikte drager het tripeptide met de algemene formule 20 fixeert, in welke for- 40 mule één van de symbolen Rg en R^ een carboxylgroep voorstelt en het 800 3761 - 53 - andere symbool een carbamoyl- of alkoxycarbonylgroep voorstelt, waarin het alkyldeel 1-4 koolstofatomen bevat, eventueel gesubstitueerd met een fenyl- of nitrofenylgroep, R^ een aminogroep of al-koxygroep met 1-4 koolstofatomen, eventueel gesubstitueerd met een 5 fenyl- of nitrofenylgroep: .voorstelt, Rj. een vetzuurrest of een beschermende groep van de aminogroep voorstelt, en R^q een beschermende groep van de aminogroep voorstelt, met dien verstande dat, wanneer R,. en R^q elk een beschermende groep van de aminogroep voorstellen, deze beschermende groepen verschillend zijn, daarna, ne de-10 blokkering van de door R^q beschermde aminogroep, men een condensatie uitvoert met het zuur met de algemene formule 7> waarin R'-CO-een vetzuurrest voorstelt, zoals gedefinieerd in conclusie 1 of 2, daarna het verkregen product van zijn drager scheidt, eventueel de beschermende groepen van de amino- en carboxylgroepen verwijdert en 15 het verkregen product, eventueel in de vorm van een zout, isoleert.

10. Farmaceutisch preparaat, gekenmerkt door de aanwezigheid van één of ..meer verbindingen met formule 1 volgens conclusie 1, waarin de symbolen de bij conclusie 1 vermelde betekenissen bezitten in zuivere toestand of bij aanwezigheid van één of meer ver- 20 enigbare en farmaceutisch aanvaardbare verdunningsmiddelen of toevoegsels.

11. Werkwijze ter bereiding van een farmaceutisch preparaat, met het kenmerk, dat men een verbinding met formule 1, waarin de symbolen de bij conclusie 1 vermelde betekenissen bezitten, 25 in een voor een dergelijke toepassing geschikte vorm brengt. xxxxxxxx 8003761 A R — NH— CH—CO—-NH—CH — CO — CH3 CHgCHg—CO — NH—CH—Rj fzh r — HH—CH — R2 A ~ NAG—Nj\M------MAG—NAM " Ala Ala Glu Glu (R COOH) I I * D^P DAP Ala-------- -1 m λ L R—NH — CH —CO —HH —CH — CO — R, H N-CH—R 5. f ^ I ch3 ch2ch2—cooh (ch2)3 R3—NH —CH —R2 A 1 o —NH—CH—COOH H9N — CH — CO — R, R'— CO — OH

10. I 4 I I I Rc—NH—CH — R9 CH, CH-CH-—CO — NH— CH — R, 5 2 3 2 2 I 3 R^ — NH — CH — Rg 800 3761