MXPA06015234A

MXPA06015234A - Conjugados de fraccion polimero-factor ix.

Info

Publication number: MXPA06015234A
Application number: MXPA06015234A
Authority: MX
Inventors: Mary J Bossard; Gayle Stephenson
Original assignee: Nektar Therapeutics Al Corp
Priority date: 2004-06-30
Filing date: 2005-06-30
Publication date: 2007-11-22
Also published as: KR20070030308A; US20100130428A1; IL180115A0; CA2571292A1; US20060052302A1; US20100120982A1; US20100130684A1; US20090280550A1; US9347054B2; US20170035896A1; EP1765411B1; WO2006005058A2; US8586711B2; KR101146160B1; AU2005260763B2; NO20070552L; US20140141483A1; ES2390082T5; JP6162358B2; US20210023186A1

Abstract

La presente invencion se refiere a conjugados de una porcion del Factor IX y uno o mas polimeros solubles en agua. Tipicamente, el polimero soluble en agua es polietilenglicol, o un derivado del mismo. Tambien se proporcionan (entre otras cosas), composiciones que comprenden los conjugados, metodos para elaborar los conjugados y metodos para administrar a un paciente, composiciones que comprenden los conjugados.

Description

CONJUGADOS DE FRACCIÓN POLÍMERO-FACTOR IX CAMPO DEL INVENTO [001] El presente invento se refiere en términos generales a conjugados que comprenden una fracción con Factor IX (es decir, una fracción que tiene actividad de factor IX) , y un polimero. Además, el invento se refiere a composiciones que contienen los conjugados, métodos para la sintetización de los conjugados, métodos para la transmisión de los conjugados, y métodos para el tratamiento de pacientes .

ANTECEDENTES DEL INVENTO [002] Hemostasis es el proceso de detención del flujo de salida de la sangre desde un vaso sanguíneo deteriorado. Para los mamíferos, así como muchos otros organismos, el proceso de hemostasis es fundamentalmente importante para la supervivencia continua. Las imper ecciones en el proceso de hemostasis pueden resultar, por ejemplo, en la incapacidad de formar efectivamente coágulos de sangre que sirvan para detener la pérdida de sangre después de una lesión vascular. En los humanos, los individuos que sufren de la incapacidad de formar coágulos de sangre se conocen como hemofílicos. De particular preocupación para los hemofílicos es el riesgo que amenaza la vida, de que, una vez haya iniciado, el sangrado nunca se detenga. [003] Generalmente, los hemofílicos pierden la capacidad para producir cantidades efectivas de una o más sustancias finalmente necesarias para la transformación del fibrinógeno soluble en una fibrina no soluble. Por ejemplo, los hemofílicos que sufren de Hemofilia B (también conocida como "deficiencia congénita de Factor IX", o "enfermedad del Sr. Christmas"), tienen una incapacidad de producir niveles efectivos de factor IX. El Factor IX es uno de los componentes claves de una de las muchas "cadenas" de reacciones que resultan en la formación de coágulos de sangre . Fundamental para la cadena de reacciones que se conoce con el nombre de "sistema intrínseco", el Factor IX finalmente influye en la conversión del fibrinógeno en el componente principal de los coágulos de sangre, la fibrina. [004] Aunque el proceso por medio del cual se forman los coágulos de sangre es relativamente complejo, la función del Factor IX en el sistema intrínseco puede ser descrita brevemente. Cuando la sangre entra en contacto con superficies cargadas negativamente y/o tej idos conectivos sub endotélicos (como resultado, por ejemplo, del deterioro de los tejidos asociado con una laceración) , el Factor XII (o el factor Hageman) en la presencia de otras sustancias es transformado en Factor Xl a. El Factor Xlla (junto con otras sustancias) transforma el Factor XI en Factor Xla. A cambio, el factor Xla (junto con otras sustancias) transforma el factor IX en factor IXa. El Factor VIII, el Factor IXa, los iones de Calcio y las micelas de fosfolípidos forman una lipoproteína compleja con Factor X y la activan para formar el Factor Xa. Después de esto, el Factor Xa (junto con otras sustancias) convierte la protrombina en trombina, con el resultado de que una cantidad relativamente grande de trombina es producida a través del tiempo. Cantidades de trombina relativamente grandes convierten el fibrinógeno en fibrina. La fibrina, en cambio, forma la matriz o red responsable de la formación de los coágulos de sangre . [005] La función del Factor IX en el sistema intrínseco de la coagulación de la sangre se muestra esquemáticamente en la parte inferior.

Factor [006] Afectando a uno de cada 34.500 varones, La hemofilia B puede resultar de cualquiera de una variedad de mutaciones del gen del factor IX, el cual está ubicado en el cromosoma X. Dependiendo de la mutación particular, la hemofilia B puede manifestarse a sí misma como severa, moderada o apacible. Los individuos que sufren de las formas más severas de hemofilia B carecen completamente de la capacidad de expresar formas activas de Factor IX. Desde el punto de vista clínico, los individuos afectados con hemofilia B sufren de sangrados en la nariz, contusiones fáciles, hemoartrosis (hemorragia en los espacios de las articulaciones) y sangrado prolongado de las heridas. El tratamiento actual para la hemofilia B implica la infusión de concentrado exógeno de Factor IX, obtenido de plasma humano, o preparado a través de técnicas de recombinación de ADN. Por cuanto estos tratamientos sirven sólo para suplir la falta de niveles efectivos de Factor IX, los individuos que sufren de formas severas de hemofilia B necesitan inyecciones regulares de concentrado de Factor IX (tan frecuente como tres veces por semana) a lo largo de sus vidas . Los pacientes que sufren formas incluso más moderadas de hemofilia B necesitan a menudo la inyección de concentrado de Factor IX antes y/o después de cirugías y trabajos dentales . [007] Muchas formas comerciales de concentrados de Factor IX están disponibles para proveer terapia de reemplazo para pacientes que sufren hemofilia B. Por ejemplo, en el mercado se venden productos de complejos de Factor IX derivados de la sangre (conteniendo otros factores) bajo las marcas BEVULIN BH (Baxter Healthcare, Viena, Austria) , KONYNE 8?" (Baxter Corporation, Eikhart, IN) , PROFILNINE SD™ (Alpha Therapeutic Corporation, Los Angeles, CA) , y PROPLEX T@ (Baxter Healthcare, Glendale, CA) '. Algunas formas un tanto más purificadas de productos de Factor IX se venden en el mercado bajo las marcas ALPHANINE SD® (Alpha Therapeutic Corporation, Los Angeles, CA) , y MONONINE (Aventis Behring, Kankakee L) . Con respecto a los concentrados de Factor IX, preparados a través de la recombinación, un producto está actualmente disponible bajo la marca BENEFIX (Wyeth Genetics Institute, Cambridge, MA) . [008] En términos generales, la fuente de concentrados de Factor IX por recombmacion es favorecida por encima de las fuentes derivadas de la sangre, puesto que estas últimas involucran el riesgo de la transmisión de virus y otras enfermedades. Además, la pureza a menudo es más alta con la fuente de concentrados por recombinación, evitando de esa manera problemas potenciales resultantes de la administración de factores sanguíneos no deseados, y otras proteínas generalmente presentes en las fuentes derivadas de la sangre . [009] No obstante los beneficios de administrar formulas basadas en la recombinación, el procesamiento de 5 los productos basados en la recombm. aci.o.n a menudo requiere la presencia de ciertas proteínas como la albúmina, la cual puede estar presente en la fórmula final administrada al paciente. Como resultado, los pacientes que reciben tales formulaciones desarrollan reacciones alérgicas a estas 0 proteínas extrañas. En cualquier caso, tanto los productos derivados de la sangre como los derivados de la recombinación experimentan la desventaja de la administración repetida. 5

[0010] La PEGilación, o el proceso de enlazar a una proteína un glicol de polietileno, ha sido descrito como un medio para reducir la inmunogenicidad, así como un medio para prolongar la vida media de una proteína in vivo. Con respecto al Factor IX, sin embargo, los acercamientos nn previos para formar conjugados polímeros de proteína experimentaron serias deficiencias .

[0011] Por ejemplo, la patente de EE.UU. No. 5.969.040 describe un proceso que comprende la oxidación de diolos vecinales de fracciones de carbohidratos en la 25 región de activación del Factor IX para formar aldehidos .

Siguiendo el procedimiento de la oxidación, el proceso descrito incluye la medida de adjuntar de manera covalente uno o más polímeros antigénicos (como un derivado de glicol de polietileno con hidracina) , a las fracciones de carbohidrato oxidado. Un problema con este enfoque, sin embargo, es el aumento de la complejidad atribuido a los pasos adicionales necesarios para obtener una forma oxidada del Factor IX. Adicionalmente, cualquier oxidante que pueda permanecer después del procedimiento de oxidación puede degradar el polímero asociado con el conjugado. Finalmente, este enfoque está limitado a la conjugación usando polímeros específicos (es decir, polímeros con hidracida) y regiones específicas sobre el Factor IX (es decir, diolos vecinales de fracciones de carbohidratos en la región de activación del Factor IX) .

[0012] La presencia de oxidantes (sea como resultado del proceso descrito en la patente de EE.UU. No. 5,969,040 o provenientes de otras causas), introduce desafíos adicionales con respecto a proveer un producto farmacéutico aceptable de un conjugado polímero para el Factor IX. Específicamente, la metionina y otros aminoácidos que contienen hidroxilo pueden estar sujetos a oxidación no deseada en la presencia de oxidantes, introduciendo de esa manera grupos de aldehidos . Cualquier aldehido residual que no haya reaccionado con el reactivo polimérico será reactivo, y potencialmente puede dañar la proteína. A fin de enfrentar este problema, los aldehidos no reactivos necesitan ser cubiertos con glicina u otra pequeña molécula para estabilizar la proteína. Al hacer esto, sin embargo, se levanta un problema analítico en ello para propósitos de normatividad, un producto debe estar definido sin dificultad; de otra manera, la introducción de componentes adicionales puede frustrar la sincera definición del producto. En particular, el uso de agentes de cubrimiento presentaría un desafío particularmente difícil.

[0013] La patente de EE.UU. No. 6.037.452 describe el enlace de un óxido poli alquileno al Factor IX, en el cual el enlace al Factor IX es efectuado a través de un óxido poli alquileno que contenga uno de los siguientes grupos reactivos: triacina, acetilo, hidracina, diazonio, amino, o éster succinimidilo. Otra vez, sin embargo, la referencia carece de revelaciones respecto al enlace a través de polímeros con carga de grupos reactivos diferentes a la triacina, el acetil, la hidracina, el diazonio, el amino, o el éster succinimidilo.

[0014] Así, permanece allí en el arte una necesidad de proveer conjugados adicionales entre polímeros solubles en el agua y segmentos moleculares que tengan actividad del Factor IX. En particular, hay una necesidad de proveer procesos más simples para la conjugación de un polímero a un segmento molecular que tenga actividad de Factor IX. El presente invento está orientado, entonces, a tales conjugados, así como a composiciones que comprendan los conjugados y métodos relacionados, de la manera como ha sido descrito aquí, lo cual se cree que es nuevo y no ha sido sugerido por la industria.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

[0015] Por consiguiente, en una o más representaciones del invento, se provee un conjugado, el cual comprende un segmento molecular de Factor IX enlazado de manera covalente, sea directamente o a través de una fracción espaciadora compuesta por uno o más átomos, a un polímero soluble en agua, en el cual el peso molecular del polímero soluble en agua es mayor que 5.000 daltones y menor que alrededor de 150.000 daltones.

[0016] En una o más de las representaciones del invento, se provee un conjugado, el cual comprende una fracción de Factor IX enlazado de manera covalente a un residuo aminoácido, sea directamente o a través de una fracción espaciadora compuesta por uno o más átomos, a un polímero soluble en agua, en el cual el residuo aminoácido no está enlazado, sea directamente o a través del fracción espaciadora, a través de un -CH2-C (O) -O- , -N(H) -C (O) CH2-0- , -C(0)-N(H)-, -N(H) -C(O) -CH2-0-, -C (O) -CH2-0- , -C (O) -CH2-CH2-C(0)-0-, un enlace diazo, o triacina.

[0017] En una o más representaciones del invento, se provee un conjugado, el cual comprende una fracción de Factor IX enlazada de manera covalente, sea directamente o a través de una fracción espaciadora compuesta por uno o más átomos a un polímero no lineal, soluble en agua.

[0018] En una o más representaciones del invento, se provee una composición, el cual comprende una pluralidad de conjugados, donde por lo menos el 80% de todos los conjugados está composición, cada una, por una fracción de Factor IX enlazada de manera covalente a uno, dos, tres o cuatro polímeros solubles en agua, y donde además, por cada polímero soluble en agua que haya en el conjugado, fracción de Factor IX es enlazada, sea directamente o a través de una fracción espaciadora compuesta por uno o más átomos .

Las composiciones abarcan todos los tipos de fórmulas, y en particular aquellas que son adecuadas para inyección, tal como polvos que pueden ser reconstituidos, así como líquidos (es decir, suspensiones y soluciones) .

[0019] En una o más representaciones del invento, se provee un método para preparar un conjugado, comprendiendo el método la adición de una composición polimérica reactiva a una composición de Factor IX bajo condiciones suficientes para dar como resultado un conjugado que comprenda una fracción de Factor IX enlazada de manera covalente, ya sea directamente o a través de una fracción espaciadora compuesta por uno o más átomos, a un polímero soluble en agua.

[0020] En una o más descripciones del invento, se provee un método para la entrega de un conjugado, comprendiendo el método la administración al paciente de una composición que comprenda un conjugado tal como ha sido descrito aquí . El procedimiento de administración del conjugado puede efectuarse por inyección (es decir, inyección intramuscular, inyección intravenosa, inyección subcutánea y así sucesivamente), u otro método.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

[0021] La FIG. 1 y la FIG 2 son copias de gel resultantes del análisis de muestras de electroforesis en gel de poliacrilamida con sulfato dodecilo de sodio (SDS-PAGE) , descritas en los ejemplos del 1 al 4.

[0022] La FIG. 3 es una copia de gel resultante del análisis SDS-PAGE de muestras descritas en los ejemplos 5, 6, 10 y 11.

[0023] La FIG. 4 es una copia de gel resultante del análisis SDS-PAGE de muestras descritas en los ejemplos 2, 9 y del 12 al 16.

[0024] La FIG. 5 es un trazado correspondiente a la solución de conjugación resultante del ejemplo 1.

[0025] La FIG. 6 es un trazado correspondiente a la solución de conjugación resultante del ejemplo 2.

[0026] La FIG. 7 es un trazado correspondiente a la solución de conjugación resultante del ejemplo 3.

[0027] La FIG. 8 es un trazado correspondiente a la solución de conjugación resultante del ejemplo 4.

[0028] La FIG. 9 es un trazado correspondiente a la solución de conjugación resultante del ejemplo 12.

[0029] La FIG. 10 es un trazado correspondiente a la solución de conjugación resultante del ejemplo 13.

[0030] La FIG. 11 es un trazado correspondiente a la solución de conjugación resultante del ejemplo 14.

[0031] La FIG. 12 es un trazado correspondiente a la solución de conjugación resultante del ejemplo 15.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DEL INVENTO

[0032] Antes de describir en detalle una o más de las representaciones del presente invento, debe entenderse que este invento no está limitado a los polímeros, técnicas sintéticas, fracciones de Factor IX, y semejantes, pues los tales pueden variar.

[0033] Debe anotarse que, tal como son usados en esta especificación y en las declaraciones, las formas singulares "un", "una", y "el, la, los, las" incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a "un polímero" incluye un polímero individual, así como dos o más del mismo polímero o diferentes; la referencia a "un excipiente opcional" se refiere a un excipiente opcional en particular, así como a dos o más excipientes opcionales del mismo tipo o diferentes, y así sucesivamente.

[0034] Al describir y pretender el presente invento, la siguiente terminología será usada en concordancia con las definiciones descritas abajo.

[0035] "PEG", y "glicol de polietileno", tal como son usados aquí, son intercambiables. Generalmente, los PEGs para su uso en concordancia con el presente invento comprenden la siguiente estructura: "-0(CH2CH2)n-" . donde n es de 2 a 4000. Tal como es usado aquí, PEG incluye además "CH2-CH2-0(CH2CH20)n-CH2CH2- ", y "- (OCH2CH2) nO-" , dependiendo si los oxígenos terminales han sido cambiados de sitio o no. A lo largo de las especificaciones y las pretensiones aquí presentadas, debe recordarse que el término "PEG" incluye estructuras que tienen varios grupos terminales o "protector de terminación", y así sucesivamente. El término "PEG" también se refiere a un polímero que contiene una mayoría, es decir, más del 50%, de sub unidades repetitivas de -OCH2CH2- . Con respecto a formas específicas, PEG puede tomar cualquier número de una variedad de pesos moleculares, así como estructuras o geometrías como "ramificada", "lineal", "tipo ?forked'", "multifuncional", y así sucesivamente, a ser descritas abajo con más detalle.

[0036] Los términos o expresiones "de terminación cubierta" , y "de terminación cubierta" son usados de manera intercambiable aquí, para referirse a un extremo terminal o punto de terminación de un polímero que tiene una fracción de terminación. Generalmente, aunque no necesariamente, la fracción protectora de terminación comprende un hidroxi o grupo alkoxi C?-20, más pref riblemente un grupo alkoxi C?_ 10 , y aún más preferiblemente, un grupo alkoxi C?-5. Así, entre los ejemplos de fracción protectora de terminación están alkoxi (es decir, metoxi, etoxi y benziloxi) , así como arilo, heteroarilo, ciclo, heterociclo, y así sucesivamente . Debe recordarse que la fracción protectora de terminación puede incluir uno o más átomos del monómero terminal en el polímero (es decir, la fracción protectora de terminación "metoxi" en CH30 (CH2CH20) n-) o no hacerlo (es decir, "CH3" en CH3 (OCH2CH2)n_) . Adicionalmente, están previstas formas saturadas, no saturadas, sustituidas y no sustituidas, de los anteriores. Más aún, el grupo protector de terminación también puede ser un silano. El grupo protector de terminación también puede ventajosamente comprender una etiqueta perceptible. Cuando el polímero tiene un grupo protector de terminación que comprende una etiqueta perceptible, el número o ubicación del polímero y la fracción (es decir, el agente activo) al cual el polímero está acoplado puede ser determinado usando un indicador conveniente. Tales etiquetas incluyen, aunque sin limitación, fluorescentes, luminosos químicos, fracciones usados en el etiquetado de enzinas, fracciones colorimétricas, (es decir, tintes) , iones metales, fracciones radiactivas, y así sucesivamente. Entre los indicadores convenientes están fotómetros, películas, espectómetros, y así sucesivamente. El grupo protector de terminación también puede ventajosamente comprender un fosfolípido. Cuando el polímero tiene un grupo protector de terminación que comprende un fosfolípido, propiedades únicas son impartidas al polímero y cualquier conjugado resultante. Entre los fosfolípidos ejemplares están, sin limitación, aquellos seleccionados de la clase de fosfolípidos llamados fosfatidilcolinos . Entre los fosfolípidos específicos están, sin limitación, aquellos seleccionados del grupo de los dilaurilfosfatidilcolinos, dioleilfosfatidilcolinos , dipalmitoilfosfatidilcolinos , disteroilfosfatidilcolinos , behenoilfosfatidilcolinos , arachidoilfosfatidilcolinos y lecitina.

[0037] "De surgimiento no natural", con respecto a un polímero, tal como es descrito en este documento, se refiere a un polímero que en su integridad no es hallado en la naturaleza. Un polímero de surgimiento no natural puede, sin embargo, contener uno o más monómeros o segmentos de monómeros que son surgimiento natural, siempre que la estructura general del polímero no se encuentre en la naturaleza.

[0038] El término "soluble en agua", como en "polímero soluble en agua" , se refiere a cualquier polímero que es soluble en agua a la temperatura de una habitación. Generalmente, un polímero soluble en agua transmitirá por lo menos cerca del 75%, más preferiblemente por lo menos cerca del 95%, de luz transmitida por la misma solución después del filtrado. Sobre la base del peso, un polímero soluble en agua preferiblemente será por lo menos cerca del 35% (del peso) soluble en agua, más preferiblemente por lo menos cerca del 50% (del peso) soluble en agua, y algo más preferiblemente cerca del 70% (del peso) soluble en agua, y aún más preferiblemente cerca del 85% (del peso) soluble en agua. Es más preferido, sin embargo, que el polímero soluble en agua sea cerca del 95% (del peso) soluble en agua, o completamente soluble en agua.

[0039] El peso molecular en el contexto de un polímero soluble en agua, como PEG, puede ser expresado ya sea como un peso molecular en promedio numérico o como un peso molecular en promedio de peso. A menos que se indique de otra manera, todas las referencias a peso molecular en este documento se refieren al peso molecular en promedio de peso. Ambas determinaciones de peso molecular, tanto promedio numérico como promedio de peso, pueden ser medidas usando técnicas de cromatografía de permeación en gel, u otras técnicas de cromatografía líquida. Otros métodos para la medición de los valores de peso molecular también pueden ser usados, como el uso de análisis de grupo final, o la medición de las propiedades coligativas, (por ejemplo, depresión del punto de fusión, aumento ebulloscópico, o presión osmótica) para determinar el peso molecular en promedio numérico, o el uso de técnicas difusión de ondas de luz, ultracentrifugado o viscometría para determinar el peso molecular en promedio de peso. Los polímeros del invento son generalmente polidispersos (es decir, el peso molecular en promedio numérico y el peso molecular en promedio de peso de los polímeros no son iguales) , poseyendo valores bajos de polidispersidad, preferiblemente de menos de cerca de 1.2, más preferiblemente de menos de cerca de 1.15, algo más preferiblemente de menos de cerca de 1.10, aún más preferiblemente de menos de cerca de 1.05, y más preferiblemente de menos de cerca de 1.03. Tal como son usadas en este documento, a veces se harán referencias a un particular polímero soluble en agua que tenga ya sea un peso molecular en promedio de peso o un peso molecular en promedio numérico; se entenderá que tales referencias significarán que el polímero individual soluble en agua fue obtenido de una composición de polímeros solubles en agua, con el peso molecular declarado.

[0040] Los términos "activo" o "activado", cuando se usan en conjunción con un grupo funcional en particular, se refieren a un grupo funcional reactivo, que reacciona rápidamente con electrófilo o nucleófilo en otra molécula. Esto es en contraste con aquellos grupos que requieren catalizadores fuertes o condiciones reactivas altamente imprácticas a fin de reaccionar (es decir, un grupo "no reactivo" o "inerte") .

[0041] Tal como se usa en este documento, el término "grupo funcional" o cualquier sinónimo de éste comprende formas protegidas de éste, así como formas no protegidas .

[0042] Los términos "fracción espaciadora", "unión" o "vínculo" son usados en este documento para referirse a un átomo o a un grupo de átomos usados de manera opcional para enlazar fracciones interconectadas, como un término de un polímero soluble en agua y una fracción de Factor IX, o un electrófilo o nucleófilo de una fracción de Factor IX. La fracción espaciadora puede ser ilidrolíticamente estable o puede incluir una unión o vínculo fisiológicamente hidrolizable, o enzimáticamente degradable .

[0043] "Alquilo" se refiere a una cadena de hidrocarbono, cuya longitud generalmente oscila entre 1 y 15 átomos . Tales cadenas de hidrocarbono son preferiblemente (pero no necesariamente) saturadas, y puede ser de cadena ramificada o directa, aunque generalmente se prefiere la cadena directa. Entre los grupos ejemplares de alquilo están el metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, 1-metilobutilo, 1-etilopropilo, 3-metilopentilo, y demás. Tal como es usado en este documento, "alquilo" incluye cicloalquilo, así como un alquilo que contenga cicloalquileno .

[0044] "Alquilo bajo" se refiere a un grupo alquilo que contiene de 1 a 6 átomos de carbono, y puede ser de cadena directa o ramificada, tal como el ejemplo del metilo, etilo, n-butilo, i-butilo, y t-butilo.

[0045] "Cicloalquilo" se refiere a una cadena de hidrocarbono cíclico, saturada o no saturada, incluyendo compuestos con puente, fusionada, o espiro cíclica, preferiblemente constituidos por una cantidad entre 3 y cerca de 12 átomos de Carbono, más preferiblemente entre 3 y cerca de 8 átomos de Carbono. "Cicloalquileno" se refiere a un grupo cicloalquilo que es insertado en una cadena de alquilo, uniendo la cadena en dos átomos de carbono en el sistema cíclico de anillos.

[0046] "Alkozy" se refiere a un grupo -O-R, donde R es alquilo o alquilo sustituido, preferiblemente alquilo C?_6 (por ejemplo, metoxi, etoxi, propiloxi, y así sucesivamente) .

[0047] El término "sustituido", como por ejemplo en "alquilo sustituido" se refiere a una fracción (por ejemplo, un grupo alquilo) sustituido con uno o más sustitutos no interferentes como, sin estar limitados a, alquilo, cicloalkilo C3_8/ por ejemplo, ciclopropilo, ciclobutilo y así sucesivamente; halógenos, por ejemplo, fluoro, cloro, bromo y yodo; ciano, alkoxi, penilo bajo, penilo sustituido, y así sucesivamente. "Sustituido arilo" se refiere al arilo con uno o más grupos no interferentes como sustitutos. Para sustituciones en el anillo penilo, los sustitutos pueden estar en cualquier orientación (es decir, orto, meta o para) .

[0048] "Sustitutos no interferentes" son aquellos grupos que, cuando están presentes en una molécula, son generalmente no reactivos con otros grupos funcionales contenidos dentro de la molécula.

[0049] "Arilo" se refiere a uno o más anillos aromáticos, cada uno de 5 o 6 átomos con carbono. Arilo incluye anillos múltiples de arilo que pueden estar fusionados como en naftilo o no fusionados, como en el bifenilo. Los anillos de Arilo también pueden estar fusionados o no fusionados con uno o más hidrocarburos cíclicos, heteroarilo, o anillos heterocíclicos. Tal como es usado en este documento, "arilo" incluye el heteroarilo.

[0050] "Heteroarilo" es un grupo del arilo que contiene de uno a cuatro heteroátomos, preferiblemente azufre, oxígeno, o nitrógeno, o una combinación de éstos. Los anillos de heteroarilo también pueden estar fusionados con uno o más anillos cíclicos de hidrocarburos heterocíclicos, arilo, o heteroarilo.

[0051] "Heterociclo" o " heterocíclico" se refiere a uno o más anillos de 5-12 átomos, preferiblemente de 5-7 átomos, con o sin insaturación o carácter aromático y teniendo por lo menos un átomo de anillo que no sea un carbono. Entre los heteroátomos preferidos están el azufre, el oxígeno, y el nitrógeno.

[0052] "Heteroarilo sustituido" es un heteroarilo que tiene uno o más grupos no interferentes como sustituyentes

[0053] "Heterociclo sustituido" es un heterociclo que tiene una o más cadenas laterales formadas de sustituyentes no interferentes .

[0054] Un "radical orgánico", tal como es usado en este documento, debe incluir alquilo, alquilo sustituido, arilo y arilo sustituido.

[0055] "Electrófilo" y "grupo electrofílico" se refieren a un ion o átomo, o grupo de átomos, que pueden ser iónicos, teniendo un centro electrofílico, es decir, un centro que está en busca de electrones, capaz de reaccionar con un nucleófilo.

[0056] "Nucleófilo" y "grupo nucleofílico" se refiere a un ion o átomo, o grupo de átomos, que pueden ser iónicos, teniendo un centro nucleofílico, es decir, un centro que está en busca de un centro electrofílico o con un electrófilo.

[0057] Un enlace "fisiológicamente hendible" o 'hidrolizable" es un enlace que reacciona con agua, (es decir, está hidrolizado) bajo condiciones fisiológicas. La tendencia de un enlace a hidrolizar en agua dependerá no solo del tipo general de vínculo que conecta dos átomos centrales, sino también de los sustituyentes adjuntos a estos átomos centrales. Entre los vínculos hidrolíticamente inestables o débiles están pero no se limitan a: éster carbolinato, éster fosfato, anhídridos, acétales, quetales, éster aciloxialquilo, iminas, ortoésteres, péptidos y oligonucleótidos .

[0058] Un "vínculo enzimáticamente degradable" significa un vínculo que está sujeto a la degradación por parte de una o más enzimas .

[0059] Un vínculo o enlace "hidrolíticamente estable" se refiere a un vínculo químico, generalmente un enlace covalente, que es substancialmente estable en el agua, es decir, no sufre hidrólisis bajo condiciones fisiológicas en una magnitud apreciable durante un período extendido de tiempo. Entre los ejemplos de vínculos hidrolíticamente estables se encuentran, pero no están limitados a, los siguientes: enlaces de carbono-carbono (por ejemplo, en las cadenas alifáticas) , éteres, amidas, el uretanos, y así sucesivamente. Generalmente, un vínculo hidrolíticamente estable es uno que exhibe una proporción de hidrólisis menor que aproximadamente 1-2% por día bajo condiciones fisiológicas. Las proporciones de hidrólisis de los enlaces químicos representativos puede encontrarse en la mayoría de los libros regulares de texto para química.

[0060] Un "excipiente farmacéuticamente aceptable" se refiere a un ingrediente que puede ser incluido opcionalmente en las composiciones del invento, y que no ocasiona un efecto tóxico adverso significativo para el paciente .

[0061] "Cantidad terapéuticamente efectiva" es usado en este documento para referirse a la cantidad de conjugado de fracción polímero-Factor IX polímero que se necesita para proveer el nivel deseado del conjugado (e la fracción de Factor IX no conjugado correspondiente) en el torrente sanguíneo o en el tejido designado. La cantidad precisa dependerá de numerosos factores, por ejemplo la fracción particular de Factor IX, los componentes y características físicas de composición therapeutic, la población de pacientes a la cual se apunta, el modo de entrega, consideraciones individuales del paciente, y demás, y puede ser determinada rápidamente por una persona con habilidades en el arte, con base en la información provista aquí .

[0062] "Multifuncional" se refiere a un polímero que tiene tres o más grupos funcionales contenidos en él, donde los grupos funcionales pueden ser iguales o diferentes. Los reactivos poliméricos multifuncional generalmente contienen desde cerca de 3-100 grupos funcionales, o desde 3 -50 grupos funcionales, o desde 3 -25 grupos funcionales, o desde 3 -15 grupos funcionales, o desde 3 a 10 grupos funcionales, o pueden contener 3, 4, 5, 6, 1 , 8, 9 ó 10 grupos funcionales dentro del polímero "backbone" .

[0063] El término "fracción de Factor IX", tal como se usa en este documento, se refiere a una fracción que tiene actividad de Factor IX. La fracción de Factor IX también tendrá por lo menos un grupo electrofílico o grupo nucleofílico apropiado para reacción con un reactivo polimérico. Generalmente, aunque no necesariamente, la fracción de Factor IX es una proteína. Adicionalmente, el término "fracción de Factor IX" comprende tanto la fracción de Factor IX antes de la conjugación, como la fracción de Factor IX que quedó como residuo después de la conjugación. Como será explicado en detalle más abajo, alguien con habilidad ordinaria en la materia puede determinar su una fracción determinada tiene actividad de Factor IX. Una proteína que contiene una secuencia aminoácida correspondiente a SEQ ID NO: 1 es una fracción de Factor IX, así como cualquier proteína o polipéptido sustancialmente homólogo a éste, cuyas propiedades biológicas resultan en la actividad de Factor IX. Tal como se usa en este documento, el término "fracción de Factor IX" incluye proteínas modificadas deliberadamente, como por ejemplo, por mutagénesis orientada al sitio, o accidentalmente, a través de mutaciones. El término "fracción de Factor IX" incluye además derivados que tienen de 1 a 6 sitios adicionales de glicosilación, los derivados tienen por lo menos un aminoácido adicional en el extremo terminal carboxi de la proteína en la cual el aminoácido adicional incluye por lo menos un sitio de glicosilación, y los derivados que tienen una secuencia de aminoácidos que incluye por lo menos un sitio de glicosilación.

[0064] El término "sustancialmente homólogo" significa que una secuencia particular, por ejemplo, una secuencia mutante, varía de una secuencia de referencia por una o más sustituciones, eliminaciones o adiciones, el efecto red del cual no resulta en una disimilitud funcional adversa entre la referencia y las secuencias sujeto. Para propósitos del presente invento, las secuencias que tienen más del 95 por ciento de homología, las propiedades biológicas equivalentes (aunque potencialmente tengan diferentes grados de actividad) , y las características de expresión equivalentes son consideradas sustancialmente homologas. Para propósitos de determinación de homología, el truncamiento de la secuencia madura debe ser descartado. Las secuencias que tienen menores grados de homología, bioactividad comparable, y características de expresión equivalente, son consideradas equivalentes sustanciales. Entre las fracciones ejemplares de Factor IX para uso en este documento están aquellas proteínas que tienen una secuencia que es sustancialmente homologa a SEQ ID NO: 1.

[0065] El término "fragmento" se refiere a cualquier proteína o polipéptido que tiene la secuencia aminoácido de una porción de una fracción de Factor IX que mantiene algún grado de actividad de Factor IX. Entre los fragmentos están las proteínas o polipéptidos producidos por degradación proteolítica de la proteína de Factor IX, o producidos por síntesis química mediante métodos de rutina en la materia. La determinación de si un fragmento particular tiene la actividad biológica de Factor IX puede ser llevada a cabo por medio de exámenes convencionales, bien conocidos, utilizados para tales propósitos, en una o más especies de mamíferos . Una evaluación apropiada que puede ser utilizada para demostrar tal actividad biológica es descrita aquí.

[0066] Una "variante de eliminación" de una fracción de Factor IX es un péptido o proteína donde un residuo aminoácido de fracción de Factor IX ha sido eliminado, y los residuos aminoácido que preceden y que siguen al residuo aminoácido eliminado están conectados a través de un enlace de amida (excepto en lugares donde el residuo aminoácido eliminado estaba localizado en un punto terminal del péptido o proteína) . Entre las variantes de eliminación están lugares donde sólo un residuo aminoácido en particular ha sido eliminado, así como los lugares donde dos aminoácidos son eliminados, tres aminoácidos son eliminados, cuatro aminoácidos son eliminados, y así sucesivamente. Cada variante de eliminación debe, sin embargo, mantener cierto grado de actividad de Factor IX.

[0067] Una "variante de sustitución" de una fracción de Factor IX es un péptido o proteína en donde un residuo aminoácido de una fracción de Factor IX ha sido eliminado y un residuo aminoácido diferente ha tomado su lugar. Entre las variantes de sustitución están casos donde sólo un aminoácido en particular ha sido sustituido, así como los lugares donde dos aminoácidos son sustituidos, tres aminoácidos son sustituidos, cuatro aminoácidos son sustituidos, y así sucesivamente. Cada variante de sustitución debe, sin embargo, mantener cierto grado de actividad de Factor IX.

[0068] Una "variante de adición" de una fracción de Factor IX es un péptido o proteína en donde un residuo aminoácido de una fracción de Factor IX ha sido añadido al interior de una secuencia de aminoácido y los residuos de aminoácido adyacentes son enlazados al residuo aminoácido que se añadió, por medio de enlaces de amida (excepto en lugares donde el residuo aminoácido añadido estaba localizado en un punto terminal del péptido o proteína, donde un solo enlace de amida se enlaza al residuo aminoácido) . Entre las variantes de adición están casos donde sólo un aminoácido en particular ha sido adicionado o añadido, así como los lugares donde dos aminoácidos son añadidos, tres aminoácidos son añadidos, cuatro aminoácidos son añadidos, y así sucesivamente. Cada variante de adición debe, sin embargo, mantener cierto grado de actividad de Factor IX.

[0069] El término "paciente" se refiere a un organismo viviente que sufre de una condición que puede ser prevenida o tratada por la administración de un agente activo (por ejemplo, un conjugado) , o está propenso a esa condición. El término incluye tanto humanos como animales.

[0070] "Opcional" u "opcionalmente" significa que la circunstancia descrita subsecuentemente puede o no puede ocurrir, de modo que la descripción incluye instancias donde la circunstancia ocurre, e instancias donde no ocurre .

[0071] "Sustancialmente" (a menos que sea específicamente definido para un contexto particular en algún lugar diferente, o que el contexto indique claramente otra cosa) significa casi totalmente o completamente, por ejemplo, satisfaciendo uno o más de los siguientes: más del 50%, 51% o mayor, 75% o mayor, 80% o mayor, 90% o mayor, y 95% o mayor que la condición.

[0072] A menos que el contexto indique claramente otra cosa, cuando el término "cerca de" preceda un valor numérico, debe entenderse que éste significa + el 10% del valor numérico declarado.

[0073] Los residuos de aminoácido en péptidos son abreviados como sigue: Fenilalanina es Phe o F; Leucina es Leu o L; Isoleucina es lie o I; Metionina es Met o M; Valine es Val o V; Serina es Ser o S; Prolina es Pro o P; Treonina es Thr o T; Alanina es Ala o A; Tirosina es Tyr o Y; Histidina es His o H; Glutamina es Gln o Q; Asparagina es Asn o N; Lisina es Lys o K; Ácido aspártico es Asp o D; Ácido glutámico es Glu o E; Cisteína es Cys o C; Triptófano es Trp o W; Arginina es Arg o R; y Glicina es Gly o G.

[0074] Volviendo a una o más representaciones del invento, un conjugado es provisto, comprendiendo éste una fracción de Factor IX enlazada de manera covalente, ya sea directamente o a través de una fracción espaciadora conformada por uno o más átomos, a un polímero soluble en agua. Los conjugados del invento tendrán una o más de las siguientes características.

[0075] La fracción de Factor IX

[0076] Tal como se declaró anteriormente, el término "fracción de Factor IX" debe incluir la fracción de Factor IX antes de la conjugación, así como la una fracción de Factor IX después del enlace a un polímero soluble en agua. Se entiende, sin embargo, que cuando la fracción de Factor IX es enlazada a un polímero no péptico soluble en agua, la fracción de Factor IX es levemente alterada debido a la presencia de uno o más enlaces covalentes asociados con enlaces al polímero (o fracción espaciadora que es enlazada al polímero) . A menudo, esta forma levemente alterada de fracción de Factor IX enlazada a otra molécula recibe el nombre de "residuo" de una fracción de Factor IX.

[0077] La fracción de Factor IX puede ser derivada, ya sea de métodos no recombinantes o por métodos recombinantes, y el invento no está limitado en este sentido. Adicionalmente, la fracción de Factor IX puede ser derivada de Fuentes humanas o animales .

[0078] La una fracción de Factor IX puede ser derivada de manera no recombinante. Por ejemplo, la fracción de Factor IX puede ser obtenida de fuentes derivadas de la sangre. En particular, el Factor IX puede ser fraccionado del plasma humano usando las técnicas de precipitación y centrifugación conocidas para quienes tienen habilidades ordinarias en el arte. Véase, por ejemplo, Wickerhauser (1976) Transfusión 16 (4) : 345-350 y Slichter et al. (1976) Transfusión 16 (6) : 616-626. El Factor IX también puede ser aislado de granulocitos humanos . Véase Szmitkoski et al. (1977) Haematologia (Budap . ) 11 (1-2) : 177- 187.

[0079] La fracción de Factor IX puede ser derivada por métodos recombinantes. Por ejemplo, el código cDNA para el Factor IX nativo, que es una fracción de Factor IX, ha sido aislado, caracterizado y clonado en vectores de expresión. Véase, por ejemplo, Choo et al. (1982) "Molecular Cloning of the Gene for Human Anti-hemophilic Factor IX," Nature, Vol. 299: 178-180, y Kurachi et al. (1982) "Isolation y Characterization of a cDNA Coding for Human Factor IX," Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., Vol. 79: 6461- 65.

[0080] Una vez expresado, el Factor IX nativo es una glicoproteína de cadena única con cerca de 55,000 daltones. Puede ser considerado estructuralmente como teniendo cuatro dominios: el Gla, o dominio rico en carboxiglutamato; las regiones semejantes a EGF (factor de crecimiento epidérmico) ; el péptido de activación; y el sitio activo. La secuencia de aminoácido expresada es provista como SEQ ID NO: 1. A menos que ello se registre específicamente, todas las asignaciones de una ubicación numérica de un resituo aminoácido tal como han sido provistas aquí, están fundamentadas en SEQ ID NO: 1.

[0081] Los métodos recombinantes ejemplares usados para preparar una fracción de Factor IX (sea el Factor IX nativo o una proteína diferente que tenga actividad de Factor IX) pueden ser descritos brevemente. Tales métodos involucran la construcción del ácido nucleido codificando el polipéptido deseado o un fragmento, clonando el ácido nucleico en un vector de expresión, transformando una célula anfitriona (por ejemplo, planta, bacteria tal como E. cali , levadura como as Saccharornyces cerevisiae, o célula de mamífero como las células del ovario de una marmota china, o una célula de riñon de marmota bebé) , y expresando el ácido nucleico para producir el polipéptido o fragmento deseado. La expresión puede ocurrir a través de una expresión exógena (cuando la célula anfitriona contiene naturalmente el código genético deseado) o a través de una expresión endógena. Los métodos para la producción y expresión de polipéptidos recombinantes ín vi tro y en células procarióticas y eucarióticas se conocen como aquellos de habilidad ordinaria en el arte. Véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. No. 4.868.122.

[0082] Para facilitar la identificación y purificación del polipéptido recombinante, las secuencias de ácido nucleico que codifican para un "epitope tag" u otra secuencia enlazante de afinidad pueden ser insertadas o añadidas en el marco con la secuencia de codificación, produciendo así una proteína de fusión compuesta por el polipéptido deseado y un polipéptido preparado para el enlace . Las proteínas de fusión pueden ser identificadas y purificadas haciendo correr primero una mezcla con la proteína de fusión a través de una columna de afinidad que cargue fracciones enlazantes (por ejemplo, anticuerpos) dirigidos contra el "epitope tag" u otra secuencia enlazante en las proteínas de fusión, enlazando así la proteína de fusión dentro de la columna. Después de esto, la proteína de fusión puede ser recubierta lavando la columna con la solución apropiada (por ejemplo, ácido) para liberar la proteína de fusión enlazada. El polipéptido recombinante también puede ser identificado y purificado mediante la separación de las células anfitrionas, separando el polipéptido, por ejemplo, por cromatografía de exclusión de tamaño, y colectando el polipéptido. Estos y otros métodos para la identificación y purificación de polipéptidos recombinantes se conocen como aquellos de habilidad ordinaria en el arte. En una o más representaciones del presente invento, sin embargo, se prefiere que la fracción de Factor IX no esté en la forma de una proteína de fusión.

[0083] Dependiendo del sistema usado para expresar las proteínas que tienen actividad de Factor IX, la fracción de Factor IX can be desglicosilada o glicosilada y ambas pueden ser usadas. Esto es, la fracción de Factor IX puede ser desglicosilada o la fracción de Factor IX puede ser glicosilada. En una o más representaciones del invento, se prefiere que la fracción de Factor IX sea glicosilada.

[0084] La fracción con actividad de Factor IX puede ventajosamente ser modificada para incluir uno o más residuos de aminoácido tales como, por ejemplo, lisina, cisteína y/o arginina, a fin de proveer un enlace fácil de un polímero a un átomo dentro de un aminoácido.

Adicionalmente, la fracción de Factor IX puede ser modificada para incluir un residuo aminoácido de surgimiento no natural . Las técnicas para añadir residuos de aminoácido y residuos aminoácidos de surgimiento no natural son bien conocidas por aquellos que tienen habilidades ordinarias en el arte. Se hace referencia a J. March, Advanced Organic Chemistry: Reactions Mechanisms y Structure, 4th Ed. (New York: Wiley-Interscience, 1992) .

[0085] Adicionalmente, la fracción de Factor IX can ventajosamente ser modificada para incluir el enlace de un grupo funcional (diferente que a través de la adición de un residuo aminoácido que contenga un grupo funcional) . Por ejemplo, la fracción de Factor IX puede ser modificada para incluir un grupo tiol. Además, la fracción de Factor IX puede ser modificada para incluir un alfa carbón N-terminal. Adicionalmente, la fracción de Factor IX puede ser modificada para incluir una o más fracciones de carbohidrato. Las fracciones de Factor IX modificadas para contener un aminoxi, aldehido u otro grupo funcional también pueden ser usadas .

[0086] Algunos ejemplos no limitantes de fracciones de Factor IX son los siguientes: Factor IX; Factor IXa; versiones truncadas de Factor IX; proteínas híbridas, y miméticos péptidos que tengan actividad de Factor IX. Fragmentos biológicamente activos, variantes de eliminación, variantes de sustitución o variantes de adición de cualquiera de las anteriores, que mantengan por lo menos algún grado de actividad de Factor IX, también pueden servir como una fracción de Factor IX.

[0087] Para cualquier fracción dada, es posible determinar si esa fracción tiene actividad de Factor IX. Por ejemplo, muchas líneas animáis han sido criadas intencionalmente con la mutación genética para la hemofilia, de modo que un animal producido desde dicha línea tenga niveles muy bajos e insuficientes de Factor IX. Tales líneas están disponibles de una variedad de Fuentes como, sin limitación, División of Laboratories y Research, New York Department of Public Health, Albany, NY (división de laboratorio e investigación del departamento de salud pública de Nueva York, Albania, Nueva York) y el departamento de patología, Universidad de Carolina del Norte, Chapel Hill, NC. Ambas fuentes, por ejemplo, proveen caninos que sufren de hemofilia B canina. A fin de evaluar la actividad de Factor IX de cualquier fracción dada en cuestión, la fracción es inyectada en el interior del animal enfermo, es hecha una pequeña herida y el tiempo de sangrado es comparado con un control saludable . Otro método útil para determinar la actividad de Factor IX es determinar el cofactor y la actividad piocoagulante . Véase, por ejemplo, Mertens et al. (1993) Brit . J. Ha.einatol . 8_5:133-42. Otros métodos conocidos para aquellos con habilidades ordinarias en el arte también pueden ser usados para determinar si una fracción específica tiene actividad de Factor IX. Tales métodos son útiles para la determinación de la actividad de Factor IX, tanto de una fracción de Factor IX propuesta, así como el conjugado de fracción polímero-Factor IX .

[0088] El polímero soluble en agua.

[0089] Como se analizó previamente, cada conjugado comprende una fracción de Factor IX enlazada a un polímero soluble en agua. Con respecto al polímero soluble en agua, el polímero soluble en agua es no péptico, no tóxico, de surgimiento no natural y biocompatible . Con respecto a la biocompatibilidad, una sustancia es considerada biocompatible si los efectos benéficos asociados con el uso de la sustancia en sí misma o con otra sustancia (por ejemplo, un agente activo como una fracción de Factor IX) en conexión con tejidos vivientes (por ejemplo, la administración a un paciente) acarrea cualquier efecto deletéreo según la evaluación de un profesional médico, por ejemplo, un doctor en medicina. Con respecto a no inmunogenicidad, una sustancia es considerada no inmunogénica si el uso pretendido de la sustancia in vivo no produce una respuesta inmunológica no deseada (por ejemplo, la formación de anticuerpos) o, si se produce una respuesta inmunológica, tal respuesta no es considerada clínicamente significativa o importante, según la evaluación de un profesional médico. Es particularmente preferido que el polímero soluble en agua sea biocompatible y no inmunogénico.

[0090] El polímero se caracteriza generalmente por tener de 2 a cerca de 300 terminaciones. Entre los ejemplos de tales polímeros están, pero no están limitados a, glicoles polialquilenos tales como el glicol polietileno (PEG), el glicol propileno ("PPG"), copolímeros del glicol etileno y el glicol propileno y así sucesivamente, poliol polioxietilado, alcohol poliolefínico, polivinilpirolidona, polihidroxialquilometacrilamida, polihidroxialquilometacrilato, polisacáridos, poli (a-hidroxi ácido) , alcohol polivinilo, polifosfaceno, polioxazolina, poli (N-acriloilmorfolina) , y combinaciones de cualquiera de las anteriores .

[0091] El polímero no está limitado en una estructura particular y puede ser lineal (por ejemplo, PEG alkoxi o PEG bifuncional) , o no lineal, como la ramificada, tipo "forked", de brazos múltiples (por ejemplo, PEGs enlazados a un centro poliol) , tipo dendrita. Más aún, la estructura interna del polímero puede estar organizada en cualquier número de patrones diferentes y puede ser seleccionada del grupo consistente en homopolímero, copolímero alternante, copolímero aleatorio, copolímero de bloque, tripolímero alternante, tripolímero aleatorio, y tripolímero de bloque.

[0092] Generalmente, el PEG activado y otros polímeros activados solubles en agua (es decir, reactivos poliméricos) son activados con un grupo de activación conveniente, apropiado para acoplarse a un sitio deseado en la fracción de Factor IX. Así, un reactivo polimérico poseerá un grupo reactivo para reacción con la fracción de Factor IX. Los reactivos poliméricos y métodos representativos para la conjugación de estos polímeros a una fracción activa son conocidos en el arte, y además descritos en Zalipsky, S., et al., "Ose of Functional i zed Poly (Ethylene Glycols) for Modif ication of Polipéptidos" en Polyethylene Glicol Chemistry: Biotechnical y Biomedical Applications, J. M. Harris, Plenus Press, New York (1992) , y en Zalipsky (1995) Advanced Drug Reviews 16: 157-182.

[0093] Generalmente, el peso molecular en promedio de peso del polímero soluble en agua en el conjugado es desde cerca de 100 daltones hasta cerca de 150,000 daltones. Los rangos ejemplares, sin embargo, incluyen pesos moleculares promedio de peso en un rango que es mayor que 5,000 daltones hasta cerca de 100,000 daltones, en un rango que está desde cerca de 6,000 daltones hasta cerca de 90,000 daltones, en un rango que está desde cerca de 10,000 daltones hasta cerca de 85,000 daltones, en un rango que es mayor que 10,000 daltones hasta cerca de 85,000 daltones, en un rango que está desde cerca de 20,000 daltones hasta cerca de 85,000 daltones, en un rango que está desde cerca de 53,000 daltones hasta cerca de 85,000 daltones, en un rango que está desde cerca de 25,000 daltones hasta cerca de 120,000 daltones, en un rango que está desde cerca de 29,000 daltones hasta cerca de 120,000 daltones, en un rango que está desde cerca de 35,000 daltones hasta cerca de 120,000 daltones, y en un rango que está desde cerca de 40,000 daltones hasta cerca de 120,000 daltones. Para cualquier polímero específico soluble en agua, los PEGs que tienen un peso molecular en uno o más de estos rangos, son preferidos .

[0094] Entre los pesos moleculares promedio de peso ejemplares para el polímero soluble en agua están cerca de 100 daltones, cerca de 200 daltones, cerca de 300 daltones, cerca de 400 daltones, cerca de 500 daltones, cerca de 600 daltones, cerca de 700 daltones, cerca de 750 daltones, cerca de 800 daltones, cerca de 900 daltones, cerca de 1,000 daltones, cerca de 1,500 daltones, cerca de 2,000 daltones, cerca de 2,200 daltones, cerca de 2,500 daltones, cerca de 3,000 daltones, cerca de 4,000 daltones, cerca de 4,400 daltones, cerca de 4,500 daltones, cerca de 5,000 daltones, cerca de 5,500 daltones, cerca de 6,000 daltones, cerca de 7,000 daltones, cerca de 7,500 daltones, cerca de 8,000 daltones, cerca de 9,000 daltones, cerca de 10,000 daltones, cerca de 11,000 daltones, cerca de 12,000 daltones, cerca de 13,000 daltones, cerca de 14,000 daltones, cerca de 15,000 daltones, cerca de 20,000 daltones, cerca de 22,500 daltones, cerca de 25,000 daltones, cerca de 30,000 daltones, cerca de 35,000 daltones, cerca de 40,000 daltones, cerca de 45,000 daltones, cerca de 50,000 daltones, cerca de 55,000 daltones, cerca de 60,000 daltones, cerca de 65,000 daltones, cerca de 70,000 daltones, y cerca de 75,000 daltones. Versiones ramificadas del polímero soluble en agua (por ejemplo, polímero soluble en agua de a ramificada 40,000 daltones compuesto por dos polímeros de 20,000 daltones) y que tengan un peso molecular total de cualquiera de las anteriores, puede ser usado. En una o más representaciones, el conjugado no tendrá ningún fracción PEG enlazada, ya sea directa o indirectamente, con un PEG que tenga un peso molecular en promedio de peso menor que 6,000 daltones.

[0095] Cuando se usan como polímeros, los PEGs generalmente comprenderán un número de monómeros (OCH2CH2) (o bien, monómeros (CH2CH20) , dependiendo de cómo sea definido el PEG) . Tal como se usa a lo largo de toda la descripción, el número de unidades que se repiten es identificado por el subíndice "n" en " (OCH2CH2) ." Así, el valor de (n) generalmente cae dentro de uno o más de los siguientes rangos: desde 2 hasta cerca de 3400, desde cerca de 100 hasta cerca de 2300, desde cerca de 100 hasta cerca de 2270, desde cerca de 136 hasta cerca de 2050, desde cerca de 225 hasta cerca de 1930, desde cerca de 450 hasta cerca de 1930, desde cerca de 1200 hasta cerca de 1930, desde cerca de 568 hasta cerca de 2727, desde cerca de 660 hasta cerca de 2730, desde cerca de 795 hasta cerca de 2730, desde cerca de 795 hasta cerca de 2730, desde cerca de 909 hasta cerca de 2730, y desde cerca de 1,200 hasta cerca de 1,900. Para cualquier polímero dado, en el cual el peso molecular se conoce, es posible determinar el número de unidades que se repiten (es decir, "n" ) dividiendo el peso molecular en promedio de peso total del polímero entre el peso molecular del monómero repetitivo.

[0096] En relación con el peso molecular del polímero soluble en agua, en una o más representaciones del invento, un conjugado es provisto, comprendiendo éste una fracción de Factor IX convenientemente enlazada, sea directamente o a través de una fracción espaciadora compuesta por uno o más átomos, a un polímero soluble en agua, donde el peso molecular del polímero soluble en agua es mayor que 5,000 daltones y menor que cerca de 150,000 daltones .

[0097] Un polímero particularmente preferido para el uso en el invento es un polímero de terminación cubierta, esto es, un polímero que tiene por lo menos una terminación cubierta con un grupo relativamente inerte, como el grupo alkoxiC?_6 bajo, aunque un grupo hidroxilo también puede ser usado. Cuando el polímero es PEG, por ejemplo, se prefiere usar un PEG metoxi (comúnmente conocido como mPEG) , que es una forma lineal de PEG, donde la terminación del polímero tiene un grupo metoxi (-OCH3) , mientras la otra terminación es un hidroxilo u otro grupo funcional que puede ser opcionalmente modificado.

[0098] En una forma útil en el presente invento, un PEG libre o no enlazado es un polímero lineal terminado en cada extremo con grupos hidroxilo: HO-CH2CH20- (CH2CH20)n-CH2CH2-OH, en el cual (n) generalmente oscila entre cero y cerca de 4,000.

[0099] El polímero de arriba, alpha-, omega-dihidroxilpolietileno glicol, puede ser representado en forma breve como HO-PEG-OR donde se entiende que el símbolo-PEG puede representar la siguiente unidad estructural : -CH2CR20- (CH2CH20)n-CH2CH2-, donde (n) es como se definió arriba. [00100] Otro tipo de PEG útil en el presente invento es metoxi-PEO-OH, o mPEG en versión corta, en el cual un término es el grupo metoxi relativamente inerte, mientras el otro término es un grupo hidroxilo. La estructura de mPEG se muestra abajo. CH30-CH2CH20- (CH2CH20)n-CH2CH2-OH donde (n) es como se definió arriba. [00101] Las moléculas PEG de brazos múltiples o ramificadas, tales como aquellas descritas en la patente de los EE.UU. No. 5.932.462, también puede ser usada como el polímero PEG. Por ejemplo, PEG puede tener la estructura: poIy¡ P t polyb— Q donde : polya y polyt, son PEGs de marcos o "backbone" (sean iguales o diferentes) , como el glicol polietileno metoxi; R" es una fracción no reactiva, como H, metilo, o un backbone PEG; y P y Q son enlaces no reactivos. En una o más representaciones, el polímero PEG ramificado es glicol polietileno metoxi, lisina disustituida. Dependiendo de fracción de Factor IX específico usada, el grupo funcional reactivo éster de la lisina disustituida puede ser además modificada para formar un grupo funcional conveniente pare reacción con el grupo destino dentro de fracción de Factor IX. [00102] Adicionalmente, el PEG puede comprender un PEG bifurcado. Un ejemplo de PEG bifurcado está representado por la siguiente estructura: potya — P I polyb— -Q donde X es una fracción espaciadora de uno o más átomos y cada Z es un grupo terminal activado, enlazado a CH por un cadena de átomos de longitud definida. La Solicitud Internacional No. PCT/US99/05333 , revela varias estructuras PEG bifurcadas, útiles para ser usadas en una o más de las representaciones del presente invento. La cadena de átomos que enlazan los grupos funcionales Z al átomo de Carbono que se ramifica, sirven como un grupo que liga y puede comprender, por ejemplo, cadenas de alquilo, cadenas de éter, cadenas de éster, cadenas de amida y combinaciones de los anteriores . [00103] El polímero PEG puede comprender una molécula PEG pendiente que tenga grupos reactivos, como el carboxilo, enlazado de manera covalente por toda la longitud del PEG, en vez de serlo por el final de la cadena PEG. Los grupos reactivos pendientes pueden ser enlazados al PEG directamente o a través de una fracción espadadora, como un grupo alquileno. [00104] Además de las formas de PEG arriba descritas, el polímero también puede ser preparado con uno o dos enlaces débiles o degradables (como un enlace hidrolíticamente degradable) en el polímero, incluyendo cualquiera de los polímeros arriba descritos. Por ejemplo, PEG puede ser preparado con enlaces éster en el polímero que está sujeto a la hidrólisis. Como se muestra abajo, esta hidrólisis resulta en la división del polímero en fragmentos de peso molecular más bajo: -FEG-CO2-PEG- +H2Q '——** -PEG-CG2H -HO-?1?G- [00105] Entre otros enlaces h?drolíticamente degradables, útiles como enlace degradable dentro de un polímero de marco, están: enlaces de carbonato; enlaces de iminos resultantes, por ejemplo, de la reacción de una amina y un aldehido (véase, por ejemplo, Ouchi et al. (1997) Polyiner Preprints 3_8 (1) : 582-3) ; enlaces éster de fosfato formados, por ejemplo, reaccionando un alcohol con un grupo fosfato; enlaces de hidrazona que generalmente se forman por la reacción de un hidrazido y un aldehido; enlaces acétales que generalmente se forman por la reacción entre un aldehido y un alcohol; enlaces de ortoéster que son formados, por ejemplo, por la reacción entre un formato y un alcohol; enlaces de amida formados por un grupo amina, por ejemplo, en una terminación de un polímero como PEG, y un grupo carboxilo de otra cadena PEG; enlaces de uretano formados por la reacción de, por ejemplo, un PEG con un grupo de isocianato terminal y un alcohol PEG; enlaces péptidos formados por un grupo amina, por ejemplo, en una terminación de un polímero tal como PEG, y un grupo carboxilo de un péptido; y enlaces oligonucleótidos, formados por un grupo fosforamidita, por ejemplo, al final de un polímero, y un grupo hidroxilo 5 " de un oligonucleótido . [00106] Tales características opcionales del conjugado polímero, es decir, la introducción de uno o más enlaces degradables al interior de la cadena del polímero, pueden proveer control adicional sobre las propiedades farmacológicas finales deseadas para el conjugado al momento de su administración. Por ejemplo, un conjugado grande y relativamente inerte (por ejemplo, que tenga una o más cadenas PEG de alto peso molecular adjuntas al una fracción de Factor IX; por ejemplo, una o más cadenas PEG que tengan un peso molecular mayor que cerca de 10.000, donde el conjugado no posee esencialmente bioactividad) , puede ser administrado, el cual es hidrolizado para genera un conjugado bioactivo con una porción de la cadena original PEG. De esta manera, las propiedades del conjugado pueden ser más efectivamente entalladas para balancear la bioactividad del conjugado a través del tiempo. [00107] Quienes tienen habilidades ordinarias en el arte reconocerán que la extraña discusión concerniente a segmentos de polímero sustancialmente solubles en agua no es de ninguna manera exhaustiva, y es simplemente ilustrativa, y que todos los materiales poliméricos que tengan las cualidades descritas arriba, están contemplados. Tal como se usa en este documento, el término 'reactivo polimérico" generalmente se refiere a ana molécula entera, que puede comprender un segmento de polímero soluble en agua y un grupo funcional . [00108] Conjugados [00109] Tal como fue descrito arriba, un conjugado del invento comprende un polímero soluble en agua enlazado de manera covalente (ya sea directamente o a través de una fracción espaciadora) a una fracción de Factor IX. Generalmente, para cualquier conjugado determinado, habrá de uno a cuatro polímeros solubles en agua enlazados de manera covalente a una fracción de Factor IX (donde por cada polímero soluble en agua, el polímero soluble en agua puede ser enlazado, sea directamente una fracción de Factor IX o a través de una fracción espaciadora) . En algunas instancias, sin embargo, el conjugado puede tener 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más polímeros solubles en agua enlazados individualmente a una fracción de Factor IX. Adicionalmente, el conjugado puede incluir no más de 8 polímeros solubles en agua enlazados individualmente a una fracción de Factor IX, no más de 7 polímeros solubles en agua enlazados individualmente a una fracción de Factor IX, no más de 6 polímeros solubles en agua enlazados individualmente a una fracción de Factor IX, no más de 5 polímeros solubles en agua enlazados individualmente a una fracción de Factor IX , no más de 4 polímeros solubles en agua enlazados individualmente a una fracción de Factor IX, no más de 3 polímeros solubles en agua enlazados individualmente a una fracción de Factor IX, y no más de 2 polímeros solubles en agua enlazados individualmente a una fracción de Factor IX. [00110] El enlace particular entre la fracción de Factor IX y el polímero (o la fracción espaciadora que está enlazada al polímero) depende de una cantidad de factores. Entre tales factores están, por ejemplo, el químico específico de enlace empleado, la fracción de Factor IX particular, los grupos funcionales disponibles dentro de fracción de Factor IX (sea para enlace a un polímero o conversión a un sitio de enlace conveniente) , la posible presencia de grupos funcionales reactivos adicionales dentro de fracción de Factor IX, y así sucesivamente. [00111] En una o más representaciones del invento, el enlace entre la fracción de Factor IX y el polímero (o la fracción espaciadora que es enlazada al polímero) es un enlace hidrolíticamente estable, tal como una amida, uretano (también conocido como carbamato) , amino, tioéter (también conocido como sulfito) , o urea (también conocida como carbamida) . En una o más representaciones, el enlace no resulta de la reacción del reactivo polimérico que carga triazina, acetilo, hidracina, diazonio, amino, o el grupo funcional éster succinimidilo con la fracción de Factor IX. En algunos casos, se prefiere que el enlace no sea de carbamato ni de carbamida, y además, que no sea formado ningún enlace con base en la reacción de un polímero derivativo que carva un isocianato o especie de isocianato a una fracción de Factor IX. Una vez más, la amida es un enlace hidrolíticamente estable, preferido. Una amida puede ser fácilmente preparada por la reacción de un grupo carboxilo contenido dentro de fracción de Factor IX (por ejemplo, el carboxilo terminal de una fracción peptídíca con actividad de Factor IX) con un polímero terminado en amino . [00112] En una o más representaciones del invento, la unión entre la fracción de Factor IX y el polímero (o la fracción espaciadora que está enlazada al polímero) es un enlace degradable. De esta manera, el enlace del polímero soluble en agua (y cualquier fracción espaciadora) es "reductible" . En otras palabras, el polímero soluble en agua (y cualquier fracción espaciadora) reduce (ya sea a través de hidrólisis, procesos enzimáticos u otra alternativa) , resultando así la fracción nativa o no conjugada de Factor IX. Preferiblemente, los enlaces reducibles resultan haciendo que el polímero (y cualquier fracción espaciadora) se separe de fracción de Factor IX in vivo, sin dejar ningún fragmento del polímero soluble en agua (y cualquier fracción espaciadora) . Entre los enlaces degradables ejemplares están el carbonato, el carboxilato éster, fosfato éster, tiolester, anhídridos, acétales, quetales, éter aciloxialquilo, iminas, y otrtoésteres . Tales enlaces pueden estar completamente listos para la apropiada modificación ya sea de fracción de Factor IX (por ejemplo, la terminación del grupo C carboxilo o un grupo hidroxilo cadena lateral, de un aminoácido como serme serina o treonina, contenida en el interior de la proteína) y/o el reactivo polimérico, usando métodos de acoplamiento comúnmente empleados en el arte. Más preferidos, sin embargo, son los enlaces hidrolizables que son prontamente formados por reacción de un polímero convenientemente activado, con un grupo funcional no modificado, contenido dentro de fracción que tiene actividad de Factor IX. [00113] En relación con los enlaces, en una o más representaciones del invento, es provisto un conjugado que comprende unA fracción de Factor IX enlazada de manera covalente a un residuo aminoácido, ya sea directamente o a través de una fracción espaciadora compuesta por uno o más átomos, a un polímero soluble en agua, donde el residuo aminoácido no está enlazado, sea directamente o a través de fracción espaciadora, mediante un CH2-C(0)-0-, -N(H) -C(0)CH2-0-, -C(0)-N(H)-, -N (H) -C (O) -CH2-0- , -C(0)-CH2-O-, -C(O) -CH2-CH2-C(0) -O-, enlace diazo, triazino. [00114] Los conjugados (contrariamente a una fracción no conjugada de Factor IX) pueden o no pueden poseer un grado mesurable de actividad de Factor IX. Es decir, un conjugado en concordancia con el invento poseerá entre un 0% y cerca del 100% o más de la bioactividad de la fracción de Factor IX parental no modificada. Preferiblemente, los compuestos que poseen poca o ninguna actividad de Factor IX generalmente contienen un enlace hidrolizable que conecta el polímero al fracción, de manera que sin importar la falta de actividad en el conjugado, la molécula parental activa (o un derivado de ésta que tenga actividad de Factor IX) es liberada en un vínculo acuoso inducido en el enlace . Tal actividad puede ser determinada usando un conveniente modelo in-vivo o in-vitro, dependiendo de la actividad conocida de la fracción particular, que ha empleado actividad de Factor IX. [00115] Idealmente, la reducción de cada porción del polímero soluble en agua es facilitada a través del uso de enlaces fisiológicamente hendibles y/o enzimáticamente degradables como uretano, amida, carbonato, o enlaces que contengan éster. De esta manera, el espacio del conjugado (a través de la reducción de polímeros individuales solubles en agua) puede ser modulada seleccionando el tamaño del polímero molecular y el grupo funcional tipo que proveerá las propiedades deseadas del espacio. Alguien con habilidades ordinarias en el arte puede determinar el tamaño molecular apropiado del polímero, así como el grupo funcional reductible. Por ejemplo, alguien de habilidad ordinaria en el arte, usando experimentos de rutina, puede determinar un tamaño molecular apropiado y el grupo funcional reductible, preparando primero una variedad de conjugados polímero-Factor IX con diferentes pesos de polímero y grupos funcionales reductibles, y obteniendo entonces el perfil de distancia para cada conjugado, administrando el conjugado a un paciente y tomando muestras periódicas de sangre y/o orina. Una vez haya sido obtenida una serie de perfiles de distancia para cada conjugado examinado, se puede identificar un conjugado que tenga la distancia deseada. [00116] Para conjugados que poseen un enlace hidrolíticamente estable que enlaza la fracción de Factor IX al polímero, el conjugado generalmente poseerá un grado mesurable de actividad de Factor IX. Por ejemplo, tales conjugados se caracterizan generalmente por tener una bioactividad que satisface uno o más de los siguientes porcentajes relacionados con la fracción de Factor IX no conjugada: por lo menos cerca del 2%, por lo menos cerca del 5%, por lo menos cerca del 10%, por lo menos cerca del 15%, por lo menos cerca del 25%, por lo menos cerca del 30%, por lo menos cerca del 40%, por lo menos cerca del 50%, por lo menos cerca del 60%, por lo menos cerca del 80%, por lo menos cerca del 85%, por lo menos cerca del 90%, por lo menos cerca del 95%, por lo menos cerca del 97%, por lo menos cerca del 100%, y más del 105% (medido en un modelo conveniente, como los presentados aquí, y/o bien conocidos en el arte. Preferiblemente, los conjugados que tengan un enlace hidrolíticamente estable (por ejemplo, un enlace de amida) poseerán por lo menos algún grado de la bioactividad de la fracción de Factor IX parental, no modificada. [00117] Ahora serán descritos conjugados ejemplares. Se espera que la fracción de Factor IX comparta (por lo menos en parte) una secuencia de aminoácido similar o relacionada con el Factor IX nativo. Así, mientras se hará referencia a ubicaciones específicas o átomos dentro de la proteína del Factor IX nativo, tal referencia es sólo por conveniencia, y una persona con habilidades ordinarias en el arte será capaz de determinar prontamente la ubicación o átomo correspondiente en otras fracciones que tengan actividad de Factor IX. En particular, la descripción provista aquí para el Factor IX nativo es a menudo aplicable al Factor IXa, así como a fragmentos, variantes de eliminación, variantes de sustitución o variantes de adición, de cualquiera de las anteriores. [00118] Grupos de amino en fracciones de Factor IX pueden proveer un punto de enlace entre la fracción de Factor IX y el polímero soluble en agua. El Factor IX nativo comprende 27 residuos de lisina, cada uno con un grupo e-amino que puede estar disponible para conjugación, así como un segmento terminal amino. De esta manera, puntos ejemplares de enlace de tales fracciones de Factor IX incluyen el enlace a un aminoácido (a través de la cadena lateral de lisina que contiene amina) en una o más posiciones 39, 45, 51, 68, 89, 109, 127, 137, 146, 168, 189, 234, 247, 260, 274, 293, 311, 339, 347, 362, 387, 438, 440, 446, 455, 457, y 459. Es más, la amina N-terminal de cualquier proteína con actividad de Factor IX también puede servir como punto de enlace . [00119] Hay una cantidad de ejemplos convenientes de reactivos poliméricos solubles en agua, útiles para formar enlaces covalentes con aminas disponibles de una fracción de Factor IX. Ejemplos específicos, junto con los conjugados correspondientes, son provistos en la Tabla 1, abajo. En la tabla, la variable (n) representa el número de unidades monoméricas repetitivas y "-NH-F9" representa la fracción de Factor IX después de la conjugación al polímero soluble en agua. Mientras cada porción polimérica (por ejemplo, (OCH2CH2)n o (CH2CH20)n) presentada en la Tabla 1 termina en un grupo "CH3", otros grupos (como H y benzilo) pueden ser sustituidos entonces.

Tabla 1 Reactivos poliméricos amina específicos y Conjugado de fracción de Factor IX así formado [00120] La conjugación de un reactivo polimérico a un grupo amina de una fracción de Factor IX puede ser efectuada por medio de una variedad de técnicas. En un enfoque, una fracción de Factor IX puede ser conjugada a un reactivo polimérico funcionarizado con un derivado succinimidilo (u otro grupo éter activado, donde los enfoques similares a los descritos para un derivado succinimidilo pueden ser usados para otros reactivos poliméricos con un grupo éster activado) . En este enfoque, el reactivo polimérico que carga un grupo succinimidilo puede ser enlazado al fracción de Factor IX in medio acuoso, a un pH de 7.0 a 9.0, aunque pueden resultar diferentes condiciones de reacción (por ejemplo, un pH más bajo como 6 ó 7, o diferentes temperaturas y/o menos de 15 °C) , al enlazar un polimero a una ubicación diferente en la fracción de Factor IX. Adicionalmente, un enlace amida puede ser formado reaccionando un polímero soluble en agua, no péptico y con terminación en amino, con una fracción de Factor IX que carga un aldehido o un grupo de ácido carboxílico activado. [00121] Un conjugado ejemplar comprende la siguiente estructura: O II H3CO-{CH2CHgO)?-X-C-H-C-WH-FS R1 en el cual: (n) es un entero que tiene un valor que puede estar desde 2 hasta 3400; X es una fracción espaciadora, preferiblemente uno de metileno (W-CH2-"). etileno ("-CH2CH2-") y propileno ( "-CH2CH2CH2-" ) ; R1 es un radical orgánico, preferiblemente H o metilo ("-CH3"); y F9 es una fracción de Factor IX. [00122] Típico de otro acercamiento útil para conjugar la fracción de Factor IX a un reactivo polimérico es el uso de una reacción de aminación reductiva para conjugar un amina primaria de una fracción de Factor IX con un polímero hecho funcional con una ketona, aldehido, o una forma hidratada de éstos (por ejemplo, hidrato de ketona e hidrato aldehido) . En este acercamiento, la amina primaria de la fracción de Factor IX reacciona con el grupo carbonilo del aldehido o la ketona (o el correspondiente grupo contenedor de hidroxi, de un aldehido hidratado o ketona) , formando de esa manera una base Schiff . La base Schiff, a cambio, puede entonces ser convertida reductivamente a un conjugado estable, a través del uso de un agente reductor como el borohidrido de sodio. Las reacciones selectivas (por ejemplo, en el extremo N, son posibles) son posibles, particularmente con un polímero hecho funcional con una ketona o un alfametilo aldehido ramificado y/o bajo condiciones de reacción específicas (por ejemplo, pH reducido) . [00123] Los grupos carboxilo representan otro grupo funcional que puede servir como punto de enlace sobre la fracción de Factor IX. Estructuralmente, el conjugado comprenderá lo siguiente : Q II F9-C-X-POLY donde F9 y el grupo carbonilo adyacente corresponden la una fracción de Factor IX que tiene carboxilo, X es una fracción espaciadora, preferiblemente un heteroátomo seleccionado de O, N(H) , y S, y POLY es un polímero soluble en agua como PEG, opcionalmente terminando en una fracción protectora de terminación. [00124] El enlace C(0)-X resulta de la reacción entre un derivado polimérico que carga un grupo funcional terminal y una fracción de Factor IX con carga de carboxilo. Como se explicó arriba, el enlace específico dependerá del tipo de grupo funcional utilizado. Si el polímero de terminación funcionalizada, o "activado" con un grupo hidroxilo, el enlace resultante sera un ácido carboxílico éster y X será O. Si el marco del polímero es funcionalizado con un grupo tiol, el enlace resultante será un tioéster y X será S . Cuando son usados ciertos polímeros de brazos múltiples, ramificados o tipo "forked'J la fracción C(0)X, y en particular la fracción X, puede ser relativamente más compleja y puede incluir una estructura de enlace más larga. [00125] Los reactivos poliméricos con una fracción hidracida también son útiles para la conjugación en un carbonilo. Hasta el punto en que la fracción de Factor IX no contenga una fracción carbonilo, puede ser introducida una fracción carbonilo, reduciendo cualquier ácido carboxílico (por ejemplo, el ácido carboxílico de terminación C) y/o proveyendo versiones glicosiladas o glicatadas (donde los azúcares añadidos tienen una fracción carbonilo) de la fracción de Factor IX. Ejemplos específicos de reactivos poliméricos con una fracción hidrazida, junto con los correspondientes conjugados, están provistos en la Tabla 2, en la parte de abajo. Adicionalmente, cualquier reactivo polimérico con un éster activado (por ejemplo, un grupo succinimidilo) puede ser convertido para contener una fracción hidrazida, reaccionando el reactivo polimérico que tiene el éster activado, con hidracina (NH2-NH2) o tertbutilo carbazato [NH2NHC02C(CH3)3] . En la tabla, la variable (n) representa el número de unidades monoméricas repetitivas y "=C-F9" representa la fracción de Factor IX después de la conjugación al reactivo polimérico. Opcionalmente, el enlace de hidrazina puede ser reducido usando un agente redactor conveniente . Mientras cada porción polimérica [por ejemplo, (OCH2CH2)n or (CH2CH20)n] presentada en la Tabla 1 termina en un grupo "CH3" , otros grupos (como H y benzilo) puede ser sustituido entonces .

Tabla 2 Reactivos poliméricos carboxil-específicos, y Conjugado de fracción de Factor IX así formado [00126] Los grupos de tiolo contenidos dentro de la fracción de Factor IX pueden servir como sitios efectivos de enlace para el polímero soluble en agua. En particular, los residuos de cisteína proveen grupos de tiolo cuando la fracción de Factor IX es una proteína. Los grupos de tiolo contenidos en tales residuos de cisteína pueden ser reaccionados con un PEO activado que es específico para reacción con grupos de tiolo, por ejemplo, un polímero N-maleimidilo u otro derivado, tal como se describe en la patente de EE.UU. ?o. 5.739.208 y, en la Publicación Internacional de Patente ?o . WO 01/62827. [00127] Pese a que no queremos ser atados por la teoría, se cree que todos los residuos de císteína dentro del Factor IX participan en el enlace de disulfida. Como consecuencia, la conjugación a un residuo de cisteína participando en un enlace de disulfida puede romper la estructura terciaria del Factor IX y potencialmente puede disminuir significativamente su actividad general. Así, hasta el punto en que cualquier fracción particular de Factor IX carezca de un grupo de tiolo o ruptura de enlaces de disulfida debe evitarse, es posible añadir un residuo de cisteína al fracción de Factor IX usando técnicas sintéticas convencionales. Véase, por ejemplo, el procedimiento descrito en la Publicación Internacional de Patente WO 90/12874 para añadir residuos de cisteína, donde tal procedimiento puede ser adaptado para una fracción de Factor IX. Adicionalmente, los procesos convencionales de ingeniería genética también pueden ser usados para introducir un residuo de cisteína en el interior de la fracción de Factor IX. [00128] Ejemplos específicos, junto con los correspondientes conjugados, son provistos en la Tabla 3, abajo. En la tabla, la variable (n) representa el número de unidades monoméricas repetitivas y "-S-F9" representa la fracción de Factor IX después de la conjugación al polímero soluble en agua. Mientras cada porción polimérica [por ejemplo, (OCH2CH2)n o (CH2CH20) presentada en la Tabla 3 termina en in grupo "CH3" , otros grupos (como H y benzilo) can pueden ser sustituidos entonces .

Tabla : Reactivos poliméricos tiol-específicos, y Conjugado de fracción de Factor IX así formado Con respecto a conjugados formados de polímeros solubles en agua y que contienen uno o más grupos funcionales de maleimida (sin importar si la maleimida reacciona con el grupo amina o tiolo en la fracción de Factor IX) , las correspondientes formas de ácido maleánico del el polímero soluble en agua también pueden reaccionar con la fracción de Factor IX. Bajo ciertas condiciones, (por ejemplo, un pH de cerca de 1-9 y en la presencia del agua) , el anillo de maleimida se "abrirá" para formar el correspondiente ácido maleánico. El ácido maleánico, en cambio, puede reaccionar con un grupo amina o tiolo de una fracción de Factor IX. Reacciones ejemplares basadas en ácido están mostradas sistemáticamente en la parte de abajo. POLY representa el polímero soluble en agua, y F9 representa la fracción de Factor IX. [00129] Un conjugado representativo en concordancia con el invento puede tener la siguiente estructura: POLY-L0,?-C(O) Z-Y-S-S-F9 donde POLY es un polímero soluble en agua, L es un enlace opcional, Z es un heteroátomo seleccionado del grupo que consta de O, NH, y S, y Y es seleccionado del grupo que consta de C2.10 alkilo, alkilo sustituido C2-?o, arilo", arilo sustituido y F9 es una fracción de Factor IX. Los reactivos poliméricos que pueden ser reaccionados con un segmento molecular de Factor IX y el resultado en este tipo de conjugado son descritos en la solicitud de publicación de Patente de EE.UU No. 2005/0014903. [00130] Con respecto a los reactivos poliméricos, los que fueron descritos aquí y en otros lugares pueden ser comprados de fuentes comerciales (por ejemplo, Nektar Therapeutics, Huntsville AL) . Adicionalmente, los métodos para preparar los reactivos poliméricos son descritos en la literatura. [00131] El enlace entre la fracción de Factor IX y el polímero soluble en agua puede ser directo, en el cual no hay átomos participantes ubicados entre la fracción de Factor IX y el polímero, o indirecto, en el cual uno o más átomos están ubicados entre la fracción de Factor IX y el polímero. Con respecto al enlace indirecto, una "fracción espaciadora" sirve como enlace entre la fracción de Factor IX y el polímero soluble en agua. El átomo o los átomos que constituyen la fracción espaciadora puede incluir uno o más átomos de carbón, de nitrógeno, de azufre, de oxígeno, y combinaciones de éstos . La fracción espaciadora puede comprender una amida, una amida secundaria, un carbamato, un tioéter, y/o un grupo de disulfidos . Entre los ejemplos no limitantes de las fracciones espaciadoras de manera específica están aquellos seleccionados del grupo que consta de: -O-, -S-, -S-S-, -C(O)-, -C(0)-NH-, -NH-C (O) -NH- , -0-C(0)-NH-, - C(S) -, -CH2-, -CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-, -0-CH2-, -CH2-O-, -O-CH2-CH2-, -CH2-O-CH2-, -CH2-CH2-O-, -0-CH2-CH2-CH2-, -CH2-0-CH2-CH2-, -CH2-CH2-0-CH2-, -CH2-CH2-CH2-0- , -0-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-O-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-O-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-O-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-O-, -C(0) -NH-CH2-, -C(0) -NH-CH2-CH2-, -CH2-C(0) -NH-CH2-, -CH2-CH2-C(0) -NH-, -CÍO) -NH-CH2-CH2-CH2-, -CH2-C(0)-NH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-C (O) -NH-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(0) -NH-, -C (O) -NH-CH2-CH2-CH2-CH2- , -CH2-C(0) -NH-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-C(0) -NH-CH2-CH2- , -CH2-CH2-CH2-C (O) -NH-CH2- , -CH2-CH2-CH2-C (O) -NH-CH2-CH2- , -CH2-CH2-CH2-CH2-C(0) -NH-, -C (O) -0-CH2- , -CH2-C (O) -Q-CH2- , -CH2-CH2-C(0) -O-CH2-, -C(O) -O-CH2-CH2-, -NH-C(O) -CH2-, -CH2-NH-C(O) -CH2-, -CH2-CH2-NH-C(0) -CH2-, -NH-C (O) -CH2-CH2- , -CH2-NH-C (O) -CH2- CH2-, -CH2-CH2-NH-C(0) -CH2-CH2-, -C(O) -NH-CH2-, -C (O) -NH-CH2-CH2- , -O-C(O) -NH-CH2-, -O-C(O) -NH-CH2-CH2-, -NH-CH2-, -NH-CH2-CH2-, -CH2-NH-CH2-, -CH2-CH2-NH-CH2-, -C(0)-CH2-, -C(0)-CH2-CH2-, -CH2-C(0) -CH2-, -CH2-CH2-C(0) -CH2-, -CH2-CH2-C (O) -CH2-CH2- , -CH2-CH2-C(0) -, -CH2-CH2-CH2-C(0) -NH-CH2-CH2-NH- , -CH2-CH2-CH2-C(0) -NH-CH2-CH2-NH-C(0) -, -CH2-CH2-CH2-C(0) -NH-CH2-CH2-NH-C(0) -CH2-, -CH2-CH2-CH2-C (O) -NH-CH2-CH2-NH-C (O) -CH2-CH2- , -O-C(O) -NH- tCH2]h- (OCH2CH2)j-, grupo cicloalkilo bivalente, -O-, -S-, un aminoácido , -N(R6)-, y combinaciones de dos o más de cualquiera de los anteriores, donde R6 es H o un radial orgánico seleccionado del grupo que consta de alquilo, alquilo sustituido, alkenilo, alkenilo sustituido, alkinilo, alkinilo sustituido, arilo y arilo sustituido, (h) es de cero a seis, y (j) es de cero a 20. Otras fracciones espaciadoras específicas tienen las siguientes estructuras: -C(O) -NH- (CH2) ?_6-NH-C(0) -, -NH-C (O) -NH- (CH2) ?. 6-NH-C(0)-, y -O-C(O) -NH- (CH2)1.6-NH-C(0) -, donde los valores suscritos que siguen a cada metileno indican el número de metilenos contenidos en la estructura, por ejemplo, (CH2)?-6 significa que la estructura puede contener 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 metilenos. Adicionalmente, cualquiera de las anteriores fracciones espaciadoras puede además incluir una cadena oligomérica de óxido de etileno comprendiendo de 1 a 20 unidades monoméricas de óxido de etileno [es decir, - (CH2CH20) ?_20] . Es decir, la cadena oligomérica de óxido de etileno puede ocurrir antes o después de la fracción espaciadora, y opcionalmente en medio de cualquier dos átomos de una fracción espaciadora compuesta por dos o más átomos. Además, la cadena oligomérica no será considerada parte de la fracción espaciadora si el oligómero está adyacente a una segmento polímero y apenas representa una extensión del segmento del polímero. La fracción espaciadora no incluye azúcares ni carbohidratos, y se prefiere que al conjugado le haga falta sustancialmente cualquier polímero soluble en el agua enlazado directamente, o a través de una fracción espaciadora, a un azúcar o carbohidrato que, en cambio, está enlazado a una fracción de Factor IX. [00132] En algunas instancias el conjugado sólo puede tener un único polímero soluble en agua asociado con una única fracción de Factor IX. Como consecuencia puede ser deseable que el polímero soluble en agua sea un polímero no lineal soluble en agua (y preparar el conjugado usando un reactivo polimérico no lineal) . Un polímero no lineal soluble en agua preferido es un polímero ramificado soluble en agua, aunque se incluyen polímeros de múltiples ramas, solubles en agua. Al incorporar un polímero ramificado soluble en agua, es posible, por ejemplo, duplicar el peso molecular efectivo para cada sitio de enlace, en comparación con un solo polímero. [00133] Entre los conjugados ejemplares del invento, en donde el polímero soluble en agua está en una forma ramificada, están las formas ramificadas que comprenden un polímero ramificado basado en lisina, y un enfoque ramificado comprendiendo la estructura: donde cada (n) es independientemente un entero que tiene un valor de 2 a 3400. [00134] Los conjugados ejemplares del invento, comprenden la siguiente estructura: donde : cada (n) es independientemente un entero que tiene un valor de 2 a 3400; X es una fracción espaciadora; (b) es un entero que tiene un valor de 2 a 6 ; (c) es un entero que tiene un valor de 2 a 6; R2, en cada aparición, es independientemente H o alquilo bajo; y F9 es un a fracción de Factor IX. [00135] Un conjugado ejemplar del invento comprende la siguiente estructura: H3C0-{CH2CH2O)n-CHaCH2-NH-C-O- 0 -OCH2CH2C-H2"C.-NH-ÍCHaCH2?)4-CH2CH2CH2CH2-Fg H3C0-(CH=CH2O)R-CH2CH2-NH-C-O-1 donde : cada (n) es independientemente un entero que tiene un valor de 2 a 3400; F9 es una fracción de Factor IX. [00136] Otro conjugado ejemplar del invento comprende la siguiente estructura: donde : cada (n) es independientemente un entero que tiene un valor de 2 a 3400; (a) es cero o uno; X, cuando está presente, es una fracción espaciadora compuesta por uno o más átomos; (b1) es cero o un entero que tiene un valor del uno al diez; (c) es un entero que tiene el valor del uno al diez; R2, en cada aparición, es independientemente H o un radical orgánico; R3, en cada ocurrencia es independientemente H o un radical orgánico y; F9 es una fracción de Factor IX. [00137] Otro conjugado ejemplar del invento comprende la siguiente estructura: H3CO-(CHsCHaO)n-CH2CH2-NH-C-0-| O O -0-CHaCHgCH2C-NH-F9 HgCO-CCHgCHaO),,-CHaCHs-NH-C-O-1 donde : cada (n) es independientemente un entero que tiene un valor de 2 a 3400; F9 es una fracción de Factor IX. [00138] Composiciones [00139] Los conjugados son generalmente parte de una composición. Generalmente, la composición comprende una variedad de conjugados, preferiblemente aunque no necesariamente, cada uno de ellos tendría uno, dos, tres o cuatro polímeros solubles en agua individualmente enlazados de manera covalente (sea directamente o a través de una fracción espaciadora) a una fracción de Factor IX. Las composiciones, sin embargo, también pueden comprender otros conjugados que tengan cuatro, cinco, seis, siete, ocho o más polímeros enlazados a cualquier fracción determinada que tenga actividad de Factor IX. Adicionalmente, el invento incluye instancias en las cuales la composición comprende una pluralidad de conjugados, cada uno de los cuales comprende un polímero soluble en agua enlazado de manera covalente a una fracción de Factor IX, así como composiciones que comprenden dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o más polímeros solubles en agua enlazado de manera covalente a una fracción de Factor IX. [00140] En una o más representaciones del invento, se provee una composición, el cual comprende una pluralidad de conjugados, donde por lo menos cerca del 80% de todos los conjugados en la conposición, cada uno de los cuales está comprendido por una fracción de Factor IX enlazada de manera covalente a uno, dos, tres o cuatro polímeros solubles en agua, y donde además por cada polímero soluble en agua que haya en el conjugado, la fracción de Factor IX está enlazada al polímero soluble en agua, sea directamente o a través de una fracción espaciadora compuesta por uno o más átomos . [00141] Con respecto a los conjugados de la composición, la composición generalmente satisfará una o más de las siguientes características: por lo menos cerca del 85% de los conjugados de la composición tendrá de uno a cinco polímeros enlazado al fracción de Factor IX; por lo menos cerca del 85% de los conjugados de la composición tendrá entre uno y cuatro polímeros enlazados al fracción de Factor IX; por lo menos cerca del 85% de los conjugados de la composición tendrá de uno a tres polímeros enlazados al fracción de Factor IX; por lo menos cerca del 85% de los conjugados de la composición tendrá de uno a dos polímeros enlazados al fracción de Factor IX; por lo menos cerca del 85% de los conjugados de la composición tendrá un polímero enlazado al fracción de Factor IX (es decir, será monoPEGilizado) ; por lo menos cerca del 95% de los conjugados de la composición tendrá de uno a cinco polímeros enlazados al fracción de Factor IX; por lo menos cerca de 95% de los conjugados de la composición tendrá de uno a cuatro polímeros enlazados al fracción de Factor IX; por lo menos cerca de 95% de los conjugados de la composición tendrá de uno a tres polímeros enlazados al fracción de Factor IX; por lo menos cerca de 95% de los conjugados de la composición tendrá de uno a dos polímeros enlazados al fracción de Factor IX; por lo menos cerca de 95% de los conjugados de la composición tendrá un polímero enlazado al fracción de Factor IX (es decir, s rá monoPEGilizado) ; por lo menos cerca de 99% de los conjugados de la composición tendrá de uno a cinco polímeros enlazados al fracción de Factor IX; por lo menos cerca de 99% de los conjugados de la composición tendrá de uno a cuatro polímeros enlazados al fracción de Factor IX; por lo menos cerca de 99% de los conjugados de la composición tendrá de uno a tres polímeros enlazados al fracción de Factor IX; por lo menos cerca de 99% de los conjugados de la composición tendrá de uno a dos polímeros enlazados al fracción de Factor IX; y por lo menos cerca de 99% de los conjugados de la composición tendrá un polímero enlazado al fracción de Factor IX (es decir, será monoPEGilizado) . [00142] En una o más representaciones, se prefiere que la composición que contiene el conjugado esté libre o sustancialmente libre de albúminas. También se prefiere que la composición esté sustancialmente libre de proteínas que no tengan actividad de Factor IX. Así, se prefiere que la composición sea 85%, más preferiblemente 95%, y aún más preferiblemente 99% libre de albúminas. Adicionalmente, se prefiere que la composición sea el 85%, más preferiblemente el 95%, y aún más preferiblemente 99% libre de cualquier proteína que no tenga actividad de Factor IX. Hasta el punto en que la albúmina esté presente en la composición, las composiciones ejemplares del invento están sustancialmente libres de conjugados que no comprendan un glicol de polietileno polímero enlazando un residuo de una fracción de Factor IX a albúmina. [00143] El control de número deseado de polímeros para cualquier fracción determinada puede lograrse seleccionando el reactivo polimérico apropiado, el radio del reactivo polimérico al fracción de Factor IX, la temperatura, condiciones pH y otros aspectos de la reacción de conjugación. Adicionalmente, la reducción o eliminación de conjugados no deseados (por ejemplo, aquellos conjugados con cuatro o más polímeros enlazados) puede lograrse a través de medios de purificación. [00144] Por ejemplo, los conjugados de fracción polímero-Factor IX pueden ser purificados para obtener o aislar diferentes especies de conjugado. Específicamente, la mezcla de producto puede ser purificada para obtener un promedio de cualquiera entre uno, dos, tres, cuatro, cinco o más PEGs por fracción de Factor IX, generalmente uno, dos o tres PEGs por fracción de Factor IX. La estrategia para la purificación de la mezcla de reacción del conjugado final dependerá de una cantidad de factores, incluyendo, por ejemplo, el peso molecular del reactivo polimérico empleado para la fracción de Factor IX en particular, el régimen de dosificación deseado, y la actividad residual y las propiedades in vivo del conjugado en particular. [00145] Si se desea, los conjugados con diferentes -pesos moleculares pueden ser aislados usando cromatografía de filtración de gel y/o cromatografía de intercambio de iones. Es decir, la cromatografía de filtración de gel se usa para fraccionar radios de fracción polímero-Factor IX con números diferentes (por ejemplo, 1-mer, 2-mer, 3-mer, y así sucesivamente, donde "1-mer" indica 1 polímero enlazado a una fracción de Factor IX, "2-mer" indica dos polímeros enlazados una fracción de Factor IX, y así sucesivamente) sobre la base de sus pesos moleculares diferentes (donde la diferencia corresponde esencialmente al peso molecular promedio de la porción del polímero soluble en agua) . Por ejemplo, en una reacción ejemplar donde una proteína de 55,000 daltones está siendo conjugada de manera aleatoria con un reactivo polimérico que tiene un peso molecular de cerca de 20,000 daltones, la mezcla de reacción resultante puede contener proteína no modificada (teniendo un peso molecular de cerca de 55,000 daltones), proteína monoPEGilizada (o de "1-mer") (teniendo un peso molecular de cerca de 75,000 daltones), proteína diPEGilizada (o de 2-mer") (teniendo un peso molecular de cerca de 95,000 daltones), y así sucesivamente. [00146] Mientras este enfoque puede ser usado para separar PEGs y otros conjugados de fracción polímero-Factor IX teniendo diferentes pesos moleculares, este enfoque generalmente es ineficaz para separar isómeros posicionales que tienen diferentes sitios de enlace dentro de la fracción de Factor IX. Por ejemplo, puede usarse cromatografía de filtración de gel para separar entre sí mezclas de 1-mers, 2- mers, 3-mers, y así sucesivamente, aunque cada uno de los compuestos PEG-mer recuperados puede contener PEGs enlazados a diferentes grupos de amino reactivos (por ejemplo, residuos de lisina) dentro de la fracción de Factor IX. [00147] Algunas columnas de filtración de gel convenientes para llevar a cabo este tipo de separación son columnas Superdex™ y Sephadex™, disponibles de Amersham Biosciences (Piscataway, NJ) . La selección de una columna particular dependerá del rango de fracción deseado. La elución generalmente es desarrollada usando un búfer conveniente, como un fosfato, acetato, o semejantes. Las fracciones recogidas pueden ser analizadas por una cantidad de métodos diferentes, por ejemplo, (i) absorción a 280 nm por contenido de proteína, (ii) análisis de proteína con base en el tinte usando albúmina de suero bovino como estándar, (iii) evaluación iodina para contenido PEG (Sims et al. (1980) Anal. Biochm, 107:60-63) , (iv) electroforesis de sulfato dodecilo de sodio poliacrilamida gel (SDS PAGE) , seguida por manchas con iodo de bario, y cromatografía líquida de más alto desempeño. [00148] La separación de isómeros posicionales puede ser efectuada por cromatografía de fase reversa, usando métodos de cromatografía líquida para alto desempeño, fase reversa (RP-HPLC) , usando por ejemplo una columna C18 o una C3 (Amersham Biosciences or Vydac) o por medio de cromatografía de intercambio de iones usando una columna de intercambio de iones, por ejemplo, una columna de intercambio de iones Sepharose™, disponible de parte de Amersham Biosciences . Cada enfoque puede ser usado para separar isómeros agentes de polímero activo que tienen el mismo peso molecular (isómeros posicionales) . [00149] Preferiblemente, las composiciones están sustancialmente libres de proteínas que no tengan actividad de Factor IX. Adicionalmente, las composiciones preferiblemente están sustancialmente libres de todos los demás polímeros solubles en agua y enlazados de manera no covalente. En algunas circunstancias, sin embargo, la conposición puede contener una mezcla de conjugados de fracción de polímero-Factor IX y factor IX no conjugado. [00150] Opcionalmente, la composición del invento comprende además un excipiente farmacéuticamente aceptable . Si se desea, el excipiente farmacéuticamente aceptable puede ser añadido a un conjugado para formar una composición. [00151] Entre los excipientes ejemplares están, sin limitación, aquellos seleccionados del grupo que consta de carbohidratos, sales orgánicas, agentes antimicrobióticos, antioxidantes, tensoactivos, búferes, ácidos, bases, y combinaciones de éstos . [00152] Un carbohidrato como un azúcar, un azúcar derivada como un alditol, ácido aldónico, un azúcar esterizada o sintetizada, y/o un azúcar polímero pueden estar presentes como excipientes . Entre los excipientes específicos de carbohidratos están, por ejemplo: monosacáridos, como fructosa, maltosa, galactosa, glucosa, D-mannose, sorbosa, y demás; disacáridos, como lactosa, sacarosa, trehalosa, celobiosa, y demás; polisacáridos, como melitosa, melecitosa, maltodextrins , dextrans, starches, y demás; y alditois, such as manitol, xilitol, maltitol, lactitol, xihitol, sorbitol (glucitol) , piranosil sorbitol, moinositol, y demás. [00153] El excipiente también puede incluir una sal inorgánica o pulidos como ácido cítrico, cloruro de sodio, cloruro de potasio, sulfato de sodio, nitrato de potasio, fosfato monobásico de sodio, fosfato dibásico de sodio, y combinaciones de éstos. [00154] La composición puede también incluir un agente antimicrobiótico para prevenir o detener el crecimiento de microbios. Algunos ejemplos no limitantes de agentes antimicrobióticos convenientes para el presente invento son cloruro de benzalkonio, cloruro de benzetonio, alcohol benzil, cloruro de cetiloopiridinio, clorobutanol, fenol, alcohol feniloetilo, nitrato fenilomercúrico, timersol, y combinaciones de éstos. [00155] Un antioxidante puede asimismo estar presente en la composición. Los antioxidantes son usados para impedir la oxidación, impidiendo así el deterioro del conjugado u otros componentes de la preparación. Antioxidantes convenientes para el uso en el presente invento incluyen, por ejemplo, palmitato ascórbico, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, ácido hipofosforoso, monotioglicerol, propil galato, bisulfito de sodio, sulfoxilato de sodio formaldehído, metabisulfito de sodio, y combinaciones de éstos . [00156] Un tensoactivo puede estar presente como excipiente. Algunos tensoactivos ejemplares son: polisorbatos, tales como "Tween 20' y "Tween 80," y plurónicos como F68 y F88 (ambos están disponibles de parte de BASF, Mount Olive, New Jersey) ; esteres sorbitanos; lípidos, como los fosfolípidos como la lecitina y otras fosfatidilcolinas, fosfatidiletanolaminas (aunque preferiblemente no en forma de liposoma) , ácidos grasos y esteres ácidos; asteroides, como el colesterol; y agentes quelatantes, como EDTA, zinc y otros cationes convenientes. [00157] Puede haber ácidos o bases presentes como excipientes en la composición. Ejemplos no limitantes de ácidos que pueden ser usados, incluyen aquellos ácidos seleccionados del grupo que consta de ácido hidroclórico, ácido acético, ácido fosfórico, ácido cítrico, ácido málico, ácido láctico, ácido fórmico, ácido tricloroacético, ácido nítrico, ácido perclórico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico, ácido fumárico y combinaciones de éstos. Ejemplos de bases convenientes incluyen, sin limitación, bases seleccionadas del grupo que consta del hidróxido de sodio, acetato de sodio, hidróxido de amonio, hidróxido de potasio, fosfato de sodio, fosfato de potasio, citrato de sodio, fornato de sodio, sulfato de sodio, sulfato de potasio, fumerato de potasio, y combinaciones de éstos. [00158] La cantidad del conjugado (es decir, el conjugado formado entre el agente activo y el reactivo polimérico) en la composición variará dependiendo de una cantidad de factores, pero idealmente será una cantidad terapéuticamente efectiva cuando la composición es almacenada en un contenedor de dosis por unidades (por ejemplo, una redoma) . Adicionalmente, la preparación farmacéutica puede ser almacenada en una jeringa. Una cantidad terapéuticamente efectiva puede ser determinada experimentalmente mediante la administración repetida de cantidades crecientes del conjugado a fin de determinar qué cantidad produce un punto de efectividad clínicamente deseado. [00159] La cantidad de cualquier excipiente individual en la composición variará dependiendo de la actividad del excipiente y las necesidades particulares de la composición. Generalmente, la cantidad óptima de cualquier excipiente individual es determinada a través de la experimentación de rutina, es decir, preparando composiciones que contengan diversas cantidades del excipiente (oscilando desde cantidades bajas hasta altas) , examinando la estabilidad y otros parámetros, y determinando entonces el rango en el cual se consigue un desempeño óptimo sin efectos adversos significativos. [00160] Generalmente, sin embargo, el excipiente estará presente en la composición en una cantidad desde cerca del 1% hasta cerca del 99% por el peso, preferiblemente desde cerca del 5% hasta cerca del 98% por el peso, más preferiblemente desde cerca de 15 hasta cerca del 95% por el peso del excipiente, con preferencia hacia las concentraciones menores al 30% del peso. [00161] Estos anteriores excipientes farmacéuticos junto con otros excipientes son descritos en "Remington: The Science & Practice of Pharmacy", 19th ed. , Williams & Williams, (1995), the Physician's Desk Reference, 52nd ed. , Medical Economics, Montvale, NJ (1998), y Kibbe, A.H. , Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd Edition, American Pharmaceutical Association, Washington, D.C., 2000. [00162] Las composiciones comprenden todos los tipos de formulas y en particular aquellas que están preparadas para inyección, por ejemplo, polvos o liofilatos que pueden ser reconstituidos, así como líquidos. Entre los ejemplos de diluyentes convenientes para reconstituir composiciones sólidas antes de la inyección, están el agua bacteriostática para inyección, dextrosa al 5% en agua, salme con búfer de fosfato, solución Ringers, salme, agua estéril, agua desionizada, y combinaciones de éstos. Con respecto a las composiciones farmacéuticas líquidas, se vislumbran soluciones y suspensiones. [00163] Las composiciones del presente invento son generalmente, aunque no necesariamente, administrados a través de inyección, y por consecuencia generalmente son soluciones líquidas o suspensiones inmediatamente antes de su administración. La preparación farmacéutica también puede tomar otras formas como jarabes, cremas, ungüentos, tabletas, polvos y demás. Otros modos de administración también están incluidos, tal como la administración pulmonar, rectal, intradérmica, intramucosa, oral, intratecal (en el canal espinal) , subcutánea, intraarterial, y así sucesivamente. [00164] El invento provee además un método para la administración o entrega de un conjugado tal como ha sido provisto aquí, a un paciente que sufre de una condición que responde al tratamiento con el conjugado. El método comprende la administración o entrega, generalmente a través de inyección, de una cantidad terapéuticamente efectiva del conjugado (preferiblemente provista como parte de una composición farmacéutica) . Los conjugados (generalmente como parte de una composición farmacéutica) pueden ser administrados o entregados, por ejemplo, a través de inyección intravenosa, inyección intramuscular, inyección subcutánea, y así sucesivamente. Entre los tipos de formulación convenientes para la administración parenteral están las soluciones listas para inyectar, los polvos secos para ser combinados con un solvente antes de su uso, las suspensiones listas para inyección, composiciones secas no solubles para combinación con un vehículo antes de su uso, y emulsiones y concentrados líquidos para su dilución antes de la administración, entre otros . [00165] El método de administración o entrega puede ser usado para el tratamiento de un paciente que tiene una condición que puede ser remediada o prevenida por la administración del conjugado. Aquellos con habilidades ordinarias en el arte aprecian qué condiciones, puede tratar un conjugado específico de manera efectiva. Por ejemplo, los conjugados pueden ser usados para tratar individuos que sufren de hemofilia B, sea como una terapia de reemplazo o como una profilaxis . La administración del conjugado para profilaxis incluye situaciones en las cuales un paciente que sufre de hemofilia B está a punto de pasar por una cirugía, y el conjugado es administrado entre una y cuatro horas antes de la cirugía. Adicionalmente, los conjugados están preparados para ser usados como profilácticos contra el sangrado no controlado, opcionalmente en pacientes que sufren de hemofilia. Así, por ejemplo, el conjugado puede ser administrado a un paciente en riesgo de sangrado descontrolado, antes de la cirugía. [00166] La dosis real a ser administrada variará dependiendo de la edad, el peso y la condición general del sujeto, así como la severidad de la condición que está siendo tratada, el juicio del profesional de la salud y el conjugado que está siendo administrado. Las cantidades terapéuticamente efectivas son conocidas para quienes tienen habilidades en el arte y/o son descritas en los libros de referencia y en la literatura. Generalmente, sobre la base del peso, una cantidad terapéuticamente efectiva variará desde cerca de 0.001 mg hasta 100 mg, preferiblemente en dosis de 0.01 mg/día hasta 75 mg/día, y más preferiblemente en dosis desde 0.10 mg/día hasta 50 mg/día. Sobre la base de la actividad, las dosis correspondientes fundamentadas en unidades internacionales de actividad pueden ser calculadas por una persona con habilidades ordinarias en el área. [00167] Las dosis por unidad de cualquier conjugado determinado (una vez más, preferiblemente provisto como parte de una composición farmacéutica) puede ser administrado en una variedad de horario de dosis dependiendo del juicio del profesional médico, las necesidades del paciente, entre otras cosas. El horario específico de administración será conocido por aquellos con habilidades en el arte, o puede ser determinado experimentalmente usando métodos de rutina. Entre los ejemplos de horarios de dosificación están, sin limitación, la administración cinco veces por día, cuatro veces por día, tres veces por día, dos veces por día, una vez por día, tres veces por semana, dos veces por semana, una vez por semana, dos veces por mes, una vez por mes, y cualquier combinación de estos . Una vez haya sido logrado el punto clínico de efectividad, se detiene la dosificación de la composición. [00168] Debe entenderse, aunque el invento ha sido descrito en conjunto con las representaciones específicas preferidas, que la anterior descripción así como los ejemplos que siguen tienen la intención de ilustrar y no limitan el alcance del invento. Otros aspectos, ventajas y modificaciones dentro del alcance del invento serán evidentes a quienes tienen habilidades en el arte a la cual pertenece el invento. EXPERIMENTACIÓN [00169] La práctica del invento empleará, a menos que se indique de otra manera, técnicas convencionales de síntesis orgánica y demás, que están dentro de las habilidades del arte. Tales técnicas son explicadas completamente en la literatura. Los reactivos y materiales están disponibles en el comercio, a menos que se indique específicamente lo contrario. Véase, por ejemplo, J. March, Advanced Organic Chemistry: Reactions Mechanisms y Structure, 4th Ed. (New York: Wiley-Interscience, 1992) , supra . [00170] En los siguientes ejemplos, se han hecho esfuerzos para asegurar la confiabilidad con respecto a las cifras usadas (por ejemplo, cantidades, temperaturas, entre otros) pero debe tenerse en cuenta algo de error experimental error y desviación. A menos que se indique lo contrario, la temperatura está en grados centígrados y la presión está al nivel de la presión atmosférica a nivel del mar, o cerca de ese nivel. [00171] Aunque otras abreviaciones conocidas por quienes tienen habilidades ordinarias serán referenciadas, otros reactivos y materiales serán usados, y otros métodos conocidos por quienes tienen habilidades ordinarias en el arte serán usados, la siguiente lista y descripción de métodos es provista para propósitos de conveniencia. [00172] NaCNBH3 cianoborohidrido de sodio, 95% (Aldrich) [00173] HCl ácido hidroclórico, glacial (Fisher) [00174] K or kDa kilodaltones [00175] Acetonitrilo (Fisher Optirna) [00176] TFA Ácido trifluroacético, HPLC grade (JT Baker) [00177] PBS salme con buffer de fosfato (Sigma) [00178] SEC cromatografía de exclusión de tamaño [00179] HPLC cromatografía líquida de alto desempeño [00180] SDS-PAGE electroforesis en gel de sulfato dodecilo de sodio-poliacrilamida [00181] HEPES [4- (2-hidroxietilo) -l-ácido piperazineetanosulfónico] certificado de desempeño en biotecnología, 99.5+% (Sigma) [00182] Ethyl alcohol, USP, Absolute-200 Proof (AAPER) [00183] NuPAGET MES [2- (N-morfolino) ácido etano sulfónico] SDS running búfer (Invitrogen Corporation, Carlsbad CA) [00184] NuPAGE® 4x LDS (sulfato dodecil de litio) búfer muestra (Invitrogen Corporation, Carlsbad CA) [00185] SigmaMarker, rango bajo (M.W.6, 500-66, 000) (Sigma) [00186] SigmaMarker, rango alto (M.W. 36,000-205,000) (Sigma) [00187] NuPAGE® Novex Bis-Tris [Bis (2-hidroxiethyl) imino- tris (hidroximethyl)methane-HCl] gel (Invitrogen Corporation, Carlsbad CA) [00188] Análisis SEC-HPLC [00189] Se ha hecho cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) en un sistema Agilent 1100 HPLC (Agilent) . Para esos ejemplos analizados usando SEC-HPLC, cada muestra fue analizada usando una proteína SHODEX columna KW-804 (Showa Denko KK, Tokio, Japón), con un pH de 7.2. La tasa de flujo para la columna fue establecida a 0.5 mL/minuto. La proteína eluted y los conjugados de proteína PEG fueron detectados usando un enfoque UV con una longitud de onda establecida en 280 nm. [00190] Análisis SDS-PAGE [00191] La electroforesis de sulfato dodecilo de sodio-poliacrilamida gel (SDS-PAGE) fue desarrollada usando un sistema de electroforesis XCELL SURELOCK Mini-Ceil (Invitrogen Corporation, Carlsbad CA) . Para aquellas muestras analizadas usando SDS-PAGE, cada muestra fue mezclada con 4x LDS Sample Búfer (Invitrogen Corporation, Carlsbad CA) . Las muestras preparadas fueron entonces cargadas a un gel NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris y puestas en funcionamiento durante aproximadamente treinta minutos a 200 V usando el búfer NuPAGE MES (Invitrogen Corporation, Carlsbad CA) . [00192] Análisis RP-HPLC [00193] Se desarrolló cromatografía líquida de alto desempeño, fase reversa usando una columna reversa C3 (Hamilton, Zorbax) . Una pendiente de 30-80% de acetonitrilo fue usada junto con una temperatura elevada durante treinta minutos a 0.5 mL/minuto . [00194] El Factor IX recombinante correspondiente a la secuencia de aminoácido de SEQ. ID. NO. 1. fue usada en los ejemplos del 1-16. El Factor IX fue obtenido en un búfer que contenía tanto L-histidina como glicina. Por cuanto los grupos amina asociados con L-histidina y glicina en el búfer competirían por grupos amino asociados con el Factor IX, fue necesario intercambiar el búfer con amina por un búfer sin amina, para mejorar el rendimiento de la conjugación del Factor IX cuando los reactivos poliméricos dirigidos al amino fueron usados para efectuar la conjugación. [00195] Brevemente, el búfer con amina fue intercambiado por un búfer libre de amina mediante uno de dos acercamientos, dependiendo del volumen del búfer a ser intercambiado. Para cantidades de búfer relativamente pequeñas, una columna centrífuga 500 µL Zeba Desalt (Pierce Biotechnology, Rockford IL) fue usada de acuerdo con el protocolo provisto por el fabricante. Para cantidades de búfer relativamente grandes, un dispositivo de filtro centrífugo CENTRICON® de 2 mL (Millipore Corporation, Billerica MA) con un corte de peso molecular de 10,000 ó 30,000 daltones fue usado de acuerdo con el protocolo provisto por el fabricante. Todas las muestras usadas en los ejemplos sin etanol fueron cambiadas a un büfer lx PBS con un pH de 7.5, mientras todas las muestras usadas en los ejemplos con etanol fueron intercambiadas a un búfer lx PBS con un pH de 7.5 con etanol añadido para formar una mecía de reacción de Factor IX con etanol al 10%. [00196] El búfer sin aminas, con Factor IX recombinante y correspondiente a la secuencia de aminoácido SEQ. ID. NO. 1. (la "Factor IX stock solution", solución de Factor IX) fue usada en los ejemplos 1-16. La solución de Factor IX stock contenía cerca de 0.2 mg/mL hasta 0.55 mg/mL de Factor IX.

Ejemplo 1 PEGilación de Factor IX con mPEG-SMB, 30kDa (radio 1:1 del Polímero al Factor IX; sin etanol) [00197] mPEG-SMB, 30kDa, almacenado a -20°C bajo argón, fue calentado a temperatura ambiente. El mPEG-SMB aclimatado (4.1 mg) fue disuelto en 1 mL de 2 mM HCl para formar una solución mPEG-SMB. La solución mPEG-SMB fue añadida a una alícuota de la solución de Factor IX stock conteniendo 0.07 mg de Factor IX hasta que se logró un radio molar 1:1 de mPEG-SMB en relación con el Factor IX.

Después de la adición de mPEG-SMB, el pH de la reacción fue evaluado para asegurar un pH de 7.2. a 7.5, y bien mezclado. Para permitir el acople del mPEG-SMB al Factor IX a través de un enlace amida, la solución de reacción fue revuelta durante tres horas a temperatura de habitación, después que SDS PAGE fue efectuado en la muestra, lo cual confirmó la presencia de material monoconjugado ("1-mer").

Vea el espacio etiquetado como "1:1 30K SMB" en el gel provisto como la FIG. 1. Después de esto, se permitió que el acople continuara, revolviendo la solución de reacción durante quince horas a 4°C, resultando así una solución de co jugado . [00198] RP-HPLC (C3) y un segundo SDS PAGE fueron usados para la caracterización de la solución de conjugado resultante. Con base en el resultado del segundo SDS PAGE, la conjugación fue evidente. Vea la sección etiquetada como "1:1 30K SMB" en el gel provisto como la FIG. 2. RP-HPLC (C3) fue usado para separar los componentes de la solución de conjugado resultante y y el cromatograma resultante indicó un rendimiento del 0.54% (representando 100% monoPEGilización o especies "1-mer"). Véase el cromatograma provisto como la FIG. 5. [00199] Se espera que períodos de tiempo más largos, aumento en las temperaturas y/o múltiples adiciones del reactivo polimérico podrían incrementar los rendimientos de aumento. Usando este mismo enfoque, otros conjugados pueden ser preparados usando mPEG-SMB teniendo otros pesos moleculares promedio de peso.

Ej emplo 2 PEGilación de Factor IX con mPEG-SMB, 30kDa (radio 10:1 Polímero a Factor IX ; sin etanol) mPEG-SMB, 30 a [00200] mPEG-SMB, 30kDa, almacenado a -20°C bajo argón, fue calentada a temperatura ambiente. El mPEG-SMB atemperado (4.1 mg) fue disuelto en 1 mL de 2 mM para formar una solución mPEG-SMB. La solución mPEG-SMB fue añadida a una alícuota de la solución de Factor IX stock que contenía 0.07 mg de Factor IX hasta que se alcanzó un exceso molar de diez, de mPEG-SMB en relación con el Factor IX. Después de la adición de mPEG-SMB, el pH de la mezcla de reacción fue evaluado para asegurar un pH de 7.2 a 7.5, y mezclado correctamente. Para permitir el acople de mPEG-SMB al Factor IX a través de un enlace amida, la solución de reacción fue revuelta durante tres horas a temperatura de habitación, después de lo cual se efectuó un SDS PAGE en la muestra, lo cual confirmó la presencia de material monoconjugado (' 1-mer"). Véase la sección etiquetada como "10:1 30K SMB" en el gel provisto como FIG. 1. Después de esto, se permitió que continuara el acople, revolviendo la solución de reacción durante quince horas a 4°C, resultando de esa manera una solución de conjugado. [00201] RP-HPLC (C3) y un segundo SDS PAGE fueron usados para la caracterización de la solución de conjugado resultante . Con base en los resultados del segundo SDS PAGE, la conjugación fue evidente. Véase la sección etiquetada como "10:1 30K SMB" en el gel provisto como FIG. 2. RP-HPLC (C3) fue usado para separar los componentes de la solución de conjugado resultante y el cromatograma resultante indicó un rendimiento de 6.4% (representando 100% monoPEGyled or "1-mer" species) . Véase el cromatograma provisto como FIG. 6. [00202] Se espera que tiempos de reacción más largos, el aumento en las temperaturas y/o múltiples adiciones del reactivo polimérico podrían incrementar el rendimiento. Así, cuando este experimento fue repetido por un periodo extendido del tiempo a temperatura de habitación antes de continuar la reacción durante la noche a 4°C, un rendimiento en el incremento del conjugado fue evidenciado por una banda más oscura, tal como se vio en un gel de SDS PAGE gel. Véase la sección etiquetada como "10:1 30K SMB" en la FIG. 4. Usando los mismos procedimientos aquí descritos, otros conjugados pueden ser preparados usando mPEG-SMB teniendo otros pesos moleculares promedio de peso.

Ejemplo 3 PEGilación de Factor IX con Hidroxisuccinimida ramificada mPEG2-N, 40kDa (radio 1:1 Polímero al Factor IX; sin etanol) Hidroxisuccinimida ramificada mPEG2-N, 40kDa [00203] Hidroxisuccinimida ramificada mPEG2-N, 40kDa, almacenada a -20°C bajo argón, fue calentada a temperatura ambiente. La hidroxisuccinimida ramificada mPEG2-N- (2.0 mg) , calentada, fue disuelta en 1 mL de 2 mM HCl para formar una solución de mPEG2-N-hidroxisuccinimida ramificada. La solución hidroxisuccinimida ramificada mPEG2-N fue añadida a una alícuota de la solución de Factor IX que contenía 0.07 mg de Factor IX hasta que se alcanzó un radio molar 1:1 de mPEG2-N-hidroxisuccinimida ramificada, en relación con el Factor IX. Después de la adición de hidroxisuccinimida ramificada mPEG2-N, el pH de la mezcla de reacción fue evaluado para asegurar un pH de 7.2 a 7.5, y mezclado correctamente. Para permitir el acople del hidroxisuccinimida ramificada mPEG2-N al Factor IX a través de un enlace amida, la solución de reacción fue revuelta durante tres horas a temperatura de habitación, después de lo cual se efectuó un SDS PAGE en la muestra, lo cual no mostró conjugación detectable. Véase la sección etiquetada como "1:1 40K NHS" en el gel provisto como FIG. 1. Después de esto, hubo tiempo adicional para la conjugación, provisto al revolver la solución de reacción durante quince horas a 4°C, resultando de esa manera una solución de conjugado. [00204] RP-HPLC (C3) y un segundo SDS PAGE fueron usados para la caracterización de la solución de conjugado resultante . Con base en los resultados del segundo SDS PAGE, la conjugación fue evidente. Véase la sección etiquetada como "1:1 40K NHS" en el gel provisto como FIG. 2. RP-HPLC (C3) fue usado para separar los componentes de la solución de conjugado resultante y el cromatograma resultante indicó un rendimiento de 0.1% (representando 100% monoPEGilado o "especie 1 -mer"). Véase el cromatograma provisto como FIG. 7. [00205] Se espera que tiempos de reacción más largos, el aumento en las temperaturas y/o múltiples adiciones del reactivo polimérico podrían incrementar el rendimiento. Usando este mismo procedimiento, otros conjugados pueden ser preparados usando mPEG2-N-hidroxisuccinimida ramificada teniendo otros pesos moleculares promedio de peso.

Ejemplo 4 PEGilación de Factor IX con Hidroxisuccinimida ramificada mPEG2-N, 40kDa (radio 10:1 Polímero al Factor IX; sin etanol) Hidroxisuccinimida ramificada mPEG2-N, 40kDa [00206] Hidroxisuccinimida ramificada mPEG2-N, 40kDa, almacenada a -20°C bajo argón, fue calentada a temperatura ambiente. La Hidroxisuccinimida mPEG2-N~ ramificada (2.0 mg) atemperada fue disuelta en 1 mL de 2 mM HCl para formar una solución de hidroxisuccinimida ramificada mPEG2-N. La solución de hidroxisuccinimida ramificada mPEG2-N fue añadida a una alícuota de la solución de Factor IX que contenía 0.07 mg de Factor IX hasta alcanzar un exceso molar de 10 hidroxisuccinimida ramificada mPEG2-N en relación con el Factor IX. Después de la adición de hidroxisuccinimida ramificada mPEG2-N, el pH de la mezcla de reacción fue evaluado para asegurar un pH de 7.2 a 7.5, y mezclado correctamente . Para permitir el acople de la hidroxisuccinimida ramificada mPEG2-N al Factor IX a través de un enlace amida, la solución de reacción fue revuelta por tres horas a temperatura de habitación, después de lo cual se efectuó un SDS PAGE en la muestra, lo cual no mostró conjugación detectable. Véase la sección etiquetada como 10:1 40k NHS" en el gel provisto como FIG. 1. Después de esto, se permitió que continuara el acople revolviendo la solución de reacción por quince horas a 4°C, resultando de esa manera una solución de conjugado. [00207] RP-HPLC (C3) y un segundo SDS PAGE fueron usados para la caracterización de la solución de conjugado resultante . Con base en los resultados del segundo SDS PAGE, la conjugación aún no era detectable. Véase la sección etiquetada como "10:1 40K NHS" en el gel provisto como FIG. 2. RP-HPLC (C3) fue usado para separar los componentes de la solución de conjugado resultante y el cromatograma resultante no indicó rendimiento detectable de conjugado. Véase el cromatograma provisto como FIG. 8. [00208] Se espera que tiempos de reacción más largos, el aumento en las temperaturas y/o múltiples adiciones del reactivo polimérico podrían incrementar el rendimiento. Usando este mismo enfoque, otros conjugados pueden ser preparados usando hidroxisuccinimida ramificada mPEG2-N- teniendo otros pesos moleculares promedio de peso.

Ejemplo 5 PEGilación de Factor IX con mPEG-SMB, 30kDa (Radio 10:1 Polímero al Factor IX; con etanol) mPEG - SMB , 30 kDa [00209] Puesto que se cree que el etanol incrementa la flexibilidad estructural de ciertas proteínas, se introdujo etanol en el búfer y el sistema de reacción. mPEG-SMB, 30kDa, almacenado a -20°C bajo argón, fue calentado a temperatura ambiente. El mPEG-SMB atemperado (10.0 mg) fue disuelto en 0.5 mL de 2 mM HCl con etanol añadido para formar una solución de mPEG-SMB con etanol al 10%. La solución de mPEG-SMB con etanol al 10% fue añadida a la mezcla de reacción de factor IX con etanol al 10% hasta alcanzar un exceso molar de 10 mPEG-SMB en relación con el Factor IX. Después de la adición de mPEG-SMB, el pH de la mezcla de reacción fue evaluado para asegurar un pH de 7.2 a 7.5, y mezclado correctamente. Para permitir el acople de mPEG-SMB al Factor IX a través de un enlace amida, la solución de reacción fue revuelta durante tres horas a temperatura de habitación. Se permitió que el acople continuara, revolviendo la solución de reacción durante la noche a 4°C, resultando de esa manera una solución de conjugado. [00210] SDS PAGE fue usado para la caracterización de la solución de conjugado resultante. Con base en los resultados de SDS PAGE, no se efectuó conjugación. Véase la sección etiquetada como "10:1 30K SMB + EtOH" en el gel provisto como FIG. 3. Ahora se creé que la introducción de etanol no incrementa la flexibilidad estructural del Factor IX para permitir una conjugación aumentada de mPEG-SMB, 30kDa. [00211] Se espera que tiempos de reacción más largos, el aumento en las temperaturas y/o múltiples adiciones del reactivo polimérico podrían incrementar el rendimiento. Usando este mismo enfoque, otros conjugados pueden ser preparados usando mPEG-SMB teniendo otros pesos moleculares promedio de peso. Ej emplo 6 PEGilación de Factor IX con mPEG-SMB, 30kDa (Radio 20:1 Polímero al Factor IX; con etanol) mPEG - SMB, 30kDa [00212] Puesto que se cree que el etanol incrementa la flexibilidad estructural de ciertas proteínas, se introdujo etanol en el búfer y el sistema de reacción. mPEG-SMB, 30kDa, almacenado a -20°C bajo argón, fue calentada a temperatura ambiente. El mPEG-SMB (10.0 mg) atemperado fue disuelto en 0.5 mL de 2 mM HCl con etanol añadido para formar una solución de mPEG-SMB con etanol al 10%. La solución de mPEG-SMB con etanol al 10% fue añadida a la mezcla de reacción de Factor IX hasta lograr un exceso molar 20 de mPEG-SMB en relación con el Factor IX. Después de la adición de mPEG-SMB, el pH de la mezcla de reacción fue evaluado para asegurar un pH de 7.2 a 7.5, y mezclado correctamente. Para permitir el acople de mPEG-SMB al Factor IX a través de un enlace amida, la solución de reacción fue revuelta durante tres horas a temperatura de habitación. Se permitió que continuara el acople revolviendo la solución de reacción durante la noche a 4°C, resultando de esa manera una solución de conjugado. [00213] SDS PAGE fue usado para la caracterización de la solución de conjugado resultante. Con base en los resultados de SDS PAGE, no se detectó conjugación. Véase la sección etiquetada como "20:1 30K SMB + EtOH" en el gel provisto como FIG. 3. Ahora se cree que la introducción del etanol no incrementa la flexibilidad estructural del Factor IX para permitir el aumento de la conjugación de mPEG-SMB, 30kDa. [00214] Se espera que tiempos de reacción más largos, el aumento en las temperaturas y/o múltiples adiciones del reactivo polimérico podrían incrementar el rendimiento. Usando este mismo enfoque, otros conjugados pueden ser preparados usando mPEG-SMB teniendo otros pesos moleculares promedio de peso. Ejemplo 7 PEGilación de Factor IX con Hidroxisuccinimida ramificada mPEG2-N, 40kDa (Radio de 10:1 Polímero al Factor IX; con etanol) Hidroxisuccinimida ramificada mPEG2-N, 40kDa [00215] Puesto que se cree que el etanol incrementa la flexibilidad estructural de ciertas proteínas, se introdujo etanol en el búfer y el sistema de reacción. Hidroxisuccinimida ramificada mPEG2-N, 40kDa, almacenado a -20°C bajo argón, fue calentada a temperatura ambiente. La hidroxisuccinimida ramificada mPEG2-N (2.0 mg) atemperada fue disuelta en 1.0 mL de 2mM HCl con etanol añadido para formar una solución de hidroxisuccinimida ramificada mPEG2- N con etanol al 10%. La solución de hidroxisuccinimida ramificada mPEG2-N con etanol al 10% fue añadida a la mezcla de reacción de Factor IX con etanol al 10% hasta alcanzar un exceso molar de 10:1 de hidroxisuccinimida ramificada mPEG2-N en relación con el Factor IX. Después de la adición de hidroxisuccinimida ramificada mPEG2-N, el pH de la mezcla de reacción fue evaluado para asegurar un pH de 7.2 a 7.5, y mezclado correctamente . Para permitir el acople de la hidroxisuccinimida ramificada mPEG2-N al Factor IX a través de un enlace amida, la solución de reacción fue revuelta durante tres horas a temperatura de habitación. Se permitió que continuara el acople revolviendo la solución de reacción durante la noche a 4°C, resultando de esa manera una solución de conjugado. [00216] SDS PAGE fue usado para la caracterización de la solución de conjugado resultante. Con base en los resultados del SDS PAGE, no se detectó conjugación (no se mostraron los resultados) . Ahora se cree que la introducción de etanol no incrementa la flexibilidad estructural del Factor IX para permitir el aumento de la conjugación de hidroxisuccinimida ramificada mPEG2-N, 0kDa. [00217] Se espera que tiempos de reacción más largos, el aumento en las temperaturas y/o múltiples adiciones del reactivo polimérico podrían incrementar el rendimiento. Usando este mismo enfoque, otros conjugados pueden ser preparados usando mPEG2-N-hidroxisuccinimida ramificada teniendo otros pesos moleculares promedio de peso. Ejemplo 8 PEGilación de Factor IX con Hidroxisuccinimida ramificada mPEG2-N, 40kDa (Radio 20:1 Polímero al Factor IX; con etanol) Hidroxisuccinimida ramificada mPEG2-N, 40kDa [00218] Puesto que se cree que el etanol incrementa la flexibilidad estructural de ciertas proteínas, se introdujo etanol en el búfer y el sistema de reacción. La hidroxisuccinimida ramificada mPEG2-N, 40kDa, almacenada a -20°C bajo argón, fue calentada a temperatura ambiente. La hidroxisuccinimida ramificada mPEG2-N (2.0 mg) atemperada fue disuelta en 1.0 mL de 2mM HCl con etanol añadido para formar una solución de hidroxisuccinimida ramificada mPEG2-N con etanol al 10%. La solución de hidroxisuccinimida ramificada mPEG2-N con etanol al 10% fue añadida a la mezcla de reacción de Factor IX con etanol al 10% hasta alcanzar un exceso molar de hidroxisuccinimida ramificada mPEG2-N en relación con el Factor IX. Después de la adición de hidroxisuccinimida ramificada mPEG2-N, el pH de la mezcla de reacción fue evaluado para asegurar un pH de 7.2 a 7.5, y mezclada correctamente. Para permitir el acople de la hidroxisuccinimida ramificada mPEG2-N al Factor IX a través de un enlace amida, la solución de reacción fue revuelta durante tres horas a temperatura de habitación. Se permitió que continuara el acople revolviendo la solución de reacción durante la noche a 4°C, resultando de esa manera una solución de conjugado. [00219] SDS PAGE fue usado para la caracterización de la solución de conjugado resultante. Con base en los resultados del SDS PAGE, no se detectó conjugación (no fueron mostrados los resultados) . Ahora se cree que la introducción de etanol no aumenta la flexibilidad estructural de Factor IX para permitir el aumento de la conjugación de hidroxisuccinimida ramificada mPEG2-N, 40kDa. [00220] Se espera que tiempos de reacción más largos, el aumento en las temperaturas y/o múltiples adiciones del reactivo polimérico podrían incrementar el rendimiento. Usando este mismo enfoque, otros conjugados pueden ser preparados usando hidroxisuccinimida ramificada mPEG2-N teniendo otros pesos moleculares promedio de peso.

Ejemplo 9 PEGilación de Factor IX con mPEG-SMB, 30kDa (Radio 20:1 Polímero al Factor IX; sin etanol) mPEG-SMB, 30kDa mPEG-SMB, 30kDa, almacenado a -20°C bajo argón, fue calentado a temperatura ambiente. El mPEG-SMB (8.6 mg) atemperado fue disuelto en 1.0 mL de 2 mM HCl para formar una solución de mPEG-SMB. La solución mPEG-SMB fue añadida a una alícuota de la solución de Factor IX que contenía 0.07 mg de Factor IX hasta alcanzar un exceso molar de veinte de mPEG-SMB en relación con el Factor IX. Después de la adición de mPEG-SMB, el pH de la mezcla de reacción fue evaluado para asegurar un pH de 7.2 a 7.5. Para permitir el acople de mPEG-SMB al Factor IX a través de un enlace amida, la solución de reacción fue revuelta durante dos horas a temperatura de habitación. Se permitió que continuara el acople revolviendo la solución de reacción durante la noche a 4°C, resultando de esa manera una solución de conjugado. Después de esto, se permitió que continuara el acople revolviendo durante la noche a 4°C, resultando de esa manera una solución de conjugado. [00221] SDS PAGE fue usado para la caracterización. Con base en los resultados del segundo SDS PAGE, la conjugación fue evidente. Véase la sección etiquetada como "20:1 30K SMB" en el gel provisto como FIG. 4. [00222] Se espera que tiempos de reacción más largos, el aumento en las temperaturas y/o múltiples adiciones del reactivo polimérico podrían incrementar el rendimiento. Usando este mismo enfoque, otros conjugados pueden ser preparados usando ramificada mPEG-SMB teniendo otros pesos moleculares promedio de peso. Ejemplo 10 PEGilación de Factor IX con mPEG-SPA, 20kDa (Radio 20:1 Polímero al Factor IX; con etanol) mPEG-SPA, 20kDa [00223] Puesto que se cree que el etanol incrementa la flexibilidad estructural de ciertas proteínas, se introdujo etanol en el búfer y sistema de reacción. mPEG-SPA, 20kDa, almacenado a -20°C bajo argón, fue calentado a temperatura ambiente. El mPEG-SPA (10.0 mg) atemperado fue disuelto en 0.5 mL de 2mM HCl con etanol añadido para formar una solución de mPEG-SPA con etanol al 10%. La solución de mPEG-SPA con etanol al 10% fue añadida a la mezcla de reacción de Factor IX con etanol al 10% hasta alcanzar un exceso molar de veinte mPEG-SPA en relación con el Factor IX. Después de la adición de mPEG-SPA, el pH de la mezcla de reacción fue evaluado para asegurar un pH de 7.2 a 7.5, y mezclado correctamente . Para permitir el acople de mPEG-SPA al Factor IX a través de un enlace amida, la solución de reacción fue revuelta durante dos horas a temperatura de habitación. Se permitió que continuara el acople revolviendo la solución de reacción. [00224] Con base en los resultados de SDS PAGE, no se detectó conjugación. Véase la sección etiquetada como "20:1 20K SPA + EtOH" en el gel provisto como FIG. 3. Ahora se cree que la introducción de etanol no incrementa la flexibilidad estructural del Factor IX para permitir el aumento de la conjugación de mPEG-SPA, 20kDa. [00225] Se espera que tiempos de reacción más largos, el aumento en las temperaturas y/o múltiples adiciones del reactivo polimérico podría aumentar el rendimiento. Usando este mismo enfoque, otros conjugados pueden ser preparados usando mPEG-SPA teniendo otros pesos moleculares promedio de peso. Ejemplo 11 PEGilación de Factor IX con mPEG-SPA, 20kDa (Radio 40:1 Polímero al Factor IX; con etanol) mPEG- SPA, 20kDa [00226] Puesto que se cree que el etanol incrementa la flexibilidad estructural de ciertas proteínas, se introdujo etanol en el búfer y el sistema de reacción. mPEG-SPA, 20kDa, almacenado a -20°C bajo argón, fue calentado a temperatura ambiente. El mPEG-SPA (10.0 mg) atemperado fue disuelto en 0.5 mL de 2mM HCl con etanol añadido para formar una solución de mPEG-SPA con etanol al 10%. La solución de mPEG-SPA con etanol al 10% fue añadida a la mezcla de reacción de Factor IX con etanol al 10% hasta alcanzar un exceso molar de cuarenta mPEG-SPA en relación con el Factor IX. Después de la adición de mPEG-SPA, el pH de la mezcla de reacción fue evaluado para asegurar un pH de 7.2 a 7.5, y mezclado correctamente. Para permitir el acople de mPEG-SPA al Factor IX a través de un enlace amida, la solución de reacción fue revuelta durante dos horas a temperatura de habitación. Se permitió que continuara el acople revolviendo la solución de reacción. [00227] Con base en los resultados de SDS PAGE, no se detectó conjugación. Véase la sección etiquetada como "40:1 20K SPA + EtOH" en el gel provisto como FIG. 3. Ahora se cree que la introducción de etanol no incrementa la flexibilidad estructural del Factor IX para permitir el aumento de la conjugación de mPEG-SPA, 20kDa. [00228] Se espera que tiempos de reacción más largos, aumento de temperaturas y/o múltiples adiciones del reactivo polimérico podrían incrementar el rendimiento. Usando este mismo enfoque, otros conjugados pueden ser preparados usando mPEG-SPA teniendo otros pesos moleculares promedio de peso . Ejemplo 12 PEGilación de Factor IX con Ramificada mPEG-Butiraldehído, 20kDa (Radio 10:1 Polímero al Factor IX; sin etanol) MPEG2-Butiraldehído, 20kDa ramificado [00229] MPEG2-Butiraldehído, 20kDa ramificado, almacenado a -20°C bajo argón, fue calentado a temperatura ambiente. El mPEG2-Butiraldehído ramificado (10.9 mg) atemperado fue disuelto en 1 mL de 2mM HCl hasta formar una solución de mPEG2-Butiraldehído ramificado. La solución mPEG2-butiraldehído ramificado fue añadido a una alícuota de la solución de Factor IX que contenía 0.07 mg de Factor IX hasta alcanzar un exceso molar de 10 mPEG2-butiraldehído ramificado al Factor IX. Después de treinta minutos de mezclado, con un agente reductor NaCNBH3 (disuelto en lx PBS) , fue añadido en exceso en relación con el mPEG2-Butiraldehído ramificado (con el pH evaluado y ajustado como fue necesario para asegurar la reacción del amino secundario) . La solución fue revuelta entonces durante la noche a 4°C para asegurar el acoplamiento a través de un enlace de amina. [00230] RP-HPLC (C3) y un SDS PAGE fueron usados para la caracterización de la solución de conjugado resultante. Con base en los resultados del SDS PAGE, no se detectó conjugación. Véase la sección etiquetada como "10:1 20K BYA" en el gel provisto como FIG. 4. RP-HPLC (C3) fue usado para separar los componentes de la solución de conjugado resultante y el cromatograma resultante no confirmó la presencia de material conjugado. Véase el cromatograma provisto como FIG. 9. [00231] Se espera que tiempos de reacción más largos, el aumento en las temperaturas y/o múltiples adiciones del reactivo polimérico podrían incrementar el rendimiento. Usando este mismo enfoque, otros conjugados pueden ser preparados usando mPEG2-Butiraldehído ramificado teniendo otros pesos moleculares promedio de peso.

Ejemplo 13 PEGilación de Factor IX con mPEG-Butiraldehído Ramificado, 20kDa (20:1 Polímero al Factor IX Ratio; sin etanol) MPEG2-Butiraldehído, 20kDa ramificado [00232] MPEG2-Butiraldehído, 20kDa ramificado, almacenado a -20°C bajo argón, fue calentado a temperatura ambiente. El mPEG2-Butiraldehído ramificado (10.9 mg) atemperado fue disuelto en 1 mL de 2mM HCl para formar una solución de mPEG2-Butiraldehído ramificado. La solución de mPEG2-Butiraldehído ramificado fue añadida a una alícuota de la solución de Factor IX stock que contenía 0.07 mg de Factor IX hasta alcanzad un exceso molar de mPEG2-butiraldehído ramificado al Factor IX. Después de treinta minutos de mezclado, un agente reductor, NaCNBH3 (disuelto en lx PBS) , fue añadido en exceso en relación con el mPEG2-Butiraldehído ramificado (con the pH evaluado y ajustado para asegurar la reducción al amino secundario) . La solución fue entonces revuelta durante la noche a 4°C para asegurar el acoplamiento a través el enlace amino. [00233] RP-HPLC (C3) y a SDS PAGE fueron usados para la caracterización de la solución de conjugado resultante. Con base en los resultados del SDS PAGE, no se detectó conjugación. Véase el espacio etiquetado como "20:1 20K BYA" en el gel provisto como FIG. 4. Se usó RP-HPLC (C3) para separar los componentes de la solución de conjugado resultante y el cromatograma resultante no confirmó la presencia de material conjugado. Véase el cromatograma provisto como FIG. 10. [00234] Se espera que tiempos de reacción más largos, el aumento en las temperaturas y/o múltiples adiciones del reactivo polimérico podrían incrementar el rendimiento. Usando este mismo enfoque, otros conjugados pueden ser preparados usando mPEG2-Butiraldehído ramificado teniendo otros pesos moleculares promedio de peso.

Ejemplo 14 PEGilación de Factor IX con mPEG-SPA, 20kDa (Radio 53:1 Polímero al Factor IX; sin etanol) mPEG-SPA, 20kDa [00235] El mPEG-SPA, 20kDa, almacenado a -20°C bajo argón, fue calentado a temperatura ambiente. El mPEG-SPA (5.4 mg) atemperado fue disuelto en 1 mL de 2mM HCl para formar una solución mPEG-SPA. La solución mPEG-SPA fue añadida a una alícuota de la solución de Factor IX que contenía 0.07 mg de Factor IX hasta alcanzar un exceso molar de 53 mPEG-SPA en relación con el Factor IX. Después de la adición del mPEG-SPA, el pH de la mezcla de reacción fue evaluado para asegurar un pH de 7.2 a 7.5. Para permitir el acople de mPEG-SPA al Factor IX a través de un enlace amida, la solución de reacción fue revuelta durante dos horas a temperatura de habitación. Se permitió que continuara el acople revolviendo la solución de reacción durante la noche a 4°C, resultando de esa manera una solución de conjugado. [00236] RP-HPLC (C3) y un segundo SDS PAGE fueron usados para la caracterización de la solución de conjugado resultante. Con base en los resultados del SDS PAGE, se verificó la conjugación. Vea el espacio etiquetado como "53:1 20K SPA" en el gel provisto como FIG. 4. RP-HPLC (C3) fue usado para separar los componentes de la solución de conjugado resultante y el cromatograma resultante indicó aproximadamente 60% de rendimiento de conjugación (comprendiendo 5 1.9% monoPEGilizado o especie "1- mer" y 8% diPEGylated o especie "2-mer"). Véase el cromatograma provisto como FIG. 11. Se cree, sin embargo, que el rendimiento real puede ser algo más bajo debido al exceso relativamente alto de reactivo polimérico. [00237] Usando este mismo enfoque, otros conjugados pueden ser preparados usando mPEG-SPA teniendo otros pesos moleculares promedio de peso.

Ejemplo 15 PEGilación de Factor IX con mPEG.-SPA, 20kDa (Radio de 110:1 Polimero al Factor IX; sin etanol) mPEG-SPA, 20kDa [00238] El mPEG-SPA, 20kDa, almacenado a -20°C bajo argón, fue calentado a temperatura ambiente. El mPEG-SPA (5.4 mg) atemperado fue disuelto en 1 mL de 2mM HCl para formar una solución mPEG-SPA. La solución mPEG-SPA fue añadida a una alícuota de la solución de Factor IX que contenía 0.07 mg de Factor IX hasta alcanzar un exceso molar de 110 de mPEG-SPA en relación con el Factor IX. Después de la adición del mPEG-SPA, el pH de la mezcla de reacción fue evaluado para asegurar un pH de 7.2 a 7.5. Para permitir el acople de mPEG-SPA al Factor IX a través de un enlace amida, la solución de reacción fue revuelta durante dos horas a temperatura de habitación. Se permitió que continuara el acople revolviendo la solución de reacción durante la noche a 4°C, resultando de esa manera una solución de conjugado. [00239] El RP-HPLC (C3) y un segundo SDS PAGE fueron usados para la caracterización de la solución de conjugado resultante. Con base en los resultados del SDS PAGE, se verificó la conjugación. Véase el espacio etiquetado "110:1 20K SPA" en el gel provisto como FIG. 4. RP-HPLC (C3) fue usado para separar los componentes de la solución de conjugado resultante y el cromatograma resultante indicó aproximadamente 44% de rendimiento de conjugación (representando aproximadamente 100% monoPEGilizado o "especie 1-mer"). Véase el cromatograma provisto como FIG. 12. Se cree sin embargo, que el rendimiento real puede ser algo inferior debido al exceso de reactivo polimérico, relativamente grande . [00240] Usando este mismo enfoque, otros conjugados pueden ser preparados usando mPEG-SPA teniendo otros pesos moleculares promedio de peso. Ejemplo 16 PEGilación de Factor IX con mPEG-Butiraldehído Ramificado, 20kDa (Radio 20:1 Polímero al Factor IX; con etanol) H3C-f-OCH2CH2)-NH-C~0- Q " O ~OCH£CHsCHa-C~NH-(-CH2CH2?)-CHgCH2CH2CHO H3C OCH2CH3)-NH-C"0-J MPEG2-Butiraldehído, 20kDa ramificado [00241] Puesto que se cree que el etanol incrementa la flexibilidad estructural de ciertas proteínas, se introdujo etanol en el búfer y sistema de reacción. mPEG2-Butiraldehído ramificado, 20kDa, almacenado a -20°C bajo argón, fue calentado a temperatura ambiente. El mPEG2-Butiraldehído ramificado (10.9 mg) atemperado fue disuelto en 1 mL de 2mM HCl con etanol añadido para formar una solución de mPEG2-Butiraldehído ramificado con etanol al 10%: La solución de mPEG2-Butiraldehído ramificado con etanol al 10% fue añadida a una alícuota de la solución de Factor IX que contenía 0.07 mg de Factor IX hasta alcanzar un exceso molar de veinte mPEG2-butiraldehído ramificado al Factor IX. Después de treinta minutos de mezclado, un agente reductor, NaCNBH3 (disuelto en Ix PBS) , fue añadido en exceso en relación con mPEG2-Butiraldehído ramificado (con el pH evaluado y ajustado como fue necesario para asegurar la reducción al amino secundario) . La solución fue revuelta entonces durante la noche a 4°C para asegurar el acople a través de un enlace amino . [00242] RP-HPLC (C3) y un SDS PAGE fueron usados para la caracterización de la solución de conjugado resultante. Con base en los resultados del SDS PAGE, no se detectó conjugación. Véase la sección etiquetada como '20:1 20K BYA + EtOH" en el gel provisto como FIG. 4. RP-HPLC (C3) confirmó la ausencia de material conjugado detectable (los resultados no fueron mostrados) . Ahora se cree que la introducción de etanol no incrementa la flexibilidad estructural del Factor IX para permitir el aumento de la conjugación de mPEG2-Butiraldehído ramificado. [00243] Se espera que tiempos de reacción más largos, el aumento en las temperaturas y/o múltiples adiciones del reactivo polimérico podrían incrementar el rendimiento. Usando este mismo enfoque, otros conjugados pueden ser preparados usando mPEG2-Butiraldehído ramificado teniendo otros pesos moleculares promedio de peso. Ejemplo 17 PEGilación de Factor IXa con mPEG-SBA mPEG-Succinimidilo butanoato, con un peso molecular de 10,000 daltones es obtenido de Nektar Therapeutics, (Huntsville, AL) . La estructura básica del reactivo polímero es provisto en la parte de abajo: [00244] Si es liofilizado, el Factor IXa es disuelto en búfer libre de amina como el fosfato para resultar en un pH final de 7.2-9. A esta solución entonces se añade un exceso molar en pliegue de 1.5 a 10- de mPEG-SBA. La mezcla resultante es revuelta a temperatura de habitación por varias horas . [00245] La mezcla de reacción es analizada por SDS-PAGE para determinar el grado de PEGilación de la proteína. Ejemplo 18 PEGilación de Factor IX con mPEG-PIP, 5K O OT3Q-(GH2CH20)aCH2CH2-c C-N o [00246] El reactivo polimérico presedente, mostrado al mismo tiempo como la ketona y como el ketal correspondiente, es preparada como se describe en la Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. No. 2005/0031576. [00247] Para preparar el reactivo polimérico precedente, a una solución de metoxiglicol de polietileno-succinimidilo propionato con un peso molecular en promedio de peso de 5,000 daltones (1.0 g, 0.002 moles) en cloruro de metileno (20 ml) , triethyl amina (0.084 ml, 0 . 006 moles) y hidrocloruro monohidrato de piperidona 4 (0.077g, 0.005 moles) son añadidos. La mezcla de reacción es revuelta a temperatura de habitación bajo una atmósfera de nitrógeno durante la noche y entonces purificada antes de su conjugación. Alternativamente el reactivo polímero puede ser comprador de Nektar Therapeutics . [00248] Para efectuar la conjugación a una solución de Factor IX en büfer acuoso se añade un exceso molar plegado de 20-mPEG-PIP, 5K. La solución resultante es puesta en un agitador orbital Roto Mix™ (Thermolyne Corp., Dubuque, IA) configurado a una velocidad baja para facilitar la reacción a temperatura de habitación. Después de 15 minutos, NaCNBH3 acuoso es añadido en una cantidad igual a un exceso molar plegado de 50 en relación con el Factor IX. Se retiran alícuotas de la mezcla de reacción en espacios de tiempo programados y son analizados por SDS-PAGE (usando geis disponibles de Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) . [00249] El análisis SDS-PAGE indica la presencia de derivados PEG de Factor IX con 1, 2, y 3 fracciones PEG adjuntas . Ejemplo 19 Conjugación de Factor IX con cisteína insertada, con mPEG-MAL, 20K [00250] Factor IX es insertado con uno o más residuos de cisteína de acuerdo con el proceso descrito en WO 90/12874. [00251] Antes de la conjugación, se desarrolla un intercambio de búfer para Factor IX, para reemplazar la histidina con HEPES. [00252] mPEG-MAL, 20K, almacenado a -20 °C bajo argón, es calentado a temperatura ambiente. El reactivo mPEG-MAL (4.4 mg) atemperado es disuelto en 0.044 ml de búfer HEPES [50 mM HEPES (u otro búfer conveniente) pH 7.0] para hacer una solución de mPEG-MAL al 10%. La solución de mPEG-MAL es rápidamente añadida a 4 ml de la solución de Factor IX [0.4324 mg/ml en 50 mM [TEPES (u otra fórmula conveniente) pH 7.0] y es bien mezclada. Después de 30 minutos de reacción de temperatura de habitación, la redoma de reacción es transferida al cuarto frío (4°C) , y otra solución de 0.044 ml de mPEG-MAL es añadida a la mezcla de reacción, seguida por la adicción de tres alícuotas adicionales de 0.044 ml de mPEG-MAL durante el curso de dos horas. El pH es determinado (pH 7.0+0.2) . El radio molar de mPEG-MAL a la proteína es 50:1. La concentración final mPEG-MAL es de 5.213 mg/ml, y la concentración final de Factor IX es 0.410 mg/ml. Se permite que la reacción suceda durante la noche a 4°C, en Rotomix (baja velocidad, Thermolyne) . [00253] La mezcla de conjugado es purificada usando cromatografía de filtración de gel . Un método de cromatografía de exclusión de tamaño es desarrollado para analizar las mezclas de reacción, los productos finales. El análisis SDS-PAGE también es usado para la caracterización de las muestras .

Ejemplo 20 Actividad in vitro de conjugados ejemplares de Factor IX-PEG [00254] La actividad biológica de cada uno de los conjugados de Factor IX-PEG descritos en los ejemplos 1, 2, 3, 9, 14 y 15 es determinada. Todos los conjugados de Factor IX-PEG evaluados son determinados como poseyendo algún grado de actividad de Factor IX.

LISTA DE SECUENCIA SEQ. ID. NO. 1 (abreviación de una sola letra) : Secuencia de aminoácidos del Factor IX en los humanos 1 -nqrvnrníxae =p liticll gyllsaactv fleüíenanki Isrp ryr-sg kléefvqgal SI Grßaineekss feearevfan tßrteefwkq yvdg qsQsn pdng?r=ckd ai?-syec cp 121 fgfegkncel fivtcsikngr seqfokpsgá, nlcwcssteg yrlaertcrfcsc epavpfpcgr 181 -vsvsq-.sj.lt raeavfpdvd yvnsteaefci lanítgs gs f?idffcrwgg 241 s lngkyda edakpgqfpw fcggaivnek t?iv aal?cve tegvkífcwag shnisQtsht 301 jjiumyna--.il, eq rnvirii k nhdialle ldeplvlnay vfcpiciaakQ 351 h grsalvlq y niflkE^s gyvsgwgrvf ylrvplvd?a telrst f fci yrum£t.ag h eggrdscetgei 421 gtsfltß±is goeca-ekg-k sggplavfceve ygiytkvsry ?n?/ikektkl t

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención se considera como novedad y por lo tanto se reclama como propiedad lo descrito en las siguientes reivindicaciones. REIVINDICACIONES

1. Un conjugado que comprende una fracción de Factor IX enlazada de manera covalente, ya sea directamente o a través de una fracción espaciadora compuesta por uno o más átomos, a un polímero soluble en agua, donde el peso molecular del polímero soluble en agua es mayor que 5,000 daltones y menor que cerca de 150,000 daltones.

2. Un conjugado que comprende una fracción de Factor IX enlazada de manera covalente a un residuo de aminoácido, ya sea directamente o a través de una fracción espaciadora compuesta por uno o más átomos, a un polímero soluble en agua, donde el residuo aminoácido no está enlazado ni directamente ni a través de la fracción espadadora, mediante -CH2-C(0) -O-, -N(H) -C (O) CH2-0- , - C(0)-N(H)-, -N(H) -C(0) -CH2-0-, -C (O) -CH2-0- , -C(0)-CH2- CH2-C(0)-0-, un enlace diazo o triacina.

3. Un conjugado que comprende una fracción de Factor IX enlazada de manera covalente, ya sea directamente o a través de una fracción espaciadora constituido por dos o más átomos, a un polímero no lineal soluble en agua.

4. El conjugado de la declaración de reivindicación 1, 2 ó 3, donde el polímero soluble en agua en cada conjugado es seleccionado del grupo que consta de un óxido polialquileno, pirrolidona de polivinilo, alcohol de polivinilo, polioxazolina y poliacriloil morfolina.

5. El conjugado de la declaración de reivindicación 4, donde cada polímero soluble en agua es un óxido polialquileno.

6. El conjugado de la declaración de reivindicación 5, donde cada óxido polialquileno es un glicol de polietileno.

7. El conjugado de la declaración de reivindicación 6, donde el glicol de polietileno es de terminación cubierta con una fracción de terminación cubierta, seleccionado del grupo que consta de hidroxi, alkoxi, alkoxi sustituido, alkenoxi, alkenoxi sustituido, alquinoxi, alquinoxi sustituido, ariloxi y ariloxi sustituido.

8. El conjugado de la declaración de reivindicación 6, donde el glicol de polietileno es de terminación cubierta con metoxi .

9. El conjugado de la declaración de reivindicación 2 ó 3, donde el polímero soluble en agua tiene un peso molecular total en promedio de peso que está en el rango de: desde mayor de 5,000 daltones hasta cerca de 150,000 daltones .

10. El conjugado de la declaración de reivindicación 6, donde el glicol de polietileno tiene un peso molecular total en promedio de peso que está en el rango de : desde cerca de 6,000 daltones hasta cerca de 100,000 daltones.

11. El conjugado de la declaración de reivindicación 10, donde el glicol de polietileno tiene un peso molecular total en promedio de peso en el rango de: desde cerca de 10,000 daltones hasta cerca de 85,000 daltones.

12. El conjugado de la declaración de reivindicación 11, donde el glicol de polietileno tiene un peso molecular total en promedio de peso en el rango de: desde cerca de 20,000 daltones hasta cerca de 85,000 daltones.

13. El conjugado de la declaración de reivindicación 1 ó 2 , donde cada polímero soluble en agua es lineal .

14. El conjugado de la declaración de reivindicación 1 ó 2, donde cada polímero soluble en agua es ramificado.

15. El conjugado de la declaración de reivindicación 1, 2 ó 3 , donde la fracción de Factor IX es seleccionada del grupo que consta de Factor IX, Factor IXa, y fragmentos biológicamente activos, variantes de eliminación, variantes de sustitución, o variantes de adición de cualquiera de las anteriores.

16. El conjugado de la declaración de reivindicación 15, donde la fracción de Factor IX es Factor IX.

17. El conjugado de la declaración de reivindicación 16, donde la fracción de Factor IX es Factor IXa.

18. El conjugado de la declaración de reivindicación 6, donde la fracción de Factor IX es derivado por recombinación.

19. El conjugado de la declaración de reivindicación 6, donde la fracción de Factor IX es derivado de la sangre.

20. El conjugado de la declaración de reivindicación 6, donde no más de tres polímeros solubles en agua son enlazados la fracción de Factor IX.

21. Una composición que comprende una pluralidad de conjugados, donde por lo menos cerca del 80% de todos los conjugados en la composición está conformado por una fracción de Factor IX enlazada de manera covalente a uno, dos, tres ó cuatro polímeros solubles en agua, y donde además por cada polímero soluble en agua que está en el conjugado, la fracción de Factor IX está enlazada a el polímero soluble en agua ya sea directamente o a través de una fracción espaciadora compuesta por uno o más átomos .

22. Una composición que comprende una pluralidad de conjugados, donde por lo menos cerca del 85% de todos los conjugados en la composición tiene de uno a tres polímeros solubles en agua cada uno, enlazada de manera covalente a una fracción de Factor IX, donde cada polímero soluble en agua tiene un peso molecular en promedio de peso en el rango de: desde mayor que 5,000 daltones hasta cerca de 150000 daltones.

23. Una composición que comprende una pluralidad de conjugados de fracción de Factor IX monoPEGilizado, donde por menos cerca de 85% de los conjugados en la composición son conjugados de fracción de Factor IX monoPEGilizado.

24. La composición de la declaración de reivindicación 21, 22 ó 23, donde el polímero soluble en agua en cada conjugado es seleccionado del grupo que consta de óxido polialquileno, pirrolidona polivinílica, alcohol polivinílico, polioxazolina, y poliacriloil morfolina.

25. La composición de la declaración de reivindicación 24, donde cada polímero soluble en agua es un óxido polialquileno .

26. La composición de la declaración de reivindicación 25, donde cada óxido polialquileno es un glicol de polietileno.

27. La composición de la declaración de reivindicación 26, donde el glicol de polietileno está protegido en sus terminaciones con una fracción protectora de terminación seleccionada del grupo que consta de hidroxi, alkoxi, alkoxi sustituido, alkenoxy, alkenoxy sustituido, alquinoxi, alquinoxi sustituido, ariloxi y ariloxi sustituido.

28. La composición de la declaración de reivindicación 26, donde el glicol de polietileno es de terminación cubierta con metoxi .

29. La composición de la declaración de reivindicación 21 ó 23, donde el polímero soluble en agua tiene un peso molecular total en promedio de peso en el rango de : desde más de 5,000 daltones hasta cerca de 150,000 daltones .

30. La composición de la declaración de reivindicación 26, donde el glicol de polietileno tiene un peso molecular total en promedio de peso en el rango de: desde cerca de 6,000 daltones hasta cerca de 100,000 daltones.

31. La composición de la declaración de reivindicación 30, donde el glicol de polietileno tiene un peso molecular total en promedio de peso en el rango de desde cerca de 10,000 daltones hasta cerca de 85,000 daltones.

32. La composición de la declaración de reivindicación 31, donde el glicol de polietileno tiene un peso molecular total en promedio de peso en el rango de desde cerca de 20,000 daltones hasta cerca de 85,000 daltones.

33. La composición de la declaración de reivindicación 6, donde cada polímero soluble en agua es lineal .

34. La composición de la declaración de reivindicación 6, donde cada polímero soluble en agua es ramificado.

35. La composición de la declaración de reivindicación 21, 22 ó 23, donde la fracción de Factor IX es seleccionada del grupo que consta de Factor IX, Factor IXa, y fragmentos biológicamente activos, variantes de eliminación, variantes de sustitución, o variantes de adición de cualquiera de las anteriores.

36. La composición de la declaración de reivindicación 35, donde la fracción de Factor IX es Factor IX.

37. La composición de la declaración de reivindicación 35, donde la fracción de Factor IX es Factor IXa.

38. La composición de la declaración de reivindicación 26, donde la fracción de Factor IX es derivado por recombinación.

39. La composición de la declaración de reivindicación 26, donde la fracción de Factor IX es derivado de la sangre .

40. La composición de las declaraciones de reivindicación 21 ó 22, donde no más de tres polímeros solubles en agua están enlazados al fracción de Factor IX.

41. La composición de la declaración de reivindicación 26, donde la composición está sustancialmente libre de albúmina.

42. La composición de la declaración de reivindicación 26, donde la composición está sustancialmente libre de proteínas que no tienen actividad de Factor IX.

43. La composición de la declaración de reivindicación 26, donde la composición está sustancialmente libre de polímeros solubles en agua no enlazados de manera covalente .

44. La composición de la declaración de reivindicación 26, en forma liofilizada.

45. La composición de la declaración de reivindicación 26, en la forma de un líquido.

46. La composición de la declaración de reivindicación 26, comprendiendo además un excipiente farmacéuticamente aceptable .

47. La composición de la declaración de reivindicación 23, donde cada conjugado de fracción de Factor IX monoPEGilizado comprende una fracción de Factor IX enlazada de manera covalente, ya sea directamente o a través de una fracción espaciadora compuesta por uno o más átomos, al polímero soluble en agua.

48. La composición de la declaración de reivindicación 21, 22 ó 26, donde cada conjugado comprende un enlace amida, enlazando el fracción de Factor IX, sea al polímero soluble en agua o fracción espaciadora.

49. La composición de la declaración de reivindicación 21, 22 ó 26 donde cada conjugado comprende un enlace amina secundario que enlaza la fracción de Factor IX, ya sea al polímero soluble en agua o fracción espaciadora.

50. La composición de la declaración de reivindicación 21, 22 ó 26, donde cada conjugado comprende un enlace de carbamato que une la fracción de Factor IX, ya sea al polímero soluble en agua o fracción espaciadora.

51. La composición de la declaración de reivindicación 21, 22 ó 26, donde cada conjugado comprende un enlace tioéter que une la fracción de Factor IX, ya sea al polímero soluble en agua o fracción espaciadora.

52. La composición de la declaración de reivindicación 21, 22 ó 26, donde cada conjugado comprende un enlace disulfido que une la fracción de Factor IX, ya sea al polímero soluble en agua o fracción espaciadora.

53. Un método para hacer un conjugado que comprende el contacto, bajo condiciones de conjugación, entre una fracción de Factor IX y un reactivo polimérico.

54. El método de la declaración de reivindicación 53, donde no se añade alcohol adicional .

55. El método de la declaración de reivindicación 53, donde no se realiza un paso de oxidación.

56. Un método para hacer un conjugado que comprende la adición de una composición de reactivo polimérico a una composición de Factor IX bajo condiciones suficientes para dar como resultado en un conjugado que comprende una fracción de Factor IX enlazada de manera covalente, ya sea directamente o a través de una fracción espaciadora compuesta por uno o más átomos, a un polímero soluble en agua.

57. El método de la declaración de reivindicación 56, donde no se añade alcohol adicional .

58. El método de la declaración de reivindicación 56, donde no se desarrolla un paso de oxidación.

59. Un método para la administración o entrega de un conjugado, comprendiendo el método la administración a un paciente, una composición de la declaración de reivindicación 46.

60. El método de la declaración de reivindicación 59, llevado a cabo por inyección subcutánea.

61. El método de la declaración de reivindicación 59, donde el paciente sufre de hemofilia B.

62. El método de la declaración de reivindicación 59, donde al paciente se le administra la composición dentro del marco de dos días antes de pasar por una cirugía