MXPA06011815A

MXPA06011815A - Proteinas adamts-8 y usos de las mismas.

Info

Publication number: MXPA06011815A
Application number: MXPA06011815A
Authority: MX
Inventors: Edward R Lavallie; Michael J Agostino; Lisa A Collins-Racie; Maya Arai; Christopher John Corcoran; Bethany A Freeman; Carl R Flannery; Macy X Jin
Original assignee: Wyeth Corp
Priority date: 2004-04-16
Filing date: 2005-04-15
Publication date: 2006-12-15
Also published as: JP2007534675A; WO2005116197A3; BRPI0509941A; CA2562683A1; EP1737953A2; US20050260733A1; WO2005116197A2; CN1969043A; AU2005248299A1

Abstract

La presente invencion caracteriza los metodos de las proteinas ADAMTS-8 o sus derivados funcionales para escindir el agrecano u otras moleculas de proteoglicano. La presente invencion tambien describe los metodos para identificar los moduladores de ADAMTS-8 que seas capaces de inhibir o aumentar las actividades proteoliticas de ADAMTS-8. Ademas, la presente invencion describe las composiciones farmaceuticas que comprenden las proteinas ADAMTS-8 o sus derivados o moduladores. Estas composiciones farmaceuticas pueden ser utilizadas para tratar enfermedades que estan caracterizadas por deficiencias o anormalidades en la escision o metabolismos de los proteoglicanos.

Description

espaciador y las repeticiones similares a la trombospondina I. Ver uno y Matsushima, J. BIOL. CHEM. , 273:13912-13917 (1998). Los papeles fisiológicos de un subgrupo pequeño de miembros de la familia ADAMTS han sido elucidados, y en algunos casos la expresión aberrante ha sido implicada en la enfermedad humana. ADAMTS-2, ADAMTS-3 y ADAMTS-14 al parecer funcionan como procolagenasas . ADAMTS-2 ha sido identificada como una N-proteinasa (pNPI) responsable del procesamiento de los procolágenos tipo I y tipo II . La ausencia del procesamiento del procolágeno tipo I da como resultado la acumulación de fibrillas de colágeno que retienen el polipéptido amino-terminal (pN-colágeno I) . Las fibrillas construidas a partir del pN-colágeno I no proporcionan niveles normales de resistencia a la tracción, que provocan defectos del tejido conectivo asociados a la enfermedad. El síndrome de Ehlers-Danlos tipo VIIC es un trastorno genético recesivo humano provocado por la incapacidad para procesar procolágeno tipo I a colágeno, dando como resultado la pérdida de la integridad de las articulaciones y fragilidad de la piel . Una enfermedad relacionada observada en el ganado bovino, en las reces y en algunas especies de gatos, es llamada desmatosparaxis ("rompimiento de la piel"). Estas dos enfermedades han sido vinculadas a la pérdida de la actividad de ADAMTS-2. La escisión amino-propéptido residual del colágeno tipo I en ausencia de actividad de ADAMTS-2 conduce al descubrimiento que ADAMTS-14 es también capaz de escindir el colágeno tipo I in vi tro. ADAMTS-3 ha sido propuesto como la N-propeptidasa del procolágeno II mayor. ADAMTS-13 ha sido identificada como una proteasa plasmática que rompe el factor de von Willebrand (vWF) en una unión Tyr-Met específica dentro del dominio A2. La púrpura trombocitopénica trombótica (TTP) es un síndrome caracterizado por trombosis microvascular de bajo contenido de plaquetas, y anemia. Se postula que la falta de escisión apropiada de multímeros grandes de vWF (UL-vWF) liberados de las células endoteliales pueden dar como resultado TTP. El análisis genético de 4 pedigríes familiares de TTP demostró que las mutaciones en el gen ADAMTS-13 fueron responsables en gran medida para este trastorno. ADAMTS-1, ADA TS-4, ADAMTS-5 y ADAMTS-9 han mostrado que son capaces de escindir los proteoglicanos de matriz extracelular con grados variantes de eficiencia. Por ejemplo, ADAMTS-1, ADAMTS-4 y ADAMTS-5 pueden romper el enlace Glu373 , Ala374 en el dominio interglubular (IGD) del agrecano. Ver Caterson, et al., MATRIX BIOLOGY, 19:333-344 (2000). Esta actividad proteolítica es denominada como actividad de agrecanasa, y el enlace Glu373-Ala374 es conocido como el sitio de escisión de agrecanasa. Una proteína que posee la actividad de agrecanasa es llamada una agrecanasa. El enlace Glu373-Ala374 es hidrolizado in vivo durante las enfermedades degenerativas de las articulaciones tales como la osteoartritis . La evidencia sugiere que las agrecanasas son responsables de la escisión primaria del IGD durante la degradación del cartílago. Ver Caterson, et al., supra. Se encontró también que ADAMTS4 juega un papel en la escisión del brevican, un proteoglicano abundante en el cerebro del adulto y, junto con ADAMTS-1, ha mostrado que rompe el versicano. ADAMTS-8, también conocido como Meth2, ha estado implicado en la angiogénesis . Los estudios han mostrado que ADAMTS-8 recombinante puede inhibir la proliferación de células endoteliales in vi tro, y la vascularización en ensayos in vivo. Ver por ejemplo, Vázquez, et al., J. BIOL. CHEM. , 274:23349-23357 (1999). ADAMTS-8 parece perturbar la angiogénesis in vitro e in vivo de manera más eficiente que la trombospondina-1 o la endostaína, pero menos eficientemente que ADAMTS-1. No ha sido identificada la actividad proteolítica para ADAMTS-8. BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención caracteriza el uso de las proteínas ADAMTS-8 aisladas para escindir proteoglicanos . Los métodos adecuados para este propósito comprende poner en contacto una molécula de proteoglicano con una proteína aislada de ADAMTS-8 que rompe la molécula de proteoglicano. En muchas modalidades, la molécula de proteoglicano que es escindida es una molécula de agrecano, y la proteína ADAMTS-8 aislada rompe la molécula de agrecano en el enlace Glu373- Ala . Las proteínas ADAMTS-8 empleadas en la presente invención pueden ser proteínas ADAMTS-8 maduras, de longitud completa. En un ejemplo, la proteína ADAMTS-8 empleada comprende o consiste de los aminoácidos 214-890 de la SEQ ID No.: 28. En otro ejemplo más, la proteína ADAMTS-8 empleada es codificada por GenBank Acceso No. AF060153 pero carece del péptido de señal y el prodominio. La presente invención también caracteriza el uso de los derivados de ADAMTS-8 aislados, para escindir los proteoglicanos . Estos derivados de ADAMTS-8 comprenden un dominio catalítico de metaloproteasa de ADAMTS-8 y poseen actividades de escisión de proteoglicano (por ejemplo, actividad de agrecanasa) de las proteínas de ADAMTS-8 maduras, de longitud completa. La puesta en contacto de tal derivado de ADAMTS-8 con una molécula de proteoglicano (por ejemplo, una molécula de agrecano) rompe la molécula de proteoglicano. En un ejemplo, el dominio catalítico de metaloproteasa de ADAMTS-8 empleado en la presente invención comprende o consiste de los aminoácidos 214-439 de la SEQ ID No.: 28. Un derivado de ADAMTS-8 puede además incluir un dominio similar a la desintegrina de ADAMTS-8 y/o una repetición de trombospondina tipo 1 central de ADAMTS-8. Los derivados de ADAMTS-8 adecuados para la presente invención pueden ser preparados mediante cualesquiera medios convencionales. En muchos casos, los derivados de ADAMTS-8 no incluyen el péptido de señal o el prodominio. Los derivados de ADAMTS-8 pueden ser preparados a partir de las proteínas ADAMTS-8 de longitud completa a través de supresión, inserción o sustitución de los residuos de aminoácidos seleccionados. En una modalidad, el derivado de ADAMTS-8 empleado en la presente invención comprende o consiste de los aminoácidos 214-588 de la SEQ ID No.: 28. Los derivados ADAMTS-7 o ADAMTS-9 que consisten de las secuencias de aminoácidos correspondientes, han mostrado que conservan actividad de agrecanasa de las proteínas originales de longitud completa. En otro aspecto más, la presente invención caracteriza el uso de las proteínas ADAMTS-8 -producidas recombinantemente, o sus derivados para romper proteoglicanos . Los métodos adecuados para este propósito comprenden la expresión de una proteína ADAMTS-8 o un derivado de la misma a partir de un vector de expresión recombinante . La proteína ADAMTS-8 expresada o el derivado rompe una molécula de proteoglicano (por ejemplo, una molécula de agrecano) después del contacto. También proteína o derivado de ADAMTS-8 descrito en la presente, puede ser recombinantemente producido. En muchas modalidades, los vectores recombinantes que codifican para las proteínas ADAMTS-8 o los derivados, son expresadas en células de mamífero que secretan las proteínas expresadas o los derivados hacia el medio de cultivo o las regiones de matriz extracelular . En un ejemplo, el vector de expresión recombinante empleado en la presente invención comprende una secuencia que codifica para los aminoácidos 214-890 de la SEQ ID No.: 28. En otro ejemplo más, un vector de expresión recombinante empleado en la presente invención comprende una secuencia que codifica para los aminoácidos 214-588 de la SEQ ID No.: 28. En otro ejemplo más, un vector de expresión recombinante empleado en la presente invención comprende la proteína que codifica para la secuencia de GenBank Acceso No. AF060153. Los proteoglicanos que son escindidos de acuerdo a la presente invención son localizados en un tejido, un cultivo de tejidos o un cultivo celular. Una proteína ADAM S-8 aislada o recombinantemente producida o un derivado de la misma puede ser distribuido a un tejido mediante cualquier medio convencional, tal como mediante la administración parenteral, intravenosa, tópica, intradérmica, transdérmica o subcutánea, o mediante la introducción de vectores de expresión que codifican una proteína o derivado de ADAMTS-8 dentro de las células seleccionadas, en el sitio del tejido. La presente invención caracteriza además los métodos para la identificación de los moduladores de ADAMTS-8. Estos métodos comprenden: poner en contacto una proteína derivada de ADAMTS-8 con una molécula de proteoglicano (por ejemplo, una molécula de agrecano) en presencia o ausencia de un agente de interés; y medir la actividad de escisión de proteoglicano (por ejemplo, la actividad de agrecanasa) de la proteína o derivado de ADAMTS-8 en presencia o ausencia del agente. Un cambio en la actividad de la escisión del proteoglicano (por ejemplo, la actividad de agrecanasa) en presencia del agente, en comparación a la ausencia de dicho agente, indica que el agente es capaz de modular la actividad de escisión de proteoglicano de - la proteína o derivado de ADAMTS-8. Cualquier proteína o derivado de ADAMTS-8 descrito en la presente puede ser utilizado para seleccionar los moduladores de ADAMTS-8. Los moduladores identificados de acuerdo a la presente invención pueden inhibir (por ejemplo, reducir o eliminar) o aumentar la actividad de escisión del proteoglicano (por ejemplo, la actividad de agrecanasa) de una proteína ADAMTS-8. La presente invención también caracteriza el uso de los moduladores de ADAMTS-8 para tratar enfermedades que son caracterizadas por deficiencias o normalidades en la escisión del proteoglicano (por ejemplo, la escisión del agrecano) . Los métodos adecuados para este propósito comprenden la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un modulador de ADAMTS-8 a un mamífero en necesidad del mismo. Cualquier ruta de administración puede ser utilizada, con la condición de que el modulador de ADAMTS-8 pueda llegar al o a los sitios deseados del tejido, y que sea efectivo en alterar las actividades de escisión de proteoglicano en el o los sitios. Cualquier modulador de ADAMTS-8 identificado por la presente invención puede ser utilizado para tratar deficiencias o anormalidades de los proteoglicanos . Las actividades de escisión de. proteoglicano en un sitio del tejido pueden ser también moduladas por la introducción de una proteína o derivado de ADAMTS-8 aislado, o mediante la expresión de una proteína o derivado de ADAMTS-8 recombinante, en el sitio. Además, las actividades de escisión del proteoglicano en una región de matriz extracelular pueden ser moduladas al inhibir la expresión de ADAMTS-8 en células seleccionadas en la región. Los métodos adecuados para este propósito incluyen, pero no están limitados a, la introducción o expresión de una secuencia de ácido ribonucleico de interferencia (R Ai, por sus siglas en inglés) o antisentido de ADAMTS-8, en las células seleccionadas. En muchos casos, el RNAi o la secuencia antisentido empleada es específica para el gen ADAMTS-8 e incapaz.de inhibir la expresión de otros genes de proteasa. La presente invención también caracteriza las composiciones farmacéuticas que comprenden las proteínas ADAMTS-8 o sus derivados o moduladores. Otras características, objetivos y ventajas de la presente invención son aparentes en la descripción detallada siguiente. Se debe entender, no obstante, que la descripción detallada, mientras que indica las modalidades preferidas de la presente invención, es dada a manera de ilustración únicamente, y no de limitación. Diversos cambios y modificaciones dentro del alcance de la invención se volverán aparentes para aquellos expertos en la técnica a partir de la descripción detallada. BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Las figuras son proporcionadas para ilustración, no limitación. La figura 1 ilustra un árbol filogenético de los miembros de la familia ADAM S . Las secuencias de aminoácidos de múltiples proteínas ADAMTS fueron comparadas utilizando CLUSTALW, y visualizadas utilizando TreeView. El filograma agrupa las proteínas conjuntamente con base en el parentesco de secuencia. La figura 2A muestra un SDS-PAGE al 10% de fracciones de proteína a partir de la purificación Strep-tag® (IBA, Alemania) de las proteínas ADAMTS-8 aisladas de medios condicionados por CHO. El SDS-PAGE fue teñido con Azul Brillante de Comassie. Banda: 1, medio condicionado con célula CHO; banda 2, fracción de flujo de lado a lado (filtrado) proveniente de la ultrafiltración; banda 3, fracción del retenido ultrafiltración, concentrado; banda 4, fracción del flujo de lado a lado de la columna de estreptactina; bandas 5-9, fracciones de lavado de la columna de estreptactina; bandas 10-15, fracciones de elusión de la columna de estreptactina. La figura 2B es una técnica de Western Blot del SDS- PAGE de la figura 2A utilizando un antisuero policlonal anti Strep-Tag II (IBA) . La figura 3A describe un arreglo de expresión de tejidos múltiples del ARNm mensajero (mRNA, por sus siglas en inglés) de 76 diferentes tejidos humanos, sondeados con una sonda del fragmento de cADN proveniente del gen ADAMTS-8 humano . La figura 3B indica las fuentes de mRNA utilizadas por el arreglo de expresión en tejidos múltiples de la figura 3A. Los recuadros en blanco indican que no fue transferido por puntos el mRNA en esas coordenadas. Los tejidos con alta abundancia relativa del mRNA de ADAMTS-8 son pulmón (A8) , aorta (B4) , y corazón fetal (Bll) , con los niveles más bajos del mRNA de ADAMTS-8 detectables en el apéndice (G5) y en diversas regiones del cerebro (Al-Gl, C3-H3, y B3) . La figura 4 demuestra un histograma de los niveles de expresión de mRNA de ADAMTS-8 en muestras clínicas humanas de cartílago libre de enfermedad y osteoartrítico (OA) determinado por PCR en tiempo real. Las muestras W-04 a la W-13 representan cartílago articular de rodilla no afectado por OA ("libre de enfermedad"). Las muestras 77M-96M representan regiones visualmente no afectadas del cartílago articular con OA en etapa tardía ("OA leve") . Las muestras 88S-98S representan secciones severamente afectadas del cartílago articular con OA de etapa tardía ("OA severo") . La abundancia del mRNA de ADAMTS-8 en cada muestra fue reportada como un valor normalizado, al dividir los datos promediados determinados para ADAMTS-8 o los datos promediados determinados para GAPDH de la misma muestra. La figura 5 muestra los resultados de los ensayos de ELISA de inhibición, competitivos, utilizando el anticuerpo monoclonal AGG-C1. Las placas de microtitulación recubiertas con estreptavadina fueron recubiertas con el péptido aggcl biotinilado. Los análisis de inhibición fueron realizados utilizando los siguientes competidores: el péptido sintético GGLPLPKNITEGE (SEQ ID No . : 22, cuadros cerrados), GGLPLP NITEGEARGSVILTVK-CONH2 (SEQ ID No.: 23, cuadros abiertos) , agrecano digerido con ADAMTS-4 (círculos cerrados) , y agrecano no digerido (círculos abiertos) . La figura 6A es una técnica de Western blot del agrecano bovino digerido con ADAMTS-4 y ADAMTS-8, utilizando el anticuerpo monoclonal BC-3. El agrecano bovino fue incubado con o sin ADAMTS-4 o ADAMTS-8 por 16 horas a 37aC. Los productos de digestión fueron separados mediante SDS-PAGE y visualizados mediante inmunotransferencia de Western utilizando el anticuerpo monoclonal BC-3. Banda 1, sin enzima agregada; banda 2, agrecano digerido con ADAMTS-4 (proporción molar 1:20 de enzima : sustrato) ; bandas 3-7, agrecano digerido con ADAMTS-8 a la proporción molar de la enzima: sustrato mostrada por arriba de cada banda. Las exposiciones de migración de los estándares de proteína globular son mostradas a la izquierda de la mancha de transferencia. La figura 6B es una técnica de Western blot del agrecano bovino digerido con ADAMTS-8 utilizando el anticuerpo monoclonal AGG-Cl . El agrecano bovino fue incubado ya sea sin enzima, o con proporciones molares cada vez mayores de ADAMTS- 8 por 16 horas a 372C. Los productos de digestión fueron separados por SDS-PAGE y visualizados mediante inmunotransferencia de Western utilizando el anticuerpo monoclonal AGG-Cl . La proporción molar relativa de enzima : sustrato en cada digestión es indicada. La figura 6C describe una técnica de Western blot del agrecano bovino digerido con ADAMTS-4 utilizando el anticuerpo monoclonal AGG-Cl. El agrecano bovino (12.5 pmol) fue incubado ya sea sin enzima, o con 0.05 ng, 0.1 ng, 0.25 ng, 0.5 ng, o 1 ng de ADAMTS-4, respectivamente, por 16 horas a 37aC. Los productos de digestión fueron separados en SDS-PAGE y visualizados mediante inmunotransferencia de Western utilizando AGG-Cl . La proporción molar relativa de la enzima : sustrato en cada digestión es indicada. La figura 7 muestra el resultado del ensayo de ELISA de inhibición, competitivo, para la actividad de agrecanasa. La curva estándar fue generada mediante la incubación del agrecano bovino con cantidades cada vez mayores de ADAMTS-4 recombinante por 16 horas a 37aC, seguido por la adición del anticuerpo monoclonal AGG-C1 a cada digestión. Este requiere aproximadamente 1 ng de ADAMTS-4 para generar una cantidad de producto de escisión de agrecano que da como resultado 45% de inhibición en el ensayo de ELISA de inhibición competitivo. DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención caracteriza el uso de las proteínas ADAMTS-8 o sus derivados para escindir las moléculas de proteoglicano . La presente invención también caracteriza los métodos para identificar los moduladores de ADAMTS-8 que son capaces de inhibir o de aumentar las actividades proteolíticas de ADAMTS-8. Además, la presente invención proporciona las composiciones farmacéuticas que comprenden proteínas ADAMTS-8 o sus derivados o moduladores. Estas composiciones farmacéuticas pueden ser utilizadas para tratar condiciones que son caracterizadas por deficiencias o anormalidades en la escisión o metabolismo del proteoglicano. Son descritos diversos aspectos de la invención con detalle en las siguientes secciones. No se entiende que el uso de las secciones limite la invención. Cada sección puede aplicar a cualquier aspecto de la invención. En esta solicitud, el uso de "o" significa "y/o" a no ser que se establezca de otro modo.

I. PROTEINAS ADA TS-8 Y SUS DERIVADOS FUNCIONALES La presente invención caracteriza el uso de las proteínas ADAMTS-8 maduras para la escisión del agrecano u otras moléculas de proteoglicano. Las proteínas ADAMTS-8 maduras carecen del péptido de señal y del prodominio. Los ejemplos de las proteínas ADAMTS-8 maduras, adecuadas, incluyen, pero no están limitados, las proteínas ADAMTS-8 maduras de longitud completa (por ejemplo, la proteína ADAMTS- 8 procesada por furina, codificada por GenBank número de acceso- AF060153), y las isoformas de ADAMTS-8 maduras producidas mediante el empalme del RNA alternativo o el procesamiento proteolítico de los dominios auxiliares . El empalme del RNA alternativo, que da como resultado la supresión de una o más repeticiones C-terminales similares a la trombospondina 1, ha sido observado para ciertos miembros de la familia ADAMTS. La eliminación proteolí ica de los dominios auxiliares C-terminal, durante el proceso de maduración ha sido también reportada para ciertos miembros de la familia ADAMTS. La presente invención también contempla el uso de la proteína ADAMTS no procesada para la escisión del agrecano u otras moléculas de proteoglicano. Estas proteínas no procesadas incluyen el péptido de señal o el prodominio. En muchos casos, las proteínas ADAMTS-8 no procesadas son recombinantemente expresadas en células hospederas adecuadas y secretadas hacia el medio de cultivo o las regiones de matriz extracelular . Estas proteínas secretadas típicamente carecen de la secuencia de señal . Estas proteínas pueden ser además proteolíticamente procesadas para eliminar el prodominio. Las proteínas ADATS-8 empleadas en la presente invención pueden ser proteínas de origen natural tal como aquella codificada por el GenBank número de acceso AF060153 o sus productos proteolíticos de origen natural. En un ejemplo, la proteína ADAMTS-8 empleada en la presente invención comprende los aminoácidos 214-890 de la SEQ ID No.: 28. La presente invención también caracteriza el uso de las variantes de las proteínas ADAMTS-8 de origen natural para la escisión del agrecano u otras moléculas de proteoglicano . Estas variantes conservan las actividades de escisión del proteoglicano (por ejemplo, la actividad de agrecanasa) de las proteínas originales . La secuencia de aminoácidos de una variante es sustancialmente idéntica a aquella de la proteína original. En un ejemplo, la secuencia de aminoácidos de una variante tiene al menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, o más de identidad o similitud secuencial global a la proteína original . La identidad o similitud secuencial puede ser determinada utilizando diversos métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la identidad o similitud secuencial puede ser determinada utilizando algoritmos de alineamiento estándares, tales como la herramienta de alineamiento local básico (BLAST, por sus siglas en inglés) descrita en Altschul, et al., J. MOL. BIOL., 215:403-410 (1990), el algoritmo de Needlemna, et al., J. MOL. BIOL., 48:444-453 (1970), el algoritmo de Meyers, et al., COMPUT, APPL. BIOSCI., 4:11-17 (1988), y el análisis de matriz por puntos. Las dotaciones lógicas informáticas (softwares) adecuadas para este propósito incluyen, pero no están limitadas a, los programas BLAST proporcionados por el Nacional Center for Biotechnology Information (Bethesda, MD) y MegAlign proporcionado por DNASTAR, Inc. (Madison, WI) . En un ejemplo, la identidad o similitud secuencial es determinada utilizando los programas GAP de Genetics Computer Group (GCG) (algoritmo de Needlemna-Wunsch) . Los valores por omisión asignados por los programas pueden ser empleados (por ejemplo, la penalidad para una abertura de un espacio vacio en una de las secuencias es de 11 y para extensión del espacio vacío es de 8) . Aminoácidos similares pueden ser definidos utilizando la matriz de sustitución BLOSUM62. Las variantes de la proteína ADAMTS-8 pueden ser de origen natural, tales como por variaciones alélicas o polimorfismo, o deliberadamente manipuladas por ingeniería genética. En muchos ejemplos, las sustituciones conservadoras de aminoácidos pueden ser introducidas dentro de una secuencia de proteína sin cambiar significativamente la estructura o la actividad biológica de la proteína. Las sustituciones conservadoras de aminoácidos pueden ser elaboradas con base en la similitud en la polaridad, en la carga, en la solubilidad, la hidrofobicidad, la hidrofilicidad o _ la naturaleza anfipática de los residuos. Por ejemplo, las sustituciones conservadoras de aminoácidos pueden ser realizadas entre aminoácidos con cadenas laterales básicas, tales como lisina (Lys o K) , arginina (Arg o R) e histidina (His o H) ; aminoácidos con cadenas laterales, tales como ácido aspártico (Asp o D) y ácido glutámico (Glu o E) ; los aminoácidos con cadenas laterales polares sin carga, tales como asparagina (Asn o N) , glutamina (Gln o Q) , serina (Ser o S) , treonina (Thr o T) , y tirosina (Tyr o Y) , y los aminoácidos con cadenas laterales no polares, tales como alanina (Ala o A) , glicina (Gly o G) , valina (Val o V) , leucina (Leu o L) , isoleucina (lie o I) , prolina (Pro o P) , fenilalanina (P e, F) , metionina (Met o M) , triptofano (Trp o W) , y cisteína (Cys o C) . Otras sustituciones adecuadas de aminoácidos son ilustradas en la tabla 1. Tabla 1: Sustituciones ejemplares de aminoácidos Residuos Sustituciones Ejemplares Sustituciones más Originales conservadoras Ala (A) Val, Leu, lie Val Arg(R) Lys, Gln, Asn Lys Asn(N) Gln Gln Asp (D) Glu Glu Cys(C) Ser, Ala Ser Gln(Q) Asn Asn Gly(G) Pro, Ala Ala Residuos Sustituciones Ejemplares Sustituciones más Originales conservadoras His (H) Asn, GIn, Lys, Arg Arg He (D Leu, Val, Met, Ala, Phe, Norleucina Leu Leu (L) Norleucine, lie, Val, Met, Ala, Phe lie Lys(K) Arg, ácido 1 ,4-diamino-butírico, GIn, Asn Arg Met (M) Leu, Phe, lie Leu Phe (F) Leu, Val, lie, Ala, Tyr Leu Pro (P) Ala Gly Ser (S) Thr, Ala, Cys Thr Thr(T) Ser Ser Trp(W) Tyr, Phe Tyr Tyr(Y) Trp, Phe, Thr, Ser Phe Val (V) He, Met, Leu, Phe, Ala, Norleucina Leu Los residuos de aminoácidos de origen no natural pueden ser también utilizados para las sustituciones. Estos residuos de aminoácidos son típicamente incorporados mediante síntesis química de péptidos en vez de por síntesis en sistemas biológicos. Además, las variantes de ADAMTS-8 pueden incluir sustituciones de aminoácidos para incrementar la estabilidad de las moléculas . Otras sustituciones deseables de aminoácidos (ya sea conservadoras o no conservadoras) pueden ser introducidas dentro de las proteínas ADAMTS-8. Por ejemplo, los residuos de aminoácidos importantes para una actividad proteolítica de una proteína ADAMTS-8 pueden ser identificados . Las sustituciones capaces de incrementar o disminuir esa actividad proteolítica pueden ser seleccionadas.

Además, las variantes de ADAMTS-8 pueden incluir modificaciones de los sitios de glucosilación. Estas modificaciones pueden involucrar sitios de glucosilación 0- enlazados o N-enlazados. Por ejemplo, los residuos de aminoácidos de los sitios de reconocimiento de glucosilación enlazados a la asparagina pueden ser sustituidos o suprimidos, dando como resultado la glucosilación parcial o la abolición completa de la glucosilación. Los sitios de reconocimiento enlazados a asparagina comprenden típicamente secuencias tripeptídicas que son reconocidas por enzimas de glucosilación celulares apropiadas. Estas secuencias tripeptídicas pueden ser, por ejemplo, asparagina-X-treonina o asparagina-X-serina, donde X es usualmente cualquier aminoácido. Una variedad de sustituciones o supresiones de aminoácidos en una o ambas de la primera o tercera posiciones de aminoácido de un sitio de reconocimiento de glucosilación (o supresión del aminoácido en la segunda posición) puede dar como resultado la no glucosilación en la secuencia tripeptídica modificada. Adicionalmente, la expresión bacteriana también da como resultado la producción de proteínas no glucosiladas , incluso si los sitios de glucosilación son dejados sin modificar. Otros tipos de modificaciones también pueden ser introducidas dentro de una variante ADAMTS-8. Estas modificaciones pueden ser introducidas mediante procesos de origen natural, tales como las modificaciones post- traduccionales, . o por procesos artificiales o ¦ sintéticos . Las modificaciones pueden ocurrir en cualquier sitio en el polipéptido, incluyendo la cadena principal, las cadenas laterales de aminoácidos y los extremos amino o carboxilo. El mismo tipo de modificación puede estar presente al mismo o a diversos grados en diversos sitios en una variante. Una variante puede también incluir muchos diferentes tipos de modificaciones. Las modificaciones adecuadas para esta invención incluyen, pero no están limitadas a, acetilación, acilación, ADP-ribosilación, amidación, enlace covalente de flavina, enlace covalente de una porción hemo, enlace covalente. de un nucleótido o derivado de nucleótido, enlace covalente de un lípido o derivado de lípido, enlace covalente del fosfatidilinositol , reticulación, ciclización, formación de enlaces disulfuro, desmetilación, formación de reticulaciones covalentes, formación de cisteína, formación de piroglutamato, formilación, gamma-carboxilación, glucosilación, formación de ancla GPI, hidroxilación, yodación, mutilación, miristoilación, oxidación, pegilación, procesamiento proteol tico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, sulfatación, adición de aminoácidos mediada por RNA de transferencia a proteínas tales como arginilación, ubiquitinación o cualquier combinación de las mismas. Una variante polipeptídica puede ser ramificada (por ejemplo, como resultado de la ubiquitinación) o cíclica, / con o sin ramificación. Una variante de ADAMTS-8 empleada en la presente invención puede ser sustancialmente idéntica a la proteína ADAMTS-8 original en una o más regiones, pero divergente en otras regiones. Una variante de ADAMTS-8 puede conservar la estructura del dominio entera de la proteína ADAMTS-8 original . En una modalidad, es preparada una variante mediante la modificación de al menos 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, o más residuos de aminoácidos de una secuencia ADAMTS-8 de origen natural. Las modificaciones ejemplares incluyen, pero no están limitadas a, sustitutos, supresiones e inserciones. Las sustituciones pueden ser conservadoras, no conservadoras, o ambas. Estas modificaciones no afectan de manera significativa las actividades proteolíticas (por ejemplo, actividad de agrecanasa) de la proteína original. Por ejemplo, una variante puede conservar al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%·, 70%, 80%, 90%, o más de una actividad proteolítica (por ejemplo, actividad de agrecanasa) de la proteína ADAMTS-8 original. Una variante puede también tener -una actividad proteolítica mejorada (por ejemplo, actividad de agrecanasa mejorada) en comparación a la proteína ADAMTS-8 original . La presente invención caracteriza además el uso de los derivados de ADAMTS-8 para la escisión de las moléculas de agrecano o proteoglicano . Estos derivados de ADAMTS-8 son proteínas ADA TS-8 modificadas con supresiones o modificaciones de uno o más residuos de aminoácidos. Eri un ejemplo, un derivado de ADAMTS-8 incluye la supresión de una porción sustancial de un dominio auxiliar de una proteína ADAMTS-8 de longitud completa. En otro ejemplo, un derivado de ADAMTS-8 incluye la supresión del dominio espaciador y la repetición C-terminal, similar a la trombospondina I, a partir de una proteína ADAMTS-8 de longitud completa. Cualquier región después del dominio espaciador y la repetición C- terminal similar a la trombospondina I, puede ser también suprimida . En una modalidad, un derivado de ADAMTS-8 empleado en la presente invención incluye la supresión de una porción sustancial de los residuos de aminoácidos localizados después de Phe588 de la SEQ ID No.: 28. Los truncamientos de ADAMTS-7 o ADAMTS-9 con supresión de las secuencias correspondientes han mostrado que conservan la actividad de agrecanasa de las proteínas originales. Los residuos de aminoácidos suprimidos de la proteína ADAMTS-8 de longitud completa pueden incluir, sin limitación 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% de los residuos de aminoácidos que están localizados C-terminales a Phe588. Los residuos suprimidos de aminoácidos pueden ser seleccionados del dominio rico en cisteína, el dominio espaciador, la repetición C-terminal, similar a la trombospondina 1, o cualquier región localizada entre éstas, o después de éstas. Los residuos suprimidos pueden ser contiguos o no contiguos. En un ejemplo, un derivado de ADAMTS-8 comprende o consiste de los aminoácidos 214-588 de la SEQ ID No.: 28. Los residuos de aminoácidos en la región N-terminal de una proteína ADAMTS-8 pueden ser también modificados, por ejemplo, ciertos residuos seleccionados en las secuencias de señal, el prodominio, el dominio catalítico de metaloproteasa, el dominio similar a la desintegrina, o la repetición central de trombospondina tipo I pueden ser suprimidos o de otro modo modificados sin reducir significativamente las actividades proteolíticas (por ejemplo, actividad de agrecanasa) de la proteína ADAMTS-8. Los polipéptidos adicionales pueden ser fusionados al extremo N o C de una proteína ADAMTS-8 o sus derivados funcionales. Los ejemplos no limitantes de estos polipéptidos incluyen marcadores peptídicos, enzimas, anticuerpos, receptores, proteínas de enlace al ligando, receptor o combinaciones de los mismos . Los anticuerpos adecuados para este propósito incluyen, pero no están limitados a, anticuerpos policlonales , monoclonales , monoespecíficos , poliespecífieos, no específicos, humanizados, humanos, de cadena simple, quiméricos, sintéticos, recombinantes , híbridos, mutados, injertados, o generados in vitro. Pueden ser también utilizados fragmentos de anticuerpos. Los ejemplos de estos fragmentos de anticuerpo, incluyen, pero no están limitados a, Fab, F(av')2/ Fv, Fd o dAb. Los marcadores peptídicos pueden ser también agregados a una proteína ADAMTS-8 o sus derivados. Los marcadores peptídicos adecuados incluyen, pero no están limitados a, Strep-tag® (IBA) , el marcador de poli- istidina o el marcador de poli-histidina-glicina, el marcador de epitopo FLAG, el péptido de epitopo KT3 , el polipéptido del marcador flu HA, el marcador c-myc, la glucoproteína D de herpes simple, la beta-galactosidasa, la proteína de enlace a la maltosa, el marcador de estreptavidina, el péptido de epitopo de tubulina, el marcador peptídico proteico T7 del gen 10, y la S-transferasa del glutatión. Los anticuerpos contra estos marcadores peptídicos pueden ser fácilmente obtenidos de una variedad de fuentes comerciales . Los anticuerpos representativos incluyen el anticuerpo 12CA5, contra el polipéptido marcador flu HA, los anticuerpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 y 9E10 contra el marcador c-myc. Los ligadores peptídicos pueden ser agregados entre un marcador peptídico y la proteína original, para " aumentar la accesibilidad del marcador peptídico . El o los sitios proteolíticamente escindibles pueden ser introducidos entre un polipéptido agregado y la proteína original. Estos sitios escindibles permiten la separación de la proteína original del polipéptido agregado . Las enzimas adecuadas para este propósito incluyen, pero no están limitadas a, factor Xa, trombina o enterocinasa . Los polipéptidos agregados pueden ser utilizados para facilitar la purificación de las proteínas, la detección, la inmovilización, el plegamiento o la dirección al objetivo, o para servir otros propósitos deseados . Estos polipéptidos pueden ser también utilizados para incrementar la expresión, la solubilidad o la estabilidad dé las proteínas de fusión. En muchas modalidades, los polipéptidos agregados no afectan de manera significativa las actividades proteolíticas (por ejemplo, la actividad de agrecanasa) de las proteínas de fusión. II. POLINUCLEOTIDOS QUE CODIFICAN PARA LAS PROTEINAS ADAMTS-8 0 SUS DERIVADOS FUNCIONALES Los polinucleotidos que codifican para las proteínas ADAMTS-8 o sus derivados, pueden ser preparados utilizando una variedad de métodos . Estos polinucleotidos pueden ser DNA, RNA, u otras moléculas de ácido nucleico expresables . Estas pueden ser de una sola hebra o de doble hebra. En una modalidad, se utilizan GenBank acceso número AF060153 para la preparación de las secuencias de codificación de las proteínas ADAMTS-8 o sus derivados. Pueden ser introducidas supresiones u otras modificaciones dentro de secuencia de codificación de la proteína de GenBank Acceso número AF060153 utilizando técnicas de DNA recombinantes , estándares. Las técnicas ejemplares de supresión/modificación de DNA incluyen, pero no están limitadas a, mutagénesis mediada por PCR, mutagénesis de "bucle" dirigida al oligonucleótido, extensión de traslape de PCR, digestión controlada en el tiempo con exonucleasa III, procedimiento de megacebador, PCR inversa y síntesis automatizada de DNA. Pueden ser también utilizadas bibliotecas de supresión. Estas bibliotecas de supresión incluyen las secuencias de codificación para las proteínas ADAMTS-8 N- terminal, C-terminal o suprimida interna. Los métodos ejemplares para la construcción de las bibliotecas de supresión incluyen, pero no están limitadas a, aquella descrita en Pues et al., NUCLEIC ACIDS RES., 25:1303-1305 (1997) . Para generar bibliotecas de supresión de ADAMTS-8 pueden ser también utilizados equipos de supresión comerciales, tales como la máquina de supresión basada en plásmido EZ::TN y el equipo de transposición de cósmido de supresión pWEB: :TNCm (Epicentro, Madison, WI) . Las supresiones que conservan la actividad proteolítica de la proteína ADAMTS-8 original pueden ser seleccionadas . Los polinucleótidos empleados en la presente invención pueden ser modificados para incrementar sus estabilidades in vivo. Las posibles modificaciones incluyen, pero no están limitadas a, la adición de las secuencias blanqueantes en el extremo 5' ó 3 ' ; el uso del fosforotioato o 2-0-metilo en vez de los enlaces fosfodiesterasa en la cadena principal; y la inclusión de bases no tradicionales tales como inosina, queosina y wibutosina, así como acetil-, metil-, o tio-, u otras formas modificadas de adenina, citidina, guanina, timina o uridina. La presente invención también caracteriza los vectores de expresión que codifican para las proteínas ADAMTS-8 o sus derivados funcionales. Estos vectores de expresión comprenden secuencias reguladoras no traducidas 5' ó 3' operablemente enlazadas a una secuencia que codifica para la proteína, que codifica para una proteína ADAMTS-8 o un derivado funcional de la misma. El diseño de los vectores de expresión dependen de los factores tales como la elección de las células hospederas y los niveles de expresión deseados. Los ejemplos no limitantes de los vectores de expresión adecuados incluyen vectores de expresión bacterianos, vectores de expresión en levadura, vectores de expresión en células de insecto y vectores de expresión en mamífero. Los vectores virales pueden ser utilizados, tales como los vectores retrovirales, lentivirales, adenovirales, virales adenoasociados, virales del herpes, alfavirus, astrovirus, coronavirus, ortomixovirus, papovavirus, paramixovirus, parvovirus, picornavuris, poxvirus o togavirus . Un vector de expresión empleado por la presente invención puede ser controlado ya sea por un promotor constitutivo o uno inducible.

La presente invención también contempla el uso de los promotores específicos de tejido o regulados en el desarrollo. Los ejemplos de los promotores adecuados específicos del tejido incluyen, pero no están limitados a, promotores específicos del cartílago, promotores específicos del cerebro, promotores específicos del pulmón, promotores específicos de la aorta, promotores específicos del apéndice, promotores específicos del hígado, promotores específicos de linfoides, promotores específicos del páncreas, promotores específicos de las glándulas mamarias, promotores específicos de los condrocitos, promotores específicos de las neuronas, promotores específicos de las células gliales, y promotores específicos de las células T. Los ejemplos de promotores regulados en el desarrollo incluyen, pero no están limitados a, el promotor de oc-fetoproteína . El uso de los promotores específicos del tejido o regulados en el desarrollo permite la expresión seleccionada de las proteínas ADAMTS-8 o sus derivados en tejidos predeterminados o en etapas del desarrollo específicas. Los sistemas de expresión regulables pueden ser también utilizados para la expresión de las proteínas ADAMTS-8 o sus derivados . Los sistemas adecuados para este propósito incluyen, pero no están limitados a, el sistema Tet-on/off, el sistema Ecdisone, el sistema de Progesterona y el sistema de Rapamicina .

III. EXPRESION Y PURIFICACION DE LAS PROTEINAS ADAMTS-8 O SUS DERIVADOS FUNCIONALES Los vectores de expresión que codifican para las proteínas ADAMTS-8 o sus derivados funcionales pueden ser estable o transitoriamente introducidos dentro de las células hospederas para la expresión. Las proteínas expresadas pueden ser aisladas de las células- hospederas utilizando medios convencionales . Las células hospederas adecuadas para este propósito incluyen, pero no están limitadas a, células eucarióticas (por ejemplo, células de mamífero, células de insecto o células de levadura) y células procarióticas (por ejemplo, bacterias) . Los ejemplos no limitantes de las células hospederas eucarióticas adecuadas incluyen células de ovario de hámster Chino (CHO) , células HeLa, células COS, células 293, y células CV-1. Las células hospederas eucarióticas proporcionan usualmente modificaciones post-traduccionales deseadas, tales como glucosilación, para las proteínas expresadas. Los' ejemplos no limitantes de las células hospederas procarióticas adecuadas incluyen, E. coli (por ejemplo HB101, MC1061) , B. subtilis y Pseudomonas. Las células hospederas empleadas en la presente invención pueden ser líneas celulares, cultivos de células primarias, o cultivos celulares . Estas pueden ser también células en animales transgénicos o quiméricos . La selección de las células hospederas adecuadas y los métodos para el cultivo, la transíección-transformación, la amplificación, la selección y la producción y purificación del producto, es un asunto de diseño rutinario dentro del nivel de experiencia ordinaria en la técnica. En una modalidad, una proteína ADAMTS-8 o un derivado funcional de la misma es expresada en células hospederas de mamífero que secretan la proteína expresada hacia el medio de cultivo. El producto secretado puede ser aislado y purificado utilizando técnicas estándares de aislamiento/purificación, tales como la cromatografía de afinidad (incluyendo cromatografía de inmunoafinidad, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de exclusión de tamaño, HPLC, precipitación de proteína (incluyendo inmunoprecipitación) , solubilización diferencial, electroforesis, centrifugación, cristalización, o cualquier combinación de las mismas. Los marcadores de purificación, tales como el marcador de estreptavidina, el marcador FLAG, el marcador de polihistidina, o la glutation-S-transferasa, pueden ser utilizados para facilitar el aislamiento de la proteína expresada. Los marcadores de purificación pueden ser escindidos a partir de la proteína expresada después de su purificación. Los' marcadores de purificación pueden ser también utilizados para el aislamiento o purificación de las proteínas ADAMTS-8 no secretoras, a partir de los lisados celulares. En otra modalidad más, una proteína ADAMTS—8 o un derivado funcional de la misma, es expresado en células hospederas procarióticas y concentrada en los cuerpos de inclusión de estas células. La proteína concentrada puede ser solubilizada a partir de los cuerpos de inclusión, replegada y luego aislada utilizando los métodos descritos anteriormente. Una proteína ADAMTS—8 aislada o su derivado puede ser analizado o verificado utilizando técnicas estándares tales como SDS-PAGE o inmunotransferencias . La proteína aislada puede ser también analizada mediante secuenciamiento de proteínas o espectroscopia de masas. En un ejemplo, una banda de proteína de interés en un SDS-PAGE es extirpada manualmente del gen, y luego reducida, alquilada y digerida con tripsina o endopeptidasa Lys-C (Promega, Madison, wi) . La digestión puede ser conducida in situ utilizando un robot de digestión en gel, automatizado. Después de la digestión, Los extractos peptídicos pueden ser expresados y 'separados mediante HPLC de fase inversa de microelectrorrocío . Los análisis de péptidos pueden ser utilizados sobre un espectrómetro de masa de trampa de iones Finnigan LCQ (ThermoQuest, San José, CA) . El análisis automático de datos de MS/MS puede ser realizado utilizando el algoritmo de computadora SEQUEST incorporado en el paquete de análisis de datos de Finnigan Bioworks (ThemoQuest , San José, CA) . La presente invención también caracteriza la expresión de las proteínas ADAMTS-8 o sus derivados en los sistemas de transcripción y traducción libres de células. Los sistemas de expresión libres de células, adecuadas, incluyen pero no están limitadas a, extractos de germen de trigo, lisados de reticulocitos , y extractos nucleares HeLa. Las proteínas expresadas pueden ser aisladas o purificadas utilizando los métodos descritos anteriormente. IV. DETECCION DE LAS ACTIVIDADES PROTEOLITICAS La actividad de agrecanasa puede ser evaluada utilizando el ensayo del péptido fluorescente, el análisis de Western blot de neoepitopo, la ELISA de agrecano, y el ensayo de actividad. Los primeros dos ensayos son adecuados para detectar la capacidad de escisión en el enlace Glu373-Ala374 en el IGD del agrecano. En el ensayo de péptido fluorescente, una proteína ADAMTS-8 (o un derivado de la misma) es incubada con un péptido sintético que contiene la secuencia de aminoácidos en el sitio de escisión de agrecanasa. El extremo N o el extremo C del péptido sintético es marcado con un fluoroforo y el otro extremo incluye un apagador. La escisión del péptido separa el fluoroforo y el apagador, con lo cual se promueve la fluorescencia. La fluorescencia relativa puede ser utilizada para determinar la actividad de agrecanasa relativa de la proteína . En el ensayo Western blot del neoepitopo, una proteína ADAMTS-8 (o un derivado de la misma) es incubada con el agrecano intacto. Los productos de escisión son luego sometidos a varios tratamientos bioquímicos . antes de ser separados por un SDS-PAGE. Los tratamientos bioquímicos incluyen, por ejemplo, diálisis, tratamiento con condroitinasa, liofilización, y reconstitución. Las muestras de proteínas en el SDS-PAGE son transferidas a una membrana (tal como un papel de nitrocelulosa) , y teñidas con un anticuerpo específico del neoepitopo. El anticuerpo del neoepitopo reconoce específicamente una nueva secuencia de aminoácidos N- o C-terminal expuesta por la escisión proteolítica del agrecano. El anticuerpo no se enlaza a tal epitopo sobre la molécula original o no escindida. Los anticuerpos del noepitopo adecuados incluyen, pero no están limitados a, MAb, BC-13, MAb BC-3 , y .el anticuerpo I19C. Ver por ejemplo, Caterson et al., supra; y Hashimoto, et al., FEBS LETTERS, 494:192-195 (2001). En un ejemplo, los fragmentos de agrecano escindidos son visualizados utilizando un anticuerpo secundario conjugado a fosfatasa alcalina, y el cromógeno nitroazul de tetrazolio, y el sustrato fosfato de bromocloroindolilo (NBT/BCIP) . La densidad relativa de las bandas es indicadora de la actividad relativa de agrecanasa. La ELISA de agrecano puede ser utilizada para detectar cualquier escisión en una molécula de agrecano. En este ensayo, la proteína ADAMTS-8 (o un derivado de la misma) es incubada con el agrecano intacto que ha sido previamente adherido a pozos de plástico. Los pozos son lavados y luego incubados con un anticuerpo que detecta el agrecano . Los pozos son revelados con un anticuerpo secundario. Si la cantidad original del agrecano permanece en los pozos, la tinción del anticuerpo podría ser densa. Si el agrecano es digerido por la proteína ADAMTS-8 (o su derivado) , la molécula de agrecano enlazada saldrá de los pozos, con lo cual se reduce la tinción subsecuente por el anticuerpo. Este ensayo puede detectar si una proteína ADAMTS-8 (o un derivado de la misma) es capaz de escindir el agrecano. La actividad de escisión relativa puede ser también determinada utilizando este ensayo. En el ensayo de actividad, las placas de microtitulación son primeramente recubiertas con ácido hialurónico (ICN) , seguido por el agrecano bovino tratado con clondroitinasa. La clondroitinasa puede ser obtenida, por ejemplo, de Seikagaku Chemicals. El medio de cultivo que contiene una proteína ADAMTS-8 (o un derivado de la misma) es agregada en placas recubiertas con el agrecano . El agrecano escindido en Glu373-Ala374 dentro del IGD es lavado. El agrecano no escindido remanente puede ser detectado con el anticuerpo 3B3 (ICN) , seguido por el anticuerpo secundario anti-IgM-HRP (Southern Biotechnology) . El desarrollo de color final puede ser obtenido, utilizando, por ejemplo, 3,3", 5,5"-tetrametilbencidina (TMB, BioFx Laboratories) . Las actividades proteolíticas contra el brevicano, versicano, neurocano u otros proteoglicanos o proteínas de matriz extracelulares pueden ser también evaluadas utilizando medios convencionales. Ver por ejemplo, Somerville, et al., J. BIOL. CHEM. , 278 : 9503-9513 ( 2003 ) (que describen ensayos para evaluar las actividades de versicanasa) . Estos métodos involucran típicamente poner en contacto una proteína ADAMTS-8 (o un derivado de la misma) con una molécula de proteoglicano, seguido por la detección de cualquier escisión de la molécula de proteoglicano. V. DESARROLLO DE LOS INHIBIDORES DE ADAMTS-8 , POLINUCLEOTIDOS ANTISENTIDO Y SECUENCIAS DE RNAi La presente invención caracteriza la identificación de los inhibidores de ADAMTS- 8 . Un ensayo de selección adecuado para este propósito incluye poner en contacto una proteína ADAMTS-8 (o un derivado de la misma) con un sustrato de proteoglicano en presencia o ausencia de un compuesto de interés. La actividad proteolítica de la proteína ADAMTS-8 (o sus derivados) es evaluada en ausencia o presencia del compuesto para determinar si el compuesto tiene algún efecto inhibitorio sobre la ' actividad proteolítica. Ver por ejemplo, Hashimoto, et al., supra. Los ensayos de selección de alto rendimiento o las bibliotecas de compuesto pueden ser empleadas para facilitar la identificación de los inhibidores de ADAMTS-8. Los aumentadores de ADAMTS-8 pueden ser similarmente identificados-.

Los inhibidores de ADAMTS-8 pueden ser también identificados utilizando análisis estructural tridimensional o diseño de fármacos ayudados por computadora. El último método involucra la determinación de los sitios de enlace para los inhibidores basados en estructuras tridimensionales de las proteínas ADAMTS-8 y sus sustratos de piroteoglicano (por e emplo, agrecano) . Las moléculas reactivas con el o los sitios de enlace sobre ADAMTS-8 o sus sustratos, son seleccionadas . Las moléculas candidatas son luego evaluadas para determinar un efecto inhibitorio. Otros métodos que son adecuados para desarrollar inhibidores de proteasa pueden ser también utilizados para la identificación de los inhibidores de ADAMTS-8. Inhibidores de ADAMTS-8 pueden ser, por ejemplo, proteínas, péptidos, anticuerpos, compuestos químicos, o moléculas pequeñas . En una modalidad, un inhibidor de ADAMTS—8 identificado por la presente invención puede inhibir al menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ó más de una actividad proteolítica (por ejemplo, actividad de agrecanasa) de una proteína ADAMTS-8. En otra modalidad más, un inhibidor de ADAMTS-8 identificado por la presente invención puede inhibir específicamente una actividad proteolítica de una proteína ADAMTS-8 pero no de otras proteasas diferentes a ADAMTS, tales como MMPs . En otra modalidad más, un inhibidor de ADAMTS-8 identificado por la presente invención puede inhibir específicamente una actividad proteolítica de una proteína ADAMTS-8 pero no otros miembros de la familia ADAMTS. Por "inhibir específicamente" se entiende que un inhibidor puede reducir o eliminar una actividad de la proteína diana u objetivo, pero no afecta significativamente las actividades de otras proteínas. En algunos ejemplos, los inhibidores específicos para las proteínas ADAMTS-8 inhiben menos del 10%, 5% ó 1% de las actividades de otras proteasas . En algunos otros ejemplos, los inhibidores específicos para las proteínas ADAMTS-8 no tienen efecto detectable sobre otras proteasas. Los inhibidores de ADAMTS-8 de la presente invención pueden ser utilizados para determinar la presencia o la ausencia de, o para cuantificar, las proteínas ADAMTS-8 en una muestra. Mediante la correlación de la presencia o el nivel de expresión de las proteínas ADAMTS-8 con una enfermedad, una persona experta en la técnica puede utilizar proteínas ADAMTS-8 como marcadores biológicos para el diagnóstico de la enfermedad o la determinación de su severidad. Donde los inhibidores de ADAMTS-8 están destinados para fines de diagnóstico, puede ser deseable modificar los inhibidores, por ejemplo, con un grupo ligando (por ejemplo biotina u otras moléculas que tienen socios de enlace específicos) o un grupo marcador detectable (por ejemplo, un fluoróforo, un cromóforo, un átomo radioactivo, un reactivo tenso en electrones o una enzima) . Las moléculas que tienen socios de enlace específicos, incluyen pero no están limitadas a, biotina y avidina o estreptavidina, IgG y proteína A, y numerosos pares del receptor-ligando conocidos en la técnica. Los marcadores enzimáticos que son conjugados a los inhibidores de ADAMTS-8 pueden ser detectados por sus actividades enzimáticas. Por ejemplo, la peroxidasa de rábano puede ser detectada por su habilidad para convertir la tetrametilbencidina (TMB) a un pigmento azul, en cual es cuantificable por un espectrofotómetro . La presente invención también caracteriza los polinucleótidos que son antisentido para las secuencias ADAMTS-8. Un polinucleotido antisentido puede formar enlaces de hidrógeno al polinucleotido en sentido que codifica para una proteína ADAMTS-8. Un polinucleotido antisentido puede ser complementario a una región de codificación o de no codificación de una secuencia ADAMTS-8. Un polinucleotido antisentido puede ser complementario a la hebra entera de un transcrito de ADAMTS-8 o únicamente a una porción del mismo. Un polinucleotido antisentido puede incluir, sin limitación, aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más residuos de nucleótidos . Cualquier método conocido en la técnica puede ser utilizado para preparar los polinucleótidos antisentido. En una modalidad, los polinucleótidos antisentido son químicamente sintetizados utilizando nucleótidos de origen natural. En otra modalidad más, los polinucleótidos antisentido son sintetizados utilizando nucleotidos modificados para incrementar la estabilidad biológica de las moléculas o la estabilidad física del dúplex formado entre los polinucleótidos antisentido y en sentido. Los ejemplos de nucleotidos modificados incluyen, pero no están limitados a, derivados de fosforotioato, nucleotidos sustituidos con acridina, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5- yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5- (carboxihidroximetil ) -uracilo, 5-carboximetilaminometilo-2- tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, beta-D-galactosilqueosina, inosina, ?ß-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2 , 2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5~ metilcitosina, N6-adenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilgueosina, 5 ' -metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2~metiltio-N6-isopenteniladen4exina, ácido uracil-5-oxiacético (v) , ibutoxosina, pseudouracilo, gueosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, éster metílico del ácido uracil- 5-oxiacético, 3- (3-amino-3-N-2-carboxipropil) -uracilo, (acp3)w, y 2 , 6-diaminopurina . Los polinucleótidos antisentido pueden ser preparados utilizando nucleotidos de origen natural y modificados .

En otra modalidad más, los polinucleótidos antisentido son producidos biológicamente utilizando vectores de expresión. Estos vectores de expresión codifican para los polinucleótidos en una orientación tal que el ARN transcrito a partir de éstos es de una orientación antisentido a los polinucleótidos objetivo. En otra modalidad más, las moléculas antisentido son moléculas de polinucleótidos -anomérico. Las moléculas de polinucleótidos a-anomérico pueden formar híbridos específicos de. doble hebra con el RNA complementario, en el cual, de manera contraria a las unidades ß usuales, las hebras corren paralelas una a la otra. En otra modalidad más, las moléculas antisentido incluyen 2 ' -o-metilribonucleótidos o análogos de KNA-DNA quiméricos . En otra modalidad más, las moléculas antisentido son ribozimas . Las ribozimas son moléculas catalíticas de ARN que pueden escindir los polinucleótidos de una sola hebra (por ejemplo, mRNA) para los cuales éstos tienen una región complementaria. Las ribozimas específicas para el RNA de ADAMTS-8 pueden ser diseñadas o seleccionadas utilizando diversos métodos conocidos en la técnica. En una modalidad adicional, las moléculas antisentido son capaces de formar una estructura helicoidal triple con una región reguladora del gen ADAMTS-8, con lo cual se previene la transcripción ADAMTS-8.

Los polinucleótidos antisentido son típicamente administrados a un sujeto en composiciones farmacéuticas, o generados in situ a partir de vectores de expresión. En un ejemplo, los polinucleótidos antisentido son directamente inyectados a un sitio del tejido- (por ejemplo, cartílago articular) . En otro ejemplo más, los polinucleótidos antisentido son administrados sistémicamente . Para la administración sistémica, las moléculas antisentido pueden ser primeramente modificadas tal que éstas pueden enlazarse específicamente a receptores o antígenos expresados sobre la superficie de una célula seleccionada. Los vectores de expresión que codifican para las moléculas antisentido pueden ser administrados a un sitio de tejido mediante cualquier medio convencional . Para lograr concentraciones intracelulares suficientes de las moléculas antisentido, pueden ser utilizados promotores fuertes, tales como el promotor pol II o pol III, en los vectores de expresión. Las moléculas antisentido directamente administradas o producidas por el vector, pueden hibridarse o enlazarse al mKNA celular o al DNA genómico, con lo cual se inhibe la traducción o la transcripción de las proteínas ADAMTS-8. La presente invención contempla además el uso del R A de interferencia ("KNAi") para inhibir la expresión de las proteínas ADAMTS-8. RNAi proporciona un mecanismo de silenciamiento de genes al nivel del mKNA. Las secuencias de RNAi de la presente invención pueden tener cualquier longitud deseada. En muchos casos, las secuencias de RNAi tienen al menos 10 , 15 , 20 , 25 ó más nucleótidos consecutivos. Las secuencias de RNAi pueden ser dsRNA u otros tipos de polinucleótidos , con la condición de que éstos puedan formar un completo de silenciamiento funcional para degradar el transcrito de mRNA objetivo. En una modalidad, las secuencias de RNAi de la presente invención, comprenden o consisten de un RNA de interferencia corto (siRNA) . En muchas aplicaciones, los siRNA son dsRNA que tienen aproximadamente 19 a 25 nucleótidos. Los siRNAs pueden ser producidos endógenamente mediante degradación de moléculas más largas de dsRNA mediante una nucleasa Dicer relacionada a la RNAasa III. Los siRNAs pueden ser también introducidos dentro de las células exógenamente o mediante la transcripción a partir de los vectores de expresión. Una vez producidos, los siRNAs se ensamblan con los componentes proteicos para formar complejos que comprenden endorribonucleasa producidos como complejos de silenciamiento inducidos por el RNA (RISCs) . Los RISCs activados rompen y destruyen los transcriptos de mRNA complementarios . Esta degradación del mRNA específica de la secuencia da como resultado silenciamiento del gen. Al menos dos métodos pueden ser empleados para lograr el silenciamiento de genes mediados por el siRNA. En el primer método, los siRNAs son sintetizados in vitro y luego introducidos dentro de las células para suprimir transitoriamente la expresión del gen. Los siRNAs sintéticos proporcionan una manera fácil y eficiente para lograr el RNAi. En muchas modalidades, los siRNAs son dúplex de oligonucleótidos mixtos cortos que incluyen aproximadamente 19-23 nucleótidos con protuberancias 3-dinucleotídicas simétricas (por ejemplo, las protuberancias UU o dTdT 3'). Estos siRNAs pueden suprimir específicamente la producción dirigida al gen en células de mamífero sin activación de la cinasa proteica dependiendo del DNA (PKR) . Se ha reportado que la activación de PKR provoca represión no específica de la traducción de muchas proteínas . En el segundo método, los siRNAs son expresados a partir de los vectores . Este procedimiento puede ser utilizado para expresar estable o transitoriamente los siRNAs en las células o en animales transgénicos . En una modalidad, los vectores de expresión de siRNAs son manipulados por ingeniería genética para impulsar la transcripción del siRNA a partir de las unidades de transcripción de polimerasa III (pol III) . En muchos casos, las unidades de transcripción pol III emplean un sitio de terminación de la transcripción rico en AT, corto, que conduce a la adición de protuberancias de dos pares de bases (por ejemplo UU) a los siRNAs de orguilla - una característica que es de auxilio para la función del siRNA.

Los vectores de expresión de pol III pueden ser también utilizados para crear animales transgénicos que expresan siRNAs. Además, los promotores específicos de tejidos pueden ser utilizados para expresar siRNAs en células o tejidos seleccionados . Puede ser empleado un procedimiento similar para crear animales inactivados en un gen (agénicos) específicos del tejido. En otra modalidad más, los ARNs de doble hebra, largos (dsR As) son primeramente expresados a partir de un vector. Los dsRNAs largos son luego procesados en siRNAs por Dicer para generar el silenciamiento específico del gen. Numerosas protuberancias 3 ' dinucleotídicas (por ejemplo, UU) pueden ser utilizadas para el diseño del siRNA. En algunos casos, los residuos de G sobresalientes son evitados para reducir el riesgo de que el siRNA sea escindido por la RNAasa de los residuos de G de una sola hebra. En una modalidad, los siRNAs de la presente invención tienen aproximadamente 30 a 50% de contenido de GC. En otra modalidad más, tramos de más de 4 Ts o As consecutivos en la secuencia objetivo son evitados cuando se diseñan los siRNAs que van a ser expresados a partir de un promotor pol III de RNA. En otra modalidad más, los siRNAs son seleccionados tal que la secuencia de mRNA objetivo no es altamente estructurada o enlazada por las proteínas reguladoras. En otra modalidad más, los sitios objetivo potenciales son comparados a la base de datos genómica apropiada. Las secuencias objetivo con más de 16 a 17 pares de bases contiguos de homología a otras secuencias de codificación, pueden ser eliminadas de la consideración. En otra modalidad más, los siR As son diseñados para tener dos repeticiones invertidas separadas por una secuencia espaciadora corta y terminan con una hebra de Ts que sirve como sitio de terminación de la transcripción. Este diseño produce un transcrito de RNA que se predice se pliega en un siRNA de orquilla corto. La selección de la secuencia objetivo de siRNA, la longitud de las repeticiones invertidas que codifican el tallo de una orquilla putativa, el orden de las repeticiones inversiones, la longitud y la composición de la secuencia espaciadora que codifica para el bucle de la orquilla, y la presencia o ausencia de 5 ' -protuberancias , pueden variar para lograr los resultados deseados. En otra modalidad más, el cásete de expresión del siRNA de orquilla es construido para contener la hebra en sentido del objetivo, seguido por un espaciador corto, la hebra antisentido del objetivo, y 5-6 Ts de un terminador de la transcripción. El orden de las hebras en sentido y antisentido dentro de las construcciones de expresión de siRNA puede ser alterado sin afectar las actividades de silenciamiento de los genes del siRNA de orquilla. En algunos casos, no obstante, la reversión del orden puede provocar la reducción parcial en las actividades de silenciamiento de los genes . En otra modalidad más, la longitud de la secuencia nucleotídica que es utilizada como el tallo de un cásete de expresión de siRNA está en el intervalo de aproximadamente 19 a 29. El tamaño del bucle o rizo puede estar en el intervalo de 3 a 23 nucleótidos . Otras longitudes de tallo o tamaños de bucle pueden ser también utilizados. Son disponibles una variedad de métodos para seleccionar los objetivos de siRNA. En un ejemplo, los objetivos de siRNA son seleccionados mediante la selección de una secuencia de mRNA para los dinucleotidos AA y registrando los 19 nucleótidos inmediatamente corriente abajo (3') del AA. En otro ejemplo más, la selección de las secuencias objetivo de siRNA es puramente empíricamente determinada, con la condición de que la secuencia objetivo comience con GG y no comparta homología secuencial significativa con otros genes, como es analizado por la búsqueda BLAST. En otro ejemplo más, la selección de las secuencias objetivo de siRNA está basada en la observación de que los sitios accesibles en el mRNA endógeno pueden ser dirigidos para la degradación por el método de oligodexorribonucleótido sintético/RNAasa H (Lee, et al., NATURE BIOTECHNOLOGY, 20:500-505 (2002)). En una modalidad, las secuencias objetivo para el RNAi son los fragmentos de la secuencia 21-mer seleccionados con base en las secuencias que codifican para ADAMTS-8. El extremo 5' de cada secuencia objetivo incluye el dinucleotido "NA" , donde "N" puede ser cualquier base y "A" representa la adenina. La secuencia 19-mer remanente tiene un contenido de GC de entre 35% y 55%. Además, la secuencia 19-mer remanente no incluye cuatro A o T consecutivo (por ejemplo, AAAA o TTTT) , tres G o C consecutivos (por ejemplo, GGG o CCC) , o siete "GC" en una hilera. Criterios adicionales pueden ser también incluidos para el diseño de la secuencia objetivo de RNAi . Por ejemplo, el contenido de GC de la secuencia de 19-mer remanente puede ser limitado a entre 45% y 55%. Además, cualquier secuencia 19-mer que tenga tres bases idénticas consecutivas (por ejemplo, GGG, CCC, TTT o AAA) o una secuencia palindrómica con 5 ó más bases, puede ser excluida. Además, la secuencia 19-mer remanente puede ser seleccionada para tener baja homología secuencial a otros genes. En un ejemplo, las secuencias objetivos potenciales son buscadas por BLASTN contra la base de datos de la secuencia grupal UniGen humana de NCBI . La base de datos UniGen humana contiene grupos no redundantes de cúmulos orientados al gen. Cada cúmulo UniGen incluye secuencias que representan un gen único. Las secuencias 19-mer que no producen acierto a otros genes humanos bajo la búsqueda BLASTN, pueden ser seleccionadas. Durante la búsqueda, puede ser ajustado un valor e a un valor exigente (tal como 'en "1") .

La efectividad de las secuencias de siRNA de la presente invención puede ser evaluada utilizando números métodos. Por ejemplo, una secuencia de siRNA de la presente invención puede ser introducida dentro de una célula que expresa ADAMTS-8. El nivel de polipéptido o el mR A de ADAMTS-8 en la célula puede ser detectado. Una disminución en el nivel de expresión de ADAMTS-8 después de la introducción de la secuencia de siRNA indica que la secuencia de siRNA introducida es efectiva para introducir la interferencia del R A. Los niveles de expresión de otros genes pueden ser también monitorizados antes y después de la introducción de las secuencias de siRNA. Las secuencias de siRNA que tienen efectos inhibitorios sobre la expresión del gen de ADAMTS-8 pero no otros genes, pueden ser seleccionadas. Además, pueden ser introducidas diferentes secuencias de siRNA dentro de la misma célula para la supresión del gen de ADAMTS-8. VI. TRATAMIENTO DE LA ENFERMEDAD La presente invención caracteriza el uso de los moduladores ADAMTS-8 para tratar enfermedades relacionadas a la proteasa. Los moduladores de ADAMTS-8 incluyen, pero no están limitados a, anticuerpos para ADAMTS-8, inhibidores de ADAMTS-8, secuencias antisentido o de RNAi de ADAMTS-8 y vectores que codifican o que comprenden secuencias antisentido o de RNAi de ADAMTS-8. Las enfermedades relacionadas a la proteasa que son adecuadas para la presente invención incluyen, sin limitación, cáncer, enfermedad inflamatoria de las articulaciones, osteoartritis, artritis reumatoide, artritis séptica, enfermedades periodontales, ulceración corneal, proteinuria, trombosis coronaria por ruptura de placa ateroesclerótica, enfermedad aórtica aneurismal, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn, enfisema, síndrome de insuficiencia respiratoria aguda, asma, enfermedad obstructiva crónica del pulmón, enfermedad de Alzheimer, malignidades cerebrales y hematopoyéticas , osteoporosis , enfermedad de Parkison, migraña, depresión, neuropatía periférica, enfermedad de Huntington, esclerosis múltiple, angiogénesis ocular, degeneración macular, infarto del miocardio por aneurisma aórtico, trastornos autoinmunes, pérdida degenerativa del cartílago después del daño traumático a las articulaciones, trauma craneal, epidermolisis bulosa distrófica, daño a la médula espinal, enfermedades neurodegenerativas agudas y crónicas, osteopenias, enfermedades de la articulación temporo mandibular, enfermedades de desmielinización del sistema nervioso, toxicidad de rechazo por transplante de órgano, caquexia, alergia, ulceración titulares, restenosis y otras enfermedades caracterizadas por degradación anormal de las proteínas de matriz extracelulares o las moléculas de proteoglicano . El tratamiento puede incluir tratamientos terapéuticos y profilácticos o medidas preventivas. Aquellos en necesidad de tratamiento incluyen individuos que tienen ya un trastorno médico particular, así como aquellos quienes pueden al final adquirir el trastorno. En muchos ejemplos, un tratamiento deseado regula la actividad proteolítica o la expresión del gen de ADAMTS-8 para prevenir así o mejorar los síntomas clínicos de la enfermedad. Los moduladores de ADAMTS- 8 pueden funcionar, por ejemplo, mediante la prevención de la interacción entre ADAMTS-8 y su sustrato de proteoglicano, reduciendo o eliminando la actividad catalítica de ADAMTS-8 o reduciendo o eliminando la transcripción de la traducción del gen ADAMTS-8. En una modalidad, los moduladores de ADAMTS-8 (por ejemplo, anticuerpos o inhibidores) son administrados a humanos o a animales en composiciones farmacéuticas . Una composición farmacéutica incluye típicamente un portador farmacéuticamente aceptable y una cantidad terapéuticamente efectiva de un modulador de ADAMTS-8. Los ejemplos de portadores farmacéuticamente aceptables incluyen solventes, solubilizadores , rellenadores, estabilizadores, aglutinantes, absorbentes, bases, agentes amortiguadores, lubricantes, vehículos de liberación controlada, diluyentes, agentes emulsificantes , humectantes, lubricantes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antimicóticos, agentes isotónicos y de retardo de la absorción, y similares, que son compatibles con la administración farmacéutica. El uso de los medios portadores y agentes portadores para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica. Los agentes suplementarios pueden ser también incorporados dentro de las composiciones . Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden ser formuladas para ser compatibles con su ruta preferida de administración. Los ejemplos de rutas de administración incluyen la administración parenteral intravenosa, intradérmica, subcutánea, oral, inhalación, transdérmica, rectal, transmucosal , tópica y sistémica. En un ejemplo, la administración es llevada a cabo mediante el uso de un implante. En una modalidad, las soluciones o suspensiones utilizadas para las aplicaciones parenterales, intradérmicas o subcutáneas, incluyen los siguientes componentes: un diluyente estéril tal como agua, solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles , glicerina, propilenglicol u otros solventes sintéticos; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metilparabenos; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfato de sodio; agentes quelantes tales como ácido etilendiaminotetraacético; amortiguadores tales como acetatos, citratos o fosfatos; y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro de sodio o dextrosa. El pH de una composición farmacéutica puede ser ajustado con ácidos o bases, tales como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio. En un ejemplo, las preparaciones parenterales son encerradas en ampolletas, jeringas desechables, o frascos de dosis múltiples elaborados de vidrio o de plástico. Una composición farmacéutica de la presente invención puede ser administrada a un paciente o animal tal que el modulador ADAMTS-8 comprendido en ésta está en una cantidad suficiente para reducir o abolir la actividad o expresión de ADAMTS-8 dirigida. Las dosis terapéuticas adecuadas para un anticuerpo ADAMTS-8 o inhibidor del mismo, pueden estar en el intervalo, sin limitación, de 5 mg a 100 mg, de 15 mg a 85 mg, de 30 mg a 70 mg o de 40 mg a 60 mg. Pueden ser también utilizadas dosis por debajo de 5 mg o por arriba de 100 mg. Los anticuerpos o inhibidores de ADAMTS-8 pueden ser administrados en una dosis o en dosis múltiples. Las dosis pueden ser administradas a intervalos tales como, sin limitación, una vez al día, una vez a la semana, o una vez al mes. Los esquemas de dosificación para la administración de un anticuerpo o inhibidor de ADAMTS-8 pueden ser ajustados con base en, por ejemplo, la afinidad del anticuerpo/inhibidor para su objetivo, la vida media del anticuerpo/inhibidor, y la severidad de la condición del paciente. En una modalidad, los anticuerpos o los inhibidores son administrados como una dosis en bolo, para elevar al máximo sus niveles en circulación. En otra modalidad más, son utilizadas infusiones continuas después de la dosis de bolo.

La toxicidad y la eficacia terapéutica de los moduladores de ADAM S-8 pueden ser determinadas mediante procedimientos farmacéuticos estándares en cultivo · celular o en modelos animales experimentales. Por ejemplo, la LD50 (la dosis letal para el 50% de la población) y la ED50 (la dosis terapéuticamente efectiva en 50% de la población) pueden ser determinadas . La proporción de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico, y pueden ser expresados como la proporción LD50/ED50. En un ejemplo, los moduladores que muestran índices terapéuticos grandes son seleccionados . Los datos obtenidos de los ensayos de cultivo celular o los estudios en animales pueden ser utilizados en la formulación de una gama de dosis para el uso en humanos . En muchos casos, la dosis de tales compuestos o moduladores puede caer dentro de un intervalo de concentraciones en circulación que muestran una ED50 con poca o ninguna toxicidad. La dosis puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosis empleada y de la ruta de administración utilizada. Para cualquier modulador utilizado de acuerdo a la presente invención, una dosis terapéuticamente efectiva puede ser estimada inicialmente a partir de los ensayos de cultivo celular o de modelos animales . En una modalidad, una dosis puede ser formulada en modelos animales para alcanzar un intervalo de concentración plasmática en circulación que muestra una IC50 (por ejemplo, la concentración del inhibidor de prueba que muestra una inhibición media máxima de los síntomas) como es determinada por ensayos de cultivo celular. Los niveles en plasma pueden ser medidos, por ejemplo, mediante cromatografía líquida de alta resolución. Los efectos de cualquier dosis particular pueden ser monitorizados mediante bioensayos adecuados. Los ejemplos de bioensayos incluyen ensayos de replicación de ADN, ensayos basados en transcripción, ensayos de enlace de proteína GDF/receptor, ensayos de creatina-cinasa, ensayos basados en la diferenciación de los pre-adipocitos , ensayos basados en la captación de glucosa en adipocitos, y ensayos inmunologicos. El régimen de dosificación para la administración de una composición farmacéutica de la presente invención puede ser determinado por el médico que atiende con base en diversos factores tales como el sitio de la patología, la severidad de la enfermedad, la edad del paciente, el sexo y la dieta, la severidad de cualquier inflamación, el tiempo de administración, y otros factores clínicos. En ciertas modalidades, es iniciada la administración sistémica o .inyectable a una dosis que es mínimamente efectiva, y la dosis será incrementada en un curso de tiempo preseleccionado hasta que se observe un efecto positivo. Subsecuentemente, los incrementos cada vez mayores en la dosis serán realizados limitándose a niveles que produzcan un incremento correspondiente en el efecto, al tiempo que tomen en cuenta cualesquiera efectos adversos que puedan aparecer. La adición de otros factores conocidos a una composición final puede también afectar la dosificación. La presente invención también contempla el tratamiento de las enfermedades que son provocadas por o asociadas con la acumulación anormal de agrecano u otros proteoglicanos . En una modalidad, el tratamiento incluye la administración de una composición farmacéutica que comprende una proteína ADAMTS-8 o un derivado funcional de la misma, a un humano o animal afectado por tal enfermedad. En tal modalidad, se utilizan terapias basadas en vectores para corregir la acumulación anormal de proteoglicanos. Estas terapias comprenden típicamente la introducción de un vector de expresión o un vector de distribución de genes que codifican para una proteína ADAMTS-8 o un derivado funcional de la misma, en un humano o animal en necesidad del mismo. Se debe entender que las modalidades anteriormente descritas y los siguientes ejemplos se dan a manera de ilustración, no de limitación. Diversos cambios y modificaciones dentro del alcance de la presente invención se volverán aparentes para aquellos expertos en la técnica a partir de la presente descripción. EJEMPLOS Ejemplo 1. Generación del Filograma Las siguientes proteínas miembros de la familia ADAMTS humana fueron recolectadas para la generación de un filograma: ADAMTS-1/AB037767 , ADAMTS-2/AJ003125 (con los siguientes cambios en la secuencia publicada en comparación a la secuencia utilizada en el filograma: W643C, P1001L, y S1089C) , ADAMTS-3/AF247668, ADAMTS-4/AF148213 , ADAMTS- 5/AF142099, ADAMTS-6/ w SEQ ID NO: 2" en la publicación de solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 20020120113, ADAMTS-7/AF140675, ADAMTS-8/AF060153 (con los siguientes cambios en la secuencia publicada en comparación a la secuencia utilizada en el filograma: LllP, F13L, L21P, ?23?, L24A y L12Q, donde ? se refiere a la supresión) , ADAMTS-9/AF261918 (con los siguientes cambios en la secuencia publicada en comparación a la secuencia utilizada en el filograma: G46S y S96T) , ADAMTS-10/WSEQ ID NO: 9" en la publicación del PCT número WO02/60942 (con el siguiente cambio en la secuencia publicada en comparación a la secuencia utilizada en el filograma: V2671) , ADAMTS-12/AJ250725, ADAMTS-13/AJ305314, ADAMTS-14/AF358666 (con el siguiente cambio en la secuencia publicada en comparación a la secuencia utilizada en el filograma: L937M) , ADAMTS-15 /AJ315733 , ADAMTS-16/ "SEQ ID NO: 4" en la publicación del PCT número W002/31163, ADAMTS-17/AJ315735 (con los siguientes cambios en la secuencia publicada en comparación a la secuencia utilizada en el filograma: reemplazo de la secuencia de aminoácidos 713ALKD716 con la secuencia de aminoácidos 713GYIEAAVIPAGARRIRWEDKPAHSFLALKD743 (SEQ ID NO : 1)), ADAMTS- 18/AJ311903, ADAMTS-19/AJ311904, y ADAMTS-20/wSEQ ID NO: 57" en la publicación del PCT número WO01/83782. Los 19 archivos de secuencias de proteínas fueron concatenados en un archivo multi-FASTA simple y utilizados como entrada dentro de CLUSTALW 1.81 (ver, por ejemplo, el sitio de la red en www.ebi.ac.uk) y se corrió sobre IRIX64. CLUSTALW fue corrido bajo los ajustes por omisión. El archivo de árbol .dnd fue utilizado como entrada para TREEVIEW 1.6.6 (Page, Comput. Appl. Biosci., 12: 357-358 (1996); y el sitio de la red en taxonomy. zoology.gla.ac.uk/rod/treeview.html) para generar el filograma. El árbol filogenético de los miembros de la familia ADAMTS se muestra en la Figura 1. El filograma agrupa las proteínas conjuntamente con base en el parentesco de secuencia. Los miembros de la familia ADAMTS que fueron agrupados entre sí por el programa fueron comparados a la información funcional conocida para los miembros de la familia ADAMTS que han sido caracterizados. Por ejemplo, se predice que ADAMTS-2 , 3 y 14 son enzimas de procesamiento de procolágeno. Estos miembros de la familia son los más parecidos uno al otro por homología secuencial y forman un cúmulo único sobre el árbol filogenético. Para otro ejemplo, se ha mostrado que las mutaciones en · ADAMTS-13 provocan defectos en el procesamiento de vWF dando como resultado púrpura trombocitopénica trombótica. Este miembro de la familia forma su propio nodo sobre el árbol filogenético . Además, ADAMTS-1 , 4, 5 y 9 han mostrado que escinden el agrecano con eficiencia variante. El análisis de la homología secuencial demostró un grupo que contenía todas las otras tres ADAMTSs degradadoras del agrecano más ADA TS-8, 15 y 20, sugiriendo que ADAMTS-8 puede también poseer actividades de escisión de agrecano. ADAMTS-8 fue subsecuentemente clonado, expresado, y purificado para determinar su habilidad para escindir el agrecano. A la fecha, han sido identificados al menos 19 miembros de la familia ADAMTS. Menos de la mitad de las proteínas ADAMTS han tenido funciones adscritas a ellas, dejando al menos 10 miembros que no tienen función conocida. La construcción de un árbol filogenético (Figura 1) con base en las similitudes secuenciales entre los miembros de la familia, condujo la observación de que aquellos miembros de la familia ADAMTS con funciones similares (por ejemplo actividad degradadora del agrecano, demostrada, o actividad de procesamiento del procolágeno) fueron agrupados conjuntamente. Esto sugirió que otros miembros del nodo putativo "degradador del agrecano" del árbol filogenético puede poseer actividad de agrecanasa significativa, y quizás puede mostrar mayor asociación a la enfermedad a la osteoartritis que ADAMTS- o ADAMTS-5. Como se demostró en los siguientes ejemplos, ADAMTS- 8 otro miembro más del nodo wdegradador de agrecano", es capaz de escindir el agrecano en el enlace Glu373-Ala374 relevante para la osteoartritis y por lo tanto la asociación estructura/función predicha por las homologías secuenciales se mantiene verdadera para esta proteína. Ejemplo 2. Construcción de un Vector de Expresión de ADA S-8 La secuencia de ácido desoxirribonucleico (DNA por sus siglas en ingles) para ADAMTS-8 fue depositada en GenBank por Vázquez et al., supra (número de acceso AF060153). Para el aislamiento del gen, 4 grupos de pares de cebadores oligonucleotídicos que abarcan la estructura de lectura abierta de ADAMTS-8 fueron diseñados. El primer par de cebadores incluye ATGTTCCCCGCCCCCGCCGCCCCCCGGTG (SEQ ID NO: 2) y GGATCCCCCGAGGCGCTCGATCTTGAACT (SEQ ID NO : 3). El segundo par de cebadores incluye GGATCCGGCCGGGCGACCGGGGGC (SEQ ID NO: 4) y CTCTAGAAGCTCTGTGAGATACATGGCGCT (SEQ ID NO : 5) . El tercer par de cebadores incluye CTCTAGACGGCGGGCACGGAGACTGTCTCCTGGATGCCCCTGGTGCGGCCCTGCCCCTCCCC ACA (SEQ ID NO: 6) y ACGTGTATTTGACTTTTGGGGGGAAGACCTCGCCAGGGACTGTCAGGAGCTGCACTGTCAGA GGCTC (SEQ ID NO: 7) . El cuarto par de cebadores incluye CACACGTTCTTTGTTCCTAATGACGTGGACTTTAG (SEQ ID NO: 8) y GCGGCCGCTCACAGGGGGCACAGCTGGCTTTC (SEQ ID NO : 9) . La amplificación por PCR fue realizada sobre una biblioteca de cDNA de pulmón de adulto, utilizando el equipo GC de Clontech, siguiendo las recomendaciones del fabricante. La amplificación de los productos de PCR fue realizada sobre un Perkin Elmer 9600. Reacciones de PCR de cincuenta microlitros fueron calentadas a 95°C para un paso de pre- incubación de 1 minuto, seguido inmediatamente por 25 ciclos que consisten de incubación a 95 °C por 15 segundos, seguido por la incubación a 68°C por 2 minutos. Los productos de PCR resultantes fueron purificados, digeridos con las enzimas de restricción apropiadas (EcoRI/BamHI , BamHI/Xbal, Xbal/Afllil, AflIII/Notl respectivamente) , y ligados entre sí dentro del vector de expresión pHTop de CHO (un derivado de pED) . El inserto de PCR fue verificado mediante secuenciamxento de DNA. La construcción de expresión de ADAM S-8 fue modificada por la adición de una secuencia Strep-tag® (IBA) . El marcador fue agregado utilizando los cebadores de PCR con una extensión 3 ' que codifica para un ligador de cinco aminoácidos (GSGSA (SEQ ID NO: 10)) seguido por la secuencia adicional que codifica para un Strep-tag de 8 aminoácidos (WSHPQFEK (SEQ ID NO: 11)). Estos 13 aminoácidos fueron agregados como una fusión traduccional C-terminal al aminoácido final de la estructura de lectura abierta de ADAMTS-8. El par de cebadores de PCR consistió de un cebador delantero CTTCTAGACGGCGGGCACGGAGAC (SEQ ID NO: 12) y un cebador inverso TTCTAGAGCGGCCGCCTTATTTTTCGAACTGCGGGTGGCTCCAAGCAGATCCGGATCCCAGG GGGCATAGCTGGCTTTCGCA (SEQ ID NO : 13) . La amplificación del producto de PCR fue realizada en un Perkin Elmer 9600. Se utilizó Pfu Turbo Hotstart (Stratagene) como la DNA-polimerasa y las condiciones de reacción siguieron aquellas recomendadas por el fabricante. Las reacciones de PCR fueron inicialmente calentadas a 94°C por 2 minutos, seguido por 25 ciclos de 94°C por 15 segundos/70°C por 2 minutos. Después del ciclo final, las reacciones de PCR fueron mantenidas por 5 minutos a 72 °C. El producto de PCR fue purificado, digerido con las enzimas de restricción apropiadas (BglII/Notl) y luego ligadas entre sí con los fragmentos ADAMTS-8 apropiados dentro del vector de expresión pHTop. Fueron identificadas variaciones de aminoácidos cuando se comparan AF060153 a la secuencia clonada. Los cambios observados fueron restringidos al péptido de señal y al predominio. Dos de las variaciones en la secuencia de señal del aislado de ADAMTS-8 fueron también encontradas en un envío de secuencia de base de datos GenBank, número de acceso AAB74946. Los cambios observados en el aislado de ADAMTS-8 que no pudieron ser adscritos a las variaciones alélicas (por ejemplo, F13 y F14 suprimidos, y L129Q) dieron como resultado un péptido de señal de 25 aminoácidos y un cambio de aminoácido simple en el predominio. Estos cambios no afectaron la expresión o la actividad de la proteína madura en virtud de sus localizaciones, y se dejaron sin cambio en la construcción de expresión. La secuencia de proteína predicha para la porción madura de la proteína fue idéntica a AF060153. Ejemplo 3. Establecimiento de la Línea Celular CHO para la Expresión de ADAMTS-8 Las células CH0/A2 fueron utilizadas para establecer la línea celular estable que expresa ADAMTS-8. La línea celular CH0/A2 fue derivada de CHO DUKX Bll mediante integración estable del activador transcripcional tTA, una proteína de fusión comprendida del represor Tet y el dominio transcripcional VP16 del virus del herpes. El vector de expresión ADAMTS-8pHTop contiene seis repeticiones del operador tet corriente arriba (5') de la secuencia ADAMTS-8. El enlace de tTA al operador Tet en pHTop activa la transcripción del gen corriente abajo (3'). El gen que codifica para la dihidrofolato-reductasa está también contenido sobre el vector de expresión pHTop, permitiendo la selección de transíectantes estables en virtud de la resistencia al metotrexato. Una línea de células CHO que expresa ADAMTS-8 extracelular, fue establecida mediante la transfección del DNA de pHTop/ADAMTS-8 dentro de células CHO/A2, utilizando el protocolo recomendado por el fabricante para la lipofección (Lipofectina de InVitrogen) . Los clones fueron seleccionados en metotrexato .0.02 ?. Las líneas celulares que expresan el más alto nivel de la proteína ADAMTS-8 fueron seleccionadas mediante el monitoreo del antígeno ADAMTS-8 dentro del medio condicionado con CHO, mediante transferencia de Western utilizando un anticuerpo anti-Strep-tag conjugado a la peroxidasa de rábano (HRP) (Southern Biotech) seguido por la quimioluminiscencia de ECL (Amersham Biosciences) y autorradiografía . Ejemplo 4. Purificación de ADAMTS-8 300 mi del medio condicionado proveniente de una línea de células CHO estables que expresan ADAMTS-8, fue recolectado y concentrado 3 veces (10 mi) mediante ultrafiltración utilizando una celda de agitación (Amicon) equipada con un filtro MWCO de 10 kDa (corte de peso molecular) . La avidina inmovilizada sobre la agarosa con esferas al 6% reticulada (1 mi) de Sigma fue mezclada con el medio condicionado concentrado por 1 hora a 4°C, para eliminar cualquier biotina contaminante. El sobrenadante fue recuperado después de la centrifugación, y se cargó sobre una columna Strep-Tactin de 1 mi (IBA) . La columna fue lavada con cinco alícuotas de 1 mi de Amortiguador W (Tris 100 mM, pH 8.0, NaCl 150 mM) , y la proteína enlazada fue eluida de la columna con el Amortiguador W que contenía destiobiotina 2.5 mM (Sigma). Las alícuotas del medio condicionado concentrado, el flujo de la columna de lado a lado, el lavado y las fracciones de elución fueron analizados mediante el análisis en gel de SDS-PAGE al 10% (Figura 2A) seguido por el análisis de Western utilizando el antisuero policlonal anti-Strep-Tag II (IBA) y la detección de ECL por autorradiografía (Figura 2B) . La Figura 2A ilustra el SDS-PAGE al 10% de las fracciones proteicas a partir de la purificación Strep-tag de ADAMTS-8 a partir del medio condicionado con CHO. El SDS-PAGE fue teñido con Azul Brillante de Coomassie. La Banda 1 indica el medio condicionado de células CHO. La Banda 2 muestra el flujo de lado a lado de la fracción (filtrado) a partir de la ultrafiltración*. La Banda 3 es la fracción de retenido de la ultrafiltración del concentrado. La Banda 4 representa la fracción de flujo de lado a lado de la columna Strep-Tactin. Las Bandas 5-9 son fracciones de lavado de la columna Strep-Tactin. Las Bandas 10-15 describen fracciones de elución de columna Strep-Tactin. La Figura 2B muestra una técnica de Western blot a SDS-PAGE de la Figura 2A. El análisis de Western empleó el antisuero policlonal Strep-Tagll (IBA) . Los pesos moleculares esperados de ADAMTS-8 no procesado y procesado con furina, que contenía el Strep-tag, que no explica la movilidad alterada debida a la glucosilación, son de 95 kDa y de 75 kDa, respectivamente. Los productos mayores de la purificación fueron 2 bandas que migraron sobre SDS-PAGE a pesos moleculares aparentes de 110 kDa y 95 kDa (Figura 2A, Banda 12) y enlazaron el anticuerpo Strep-tag sobre transferencias de Western (Figura 2B, banda 12) . La co-expresión de PACE soluble (enzima de escisión de aminoácidos básicos apareados o furina) con la construcción de expresión ADAMTS-8 en células CH0/A2 dio como resultado la eliminación de la banda pro-ADAMTS-8 de 110 kDa con un incremento concomitante en la cantidad de la banda de 95 kDa, sugiriendo que la banda de 110 kDa representó pro-ADAMTS-8 secretada. Existen 5 sitios de glucosilación putativos líenlazados dentro de la proteína ADAMTS-8 madura, lo cual presumiblemente explica el peso molecular aparente incrementado de 75 kDa predicho para la ADAMTS-8 madura a los 95 kDa observados. El análisis de Western de las fracciones proteicas purificadas mostró una preponderancia de la proteína de longitud completa, y únicamente una proporción menor de bandas inmunorreactivas de peso molecular disminuido (banda 12 en la Figura 2B) . Estos productos menores pueden ser el resultado de la degradación o la autocatálisis de la proteína ADAMTS-8. Una fracción de elución que contiene pro-ADAMTS-8 y ADAMTS-8 madura, procesada se utilizó para los análisis de actividad subsiguientes . En este ejemplo, el cDNA de ADAMTS-8 de longitud completa, fue anexado con una secuencia que codifica para un Strep-tag carboxilo-terminal y se expresó en células CHO. La proteína fue eficientemente expresada y secretada hacia el medio condicionado. La proteína de longitud completa fue acumulada en el medio condicionado, y no fue ' apreciablemente proteolizada en productos más pequeños. Esta observación fue apoyada por la retención del marcador carboxilo-terminal, como se determinó mediante la transferencia de Western con anticuerpos anti-Strep-tag y se verificó por la habilidad de la mayor parte de la proteína para enlazarse a la resina Strep-Tactin. En contraste, ADA TS-4 recombinante como se utilizó para la comparación fue espontáneamente proteolizado en sitios dentro de los dominios C-terminales , lo cual generó una molécula truncada que carece de dominio espaciador. El truncamiento de ADAMTS-4 parece ser un evento autoproteolxtico, debido a una forma modificada de ADAMTS-4 en la cual ha sido destruida la actividad catalítica por una mutación de sitio activo E362Q que no demostró este truncamiento C-terminal espontáneo (Flannery et al., J. Bio. Chem., 277: 42775-42780 (2002)). Además, ADAMTS-5 recombinante (Aggrecanase-2) puede auto-truncar su extremo C. ADAMTS-12 recombinante también muestra esta característica de proteólisis secundaria C-terminal (Cal, et al., J. BICL. CHEM., 276: 17932-17940 (2001)), aunque a partir del reporte publicado no es claro si éste es un evento autoproteolxtico o si éste es mediado por otra u otras proteasas . Además, la expresión de ADAMTS-1 en células 293T al parecer dio como resultado tres formas de proteína -a saber, una forma pllO que representa pro-ADAMTS-1 , una forma p87 que se presume es ADAMTS-1 madura de longitud completa, y una forma p65 que constituye ADAMTS-1 madura C-terminalmente truncada dentro del dominio espaciador (Rodríguez-Manzaneque, et al., J. BIOL. CHEM., 275: 33471-33479 (2000)). Consistente con las observaciones con ADAMTS-4, un mutante del sitio activo de ADAMTS-1 no se truncó C-terminalmente, sugiriendo que un mecanismo autoproteolítico es responsable de la eliminación de los dominios C-terminales . Con base en estos datos, fue sorprendente que la mayor parte de ADAMTS-8 recombinante aislado en este ejemplo conservó sus dominios C-terminales y no pareció autoproteolizarse o llegarse a escindir por otra proteasa. La actividad proteolítica de está proteína ADAMTS-8 recombinante fue verificada mediante el uso del ensayo de enlace a la macroglobulina a-2. En consecuencia, la trombospondina carboxilo-terminal y los dominios espaciadores en ADAMTS-8 son no característicamente refractarios al procesamiento secundario por su propia actividad catalítica u otras enzimas de procesamiento, proporcionando por lo tanto una oportunidad única para evaluar la eficiencia catalítica de una proteína ADAMTS de longitud completa, estable. Ejemplo 5. Aislamiento del RNA de Cartílago Articular El cartílago articular humano no osteoartrítico fue obtenido de Clinomics (Pittsfield, MA) , y el cartílago articular humano osteoartrítico fue obtenido de New England Baptist Hospital (Boston, MA) . Las muestras fueron congeladas instantáneamente en nitrógeno líquido al tiempo de la recolección, y almacenadas a -80°C. Para el aislamiento del RNA, 1 gramo de cartílago articular congelado se molió dos veces (1 minuto cada una, con un paso de enfriamiento de 2 minutos entre cada molienda) en un molino congelador Spex Certiprep (modelo 6750) a 15 Hz bajo nitrógeno líquido. El RNA fue luego aislado de acuerdo al método de McKenna et al . , ANAL. BIOCHEM. , 286: 80-85 (2000), con las siguientes modificaciones . El cartílago molido fue suspendió en 4 mi de isotiocianato de guanidinio 4 M enfriado con hielo (GITC, Gibco-BRL) que contenía 2.5 µ? de 2-mercaptoetanol (2-ME) . La suspensión fue inmediatamente homogeneizada sobre hielo por 1 minuto utilizando un homogeneizador Polytron (Kinematica AG) a la más alta velocidad. El lisado de cartílago homogeneizado fue centrifugado a 1500xg por 10 minutos a 4°C, el sobrenadante se guardó, y la pella resultante se homogeneizó nuevamente como se describe anteriormente en otros 4 mi de GITC/2-?? y se centrifugó nuevamente a 1500 x g por 10 minutos a 4°C. Las fracciones del sobrenadante de cada homogeneizado fueron combinadas y se agregaron 0.65 mi de Tritón X-100 al 25% (reserva de 100% de Sigma, diluido a 25% en dH20 libre de R asa) a las fracciones del sobrenadante combinado. Después de la incubación sobre hielo por 15 minutos, se agregaron 8 mi de amortiguador de acetato de sodio 3M pH 5.5 libre RNasa (Ambion) y la solución se incubó por otros 15 minutos sobre hielo. El homogeneizado fue luego extraído con 15 mi de fenol ácido : cloroformo 5:1, pH 4.5 (Ambion) mediante mezclado vigoroso por 1 minuto, incubación sobre hielo por 15 minutos, y centrifugación a 15,000 x g por 20 minutos a 4°C. La ' fase acuosa fue luego recuperada y re-extraída con fenol : cloroformo ácido, utilizando el mismo procedimiento que se describió anteriormente. La fase acuosa proveniente de la segunda extracción ácida con fenol : cloroformo, fue luego extraída una tercera vez con 15 mi de fenol : cloroformo : IAA 25:24:1 pH 6.7/8.0 (Ambion), se mezcló vigorosamente por 1 minuto, se incubó sobre hielo por 15 minutos, y se centrifugó a 15,000 x g por 20 minutos a 4°C. La fase acuosa fue recuperada, y se agregaron 0.8 volúmenes de 2-propanol al 100%. La solución fue mezclada, incubada sobre hielo por 5 minutos y centrifugada a. 15,000 x g por 30 minutos a 4°C. El sobrenadante resultante fue cuidadosamente decantado, y el botón fue resuspendido en 0.9 mi de amortiguador RLT + 2-ME (equipo Qiagen RNeasy) . Fue seguido luego el protocolo descrito en McKenna et al., supra, hasta la terminación desde este paso en adelante. Ejemplo 6. Distribución Tisular de ADAMTS-8 Una transferencia por puntos de mR A del arreglo de expresión tisular múltiple de humano (M E de Clontech) fue sondeada con un fragmento de ADAMTS-8 de 393 pares de bases que fue un fragmento digerido con Bglll/HindIII correspondiente al par de base 2070 hasta el par de base 2463 de la secuencia de ADAMTS-8 (Genbank número de acceso AF060153) . El fragmento contiene una porción del dominio de desintegrina y una porción del fragmento central TSP tipo 1. La secuencia del fragmento fue luego utilizada para buscar GenBank utilizando la Herramienta de Búsqueda de Alineamiento Local Básico, Versión 2, de NCBI (NCBI-BlastN) . La búsqueda BlastN no encontró homología significativa entre la secuencia de la sonda ADAMTS-8 y otros transcritos humanos en la base de datos, sugiriendo que el fragmento de la sonda no podría reaccionar de manera cruzada con otros transcritos humanos bajo las condiciones de hibridación de MTE. El fragmento de la sonda de ADAMTS-8 fue purificado y radiomarcado utilizando Esferas de Marcación de DNA Ready-To-Go (-dCTP) de Amersham Pharmacia Biotech de acuerdo a las instrucciones del fabricante. El fragmento radiomarcado fue purificado de los cebadores y los radionucleótidos no incorporados utilizando una columna Nick (Amersham Pharmacia Biotech) siguiendo las instrucciones del fabricante y luego utilizado' para sondear el MTE. La hibridación y las condiciones de lavado subsecuentes para el MTE siguió las condiciones sugeridas por el fabricante para una sonda de ADNc radiomarcada (Manual del Usuario del Arreglo MTE de Clontech) . La Figura 3A muestra el resultado del análisis de hibridación de MTE utilizando el mRNA proveniente de 76 tejidos humanos diferentes. Una clave que denota la colocación del mRNA proveniente de los diferentes tejidos se muestra en la Figura 3B. Los recuadros en blanco indican que no fue transferido por puntos el mRNA en esas coordenadas. El análisis de hibridación de MTE indica que ADAMTS-8 tiene una distribución tisular más estrecha y en general menor abundancia del transcrito que los transcritos de ADAM S-1 y ADAMTS-4 degradadores del agrecano, los cuales tienen una amplia distribución tisular. Uno de los más altos niveles de la expresión de ADAMTS-8 fue observada en un pulmón adulto (Figura 3, hilera A, columna 8), con los menores niveles encontrados en el pulmón fetal (Figura 3, hilera G, columna 11) . La expresión en corazón de adulto fue detectable pero baja (Figura 3, columna 4), con la excepción de la aorta que mostró un alto nivel de expresión (Figura 3, hilera B, columna 4). El corazón fetal (Figura 3, hilera B, columna 11) mostró niveles moderados de abundancia de transcrito, y expresión de nivel moderado a bajo fue observada en las diversas subsecciones del cerebro, el apéndice y la vejiga (por ejemplo, G5, Al-Gl, C3-H3, y B3 ) . Diversas líneas de células cancerosas (Figura 3, columna 10) mostraron niveles bajos o no detectables de la expresión. Ejemplo 7. PCR en Tiempo Real La expresión del tejido en el cartílago articular humano fue demostrada por la realización de PCR cuantitativa en tiempo real utilizando TaqMan (Applied Biosystems) . El programa Primer Express de Applied Biosystems fue utilizado para diseñar los siguientes cebadores y la sonda de ADAM S-8 cebador 5P: GGACCGCTGCAAGTTGTTCT (SEQ ID NO: 14), cebador 3P:GGACACAGATGGCCAGTGTT (SEQ ID NO: 15), y sonda CCATCAATCACCTTGGCCTCGAACA (SEQ ID NO: 16) . La sonda para ADAMTS-8 traslapó un límite exon/intrón, haciéndolo incapaz de hibridarse al DNA genómico. Los cebadores y una sonda fueron designados al GAPDH y fueron como sigue: cebador 5P: CCACATCGCTCAGACACCAT (SEQ ID NO: 17), cebador 3P: GCGCCCAATACGACCAAA (SEQ ID NO: 18), y sonda GGGAAGGTGAAGGTCGGAGTCAACG (SEQ ID NO : 19). Las sondas TaqMan (sintetizadas por Wyeth Research Core Technologies Group) contenían el colorante 6-FAM del reportero 5P y el 3P-apagador TAMRA. El RNA de cartílago articular fue aislado de las articulaciones de las rodillas de pacientes que no estaban infectados por la osteoartritis (libres de enfermedad) , y de regiones con lesión levemente afectadas y severamente afectadas de las articulaciones de rodillas de pacientes con osteoartritis. El RNA de cartílago articular, purificado fue convertido a cDNA antes de la PCR tiempo real siguiendo el protocolo, y el análisis TagMan fue realizado sobre el cDNA de primera hebra del cartílago articular libre de enfermedad y osteoartrítico después de la transcripción inversa del mRNA. 5 µg del RNA total fueron incubados por 10 minutos a 70°C con 200 pmol de un cebador que contiene un sitio promotor del fago T7 y una cola poliT de 24 bases (GGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGCGGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TT (SEQ ID NO: 20)). El RA fue luego transcrito inversamente utilizando 10 unidades/µ? de Superscript II (Invitrogen) en una mezcla de reacción de 20 µ? por 1 hora a 50°C. La mezcla de reacción contenía 0.25 µg/µl de ARN total, 10 pmol/µ? de cebador T7T2 , Amortiguador de Ia Hebra IX (Invitrogen) , DTT 10 mM (Invitrogen), dNTPs 0.5 niM (Invitrogen), y 1 unidad/µ? de SUPERase-In (Ambion) . Después de la síntesis de la primera hebra, se realizó la síntesis de la segunda hebra. La mezcla de reacción fue llevada hasta un volumen final de 150 µ?. La reacción contenía la mezcla de la primera hebra, y los siguientes reactivos (concentraciones finales)- -a saber, Amortiguador de 2a Hebra IX (Invitrogen), dNTPs 0.2mM (Invitrogen), 0.067 unidades/µ? de DNA-ligasa de E. coli (New England Biolabs) , 0.27 unidades/µ? de Polimerasa I de DNA (Invitrogen), y 0.013 unidades/µ? de RNasa H (Invitrogen). La reacción de síntesis de la segunda hebra fue incubada por 2 horas a 16°C. Durante los últimos 5 minutos de la incubación, se agregó la DNA-Polímerasa T4 (Invitrogen) hasta una concentración final de 0.067 unidades/µ?. Después de la incubación, la reacción se llevó a EDTA 16.67 mM y el cDNA resultante fue purificado utilizando esferas Terminadas en Carboxilo BioMag de PerSeptive Biosystems. La mezcla de reacción de la segunda hebra se llevó a 10% de PEG-8000/NaCl 1.25 M, y se agregó a 10 µ? de esferas BioMag (pre-lavadas con EDTA 0.5 M) . El cDNA y las esferas BioMag lavadas se mezclaron y se incubaron por 10 minutos a temperatura ambiente. Las esferas se lavaron 2 veces con 300 µ? de etanol al 70% con la ayuda de un imán Magna-Sep de GibcoBRL. Las esferas fueron secadas al aire por 2 minutos a temperatura ambiente después del lavado final. El cDNA purificado fue eluido de las esferas utilizando Tris-acetato 10 mM (pH 7.8). El cDNA eluído fue cuantificado mediante medición de la absorbancia de una alícuota diluida del eluido a 280 nm utilizando un espectrofotómetro . Cada reacción de PCR TaqMan utilizó 100 ng de cDNA de cartílago articular para el grupo cebador/sonda de ADAMTS8 y se realizó por duplicado. Los niveles de expresión entre los tejidos fueron normalizados utilizando el grupo de sonda/cebador de GAPDH (Applied Biosystems) . Los componentes de las reacciones fueron derivados de la Mezcla Maestra de PCR TaqMan Universal de Applied Biosystems, siguiendo las instrucciones del fabricante, con una concentración final de 900 nmol/µ? de cebador y 250 nmol/µ? de sonda. Las reacciones fueron incubadas por 2 minutos a 50°C, seguido por 10 minutos a 95°C, y luego 40 ciclos de 95°C por 15 segundos y 60°C por 1 minuto. Después del ciclo final, las reacciones fueron incubadas por 2 minutos a 25°C. La Figura 4 describe un histograma de los niveles de expresión de mR A de ADAMTS-8 en muestras clínicas humanas de cartílago libre de enfermedad y osteoartrítico (OA) determinado mediante PCR en tiempo real. Las muestras W-04 a W-13 representan el cartílago articular de rodilla no afectado por OA ("Libre de Enfermedad"). Las muestras 77M-96M representan regiones visualmente no afectadas del cartílago auricular OA de etapa tardía ("OA Leve") . Las muestras 88S-98S representan regiones severamente afectadas del cartílago articular OA de etapa tardía ("OA Severa"). La abundancia del mRNA de ADAMTS-8 en cada muestra fue reportada como un valor normalizado, al dividir los datos promediados determinados para ADAMTS-8 por los datos promediados determinados para GAPDH en la misma muestra. Los resultados del análisis TaqMan mostraron que no existía diferencia significativa en el nivel promedio del trascrito en el cartílago no afectado, en comparación al cartílago osteoartrítico, al menos en el cartílago OA de etapa tardía que fue utilizado en este estudio. No obstante, el nivel de expresión de ADAMTS-8 fue significativamente incrementado en la muestra 96M del cartílago OA. Esta observación apoya un procedimiento personalizado para tratar osteoartritis en pacientes seleccionados quienes tienen expresión elevada de ADAMTS-8 en sus tejidos de cartílago. Ejemplo 8. Producción del Anticuerpo Monoclonal AGG-Cl (mAb AGG-Cl) péptido sintético CGGPLPRNITEGE (péptido aggcl, SEQ ID NO: 21) fue acoplado a la proteína portadora KLH, y el conjugado se utilizó como el inmunogeno para la producción de anticuerpos monoclonales mediante tecnología de hibridoma estándar. En resumen, ratones BALB/c fueron inmunizados subcutáneamente con 20 µg de inmunogeno en el adyuvante completo · de Freund. La inyección fue repetida dos veces (bisemanalmente) utilizando el péptido en el adyuvante incompleto de Freund. Los sangrados de prueba fueron realizados sobre ratones inmunizados, y el suero fue evaluado mediante ELISA para la reactividad contra el péptido de inmunización y el agrecano de cartílago articular bovino digerido con ADAMTS-4 (Flannery et al., supra) . Tres días antes de- la fusión del hibridoma, se dio una inmunización final sin adyuvante al ratón que muestra el título de anticuerpo más alto. Las células del bazo provenientes de este ratón fueron aisladas y fusionadas con células de mieloma FO (American Type Culture Collection, Manassas, VA) y cultivadas en el medio de selección HAT (Sigma-Aldrich, St, Louis, MO) . Los sobrenadantes del cultivo de hibridoma fueron seleccionados contra los antígenos KLH-CGGPLPRNI EGE mediante ELISA, y contra el agrecano digerido con ADAMTS-4 mediante análisis de transferencia de Western. Los clones de hibridoma positivos fueron seleccionados para la subclonación mediante dilución limitante. Una línea celular hibridoma simple, designada AGG-C1, fue expandida en cultivo. El isotipo del anticuerpo fue determinado como IgGl (cadena ligera ) utilizando el equipo de Isotipificación del Anticuerpo Monoclonal de Ratón (Roche, Indianápolis , IN) e IgG a partir de 1 litro de medio de cultivo fue purificada mediante cromatografía de afinidad de Proteína A. Ejemplo 9. Ensayos de ELISA de Inhibición Competitiva Los experimentos de ELISA de inhibición competitiva fueron realizados para demostrar que el MAb AGG-Cl reconoció específicamente el neoepitopo de agrecano apropiado. Las placas de microtitulación recubiertas con estreptavidina (Pierce, Rockford, IL) fueron recubiertas con el péptido aggcl N-terminalmente biotinilado (b-aggcl) mediante la incubación de cada pozo con 100 µ? de b-aggcl (100 ng/ml) por 1 hora a temperatura ambiente. Después del lavar 4 veces con solución salina amortiguada con fosfato que contenía 0.01% de Tween 20 (PBS-Tween) , los pozos fueron bloqueados por 1 hora a temperatura ambiente con 100 µ? de PBS-Tween que contenía 2% de BSA, seguido por 4 lavados con PBS-Tween. Con el fin de validar la naturaleza del neoepitopo de MAb AGG-Cl, mezclas de competencia (100 µ?) comprendidas de MAb AGG-Cl (0.04 µg ml) y 1.0-1000 nmol/ml de los péptidos sintéticos GGLPLPRNITEGE (SEQ ID NO: 22), GGLPLPRNITEGEARGSVILTVK-CONH2 (SEQ ID NO: 23), el agrecano no digerido, o el agrecano digerido con ADAMTS-4 fueron preincubados por 1 hora a temperatura ambiente. Las mezclas fueron luego transferidas a pozos recubiertos con b-aggcl . Después de una incubación adicional por 1 hora a temperatura ambiente, las placas fueron lavadas 4 veces con PBS-Tween, y luego incubadas por 1 hora a temperatura ambiente con 100 µ? de IgG secundaria de cabra anti-ratón conjugado a peroxidasa (1:10,000). Después de 4 lavados finales con PBS-Tween, los pozos fueron incubados con el sustrato de peroxidasa de micropozo de 1 componente, TMB (BioFX Laboratories, Owings Mills, MD) . El desarrollo del color fue terminado por la adición de H2S0 0.18 M, y la absorbancia fue monitorizada espectrofotometricamente a 450 nm. Para la generación de una curva estándar, el agrecano bovino (25 µg en 50 µ?) fue digerido con ADAMTS-4 (0.001 ng-5 ng) por 16 horas a 37°C. El MAb AGG-Cl fue luego agregado a cada digestión (concentración final del anticuerpo de 0.04 µg/ml y estas mezclas fueron preincubadas por 1 hora a temperatura ambiente, seguido por la transferencia a placas recubiertas con b-aggcl y la terminación del ELISA. La Figura 5 muestra los resultados de las ELISAs de inhibición competitivas utilizando el MAb AGG-Cl. La competencia dependiente de la dosis fue observada para el péptido sintético GGLPLPRNITEGE (SEQ ID NO: 22, el extremo C del cual corresponde a E373 de la proteína nuclear de agrecano) y con el agrecano digerido con ADAMTS-4 (cuadros cerrados y círculos abiertos, respectivamente) . El péptido sintético GGPLPRNITEGEARGSVILTVK (SEQ ID NO : 23) y el agrecano no digerido no compitieron en el ensayo (cuadros abiertos y círculos abiertos, respectivamente) . La Figura 7 muestra otra ELISA de inhibición competitiva para la actividad de agrecanasa. La curva estándar fue generada mediante la incubación del agrecano bovino con cantidades cada vez mayores de ADAMTS-4 recombinante por 16 horas a 37 °C, seguido por la adición del MAb AGG-Cl a cada digestión. Fueron realizados ensayos similares para generar la actividad relativa de agrecanasa de ADAMTS-8. Donde se requirieron 0.0135 pM de ADAMTS-4 para generar una inhibición del 45% en la ELISA de inhibición competitiva, se requirieron 46.6 ± 4.8 pM de ADAMTS-8 para alcanzar un nivel similar de actividad. Ejemplo 10. Análisis de Western Blott de Agrecano Digerido con ADAMTS-8 y ADAMTS-4 " La habilidad de ADAMTS-8 para escindir el agrecano en el sitio de escisión de la agrecanasa (Glu373-Ala374) que define la actividad de agrecanasa asociada a la osteoartritis, fue demostrada utilizando dos diferentes anticuerpos monoclonales -a saber, MAb BC-3 y MAb AGG-Cl. El MAb BC-3 detecta específicamente la secuencia N-terminal del neoepitopo 37ARGXX... (SEQ ID NO: 24). El MAb AGG-Cl específicamente detecta la secuencia C-terminal del neoepitopo ... ITEGE373 (SEQ ID NO: 25) . Ambos neoepitopos son generados mediante la escisión con agrecanasa del enlace peptídico Glu373-Ala374 dentro del dominio interglobular del agrecano. Las Figuras 6A-6C demuestran los resultados de análisis de Western blott del agrecano digerido con ADAMTS-4 y ADAMTS-8, utilizando el MAb BC-3 y el MAb AGG-Cl . La Figura 6A muestra el análisis de Western blott utilizando el MAb BC-3. En la banda 1, no se agregó enzima. La banda 2 muestra el agrecano digerido con ADAMTS-4 a una proporción molar de 1:20. Las bandas 3-7 muestran el agrecano digerido con ADAMTS-8 a una proporción molar de enzima : sustrato de 1:2, 1:0.5, 1:0.2, 1:0.1, y 1:0.07, respectivamente. Las bandas inmunorreactivas de MAb BC-3 se incrementaron en " intensidad con cantidades cada vez mayores de la proteína ADAMTS-8 con relación al sustrato de agrecano (Figura 6A, bandas 3-7) , indicadores de la escisión del agrecano en la posición relevante a OA. No obstante, fue requerida una mayor cantidad de la enzima con relación a aquella cuando se utiliza ADAMTS-4 (comparando las bandas 3-7 a la banda 2 en la Figura 6A) . La Figura 6B es un análisis de Wester blot utilizando AGG-Cl. La proporción molar relativa de la enzima: sustrato en cada digestión es indicada. Las bandas inmunorreactivas del MAb AGG-Cl fueron mostradas en la Figura 6B utilizando proporciones enzima: sustrato en el intervalo de 1:1 a 1:0.3. En el mismo ensayo, ADAMTS-4 también produjo bandas inmunorreactivas de MAb AGG-Cl, pero a proporciones mucho menores de enzima : sustrato (Figura 6C, bandas 2-6). Las posiciones de migración de los estándares de proteína globular se muestran a la izquierda de cada transferencia. Como un control negativo, los análisis de Western blot del agrecano (25 µg) digerido con hasta 2.5 g del rhMMP- 13 no produjo péptidos inmunorreactivos , demostrando que el MAb AGG-C1 no reconoce la secuencia del neoepitopo ..DIPEN341 (SEQ ID NO: 26) que es generada por la escisión con MMP del agrecano . Además, el agrecano digerido con MMP-13 a proporciones similares de enzima: sustrato utilizadas para ADAMTS-8 fue inmunorreactivo con el MAb BC-14, que reconoce la secuencia del neoepitopo generado por MMP 3 2FFG.. (SEQ ID NO: 27) pero no fue reconocida por MAb BC-3 , que reconoce la secuencia del neoepitopo generado por agrecanasa, 373ARGXX.. (SEQ ID NO: 24) . Los procedimientos detallados para los análisis de Western blot se describen más adelante. El agrecano de cartílago articular bovino fue incubado con ADAMTS-8 o ADAMTS-4 purificados, por 16 horas a 37°C en Tris 50 mM, pH 7.3, que contenía cloruro de sodio 100 nM y cloruro de calcio 5 mM. Los productos de digestión fueron desglucosilados mediante incubación por 2 horas a 37°C en presencia de condroitinasa ABC (Seikagaku America, Falmouth, MA; 1 mU^g de agrecano) , keratanasa (Seikagaku; 1 mü/µg de agrecano) y keratanasa II (Seikagaku; 0.02 mU/^g de agrecano). Los productos de digestión fueron separados sobre geles de SDS-PAGE Bis-Tris NuPAGE al 4-12% (Invitrogen, Carlsbad, CA) y luego se transfirieron electroforáticamente a la nitrocelulosa . Los productos inmunorreactivos fueron detectados mediante análisis de Western blot con el MAb AGG-Cl (0.04 µg/ml) o MAb BC-3 (Caterson et al., supra) . La IgG de cabra anti-ratón secundaria, conjugada a fosfatasa alcalina (Promega Corp., Madison, WI, 1:7500) fue subsecuentemente incubada con las membranas, y se utilizó el sustrato NBT/BCIP (Promega) para visualizar las bandas inmunorrectivas . Todas las incubaciones del anticuerpo que fueron realizadas por 1 hora a temperatura ambiente, y las inmunotransferencias fueron incubadas con el sustrato por 5-15 minutos a temperatura ambiente para lograr un desarrollo de color óptimo. Otros miembros de la familia diferentes de ADAMTS-4 (Agrecanasa 1) y ADAMTS-5 (Agrecanasa 2) , otros ADAMTS (ADAMTS1 y ADAMTS9) al parecer son capaces de escindir el, agrecano de cartílago en algún sitio dentro de la proteína, y ambos de ellos se agrupan en el mismo nodo en el árbol filogenético como la Agrecanasa 1, Agrecanasa 2 y ADAMTS-8. Las Figura 6A-6C muestran que la eficiencia de la actividad de ADAMTS-8 como una agrecanasa es comparable a aquella de estos otros miembros de la familia ADAMTS. Además, la actividad de agrecanasa de ADAMTS-8 parece ser específica para el sitio Glu373-Ala374, debido a que las transferencias de Western de BC- 3 (monitoreo de la generación del fragmento de escisión de agrecano C-terminal) y las trasferencias de Western AGG-Cl (monitoreo de la generación del fragmento de escisión N- terminal) del agrecano digerido con ADAMTS-8 humano recombinante muestran que el neoepitopo apropiado es creado por tratamiento con ADAMTS-8, y ambos fragmentos de agrecano que son generados parecen permanecer intactos y no son adicionalmente degradados, indicando una escisión específica dentro del dominio interglobular G1-G2 del agrecano. Las Figuras 6A-6C también demuestran que la escisión del agrecano de cartílago articular bovino por ADAMTS-8 en una proporción enzima: sustrato 1:0.5, utilizando el MAb del neoepitopo BC-3 y quizás incluso menor utilizando el MAb del neoepitopo AGG-Cl, pueden ser fácilmente detectados. La eficiencia de la escisión en el enlace del péptido Glu373-Ala374 del agrecano se compara favorablemente con las actividades de agrecanasa reportadas para ADAMTS-1 y ADAMTS-9. La comparación de la escisión del agrecano por ADAMTS-8 a ADAMTS-4 sobre las mismas transferencias de Western revelaron que ADAMTS-8 pareció menos eficiente que ADAMTS-4 en la escisión del agrecano de cartílago en el enlace peptídico Glu373-Ala374 bajo las condiciones de prueba. Se ha sugerido que el procesamiento proteolítico carboxilo-terminal de ADAMTS4 puede jugar un papel en la activación de su actividad proteolitica y la movilización de la enzima mediante la eliminación de los dominios putativos C-terminales de enlace a ECM provenientes del dominio catalítico, y reducción de su afinidad por los GAG's presentes en la matriz extracelular. De este modo, existe la posibilidad de que la actividad enzimática de ADAMTS-8 puede ser inhibida por la presencia persistente de los dominios C-terminales, y que ADAMTS-8 C- terminalmente truncada puede mostrar actividad de agrecanasa mejorada. Para enfrentar esta cuestión, se construyó y se expresó un cDNA de ADAMTS-8 modificado, en el cual la secuencia de codificación para la trombospondina C-terminal y los dominios espaciadores, fue suprimida, el ADAMTS-8 C-terminalmente truncado, recombinante fue eficientemente expresado y secretado, y la proteína purificada fue activa como se juzgó por el ensayo de a-2-macroglobulina, pero pareció no ser más activa que la ADAMTS-8 recombinante de longitud completa sobre el sustrato agrecano, como se juzgó por el análisis de Western blot de AGG-Cl . No obstante, la habilidad de ADAMTS-8 para retener sus dominios de enlace a GAG C-terminales, puede hacer a ADAMTS-8 más eficiente al escindir el agrecano de cartílago in vivo, mediante el mantenimiento de la enzima localizada hacia la matriz del cartílago, y con esto incrementar la concentración efectiva de la enzima. La presencia del mRNA de ADAMTS-8 en cartílago articular humano normal y osteoartrítico (Figura 4) , se presta al apoyo adicional para la posibilidad de que ADAMTS-8 funcione como una agrecanasa in vivo. Otros proteoglicanos de enlace al hialuronano relacionados tales como neurocan, brevican, o versican pueden ser escindidos más eficientemente por ADAMTS-8. El mRNA de ADAMTS-8 es fácilmente detectable en diversas subsecciones del cerebro, coincidentes con los patrones de expresión para el neurocan y brevican. ADAMTS-8 murino fue primeramente descrito como Meth2, uno de dos miembros de la familia ADAMTS (ADAMTS-1 era el otro) que mostró que era inhibitorio en ensayos de angiogenésis (Vázquez et al., supra) . Uno de los pocos y más abundantes sitios de la expresión de mRNA de ADAMTS-8 es la aorta, un tejido rico en versican. Versican es una proteína de matriz extracelular vascular importante, con diversos papeles en la adhesión, proliferación y migración celulares . De este modo, se está intentando especular que ADAMTS-8 puede funcionar como una versicanasa en el endotelio, posiblemente escindiendo el versican después del dominio Gl, y liberándolo de la matriz. Tal pérdida del versican mediada por ADAMTS-8 a partir de las células endoteliales en proliferación, puede explicar la actividad anti-angiogénica observada de ADAMTS-8. El apoyo de esta posibilidad es la observación de que los fragmentos del versican aórtico que son escindidos en la Glu41-Ala442 son encontrados in vivo, asemejándose a la especificidad de escisión para ADAMTS-8 que mostramos en este estudio. La actividad de versicanasa ha sido ya mostrada para ADAMTS-1 y ADAMTS-4, incrementando la posibilidad de que ADAMTS-8 pueda ser capaz de escindir el versican con algún nivel de eficiencia y especificidad. Ejemplo 11. Vectores de Expresión El vector de expresión en mamífero pMT2 CXM, el cual es un derivado de p91023 (b) , puede ser utilizado en la' presente invención. El vector pMT2 CXM difiere de p91023 (b) en que el primero contiene el gen de resistencia a la ampicilina en lugar del gen de resistencia a la tetraciclina y contiene además un sitio Xho I para la inserción de los clones de cDNA. Los elementos funcionales de pMT2 CXM incluyen los genes VA del adenovirus, el origen SV40 de replicación (incluyendo el aumentador de 72 pares de bases) , el promotor tardío mayor del adenovirus (incluyendo un sitio de empalme 5 ' y la mayor parte de la secuencia guía tripartita del adenovirus presente sobre los mR As tardíos del adenovirus) , un sitio aceptor de empalme 3 ' , un inserto DHFR, el sitio de poliadenilación temprana de SV40 (SV40) , y las secuencias pBR322 necesarias para la propagación en E. coli. El plásmido pMT2 CXM es obtenido mediante digestión con EcoRI de pMT2-VWF, que ha sido depositado con la American Type Culture Collection (ATCC) , Rockville, MD (EUA) bajo el número de acceso ATCC 67122. La digestión con EcoRI extirpa el inserto de cDNA presente en pMT2-V F, produciendo un pMT2 en forma lineal, el cual puede ser ligado y utilizado para transformar E. coli HB 101 o DH-5 para la resistencia a la ampicilina. El DNA del plásmido pMT2 puede ser preparado mediante métodos convencionales . pM 2 CXM es luego construido utilizando mutagénesis rizo externo/interno. Esto elimina las bases 1075 a 1145 con relación al sitio HindIII cercano al origen SV40 de replicacion y a las secuencias aumentadoras de pMT2. Además, éste inserta una secuencia que contiene el sitio de reconocimiento para la endonucleasa de restricción Xhol. Un derivado de pMT2CXM, denominado pMT23, contiene sitios de reconocimiento para las endonucleasas de restricción PstI, EcoRI, Salí y Xhol. El plásmido pMT2 CXM y el DNA de pMT23 pueden ser preparados mediante métodos convencionales. ???02ß1 derivado de pMT21 puede ser también adecuado en la práctica de la presente invención. pMT21 es derivado de pM 2 el cual es derivado de pM 2-VWF. Como se describió anteriormente, la digestión con EcoRI extirpa el inserto de cDNA presente en pMT-VWF, produciendo pMT2 en forma lineal, el cual puede ser ligado y utilizado para transformar E. coli HR 101 o DH-5 para la resistencia a la ampicilina. El DNA de plásmido pMT2 puede ser preparado mediante métodos convencionales . pMT21 es derivado de pMT2 a través de las siguientes dos modificaciones. Primeramente, los 76 pares de bases de la región 5' no traducida del cDNA de DHFR incluyendo un tramo de 19 residuos de G desde la cola G/C para la clonación del cDNA es suprimido. En este proceso, los sitios PstI, EcoRI y Xhol son insertados inmediatamente corriente arriba (5') de DHFR. En segundo lugar, es introducido un sitio Clal único mediante digestión con EcoRV y Xbal, tratamiento con el fragmento Klenow de la DNA polimerasa I y ligadura a un ligador Clal (CATCGATG) . Esto suprime un segmento de 250 pares de bases proveniente de la región del R A asociada al adenovirus (VAI) pero no interfiere con la expresión o función del gen VAI RNA. pMT21 es digerido con EcoRI y Xhol, y utilizado para derivar el vector pEMC2Bl . Una porción de la guía EMCV es obtenida de pMT2~ ECATl mediante digestión con EcoRI y PstI, dando como resultado un fragmento de 2752 pares de bases. Este fragmento es digerido con Taql produciendo un fragmento EcoRI-Taql de 508 pares de bases que es purificado mediante electroforesis sobre gel de agarosa de bajo punto de fusión. Un adaptador de 68 pares de bases y su hebra complementaria son sintetizados con un extremo sobresaliente 5' Taql y un extremo sobresaliente 3 ' Xhol . La secuencia adaptadora concuerda con la secuencia guía del virus EMC del nucleótido 763 al 827. Éste también cambia el ATG en la posición 10 dentro de la guía del virus EMC a un ATT, y es seguido por un sitio Xhol. Una ligadura de tres vías del fragmento EcoRI-Xhol de pMT21, el fragmento EcoRI-Taql del virus EMC, y el adaptador oligonucleotídico de 68 pares de bases Taql-Xhol, que da como resultado el vector Este vector contiene el origen SV40 de replicación y el aumentador, el promotor tardío mayor del adenovirus, una copia de cDNA de la mayor parte de la secuencia guía tripartita del adenovirus, una secuencia de intervención híbrida pequeña, una señal de poliadenilación del SV40 y el gen VAI del adenovirus, los marcadores de DHFR y de ß- lactamasa y una secuencia EMC, en relaciones apropiadas para dirigir la expresión de alto nivel del cDNA deseado en células de mamífero . La construcción de los vectores puede involucra la modificación de las secuencias de DNA relacionadas a la agrecanasa. Por ejemplo, un cDNA que codifica para una agrecanasa puede ser modificado mediante la eliminación de los nucleótidos de no codificación sobre los extremos 5' y 3' de la región de codificación. Los nucleótidos de no codificación suprimidos pueden o no ser reemplazados por otras secuencias que se sabe son benéficas para la expresión. Estos vectores son transformados dentro de células hospederas apropiadas para la expresión de la agrecanasa de la presente invención. En un ejemplo específico, las secuencias reguladoras de mamífero que flanquean la secuencia de codificación de la agrecanasa son eliminadas o reemplazadas con secuencias bacterianas para crear vectores bacterianos para la expresión intracelular o extracelular de la molécula de agrecanasa. Las secuencias de codificación pueden ser además manipuladas (por ejemplo ligadas a otros ligadores conocidos o modificadas por supresión de las secuencias de no codificación a partir de éstas, o alterando los nucleótidos en éstas mediante otras técnicas conocidas) . Una secuencia que codifica para la agrecanasa puede ser luego insertada dentro de un vector bacteriano conocido utilizando procedimientos como son apreciados por aquellos expertos en la técnica. El vector bacteriano puede ser transformado dentro de células hospederas bacterianas para expresar las agrecanasas de la presente invención. Para una estrategia de producción de la expresión extracelular de las proteínas . agrecanasas en células bacterianas, ver por ejemplo la Solicitud de Patente Europea 177,343. Pueden ser realizadas manipulaciones similares para la construcción de un vector de insecto para la expresión en células de insecto (ver, por ejemplo, los procedimientos descritos en la Solicitud de Patente Europea publicada No. 155,476). Un vector de levadura puede también ser construido empleando secuencias reguladoras de levadura para la expresión intracelular o extracelular de las proteínas de la presente invención en células de levadura (ver, por ejemplo, procedimientos descritos en la solicitud del PCT publicada WO86/00639 y Solicitud de Patente Europea 123,289).

Un método para producir altos niveles de proteínas agrecanasas en sistemas celulares hospederos de mamífero, de bacterias, de levaduras o de insectos, puede involucrar la construcción de células que contienen copias múltiples del gen heterólogo de la agrecanasa. El gen heterólogo puede ser ligado a un marcador amplificable, por ejemplo, el gen de la dihidrofolato-reductasa (DHFR) para el cual pueden ser seleccionadas las células que contienen copias incrementadas del gen, para la propagación en concentraciones cada vez mayores de metotrexato (M X) . Este procedimiento puede ser empleado con un número de diferentes tipos celulares. Por ejemplo, un plásmido que contiene una secuencia de DNA para una agrecanasa en asociación operativa con otras secuencias plasmídicas que hacen posible la expresión del mismo, y un plásmido de expresión de DHFR (tal como, pAdA26SV(A) 3 ) puede ser co-introducido dentro de las células CHO deficientes en DHFR (DUKX-BII) mediante diversos métodos que incluyen transfección mediada por fosfato de calcio, electroporación, o fusión de protoplastos . Los transformantes que expresan DHFR son seleccionados para el desarrollo en medio alfa con suero fetal de ternera dializado, y subsecuentemente seleccionados para la amplificación por crecimiento en concentraciones cada vez mayores de MTX (por ejemplo, pasos secuenciales en 0.02, 0.2, 1,0 y 5 µ? de MTX). Los transformantes son clonados, y la expresión de agrecanasa biológicamente activa es monitorizada por al menos uno de los ensayos descritos anteriormente. La expresión de la proteína agrecanasa debe incrementarse con los niveles cada vez mayores de la resistencia al MTX. Los polipéptidos de agrecanasa son caracterizados utilizando técnicas estándares conocidas en la materia tales como marcación por pulsos con 35S-metionina o cisteína y electroforesis en gel de poliacrilamida. Pueden ser seguidos procedimientos similares para producir ' otras agrecanasas . Ejemplo 12. Transfeccion de los Vectores de Expresión Como un ejemplo, una secuencia nucleotídica de agrecanasa de la presente invención es clonada dentro del vector de expresión pED6. Las células COS y CHO DUKX Bll son transitoriamente transfectadas con la secuencia de agrecanasa mediante lipofección (LF2000, Invitrogen) (± co-transfección de PACE sobre un plásmido PED6 separado) . Son realizadas transfecciones por duplicado para cada molécula de interés: (a) un grupo de transfeccion para cosechar el medio condicionado, para el ensayo de actividad y (b) el otro grupo de transfeccion para la marcación metabólica de 35-S-metionina/cisteína. En el día uno, el medio es cambiado a medio DME(COS) o alfa (CHO) más 1% de suero fetal de ternera inactivado por calor, ± 100 g/ml de heparina sobre los pozos del grupo (a) para ser cosechados para el ensayo de actividad. Después de 48 horas, se cosecha el medio condicionado para el ensayo de actividad. En el día 3, los pozos duplicados del grupo (b) son cambiados a medio MEM (libre de metionina/libre de cisteína) más 1% de suero fetal de ternera inactivado por calor, 100 µg/ml de heparina y 100 µ??/t? de 35S-metionina/cisteína (Redi ue Pro mix, Amersham) . Después de 6 horas de incubación a 37°C, se cosecha el medio condicionado y se corre sobre geles de SDS-PAGE bajo condiciones reductoras . Las proteínas pueden ser visualizadas mediante autorradiografía. La descripción anterior de la presente invención proporciona la ilustración y la descripción, pero no se pretende que sea exhaustiva o que limite la invención a aquella precisamente descrita. Son posibles modificaciones y variaciones consistentes con las enseñanzas anteriores o pueden ser adquiridas a partir de la práctica de la invención. De este modo, se nota que el alcance de la invención es definido por las reivindicaciones y sus equivalentes . Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES
Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un método para escindir un proteoglicano, caracterizado porque comprende poner en contacto el proteoglicano con una proteína ADAMTS-8 aislada, que rompe el proteoglicano . 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el proteoglicano es una molécula de agrecano .
3. Un método de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque la proteína ADAMTS-8 es una proteína ADAMTS-8 madura.
4. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la proteína ADAMTS-8 madura es codificada por GenBank Acceso No. AF060153 pero carece del péptido de señal y el prodominio.
5. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la proteína ADAMTS-8 madura comprende los aminoácidos 214-890 de la SEQ ID NO: 28.
6. Un método para escindir un proteoglicano, caracterizado porque comprende poner en contacto el proteoglicano con una proteasa aislada para romper el proteoglicano, en donde la proteasa comprende un dominio catalítico de metaloproteasa de ADAMTS-8.
7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el proteoglicano es una molécula de agrecano .
8. Un método de conformidad con las reivindicaciones 6 ó 7, caracterizado porque el dominio catalítico de la metaloproteasa de ADAMTS-8 consiste de los aminoácidos 214-439 de la SEQ ID NO: 28.
9. Un método de conformidad con las reivindicaciones 6, 7 u 8, caracterizado porque la proteasa comprende aminoácidos 214-588 de la SEQ ID NO: 28.
10. Un método para escindir un proteoglicano, caracterizado porque comprende la expresión de una proteasa a partir de un vector de expresión recombinante, en donde la proteasa comprende un dominio catalítico de metaloproteasa de ADATS-8, y la proteasa rompe el proteoglicano.
11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el proteoglicano es una molécula de agrecano, y el vector de expresión recombinante es expresado en una célula de mamífero que secreta dicha proteasa.
12. Un método de conformidad con las reivindicaciones 10 u 11, caracterizado porque el vector de expresión recombinante comprende una secuencia que codifica para los aminoácidos 214-890 de la SEQ ID NO: 28.
13. Un método de conformidad con las. reivindicaciones 10 0 12, caracterizado porque el vector de expresión recombinante comprende una secuencia que codifica para los aminoácidos 214-588 de la SEQ ID NO: 28. 1 . Un método para identificar un agente capaz de modular una actividad de escisión de agrecano de una proteína ADAMTS-8, el método está caracterizado porque comprende: poner en contacto la proteína ADAMTS-8 con una molécula de agrecano en presencia o ausencia del agente; y la medición de la actividad de escisión del agrecano de la proteína ADAMTS-8 en presencia o ausencia del agente, en donde un cambio en la actividad de escisión del agrecano, en presencia del agente, en comparación a la ausencia de dicho agente, indica que el agente es capaz de modular la actividad de escisión del agrecano . 15. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende el agente identificado de conformidad con el método de la reivindicación 1 . 16. Un método para el tratamiento de una anormalidad por escisión de agrecano en un mamífero, caracterizado porque comprende administrar al mamífero el agente identificado de acuerdo al método de conformidad con la reivindicación
14. 17. Un método para identificar un agente capaz de modular una actividad de escisión, del agrecano de una proteína ADAMTS-8, el método está caracterizado porque comprende : poner en contacto una proteasa con una molécula de agrecano en presencia o ausencia del agente, la proteasa comprende un dominio catalítico de metaloproteasa de ADAMTS-8 y que posee la actividad de escisión de agrecano; y la medición de la actividad de escisión del agrecano de dicha proteasa, en presencia o ausencia del agente, en donde un cambio en la actividad de escisión del agrecano en presencia del agente, en comparación a la ausencia del agente, indica que el agente es capaz de modular la actividad de escisión del agrecano . 18. Un método para modular una actividad de escisión del agrecano en una región extracelular de una célula de mamífero, caracterizado porque comprende la inhibición de la expresión de ADAMTS-8 en la célula de mamífero. 19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la inhibición comprende introducir dentro de la célula de mamífero un polinucleótido que comprende o que codifica para un R Ai de ADAMTS-8 o para la secuencia antisentido. 20. Un método para tratar una anormalidad por escisión de agrecano en un mamífero, caracterizado porque comprende inhibir la expresión de ADAMTS-8 en las células seleccionadas del mamífero.