MXPA06006651A

MXPA06006651A - Metodos para suprimir una respuesta inmune o un tratamiento para un trastorno proliferativo.

Info

Publication number: MXPA06006651A
Application number: MXPA06006651A
Authority: MX
Inventors: Joel Moss
Original assignee: Gov Health & Human Serv
Priority date: 2003-12-09
Filing date: 2004-12-09
Publication date: 2006-08-11
Also published as: TR200808208T1; AU2004296868A1; TR200604485T1; IL176214A0; BRPI0417498A; ZA200604724B; US20120039903A1; EP1694331B1; CN1889958A; CA2546920A1; EP1694331A1; JP2007513962A; ATE447957T1; US20070173514A1; AU2004296868B2; WO2005056014A8; EP1694331B8; RU2006124421A; WO2005056014A1; DE602004024115D1

Abstract

Se describen aqui metodos para suprimir una respuesta inmune de un sujeto, tratar un neoplasma en un sujeto, o tratar una enfermedad vascular fibroproliferativa en un sujeto, que incluye la administracion al sujeto de una cantidad terapeuticamente efectiva de un compuesto de 2-(4-piperazinilo)-4 H-1-benzopiran-4-sustituido con o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo (Ver formula (A)).

Description

MÉTODOS PARA SUPRIMIR UNA RESPUESTA INMUNE O UN TRATAMIENTO PARA UN TRASTORNO PROLIFERATIVO PRIORIDAD Esta solicitud reclama el beneficio de la solicitud provisional de E.U.A. No. 60/528,340, presentada el 9 de diciembre del 2004, la cual se incorpora aquí por referencia.

CAMPO DE LA INVENCIÓN Se describen aquí métodos y composiciones farmacéuticas para tratar trastornos proliferativos y para suprimir la respuesta de un sistema inmune que involucra la administración de ciertos compuestos de 4H-1-benzopiran-4-ona a un sujeto.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Fosfinositidas de fosforilato de fosfatidilinositol 3-cinasas (PI3K) en el 3-hidroxilo. Estas enzimas generan mensajeros secundarios (por ejemplo, PIP3) y actúan como transductores en corriente descendente de receptores de cinasa de tirosina y receptores acoplados a la proteína G. Los P13Ks se involucran en un gran número de procedimientos fundamentales incluyendo apoptosis, proliferación, motilidad y adhesión. (Ver Walter y otros, Molec. Cell 6:909-919,2000). De esta forma, varios inhibidores P13K han sido desarrollados. El objetivo mamífero de rapamicina (mTOR) es una cinasa de treonina de serina de 289 kDa que también es conocida como el objetivo-1 FKBP-12 (RAFT-1 ) y la proteína asociada con rapamicina FKBP-12. Existen varios dominios conservados de mTOR, incluyendo un dominio de cinasa de serina - treonina. Los modelos de células T sugieren que IL-2 y otros factores promueven la activación de mTOR y subsecuentemente promueven el crecimiento de la célula a través de la indución de la síntesis de proteína. mTOR se sabe que contribuye a la activación de cinasas P70 S6, las cuales a su vez catalizan la fosforilación de la proteína ribosomal 40S, S6, requerida para la activación de polisomas para conducir la síntesis de proteína y la traducción de ARNm. Además, mTOR activa el factor 4E de iniciación eucariótica. De esta forma, mTOR juega un rol en la regulación de la síntesis de proteína y en el ciclo de la célula. Se cree que mTOR actúa como un punto de control percibiendo el estado de la célula y regulando el avance de la célula a través de la fase G1-S. Varias trayectorias del ejecutador en corriente ascendente y en corriente descendente de mTOR se utiliza para regular las actividades de mTOR. De esta forma, los compuestos que inactivan mTOR a través del enlace de mTOR se pueden utilizar para regular la función del ciclo de la célula, y por lo tanto el crecimiento de la célula. Ya que mTOR específicamente funciona en linfocitos, la inhibición de mTOR también se puede utilizar para alterar la señalización en' células T y B (ver, Kirken y Want, Transplantation Proc. 35:227S-230S, 2003). Los inhibidores mTOR conocidos incluyen LY294002 (2-(4- morfolinil)-8- fenil-4H-1-benzopiran-4-ona) y rapamicina. La rapamicina se utiliza en la inmunosupresión, en los protocolos quimioterapéuticos, y en la prevención de restenosis coronaria post-angioplastía. LY294002 bloquea la fosforilación dependiente de P13K de la cinasa de proteína B. La rapamicina tiene importantes defectos adversos, incluyendo hipercolesterolemia, feumonitis inducida por fármaco, toxicidad renal, hipertensión, e incremento de la predisposición para infecciones de oportunidad. La proliferación de células indeseada es un componente de muchos procesos de enfermedad. Por ejemplo, el crecimiento de célula no deseado puede conducir a la formación de ya sea tumores benignos o malignos. De acuerdo con la Sociedad de Cáncer Americano, el cáncer es un grupo de enfermedades caracterizadas por el crecimiento no controlado y esparcimiento de células anormales. Si el esparcimiento no está controlado, puede dar como resultado la muerte. Aunque el cáncer por lo general es referido como una condición individual, actualmente consiste de más de 100 diferentes enfermedades. Estas enfermedades se caracterizan por el crecimiento no controlado y la esparción de células anormales. El cáncer puede surgir en muchos sitios y comportarse de manera diferente dependiendo de su órgano de origen. Existe una búsqueda continua de agentes para uso en el tratamiento de los diferentes tipos de cáncer.

El crecimiento de células no deseado también es un componente de restenosis, la recurrencia de estenosis o de estenosis de arteria después de una cirugía correctiva. La restenosis ocurre después de la derivación de arteria coronaria (CAB), endarterectomía, transplante de corazón, y particularmente después de angioplastía, aterectomía, extirpación láser o moldeo. La restenosis es el resultado del daño de la pared de los vasos sanguíneos durante el procedimiento de apertura de lumen. En algunos pacientes, el daño inicia una respuesta de reparación que se caracteriza a través de la proliferación de la célula del músculo liso referido como "hiperplasia" en la región traumatizada por la angioplastía. Esta proliferación de las células del músculo liso reestrechan el lumen que fue abierto a través de la angioplastía dentro de unas pocas semanas a pocos meses, por lo tanto necesitando repetir la angioplastía u otro procedimiento para aliviar la restenosis. En una respuesta inmune, las células T y/o B proliferan la respuesta a un estímulo visto como "exógeno" a través del sistema inmune. Aunque generalmente las respuestas inmunes son benéficas, existen situaciones en donde se desea una respuesta inmune disminuida. Por ejemplo, en los transtornos inmunes, las células del sistema inmune incorrectamente identifican un componente propio como exógeno y proliferan en respuesta al componente propio. Las respuestas inflamatorias pueden ser perjudiciales como lo pueden ser las respuestas inmunes contra los órganos transplantados.

Existe claramente una necesidad de desarrollar agentes que puedan reducir la proliferación celular indeseada. Estos agentes incluyen agentes que inducen la inmunosupresión, quimioterapéuticos, y agentes para el tratamiento de restenosis.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Se describen aquí métodos para suprimir una respuesta inmune en un sujeto y para tratar un trastorno proliferativo en un sujeto. Estos métodos incluyen administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de 2-(4-piperazinil)-4H-1-benzopiran-4-ona sustituido, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, que tiene la estructura de Fórmula A en donde la presencia de cada uno R-i y R2 es opcional y Ri y R2 son cada uno independientemente seleccionados de alquilo, alquilo sustituido, heteroalquilo, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido heterocicloalquilo, heterocicloalquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxi, halógeno, hidroxi, o amino.

También se describen aquí métodos para seleccionar un agente inmunosupresor o un agente anti-proliferativo. El método incluye seleccionar un agente de prueba que preferencialmente inhibe cinasa 2 de caseína y/o la fosforilación de cinasa P70 S6 según comparado con la fosforilación dependiente de 3-cinasa (P13K) de fosfatidilinositol de un substrato. Además se describen composiciones farmacéuticas que comprenden 2-(4-piperazinil)-8-fenil-4H-1-benzopiran-4-ona o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y un portador farmacéuticamente aceptable.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1A es una imagen digital que muestra los resultados en donde las células A549 se incubaron sin o con 100 µM de LY303511 , rapamicina, 200 ng/ml, o 200 nM de wortmanina, (o en la imagen digital mostrada en la Figura 1 B y la gráfica de barras y la imagen digital mostrada en la Figura 1C. Las células se hicieron reaccionar con 0-100 µM de LY303511 durante una hora antes de la adición de L/l durante 30 minutos y la preparación de los lisatos de célula. Las muestras (70 µg) de proteínas se separaron a través de SDS-PAGE y se transfirieron a membranas nitrocelulosas antes de la inmunodetección de cinasa fosfo-p70 S6 T389 (pS6K), fosfo -Akt S473 (pAkt), cinasa total p70 S6 (S6K), Akt total (Akt), fosfo-mTOR S2481 (pmTOR), o mTOR total (mTOR) a través de Western blot. Las posiciones de los estándares de proteína (kDa), están en la derecha. Para la gráfica de barras y las imágenes digitales mostradas en la Figura 1C, las mediciones de la densidad de banda también se representaron gráficamente. Las densidades de la banda integradas para pmTOR se normalizaron para aquellas de mTOR. Las densidades de las bandas normalizadas para células tratadas con inhibidores se expresaron con relación a aquellos tratados con DMSO=1 (pmTOR/DMSO). Los datos son los promedios de los valores de 5 experimentos (+SEM).*p< 0.05 a través de la prueba de Student. Todos los paneles representan datos del mismo experimento, y son representativos de cuatro experimentos separados. La Figura 2A es una gráfica de barras que muestra la proliferación de la célula de bloqueo LY303511 , la síntesis de ADN, y el avance del ciclo de la célula, en células A549. A. Las células A549 (80,000 células por plato de 35 mm) se hicieron crecer durante un día en un medio con FBS antes de la adición de 0.1% DMSO, 100 µM de LY303511 , rapamicina, 200 ng/ml, 200 nM wortmanina, o 100 µM de LY294002 durante 24 horas. Las células después se incubaron con tripsina, se recolectaron y se contaron. Los datos son los promedios de células/cavidad x 10 -4 ± SEM de ensayos duplicados en tres experimentos. *p<0.05 a través de la prueba t Student. La Figura 2B es una gráfica lineal de los resultados obtenidos cuando las células A549 (4,000 por cavidad) se hicieron crecer en placas de 96 cavidades en medio con FBS durante 24 horas antes de la adición de 10 mM BrDU más O-200 µM de LY303511 sin o con rapamicina, 200 ng/ml, o con rapamicina sola (0-200 ng/ml). La incorporación de BrDU (absorbancia a 490/465) se midió a través de ELISA in situ según las instrucciones del fabricante (kit de detección BrDU, Roche). Para cada experimento, se expresó BrDU en las células incubadas con inhibidores como un porcentaje de las células tratadas con 0.2% de control DMSO (% de control). Las mediciones de la absorbancia promedio para los controles = a 100% en cada experimento fue de 0.9 ±0.3, 0.8 ±0.3, y 0.8 ± 0.3. Los datos son los promedios del contenido BrDu ± SEM para ensayos por triplicado en tres experimentos. *p<0.05 a través de la prueba t de Student. La Figura 2C es una gráfica de barras que muestra que LY303511 inhibe el ciclo de la célula a través de G1 combinado y G2/M en el resto. Las células A549 se hicieron crecer en medio con FBS durante 48 horas antes de la adición de 0-100 µM de LY303511 sin o con rapamicina, 200ng/ml durante 24 horas. Las células después se cosecharon y se incubaron con yoduro de propidio durante dos horas antes de continuar utilizando un FACS Calibur de Becton-Dickson. Los datos son los promedios de los porcentajes de células en la fase G1 , S, o G2/M del ciclo de la célula ± SEM. *p<0.05 contra control DMSO, o t p=0.056 contra 10 µM de LY303511 , a través de la prueba t de Student. Las Figuras 3A - 3D son gráficas de barra e imágenes digitales que muestran el efecto de LY303511 sobre los niveles de los inhibidores del ciclo de célula y ciclinas. Las células A549 (aproximadamente -1x106 células por placa de 100 mm) se hicieron crecer durante 48 horas antes de la adición de 0.1% DMSO, 100 µM de LY303511, o rapamicina, 200 ng/ml, durante 0, 12, o 24 horas. En los tiempos indicados, las células se homogeneizaron y se almacenaron a -80° C. Para los análisis de Western blot, se separaron muestras, (70 µg) de proteínas de lisato a través de SDS-PAGE que se transfirieron a membranas de nitrocelulosa y se hicieron reaccionar con los siguientes anticuerpos: Figuras 3A-3D. Fosfo-S6K T389 (pS6K), p27 Quipl, p21 Cip1 , fosfo-Rb S807/S811 , o las Figuras 3C-3D. Ciclina A, Ciclina B, Ciclina D, y Ciclina E. Todas las tensiones son de un experimento. Las Figuras 3A-3D (densidad relativa) son promedios de los valores densitométricos de platos por duplicado tratados con inhibidores durante 24 horas con relación al control DMSO =1.0 en tres experimentos. *p< 0.05 contra DMSO de la prueba t de Student. Las Figuras 4A-4D son gráficas de barra e imágenes digitales que muestran que LY303511 inhibe la fosforilación estimulada por suero de S6K Akt (Figura 4A y 4B), así como la proliferación en células PASM (Figura 4C y 4D). Después de la incubación en medio libre de suero durante 24 horas, las células PASM se incubaron sin o con 100 µM de LY303511 , rapamicina, 200 ng/ml, o 200 nM de wortmanina (Figura 4A), o 0-100 µM de LY303511 (Figura 4B), durante una hora después de la adición de 10% de FBS durante 30 minutos y la preparación de lisatos de célula. Se separaron cantidades ¡guales de proteína (20 µg/gel) a través de SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa antes de la inmunodetección de cinasa fosfo - p70 S6 T389 (pS6K) o fosfo-Akt S473 (pAkt) a través de Western blot. Los datos son de un experimento representativo de cinco. Las células PASM (4,000 por cavidad) se hicieron crecer en placas de 96 cavidades durante 24 horas antes de la incubación durante 4 horas en medio (Figura 4C) o sin 10% FBS (Figura 4D). Las células después se incubaron en medio fresco conteniendo 10% de FBS, 10 µM BrDU y 0-100 µM de LY303511 sin o con rapamicina, 200 o 400 ng/ml, y se midió la incorporación de BrDU durante 24 horas, a través de ELISA in situ según las instrucciones del fabricante (kit BrDU de detección, Roche). Para cada experimento, el contenido de BrDU de las células incubado con los inhibidores se expresó con relación a esas células incubadas con 0.1% de control de DMSO, (% de control). La absorbancia de control promedio (=100%) para cada experimento utilizando células de diferentes donadores puede 0.22±0.06 y 0.24±0.06 para la Figura 4C y 4D, respectivamente (=100%). Los datos son los promedios de los valores BrDU ±SEM de tres experimentos con ensayos en sextuplicado. *p<0.05 contra. Control de DMSO, o | p<0.05 contra 10 µM de LY303511 , a través de la prueba t de Student. Las Figuras 5A-5B son gráficas de barras que muestran que LY303511 inhibe el ciclo de la célula causando que G1 y G2/M combinados se detengan y que LY303511 inhiba la actividad de CK2. Para los datos mostrados en la Figura 5A, las células PASM se cultivaron en un medio FBS, durante 48 horas antes de la adición de 0-100 µM de LY303511 sin o con rapamicina, 400 ng/ml, durante 24 horas. Las células después se cosecharon y se incubaron con yoduro de propidio durante 2 horas antes de continuar utilizando un FACSCalibur de Becton-Dickson. Los datos son los promedios (±SEM) de los porcentajes de células en la fase G1 , S, o G2/M del ciclo de la célula en tres experimentos con ensayos por duplicado. *p<0.05 contra control DMSO, o t P<0.05 contra 10 µM de LY303511 , a través de la prueba t de Student. La Figura 5B es una gráfica de barras que muestra que LY303511 o LY294002 inhiben CK2 in Vitro. Como según el fabricante, (Upstate Biotechnologies), 0 o 100 ng de CK2 recombinantes se incubaron con péptido de substrato CK2 y 32P-?-ATP durante 10 minutos con 1 % de DMSO o inhibidores como se indicó. Los datos son los promedios de los valores para las muestras con inhibidores estresados como porcentajes para ese control, que fueron (promedio ±SEM) 0.2±0.03 pmoles de fosfato/100 ng de proteína/10 minutos. Los datos de estos tres experimentos se llevaron a cabo por duplicado. *p<0.05 a través de la prueba de Student cuando se compara con el control DMSO. La figura 6 muestra que el protocolo finalizó a los 33 días después de haber iniciado el tratamiento de fármaco. Después de la eutanasia o de la muerte, los tumores se extirparon para el análisis histológico, la inmunohistoquímica, y Western blot Las Figuras 7A-7B son gráficas de barra que muestran que LY303511 inhibe el crecimiento de células de adenocarcinoma de próstata (PC-3) en ratones desnudos. LY303511, 10mg/kg/d se administró enzima para atenuar el crecimiento de tumor PC-3 en ratones desnudos. El grado de inhibición del crecimiento fue proporcional a la duración del tratamiento con LY303511. Un curso de 20 días de LY303511 (LY3) fue efectivo para la inhibición del crecimiento del tumor como un curso de 10 días. La Figura 7C es un gráfica de un análisis de supervivencia de Kaplan-Mieir. El análisis incluye la premisa de que un evento sucede cuando un tumor alcanza 300 mm3. El eje y describe la probabilidad de que el tamaño del tumor es menor de 300 mm3. Se deberá observar que el grupo 4 tuvo un evento temprano, el cual probablemente representa un valor atípico (por ejemplo, la dosis completa del fármaco puede no haber sido recibida por el animal). Las Figuras 8A-8F son gráficas que de barras que muestran que LY303511 inhibe la producción de citosina inducida por lipopolisacárido (LPS) 0 la actividad de STATI en macrófagos perifonéales de ratón primarios o células A549. Los ratones de tipo silvestre de Jackson (Jac) y Tacónicos (Tac) se utilizaron. Los macrófagos peritoneales se cosecharon 3 días antes de la inyección de tioglicolato. Las células se incubaron durante 3 días en 2% de FCS RPMI. El sobrenadante se recolectó después de la estimulación con LPS 1 µg/ml sin o con LY303511 (1~100µM) o DMSO durante 24 horas. Se midieron las citosinas (interleucina (IL)-12p70, el factor de necrosis de tumor (TNF)-a, interferón (IFN)-?, MCP-1 , IL-10, IL-6) en sobrenadantes de célula. Los resultados demostraron que LY303511 causó una reducción dependiente de la dosis de las 6 citosinas (ver Figura 8A-8F). La adición de 100 µM de LY303511 dio como resultado la secreción de citosina similar a los niveles antecedentes. De esta forma, LY303511 claramente puede reducir la expresión de citosina, y tiene un efecto anti-inflamatorio. Las Figuras 9A-9B son un grupo de gráficas de barra que muestran la inhibición de la actividad de STAT1 inducida por LPS/IFN-? a través de LY303511. Las células A549 fueron temporalmente transferidas por un con un vector reportero expresando luciferasa de luciérnaga a través de STAT1 (GAS-luc, Clontech), y se incubaron con 100 mcM LY303511, rapamicina, 200ng/ml, o ambos, durante una hora antes de la adición de LPS/IFN-? durante 6 horas. La actividad de STAT1 (actividad de luciferasa) se midió en lisatos de célula (RLU). Los datos se presentaron por muestras de triplicado ±SEM, y son representativos de dos experimentos independientes. Como se muestra en las Figuras 4A y 4B, LY303511 inhibe la activación de STAT1 a través de dos mediadores inflamatorios, LPS/IFN-?.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS VARIAS MODALIDADES Para un fácil entendimiento, los siguientes términos utilizados aquí se describen a continuación con más detalle: Términos químicos "Alquilo" se refiere a un grupo alquilo de cadena recta o de cadena ramificada, cíclico, que contiene solamente un carbono y un hidrogeno, y a menos que se mencione otra cosa típicamente contiene de uno a doce átomos de carbono. Este término además se ejemplifica a través de los grupos tales como metilo, etilo, n-propilo, isobutilo, t-butilo, pentilo, pivalilo, heptilo, adamantilo, y ciclopentilo. Los grupos alquilo pueden ser ya sea no sustituidos o sustituidos con uno o más substituyentes como se describe más adelante. "Alquilo sustituido" se refiere a un alquilo como se describió anteriormente en donde uno o más átomos de hidrogeno de carbono del alquilo están reemplazados por otro grupo tal como halógeno, arilo, arilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, y combinaciones de los mismos. Los alquilos sustituidos ilustrativos incluyen bencilo, triclorometilo, y similares. "Heteroalquilo" se refiere a un alquilo como se describió anteriormente en donde uno o más átomos de hidrogeno de carbono del alquilo están reemplazados por un átomo heterogéneo tal como N, O, P, B o S. Un alquilo sustituido con un heterocicloalquilo, heterocicloalquilo sustituido heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxi, ariloxi, o amino se incluye dentro del "heteroalquilo". Los heteroalquilos ilustrativos incluyen ciano, benzoilo, 2-piridilo, 2-furilo y similares. "Cicloalquilo" se refiere a un radical hidrocarburo no aromático cíclico ¡nsaturado o saturado que tiene un anillo individual o múltiples anillos condensados. Los cicloalquilos ilustrativos incluyen ciclopentilo, ciciohexilo, biciclooctilo, y similares. "Cicloalquilo sustituido" se refiere al cicloalquilo como se describió anteriormente en donde uno o más átomos de hidrogeno de carbono están reemplazados por otro grupo tal como un halógeno, arilo, arilo sustituido, alcoxi, ariloxi, amino y combinaciones de los mismos. "Heterocicloalquilo" se refiere a un radical cicloalquilo como se describió anteriormente en donde uno o más de los átomos de carbono del radical cíclico están reemplazados por un átomo heterogéneo tal como N, O, P, B o S. Los heterocicloalquilos ilustrativos incluyen, por ejemplo, piperazinilo, morfolinilo, tetrahidropiranilo, tetrahidrofuranilo, piperidinilo, pirrolindinilo, oxazolinilo, y similares. "Heterocicloalquilo sustituido" se refiere a un radical heterocicloalquilo como se describió anteriormente en donde uno o más átomos de hidrogeno o de carbono están reemplazados por otro grupo tal como halógeno, arilo, arilo sustituido, alcoxi, ariloxi, amino y combinaciones de los mismos. "Arilo" se refiere a un substituyente aromático que puede ser un anillo aromático individual o múltiples anillos aromáticos que están fusionados juntos, enlazados covalentemente o enlazados a un grupo común tal como una porción de metileno o de etileno. El grupo enlazador común también puede ser carbonilo como benzofenona u oxigeno como éter difenílico o nitrógeno en difenilamina. El (los) anillo(s) aromático(s) puede incluir fenilo, naftilo, bifenilo, difeniléter, difenilamino y benzofenona entre otros. En los ejemplos particulares, los arilos han estado entre 1 y 20 átomos de carbono. "Arilo sustituido" se refiere a un radical arilo como se describió anteriormente en donde uno o más átomos de hidrogeno o carbono está reemplazado por uno o más grupos funcionales tales como alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, heterocicloalquilo, heterocicloalquilo sustituido, halógeno, haloalquilo, hidroxi, amino, alcoxi y tio. Los arilos sustituidos ilustrativos incluyen clorofenilo, 3,5, dimetilfenilo, 2,6- diisopropilfenilo y similares. "Heteroarilo" se refiere a anillos aromáticos en donde uno o más átomos de carbono del anillo(s) aromáticos(s) está reemplazado por un átomo heterogéneo (s) tal como N, O, P, B, o S. Heteroarilo se refiere a estructuras que pueden ser un anillo aromático individual, o anillos aromáticos múltiples o uno o más anillos aromáticos acoplados a uno o más anillos no aromáticos. Los heteroarilos ilustrativos incluyen, por ejemplo, tiofeno, piridino, isoxazol, talidimida, pirazol, indol, furano y similares. "Heteroarilo sustituido" se refiere a un radical heteroarilo como se describió anteriormente en donde uno o más átomos de hidrogeno de carbono están reemplazados por uno o más grupos funcionales tales como alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, heterocicloalquilo, heterocicloalquilo sustituido, halógeno, haloalquilos, hidroxi, amino, alcoxi, y tio. "Alcoxi" se refiere a un radical -OZ en donde Z se selecciona de alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, heterocicloalquilo, heterocicloalquilo sustituido, y combinaciones de los mismos. Los radicales alcoxi ilustrativos incluyen metoxi, etoxi, benciloxi, y t-butoxi. Un término relacionado es "ariloxi" en donde Z se selecciona de arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, y combinaciones de los mismos. Los radicales alcoxi ilustrativos incluyen fenoxi, fenoxi sustituido, 2-piridinoxi, 8- quinalinoxi y similares. "Amino" se refiere a un grupo -NZ1 Z2 en donde cada uno de Z1 y Z2 se selecciona independientemente de hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, heterocicloalquilo, heterocicloalquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxi, ariloxi, y combinaciones de los mismos. "Tio" se refiere a un grupo -SZ1 Z2 en donde cada uno de Z1 y Z2 independientemente se selecciona de hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, heterocicloalquilo, heterocicloalquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxi, ariloxi, y combinaciones de los mismos. "Halógeno" se refiere a substituyentes de fluoro, bromo, cloro y yodo. "Sales farmacéuticamente aceptables" de los compuestos actualmente descritos incluyen aquellos formados de cationes tales como sodio, potasio, aluminio, calcio, litio, magnesio, zinc y de bases libres tales como amoniaco, etilenodiamina, N-metil-glutamina, lisina, arginina, omitina, colina, N,N1-dibenciletilenodiamina, cloroprocaína, dietanolamina, procaína, N-bencilfenetilamina, dietilamina, piperazina, tris(hidroximetil) aminometano, e hidróxido de tetrametilamonio. Estas sales se pueden preparar a través de procedimientos estándares, por ejemplo a través de la reacción del ácido libre con una base orgánica o inorgánica adecuada. Cualquier compuesto químico recitado en esta especificación puede alternativamente administrarse como una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. "Sales farmacéuticamente aceptables" también son inclusivas de ácido libre, base y formas zwiterionicas. La descripción de sales farmacéuticamente aceptables adecuadas se pueden encontrar en Handbook of Pharmaceutical Salts, Properties, Selection and Use, Wiley VCH (2002). Un "Agente farmacéutico" o "fármaco" se refiere a un compuesto químico o composición capaz de inducir un efecto terapéutico o profiláctico deseado cuando se administra apropiadamente a un sujeto.

Otros términos "AKT" se refiere a cinasa de proteína de serina/treonina que se sabe que regula las señales de supervivencia de la célula en respuesta a los factores de crecimiento, citocinas, y Ras oncogénico. AKT se convierte en activado a través de la trayectoria de cinasa fosfoinositida-3-OH (P13K) y a través de otras cinasas en corriente ascendente. AKT inhibe las trayectorias de muerte de célula a través de las proteínas de fosforilación e inactivación directamente involucradas en apoptosis, incluyendo Bad, procaspasa 9, y miembros de la familia del factor de transcripción Forkhead. AKT también se conoce como una cinasa de proteína B (PKB, No. NP_005154 GenBank). Un "animal" es un organismo vertebrado multicelular viviente, una categoría que incluye, por ejemplo, mamíferos y aves. Un "mamífero" incluye mamíferos tanto humanos como no humanos. "Sujeto" incluye sujetos tanto humanos como animales. Un "agente anti-proliferativo" se refiere a un agente que disminuye la proliferación, o causa la muerte de las células. Los agentes anti- proliferativos incluyen agentes quimioterapéuticos. "Ateroesclerosis" se refiere al estrechamiento progresivo y endurecimiento de los vasos sanguíneos a través del tiempo. La Ateroesclerosis es una forma común de aterioesclerosis en donde los depósitos de plaquetas amarillentas (ateromas) conteniendo colesterol, material lipoideo y lipófagos se forman dentro del medio íntimo e interior de las arterias de tamaño grande y medio. Una "enfermedad auto-inmune" es una enfermedad en donde el sistema inmune produce una respuesta inmune (por ejemplo, una respuesta de célula B o una respuesta de célula T) contra un antígeno que es parte del hospedero normal (es decir, un auto-antígeno), con un daño consecuente de los tejidos. Un auto-antígeno se puede derivar de la célula hospedero, o se puede derivar de un organismo comensal tal como los micro-organismos (conocidos como organismos comensales) que normalmente colonizan las superficies mucosas. Las enfermedades auto-inmunes ilustrativas que afectan a los mamíferos incluyen artritis reumatoide o oligoartritis juvenil, artritis inducida por colágeno, artritis inducida por auxiliar, el síndrome de Sjogren, esclerosis múltiple, encéfalo mielitis auto-inmune experimental, enfermedad del intestino inflamatorio (por ejemplo, enfermedad de Crohn o colitis ulcerativa) atrofia gástrica auto-inmune, pemfigus vulgaris, soriasis, vitiligo, diabetes de tipo 1 , diabetes no de obesidad, miastenia gravis, enfermedad de Grave, tiroiditis de Hashimoto, colangitis esclerosante, sialadenitis esclerosante, lupus eritematosis sistémico, trombocitopenia púrpura auto-inmune, el síndrome de Goodpasture, la enfermedad de Addison, esclerosis sistémica, polimiositis, dermatomiositis, anemia hemolítica auto-inmune, anemia perniciosa, y similares. "Quimioterapia" se refiere a la administración de uno o una combinación de compuestos, referidos como "agentes quimioterapéuticos" para aniquilar o alentar la reproducción de células que se multiplican rápidamente. Los agentes quimioterapéuticos por los expertos en la técnica, que incluyen pero no se limitan a 5-fluorouracilo (5-FU), azatioprina, ciclofosfamida, antimetabolitos (tales como Fludarabina), antineoplasticos (tales como Etoposida, Doxorubicina, metotrexato y Vincristina), carboplatina, cis-platina, y los taxanos, tales como taxol. La rapamicina también ha sido utilizada como un quimioterapéutico. "Enfermedades de injerto contra hospedero" se refiere a una complicación de los transplantes de medula ósea en donde las células T en el injerto de medula ósea del donador se ponen a la ofensiva y atacan los tejidos del hospedero. La enfermedad de injerto contra hospedero (GVHD) se ve en la mayoría de los casos en donde el donador de la medula ósea no está relacionado con el paciente o cuando el donador está relacionado con el paciente pero no es una coincidencia perfecta. Existen dos formas de GVHD: una forma temprana llamada GVHD aguda que ocurre justo después del transplante cuando los glóbulos blancos se están aumentando, y una forma tardía denominada GVHD crónica. La GVHD aguda típicamente ocurre dentro de los primeros tres meses después del transplante y puede afectar la piel, el hígado, el estomago, y/o los intestinos. El primer indicio es usualmente un salpullido sobre la mano, el pie, la cara que se puede esparcir y lucir como quemadura de sol. Los problemas severos de GVHD agudo pueden incluir vejigas en la piel, diarrea líquida o sanguínea con calambres, e ictericia (amarillamiento de la piel y los ojos) que refleja la implicación del hígado. GVHD crónica típicamente ocurre 2-3 meses después del transplante y origina síntomas similares a aquellos de los trastornos auto-inmunes tales como lupus y escleroderma. Los pacientes desarrollan un salpullido con comezón seco que se incrementa y la piel de tipo cocodrilo. También puede haber pérdida del cabello, disminución de sudoramiento en la piel, y encanecimiento prematuro del cabello. La sequedad de la boca es un síntoma común. Puede avanzar a sensibilidad a los alimentos y los alimentos ácidos y condimentados pueden picar. Los ojos también pueden estar involucrados con sequedad y el sentimiento de estar irritados y de volverse rojos. Casi cualquier órgano puede ser afectado por GVHD crónica. Una "respuesta inmune" se refiere a la respuesta de una célula al sistema inmune, tal como la célula B, una célula T, un macrófago o polimorfonucleócito, a un estimulo. Una respuesta inmune puede incluir cualquier célula del cuerpo involucrada en la respuesta de defensa del hospedero, por ejemplo, una célula epitelial que secreta una citosina. Las citosinas se incluyen, pero no se limitan a interleucinas (tales como IL-12 (ver Kesniaux, Research Immunology 143:385-400, 1992), factor de necrosis de tumor (TNF)-a (ver Aggarwal and Vilcek (eds), interferón (IFN)-? (ver Farrar y Schreiber, Ann. Rev. of Immunol. 11 :571-611 , 1993), proteína quimioatrayente de monocito (MCP)-l(ver Yoshimura y Leonard Cytokines 4:131-52, 1992), IL- 10 (ver Zlotnik y Moore, Cytokines 3:366-71 , 1991 ), y IL-6 (ver Van Snick, Ann. Rev. Immunol. 8:253-78,1990). Se deberá observar que las descripciones de citosina incluyen secuencias de proteína, las secuencias de ácidos nucleicos y las descripciones de sus funciones están disponibles en el Internet, tal como en el sitio web Cytokines Online Pathfinder Encyclopaedia. Una respuesta inmune (por ejemplo, adaptativa innata) incluye, pero no se limita, una respuesta a una infección con un virus o una bacteria, una respuesta inmune innata, una respuesta a un auto antígeno, o inflamación. "Inmunosupresión" se refiere a una carencia de respuesta no específica de inmunidad celular y/o humoral. La inmunosupresión se refiere a la prevención o disminución de una respuesta inmune que ocurre cuando una célula T y/o B se reducen en número o se suprimen en su reactividad, expansión, o diferenciación. La inmunosupresión puede surgir de la activación de células T, específicas o no específicas, tales como células T reg, de la señalización de citosina, en respuesta a la irradiación, o a través de fármacos que tienen efectos inmunosupresores generalizados sobre células T y B. Un "agente inmunosupresor" se refiere a una molécula, tal como un compuesto químico una molécula pequeña, un esferoide, una molécula de ácido nucleico, u otro agente biológico, que puede disminuir una respuesta inmune tal como una reacción inflamatoria. Los agentes inmunosupresores incluyen, pero no se limitan a un agente para uso en el tratamiento de artritis (agente anti-artritis). Los ejemplos no limitantes, específicos para agentes inmunosupresores son agentes anti-inflamatorios no esferoidales, ciclosporina A, FK506, y anti-CD4. En ejemplos adicionales, el agente es un modificador de la respuesta biológica, tal como Kineret® (anakinra), Enbrel® (etanercept), o Remicade® (infliximab), un fármaco anti-reumático modificador de la enfermedad (DMARD), tal como Arava® (leflunomida), un fármaco antiinflamatorio no esferoidal (NSAIDs), específicamente un inhibidor de Ciclo-Oxigenasa-2 (COX-2), tal como Celebrex® (celecoxib) y Vioxx®( rofecoxib), u otro producto tal como Hyalgan ® (hialuronan) y Synvisc® (hilan G-F20). La rapamicina es un ejemplo adicional de un agente inmunosupresor. "Inflamación" o un "proceso inflamatorio" se refiere a una serie de eventos complejos, incluyendo dilatación de las arteriolas, capilares y venas chicas, con una permeabilidad y flujo sanguíneo incrementados, exudación de los fluidos, incluyendo proteínas de plasma y migración de leucocitos dentro del foco inflamatorio. La inflamación se puede medir a través de varios métodos bien conocidos en la técnica, tales como el número de leucocitos, el número de neutrófilos polimorfonucleares (PMN), una medición del grado de la activación de PMN, tales como la quimioluminiscencia mejorada luminal, o una medición de la cantidad de citosinas presentes. "Inhibición" o "tratar" una enfermedad se refiere a la inhibición del desarrollo completo de una enfermedad, por ejemplo, en un sujeto que está en riesgo de una enfermedad tal como una enfermedad auto inmune, la enfermedad de injerto contra hueso, o rechazo de un tejido transplantado u órgano. "Tratamiento" se refiere a una intervención terapéutica que mejora un indicio o síntoma de una enfermedad o condición patológica después de que ha empezado a desarrollarse. Como se utiliza aquí, el término "mejoramiento" con referencia a una enfermedad o condición patológica, se refiere a cualquier efecto benéfico observable en el tratamiento. El efecto benéfico puede ser evidenciado, por ejemplo, a través de un inicio retrasado de los síntomas clínicos de la enfermedad en un sujeto susceptible, o la reducción en la severidad de algunos o todos los síntomas clínicos de la enfermedad, el alentamiento del avance de la enfermedad, una reducción en el número de recaídas de la enfermedad, un mejoramiento en la salud general por el bienestar de un sujeto, o través de otros parámetros bien conocidos en la técnica que son específicos de la enfermedad particular. Una "cinasa" se refiere a una enzima que cataliza la transferencia de un grupo fosfato de una molécula a otra. Una "cinasa de treonina de serina" transfiere grupos fosfato a un grupo hidroxilo de serina y/o trionina en un polipéptido. "Cinasa P70 S6" es una cinasa que fosforila la proteína S6 de la sub-unidad 40S (sub-unidad pequeña) de ribosomas. El número de registro de GenBank No. JE0377 establece una secuencia de aminoácido ilustrativa de la cinasa P70 S6 humana. Una "3-cinasa de fosfatidil inositol" se refiere a una enzima que fosforila lípidos de inositol en la posición D-3 del anillo inositol para generar 3-fosfoinositidas, 3-fosfato de fosfatidilinositol [Ptdlns(3)P], 3,4-bisfosfato de fosfatidilinositol [Ptdlns(3,4)P2] y 3,4,5-trisfosfato de fosfatidilinositol [Ptdlns(3,4,5)P3]. El número de registro de GenBank No. AAB53966 establece una secuencia de amino ácido ilustrativa para la sub-unidad catalítica de 3-cinasa de fosfatidilinositol. "Cinasa 2 de caseína" (Número de registro en GenBank No. NPJ301887) se refiere a una enzima que preferencialmente fosforiliza proteínas acidas tales como caseínas. El número de registro de GenBank No. NP_001887 establece una secuencia de amino ácido ilustrativa de cinasa 2 de caseína. Ejemplos de sustratos de cinasa 2 de caseína incluyen p53 (Número de registro de GenBank CAA25652), BH3 que interactúa con el agonista de muerte de dominio (Bid; números de registro para transcripciones alternativas NPJD01187.1 , NP_932070.1 , NP_932071.1), Topoisomerasa II de ADN (NP__001058). Una inhibición "preferencial" de una cinasa se refiere a la disminución de la actividad de una cinasa, tal como la cinasa P70S6, más de la inhibición de la actividad de una segunda cinasa, tal como P13K. "Leucocitos" se refiere a células en la sangre, también denominadas como "glóbulos blancos", que están involucrados en la defensa del cuerpo contra organismos inefectivos y substancias extrañas. Los leucocitos se producen en la médula espinal. Existen 5 tipos principales de leucocitos, subdivididos en dos grupos principales: Leucocitos polimorfonucleares (neutrófilos, eosinófilos, basófilos) y leucocitos mononucleares (monocitos y linfocitos). "Macrófagos" se refiere a una población de fagocitos mononucleares distribuidos de forma omnipresente, responsables de numerosos procesos homeostáticos, inmunológicos, inflamatorios. La amplia variedad de distribución de tejido hace que estas células sean bien adecuadas para proveer una defensa inmediata contra elementos extraños antes de la inmigración de los leucocitos. Los macrófagos inflamatorios están presentes en varios exudados, y se pueden caracterizar a través de varios marcadores específicos, tales como la actividad de peroxidasa, y la expresión de citosina, y se derivan de monocitos que tiene propiedades similares. "Macrófagos activados" se refieren a macrófagos que poseen una actividad funcional específicamente en incremento. El proceso de diferenciación es diferente de la "activación" de macrófago, la cual es el proceso a través del cual los macrófagos diferenciados adquieren una habilidad incrementada para llevar a cabo funciones específicas. Generalmente, los macrófagos no activados son relativamente tranquilos inmunológicamente, que tienen un bajo consumo de oxigeno, bajos niveles de expresión del gen de clase II (MHC) del complejo de histocompatibilidad mayor, y poca o nada secreción de citosina. Una vez que se activan, un macrófago tiene una inhabilidad de proliferar y tiene un alto consumo de oxigeno. Además, los macrófagos activados pueden ser capaces de matar parásitos, y/o células de tumor de lyse, y secretar citosinas tales como TNF-a, IL-1 y IL-6. "Mamífero objetivo de rapamicina (mTOR)", se refiere a un polipéptido de aproximadamente 289 kDa que comparte aproximadamente 45% de identidad con proteínas S.cerevisae y proteínas Tor1 y Tor2. Las proteínas mTOR humanas, de rata y de ratón, comparten aproximadamente 95% de identidad con el nivel de amino ácido. Las proteínas mTOR son cinasas de proteína de serina/treonina (ver Hunter y otros., Cell 83:1-4, 1995;Hoekstra, Curr. Opin. Genet. Dev. 7:770-175,1997). mTOR (ver número de registro en GenBank No. L30475) fosforila la cinasa P70 S6 en la treonina 389 y fosforila y activa el enlace de la proteína del factor de iniciación de traducción eucariótico. "Neoplasia" se refiere al proceso de crecimiento anormal y no controlado de células. El producto de neoplasia es un neoplasma (un tumor), el cual es un crecimiento anormal de tejido que da como resultado una división de célula excesiva. Un tumor que no metastatiza se refiere como "benigno". Un tumor que invade el tejido circundante y/o puede metastatizar es referido como "maligno". La Neoplasia es un ejemplo de un trastorno proliferativo. Ejemplos de tumores hematológicos incluyen leucemias, incluyendo leucemia aguda (tal como leucemia linfosítica aguda, leucemia mielocítica aguda, leucemia mieloginosa aguda, y mieloblástica, cromiolítica, mielomonocítica, monocítica, y eritroleucemia), leucemias crónicas tales como mielocítica crónica (granulocítica) leucemia, leucemia mieloginosa crónica, y leucemia linfocítica crónica, vera polictemia, linfoma enfermedad de Hodgkin, linfoma non de Hodgkin (formas de grado indolente y alto), mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom enfermedad de cadena pesada, síndrome de mielodisplástico, y mielodisplasia. Ejemplos de tumores sólidos, tales como sarcomas y carcinomas, incluyen fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma ostiogénico, y otros sarcomas, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, malignidad linfoide, cáncer pancreático, cáncer de pecho, cáncer de pulmón, cáncer ovárico, cáncer de próstata, carcinoma epato celular, carcinoma de célula escamosa, carcinoma de célula basal, adenocarcinoma, carcinoma de la glándula sudorípara, carcinoma de la glándula sebácea, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de célula renal, hepatoma, carcinoma del tracto biliar, coriocarcinoma, tumor de Wilm, cáncer cervical, tumor testicular, carcinoma de vejiga, y tumores CNS (tales como glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craniofariogioma, ependioma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, menangioma, melanoma, neuroblastoma y retinoblastoma). Administración "parenteral" se refiere a la administración fuera del intestino, por ejemplo, no a través del tracto alimenticio. Generalmente, las formulaciones parenterales son aquellas que se administrarán a través de cualquier modo excepto ingestión. Este término específicamente se refiere a inyecciones, ya sea administradas intravenosamente, intrahecalmente, ¡ntramuscularmente, intraperitonealmente, intraarticularmente, o subcutáneamente, y varias aplicaciones de superficie incluyendo intranasal, intradérmica, y aplicación tópica, por ejemplo. "Fosforilación" se refiere a la creación de un derivado de fosfato de una molécula orgánica (tal como una proteína o un lípido). En una célula, esto se puede lograr a través de la transferencia de un grupo fosfato de trifosfato de adenosina (ATP). Un "trastorno proliferativo" es inclusivo de neoplasmas y restenosis. "Restenosis" se refiere a la recurrencia del estrechamiento después de la cirugía correctiva sobre la válvula del corazón o el estrechamiento de una estructura vascular (tal como la arteria coronaria) después de la remoción o reducción de un estrechamiento previo. En varios ejemplos, la restenosis ocurre después de la colocación de una cánula o después de la angioplastía. "Identidad de secuencia" se refiere a la similitud entre las secuencias de amino ácido, y se expresa en términos de similitud entre las secuencias, de lo contrario se refiere como identidad de secuencia. La identidad de secuencia es frecuentemente medida en términos de identidad porcentaje de identidad (o similitud u homología); entre más alto es el porcentaje, más similares son las dos secuencias. Los homólogos o variantes de un polipéptido poseerán un grado relativamente alto de identidad de secuencia cuando se alinean utilizando métodos estándares. Los métodos de alineación de secuencias para comparación son bien conocidos en la técnica. Se describen varios programas y algoritmos de alineación en: Smith y Waterman, Adv. Appl.Math. 2:482, 1981 , Needleman y Wunsch, J.Mol. Biol. 48:443,1970; Pearson and Lipman, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988; Higgins y Sharp, Gene 73:237, 1988;Higgins y Sharp, CABIOS 5:151 ,1989; Corpet y otros, Nucleic Acids Research 16:10881 ,1988; y Pearson and Lipman, Proc Nati. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988. Altschul y otros, Nature Genet., 6:119, 1994, presentan una consideración detallada de métodos de alineación de secuencia y cálculos de homología. La herramienta de búsqueda de alineación local básica NCBI (BLAST) (Altschul y otros, J.Mol. Biol. 215:402,1990) está disponible de varias fuentes, incluyendo el Centro Nacional de Información de Biotecnología (NCBI, Bethesda, MD) y en el Internet para uso en conexión con los programas de análisis de secuencia blastp, blasón, blastx, tblastn y tblastx. Una descripción de cómo determinar la identidad de secuencia utilizando este programa está disponible en el sitio web NCBI en el Internet. "Homólogos" y "variantes" de un polipéptido se refiere a polipéptidos caracterizados por que poseen por lo menos 75%, por ejemplo por lo menos 80%, o por lo menos 90% de identidad de secuencia contado a través de la alineación de longitud completa con la secuencia de amino ácido del polipéptido utilizando Blast 2.0 de NCBI, blastp de intervalo establecido con parámetros por omisión. Para comparaciones de secuencias de amino ácido mayores de aproximadamente 30 amino ácidos, se empleó la función de secuencias Blast 2 utilizando la matriz BLOSUM62 por omisión fijada con parámetros por omisión (intervalo de costo de existencia de 11, y costo de intervalo por residuo de 1). Cuando se alinean péptidos cortos (menores de alrededor de 30 amino ácidos), la alineación se determinará utilizando la función de secuencias Blast 2, empleando la matriz PAM30 fijada a parámetros por omisión (intervalo abierto 9, intervalo por extensión 1 penalidad). Las proteínas con aún una mayor similitud a las secuencias de referencia mostrarán porcentajes en incremento de identidades cuando se evalúen a través de este método, tal como por lo menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98%, o al menos 99% de identidad de secuencia. Cuando se compara menos de la secuencia completa para la identidad de secuencia, los homólogos y variantes típicamente poseerán por lo menos 80% de identidad de secuencia a través de ventanas cortas de 10, 20 amino ácidos, y pueden poseer identidades de secuencia de al menos 85%, o al menos 90%, o al menos 95%, dependiendo de su similitud con la secuencia de referencia. Los métodos para determinar la identidad de secuencia a través de ventanas cortas están disponibles en el sitio web NCBI en Internet. Un experto en la técnica apreciará que estas escalas de identidad de secuencias se prohiben en forma de guía solamente. Es completamente posible que los homólogos fuertemente significativos se podrían obtener como cayendo fuera de las escalas provistas.

"Transplante" se refiere a la transferencia de un tejido, célula o un órgano, o una porción del mismo, de un sujeto a otro sujeto a partir de un sujeto a otra parte del mismo sujeto, o de un sujeto a la misma parte del mismo sujeto. El donador y el receptor pueden o no pueden ser del mismo genotipo. Un "transplante alogénico" o "transplante heterólogo" se refiere al transplante de un individuo a otro, en donde los individuos tienen genes en uno o más lugares que no son idénticos en secuencia en los dos individuos. Un transplante alogénico puede ocurrir entre dos individuos de las mismas especies, que difieren genéticamente, o entre individuos de dos diferentes especies. Un "transplante autólogo" se refiere al transplante de un tejido, células, o porciones de las mismas, de un lugar a otro en el mismo individuo, o transplante de tejido o una porción del mismo de un individuo a otro, en donde los dos individuos son genéticamente idénticos. Las descripciones de los términos anteriores se proveen solamente para ayudar al lector, y no deberán ser interpretadas como que tienen un alcance menor que aquel entendido por un experto en la técnica o como una limitante del alcance de las reivindicaciones anexas. Los términos singulares "un", "uno" y "el" incluyen referencias plurales a menos que el contexto claramente indique lo contrario. Similarmente, la palabra "o" pretende incluir "y" a menos que el contexto claramente indique lo contrario. La palabra "comprende" indica "¡ncluye". Además entenderá que todos los pesos moleculares o los valores de masa molecular dados para los compuestos se aproximan, y están provistos para la descripción. Aunque los métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos aquí se pueden utilizar en la práctica o en la prueba de esta descripción, los métodos y materiales adecuados se describen a continuación. Además, los materiales, métodos, y ejemplos son ilustrativos solamente y no pretenden ser limitantes. Todos los compuestos técnicos ambos el (+) y (-) estereoisómeros (así como cualquier (+) o (-) estereoisómero), y cualesquiera tautómeros de los mismos. La abreviación "me" indica "micro", de esta forma "mcM" indica micromolar y "mcL" indica microlitro.

Compuestos de uso Un ejemplo de una clase de compuestos de 4H-1-benzopiran-4-ona útil en los métodos y composiciones descritos aquí son los compuestos de 4H-1-benzopiran-4-ona sustituidos con 2-(4-piperazinil) que tienen una estructura representativa de: Formula A en donde la presencia de cada uno de R-i y R2 es opcional y Ri y R2 son cada uno independientemente seleccionados de alquilo, alquilo sustituido, heteroalquilo, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, heterocicloalquilo, heterocicloalquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxi, halógeno, hidroxi, amino, o tio. Si R-i y/o R2 están presentes, entonces pueden ser uno o más substituyentes R<? y/o R2 en cada estructura de anillo respectiva. Un ejemplo adicional de compuestos de 4H-1-benzopiran-4-ona útiles en los métodos y composiciones descritos aquí son los compuestos 2- (4-piperazinil)-8-fenil-4H-1-benzopiran-4-ona que son una estructura representativa de: en donde la presencia de cada uno de Ri, R2 y R3 es opcional y R1 y R2, son cada uno independientemente seleccionados de alquilo, arilo, alcoxi, halógeno, hidroxi o amino. Si R1 y/o R2 están presentes, entonces pueden ser uno o más substituyentes R-i y/o R2 en cada estructura de anillo respectiva. Un ejemplo ilustrativo del compuesto 4H-1-benzopiran-4-ona es 2-(4-piperazinil)-8-fenil-4H-1-benzopiran-4-ona que tiene la estructura de: Formula C La sal de diclorhidrato de 4H-1-benzopiran-4-ona es 2-(4-piperazinil)-8-fenil-4H-1-benzopiran-4-ona está comercialmente disponible de Sigma-Aldrich Corporation bajo la designación "LY303511." Los compuestos de 4H-1-benzopiran-4-ona es 2-(4-piperazinil)-8-fenil-4H-1-benzopiran-4-ona descritos aquí se pueden sintetizar con base en los procedimientos descritos en Vlahos y otros, J.Biol. Chem. 269:5241-5248,1994. Otras formas de sal de 2-(4-piperazinil)-8-fenil-4H-1-benzopiran-4-ona son fácilmente sintetizables siguiendo las técnicas conocidas tales como aquellas descritas en Handbook of Pharmaceutical Salts, Properties, Selection y Use, Wiley VCH (2002). Los métodos descritos actualmente incluyen la administración de uno o más de los compuestos presentemente descritos o una combinación de uno o más de los compuestos y uno o más de otros agentes farmacéuticos, al sujeto en un portador farmacéuticamente compatible. La administración se hace en una cantidad efectiva para inhibir el desarrollo de los transtornos proliferativos, tales como neoplasmas o restenosis, o para proveer inmunosupresión. Aunque el tratamiento se puede utilizar profilácticamente en cualquier paciente en un grupo demográfico a un riesgo significativo de dichas enfermedades, los sujetos también pueden seleccionarse utilizando criterios específicos, tales como diagnosis definitiva de la condición. El vehículo en el cual el fármaco se distribuye puede incluir composiciones farmacéuticamente aceptables de fármacos, utilizando métodos bien conocidos por aquellos con experiencia en la técnica. Cualquiera de los portadores comunes tales como salina estéril o solución de glucosa, se pueden utilizar con los fármacos descritos aquí. Las rutas de administración incluyen, pero no se limitan a, rutas orales y parenterales, tales como intravenosa (iv), intraperitoneal (ip), rectal, tópica, nasal, oftálmica, y transdérmica. El fármaco se puede administrar en una forma adecuada ahora conocida o posteriormente desarrollada, por ejemplo, oral o intravenosamente, en cualquier medio convencional (ver más adelante). Por ejemplo, la inyección intravenosa puede ser a través de cualquier medio de salina acuosa. El medio puede también contener materiales auxiliares farmacéuticos convencionales tales como, por ejemplo, sales farmacéuticamente aceptables para ajustar la presión osmótica, portadores lípidos tales como ciclodextrinas, proteínas tales como albúmina, agentes hidrofílicos tales como celulosa de metilo, detergentes, reguladores de PH, conservadores, agentes tensioactivos, antioxidantes (por ejemplo, palmitato de ascorbilo, hidroxi butil anisol (BHA), butil hidroxi tolueno (BHT) y tocoferoles), agentes de quelatación, viscomoduladores, tonificadores, saborizantes, colorantes, odorantes, y similares. Una explicación más completa de los portadores farmacéuticamente farmacéuticos parenterales se puede encontrar en Remington: The Science and Practice of Pharmacy (19o. Edición, 1995) en el capítulo 95. Los ejemplos de otras composiciones farmacéuticas se pueden preparar con portadores farmacéuticamente aceptables convencionales auxiliares y contrapones que son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. Las composiciones preferiblemente en la forma de una dosis unitaria en formas de dosificación, sólida, semisólida y líquida tales como tabletas, pildoras, polvos, soluciones liquidas o suspensiones. Formulaciones semisólidas pueden ser cualquier formulación semisólida incluyendo, por ejemplo, geles, pastas, cremas y ungüentos. Las fórmulas de dosificación liquida pueden incluir, soluciones, suspensiones, formulaciones de liposoma, o emulsiones en vehículos orgánicos o acosos.

Métodos para suprimir una respuesta inmune o para tratar un trastorno proliferativo Se provee un método aquí para suprimir una respuesta inmune en un sujeto que comprende la administración al sujeto de una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de 2-(4-piperazinil)-8-fenil-2-(4-piperazinil)-4H-1-benzopiran-4-ona sustituido descrito aquí, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en un ejemplo no limitante como específico la respuesta inmune puede incluir la secreción de citocinas, tales como, pero no limitándose a, interieucina (IL)-12, factor de necrosis tumoral (TNF)-a, interferón (IFN)-?, proteína quimioatrayente de monocito (MCP)-1 , IL-10, IL-6. En otro ejemplo específico no limitante, la respuesta inmune incluye la activación de macrófago. La cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto 4H-1-benzopiran-4-ona sustituido con 2-(4-piperazinil) descrito aquí, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, se pueden administrar en conjunción con un agente ¡nmunosupresor adicional. Esta administración puede ser simultánea o secuencial, en cualquier orden. Los agentes inmunosupresores se incluyen, pero no se limitan a, Ciclosporina A, FK506, o análogos de los mismos, o anticuerpos tales como el anticuerpo monoclonal que específicamente se enlaza a CD3 (tal como OKT3), CD4, o CD8. En un ejemplo, el compuesto 2-(4-piperazinil)-4H-1-benzopiran- 4-ona sustituido y el agente inmunosupresor se pueden co-administrar en solución, o en un vehículo de distribución, tal como una liposoma, la cual facilita la distribución y la absorción de estos agentes. En una modalidad, el método descrito aquí se puede utilizar para tratar el rechazo al transplante. El transplante involucra la transferencia de un tejido o un órgano, o una porción del mismo, de un cuerpo a otro cuerpo o parte del cuerpo. Un "transplante alogénico" o un "transplante heterólogo", es un transplante de un donador a un sujeto receptor, en donde el donador y el receptor tienen genes en uno o más lugares que no son idénticos en secuencia en los dos individuos. El receptor puede generar una respuesta inmune contra los antígenos del donador (incluyendo MHC de donador); de esta forma, la terapia inmunosupresora por lo general se utiliza para tratar receptores de transplante (tales como receptores de transplante de corazón, de pulmón, o de riñon). Se describe aquí, un método novedoso para tratar el rechazo al transplante que incluye la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de 4-H-1-benzopiran-4-ona sustituido con 2-(4-piperazinilo) descrito aquí, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En una modalidad, el tratamiento prolonga la supervivencia y mejora la función del tejido del donador. Los métodos descritos aquí también se pueden utilizar para tratar la enfermedad injerto contra hospedero. Se provee aquí un método para tratar un trastorno proliferativo, que comprende la administración a un sujeto de una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de 4-H-1-benzopiran-4-ona sustituido con 2-(4-piperazinilo) descrito aquí. Se demostró que el compuesto 4-H-1-benzopiran-4-ona sustituido con 2-(4-piperazinilo) se puede utilizar para inhibir la proliferación de células de tumor. De esta forma, una cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto 4-H-1 -benzopiran-4-ona sustituido con 2-(4-piperazinilo) se puede administrar a un sujeto para tratar un tumor. Los tumores incluyen tanto tumores benignos como malignos. Los tumores además incluyen tumores hematológicos, y tumores sólidos. Los tumores ilustrativos son tumores de la piel, del sistema nervioso, de pulmón, de pecho, de órganos reproductores, de páncreas, de células linfoides (incluyendo leucemias y linfomas), de vasos sanguíneos o linfáticos, y de colon. Los tumores incluyen carcinomas, sarcomas, papilomas, adenomas, leucemias, linfomas, melanomas, y adenocarcinomas, entre otros. La cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto 4-H-1-benzopiran-4-ona sustituido con 2-(4-piperazinilo) descrito aquí, a una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, se puede administrar en conjunción con un agente quimioterapéutico adicional. Esta administración puede ser simultánea o secuencial, en cualquier orden. Los agentes quimioterapéuticos incluyen, pero no se limitan a, agentes químicos anti-metabolitos, y anticuerpos. Los agentes quimioterapéuticos ilustrativos son doxirubicina, paclitaxel, rapamicina, y metotrexato. Además se demuestra aquí, que el compuesto 2-(4-piperazinil) sustituido por 4H-1-benzopiran-4-ona se puede utilizar para inhibir la proliferación de células del músculo liso. De esta forma, una cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto 2-(4-piperazinil) sustituido por 4H-1- benzopiran-4-ona se puede administrar a un sujeto para tratar restenosis vascular. Los compuestos terapéuticos descritos aquí se pueden utilizar para tratar restenosis a través de la administración del compuesto a un paciente antes de, durante y/o después de angioplastía arteria coronaria o periférica, o aterectomía, injerto de una derivación coronaria o cirugía de cánula, o cirugía vascular periférica (por ejemplo, endaterectomía de vaso sanguíneo de carótida u otro periférico, derivación vascular, procedimiento de injerto de cánula o prostético). Además de la administración de las técnicas descritas en cualquier otro lugar en esta especificación, la benzopiran-4-onas pueden distribuirse a través de dispositivos nominales tales como injertos o cánulas vasculares. Por ejemplo, una cánula o un injerto se puede recubrir con o incorporar el compuesto de benzopiran-4-ona para la liberación controlada del compuesto de benzopiran-4-ona en el sitio vascular de interés.

Dicha liberación controlada puede incluir la distribución del compuesto sostenida durante un período de tiempo deseado.

Para uso en los métodos terapéuticos descritos aquí, la administración del compuesto 2-(4-piperazinil) sustituido por 4H-1-benzopiran- 4-ona (y opcionalmente agentes adicionales) puede ser sistémica o local. La administración local del compuesto 2-(4-piperazinil) sustituido por 4H-1- benzopiran-4-ona se realiza a través de métodos bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. A manera de ejemplo, un método para la administración en la rodilla, cadera y/o hombro de un individuo, tal como un individuo con artritis, es a través de inyección intra-articular. Para administración en la rodilla, por ejemplo, la articulación que se va a inyectar se lava con una solución de betadina u otro antiséptico. Se inyecta una solución de aproximadamente 1 % de clorhidrato de lidocaína dentro de la piel y el tejido subcutáneo. Se utiliza un ensamble de llave de paso/aguja de 3 formas para administrar el compuesto a través de una aguja de medida 18-30. El compuesto 2-(4-piperazinil) sustituido por 4H-1-benzopiran-4-ona se inyecta en el espacio de la articulación utilizando un método lateral estándar bien conocido por aquellos con experiencia en la técnica. La aguja y el tracto de la aguja se limpian a través de enjuague con 1 % de clorhidrato de lidocaína a través de un ensamble de llave de paso de tres formas según se retira la aguja. La rodilla después se mueve a través de un arco de flexión-extensión y después se inmoviliza en su extensión completa. El paciente después se confina en la cama durante aproximadamente 24 horas para minimizar el movimiento y minimizar la fuga del agente activo de la articulación.

En otras modalidades la administración del compuesto 2-(4- piperazinil) sustituido por 4H-1-benzopiran-4-ona es sistémica. También se contempla la administración oral, intravenosa, intra-arterial, subcutánea, intraperitoneal, intramuscular, y aún la rectal. Las composiciones farmacológicas para uso se pueden formular en una forma convencional utilizando uno o más portadores farmacológicamente aceptables (por ejemplo, fisiológicamente o farmacéuticamente) que comprenden excipientes, así como auxiliares opcionales que facilitan el procesamiento del compuesto activo dentro de las preparaciones que se van a utilizar farmacéuticamente. La formulación apropiada depende de la ruta de administración seleccionada. Además, un experto en la técnica puede fácilmente seleccionar una ruta de administración adecuada, incluyendo pero no limitándose a administración intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, transmucosa, subcutánea, transdérmica, transnasal, por inhalación y oral. De esta forma, para la inyección, el ingrediente activo se puede formular en soluciones acuosas, preferiblemente en reguladores de PH fisiológicamente compatibles. Para la administración transmucosal, se utilizan penetrantes apropiados para que la barrera sea penetrada en la formulación. Dichos penetrantes son generalmente conocidos en la técnica. Para administración oral, el ingrediente activo se puede combinar con portadores adecuados para la inclusión en tabletas, pildoras, grageas, capsulas, líquidos, geles, jarabes, lechadas, suspensiones y similares. Un compuesto 2-(4- piperazinil) sustituido por 4H-1-benzopiran-4-ona también se puede formular para uso en terapia de inhalación, tal como para el tratamiento de sujetos con inflamación en los pulmones. Para administración por inhalación, el ingrediente activo es convenientemente distribuido en la forma de una presentación de aspersión en aerosol de paquetes presurizados o un nebulizador, con el uso de un impulsor adecuado. El compuesto 2-(4-piperazinil) sustituido por 4H-1-benzopiran-4- ona se puede formular para administración parenteral a través de inyección, por ejemplo, a través de inyección de bolo o infusión continua. Similarmente, el compuesto 2-(4-piperazinil) sustituido por 4H-1-benzopiran-4-ona se puede formular para administración ¡ntrahecal o para inhalación. Dichas composiciones pueden tomar dichas formas como suspensiones, soluciones, o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación tales como de suspensión, estabilización, y/o dispersión. Otros excipientes farmacológicos son bien conocidos en la técnica. Las dosis terapéuticamente efectivas de los compuestos actualmente descritos se pueden determinar por un experto en la técnica, con un objetivo de lograr el nivel de restenosis deseado anti-ateroesclerosis, antineoplasma, o inmunosupresión. Las toxicidades relativas de los compuestos hacen posible administrarlo en varias escalas de dosificación. En un ejemplo, el compuesto se administra oralmente en una sola dosis o en dosis divididas. El nivel de dosis específico y la , frecuencia de la dosificación para cualquier sujeto particular puede variar y dependerá de una variedad de factores, incluyendo la actividad del compuesto específico, la extensión de la actividad de la enfermedad existente, la edad, el peso del cuerpo, la salud general, el sexo, la dieta, ei modo y el tiempo de administración, la velocidad de excreción, la combinación del fármaco, y la severidad de la condición de la terapia que está experimentando el hospedero.

Selección Se provee un método aquí para seleccionar un agente inmunosupresor o un agente anti-proliferativo. El método ¡ncluye seleccionar un agente de prueba que preferencialmente inhibe la fosforilación dependiente de mTOR de cinasas de P70 S6 según comparado con la fosforilación dependiente de cinasa de fosfatidil ¡nositol 3 (PI3K) de un sustrato, mientras la identificación de un agente inmunosupresor farmacéuticamente útil o agente antiproliferativo. En una modalidad, el agente también inhibe una o más cinasas adicionales. Por ejemplo, el agente puede inhibir cinasa 2 de caseína, un regulador de la proliferación de célula. De esta forma, el método incluye seleccionar un agente de prueba que preferencialmente inhibe la fosforilación dependiente de mTOR de cinasa P70 S6, cinasa 2 de caseína, o ambas según comparado con la fosforilación dependiente de cinasa de fosfatidilinositol 3 (P13K) de un sustrato, mientras se identifican el agente inmunosupresor farmacéuticamente útil o un agente anti-proliferativo. Este ensayo se puede llevar a cabo en células o extractos de célula.

El compuesto de prueba puede ser cualquier compuesto de interés, incluyendo compuestos químicos, moléculas pequeñas, polipéptidos u otros agentes biológicos (por ejemplo, anticuerpos o citocinas). En varios ejemplos, se clasifica un panel de agentes quimioterapéuticos potenciales, o un panel de agentes ¡nmunosupresores potenciales. En otras modalidades se clasifica un panel de variantes de polipéptido. En ensayos que utilizan células, las células se ponen en contacto con los compuestos de prueba. En algunas modalidades, las células se incuban con el compuesto de prueba durante una cantidad de tiempo suficiente para afectar la fosforilación de un substrato a través de PI3K y para inhibir la fosforilación de cinasa P70 S6 en la célula. Las células se lisan y la cantidad de cinasa P70 S6 fosforilada y la cantidad de substrato fosforilado a través de PI3K se miden. Las cantidades de cinasa P70 S6 fosforilada y la cantidad de substrato fosforilado que está presente en las células se compara con células idénticas que no fueron expuestas al compuesto de prueba. En algunas modalidades, se utiliza la tecnología de Western blot con las proteínas de células separadas a través de electroforesis y anticuerpos que enlazan la cinasa P70 S6, la cinasa p70S6 fosforilada, y/o anticuerpos que específicamente enlazan el substrato (tal como S6 fosforilada) se utilizan. Alternativamente, las células se pueden incubar en la presencia de ortofosfato conteniendo un fósforo radio marcado, que permite la detección de substrato fosforilado o no fosforilado (tal como cinasa P70 S6).

En algunas modalidades, las células se tratan in Vitro con compuestos de prueba 37° C en una atmósfera humidificada con C02 al 5%. Después del tratamiento con los compuestos de prueba, las células se lavan con Ca2+ y Mg2+ libre de PBS y se extrae una proteína total como se describió (Haldar y otros, Cell Death Diff. 1 :109-115, 1994; Haldar y otros, Nature 342:195-198, 1989; Haldar y otros, Cáncer Res. 54:2095-2097,1994). En modalidades adicionales, se utilizan diluciones seriales del compuesto de prueba. En algunas modalidades, la fosforilación se analiza utilizando Western blot e inmunodetección que se llevan a cabo utilizando ECL de Amersham un sistema de detección quimioluminiscente mejorado y una metodología bien conocida. En un ejemplo, la fosforilación de las células linfoides se puede llevar a cabo en medio libre de fosfato (GIBCO), utilizando 1 mCi/ml [P32] de ácido ortofosfórico (NEN) durante 6 horas en la presencia de un compuesto de prueba. La inmunoprecipitación del extracto células marcado P32 se puede llevar a cabo por ejemplo, como se describe en Haldar y otros, Nature 342:195-198, 1998. Esta inmunoprecipitación utiliza un anticuerpo que enlaza un substrato de interés, tal como cinasa P70 S6, substrato de cinasa 2 de caseína (tal como p53, Bid, topoisomerasa II de ADN) o un substrato PI3K (tal como fosfatidilinositol, 4-fosfato de fosfatidilinositol 4,5-fosfato de fosfatidilinositol). Se corre un inmunocomplejo sobre SDS-PAGE con un grosor de 0.75 mm al 10%. Subsecuentemente los geles se secan y se exponen para auto radiografía.

El análisis de fosfo-amino ácido se puede llevar a cabo como se conoce en la técnica. Por ejemplo, el análisis se puede llevar a cabo esencialmente como se describe en el manual para Hunter del sistema de electroforesis de capa delgada, HTLE700, (CBS Scientific Company Inc., USA). Brevemente, los inmunoprecipitados marcados como P32 se corren sobre geles SDS-PAGE al 10%. Las bandas inmunoreactivas de interés se cortan del gel y se luyen con 50µM de bicarbonato de amonio. Después de la elusión, las proteínas se precipitan en la presencia de 15%-20% de TCA más la proteína del portador, y se lavan con etanol. La proteína precipitada después se oxida en ácido perfórmico y se liofiliza. La P ya seca se vuelve a suspender en HCl, en ebullición constante, se calienta a 110°C y se liofiliza. El residuo se vuelve a suspender en regulador de PH a 1.9 (50 mcl de ácido fórmico, 156 mcl de ácido acético, 794 mcl de H20) conteniendo estándares de fosfo-aminoácido y se detectan sobre una placa de celulosa PEÍ. Se corre una cromatografía de capa delgada bidimensional utilizando el regulador de pH a un pH de 1.9 para la primera dimensión y un regulador de pH de un pH a 3.5 (100 ml de ácido acético, 10 ml de piridina, 1890 ml de H2O) para el segundo. La placa se cocina a 65° C durante 10 minutos, y los estándares fríos se visualizan a través de la aspersión de la placa con 0.25% de ninhidrina y se devuelve la placa al horno a 65°C durante 15 minutos. La placas después se expone a la película, tal como una película Modal X-omat AR, durante de dos a cuatro semanas.

En algunas modalidades, la modulación de la fosforilación se analiza utilizando material de extracto de célula como el material de partida. Los compuestos de prueba se combinan con el material de extracto de célula y el efecto de los compuestos sobre la fosforilación de cinasa P70 S6 y sobre la fosforilación dependiente de cinasa (PI3K) de fosfatidilinositol 3 se examina. En un ejemplo, el material de extracto de célula se pone en contacto con los compuestos de prueba para identificar el efecto que el compuesto de prueba tiene sobre la fosforilación de cinasa P70 S6 en la presencia de 32 P-gamma-ATP, o para identificar el efecto que el compuesto de prueba tiene sobre la fosforilación de bcl-2. En un protocolo ilustrativo, el extracto de célula se trata in Vitro a 37° C utilizando 100 de µg de extracto celular total con una concentración especificada del compuesto de prueba. Para las reacciones de fosfatasa, se ponen en contacto 50 µl de lisato de célula con el compuesto de prueba y se incuban con una mezcla de reacción durante 30-60 minutos a 37°C. Para la fosforilación del material de extracto de célula, se tratan 100 µg de extracto de célula como se describió anteriormente excepto que se agregan 40 µci [32 P] ATIP (3000 Ci/mmol) a cada reacción. Las reacciones se detienen a través de la inmersión de los tubos en hielo. La mezcla de reacción marcada [32 P] ATIP se absorbe sobre una columna de inmunoafinidad hecha del anticuerpo monoclonal contra cinasa P70 S6 o un substrato PI3K mediante el enlace covalente de anticuerpos purificados con proteína - A Sefarose utilizando el entrelazador de diclorhidrato de dimetilpimelimidato (50 mM). La proteína específicamente enlazada marcada [32 P] se eluye con 0.05 M de dietilamina, pH de 11.5 conteniendo 0.5% de Na-deoxicolato. En los métodos ilustrativos, la inmunodetección a través de Western blot se lleva a cabo utilizando el sistema de detección ECL de Amersham y la metodología conocida por un experto en la técnica. La inmunoprecipitación del extracto celular marcado P32 se puede llevar a cabo, por ejemplo, como se describe en Haldar y otros, Nature 342:195-198,1989. El inmunocomplejo se corre sobre SDS-PAGE al 10% con un grosor de 0.75 mm. Subsecuentemente los geles se secan y se exponen para auto radiografía utilizando una película tal como la película Kodak XAR. El análisis de fosfoaminoácido se puede llevar a cabo esencialmente como se describe en el manual para el sistema de electroforesis de capa delgada de HTLE700, (CBS Scientific Company Inc., USA). En un método ilustrativo, los ¡nmunoprecipitados marcados P32 se corren sobre geles SDS-PAGE al 10%. Las bandas inmunoreactivas de cinasa P70 S6 se cortan del gel y se luyen con 50 µM de bicarbonato de amonio. Después la ilusión de las proteínas se precipita en la presencia de 15%-20% de TCA, más la proteína portadora, y se lavan con etanol. La proteína precipitada después se oxida en ácido perfórmico y se liofiliza. La pella seca se vuelve a suspender en HCl, en ebullición constante, se calienta a 110° C y se liofiliza. El residuo se vuelve a suspender al regulador de pH a un pH de 1.9 (50 mcl de ácido fórmico, 156 mcl de ácido acético, 1794 mcl de H2O) conteniendo estándares de fosfo-amino ácido y se detecta sobre una placa de celulosa PEÍ. La cromatografía de capa delgada bidimensional se corrió utilizando un regulador de pH con pH de 1.9 para la primera dimensión y un regulador de pH de pH de 3.5 (100 ml de ácido acético, 10 ml de piridina, 1890 ml de H2O) para el segundo. La placa se horneó a 65°C durante 10 minutos, y los estándares que no se visualizaron a través del rocío de la placa con 0.25% de ninhidrina y devolviendo la placa al horno a 65°C durante 15 minutos, las placas después se exponen a la película. Un ensayo específico para la actividad de cinasa 2 de caseína está comercialmente disponible como un kit de Upstate Biotechnology (New York). El ensayo se basa en la fosforilación de un substrato específico (péptido de substrato CK-2) utilizando la transferencia de gama-fosfato de 32P-ATP a través de cinasa 2 de caseína durante una incubación de 10 minutos a 30° C. El substrato fosforilado después se separa del 32P-ATP residual utilizando papel de fosfocelulosa P81 y se cuantifica a través de conteo por cintilación.

EJEMPLOS La rapamicina inhibe la proliferación de célula de cáncer y de músculo liso, a través del bloqueo de la regulación dependiente de mTOR de cinasa P70 S6. La rapamicina está aprobada por FDA para tratamiento del rechazo al transplante (acción inmunosupresora y anti-inflamatoria), cáncer, y restenosis vascular después de angioplastía coronaria. Sin embargo, el uso de rapamicina tiene varias desventajas y efectos adversos, y es deseable identificar otros inhibidores farmacológicos de la señalización dependiente de mTOR. Como LY294002, LY303511 inhibe mTOR y cinasa 2 de caseína.

A diferencia de LY294002, LY303511 falla en significativamente inhibir PI3K, una enzima de señalización importante en el control de la muerte de célula, citoquinesis, y metabolismo de glucosa/lípido. La Wortmanina es selectiva para PI3K. Los ejemplos descritos aquí utilizan LY303511 como un compuesto de 4H-1-benzopiran-4-uno ilustrativo. Los resultados demuestran que LY303511 se puede utilizar para suprimir una respuesta inmune y para inhibir la proliferación de las células, incluyendo células de músculo liso y células de tumor. Es probable que LY303511 selectivamente inhiba mTOR en un sitio diferente de aquel involucrado en el enlace de rapamicina, con menos efectos sobre PI3K. LY303511 se puede utilizar solo, o en combinación con rapamicina u otros agentes para controlar la proliferación de célula y la respuesta inmóvil.

EJEMPLO 1 LY303511 inhibe la proliferación de células Este ejemplo demuestra que LY303511 bloquea la fosforilación de la cinasa P70 S6 y ia proliferación de células en células de adenocarcinoma epitelial de pulmón humano (A549). LY303511 difiere de LY294002 por una substitución de oxigeno que reemplaza el oxigeno de morfolino con una amina (Estructura 1 ).

Las células A549 se trataron con o sin 100 mcM L6303511 , 200 ng/ml de rapamicina o 50 nM de wortmanina en medio libre de suero durante una hora antes de la adición de lipopolisacarido E.coli. (LPS), 1000 mcg/ml e interferón (IFN)-?, 100 U/ml (LPS/IFN-? o "L/l"). Las células se homogeneizaron y se detectaron las proteínas indicadas (ver cuadro 1 ) detectadas por Western blot. El Western blot del mismo experimento, y representativas de 3 experimentos.

CUADRO 1 Descripción de anticuerpos Los resultados demostraron que LY303511 bloquea la fosforilación de cinasa P70 S6 (Figura 1A). La Wortmanina y la rapamicina también bloquearon la fosforilación. Estos resultados demostraron que LY303511 y rapamicina incrementan la fosforilación de AKT (Figura 1A). La Wortmanina bloquea PI3K e inhibe la fosforilación de pAKT. De esta forma, LY303511 inhibe la fosforilación sensible a mTOR de S6 pero no de AKT (Figura 1B). Estos resultados indican que LY303511 es un inhibidor de mTOR. Estos resultados también demuestran que LY303511 inhibe la autofosforilación de mTOR en una forma dependiente de concentración (Figura 1C). A diferencia de rapamicina, LY303511 tuvo efectos mínimos sobre la fosforilación basal de LPS/IFN-?- o de mTOR en una forma dependiente de concentración (Figura 1C). A diferencia de rapamicina, LY303511 tuvo efectos mínimos sobre la fosforilación basal de S6K o mTOR (Figuras 1A, 1 C). De esta forma, LY303511 inhibió la actividad de mTOR estimulada por LPS/IFN-?- y la fosforilación dependiente de mTOR de S6K en la forma independiente de PI3K y a concentraciones tan bajas como 1µM.

En un experimento adicional las células A549 se colocaron en placas a 4,000 células por cavidad en una placa de 96 cavidades y se trataron como con bromodeoxiuridina durante 24 horas sin o con inhibidores farmacológicos según se indicó. La captación de bromodeoxiuridina (BrdU), un indicador de la síntesis de ADN y de proliferación de células se midió a través de ELISA in situ (kit BrdU de detección, Roche). Adicionalmente se hicieron crecer células A549 (80,000 células por cavidad) durante 24 horas antes de la visión de los inhibidores (Figura 2A). Después de 24 horas, se contaron las células teñidas con azul de trlpano utilizando un hemocitómetro. La viabilidad de la célula fue de >99% bajo todas las condiciones (datos no mostrados). En células expuestas al vehículo solo, el número de células se incrementó a aproximadamente 50% durante 24 horas. La rapamicina ligeramente atenúo la proliferación de las células, mientras LY303511 tuvo un efecto inhibidor significativo, casi igual a aquel de LY294002. Consistente con los efectos independientes de PI3K de LY303511 y LY294002, la wortmanina no reduce significativamente la proliferación de células A549. LY303511 no induce a apoptosis o necrosis según determinado por el análisis citométrico de flujo de células teñidas con yoduro de propidio. Según determinado por la captación de bromodeoxiuridina (BrDu), LY303511 así como la combinación de LY303511 y rapamicina inhibieron la proliferación de células A549 (Figura 2B). Mientras que la rapamicina tuvo un efecto débil pero estadísticamente importante sobre la síntesis de ADN, la administración de LY303511 condujo a una reducción dependiente de la concentración (Figura 2B). No hubo un efecto adicional cuando LY303511 se combinó con rapamicína. DMSO sólo no tuvo efectos sobre la proliferación de células A549. En otro experimento, se hicieron crecer las células A549 para sub-converger en medio conteniendo suero, y se incubaron con un vehículo, 100 mcM LY303511 o rapamicina, 200ng/ml durante 0,12, o 24 horas. Las células se lisaron, y las proteínas se separaron a través de SDS-PAGE antes de la transferencia a membranas de nitrocelulosa. Las membranas se incubaron con anticuerpos contra p27Kip1 , p21 Cip1 o fosfo-cinasa P70 S6 T389. A las 12 y 24 horas después del tratamiento, LY303511 y rapamicina bloquearon la fosforilación de cinasa P70 S6, en T389 consistente con la inhibición de la actividad de cinasa mTOR (Figura 3A). LY303511 , pero no rapamicina, condujeron a la acumulación de p27Kip1 , y p21 Cip1 , los marcadores de la detención del ciclo de la célula. Los niveles en incremento en LY303511 dependientes de p27 Quipl (p27) indican un efecto sobre los inhibidores de transición G1/S similares a aquellos de rapamicina (Figura 3A). En contraste con rapamicina, sin embargo, LY303511 causó un incremento significativo en p21 Cip1 (p21 ), un inhibidor del avance de la fase S anterior (Figura 3A). LY303511 , pero no rapamicina, disminuyeron los niveles de ciclina A y B, los cuales también son reguladores del avance de la fase S y G2/M (Figura 3B). LY303511 también redujo la fosforilación de Rb, lo que sugiere que el mecanismo de la inhibición del ciclo de la célula, fue, en parte, debido a la inhibición de genes dependientes de E2F. Estos resultados soportan un papel para la cinasa (s) sensible a LY303511 en el avance en S anterior y G2/M, además de la transición a G1/S. Para confirmar que LY303511 conduce a la detención de G1 , células A549 se trataron con 0,10, o 100 mcM de LY303511 durante 24 horas, se fijaron, y se incubaron, con anticuerpos contra QUI-67. Los porta-objetos se montaron en solución conteniendo DAPI para manchar el núcleo. Se capturaron fotos utilizando intensidad y ganancia de láser iguales. El tratamiento con LY303511 , pero no con rapamicina condujo a una disminución significativa en los niveles de la célula QUI-67 completos, los cuales también fueron consistentes con un bloqueo en la proliferación de célula. Los resultados demostraron que LY30351 inhibió la fosforilación nasal basal y estimulada de cinasa P70 S6 en treonina (T) 389 (T389), un marcador de la activación de cinasa P70 S6 dependiente de mTOR. Además, LY303511 no inhibe la fosforilación dependiente de PI3K- en AKT en serina (S) 473 (S473). Similar a rapamicina, LY303511 incrementó la fosforilación de AKT. Además, LY303511 inhibió la fosforilación basal y estimulada de mTOR en serina 2481 (S2481 ), un marcador de la actividad de cinasa de mTOR.

LY303511 también inhibió la proliferación en células A549. El efecto fue aditivo con rapamicina a dosis de LY303511 entre 10 y 100 mcM. De esta forma, LY303511, o las combinaciones de LY303511 se pueden utilizar para inhibir el crecimiento de células de adenocarcinoma. Los resultados demostraron que se indujo el arresto del ciclo de la célula.

EJEMPLO 2 LY303511 inhibe la activación de un proceso inflamatorio Este ejemplo demuestra que LY303511 inhibe la fosforilación de cinasa P70 S6 y la activación de STAT1 en respuesta a LPS e IFN-? en células A549. Las células A549 fueron temporalmente transfectadas con un vector reportero que expresa luciferasa de luciérnaga conducido por STAT1 (GAS-luc, Clontech), y se incubaron sin o con 100 mcM de LY303511 , rapamicina 200 ng/ml, o ambos, durante una hora antes de la adición de LPS/IFN-? durante 6 horas. La actividad de STAT1 (actividad de luciferasa) se midió en los lisatos de célula (RLU). Los datos presentados en las Figuras 8A-8B son muestras por triplicado ±SEM, y son representativas de dos experimentos independientes. LY303511 inhibe la activación de STAT1 a través de dos mediadores inflamatorios, LPS/IFN-?. Consistente con la inhibición del factor de trascripción STAT1 , LY303511 disminuyó la producción de citosina inducida por LPS, a través de macrófagos estimulados con LPS, (ver ejemplo 8).

EJEMPLO 3 LY303511 inhibe la fosforilación de cinasa de P70 S6 en células de músculo liso Este ejemplo demuestra que LY303511 inhibe la fosforilación de cinasa P70 S6 en células de músculo liso de arteria pulmonar humana primaria (HPASM). Las células de LY303511 , se compraron de Clonetics, y se pasaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células se colocaron en placas en platos de 100 mm, y se dejaron crecer cerca de la confluencia antes de la supresión del suero durante 14 horas. Los inhibidores se agregaron al medio una hora antes de la adición de 10% de FBS durante 30 minutos. Las células se homogenizaron y las proteínas indicadas se detectaron a través de Western blot. LY303511 inhibió la fosforilación estimulada basal y de suero de cinasa P70 S6 en células del músculo liso de la arteria pulmonar humana (PASM) (Figuras 4A y 4B). LY303511 también inhibe la fosforilación de AKT, aunque a una extensión menor que la fosforilación de cinasa de p70 S6 (Figura 4B). LY303511 también inhibió la fosforilación estimulada por suero de mTOR en S2481 , un marcador de la actividad de cinasa de mTOR. En las células PASM incubadas con suero antes de la adición de los inhibidores, la rapamicina tuvo muy poco efecto sobre la proliferación, mientras LY303511 inhibió en una forma dependiente de la concentración (Figura 4C). El efecto de rapamicina sobre la proliferación (incorporación de BrDu), sin o con LY303511 se mejoró cuando las células PASM se incubaron en medio libre de suero durante 24 horas antes de la adición de FBS (Figura 4D). El efecto de de LY303511 sobre la proliferación de células PASM, como con la rapamicina, se mejoró en la ausencia de suero. El efecto de la proliferación de 10 µM LY303511 y rapamicina, 200 ng/ml, fue aditivo para 10 µM de LY303511 solo (p<0.05, Figura 4C, 4D). Aunque la fosforilación de Akt se inhibió a través de LY303511 , (Figura 4B), la wortmanina no inhibió la proliferación de célula, indicando que este efecto de LY303511 fue independiente de PI3K. Los efectos de rapamicina y LY303511 sobre el ciclo de la célula fueron menos pronunciados en PASM que en células A549 (Figura 5A). La incubación con rapamicína o medio libre de suero condujo al arresto de G1. En contraste, LY303511 redujo la proporción de células en la fase S a través del incremento de la fracción en la fase G1 y G2/M. Los efectos de rapamicina más LY303511 sobre la reducción de las células en la fase S fueron aditivas. Sin embargo, el incremento en las células de músculo liso G1 en respuesta a LY303511 fueron insignificantes, indicando un efecto mayor de LY303511 en células de cáncer que en células primarias. De esta forma, LY303511 o las combinaciones de LY303511 y rapamicina, se pueden utilizar para inhibir el crecimiento de células de músculo liso primario. Los resultados además indican que LY303511 se puede utilizar para inducir el arresto del ciclo de la célula de estas células.

EJEMPLO 4 LY303511 inhibe el ciclo de la célula causando el arresto de G1 y G2 combinados Con el fin de investigar el efecto de LY303511 sobre el ciclo de la célula, la células A549 o células del músculo liso de la arteria pulmonar se hicieron crecer a sub-confluencia en medio conteniendo suero, y se incubaron con vehículo, 10, o 100 mcM de LY303511, sin o con rapamicina (200ng/ml), durante 24 horas. Las células después se cosecharon y se tiñeron con yoduro de propidio, antes del análisis del ciclo de la célula a través de citometría de flujo. La proporción de células en la fase G1 , S o G2/M del ciclo de la célula para cada condición experimental se determinó. Las células se confinaron a través de la intensidad de la tinción de yoduro de propidio para determinar las proporciones de células en la fase G1 , S o G2/M del ciclo de la célula. Consistente con el efecto de la síntesis de ADN, 100 µM de LY303511 significativamente reducen la fracción de las células en la fase S (Figura 2C). La proporción de las células en G2/M permanecieron invariables, indicando que las células se arrestaron en ambas G1 y G2/M. En contraste, la rapamicina incrementa la población de G1 a través de la reducción de la proporción de las células en ambas S y G2/M. Los efectos de 10 µM de LY303511 y rapamicina en la reducción de la fase S de las células fue aditivo con aquel de 10 µM de LY303511 solo (P=0.056, Figura 2C), La reducción mayor en las células en la fase S producidas por la adición de LY303511 a rapamicina ocurrió sin una disminución adicional en G2/M, indicando que LY303511 bloquea el ciclo de la célula a través de un mecanismo adicional que difiere de aquel utilizado por rapamicina. Los resultados demostraron que LY303511 causa el arresto del ciclo de la célula en ambas células transformadas y células de músculo liso de arteria pulmonar. Ya que a diferencia de rapamicina, LY303511 conduce a un incremento en células en la fase G2/M, los resultados también sugieren que podría haber objetivos celulares independientes de mTOR adicionales para LY303511 (por ejemplo, cinasa 2 de caseína).

EJEMPLO 5 LY303511 inhibe la actividad de cinasa 2 de caseína (CK2) Los análisis de expresión de gen de microarreglo se han desarrollado en donde las células A549 se incubaron con o sin LY294002 o wortmanina durante una hora antes de la adición de L/l durante 6 horas. A través de los mecanismos de retroalimentación celular, los niveles de ARNm que codifican las proteínas que están directamente inhibidas por un agente farmacológico se podrían incrementar en la presencia de ese agente. Para identificar los objetivos de la cinasa adicional para LY294002 que son independientes de PI3K, los ARNms que fueron incrementados por LY294002, y no a través de wortmanina, se identificaron a partir del grupo de datos mediante la filtración y el análisis estadístico. Como se esperaba, los niveles de ARNm de mTOR se incrementaron en la presencia de LY294002 (1.7), y no a través de wortmanina. Los ARNms de otras cinasas que fueron incrementadas por LY294002 incluyeron el CK2a (1.8 veces; número de registro en GenBank # M55268). Ya que CK2 puede regular tanto las transiciones del ciclo de célula G1 y G2/M, los efectos de LY294002 y LY303511 sobre la actividad de CK2 se evaluaron. La actividad de de cinasa de caseína 2 (CK2) (conteos por minutos), se midieron utilizando un equipo de actividad de cinasa 2 de caseína (Upstate Biotechnology número de catálogo 17-132) a través de la incubación de 100 ng de CK2, recombinante, cóctel de magnesio /ATP (10 mcCi 32 P- gama-ATIP, 0.0675 micromoles de MgCI2, 4.5 moles de ATP), y 10 micromoles de substrato de péptido (secuencia de amino ácido RRRDDDSDDD (SEQ ID NO:1 ) en regulador de pH en 50 mcl de regulador de pH de ensayo sin o con las concentraciones de DMSO indicadas (1%), LY294002, LY303511 , o rapamicina durante 10 minutos a 30°C. Los ensayos se detuvieron con 20 mcl de ácido trido roacético al 40%, y 25 mcl se detectaron en cuadros de papel de fosfocelulosa P81 antes de lavar 3 veces con 0.75% de ácido fosfórico, y una vez con acetona. La incorporación de 32P en el péptido de substrato se detectó a través del conteo de los cuadros de fosfocelulosa en fluido de cintilación de 5 milímetros utilizando un contador de cintilación líquido Packard 100 Tri-Carb. La incubación de CK2 recombinante con LY303511 o LY294002 condujo a una inhibición dependiente de la concentración de la actividad de CK2 (Figura 5B). El IC50 aproximado para LY294002 (10µM) fue un décimo de aquel para LY303511. Ni wortmanina ni rapamicina afectaron la actividad de CK2. Ya que CK2 se sabe que regula el avance de G1 y G2 en células intactas, CK2 representa un objetivo de cinasa adicional para LY303511. De esta forma, LY303511 inhibe la cinasa 2 de caseína con IC50 entre 10 y 100 mcM. LY303511 preferencialmente inhibe cinasa P70 S6 y cinasa 2 de caseína según comparado con PI3K. La habilidad de LY303511 y LY294002 para inhibir CK2 in Vitro sugiere un segundo mecanismo mTOR e independiente de PI3K a través del cual estos inhibidores podrían bloquear la proliferación de células. Estos resultados establecen una familia novedosa de compuestos que podrían ser útiles para el tratamiento de transtornos neoplásticos. El hallazgo de LY303511 y LY294002 bloquean la actividad de CK2 sugiere un nuevo objetivo alternativo para esta clase de fármacos, y es consistente con un mecanismo independiente de mTOR para la inhibición de la proliferación de célula y la regulación del ciclo de la célula. CK2 es una cinasa de serina/treonina general altamente conservada que es requerida para la supervivencia de la célula. En general, la células de tumor exhiben varios niveles de la actividad de CK2, y la sobre producción de CK2 es capaz de inducir tumorigénesis en ratones deficientes de p53. Las células protectoras CK2 de la de la apoptosis a través de la fosforilación directa de las proteínas tal como p53, BH3, solamente proteína de de proapoptosis (BID), ß-catenina, o el factor asociado con Fas (FAF1 ). Además, CK2 regula el avance a través de los puntos de control G0/G1, G1/S, y G2/M. La reducción inducida por LY303511 en los niveles de ciclina A y B, así como incremento en los niveles de p21 y p27 (Figuras 3A-3D), es consistente con el bloqueo dependiente de CK2 del ciclo de la célula. El efecto aditivo de LY303511 sobre la proliferación y el ciclo de la célula indican que, además de la adición de la fosforilación de mTOR, de S6K, LY303511 puede superar la resistencia de rapamicina a través de la inhibición de una trayectoria aparente de S6K, tal como CK2. mTOR y PI3K con dentro de la familia de cinasa 3 y 4 de fosfatidilinositol de proteínas (familia interpro PI3_PI4_cinasa, número de registro IPR000403, ver la base de datos InterPro, disponible en el Internet). Esta familia incluye 247 proteínas consecuencias de firma específicas para el dominio PI3K. LY294002 inhibe PI3K y mTOR, mientras otros análogos (tales como LY303511 ) podrían preferencialmente inhibir un sub-grupo de cinasas en la familia. Dada la homología estructural entre los dominios catalíticos de PI3K de mTOR y PI3K, LY303511 también podría inhibir otras cinasas con dominios de tipo PI3K; estas incluyen los siguientes: EJEMPLO 6 Determinación del IC50 para la inhibición de fosforilación.

En células A549, el IC50 para la inhibición mediada por LY303511 de la fosforilación de S6K en células estimuladas es de aproximadamente de 10 mcM a través de un análisis densitométrico de fosfotinciones pS6K. LY303511 no inhibe la fosforilación de Akt cuando las células A549 están en contacto con el fármaco aún a 100 mcM. En células del músculo liso de la arteria pulmonar, el IC50 para la inhibición mediada por LY303511 de la fosforilación de S6K es de aproximadamente 1 mcM a través de densitometría. El IC o para la inhibición mediada por LY303511 de la fosforilación de Akt está entre 10 y 100 mcM a través de densitometría (ver Figuras 9A-9B).

EJEMPLO 7 Efecto de LY303511 solo o en combinación con doxorubicina en cáncer de próstata en un sistema de modelo In Vivo Se alimentaron ratones desnudos adultos machos con una dieta estándar y se alojaron en jaulas comunes. Cinco ratones se incluyeron por grupo de tratamiento para un total de 100 ratones. Cada ratón se inoculó subcutáneamente con 1 x 106 con células PC-3 (cáncer de próstata) en PBS conteniendo 20% de matrigel. Después de que los tumores alcanzaron aproximadamente 200 mm3 en tamaño, se administró un vehículo (0.2% DMSO o salina) o fármaco una vez por día durante 5 días, y el volumen del tumor se midió cada dos días durante 33 días antes de la muerte o eutanasia a través de la inhalación de dióxido de carbono. Cinco ratones fueron asignados a cada grupo de tratamiento como sigue: La doxorubicina o un vehículo se administró solamente en el día uno. La rapamicina o LY303511 se administró diariamente e ¡ntraperitonealmente durante los días 1 a 5 como se describió previamente (ver Grunwald y otros, Cáncer Res 62:6141 ,2002). El efecto de LY303511 sobre el crecimiento del tumor se evaluó in vivo. Las células de adenocarcinoma de próstata humana (células PC-3, ATCC No. CTL-1435) se cultivaron in Vitro antes de la cosecha y el implante. Para cada ratón, se implantaron 1 x 106 células en 20% de Matrigel ™ (matriz) a través de inyección subcutánea dentro del flanco. Los ratones se subdividieron en 6 grupos de 10 ratones cada uno. Los protocolos de tratamiento iniciaron cuando los tumores alcanzaron aproximadamente 150 mm3 y los volúmenes del tumor (=longitud del calibrador X anchura 2/2) se midió durante 30 días en los puntos de tiempo indicados. Los datos se expresaron como el promedio del volumen del tumor +/- SEM para cada grupo de tratamiento y punto de tiempo. Los datos se mostraron ambos en la Figuras 7A y 7B. (*p<0.05 a través de ANOVA en una vía para las comparaciones entre grupo en cada punto de tiempo. Las Figuras 7A-7B es un análisis de Kaplan-Meier que representa la probabilidad de que los volúmenes de tumor sean menores de los 300 mm3 en cualquier punto del tiempo dado (p< 0.001 a través de la prueba log-rank para la comparación ínter-grupo).

Se asignaron los siguientes tratamientos para cada grupo.

LY303511 inhibió el crecimiento de las células de adenocarcinoma de próstata (PC-3) en células de ratones desnudos. LY303511 , 10mg/kg se administró intraperitonealmente para atenuar el crecimiento del tumor PC-3 en ratones desnudos. El grado de inhibición de crecimiento fue directamente proporcional a la duración del tratamiento. En un curso de 20 días de LY303511 (LY3) fue efectivo en la inhibición del crecimiento del tumor como el curso de 10 días (ver Figura 7C). Después de 21 días, más del 15% de los ratones requirieron la eutanasia debido al excesivo crecimiento del tumor, y las mediciones del promedio del volumen del tumor se convirtieron en demasiado variables. Los resultados demostraron que LY303511 , o una combinación de LY303511 y doxorubicina disminuyen la carga de tumor (Figuras 7A y 7B). De esta forma, LY303511 , y/o LY303511 combinados con un quimioterapéutico adicional se pueden utilizar para tratar un trastorno proliferativo, tal como cáncer. LY303511 también se puede combinar con rapamicina para tratamiento de tumor.

EJEMPLO 8 Uso de LY303511 para suprimir una respuesta inmune La patogénesis de una variedad de enfermedades humanas incluyendo esclerosis múltiple (MS), artritis reumatoide, diabetes, uveitis auto- inmune, rechazo al transplante, enfermedad de berilio crónico, y enfermedad de injerto contra hospedero aparecen en una respuesta inmune mediada por la célula T . Los compuestos descritos aquí se pueden utilizar para tratar estos trastornos.

CUADRO 2 Ejemplos de trastornos autoinmunes humanos Existen varios modelos auto inmunes basados en animales que pueden ser utilizados para probar el uso de los compuestos descritos aquí para el tratamiento de un trastorno auto inmune. El Cuadro 2 lista varios trastornos mediados por inmunes ilustrativos que pueden ser tratados utilizando un complejo de péptido/MHC. Por ejemplo, el modelo de ratones diabéticos no obesos (NOD) es un sistema de modelo de animal en donde los animales desarrollan diabetes sin incrementar la edad. Para probar la eficacia de un compuesto particular, los grupos de animales en una etapa pre- diabética, (4 semanas o más jóvenes) se trataron, con, por ejemplo, LY303511 , o LY303511 en combinación con un agente inmunosupresor adicional. El número de animales desarrollaba diabetes, y la tasa de los animales que desarrollaron diabetes, después se analizó. Similarmente, en el sistema de modelo de ratón de Hashimoto, para probar la eficacia de una vacuna, los grupos de animales antes del desarrollo de los síntomas se trataron con, por ejemplo, LY303511 , o LY303511 en combinación con un agente inmunosupresor adicional. El número de animales que desarrollaron la enfermedad, y la tasa de los animales que desarrollaron la enfermedad, después se analizaron. En el modelo NOD o en el modelo de Hashimoto, o cualquier otro sistema de modelo, LY303511 , o LY303511 en combinación con un agente inmunosupresor adicional, retrasaron el avance de la enfermedad, o previeron protección a partir de del desarrollo de la enfermedad, cuando se comparó con los animales no tratados. Con el fin de demostrar el efecto de LY303511 en una respuesta inmune, se utilizaron ratones de tipo silvestre de Jackson (Jac), y Taconicos (Tac). Los macrófagos peritoneales se cosecharon 3 días después de la inyección de tioglicolato. Las células se incubaron durante 3 días en 2% de FCS RPMI. El sobrenadante se recolectó después de la estimulación con un 1 µg/ml de LPS con o sin LY303511 (de 1-100 µM) o DMSO durante 24 horas. Las tocinas (interieucina (IL)-12p70, el factor de necrosis de tumor, (TNF)-a, interferón (IFN)-?, y proteína quimioatrayente de monocito (MCP)-1 , IL-10, IL- 6) se midieron en los sobrenadantes de la célula. Los resultados demostraron que LY303511 causó una reducción dependiente de dosis de las 6 citosinas (ver Figuras 8A-F). Después de 100 µM de LY303511 dio como resultado una secreción de citosina similar a los niveles antecedentes. De esta forma, LY303511 claramente puede reducir la expresión de citosina, y tiene un efecto anti-inflamatorio.

EJEMPLO 9 Materiales y Métodos Lo siguiente provee un resumen de los materiales y métodos que se utilizaron en los ejemplos anteriores; esta sección se provee para consolidar esta información en una sola sección. Cultivo de célula: células A549 (CCL 185, Colección de Cultivo de Tipo Americano (ATCC); Manassas, VA), una línea de células de adenocarcinoma de pulmón de tipo célula epitelial de tipo II alveolar humana, se hicieron crecer a 37°C con 5% de CO2 en medio F-12 K de Ham suplementado con 10% de suero de bovina fetal (FBS), 2 mM de glutamina, penicilina (100 unidades /ml), y estreptomicina (100 µg/ml), todas de Biofluids (Rockville, MD). Las células del músculo liso de arteria pulmonar humana (PASM) (Cambres; Rockland, ME) se hicieron crecer a 37°C con 5% de CO2 en medio SMG2 suplementado con 5% FBS, insulina, factor de crecimiento de fibroblasto, factor del crecimiento epidemial, y gentamicina/anfotericina según las instrucciones del fabricante. Inhibidores y anticuerpos farmacológicos: LY303511 , rapamicina, LY294002, y wortmanina se compraron de Biomol (Plymouth.PA) o Calbiochem (San Diego, CA), y se disolvieron en DMSO. Los anticuerpos contra fosfo-S6K T389, fosfo-Akt S473, fosfo- mTOR S2481 , se compraron de fosfo-Rb S807/S811 , S6K, y Akt se compraron de Signaling Technologies (Beverly, MA). Los anticuerpos monoclonales contra mTOR (RAFT1 ), ciclina A, ciclina B, ciclina D, ciclina E, p27 Quipl, y p21 Cip1 se compraron de BD Transduction Laboratorios (San Diego, CA). Medición de la fosforilación de proteína: Las células A549 se incubaron en medio litro de suero con o sin inhibidores, durante una hora según se indicó, antes de la incubación por 30 minutos con una mezcla LPS, 100 µg/ml (Sigma; St.Louis, MO) y IFN-?, 100 U/ml (Roche; Nutley, NJ). Las células PASM se incubaron en medio libre de suero con o sin inhibidores durante 24 horas como se indicó, antes de la incubación durante 30 minutos con 10% FBS. Las células A549 o PASM se lavaron una vez con PBS frío y se incubaron durante 15 minutos sobre hielo el regulador de pH de lisis (20 mM Tris pH 8.0,1% de Nonidet P-40, 1 mM EDTA, 5 mM de benzamidina, aprotinina, 10 µg/ml, de leupeptima, 10 µg/ml de inhibidor de fríjol de soya de tripsina, 1 mM PMSF, 50 mM de fluoruro de sodio, 100 µM de ortovanadato de sodio, y 1 :100 de inhibidor de fosfatasa sigma del grupo I conteniendo cantaradina, microcistina LR y bromotetramizol). Después del congelado y el dos congelado, los lisatos se centrifugaron durante 30 minutos a 16,000 x g antes de la medición de la proteína y se almacenaron a -80°C. Se separaron cantidades ¡guales de la proteína total a través de SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa, antes de la inmunoblot con anticuerpos primarios, como se indicó. Las membranas se trataron con IgG anti-conejo o anticuerpos IgG de anti-ratón (Promega; Madison, Wl) enlazada a peroxidasa de rábano picante, desarrollado utilizando un kit de detección quimioluminiscente mejorado (SuperSignal West Pico, Pierce; Rockford, IL), y se expusieron a la película de rayos X, la cual se exploró utilizando un escáner Epson Expression 636. Las densidades de banda integradas se cuantificaron utilizando el software de Scion Image beta 3b. Medición de la proliferación de célula: La proliferación de la célula, o la síntesis de ADN, se estimó utilizando el kit de detección de 5-bromo-2 deoxi-uridina (BrDU), in situ según las instrucciones del fabricante (Roche Diagnostics; Nutley, NJ). Brevemente, las células A549 o PASM (4,000/cavidad) se sembraron en placas de 96-cavidades y se hicieron crecer durante 24 horas en presencia de suero. Se agregaron 10 mM de BrDU durante 24 horas sin y con inhibidores como se indicó. En algunos experimentos, las células BrDU se incubaron en medio libre de suero durante 24 horas adicionales antes de la adición de BrDU y los inhibidores. Las células se fijaron, y se detectó BrDU utilizando un anticuerpo anti-BrDU conjugado con peroxídasa. Los datos de absorbancia medidos en las células tratadas con inhibidores se normalizaron a aquellas tratadas con control de DMSO (% de control). La medición del ciclo de la célula: Las células A549 PASM se hicieron crecer a 807o de confluencia antes de la adición de inhibidores según indicado durante 24 horas. Las células se cosecharon a través de tripsinización ligera, y se lavaron tres veces con PBS antes de la adición de 0.5 ml de yoduro de propidío de Vindalov (10 mM de base de Trizma, 10 mM de NaCI, 0.05 mg/ml de yoduro de propidio, 0.7 U/ml RNA se, 0.1 % de Nonidet P40) durante por lo menos dos horas. El análisis del ciclo de las células se llevó a cabo en un clitómetro de flujo (BD Biosciences; San Diego, CA). La línea de 488-nm de un láser de argón se utilizó para la excitación del yoduro de propidio, y la fluorescencia emitida se recolectó utilizando un filtro de paso de banda de 585 -nm (FL2). Los datos en modo de lista se recolectaron en una escala lineal utilizando el software Cell Quest. Las células teñidas con yoduro de propidio se contaron a través de citometria de flujo, y el porcentaje de células en la fase G1, S, o G2/M se determinaron. Medición de la actividad de cinasa 2 (CK2): la actividad de CK2 (conteos por minuto) se midió utilizando un kit de actividad CK2 (Upstate, Charlottesville, VA) a través de la incubación de 100 ng de secador recombinante, cóctel de magnesio/ATP (10µCi 32 P-gama-ATP, 0.675 µmol MgCI2, 4.5 nmoles de ATP), y 10 µmol substrato de péptido (secuencia de amino ácido RRRDDDSDDD) en 50 µl (20 mM MOPS, pH 7.2, 5 mM EGTA, 25 mM ß-glicerol fosfato, 1 mM sodio ortovanadato, 1 mM de ditiotreitol) con o sin las concentraciones indicadas de LY294002, LY303511, wortmanina o rapamicina en 1% de DMSO durante 10 minutos a 30°C. Los ensayos se detuvieron con 20 µl de 40% de ácido tricloroacético, y las muestras (25 µl) de sobrenadante se aplicaron a cuadros de papel de fosfocelulosa P81 , los cuales después se lavaron tres veces con 0.75% de ácido fosfórico, y una vez con acetona. 32P en el péptido de sustrato se cuantificó utilizando un contador de cíntilación Tri-Carb de Packard 100 sobre cuadros de fosfocelulosa durante 10 minutos. La actividad de CK2 se midió en la presencia de inhibidores divididos por aquellos medidos para el control DMSO (= 100% de control). Habiendo ilustrado y descrito los principios de las composiciones y métodos descritos, será evidente que estas composiciones y métodos se pueden modificar en configuración y detalle sin apartarse de dichos principios.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- El uso de un compuesto 2-(4-piperazinilo)-4H-1-benzopiran-4- ona sustituido, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo que tiene la estructura de

Fórmula A en donde la presencia de cada uno de Ri y de R2 es opcional y Ri y R2 son cada uno independientemente seleccionados de alquilo, alquilo sustituido, heteroalquilo, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, heterocicloalquilo, heterocicloalquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxi, halógeno, hidroxi, o amino, para la preparación de un medicamento para suprimir una respuesta inmune en un sujeto. 2.- El uso que se reclama en la reivindicación 1 , en donde el compuesto 2-(4-piperazinilo)-4H-1-benzopiran-4-ona sustituido comprende un compuesto 2-(4-piperazinilo)-8-fen¡l-4H-1-benzopiran-4-ona que tiene la estructura de Fórmula B en donde la presencia de cada uno de R-i y R2 es opcional y Ri y R2 son cada uno independientemente seleccionados de alquilo, arilo, alcoxi, halógeno, hidroxi, o amino.

3.- El uso que se reclama en la reivindicación 1 , en donde el compuesto 2-(4-piperazinilo)-4H-1-benzopiran-4-ona sustituido comprende 2-(4-piperazinilo)-8-fenil-4H-1-benzopiran-4-ona.

4.- El uso que se reclama en la reivindicación 1 , en donde el compuesto 2-(4-piperazinilo)-4H-1-benzopiran-4-ona sustituido inhibe al objetivo mamífero de rapamicina o cinasa 2 de caseína, pero no inhibe significativamente 3-cinasa de fosfatidilinositol.

5.- El uso que se reclama en la reivindicación 1 , en donde el sujeto tiene un trastorno autoinmune.

6.- El uso que se reclama en la reivindicación 1 , en donde el sujeto tiene una respuesta inflamatoria.

7.- El uso que se reclama en la reivindicación 1 , en donde el sujeto tiene una enfermedad de injerto contra hospedero.

8.- El uso que se reclama en la reivindicación 1 , en donde el sujeto es un receptor de transplante y en donde la respuesta inmune es un rechazo al transplante.

9.- El uso que se reclama en la reivindicación 1 , en donde un agente inmunosupresor adicional es administrable además al sujeto.

10.- Un método in vitro para inhibir la proliferación de una célula, que comprende poner en contacto la célula con una cantidad efectiva de un compuesto 2-(4-piperazinilo)-4H-1-benzopiran-4-ona sustituido o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, que tiene la estructura de Fórmula A en donde la presencia de cada R-i y R2 es opcional y Ri y R2 cada uno independientemente se selecciona de alquilo, alquilo sustituido, heteroalquilo, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, heterocicloalquilo, heterocicloalquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxi, halógeno, hidroxi, o amino.

11.- El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque el compuesto 2-(4-piperazinilo)-4H-1-benzopiran-4-ona sustituido comprende un compuesto 2-(4-piperazinilo)-8-fenil-4H-1-benzopiran-4-ona que tiene la estructura de Fórmula B en donde la presencia de cada R-i y R2 es opcional y Ri y R2 cada uno se selecciona independientemente de alquilo, arilo, alcoxi, halógeno, hidroxí o amino.

12.- El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque el compuesto 2-(4-piperazinilo)-4H-1-benzopiran-4-ona sustituido comprende un compuesto 2-(4-piperazinilo)-8-feníl-4H-1 -benzopiran-4-ona.

13.- El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque el compuesto 2-(4-piperazinilo)-4H-1-benzoplran-4-ona sustituido inhibe al objetivo mamífero de rapamicina o cinasa 2 de caseína pero no inhibe significativamente 3-cinasa de fosfatidilinosítol.

14.- El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque comprende poner en contacto la célula con una cantidad efectiva de un agente quimioterapéutico.

15.- El uso de un compuesto 2-(4-piperazinilo)-4H-1-benzopiran-4-ona sustituido o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, que tiene la estructura de Fórmula A en donde la presencia de cada R-i y R2 es opcional y R-i y R2 cada uno se selecciona independientemente de alquilo, alquilo sustituido, heteroalquilo, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, heterocicloalquílo, heterocicloalquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxi, halógeno, hidroxi, o amino.

16.- El uso que se reclama en la reivindicación 15, en donde el compuesto 2-(4-piperazinilo)-4H-1-benzopiran-4-ona sustituido comprende un compuesto de 2-(4-piperazinilo)-8-fenil-4H-1-benzopiran-4-ona que tiene la estructura de Fórmula B en donde la presencia de cada Ri y R2 es opcional y Ri y R2 cada uno se selecciona independientemente de alquilo, arilo, alcoxl, halógeno, hidroxi, o amino.

17.- El uso que se reclama en la reivindicación 15, en donde el compuesto 2-(4-piperazinilo)-4H-1-benzopiran-4-ona sustituido comprende un compuesto de 2-(4-piperazinilo)-8-fenil-4H-1-benzopiran-4-ona.

18.- El uso que se reclama en la reivindicación 15, en donde el compuesto 2-(4-piperazínilo)-4H-1-benzopiran-4-ona sustituido inhibe la fosforilación de cinasa P79 S6 pero no inhibe significativamente 3-cinasa de fosfatidilinositol.

19.- El uso que se reclama en la reivindicación 15, en donde el trastorno proliferativo comprende restenosis.

20.- El uso que se reclama en la reivindicación 15, en donde el trastorno proliferativo es un tumor.

21.- El uso que se reclama en la reivindicación 20, en donde el tumor es un cáncer de pulmón o un cáncer de próstata.

22.- Un método para seleccionar un agente inmunosupresor o un agente anti-proliferativo que comprende seleccionar un agente de prueba que preferencialmente inhibe cinasa 2 de caseína y la fosforilación de cinasa de P70 S6 según comparado con la inhibición de la fosforilación dependiente de 3-cinasa (PI3K) de fosfatilidinositol de un sustrato, por lo tanto identificar un agente inmunosupresor farmacéuticamente útil o un agente anti-proliferativo.

23.- El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque el sustrato es cinasa B de proteína (PKB).

24.- El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque el agente de prueba inhibe la fosforilación de cinasa P70 S6 en serina -389.

25.- El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque se selecciona un agente inmunosupresor.

26.- El método de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque se selecciona un anti-proliferativo.

27.- Una composición farmacéutica que comprende 2-(4- piperazinilo)-8-fen¡l-4H-1-benzopiran-4-ona o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y un portador farmacéuticamente aceptable.

28.- El uso que reclama en la reivindicación 1 , en donde la respuesta inmune comprende la activación de macrófago.

29.- El uso que reclama en la reivindicación 1 , en donde la respuesta inmune comprende la secreción de una o más citosinas.

30.- El uso que reclama en la reivindicación 29, en donde la citosina es interieucina (IL)-12, factor de necrosis de tumor (TNF)-a, interferón (IFN)-?, proteína quimioatrayente de monocito (MCP)-1 , IL-10, IL-6.

31.- El uso que reclama en la reivindicación 20, en donde un agente quimioterapéutico adicional administrable además al sujeto.

32.- El uso que reclama en la reivindicación 31 , en donde el agente quimioterapéutico es 5-fluorouacilo (5-FU), azatioprina, ciclofosfamida, fludarabina, etoposida, doxorubicina, metotrexato, vincristina, carboplatina, cis-platina, taxol , rapamicina, o una combinación de los mismos.

33.- El uso que reclama en la reivindicación 1 , en donde el compuesto 2-(4-piperazinilo)-4H-1-benzopiran-4-ona sustituido se distribuye en una cánula vascular.

34.- El método de conformidad con la reivindicación 15, en donde el compuesto 2-(4-piperazinilo)-4H-1-benzopiran-4-ona sustituido se distribuye en una cánula vascular.

35.- El uso que reclama en la reivindicación 19, en donde el compuesto 2-(4-piperazinilo)-4H-1-benzopiran-4-ona sustituido se distribuye en una cánula vascular.

36.- Una cánula vascular que comprende la composición farmacéutica de la reivindicación 27.

37.- Una cánula vascular que comprende el compuesto 2-(4-piperazinilo)-4H-1-benzopiran-4-ona sustituido.

38.- El uso que reclama en la reivindicación 20, en donde el tumor es un tumor maligno.

39.- El uso que reclama en la reivindicación 20, en donde el tumor es un tumor de próstata o un tumor de pulmón.

40.- El uso que reclama en la reivindicación 1 , en donde el sujeto tiene una enfermedad de intestino inflamatoria.

41.- El uso de un compuesto 2-(4-piperazinilo)-4H-1-benzopiran-4-ona sustituido o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, que tiene la estructura de Fórmula A en donde la presencia de cada R-i y R2 es opcional y R-i y R2 cada uno independientemente se selecciona de alquilo, alquilo sustituido, heteroalquilo, cicloalqullo, cicloalquilo sustituido, heterocicloalquilo, heterocicloalquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxi, halógeno, hidroxi, o amino, para la preparación de una composición farmacéutica para inhibir la proliferación de una célula.

42.- El uso que se reclama en la reivindicación 41 , en donde el compuesto 2-(4-piperazinilo)-4H-1-benzopiran-4-ona sustituido comprende un compuesto 2-(4-piperazinilo)-8-fenil-4H-1-benzopiran-4-ona que tiene la estructura de Fórmula B en donde la presencia de cada R-i y R2 es opcional y Ri y R2 cada uno se selecciona independientemente de alquilo, arilo, alcoxi, halógeno, hidroxi o amino.

43.- El método de conformidad con la reivindicación 41 , caracterizado además porque el compuesto 2-(4-piperazinilo)-4H-1-benzopiran-4-ona sustituido comprende 2-(4-piperazinilo)-8-fenil-4H-1-benzopiran-4-ona.

44.- El método de conformidad con la reivindicación 41 , caracterizado además porque el compuesto 2-(4-piperazinilo)-4H-1- benzopiran-4-ona sustituido inhibe al objetivo mamífero de rapamicina o cinasa 2 de caseína pero no inhibe significativamente 3-cinasa de fosfatidilinositol.

45.- El método de conformidad con la reivindicación 41 , caracterizado además porque comprende poner en contacto la célula con una cantidad efectiva de un agente quimioterapéutico.