MXPA06010590A - Analisis de vacunas de sacaridos sin interferencia - Google Patents

Abstract

La invención estábasada en los métodos que permiten el análisis de los sacáridos mixtos de meningococos provenientes de múltiples serogrupos, aun cuandoéstos compartan unidades monosacáridas. Con una combinación de sacáridos de serogrupos C, W135 e Y, la invención analiza el contenido deácido siálico, de glucosa y de galactosa. Los resultados de glucosa y galactosa son utilizados para cuantificar directamente los sacáridos de los serogrupos Y y W135, respectivamente, y el contenido combinado de glucosa y galactosa es sustraído del contenido deácido siálico para cuantificar los sacáridos del serogrupo C. Los tres serogrupos pueden de este modo ser resueltos aun cuando sus contenidos de monosacárido se traslapen. Los tres diferentes análisis de monosacárido pueden ser realizados sobre el mismo material, sin interferencia entre los monosacáridos y sin interferencia a partir de cualesquiera otros materiales sacáridos en la composición (por ejemplo los estabilizadores de la liofilización). El método puede ser utilizado para analizar el sacárido total y libre en las vacunas conjugadas y simplifica el control d calidad de las vacunas que contienen sacáridos capsulares de múltiples serogrupos.

Description

ANÁLISIS DE VACUNAS DE SACARIDOS SIN INTERFERENCIA CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención está en el campo del análisis y control de calidad de vacunas que incluyen sacáridos capsulares bacterianos, y en particular aquellas donde los sacáridos son conjugados a un portador.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los inmunógenos que comprenden antígenos de sacáridos capsulares conjugados a proteínas portadoras son bien conocidos en la técnica. La conjugación convierte los antígenos independientes de T a antígenos de T, con lo cual se aumentan las respuestas de memoria y se permite que se desarrolle la inmunidad protectora, y la vacuna de conjugado prototipo fue para Haemophilus influenzae tipo b (Hib) [por ejemplo, ver capítulo 14 de la ref. 1] . Desde la vacuna de Hib, las vacunas de sacáridos conjugadas para proteger contra Neisseria miningi tidis (meningococos) y contra Streptococcus pneumoniae (pneumococos) han sido desarrolladas. Otros organismos donde las vacunas conjugadas son de interés, son Streptococcus agalactíae (estreptococos grupo B) [2], Pseudomonas aeruginosa [3] y Staphylococcus aureus [4J. Las vacunas conjugada para N. meningi tidis serogrupo C han sido probadas para el uso en humanos, e REF.: 175844 incluyen Menjugate11 [5], Meningitec1111 y Neis Vac-C14. Las mezclas de conjugados de cada uno de los serogrupos A, C W135 e Y han sido reportadas [por ejemplo, referencias 6-9], incluyendo el producto Menactra1111. Otras mezclas de antígenos conjugados incluyen: (i) mezclas de meningococos A/C [10:11]; (ii) el producto PrevNar1111 [12] que contiene siete conjugados de neumococos; (iii) conjugados mixtos de meningococos Hib [13, 14]; y (iv) conjugados combinados de meningococos, pneumococos y Hib [15]. Los problemas cuando se trata de vacunas conjugadas incluyen la estabilidad y la consistencia lote a lote. En las vacunas del Hib, por ejemplo, ha sido reportada la despolimerización catalítica del sacárido [16] y los conjugados de la cápsula de meningococos del serogrupo A son fácilmente hidrolizados [17]. La inestabilidad de los conjugados conduce de manera indeseable a una reducción de la dosis efectiva del conjugado inmunogénico sobre el tiempo, la variación entre lotes y niveles incrementados de producción de desintegración no caracterizados . Las ref rencias 18 y 19 discuten problemas concernientes a las pruebas de estabilidad de las vacunas conjugadas de Hib. El análisis del glucoconjugado cuantitativo involucra típicamente un primer paso de hidrólisis de sacárido, con el análisis que está basado entonces a los monosacáridos liberados. Mientras que este análisis es relativamente directo para conjugados simples, por ejemplo, han sido utilizados métodos cromatográficos de intercambio aniónico para analizar los conjugados hidrolizados del Hib [20] y meningococos del serogrupo A [21]) , la situación es más compleja en vacunas en combinación, particularmente donde diferentes sacáridos comparten unidades monosacáridas . Por ejemplo, los sacáridos capsulares de los meningococos serogrupos C, W135 e Y todos contienen ácido siálico, de modo que cualquier método basado en la medición del ácido siálico liberado no será capaz de distinguir los tres serogrupos . Un objetivo de la invención es proporcionar mejoramientos en la evaluación cuantitativa de los sacáridos en las vacunas conjugadas para evaluar la estabilidad y la integridad. En particular, un objetivo es proporcionar los métodos que puedan ser utilizados para medir conjugados individuales dentro de las vacunas conjugadas de meningococos, combinadas, y de este modo para proporcionar mejoramientos en el control de calidad y consistencia de las vacunas .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención está basada en los métodos que permiten el análisis de los sacáridos meningococos mixtos provenientes de múltiples serogrupos, aun cuando los sacáridos compartan unidades monosacáridos . La invención proporciona de este modo un proceso para analizar el contenido de sacáridos de una composición, en donde: (a) la composición comprende un sacárido capsular del serogrupo C de Neisseria meningi tidis y uno o ambos de: (i) sacárido capsular del serogrupo 135 de Neisseria meningi tidis; y/o (ii) un sacárido capsular del serogrupo Y del serogrupo Neisseria meningitidis; (b) el proceso comprende un paso de analizar el contenido de ácido siálico de la composición; y: (i) si la composición incluye un sacárido del serogrupo W135, un paso de analizar el contenido de galactosa de la composición; (ii) si la composición incluye un sacárido del serogrupo Y, un paso de analizar el contenido de glucosa de la composición; (c) si la composición incluye un sacárido del serogrupo W135, el contenido del sacárido del serogrupo 135 en la composición es determinado de acuerdo a los resultados del análisis de galactosa del paso (b) ; (d) si la composición incluye un sacárido del serogrupo Y, el contenido de sacárido del serogrupo Y en la composición es determinado de acuerdo a los resultados del análisis de glucosa del paso (b) ; (e) el contenido del sacárido del serogrupo C en la composición es determinado al comparar los resultados del análisis de ácido siálico con: (i) si la composición incluye un sacárido del serogrupo W135 pero no un sacárido del serogrupo Y, los resultados del análisie de galactosa del paso (b) ; (ii) si la composición incluye un sacárido del serogrupo Y pero no un sacárido del serogrupo W135, los resultados del análisis de glucosa del paso (b) ; o (iii) si la composición incluye un sacárido del serogrupo W135 y un sacárido del serogrupo Y, los resultados combinados de los análisis de glucosa y galactosa del paso (b) . Con una combinación de sacáridos de los serogrupos C, W135 e Y, por lo tanto, la invención analiza el contenido de ácido siálico, glucosa y galactosa. Los resultados de glucosa y galactosa son utilizados para cuantificar directamente los sacáridos de los serogrupos Y, W135, respectivamente, y el contenido combinado de glucosa y galactosa es sustraído del contenido de ácido siálico para cuantificar los sacáridos del serogrupo C. Los tres serogrupos pueden ser de este modo resueltos aun cuando sus contenidos de monosacáridos se traslapen. Los inventores han encontrado ventajosamente que los tres diferentes análisis de monosacáridos pueden ser realizados sobre el mismo material, sin interferencia entre los monosacáridos sin interferencia de cualesquiera otros materiales sacáridos en la composición (por ejemplo, estabilizadores de la liofilización) . El método puede ser utilizado para analizar el sacárido total y libre en las vacunas conjugadas, y simplifica el control de calidad de las vacunas que contienen sacáridos capsulares a partir de múltiples serogrupos . Un método para analizar las mezclas de aldosa, hexosamina y ácido siálico sin interferencia, ha sido descrito [22], pero éste confía en tratamientos enzimáticos y en derivatización química. En contraste, el proceso de la invención no requiere tales pasos y es de este modo más rápido y más fácil de realizar. Además, la situación tratada en la referencia 22 no sufre del problema inherente de tener que resolver diferentes sacáridos que comparten unidades monosacáridas comunes . La invención también proporciona un aparato de computadora adaptado para realizar un proceso de la invención. En particular, la invención proporciona un programa de computadora para analizar el contenido del sacárido de una composición como se define anteriormente, que comprende un módulo de programa para: (a) recibir datos sobre el contenido de ácido siálico, y sobre el contenido de glucosa y/o galactosa, de una muestra; y (b) calcular a partir de esos datos el contenido de sacárido capsular a partir de serogrupo C y del serogrupo W135 e Y. La invención también proporciona un producto de programa de computadora que comprende un medio de almacenamiento legible en computadora, que ha almacenado en éste el programa de computadora de la invención.

Los sacáridos capsulares de los serogrupos C, W135 e Y Loe métodos de la invención son para analizar los sacáridos capsulares de meningococos . Las mezclas incluyen los sacáridos capsulares de (i) el serogrupo C y (ii) uno o ambos de los serogrupos W135 e Y, por ejemplo, C + W135, C + Y ó C+ W135 + Y. Pueden estar presentes sacáridoe adicionales . El sacárido capsular del serogrupo C es un homopolímero de ácido siálico (a 2 —» 9) -enlazado (ácido N-acetil-neuroamínico o "NeuNac"). La mayoría de las cepas del serogrupo C tienen grupos O-acetilo en el carbono 7 y/o en el carbono 8 de los residuos de ácido siálico, pero aproximadamente 15% de los aislados clínicos carecen de estos grupos O-acetilo [23, 24]. La acetilación no parece afectar la eficacia protectora (por ejemplo, de manera contraria al producto Menjugate*111, el producto NeisVac-Cm utiliza un sacárido des-O-acetilado, pero ambas vacunas son efectivas) . La estructura del sacárido es mostrada en la figura 13 y es descrita como: — > 9) -Neu p NAc 7/8 OAc- ( 2 — > El sacárido del serogrupo W135 es un polímero de unidades disacáridas de ácido siálico-galactosa. Como el sacárido del serogrupo C, éste tiene O-acetilación variable, pero en las posiciones 7 y 9 del ácido siálico [25]. La estructura es mostrada en la figura 14 y es escrita como: —> 4) ) -D-Neup5Ac (7/ OAc) -a- (2?6 ) -D-Gal-a- ( l? El sacárido del serogrupo Y es similar al sacárido del serogrupo W135, excepto que la unidad repetida disacárida incluye glucosa en vez de galactosa (ver figura 16) . Como el sacárido del serogrupo W135, éste tiene O-acetilación variable en las posiciones 7 y 9 del ácido siálico [25]. La estructura del serogrupo Y es mostrada en la figura 15 y escrita como: — > 4) ) -D-Neup5Ac (7/90Ac) - - (2 —> 6) -D-Glc-a- (l-> Dentro de una composición que incluye sacáridos capsulares de los serogrupos C, W135 e Y existen de este modo tres diferentes monómeros constituyentes- (glucosa, galactosa y ácido siálico) y estos tres monómeros están presentes en una mezcla post-hidrólisis. La cantidad de monómeros de glucosa en tal mezcla está directamente relacionada a la cantidad del sacárido del serogrupo Y en la composición original, y la cantidad de monómeros de galactosa está directamente relacionada a la cantidad de sacáridos de W135. Para el serogrupo C, no obstante, la situación es más compleja: el ácido siálico es el único monómero disponible para la cuantificación del sacárido del serogrupo C, pero cualquier medición de la cantidad de ácido siálico en la mezcla incluirá monómeros derivados de los sacáridos de los serogrupos W135 e Y. La invención supera la complejidad de este análisis al medir el contenido en la mezcla de cada uno de galactosa, glucosa y ácido siálico (separada y/o simultáneamente) y luego: (a) utilizando el contenido de galactosa para cuantificar el contenido de W135 del serogrupo pre-hidrólisis; (b) utilizando el contenido de glucosa para cuantificar el contenido del serogrupo Y pre-hidrólisis,• (b) utilizando la diferencia entre el contenido de ácido siálico y el contenido combinado de glucosa y galactosa para cuantificar el contenido del serogrupo C pre-hidrólieis, por ejemplo, la cantidad molar del serogrupo C es calculada de acuerdo a la cantidad molar del ácido siálico menos la cantidad molar de (glucosa + galactosa) . La sustracción del contenido molar de glucosa y galactosa a partir del contenido molar de ácido siálico, corrige la interferencia proveniente de los serogrupos W135 e Y, y deja únicamente el ácido siálico proveniente del serogrupo C. La invención puede ser utilizada para analizar sacáridos capsulares de longitudes variantes. Por ejemplo, Menjugate^ y Meningitec101 incluyen fragmentos seleccionados por tamaño (oligosacáridos) del serogrupo C de longitud completa, mientras que NeisVAc-C101 utiliza el polisacárido de longitud completa. La invención puede ser utilizada con los oligosacáridos y/o polisacáridos de longitud completa. Los oligosacáridos tienen un grado de polimerización (DP) menor que aquel encontrado en polisacáridos capsulares nativos presentes en las bacterias, y pueden tener un DP promedio menor < 30, por ejemplo entre 10 y 25. El grado de polimerización puede ser convenientemente medido mediante cromatografía de intercambio iónico o mediante ensayos colorimétricos [26] .

Análisis del contenido de mono sác árido El proceso de la invención involucra un paso de analizar el contenido de ácido siálico, de galactosa (si está presente el serogrupo 135) y de glucosa (si está presente el serogrupo Y) . Si está siendo realizado un proceso para monitorizar la presencia de unidades monosacáridos en una composición (por ejemplo, simplemente para monitorizar los monosacáridos residuales provenientes de una etapa previa en producción, o para monitorizar la posible liberación hidrolítica de los monómeros a partir de un conjugado) entonces esto puede ser realizado sobre la composición directamente. Típicamente, no obstante, el proceso será utilizado para medir el contenido total de sacárido de una composición, y así pues la composición será hidrolizada a monosacáridos antes del análisis. De este modo, el proceso de la invención incluirá típicamente un paso de tratar una composición con el fin de despolimerizar los sacáridos capsulares para dar sus monosacáridos constituyentes. El análisis del contenido de ácido siálico y del contenido de galactosa y/o glucosa puede entonces proceder sobre la mezcla despolimerizada de los monosacáridos liberados. Las condiciones para la despolimerización de los sacáridos capsulares a sus monosacáridos constituyentes son conocidas en la técnica. Por ejemplo, el sacárido del serogrupo C puede ser hidrolizado para el análisis del contenido total de sacárido o mediante tratamiento con HCl 100 mM a 80eC por 2 horas [27]. La hidrólisis ácido utilizando ácido trifluoroacético (TFA) puede ser utilizada para la hidrólisis de todos los serogrupos W135 e Y, con una temperatura de incubación ligeramente menor que es preferida para el serogrupo C, para evitar la degradación de su ácido siálico (902C en vez de 100aC) . Un tratamiento típico con TFA involucra la adición de TFA a una concentración final de 2M, seguido por el calentamiento a 90-1002C por 90 minutos. Después de la despolimerización, los hidrolizados del sacárido pueden ser secados, por ejemplo, utilizando un secador a vacío. Después de la despolimerización, una composición contendrá monosacáridos mixtos derivados de los serogrupos C y W135 y/o Y. Las cantidades de estos monosacáridos en la mezcla están directamente relacionadas a las cantidades de sacáridos en la composición original por hidrólisis, y así pues las cantidades de los sacáridos iniciales pueden ser determinadas como se describe anteriormente. Las cantidades pueden ser determinadas en términos de números (por ejemplo moles) de las moléculas, masas, proporciones o concentraciones. Es típico trabajar en moles, ya que el ácido siálico tiene una masa molecular diferente de la glucosa-galactosa, pero cualquiera de estas mediciones puede ser utilizada e intercambiada para evaluar el contenido de los sacáridos de las mezclas. Para la medición cuantitativa, los resultados analíticos pueden ser comparados a un estándar con un contenido conocido de un sacárido particular. La mezcla despolimerizada es preferentemente hidrolizada completamente a monosacárido. Los inventores han encontrado que la hidrólisis incompleta ocurre algunas veces, dando mezclas en las cuales están presentes fragmentos disacáridos (por ejemplo, Gal-NeuNAc para MenWl35, y Glc-neunAc para MenY) . No obstante, los monosacáridos son liberados con la proporción teórica correcta, y los disacáridos no interfieren del análisis del monosacárido, de modo que su presencia no necesita provocar dificultades. El progreso de la despolimerización (por ejemplo, para verificar la hidrólisis total a monosacáridos en vez de la hidrólisis parcial a oligosacáridos) puede ser verificada mediante la medición del grado de polimerización (DP, por sus siglas en inglés) en una mezcla, utilizando técnicas conocidas, por ejemplo, resonancia magnética nuclear (RMN, por sus siglas en inglés), espectrometría de masa, etc. Los métodos para cuantificar monosacáridos de glucosa, galactosa y ácido siálico son bien conocidos en la técnica. Los métodos pueden ser directos o indirectos (por ejemplo, éstos pueden involucrar la derivatización de los monosacáridos, seguido por un análisis que correlaciona con el contenido de monosacárido original) . Los métodos pueden involucrar la separación de los dos o tres diferentes monosacáridos, uno del otro, seguido por el análisis separado, y en tal caso, la medición efectiva del contenido de monosacárido podría ser la misma en cada caso, con la especificidad que surge a partir de la separación. Se prefiere no obstante, métodos que puedan analizar sacáridos uno en presencia del otro, tal que éstos no necesitan ser separados uno del otro antes del análisis. Además, pueden ser utilizados los métodos para sacáridos conjugados en los cuales, después de la desconjugación, el portador y el sacárido no necesitan ser separados . Un método preferido es la cromatografía aniónica, y en particular la cromatografía de intercambio aniónico de alta resolución (HPAEC, por sus siglas en inglés) , usualmente con detección amperométrica pulsada (PAD, por sus siglas en inglés) [28, 29], Los sistemae HPAEC-PAD son proporcionados por la Corporación Dionex1111 (Sunnyvale, CA) , por ejemplo, el sistema BioLC™ utilizando una columna tal como PAl [sustrato de poliestireno de 10 µm de diámetro de 2% reticulado con divinilbenceno, aglomerado con látex funcionalizado con amonio cuaternario MicroBead 500 nm (5% reticulado)] o PA10 [sustrato de etilvinilbenceno de 10 µm de diámetro, 55% reticulado con divinilbenceno, aglomerado con ion amonio cuaternario difuncional MicroBead 460 nm (5% reticulado)]. Estos sistemas pueden analizar cuantitativamente los sacáridos individuales dentro de las mezclas y la necesidad de la derivatización o la separación pre-análisis . Para el análisis de los sacáridos, puede ser deseado filtrar otros compuestos antes de la entrada a la columna, y Dionex1™ produce trampas y guardas pre-columna para este propósito, por ejemplo, una trampa amino para eliminar los grupos amino, una trampa de borato, etc. Un método alternativo para cuantificar los monosacáridos de glucosa, galactosa y ácido siálico dentro de una mezcla despolimerizada, es la resonancia magnética nuclear (RMN) . Para facilidad de uso y para alta sensibilidad, no obstante, son preferidos los métodos cromatográficos de la invención. Una vez que han sido determinados el contenido de ácido siálico y el contenido de glucosa y/o galactosa, es simple comparar las cantidades molares de cada monosacárido en la mezcla, y con esto calcular la cantidad de sacáridos capsulares en la composición original . El proceso de la invención es típicamente destructivo. En vez de realizar el proceso sobre una composición completa, por lo tanto, es más típico tomar una muestra a partir de una composición de interés y luego realizar el análisis sobre la muestra.

Conjugados La invención es útil para analizar el contenido de sacárido de las vacunas, y en particular para vacunas que incluyen un sacárido conjugado. La conjugación covalente es utilizada para aumentar la inmunogenicidad de los sacáridos al convertirlos de antígenos independientes de T a antígenos dependientes de T, permitiendo de este modo el aprestamiento para la memoria inmunológica. La conjugación es particularmente útil para vacunas pediátricas y es una técnica bien conocida [por ejemplo revisada en las referencias 30 a 39] . Los sacáridos pueden ser enlazados a portadores directamente [40, 41], pero un ligador o espaciador es en general utilizado, por ejemplo ácido adípico, ß-propionamida [42], nitrofenil-etilamina [43], haluros de haloacilo [44] , enlaces glucosídicos [45] , ácido 6-aminocaproico [46] , ADH [47] , porciones de 4 a 12 átomos de carbono [48], etc. Las proteínas portadoras típicas en los conjugados son toxinas bacterianas o toxoides, tales como el toxoide de la difteria o el toxoide tetánico. El derivado de toxina de la difteria CRM?97 [49-51] es la proteína portadora en Menjugate1111 y Meningitec1111, mientras que el toxoide tetánico es utilizado en NeisVac1111. El toxoide de la difteria es utilizado como el portador en Menactram. Otras proteínas portadoras conocidas incluyen la proteína de la membrana externa de N. meningi tidis [52], péptidos sintéticos [53, 54], proteínas de choque térmico [55, 56], proteínas de pertussis [57, 58], citocinas [59], linfocinas [59], hormonas [59], factores de crecimiento [59], proteínas artificiales que comprenden epitopos múltiples de células T CD4+ humanas provenientes de diversos antígenos derivados de patógenos

[60], la proteína D de H. influenzae [61, 62], la proteína PspA superficial de neumococos [63], proteínas de captación de hierro [64], toxina A o B de C. difficile [65], etc. Las composiciones pueden utilizar más de una proteína portadora, por ejemplo para reducir el riesgo de supresión del portador, y una proteína portadora simple puede llevar más de un antígeno sacárido [66] . Los conjugados tienen en general una proporción de sacárido:proteína (p/p) de entre 1:5 (por ejemplo proteína en exceso) y 5:1 (por ejemplo sacárido en exceso) . Las composiciones pueden incluir proteína portadora libre además de los conjugados [67] . En general, las composiciones que incluyen los sacáridos conjugados pueden ser analizadas utilizando la invención de dos formas. Primeramente, la concentración del sacárido total para cada serogrupo en una composición, puede ser medida por ejemplo antes de la liberación de una vacuna (para fines regulatorios o de control de calidad) , o para verificar las concentraciones después de que se mezclan los conjugados. En segundo lugar, el sacárido no conjugado libre en una composición puede ser medido por ejemplo para verificar la conjugación incompleta, o para seguir la hidrólisis del conjugado por monitoreo incrementando el sacárido libre sobre le tiempo. Mediante la realización de ambos tipos de análisis, la proporción del sacárido libre al sacárido total puede ser evaluada para cada serogrupo, que puede ser utilizado para fines regulatorios o de control de calidad. En general, es deseable asegurar que una vacuna incluya <25% (por ejemplo <20%, <15%, <10%, etc.) de cada sacárido en forma libre. Los altos niveles de sacáridos libres significan una dosis inmunogénica más baja del conjugado. De este modo, la invención proporciona un método para analizar una composición, en donde: a) la composición comprende un conjugado de un sacárido capsular proveniente del serogrupo C de Neisseria meningi tidis y uno o ambos de: (i) un conjugado de un sacárido capsular proveniente del serogrupo 135 de Neisseria meningi tidis; y/o (ii) un conjugado de un sacárido capsular de serogrupo Y de Neisseria meningi tidis ; b) la composición puede comprender los sacáridos capsulares en forma no conjugada; c) el contenido de cualesquiera sacáridos capsulares no conjugados es determinado mediante un proceso de la invención, como se describió anteriormente; d) el contenido de los sacáridos capsulares conjugados es determinado mediante un proceso de la invención, como se describió anteriormente; y opcionalmente: e) la proporción del sacárido conjugado :no conjugado es calculada para uno o más de los sacáridos capsulares . Los pasos (c) y (d) pueden ser realizados en cualquier orden, o simultáneamente. La invención también proporciona un método para liberar una vacuna para el uso por los médicos, que comprende los pasos de: (a) fabricar una vacuna que contiene un conjugado de un sacárido capsular del serogrupo C de Neisseria meningi tidis y uno o ambos de: (i) un conjugado de un sacárido capsular del serogrupo W135 de Neisseria meningi tidis; y/o (ii) un conjugado de un sacárido capsular del serogrupo Y de Neisseria meningi tidis; (b) el análisis de la cantidad del sacárido conjugado y/o no conjugado en la vacuna para cada uno de los sacáridos capsulares; y, si los resultados del paso (b) indican un contenido de sacárido aceptable para el uso clínico, (c) se libera la vacuna para el uso por los médicos. El paso (b) puede involucrar la evaluación de la concentración mínima del sacárido (por ejemplo entre 1-20 µg del sacárido total por serogrupo) , la evaluación de la proporción del sacárido no conjugado: conjugado (por ejemplo <20% en peso del sacárido no conjugado, preferentemente <10% o <5%) , etc. El paso 8b) puede ser realizado en una vacuna envasada, o puede ser realizado en una vacuna a granel antes del envasado. Para evaluar separadamente los sacáridos conjugados y no conjugados, éstos deben ser separados. El sacárido libre (por ejemplo no conjugado) en una composición acuosa puede ser separado del sacárido conjugado de diversas formas. La reacción de conjugación cambia varios parámetros químicos y físicos para el sacárido, y las diferencias pueden ser explotadas para la separación. Por ejemplo, la separación por tamaño puede ser utilizada para separar el sacárido libre y conjugado, ya que el material conjugado tiene una mayor masa debido a la proteína portadora. La ultrafiltración es un método de separación por tamaño, preferido, y el sacárido libre puede pasar a través de una membrana de ultrafiltración con un límite apropiado (por ejemplo 30 kDa para un portador CRM?97) , mientras que el conjugado será retenido . Un método alternativo es utilizar la extracción en fase sólida utilizando (SPE) una columna o membrana que retiene el conjugado, pero que permite que el sacárido libre pase a través como un eluido. SPE tiende a ser más rápido y más consistente, pero la separación por tamaño es más universalmente aplicable. Como una alternativa adicional, si los conjugados han sido adsorbidos a un adyuvante, entonces la centrifugación separará el conjugado adsorbido (pella) del sacárido libre (sobrenadante) que se desorbe después de la hidrólisis . De este modo el sacárido libre puede ser separado del sacárido total y puede ser separadamente analizado, con lo cual se permite una determinación de la cantidad del material no conjugado en una composición. La comparación de la cantidad libre a la cantidad total es más fácil que analizar separadamente los dos combinados después de la separación, particularmente si el material conjugado es retenido sobre un soporte durante la separación.

Componentes sacáridos capsulares adicionales La invención permite el análisis de las composiciones que comprenden sacáridos capsulares de los serogrupos C y W135 y/o Y de N. meningi tidis . Ésta puede ser también utilizada para el análisis de las composiciones que incluyen sacáridos capsulares adicionales, por ejemplo un sacárido capsular del serogrupo A de N. meningi tidis, un sacárido capsular de H. influenzae b, etc. El sacárido capsular del meningococo del serogrupo A es un homopolímero de N-acetil-D-manosamina-1-fosfato (al- 6) -enlazado, con la O-acetilación parcial en las posiciones del carbono 3 y el carbono 4 (Figura 17) . Los grupos acetilo pueden ser reemplazados con grupos de blogueo para prevenir la hidrólieis [17] , y tales sacáridos modificados son todavía sacáridos del serogrupo A dentro del significado de la presente invención. Las condiciones de despolimerización para el sacárido capsular del serogrupo A son conocidas [21] por ejemplo la hidrólisis por TFA a 100°C, como se describe anteriormente para otros serogrupos. Un método alternativo involucra Dowex 50 H+ seguido por calentamiento por 1 hora a 100°C [68] . Los monómeros de fosfato de manosamina liberados pueden ser analizados en paralelo con la glucosa, galactosa y el ácido siálico por ejemplo mediante HPAEC-PAD [21] . El sacárido capsular Hib es un polímero de ribosa, ribitol y fosfato. El sacárido es conocido como 'PRP' (poli-3-ß-D-ribosa- (1,1) -D-ribitol-5-fosf to) y es mostrado en la Figura 18. Los métodos para despolimerizar PRP a monosacáridos para HPAEC-PAD o análisis de 31P-RMN son conocidos por ejemplo mediante incubación de toa la noche con hidróxido de sodio a temperatura ambiente [20] . La ribosa y el ribitol liberado pueden ser analizados en paralelo con la glucosa, la galactosa y el ácido siálico. El polisacárido capsular del serogrupo C es un homopolímero de ácidos siálicos a2- 9-enlazados (también conocidos como ácido colomínico) . Se prefiere que una composición analizada por la invención no incluya homopolímeros de ácido siálico por ejemplo el sacárido capsular de meningococos del serogrupo B (ácidos siálicos a2->8-enlazados) , o el sacárido capsular de ?. coli K12 (con enlaces a2->8 y a2- 9). Más en general, si la composición que va a ser analizada incluye un sacárido capsular que incluye un monómero de glucosa, galactosa o ácido siálico, entonces se prefiere que este sacárido capsular deba también incluir monómero o monómeros adicionales que es o son únicos (dentro de la mezcla) para ese sacárido, con el fin de facilitar el análisis mixto. Incluso donde los monómeros son compartidos entre sacáridos, la presencia de un monómero único permite que diferentes sacáridos sean analizados en paralelo utilizando los mismos principios que se describen para la resolución de los serogrupos C, W135 e Y de meningococos.

Componentes sacáridos no capuslares Donde la invención confía en el análisis de monosacáridos de una mezcla derivada de una composición bajo análisis, se prefiere que la composición no incluya ese monosacárido en forma libre (diferente de cualesquiera monosacáridos antecedentes derivados de la hidrólisis del sacárido capsular) . Por ejemplo, la inclusión de ácido siálico libre en una composición que va a ser analizada, podría dar como resultado que el contenido del serogrupo C sea sobreestimado. El mismo principio aplica si son incluidos disacáridos, y son luego hidrolizados, por ejemplo la presencia de la sucrosa (glucosa + fructosa) , o de maltosa o trehalosa (ambos di-glucosa) podrían dar una sobreestimación del contenido del serogrupo Y, y la presencia de lactosa (glucosa + galactosa) podría dar un sobreestimado de W135 e Y (y un subestimado del serogrupo C) . No obstante, tales sacáridos son frecuentemente utilizados en formulación de vacunas (por ejemplo como estabilizadores [69, 70]), y existen dos formas generales en las cuales estos problemas de interferencia pueden ser reducidos al mínimo o evitados. Primeramente, los niveles iniciales de estos componentes pueden ser medidos, y luego sustraídos de los niveles medidos en la mezcla despolimerizada. En segundo lugar, estos componentes pueden ser removidos de la composición antes del análisis, por ejemplo mediante filtración o diálisis. Las membranas de ultrafiltración pueden ser utilizadas para remover los componentes de bajo peso molecular, por ejemplo una membrana 1K para eliminar la sucrosa (peso molecular: 360) . La presencia de monosacáridos que tampoco son encontrados en los sacáridos capsulares que son analizados, normalmente no conduce a problemas de interferencia. Por ejemplo, los alcoholes de azúcar pueden ser incluidos en la vacuna como un estabilizador de la liofilización [71] , pero HPAEC-AED es capaz e distinguir entre un monosacárido simple y el monosacárido de poliol correspondí nte, por ejemplo entre la mañosa (como se encuentra en la cápsula de Aerobacter aerogenes [72]) y monosacáridoe de manitol (un estabilizador) , y entre la ribosa y el ribitol [73] .

Análisis de los componente no sacáridos Así como se analiza el contenido de los sacáridos en una composición, el proceso puede incluir el análisis de otros componentes o propiedades por ejemplo la osmolalidad, el pH, el grado de polimerización para sacáridos individuales o conjugados, el contenido de proteína (particularmente para proteínas portadoras) , el contenido de aluminio, el contenido de detergente, el contenido de conservadores, etc. La invención proporciona un método para preparar un método de composición de vacuna, que comprende un paso de analizar una composición de acuerdo a la invención, que incluye un paso de medición del pH, seguido por un paso de ajuste del pH de la composición a un valor deseado, por ejemplo entre 6 y 8, o aproximadamente 7. La invención proporciona un método para envasar una vacuna, que comprende los pasos de: (a) fabricar una vacuna a granel que contiene un conjugado de un sacárido capsular proveniente del serogrupo C de Neisseria meningitidis y uno o ambos de: (i) un conjugado de un sacárido capsular del serogrupo W135 de Neisseria meningi tidis; y/o (ii) un conjugado de un sacárido capsular del serogrupo Y de Neisseria meningi tidis; (b) analizar la cantidad del sacárido conjugado y/o no conjugado en la vacuna a granel para cada uno de los sacáridos capsulares; (c) opcionalmente, el análisie de la vacuna a granel para el pH y/o otras propiedades; y, si los resultados del paso (b) y (c) indican que la vacuna a granel es aceptable para el uso clínico, (d) se prepara y se pasa la vacuna para el uso humano a partir del granel. El paso (c) puede involucrar (ver arriba) la evaluación de la concentración mínima del sacárido, la evaluación de la proporción del sacárido no conjugado: conjugado, etc. El paso (d) puede involucrar el envasado en forma de dosis unitaria o en forma de dosis múltiples, por ejemplo dentro de frascos o en jeringas. Una dosis humana típica para la inyección tiene un volumen de 0.5 ml. El paso (c) y/o (d) puede ser precedido por el mezclado de la vacuna a granel con uno o más antígenos adicionales, por ejemplo con: un antígeno sacárido capsular del serogrupo A de N. meningi ti dis . - un antígeno proteico del serogrupo B de N. meningi tidis . preparaciones de microvesículas de N. meningi tidis serogrupo B [74], ?OMVs nativos' [75], ampollas o vesículas de la membrana externa [por ejemplo referencias 76 a 81, etc. ] . - un antígeno sacárido de Haemophilus influenzae tipo b. un antígeno de Streptococcus pneumoniae, tal como los antígenos sacáridos conjugados polivalentes [por ejemplo referencias 82 a 84] . un antígeno del virus de la hepatitis A, tal como el virus inactivado [por ejemplo 85, 86] . un antígeno del virus de la hepatitis B, tales como los antígenos superficial y/o nuclear [por ejemplo 86, 87] . un antígeno de Bordetella pertussis, tal como la holotoxina de pertussis (PT) y la hemaglutinina filamentosa (FHA) de B . pertussis, opcionalmente también en combinación con pertactina y/o los aglutinógenos 2 y 3 [por ejemplo referencias 88 y 89] . Pueden ser utilizados antígenos de pertussis celularee . un antígeno de la difteria, tal como un toxoide de la difteria [por ejemplo Capítulo 13 de la referencia 1] por ejemplo el mutante CRMi97 [por ejemplo 90] . un antígeno de tétanos, tal como el toxoide tetánico [por ejemplo Capítulo 27 de la referencia 1] . uno o varios antígenos de la polio [por ejemplo 91, 92], tales como IPV.

Tales antígenos pueden ser adsorbidos a un adyuvante de sal de aluminio (por ejemplo un hidróxido o un fosfato) . Cualesquiera antígenos sacáridos adicionales son preferentemente incluidos como conjugados.

Consistencia de lote a lote Para la fabricación de vacunas humanas, los sacáridos conjugados deben ser sometidos a control de calidad antes de la conjugación (por ejemplo el sacárido y la proteína portadora) , después de la conjugación, después de la formulación y después del mezclado . Los métodos de la técnica anterior basados en el análisis de monosacáridos no pueden ser utilizados para distinguir los sacáridos capsulares de los serogrupos C, W135 e Y de meningococos, después de que éstos han sido mezclados, debido a la interferencia provocada por tener múltiples fuentes de ácido siálico. Con la invención, no obstante, el análisis de los monosacáridos puede ser utilizado para analizar los conjugados mixtos. Además, los procesos de la invención son confiables y consistentes, y de este modo permiten comparaciones válidas de los diferentes lotes de los conjugados mixtos, donde esto no era posible con los métodos de la técnica anterior. Diferentes lotes de vacunas conjugadas mixtas pueden ser de este modo preparados, evaluados y luego los lotes más consistentes pueden ser seleccionados para la liberación y uso, mientras que los lotes aberrantes pueden ser rechazados . La invención proporciona un proceso para cuantificar los sacáridos a partir de serogrupos individuales dentro de una mezcla de sacáridos capsulares, a partir de al menos dos diferentes serogrupos de meningococos, en donde: (a) los diferentes serogrupos comprenden el serogrupo C y uno o ambos de: (i) el serogrupo W135 y/o (ii) serogrupo Y; (b) el proceso comprende un paso de despolimerizar los sacáridos capsulares dentro de la mezcla, para dar una mezcla despolimerizada; y (c) los diferentes serogrupos son cuantificados al comparar la composición de monosacárido de la mezcla despolimerizada. La invención también proporciona n lotes de una vacuna, en donde: (a) cada uno de los n lotes de vacuna comprende: un conjugado de un sacárido capsular del serogrupo C de Neisseria meningi tidis y uno o ambos de: (i) un conjugado de un sacárido capsular del serogrupo W135 de Neisseria meningi tidis; y/o (ii) un conjugado de un sacárido capsular del serogrupo Y de Neisseria meningi tidis; (b) la concentración del sacárido del serogrupo C conjugado en el primer lote es C , (c) la concentración del conjugado del sacárido del serogrupo C conjugado en el segundo lote es C ; si es aplicable, (d) la concentración del sacárido del serogrupo 135 conjugado en el primer lote es Wx ; si es aplicable, (e) la concentración del sacárido del serogrupo W135 conjugado en el segundo lote es W2; si es aplicable, (f) la concentración del sacárido del serogrupo Y conjugado en el primer lote es Y±; si es aplicable, (g) la concentración del sacárido del serogrupo Y conjugado en el segundo lote es Y2; (h) las proporciones C /C2, W?/W2 e Y1/Y2 están cada una entre 0.90 y 1.10, y preferentemente están cada una entre 0.95 y 1.05; y (i) el valor de n es 2 ó más (por ejemplo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ó más). Las proporciones especificadas en (h) pueden estar basadas en una muestra simple proveniente de cada lote que se compare, pero típicamente estará basada en valores promedio (por ejemplo medias) a partir de muestras múltiples de cada lote. De este modo, cada uno de los n lotes puede ser sometido a muestreo múltiple, y cada muestra puede ser sometida a múltiples mediciones de Ci, C2, Wx, W2, Yx e Y2, con los promedios que son luego calculados para cada lote, y con los promedios que son utilizados para calcular las proporciones necesarias . Cada lote de vacuna habrá sido preparado separadamente. Por ejemplo, dos diferentes lotes pueden ser elaborados mediante mezclados separadoe de los mismos conjugados simples a granel, o mediante el mezclado de los conjugados simples a granel que fueron separadamente preparados . Diferentes muestras de la misma mezcla a granel no son diferentes lotes, ya que estas muestras no son sometidas a las variaciones lote a lote que resultan de las diferencias que surgen cuando se preparan mezclas de diferentes conjugados. Además de las características (a) a (i) como se especifican anteriormente, los n lotes pueden además ser caracterizados por: (j) la concentración del sacárido del serogrupo C no conjugado en el primer lote es C3; (k) la concentración del sacárido del serogrupo C no conjugado en el segundo lote es C4; si es aplicable, (1) la concentración del sacárido del serogrupo W135 no conjugado en el primer lote es W ; si es aplicable, (m) la concentración del sacárido del serogrupo W135 no conjugado en el segundo lote es W4 ; si es aplicable, (n) la concentración del sacárido del serogrupo Y no conjugado en el primer lote es Y ; si es aplicable, (o) la concentración del sacárido del serogrupo Y no conjugado en el segundo lote es Y4; (p) las proporciones C3/C4, W3/W4 e Y3/Y4 están cada una entre 0.90 y 1.10, y preferentemente están cada una entre 0.95 y 1.05. Los lotes pueden también ser caracterizados por: (q) las proporciones C3/C1, C /C2, W3/W1, W4/W2, Y3/Y1 e Y4/Y son cada una menores de 0.20 (por ejemplo <0.15, <0.10, <0.05, <0.02, 0).

General El término "que comprende" abarca "que incluye" así como "que consiste", por ejemplo una composición "que comprende" X puede consistir exclusivamente de X o puede incluir algo adicional, por ejemplo X + Y. La palabra "sustancialmente" no excluye "completamente" por ejemplo una composición que está "sustancialmente libre" de Y puede estar completamente libre de Y. Donde es necesario, la palabra "eustancialmente" puede ser omitida de la definición de la invención. El término "aproximadament " en relación a un valor x numérico significa, por ejemplo, x±10%. Se apreciará que los anillos de azúcar pueden existir en forma abierta y cerrada y que, mi ntras que son mostradas las formas cerradas en las fórmulas estructurales en la presente, las formas abiertas son también abarcadas por la invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las Figuras 1 y 2 muestran el análisis de HPAEC-PAD de un conjugado del serogrupo A de meningococos, liofilizados utilizando un estabilizador de manitol. Análisis similares para el material donde la sucrosa ha sido utilizada como un estabilizador, se muestran en las Figuras 3 y 4. Las Figuras 5 y 6 muestran análisis similares para un conjugado del serogrupo Y que no había sido liofilizado, y las Figuras 7 y 8 muestran el mismo análisis para un conjugado del serogrupo W135. Las Figuras 9 a la 12 muestran los análisis de HPAEC-PAD de los conjugados mixtos de los serogrupos C, W135 e Y. Las Figuras 13 a la 15 muestran las fórmulas estructurales para los sacáridos capsularee de los serogrupos meningocócicos C (13), W135 (14) e Y (15). La Figura 16 muestra la diferencia entre los serogrupos 135 e Y. La Figura 17 muestra una fórmula estructural del sacárido capsular de meningococos del serogrupo A. La Figura 18 muestra una fórmula estructural del sacárido capsular de H. influenzae tipo b. La Figura 19 muestra el cambio en el sacárido libre (%) sobre seis puntos de tiempo en conjugados combinados provenientes de los serogrupos C ( ), W135 (ß) e Y ( ).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Producción de conjugados y métodos cromatográficos Los antígenos sacáridos capsulares fueron preparados a partir de los serogrupos A, C, W135 e Y de Neisseria meningi tidis y conjugados a CRM?g7 como se describe en la referencia 7. Los cuatro conjugados fueron combinados para dar una composición acuosa "Mer±ACWY" . En un trabajo separado, el conjugado del serogrupo A fue liofilizado en presencia ya sea de sucrosa o de manitol, y se preparó una mezcla de los conjugados del serotipo C W135 e Y ("MenCWY") . El análisis del contenido de sacárido fue analizado sobre un sistema de cromatografía Dionex1411 HPAEC-PAD de acuerdo a las instrucciones del fabricante. El instrumento tuvo un módulo de bomba de gradiente (GP40 o GP50) , un detector amperométrico pulsado (ED40 o ED50) y un automuestreador (AS3500 o AS50) . Los sacáridos son detectados mediante la medición de la corriente eléctrica generada por su oxidación en la superficie de un electrodo de trabajo, de oro (con electrodo de referencia de Ag/AgCl) . Una forma de onda triple-potencial fue aplicada utilizando los siguientes ajustes: El = 0.05 V; ti = 400 ms; E2 = 0.75 V; t2 = 200 ms; E3 = 0.15V; t3 = 400 ms). La integración ocurrió de 200 a 400 ms durante la aplicación El. Los datos cromatográficos fueron integrados y procesados utilizando el software de reducción de datos PeakNet 6.4.

Serogrupo A La formulación liofilizada con manitol del sacárido del serogrupo A fue probada mediante HPAEC-PAD después del almacenamiento a 4°C por 3 meses. Las composiciones que contenían el conjugado fueron separadas del sacárido libre utilizando una columna de extracción en fase sólida C4 (SPE) .

La solución que contenía el sacárido libre fue sometida a hidrólisis acida utilizando ácido trifluoroacético a 100°C por 2 horas . La mezcla fue luego aplicada a una columna Dionex101 CarboPac PAl utilizando una protección PAl, elución en gradiente y una detección PAD, para la detección de manosamina-6-fosfato. Los resultados se muestran en la Figura 1. El mismo análisis fue realizado, pero sin la separación por SPE del sacárido libre. Los resultados de este análisis se muestran en la Figura 2. La comparación de las Figuras 1 y 2 , tomando en cuenta que el análisis de la Figura 1 utilizó una dilución 1:2 y el análisis de la Figura 2 utilizó una dilución 1:5, muestra que el pico de manosamina-6-fosfato es mucho menor en la Figura 1, mostrando un bajo nivel de sacárido libre en la composición. El análisis cuantitativo muestra un total de 10.7 µg de sacárido por frasco, con 3.7% libre. El material liofilizado con sucrosa fue analizado de la misma manera, después de la reconstitución con 600 µl de agua por frasco, seguido por la combinación de las muestras para dar 2 a 3 ml por análisis. Antes del SPE C4, no obstante, la composición fue sometida a ultrafiltración utilizando una membrana 1K (lavado con 2 ml de agua, carga de la solución de muestra de 2 ml, 3 ciclos de lavado con 2 ml de agua cada vez, recuperación del retenido y ajuste del volumen hasta 1 ml, dilución 1:1 para dar la concentración final del cloruro de sodio de 0.9% para la carga de SPE) . La Figura 3 muestra que existió sacárido libre despreciable en la composición, pero un pico grande correspondiente al material conjugado (Figura 4) .

Serogrupos W135 e Y Antes de la combinación con otros conjugados, se analizó el conjugado del serogrupo Y a granel. El conjugado fue separado del sacárido libre utilizando una membrana de ultrafiltración de 30 kDa. El material que va a ser analizado fue hidrolizado con TFA a 100°C, seguido por el análisis cuantitativo de la glucosa sobre la máquina Dionex1^ utilizando una columna CarboPac PAl, un AminoTrap, una elución isocrática y paso de regeneración, y la detección de PAD, de acuerdo a las instrucciones del fabricante. El portador CMR?97 no necesitó ser removido antes de la aplicación del hidrolizado a la columna. El material no conjugado fue detectable (Figura 5) pero fue menos abundante que la glucosa total (Figura 6) . Tomando en cuenta las diferentes diluciones, el análisis de estas Figuras da una fracción de sacárido libre de 1.8%. El material del serogrupo W135 a granel fue tratado y analizado de la misma manera, pero con la detección de galactosa en vez de la detección de glucosa (Figuras 7 y 8) .

Tomando en cuenta las diferentes diluciones, el análisis de estas Figuras da una fracción de sacárido libre de 6%.

Conjugados combinados Los conjugados para los serogrupos A, C, W135 e Y fueron combinados con un adyuvante de fosfato de aluminio, como se describe en la referencia 7. Una combinación del conjugado MenC Y que había sido almacenado por 2 semanas a 4°C se utilizó para reconstituir el conjugado MenA liofilizado, y el análisis seguido 48 horas después, con centrifugación para separar el adyuvante de los conjugados. Los conjugados combinados fueron separados de los sacáridos libres por dos ciclos de ultrafiltración utilizando una membrana de 30 kDa. El segundo ciclo disminuyó la contaminación con glucoconjugado que se encontró que algunas veces pasa a través del permeado del primer ciclo . Los sacáridos fueron evaluados, antes y después de la ultrafiltración por hidrólisis acida utilizando TFA a 90°C/100°C, seguido por dos análisis HPAEC-PAD separados utilizando una columna Dionex1111 CarboPac PAl. Para el análisis del serogrupo C, la columna tuvo una protección CarboPac PAl y utilizó elución en gradiente por pasos . Esta columna fue corrida en un modo donde la glucosa y la galactosa no fueron resueltas, ya que es más rápido de esta manera. Los resultados se muestran en las Figuras 9 y 10. Para los serogrupos W135 y Y, la columna tuvo un AminoTrap y utilizó elución ieocrática y regeneración, que reeuelve la glucosa y la galactosa. Los resultados se muestran en las Figuras 11 y 12. Para calcular las cantidades de cada sacárido diferente, la cantidad de ácido siálico en el análisis de la Figura 9/10 es corregido para la interferencia al sustraer la cantidad combinada de glucosa y galactosa. Este valor da la concentración de MenC. Las cantidades de galactosa y glucosa en el análisis de la Figura 11/12 son luego utilizadas para cuantificar los serogrupos W135 y Y. Las cantidades combinadas de glucosa y galactosa de la Figura 11/12 pueden no concordar con la cantidad tomada de la Figura 9/10, debido a la hidrólisis incompleta, como se describe anteriormente, pero tales discrepancias no afectan el análisis general. Las cantidades fueron. calculadas por comparación a los estándares que contienen cantidades conocidas de glucosa, galactosa y ácido siálico. Un análisis típico por duplicado del sacárido MenC total y libre en un conjugado dio estos resultados: t por ejemplo la concentración del sacárido del serogrupo C A pesar de la falta de un sacárido único para cuantificar el sacárido del serogrupo C, por lo tanto, la invención permite que este material sea cuantitativamente evaluado en un antecedente de los sacáridos de los serogrupos W135 y Y. El análisis similar de las Figuras 9 y 10 revela la cantidad de cada sacárido libre en la composición MenAC Y, y permite que el sacárido libre sea expresado como un porcentaje del sacárido total en la composición. Este análisis fue realizado en diversos puntos de tiempo en un periodo de 1 año para la combinación de MenCWY formulada para contener 10 µg/dosis (por ejemplo 20 µg/ml) de cada sacárido. Los resultados fueron: SD = desviación estándar CV = coeficiente de variación por ejemplo (SD/media) x 100% La variación en el porcentaje de sacárido libre en los seis puntos de tiempo se muestra en la Figura 19. En una segunda serie de experimentos, las vacunas fueron formuladas a la mitad (5 µg de cada sacárido por dosis) y un cuarto de dosis (2.5 µg) con relación al trabajo previo. El proceso de la invención fue utilizado para resolver los diferentes sacáridos dentro de la combinación, y los resultados fueron: Se entenderá que la invención ha sido descrita a manera de ejemplo únicamente y pueden ser realizadas modificaciones mientras que se permanezca dentro del alcance y espíritu de la invención. REFERENCIAS (los contenidos de las cuales son incorporadas por referencia en la presente) [1] Vaccines (eds. Plotkin et al. ) 4A edición, ISBN: 0721696880. [2] Baker et al . (2003) J Infect Dis 188:66-73. [3] Theilacker et al . (2003) Infect I mun 71: 3875-84. [4] Anonymous (2003) Drugs R D 4:383-5. [5] Jones (2001) Curr Opin Investig Drugs 2:47-49. . [7] WO03/007985. [8] Rennels et al . (2002) Pediatr Infect Dis J 21 :978-979 [9] Campbell et al . (2002) J Infect Dis 186:1848-1851. [10] Costantino et al . (1992) Vaccine 10:691-698. [11] Lieberman et al . (1996) JAMA 275:1499-1503. [12] Darkee & Plosker (2002) Paediatr Drugs 4:609-630. [13] Ugozzoli (2002) J Infect Dis 186:1358-61. [14] Granoff et al . (1997) Infect Immun 65:1710-5. [15] Paradiso & Lindberg (1996) Dev Biol Stand 87:269-275.

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Claims (18)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un proceso para analizar el contenido de sacárido de una composición, caracterizado porque: a) la composición comprende un sacárido capsular del serogrupo C de Neisseria meningi tidis y uno o ambos de: (i) un sacárido capsular del serogrupo W135 de Neisseria meningi tidis; y/o (ii) un sacárido capsular del serogrupo Y de Neisseria meningitidis; b) el proceso comprende un paso de analizar el contenido de ácido siálico de la composición, y: i) si la composición incluye un sacárido del serogrupo W135, un paso de analizar el contenido de galactosa de la composición; (ii) si la composición incluye un sacárido del serogrupo Y, un paso de analizar el contenido de glucosa de la composición; c) si la composición incluye un sacárido del serogrupo W135, el contenido del sacárido del serogrupo W135 en la composición es determinado de acuerdo a los resultados del análisis de galactosa del paso (b) ; d) si la composición incluye un sacárido del serogrupo Y, el contenido del sacárido del serogrupo Y en la composición es determinado de acuerdo a los resultados del análisis de glucosa del paso (b) ;' y e) el contenido del sacárido del serogrupo C en la composición es determinado al comparar los resultados del análisis de ácido siálico con: (i) si la composición incluye un sacárido del serogrupo W135 pero no un sacárido del serogrupo Y, los resultados del análisis de galactosa del paso (b) ; (ii) si la composición incluye un sacárido del serogrupo Y pero no un sacárido del serogrupo W135, los resultados del análisis de glucosa del paso (b) ; o (iii) si la composición incluye un sacárido del serogrupo W135 y un sacárido del serogrupo Y, los resultados combinados de los análisis de glucosa y galactosa del paso (b) .
2. 2. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la composición comprende el sacárido capsular de los tres serogrupos C, W135 y Y de Neisseria meningi tidis.
3. 3. El proceso de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la composición comprende uno o más sacáridos capsulares adicionales .
4. 4. El proceso de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque uno o más de los sacáridos capsulares adicionales se seleccionan del grupo que consiste de: un sacárido capsular del serogrupo A de N. meningi tidis; y un sacárido capsular de Haemophilus influenzae b.
5. 5. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque incluye un paso de tratar la composición con el fin de despolimerizar los sacáridos capsulares para dar sus monosacáridos constituyentes .
6. 6. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el contenido de ácido siálico, el contenido de glucosa y/o el contenido de galactosa se miden mediante cromatografía de intercambio iónico de alta resolución, opcionalmente con detección amperométrica pulsada.
7. 7. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el proceso también incluye el o los pasos en los cuales uno o más de los siguientes componentes o propiedades son analizados : osmolalidad, pH, grado de polimerización para sacáridos individuales o conjugados, contenido de proteína, contenido de aluminio, contenido de detergente, y contenido de conservador.
8. 8. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque los sacáridos capsulares son derivados de un conjugado de sacárido-proteína .
9. 9. El proceso de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la proteína en el conjugado es una toxina o toxoide bacteriano .
10. 10. El proceso de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la toxina o toxoide se selecciona del grupo que consiste de: toxoide de la difteria; toxoide tetánico; derivado de toxina de la difteria CRM197; y proteína D proveniente de H. influenzae .
11. 11. Un proceso para analizar una composición, caracterizado porque: a) la composición comprende un conjugado de un sacárido capsular del serogrupo C de Neisseria meningi tidis y uno o ambos de: (i) un conjugado de un sacárido capsular del serogrupo W135 de Neisseria meningi tidis; y/o (ii) un conjugado de un sacárido capsular del serogrupo Y de Neisseria meningi tidis; b) la composición puede comprender los sacáridos capsulares en forma no conjugada; c) el contenido de cualesquiera sacáridos capsulares no conjugados es determinado mediante el proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7; d) el contenido de los sacáridos capsulares conjugados es determinado mediante el proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7; y opcionalment , e) la proporción del sacárido conjugado :no conjugado en la composición es calculada para uno o más de los sacáridos capsulares .
12. 12. Un proceso para cuantificar los sacáridos de los serogrupos individuales dentro de una mezcla de sacáridos capsulares a partir de al menos dos serogrupos de meningococos diferentes, caracterizado porque: (a) los diferentes serogrupos comprenden el serogrupo C y uno o ambos de: (i) el serogrupo W135 y/o (ii) el serogrupo Y; (b) el proceso comprende un paso de despolimerizar los sacáridos capsulares dentro de la mezcla, para dar una mezcla despolimerizada; y (c) los diferentes serogrupos son cuantificados al comparar la composición del monosacárido de la mezcla despolimerizada.
13. 13. Un método para liberar una vacuna para el uso por los médicos, caracterizado porque comprende los pasos de: (a) fabricar una vacuna que contiene un conjugado de un sacárido capsular del serogrupo C de Neisseria meningitidis y uno o ambos de: (i) un conjugado de un sacárido capsular del serogrupo W135 de Neisseria meningi tidis; y/o (ii) un conjugado de un sacárido capsular del serogrupo Y de Neisseria meningi tidis; (b) analizar la cantidad del sacárido conjugado y/o no conjugado en la vacuna para cada uno de los sacáridos capsulares; y, si los resultados del paso (b) indican un contenido de sacárido aceptable para el uso clínico, (c) se libera la vacuna para el uso por médicos.
14. 14. Dos lotes de una vacuna, caracterizados porque: a) cada uno de los lotes de vacuna comprende: un conjugado de un sacárido capsular del serogrupo C de Neisseria meningi tidis y uno o ambos de: (i) un conjugado de un sacárido capsular del serogrupo W135 de Neisseria meningi tidis; y/o (ii) un conjugado de un sacárido capsular del serogrupo Y de Neisseria meningi tidis; b) la concentración del sacárido del conjugado del serogrupo C en el primer lote es Cu c) la concentración del sacárido del conjugado del serogrupo C en el segundo lote es C2; si es aplicable, (d) la concentración del sacárido del conjugado del serogrupo W135 en el primer lote es Wx ; si es aplicable, (e) la concentración del sacárido del conjugado del serogrupo W135 en el segundo lote es W2; si es aplicable, (f) la concentración del sacárido del conjugado del serogrupo Y en el primer lote es Y ; si es aplicable, (g) la concentración del sacárido del conjugado del serogrupo Y en el segundo lote es Y ; y en donde (h) las proporciones Cx/C2, W /W2 e Y /Y2 están cada una entre 0.90 y 1.10.
15. 15. Los lotes de conformidad con la reivindicación 14, caracterizados porque: (i) la concentración del sacárido no conjugado del serogrupo C en el primer lote es C3; (j) la concentración del sacárido no conjugado del serogrupo C en el segundo lote es C ; si es aplicable, (k) la concentración del sacárido no conjugado del serogrupo W135 en el primer lote es W3; si es aplicable, (1) la concentración del sacárido no conjugado del serogrupo W135 en el segundo lote es W4 ; si es aplicable, (m) la concentración del sacárido no conjugado del serogrupo Y en el primer lote es Y3; si es aplicable, (n) la concentración del sacárido no conjugado del serogrupo Y en el segundo lote es Y4; (o) las proporciones C3/C4, W /W4 y Y3/Y están cada una entre 0.90 y 1.10, y preferentemente están cada una entre 0.95 y 1.05.
16. 16. Los lotes de conformidad con la reivindicación 15, caracterizados porque (p) las proporciones C3/Cx, C4/C2, W3/W1 , W /W2, Y3/Y1 y Y4/Y son cada una menores de 0.20.
17. 17. Un aparato de computadora, caracterizado porque es adaptado para realizar el proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.
18. 18. Un programa de computadora para analizar el contenido de sacárido de una composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende un módulo de computadora para: (a) recibir los datos sobre el contenido de ácido siálico, y sobre el contenido de glucosa y/o galactosa de una muestra; y (b) calcular a partir de esos datos el contenido de sacárido capsular del serogrupo C y del serogrupo W135 y/o Y.