NL2029695B1

NL2029695B1 - Method and kit for detection of protein-DNA markers, such as protein-DNA interactions and/or histone modifications, in cells

Info

Publication number: NL2029695B1
Application number: NL2029695A
Authority: NL
Inventors: Johanna Anna Lochs Silke; Haico Kind Jop
Original assignee: Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen
Priority date: 2021-11-09
Filing date: 2021-11-09
Publication date: 2023-06-05
Also published as: JP2024540407A; WO2023085928A1; EP4430204A1

Claims

CONCLUSIES

1. Een werkwijze om DNA sequentie informatie te verkrijgen, de werkwijze omvattende de stappen van: (a) het verstrekken van een monster omvattende uit één of meer permeabel gemaakte en gefixeerde celkernen omvattende DNA; (b) het behandelen van de één of meer celkernen omvattende DNA door (iy het verteren van het DNA met een eerste restrictie-endonuclease om te voorzien in DNA-fragmenten en het defosforyleren van het 5'-uiteinde van de DNA-fragmenten om te voorzien in gedefosforyleerde DNA- fragmenten; (i) het contacteren, voor, tijdens of na stap (i), van één of meer celkernen omvattende DNA (1) met één of meer eerste antilichaam-DNA-adapter conjugaten, en/of (2) met één of meer eerste antilichamen en één of meer eerste antilichaam-DNA-adapter conjugaten, waarbij het eerste antilichaam gericht is tegen een eiwit van belang waarvan wordt vermoed dat het interageert met DNA waarbij het eerste antilichaam-DNA-adapter conjugaat een eerste antilichaamdeel omvat dat is geconjugeerd aan een eerste DNA- adapterdeel is geconjugeerd en waarbij in situatie (1) het eerste antilichaamdeel gericht is tegen een eiwit van belang waarvan wordt vermoed dat het interageert met DNA en waarbij in situatie (2) het eerste antilichaamdeel gericht is tegen het eerste antilichaam, en waarbij een uiteinde van het eerste DNA-adapterdeel cohesief is of cohesief gemaakt is met een uiteinde van de gefosforyleerde DNA- fragmenten als gedefinieerd in stap (i), en waarbij het eerste DNA-adapterdeel een tweede restrictieplaats omvat voor een tweede restrictie-endonuclease, en, bij voorkeur, waarbij het eerste DNA-adapterdeel een eerste barcode sequentie omvat, waarbij de eerste barcode sequentie is gepositioneerd tussen het uiteinde van het eerste DNA-adapterdeel dat cohesief is aan een uiteinde van de gedefosforyleerde DNA- fragmenten gedefinieerd in stap (i) en de tweede restrictieplaats, waarbij het contacteren onder omstandigheden is welke (1) het antilichaamdeel van het eerste antilichaam-DNA-adapter conjugaat of (2) het antilichaam, en het antilichaamdeel van het eerste antilichaam-DNA- adapter conjugaat toestaat te binden met haar doel(en) om te voorzien in een eerste antilichaam-DNA-adapter conjugaat dat is gebonden aan het eiwit van belang, (ii) het toestaan van het eerste DNA-adapterdeel van het eerste antilichaam- DNA-adapter conjugaat om te ligeren aan een uiteinde van de gedefosforyleerde DNA-fragmenten, teneinde een eerste DNA-adapter- DNA-fragmentproduct te verkrijgen; {c) het behandelen van het monster welk is verkregen na stap b) door (i) het afbreken van eiwit, bij voorkeur door het uitvoeren van een eiwitafbrekend enzym behandeling, bij voorkeur waarbij het enzym proteinase K omvat, en/of door een hittebehandeling, en, het lyseren van de kernen; en (iy het behandelen voor of na (i) van het DNA in het monster met de tweede restrictie-endonuclease waardoor een knip wordt aangebracht in de tweede restrictieplaats die is omvat in het eerste DNA-adapterdeel; (d) het incuberen van het monster verkregen na stap (c) met een tweede DNA- adapter, waarbij een uiteinde van de tweede DNA-adapter cohesief is, bij voorkeur waarbij het cohesieve uiteinde een 5'-uiteinde fosfaatgroep heeft, aan het uiteinde welk is gecreëerd bij de tweede restrictieplaats van de eerste DNA-adapter in stap (c) (ii), en waarbij de tweede DNA-adapter een RNA polymerase bindende sequentie en/of een DNA-primer sequentie omvat, en bij voorkeur verder een tweede barcode sequentie omvat, bij voorkeur waarbij de tweede barcode sequentie gepositioneerd is tussen de RNA polymerase bindende sequentie en/of een DNA-primer sequentie en het uiteinde dat cohesief is aan het uiteinde welk is gecreëerd bij de tweede restrictieplaats van de eerste DNA-adapter in stap (c) (ii),

waarbij het contacteren onder omstandigheden is welke het toestaan dat de tweede DNA-adapter kan ligeren aan het uiteinde welk is gecreëerd bij de tweede restrictieplaats van het eerste DNA-adapterdeel in stap (c) (ii), teneinde een tweede DNA-adapter - eerste DNA-adapter - DNA-fragmentproduct te verkrijgen; (e) het amplificeren van het tweede DNA-adapter - eerste DNA-adapter - DNA- fragmentproduct en het bepalen van de sequentie van het verkregen geamplificeerde product.

2. De werkwijze volgens één van de voorgaande conclusies, waarbij de één of meer kernen van stap (a): - één celkern is; - meer dan 10, 20, 100 of 1000 celkernen omvat; - van een dier is, bij voorkeur van een knaagdier of zoogdier, bij voorkeur de mens; - verkregen is uit één enkel type organisme, of één enkel organisme, bij voorkeur één enkel mens; - verkregen is uit een ziek weefsel; - omvat is in een cel; en/of - van één celtype of van verschillende typen van cellen is.

3. De werkwijze volgens één van de voorgaande conclusies, waarbij de eerste restrictie- endonuclease: - een stomp uiteinde creëert of een uiteinde met een overhang creëert - een herkenningsplaats herkent die 4 - 8 basenparen in lengte is, bij voorkeur 4 basenparen in lengte, bij voorkeur is de eerste restrictie-endonuclease gekozen uit de groep bestaande uit Msel, Mbol, Dpnll, en Nlalll; en/of - een restrictie-endonuclease is die gemiddeld het DNA elke 100 - 10000 basenparen knipt.

4. De werkwijze volgens één van de voorgaande conclusies, waarbij in situatie (1) het antilichaamdeel van het antilichaam-DNA-adapter conjugaat en in situatie (2) het antilichaam gericht is tegen een eiwit waarvan bekend is dat het bindt aan DNA of waarvan vermoed wordt dat het bindt aan DNA, bij voorkeur waarbij het eiwit wordt gekozen uit de groep bestaande uit een histon, een histon hebbende een histonmodificatie, bij voorkeur wanneer de modificatie één of meer is gekozen uit de groep bestaande uit: methylering, fosforylering, acetylering, ubiquitylering en sumoylering, een DNA-polymerase, een RNA-polymerase, een transcriptiefactor, een nuclease, een hoge mobiliteit groep eiwit, een nucleosoom remodeler, een nucleair structuureiwit, een DNA-schade reparatie eiwit, een histon-modificerend enzym, een component van een chromatinecomplex, een chromatine structureel eiwit en een histon- chaperon.

5. De werkwijze volgens één van de voorgaande conclusies, waarbij het eerste DNA- adapterdeel van het eerste antilichaam-DNA-adapter conjugaat: - een lengte heeft van tussen 50 en 150 basenparen; - de eerste barcode sequentie omvat, waarbij, bij voorkeur, de eerste barcode sequentie uniek identificerend is voor het antilichaamdeel van het antilichaam- DNA-adapter conjugaat; en/of - cohesief is gemaakt aan een uiteinde van de gedefosforyleerde DNA-fragmenten die in stap (b) (i), zijn gecreëerd, voordat of nadat het antilichaamdeel van het eerste antilichaam-DNA-adapter conjugaat is toegestaan om aan haar doel te binden.

6. De werkwijze volgens één van de voorgaande conclusies, waarbij de omstandigheid die het eerste DNA-adapterdeel toestaat te ligeren aan een uiteinde van een gedefosforyleerd DNA-fragment het gebruik van een DNA-ligase omvat.

7. De werkwijze volgens één van de voorgaande conclusies, waarbij het behandelen volgens stap (c) het behandelen met één of meer proteasen omvat, bij voorkeur waarbij de protease proteinase K is, en/of waarbij het afbreken van eiwit een hittebehandeling omvat, bij voorkeur waarbij de hittebehandeling plaatsvindt bij een temperatuur tussen 50 - 70 graden Celsius.

8. De werkwijze volgens één van de voorgaande conclusies waarbij het tweede restrictie- endonuclease: - een stomp uiteinde creëert of een uiteinde met een overhang creëert;

- een herkenningsplaats herkent die ten minste 4 - 8 basenparen in lengte is, bij voorkeur 6 - 8 basenparen in lengte is, bij nog meer voorkeur 8 basenparen in lengte of meer; - is gekozen uit de groep bestaande uit Notl en Sfil; - een restrictie-endonuclease is welk gemiddeld het DNA elke 20.000 — 2.000.000 basenparen knipt; en/of - een uiteinde creëert dat verschillend is van het uiteinde dat door het eerste restrictie-endonuclease wordt gecreëerd.

9. De werkwijze volgens één van de voorgaande conclusies waarbij de tweede DNA- adapter: - lineair is en bij voorkeur een lengte heeft van tussen 50 en 100 basenparen; - een RNA-polymerase-bindende sequentie omvat gekozen uit een T7-RNA- polymerase-bindende sequentie en een T3-RNA-polymerase-bindende sequentie; - de tweede barcode sequentie omvat waarbij de tweede barcode sequentie uniek identificerend is voor het monster; en/of - één of meer verdere adaptersequenties omvat, bij voorkeur gekozen uit P5- adaptersequenties (lllumina), P7-adaptersequenties (lllumina).

10. De werkwijze volgens één van de voorgaande conclusies, waarbij de omstandigheid die het tweede DNA-adapter toestaat te ligeren aan het uiteinde dat bij de tweede restrictieplaats van de eerste DNA-adapter is gecreëerd in stap (d) het gebruik van een DNA-ligase omvat.

11. De werkwijze volgens één van de voorgaande conclusies waarbij: - meer dan één eerste restrictie-endonuclease wordt gebruikt; - meer dan één eerste antilichaam-DNA-adapter conjugaat wordt gebruikt, waarbij ofwel het antilichaam, danwel het eiwit waartegen het antilichaam is gericht, het eerste DNA-adapterdeel, de eerste barcode sequentie, of een combinatie daarvan, hetzelfde of verschillend kunnen zijn; - meer dan één tweede restrictie-endonuclease wordt gebruikt; en/of - meer dan één tweede DNA-adapter wordt gebruikt, waarbij het uiteinde van de tweede DNA-adapter dat cohesief is met het uiteinde dat wordt gecreëerd bij de tweede restrictieplaats van de eerste DNA-adapter, de tweede barcode, de RNA- polymerase bindende sequentie, of de één of meer verdere adaptersequenties, of een combinatie daarvan, hetzelfde of verschillend kunnen zijn.

12. De werkwijze volgens één van de voorgaande aanspraken waarbij amplificatie van het tweede-DNA-adapter - eerste-DNA-adapter - DNA-fragmentproduct middels lineaire amplificatie is.

13. De werkwijze volgens één van de voorgaande aanspraken waarbij vóór stap (b), als onderdeel van stap (b) of vóór stap (c) de kernen worden gesorteerd om te voorzien in gesorteerde monsters omvattende één of meer, bij voorkeur één kern per gesorteerd monster, en waarbij bij voorkeur na stap (c), na stap (d) of vóór stap (e) één of meer van de gesorteerde monsters worden gepoold.

14. Gebruik van een werkwijze volgens één van de voorgaande conclusies voor het genereren van genoom-brede eiwit-DNA interactieprofielen, genoom-brede epigenetische profielen, het vergelijken tussen celtype-specifieke epigenetische en/of eiwit-DNA interactieprofielen of het vergelijken tussen epigenetische en/of eiwit-DNA interactieprofielen tussen embryo's in verschillende ontwikkelingsstadia, vergelijking tussen epigenetische en/of eiwit-DNA-interactieprofielen bij tumorigenese in verschillende ziektestadia, na verschillende behandelingsregimes, analyse van eiwit- DNA-interactie op verschillende loci, vergelijking van eiwit-DNA-interactie tussen één of meer verkregen monsters, vergelijking van eiwit-DNA-interactie tussen ziek en gezond weefsel of tussen verschillende delen van een organisme.

15. Een kit omvattende een eerste antilichaam-DNA-adapter conjugaat zoals gedefinieerd in éen van de voorgaande conclusies en een overeenkomstige tweede DNA-adapter zoals gedefinieerd in één van de voorgaande conclusies.