AGENTES PARA EL TRATAMIENTO DE LA RETINOPATIA DIABÉTICA Y FORMACIÓN DE DRUSEN EN DEGENERACIÓN MACULAR
CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere al campo de los agentes profilácticos y terapéuticos para retinopatía diabética y formación de drusen en degeneración macular relacionada con la edad. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La retinopatía diabética es una enfermedad del ojo que se desarrolla en pacientes diabéticos debido a cambios en las células que recubren los vasos sanguíneos. Cuando los niveles de glucosa son elevados, como en el caso de la diabetes, la glucosa puede causar daños de varias formas. Por ejemplo, la glucosa o un metabolito de la glucosa, se une a los grupos amino de proteínas, provocando un daño tisular. Además, el exceso de glucosa ingresa en la vía de poliol lo que resulta en acumulaciones de sorbitol. El sorbitol no puede ser metabolizado por las células de la retina y puede contribuir a una presión osmótica intracelular alta, edema intracelular, difusión afectada, hipoxia tisular, daño a células capilares y debilitamiento capilar. La retinopatía diabética involucra un espesamiento de las membranas de basamento capilar y previene la entrada en contacto de los pericitos con las células endoteliales de los capilares. La pérdida de pericitos incrementa las fugas de los capilares y provoca una ruptura de la barrera sangre-retina. Capilares debilitados provocan la formación de aneurismas y fugas adicionales. El efecto de la hiperglicemia puede también afectar las funciones neuronales en la retina. Es una etapa temprana de la retinopatía diabética que se conoce retinopatía diabética no proliferativa. Los capilares retínales se pueden tapar en pacientes diabéticos provocando áreas de isquemia en la retina. El tejido no perfusado responde provocando el crecimiento de nuevos vasos a partir de los vasos existentes (angiogénesis) . Estos nuevos vasos sanguíneos pueden también causar una pérdida de la vista, una condición que se conoce como retinopatía diabética proliferativa, puesto que los nuevos vasos sanguíneos son frágiles y tienden a permitir fugas sangre en el ojo. La administración oral de genisteína, un isoflavonoide encontrado en la soya, reduce según los reportes las fugas vasculares retínales en ratas con diabetes experimentalmente inducida ( Invest Ophthalmol Vis Sci , 2001 , 42, 2110-2114) . La solicitud de patente PCT no. PCT/US02/40457 de Gao, X., et al, publicada como WO 13/051313, ofrece según se reporta una inducción de una enzima de detoxificación de fase II por sulforafano en células epiteliales de pigmento retinal de ser humano. Sin embargo, las células epiteliales difieren de las células endoteliales vasculares y las respuestas biológicas de tejidos endoteliales a agentes terapéuticos particulares no pueden ser predichas a partir de las respuestas biológicas de las células epiteliales. Dada la dificultad de mantener un buen control glicémico en diabéticos humanos, el desarrollo de fármacos que inhiben o hacen más lento el daño a las células capilares retínales y a las neuronas retinales proporcionaría una forma de reducir el daño celular temprano que incurre en la retinopatía diabética. La degeneración macular es la pérdida de fotoreceptores en la porción de la retina central, que se conoce como mácula, responsable de una vista de alta agudeza. La degeneración macular relacionada con la edad (AMD, por sus siglas en inglés), se describe como "seca" o "húmeda". La forma húmeda, exudativa, neovascular de AMD afecta aproximadamente el 10% de las personas con AMD y se caracteriza por un crecimiento anormal de vasos sanguíneos a través del epitelio de pigmento retinal (RPE, por sus siglas en inglés) , que resulta en hemorragia, exudación, cicatriz, o desprendimiento retinal serio. El 90% de los pacientes con AMD tienen la forma seca que se caracteriza por una atrofia del epitelio del pigmento retinal y pérdida de foto receptores maculares. Actualmente no hay curas para ninguna forma AMD aún cuando se ha logrado un cierto éxito en la atenuación a través de una terapia fotodinámica.
Drusen es un material de tipo residuo que se acumula con la edad debajo de RPE. Se observa drusen utilizando un examen funduscópico del ojo. Los ojos normales pueden tener máculas libres de drusen, sin embargo, el drusen puede estar abundante en la periferia retinal. La presencia de drusen blando en la mácula, en ausencia de pérdida de visión macular, se considera como etapa temprana de AMD. El drusen contiene varios lípidos, polisacáridos y glicosaminoglicanos junto con varias proteínas, proteínas modificadas o aductos de proteína. Crabb, J.W. , et al ( Proc Nati Acad Sci 99 : 23, 14682-14687) ofrece, según se reporta, un análisis proteómico de drusen aislado a partir de ojos de donadores sanos y de donadores con AMD. La protección de células de RPE de ser humano cultivadas contra oxidantes químicos se proporciona, según se reporta, por oltipraz, una ditioletiona ( Invest Ophthalmol Vis Sci, 2002, 43, 3550-3554) , sulforafano, un isocianato ( Proc Nati Acad Sci , 2001 , 98, 15221-15226), y dimetilfumarato ( Prog Ret Eye Res, 2000, 19, 205-221) . Sin embargo, no se proporciona ninguna sugerencia a través de estas referencias que la formación de drusen sea afectada por dicho tratamiento. No hay ningún método terapéutico generalmente aceptado que ataca la formación de drusen y por consiguiente maneja la naturaleza producida de AMD. Tomando en cuenta el impacto de AMD sobre la salud y el bienestar, y el carácter adecuado de los métodos de tratamiento de la técnica anterior, sería deseable tener un método mejorado para tratar AMD en etapa temprana, particularmente la formación de depósito de drusen. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura muestra los efectos citoprotectores de quercetina en células endoteliales retinales expuestas a un estrés oxidativo, hidroperóxido de t-butilo. Los símbolos son los siguientes: || control; || + quercetina; /// + butionina- (S,R) -sulfoximina; \\\ + quercetina y butionina- (S,R) -sulfoximina; *, mayor que control t-BOOH respectivo P<0.001; #, menos que control t-BOOH respectivo P<0.004; í, menos que control t-BOOH cero P<0.04. COMPENDIO DE LA INVENCIÓN De conformidad con la presente invención, un agente que tiene una actividad estimuladora de la translocación nuclear de proteína Nrf2 y los incrementos subsiguientes en productos génicos que detoxifican y eliminan metabolitos citotóxicos ofrece un efecto protector o terapéutico para retardar o prevenir el daño vascular retinal y neuronal causado por retinopatía diabética. Tales agentes ofrecen también un efecto inhibidor sobre la formación y depósitos de drusen que acompañan la degeneración macular. Como se utiliza aquí, el término "actividad estimuladora para translocación nuclear de proteína Nrf2" se refiere a un agente que mejora la disponibilidad o transporte de Nrf2 al núcleo. La translocación de proteína Nrf2 al núcleo permite una elevación subsiguiente de la expresión de productos génicos que detoxifican y eliminan metabolitos citotóxicos. Los métodos de la presente invención proporcionan un método para el tratamiento de la retinopatía diabética en un sujeto, el método comprende la administración al sujeto de una cantidad efectiva de una composición que comprende un agente que tiene la actividad estimuladora para translocación nuclear de proteína Nrf2, y un vehículo aceptable. El sujeto puede estar en riesgo de desarrollar retinopatía diabética o formación de drusen o puede tener síntomas de retinopatía diabética o formación de drusen. El agente que estimula la translocación nuclear de la proteína Nrf2 y los incrementos subsiguientes de productos génicos que detoxifican y eliminan metabolitos citotóxicos de la presente invención comprende un aceptor de Adición de Michael, difenol, tiocarbamato, quinona, 1, 2-ditiol-3-tiona, hidroxianisol butilado, flavonoide otro que genisteína, un isotiocianato, 3,5-di-terc-butil-4-hidroxitolueno, etoxiquina, una coumarina, combinaciones de los mismos o un derivado farmacológicamente activo o análogo de los mismos. En una modalidad, el agente comprende un isotiocianato como por ejemplo sulforafano, o un derivado farmacológicamente activo o análogo del mismo. En otra modalidad, el agente comprende una 1, 2-ditiol-3-tiona como por ejemplo oltipraz, o un derivado o análogo farmacológicamente activo el mismo. Los métodos de la presente invención ofrecen además un método para inhibir la formación de drusen sub-retinal de un sujeto, el método comprende la administración al sujeto de la misma cantidad efectiva de una composición que comprende un agente que tiene una actividad estimuladora para translocación nuclear de proteína Nrf2, y un vehículo aceptable. El agente comprende un aceptador de Adición de Michael, difenol, tiocarbamato, quinona, 1, 2-ditiol-3-tiona, hidroxianisol butilado, flavonoide, un isotiocianato, 3, 5-di-terc-butil-4-hidroxitolueno, etoxiquina, una coumarina, combinaciones de los mismos, o un derivado o análogo farmacológicamente activo de los mismos . Una modalidad adicional de la presente invención es un método para predecir una respuesta terapéutica de un agente de prueba contra retinopatía diabética en un sujeto en donde el agente de prueba tiene una actividad estimuladora para translocación nuclear de proteína Nrf2. El método comprende la exposición de una primera muestra de células retinales a un estrés oxidativo, exponer una segunda muestra de células retinales al estrés oxidativo en combinación con el agente de prueba, y comparar el número de células viables de la primera muestra expuesta con el número de células viables de la segunda muestra expuesta. Cuando el número de células viables de la segunda muestra es mayor que el número de células viables de la primera muestra, se predice que el agente de prueba ofrece una respuesta terapéutica a retinopatía diabética en un sujeto. La administración del agente que estimula la translocación nuclear de proteína Nrf2 y los incrementos subsiguientes en cuanto a productos génicos que detoxifican y eliminan metabolitos citotóxicos puede ser por inyección infraocular, implantación de un dispositivo de liberación lenta, o administración tópica, oral, intranasal, inyección sistémica u otras administraciones sistémicas. En una modalidad adicional del método de la presente invención, el sujeto es diagnosticado con retinopatía diabética o formación de drusen y, en otra modalidad de la invención, el sujeto tiene síntomas de retinopatía diabética o formación de drusen. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere al uso de agentes que estimulan la translocación nuclear de proteína Nrf2 y los incrementos subsiguientes de productos génicos que detoxifican y eliminan metabolitos citotóxicos como método de tratamiento de la retinopatía diabética y formación de drusen en degeneración macular relacionada con la edad. El término "tratamiento de la retinopatía diabética", como se utiliza, se refiere a retardar o prevenir el desarrollo de la retinopatía diabética, inhibir la progresión de la retinopatía diabética o mitigar los efectos de la retinopatía diabética, o síntomas de los mismos. La estimulación de la translocación nuclear de proteína Nrf2 y los incrementos subsiguientes en productos génicos que detoxifican y eliminan los metabolitos citotóxicos se proporciona para proteger los capilares vasculares retinales y las neuronas retinales en una condición diabética. El término "tratamiento de la formación de drusen", como se utiliza aguí, se refiere a retardar o prevenir el desarrollo de la presencia de drusen, inhibir la progresión de la presencia de drusen o mitigar los efectos de la presencia de drusen en el área sub-retinal. La estimulación de la translocación nuclear de proteína Nrf2 y los incrementos subsiguientes en productos génicos que detoxifican y eliminan metabolitos citotóxicos se proporciona para proteger la mácula mediante la formación de drusen. La translocación nuclear de Nrf2 es inducida en células expuestas a ciertos electrófilos y oxidantes. Los genes inducidos debido a la translocación nuclear de Nrf2 proporcionan una detoxificación de enzimas que mejoran la protección contra electrófilos y promueven la reparación o degradación de proteínas dañadas . La inducción de estas enzimas es regulada a nivel transcripcional y es mediada por un realzador específico, el elemento de respuesta antioxidante o ARE, que se encuentra en el promotor del gen que codifica la enzima. El contexto de secuencia del ARE, la naturaleza de los inductores químicos, y el tipo de células afectan la actividad del realzador en un gen particular. El factor de transcripción Nrf2 es un miembro de la familia de factores de transcripción NF-E2 y responsable de la regulación ascendente de la expresión génica mediada por elemento de respuesta antioxidante (ARE) . Nrf2 induce la expresión génica mediante la unión a la región de ARE (elemento de respuesta antioxidante) del promotor para activar constitutivamente la transcripción génica en respuesta a una señal de estrés oxidativo. Bajo condiciones normales, se cree que Nrf2 está presente en el citoplasma unido por la proteína represora Keapl, una proteína citoplásmica anclada en el citoesqueleto de actina. Sin desear limitarnos a la materia, se cree que agentes que tienen una actividad estimuladora para la translocación nuclear de proteína Nrf2 pueden competir con la región de intervención rica en cisteína de un factor de citosólico Keapl para interacción don Nrf2 (Dinkova-Kostova, A.T., et al , Proc . Nati Acad Sci, USA, 99:11908-11913 (2002)). La perturbación del complejo Nrf2-Keapl por ciertos compuestos tales como sulforafano puede liberar Nrf2 para translocación en el núcleo en donde puede heterodimerizarse con otros factores de transcripción (por ejemplo, Maf, c-Jun, etc.) en regiones ARE de genes que llevan a la inducción de expresión génica regulada por ARE. Enzimas y proteínas expresadas por esta vía Nrf2/ARE poseen propiedades citoprotectoras químicamente versátiles y son una defensa contra metabolitos tóxicos y xenobióticos. Enzimas y proteínas conocidas puede expresarse de la vía Nrf2/ARE incluyen glutationa-5-transferasas, UDP glucuronosiltransferasas, NADP(H) quinona oxidoreductasa, ?-glutamilcisteina sintetasa, proteínas chaperonas/de respuesta a estrés, y proteínas ubiquitina/proteasoma. Agentes que tienen actividad estimuladora para la translocación nuclear de proteína Nrf2 incluyen, por ejemplo: aceptores de Adición de Michael (por ejemplo, compuestos de carbonilo , ß-insaturado) , como por ejemplo maleato de dietilo o dimetilfumarato; difenoles tales como resveratrol, hidroxianisoles butilados tales como 2 (3) -terc-butil-4- hidroxianisol, tiocarbamatos tales como pirrolidinetiocarbamato, quinonas como por ejemplo terc-butil-hidroquinona, isotiocianatos como por ejemplo sulforafano, su precursor glucosinolato, glucorafaniño, o isotiocianato de fenetilo (PEITC) , 1, 2-ditiol-3-tiones tales como oltipraz, 3, 5-di-terc-butil-4-hidroxitolueno, etoxiquina, coumarinas tales como 3-hidroxicoumarina, flavonoides como por ejemplo quercetina o curcumina para el tratamiento de formación de drusen, un flavonoide otro que genisteína como por ejemplo quercetina o curcumina para el tratamiento de la retinopatía diabética, sulfuro de dialilo, indol-3-carbinol, epigallo-3-catequina galato, ácido elágico, combinaciones de los mismos, o un derivado o análogo farmacológicamente activo de los mismos. Un aceptor Michael es una molécula que tiene un alqueno adyacente a un grupo retirador de electrones. El grupo retirador de electrones es habitualmente un carbonilo, pero puede ser también un nitrilo o un grupo nitro . Aún cuando químicamente diversos, estos compuestos son electrófilos y tienen la capacidad de reaccionar con grupos sulhidrilo nucleofílicos . Un "derivado farmacológicamente activo del mismo", es un agente estructuralmente relacionado con cualquiera de los compuestos antes mencionados con actividad estimuladora para translocación nuclear de proteínas Nrf2 y derivable de él y puede ser un éster, una amida, o una sal del mismo, por ejemplo, ün "análogo farmacológicamente activo del mismo", es un agente estructuralmente similar a cualquiera de los compuestos antes mencionados con una actividad estimuladora para translocación nuclear de proteína Nrf2 pero que difiere ligeramente en cuanto a composición, como por ejemplo mediante el reemplazo de un átomo por un átomo de un elemento diferente o en presencia de un grupo funcional particular, por ejemplo. En una modalidad, la presente invención ofrece sulforafano, oltipraz, un análogo farmacológicamente activo del mismo, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo en un método para el tratamiento de la retinopatía diabética o formación de drusen relacionada con la degeneración macular relacionada con la edad. Se sabe que el sulforafano (no. de producto S6317, Sigma-Aldrich) induce la quinona reductasa, glutationa-S-transferasa, y glutationa reductasa, por ejemplo. Se ha observado inducción enzimática en varias líneas de células incluyendo células epiteliales de pigmento retinal de adultos humanos (Zhang, Y, et al , Proc. Nati Acad Sci, USA, 89:2399-2403 (1992) ) . Análogos de sulforafano incluyen, por ejemplo,
6- (isotiocianato-2-hexanona) , exo-2-acetil-6-isotiocianatonorbornano, exo-2- (isotiocianato-6-metilsulfonilnorbornano) , 6-isocianato-2-hexanol, 1- (isotiocianato-4-dimetilfosfonilbutano, exo-2- (1-hidroxietil) -5- isotiocianatonorbonano, exo-2-acetil-5- isotiocianatonorbornano, 1- (isotiocianato-5- metilsulfonilpentano) , cis-3- (metilsufonil) (ciclohexilmetilisotiocianato) y trans-3- (metilsulfonil) (ciclohexilmetilisotiocianato) . El término "esfuerzo oxidativo", como se utiliza aquí, se refiere a la exposición a un agente que provoca niveles elevados de especies de oxígeno reactivas (ROS, por sus siglas en inglés) tales como radicales superóxido, radicales ion hidroxilo, peróxido de hidrógeno, oxígeno singlete, o peróxidos de lípido, por ejemplo. El estrés oxidativo se logra mediante la inducción de condiciones fisiológicas que promueven la generación de ROS y mediante la afectación de sistemas antioxidantes celulares, que se ha mostrado en ratas diabéticas experimentales, ratas galactosémicas experimentales, ratones deficientes en Nrf2, y como consecuencia del proceso de envejecimiento. En sistemas de cultivos celulares, el estrés oxidativo es también inducido mediante la generación o adición de ROS o mediante la inhibición de sistemas antioxidantes. Por ejemplo, el peróxido de hidrógeno y el hidroperóxido de t-butilo pueden agregarse a medios de cultivo. Se puede agregar menadiona para proporcionar una fuente de superóxido. El 4-Hidroxinonenal es un producto final de peroxidación de lípido que puede estar incluido en el medio, y el peroxinitrito puede ser generado a partir de donadores de óxido nítrico en presencia de superóxido. La butionina- (S,R) -sulfoximina inhibe la síntesis de glutationa, un importante antioxidante celular. Además, las células mantenidas bajo altos niveles de glucosa o en presencia de productos finales de glicación avanzada incrementan en la producción de ROS endógenas . Además, se pueden emplear hipoxia .isquémica y reperfusión tanto en modelos animales como en sistemas de cultivo de células y órganos para imponer un estrés oxidativo sobre sistemas biológicos, por ejemplo. El término "células retinales", como se utiliza aquí, incluye células endoteliales, neuronas, células guales, o pericitos, por ejemplo. Modo de administración : Los agentes de la presente invención pueden ser administrados directamente al ojo (por ejemplo: gotas oculares tópicas o ungüentos; dispositivos de liberación lenta en el fondo del saco o implantados adyacentes a la esclera o dentro del ojo; administración periocular, conjuntival, sub-tenon, intracameral, intravitreal, o inyecciones intracanalicular) o administración sistémica (por ejemplo, administración oral, inyecciones intravenosa, subcutáneas, o intramusculares; administración parenteral, dérmica o administración nasal) empleando técnicas bien conocidas por parte de las personas con conocimientos en la materia. Se contempla además que los agentes de la invención puedan ser formulados en dispositivos de insertos o implantes infraoculares. Sujeto: Un sujeto tratado para retinopatía diabética o formación de drusen de conformidad con lo descrito aquí puede ser un ser humano u otro animal en riesgo de desarrollar retinopatía diabética o formación de drusen que llevan a una degeneración macular relacionada con la edad o que tiene síntomas de retinopatía diabética o formación de drusen relacionada con la degeneración macular relacionada con la edad. Formulaciones y Dosificación : Los agentes de la presente invención pueden ser administrados como soluciones, suspensiones, o emulsiones (dispersiones) en un vehículo oftálmico adecuado. A continuación se presentan ejemplos de posibles formulaciones incorporadas por la invención. Cantidad en % en peso Agente estimulador de trans- 0.01-5; 0.01 - 2.0; 0.5 - 2.0 locación nuclear de proteína Nrf2 Hidroxipropilmetilcelulosa 0.5 Cloruro de sodio .8 Cloruro de benzalconio 0.01 EDTA 0.01 NaOH/HCl qs pH 7.4 Agua purificada qs 100% Cantidad en % en peso Agente esti- 0.0005-0.5; 0.0003 - 0.3; 0.0005 - 0.03; 0.001 mulador de translocación nuclear de proteína Nrf2 Solución Salí 1.0 na Amortiguada con fosfato Cloruro de 0.01 Benzalconio Polysorbate 80 Agua purifi- q.s. a 100% cada Cantidad en % en peso
Agente estimulador de la trans- 0.001 locación nuclear de proteína Nrf2 Fosfato de sodio monobásico 0.05 Fosfato de sodio dibásico 0.15 (anhidro) Cloruro de sodio 0.75 EDTA disódico 0.05 Cremophor EL 0.1 Cloruro de benzalconio 0.01 HCl y/o NaOH pH 7.3-7.4 Agua purificada q.s. a 100% Cantidad en % en peso Agente estimulador de trans- 0.0005 locación nuclear de proteína Nrf2 Solución Salina Amortiguada con Fosfato 1.0 Hidroxipropil-ß-ciclodextrina 4.0 Agua purificada q.s. a 100% En una modalidad adicional, las composiciones oftálmicas son formuladas para proporcionar una concentración infraocular de aproximadamente 0.1-100 nanomolar (nM) , o, en una modalidad adicional, 1-10 nM. Concentraciones plasmáticas pico de hasta 20 micromolar pueden alcanzarse para administración sistémica. Las composiciones tópicas son administradas a la superficie del ojo de una a cuatro veces al día según el criterio de un médico experimentado. El pH de la formulación debe estar dentro de un rango de 4 a 9, o de 4.5 a 7.4. Formulaciones sistémicas pueden contener de aproximadamente 10 mg a 1000 mg, de aproximadamente 10 mg a 500 mg, de aproximadamente 10 mg a 100 mg o hasta 125 mg, por ejemplo, del agente que estimula la translocación nuclear de proteína Nrf2 y los incrementos subsiguientes de productos génicos que detoxifican y eliminan metabolitos citotóxicos.
Una "cantidad efectiva" se refiere a al cantidad de agente que puede estimular la translocación nuclear de proteína Nrf2 y los incrementos subsiguientes de productos génicos que detoxifican y eliminan los metabolitos citotóxicos. Dicha inducción de expresión génica ofrece una defensa contra la toxicidad de electrófilos reactivos así como otros metabolitos tóxicos. Por consiguiente, un agente que estimula la translocación nuclear de proteína Nrf2 y los incrementos subsiguientes de productos génicos que detoxifican y eliminan metabolitos citotóxicos se proporciona para la protección contra citotoxicidad. Dicha protección retarda o previene el inicio de síntomas en un sujeto en riesgo de desarrollar retinopatía diabética o formación de drusen en degeneración macular relacionada con la edad. La cantidad efectiva de una formulación puede depender de factores tales como la edad, raza, y sexo del sujeto, o la severidad de la retinopatía o grado de formación de drusen, por ejemplo. En una modalidad, el agente se administra tópicamente al ojo y alcanza la retina o drusen en una dosis terapéutica mejorando así la retinopatía diabética o proceso de formación de drusen. Mientras que el régimen preciso se deja a criterio del médico, la solución resultante o las soluciones resultantes se administran preferentemente mediante la colocación de una gota de cada solución en cada ojo de una a cuatro veces al día, o según lo indicado por el médico.
Vehículos aceptables : Un vehículo oftálmicamente aceptable se refiere a los vehículos que causa, al máximo, poca o ninguna irritación ocular, ofrecen una conservación adecuada si se requiere, y suministran uno o varios agentes que estimulan la translocación nuclear de proteína Nrf2 y los incrementos subsiguientes de productos génicos que detoxifican y eliminan los metabolitos citotóxicos de la presente invención en una dosificación homogénea. Para administración oftálmica, un agente que estimula la translocación nuclear de proteína Nrf2 y los incrementos subsiguientes d productos génicos que detoxifican y eliminan metabolitos citotóxicos pueden combinarse con conservadores oftalmológicamente aceptables, co-solventes, surfactantes, realzadores de la viscosidad, realzadores de la penetración, amortiguadores, cloruro de sodio, o agua para formar una suspensión acuosa oftálmica estéril, solución, o geles viscosos o semi-viscosos u otros tipos de composición sólida o semi-sólida como por ejemplo un ungüento. Formulaciones de solución oftálmica pueden prepararse mediante la disolución de un agente en un amortiguador acuoso isotónico fisiológicamente aceptable. Además, la solución oftálmica puede incluir un surfactante oftalmológicamente aceptable para ayudar a disolver el agente. Compuestos que incrementan la viscosidad, como por ejemplo, hidroximetil celulosa, hidroxietil celulosa, metilcelulosa, polivinilpirrolidona, o similares pueden agregarse a las composiciones de la presente invención para mejorar la retención el compuesto. Con el objeto de preparar una formulación de ungüento oftálmica estéril, el agente que estimula la translocación nuclear de proteína Nrf2 y los incrementos subsiguientes en productos génicos que detoxifican y eliminan metabolitos citotóxicos se combina con un conservador en un vehículo apropiado como por ejemplo, aceite mineral, lanolina líquida, o petrolato blanco. Formulaciones oftálmicas estériles en gel pueden prepararse mediante la suspensión del agente en una base hidrofílica preparada a partir de la combinación de, por ejemplo, CARBOPOL® -940 (BF Goodrich, Charlotte, NC) , o similares, según métodos conocidos en la técnica para otras formulaciones oftálmicas. VISCOAT® (Alcon Laboratories, Inc., Fort Worth, TX) pueden utilizarse para inyección infraocular, por ejemplo. Otras composiciones de la presente invención pueden contener materiales realzadores de la penetración tales como CREMOPHOR® (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) y TWEEN® 80 (polioxietileno sorbitano monolaureato, Sigma Aldrich) , en el caso de los agentes de la presente invención penetran menos en el ojo. Ejemplo 1 Agentes que tienen una Actividad Estimuladora para Translocación Nuclear de Proteína Nrf2 Células endoteliales vasculares, como por ejemplo células endoteliales aórticas bovinas (BAEC, VEC Technologies, Rensselaer, NY) , se utilizan para determinar los agentes que tienen una actividad estimuladora para la translocación nuclear de proteína Nrf2. Por ejemplo, monocapas confluentes de células endoteliales aórticas bovinas están expuestas a agentes candidatos en medio Eagle modificado por Dulbecco con suero bovino fetal al 1% durante hasta 24 horas. Lisados celulares, extractos citosólicos, y extractos nucleares se preparan, y se efectúa un ensayo de inmunoblot y se cuantifica de conformidad con lo descrito en Buckley, B. J. , et al (Biochem Biophys Res Commun ^ 307:973-979 (2003)). Agentes que incrementan la cantidad de Nrf2 que se detecta en la fracción nuclear en comparación con células de control sin agente son después probados para determinar su actividad en células endoteliales que imitan la hiperglicemia de conformidad con lo presentado en el Ejemplo 2. Ejemplo 2 Protección de Células que Imitan la Hiperglicemia Células endoteliales retinales de bovino (BREC's) cultivadas bajo condiciones que imitan la hiperglicemia se combinan con un agente que tiene una actividad estimuladora para la translocación nuclear de proteína Nrf2, después las células expuestas son probadas para protección de los efectos de la hiperglicemia mediante la medición de la magnitud de la formación de peróxidos lípidos, o mediante la medición de los niveles de expresión de moléculas de adición de células intercelulares-1 (ICAM-1) , por ejemplo, de conformidad con lo descrito abajo. Una magnitud menor de formación de peróxidos de lípido, o un nivel menor de expresión de ICAM-1 en cultivos de prueba en comparación con un cultivo de control sin agente indica que el agente ofrece protección contra los efectos de la hiperglicemia. Ensayo para la formación de peróxidos lípidos: Células endoteliales de micro vasos retinales bovinas aisladas (BRMEC's, VEC Technologies, Rensselaer, NY) son tratadas o pre-tratadas con un agente que tiene una actividad de estimulación de la translocación nuclear de proteína Nrf2. El agente es opcionalmente removido. Las células tratadas son expuestas a D-glucosa 25 mM en medio de cultivo durante hasta diez días ya sea antes de la exposición al agente, durante la exposición al agente, o después de dicha exposición. La formación de peróxidos lípidos en las células se mide con un kit comercialmente disponible (Lipid Hydroperoxide Ássay Kit #705002, Cayman Chemical Co., Ann Arbor, MI), y se compara con la formación observada en células expuestas a D-glucosa
(5mM) normal. Una magnitud inferior de formación de peróxidos lípidos en células expuestas al agente en comparación con células no expuestas al agente indica que el agente ofrece protección contra los efectos de la hiperglicemia y que el agente es útil para el tratamiento de la retinopatía diabética Ensayo para la Protección contra Oxidantes utilizando Actividad Lactato Deshidrogenasa : Células BREC's aisladas son tratadas o pre-tratadas con un agente que tiene una actividad de estimulación de la translocación nuclear de proteína Nrf2. Las células tratadas con expuestas al estrés de oxidantes como por ejemplo t-butilhidroxiperóxido (hasta 0.5 mM) o menadiona (hasta 0.25 mM) , por ejemplo, durante hasta 24 horas. La supervivencia celular es determinada mediante la medición de la liberación de actividad lactato deshidrogenasa (LDH) en el medio de cultivo debido a lisis celular y/o actividad LDH retenida en las células viables en un cultivo expuesto al agente en comparación con las células no expuestas al agente. Una cantidad disminuida de liberación de LDH en el medio en comparación con un cultivo de control no expuesto al agente indica supervivencia celular, que el agente ofrece protección contra los efectos de los oxidantes, y que el agente es útil para el tratamiento de la retinopatía diabética. Ensayo para Niveles de ICAM-1 : Células BRECs aisladas son tratadas o pre-tratadas con un agente que tiene una actividad estimuladora de la translocación nuclear de proteína Nrf2. Las células tratadas son expuestas a metilglioxal (MG) y/o BSA modificado con. MG como un modelo in vitro de hiperglicemia en donde incrementos en la expresión de molécula de adhesión celular e intercelular-1 (ICAM-1) ocurre como resultado de la hiperglicemia. Niveles incrementados de ICAM-1 promueven la adhesión de leucocitos al endotelio vascular (leucostasis) y conllevan a la no perfusión capilar. Niveles de ICAM-1 se miden a través de un ensayo inmunosorbente enlazado a enzima (ELISA) utilizando anticuerpos anti-ICAM-1 comercialmente disponibles en BioVendor (Brno, República Checa; Heidelberg, Alemania, #RE 11228C100, anticuerpo monoclonal para ICAM-1 de clon MEM-111) o bien en Zymed Laboratories (South San Francisco, CA; MY-13 anti-ICAM-1 monoclonal, Buras et al, Am J Cell Phys 278:C292-C302, (2000)). Un nivel reducido de ICAM-1 en comparación con un cultivo de control no expuesto a un agente indica que el agente ofrece protección contra los efectos de la hiperglicemia y que el agente es útil para el tratamiento de la retinopatía diabética. En los ensayos mencionados arriba, un agente que tiene una actividad estimuladora para la translocación nuclear de proteína Nrf2, como por ejemplo sulforafano, oltipraz, u otro inductor de la vía Nrf2 puede proporcionarse como tratamiento o como pre-tratamiento con relación a la condición hiperglicémica o estrés oxidativo. Ejemplo 3 Efectos de la Protección I Vivo de Agentes con Actividad de Estimulación de la Translocación Nuclear de Proteína Nr£2 La permeabilidad vascular retinal en una rata con diabetes inducida por estreptozotocina que recibe un agente que tiene una actividad estimuladora para la translocación nuclear de proteína Nrf2 se prueba y se compara con la permeabilidad vascular retinal en una rata de este tipo que no recibe el agente. El método es modificado a partir de Nakajima, M., et al . ( Investigative Ophthalmology & Visual Science 42:9, Agosto de 2001, páginas 2110-2114) . En resumen, un grupo de ratas de control no diabéticas, un grupo de ratas de control diabética, y un grupo de ratas diabéticas que reciben un agente que estimula la actividad de translocación nuclear de proteína Nrf2 son analizados para permeabilidad vascular retinal observando la albúmina en el espacio extracelular después de la perfusión. La diabetes es inducida por inyección de estreptozotocina. La permeabilidad vascular retinal es medida utilizando un análisis Western blot para albúmina extravasada. Niveles de fosfotirosina retinal y proliferación de antígeno nuclear celular (PCNA, por sus siglas en inglés) pueden también evaluarse mediante análisis Western blot. Un nivel reducido de permeabilidad, es decir, menos albúmina extravasada, en el grupo de ratas diabéticas tratadas con agente en comparación con el grupo de ratas diabéticas de control indican que el agente ofrece protección contra los efectos de la hiperglicemia y que el agente es útil para el tratamiento de la retinopatía diabética.
Ejemplo 4 Inhibición de Formación de Drusen por Agentes que tienen Actividad Estimuladora de la Translocación Nuclear de Proteína Nrf2 Células de etipitelio de pigmento retinal (RPE, por sus siglas en inglés) de ser humano cultivadas provenientes de la línea de células ARPE-19 (ATCC CRL-2502) son tratadas con un agente que estimula la translocación nuclear de Nrf2. El tratamiento para agente puede preceder o bien ser concomitante con la exposición de las células de RPE a condiciones de estrés oxidativo. El estrés oxidativo es generado por la inclusión de hidroperóxido de t-butilo (ICN Biomedicals, Irvine, CA) , menadiona (Sigma-Aldrich, St. Louis. MO) , o bien S-nitroso-N-acetil-DL-penicilamina (SNAP, Sigma-Aldrich) , o una combinación de estos agentes, en el medio de incubación durante hasta siete días. La inhibición de la enzima limitante de la velocidad de la reacción en síntesis de glutationa, ?-glutamilcisteina sintetasa, por inclusión de butionina sulfoximina (Sigma-Aldrich) en el medio de cultivo, se emplea sola o en combinación con los demás agentes indicados arriba. Durante el transcurso de los tratamientos, se efectúan inmuno-ensayos cuantitativos para monitorear la formación de malondialdehído (MDA) , 4-hidroxinonenal (HNE) , nitrotirosina, y modificaciones de producto final de glicación avanzada (AGE, por sus siglas en inglés) a proteínas celulares de RPE. Estos ensayos emplean anti sueros anti-MDA y anti-HNE (Alpha Diagnostics, San Antonio, TX) , anticuerpo anti-AGE (Wako Chemicals, Richmond, VA) y anticuerpo anti-nitrotirosina (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY) . Una reducción del nivel de una o varias de las modificaciones de proteínas en células expuestas al agente en comparación con las células no expuestas al agente indica una inhibición a la formación de modificaciones de proteína o aductos encontrados en drusen debido a una expresión incrementada de genes que codifican enzimas antioxidantes y proteínas y enzimas de detoxificación de fase II. Ejemplo 5 Ensayo de Estrés oxidativo In Vitro; Efectos Protectores de Pre-tratamiento con Quercetina La presente invención ofrece un estudio en donde células endoteliales retinales cultivadas fueron expuestas a un estrés oxidativo para evaluar los efectos protectores del pre-tratamiento con quercetina. Además, el presente ejemplo ofrece un sistema de ensayo para tamizar compuestos para actividad terapéutica en retinopatía diabética no proliferativa . Células endoteliales retinales de bovino (BRECs) (VEC Technologies, Rensselaer, NY) fueron cultivadas en platos de plástico cubiertos con fibronectina (50 mg/ml) a una temperatura de 37 °C en C02 al 5% en medio completo MCDB-131 (VEC Technologies, Rensselaer, NY) . Para condiciones de medio libre de suero (SFM) , se utilizó MCDB-131 suplementado a 5ml/500ml con 100X antibiótico/antimicótico, L-glutamina 10 mM, y BSA al 0.1% (todos de Life Technologies Inc., Grand Island, NY) . Las células BRECs fueron sembradas a razón de 10,000 células/pozo y se permitió su fijación de cultivo durante tres días en 0.2 ml/pozo en medio completo (suero bovino fetal al 10% (FBS) ) . El medio completo fue reemplazado con SFM durante las veinticuatro horas siguientes en dicho momento se agregaron quercetina 25 µM, DL-butionina- (S,R) -sulfoximina (BSO, Sigma, St . Louis, MO) 100 µM, y DMSO al 0.1%. El día siguiente, todo el medio fue reemplazado por SFM (0.1 ml/pozo) que contenía hidroperóxido de t-butilo 0-500 µM
(ICN Biomedicals, Irvine, CA) . Después de cuatro horas de incubación a una temperatura de 37°C en C02 al 5%, el ensayo fue iniciado mediante la adición de 20 µm de una mezcla de veinte partes de MTS (3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -5- (3-carboximetoxifenil) -2- (4-sulfofenil) -2H-tetrazolio, sal interna) y una parte de PMS (metosulfato de fenacina) del kit de ensayo de Proliferación de Células No Radioactivo Promega CellTiteer 96® (Promega Corporation, Madison, WI) . Las placas fueron regresadas al incubador durante tres horas y después se registraron las absorbancias netas a 490 nm, obtenidas por medio de la resta de una media de blanco y se utilizaron como una medición de los niveles de células viables. ' Utilizando seis pozos por condición, el ensayo fue efectuado tres veces. Los valores de absorbancia fueron normalizados de tal manera que los pozos de control sin hidroperóxido t- butilo igualaran el 100%, y se combinaron los datos de los tres ensayos. Se encontró una diferencia estadística global entre grupos de tratamiento (véase figura; ANOVA, P<0.05). Como se muestra a través de los datos de la figura, la exposición a hidroperóxido de t-butilo resultó en reducciones significativas de la supervivencia de las células en todas las concentraciones. Además, el pre-tratamiento con quercetina sola proporcionó números más elevados de células viables que en el. grupo de control para cada concentración de hidroperóxido de t-butilo. El pre-tratamiento con BSO solo no tuvo efecto sobre la supervivencia de las células, pero mejoró significativamente la toxicidad de todas las concentraciones de hidroperóxido de t-butilo. Un pretratamiento combinado con quercetina y BSO resultó en una supervivencia celular igual a la observada con el pretratamiento con quercetina sola a excepción del grupo de exposición a hidroperóxido de t-butilo 100 µM. En este grupo, el pre-tratamiento combinado restauró solamente parcialmente la supervivencia de las células. En este estudio, el pre-tratamiento con BSO mejoró la toxicidad de exposiciones subsiguientes a hidroperóxido de t-butilo. Este resultado era esperado puesto que el hidroperóxido de t-butilo es eliminado en gran parte por glutationa peroxidasa y puesto que BSO inhibe la ?-glutamilcisteina sintetasa, la enzima limitante de la velocidad de la reacción en la síntesis de glutationa. Se ha reportado que la quercetina eleva los niveles de glutationa mediante la transactivación el promotor de la sub-unidad catalítica de ?-glutamilcisteina sintetasa (Myhrstad, et al . , 2002, Free Radical Biology and Medicine, 32:386-393). La disminución del incremento de la toxicidad de BSO por el pretratamiento combinado con quercetina y BSO es consistente con un mecanismo a través del cual la quercetina tiene efectos antioxidantes a través de expresión enzimática a través de la vía Nrf2/ARE. Las referencias mencionadas aquí, en la medida en que proporcionan ejemplo de procedimiento u otros detalles suplementarios a los indicados aquí, se incorporan específicamente por referencia. Las personas con conocimientos ordinarios en la materia, tomando en cuenta la presente divulgación, podrán observar que se pueden hacer modificaciones a las modalidades divulgadas aquí sin salirse del espíritu y alcance de la invención. Todas las modalidades divulgadas aquí pueden efectuarse y experimentos sucesivos tomando en cuenta la presente divulgación. El alcance completo de la invención se presenta en la divulgación y en modalidades equivalentes. La especificación no debe considerarse para limitar indebidamente el alcance completo de protección a la cual la presente invención tiene derecho. Como se utilizan aquí y a menos que se indique lo contrario, los términos "un" y "una" significan "uno", "al menos uno" o "uno o más".