MXPA06012511A - Vectores virales polivalentes y un sistema para su produccion. - Google Patents

Abstract

Se provee un sistema para generar vectores virales que llevan dos casetes de expresion distintos; el sistema utiliza un vector de transferencia polivalente unico que permite la deteccion y seleccion eficientes de los casetes de expresion insertados.

Description

También se proveen métodos para generar partículas virales polivalentes que utilizan las estructuras polivalentes de la invención. Estas y otras modalidades y ventajas de la invención se describen más abajo en mayor detalle.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS La figura 1 ilustra el ensamble de los vectores adenovirales AE ??3. La figura 2 ¡lustra la introducción de antígenos en los locus de supresión de E1 y E3 de los vectores adenovirales. La figura 3 es un diagrama de barras que provee los resultados de una comparación in vivo de la expresión de un adenovirus recombinante C9 de chimpancé, que expresa el mismo transgen (a1AT) del locus E1 solo (barras oscuras), o de los locus de E1 y E3 (barras claras).

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La presente invención provee un sistema para generar un vector viral que lleva casetes de expresión múltiples hacia un objetivo. El sistema utiliza una molécula de ADN que lleva un genoma viral que contiene casetes de clonación movibles, que llevan genes marcadores. Esta molécula de ADN se usa para generar un vector de transferencia que lleva un genoma viral que contiene múltiples casetes de expresión heterólogos localizados en locus diferentes dentro del genoma viral. El genoma viral que lleva los casetes de expresión heterólogos es rescatado del vector de transferencia de la invención, y es empaquetado en una cápside viral o proteína de envoltura adecuada para producir vectores virales polivalentes. Como se usa aquí, la molécula de ADN y/o vector de transferencia se pueden derivar de cualquier elemento genético que pueda llevar el genoma viral de acuerdo con la invención, y que sea capaz de transferir el genoma a una célula hospedera. Se puede seleccionar cualquier elemento (o estructura) genético adecuado, que incluye, por ejemplo, un plásmido, fago, transposón, cósmido, episoma, y similares. En una modalidad, el elemento genético es adecuado para expresión procariótica, aunque se pueden utilizar otros sistemas de clonación. Como se usa aquí, el término "locus diferentes" indica que el cásete de expresión heterólogo para un primer producto objetivo seleccionado, está localizado en la estructura viral en un sitio que no es contiguo a un segundo cásete de expresión heterólogo; esto es, están localizadas secuencias virales entre los casetes de expresión heterólogos. Estos locus pueden estar en regiones de gen diferentes o en marcos de lectura abiertos diferentes dentro de una sola región del gen. Alternativamente, los locus múltiples pueden estar dentro de un solo marco de lectura abierto, pero no son contiguos entre sí; por ejemplo, están separados por espaciadores, secuencias nativas, sitios de enzimas de restricción o similares. Como se usa aquí, un "cásete de expresión" comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un producto para suministro a una célula hospedera. La secuencia de ácido nucleico que codifica el producto está bajo el control de secuencias de control reguladoras que dirigen la expresión del producto en el hospedero. Convenientemente, el cásete de expresión es heterologo con respecto a las secuencias de vector que flanquean el cásete. En una modalidad, los elementos de control reguladores de cada cásete de expresión heterologo difieren de los elementos de control reguladores de los otros casetes de expresión heterólogos para minimizar (o eliminar) el riesgo de recombinación homologa durante el proceso de clonación y en el proceso de manipulación viral en las células. En una modalidad, cada cásete de expresión heterologo está provisto de promotores y/o incrementadores y/o secuencias de poli-A diferentes. Sin embargo, en otras modalidades, un cásete de expresión heterologo en un vector polivalente de la invención, puede tener uno o más elementos de control reguladores en común con otro cásete de expresión heterologo en el vector polivalente. En dicha modalidad, el elemento de control regulador es preferiblemente una secuencia corta que no permite la recombinación. Como se describe aquí, el producto codificado puede proveer un objetivo para el sistema inmune para inducir una respuesta inmune humoral y/o celular; puede ser un adyuvante para otro producto codificado; puede proveer un efecto modulador inmune; y/o puede proveer un efecto terapéutico.

Combinaciones de estos productos pueden ser suministradas en un vector viral polivalente de acuerdo con la invención. El término "suprimido funcionalmente" o "supresión funcional" significa que una cantidad suficiente de la región del gen es removida o dañada de otra manera, por ejemplo por mutación o modificación, de tal manera que la región del gen ya no es capaz de producir productos funcionales de la expresión del gen. Si se desea, se puede remover la región de gen completa. Otros sitios adecuados para rompimiento o supresión del gen se exponen en otra parte de la solicitud.

I. Construcción Viral Polivalente A. Molécula de ADN que lleva un genoma viral y múltiples genes reporteros En un aspecto, la presente invención provee una molécula de ADN que lleva secuencias de un virus que se van a empaquetar en un vector viral polivalente. En una modalidad, dicha molécula de ADN es un plásmido. Sin embargo, se puede seleccionar otro elemento genético adecuado como se define arriba. La introducción del vector en una célula se puede lograr mediante cualquier método conocido o como se describe en la presente, incluyendo transfección. Las secuencias virales se seleccionan de los tipos de virus que se desean usar como vehículo de suministro y que tengan suficiente espacio para acomodar múltiples casetes de expresión. Estas secuencias virales se pueden seleccionar fácilmente de entre varios virus que tienen una proteína de cápside, por ejemplo, adenovirus, o de virus envueltos, por ejemplo retrovirus tales como el virus de la leucemia felina (VLFe), HTL VI y HTL VII, y lentivirinae [por ejemplo, el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus de la inmunodeficiencia de simio (VIS), virus de la inmunodeficiencia felina (VI F), virus de la anemia infecciosa equina y spumavirinae], poxvirus (por ejemplo, viruela del canario), entre otros. Otros virus más pueden ser seleccionados fácilmente por el experto en la materia. En una modalidad, las secuencias virales son de un adenovirus.

Convenientemente, la molécula de ADN polivalente contiene secuencias de ácido nucleico de un genoma adenoviral que contiene por lo menos las secuencias necesarias para empaquetar el genoma viral en una cápside. Normalmente una molécula adenoviral polivalente contendrá los elementos adenovirales cis 5' y los elementos adenovirales cis 3' en el extremo 5' y los extremos 3' del genoma adenoviral, respectivamente. El extremo 5' del genoma adenoviral contiene los elementos cis 5' necesarios para empaquetamiento y duplicación, esto es, las secuencias 5' de repetición terminal invertida (ITR) (que funcionan como orígenes de duplicación), y los dominios incrementadores de empaquetamiento 5' (que contienen las secuencias necesarias para empaquetar los genomas Ad lineales y elementos incrementadores para el promotor de E1 ). El extremo 3' del genoma adenoviral incluye los elementos cis 3' (que incluyen las ITRs) necesarios para empaquetamiento y encapsulación. Además, la molécula de ADN polivalente puede contener secuencias adenovirales adicionales, o puede estar suprimido por lo menos funcionalmente de una o más regiones del gen adenoviral. En una modalidad, un vector adenoviral usado en la invención contendrá la región E2 o una porción funcional de la misma (por ejemplo, la región que codifica E2a y/o E2b), y uno o más de los genes tardíos, por ejemplo L1 , L2, L3, L4 y L5. En algunas modalidades, los vectores de adenovirus usados en la invención contendrán toda la región E4 o una porción de la misma (por ejemplo, el ORF6 de E4). Por ejemplo, se puede eliminar de la secuencia de adenovirus todo el gen temprano retrasado E3 de adenovirus, o una parte del mismo, que forma parte del vector. Se cree que la función del E3 de simio es irrelevante para la función y producción de la partícula de virus recombinante. Por ejemplo, se puede construir un vector Ad E1 -suprimido que tenga una supresión de por lo menos la región ORF6 del gen E4, o debido a la redundancia en la función de esta región, toda la región E4. Otro vector de esta invención contiene una supresión en el gen temprano retrasado E2a. Convenientemente, estos vectores retienen los genes tardíos (es decir, L1 , L2, L3, L4 y L5), y otros elementos esenciales para el empaquetamiento de los vectores adenovirales en partículas virales. También se pueden hacer supresiones en los genes intermedios IX y IVa2 con el mismo fin. Se pueden hacer otras supresiones en los otros genes de adenovirus estructurales o no estructurales. Las supresiones anteriormente mencionadas se pueden usar individualmente; esto es, una secuencia de adenovirus para usar en la presente invención puede contener supresiones únicamente en una región. Alternativamente se pueden usar supresiones de genes completos o porciones de los mismos, eficientes para destruir su actividad biológica en cualquier combinación. Por ejemplo, en un vector ejemplar, la secuencia de adenovirus puede tener supresiones en los genes E1 y el gen E4, o los genes E1 , con o sin la supresión de E3, y así sucesivamente. En otra modalidad, se utiliza un genoma lentiviral. Normalmente un plásmido de vector lentiviral contiene secuencias genéticas de acción c/'s necesarias para que el vector infecte la célula objetivo y transfiera los casetes de expresión heterólogos. Convenientemente, las proteínas de envoltura originales y el promotor de secuencia gag han sido removidos. Las secuencias virales en la estructura de plásmido no están limitadas por el tipo de cápside o envoltura en la que se insertan. De esta manera, la estructura de plásmido puede contener secuencias virales de una fuente viral que es encapsulada o empaquetada en una envoltura de otra fuente. Por ejemplo, un vector de VIH polivalente se puede empaquetar en una envoltura de VIF; un vector de VIF polivalente se puede empaquetar en una envoltura de VIH; un vector adenoviral polivalente se puede empaquetar en una cápside de otro serotipo. Otros seudotipos de vectores virales serán muy evidentes para el experto en la materia. Una vez que las secuencias virales se clonan en un plásmido usando las técnicas conocidas, el genoma viral se altera para contener un primer cásete movible localizado en una primera región suprimida de un genoma viral, y un segundo cásete movible localizado en una segunda región suprimida de un genoma viral. Opcionalmente, el plásmido puede contener múltiples casetes movibles, cada uno localizado en distintos locus del genoma viral. Cada cásete movible está flanqueado por un grupo único de sitios de enzima de restricción que permiten su remoción selectiva del plásmido y una fácil inserción de un cásete de expresión heterólogo. Cada uno de los casetes movibles usados en la invención contiene secuencias de ácido nucleico de un gen reportero detectable, ligado operativamente a secuencias que dirigirán la expresión directa del mismo en una célula hospedera. Convenientemente, cada uno de los casetes movibles contiene un gen reportero único que es fácilmente distinguible de los genes reporteros llevados por otros casetes movibles llevados por la estructura de plásmido. En una modalidad, los genes reporteros expresan productos que se diferencian unos de otros por medio del color. Los genes reporteros adecuados incluyen los que codifican productos que se pueden distinguir de otros genes reporteros llevados por la estructura de plásmido polivalente de la invención. Por ejemplo, las proteínas fluorescentes son distinguibles por color después de excitarlas con la longitud de onda de luz apropiada, que incluyen por ejemplo la proteína fluorescente verde, proteína fluorescente roja, proteína fluorescente azul, proteína fluorescente ciánica, proteína fluorescente amarillo-verde. Las proteínas fluorescentes adecuadas para usar en el tipo seleccionado de célula hospedera están disponibles comercialmente, por ejemplo de ClonTech. Otros genes reporteros adecuados que son distinguibles por color incluyen, por ejemplo, gusA (azul); DsRed (rojo); luciferasa (rojo); y beta-galactosidasa. Alternativamente, el experto en la materia puede proveer otro gen reportero que esté provisto con una marca o etiqueta, muchos de los cuales son conocidos para el experto en la materia. Los genes reporteros adecuados se seleccionan tomando en cuenta el sistema de célula hospedera usado para la clonación. La célula hospedera misma se puede seleccionar de cualquier organismo biológico, que incluye células procarióticas (por ejemplo, bacterianas) y células eucarióticas, que incluyen células de insecto, células de levadura y células de mamífero, como se describe más abajo en mayor detalle. En una modalidad particularmente deseable se usa un sistema procariótico. Además, la célula hospedera es susceptible de transfección de ADN y expresión del ADN transfectado, y es capaz de expresar el gen reportero seleccionado de la manera que se desea, por ejemplo, colorimétricamente. Los ejemplos de sistemas procarióticos adecuados son muy conocidos, incluyendo las células bacterianas. Por ejemplo, las cepas bacterianas adecuadas pueden incluir, Escherichia coli C600 - F-, el4, mcrA, thr-1 supE44, thi-1 , leuB6, lacY1 , tonA21 , [[lambda]] [-] [Huynh, Young y Davis (1985) DNA Cloning, Vol. 1 , 56- 10]; DH1 - F[-], recA1 , endA1 , gyrA96, thi-1 , hsdR17 (rk[-], mk[+], supE44, relA1 , [[lambda]][-] [-Hanahan (1983) J. Mol. Biol. 166, 557-580; XL1 Blue-MRF' - D(mcrA)182, D(mcrCB-hsdSMR-mrr) 72, endA1 , supE44, thi-1 , recA, gyrA96, relA1 , lac, 1 -, [F'proAB, lac l[q]ZDM1 5, Tn10 (tet[r])]¡ SURE Cells [Stratagene]; e14(mcrA), D(mcrCB- hsdSMR-mrr)171 , sbcC, recB, recJ, umuC::Tn5 (kan[r]), uvrC, supE44, lac, gyrA96, relA1 , th¡-1 , end A1 [F'proAB, lacl[q]DM 5, Tn10(tet[r])]; GM272 - F[-], hsdR544 (rk[-], mk[-]), supE44, supF58, lacY1 o [[Delta]]laclZY6, galK2, galT22, metBl m, trpR55, [[lambda]][-]; HB101 - F[-], hsdS20 (rb[-], mb[-]), supE44, ara14, galK2, lacY1 , proA2, rpsL20 (str[R]), xyl-5, mtl-1 , [[lambda]][-], recA13, mcrA(+), mcrB(-) [Raleigh y Wilson (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 9070-9074]; JMIOI -supE, thi, [[Delta]](lac-proAB), [F\ traD36, proAB, laclqZ[[Deita]]M15], restricción: (rk[+], mk[+]), mcrA+ [Yanisch-Perron y otros (1985), Gene 33, 103-1 19]; XL-1 blue recA1 , endA1 , gyrA96, thi, hsdR17 (rk[+], mk[+]), supE44, relA1 , [[lambda]][-], lac [F\ proAB, laclqZ[[Delta]]M15, Tn10 (tet[R])] [Bullock y otros (1987), BioTechniques 5, 376-379]; GM2929 [de B. Bachman, Centro de Depósito Genético de E. coli de Yale (CSGC#7080)]; cepa M. Marinus; sex F[-]; (ara-14, leuB6, fhuA 13, lacY1, tsx-78, supE44, [glnV44], ga!K2, galT22, l[-], mcrA, dcm-6, hisG4 [Oc], rfbD1.. rpsL136, dam-13::Tn9, xyl-5, mtl-1, recF143, thi-1, mcrB, hsdR2.); MC1000 - (araD139, D[ara-leu]7679, galU, galK, D[lac]174, rpsL, thi-1); ED8767 (F-, el4-[mcrA],supE44, supF58, hsdS3[rB[-]mB[-]], recA56, galK2, galT22,metB1, lac-3 o lac3Y1. Las células procarióticas hospederas adecuadas están disponibles de la Colección de Cultivos Tipo de Estados Unidos [ATCC], Manassas, Virginia, EE. UU., otros depósitos de células públicos, y una variedad de fuentes académicas y comerciales. La selección de un sistema o célula de clonación adecuado no es una limitación de la presente invención. Cada uno de los casetes movibles usados en la construcción de la invención se flanquea con un grupo único de sitios de enzimas de restricción raras. Cada grupo de sitios de enzimas de restricción raras provee un primer sitio de enzima de restricción rara en el extremo 5' del cásete movible y un segundo sitio de enzima de restricción rara en el extremo 3' del cásete movible. En una modalidad, el grupo de sitios de enzimas de restricción raras permite la clonación direccional de un cásete de expresión en el locus. Sin embargo, la invención no se limita a la dirección del inserto. En otras palabras, el cásete movible y/o cásete de expresión heterólogo se puede localizar, ya sea de 5' a 3', o de 3' a 5', con respecto a la orientación del marco de lectura del génoma viral circundante. Además, en algunas modalidades, el grupo de sitios de enzimas de restricción raras puede permitir la clonación no direccional del cásete de expresión en un locus seleccionado. En un ejemplo, se puede seleccionar la enzima de restricción rara l-Scel para los sitios de enzimas de restricción raras 5' y 3' que componen un solo grupo. Esta enzima permite la clonación direccional, incluso cuando flanquea ambos extremos de un cásete. En otras palabras, I-Scel se puede usar en combinación con otra enzima de restricción rara para formar un grupo de sitios de enzima de restricción. Convenientemente, cada grupo de enzimas de restricción raras es único, para permitir únicamente la digestión de un locus y la inserción fácil de un cásete de expresión heterólogo de un sitio objetivo seleccionado. En una modalidad adicional, la enzima de restricción rara se selecciona de tal manera que únicamente sea cortada la o las localizaciones seleccionadas en el genoma viral; esto es, el corte se hace sólo en los extremos 5' y 3' del cásete movible y/o cásete de expresión heterólogo, y no se corta el elemento genético que lleva el genoma viral, ni otras localizaciones en el genoma viral. En la presente solicitud, dicha enzima de restricción se denomina un cortador raro. Ejemplos de estos cortadores raros incluyen los que tienen sitios de reconocimiento para siete, ocho, o más bases, que incluyen por ejemplo, l-Ceu I, Pl-Sce I, Tevll, Bmol, Dmol, Fsel, Pací, Pmel, Psrl, Bcgl, Bgll, Bsabl, BstXI, Drdl, EcoNI, Fsel, MaM I, Msl I, Mwo I, Psha I, Sfi I, Swa I, Xcm I y Xmn I, y similares. Los cortadores raros adecuados se pueden identificar usando la información fácilmente disponible en la literatura y en una variedad de bases de datos en línea, por ejemplo la base de datos REBASE™. Los cortadores adecuados para el método pueden ser determinados fácilmente usando una variedad de programas de computadora y/o bases de datos en línea. Las enzimas de restricción adecuadas están disponibles de una variedad de fuentes comerciales que incluyen por ejemplo, England Biolabs, Obiogene, Lift Technology, Roche, BB Clontech, Stratagene, Amersham Pharmacia, entre otros. De esta manera, el plásmido polivalente de la invención contiene por lo menos dos casetes movibles, cada uno de los cuales está flanqueado por un grupo único de enzimas de restricción raras que permiten el reemplazo selectivo de los casetes movibles con un cásete de expresión heterólogo. Estos plásmidos polivalentes son transfectados en las células hospederas que permiten la expresión de los marcadores llevados por los casetes movibles.

B. Vector de transferencia polivalente que lleva los casetes de expresión heterólogos Una vez seleccionada la o las enzimas de digestión apropiadas, se utilizan técnicas convencionales de digestión y religación. Normalmente el ADN plasmídico se mezcla con las enzimas de restricción y se incuba durante aproximadamente 12 a 48 horas. Después de esto, se realiza un paso convencional de extracción con fenol/cloroformo. Por ejemplo, se puede utilizar extracción con fenol/cloroformo, seguido por precipitación con etanol, y disolver el precipitado (por ejemplo en TE u otro amortiguador adecuado), para usar en el resto de los pasos del método. Véase, por ejemplo, Sambrook, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2a edición, 5.28-5.32, apéndice E.3-E.4 (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989). Otros métodos adecuados pueden ser provistos por el fabricante o vendedor de la enzima de restricción utilizada, o son conocidos de otra manera por los expertos en la materia. Normalmente, para asegurar la inserción apropiada del cásete de expresión heterólogo, los casetes de expresión heterólogos se flanquean en sus extremos 5' y 3' con sitios de restricción de enzimas de restricción que son complementarios al grupo de sitios de enzimas de restricción que flanquean el cásete movible en el sitio en el que se insertan los casetes de expresión. Así, normalmente, un primer cásete de expresión heterólogo se clona en el sitio del cásete movible cortado. Ventajosamente, el método de la invención permite una identificación rápida de los plásmidos que contienen el primer cásete de expresión heterólogo. Dichos plásmidos carecen de la expresión del primer gen marcador, pero estarán expresando el producto del segundo de gen marcador (así como también cualquier otro producto de gen marcador presente). En otras palabras, si el primer cásete movible expresó la proteína fluorescente verde, la ausencia de color verde después de la digestión y religación, indicará una remoción exitosa del cásete movible en el sitio del primer gen marcador. En una modalidad, los pasos de digestión y religación se repiten secuencialmente para cada uno de los casetes movibles. En otras palabras, se realiza un primer paso de digestión usando un primer grupo de enzimas de restricción para remover un solo cásete movible, para asegurar que el cásete de expresión heterólogo se inserte en el locus deseado. Después se realiza un segundo paso de digestión usando un segundo grupo de enzimas de restricción único para el grupo que flanquea el segundo cásete movible. Un segundo cásete de expresión heterólogo, flanqueado por los sitios de enzima de restricción que corresponden al grupo que flanquea el segundo cásete movible, se liga a la estructura de plásmido, y se seleccionan las clonas que carecen de expresión del segundo gen marcador. Opcionalmente se realizan uno o más pasos de digestión para remover uno o más casetes movibles adicionales. De esta manera, el método de la invención permite la producción eficiente de un vector de transferencia polivalente útil para la producción de partículas virales infecciosas.

II. Método de Producción del Vector Viral Polivalente Usando los métodos conocidos se puede usar un vector de transferencia polivalente de la invención para generar partículas virales que tienen una cápside o una envoltura. Dichos métodos incluyen técnicas de clonación convencionales de ADNc, tales como las que se describen en los textos [Sambrook y otros, anteriormente citados], el uso de secuencias de oligonucleótido traslapadas de genomas de adenovirus, reacción en cadena de polimerasa, y cualquier método adecuado que provea la secuencia de nucleótídos deseada. Se emplean técnicas de transfección y cotransfección estándares, por ejemplo técnicas de precipitación de CaP04. Otros métodos convencionales empleados incluyen la recombinación homologa de los genomas virales, siembra del virus en placas de agar, métodos para medir la generación de señal, y similares. Las líneas celulares adecuadas para producción son seleccionadas fácilmente por un experto en la materia. Por ejemplo, se puede seleccionar una célula hospedera adecuada de cualquier organismo biológico, que incluye células procarióticas (por ejemplo, bacterias), y células eucarióticas, que incluye células de insecto, células de levadura y células de mamífero. Las células hospederas se pueden seleccionar de cualquier especie de mamífero, incluyendo, sin limitación, células como A549, WEH1 , 3T3, 1 OT1/2, HEK 293 o PERC6 (ambas expresan E1 adenoviral funcional) [Fallaux, FJ y otros (1998), Hum Gene Ther, 9:1909-1917], Saos, C2C12, células L, HT1080, HepG2, y células de fibroblasto primario, hepatocitos y células de mioblasto, derivadas de mamíferos que incluyen ser humano, mono, ratón, rata, conejo y hámster. La selección de la especie de mamífero que provee las células no es una limitación de esta invención; ni tampoco el tipo de célula de mamífero, esto es, fibroblasto, hepatocito, célula de tumor, etc. Generalmente, cuando se suministra el vector de transferencia polivalente que comprende los casetes de expresión heterólogos a una célula hospedera mediante transfección, la estructura es suministrada en una cantidad de aproximadamente 5 pg a aproximadamente 100 pg de ADN, o aproximadamente 10 pg a aproximadamente 50 pg de ADN, a una cantidad de aproximadamente 1 x 104 células a aproximadamente 1 x 1013 células, o aproximadamente 105 células. Sin embargo, se pueden ajustar las cantidades relativas de ADN plasmídico para las células hospederas, tomando en cuenta factores tales como el vector seleccionado, el método de suministro y las células hospederas seleccionadas.

Normalmente los vectores de transferencia polivalentes se cultivan en las células hospederas que expresan la proteína de cápside y/o la proteína de envoltura. En las células hospederas, los genomas virales polivalentes que expresan los casetes de expresión heterologos son rescatados y empaquetados en la proteína de cápside o proteína de envoltura, para formar una partícula viral infecciosa.

A. Vectores virales que tienen proteínas de cápside En una modalidad, la invención provee un método para empaquetar un genoma viral polivalente en una cápside viral infecciosa. En una modalidad, la cápside viral deriva de un adenovirus. Una partícula o vector adenoviral de la presente invención está compuesto de una cápside de proteína de adenovirus infeccioso que tiene empaquetado un genoma viral polivalente que contiene dos o más casetes de expresión heterologos, cada uno de estos casetes llevando un producto que se quiere expresar en el hospedero. En una modalidad adicional, estos vectores adenovirales son defectuosos de duplicación, evitando así su duplicación en una célula hospedera. La selección del serotipo de las secuencias adenovirales presentes en el vector no es una limitación de la presente invención. Una variedad de cepas de adenovirus están disponibles de la Colección de Cultivos Tipo de Estados Unidos, Manassas, Virginia, o disponibles a solicitud de una variedad de fuentes comerciales e institucionales. Además, las secuencias de muchas de estas cepas están disponibles de una variedad de bases de datos que incluyen por ejemplo, PubMed™ y GenBank™. Los vectores de adenovirus homólogos preparados de otros adenovirus de simio o humanos se describen en la literatura publicada [véase por ejemplo la patente de EE. U.U. No. 5,240,846]. Las secuencias de ADN de varios tipos de adenovirus están disponibles de GenBank, incluyendo el tipo Ad5 [GenBank™ No. de Registro M73260]. Las secuencias de adenovirus se pueden obtener de cualquier serotipo de adenovirus conocido, tal como los serotipos 2, 3, 4, 7, 12 y 40, incluyendo además cualquiera de los tipos humanos actualmente identificados. Similarmente, también se pueden emplear en las construcciones de vector de esta invención los adenovirus conocidos que infectan a los animales no humanos (por ejemplo, los simios). En una modalidad, por lo menos uno de los adenovirus usados en la invención deriva de un primate no humano. Ejemplos de secuencias de primate no humano adecuadas incluyen los adenovirus de simio, tales como Pan5 (también C5), Pan6 (también C6), Pan7 (también C7), Pan 9 (también C68) y C1 . Se han descrito adenovirus recombinantes para suministrar moléculas a células hospederas. Véase la patente de E.E. U.U. No. 6,083,716, que provee vectores adenovirales derivados de los dos adenovirus de chimpancé C1 y C68 (también denominado Pan 9), y la publicación de patente internacional No. WO 02/33645 [vectores derivados de Pan 5, Pan6, Pan7]. Sin embargo, la invención no está limitada a esto. Los expertos en la materia conocen una variedad de métodos de producción de partículas adenovirales. La selección de los métodos de producción apropiados no es una limitación de la presente invención. Véase por ejemplo, la patente de EE. UU. No. 6,083,716; la publicación de patente internacional No. WO 02/33645; y la solicitud de patente de EE. UU. No. 10/465,302, y su contraparte internacional WO 2005/001 103. Brevemente, un vector de transferencia adenoviral polivalente de la invención que carece de la capacidad para expresar una versión funcional de cualquier producto de gen adenoviral esencial (por ejemplo, E1 a, E1 b, E2a, E2b y/o ORF6 E4), se puede cultivar en presencia de los productos génicos adenoviral faltantes que son requeridos para la infecciosidad viral y la propagación de una partícula adenoviral. Estas funciones ayudadoras pueden ser provistas cultivando la estructura en presencia de una o más construcciones ayudadoras (por ejemplo, un plásmido o virus) o una célula hospedera de empaquetamiento. Véase por ejemplo las técnicas descritas para la preparación de un vector de adenovirus (Ad) humano "mínimo" en la publicación de patente internacional No. WO96/13597, publicada el 9 de mayo de 1996. 1 . Virus Ayudadores De esta manera, dependiendo del contenido génico adenoviral del vector de transferencia polivalente empleado para llevar los casetes de expresión, puede ser necesario un adenovirus ayudador o fragmento de virus no duplicante para proveer las secuencias génicas adenovirales suficientes necesarias para producir una partícula viral recombinante infecciosa que contenga el cásete de expresión. Los virus ayudadores útiles contienen secuencias génicas de adenovirus seleccionadas, no presentes en la construcción de vector de adenovirus y/o no expresadas por la línea celular empaquetada en la que es transfectado el vector. En una modalidad, el virus ayudador es defectuoso de duplicación y contiene una variedad de genes de adenovirus además de las secuencias anteriormente descritas. Dicho virus ayudador se usa deseablemente en combinación con una línea de células que expresan E1. También se pueden formar virus ayudadores en conjugados policatiónicos como se describe en Wu y otros, J. Biol. Chem., 264:16985-16987 (1989); K. J. Fisher y J. M. Wilson, Biochem. J., 299:49 (1 de abril de 1994). Opcionalmente el virus ayudador puede contener un segundo cásete de expresión reportero. Se conocen varios de estos genes reporteros. La presencia de un gen reportero en el virus ayudador que es diferente del producto génico en el vector de adenovirus, permite que tanto el vector de estructura de Ad como el virus ayudador sean monitoreados independientemente. Este segundo reportero se usa para que al purificarse se pueda separar el virus recombinante resultante del virus ayudador. 2. Líneas celulares de complementación Para generar adenovirus recombinantes (Ad) suprimidos en cualquiera de los genes anteriormente descritos, la función de la región del gen suprimido, si es esencial para la duplicación e infecciosidad del virus, debe ser provista al virus recombinante por medio de un virus ayudador o línea celular, esto es una línea celular de complementación o empaquetamiento. En muchas circunstancias se puede usar una línea celular que expresa el E1 humano para transcomplementar el vector Ad de chimpancé. Esto es particularmente ventajoso porque debido a la diversidad entre las secuencias de Ad de chimpancé de la invención y las secuencias de AdE1 humano encontradas en las células de empaquetamiento actualmente disponibles, el uso de las células actuales que contienen E1 humano impide la generación de adenovirus competentes de duplicación durante el proceso de duplicación y producción. Sin embargo, en algunas circunstancias será deseable utilizar una línea celular que exprese los productos del gen E1 para la producción de un adenovirus de simio suprimido en E1. Se han descrito dichas líneas celulares. Véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. No. 6,083,716. Si se desea, se pueden utilizar las secuencias aquí provistas para generar una célula de empaquetamiento o línea celular que exprese como mínimo el gen E1 de adenovirus bajo el control transcripcional de un promotor, para su expresión en una línea celular materna seleccionada. Para esta finalidad se pueden emplear promotores inducibles o constitutivos. Ejemplos de dichos promotores se describen en detalle en otra parte de esta especificación. Se selecciona una célula materna para generar una línea celular novedosa que exprese cualquier gen Ad deseado. Sin limitación, dicha línea celular materna puede ser HeLa [Registro ATCC No. CCL 2], A549 [Registro ATCC No. CCL 185], HEK 293, KB [CCL 17], Detroit [por ejemplo, Detroit 510, CCL 72] y WI-38 [CCI 75], entre otras. Estas líneas celulares están disponibles de la Colección de Cultivos Tipo de Estados Unidos, 10801 Universíty Boulevard, Manassas, Virginia 201 10-2209. Otras líneas celulares maternales adecuadas se pueden obtener de otras fuentes. Estas líneas celulares que expresan E1 son útiles para generar vectores suprimidos en E1 de adenovirus recombinante. Adicionalmente, o alternativamente, la invención provee líneas celulares que expresan uno o más productos génicos adenovirales de simio, por ejemplo E a, E b, E2a y/o ORF6 E4, usando esencialmente los mismos procedimientos usados en la generación de vectores virales recombinantes de simio. Dichas líneas celulares se pueden utilizar para transcomplementar los vectores de adenovirus suprimidos en los genes esenciales que codifican aquellos productos. La preparación de una célula hospedera de acuerdo con esta invención incluye técnicas tales como el ensamble de secuencias de ADN seleccionadas. Este ensamble se puede hacer utilizando las técnicas convencionales. Estas técnicas incluyen la clonación de ADNc y genómíco, que es muy conocida y se describe en Sambrook y otros, anteriormente citados, el uso de secuencias de oligonucleotido traslapadas de los genomas de adenovirus, combinado con reacción de cadena de polimerasa, métodos sintéticos, y cualquier otro método adecuado que provea la secuencia de nucleótidos deseada.

En otra alternativa más, los productos génicos adenovirales esenciales son provistos en trans por medio de un vector y/o virus ayudador. En tal caso se puede seleccionar una célula hospedera adecuada de cualquier organismo biológico, que incluye células procarióticas (por ejemplo bacterias) y células eucarióticas que incluyen células de insecto, células de levadura y células de mamífero. Las células hospederas adecuadas incluyen las conocidas en la técnica, así como también las que se identifican en la presente. 3. Ensamble de la partícula viral y transfección de una línea celular Uno o más de los genes adenovirales faltantes se pueden integrar establemente en el genoma de la célula hospedera, se pueden expresar establemente como episomas, o se pueden expresar transitoriamente. Todos los productos génicos se pueden expresar transitoriamente en un episoma, o se pueden integrar establemente, o algunos de los productos génicos se pueden expresar establemente mientras que otros se expresan transitoriamente. Además, los promotores de cada uno de los genes adenovirales se pueden seleccionar independientemente de un promotor constitutivo, un promotor inducible o un promotor adenoviral nativo. Los promotores pueden ser regulados, por ejemplo, por medio de un estado fisiológico específico del organismo o célula (esto es, mediante el estado de diferenciación, o en células en duplicación o quiescentes), o mediante factores añadidos exógenamente. La introducción de las moléculas (como plásmidos o virus) en la célula hospedera se puede hacer usando las técnicas conocidas y las que se exponen en toda esta especificación. En una modalidad se utilizan técnicas de clonación directa. Dichas técnicas ya se han descrito [G. Gao y otros, Gene Ther. 2003 Oct; 10(22): 1926-1930; publicación de patente de EE. UU. No. 2003-0092 61 -A, 15 de mayo de 2003; solicitud de patente internacional No. PCT/US03/12405]. En otra modalidad se usan técnicas de transfección estándares, por ejemplo, transfección con CaP04 o electroporación. El ensamble de las secuencias de ADN seleccionadas del adenovirus (así como también las secuencias que codifican el producto y otros elementos del vector) en diversos plásmidos intermedios, y el uso de los plásmidos y vectores para producir una partícula viral recombinante, se hacen usando las técnicas convencionales. Por ejemplo, después de la construcción y ensamble del vector viral polivalente, el vector se transfecta in vitro en la línea celular de empaquetamiento, en presencia de un virus ayudador. Ocurre recombinación homologa entre las secuencias ayudadoras y el vector, lo que permite que las secuencias génicas de adenovirus en el vector sean duplicadas y empaquetadas en cápsides de virión, dando como resultado partículas de vector viral recombinante. El método actual para producir dichas partículas de virus está basado en la transfección. Sin embargo, la invención no se limita a dichos métodos. Los adenovirus recombinantes resultantes son útiles para transferir dos o más casetes de expresión heterólogos seleccionados a una célula seleccionada.

B. Vectores virales que tienen proteínas de envoltura En otra modalidad, los vectores de transferencia de la invención se usan para empaquetar un vector viral en una partícula infecciosa de un virus que tiene una proteína de envoltura, por ejemplo un lentivirus o un poxvirus. Ejemplos de lentivirus adecuados incluyen, por ejemplo, el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), el virus de la inmunodeficiencia de simio (VIS), el virus de la artritis y encefalitis caprina, el virus de la anemia infecciosa equina, el virus de la inmunodeficiencia bovina, el virus del visna, y el virus de la inmunodeficiencia felina (VIF). Los ejemplos de la presente ilustran el uso de minigenes derivados de VIH y VIF. Sin embargo, también se pueden usar otros lentivirus de origen humano o no humano. Las secuencias usadas en las construcciones de la invención se pueden derivar de fuentes de lentivirus académicas, no lucrativas (por ejemplo, la Colección de Cultivos Tipo de Estados Unidos, Manassas, Virginia), o comerciales. Los métodos para generar dichos vectores virales son conocidos para el experto en la materia. Se han descrito métodos para producir vectores lentivirales.

Véase, por ejemplo, JE Coleman y otros, Physiol Genomics. 6 de febrero de 2003; 12(3):221 -8, que describe la producción de un sistema lentiviral basado en VIH-1 que utiliza vectores lentivirales autoinactivadores. En un ejemplo, se crean vectores lentivirales en un sistema de transfección transitorio en el que una línea celular se transfecta con tres sistemas de expresión de plásmido separados. Estos incluyen el plásmido de vector de transferencia, que es producido de acuerdo con la presente invención y contiene porciones del provirus lentiviral seleccionado y los casetes de expresión heterólogos, el plásmido o construcción de empaquetamiento, y un plásmido que tiene un gen de envoltura lentiviral (ENV), que puede ser una proteína de envoltura del mismo lentivirus o un virus diferente [Amado y Chen, "Lentiviral Vectors- The Promise of Gen Therapy Within Reach?" Science 285(5428): 674-76 (1999)]. Los tres componentes plasmídicos del vector se ponen en una célula de empaquetamiento que después se inserta en una cubierta lentiviral. En una modalidad, el plásmido de vector de transferencia contiene secuencias genéticas de acción cis necesarias para que el vector infecte la célula objetivo y para que transfiera el gen terapéutico (o reportero), y contiene sitios de restricción para la inserción de los genes deseados. Se han removido las LTRs 3' y 5', las proteínas de envoltura maternales y el promotor de secuencia gag. El plásmido de empaquetamiento contiene los elementos necesarios para el empaquetamiento de vector tales como proteínas estructurales, genes del VIH (excepto el gen env que codifica para la infección de células T, o el vector solamente sería capaz de infectar estas células), y las enzimas que generan partículas de vector. Normalmente, las señales de empaquetamiento y sus señales adyacentes son removidas de tal manera que las partes responsables del empaquetamiento del ADN viral han sido separadas de las partes que las activan. De esta manera, las secuencias de empaquetamiento no serán incorporadas en el genoma viral y el virus no se reproducirá después de que ha infectado a la célula hospedera. El tercer gen de envoltura del plásmido de un virus diferente especifica qué tipo de célula alcanzar e infectar en lugar de las células T, por ejemplo la glicoproteína del virus de la estomatitis vesicular, conocido como VSV, MLV, entre otros. Normalmente el VIH sólo puede infectar células T ayudadoras porque estas usan su proteína gp 120 para unirse al receptor CD4. Sin embargo, es posible intercambiar genéticamente la proteína de unión del receptor de CD4 por otra proteína que codifica el tipo de célula diferente sobre el cual se realizará la terapia génica. Esto da al vector lentiviral una amplia gama de células objetivo posibles. Otros métodos de producción lentiviral y elementos de vector se describen en la publicación de patente internacional No. WO 03/092582, que se incorpora como referencia. Usando los métodos de estructuras virales polivalentes de la invención se pueden producir otros vectores virales envueltos. Véase, por ejemplo, "The Uses of Poxviruses as Vectors", Current Gene Therapy, vol. 3, No. 6, p. 583-595 (diciembre de 2003); M. E. Perkus y otros, "Poxvirus-based vaccine candidates for cáncer, AIDS, and other infectious diseases", Journal of Leukocyte Biology, vol. 58, edición 1 1 -13 (1995).

III. Usos del Vector Viral Polivalente Los vectores virales polivalentes de la invención se formulan en una composición que contiene un vehículo fisiológicamente compatible. Estas composiciones son útiles en una variedad de regímenes terapéuticos y de inmunización. Ventajosamente, la expresión de múltiples productos génicos de los vectores virales polivalentes puede reducir la cantidad de vector, u otro fármaco, necesaria para suministrar al sujeto, para lograr el efecto biológico deseado. En una modalidad, el vector viral polivalente de la invención contiene un cásete de expresión heterólogo que lleva un producto terapéutico. Dicho vector viral polivalente puede llevar además uno o más productos terapéuticos adicionales. Un producto terapéutico adicional se puede dirigir al tratamiento de las mismas condiciones o síntomas relacionados con el primer producto terapéutico, o a una indicación diferente. Cuando se desee, se puede suministrar un producto génico terapéutico seleccionado para modular cualquier reacción al vector viral polivalente. En otra modalidad, el vector viral polivalente de la invención contiene un cásete de expresión heterólogo que lleva un producto que induce una respuesta inmune humoral y/o citotóxica en un objetivo. Dicho vector viral polivalente también puede llevar uno o más productos inmunogénicos adicionales. Este segundo producto puede estar dirigido a la inducción de una respuesta inmune en el objetivo, o en un objetivo de reacción cruzada. En otra modalidad, el segundo producto puede ser un producto terapéutico diseñado para tratar síntomas asociados con la condición fundamental. En otra modalidad, el segundo producto puede ser un adyuvante para otro producto génico suministrado por el vector viral polivalente. En otra modalidad, el segundo producto es un producto terapéutico suministrado para modular cualquier reacción al vector viral polivalente. Como se usa aquí, los inmunomoduladores incluyen productos que modifican la reacción del sistema inmune, por ejemplo, a un vector viral. Ejemplos de inmunomoduladores incluyen por ejemplo citocinas e interleucinas. Como se usa aquí, los compuestos inmunomoduladores adecuados pueden incluir por ejemplo, inmunoglobulina CTLA4; anticuerpos anti-CD4; FK506; e interleucinas (IL), que incluyen cualquiera de IL1-21 , por ejemplo, IL-2, IL-3, IL-4, IL-10, IL-12 e IL-18. Por ejemplo, la IL-10 puede ser útil para modular negativamente una respuesta antiinflamatoria local. El ligando Fas puede ser útil en la regulación negativa de las respuestas de células T mediadas por adenovirus. Para los expertos en la materia serán evidentes, partiendo de la presente especificación, otras combinaciones adecuadas de productos por suministrar en un vector viral polivalente de la invención, en un cóctel que contiene uno o más vectores virales polivalentes de la invención, o en un régimen que incluye el suministro dé uno o más vectores virales polivalentes de la invención.

A. Suministro de moléculas terapéuticas mediado por el vector viral polivalente En una modalidad, los vectores polivalentes se administran a los humanos de acuerdo con los métodos publicados para terapia génica. Un vector polivalente viral que lleva múltiples casetes de control de expresión heterólogos se puede administrar a un paciente, preferiblemente suspendido en una solución biológicamente compatible o vehículo de suministro farmacéuticamente aceptable. Un vehículo adecuado incluye solución salina estéril. Para esta finalidad se pueden emplear otras soluciones inyectables estériles isotónicas, acuosas y no acuosas, y suspensiones inyectables estériles acuosas y no acuosas, que son vehículos farmacéuticamente aceptables muy conocidos para el experto en la materia. Los vectores polivalentes se administran en cantidades suficientes para transducir las células objetivo y proveer un grado suficiente de transferencia y expresión de genes, para proveer un beneficio terapéutico sin efectos adversos indebidos y con efectos fisiológicos médicamente aceptables que pueden ser determinados por los expertos en las técnicas médicas. Las vías de administración convencionales y farmacéuticamente aceptables incluyen, sin limitación, suministro directo a la retina y otros métodos de suministro intraocular, suministro directo al hígado, inhalación, administración intranasal, intravenosa, intramuscular, intratraqueal, subcutánea, intradérmica, rectal, oral, y otras vías parenterales. Las vías de administración se pueden combinar si se desea o ajustarse dependiendo del producto del gen o la condición. La vía de administración dependerá principalmente de la naturaleza de la condición tratada. Las dosis del vector viral dependerán principalmente de factores tales como la condición tratada, la edad, peso y salud del paciente, y por lo tanto puede variar entre los pacientes. Por ejemplo, una dosis terapéuticamente efectiva para adulto humano o veterinaria del vector viral, generalmente estará en la escala de aproximadamente 100 pL a aproximadamente 100 mL de un vehículo que contiene concentraciones de aproximadamente 1 x 106 a aproximadamente 1 x 1015 partículas, de aproximadamente 1 x 1011 a 1 x 1013 partículas, o de aproximadamente 1 x 109 a 1 x 1012 partículas de virus. Las dosis varían dependiendo del tamaño del animal y la vía de administración. Por ejemplo, una dosis humana o veterinaria adecuada (para un animal de 80 kg) para inyección intramuscular, está en la escala de aproximadamente 1 x 109 a aproximadamente 5 x 1012 partículas por mL, para un solo sitio. Opcionalmente se pueden suministrar sitios múltiples de administración. En otro ejemplo, una dosis humana o veterinaria adecuada puede estar en la escala de aproximadamente 1 x 1011 a aproximadamente 1 x 1015 partículas para una formulación oral. El experto en la materia puede ajusfar estas dosis, dependiendo de la vía de administración y la aplicación terapéutica o de vacuna en la que se emplea el vector recombinante. El grado de expresión del producto terapéutico, o para un inmunogen la concentración de anticuerpo en circulación, se puede monitorear para determinar la frecuencia de administración de la dosis. Otros métodos para determinar la frecuencia de administración serán muy evidentes para el experto en la materia. En una modalidad, un vector viral polivalente contiene un cásete de expresión heterólogo que codifica un producto terapéutico y un cásete de expresión heterólogo que codifica un inmunomodulador. El inmunomodulador seleccionado se define aquí como un agente capaz de inhibir la formación de anticuerpos neutralizantes dirigidos contra el vector recombinante de esta invención, o capaz de inhibir la eliminación de linfocitos T citolíticos (CTL) del vector. El inmunomodulador puede estorbar las interacciones entre los subgrupos de ayudadores T (THi o TH2) y las células B para inhibir la formación de anticuerpo neutralizante. Alternativamente, el inmunomodulador puede inhibir la interacción entre las células THi y CTLs para reducir la ocurrencia de eliminación de CTL del vector. Una variedad de inmunomoduladores útiles y sus dosis de uso se describen por ejemplo en Yang y otros, J. Virol., 70(9) (septiembre, 1996); publicación de patente internacional No. WO 96/12406, publicada el 2 de mayo de 1996; y publicación de patente internacional No. WO 96/26285. 1. Producto terapéutico Los productos terapéuticos útiles codificados por el cásete de expresión heterólogo incluyen hormonas y factores de crecimiento y diferenciación que incluyen, sin limitación, insulina, glucagón, hormona de crecimiento (GH), hormona paratiroidea (PTH), factor de liberación de la hormona de crecimiento (GRF), hormona estimuladora del folículo (FSH), hormona luteinizante (LH), gonadotropina coriónica humana (hCG), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), angiopoyetinas, angiostatina, factor estimulador de colonia de granulocitos (GCSF), eritropoyetina (EPO), factor de crecimiento de tejido conectivo (CTGF), factor de crecimiento de fibroblasto básico (bFGF), factor de crecimiento de fibroblasto ácido (aFGF), factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento de transformación a (TGF a), factor de crecimiento derivado de plaqueta (PDGF), factores de crecimiento de insulina I y II (IGF-I e IGF-II), cualquiera de los factores de la superfamilia de factores de crecimiento de transformación, que incluyen TGF, activinas, inbibinas, o cualquiera de las proteínas morfogénicas de hueso (BMP) BMPs 1 -15, cualquier factor de la familia de factores de crecimiento heregluina/neuregulina/ARIA /factor de diferenciación de neu (NDF), factor de crecimiento de nervio (NGF), factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF), neurotrofinas NT-3 y NT-4/5, factor neurotrófico ciliar (CNTF), factor neurotrófico derivado de línea de células gliales (GDNF), neurturina, agrina, cualquier miembro de la familia de semaforinas/colapsinas, netrina 1 y netrina 2, factor de crecimiento de hepatocito (HGF), efrinas, nogina, la proteína SHH y tirosina hidroxilasa. Otros productos génicos útiles incluyen proteínas que regulan el sistema inmune, que incluyen, sin limitación, citocinas y linfocinas tales como trombopoyetina (TPO), interleucinas (IL) IL-1 a IL-25 (que incluyen por ejemplo, IL-2, IL-4, tL-12 e IL-18), proteína quimioatrayente de monocito, factor inhibidor de leucemia, factor estimulador de colonia de granulocito-macrófago, ligando Fas, factores de necrosis de tumor e interferones, y factor de célula madre, ligando flk-2/flt3. Los productos génicos producidos por el sistema inmune también son útiles en la invención. Estos incluyen, sin limitación, inmunoglobulinas IgG, IgM, IgA, IgD e IgF, inmunoglobulinas quiméricas, anticuerpos humanizados, anticuerpos de una sola cadena, receptores de células T, receptores de células T quiméricos, receptores de células T de una sola cadena, moléculas de MHC de clase I y clase II, y también inmunoglobulinas diseñadas por ingeniería y moléculas de MHC. Los productos génicos útiles también incluyen proteínas reguladoras de complemento, tales como proteínas reguladoras de complemento, proteína de cofactor de membrana (MCP), factor de aceleración de declinación (DAF), CR1 , CF2 y CD59. Otros productos génicos útiles incluyen cualquiera de los receptores para las hormonas, factores de crecimiento, citocinas, linfocinas, proteínas reguladoras y proteínas del sistema inmune. La invención abarca receptores para la regulación de colesterol, que incluyen el receptor de lipoproteína de baja densidad (LDL), el receptor de lipoproteína de alta densidad (HDL), el receptor de lipoproteína de muy baja densidad (VLDL) y el receptor barredor. La invención también abarca productos génicos tales como los miembros de la superfamilia de receptores de hormonas esteroides, que incluyen los receptores glucocorticoides y los receptores de estrógenos, receptores de vitamina D y otros receptores nucleares. Además, los productos génicos útiles incluyen factores de transcripción tales como ¡un, fos, max, mad, factor de respuesta de suero (SRF), AP-1 , AP2, myb, MyoD y miogenina, proteínas que contienen la caja ETS, TFE3, E2F, ATF1 , ATF2, ATF3, ATF4, ZF5, NFAT, CREB, HNF-4, C/EBP, SP1 , proteínas de unión de la caja CCAAT, factor de regulación de interferón (IRF-1 ), proteína del tumor de Wilms, proteína de unión de ETS, STAT, proteínas de unión de la caja GATA, por ejemplo, GATA-3 y la familia forkhead de proteínas de hélice alada. Otros productos génicos útiles incluyen carbamoilsintetasa I, ornitina transcarbamilasa, arginosuccinato sintetasa, arginosuccinato Nasa, arginasa, fumarilacetato hidrolasa, fenilalanina hidroxilasa, alfa- antitripsina, glucosa-6-fosfatasa, porfobilinógeno desaminasa, factor VIII, factor IX, cistation beta-sintasa, cetoácido descarboxilasa de cadena ramificada, albúmina, isovaleril-CoA deshidrogenasa, propionil-CoA carboxilasa, metil-malonil-CoA mutasa, glutaril-CoA deshidrogenasa, insulina, beta-glucosidasa, piruvato carboxilato, fosforilasa hepática, fosforilasa cínasa, glicina descarboxilasa, proteína H, proteína T, una secuencia reguladora de transmembrana de fibrosis cística (CFTR) y una secuencia de ADNc de distrofina. Otros productos génicos útiles incluyen los polipéptidos no naturales, tales como polipéptidos quiméricos o híbridos que tienen una secuencia de aminoácidos no natural que contiene inserciones, supresiones o sustituciones de aminoácido. Por ejemplo, las inmunoglobulinas diseñadas por ingeniería de una sola cadena podrían ser útiles en algunos pacientes inmunocomprometidos. Otros tipos de secuencias de gen no naturales incluyen moléculas de antisentido y ácidos nucleicos catalíticos, tales como ribozimas, que se podrían usar para reducir la sobreexpresión de un objetivo. La reducción y/o modulación de la expresión de un gen son particularmente deseables para el tratamiento de condiciones hiperproliferativas caracterizadas por células hiperproliferativas, como son el cáncer y la soriasis. Los polipéptidos objetivo incluyen los polipéptidos que son producidos exclusivamente o en alto grado en células hiperproliferativas, en comparación con las células normales. Los antígenos objetivo incluyen polipéptidos codificados por oncogenes, tales como myb, myc, fyn, y el gen de translocalización bcr/abl, ras, src, P53, neu, trk y EGRF. Además de los productos de oncogen como antígenos objetivo, los polipéptidos objetivo para tratamientos contra el cáncer y regímenes protectores incluyen las regiones variables de anticuerpos hechas por linfomas de células B, y regiones variables de receptores de células T de linfomas de células T, que en algunas modalidades también se usan como antígenos objetivo para la enfermedad autoinmune. Otros polipéptidos asociados con tumor se pueden usar como polipéptidos objetivo, tales como los polipéptidos que se encuentran en cantidades más altas en las células de tumor, que incluyen el polipéptido reconocido por el anticuerpo monoclonal 17-1 A y polipéptidos de unión de folato. Otros polipéptidos y proteínas terapéuticas adecuados incluyen los que pueden ser útiles para el tratamiento de individuos que sufren de enfermedades y trastornos autoinmunes, confiriendo una respuesta inmune protectora de base amplia contra objetivos que están asociados con la autoinmunidad, incluyendo receptores de células y células que producen anticuerpos autodirigidos. Las enfermedades autoinmunes mediadas por células T incluyen artritis reumatoide (RA), esclerosis múltiple (MS), síndrome de Sjógren, sarcoidosis, diabetes mellitus dependiente de insulina (IDDM), tiroiditis autoinmune, artritis reactiva, espondilitis anquilosante, esclerodermia, polimiositis, dermatomiositis, soriasis, vasculitis, granulomatosis de Wegener, enfermedad de Crohn y colitis ulcerativa. Cada una de estas enfermedades está caracterizada por receptores de células T (TCRs) que se unen a antígenos endógenos e inician la cascada inflamatoria asociada con las enfermedades autoinmunes. Los vectores virales polivalentes de la invención son particularmente adecuados para regímenes terapéuticos en donde se desea el suministro múltiple de productos génicos mediado por virus, por ejemplo en regímenes que implican el resuministro del mismo producto, o regímenes de combinación que incluyen el suministro de otros productos génicos.

B. Suministro de productos génicos inmunogénicos mediado por virus polivalente Los vectores virales polivalentes de la invención también se pueden emplear como composiciones inmunogénicas. Como se usa aquí, una composición inmunogénica es una composición con la que se provoca una respuesta humoral (por ejemplo anticuerpo) o celular (por ejemplo una célula T citotoxica) contra un producto suministrado por la composición inmunogénica después de su administración a un mamífero, preferiblemente a un primate. La presente invención provee un vector viral polivalente que puede contener en cualquiera de sus supresiones de secuencia de adenovirus un primer cásete de expresión heterólogo que codifica un inmunógeno deseado. El vector viral polivalente puede contener además un cásete de expresión heterólogo que codifica un adyuvante para el inmunógeno, productos inmunogénicos adicionales, un producto terapéutico, o un producto que regula negativamente una respuesta inmune al vector viral polivalente. Cuando el vector viral polivalente es un vector adenoviral polivalente, adecuado para usar como una vacuna de virus recombinante vivo en diferentes especies animales en comparación con un adenovirus de origen humano, pero no está limitado a dicho uso. Los virus polivalentes recombinantes se pueden usar como vacunas profilácticas o terapéuticas contra cualquier patógeno para el cual se han identificado el o los antígenos cruciales para inducir una respuesta inmune, y sean capaces de limitar la diseminación del patógeno, y para los cuales está disponible el ADNc. Dichas composiciones de vacuna (u otras composiciones inmunogénicas) se formulan en un vehículo de suministro adecuado, como se describió arriba. Generalmente las dosis de las composiciones inmunogénicas están en la escala definida anteriormente para las composiciones terapéuticas. Los grados de inmunidad del gen seleccionado se pueden monitorear para determinar si hubiera la necesidad de refuerzo. Después de determinar los títulos de anticuerpo en el suero pueden ser necesarias inmunizaciones de refuerzo opcionales. Opcionalmente, una composición de vacuna de la invención se puede formular para contener otros componentes, que incluyen por ejemplo adyuvantes, estabilizadores, ajustadores de pH, conservadores y similares. Dichos componentes son muy conocidos en la técnica de las vacunas. Ejemplos de adyuvantes adecuados incluyen, sin limitación, liposomas, alumbre, monofosforil lípido A, y cualquier factor biológicamente activo, tal como citosina, una interleucina, una quimocina, un ligando, y opcionalmente combinaciones de los mismos. Algunos de estos factores biológicamente activos pueden ser expresados in vivo, por ejemplo por medio de un plásmido o vector viral. Por ejemplo, dicho adyuvante se puede administrar con una vacuna de ADN de estimulación que codifica un antígeno para incrementar la respuesta inmune específica de antígeno, en comparación con la respuesta inmune generada después de la estimulación con una vacuna de ADN que codifica sólo el antígeno. Los vectores virales polivalentes se administran en una "cantidad inmunogénica", esto es, una cantidad de vector viral polivalente que es efectiva en una vía de administración para transfectar las células deseadas y proveer un grado suficiente de expresión del gen seleccionado para inducir una respuesta inmune. Cuando se provee inmunidad protectora, los vectores vírales polivalentes se consideran composiciones de vacuna útiles para prevenir una infección o enfermedad recurrente. Alternativamente, o adicionalmente, los vectores de la invención pueden contener un gen que codifica un péptido, polipéptido o proteína, que induce una respuesta inmune a un inmunógeno seleccionado. Se espera que los vectores adenovirales polivalentes de esta invención sean altamente eficaces para inducir células T citolíticas y anticuerpos contra la proteína antigénica heteróloga insertada expresada por el vector. Por ejemplo, se pueden seleccionar inmunógenos de una variedad de familias virales. Ejemplos de familias virales contra las cuales sería deseable una respuesta inmune incluyen la familia de picornavirus, que incluye el género rinovirus, que es el responsable de cerca del 50% de los casos del resfriado común; el género enterovirus, que incluye poliovirus, virus coxsackie, echovirus y entervirus humanos tales como el virus de la hepatitis A; y el género aptovirus, que es el responsable de enfermedades de los pies y la boca, principalmente en animales no humanos. Dentro de la familia de virus picornavirus, los antígenos objetivo incluyen los VP1 , VP2, VP3, VP4 y VPG. Otra familia viral incluye la familia calcivirus, que abarca el grupo de virus de Norwalk, que son un agente causativo importante de la gastroenteritis epidémica. Otra familia viral deseable para usar como antígenos objetivo para inducir respuestas inmunes en humanos y animales no humanos, es la familia togavirus, que incluye el género alfavirus, que incluye virus de Sindbis, virus de RossRiver y el virus de la encefalitis equina de Venezuela, Occidental y Oriental, y rubivirus, que incluye el virus de la rubéola. La familia flaviviridae incluye los virus del dengue, la fiebre amarilla, la encefalitis japonesa, la encefalitis de San Luis y el virus de la encefalitis transmitida por garrapatas. Otros antígenos objetivo pueden ser generados de los virus de la hepatitis C [véase, por ejemplo, la solicitud de patente publicada de EE. UU. No. US2003/190606 (9 de octubre de 2003); US2002/081568 (27 de junio de 2002)], o la familia coronavirus, que incluye varios virus no humanos tales como el virus de la bronquitis infecciosa (de aves), el virus gastroentérico transmisible porcino (cerdo), el virus de la encefalomielitis hemoaglutinante porcina (cerdo), el virus de la peritonitis infecciosa felina (gatos), el coronavirus entérico felino (gato), el coronavirus canino (perro), y coronavirus respiratorios humanos, que pueden causar el resfriado común y/o hepatitis no A, B o C, y el agente causante putativo del síndrome respiratorio agudo repentino (SARS). Dentro de la familia de coronavirus, los antígenos objetivo incluyen las glicoproteínas (no presentes en todos los coronavirus) E1 (también denominada proteína M o de matriz), E2 (también denominada proteína Spike o S), E3 (también denominada HE o hemoaglutínina-elterosa), o N (nucleocápside). Otros antígenos pueden servir de objetivo contra la familia de rabdovirus, que incluye los géneros vesiculovirus (por ejemplo, virus de la estomatitis vesicular), y los lisavirus generales (por ejemplo de la rabia). Dentro de la familia de rabdovirus se pueden derivar antígenos adecuados de la proteína G o la proteína N. La familia filoviridae, que incluye virus de la fiebre hemorrágica tales como el virus de Marburg y Ebola, puede ser una fuente adecuada de antígenos. La familia de paramixovirus incluye el virus de la parainfluenza de tipo I, el virus de la parainfluenza de tipo 3, el virus de la parainfluenza bovina de tipo 3, rubulavirus (virus de las paperas), el virus de la parainfluenza de tipo 2, el virus de la parainfluenza de tipo 4, el virus de la enfermedad de Newcastle (pollos), virus de la peste bovina, morbilivirus, que incluye los virus del sarampión y moquillo canino, y neumovirus, que incluyen el virus sincitial respiratorio. El virus de la influenza se clasifica dentro de la familia de ortomixovirus y es una fuente adecuada de antígeno (por ejemplo, la proteína HA, la proteína N1 ). La familia de buniavirus incluye los géneros buniavirus (virus de la encefalitis de California, La Crosse), flebovirus (virus de la fiebre del valle de Rift), hantavirus (Puumala es un virus de la fiebre hemorrágica), nairovirus (enfermedad de las ovejas de Nairobi) y varios bungavirus no designados. La familia arenavirus provee una fuente de antígenos contra el virus de LCM y el virus de la fiebre de Lassa. La familia de reovirus incluye los géneros reovirus, rotavirus (que ocasiona gastroenteritis aguda en los niños), orbivirus y cultivirus (fiebre de las garrapatas de Colorado, Lebombo (humanos), encefalosis equina, lengua azul). La familia de retrovirus incluye la subfamilia oncorivirinal que abarca virus de enfermedades humanas y veterinarias, tales como el virus de la leucemia felina, HTLVI y HTLVII, lentivirinal (que incluye el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), el virus de la inmunodeficiencia de simio (VIS), el virus de la inmunodeficiencia felina (VIF), el virus de la anemia infecciosa equina, y spumavirus). Entre los lentivirus se han descrito muchos antígenos adecuados y se pueden seleccionar fácilmente. Ejemplos de antígenos de VIH y VIS adecuados incluyen, sin limitación, las proteínas gag, pol, Vif, Vpx, VPR, Env, Tat, Nef y Rev, así como también varios fragmentos de las mismas. Por ejemplo, fragmentos adecuados de la proteína Env pueden incluir cualquiera de sus subunidades, tales como gp120, gp160, gp41 , otros fragmentos más pequeños de las mismas, por ejemplo de por lo menos aproximadamente 8 aminoácidos de longitud. Similarmente, se pueden seleccionar fragmentos de la proteína tat [véase la patente de EE. UU. No. 5,891 ,994 y la patente de EE. UU. No. 6,193,981 ; véanse también las proteínas de VIH y VIS descritas en D.H. Barouch y otros, J. Virol. 75(5):2462-2467 (marzo de 2001 ), y R. R. Amara y otros, Science, 292:69-74 (6 de abril de 2001 ). En otro ejemplo, se pueden usar proteínas o péptidos inmunogénicos de VIH y/o VIS para formar proteínas de fusión u otras moléculas inmunogénicas. Véase, por ejemplo, las proteínas de fusión Tat y/o Nef de VIH-1 y los regímenes de inmunización descritos en la publicación de patente internacional No. WO 01/54719, publicada el 2 de agosto de 2001 , y la publicación de patente internacional No. WO 99/16884, publicada el 8 de abril de 1999. La invención no está limitada a las proteínas o péptidos inmunogénicos de VIH y/o VIS descritos en la presente. Además, se ha descrito una variedad de modificaciones de estas proteínas, o podrían ser hechas fácilmente por el experto en la materia. Véase, por ejemplo, la proteína gag modificada que se describe en la patente de EE. UU. No. 5,972,596. Además, cualquier inmunógeno deseado de VIH y/o VIS se puede suministrar solo o en combinación. Dichas combinaciones pueden incluir la expresión de un solo vector o de múltiples vectores. Opcionalmente, otra combinación puede incluir el suministro de uno o más inmunógenos expresados, con el suministro de uno o más de los inmunógenos en forma de proteína. Dichas combinaciones se exponen más abajo en mayor detalle. La familia papovavirus incluye la subfamilia de poliomavirus (virus de BKU y JCU) y la subfamilia papilomavirus (asociada con cáncer o avance maligno de papiloma). Por ejemplo, se han descrito antígenos de papilomavirus y combinaciones de los mismos. Véase por ejemplo, la solicitud publicada de EE. UU. No. 2003/129199 (10 de julio de 2003); la solicitud publicada de EE. UU. No. 2002/18221 (15 de diciembre de 2002), la patente de EE. UU. No. 6,342,224. La familia de adenovirus incluye virus (EX, AD7, ARD, O.B.) que ocasionan enfermedad respiratoria y/o enteritis. La familia de parvovirus de parvovirus felino (enteritis felina), panleucopeniavirus felino, parvovirus canino y parvovirus porcino. La familia de herpesvirus incluye la subfamilia alphaherpesvirinae, que abarca los géneros simplexvirus (HSVI, HSVII), varicelovirus (pseudorabia, varicela zoster) y la subfamilia betaherpesvirinae, que incluye los géneros citomegalovirus (HCMV, muromegalovirus) y la subfamilia gammaherpesvirinae, que incluye los géneros linfocriptovirus, EBV (virus del linfoma de Burkitts), virusa de la rinotraqueitis infecciosa, virus de la enfermedad de Marek, y radinovirus. La familia poxvirus incluye la subfamilia chordopoxvirinae, que abarca los géneros ortopoxvirus (varióla (viruela) y vaccinia (vacuna)), parapoxvirus, avipoxvirus, capripoxvirus, leporipoxvirus, suipoxvirus, y la subfamilia entomopoxvirinae. La familia hepadnavirus incluye el virus de la hepatitis B. Un virus no clasificado que puede ser una fuente adecuada de antígenos es el virus de la hepatitis delta. Otras fuentes virales pueden incluir el virus de la enfermedad bursal infecciosa de las aves y el virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino. La familia alfavirus incluye el virus de la arteritis equina y varios virus de encefalitis. La presente invención también puede abarcar inmunógenos que son útiles para inmunizar a un humano o a un animal no humano contra otros patógenos que incluyen bacterias, hongos, microorganismos parásitos o parásitos multicelulares, que infectan a vertebrados humanos y no humanos, o una célula cancerosa o célula de tumor. Los ejemplos de patógenos bacterianos incluyen cocos patógenos gram-positivos que incluyen pneumococci; staphylococci y streptococci. Los cocos patógenos gram-negativos incluyen meningococos; gonococos. Los bacilos gram-negativos entéricos patógenos incluyen enterobacteriaceae; pseudomonas, acinetobacteria y eikenella; melioidosis; salmonella; shigella, haemophilus; moraxella; H. ducreyi (que causa chancroide); brucella; Franisella tularensis (que causa tularemia); yersinia (pasteurella), streptobacillus moniliformis y spirillum; los bacilos gram-positivos incluyen listeria monocytogenes; erisipelothrix rhusiopathiae; Corymebacterium diphtheria (difteria); cólera; 8. anthracis (carbunco); donovanosis (granuloma inguinal); y bartonellosis. Las enfermedades causadas por bacterias anaeróbicas patógenas incluyen tétanos; botulismo; otros clostridios, tuberculosis, lepra; y otras micobacterias. Las enfermedades de espiroquetas patógenas incluyen sífilis; treponematosis: frambesia, mal del pinto y sífilis endémica; y leptospirosis. Otras infecciones causadas por bacterias patógenas superiores y hongos patógenos incluyen actinomicosis; nocardiosis; criptococosis, blastomicosis, histoplasmosis y cocciodiomicosis; candidiasis, aspergilosis y mucomicosis; esporotricosis; paracoccidiomicosis, petrielidiosis, torulopsis, micetoma y cromomicosis; y dermatofitosis. Las infecciones por riketsia incluyen fiebre tifoidea, fiebre de las Montañas Rocosas, fiebre Q y rickettsiosis pustulosa. Los ejemplos de infecciones por micoplasma y clamidia incluyen: neumonía de micoplasma; linfogranuloma venéreo; sitacosis; e infecciones perinatales y de clamidia. Los eucariotes patógenos abarcan protozoarios y helmintos patógenos, y las infecciones producidas por los mismos incluyen: amebiasis; malaria; leishmaniasis; tripanosomiasis; toxoplasmosis; Pneumocystis carinii; Trichans; Toxoplasma gondii; babesiosis; giardiasis; triquinosis; filariasis; esquistosomiasis; nemátodos; tremátodos; infecciones de céstodos (solitaria). Muchos de estos organismos y/o las toxinas producidas por los mismos han sido identificados por los Centros de Control de Enfermedades [(CDC), Departamento de Salud y Servicios Humanos, EE.. UU..], como agentes que tienen uso potencial en ataques biológicos. Por ejemplo, algunos de estos agentes biológicos incluyen Bacillus anthracis (carbunco), Clostridium botulinum y su toxina (botulismo), Yersinia pestis (plaga), varióla mayor (viruela), Francisella tularensis (tularemia), y fiebres hemorrágicas virales [filovirus (por ejemplo Ebola, Marburg), y arenavirus (por ejemplo Lassa, Machupo)], todos los cuales están clasificados actualmente como agentes de Categoría A; Coxiella burnetti (fiebre Q); especies de Brucella (brucelosis), Burkholderia mallei (muermo), Burkholderia pseudomallei (meloidosis), Ricinus communis y su toxina (toxina ricina), Clostridium perfringens y su toxina (toxina épsilon), especies de Staphylococcus y sus toxinas (enterotoxina B), Chlamydia psittaci (sitacosis), amenazas para la seguridad del agua (por ejemplo Vibrio cholerae, Crytosporidium parvum), fiebre tifosa (Rickettsia powazekii), y encefalitis viral (alfavirus, por ejemplo encefalitis equina de Venezuela; encefalitis equina occidental; encefalitis equina oriental); todas las cuales están clasificadas actualmente como agentes de categoría B; y virus Ñipan y hantavirus, que están clasificados actualmente como agentes de categoría C. Además, en el futuro se pueden identificar o usar para dicho fin otros organismos que están clasificados así o diferentemente. Será entendido que los vectores virales y otras construcciones aquí descritas son útiles para suministrar antígenos de estos organismos, virus, toxinas u otros subproductos, que habrán de prevenir o tratar la infección u otras reacciones adversas con estos agentes biológicos. La administración de los vectores de la invención para suministrar inmunógenos contra la región variable de las células T provoca una respuesta inmune que incluye linfocitos T citotoxicos (CTLs) para eliminar dichas células T. En la artritis reumatoide (RA) se han caracterizado varias regiones variables específicas del receptor de células T (TCRs) que están implicadas en la enfermedad. Estas TCRs incluyen V-3, V-14, V-17 y Va -17. De esta manera, el suministro de una secuencia de ácido nucleico que codifica por lo menos uno de estos polipéptidos provocará una respuesta inmune que hará blanco en las células T implicadas en RA. En la esclerosis múltiple (MS) se han caracterizado varias regiones variables específicas de TCRs que están implicadas en la enfermedad. Estas TCRs incluyen V-7 y Voc-10. De esta manera, el suministro de una secuencia de ácido nucleico que codifica por lo menos uno de estos polipéptidos provocará una respuesta inmune que hará blanco en las células T implicadas en MS. En esclerodermia se han caracterizado varias regiones variables específicas de TCRs que están implicadas en la enfermedad. Estas TCRs incluyen V-6, V-8, V-14 y Va-16, Va-3C, Va-7, Va-14, Va-15, Va-16, Va-28 y Va-12. De esta manera, el suministro de un adenovirus recombinante de simio que codifica por lo menos uno de estos polipéptidos provocará una respuesta inmune que hará blanco en las células T implicadas en esclerodermia. Los siguientes ejemplos ilustran la clonación del adenovirus polivalente y la construcción de vectores de adenovirus polivalentes ejemplares de la presente invención. Estos ejemplos son únicamente ilustrativos y no limitan el alcance de la presente invención.

EJEMPLOS Como se ¡lustra en las figuras 1 y 2, el vector basado en Pan9 de adenovirus de chimpancé se construyó como un vector de transferencia polivalente de acuerdo con la invención.

A. Construcción de la molécula de ADN con casetes movibles Haciendo referencia a la figura 1 , se seleccionó una estructura base de plásmido que lleva el genoma viral Pan9 de adenovirus de chimpancé, que tiene un cásete de marcador de proteína fluorescente verde mutante (GFP) en el sitio de la región del gen E1 de Pan9, poli-A de hormona de crecimiento bovino, y una supresión de E3 parcial. Este plásmido se describe en más detalle en la publicación de patente internacional No. WO 2003/046124. pPan9-pkGFP se digirió con Avrll para remover la región E3 de Pan9, que se clonó en pSL1 180 [obtenido comercialmente de Pharmacia], para formar pSL1 180-Pan9-Avr(ll), que contiene el gen de resistencia a ampicilina. El plásmido RSV-Red2 contiene un promotor RSV, un promotor lac que maneja el producto AsRed2 (Lac-AsRed2), flanqueado por un sitio I-Scel y Pl-Pspl, seguido por un Poli-A SV40. Este plásmido pRSV-Red2 se construyó clonando el promotor RSV en un plásmido construido de pUC 9 y pkRFP (Clontech). El plásmido pSL1180-Pan9-Avr(ll) se digirió con Nrul para liberar el fragmento de E3 de Pan9, pRSV-Red2 se digirió con Pvull y Hpal para liberar el cásete l-Scel-RSV-lac-AsRed2-PI-Scel, y se religó para formar un plásmido SL 180-Pan9-Avr(ll)pkRFP, que contiene el gen de resistencia a ampicilina, y el cásete l-Scel-RSV-lac-AsRed2-PI-Scel en el sitio de la región E3. De la digestión de Avrll de pPan9-pkGFP descrita anteriormente también resulta un plásmido que contiene el genoma viral Pan9 que tiene una supresión en la región E3; después de religación, el plásmido resultante se denomina pPan9-pkGFP-Avr(ll). Este plásmido y el plásmido pSL1180-Pan9-Avr(ll)pkRFP se digirieron con Avrll, y se religó para formar un solo plásmido que contiene el gen reportero GFP en el locus E1 y el gen reportero RFP en el locus E3. El plásmido resultante se denominó pPan9-(E1 )-pkGFP-(E3)pkRFP. Seleccionando las colonias que expresan amarillo, se seleccionan los vectores que expresan las proteínas fluorescentes tanto verde como roja. Este diseño permite trasladar fácilmente los casetes de expresión de antígeno y una selección conveniente de colonia basada en el color de los recombinantes, y será adecuado para la creación del vector con alto rendimiento.

B. Construcción de un vector de transferencia polivalente Para construir un vector de transferencia polivalente de la invención, un primer cásete de expresión heterólogo seleccionado se clonó en un sitio apropiado en un vector promiscuo. Haciendo referencia a la figura 2, ésta ilustra la clonación del "antígeno 1" en un plásmido que tiene múltiples sitios de clonación, selección del sitio flanqueado por los sitios de enzimas de restricción que corresponden a la región deseada de la molécula de ADN producida de acuerdo con la parte A anterior, esto es, flanqueadas por los sitios l-Ceul y Pl-Scel. Un segundo cásete de expresión heterólogo (antígeno 2) se clonó en un vector apropiado (por ejemplo, pUC19-RSV) entre los sitios I-Scel. Después de la digestión con las enzimas apropiadas, los vectores que contienen los casetes de expresión heterologos deseados se pueden seleccionar por medios colorimétricos. Más particularmente, las colonias que expresan rojo por excitación con la longitud de onda de luz apropiada, indican la presencia de los vectores en los que el cásete movible que contiene el GFP ha sido reemplazado con el antígeno 1 , pero el cásete movible que contiene el RFP ha sido retenido. Las colonias que expresan verde por excitación con la longitud de onda de luz apropiada indican la presencia de vectores en los cuales el cásete movible que contiene el RFP ha sido reemplazado con el antígeno 1 , pero el cásete movible que contiene el GFP ha sido retenido. Las colonias que aparecen blancas después de excitación con luz de la longitud de onda apropiada para el GFP y RFP indican vectores en los cuales ambos casetes movibles han sido reemplazados con casetes de expresión heterologos. De esta manera, seleccionando las colonias blancas se pueden seleccionar rápida y exactamente los vectores de transferencia polivalentes de la invención.

C. Estudio del impacto de la localización (E1 o E3) y orientación de los casetes de transgen sobre la expresión de antíqeno Casetes de expresión CMV-hA1 AT idénticos se clonaron en el locus E1 del vector de Pan9 (también denominado C9) suprimido de E1 , y el locus E3 del vector C9 suprimido de E1/E3, separadamente. Se produjeron virus recombinantes de C9 que expresan A1AT de diferentes locus y se inyectaron intravenosamente a ratones C57BL/6, a una dosis de 1 x1011 pts/ratón. Se extrajo sangre de los animales los días 3 y 7 después de la transferencia del gen y se midieron las concentraciones de hA1 AT en el suero para comparación. Los datos revelaron que hA1AT expresado del locus E3 fue realmente por lo menos 2 veces más alto que el del locus E1 . Véase la figura 3. El proceso de clonación de la invención tiene un sistema de selección de color doble conveniente para los recombinantes de vector monovalente o polivalente. Además, estos datos demuestran que no hay efecto negativo dependiente del locus sobre la expresión de transgen en vectores de adenovirus de simio. Todas las publicaciones citadas en esta especificación y el listado de secuencias se incorporan aquí como referencia. Aunque la invención se ha descrito haciendo referencia a modalidades particulares, se apreciará que se pueden hacer modificaciones sin apartarse del espíritu de la invención. Se considera que dichas modificaciones están dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.

Claims (10)

NOVEDAD DE LA INVE N CION REIVINDICACIONES

1 .- Una estructura de plásmido polivalente que comprende: (a) un primer cásete movible localizado en un primer locus de un genoma viral, dicho primer cásete movible comprendiendo secuencias de ácido nucleico que comprenden un primer gen reportero detectable enlazado operativamente con secuencias que dirigirán la expresión del mismo, dicho cásete movible estando flanqueado por un primer grupo de sitios de enzimas de restricción raras compuesto de dos sitios de enzimas de restricción raras; y (b) un segundo cásete movible localizado en un segundo locus del genoma viral, dicho segundo cásete movible comprendiendo secuencias de ácido nucleico que comprenden un segundo gen reportero detectable enlazado operativamente con secuencias que dirigirán la expresión del mismo, dicho cásete movible estando flanqueado por un segundo grupo de sitios de enzimas de restricción raras compuesto de dos sitios de enzimas de restricción raras; en donde los productos de dicho primer gen reportero detectable y del segundo gen reportero detectable son distinguibles, y en donde el primer y segundo grupo de sitios de enzimas de restricción raras difieren.

2.- La estructura de plásmido polivalente de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque comprende tres o más locus.

3. - La estructura de plásmido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el primer y segundo locus están localizados en regiones de gen diferentes dentro del genoma viral.

4. - La estructura de plásmido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el primer y segundo locus están localizados en marcos de lectura abiertos diferentes dentro de una sola región de gen del genoma viral.

5. - La estructura de plásmido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el primer y segundo locus están localizados dentro de un solo marco de lectura abierto de una región de gen del genoma viral y no son contiguos entre sí.

6. - La estructura de plásmido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque los genes reporteros detectables se diferencian uno de otro por el color del producto.

7.- La estructura de plásmido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque los genes reporteros detectables se seleccionan independientemente del grupo que consiste de proteína fluorescente verde, proteína fluorescente roja y beta-galactosidasa.

8. - La estructura de plásmido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el genoma viral es un genoma adenoviral.

9. - La estructura de plásmido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el genoma viral se selecciona del grupo que consiste en un genoma lentiviral, un genoma retroviral y un genoma de poxvirus.

10. - La estructura de plásmido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque los dos sitios de enzimas de restricción raras en el primer grupo se seleccionan independientemente del grupo que consiste en l-Ceu I, Pl-Sce I, Tevll, Bmol, Dmol, y difieren uno de otro. 1 1. - Un cultivo celular que comprende células transfectadas con la estructura de plásmido polivalente que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10. 12. - Un método para generar un vector de transferencia polivalente, que comprende los pasos de: (a) mezclar, en presencia del primer grupo de enzimas, una estructura de plásmido polivalente como la que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 1 , y una primera molécula de ácido nucleico que comprende un primer cásete de expresión heterólogo, que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un producto objetivo bajo el control de secuencias reguladoras que controlan la expresión del producto, en donde dicho cásete de expresión heterólogo está flanqueado por el primer grupo de sitios de enzimas de restricción; (b) seleccionar por la ausencia del primer reportero detectable para proveer estructuras de plásmido que contienen el primer cásete de expresión heterólogo; (c) mezclar, en presencia del segundo grupo de enzimas, la estructura de plásmido polivalente y una segunda molécula de ácido nucleico que comprende un segundo cásete de expresión heterologo, que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un producto objetivo bajo el control de secuencias reguladoras que controlan la expresión del producto, en donde dicho cásete de expresión heterologo está flanqueado por el segundo grupo de sitios de enzimas de restricción raras; y (d) seleccionar por la ausencia del segundo reportero detectable para proveer estructuras de plásmido que contienen el segundo cásete de expresión heterologo; suministrando así un vector de transferencia polivalente que contiene un genoma viral polivalente, que comprende un primer cásete de expresión en un primer locus y un segundo cásete de expresión en un segundo locus. 13. - El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque el primer gen reportero detectable es la proteína fluorescente verde y el segundo gen reportero detectable es la proteína fluorescente roja. 14. - El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque el primer grupo de enzimas es l-Ceu I y Pl-Sce I. 15. - El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque el segundo grupo de enzimas difiere del primer grupo de enzimas. 16. - El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque el vector de transferencia polivalente comprende secuencias de un genoma viral seleccionado del grupo que consiste en un adenovirus, un lentivirus, un retrovirus, un poxvirus. 17. - El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque el vector de transferencia polivalente comprende secuencias adenovirales en las que el primer cásete de expresión está localizado en una región E1 de adenovirus. 18. - El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque el vector de transferencia polivalente comprende secuencias adenovirales en las que el segundo cásete de expresión está localizado en una región E4 de adenovirus. 19.- El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque el vector de transferencia polivalente comprende secuencias adenovirales en las que el segundo cásete de expresión está localizado en la región E3 de adenovirus. 20. - Un vector de transferencia polivalente producido de acuerdo con el método que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 12 a 19. 21. - Una célula hospedera que comprende un vector de transferencia polivalente como el que se reclama en la reivindicación 20. 22. - Un método para generar un virus polivalente, que comprende el paso de cultivar el vector de transferencia polivalente que se reclama en la reivindicación 20 en presencia de suficientes secuencias virales para permitir el empaquetamiento del genoma viral polivalente en una envoltura viral infecciosa. 23. - Un virus polivalente producido de acuerdo con el método que se reclama en la reivindicación 22. 24. - El virus polivalente de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado además porque está empaquetado en una envoltura infecciosa que comprende una proteína de envoltura de lentivirus, una proteína de envoltura de retrovirus, y una proteína de envoltura de poxvirus. 25. - El virus polivalente de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque el poxvirus es el virus de la viruela del canario. 26. - Un método para generar un virus polivalente, que comprende el paso de cultivar la estructura de plásmido polivalente que se reclama en la reivindicación 2 en presencia de suficientes secuencias virales, para permitir el empaquetamiento de la estructura viral polivalente en una cápside viral infecciosa. 27. - Un vector viral polivalente producido de acuerdo con el método que se reclama en la reivindicación 26. 28.- El vector viral polivalente de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado además porque comprende una proteína de cápside adenoviral. 29.- Una composición que contiene: (a) un vector viral polivalente que comprende (i) un primer cásete de expresión heterólogo que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un primer producto objetivo bajo el control de secuencias reguladoras que controlan la expresión del producto; y (ii) un segundo cásete de expresión heterólogo que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un segundo producto objetivo bajo el control de secuencias reguladoras que controlan la expresión del producto; en donde dichos primer y segundo cásete de expresión están localizados en locus distintos de un genoma de vector viral, y los productos objetivo se expresan independientemente; y (b) un vehículo fisiológicamente compatible. 30.- La composición de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada además porque dichos primer y segundo producto se seleccionan independientemente del grupo que consiste en un antígeno y una citocina. 31. - La composición de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada además porque el primer o segundo producto es un inmunomodulador. 32. - La composición de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizada además porque el segundo producto es un adyuvante para el primer producto. 33.- La composición de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizada además porque el primer o segundo producto es un producto de gen terapéutico.