MXPA06010287A - Uso de antagonistas del receptor cb1 para la elaboracion de una composicion util en el tratamiento de enfermedades hepaticas. - Google Patents

Abstract

La invencion se refiere al uso de antagonistas para el receptor CB1 para la preparacion de una composicion para el tratamiento de enfermedades hepaticas y preferentemente al uso de N-piperidino-5- (4-clorofenil)-1-(2, 4-diclorofenil)-4 -metilpirazol-3 -carboxamida.

Description

USO DE ANTAGONISTAS DEL RECEPTOR CB1 PARA LA ELABORACIÓN DE UNA COMPOSICIÓN ÚTIL EN EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES HEPÁTICAS Campo de la Invención La invención se refiere a un nuevo uso de antagonistas para el receptor CB1 en la elaboración de una composición útil en el tratamiento de enfermedades hepáticas.

Antecedentes de la Invención La fibrosis de hígado es la respuesta común a daño crónico del hígado, que conduce finalmente a cirrosis y sus complicaciones, hipertensión portal, falla del hígado y carcinoma hepatocelular. El proceso fibrogénico es consecutivo a proliferación intensa y acumulación de miofibroblastos hepáticos que sintetizan los componentes de fibrosis e inhibidores de degradación de matriz (Friedman, S.L. , ;. Biol. Chem 275, 2247-50 (2000)) Cannabis Sativa contiene más de sesenta compuestos, el más activo de los cuales es (-) ?9-tetrahidrocannabinol (THC). Los cannabinoides naturales endógenos también se han caracterizado, anandamida y 2-araquidonil glicerol, los cuales son lípidos derivados de ácido araquidónico (Piomelli, D et al, Trends Pharmacol Sci 21 , 218-24 (2000)). Los cannabinoides se enlazan a dos receptores acoplados a proteína G, CB1 y CB2, que se enlazan igualmente a THC (Pertwee, R.G . , Curr Med Chem 6, 635-64 (19999)). CB1 es así uno de los dos receptores celulares conocidos que se expresan en el cerebro y los vasos sanguíneos (Pertwee, R.G. , Curr Med Chem 6, 635-64 (1999)) pero no en hepatocitos (Guzmán, M & Sánchez, C, Life Sel 65, 657-64 (1999)). CB1 media los efectos psicoactivos de cannabis. En contraste, los receptores CB2 se expresan principalmente en el sistema inmune y están exentos de efectos psicoactivos (Friedman, S. L. , J Biol. Chem 275, 2247-50 (2000)). Además de sus efectos psicotrópicos, los cannabinoides exhiben efectos centrales analgésicos, antieméticos y orexigénicos (Harrold, J.A. & Williams, G. Br J Nutr 90, 729-34 (2003)). Además, los cannabinoides también producen propiedades anti-inflamatorias y vasorelajantes (Kumar, R.N., Chambers, W.A. & Pertwee., Anaesthesia 56, 1059-68. (2001 )). Varios estudios también sugieren que los cannabinoides pueden ser agentes antitumorales potenciales, respecto a su habilidad para inducir la regresión de diversos tipos de tumores experimentales, incluyendo glioma o tumores de la piel. Estos efectos antitumorales se atribuyen principalmente a sus propiedades antiproliferativas y apoptóticas (Bifulco, M. ef al. , Faseb J 29, 29 (2001 ); Casanova, M.L. et al.., J. Clin Invest 1 1 1 , 43-50 (2003); Sánchez, C. et al. , Cáncer Res 61 , 5784-9 (2001 )). Existen solo unos cuantos datos respecto a la acción hepática de cannabinoides. Los receptores de CB1 y CB2 no se expresan en hepatocitos (Guzmán, M. & Sánchez, C. Life Sci 65, 657-64 (1999))-. Sin embargo, los receptores CB1 se presentan en células endoteliales aisladas de arterias hepáticas y su expresión se incrementa durante la cirrosis (Batkai, S. ef al. Nat. Med. 7, 827-32. (2001 )). Se han aislado dos isoformas del receptor CB1 : una isoforma larga (correspondiente a la SEQ ID NO: 1 ) y una más corta truncada en la parte terminal de NH2 correspondiente a una variante de división (correspondiente a la SEQ ID NO: 2), la cual difiere en su afinidad a sus ligandos (Shire ef al., J. Biol. Chem, (1995); Rinaldi- Carmona ef al. , J Pharmacol Exp Ther (1996)). También existen 5 polimorfismos nucleótidos individuales en la región codificadora del gen receptor CB1 . D estos, solo tres dan como resultado los cambios de amino ácido individuales para el receptor CB1 (siendo estos, en la SEQ ID NO: 1 , una sustitución de Fenilalanina por Leucina en la posición 200, una sustitución de Isoleucina por Valina en la posición 216 y una sustitución de Valina por Alanina en la posición 246 y las posiciones correspondientes en la SEQ ID NO: 2). Una secuencia de 7 dominios en consenso para el receptor CB1 existe, la cual se conserva fuertemente en vertebrados pero no aparece en otros receptores cannabinoides (Attwood, T.K. y Findlay, J.B.C. , Protein Eng 7(2) 195-203 (1994), Attwood, T.K. y Findlay, J.B.C., 7TM, Volume 2 Eds G. Vriend and B. Bywater, (1993), Birnbaumer, L. , Ann Rev Pharmacol Toxicol, 30, 675-705 (1990), Casey, P.J. y Gilman, A.G. , J. Biol. Chem. 263(6) 2577-2580 (1988), 5. Attwood, T.K. y Findlay, J.B.C., Protein Eng 6(2) 167-176 (1993), Watson, S. y Arkinsall, S, In The G Protein-Linked Receptor Factsbook, Academic press, 1994, PP 80-83). Esa secuencia amino acida de consenso comprende los 7 dominios de proteína de la SEQ I D NO: 3 a la SEQ I D NO: 9. Los antagonistas para el receptor CB1 , los cuales incluyen agonistas de reversa o inversa, se han descrito previamente. Estos incluyen las amidas sustituidas , descritas en la WO03/077847, las amidas de arilo sustituidas descritas en la WO03/087037, los imidazoles sustituidos descritos en la WO03/063781 , las amidas bicíclicas descritas en la WO03/086288, los derivados de terfenilo descritos en WO03/084943, la N-piperidono-3-pirazolcarboxamida y N-piperidino-5-(4-clorofenil)-1 -(2,4- iclorofenil)-4-metilpirazol-3-carboxamida descrita en WO03/084943 , el N-piperidono-3-pirazolcarboxamida y N-piperidino-5-(4-clorofenil)-1 -(2,4-diclorofenil)-4-metilpirazol-3-carboxamida descritas en la EP-B-656354 , los compuestos de aril-benzo[b]tiofeno y benzo[b]furano descritos respectivamente en la US55961 06 y la US 5747524, los derivados de azetidina descritos en FR2805817, una 3-amino-azetidina descrita en FR280581 0, o los derivados de 1 -(di-((hetero)aril)-metil)-azetidina descritos en FR280581 8. Estos documentos se incorporan en la presente para referencia. Otros antagonistas se encuentran comercialmente disponibles, tal como N~ (pipe ridin- 1 -il)- 1 -(2, 4-d iciorofen il)-5-(4-iodofe nil)-4-metil-1 H-pirazol-3-carboxamida, conocido comercialmente como AM251 y el compuesto conocido como LY-320135. Los usos de estos antagonistas receptores de CB 1 se conocen para el tratamiento de disfunción sexual (solicitud de patente WO 03/082256) o diarrea (solicitud de patente WO 01 /85092) o enfermedades neuro-inflamatorias o desórdenes por abuso de sustancias, obesidad, asma, constipación (solicitud de patente WO 03/077847). Los documentos de la EU 5,939,429, WO 03/077847, WO 03/084930, WO 03/084943, WO 03/063781 y WO 03/087037 exponen que los antagonistas CB1 pueden invertir las alteraciones hemodinámicas sistémicas en ratas con hipertensión portal cirrótica.

Breve Descripción de la Invención Sin embargo, los documentos arriba mencionados nunca exponen que los antagonistas CB1 puedan reducir la fibrogénesis en enfermedades hepáticas de cualquier etiología (alcohólica, viral, tóxica). Además, no existe involucramiento conocido de los receptores CB 1 o efectos de antagonistas CB1 en esteatohepatitis alcohólica y carcinogénesis de hígado. Los inventores demuestran ahora sorprendentemente que los antagonistas CB 1 tienen potentes propiedades anti-fibróticas en el hígado, las cuales pueden utilizarse para el tratamiento de enfermedades hepáticas y preferentemente enfermedades hepáticas que resultan en fibrosis hepática. De acuerdo con lo anterior, la presente invención, en base al hallazgo de que la inactivación de receptores CB1 puede reducir la fibrogénesis de hígado asociada con daño o enfermedad del hígado, se proporcionan una variedad de métodos y composiciones para el tratamiento de enfermedades hepáticas y preferentemente enfermedades hepáticas que resultan en fibrosis hepática. La invención se refiere así a: 1 . Uso de un antagonista del receptor CB1 en la elaboración de una composición para el tratamiento de enfermedades hepáticas. 2. Uso de acuerdo con el punto 1 , en donde el antagonista del receptor CB1 es un antagonista específico del receptor CB1. 3. Uso de acuerdo con los puntos 1 o 2, en donde la enfermedad hepática da como resultado fibrosis hepática. 4. Uso de acuerdo con los puntos 1 a 3, en donde la enfermedad hepática es cirrosis alcohólica. 5. Uso de acuerdo con los puntos 1 a 3, en donde la enfermedad hepática es hepatitis viral crónica. 6. Uso de acuerdo con los puntos 1 a 3, en donde la enfermedad hepática es esteatohepatitis no alcohólica. 7. Uso de acuerdo con los puntos 1 a 3, en donde la enfermedad hepática es cáncer primario de hígado. 8. Uso de acuerdo con los puntos 1 a 7, en donde el antagonista es un compuesto de la fórmula II o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, en el cual g2, g3, g4, gs y ge y w2) w3, w4, w5 y w6 son idénticos o diferentes y son independientemente hidrógeno, un átomo de cloro o bromo, un alquilo (C-?-C3), un alcoxi (C1-C3), un trifluorometilo o un grupo nitro y g4 es opcionalmente un grupo fenilo; R4 es hidrógeno o un alquilo (C1-C3); X es ya sea un enlace directo o un grupo -(CH2)X-N(R3)-, en el cual R3 es hidrógeno o un alquilo (C1-C3) y x es cero o uno; R es: un grupo -NRi R2 en el cual R T y R2 son independientemente un alquilo-íCi-Ce); un radical carbocíclico (C3-C15) no aromático el cual se sustituye opcionalmente, siendo dichos(s) sustituto(s) diferentes de un carbonilo sustituido; un grupo alquilo (C1-C ) amino en el cual el amino se di-sustituye opcionalmente por un alquilo (C1-C3); un cicloalquilo (d-C3) alquilo en el cual es cicloalquilo es C3-C 2; un fenilo que no se sustituye o se monosustituye o polisustituye por un halógeno, por un alquilo (d-Cs) o por un alcoxi (C1-C5); un fenil(C-?-C3) alquilo; un difenil(C-?-C3) alquilo; un naftilo; un antracenilo; un radical heterocíclico, integrado por 5 hasta 8 miembros, saturado, el cual no se sustituye o se sustituye por un alquilo (C1-C3), por un hidróxilo o por un benzilo; un 1 -adamantilmetilo; un heterociclo aromático que no se sustituye o se monosustituye o polisustituye por un halógeno, por un alquilo (d-Cs) o por un alcoxi (C,-C5); un alquilo (C-1-C3) que se sustituye por un heterociclo aromático que no se sustituye o se monosustituye o polisustituye por un halógeno, por un alquilo (C1-C5) o por un alcoxi (d-Cs); o de otro modo Ri es hidrógeno y R2 es según se define arriba; o de otro modo, R , y R2 forman un radical heterocíclico, integrado por 5 hasta 8 miembros, saturado, con el átomo de nitrógeno al cual se unen, siendo dicho radical heterocíclico diferente de morfolina cuando w2, w3, w4, w5, w6, g2. g3, g4, gs y ge son todos hidrógeno; un grupo R2 según se define arriba cuando X es -(CH2)XN(R3)-; un grupo R5 cuando X es un enlace directo, siendo R5 un alquilo (d-C3); un cicloalquilo (C3-C12) el cual no se sustituye o se sustituye por un alquilo (d-C5); un fenilo (d-C3) alquilo, el cual no se sustituye o se sustituye por un halógeno o por un alquilo (C1-C5); un cicloalquilo (d-C3) en el cual el cicloalquilo es C3-C 2 y no se sustituye o se sustituye por un alquilo (d-C5); o un 2-norbornilmetilo. 9. Uso de acuerdo con los puntos 1 a 7, en donde el antagonista es N-piperidono-3-pirazolcarboxamida o una de sus sales farmacéuticamente aceptables. 10. Uso de acuerdo con los puntos 1 a 7, en donde el antagonista es N-piperidino-5-(4~bromofenil)-1 -(2,4-diclorofenil)-4-etilpirazol-3-carboxamida o una de sus sales farmacéuticamente aceptable. 1 1. Uso de acuerdo con los puntos 1 a 7, en donde el antagonista es N-piperidino-5-(4-clorofenil)-1 -(2,4-diclorofenil)-4-metiIpirazol-3-carboxamida o una de sus sales farmacéuticamente aceptable. 12. Uso de acuerdo con cualquiera de los puntos precedentes, en donde el receptor CB1 se selecciona a partir del grupo que consiste en: a) una proteína que tiene una secuencia amino acida que comprende la SEQ I D NO : 1 o una porción de la SEQ I D NO : 1 , teniendo la función biológica de un receptor celular acoplado a proteína G , capaz de enlazar THC y transducir una señal celular; b) una proteína que tiene una secuencia amino acida que comprende la SEQ ID NO: 2 o una porción de la SEQ ID NO: 2, teniendo la función biológica de un receptor celular acoplado a proteína G , capaz de enlazar THC y transducir una señal celular; c) un alelo de la proteína que tiene la secuencia amino acida de la SEQ I D NO : 1 o la SEQ I D NO: 2, que tiene la función biológica de un receptor celular acoplado a proteína G , capaz de enlazar THC y transducir una señal de celular; d) una proteína que tiene la secuencia amino acida de la SEQ I D NO : 1 con una sustitución de Fenilalanina por Leucina en la posición 200; y/o una sustitución de Isoleucina por Valina en la posición 21 6; y/o una sustitución de Valina por Alanina en la posición 246; e) una proteína que tiene la secuencia amino acida de la SEQ I D NO : 2 con una sustitución de Fenilalanina por Leucina en la posición 1 39; y/o una sustitución de Isoleucina por Valina en la posición 1 55; y/o una sustitución de Valina por Alanina en la posición 185; y f) una proteína que comprende las secuencias amino acidas de la SEQ I DNO : 3; SEQ I D NO: 4, SEQ I D NO : 5, SEQ I D NO: 6, SEQ I D NO: 7, SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 9 o secuencias amino acidas 80% homologas a estas, teniendo dicha proteína la función biológica de un receptor celular acoplado a proteína G, capaz de enlazar THC y transducir una señal celular. 13. Uso de acuerdo con los pu ntos 1 a 1 1 , en donde el receptor CB1 es u na proteína que tiene una homología en el nivel amino ácido con la SEQ I D NO: 1 de por lo menos 45%, teniendo la función biológica de un receptor celular acoplado a proteína G, capaz de enlazar THC y transducir una señal celular. 14. Uso de acuerdo con el punto precedente, en donde la homolog ía es de por lo menos 60% , preferentemente 70% , más preferentemente 80% , incluso más preferentemente 90% y más preferentemente 95% . 1 5. Uso de acuerdo con cualquiera de los puntos precedentes, en donde la dosis diaria de antagonista receptor CB 1 es desde 0.01 mg hasta 500mg , preferentemente desde 1 mg hasta 100 mg . 16. Uso de una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína que comprende la SEQ I D NO : 1 o la SEQ I D NO: 2 o una porción de a SEQ I D NO: 1 o una porción de la SEQ I D NO: 2, para la preparación de una composición para el tratamiento de enfermedades hepáticas mediante la sub-regulación o supresión del receptor CB1 . 17. Un método para el tratamiento de enfermedades hepáticas en un mamífero, que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de por lo menos un antagonista de receptor CB1 a un mamífero que necesita el mismo. 18. Un método para el tratamiento de enfermedades hepáticas de acuerdo con el punto 17, en donde el antagonista receptor CB 1 es un compuesto de la fórmula I I o una de sus sales farmacéuticamente aceptable, en el cual g2, g3, g4, gs y ge y 2, w3, w4, w5 y w6 son idénticos o diferentes y son independientemente hidrógeno, un átomo de cloro o bromo, un alquilo (d-C3), un alcoxi (C-1-C3), un trifluorometilo o un grupo nitro y g4 es opcionalmente un grupo fenilo; R4 es hidrógeno o un alquilo (d,-C3); X es ya sea un enlace directo o un grupo -(CH2)?-N(R3)-, en el cual R3 es hidrógeno o un alquilo (d-C3) y x es cero o uno; R es: un grupo -NRi R2 en el cual Rm, y R2 son independientemente un alquilo-(d-C6); un radical carbocíclico (C3-C15) no aromático el cual se sustituye opcionalmente, siendo dichos(s) sustituto(s) diferentes de un carbonilo sustituido; un grupo alquilo (C1-C4) amino en el cual el amino se di-sustituye opcionalmente por un alquilo (d-C3); un cicloalquilo (C-1-C3) alquilo en el cual es cicloalquilo es C3-d2; un fenilo que no se sustituye o se monosustituye o polisustituye por un halógeno, por un alquilo (d-C5) o por un alcoxi (C?-C5); un fenil(d-C3) alquilo.; un difenil(d-C3) alquilo; un naftilo; un antracenilo; un radical heterocíclico, integrado por 5 hasta 8 miembros, saturado, el cual no se sustituye o se sustituye por un alquilo (d-C3), por un hidróxilo o por un benzilo; un 1 -adamantilmetilo; un heterociclo aromático que no se sustituye o se monosustituye o polisustituye por un halógeno, por un alquilo (d-C5) o por un alcoxi (d-C5); un alquilo (d-C3) que se sustituye por un heterociclo aromático que no se sustituye o se monosustituye o polisustituye por un halógeno, por un alquilo (d-C5) o por un alcoxi (C1-C5); o de otro modo Ri es hidrógeno y R2 es según se define arriba; o de otro modo, R^ y R2 forman un radical heterocíclico, integrado por 5 hasta 8 miembros, saturado, con el átomo de nitrógeno al cual se unen, siendo dicho radical heterocíclico diferente de morfolina cuando w2, w3, w , w5, w6, g2, g3, g4, g5 y g6 son todos hidrógeno; un grupo R2 según se define arriba cuando X es -(CH2)XN(R3)-; un grupo R5 cuando X es un enlace directo, siendo R5 un alquilo (d-C3); un cicloalquilo (C3-C12) el cual no se sustituye o se sustituye por un alquilo (d-C5); un fenilo (C-1-C3) alquilo, el cual no se sustituye o se sustituye por un halógeno o por un alquilo (d-C5); un cicloalquilo (d-C3) en el cual el cicloalquilo es C3-C12 y no se sustituye o se sustituye por un alquilo (C1-C5); o un 2-norbornilmetilo. 19. Un método de tratamiento de enfermedades hepáticas de acuerdo con el punto 17, en donde el antagonista receptor CB 1 es N- piperidono-3-pirazolcarboxamida o una de sus sales farmacéuticamente aceptables. 20. Un método de tratamiento de enfermedades hepáticas de acuerdo con el punto 1 7, en donde el antagonista receptor CB1 es N- pipe ridin o-5- (4-b romofe nil)- 1 -(2, 4-d iciorofen i l)-4-eti I pirazol-3- carboxamida o una de sus sales farmacéuticamente aceptable. 21 . Un método de tratamiento de enfermedades hepáticas de acuerdo con el punto 1 7, en donde el antagonista receptor CB1 es N- p ipe ridin o-5-(4-clorofenil)-1 -(2, 4-d iciorofen i l)-4-metilpi razol-3- carboxamida o una de sus sales farmacéuticamente aceptable. 22. Un método de tratamiento de enfermedades hepáticas de acuerdo con los puntos 1 7 a 21 , en donde la enfermedad hepática es f?brosis de h ígado. 23. Un método de tratamiento de enfermedades hepáticas de acuerdo con los puntos 1 7 a 21 , en donde la enfermedad hepática es cirrosis alcohólica de hígado. 24. Un método de tratamiento de enfermedades hepáticas de acuerdo con los puntos 1 7 a 21 , en donde la enfermedad hepática es hepatitis viral crónica. 25. Un método de tratamiento de enfermedades hepáticas de acuerdo con los puntos 1 7 a 21 , en donde la enfermedad hepática es esteatohepatitis no alcohólica. 26. Un método de tratamiento de enfermedades hepáticas de acuerdo con los puntos 1 7 a 21 , en donde la enfermedad hepática es cáncer primario de hígado. 27. Un método de tratamiento de enfermedades hepáticas de acuerdo con los puntos 17 a 26, en donde la dosis diaria de antagonista receptor CB1 es desde 0.01 mg hasta 500mg, preferentemente desde 1 mg hasta 100 mg.

Breve Descripción de las Figuras Figura 1 : Histograma que muestra el contenido de TGFß-1 en pg por mg de proteína soluble (panel A) y que muestra expresión de alfa actina como un porcentaje de teñido de área superficial de sección total (panel B), ambos en ratones de tipo silvestre (mostrado como WT) y ratones deficientes en CB1 (mostrados como CB1 -/-). OO se refiere al grupo de ratones que reciben solo aceite de oliva, mientras que CC14 muestra los resultados para ratones intoxicados con CC14. La producción de TGFß-1 hepático se midió (la importancia estadística es p<0.05). Para la determinación de alfa actina de músculo suave, el teñido se cuantificó en 4-5 secciones de tejido de hígado por animal (importancia estadística es p<0.05). Figura 2: Histogramas que muestran, respectivamente, la viabilidad de miofibroblasto hepático (panel A) y la actividad similar a la Caspasa-3 (panel B) inicialmente y después de 48 horas siguientes a la privación de suero tanto en ratones de tipo silvestre (mostrados como WT) como también ratones deficientes en CB1 (mostrados como CB 1 KO). La apoptosis se indujo por privación de suero durante 48 horas. Los resultados de la viabilidad de miofibroblastos hepáticos se expresa como porcentaje medio de células que sobreviven +. SEM, a partir de 6 - 9 experimentos obtenidos de células aisladas de hígados de 3 ratones WT y 2 CB1 - /- (la importancia estadística p es inferior a 0.05 para CB1 -/-). Los resultados para la actividad similar a Caspasa-3 se expresan como doblez sobre actividad medida el día 0 (la media +_ SEM se obtuvo a partir de 6 - 9 experimentos obtenidos de células aisladas de hígados de 3 ratones WT y 3 CB1 -/-). Estadísticamente p es inferior a 0.05. Figura 3: Gráficas que muestran el efecto de incrementar cantidades de antagonista CB1 SR141716 en síntesis de ADN en miofibroblastos hepático humano (panel A) y en ratones de tipo silvestre (mostrados como WT) y ratones deficientes en CB 1 (mostrados como CB1 KO) (panel B). La síntesis de ADN se expresa como un porcentaje de la síntesis de ADN en células tratadas con el vehículo de SR 141716 y graficado contra concentraciones crecientes de SR 141716 en nM. Las células de miofibroblasto hepático humano se estimularon durante 30 h con concentraciones variantes del antagonista receptor de CB1 SR 141716, en presencia de 20 ng/ml de PDGF-BB. [3H] Incorporación de Timidina en ADN se midió como media +SEM, desde 3 - 6 experimentos y se expresa como por ciento de control (p es inferior a 0.05). Las barras de error se muestran en la gráfica. El miofibroblasto hepático de ratón (proveniente de ratones tipo silvestre mostrados en la gráfica como círculos y ratones deficientes en CB1 mostrados como diamantes) se estimuló durante 30 h con concentraciones variantes del antagoista receptor de CB1 SR 141716, en presencia de 20 ng/ml de PDGF-BB. [3H] incorporación de Timidina en ADN se midió como +SEM , a partir de 3 - 6 experimentos obtenidos de células aisladas de hígados de 3 ratones WT y 3 CB 1 -/- y se expresa como por ciento de control, (p es inferior a 0.05). Las barras de error se muestran en la gráfica. Figura 4: Gráfica que muestra el efecto de SE141716 o su vehículo en la mortandad inducida por tetracloruro de carbono en ratones. La tasa de supervivencia de ratones tratados con CCI4 ya sea con SR141716 (líneas punteadas) o sin tratamiento (líneas sólidas que muestran la administración de vehículo solo, sin antagonista CB1 ) se muestra contra tiempo en días. El tiempo de administración de CC14 se muestra por la flecha.

Descripción Detallada de las Modalidades de la Invención La presente invención proporciona métodos y composiciones (tales como composiciones farmacéuticas) para el tratamiento de enfermedades hepáticas que incluyen fibrosis de hígado. Las enfermedades hepáticas también incluyen, pero sin limitarse, cirrosis alcohólica de hígado, hepatitis viral crónica, esteatohepatitis no alcohólica y cáncer de hígado primario. El solicitante ha demostrado que la sub-regulación de receptores CB1 y el uso de antagonista o agonista inverso para el receptor CB1 constituye un tratamiento para diversos tipos de fibrosis de hígado. Esto se muestra por varios experimentos.

En primer lugar, la función de los receptores CB 1 en el progreso de fibrosis de hígado se estudió en ratones noqueados por receptor CB1 , diseñados para carecer de expresión de receptores CB1 (CB1 KO, n = 15) y su contraparte de tipo silvestre (WT, n=12) en un modelo de intoxicación crónica por tetracloruro de carbono que induce fibrosis. La fibrosis y necroinflamación se determinaron por una puntuación derivada de METAVIR. Los ratones CB1 KO mostraron fibrosis reducida en comparación con animales WT (puntuación de fibrosis: 2.59+0.13 contra 3.33+0.13, p<0.05). De acuerdo con lo anterior, el colágeno hepático, determinado mediante determinación de hidroxiprolina se disminuyó en 40% en ratones CB1 KO, en comparación con animales WT (0.46+_0.06 contra 0.73+0.1 1 mg/mg tejido, p<0.05). La puntuación necroinflamatoria fue similar en ambos grupos. Tal inactivación de receptor CB1 es fenotípicamente equivalente a un bloque antagonístico perfecto del receptor CB1 por medios farmacéuticos. La fibrosis de hígado se reduce fuertemente en ratones noqueados con CB 1 en comparación con ratones de control, en base a ambos análisis histológico de los hígados y medición del contenido de hidroxiprolina, un marcador bioquímico específico de deposición de colágeno. Además, se mostró que la expresión de TGF-ß1 y a actina de músculo suave se redujo en ratones deficientes de CB1 en comparación con ratones de tipo silvestre cuando se tratan con CC14. Finalmente, se demostró que la inactivación de CB1 incrementa la apoptosis en miofibroblastos hepáticos murinos. Por consiguiente, la inactivación del receptor CB1 reduce la fibrosis hepática. En segundo lugar, el etiquetado inmunohistoquímico se llevó a cabo con hígado cirrótico, normal, humano, y miofibroblastos hepáticos, cultivados. La inmunoquímica mostró una expresión débil de receptores CB1 en hígado normal (n = 3), contrastando con una sobre-regulación marcada en muestras cirróticas de diversas etiologías (n = 13), predominando en células no parénquimas dentro y en el borde de septos fibrosos. Los miofibroblastos identificados por inmunohistoquímica doble como una fuente principal de receptores CB1 y, de acuerdo con lo anterior, los receptores CB1 también se expresaron en miofibroblastos hepáticos humanos, cultivados. Los receptores CB1 se expresan débilmente por células intrasinusoidales en el hígado normal y se sobre-regulan notablemente durante enfermedades crónicas del hígado. La inmunohistoquímica doble reveló miofibroblastos hepáticos como un tipo de célula prominente que expresa receptores CB1 en el hígado cirrótico. Por consiguiente, la expresión de receptor CB1 y la actividad se correlacionan con fibrosis hepática. En tercer lugar, los estudios epidemiológicos se llevaron a cabo en un conjunto de pacientes con hepatitis crónica C y demostraron que el fumar diariamente cannabis es un factor de riesgo para el progreso de fibrosis en hepatitis crónica C ya que la velocidad de la fibrosis es mayor en estos pacientes en comparación con no fumadores de cannabis. Esto demuestra una participación de transducción de señal cannabinoide en la fibrosis del hígado. Por consiguiente, la trayectoria de señalización cannabinoide se involucra en fibrosis hepática. En cuarto lugar, los estudios in vitro de los efectos del antagonista receptor CB1 N-piperidino-5-(4-clorofenil)-1 -(2,4- diclorofeni!)-4-metilpirazol-3-carboxamida, conocido comercialmente como SR141716 (o SR141716A) o rimonabant, se llevaron a cabo en cultivos de miofibroblasto hepático provenientes de humanos y ratones que demuestran que un antagonista CB1 puede inhibir el desarrollo de miofibroblasto hepático. Este compuesto y su preparación se describen en la solicitud de patente Europea EP656354 y se representa por la fórmula I: Tal antagonista de CB1 y las sales farmacéuticamente aceptables del mismo pueden prepararse de acuerdo con la solicitud de patente Europea EP656354 y, de manera similar, las composiciones farmacéuticas pueden prepararse de acuerdo con la descripción de esa misma patente. En quinto lugar, los estudios in vivo en ratones demostraron que el antagonista CB1 SR141716 podría reducir la letalidad inducida por el tetracloruro de carbono, lo cual es un modelo de fibrosis de hígado inducida. Los antagonistas para el receptor CB1 se definen en la presente como compuestos capaces de inhibir la activación o la expresión del receptor CB1 . Los compuestos capaces de inhibir la activación de receptor CB1 incluyen, en particular, aquellos capaces de interactuar con agonistas de receptores CB1 , a fin de inhibir el enlace de dichos agonistas o para inhibir la activación de receptor CB1 que resulta de dicho enlace. En particular, los antagonistas adecuados para el receptor CB1 pueden ser específicos para CB 1 o no e incluyen agonistas inversos. Estos antagonistas también incluyen las amidas sustituidas, descritas en la WO 03/077847, las amidas de arilo sustituidas, descritas en WO 03/087037, los imidazoles descritos en WO 03/063781 , amidas cíclicas descritas en WO 03/086288, los derivados de terfenilo descritos en WO 03/084943, la N-piperidono-3-pirazolcarboxamida y N — piperidino-5-(4-clorofenil)-1 -(2,4-diclorofenil)-4-metilpirazol-3-carboxamida descritas en EP-B-656354, los compuestos de aril-benzo[b]tiofeno y benzo[b]furano, respectivamente descritos en US5596106 y US5747524, los derivados de azetidina descritos en FR2805817, 3-amino-azetidina descrita en FR2805810, o los derivados de 1 -(di-((hetero)aril)-metil)-azetidina 3-sustituidos o 3,3-sustituidos descritos en FR2805818, N-(piperidin-1 -il)-1 -(2,4-diclorofenil)-5-(4-yodofenil)-4-metil-1 -/-pirazol- 3-carboxamida (conocida como AM251 ) y el compuesto comercialmente conocido como LY-320135. Los antagonistas CB1 adecuados también incluyen N-piperidino-5-(4-bromofenil)-1 -(2,4- diclorofenil)-4-etilpirazol-3-carboxamida descrita en la patente EP1150961. Otros antagonistas CB1 adecuados se describen en la patente EP576357 e incluyen un compuesto de la fórmula II en la cual g2, g3, 94. 95 y Qß y w2, w3, w4, w5 y w6 son idénticos o diferentes y son independientemente hidrógeno, un átomo de cloro o bromo, un alquilo (d-C3), un alcoxi (d-C3), un trifluorometilo o un grupo nitro y g es opcionalmente un grupo fenilo; R4 es hidrógeno o un alquilo (d-C3); X es ya sea un enlace directo o un grupp -(CH2)X-N(R3)-, en el cual R3 es hidrógeno o un alquilo (d-C3) y x es cero o uno; R es: un grupo -NR-¡ R2 en el cual Ri y R2 son independientemente un alquilo-(d-C6); un radical carbocíclico (C3-C15) no aromático el cual se sustituye opcionalmente, siendo dichos(s) sustituto(s) diferentes de un carbonilo sustituido; un grupo alquilo (C?-C4) amino en el cual el amino se di-sustituye opcionalmente por un alquilo (d-C3); un cicloalquilo (d-C3) alquilo en el cual es cicloalquilo es C3-C 2; un fenilo que no se sustituye o se monosustituye o polisustituye por un halógeno, por un alquilo (CrC5) o por un alcoxi (d-C5); un fenil(d-C3) alquilo; un difenil(d-C3) alquilo; un naftilo; un antracenilo; un radical heterocíclico, integrado por 5 hasta 8 miembros, saturado, el cual no se sustituye o se sustituye por un alquilo (d-C3), por un hidróxilo o por un benzilo; un 1 -adamantilmetilo; un heterociclo aromático que no se sustituye o se monosustituye o polisustituye por un halógeno, por un alquilo (d-C5) o por un alcoxi (d-C5); un alquilo (d-C3) que se sustituye por un heterociclo aromático que no se sustituye o se monosustituye o polisustituye por un halógeno, por un alquilo (C?-C5) o por un alcoxi (d-C5); o de otro modo R-¡ es hidrógeno y R2 es según se define arriba; o de otro modo, R1 y R2 forman un radical heterocíclico, integrado por 5 hasta 8 miembros, saturado, con el átomo de nitrógeno al cual se unen, siendo dicho radical heterocíclíco diferente de morfolina cuando w2, w3, w4, w5, w6, g2, g3, g4, gs y 9e son todos hidrógeno; un grupo R2 según se define arriba cuando X es -(CH2)XN(R3)-; un grupo R5 cuando X es un enlace directo, siendo R5 un alquilo (d-C3); un cicloalquilo (C3-C12) el cual no se sustituye o se sustituye por un alquilo (d-C5); un fenilo (d-C3) alquilo, el cual no se sustituye o se sustituye por un halógeno o por un alquilo (d-C5); un cicloalquilo (d-C3) en el cual el cicloalquilo es C3-C 2 y no se sustituye o se sustituye por un alquilo (d-C5); o un 2-norbornilmetilo.

Estos resultados ni se confinan a humanos y pueden aplicarse a mamíferos en general. Las composiciones que contienen el(los) antagonista(s) pueden administrarse para tratamientos profilácticos y/o terapéuticos. El ingrediente activo (por ejemplo, antagonista(s) receptor(es) CB1 ) en la composición farmacéutica se presenta en una "cantidad eficaz". Por una "cantidad eficaz" de una composición farmacéutica se entiende una cantidad suficiente, pero no tóxica, del agente para proporcionar el efecto deseado. El término se refiere a una cantidad suficiente para tratar un sujeto (por ejemplo, un mamífero, particularmente un humano). De este modo, el término "cantidad terapéutica" se refiere a una cantidad suficiente para remediar un estado o síntomas de enfermedad, al prevenir, obstaculizar, retardar , o revertir el progreso de la enfermedad o cualquier otro síntoma indeseable cualquiera que sea. El término cantidad "profilácticamente eficaz" se refiere a una cantidad dada a un sujeto que aún no tiene la enfermedad y, de este modo, es una cantidad eficaz para prevenir, obstaculizar o retrasar el inicio de una enfermedad. En aplicaciones terapéuticas, las composiciones se administran a un paciente que ya sufre de una enfermedad, como se describe, en una cantidad suficiente para curar o al menos detener parcialmente los síntomas de la enfermedad y sus complicaciones. Una dosis adecuada de la composición farmacéutica ya se determina de acuerdo con cualquiera de varios protocolos bien establecidos. Por ejemplo, los estudios animales (por ejemplo, en ratones o ratas) se utilizan comúnmente para determinar la máxima dosis tolerable del agente bioactivo por kilogramo en peso. En general, al menos una de las especies animales examinada es un mamífero. Los resultados de los estudios animales pueden extrapolarse para determinar las dosis a utilizarse en otras especies, tal como humanos, por ejemplo. Lo que constituye una dosis eficaz también depende de la naturaleza y severidad de la enfermedad o condición, y en el estado general de salud del paciente. En aplicaciones profilácticas, las composiciones que contienen, por ejemplo, antagonistas de receptor CB 1 , se administran a un paciente susceptible a o de otro modo en riesgo de una enfermedad hepática. Tal cantidad se define como una cantidad o dosis "profilácticamente eficaz". En este uso, la cantidad precisa depende del estado de salud y el peso del paciente. En ambos tratamientos, terapéutico y profiláctico, el antagonista contenido en la composición farmacéutica puede administrarse en varias dosis como una sola unidad de dosis hasta que se ha logrado una respuesta deseada. El tratamiento se monitorea típicamente y pueden administrarse dosis repetidas, según sea necesario. Los compuestos de la invención pueden administrarse de acuerdo con regímenes de dosis establecidos siempre y cuando se requiera la inactivación de receptores CB1 . La dosis diaria de los productos puede variarse sobre un amplio rango desde 0.01 hasta 1 ,000 mg por adulto por día. Preferentemente, las composiciones contienen 0.01 , 0.05, 0.1 , 0.5, 1.0, 2.5, 5.0, 10.0, 15.0, 25.0, 50.0, 100, 250 y 500 mg del ingrediente activo para el ajuste sintomático de la dosis al paciente por tratarse. Un medicamento típicamente contiene desde aproximadamente 0.01 mg hasta aproximadamente 500 mg del ingrediente activo, preferentemente desde 1 mg hasta aproximadamente 100 mg del ingrediente activo. Una cantidad eficaz de fármaco se suministra ordinariamente a un nivel de dosis desde 0.0002 mg/kg hasta aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal por día, especialmente desde aproximadamente 0.001 mg/kg hasta 10 mg/kg de peso corporal por día. Sin embargo, se entenderá que el nivel de dosis específico y la frecuencia de la dosis para cualquier paciente en particular puede variar y dependerá de una variedad de factores, incluyendo la actividad del compuesto específico empleado, la estabilidad metabólica, y la longitud de acción de ese compuesto, la edad, el peso corporal, la salud en general, sexo, dieta, modo y tiempo de administración, velocidad de excreción, combinación de fármacos, la severidad de la condición en particular, y la terapia que experimenta el huésped. En las composiciones farmacéuticas de la presente invención para administración oral, sublingual, subcutánea, intramuscular, intravenosa, transdérmica, local o rectal, el principio activo, solo o en combinación con otro principio activo, puede administrarse en una forma de administración de unidad, como una mezcla con soportes farmacéuticos convencionales, a seres humanos y animales. Las formas de administración de unidad adecuadas comprenden formas de ruta oral, tales como tabletas, cápsulas de gel, polvos, granulos y suspensiones o soluciones orales, formas de administración sublingual y bucal, aerosoles, implantes, formas de administración subcutánea, transdérmica, tópica, intraperitoneal, intramuscular, intravenosa, subdérmica, transdérmica, intratecal e intranasal y formas de administración rectal. Las formas de administración de unidad adecuadas incluyen formas para administración oral, tales como tabletas, cápsulas de gelatina, polvos, granulos y soluciones o suspensiones para tomarse de manera oral, formas para administración sublingual y bucal, aerosoles, implantes, formas para administración subcutánea, intramuscular, intravenosa, intranasal o intraocular y formas para administración rectal. En las composiciones farmacéuticas de la presente invención, el principio activo se formula generalmente como unidades de dosis que contienen desde 0.5 hasta 1000 mg, preferentemente desde 1 hasta 500 mg, más preferentemente desde 2 hasta 200 mg de dicho principio activo por unidad de dosis para administraciones diarias. Cuando se prepara una composición sólida en la forma de tabletas, un agente humectante, tal como lauriisulfato de sodio, puede agregarse al principio activo opcionalmente micronizado, el cual después se mezcla con un vehículo farmacéutico tal como sílice, gelatina, almidón, lactosa, estearato de magnesio, talco, goma arábiga o lo similar. Las tabletas pueden cubrirse con sucrosa, con diversos polímeros u otras substancias adecuadas o de otro modo pueden tratarse a fin de tener una actividad prolongada o retrasada y a fin de liberar una cantidad predeterminada de principio activo de manera continua. Se obtiene una preparación en la forma de cápsulas de gelatina mediante mezcla del principio activo con un diluyente tal como un glicol o un éster de glicerol y vaciado de la mezcla obtenido en cápsulas de gelatina, suaves o duras. Una preparación en la forma de u n jarabe o elíxir puede contener el principio activo junto con u n endulzante, el cual es preferentemente metil-parabeno y propilparabeno, libre de calorías, como un antiséptico, un saborizante y un color adecuado. Los polvos o granulos dispersables en agua pueden contener el principio activo mezclado con dispersantes o agentes humectantes, o agentes de suspensión tales como polivinilpirrolidona, y también con endulzantes o correctores de sabor. La administración rectal se efectúa mediante el uso de supositorios preparados con aglomerantes que se fusionan a la temperatura rectal, por ejemplo, manteca de cacao o glicoles de polietileno. La administración parenteral , intranasal, o intraocular se efectúa mediante el uso de suspensiones acuosas, soluciones salinas isotónicas o soluciones estériles é inyectables que contienen dispersantes farmacológicamente compatibles y/o agentes humectantes, por ejemplo, glicol de propileno, glicol de butileno o glicol de polietileno.

De este modo, un cosolvente, por ejemplo, un alcohol tal como etanol o un glicol tal como polietilenglicol o propilenglicol, y un surfactante hidrofílico, tal como Tween, RTM 80, puede utilizarse para preparar una solución acuosa inyectable mediante ruta intravenosa. El principio activo puede solubilizarse por un triglicérico o un éster de glicerol a fin de preparar una solución aceitosa inyectable mediante ruta intramuscular. La administración transdérmica se efectúa mediante el uso de parches multilaminados o depósitos en los cuales se encuentra el principio activo en la forma de una solución alcohólica. La administración mediante inhalación se efectúa mediante el uso de un aerosol que contiene, por ejemplo, trioleato de sorbitan o ácido oleico junto con triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano o cualquier otro gas propulsor, biológicamente compatibles. El principio activo también puede formularse como microcápsulas o microesferas, opcionalmente con uno o más vehículos o aditivos. Entre las formas de liberación prolongada que son útiles en el caso de tratamientos crónicos, pueden utilizarse implantes. Estos pueden prepararse en la forma de una suspensión aceitosa o en la forma de una suspensión de microesferas en un medio isotónico. El principio activo también puede presentarse en la forma de un complejo con una ciclodextrina, por ejemplo, .alfa.-, .beta.-, o .gamma. -ciclodextrina, 2-hidroxipropil-. beta. -ciclodextrina o metil-.beta. -ciclodextrina.

Otro antagonista adecuado de receptor CB1 puede consistir en un anticuerpo dirigido a receptor CB1 que impide el enlace de los agonistas al receptor CB1 . Existen diversas formas de los receptores CB1 y otras variantes. De acuerdo con lo anterior, el uso de antagonistas para cualquiera de estos receptores CB 1 variantes no lo sacaría a uno del campo de la invención. En general y además de la identidad u homología de secuencia de proteína, la función biológica de un receptor CB1 puede definirse por ser un recetor celular acoplado a proteína G, capaz de enlazar THC y transducir una señal de celular.

El trabajador experto sería capaz de examinar la función del receptor CB1 mediante procedimientos estándares conocidos. Esto podría incluir la expresión de cADN de CB1 putativo en células de CHO, utilizando la examinación posterior ligandos CB1 y la medición de la actividad de señalización celular del receptor CB1 putativo activado, por ejemplo, mediante medición de la producción cíclica de AMP. Una alternativa a la reducción de transducción de señal de los cannabinoides a través del receptor CB1 mediante medios farmacológicos, involucra la sub-regulación o supresión de ese receptor. Existen diversas técnicas para la sub-regulación o supresión de la expresión de genes, que los trabajadores expertos serán capaces de utilizar. Una lista no exhaustiva involucra la inactivación mediante recombinación homologa (Gossen, J, Trends Genet. 9: 27-31 , 1993), interferencia de ARN (Elbashir S.M. , Nature. 2001 Mayo 24; 41 1 (6836):428-9) , la expresión de receptores negativos (Dosil, M . ef al. , Mol Cell Biol .. 1998 Octubre 18 (10):5981 - 91 ) y la expresión transgénica de supresión de factores de transcripción. También es posible seleccionar antagonistas CB 1 con propiedades anti-fibróticas selectivas mediante el uso de cultivos de miofibroblasto obtenidos mediante desarrollo de explantes preparados a partir de especímenes quirúrgicos de hígado humano normal , como se describió previamente (Li, L. Et al. , Gastroenterology 1 25, 460-9 (2003), Davaille J et al. , J Biol. Chem (2002)) . En particular, un método para la selección de antagonistas CB 1 con propiedades anti-fibróticas selectivas involucra las etapas de: a) preparar múltiples cultivos celulares de miofibroblastos, b) exponer cada uno de los cultivos celulares a uno de los compuestos por examinarse c) determinar los efectos de los compuestos sobre las propiedades fibrogénicas de los miofibroblastos, al evaluar sus efectos en la supervivencia y crecimiento de estas células, d) seleccionar uno de los compuestos examinados. Un método alternativo sería como arriba, en donde la etapa c) involucra la determinación de los efectos de los compuestos sobre las propiedades fibrogénicas de los miofibroblastos, al evaluar sus efectos sobre su capacidad para sintetizar la matriz extracelular y los componentes que inhiben su degradación . Un método alternativo sería como arriba en donde la etapa c) involucra la determinación de los efectos de los compuestos sobre las propiedades fibrogénicas de los miofibroblastos, al evaluar la producción y migración de citosina. El trabajador experto sería capaz de llevar a cabo estas etapas individuales mediante el uso de procedimientos bien conocidos, tal como se describe en Li, L. et al., Gastroenterology 125, 460-9 (2003), Davaille J ef ai , J Biol. Chem (2002), Li L ef al. , J Biol Chem 2001 et Davaille, J et al., J Biol Chem 275, 34628-33 (2000). Los compuestos aislados mediante tales medios pueden utilizarse entonces para la elaboración de una composición para el tratamiento de enfermedades hepáticas. EJEMPLOS Ejemplo 1 : Sobre-regulación de receptores CB1 en hígado cirrótico humano Materiales El medio de cultivo y reactivos fueron de Gibco (Invitrogen, Francia). El suero bovino fetal fue de Jbio Laboratories (Francia).

El suero positivo AB humano depositado se suministró por el Centro Nacional de Transfusiones. El antisuero receptor anti-CB 1 de conejo (elevado contra residuos 1 -14 del receptor CB1 humano) y el péptido de bloqueo CB1 (residuos 1 -14 del receptor CB 1 humano) fueron de Cayman (Spibio, Francia). Preparación de ARN y RT-PCR El ARN total se extrajo de células quiescentes confluentes en discos de 100 mm, mediante el uso de equipo Rneasy (Qiagen, Francia). El cADN se sintetizó a partir de 2 µg de ARN total mediante transcripción inversa durante 1 h a 37°C, utilizando 200 unidades de transcriptasa inversa M-MLV (Invitrogen, Francia), en una mezcla de reacción de 20 µl que contiene 0.05 µg/µl de cargas de inicio oligo (dT)12.18 (invitrogen, Francia), 0.5 mM dNTPs (Promega, Francia) y 10 mM ditiotreitol en regulador de primer filamento (Invitrogen, Francia). Para verificar la contaminación de ADN genómico, eventual, se llevaron a cabo controles en las mismas condiciones sin transcriptasa inversa. PCRs se llevaron a cabo con 2 µl de la reacción de transcripción inversa, utilizando 1 .25 unidades de polimerasa de ADN AmpliTaq Gold (Applied Biosystems, Francia) y el regulador correspondiente, complementado con 2 mM MgCI2,0.2 mM dNTPs y 25 pmol de cada carga de inicio en un volumen total de 50 µl. 40 ciclos de PCR se llevaron a cabo en un ciclador térmico GeneAmp 2700 (Applied Biosystems, Francia), consistiendo cada ciclo en desnaturalización a 95°C durante 45 s, templado a 58°C durante 45 s, y extensión a 72°C durante 30 s, conteniendo el primer ciclo un periodo de desnaturalización prolongado (10 min) para la activación de la polimerasa y conteniendo el último ciclo un periodo de alargamiento prolongado (10 min). Las cargas de inicio oligonucleótidas (MWG Biotech, Francia) para CB1 fueron como sigue: carga de inicio de detección de CB1 5'-TTTGGCTACACAATTGGAAGTCTAAGAACCC-3' y carga de inicio de anti-detección de CB1 , 5'-GCACACATTGACACGTATCCACTGCTTG-3' con un producto de PCR predicho de 287 bp. Los productos amplificados por PCR se analizaron en un gel de agarosa al 1 .5% y se mancharon en membrana Hybond-N+ (Amersham Pharmacia Biotech , Francia) . Después de una pre-hibridización en un regulador que contiene 6XSSC, 5 mM EDTA pH 8, 5X denhardt, 0.1 % SDS y 0.1 mg/ml ssADN , durante2 h a 42°C, la membrana se hibridizó durante la noche a 42°C en el mismo regulador que contiene 50 ng de la sonda oligonucleótida CB1 5'- CCTGTGAGATGTGTATCAGTGTTTATGTGC-3', etiquetado con [?-32P] trifosfato de adenosina, mediante el uso de quinasa T4 (Invitrogen, Francia). Después de la hibridización, el manchado se enjuagó dos veces en SDS al 0.1 % , 1 XSSC durante 30 min a temperatura ambiente y analizó por fosfo-formador de imágenes (Molecular Dynamics, Francia) . Espécimen de hígado humano Cortes quirúrgicos de hígado congelados al instante provenientes de 1 3 pacientes (8 hombres, 5 mujeres, edad promedio 55 años, rango de edad 39 - 72 años) se estudiaron de manera retrospectiva. Las muestras de hígado normales se recolectaron a partir de 3 mujeres que experimentaron resección hepática para metástasis colorectal (n=3). Las muestras cirróticas se obtuvieron de 8 hígados de pacientes que experimentan transplante de hígado y de 2 pacientes que experimentan resección hepática para carcinoma hepatocelular. La cirrosis fue consecutiva a HCV crónica (n = 1 ) o infecciones por H BV (n=2) , cirrosis biliar primaria (n = 1 ) , enfermedad alcohólica del h ígado (n=4), o enfermedad de Wilson (n= 1 ) y criptogénico remanente en 1 caso. Detección inmunohistoquímica de receptores CB1 en hígados normales y cirróticos Las secciones congeladas (5 - 7 µm) se secaron al aire y se fijaron en acetona enfriada en hielo durante 10 minutos a -20°C. El enlace no específico se bloqueó mediante secciones de preincubación 1 h a temperatura ambiente con suero humano al 20% en 50 mM de solución salina regulada con Tris (TBS) pH 7.6. Las secciones se incubaron además durante la noche a 4°C con un anti-suero policlonal de conejo para receptor CB1 humano (Cayman, Spibio, Francia), diluido 1/2000 en diluyente de anticuerpo (Dakopatts, Francia). Después de enjuagar 3 veces en TBS, las secciones se incubaron durante 45 min a temperatura ambiente con anticuerpos G inmunoglobulina de anti-conejo monoclonal de ratón (Dakopatts, Francia), diluido 1 /50, enjuagado 3 veces en TBS, incubado además durante 30 min a temperatura ambiente con anticuerpos de inmunoglobulina de anti-ratón de conejo (Dakopatts, Francia), diluido 1 /50, y procesado después mediante el uso de I método inmunoenzimático de complejo de fosfatasa alcalina-anti-fosfatasa alcalina (APAAP), como se describe en la publicación de Li, L. ef al. , gastroenterology 125, 460-9 (2003). Para confirmar la especificidad del anticuerpo primario, los controles incluyen la preadsorción del anticuerpo primario con el péptido sintético correspondiente (100 µg/ml), durante 1 h a temperatura ambiente) o la omisión del anticuerpo primario. Con objeto de determinar si los miofibroblastos hepáticos expresan proteína CB1 , se llevó a cabo doble inmunoteñido de CB1 y a actina de músculo suave. Las secciones se procesaron primero para inmunoteñido de CB1 mediante el uso de un método de inmunoperoxidasa de bíotina- estreptavidina de tres etapas, estándar. Brevemente, la peroxidasa endógena se templó mediante incubación de las secciones fijas de acetona en TBS/0.3% H2O2 durante 30 min, después se enjuagó en TBS. El enlace no específico se bloqueó mediante secciones de preincubación 30 min con TBS/20% suero humano. Las secciones se incubaron entonces durante 15 min en avidina seguidas por 15 min en biotina (Vector Laboratories, equipo de bloqueo de Avidin/Biotin), y se incubó después durante la noche a 4°C con el antisuero anti-CB1 . Posteriormente, ias secciones se enjuagaron en TBS y se incubaron de manera sucesiva con el complejo de anti-conejo de cabra biotinilado de anticuerpo secundario (Dakopatts, Francia) (1 /500) y estreptavidina-peroxidasa de rábano picante (1 /50) (Pierce, Perbio, Interchim, Francia), 30 min cada uno. La actividad de la peroxidasa se reveló - mediante el uso de sustrato de diaminobenzidina mejorada con metal (DAB) (Pierce, Interchim, Francia). Todas las etapas se llevaron a cabo a temperatura ambiente a menos que se mencione de otro modo. El inmunoteñido para a actina de músculo suave se procesó entonces mediante el uso del método APAAP arriba descrito, con una dilución 1 /5000 de un anticuerpo monoclonal respecto a a actina de músculo suave (Sigma, Francia). Las divisiones se contra-tiñeron con hematoxilina acuosa. El teñido individual y doble se visualizó mediante fotomicrografías de campo brillantes en un microscopio Axioplan (Zeiss, Oberkochen, Alemania), equipado con un sistema de formación de imágenes digital (Hamamatsu 3CCD cámara a color, Hamamatsu Photonics, Francia). Aislamiento y Cultivo de miofibroblastos hepáticos humanos Los miofibroblastos hepáticos humanos se obtuvieron mediante desarrollo externo de explantes preparados a partir de especímenes quirúrgicos de hígado normal obtenido de cirugía de tumores de hígado benignos o malignos, como se describe en Davaille, et al. , J Biol. Chem 275, 34628-33 (2000). Las células se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que contiene suero al 10% (suero bovino fetal al 5%, y suero humano al 5%, DMEM 5/5) y se utilizaron entre la tercer y la séptima pasada. Los experimentos se llevaron a cabo en células que se hicieron quiescentes por una incubación de 48 h en medio de Waymouth libre de suero a menos que se indique de otro modo. La naturaleza miofibroblástica de estas células se evaluó com se describe en Davaille, J . ef al. , J Biol. Chem 275, 34628-33 (2000) y muestran las características fenotípicas y funcionales de las células fibrogénicas encontradas in situ durante la fibrogénesis hepática (Win, K.M., ef al., Hepatology 18, 137-45 (1993). Los cultivos se encontró que expresan a actina de músculo suave y dos marcadores de miofibroblastos hepáticos, fibuIin-2 e interleukin-6 (Davaille, J ef al., J Biol. Chem 275, 34628-33 (2000)).

Detección inmunocitoquímica de receptores CB1 en miofibroblastos hepáticos humanos cultivados Los miofibroblastos hepáticos humanos se sembraron (10,000/cm2) en discos de 35 mm, desarrollados en medio que contiene suero durante 24 h, exento de suero durante 48 h, enjuagado con TBS y fijado en paraformaldehído al 4% durante 10 min. Después de enjuagar una vez en TBS, las células se incubaron en TBS que contiene 20% de suero humano durante 30 min a temperatura ambiente, y se incubaron aún más con el anti-suero anti-CB1 (dilución a 1 /500 en TBS/20% suero humano) durante 3 h a temperatura ambiente y durante la noche a 4°C en una cámara húmeda. Las células se enjuagaron entonces de manera extensa en TBS, se incubaron con un IgG de anti-conejo de cabra conjugado con Cy3 (Sigma, Francia) (dilución a 1/50 en TBS/20% suero humano) a temperatura ambiente, en la oscuridad, durante 30 min, se enjuagaron, cubrieron con VECTASHIELD Mounting Médium (Vector Laboratories, Burlingame, CA) y se observaron bajo microscopio de fluorescencia. Para confirmar la especificidad del anticuerpo primario, los controles incluyeron pre-adsorción con el péptido sintético correspondiente (100 µg/ml, durante 1 h a temperatura ambiente) u omisión del anticuerpo primario. La expresión del receptor CB1 se estudió mediante inmunohistoquímica con un anticuerpo policlonal dirigido contra el receptor CB 1 humano, en secciones de tejido congeladas preparadas a partir de muestras quirúrgicas de hígados normales (n=3) y cirróticos (n = 10), con diversas etiologías (HCV crónicas n = 1 o HBV n=2, cirrosis biliar primaria n = 1 , enfermedad de hígado alcohólico n=4 o enfermedad de Wilson n = 1 y permaneció criptogénico en un caso). En hígado normal, se detectó una inmunoreactividad CB1 , de punción, discreta, a lo largo de paredes sinusoidales. En el h ígado cirrótico, la intensidad total del inmunoteñido de CB1 se incrementó notablemente, sin consideración a la etiología de cirrosis. CB1 fue principalmente evidente en numerosas células en forma de huso, distribuidas a lo largo del septo fibrótico. La expresión de receptor CB1 también se encontró en otras células no parénquimas, incluyendo células inflamatorias y células proliferantes ductulares, localizadas a lo largo del septo fibrótico. La especificidad del anticuerpo se demostró por la falta de señal en secciones incubadas en presencia del péptido de bloqueo CB1 o en ausencia del primer anticuerpo. La doble inmunohistoquímica. Mediante el uso de un anticuerpo de receptor de anti-CB1 y un anticuerpo de a actina de músculo suave, claramente identificó los miofibroblastos hepáticos dentro del septo fibrótico como un tipo de célula prominente que expresa receptores CB1 . De acuerdo con lo anterior, los receptores CB1 también se expresaron en miofibroblastos hepáticos, humanos, cultivados, como se demuestra por ambos, análisis de RT-PCR e inmunocitoquímica. Ejemplo 2: Respuesta fibrogénica reducida en ratones deficientes de CB1 Animales y Diseño Experimental Ratones CD1 macho invalidados para receptores CB1 y cachorros de la misma carnada de tipo silvestre se generaron como se describió previamente en la publicación Ledent, O et al. , Science 283, 401 -4. (1999). Los ratones heterocigosos se criaron por más de quince generaciones en un antecedente CD1 , antes de generar el tipo silvestre y los ratones mutantes se utilizaron en el presente estudio. Cuarenta machos: WT (n=20) y CB1 -/- (n=20), de 8-10 semanas de edad, se utilizaron y los animales se dividieron en los siguientes grupos: simulador de WT (aceite de oliva n = 8); WT CC14 (n=12); simulador de CB1 -/- (aceite de oliva n=5); CC14 CB1 -/-(n=15). Los animales se alojaron en ambientes controlados de temperatura y humedad, se mantuvieron en un ciclo de luz/oscuridad de 12 h y se proporcionaron cantidades no restringidas de alimento y agua, a menos que se especifique de otro modo. La fibrosis se indujo al dar tetracloruro de carbono (CC14) (Sigma, St. Quentin-Fallavier, Francia) mezclado con aceite de oliva (1 vol: 10 vol) a 0.5 ml/kg de peso corporal, mediante inyección intra peritoneal (IP), dos veces a la semana, en alternancia con un volumen igual de etanol mezclado con Cremophor y PBS (5/5/90) tres veces a la semana. Los animales simuladores para CC14 recibieron aceite de oliva. Después de 4 semanas, los animales ayunaron durante la noche y se mataron 48 h después de la última inyección de CC14. Las muestras de hígado se tomaron de varios lóbulos y ya sea i) se congelaron al instante en nitrógeno líquido y se homogenizaron en solución de extracción de ARN, ii) se homogenizaron en H2O y se congelaron al instante en nitrógeno líquido para determinación de hidroxiprolina o iii) se fijaron en formalina regulada. La muestra congelada al instante se almacenó a -80°C hasta su uso. Las muestras de sangre también se recolectaron en tubos con silicona que contienen barrera de gel inerte y disco activador de coágulos (Venoject, Terumo, Francia), separado el suero por centrifugación y almacenado a -20°C hasta su uso. Pruebas de Función del Hígado Las pruebas sanguíneas de función del hígado de rutina (bilirrubina, fosfatasa alcalina y transaminasa de aspartato) se llevaron a cabo en un analizador automatizado. Fibrosis, inflamación y determinación de necrosis Los especímenes de hígado se fijaron en formalina al 10% y se incrustaron en parafina. Las secciones de tejido (4 µm de grosor) se tiñeron con hematoxilin-eosina (H&E) para examinación de rutina, o con rojo Picro-Sirius para visualización de deposición de colágeno hepático. La calificación histológica (necrosis e infiltración inflamatoria) y la división en etapas (fibrosis) se determinaron de manera ciega en al menos 4 fragmentos de diferentes áreas de cada hígado, mediante un anatomopatólogo independiente. La fibrosis se separó por etapas en una escala de 0 a 4, de acuerdo con un sistema de puntuación METAVI R modificado, semi-cuantitativo, como sigue: no fibrosis = 0, fibrosis portal sin septo = 1 , septo escaso = 2, septo numeroso con cirrosis = 3 y cirrosis = 4. La heterogeneidad de fibrosis a través de todo el hígado, cuando se presenta, se tomó en cuenta al estimar el área porcentual correspondiente a un nivel de puntuación individual en cada fragmento y al combinar datos para cada hígado. La necrosis, definida por anticuerpos acidofílicos, degeneración de esferas y/o focos con cicatrices de necrosis hepatocelular, se calificó como sigue: ausente = 0, media = 1 (involucramiento de 173 de lóbulos o nodulos), moderada (involucramiento de 1 /3 - 2/3 de lóbulos o nodulos) = 2, marcada (involucramiento de más de 2/3 de lóbulos o nodulos) = 3. La infiltración inflamatoria se calificó desde 0 hasta 3: ninguna = 0, (portal y/o lobular) infiltración inflamatoria media en menos de 1 /3 de lóbulos o nodulos = 1 , infiltración inflamatoria moderada (portal y/o lobular) que involucra 1/3 - 2/3 de lóbulos o nodulos = 2, infiltración inflamatoria marcada (portal y/o lobular) que involucra más de 2/3 de lóbulos o nodulos = 3. Todas las muestras se calificaron de manera simultánea. Contenido de Hidroxiprolina El contenido de hidroxiprolina se determinó como se describió previamente en la publicación de Grenard, P ef al. , J Hepatol 26, 1356-62. (1997) . Tres fragmentos pequeños de cada hígado se depositaron, homogenizaron en agua destilada, se iiofilizaron y se hidrolizaron durante la noche en 6N de HCl a 1 10°C (19 mg de polvo de hígado seco / ml de HCl 6N). Los hidrolizados se trataron entonces con carbón vegetal activado, se filtraron, se evaporaron y se re-suspendieron en agua destilada. Las alícuotas de los hidrolizados se utilizaron para medir el contenido de hidroxiprolina (HP) de manera espectrofotométrica mediante lectura con reactivo de Ehrlich de acuerdo con el método de Woessner (Woessner, J. F., Arch Biochem Biophys 93, 440-7 (1961 )) modificado como se describe en la publicación de Creemers, L.B. ef al. , Biotechniques 22, 656-8 (1997). El contenido de hidroxiprolina hepático se expresa como microgramos por miligramo de tejido (peso seco). Aislamiento y cultivo de miofibroblastos hepáticos de ratones Los miofibroblastos de ratones se aislaron mediante perfusión de colagenaza y se purificaron por gradiente de densidad en Nicodenz, según se describe en Vrochides, D., ef al. Hepatology, 1996. 23(6):p. 1650-5. Después del aislamiento, las células se cultivaron en medio DMEM que contiene 20% de suero bovino fetal. El día uno, los residuos celulares y las células no adherentes se retiraron mediante enjuague, y las células se cultivaron además en medio DMEM que contiene 10% FCS. Las células se utilizaron entre la tercer y novena pasada y se encontró que expresan alfa-actina de músculo suave, fibulina-2 e interleukin-6.

Medición de actividad similar a Caspasa-3 Los ensayos de apoptosis se llevaron a cabo en células no confluentes permitidas a atacar durante la noche en DMEM que contiene 10% FCS y ayuno de suero durante el tiempo indicado. La actividad similar a Caspasa-3 se ensayó en lisados celulares mediante el usp de AC-DEVD-AFC como sustrato, como se describió previamente (Davaille, J., ef al. , J Biol. Chem, 2002. 277(40):p. 37323-30; Li, L. , et al. , J Biol. Chem, 2001 276(41 ):p. 38152-8). Determinación de viabilidad celular Los miofibroblastos hepáticos de ratones (7,000 células/cavidad en placas de 96 cavidades) se permitieron atacar durante la noche en DMEM 10%, ayuno de suero durante el tiempo indicado. El reactivo de Solución Acuosa Uno CellTiter 96 se agregó a cada cavidad y se registró la absorción a 490 nm. Determinación de TGF-ß1 hepático El contenido de TGF-ß1 hepático se determinó en homogenizados de hígado completo activados por ácido. Las muestras de hígado congelado se homogenizaron en regulador de lisis (25 mM HEPES pH 7.4, % NP40, 5 mM MgCI2, 1 .3 mM EDTA, 1 mM EGTA, fosfatasa e inhibidores de proteasa) durante 30 min a 4°C. Después de la centrifugación a 12,000 g durante 10 min a 4°C, los lisados de tejido limpios se recolectaron y almacenaron a -80°C hasta el análisis. La concentración de proteína se determinó mediante Ensayo de Proteína BCA (Pierce) utilizando albúmina de suero bovino (BSA) como un estándar. Para activar TGF-ß1 latente hacia una forma inmunoreactiva, los lisados de tejido se acidificaron en un volumen igual de 2.5 N de ácido acético, 10M urea a temperatura ambiente durante 10 min, seguidos por una neutralización que utiliza 2.7 M NaOH en 1 M HEPES. Se llevó a cabo ELISA mediante el uso de Quantikine de TGF-ß1 murino (R&D Systems, Francia) siguiendo las instrucciones del fabricante. La proteína recombinante de TGF-ß1 murino se utilizó como un estándar. Los resultados se expresan como pg de TG F-ß1 / mg de proteína soluble. Teñido inmunohistoquímico para -actina de músculo suave El tejido de hígado se fijó en formalina y se incrustó en parafina. El teñido inmunohistoquímico para a-actina de músculo suave se llevó a cabo mediante el uso de equipo de inmunodetección Vector M.O. M y, de acuerdo con el protocolo especificado con el fabricante (Vector Laboratories). En resumen , las secciones incrustadas en parafina se desparafinizaron y rehidrataron a través de xileno y etanol en TBS (50 mM Tris, 150 mM NaCI, pH 7.6). Las divisiones experimentaron microondas en regulador de citrato a una potencia de 700 W durante 2 veces cada 5 minutos, cada una. La actividad de peroxidasa endógena se templó entonces mediante incubación durante 1 hora en 0.3% H2O2 en TBS. Después del bloqueo del enlace no específico realizado mediante pre-incubación de secciones con 1 .5% de suero de caballo en TBS durante 1 hora, las secciones se incubaron durante 15 min en avidina, seguidas por 15 min en biotina (equipo de bloqueo de Avidin/Biotin, Vector Laboratories) y se incubaron después con la solución de Bloqueo de Ig de Ratón MOM durante 1 hr. Las secciones se enjuagaron posteriormente en TBS, y se incubaron sucesivamente con la solución diluyente MOM durante 5 min, con una dilución 1 : 1000 de un anticuerpo monoclonal para a-actina de músculo suave durante 30 min (Sigma, Francia), con el Reactivo de IgG de anti-ratón Biotinilado MOM durante 10 min y finalmente con el Reactivo ABC Vectastain durante 5 min. La actividad de peroxidasa se reveló mediante el uso de sustrato de diaminobenzidina mejorada con metal (DAB) (Pierce, Interchim, Francia) . Todas las etapas se llevaron a cabo a temperatura ambiente. Las divisiones de control se tiñeron con el diluyente MOM en lugar de que el anticuerpo primario no mostrara ningún teñido positivo. El área del teñido positivo se midió en 4-5 fragmentos de hígado por animal, usando un sistema de análisis morfométrico con software Image-Pro Plus (MediaCybernetics, MicroMecanique, Francia). Estadística Los resultados se expresan como media + SEM de n experimentos. Los resultados se analizaron por análisis de varianza de dos vías (ANOVA) seguido por comparaciones por par corregidas de acuerdo con el método Student-Newmann-Keuls. p<0.05 se tomó como el nivel mínimo de importancia. Los ratones deficientes de receptor CB1 (CB1 -/-) y sus cachorros de la misma carnada de tipo silvestre (WT) se expusieron a tratamiento de CC14 crónico. Los ratones simuladores (CB1 -/- y WT) recibieron aceite de oliva. El peso corporal medio, peso del hígado y proporción de peso del hígado/peso corporal no difieren significativamente entre los cuatro grupos experimentales, como se muestra en la Tabla 1 .

Tabla 1 . Parámetros vitales y pruebas de función del hígado en ratones de tipo silvestre (WT) o deficientes en CB1 después de 4 semanas de Tratamiento con CC14 Los resultados se expresan como media ± SEM. * P<0.05 contra aceite de oliva WT; # P<0.05 contra aceite de oliva CB|-/-| Los ratones WT desarrollaron fibrosis de h ígado después de 4 semanas de tratamiento con CC 14, como se muestra por análisis histológico de secciones de tejido de hígado con rojo PícroSirius. Los hígados de ratones WT tratados con CC14 mostraron numerosa formación de septos con algu nos nodulos. Sorprendentemente, los ratones CB1 -/- tratados con CC14 mostraron respuesta fibrogénica más débil con formación reducida de septos fibróticos. De acuerdo con lo anterior, la puntuación de fibrosis fue significativamente menor en ratones CB 1 -/- tratados con CC 14 en comparación con el grupo WT tratado con CC 14 (2.59 ± 0.1 3 y 3.33 ± 0.1 3, respectivamente, p<0.05) . Además, el contenido de colágeno hepático, determinado mediante determinación de hidroxiprolina en h ígado, se redujo fuertemente en 40% en ratones deficientes en CB1 tratados con CCL4 en comparación con sus contra-partes de WT (respectivamente 0.45 ± 0.06 y 0.73 ± 0.1 1 mg/mg de tejido (peso seco) ; p<0.05) . Finalmente, la necrosis e inflamación no fueron significativamente diferentes en ratones WT y CB 1 -/- tratados con CC14, como se muestra en la Tabla 2. Tabla 2: Necrosis e inflamación en ratones de tipo silvestre (WT) y CB1 -/- después de 4 Semanas de tratamiento con CC14 Los resultados se expresan como media ± SEM . El contenido hepático del TG F-ß1 de citosina fibrogénico se midió y la expresión de a-actina de músculo suave se determinó, siendo un marcador de miofibroblastos hepáticos y de células de estelado hepático activado. En animales tratados con CC 14, la producción de TGF-ß1 se redujo en ratones deficientes de CB 1 en comparación con su contraparte de tipo silvestre (Fig . 1 A). Además, la a-actina de músculo suave se atenuó notablemente en ratones CB1 -/- tratados con CC 14 en comparación con animales WT tratados con CC14 (1 .23 ± 0.09 contra 2.58 ± 0.23; p<0.05) (Fig. 1 B) . Finalmente, con objeto de determinar si la inactivación de CB 1 reduce la acumulación de miofibroblasto hepático mediante reducción de su proliferación y/o apoptosis, los miofibroblastos hepáticos aislados de ratones WT y CB1 -/- se utilizaron. El exentarse de suero se utilizó como estímulo apoptótico. La privación de suero afectó duramente la viabilidad de los miofibroblastos hepáticos aislados de ratones de tipo silvestre (WT) (Fig. 2). En contraste, el ayuno de suero produjo efectos citotóxicos hacia los miofibroblastos hepáticos aislados de animales CB1 -/-, como se muestra por el redondeo celular, encogimiento y separación y reducción de viabilidad (Fig . 2A). La privación de suero también mejoró la estimulación de la actividad similar a caspasa-3 en células CB! -/- en comparación con células WT (Fig. 2B). De este modo, los miofibroblastos hepáticos de ratones CB 1 -/- mostraron una mayor velocidad apoptótica que las células de ratones WT. Estos resultados demuestran que la invalidación de receptor CB1 sensibiliza a los miofibroblastos hepáticos a la apoptosis. Ejemplo 3: Fumado diario de cannabis es un factor de riesgo para progreso de fibrosis en hepatitis crónica C 195 pacientes consecutivos sin tratar con exposición fechada (hombres/mujeres : 140/55, edad 42 ± 10) se incluyeron. Los datos recolectados fueron consumos de cannabis, alcohol y tabaco durante el transcurso de la enfermedad, edad en la contaminación, género, ruta de transmisión, genotipo, BM I , esteatosis, actividad y fibrosis (METAVI R), y velocidad de progreso de fibrosis (siendo el valor medio de 0.08 por año).

Por análisis univariado, la velocidad de progreso de fibrosis superior a 0.08/año se asoció a fumado de cannabis, como se muestra en la tabla 3, ingesta de alcohol mayor o igual a 30 g/d (64% , p = 0.03) , esteatosis moderada o marcada (65% , p = 0.004) , edad en la contaminación mayor o igual a 25 (63%, p<0.01 ) y actividad histológica mayor o igual a A2 (65% , p<0.001 ). En análisis multivariado, la velocidad de progreso de fibrosis > 0.08 se relacionó independientemente con el fumado diario de cannabis (OR = 3.8; 95% C l ( 1 .7-8.7)), ingesta de alcohol mayor o igual a 30 g/d (OR = 2.1 ; 95% Cl (1 .04-4.6)), edad en la contaminación mayor o igual a 25 (OR = 4.0; 95% Cl (1 .9-8.4)) y actividad mayor o igual a A2 (OR = 7.5; 95% Cl (3.5-16.1 )) . Por consiguiente, existe un enlace causal entre el consumo diario de can nabis y el progreso de fibrosis. Tabla 3: Incidencia de Consumo de Cannabis en Progreso de Fibrosis Ejemplo 4: Cultivos de miofibroblasto hepático en presencia de antagonistas receptores CB1 Aislamiento y cultivo de miofibroblastos hepáticos humanos Los miofibroblastos hepáticos humanos se obtuvieron mediante desarrollo de explantes preparados a partir de especímenes quirúrgicos de hígado normal obtenido de cirug ía de tumores de h ígado, benig nos o malignos, como se describe previamente. Este procedimiento se llevó a cabo de acuerdo con regulaciones éticas impuestas por la legislación Francesa. Las células se cultivaron en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) que contiene 1 0% suero (5% suero bovino fetal, y 5% suero humano, DMEM 5/5) y se utilizaron entre la tercer y séptima pasada-. Los experimentos se llevaron a cabo en células que se hicieron quiescentes por una incubación de 48 h en medio Waymouth libre de suero a menos que se indique de otro modo. Aislam iento y cultivo de miofibroblastos hepáticos de ratones Los miofibroblastos de ratones se aislaron mediante perfusión de colagenaza y se purificaron por gradiente de densidad en Nicodenz, como se describe. Después del aislamiento, las células se cultivaron en medio DMEM que contiene 20% suero bovino fetal. El d ía uno, los residuos celulares y las células no adherentes se retiraron mediante enjuague, y las células se cultivaron después en medio DMEM que contiene 10% FCS. Las células se utilizaron entre la tercer y novena pasada. Ensayos de apoptosis Los ensayos de apoptosis se llevaron a cabo en células no confluentes permitidas a anexarse durante la noche en DMEM 5/5 y ayuno de suero durante 48 h , como se describe en Davaille J ef al, J Biol. Chem 2002; 277: 37323-30, y Li L ef al. , J Biol. Chem 2001 ; 276: 38152-8. La morfología nuclear se ensayó mediante el uso de teñido DAPI , la actividad similar a caspasa-3 se ensayó en lisados celulares mediante el uso de AC-DEVD-AFC como sustrato, y el ADN se ensayó por electroforesís en gel de agarosa de ADN total extraído mediante el uso de un Apoptotic DNA Ladder Kit. Viabilidad Celular Las células (7,000 células/cavidad en placas de 96 cavidades) se permitieron anexarse durante la noche en DMEM 5/5, ayuno de suero durante 48 h en DMEM sin rojo fenol y tratadas con efectores indicados durante 16 h. El reactivo de CellTiter 96 Aqueous One Solution se agregó a cada cavidad y se registró la absorción a 490 nm. Medición de síntesis de ADN La síntesis de ADN se midió en cavidades por triplicado mediante incorporación de [3H] timidina, como se describió previamente (Tao, J., ef al. , J Biol. Chem, 1999. 274(34): p. 23761 -23769). Los miofibroblastos humanos confluentes ayunaron de suero durante 48 h y se estimularon además durante 30 h con 20 ng/ml de PDGF-BB. Los miofibroblastos hepáticos de ratones confluentes ayunaron de suero durante 24 h en presencia de 0.1 % BSA y se estimularon además durante 30 h con 20 ng/ml de PDGF-BB en presencia de 0.1 % BSA y se estimularon además durante 30 h con 20 ng/ml PDGF-BB en presencia de 0.01 % BSA. Se agregó [3H] timidina (0.5 µd'/cavidad) durante las últimas 20 h de incubación. El cultivo celular se llevó a cano como se describe en el ejemplo 1 en la presente. El cultivo celular de ambos miofibroblastos hepáticos de humano y ratón se expusieron a dosis crecientes de antagonista receptor CB1 SR141716 y la síntesis de ADN de miofibroblastos hepáticos se midió. En miofibroblastos hepáticos humanos, la síntesis de ADN inhibida de manera dependiente de la dosis de SR 141716 producida por 20 ng/ml de PDGF-BB (Fig. 3A), con una inhibición máxima media ocurriendo en presencia de 300-400 nM del compuesto. SR141716 también inhibió la síntesis de ADN producida por 20 ng/ml PDGF-BB en miofibroblastos murinos aislados de ratones de tipo silvestre, mientras que solo afectó marginalmente la proliferación de células CB 1 -/- (Fig. 3B). Estos resultados demuestran que el antagonista CB1 SR 141716 origina la inhibición de crecimiento de miofibroblastos hepáticos, humanos y de ratones, y actúa a través de receptores CB1 . Ejemplo 5: Determinación del efecto terapéutico de SR 141716 sobre fibrosis de hígado inducida Se evaluó el potencial antifibrogénico del antagonista CB 1 SR 141716 en un modelo experimental de fibrosis de hígado, inducida por intoxicación crónica con tetracloruro de carbono. Administración de fármaco SR 141716 (10 mg/kg de peso corporal) se disolvió recientemente antes de su uso, en una solución vehículo (2 gotas de Tween 80 en 10 ml de PBS que contiene 10% dimetiisulfóxido y 5% etanol) y se sónico. Animales y Diseño Experimental Los ratones CD1 se obtuvieron de Janvier (Francia). Todos los experimentos se llevaron a cabo mediante el uso de lineamientos éticos aceptados. Se utilizaron 36 machos de 10-12 semanas de edad y los animales se dividieron en los siguientes grupos: tratados con vehículo, grupo de aceite de oliva (n=3); tratado con vehículo, grupo de CCI4 (n=14); grupo de aceite de oliva tratado con SR 141716 (n=3); grupo CC14, tratado con SR 141716A (n = 16). Los animales se alojaron en ambientes controlados en humedad y temperatura, se mantuvieron en un ciclo de oscuridad/luz de 12 h y se proporcionaron cantidades no restringidas de alimento y agua, a menos que se especifique de otro modo. La fibrosis se indujo al dar tetracloruro de carbono (CCI4) (Sigma, St Quentin-Fallavier, Francia) mezclado con aceite de oliva (1 vol: 10 vol) a 0.5 ml/kg de peso corporal, mediante inyección intra peritoneal, dos veces a la semana por un mes. SR141716 o veh ículo se administró diariamente mediante inyección intraperitoneal. El tratamiento se inició 7 días antes de la inyección de tetracloruro de carbono (CCI4) y duró a través de todo el tratamiento con CCI4. La co-administración de CCI4 con vehículo (PBS que contiene 10% DMSO, 5% etanol, 0.1 % Tween 80) produjo muerte masiva de los animales, alcanzando 50% de la población después de un mes (ver Fig. 4). En contraste, la co-administración de ratones con CCI4 en conjunto con 10 mg/kg SR 141716 se asoció con una mayor tasa de supervivencia a un mes (83%). No hubo muertes en animales simuladores, ya sea tratados con SR 141716 o vehículo.

Por consiguiente, estos resultados indican una función hepatoprotectora para el antagonista CB1 SR141716. Ejemplo 6: Determinación de un régimen óptimo para administración oral de SR141716 en el tratamiento de fibrosis de hígado Con objeto de definir las condiciones óptimas de tratamiento a largo plazo con SR141716, se lleva a cabo lo siguiente. Los 40 ratones macho CD1 se dividen en los siguientes grupos: simulador (aceite de oliva n= 3); CC14 (n= 12); grupo simulador tratado con SR 141716 (aceite de oliva n= 3); 2 grupos de grupo CC14 tratado con SR 141716 (n = 2 veces 12). Los animales se alojaron en ambientes de temperatura y humedad controladas, se mantuvieron en un ciclo de oscuridad/luz de 12 h y se proporcionaron cantidades ilimitadas de alimento y agua, a menos que se especifique de otro modo. La fibrosis se indujo al dar tetracloruro de carbono (CC 14) (Sigma, St Quentin-Fallavier, Francia) mezclado con aceite de oliva (1 vol: 10 vol) a 0.5 ml/kg de peso corporal, mediante inyección intra peritoneal (IP), dos veces a la semana. Los animales simuladores para CC14 reciben aceite de oliva. SR 141716 se incluye en alimento de ratones RM 1 (DI ETEX, Francia) a una concentración de 65 mg/kg, se da al grupo tratado con SR 141716. Suponiendo que un ratón peso 30 g comerá 5g por día, la dosis final esperada de SR 141716 administrada es de 20 mg/kg. El tratamiento con SR 141716 inicia ya sea 7 días antes de la inyección de tetracloruro de carbono (CC14) (12 ratones) o inicia 7 días después de la primer inyección (12 ratones), y dura a través de todo el tratamiento con CC14. Después de 5 semanas, los animales ayunaron durante la noche y se mataron 48 h después de la última inyección de CC14. Las muestras de hígado se tomaron de varios lóbulos y ya sea i) se congelaron al instante en nitrógeno líquido y se homogenizaron en solución de extracción de ARN, ii) se homogenizaron en H2O y se congelaron al instante en nitrógeno líquido para determinación de hidroxiprolina o iii) se fijaron en formalina regulada. La muestra congelada al instante se almacenará a -80°C hasta su uso. Las muestras de sangre también se recolectaron en tubos siliconizados que contienen barrera de gel inerte y disco activador de coágulos (Venoject, Terumo, Francia), suero separado por centrifugación y almacenado a -20°C hasta su uso. Los resultados se utilizan con objeto de determinar la concentración a la cual la toxicidad es terapéuticamente aceptable.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 1. Uso de un antagonista del receptor CB1 en la elaboración de una composición para el tratamiento de enfermedades hepáticas. 2. Uso según la reivindicación 1 , caracterizado porque el antagonista del receptor CB1 es un antagonista específico del receptor CB1 . 3. Uso según las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque la enfermedad hepática da como resultado fibrosis hepática. 4. Uso según las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la enfermedad hepática es cirrosis alcohólica. 5. Uso según las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la enfermedad hepática es hepatitis viral crónica. 6. Uso según las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la enfermedad hepática es esteatohepatitis no alcohólica. 7. Uso según las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la enfermedad hepática es cáncer primario de hígado. 8. Uso según las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el antagonista es un compuesto de la fórmula II o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, en el cual g2, g3, g4, gs y e y w2, w3, w4, w5 y w6 son idénticos o diferentes y son independientemente hidrógeno, un átomo de cloro o bromo, un alquilo (d-C3) , un alcoxi (C1-C3), un trifluorometilo. o un grupo nitro y g es opcionalmente un grupo fenilo; R4 es hidrógeno o un alquilo (C1-C3); X es ya sea un enlace directo o un grupo -(CH2)X-N(R3)-, en el cual R3 es hidrógeno o un alquilo (C?-C3) y x es cero o uno; R es: un grupo -NR-i R2 en el cual R-¡ y R2 son independientemente un alquilo-(d-C6); un radical carbocíclico (C3-C15) no aromático el cual se sustituye opcionalmente, siendo dichos(s) sustituto(s) diferentes de un carbonilo sustituido; un grupo alquilo (C?-C ) amino en el cual el amino se di-sustituye opcionalmente por un alquilo (d-C3); un cicloalquilo (d-C3) alquilo en el cual es cicloalquilo es C3-d2; un fenilo que no se sustituye o se monosustituye o polisustituye por un halógeno, por un alquilo (d-C5) o por un alcoxi (d-C5); un fenil(d- C3) alquilo; un difenil(d-C3) alquilo; un naftilo; un antracenilo; un radical heterocíclico, integrado por 5 hasta 8 miembros, saturado, el cual no se sustituye o se sustituye por un alquilo (d-C3), por un hidróxilo o por un benzilo; un 1 -adamantilmetilo; un heterociclo aromático que no se sustituye o se monosustituye o polisustituye por un halógeno, por un alquilo (C-?-C5) o por un alcoxi (d-C5); un alquilo (d-C3) que se sustituye por un heterociclo aromático que no se sustituye o se monosustituye o polisustituye por un halógeno, por un alquilo (C1-C5) o por un alcoxi (d-C5); o de otro modo R , es hidrógeno y R2 es según se define arriba; o de otro modo, R1 y R2 forman un radical heterocíclico, integrado por 5 hasta 8 miembros, saturado, con el átomo de nitrógeno al cual se unen, siendo dicho radical heterocíclico diferente de morfolina cuando w2, w3, w , w5, w6, g2> g3> 94, gs y ge son todos hidrógeno; un grupo R2 según se define arriba cuando X es -(CH2)XN(R3)-; un grupo R5 cuando X es un enlace directo, siendo R5 un alquilo (d-C3); un cicloalquilo (C3-C12) el cual no se sustituye o se sustituye por un alquilo (C1-C5); un fenilo (d-C3) alquilo, el cual no se sustituye o se sustituye por un halógeno o por un alquilo (d-C5); un cicloalquilo (d-C3) en el cual el cicloalquilo es C3-C12 y no se sustituye o se sustituye por un alquilo (d-Cs); o un 2-norbornilmetilo. 9. Uso según las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el antagonista es N-piperidono-3-pirazolcarboxamida o una de sus sales farmacéuticamente aceptables. 10. Uso según las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el antagonista es N-piperidino-5-(4-bromofenil)-1 -(2,4-diclorofenil)-4-etiIpirazol-3-carboxamida o una de sus sales farmacéuticamente aceptable. 1 1 . Uso según las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el antagonista es N-piperidino-5-(4-clorofenil)-1 -(2,4-diclorofenil)-4-metilpirazol-3-carboxamída o una de sus sales farmacéuticamente aceptable. 12. Uso de acuerdo con cualquiera de los puntos precedentes, en donde el receptor CB 1 se selecciona a partir del grupo que consiste en: a) una proteína que tiene una secuencia amino acida que comprende la SEQ ID NO: 1 o una porción de la SEQ ID NO: 1 , teniendo la función biológica de un receptor celular acoplado a proteína G, capaz de enlazar THC y transducir una señal celular; b) una proteína que tiene una secuencia amino acida que comprende la SEQ ID NO: 2 o una porción de la SEQ ID NO: 2, teniendo la función biológica de un receptor celular acoplado a proteína G , capaz de enlazar THC y transducir una señal celular; c) un alelo de la proteína que tiene la secuencia amino acida de la SEQ I D NO: 1 o la SEQ ID NO: 2, que tiene la función biológica de un receptor celular acoplado a proteína G, capaz de enlazar THC y transducir una señal de celular; d) una proteína que tiene la secuencia amino acida de la SEQ ID NO: 1 con una sustitución de Fenilalanina por Leucina en la posición 200; y/o una sustitución de Isoleucina por Valina en la posición 216; y/o una sustitución de Valina por Alanina en la posición 246; e) una proteína que tiene la secuencia amino acida de la SEQ ID NO: 2 con una sustitución de Fenilalanina por Leucina en la posición 139; y/o una sustitución de Isoleucina por Valina en la posición 155; y/o una sustitución de Valina por Alanina en la posición 185; y f) una proteína que comprende las secuencias amino acidas de la SEQ I DNO: 3; SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 9 o secuencias amino acidas 80% homologas a estas, teniendo dicha proteína la función biológica de un receptor celular acoplado a proteína G, capaz de enlazar THC y transducir una señal celular. 13. Uso según las reivindicaciones 1 a 1 1 , caracterizado porque el receptor CB1 es una proteína que tiene una homología en el nivel amino ácido con la SEQ ID NO: 1 de por lo menos 45%, teniendo la función biológica de un receptor celular acoplado a proteína G , capaz de enlazar THC y transducir una señal celular. 14. Uso según la reivindicación precedente, caracterizado porque la homología es de por lo menos 60%, preferentemente 70%, más preferentemente 80%, incluso más preferentemente 90% y más preferentemente 95%. 15. Uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la dosis diaria de antagonista receptor CB1 es desde 0.01 mg hasta 500mg, preferentemente desde 1 mg hasta 100 mg . 16. Uso de una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína que comprende la SEQ I D NO: 1 o la SEQ I D NO: 2 o una porción de a SEQ I D NO: 1 o una porción de la SEQ I D NO: 2, para la preparación de una composición para el tratamiento de enfermedades hepáticas mediante la sub-regulación o supresión del receptor CB1 . 17. Un método para el tratamiento de enfermedades hepáticas en un mamífero, que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de por lo menos un antagonista de receptor CB1 a un mamífero que necesita el mismo. 18. Un método para el tratamiento de enfermedades hepáticas según la reivindicación 17, caracterizado porque el antagonista receptor CB 1 es un compuesto de la fórmula I I o una de sus sales farmacéuticamente aceptable, en el cual g2, g3, g , gs y ge y w2, w3, w4, w5 y w6 son idénticos o diferentes y son independientemente hidrógeno, un átomo de cloro o bromo, un alquilo (d-C3), un alcoxi (d-C3), un trifluorometilo o un grupo nitro y g4 es opcionalmente un grupo fenilo; R4 es hidrógeno o un alquilo (C1-C3); X es ya sea un enlace directo o un grupo -(CH2)X-N(R3)-, en el cual R3 es hidrógeno o un alquilo (d-C3) y x es cero o uno; R es: un grupo -NRi R2 en el cual R1 y R2 son independientemente un alquilo-(d-C6); un radical carbocíclico (C3-C 5) no aromático el cual se sustituye opcionalmente, siendo dichos(s) sustituto(s) diferentes de un carbonilo sustituido; un grupo alquilo (d-C4) amino en el cual el amino se di-sustituye opcionalmente por un alquilo (d-C3); un cicloalquilo (C1-C3) alquilo en el cual es cicloalquilo es C3-C12; un fenilo que no se sustituye o se monosustituye o polisustituye por un halógeno, por un alquilo (d-C5) o por un alcoxi (C-,-C5); un fenil(d-C3) alquilo; un difen¡l(d-C3) alquilo; un naftilo; un antracenilo; un radical heterocíclico, integrado por 5 hasta 8 miembros, saturado, el cual no se sustituye o se sustituye por un alquilo (d-C3), por un hidróxilo o por un benzilo; un 1 -adamantilmetilo; un heterociclo aromático que no se sustituye o se monosustituye o polisustituye por un halógeno, por un alquilo (d-C5) o por un alcoxi (d-C ); un alquilo (d-C3) que se sustituye por un heterociclo aromático que no se sustituye o se monosustituye o polisustituye por un halógeno, por un alquilo (d-C5) o por un alcoxi (d-C5); o de otro modo R1 es hidrógeno y R2 es según se define arriba; o de otro modo, R^ y R2 forman un radical heterocíclico, integrado por 5 hasta 8 miembros, saturado, con el átomo de nitrógeno al cual se unen, siendo dicho radical heterocíclico diferente de morfolina cuando w2) w3, w , w5, w6, g2, g3, g4, gs y ge son todos hidrógeno; un grupo R2 según se define arriba cuando X es -(CH2)XN(R3)-; un grupo R5 cuando X es un enlace directo, siendo R5 un alquilo (d-C3); un cicloalquilo (C3-C-?2) el cual no se sustituye o se sustituye por un alquilo (C-?-C5); un fenilo (d-C3) alquilo, el cual no se sustituye o se sustituye por un halógeno o por un alquilo (d-C5); un cicloalquilo (C?-C3) en el cual el cicloalquilo es C3-C12 y no se sustituye o se sustituye por un alquilo (d-C5); o un 2-norbornilmetilo. 19. Un método para el tratamiento de enfermedades hepáticas según la reivindicación 17, caracterizado porque el antagonista receptor CB1 es N-piperidono-3-pirazolcarboxamida o una de sus sales farmacéuticamente aceptables. 20. Un método para el tratamiento de enfermedades hepáticas según la reivindicación 17, caracterizado porque el antagonista receptor CB1 es N-piperidino-5-(4-bromofenil)-1 -(2,4- diclorofeniI)-4-etilpirazol-3-carboxamida o una de sus sales farmacéuticamente aceptable. 21 . Un método para el tratamiento de enfermedades hepáticas según la reivindicación 17, caracterizado porque el antagonista receptor CB1 es N-piperidino-5-(4-clorofenil)-1 -(2,4-diclorofenil)-4-metilpirazol-3-carboxamida o una de sus sales farmacéuticamente aceptable. 22. Un método para el tratamiento de enfermedades hepáticas según las reivindicaciones 17 a 21 , caracterizado porque la enfermedad hepática es fibrosis de h ígado. 23. Un método para el tratamiento de enfermedades hepáticas según las reivindicaciones 17 a 21 , caracterizado porque la enfermedad hepática es cirrosis alcohólica de hígado. 24. Un método para el tratamiento de enfermedades hepáticas según las reivindicaciones 17 a 21 , caracterizado porque la enfermedad hepática es hepatitis viral crónica. 25. Un método para el tratamiento de enfermedades hepáticas según las reivindicaciones 17 a 21 , caracterizado porque la enfermedad hepática es esteatohepatitis no alcohólica. 26. Un método para el tratamiento de enfermedades hepáticas según las reivindicaciones 17 a 21 , caracterizado porque la enfermedad hepática es cáncer primario de hígado. 27. Un método para el tratamiento de enfermedades hepáticas según las reivindicaciones 17 a 26, caracterizado porque la dosis diaria de antagonista receptor CB1 es desde 0.01 mg hasta 500mg, preferentemente desde 1 mg hasta 100 mg .