MXPA06009161A - Modulacion de receptores activados por el proliferador de peroxisoma. - Google Patents

Abstract

Un metodo para tratar una enfermedad relacionada con los receptores activados por proliferadores de peroxisoma administrandole a un sujeto que lo necesita, una cantidad efectiva de un modulador de 15-ceto prostaglandina-(13 reductasa. Tambien se describen metodos para identificar un compuesto para inhibir la actividad de la reductasa y para disminuir los niveles de glucosa en la sangre, administrandole a un sujeto una cantidad efectiva de un inhibidor de reductasa.

Description

MODULACIÓN DE RECEPTORES ACTIVADOS POR EL PROLIFERADOR DE PEROXISOMA Referencia Cruzada a la Solicitud Relacionada Conforme a 35 U.S.C.§ 119(e), esta solicitud reivindica la prioridad de la Solicitud Provisoria de los Estados Unidos Acta No. 60/707,897, presentada el 12 de Agosto de 2005, cuyo contenido se incorpora a la presente como referencia.

Antecedentes Los receptores activados por el proliferador de perixosoma (PPARs) pertenecen a una familia de receptores nucleares que regulan el metabolismo de los lípidos y la glucosa. Se han identificado tres PPARs de mamífero, es decir PPAR-alfa, PPAR-gamma y PPAR-delta. Tras la activación por ácidos grasos de la dieta o sus derivados metabólicos, los PPARs disparan una cascada de eventos de transcripción que llevan a un metabolismo alterado de los lípidos y la glucosa. Por ejemplo, ante la activación, el PPAR-gamma, altamente expresado en los tejidos adiposos, promueve la captación de glucosa y reduce los niveles de glucosa en sangre. Dados sus roles en el metabolismo de los lípidos y la glucosa, los PPARs son blancos terapéuticos promisorios de enfermedades, por ejemplo diabetes de tipo II, obesidad, dislipidemia, enfermedad cardiaca coronaria, enfermedad inflamatoria y cáncer. Se han estado utilizando los agonistas sintéticos de PPAR-gamma, es decir, AVANDIA y ACTOS, para tratar la diabetes de tipo II. Se ha estado utilizando otro agonista sintético de PPAR-alfa, es decir Fibrato, para tratar la dislipidemia. Ver See Lehmann, et al., J Biol Chem, (1995) 270:12953-12956; Fruchart, er a/., Curr. Opin. Lipdol. (1999) 10:245-257. Sin embargo, la mayoría de las terapias para PPAR tienen limitada eficacia y efectos colaterales significativos. Existe una necesidad de desarrollar fármacos más efectivos para el control del metabolismo de los lípidos y la glucosa por medio de la modulación de la actividad de PPAR.

Breve Descripción de la Invención Esta invención se relaciona con métodos para el tratamiento de enfermedades relacionados con los PPAR por medio de la modulación de la actividad de PPAR en un sujeto. En un aspecto, esta invención presenta un polipéptido aislado, PGR3/ZADH2, que reduce la 15-ceto prostaglandina pero no el leucotrieno B4. La prostaglandina (PG) es una clase de mediadores fisiológicos que se caracterizan por un anillo central y cadenas laterales de diversos grados de insaturación. Entre los ejemplos de 15-ceto prostaglandina se cuentan, aunque no a modo de limitación, 15-ceto PGE2, 15-ceto PGE,, 15-ceto PGF2a, y 15-ceto PGF1s. En otro aspecto, esta invención presenta un anticuerpo que se une específicamente al polipéptido antes descrito. El anticuerpo, ya sea policlonal o monoclonal, puede unirse a un fragmento del polipéptido.

En otro aspecto más, esta invención presenta un ácido ribonucleico de doble hebra (ARNds), así como un vector de ADN que lo codifica, para inhibir la expresión de un polipéptido con actividad de 15-ceto prostaglandina-?13-reductasa. 15-ceto prostaglandina-?13-reductasa se refiere a una enzima que cataliza la conversión de una 15-ceto prostaglandina a 13,14-dihidro-15-ceto prostaglandina mediante la reducción del doble enlace ?13 de ia prostaglandina. Entre los ejemplos de 15-ceto prostaglandina-?13-reductasas se incluyen 15-ceto prostaglandina-?13-reductasa/leucotrieno B4 12-hidroxidehidrogenasa (PGR/LTB4DH), alcohol deshidrogenasa 1 de fijación de zinc (PGR2/ZADH1) y alcohol deshidrogenasa 2 de fijación de zinc (PGR3/ZADH2). El ARNds contiene dos hebras de poliribonucleótido. La primer hebra contiene una secuencia que es idéntica a 19 a 49 nucleótidos consecutivos de un ácido nucleico que codifica la 15-ceto prostaglandina-?13-reductasa. La secunda hebra es complementaria de la primer hebra. De preferencia, por lo menos un extremo del ARNds tiene 1 a 4 nucleótidos sobresalientes. En un ejemplo, la primer hebra contiene SEQ. ID. NO: 9 o 10, o un fragmento de la misma. La 15-ceto prostaglandina-? 3-reductasa puede ser PGR/LTB4DH, PGR2/ZADH1 o PGR3/ZADH2. En un aspecto más, esta invención da a conocer un método para el tratamiento de una enfermedad relacionada con el PPAR tal como la diabetes de tipo II, obesidad, dislipidemia, enfermedad cardiaca coronaria, enfermedad inflamatoria y cáncer. El método incluye la administración a un sujeto de una cantidad efectiva de un modulador de PGR3/ZADH2. Un modulador de PGR3/ZADH2 se refiere a una molécula o un complejo de moléculas que afecta la actividad o expresión de PGR3/ZADH2. Un modulador puede ser una 15-ceto prostaglandina. También puede ser un inhibidor que suprima la actividad o la expresión de PGR3/ZADH2, tal como un inhibidor molecular de gran tamaño (por ejemplo, el ARNds antes descrito) o un inhibidor de moléculas pequeñas (por ejemplo, tetrahidroxiflavona, trihidroxiflavona, 2-hidroxi-trimetoxichalcona, 2-hidroxi-bencil cinnamato o bencil hidroxilcinnamato). Entre los ejemplos de inhibidores de pequeñas moléculas se cuentan los compuestos 1-49 descritos a continuación.

Compuesto 12 Compuesto 13 Compuesto 14 Compuesto 15 Compuesto 16 Compuesto 17 Compuesto 18 Compuesto 19 Compuesto 20 Compuesto 21 Compuesto 22 Compuesto 23 Compuesto 24 Compuesto 25 Compuesto 26 Compuesto 28 Compuesto 32 Compuesto 33 Compuesto 37 Compuesto 38 Compuesto 39 Compuesto 40 Compuesto 41 Compuesto 42 43 44 Compuesto 45 Compuesto 49 En otro de sus aspectos, esta invención da a conocer un método para el tratamiento de una enfermedad relacionada con el PPAR. El método incluye la administración a un sujeto que lo necesita, de una cantidad efectiva de un compuesto de la fórmula (I): En la fórmula (I), cada uno de R1 y R2 es, independientemente, H, halo, ORa, alquilo C?-C10, cicloalquilo C3-C20, heterocicloalquilo C3-C20, arilo, o heteroarilo, y cada uno de R3, R4, R5, R6, R7, R8, Rg, Río, R11 y R?2, es, independientemente, H, halo, ORb, alquilo cicloalquílo C3-C20, heterocicloalquilo C3-C20, arilo o heteroarilo, o R4 y R5, juntos, son cicloalquilo C3-C2o, heterocicloalquilo C3-C20, arilo, o heteroarilo, o bien R10 y n, juntos, son cicloalquilo C3-C20, heterocicloalquilo C3-C20, arilo, o hetersarilo, donde cada uno de Ra y Rb es, independientemente, H, alquilo C?-C10, cicloalquilo C3-C20, heterocicloalquilo C3-C20, arilo, o heteroarilo. En una subserie de compuestos de la fórmula (I), cada uno de Ri y R2 es, independientemente, H, fenilo fusionado con cíclopentilo o fenilo sustituido con heteroarilo. En otra subserie de compuestos de la fórmula (I), R3 y R13 son OH. El término "alquilo" se refiere a una porción hidrocarburo lineal o ramificado, saturado o insaturado tal como -CH3, -CH2-CH = CH2, o -C3H7 ramificado. El término "cicloalquilo" se refiere a una porción hidrocarburo cíclico no aromático, saturado o insaturado tal como ciclohexilo o ciclohexen-3-ilo. El término "heterocicloalquilo" se refiere a una porción cíclica no aromática, saturada o insaturada que tiene por lo menos un heteroátomo del anillo (por ejemplo N, O o S), tal como 4-tetrahidropiranilo o 4-piranilo. El término "arilo" se refiere a una porción hidrocarburo que tiene uno o más anillos aromáticos. Entre los ejemplos de porciones arilo se cuentan fenilo (Ph), fenileno, naftilo, naftileno, pirenilo, antrilo, y fenantrilo. El término "heteroarilo" se refiere a una porción que tiene uno o más anillos aromáticos que contienen por lo menos un heteroátomo (por ejemplo, N, O o S). Entre los ejemplos de porciones heteroarilo se incluye furilo, furileno, fluorenilo, pirrolilo, tienilo, oxazolilo, imidazolilo, tiazolilo, piridilo, pirimidinílo, quinazolinilo, quinolilo, isoquinolilo e indolilo. Alquilo, alquileno, heteroalquileno, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, y heteroarilo mencionados en la presente incluyen tanto porciones sustituidas como no sustituidas, a menos que se indique expresamente lo contrario. Los posibles sustituyentes en cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo y heteroarilo incluyen, aunque no a modo de limitación, alquilo C-I-CK), alquenilo C2-C10, alquinilo C2-C10, cicloalquilo C3-C8, cicloalquenilo C5-C8, alcoxí C-,-C10, arilo, ariloxi, heteroarilo, heteroariloxi, amino, alquilamino C-,-C-io, dialquilamino C1-C20, arilamino, díarilamino, hidroxilo, halógeno, tio, alquiltio C-,-C10, ariltio, alquilsulfonilo Ct-C-,0, arilsulfonilo, acilamino, aminoacilo, aminotioacilo, amidino, guanidína, ureido, ciano, nitro, aciio, tioacilo, aciloxi, carboxilo y éster carboxílíco. Por otro lado, los posibles sustituyentes en alquilo, alquileno o heteroalquileno incluyen todos los sustituyentes antes citados excepto alquilo C-?-C10, alquenilo C2-C10 y alquinilo C2-C10. Cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo y heteroarilo también pueden estar fusionados entre sí. En otro aspecto más, esta invención da a conocer un método para el tratamiento de una enfermedad relacionada con PPAR mediante la administración a un sujeto que lo necesita, de una cantidad efectiva de un compuesto de la fórmula (II): En la fórmula (II), cada uno de R^ R2, R3, R , R5, R6, R7, R8, R9 y R10 es independientemente H, OR, alquilo 0,-0^, cicloalquilo C3-C20, heterocicloalquilo C3-C20, arilo o heteroarilo, donde R es H, alquilo C?-C10, cicloalquilo C3-C20, heterocicloalquilo C3-C20, arilo o heteroarilo. En una subserie de compuestos de la fórmula (II), cada uno de R-,, R2, R3, R4, R5, R6, R7, Re, Rg, y Río es independientemente H o OH. En otro de sus aspectos, esta invención presenta un método para el tratamiento de una enfermedad relacionada con PPAR mediante la administración a un sujeto que lo necesita, de una cantidad efectiva de un compuesto de la fórmula (III): En la fórmula (III), Ri es alquilo C1-C10, cicloalquilo C3-C20, heterocicloalquilo C3-C20, arilo, heteroarilo, ORa, NRaRb o SRa; y cada uno de R2, R3, R , R5 y R6 es independientemente H, halo, ORc, NRcRd, alquilo C-1-C10, cicloalquilo C3-C20, heterocicloalquilo C3-C20, arilo o heteroarilo, donde cada uno de Ra, Rb, Rc y Rd es independientemente H, alquilo CrC?0, cicloalquilo C3-C20, heterocicloalquilo C3-C20, arilo o heteroarilo. En una subserie de compuestos de la fórmula (III), Ri puede ser fenilo sustituido con halo, OR, NO2 o alquilo d-C10, donde R es H o alquilo C?-C10. En otra subserie de compuestos de la fórmula (III), R1 puede ser ORa, NRaRb o SRa, donde Ra es alquilo C-1-C10 sustituido con fenilo, donde fenilo está optativamente sustituido con CF3, F o OH, y Rb es H. En otra subserie de compuestos de la fórmula (III), R1 es heteroarilo o alquilo C^C-,0 sustituido con C(Q)R, donde R es H o alquilo C-?-C10. También está dentro del alcance de esta invención un método para reducir los niveles sanguíneos de glucosa en un sujeto. El método incluye la administración a un sujeto de una cantidad efectiva de uno de los inhibidores de PGR3/ZADH2 antes citados. El inhibidor puede suprimir la actividad o la expresión de PGR3/ZADH2.

Esta invención da a conocer, asimismo, un método para identificar un compuesto que inhibe la actividad de PGR3/ZADH2.

Inhibición se refiere a la supresión de la actividad o la expresión de PGR3/ZADH2. El método incluye proporcionar un sistema que contiene PGR3/ZADH2, la puesta en contacto de un compuesto con el sistema, la determinación de la actividad de PGR3/ZADH2 y la comparación de la actividad con la obtenida de manera igual, excepto que en ausencia del compuesto. En una modalidad, el sistema consiste en una célula que contiene un gen que expresa PGR3/ZADH2 y la actividad se determina midiendo la actividad de expresión del gen . En otra modalidad, el sistema es una solución libre de células que contiene PGR3/ZADH2 y la actividad se determina midiendo la actividad enzimática de PGR3/ZADH2 de la solución libre de células. En la siguiente descripción se exponen los detalles de una o más modalidades de esta invención. Otras características, objetivos y ventajas de la invención se pondrán de manifiesto en la descripción y en las reivindicaciones.

Descripción Detallada La presente invención se basa en el descubrimiento de que la 15-ceto prostaglandina-?13-reductasa 3 (PGR3/ZADH2), un miembro de la familia de 15-ceto prostaglandina-?13-reductasa. Se ha encontrado, con sorpresa, que la actividad de PPAR puede ser controlada mediante sus sustratos e inhibidores. Estos sustratos e inhibidores son útiles para el tratamiento de las enfermedades relacionadas con el PPAR, por ejemplo la diabetes de tipo i l , obesidad, dislipidemia, enfermedad cardiaca coronaria, enfermedad inflamatoria y cáncer. Dentro del alcance de esta invención se contempla un polipéptido humano aislado de SEQ. I D. NO: 1 o su equivalente funcional, que reduce la 15-ceto prostaglandina. A continuación se presenta una secuencia de aminoácidos (SEQ. I D. NO: 1 ), así como la secuencia nucleotídica que la codifica (es decir, SEQ . ID. NO: 2). 1 M L R L V P T G A R A I V D M S Y A R H 1 ATGCTGCGGCTGGTGCCCACCGGGGCCCGGGCCATCGTGGACATGTCGTACGCCCGCCAC 21 F D F Q G S A I P Q A M Q K L V V T R 61 TTCCTGGACTTCCAGGGCTCCGCCATTCCCCAAGCCATGCAGAAGCTGGTGGTGACCCGG 41 S P N F R E A V T S R D C P V P P 121 CTGAGCCCCAACTTCCGCGAGGCCGTCACCCTGAGCCGGGACTGCCCGGTGCCGCTCCCC 61 G D G D L L V R N R F V G V ÍT A S D I N 181 GGGGACGGAGACCTCCTCGTCCGGAACCGATTTGTTGGTGTTAACGCATCTGACATCAAC 81 Y S A G R Y D P S V K P P F D I G F E G 241 TATTCAGCAGGCCGCTATGACCCCTCAGTTAAGCCTCCCTTTGACATAGGTTTCGAAGGC 101 I G E V V A G L S A S A R Y T V G Q A 301 ATTGGGGAGGTGGTGGCCCTAGGCCTCTCTGCTAGTGCCAGATACACAGTTGGCCAAGCT 121 V A Y A P G S F A E Y T V V P A S I A 361 GTGGCTTACATGGCACCTGGTTCTTTTGCTGAGTACACAGTTGTGCCTGCCAGCATTGCA 141 T P V P S V K P E Y L T L V S G T T A 421 ACTCCAGTGCCCTCAGTGAAACCCGAGTATCTTACCCTGCTGGTAAGTGGCACCACCGCA 161 Y I S K E L G G L S E G K K V V T A 481 TACATCAGCCTGAAAGAGCTCGGAGGACTGTCGGAAGGGAAAAAAGTTTTGGTGACAGCA 181 A A G G T G Q F A M Q L S K K A K C H V 541 GCAGCTGGGGGAACGGGCCAGTTTGCCATGCAGCTTTCAAAGAAGGCAAAGTGCCATGTA 201 I G T C S S D E K S A F L K S L G C D R 601 ATTGGAACCTGCTCTTCTGATGAAAAGTCTGCTTTTCTGAAATCTCTTGGCTGTGATCGT 221 P I N Y K T E P V G T V K Q E Y P E G 661 CCTATCAACTATAAAACTGAACCCGTAGGTACCGTCCTTAAGCAGGAGTACCCTGAAGGT 241 V D V V Y E S V G G A M F D L A V D A L 721 GTCGATGTGGTCTATGAATCTGTTGGGGGAGCCATGTTTGACTTGGCTGTAGACGCCCTG 261 A T K G R L I V 1- G F I S G Y Q T P T G 781 GCTACGAAAGGGCGCTTGATAGTAATAGGGTTTATCTCTGGCTACCAAACTCCTACTGGC 281 L S P V K A G T I. P A K K S A S V 841 CTTTCGCCTGTGAAAGCAGGAACATTGCCAGCCAAACTGCTCAAGAAATCTGCCAGCGTA 301 Q G F F N H Y L S Y Q A A M S H L 901 CAGGGCTTCTTCCTGAACCATTACCTTTCTAAGTATCAAGCAGCCATGAGCCACTTGCTC 321 E M C V S G D '- V C E V D G D L S P E 961 GAGATGTGTGTGAGCGGAGACCTGGTTTGTGAGGTGGACCTTGGAGATCTGTCTCCAGAG 341 G R t T G E S i' F R A V N Y M Y M G K 1021 GGCAGGTTTACTGGCCTGGAGTCCATATTCCGTGCTGTCAATTATATGTACATGGGAAAA 361 N T G K I V V E L P H S V N S K L SEQ ID NO-.l 1081 AACACTGGAAAAATTGTAGTTGAATTACCTCACTCTGTCAACAGTAAGCTGTAA SEQ ID NO:2 También está dentro del alcance de esta invención un polipéptido aislado de ratón o su equivalente funcional que reduce la 15-ceto prostaglandina. A continuación se presenta la secuencia de aminoácidos del polipéptido de ratón (SEQ . I D . NO: 3) , así como la secuencia n ucleotíd ica que la codifica (es decir, SEQ . I D. NO: 4) .

SEQ ID NO:3 M R AAAGARAIVDMSYARHFLDFQGSAIPRTMQKLWTRLSPNFHEAVT RRDCPVP PGDGDLLVRNRF VGINASDINYSAGRYDPSLKPPFDIGFEGIGE A GLSASARYTVGQAVAYMAPGSFAEYTVVPASIAIP MPSVKPEYLTMLVSGTTAYLS EELGELSEGKKVLVTAAAGGTGQFAVQLSKIAKCHVIGTCSSDE AAFL KSIGCDRPINYRTEPVETVLKQEYPEGVDVVYESVGGAMFDLAVDALATKGR IVIGFISGYQSPTGLSPI KAGVLPTKLLKKSASIÍRGFF NHYFSKYQAAMERL ELYARGDLVCEVDLGHLAPDGRFIGIJESVFQAVDY MYTGKNTGKLWELPHPVSSKL SEQ IDNO:4 at gctgaggctg gcggccgccg gggcccgagc catcgtggac atgtcgtacg 53 cccgtcactt cctggacttc cagggctccg ccatcccccg aaccatgcag aagctggtgg 113 tgacccggct gagccctaac ttccacgagg ccgtcaccct gcgccgggac tgcccagtgc 173 cgctccccgg ggacggagac ctcctcgtcc ggaaccgatt cgttggtatt aacgcatctg 233 acatcaacta ttcggctggc cgctacgacc cgtccctgaa gccacccttt gacataggtt 293 ttgaagggat tggtgaggtg gtggccttag gcctctctgc tagtgctagg tacacagtgg 353 gccaggctgt ggcttatatg gctcctggtt cctttgctga gtatacagtg gtgcctgcta 413 gcattgcaat tcccatgcct tcagtgaaac cagagtatct caccatgctg gttagtggca 473 ccactgcata cctcagcctg gaagagcttg gggaactgtc agaagggaag aaagttctgg 533 tcacagcagc cgctgggggc acaggccagt ttgctgtgca gctttccaag atagccaagt 593 gccacgttat cggaacctgc tcctcagacg aaaaggcagc ttttctgaaa tcaattgggt 653 gtgatcggcc catcaactac agaacagagc ctgtggagac ggttctgaag caggagtacc 713 ctgaaggcgt tgacgtagtc tatgagtccg ttgggggagc catgtttgac ctggctgtgg 773 atgccttggc caccaaaggg cgcttgatag tgattgggtt tatctctggc taccaaagcc 833 ctacaggact ctcaccaata aaagcgggag ttttgccaac caagctcctg aagaagtcgg 893 ccagcctcag gggtttcttt ctgaaccact acttctccaa gtaccaggct gccatggaac 953 gtttgctgga gctgtacgct cgtggggacc tggtgtgtga ggtggacctg ggacacctgg 1013 ctccggatgg aaggttcatt ggcctggagt ccgtgtttca ggctgtcgac tatatgtaca 1073 cggggaaaaa tactgggaag cttgttgttg agttaccaca ccctgtcagc agtaagctgt 1133 ga U n polipéptido aislado se refiere a un polipéptido sustancialmente libre de moléculas asociadas naturalmente, es decir que tiene una pureza de por lo menos 75% (es decir, cualq uier número entre 75% y 1 00% inclusive) en peso seco. La pureza se puede medir mediante cualquier método estándar apropiado , por ejemplo por cromatografía en columna, electroforesis en gel de políacrilamida o análisis de H P LC . U n polipéptido aislado de acuerdo con esta invención puede ser purificado de una fuente natural , producido por técnicas de ADN recombinante o por métodos químicos. El término "equivalente funcional" se refiere a una variante de un polipéptido de SEQ. ID. NO: 1 o SEQ. ID. NO: 3 que posee la capacidad de reducir la 15-ceto prostaglandina, por ejemplo una proteína que tiene una o más mutaciones de punto, inserciones, eliminaciones, truncamientos o una combinación de los mismos. En una modalidad, un polipéptido aislado de la invención o su equivalente funcional contiene una secuencia que es por lo menos 80% (por ejemplo 85%, 95% o 100%, o cualquier otro número comprendido entre 80% y 100% inclusive) idéntica a SEQ. ID. NO: 1 o SEQ. ID. NO: 3. Puede consistir en una proteína de fusión. Actividad de 15-ceto prostaglandina-?13-reductasa se refiere a la conversión enzimática de 15-ceto prostaglandina a 13,14-dihidro-15-ceto prostaglandina. La actividad específica se determina de la siguiente manera: se incuban 10 µg de la preparación proteica que se debe analizar a 37°C en un regulador de reacción que contiene Tris-HCl 0,1 M (pH 7,4), NADPH 0,5 mM y 15-ceto PGE20,57 mM. La reacción se lleva a cabo en la oscuridad por espacio de 10 minutos a 37°C y se la da por terminada mediante el agregado de 700 µl de un regulador que contiene hidrógeno ftalato de potasio 50 mM, pH 3,0 y 1% de Tween 20. Se utilizan 200 µl dé un reactivo revelador de color, que contiene cloruro de indonitrotetrazolio 790 µM, metosulfato de fenaceno 60 µM y 1% de Tween 20 para oxidar el NADPH que pueda quedar sin reaccionar. Se mide la absorbancia a 490 nm utilizando un lector de placas de ELISA. Se genera una curva estándar utilizando reguladores de reacción que contienen cantidades de NADPH diluidas en serie. Una actividad específica de por lo menos 90 nmol/min.mg de proteína indica que el polipéptido tiene actividad de 15-ceto prostaglandina-?13-reductasa. Se puede utilizar la secuencia de nucleótidos antes descrita, es decir, SEQ. ID. NO: 2 o SEQ. ID. NO: 4 para expresar el 'polipéptido de esta invención. Una secuencia de nucleótidos se refiere a una molécula de ADN (por ejemplo, ADNc o ADN genómico), una molécula de ARN (por ejemplo un ARNm) o un análogo de ADN o ARN. Un análogo de ADN o ARN se puede sintetizar a partir de análogos de nucleótidos. La molécula de ácido nucleico puede ser de una sola hebra o doble hebra, aunque preferentemente es de doble hebra. A los efectos de la expresión de proteínas, se puede ligar operativamente el ácido nucleico a secuencias reguladoras adecuadas a fin de generar un vector de expresión. Un vector se refiere a una molécula de ácido nucleico con capacidad para transportar otro ácido nucleico al cual se la ha ligado. El vector puede tener capacidad para la replicación autónoma o integrarse a un ADN huésped. Entre los ejemplos de vectores se incluye un plásmido, un cósmido o un vector viral. El vector puede incluir una secuencia de nucieótidos en una forma adecuada para la expresión del ácido nucleico en una célula huésped. De preferencia, el vector incluye una o más secuencias reguladoras operativamente ligadas a la secuencia de ácido nucleico a expresar. Una "secuencia reguladora" incluye promotores, potenciadores y otros elementos para el control de la expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación). Las secuencias reguladoras incluyen aquellas que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos así como secuencias reguladoras de tejidos específicos y/o inducibles. El diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula huésped a transformar, el nivel de expresión de la proteína buscada y demás. El vector de expresión se puede introducir en las células huésped para producir el polipéptido de esta invención. También está dentro del alcance de esta invención una célula huésped que contiene el ácido nucleico antes descrito. Entre los ejemplos se cuentan las células de E. coli, las células de insectos Sf9 (por ejemplo, utilizando vectores de expresión de baculovirus), células de levadura o células de mamífero. Ver, por ejemplo, Goeddel, (1990) Gene Expressíon Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA. Para producir un polipéptido de esta invención, se puede cultivar una célula huésped en un medio en condiciones que permitan la expresión dei polipéptido codificado por un ácido nucleico de esta invención y purificar el polipéptido de la célula cultivada o del medio de la célula. Por otro lado, se puede transcribir y traducir la secuencia de nucleótidos in vitro, por ejemplo utilizando secuencias reguladoras promotoras de T7 y T7 polimerasa. El polipéptido precedentemente descrito se puede utilizar para generar anticuerpos en los animales. Se entiende que los anticuerpos también pueden ser generados a partir de un fragmento del polipéptido. Los métodos para la preparación de anticuerpos monoclonales y policlonales y fragmentos de los mismos en animales son conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Harlow and Lañe, (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York. El término "anticuerpo" incluye moléculas intactas así como fragmentos de los mismos tales como Fab, F(ab')2, Fv, scFv (anticuerpo de cadena simple) y dAb (anticuerpo de dominio; Ward , et. al. (1989) Nature, 341 , 544). En general, se puede acoplar un polipéptido de esta invención a una proteína portadora tal como KLH , mezclarlo con un adyuvante e inyectarlo en un animal huésped. A continuación se pueden purificar los anticuerpos producidos en ese animal por cromatografía de afinidad de péptidos. Entre los animales huésped empleados comúnmente se incluyen conejos, ratones, conejillos de Indias y ratas. Los diversos adyuvantes que se pueden emplear para incrementar la respuesta inmunológica dependen de la especie huésped e incluyen adyuvante de Freund (tanto completo como incompleto), geles minerales tales como hidróxido de aluminio, sustancias tensioactivas tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones oleosas, hemocianina de lapa calada y dinitrofenol. Los adyuvantes humanos ventajosos incluyen BCG (bacillo de Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum. Hay anticuerpos policlonales, poblaciones heterogéneas de moléculas de anticuerpos presentes en los sueros de los sujetos inmunizados. Se pueden preparar anticuerpos monoclonales, poblaciones homogéneas de anticuerpos para un polipéptido de esta invención , utilizando tecnología estándar de hibridomas (ver, por ejemplo, Kohier eí al. (1975) Nature 256, 495; Kohier et al. (1976) Eur J Immunol 6, 51 1 ; Kohier et al. (1976) Eur J Immunol 6, 292 y Hammerling et al. (1981 ) Monoclonal Antibodíes and T Cell Hybridomas, Elsevier, N .Y.). Específicamente, se pueden obtener anticuerpos monoclonales por cualquier técnica que dé lugar a la producción de moléculas de anticuerpos por líneas celulares continuas en cultivos tales como los descritos por Kohier eí al. (1975) Nature 256, 495 y en la Patente de EE. U U. No. 4.376.1 10, la técnica de hibridoma de células B humanas (Kosbor eí al. (1983) Immunol Today 4, 72; Colé eí al. (1983) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 80, 2026 la técnica de hibridoma EBV (Colé eí al. (1983) Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, Inc. , pp. 77-96). Dichos anticuerpos pueden ser de cualquier clase de ¡nmunoglobuiinas, incluyendo IgG , IgM , IgE, IgA, IgD y cualquier subclase de las mismas. El hibridoma que produce los anticuerpos monoclonales de esta invención se puede cultivar in vitro o in vivo. La capacidad para producir altos títulos de anticuerpos monoclonales in vivo hace que éste sea un método de producción particularmente útil. Además, se pueden utilizar las técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos". Ver, por ejemplo, Morrison ef al. (1984) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81 , 6851 ; Neuberger eí al. (1984) Nature 312, 604 y Takeda eí al. (1984) Nature 314:452. Un anticuerpo quimérico es una molécula en la cual se obtienen diferentes porciones de diferentes especies animales, como las que tienen una región variable derivada de un anticuerpo monoclonal murino y una región constante de inmunoglobulina humana. Por otro lado, las técnicas descritas con respecto a la producción de anticuerpos de cadena simple (Patentes de EE.UU. Nos 4.946.778 y 4.704.692) pueden ser adaptadas para la producción de una biblioteca de fagos de anticuerpos Fv de cadena simple. Los anticuerpos de cadena simple se forman ligando los fragmentos de cadena pesada y liviana de la región Fv por medio de un puente de aminoácidos. Más aun, se pueden generar fragmentos de anticuerpos por técnicas conocidas. Por ejemplo, dichos fragmentos incluyen, aunque no a modo de limitación, los fragmentos F(ab')2 que se pueden producir por medio de digestión con pepsina de una molécula de anticuerpo y los fragmentos Fab que se puede generar reduciendo los puentes de disulfuro de los fragmentos F(ab')2. Los anticuerpos también pueden ser humanizados por métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se pueden humanizar comercialmente los anticuerpos monoclonales con una especificidad de enlace pretendida (Scotgene, Scotland y Oxford Molecular, Palo Alto, Calif.). Los anticuerpos completamente humanos tales como los expresados en animales transgénicos también son características de la invención (ver, por ejemplo, Green eí al. (1994) Nature Genetics 7, 13 y las Patentes de EE.UU. Nos.5.545.806 y 5.569.825). También está dentro del alcance de esta invención un ácido ribonucleico de doble hebra (ARNds). Este ARNds se puede utilizar para inhibir la expresión de PGR3/ZADH2. Por consiguiente, se puede tratar una enfermedad relacionada con PPAR administrando el ARNds a un sujeto. El término "ARNds" se refiere a un ácido ribonucleico de doble hebra que silencia la expresión génica por medio de la degradación de una secuencia de ARN especificada, un proceso que se conoce como interferencia de ARN (¡ARN). La iARN se ha utilizado para silenciar la expresión génica en una amplia variedad de modelos animales (incluyendo embriones de C. elegans, pez cebra y ratón) así como en otros sistemas biológicos (incluyendo células neurales extraídas de pollo y cultivo de células de mamífero). Ver WO99/32619, WO00/44914, WO00/44914, WO00/44895, WO00/63364 y WO01/36646 A1. El ARN de esta invención se puede sintetizar mediante técnicas muy conocidas en el medio. Ver, por ejemplo, Caruthers eí al., 1992, Methods in Enzymology 211, 3-19, Wincott eí al., 1995, Nucleic Acids Res.23, 2677-2684, Wincott eí al., 1997, Methods Mol. Bio. 74, 59, Brennan eí al., 1998, Biotechnol Bioeng., 61, 33-45 y Brennan, Patente de EE.UU. No. 6.001.311. El ARN también puede ser transcrito de un vector de expresión y aislado utilizando técnicas estándar. El ARN o vector de acuerdo con esta invención puede ser trasladado a las células objetivo utilizando métodos que también son muy conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Akhtar eí al., 1992, Trends Cell Bio. 2, 139. Por ejemplo, se puede introducir en las células empleando liposomas, hidrogeles, ciclodextrinas, nanocápsulas biodegradables o microesferas bioadhesivas. Por otro lado, se administra el ARN o vector en forma local mediante inyección directa o mediante el uso de una bomba de infusión. Otros planteamientos incluyen el uso de diversos sistemas de transporte y portadores, por ejemplo utilizando conjugados y polímeros biodegradables. Esta invención da a conocer, asimismo, un método para el tratamiento de las enfermedades relacionadas con el PPAR mediante la modulación de la actividad o la expresión de PGR3/ZADH2. El término "tratamiento" se refiere a la administración de uno o más de los moduladores de PGR3/ZADH2 mencionados precedentemente, es decir sustratos e inhibidores de PGR3/ZADH2, a un sujeto que padece una enfermedad relacionada con el PPAR, un síntoma de dicha enfermedad o una predisposición a dicha enfermedad, con el propósito de producir un efecto terapéutico, por ejemplo curar, aliviar, alterar, afectar, mitigar o prevenir la enfermedad relacionada con el PPAR, el síntoma de la misma o la predisposición a la misma. Una "cantidad efectiva" se refiere a la cantidad que se necesita para conferir un efecto terapéutico a un sujeto en tratamiento. U n sustrato de PGR3/ZADH2 incluye 15-ceto PGE2, 15-ceto PGE-,, 15-ceto PGF2a, 15-ceto PGF1 a, y análogos estructurales de los mismos. Entre los ejemplos de enfermedades (o desórdenes o trastornos) relacionados con PPAR se incluyen , aunque no a modo de limitación , diabetes de tipo I I , hipergiucemia, baja tolerancia a la glucosa, Síndrome X, resistencia a la insulina, obesidad, trastornos de los lípidos, dislipidemia, hipertrigliceridemia, hipercolesterolemia, bajos niveles de HDL, altos niveles de LDL, aterosclerosis (y sus secuelas, tales como angina, claudicación, ataque cardiaco o accidente cerebrovascular), restenosis vascular, síndrome de intestino irritable, enfermedades inflamatorias (por ejemplo enfermedad inflamatoria intestinal, artritis reumatoidea, enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, osteoartritis, esclerosis múltiple, asma, vasculitis, lesión isquémica/por reperfusión, quemaduras por congelamiento o síndrome de insuficiencia respiratoria del adulto), pancreatitis, enfermedad neurodegenerativa, retinopatía, trastornos neoplásicos, cánceres (por ejemplo cáncer de próstata, gástrico, de mamas, vejiga, pulmón o colon o cáncer de células adiposas tales como liposarcoma), angiogénesis, enfermedad de Alzheímer, trastornos cutáneos (por ejemplo acné, psoriasis, dermatitis, excema o queratosis), hipertensión, hiperandrogenismo ovárico, osteoporosis y osteopenia. Para tratar una enfermedad relacionada con PPAR, se puede administrar una composición farmacéutica que contiene un modulador de PGR3/ZADH2 y un vehículo farmacéuticamente aceptable a un sujeto que lo necesita. Se puede administrar por vía oral o por infusión intravenosa o inyectar o implantar por vía subcutánea, intramuscular, ¡ntratecal, intraperitoneal, ¡ntrarectal, intravaginal, intranasal, intragástrica, intratraqueal o intrapulmonar.

La composición farmacéutica puede ser una solución o suspensión en un diluyente o solvente no tóxico aceptable tal como una solución en 1 ,3-butand iol . Entre los veh ícu los y solventes aceptables que se pueden emplear se cuentan manitol , agua, solución de Ringer y solución isotónica de cloruro de sodio . Además, los aceites fijos se utilizan co nvencionalmente como un solvente o medio de suspensión (por ejemplo mono- o dig licéridos sintéticos) . El ácido g raso tal como el ácido oleico y sus glicéridos derivad os sirven para la preparación de inyectables, al igual que los aceites naturales farmacéuticamente aceptables tales como el aceite de oliva o el aceite de ricino , especialmente en sus versiones polioxietiladas . Estas soluciones o suspensiones oleosas también pueden contener un diluyente o dispersante alcohólico de cadena larga , carboximetilcelulosa o agentes dispersantes similares. También se pueden utilizar otros tensioactivos utilizados com únmente tales como Tweens o Spans u otros agentes emulsionantes o potenciadores de la biodispon íbilidad similares que se utilizan comú nmente en la elaboración de formas sólidas, l íquidas aceptables desde el punto de vista farmacéutico u otras formas de dosificación para contribuir a la formulación . La dosis necesaria depende de la elección de la vía de admin istración , de las características de la formulación , de la natu raleza de la enfermedad del sujeto, del tamaño del sujeto , su peso, área superficial, edad y sexo , otros fármacos q ue se estén admin istrando y el criterio del médico a cargo. Las dosis adecuadas pueden estar en el rango de 0, 01 -1 00, 0 mg/kg . Se han de contemplar amplias variaciones de la dosis necesaria en vista de la variedad de composiciones disponibles y de las diferentes eficiencias de las diversas vías de administración. Las variaciones de estos niveles de dosificación pueden ser ajustadas utilizando rutinas empíricas normales para la optimización , como es de conocimiento de los técnicos. La encapsulación de la composición en un vehículo de administración adecuado (por ejemplo, micropartículas poliméricas o dispositivos implantables) puede aumentar la eficiencia de la administración, especialmente en el caso de la administración oral. La composición farmacéutica antes descrita se puede formular para obtener formas de dosificación para diferentes vías de administración utilizando métodos convencionales. Por ejemplo, se puede formular en una cápsula , un sello de gel o un comprimido para la administración oral. Las cápsulas pueden contener cualquier material normal farmacéuticamente aceptable tal como gelatina o celulosa. Los comprimidos pueden ser formulados de acuerdo con procedimientos convencionales, comprimiendo mezclas de la composición con un vehículo sólido y un lubricante. Entre los ejemplos de veh ículos sólidos se cuentan almidón y bentonita azucarada. También se puede administrar la composición en forma de un comprimido de cascara dura o una cápsula que contiene un aglutinante, por ejemplo lactosa o manitol, un material de carga convencional y un agente de tableteado. La composición farmacéutica se puede administrar por la vía parenteral. Entre los ejemplos de formas de dosificación parenteral se incluyen las soluciones acuosas, salina isotónica o glucosa al 5% del agente activo u otro excipiente muy conocido y aceptable desde el punto de vista farmacéutico. Se pueden util izar ciclodextrinas u otros agentes solubilizantes m uy conocidos con las personas familiarizadas con la técnica como excipientes farmacéuticos para la administración del agente terapéutico. La eficacia de la composición fa rmacéutica a ntes descrita puede ser evaluada tanto in vitro como in vivo. En pocas palabras, la composición farmacéutica puede ser analizada en cuanto a su capacidad para in hibir la actividad o expresión de PG R3/ZADH2 in 'Í?O. En el caso de los estudios in vivo, la composición farmacéutica puede ser inyectada en un animal (por ejemplo, un modelo de ratón) para luego evaluar sus efectos terapéuticos. Basándose en los resultados, se puede determinar un rango de dosificación y una ruta de administración apropiados La invención da a conocer, además , u n método para identificar un com puesto para la in hibición de la actividad o expresión de PG R3/ZAD H2. Se puede diseñar el compuesto, por ejemplo, utilizando programas de modelación por computadora , de acuerdo con la conformación tridimensional del polipéptido y sintetizarlo utilizando métodos conocidos en la técnica . También se puede identificar mediante selección de bibl ioteca , u obtenerse utilizando cualq uiera de los n umerosos enfoques en métodos de combinación de bibliotecas conocidos en la técnica. Entre las bibliotecas adecuadas se cuentan , bibliotecas de péptidos , bibliotecas de peptoides (bibliotecas de moléculas q ue tienen las funcionalidades de péptidos, aunque con una estructura principal novedosa, no peptídica, que es resistente a la degradación enzimática) bibliotecas en fase sólida o en fase de solución paralelas controlables espacialmente, bibliotecas sintéticas obtenidas mediante desconvolución o selección por cromatografía de afinidad, las bibliotecas de "una perla y un compuesto" y bibliotecas de anticuerpos. Ver, por ejemplo, Zuckermann et al. (1994) J. Med. Chem. 37, 2678-85; Lam (1997) Anticancer Drug Des. 12, 145; Lam eí al. (1991) Nature 354, 82; Houghten eí al. (1991) Nature 354, 84 y Songyang eí al. (1993) Cell 72, 767. Se pueden encontrar ejemplos de métodos para la síntesis de bibliotecas moleculares en la técnica, por ejemplo en: DeWitt eí al. (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90, 6909; Erb eí al. (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91, 11422; Zuckermann eí al. (1994) J. Med. Chem. 37, 2678; Cho eí al. (1993) Science 261, 1303; Carrell eí al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2059; Carell eí al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2061 y Gallop eí al. (1994) J. Med. Chem. 37,1233. Las bibliotecas de compuestos se pueden presentar en solución (por ejemplo, Houghten (1992) Biotechniques 13, 412-421), o en perlas (Lam (1991) Nature 354, 82-84), virutas (Fodor (1993) Nature 364, 555-556), bacterias (Patente de EE.UU. No. 5.223.409), esporas (Patente de EE.UU. No. 5.223.409), plásmidos (Culi eí al. (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89, 1865-1869) o fagos (Scott and Smith (1990) Science 249, 386-390; Devlin (1990) Science 249, 404-406; Cwirla eí al. (1990) Proc. Nati. Acad. Scí. USA 87, 6378-6382; Felici (1991) J. Mol. Biol. 222, 301-310 y Patente de EE.UU. No.5.223.409). Los siguientes ejemplos específicos deben considerarse meramente ilustrativos y no limitativos del resto de la memoria descriptiva de manera alguna. Sin más elaboración, se cree que una persona con capacitación en la materia puede utilizar esta invención en su máxima expresión basándose en la descripción aquí presentada. Todas las publicaciones citadas en este documento se incorporan a la presente como referencia en su totalidad.

Eiemplo 1. Identificación de una novedosa 15-ceto prostaglandina-?13-reductasa Se hizo referencia a las secuencias de ADNc completas correspondientes a las regiones codificantes de los genes del GenBank, No. de Acceso NM146090 y BC033780 como PGR3/ZADH2 de ratón y PGR3/ZADH2 humana, respectivamente. Se preparó ADNc de PGR3/ZADH2 de ratón utilizando ARNm extraído de adipocitos 3T3-L1 por PCR y se ligó a un vector pGEM-T easy (Promega) por medio de ligasa T4 ADN (Promega). A continuación se presentan las secuencias de los cebadores directo/inverso para la obtención de la PGR3/ZADH2 de ratón y humana: Ratón: Directo 5'-ATTGGATCCCAAATGCTGAGGCTGGCGGCC-3' (SEC. ID NO:5) Inverso 5'-ACGATGAATTCACAGCTTACTGCTGACAG-3' (SEC. ID NO:6) Humano: Directo 5'-CGCGGATCCTTATGCTGCGGCTGGTGCCCAC- 3'(SEC. ID NO:7) Inverso d'-CCGGAATTCTTACAGCTTACTGTTGACAGAGTG-3'(SEC. ID NO:8). La secuencia de aminoácidos deducida de PGR3/ZADH2 humana (SEQ. ID. NO: 1) y de ratón (SEQ. ID. NO: 3) ya han sido expuestas anteriormente. Se encontró que la PGR3/ZADH2 de ratón era homologa de ZADH1 humana (GenBank, No. de acceso NM152444) aunque sin similitud considerable. La expresión de PGR3/ZADH2 se incrementó durante la adipogénesis en las células 3T3-L1. La expresión máxima se observó el día 3 después de la inducción de la adipogénesis. En este momento, se observó que las gotas de lípido se acumulaban en forma extensiva en los adipocitos. Se detectó el nivel máximo de proteína PGR3/ZADH2 en adipocitos totalmente diferenciados. También se encontró que se inducía acentuadamente el PPAR-gamma en una etapa más precoz de la adipogénesis. También se determinó la distribución tisular de PGR3/ZADH2. Se expresó altamente en tejido adiposo. La cantidad de ARNm de PGR3/ZADH2 en la grasa omental fue considerablemente más elevada, tanto en ratones db/db homozigotos como heterozigotos, que en los ratones de tipos salvaje. Tanto las proteínas PGR3/ZADH2 de humano como de ratón fueron expresadas recombinantemente en E. coli como proteínas de fusión GST siguiendo procedimientos estándar. Las proteínas PGR3/ZADH2 reocmbinantes así obtenidas se utilizaron para determinar la especificidad por los sustratos y la cinética enzimática. Se determinó la actividad enzimática de la siguiente manera. Se incubaron 10 µg de la proteína recombinante PGR3/ZADH2 o humana a 37°C en un regulador de reacción que contenía Tris-HCl 0,1 M (pH 7,4), NADPH 0,5 mM y 15-ceto PGE20,57 mM. La reacción se llevó a cabo a 37°C en la oscuridad por espacio de 10 minutos y se la dio por terminada mediante la adición de 700 µl de un regulador que contenía hidrógeno ftalato de potasio 50 mM, pH 3,0 y 1% de Tween 20. Se agregaron 200 µl de un reactivo revelador de color, que contenía cloruro de ¡ndonitrotetrazol?o 790 µM, metosulfato de fenaceno 60 µM y 1% de Tween 20 para oxidar el NADPH que pudiera haber quedado sin reaccionar. Se mide la absorbancia a 490 nm utilizando un lector de placas de ELISA. Se generó una curva estándar utilizando reguladores de reacción que contenían cantidades de NADPH diluidas en serie. Se determinó la especificidad de PGR3/ZADH2 por los sustratos utilizando el procedimiento que acaba de describirse, excepto que se reemplazó la 15-ceto PGE2 con cada uno de seis sustratos de prostaglandina, cada uno de tres metabolitos posteriores o leucotrieno B4. 15-ceto PGE-i, 15-ceto PGF?tt? y 15-ceto PGF2a reaccionaron específicamente con PGR-3. Por el contrario, no se detectó actividad específica causada por 6-ceto PGF1a, PGF2p, 11b-PGF2a, 13,14-dihidro-15-ceto PGF2a, 13,14-dihidro-15-ceto PGD2, 13,14-dihidro-15-ceto PGE2, ni leucotrieno B4. También se investigó el efecto de la expresión de PGR3/ZADH2 sobre la modulación de la transcripción de PPAR-gamma en células Hep3B humanas, que expresaban PPAR-alfa y gama humanos endógenos. Se encontró que la sobreexpresión de PGR3/ZADH2 en células Hep3B suprimía la activación de la transcripción mediada por PPAR. También se suprimió la activación de la transcripción incluso una vez que las células Hep3B habían sido estimuladas por un agonista de PPAR-gamma, es decir BRL 49653. Se obtuvieron similares resultados en células 3T3-L1. Eiemplo 2 - Prostaqlandina Se investigó el efecto de la prostaglandina sobre la actividad de PPAR-gamma en los adipocitos. Después del tratamiento con un medio que induce la diferenciación celular, se trataron células 3T3-L1 desde el día 2 a 4 durante la adipogénesis con 14 µM 15-ceto PGE2, 13,14-dihidro-15-ceto PGE2, 15-ceto PGF2a, 13,14-dihidro-15-ceto PGF2o o 4,5 µM de BRL49653, un agonista de PPAR-gamma. Ver Forman eí al., Cell (1995) 83:803-812. El día 6, se tiñeron agregados de gotas de lípido con aceite - O rojo para su observación. La 15-ceto PGE2 efectivamente potenció la angiogénesis en un nivel similar a BRL49653. Después de ser inducidas a diferenciarse por espacio de dos días, las células 3T3-L1 fueron transfectadas con un gen reportero. Tanto 15-ceto PGE2 como 15-ceto PGE2a potenciaron de manera considerable la actividad de PPAR endógeno. Por el contrario, los metabolitos posteriores correspondientes, es decir, 13,14-dihidro-15-ceto PGE2 y 13,14-dihidro-15-ceto PGF2a, no incrementaron la actividad de PPAR. Se transfectó un gen reportero de luciferasa a células 3T3-L1 junto con el dominio de enlace al ligando de PPAR-alfa, PPAR-gamma o PPAR-delta fusionada a un dominio de enlace de ADN GAL4 de levadura. 15-ceto PGE2 y 15-ceto PGF2a activaron PPAR-gamma y, en menor grado, PPAR-alfa. También se examinó la capacidad de 15-ceto PGE2 para inducir la expresión proteica de genes objetivo específicos para la adipogénesis PPAR-gamma, es decir IRS-1 y -2. Se detectaron cantidades sustanciales de proteína PPAR-gamma1 y PPAR-gamma 2 en células 3T3-L1 cuando se trataron con insulina y dexametasona, aunque no metilisobutilxantina (MIX) sola. La adición de 15-ceto PGE2 y MIX con insulina y dexametasona aumentó significativamente la expresión de PPAR-gamma1 y PPAR-gamma2. 15-ceto PGE2 y BRL49653 indujeron fuertemente la expresión de aP2, un marcador específico de los adipocitos, incluso en ausencia de MIX. En presencia de insulina y dexametasona, el tratamiento con BRL49653 incrementó drásticamente la expresión de IRS-2. 15-ceto PGE2 incrementó significativamente la expresión en un nivel similar a la MIX. La ínsulina/dexametasona o MIX indujeron la expresión de IRS-1. Los ligandos de PPAR-gamma que incluían 15-ceto PGE2 y BRL49653 no incrementaron la cantidad de proteína IRS-1. Eiemplo 3. Inhibidores de pequeñas moléculas PGR3/ZADH2 Se expresó la proteína PGR3/ZADH2 recombinante humana y se examinó la actividad enzimática. Al igual que la PGR3/ZADH2 de ratón, la PGR3/ZADH2 recombinante humana tenía actividad de 15-ceto-prostaglandina-?13-reductasa y conversión catalizada de 15-ceto prostaglandina a 13,14-dihidro-15-ceto prostaglandinas. Se analizó a los compuestos 1-49 para determinar sus efectos inhibitorios sobre la actividad de PGR3/ZADH2. Estos compuestos se pueden obtener en el comercio (por ejemplo, de Sigma-Aidrich, St. Louis, MO) o se pueden preparar por métodos conocidos en la técnica. Se realizó el ensayo de inhibición siguiendo el procedimiento descrito anteriormente. Se agregaron diferentes concentraciones de inhibidores de PGR3/ZADH2 a la mezcla de reacción y se incubó por espacio de 2 horas a 37°C. Más específicamente, se agregaron 50 µM de los compuestos 8, 12, 13 y 27 y 25 µM de tri-fluorobencíl-2-hidroxicinnamato (compuesto 22) al sistema de reacción de la enzima PGR3/ZADH2 y se midió la capacidad de la enzima para reducir la 15-ceto-PGE2. Los resultados están resumidos en las Tablas 1 y 2 a continuación. Tabla 1 Tabla 2 Como se demuestra en las Tablas 1 y 2, la actividad de 15-ceto-prostaglandina-?13-reductasa de PGR3/ZADH2 fue inhibida por los cinco compuestos mencionados. Además, se encontró que todos los compuestos 1-7, 9-11, 14-26 y 28-49, en una concentración de 50 µM, inhibían la actividad en más de 20%. Eiemplo 4. Efectos de los inhibidores de PGR3/ZADH2 sobre la sensibilidad a la insulina Se examinó el efecto de dos de los inhibidores mencionados de PGR3/ZADH2, es decir los compuestos 12 y 28, sobre la sensibilidad de la insulina de la siguiente manera. Se indujo a células 3T3-L1 para diferenciarse de la misma manera antes descrita. Se realizó un ensayo de transporte de glucosa midiendo la captación de 2-deoxi-D-[3H]glucosa de acuerdo con el método descrito por Fingar eí al. (Endocrinology 134:728-735). Se agregaron 1,67 µM del inhibidor o 45 nM de un agonista de PPAR-gama, es decir AVANDIA, a las células. Se utilizaron 10 µM de citocalasina-B para medir los niveles de fondo de captación de glucosa. Se utilizó insulina 100 nM para estimular la captación de glucosa. El tratamiento con insulina sola en las células 3T3-L1 diferenciadas incrementó la captación de glucosa en más de 10 veces. En presencia de uno de esos dos inhibidores de PGR3/ZADH2, la captación de glucosa se incrementó 30 veces. Se encontró que la capacidad de estos inhibidores para aumentar la captación de glucosa fue comparable a la de AVANDIA. Se examinó el efecto de los inhibidores de PGR3/ZADH2 sobre la reducción de la glucosa en la sangre en ratones db/db. Se albergó a ratones db/db (C57BLKS/J-m+/+Lepdb, The Jackson Laboratory de 10-11 semanas de edad) a razón de 4 por jaula. Se inyectó 5 mg/kg de trifluorobencil 2-hídroxicinnamato (compuesto 22), un inhibidor de PGR3 (ratones #1-#6) a diez ratones, por vía intraperitoneal, dos veces diarias durante 7 días, o bien un placebo (ratones #7-#10, en una concentración final contra fluidos corporales: 0,2% de DMSO/0,7% de etanol en PBS). Se obtuvieron muestras de sangre del seno retro-orbital antes de la primer inyección y 18 horas después de la última inyección. Se midieron los niveles de glucosa en las muestras de sangre mediante un medidor de glucosa en la sangre del tipo de electrodos (HORIBA, AntSensell, Japón). Los resultados están resumidos en la siguiente Tabla 3. La última columna muestra el % de inhibición, que representa (B.G..antes — B.G. -después) B. G..antes X 100%. Los resultados sugieren que el inhibidor de PGR-3 redujo significativamente los niveles sanguíneos de glucosa en los ratones. Tabla 3 Eiemplo 5 . ARN de interferencia Se utilizó un enfoq ue de ARN de interferencia (ARN i) para silenciar la expresión de PG R3/ZADH2 en pre-adipocitos 3T3-L1 . Para generar vectores que codifiquen ARNs de interferencia (ARNis) dirig idos a PG R3/ZADH2, se sintetizaron oligonucleótidos q ue conten ían 5'-GAT CCG TGC CAC GTT ATC GGA ACC TTC AAG AGA GGT TCC GAT AAC GTG GCA CTT TTT TGG AAA-3' (SEC. ID NO:9; cebador directo) y AGC TTT TCC AAA AAA GTG CCA CGT TAT CGG AAC CTC TCT TGA AGG TTC CGA TAA CGT GGC ACG-3'(S EC . I D NO: 1 0; cebador inverso) utilizando un método estándar. A contin uación se reasociaron e incorporaron a u n vector de expresión de ARN is linealizado, pSilencerTM neo (# catalogo 5764, Ambíon) . Este vector de expresión de ARNis fue introducido posteriormente en preadipocitos 3T3-L1 mediante electroporación . Se aislaron clones transfectados en forma estable mediante selección con G41 8. A contin uación se examinaron los niveles de ARN m de PGR3/ZADH2 en estas reivindicaciones por RT-PCR estándar. Se encontró q ue se reprim ían los niveles de transcripción del ARN m de PG R3/ZADH2. Se llevó a cabo u n ensayo basado en el reportero PPRE utilizando los clones antes descritos de acuerdo con el método descrito por Forman eí al. , Cell (1 995) 83:803-81 2. Se encontró que la actividad transcripcional de PPAR-gamma se incrementaba en esos clones. Estos resultados indican que se puede mod ular la actividad de PPAR-gamma silenciando la expresión de PG R3/ZAD H2 por interferencia de ARN y, de esa manera, tratar las enfermedades relacionadas con PPAR.

Otras Modalidades Todas las características expuestas en esta especificación se pueden combinar de cualquier manera. Cada una de las característica expuestas en esta especificación puede ser reemplazada por una característica alternativa que cumpla el mismo propósito o uno equivalente o similar. Por consiguiente, a menos que se indique expresamente lo contrario, cada característica descrita es sólo un ejemplo de una serie genérica de características equivalentes o similares. De la descripción que antecede, una persona capacitada en la materia puede determinar fácilmente las características esenciales de la presente invención y, sin apartarse del espíritu y alcance de la misma, puede efectuar diversos cambios y modificaciones de la invención para adaptarla a los diversos usos y condiciones. Por lo tanto, otras modalidades también están incluidas en las reivindicaciones.

Claims (39)

1. REIVINDICACIONES 1. Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de SEQ. ID. NO: 1 o SEQ. ID. NO: 3 o un equivalente funcional del mismo, donde el polipéptido reduce la 15-ceto prostaglandina.
2. 2. El polipéptido aislado de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende una secuencia por lo menos 90% idéntica a SEQ. ID. NO: 1 o SEQ. ID. NO: 3. 3. El polipéptido aislado de acuerdo con la reivindicación 2, que comprende una secuencia por lo menos 80% idéntica a SEQ. ID. NO: 1 o SEQ. ID. NO:
3. 3.
4. 4. El polipéptido aislado de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual el polipéptido es SEQ. ID. NO: 1 o 3.
5. 5. El polipéptido aislado de acuerdo con la reivindicación 4, en el cual la 15-ceto prostaglandina es 15-ceto PGE2, 15-ceto PGE^ 15-ceto PGF2a, o 15-ceto PGF1a.
6. 6. El polipéptido aislado de acuerdo con la reivindicación 5, en el cual la 15-ceto prostaglandina es 15-ceto PGE2.
7. 7. Un anticuerpo, donde el anticuerpo se une específicamente a un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1.
8. 8. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 7, donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
9. 9. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 7, donde el polipéptido es SEQ. ID. NO: 1.
10. 10. Un método para el tratamiento de una enfermedad relacionada con el receptor activado por el proliferador de perixosoma, que comprende la administración a un sujeto que lo necesita de una cantidad efectiva de un modulador de PGR3/ZADH2.
11. 11. El método de acuerdo con la reivindicación 10, en el cual el modulador es 15-ceto prostaglandina.
12. 12. El método de acuerdo con la reivindicación 11, en el cual la 15-ceto prostaglandina es 15-ceto PGE2, 15-ceto PGE-,, 15-ceto PGF2a, o 15-ceto PGF1a.
13. 13. El método de acuerdo con la reivindicación 12, en el cual la 5-ceto prostaglandina es 15-ceto PGE2.
14. 14. El método de acuerdo con la reivindicación 10, en el cual el modulador es un inhibidor de PGR3/ZADH2.
15. 15. El método de acuerdo con la reivindicación 14, en el cual el inhibidor es un ARNds de acuerdo con la reivindicación 28.
16. 16. El método de acuerdo con la reivindicación 14, en el cual el inhibidor es tetrahidroxiflavona, trihidroxiflavona, 2-hidroxi-trimetoxichalcona o 2-hidroxi-bencil cinnamato o un derivado de los mismos.
17. 17. El método de acuerdo con la reivindicación 14, en el cual el inhibidor es uno de los compuestos 1-49.
18. 18. El método de acuerdo con la reivindicación 14, en el cual el inhibidor es un anticuerpo.
19. 19. El método de acuerdo con la reivindicación 10, en el cual la enfermedad relacionada con PPAR es la diabetes de tipo II, obesidad, dislipidemia, enfermedad cardiaca coronaria, enfermedad inflamatoria o cáncer.
20. 20. El método de acuerdo con la reivindicación 19, en el cual la enfermedad relacionada con PPAR es la diabetes de tipo II, obesidad, dislipidemia o enfermedad cardiaca coronaria.
21. 21. El método de acuerdo con la reivindicación 20, en el cual la enfermedad relacionada con PPAR es la diabetes de tipo II.
22. 22. Un método para reducir los niveles de glucosa en la sangre en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de un inhibidor de PGR-3/ZADH2.
23. 23. El método de acuerdo con la reivindicación 22, en el cual el inhibidor es tetrahidroxiflavona, trihidroxiflavona, 2-hidroxi-trimetoxichalcona o 2-hidroxi-bencil cinnamato.
24. 24. El método de acuerdo con la reivindicación 22, en el cual el inhibidor es un ARNds de acuerdo con la reivindicación 28 o uno de los compuestos 1-49.
25. 25. Un método para identificar un compuesto con respecto a su actividad inhibitoria de PGR3/ZADH2, que comprende proporcionar un sistema que contiene PGR3/ZADH2, la puesta en contacto de un compuesto con el sistema, la determinación de la actividad de PGR3/ZADH2 y la comparación de la actividad con la obtenida de manera igual, excepto que el compuesto está ausente.
26. 26. El método de acuerdo con la reivindicación 25, en el cual el sistema es una célula que contiene un gen que expresa PGR3/ZADH2 y se determina la actividad midiendo la actividad de expresión del gen.
27. 27. El método de acuerdo con la reivindicación 25, en el cual el sistema es una solución libre de células que contiene PGR3/ZADH2 y la actividad se determina midiendo la actividad enzimática de PGR3/ZADH2.
28. 28. Un ácido ribonucleico de doble hebra (ARNds) para inhibir la expresión de PGR3/ZADH2, que comprende una primer hebra de poliribonucleótido y una segunda hebra de poliribonucleótido, donde la primer hebra contiene una secuencia que es idéntica a 19 a 49 nucleótidos consecutivos de un ácido nucleico que codifica PGR3/ZADH2 y la segunda hebra es complementaría de la primer hebra.
29. 29. El ácido ribonucleico de doble hebra de acuerdo con la reivindicación 28, en el cual la primer hebra contiene SEQ. ID. NO: 9 o 10, o un fragmento de la misma.
30. 30. Un método para el tratamiento de una enfermedad relacionada con PPAR, que comprende la administración a un sujeto que lo necesita de una cantidad efectiva de un compuesto de la fórmula (I): en la cual cada uno de Ri y R2 es, independientemente, H, halo, ORa, alquilo C?-C10, cicloalquilo C3-C20, heterocicloalquilo C3-C20, arilo, o heteroarilo, y cada uno de R3, R4, R5, Re, R7, R8, R9, R10l R,, y R12, es, independientemente, H, halo, OR ¡ alquilo cicloalquilo C3-C20, heterocicloalquilo C3-C20, arilo o heteroarilo, o R4 y R5, juntos, son cicloalquílo C3-C20, heterocicloalquilo C3-C20, arilo, o heteroarilo, o bien R-io y Rn, juntos, son cicloalquilo C3-C20, heterocicloalquilo C3-C20, arilo, o heteroarilo, donde cada uno de Ra y Rb es, independientemente, H, alquilo C?-C10, cicloalquilo C3-C20, heterocicloalquilo C3-C20, arilo, o heteroarilo.
31. 31. El método de acuerdo con la reivindicación 30, en el cual cada uno de Ri y R2 es, independientemente, H, fenilo fusionado con ciclopentilo o fenilo sustituido con heteroarilo.
32. 32. El método de acuerdo con la reivindicación 30, en el cual cada uno de R3 y R-?2 es OH.
33. 33. Un método para el tratamiento de una enfermedad relacionada con PPAR, que comprende la administración a un sujeto que lo necesita de una cantidad efectiva de un compuesto de la fórmula (II): en la cual cada uno de R1; R2, R3, R4, Rs, Re, R?, Rs, Rg y Río es independientemente H, OR, alquilo C-?-C10, cicloalquilo C3-C20, heterocicloalquilo C3-C20, arilo o heteroarilo, donde R es H, alquilo C?-C10, cícloalquilo C3-C20, heterocicloalquilo C3-C20, arilo o heteroarilo.
34. 34. El método de acuerdo con la reivindicación 33, en el cual cada uno de R-,, R2, R3, R4, R5l R6, R7, R8l R9, y R10 es independientemente H o OH.
35. 35. Un método para el tratamiento de una enfermedad relacionada con PPAR, que comprende la administración a un sujeto que lo necesita de una cantidad efectiva de un compuesto de la fórmula (III): en la cual Rt es alquilo d-C10, cicloalquilo C3-C20, heterocicloalquilo C3-C20, arilo, heteroarilo, ORa, NRaRb o SRa; cada uno de R2, R3, R , Rs y R6 es independientemente H, halo, ORc, NRcRd, alquilo C-?-C10, cicloalquilo C3-C20, heterocicloalquilo C3- C20, arilo o heteroarilo, donde cada uno de Ra, Rb, Rc y Rd es independientemente H, alquilo C?-C10l cicloalquilo C3-C20, heterocicloalquilo C3-C20, arilo o heteroarilo.
36. 36. El método de acuerdo con la reivindicación 35, en el cual Ri es fenilo sustituido con halo, OR, N02 o alquilo Ct-C-io, donde R es H o alquilo C?-C10.
37. 37. El método de acuerdo con la reivindicación 35, en el cual Ri es ORa, NRaRb o SRa, donde Ra es alquilo Ci-C-,0 sustituido con fenilo, donde fenilo está optativamente sustituido con CF3, F o OH, y Rb es H.
38. 38. El método de acuerdo con la reivindicación 35, en el cual RT es heteroariio o alquilo C- C-io sustituido con C(O)R, donde R es H
39. 39. Un método para el tratamiento de una enfermedad relacionada con PPAR, que comprende la administración a un sujeto que lo necesita de una cantidad efectiva de un compuesto seleccionado del grupo constituido por 5 y RESUME U n método para tratar una enfermedad relacionada con los receptores activados por proliferadores de peroxisoma administrándole a un sujeto que lo necesita, una cantidad efectiva de un modulador de 15-ceto prostaglandina-?13 reductasa. También se describen métodos para identificar un compuesto para inhibir la actividad de la reductasa y para disminuir los niveles de glucosa en la sangre, administrándole a un sujeto una cantidad efectiva de un inhibidor de reductasa.