MXPA06003775A

MXPA06003775A - Microorganismo productor de l-aminoacido y metodo para la produccion de l-aminoacido.

Info

Publication number: MXPA06003775A
Application number: MXPA06003775A
Authority: MX
Inventors: Yuji Joe
Original assignee: Ajinomoto Kk
Priority date: 2004-01-30
Filing date: 2005-01-28
Publication date: 2006-06-14
Also published as: DK1664318T3; ZA200602484B; PL1664318T3; RU2316588C1; KR100786987B1; EP1664318B1; ES2331956T3; CN101243177B; DE602005016763D1; CN103146593B; KR20060084446A; WO2005073390A2; BRPI0506369B1; US8383363B1; EP1664318A2; CN101243177A; BRPI0506369A; ATE443757T1; WO2005073390A3; US20060019355A1

Abstract

Los L-aminoacidos se producen mediante el cultivo de un microorganismo el cual tiene una capacidad para producir el L-aminoacido, pero ha sido modificado de manera que se mejora la expresion del gen ybjE; el L-aminoacido se recolecto a partir del medio de cultivo o a partir del microorganismo.

Description

MICROORGANISMO PRODUCTOR DE L-AMINOACIDO Y METODO PARA LA PRODUCCION DE L-AMINOACÍDO CAMPO DE LA TECNICA La presente invención se refiere a un método para la producción de un L-am¡noácido mediante fermentación utilizando un microorganismo. Específicamente, la presente invención se refiere a un método para la producción de L-aminoácidos tales como L-lisina, L-arginina, L-ornitina, L-histidina, L-isoleucina, L-treonina, L-prolina, L-fenilalanina, L-cisteína, y L-ácido glutámico. Estos son L-aminoácidos industrialmente útiles. Es decir, L-lisina, L-treonina, L-isoleucina, y L-prolina son útiles como aditivos para forraje animal, componentes de alimento saludable, e infusiones de aminoácidos. L-arginina y L-ornitina son útiles como agentes promotores de la función hepática, infusiones de aminoácidos, y componentes de preparaciones comprensivas del aminoácido. L-histidina es útil como un agente promotor de la función hepática y como un precursor de histamina. L-fenilalanina es útil como un precursor de edulcolorantes.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Los L-aminoácidos se producen industrialmente mediante fermentación utilizando microorganismos que pertenecen al género Brevibacterium, Corynebacteríum, Escheríchia, o los similares. Se han reportado los métodos para la producción de L-lisina en EP 0857784A, JP 11-192088A, WO 00/53726, y WO 96/17930. Se han reportado los métodos para la producción de L-arginina en EP 0999267A, EP 1170358A, y JP 2002-017342A. En estos métodos reportados, se utilizaron las cepas bacterianas productoras de L-aminoácidos básicos, incluyendo cepas separadas a partir de cepas naturalmente mutadas o artificialmente mutadas de las mismas, y cepas recombinantes las cuales tienen actividad mejorada de una enzima biosintética de L-aminoácidos básicos. Además, también se han reportado los métodos para la producción de L-aminoácidos a partir de metanol, el cual está disponible para la fermentación en grandes cantidades para bajo costo, utilizando una cepa de un microorganismo mutado o genéticamente modificado que pertenece al género Methylophilus o Methylobacülus (WO 00/6 723 y JP 2001-120269A). Se sabe que los métodos para la modificación de la toma o exportación de L-aminoácidos en células bacterianas mejoran la capacidad productora de L-aminoácido de las bacterias. Los métodos para modificar la toma de L-aminoácido incluyen la eliminación o disminución en la toma de un L-aminoácido dentro de las células para mejorar la capacidad productora del L-am¡noácido. Específicamente, estos métodos incluyen un método para la deleción del operón gluABCD, o una parte del mismo, para eliminar o atenuar la toma de L-ácido glutámico (EP 1038970A). Los métodos para modificar el exportador incluyen la eliminación o reducción de la exportación de un intermediario o un sustrato de la biosíntesis de L-aminoácido, y un método para mejorar la exportación de un L-aminoácido producido. Como un método de eliminación o reducción de la exportación de un intermediario de la biosíntesis de L-ácido glutámico, se conoce un método para mutar o alterar el gen de la cc-cetoglutarato permeasa para reducir una exportación del ácido a-cetoglutárico (WO 01/005959). Como un método de mejoría de una exportación del L-aminoácido, se conoce un método de mejoría de lysE (a gene for basic L-amino acid exporten J. Mol. Microbiol. Biotechnol. , 1999 Nov; 1 (2): 327-36) en una cepa de la bacteria Corynebacterium para la producción de L-lisina (WO 97/23597) o L-arginina (Publicación de Patente de E.U.A. 2003-0113899). Se conoce un método para mejorar la expresión del gen rhtA, B, C (JP 2000-189177A) y el gen yfiK, yahN (EP 1016710A), el cual se ha sugerido que está implicado en la exportación de L-aminoácidos, en células de bacteria Escheríchia. Como un gen para la exportación de L-aminoácídos básicos, se conoce el gen lysE anteriomente mencionado. No obstante, cuando se amplifica un gen LysE en una bacteria que asimila el metanol tal como la bacteria Methylophilus, y la cepa resultante se utiliza para la producción de L- Usina o L-arginina, un gen de lysE de tipo silvestre derivado a partir de una bacteria Coryneform es letal para la bacteria Methylophilus, y por lo tanto es necesario introducir un gen lysE muíante (EP 1266966A) que permite el crecimiento del microorganismo hospedero. Por lo tanto, el gen lysE no puede funcionar siempre en la exportación de L-lisina o L-arginina cuando se introduce dentro de microorganismos heterogéneos. Por lo tanto, es deseable obtener un gen para para la exportación y producción de L-aminoácido que exhibe una capacidad para secretar cantidades adecuadas de L-aminoácidos, incluyendo L-lisina y L-arginina, en una variedad de microorganismos hospederos heterogéneos. El gen ybjE se localiza en el genoma de Escherichia coli y se ha pronosticado que codifica una proteína putativa de superficie (Science, 277 (5331): 1453-74, 1997). No obstante, no se ha reportado la clonación del gen y el análisis del mismo a través de la expresión en células bacterianas, y por lo tanto su función fisiológica ha permanecido desconocida.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION Un objetivo de la presente invención es proveer una cepa bacteriana que puede producir eficientemente un L-aminoácido. Otro objetivo de la presente invención es proveer un método para producir eficientemente un L-aminoácido utilizando dicha cepa.

Los inventores de la presente invención se estudiaron asiduamente con el objeto de lograr los objetivos anteriormente mencionados, y como un resultado, se obtuvo el gen ybjE, un gen novedoso para exportar L- aminoácido, basándose en la resistencia a las altas concentraciones de L- lisina. Además, ellos también encontraron que los los L-aminoácidos, incluyendo L-aminoácidos básicos tales como L-lisina, L-argin¡na, L-ornitina, y L-histidina; L-aminoácidos alifáticos tal como L-isoleucina; hidroxil L-aminoácidos tal como L-treonina; L-aminoácidos circulares tal como L-prolina; L-aminoácidos aromáticos tal como L-fenilalanina; L-aminoácidos que contienen azufre tal como L-cisteína; y L-aminoácidos ácidos tal como L-ácido glutámico, se pueden producir eficientemente utilizando un microorganismo en el cual se mejora la expresión del gen ybjE. Es un objetivo de la presente invención proveer un microorganismo que tiene una capacidad productora de L-aminoácido, en donde dicho microorganismo se modifica de manera que se mejora la expresión de un gen ybjE. Es un objetivo adicional de la presente invención proveer el microorganismo como se estableció anteriormente, en donde se mejora la expresión de dicho gen ybjE al incrementar un número de copias de dicho gen ybjE, o al modificar una secuencia reguladora de la expresión de dicho gen ybjE. Es un objetivo adicional de la presente invención proveer el microorganismo como se estableció anteriormente, en donde la secuencia de aminoácidos de una proteína codificada por dicho gen ybjE se selecciona a partir del grupo que consiste de SEQ 2, 9 y 10 y en donde dicha proteína tiene una capacidad de exportación de L-aminoácido. Es un objetivo adicional de la presente invención proveer el microorganismo como se estableció anteriormente, en donde dicho gen ybjE se seleccionó a partir del grupo que consiste de: (a) un ADN que comprende una secuencia nucleotídica de SEQ ID NO: 1 ; y (b) un ADN hibridizable bajo condiciones severas con una secuencia nucleotídica de SEQ ID NO: 1 o una sonda que se puede preparar a partir de la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO: 1 , y en donde dicho ADN codifica una proteína que tiene una capacidad de exportación de L-aminoácido. Es un objetivo adicional de la presente invención proveer el microorganismo como se estableció anteriormente, en donde dicho gen ybjE se seleccionó a partir del grupo que consiste de: (a) un ADN que tiene una secuencia nucleotídica de nucleótidos números 49 a 948 en SEQ ID NO: 1 y (b) un ADN hibridizable bajo condiciones severas con una secuencia nucleotídica de nucleótidos números 49 a 948 en SEQ ID NO: 1 o una sonda que se puede preparar a partir de la secuencia nucleotídica de nucleótidos números 49 a 948 en SEQ ID NO: 1 , y en donde dicho ADN codifica una proteína que tiene una capacidad de exportación de L- aminoácido. Es un objetivo adicional de la presente invención proveer el microorganismo como se estableció anteriormente, en donde dicha capacidad de exportación de L-aminoácido de dicho microorganismo se incrementa mediante dicha expresión mejorada de dicho gen ybjE. Es un objetivo adicional de la presente invención proveer el microorganismo anteriormente establecido, en donde se incrementa una resistencia del microorganismo a un L-aminoácido o análogo de L-aminoácido mediante dicha expresión mejorada de dicho gen ybjE. Es un objetivo adicional de la presente invención proveer el microorganismo como se estableció anteriormente, en donde dicho L-aminoácido se selecciona a partir del grupo que consiste de L-lisina, L-arginina, L-ornitina, L-histidina, L-isoleucina, L-treonina, L-prolina, L-fenilalanina, L-cisteína, y L-ácido glutámico. Es un objetivo adicional de la presente invención proveer el microorganismo como se estableció anteriormente, en donde dicho microorganismo pertenece a una familia Enterobacteriaceae. Es un objetivo adicional de la presente invención proveer el microorganismo como se estableció anteriormente, en donde dicho microorganismo que pertenece a la familia Enterobacteriaceae es un microorganismo que pertenece al género Escherichia.

Es un objetivo adicional de la presente invención proveer el microorganismo como se estableció anteriormente, en donde dicho microorganismo es una bacteria Coryneform. Es un objetivo adicional de la presente invención proveer el microorganismo como se estableció anteriormente, en donde dicho microorganismo es un microorganismo que asimila metanol. Es un objetivo adicional de la presente invención proveer el microorganismo como se estableció anteriormente, en donde dicho microorganismo que asimila metanol pertenece al género Methylophilus o MethylobacHIus. Es un objetivo adicional de la presente invención proveer un método para la producción de un L-aminoácido que comprende cultivar el microorganismo como se estableció anteriormente en un medio para producir y ocasionar la acumulación de dicho L-aminoácido, y recolectar dicho L-aminoácido a partir del medio o del microorganismo. Es un objetivo adicional de la presente invención proveer un método para la producción de un L-aminoácido, que comprende cultivar el microorganismo como se estableció anteriormente en un medio líquido que contenía metanol como una fuente principal de carbono para producir y ocasionar acumulación de dicho L-aminoácido, y recolectar el L-aminoácido a partir del medio o del microorganismo. Es un objetivo adicional de la presente invención proveer el método como se estableció anteriormente, en donde el L-aminoácido se selecciona a partir del grupo que consiste de L-lisina, L-arginina, L-ornitina, L- histidina, L-isoleucina, L-treonina, L-prolina, L-fenilalanina, L-cisteína, y L- ácido glutámico.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS La figura 1 muestra un esquema de contrucción de un plásmido para amplificación del gen ybjE en la bacteria Escherichia. Las figuras 2A-2B muestran curvas de crecimiento para una cepa control y una cepa amplificada por el gen ybjE de Escherichia coli en la presencia de altas concentraciones de L-lisina. La figura 3 muestra curvas de crecimiento para una cepa control y una cepa desorganizada por el gen ybjE de Escherichia coli en la presencia de altas concentraciones de L-lisina. La figura 4 muestra un esquema de contrucción de un plásmido para la amplificación del gen ybjE en bacterias que asimilan metanol. La figura 5 muestra un esquema de contrucción de un plásmido para la producción de L-lisina utilizando bacterias que asimilan metanol. Las figuras 6A-6B muestran curvas de crecimiento para una cepa control y una cepa amplificada por el gen ybjE de Methylophilus methylotrophus en la presencia de un análogo de L-lisina.

La figura 7 muestra curvas de crecimiento para una cepa control y una cepa amplificada por el gen ybjE de Escheríchia coli en la presencia de altas concentraciones de L-isoleucina. La figura 8 muestra curvas de crecimiento para una cepa control y una cepa amplificada por el gen ybjE de Escheríchia coli en la presencia de altas concentraciones de L-glutamato. La figura 9 muestra curvas de crecimiento para una cepa control y una cepa amplificada por el gen ybjE de Escheríchia coli en la presencia de altas concentraciones de L-treonina. La figura 10 muestra curvas de crecimiento para una cepa control y una cepa amplificada por el gen ybjE de Escheríchia coli en la presencia de altas concentraciones de L-histidina. La figura 11 muestra curvas de crecimiento para una cepa control y una cepa amplificada por el gen ybjE de Escheríchia coli en la presencia de altas concentraciones de L-prolina. La figura 12 muestra curvas de crecimiento para una cepa control y una cepa amplificada por el gen ybjE de Escheríchia coli en la presencia de altas concentraciones de L-ornitina. La figura 13 muestra curvas de crecimiento para una cepa control y una cepa amplificada por el gen ybjE de Escheríchia coli en la presencia de altas concentraciones de L-fenilalanina.

La figura 14 muestra curvas de crecimiento para una cepa control y una cepa amplificada por el gen ybjE de Escherichia coli en la presencia de altas concentraciones de L-cisteína. La figura 15 muestra curvas de crecimiento para una cepa control y una cepa amplificada por el gen ybjE de Escherichia coli en la presencia de altas concentraciones de L-arginina. La figura 16 muestra curvas de crecimiento de una cepa control y de cepas amplificadas por el gen ybjE (948 pb o 900 pb) de Escherichia coli en la presencia de altas concentraciones de L-lisina.

DESCRIPCION DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS A continuación, la presente invención se explicará en detalle. < 1 > Microorganismo de la presente invención El microorganismo de la presente invención tiene una capacidad para producir un L-aminoácido y se ha modificado de manera que se mejora la expresión del gen ybjE. La frase "capacidad para producir un L-aminoácido (capacidad de producción de L-aminoácido)" como se utiliza en la presente invención significa una capacidad para ocasionar la acumulación de un L-aminoácido en un medio o en las células del microorganismo cuando el microorganismo de la presente invención se cultiva en el medio. El microorganismo de la presente invención puede tener una capacidad para producir múltiples clases de L-aminoácidos. El microorganismo que tiene una capacidad productora de L-aminoácido puede ser un microorganismo que originalmente tiene una capacidad productora de L-aminoácido, o puede ser un microorganismo obtenido mediante la modificación de una cepa parental de un microorganismo como se menciona a continuación utilizando una técnica de mutagénesis o una técnica de ADN recombinante de manera que el microorganismo tiene una capacidad productora de L-aminoácido. El microorganismo de la presente invención también puede ser un microorganismo el cual ha obtenido una capacidad productora de L-aminoácido mediante la mejoría de la expresión del gen ybjE. Los L-aminoácidos a ser producidos en la presente invención no se limitan particularmente, e incluyen L-aminoácidos básicos tales como L-lisina, L-arginina, L-ornitina, L-histidina, y L-citrulina; L-aminoácidos alifáticos tales como L-isoleucina, L-alanina, L-valina, L-leucina, y L-glicina; hidroxil L-aminoácidos tales como L-treonina y L-serina; L-aminoácidos circulares tal como L-prolina; L-aminoácidos aromáticos tales cómo L-fenilalanina, L-tirosina, y L-triptofano; L-aminoácidos que contienen azufre tales como L-cisteína, L-cistina, y L-metionina; y L-aminoácidos ácidos y sus amidas tales como L-ácido glutámico, L-ácido aspártico, L-glutamina, y L-asparagina. Los microorganismos de la presente invención pueden tener una capacidad para producir una o más clases de estos L-aminoácidos. <lmpartic¡ón de capacidad productora de L-aminoácido> A continuación se describirán los ejemplos de microorganismos que tienen una capacidad productora de L-aminoácido a ser utilizados en la presente invención. No obstante, los microorganismos no se limitan a los ejemplos, pero incluyen cualquier microorganismo que tiene una capacidad productora de L-aminoácido. Como una cepa parental del microorganismo de la presente invención, se puede utilizar la familia Entrobacteriaciae tales como bacterias Escherichia, bacterias Pantoea, o bacterias Coryneform, y así sucesivamente. Además, también se pueden utilizar las bacterias que asimilan metanol, tales como bacterias Methylophilus y bacteria Methylobacülus, las cuales pueden producir L-aminoácidos a partir de metanol. Además, los ejemplos de cepas parentales incluyen a la familia Entrobacteriaciae que pertenece a la ?-proteobacteria incluyendo bacterias que pertenecen al género Escherichia, Pantoea, Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Erwinia, Salmonella y Morganella, y otras bacterias incluyendo bacterias AlicyclobacHIus y bacterias Bacillus, y levaduras incluyendo aquellas que pertenece al género Saccharomyces, Candida, o las similares. Estas cepas parentales pueden poseer inherentemente el gen ybjE, o pueden no poseer inherentemente el gen ybjE y exhibir capacidad mejorada de exportación de L-aminoácido cuando se introduce el gen ybjE. Se pueden utilizar las bacterias Escherichia reportadas en Neidhardt et al. (Neidhardt,. F. C. et al., Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D. C, 1208, cuadro 1), tales como Escheríchia coli. Los ejemplos de cepas de Escheríchia coli de tipo silvestre incluyen, pero no se limitan a, la cepa K12 y derivados de la misma, la cepa de Escheríchia coli MG1655 (ATCC No. 47076), y la cepa W3110 (ATCC No. 27325). Estas cepas están disponibles a partir de the American Type Culture Collection (ATCC, Dirección: P. O. Box 1549, anassas, VA 20108, Estados Unidos de América). Los ejemplos de bacterias Enterobacter incluyen Enterobacter agglomerans, Enterobacter aerogenes, y así sucesivamente. Los ejemplos de bacterias Pantoea incluyen Pantoea ananatis y así sucesivamente. Aunque algunas bacterias originalmente clasificadas como Enterobacter aerogenes pueden clasificarse actualmente como Pantoea agglomerans, Pantoea ananatis o Pantoea stewartii basándose en el análisis interno del ARNr 16S, el i microorganismo que pertenece a la familia Enterobacteriaceae utilizada en la presente invención pueden ser ya sea bacterias Enterobacter o bacterias Pantoea. Los ejemplos específicos de Pantoea ananatis incluyen Pantoea ananatis AJ13355 (FERM BP-66 4), Pantoea ananatis AJ13356 (FERM BP-6615), Pantoea ananatis AJ13601 (FERM BP-7207), y derivados de las mismas. Estas cepas se identificaron originalmente y se depositaron como Enterobacter agglomerans, y actualmente se clasifican como Pantoea ananatis. Los ejemplos de bacterias Methylophilus incluyen, pero no se limitan a, Methylophilus methylotrophus, y los ejemplos típicos de Methylophilus methyiotrophus incluyen la cepa AS1 (NCIMB10515) y así sucesivamente. La cepa Methylophilus methyiotrophus AS1 (NCIMB 10515) está disponible a partir de the National Collections of Industrial and Marine Bacteria (Dirección: NCIMB Lts., Torry Research Station, 135, Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, Reino Unido). Los ejemplos de bacterias Methylobacillus incluyen, pero no se limitan a, Methylobacillus glycogenes, Methylobacillus flagellatum, y así sucesivamente. Los ejemplos de Methylobacillus glycogenes incluyen la cepa T-11 (NCIMB 11375), la cepa ATCC 21276, la cepa ATCC 21371 , la cepa ATR80 (Appl. Microbio!. Biotechnol., vol. 42, pp. 67-72 (1994)), la cepa A513 (Appl. Microbiol. Biotechnol., vol. 42, pp. 67-72 (1994)), y así sucesivamente. La cepa Methylobacillus glycogenes NCIMB 11375 está disponible a partir de the National Collections of Industrial and Marine Bacteria (Dirección: NCIMB Lts., Torry Research Station 135, Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, Reino Unido). Los ejemplos de Methylobacillus flagellatum incluyen la cepa KT (Arch. Microbiol., vol. 149, pp. 441-446 (1988)) y así sucesivamente. Las bacterias Coryneform son un grupo de microorganismos definidos en Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8a Ed., p. 599 (1974), y se puede utilizar en la presente invención. Estos microorganismos se clasifican en bacilos aeróbicos, Gram-positivos, y bacilos no fermentadores incapaces de esporulación. Las bacterias Coryneform también incluyen aquellas bacterias que han sido clasificadas hasta la fecha dentro del género Brevibacteríum, pero se han unido habitualmente dentro del género Corynebacterium (Int. J. Syst. Bacteriol., 41 , 255 (1991)); así como las bacterias que pertenecen al género Brevibacterium o Microbacterium las cuales están cercanamente relacionadas al género Corynebacterium. Los ejemplos de dichas bacterias Coryneform se listan a continuación. Corynebacterium acetoacidophüum Corynebacterium acetoglutamicum Corynebacterium alkanolyticum Corynebacterium callunae Corynebacterium glutamicum Corynebacterium lilium Corynebacterium melassecola Corynebacterium thermoaminogenes (Corynebacterium efficiens) Corynebacterium herculis Brevibacterium divaricatum Brevibacterium flavum Brevibacterium immariophilum Brevibacterium lactofermentum Brevibacterium roseum Brevibacterium saccharolyticum Brevibacterium thiogenitalis Corynebacterium ammoniagens Brevibacterium álbum Brevibacterium cerínum Microbacterium ammoniaphilum Específicamente, se pueden ejemplificar las siguientes cepas. Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 3870 Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806 Corynebacterium alkanolyticum ATCC215 Corynebacterium cailunae ATCC 5991 Corynebacterium glutamicum ATCC13020, ATCC 3032, ATCC13060 Corynebacterium lilium ATCC15990 Corynebacterium melassecola ATCC 7965 Corynebacterium efficiens AJ 12340, (FERM BP-1539) Corynebacterium herculis ATCC 13868 Brevibacterium divaricatum ATCC 14020 Brevibacterium flavum ATCC 3826, ATCC14067, AJ124 8 (FERM BP-2205) Brevibacterium immariophilum ATCC14068 Brevibacterium lactofermentum ATCC 3869 (Corynebacterium glutamicum ATCC 13869) Brevibacterium roseum ATCC13825 Brevibacterium saccharolyticum ATCC14066 Brevibacterium thiogenitalis ATCC19240 Corynebacterium ammoniagenes ATCC6871 , ATCC6872 Brevibacterium álbum ATCC 511 1 Brevibacteríum cerínum ATCC15112 Microbacterium ammonlaphilum ATCC 15354 Estas cepas se pueden obtener, por ejemplo, a partir de the American Type Culture Collection. A cada cepa se le proporciona un número de registro único el cual está listado en el catálogo de the American Type Culture Collection. Las cepas se pueden ordenar utilizando este número de registro. Además, la cepa AJ12340 se depositó el 27 de octubre de 1987 en the National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (actualmente, the independent administrative agency, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary (Tsukuba Central 6, 1-1 , Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japón, códifo postal: 305-5466)) como un depósito internacional bajo las condiciones del Tratado de Budapest, y recibió un número de acceso de FERM BP-1539. La cepa AJ12418 se depositó el 5 de enero de 1989 en the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary como un depósito internacional bajo las condiciones del Tratado de Budapest y recibió un número de acceso de FERM BP-2205. En adelante, se explicarán los métodos para impartir una capacidad productora de L-aminoácido a una cepa parental como se mencionó anteriormente.

Con el objeto de impartir la capacidad productora de L- aminoácido, se pueden utilizar los métodos convencionalmente utilizados para la reproducción de una bacteria productora de L-aminoácido que pertenece al género Escherichia o bacteria Coryneform y así sucesivamente. Por ejemplo, se pueden utilizar los métodos para la obtención de una cepa muíante auxotrófica, cepa resistente al análogo, o cepa muíante para la regulación metabólica que tiene la capacidad productora de L-aminoácido, y los métodos para la creación de una cepa recombinante que tiene actividad mejorada de una enzima biosintéíica del L-aminoácido ("Amino Acid Fermeníaíion", íhe Japan Scieníific Societies Press [Gakkai Shuppan Center], 1a Edición, publicado el 30 de mayo de 1986, pp. 77-100). Cuando se reproducen las bacterias productoras de L-aminoácido utilizando estos métodos, se pueden impartir una o más propiedades, incluyendo auxotrofía, resistencia al análogo, y mutación para regulación metabólica. Cuando se crea una cepa recombinante, se puede mejorar la actividad de una sola o de múltiples enzimas biosintéíicas de L-aminoácido. Además, los métodos para impartir propiedades de auxotrofía, resistencia al análogo, y mutación para la regulación metabólica se pueden combinar con los métodos que mejoran una actividad de la enzima biosintéíica de L-aminoácido. Una cepa muíante auxoírófica, cepa resisfeníe al análogo del L-aminoácido, o cepa mutada para regulación metabólica que tiene una capacidad productora de L-aminoácido se puede obtener al someíer a una cepa parental o cepa de tipo silvestre a un tratamiento típico de mutagénesis tales como irradiación de rayos X o de rayos ultravioleta, tratamiento con un agente para mutagénesis tal como N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG). Posteriormente, se puede seleccionar una cepa auxotrófica, cepa resistente al análogo o cepa muíante para regulación metabólica la cual tiene una capacidad productora de L-aminoácido a partir de las cepas mutadas. Los ejemplos de análogos de L-lisina incluyen oxalisina, hidroxamato de lisina, S-(2-aminoetil)-L-cisteína (AEC), ?-metil-lisina, -clorocaprolactamo, norleucina, y así sucesivamente. Los ejemplos de análogos de L-arginina incluyen hidroxamato de arginina, homoarginina, D-arginina, canavanina, hidroxamato de arginina. Los ejemplos específicos de cepas resistentes al análogo de L-lisina o cepas mutadas para la regulación metabólica que tienen una capacidad productora de L-lisina incluyen la cepa Escheríchia coli AJ11442 (FERM BP-1543, NRRL B-12185, JP 56-18596A y Patente de E.U.A. No. 4,346,170), cepa Escheríchia coli VL611 (JP 2000-189180A), y así sucesivamente. Además, la cepa WC196 (WO 96/17930) también se puede utilizar como una Escheríchia coli productora de L-lisina. La cepa WC196 originalmente se reprodujo al impartir resistencia a AEC (S-(2-aminoetil)cisteína) a la cepa W3 10, la cual se deriva a partir de Escheríchia co/ K-12. La cepa WC196 se designó como cepa Escheríchia coli AJ 13069, y se depositó en la agencia administrativa independiente, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositar/ (Tsukuba Central 6,1-1 , Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki- ken, Japón, código postal: 305-8566) el 6 de diciembre de 1994 y recibió un número de acceso de FERM P-14690. Posteriormente, el depósito se convirtió en un depósito internacional bajo las condiciones del Tratado de Budapest el 29 de septiembre de 1995, y recibió un número de acceso de FERM BP-5252. Los ejemplos de bacterias Coryneform que tienen capacidad productora de L-lisina incluyen cepas mutantes resistentes a S-(2- aminoetil)cisteína (en adelante "AEC") incluyendo Brevibacterium lactofermentum AJ11082 (NRRL B-11470) (descrita en JP56-1914B, JP56- 1915B, JP57-14157B, JP57-14158B, JP57-30474B, JP58-10075B, JP59-4993B, JP61-35840B, JP62-24074B, JP62-36673B, JP5-11958B, JP7- 112437B y JP7-112438B), cepas mutantes auxotróficas para un aminoácido tal como L-homoserina (JP48-28078B y JP56-6499B), cepas mutantes resistentes a AEC y auxotróficas para un aminoácido tales como L-leucina, L-homoserina, L-prolina, L-serina, L-arginina, L-alanina, y L-valina (Patentes de E.U.A. Nos. 3,708,395 y 3,825,472), cepas mutantes productoras de L-lisina resistentes a DL-cc-amino-s-caprolactamo, a-amino-lauril-lactamo, análogo de ácido aspártico, fármaco sulfa, quinoide, y N-lauroil-leucina, cepas mutantes productoras de L-lisina resistentes a inhibidor de oxaloacetato descarboxilasa o un inhibidor de la enzima del tracto respiratorio (JP50-53588A, JP50-31093A, JP52-102498A, JP53-9394A, JP53-86089A, JP55-9783A, JP55-9759A, JP56-32995A, JP56-39778A, JP53-43591 B y JP53-1833B), cepas mutantes productoras de L-lisina auxotróficas para inositol o ácido acético (JP55-9784A y JP56-8692A), cepas mutantes productoras de L-lisina que son susceptibles al ácido fluoropirúvico o a una temperatura de 34°C o superior (JP55-9783A y JP53-86090A), cepas mutantes productoras de L-lisina de bacterias Brevibacterium o Corynebacterium resistentes a etilenglicol (Patente de E.U.A. No. 4,411 ,997), y así sucesivamente. Una capacidad productora de L-aminoácido también se puede impartir mediante la mejoría de la expresión de un gen que codifica para un enzima biosintética de L-aminoácido. Por ejemplo, una capacidad productora de L-lisina se puede impartir mediante la mejoría de la expresión de un gen que codifica dihidrodipicolinato sintasa y un gen que codifica aspartocinasa. Es decir, un ADN recombinante se prepara mediante la ligación de un fragmento génico que codifica dihidrodipicolinato sintasa y un fragmento génico que codifica aspartocinasa dentro de un vector, preferiblemente un vector de múltiples copias, el cual es operable en el microorganismo hospedero utilizado para producción de L-lisina. Como un resultado de la transformación, se mejora el número de copias del gen que codifica dihidrodipicolinato sintasa y el gen que codifica aspartocinasa en la célula hospedera, y por lo tanto se mejoran las actividades de estas enzimas. En adelante, dihidrodipicolinato sintasa, aspartocinasa, y aspartocinasa III también se refieren por sus abreviaturas respectivas DDPS, AK y AKIII. Los genes que codifican DDPS y AK no se limitan particularmente, siempre y cuando codifiquen proteínas que tienen actividad DDPS o AK, respectivamente. Los ejemplos de dichos genes incluyen genes de Escherichía coli, Methylophilus methylotrophus, Corynebacterium glutamicum, y así sucesivamente. Puesto que se conocen las secuencias nucleotídicas para un gen DDPS (dapA, Richaud, F. et al., J. Bacteriol., 297 (1986)) y un gen AKIII (lysC, Cassan, M., Parsot, C, Cohén, G. N. y Patte, J. C, J. Biol. Chem., 261 , 1052 (1986)), estos genes se pueden obtener mediante PCR utilizando iniciadores diseñados basándose en sus secuencias nucleotídicas a partir del ADN cromosomal de un microorganismo tal como la cepa E. coli K-12. En adelante, un gen que codifica DDPS y un gen que codifica AK serán ejemplificados por dapA y lysC derivados a partir de E. coli, pero los genes que codifican DDPS y los genes que codifican AK no se limitan a dapA y lysC. Se sabe que DDPS de tipo silvestre derivado a partir de Escherichía coli se somete a inhibición por retroalimentación mediante L-lisina, y que AKIII de tipo silvestre derivado a partir de Escherichía coli se somete a supresión e inhibición de retroalimentación mediante L-lisina. Por lo tanto, cuando se utilizan dapA y lysC, es preferible utilizar los genes mutantes que codifican DDPS y AK que son resistentes a la inhibición por retroalimentación mediante L-lisina. En adelante, DDPS que tiene una mutación que se libera a partir de la inhibición por retroalimentación mediante L-lisina también se puede referir como "muíante DDPS", y un ADN que codifica el DDPS muíante también se puede referir como "muíante dapA" o "dapA*". El AKIII derivado a partir de Escherichía coli que tiene una muíación que elimina la inhibición por retroal ¡mentación mediante L-lisina también se puede referir como "muíante AKIII", y un ADN que codifica el muíante AKIII también se puede referir como "muíaníe lysC". El DDPS derivado a partir de bacterias Corynebacterium originalmente es resisteníe a la inhibición por retroalimentacion mediante L- lisina, y por lo tanto DDPS y AK utilizados para la presente invención no necesariamente tienen que ser muíados. Los ejemplos del ADN que codifican el DDPS muíante que es resistente a la inhibición por retroalimeníación medianíe L-lisina incluyen un ADN que codifica DDPS que íiene una secuencia de aminoácidos la cual incluye sustitución del residuo 118 de histidina con tirosína. (Patente de E.U.A. Nos. 5,661 ,012 y 6,040,160). Además, los ejemplos del ADN que codifican el AKIII mutaníe que es resisfeníe a la inhibición por reíroalimeníación medianíe L-lisina incluyen un ADN que codifica AKIII que tiene la secuencia de aminoácidos la cual incluye la susíiíución del residuo 352 de íreonina con isoleucina. (Patente de E.U.A. Nos. 5,661 ,012 y 6,040,160). Se puede obtener un ADN muíante mediante una técnica de mutagénesis sitio-dirigida utilizando PCR o los similares. El plásmido utilizado para clonación génica puede ser cualquier plásmido siempre y cuando se pueda replicar en microorganismos, y los ejemplos específicos de los mismos incluyen pBR322, pTWV228 (Takara Bio), pMW119 (Nippon Gene), pUC19, y así sucesivamente. Un vector operable en un microorganismo hospedero utilizado para transformación es un plásmido que es autónomameníe replicable en células de cada microorganismo. Los ejemplos específicos de vectores para Escherichia coli incluyen pSTV29 (Takara Bio), RSF1010 (Gene, vol. 75 (2), pp. 271-288, 1989), pUC19, pBR322, pMW1 9, y así sucesivamente. También se pueden utilizar los vectores de ADN de fago. El vector para bacterias Methylophilus, por ejemplo, es un plásmido que es autónomamente replicable en células de bacterias Methylophilus. Los ejemplos específicos de vectores para bacterias Methylophilus incluyen RSF1010 y derivados de las mismas, tales como pAYC32 (Chistorerdov, A. Y., Tsygankov, Y. D. Plasmid, 16, 161- 167 (1986)), pMFY42 (Gene, 44, 53 (1990)), pRP301 , y pTB70 (Nature, 287, 396, (1980)). Los ejemplos de un vector operable en bacterias Coryneform incluyen pAM330 (JP58-67699A), pHM1519 (JP58-77895A), y pSFK6 (JP2000-262288A). Además, se pueden utilizar los vectores obtenidos mediante la escisión de un fragmento de ADN los cuales permiten que un plásmido se replique de manera autónoma en una bacteria Coryneform e insertando el fragmento dentro de los vectores para Escherichia coli como un vector denominado de lanzadera el cual se replica autónomamente tanto en Escherichia coli como en bacterias Coryneform. Para preparar un ADN recombinante vía la ligación de dapA y lysC con cualquiera de los vectores anteriormente citados, las enzimas de restricción se pueden utilizar para digerir tanto el fragmento de ADN que contenía dapA y lysC como el vector. La ligación usualmente se lleva a cabo utilizando una ligasa tal como ADN-T4 ligasa. dapA y lysC se pueden incorporar dentro de vectores separados o dentro de un vector particular. Los métodos que se pueden utilizar para digestión mediante enzima de restricción, ligación de ADN, preparación de ADN cromosomal, PCR, preparación de ADN plasmídico, transformación, diseño de iniciadores oligonucleótidos, y así sucesivamente, pueden ser métodos usuales bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. Dichos métodos que se describen en Sambrook, J., Fritsch, E. F., y Maniatis, T., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) y así sucesivamente. Con el objeto de introducir un ADN recombinante preparado como se describió anteriormente dentro de un microorganismo, se puede utilizar cualquier método siempre y cuando se logre una transformación eficiente adecuada. Por ejemplo, se puede aplicar la electroporación (Canadian Journal of Microbiology, 43, 197 (1997)). Se puede utilizar el plásmido RSFD80 con un amplio espectro de hospedero (Patente de E.U.A. No. 6,040,160) como el plásmido que contenía un muíante dapA que codifica un DDPS muíante y un mutaníe lysC que codifica un AKIII mufaníe. La cepa Escheríchia coli JM109 transformada con RSFD80 se designó AJ12396 (Pateníe de E.U.A. No. 6,040,160), y esía cepa se depositó en la agencia adminisíraíiva independieníe, Naíional Instifute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositan/ el 28 de octubre de 1993 y recibió un número de acceso de FERM P-13936. Posteriormente, el depósito se convirtió en un depósito internacional bajo las condiciones del Tratado de Budapest el 1 de noviembre de 1994, y recibió un número de acceso de FERM BP-4859. RSFD80 se puede obtener a partir de la cepa AJ12396 mediante un método conocido. La expresión del gen DDPS y del gen AK también se puede mejorar mediante la integración de múltiples copias de dapA y lysC dentro de un ADN cromosomal de un microorganismo. Con el objeto de introducir múltiples copias de dapA y lysC dentro de un ADN cromosomal de un microorganismo, la recombinación homologa se puede llevar a cabo mediante el direccionamiento de una secuencia que está presente en el ADN cromosomal en múltiples copias. Un ADN repetitivo o un repetido invertido presente en el extremo de un elemento transposable se puede utilizar como una secuencia presente en un ADN cromosomal en múltiple copies. Alternativamente, como se describió en JP2-109985A, se pueden introducir múltiples copias de dapA y/o lysC dentro de un ADN cromosomal mediante la utilización de un transposón. En ambos métodos, las actividades de DDPS y AK se mejoran como un resultado del número de copias incrementado de dapA y lysC en las cepas transformadas. Además de los métodos de amplificación del gen anteriormente mencionados, la expresión del gen DDPS y del gen AK también se puede mejorar al reemplazar una secuencia reguladora de la expresión, tales como los promotores de dapA y lysC, con promotores más fuertes (JP1-215280A). Los ejemplos de dichos promotores fuertes incluyen al promotor lac, promotor trp, promotor trc, promotor tac, promotor PR y promotor P¡_ del fago lambda, promotor tet, promotor amyE, promotor spac, y así sucesivamente. La inserción de estos promotores en el lugar de los promotores nativos mejora la expresión de dapA y lysC, resultando en la mejoría de la actividad de DDPS y AK. La mejoría de las secuencias reguladoras de la expresión se puede combinar con números de copias amplificados de dapA y lysC. Una capacidad productora de L-lisina también se puede impartir mediante la mejoría de la expresión de un gen que codifica una enzima biosintética de L-lisina diferente a DDPS y AK. Los ejemplos de dichas enzimas incluyen enzimas de la ruta de diaminopimelato sintético tales como dihidrodipicolinato reductasa, diaminopimelato decarboxilasa, diaminopimelato dehidrogenasa (WO 96/40934), fosfoenolpiruvato carboxilasa (JP60-87788A), aspartato aminotransferasa (JP6-102028B), diaminopimelato epimerasa (JP2003-135066A), y aspartato semialdehído dehidrogenasa (WO 00/61723). Los ejemplos adicionales de dichas enzimas incluyen enzimas de la ruta de aminoadipato tales como homoaconitato hidratasa (JP2000-157276A) y así sucesivamente. La mejoría en la expresión génica de estas enzimas se puede combinar con la expresión mejorada de los genes DDPS y AK. Además, un microorganismo que tiene capacidad productora de L-lisina también se puede obtener mediante la reducción o eliminación de una actividad intracelular de una enzima que cataliza una reacción para la síntesis de un compuesto diferente a L-lisina, y la ramificación a partir de la ruta biosintética de L-lisina. Los ejemplos de dichas enzimas incluyen homoserina dehidrogenasa y lisina decarboxilasa. Las cepas en las cuales las actividades de estas enzimas están reducidas o han sido eliminadas se describen en WO 95/23864 y WO 96/17930. Los ejemplos de los métodos para la reducción o eliminación de la actividad intracelular de una enzima incluyen mutación o deleción de un gen que codifica la enzima en células de un microorganismo de manera que la actividad intracelular se reduce o elimina en comparación con una cepa no mutada. Los ejemplos de métodos de mutación o deleción de un gen incluyen modificación de la expresión de secuencias reguladoras tales como promotores y secuencias Shine-Dalgarno (SD), introducción de mutaciones con sentido errado, mutaciones sin-sentido, o mutaciones de cambio de marco dentro de un marco de lectura abierta, y deleción de una porción del gen (J Biol Chem. 1997 272 (13): 8611-7). Un gen mutado se puede introducir dentro de un microorganismo mediante la utilización de una técnica de recombinación homologa en la cual un gen de tipo silvestre en un cromosoma se reemplaza con el gen mutado, o mediante la utilización de un transposón o factor IS. Las técnicas de recomblnación homologa incluyen métodos que utilizan ADN lineal, un píásmido sensible a la temperatura, y un plásmido no replicable. Estos métodos se describen en Proc Nati Acad Sci U S A. 2000 Junio 6; 97 (12): 6640-5., Patente de E.U.A. No. 6303383, JP05-007491A, y los similares. Los métodos para mejoría y reducción de la actividad enzimática para la biosíntesis de L-lisina son aplicables para impartir otra capacidad productora de L-aminoácido. Los ejemplos específicos de Escheríchia coli la cual tiene una capacidad para producir L-arginina incluyen cepas mutantes resistentes a a-metilmetionina, p-fluorofenilalanina, D-arginina, hidroxamato de arginina, S-(2-aminoetil)cisteína, a-metilserina, ß-2-tienilalanina, o sulfaguanidina (JP No. 56-106598A), y así sucesivamente. Además, también se puede utilizar la cepa Escherichia coli 237, la cual es una bacteria productora de L-arginina que tiene una mutación que imparte resistencia a la inhibición por retroalimentación mediante L-arginina y que exhibe una alta actividad de N-acetilglutamato sintasa (Solicitud de Patente Rusa No. 2000117677). Esta cepa se depositó en the Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNU Genetika con un número de VKPM B- 7925 el 10 de abril de 2000, y se convirtió a un depósito internacional bajo las condiciones del Tratado de Budapest el 18 de mayo de 2001. También se puede utiliza la cepa Escherichia coli 382, la cual se deriva a partir de la cepa 237 y tiene una capacidad mejorada para la asimilación de acetato (JP2002-017342A). La cepa Escherichia coli 382 se depositó en the Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) con un número de VKPM B- 7926 el 10 de abril del 2000. Los ejemplos de bacterias Coryneform que tienen una capacidad productora de L-arginina incluyen cepas de bacteria Coryneform las cuales no solamente son resistentes a 2-tiazolealanina sino que también son auxotróficas para L-histidina, L-prolina, L-treonina, L-isoleucina, L-metionina, o L-triptofano (JP54-44096A), una cepa de bacteria Coryneform resistente a ácido cetomalónico, ácido fluoromalónico, o ácido monofluoroacético (JP57- 18989A), una cepa de bacteria Coryneform resistente a argininol (JP62- 24075A), una cepa de bacteria Coryneform resistente a X-guanidina (X representa un derivado de un ácido graso o una cadena alifática, JP2- 186995A), una cepa de bacteria Coryneform resistente a hidroxamato de arginina y 6-azauracilo (JP57-150381A), una cepa de bacteria Coryneform la cual es deficiente en ArgR (una proteína represora de las enzimas biosintéticas de arginina) (JP2002-5 790A), y así sucesivamente. Las actividades de las enzimas biosintéticas para L-arginina, L-histidina, L-ornitina, y otros L-aminoácidos se pueden mejorar mediante métodos similares a los métodos anteriormente mencionados para las enzimas biosintéticas de L-lisina. Los ejemplos de enzimas biosintéticas de L-arginina incluyen una o más clases de enzimas seleccionadas para N-acetilglutamato sintasa (argA), N-acetilglutamil fosfato reductasa (argC), ornitina acetiltransferasa (argJ), N-acetilglutamato cinasa (argB), acetilornitina transaminasa (argD), acetilornitina deacetilasa (argE) ornitina carbamoiltransferasa (argF), argininosuccinato sintasa (argG), argininosuccinato liasa (argH), y carbamoil-fosfato sintasa (carAB). Los nombres de los genes que codifican estas enzimas se proporcionan en paréntesis después de los nombres de las enzimas, respectivamente. Los ejemplos de las cepas en las cuales las actividades de estas enzimas están mejoradas incluyen, por ejemplo, las cepas descritas en JP2000-287693A, JP2000-197490A, JP07-028749B, y así sucesivamente.

Una capacidad productora de L-arginina también se puede impartir mediante la mejoría de la expresión de un gen que codifica giutamato dehidrogenasa (EP1057893A) o mejorando la actividad de la giutamato sintetasa (US2005-00142236). Se sabe que las enzimas biosintéticas de L- arginina son suprimidas por L-arginina, y por lo tanto la capacidad productora de L-arginina también se puede mejorar eficientemente mediante la deleción de un represor de arginina o la introducción de una mutación dentro de la N-acetilglutamina sintasa (EP1154020A y EP1170361A) la cual confiere resistencia a la inhibición por retroalimentación. Además, también se pueden utilizar bacterias Bacillus resistentes a un análogo de histidina o un análogo de triptofano (JP52-114092A), bacterias Bacillus auxotróficas para al menos uno de L-metionina, L-histidina, L-treonina, L-prolina, L-isoleucina, L-lisina, adenina, guanina, y uracilo (o precursor de uracilo) (JP52-99289A), bacterias Bacillus resistentes a hidroxamato de arginina (JP51-6754B), Serratia marcescens auxotrófica para ácido succínico o resistente a un análogo de nucleótido (JP58-9692A), Serratia marcescens la cual es deficiente en una capacidad para metabolizar arginina, resistente a un antagonista de arginina y canavanina, y auxotrófica para lisina (JP52-8729A), Saccharomyces cerevisiae resistente a arginina, hidroxamato de arginina, homoarginina, D-arginina, canavanina, hidroxamato de arginina y 6-azauracilo (JP53-143288A), Candida tropicalis resistente a canavanina (JP53-3586A), y así sucesivamente como cepas productoras de L-arginina.

Los ejemplos de las enzimas biosintéticas de L-histidina incluyen ATP fosforibosiltransferasa (hisG), fosforibosil AMP ciclohidrolasa (hisl), fosforibosil-ATP pirofosfohidrolasa (hislE), fosforibosilformimlno-5- aminoimidazol carboxamida ribotida ¡somerasa (hisA), amidotransferasa (hisH), histidinol fosfato aminotransferasa (hisC), histidinol fosfatasa (hisB), histidinol dehidrogenasa (hisD), y así sucesivamente. Se sabe que los genes que codifican la enzima biosintética de L-histidina {hisG, hisBHAFI) se inhiben mediante L-histidina, y por lo tanto también se puede mejorar eficientemente una capacidad productora de L-histidina mediante la introducción de una una mutación que confiere resistencia a la inhibición por retroallmentación en la ATP fosforibosiltransferasa (hisG) (Patentes Rusas Nos. 2003677 y 2119536). Los ejemplos específicos de microorganismos los cuales tienen una capacidad productora de L-histidina incluyen cepas E. coli FERM-P5038 y 5048 las cuales han sido introducidas con un vector que porta un ADN que codifica una enzima biosintética de L-histidina (JP56-005099A), cepas introducidas con rht, un gen para una exportación de aminoácido (EP1016710A), cepa E. coli 80 impartida con sulfaguanidina, DL-1 ,2,4-triazol-3-alanina, y resistencia a estreptomicina (VKPM B-7270, Patente Rusa No. 21 9536), y así sucesivamente. La ruta biosintética de L-ornitina incluye varias enzimas en común con la ruta biosintética de la L-arginina. Los ejemplos de las enzimas biosintéticas de la L-ornitina incluyen N-acetilglutamato sintasa (argA), N- acetilglutamil fosfato reductasa (argC), omitiría acetiltransferasa (argJ), N- acetilglutamato cinasa {argB), acetilornitina transaminasa (argD), acetilornitina deacetilasa (argE), y así sucesivamente. Los ejemplos de bacterias que tienen una capacidad para producir L-ornitina incluyen bacterias Coryneform y bacterias Arthrobacter las cuales han sido introducidas con una mutación auxotrófica de L-citrulina o L- arginina (JP02-283290A), la cepa de bacteria Coryneform AJ1 1589 resistente a una sustancia activa semejante a vitamina P (FERM-P5644, JP57- 016696A), y así sucesivamente. Los ejemplos de microorganismos que tienen una capacidad productora de L-treonina incluyen un muíante resistente a 6-dimetilaminopurina el cual tiene una capacidad productora de L-treonina (JP5-304969A), una cepa en la cual un gen para una enzima biosintética de treonina que tiene una mutación para mejorar la actividad enzimática se amplifica con un plásmido (JP1-29559B, JP05-227977A), una cepa en la cual el operón de treonina se amplifica con un plásmido (JP2-109985A), una cepa en la cual se amplifican un gen que codifica piruvato carboxilasa y un gen que codifica nicotinamida nucleótido transhidrogenasa (JP2002-51787A), y así sucesivamente. La cepa Escherichia coli VKPM B-3996 (Patente de E.U.A. No. 5,175,107) también se puede utilizar como una cepa productora de L-treonina. VKPM B-3996 se depositó en the Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNU Genetika con un número de registro de VKPM B-3996 el 19 de noviembre de 1987. La cepa VKPM B-3996 que contiene el plásmido pVIC40 (Publicación de Patente Internacional WO 90/04636), el cual se obtiene mediante la inserción de un operón de treonina (thrABC) dentro del plásmido pAYC32 que tiene un gene marcador para resistencia a estreptomicina (Chistorerdov, A. Y., Tsygankov, Y. D., Plasmid, 1986, 16, 161- 167). La aspartocinasa l-homoserina dehidrogenasa I codificada por un gen muíante thrA contenido en pVIC40 se libera a partir de la inhibición por retroalimentación mediante L-treonina. La cepa Escheríchia coli VKPM B-5318 (EP 0593792B) también se puede utilizar como una cepa productora de L-treonina. VKPM B-5318 se depositó en the Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNU Genetika (VKPM GNU Genetika Dirección: Dorozhny proezd 1 , Moscú 113545, Rusia) con un número de registro de VKPM B-5318 el 3 de mayo de 1990. La cepa VKPM B-5318 es autótrofa a L-isoleucina, y el operón de treonina que codifica la enzima para la biosíntesis de treonina se localiza hacia el extremo 3' del represor sensible a la temperatura Cl, promotor PR y extremo N de la proteína Cro derivada a partir del fago ?, además, la cepa contiene el ADN plasmídico construido de manera que la expresión del gen para la biosíntesis de treonina se regula mediante el promotor y el represor derivado a partir del fago ?. Además, la cepa Escheríchia coli MG442 (US 4,278,765) también se puede utilizar como una cepa productora de L-treonina. La cepa MG442 se depositó en the Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) como CMIMB-1628. Las bacterias que tienen una capacidad para producir L-treonina se pueden obtener mediante mejoría de la actividad de una enzima biosintética de L-treonina. Los ejemplos de genes que codifican las enzimas biosintéticas de L-treonina incluyen un gen de aspartocinasa III, un gen de aspartato semialdehído dehidrogenasa, y así sucesivamente. La actividad de una enzima biosintética de L-treonina se puede mejorar en una bacteria en la cual se suprime una actividad enzimática degradadora de treonina. Los ejemplos de una bacteria en la cual se suprime la actividad en una enzima degradadora de treonina incluyen la cepa TDH6, la cual es deficiente en actividad de treonina dehidrogenasa (JP2001-346578A). La bacteria que tiene una capacidad para producir L-ácido glutámico también se puede obtener mediante la mejoría de la actividad de una enzima biosintética de L-ácido glutámico. Los ejemplos de las enzimas biosintéticas de L-ácido glutámico incluyen glutamato dehidrogenasa, glutamina sintetasa, glutamato sintasa, isocitrato dehidrogenasa, aconitato hidratasa, citrato sintasa, piruvato carboxilasa, fosfoenolpiruvato carboxilasa, fosfoenolpiruvato sintasa, enolasa, fosfogliceromutasa, fosfoglicerato cinasa, gliceraldehído-3-fosfato dehidrogenasa, triosefosfato isomerasa, fructosa bisfosfato aldolasa, fosfofructocinasa, glucosa fosfato isomerasa, y así sucesivamente.

Específicamente, las bacterias que tienen actividad mejorada de estas enzimas biosintéticas de L-ácido glutámico incluyen cepas de bacteria Coryneform descritas en WO 00/18935 y JP2000-232890A, y cepas de la familia Enterobacíeriaceae descritas en JP2001-333769A, JP2000-106869A, JP2000-189169A, y JP2000-333769A. Las bacterias que tienen una capacidad para producir L-ácido glutámico también se pueden obtener mediante la reducción o eliminación de una actividad de una o más enzimas las cuales catalizan una reacción ocasionando una ramificación a partir de la síntesis del L-ácido glutámico y la producción de un compuesto diferente a L-ácido glutámico. Dichas enzimas incluyen isocitrato liasa, a-cetoglutarato dehidrogenasa, fosfato acetiltransferasa, acetato cinasa, acetohidroxi ácido sintasa, acetolactato sintasa, formato acetiltransferasa, lactato dehidrogenasa, glutamato decarboxilasa, 1-pirofosfato dehidrogenasa, y así sucesivamente. Específicamente, la bacteria en la cual se reduce la actividad de cc-cetoglutarato dehidrogenasa incluye la cepa Brevibacteríum lactofermentum As descrita en WO 95/34672, la cepa Brevibacteríum lactofermentum AJ 12821 (FERM BP-4172) descrita en JP6-237779A, las cepas Escheríchia coli descritas en JP5-244970A o JP7-203980A, y la cepa Enterobacter agglomerans descrita en JP2001-333769A. Los ejemplos de bacterias que tienen una capacidad para producir L-cisteína incluyen la cepa Escheríchia coli en la cual se reduce la actividad de cistationina ß-Iiasa (JP2003-169668A) y una cepa de Escheríchia coli (JP1 1-155571 A) o bacteria Coryneform (JP2002-233384A) en la cual se liberó la inhibición por retroalimentación de serina acetiltransferasa L-cisteína. Los ejemplos de bacterias Escherichia que tienen una capacidad para producir L-prolina incluyen cepa Escherichia coli 702 (VKPM B-8011 ) la cual es resistente a 3,4-dihidroxiprolina y azatidin-2-carboxilato, y cepa 702ilvA (VKPM B-80 2) la cual se obtiene mediante la deleción del gen ilvA en la cepa 702 (JP2002-300874A). Los ejemplos de bacterias Escherichia que tienen una capacidad para producir L-fenilalanina incluyen cepa Escherichia coli J12739 (tyrA::Tn10,TyrR; VKPM B-8197) en la cual los genes tyrA y tyrR han sido deletados, cepa Escherichia coli HW1089 en la cual se introdujo un pheA mutado (Patente de E.U.A. No. 5,354,672) y cepa Escherichia coli en la cual los genes yddG y yedA están amplificados (WO 03/044192). Los ejemplos de bacterias Coryneform que tienen una capacidad para producir L-fenilalanina incluyen una cepa la cual es auxotrófica para tirosina y resistente a L-fenilalanil-L-tirosina (JP5-49489A). Las bacterias que tienen una capacidad para producir L-triptofano se pueden obtener mediante la mejoría de las actividades de las enzimas biosintéticas de L-triptofano incluyendo fosfoglicerato dehidrogenasa y antranilato sintasa. Enzimas pueden ser resistentes a la inhibición por retroalimentación mediante L-triptofano o L-serina. Por ejemplo, una bacteria que tiene estas enzimas resistentes a la retroalimentación se puede obtener mediante la introducción de un plásmido pGH5, el cual contiene un gen muíante serA que codifica L-triptofano resistente a fosfoglicerato dehidrogenasa dentro de la cepa Escheríchia coli S 164 la cual contiene un gen que codifica L-serina resistente a antranilato sintasa (WO 94/08031). Las bacterias que tienen una capacidad para producir L- triptofano también se pueden obtener mediante la mejoría de las actividades de las enzimas biosintéticas de L-triptofano codificadas por el operón de triptofano. Dichas enzimas incluyen la triptofano sintasa y antranilato sintasa con operón de L-triptofano. Los ejemplos de estas bacterias incluyen una cepa Escheríchia coli en la cual se introduce el operón de triptofano que contenía un gen que codifica la L-serina resistente a antranilato sintasa (JP57-71397A, JP62-244382A, y Patente de E.U.A. No. 4,371 ,614). Además, los ejemplos de bacterias que tienen una capacidad para producir L-triptofano incluyen Escheríchia coli AGX17 (pGX44) [NRRL B-12263] cepa auxotrófica para L-fenilalanina y L-tirosina, y AGX6 (pGX50) aroP [NRRLB-12264] cepa que contiene el plásmido pGX50 que contenía el operón de triptofano (Patente de E.U.A. No. 4,371 ,614). Los ejemplos de bacterias Escheríchia que tienen una capacidad para producir L-isoleucina incluyen una cepa muíante resisteníe a 6-dimeíilaminopurina (JP5-304969A), una cepa muíante resistente a hidroxamato de L-isoleucina, tiaisoleucina, DL-etionina o hidroxamato de arginina (JP5- 30882A), y una cepa recombinante en la cual un gen que codifica treonina deaminasa y ácido acetohidroxílico sinfasa se amplifica con un plásmido (JP2-458A, JP2-42988A y JP8-47397A).

Las bacterias que tienen una capacidad para producir L-valina se pueden obtener mediante la mejoría de las actividades de las enzimas biosintéticas de L-valina incluyendo aquellas codificadas por el operón ilvGMEDA, especialmente acetohidroxilato sintasa codificada por el gen ilvG (JP02-748418B). Estas enzimas pueden ser resistentes a la inhibición por retroalimentación mediante L-valina. Las bacterias que tienen una capacidad para producir L-valina pueden ser una bacteria en la cual la expresión del gen de acetolactato sintasa III (gen ilvIH) está disminuida. Las bacterias que tienen una capacidad para producir L-valina pueden ser resistentes a análogos del aminoácido. Los ejemplos de dichas bacterias incluyen una cepa mutante la cual es auxotrófica para L-isoleucina y L-metionina y es resistente a D-ribosa, nucleósido purina, o ribonucleósido pirimidina (FERM P-1841 , P-5556; JP53-025034A), y una cepa mutante resistente a policetonoide (FERM P-9325; JP04-045314B). Los ejemplos de bacterias que tienen una capacidad para producir L-alanina incluyen una cepa de bacteria Coryneform la cual es deficiente en actividad de H+-ATPasa (Appl Microbiol Biotechnol. 2001 Nov; 57 (4): 534-40) o una cepa de bacteria Coryneform en la cual el gen de ácido aspártico decarboxilasa está amplificado (JP07-163383A). < Expresión mejorada del gen ybjE > El microorganismo de la presente invención se puede obtener al modificar un microorganismo que tiene una capacidad productora de L- aminoácido como se describió anteriormente de manera que se mejora la expresión del gen ybjE. Alternativamente, la expresión del gen ybjE se puede mejorar inicialmente, seguido por la impartieron de una capacidad productora de L-am¡noácido. La expresión del gen ybjE se puede potenciar ya sea al mejorar la expresión del gen endógeno ybjE vía la modificación de una secuencia reguladora de la expresión tal como un promotor, o mediante la introducción exógena del gen ybjE utilizando un plásmido o los similares. Estas técnicas se pueden combinar. La mejoría de la expresión del gen ybjE se puede confirmar mediante la medición de la cantidad de ARN por la expresión del gen ybjE en la bacteria de la presente invención mediante hibridación northern o RT-PCR (Molecular cloning: Cold sprlng Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001 , y comparándola con la de una cepa de tipo silvestre o una cepa no modificada. La expresión del gen ybjE en el microorganismo de la presente invención se mejora más que aquella de una cepa de tipo silvestre o una cepa no modificada, y preferiblemente no menor de 1.5 veces, mas preferiblemente no menor de 2 veces, y mas preferiblemente no menor de 3 veces de una cepa de tipo silvestre o una cepa no modificada.

El gen ybjE puede ser a partir de Escherichia coli o un homólogo de la misma. Los ejemplos del gen ybjE a partir de Escherichia coli incluyen un gen que codifica una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos números 17 a 315 en SEQ ID NO: 2, preferiblemente un gen que tiene una secuencia nucleotídica de los nucleótidos números 49 a 948 en SEQ ID NO: 1. Aunque el codón para Val en la posición 1 en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 es gtg, éste se puede traducir como Met, y la proteína codificada por el gen ybjE puede ser una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 (1 a 315). En tal caso, es preferible utilizar ADN que contiene la secuencia nucleotídica de los nucleótidos números 1 a 948 de SEQ ID NO: 1. No obstante, se entiende claramente a partir de los ejemplos que un microorganismo utilizable para el método de producción de la presente invención se puede obtener mediante el uso de un ADN que contenía la secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 1 (49 a 948), sin importar cuál residuo de aminoácido es el codón del inicio de la traducción. Un homólogo del gen de Escherichia coli ybjE se refiere a un gen el cual exhibe una alta similitud estructural con el gen de Escherichia coli ybjE y mejora la capacidad de exportación del L-aminoácido o la resistencia del L-aminoácido, y la capacidad productora de L-aminoácido del microorganismo hospedero. Los ejemplos del homólogo del gen ybjE incluyen un gen que codifica una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 o NO: 10. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 es una secuencia la cual se conservó entre la proteína YbjE de Escherichia coli (SEQ ID NO: 2) y la proteína YbjE de la cepa Salmonella typhimurium LT2. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 es una secuencia la cual se conservó entre la proteína YbjE de Escherichia coli y la proteína YbjE de Yersinia pestis cepa C092YPO1361. El homólogo del gen ybjE puede ser un gen que codifica una proteína que tiene una homología del 70% o más, preferiblemente 80% o más, más preferiblemente 90% o más, más preferiblemente 95% o más, particularmente de manera preferible 98% o más, a la secuencia total de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o la secuencia de aminoácidos de aminoácidos números 17 a 315 en SEQ ID NO: 2, y que tienen una capacidad de exportación de L-aminoácido. Los ejemplos de un homólogo del gen ybjE también incluyen una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 o NO: 10 y que tiene la capacidad de exportación de L-aminoácido. La homología de secuencia de aminoácidos y secuencias de ADN se puede determinar utilizando el algoritmo BLAST (Pro. Nati. Acad. Sci. USA, 90, y 5873 (1993)) y FASTA (Methods Enzymol., 183, y 63 (1990)) por Karlin y Altschul. El programa denominado BLASTN y BLASTX se desarrolló basándose en este algoritmo BLAST. (refiérase a http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Se pueden utilizar los genes ybjE derivados a partir de un microorganismo diferente a E. coli e incluyen un gen derivado a partir de Shigella flexneri 2a str. cepa 2457T la cual tiene una secuencia complementaria a los nucleótidos números 275793 a 276692 o 275793 a 276740 de GenBank número de acceso AE016980, un gen derivado a partir de la cepa Salmonella typhimurium LT2 el cual tiene una secuencia complementaria a los nucleótidos números 97 a 996 de GenBank número de acceso AE008740, y un gen derivado a partir de la cepa Yersinia pestis C092 la cual tiene una secuencia complementaria a los nucleótidos números 197812 a 198708 de GenBank número de acceso AJ414147. Además, un gen ybjE se puede clonar a partir de una bacteria Coryneform tales como Corynebacterium glutamicum y Brevibacterium lactofermentum, la bacteria Pseudomonas tales como Pseudomonas aeruginosa, la bacteria Mycobacterium tal como Mycobacterium tuberculosis o las similares, basándose en la homología con los genes como se ejemplificó anteriormente. Además, el gen ybjE de la presente invención no se limita a un gen de tipo silvestre, pero puede ser un gen muíante o artificialmente modificado que codifica una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, una secuencia de aminoácidos de aminoácidos números 17 a 315 en SEQ ID NO: 2, o una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 ó 10. La proteína codificada puede incluir sustituciones, deleciones, o inserciones, de uno o varios residuos de aminoácidos en una o más posiciones siempre y cuando se mantenga la función de la proteína codificada YbjE, es decir, la capacidad de exportación de L-lisina. Aunque el número de "varios" residuos de aminoácidos referido en la presente invención difiere dependiendo de las posiciones en la estructura tridimensional o tipos de residuos de aminoácidos, éste puede ser de 2 a 20, preferiblemente de 2 a 10, más preferiblemente de 2 a 5. La sustitución de aminoácidos preferiblemente es una sustitución conservada incluyendo sustitución de ser o thr por ala, sustitución de gln, his o lys por arg, sustitución de glu, gln, lys, his o asp por asn, sustitución de asn, glu o gln por asp, sustitución de ser o ala por cys, sustitución de asn, glu, lys, his, asp o arg por gln, sustitución de gly, asn, gln, lys o asp por glu, sustitución de pro por gly, sustitución de asn, lys, gln, arg o tyr por his, sustitución de leu, met, val o phe por ile, sustitución de ile, met, val o phe por leu, sustitución de asn, glu, gln, his o arg por lys, sustitución de ile, leu, val o phe por met, sustitución de trp, tyr, met, ile o leu por phe, sustitución de thr o ala por ser, sustitución de ser o ala por thr, sustitución de phe o tyr por trp, sustitución de his, phe o trp por tyr y sustitución de met, ile o leu por val. La sustitución, deleción, o inserción, de uno o varios nucleótidos como se describió anteriormente también incluye una mutación que se presenta naturalmente que se genera a partir de diferencias individuales, y diferencias en especies de microorganismos que contiene el gen ybjE (muíante o variante). Dichos genes se pueden obtener al modificar una secuencia nucleotídica que se muestra en SEQ ID NO: 1 o una secuencia nucleotídica de nucleótidos números 49 a 948 en SEQ ID NO: 1 mediante, por ejemplo, mutagénesis sitio específica, de manera que se introduce una o más sustituciones, deleciones, o inserciones en un sitio específico de la proteína codificada por el gen.

Los ejemplos del gen ybjE el cual tiene una mutación en la secuencia de SEQ ID NO: 1 incluyen el gen ybjE el cual tiene una secuencia de SEQ ID NO: 1 en la cual el nucleótido (guanina) en la 3a posición está reemplazado por adenina. Además, dichos genes también se pueden obtener mediante tratamientos convencionales de mutagénesis tales como aquellos mencionados a continuación. Los ejemplos de tratamientos de mutagénesis incluyen el tratamiento de un gen que tiene una secuencia nucleotídica mostrada en SEQ ID NO: 1 o una secuencia nucleotídica de nucleótidos números 49 a 948 en SEQ ID NO: 1 in vitro con hidroxilamina, y el tratamiento de un microorganismo tal como una bacteria Escherichla que contiene el gen con irradiación de rayos ultravioleta o un agente para mutagénesis utilizado en tratamientos mutacionales típicos tales como N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG) o EMS (etil metansulfonato). Si estos genes codifican una proteína que tiene capacidad de exportación de L-aminoácido se puede confirmar mediante, por ejemplo, la expresión los genes en una célula adecuada y determinar si la cantidad del L-aminoácido exportada en el medio está incrementada. Si estos genes confieren resistencia del L-aminoácido a un microorganismo hospedero, ésto se puede confirmar mediante la introducción de los genes dentro de un microorganismo hospedero, cultivar el hospedero en la presencia de altas concentraciones del L-aminoácido, y comparar el crecimiento del microorganismo con aquel de una cepa control.

El gen ybjE también incluye un ADN el cual es capaz de hibridar bajo condiciones severas con una secuencia nucleotídica de SEQ ID NO: 1 , una secuencia nucleotídica de nucleótidos números 49 a 948 en SEQ ID NO: 1 , o una sonda preparada a partir de estas secuencias, y las cuales codifican una proteína que tiene capacidad de exportación del L-aminoácido. Las "condiciones severas" como se utilizan en la presente invención son condiciones bajo las cuales se forma un híbrido denominado específico, y no se forma un híbrido no específico. Es difícil expresar claramente esta condición mediante la utilización de cualquier valor numérico. No obstante, los ejemplos de condiciones severas incluyen, aquellas bajo las cuales los ADN que tienen una alta homología entre sí, por ejemplo, los ADN que tienen una homología de no menos de 50%, hibridan entre sí, y los ADN que tienen homología menor de 50% no hibridan entre sí, y aquellas bajo las cuales los ADN hibridan entre sí a una concentración salina con un lavado típico de hibridación de Southern, por ejemplo, lavar una vez o preferiblemente 2-3 veces bajo SSC 1 x, SDS al 0.1 % a 60°C, preferiblemente SSC 0.1 x, SDS al 0.1 % a 60°C, más preferiblemente SSC 0.1 x, SDS al 0.1 % a 68°C. La expresión del gen ybjE se puede mejorar mediante, por ejemplo, el incremento en el número de copias del gen ybjE en células utilizando técnicas de recombinación genética. Por ejemplo, se puede preparar un ADN recombinante mediante la ligación de un fragmento génico que contenía el gen ybjE a un vector, preferiblemente un vector de múltiples copias, el cual se puede replicar en el microorganismo hospedero, e introducir el vector resultante dentro del microorganismo hospedero. Cuando se utiliza el gen ybjE de Escherichia coli, éste se puede obtener mediante, por ejemplo, el método de PCR (reacción en cadena de la polimerasa, refiérase a White, T. J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)) utilizando iniciadores diseñados basados en una secuencia nucleotídica de SEQ ID NO: 1 , por ejemplo, iniciadores que tienen cada uno una secuencia de SEQ ID NO: 5 ó 6, y utilizando ADN cromosomal de Escherichia coli como un molde. Se puede utilizar el gen ybjE a partir de otros microorganismos, y se puede obtener a partir de su ADN cromosomal o librería de ADN cromosomal mediante PCR utilizando iniciadores oligonucleótidos diseñados basados en una secuencia de su gen ybjE o una secuencia homologa del mismo o la proteína YbjE a partir de diferentes especies de microorganismos, o mediante hibridación utilizando una sonda oligonucleótida preparada basándose en dicha información de secuencia. Se puede preparar un ADN cromosomal a partir de un microorganismo que sirve como un ADN donante mediante, por ejemplo, el método de Saito y Miura (refiérase a H. Saito y K. Miura, Biochem. Biophys. Acta, 72, 619 (1963), Text for Bioengineering Experimente, Editado por the Society for Bioscience and Bioengineering, Japón, pp. 97-98, Baifukan, 1992). Posteriormente, el gen ybjE se liga a un vector de ADN operable en el microorganismo hospedero para preparar un ADN recombinante.

Preferiblemente, se utilizaron vectores autónomamente replicables en el microorganismo hospedero. Los ejemplos de vectores autónomamente replicables en Escheríchia coli includen pUC19, pUC18, pHSG299, pHSG399, pHSG398, pACYC184, (pHSG y pACYC están disponibles a partir de Takara Bio), RSF1010, pBR322, pMW219 (pMW está disponible a partir de Nippon Gene), y así sucesivamente. Los ejemplos de vectores los cuales son autónomamente replicables en bacterias Coryneform incluyen pA 330 (JP58-67699A), pHM1519 (JP58-77895A), pVK7 (US2003-0175912) y pSFK6 (JP2000-262288A). Además, también se puede utilizar un vector denominado de lanzadera autónomamente replicable en ambas bacterias Escheríchia coli y Coryneform. Los ejemplos de vectores autónomamente replicables en bacterias Methylophilus incluyen RSF1010, y derivados de los mismos tales como pAYC32 (Chistorerdov, A. Y., Tsygankov, Y. D., Plasmid, 16, pp. 161-167 (1986)), pMFY42 (Gene, 44, p. 53 (1990)), pRK301 , y pTB70 (Nature, 287, 396 (1980)). Con el objeto de preparar un ADN recombinante mediante ligación del gen ybjE y cualquiera de los vectores anteriormente mencionados, el vector y un fragmento que contenía el gen ybjE se digirieron con enzimas de restricción y se ligaron, usualmente mediante la utilización de una ligasa tal como una ADN T4 ligasa.

Para introducir un ADN recombinante preparado como se describió anteriormente dentro de un microorganismo, se puede emplear cualquier método de transformación conocido hasta ahora. Por ejemplo, se puede emplear el tratamiento de las células recipientes con cloruro de calcio de manera que se incrementa la permeabilidad de ADN, el cual ha sido reportado para Escherichia coli (Mandel, . y Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)), y utilizando células competentes preparadas a partir de células en crecimiento para introducir un ADN, el cual ha sido reportado para Bacülus subtilis (Duncan, C. H., Wilson, G. A. y Young, F. E., Gene, 1 , 153 (1977)). Además de estos métodos, se puede emplear la introducción de un ADN recombinante dentro de células recipientes semejantes a protoplasto o a esferoplasto, el cual ha sido reportado que es aplicable para Bacülus subtilis, actinomicetos, y levaduras (Chang, S. y Choen, S. N., Molec. Gen. Genet, 168, 11 (1979); Bibb, M. J., Ward, J. M. y Hopwood, O. A., Nature, 274, 398 (1978); Hinnen, A., Hicks, J. B. y Fink, G. R., Proc. Nati. Sci., USA, 75, 1929 (1978)). Además, también se puede llevar a cabo la transformación de bacterias Coryneform mediante el método de pulso eléctrico (Sugimoto et al., JP2-207791A). El número de copias del gen ybjE también se puede incrementar mediante la integración de múltiples copias del gen en un ADN cromosomal de un microorganismo. Con el objeto de integrar múltiples copias del gen ybjE en un ADN cromosomal de un microorganismo, la recombinación homologa se puede llevar a cabo mediante direccionamiento de una secuencia la cual existe en múltiples copias en un ADN cromosomal. El ADN repetitivo y los repetidos invertidos en un extremo de un transposón se pueden utilizar como una secuencia en la cual se presentan múltiples copias en un ADN cromosomal. Alternativamente, como se describe en JP2-109985A, también es posible incorporar el gen ybjE dentro de un transposón, y permite que se transfiera de manera que se integren múltiples copias del gene dentro del ADN cromosomal. La integración del gen ybjE dentro del cromosoma se puede confirmar mediante hibridación de Southern utilizando una sonda que tiene una secuencia parcial del gen ybjE. La expresión mejorada del gen ybjE también se puede lograr ya sea mediante el reemplazo de una secuencia reguladora de la expresión, incluyendo un promotor del gen ybjE, en un ADN cromosomal o en un plásmido con un promotor más fuerte, como se describe en WO 00/18935, amplificar un factor regulador que incrementa la expresión del gen ybjE, o deletar o atenuar un factor regulador que reduce la expresión del gen ybjE. Por ejemplo, el promotor lac, promotor trp, promotor trc y así sucesivamente se conocen como promotores fuertes. Además, también es posible introducir varias sustituciones de nucleótidos dentro de una región promotora para el gen ybjE de manera que el promotor debe ser más potente. Un método para la evaluación de la potencia del promotor y los ejemplos de promotores potentes se describen en Goldstein et al. (Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1995, 1 , 105-128). Además, se sabe que una secuencia espaciadora entre el sitio para unión al ribosoma (RBS) y el codón de inicio de la traducción, especialmente, varios nucleótidos justo hacia el extremo 5' del codón de inicio, tiene una gran influencia sobre la eficiencia de la traducción. Por lo tanto, esta secuencia se puede modificar. La expresión de secuencias reguladoras del gen ybjE se pueden identificar utilizando un vector para identificación del promotor o software para análisis genético tal como GENETYX. La expresión del gen ybjE se mejora mediante dicha sustitución o modificación de un promotor. También se puede lograr la sustitución de una secuencia reguladora de la expresión mediante, por ejemplo, la utilización de un plásmido sensible a la temperatura. Los ejemplos de un plásmido sensible a la temperatura para bacterias Coryneform incluyen p48K y pSFKT2 (JP2000-262288A), pHSC4 (refiérase a Publicación de Patente Francesa Abierta al Público No. 2667875,1992 y JP5-7491A), y así sucesivamente. Estos plásmidos se pueden replicar autónomamente al menos a una temperatura de 25°C, pero no se pueden replicar autónomamente a una temperatura de 37°C en bacterias Coryneform. La modificación de la secuencia reguladora de la expresión se puede combinar con el incremento del número de copias del gen ybjE. Con el objeto de mejorar una actividad de la proteína codificada por el gen ybjE, se puede introducir una mutación la cual incrementa una capacidad de exportación del L-aminoácido dentro del gen ybjE. Los ejemplos de una mutación que incrementa la actividad de la proteína codificada por el gen ybjE (proteína YbjE) incluyen una mutación en una secuencia promotora que incrementa la transcripción del gen ybj'E y una mutación en la región codificante del gen ybjE que incrementa la actividad específica de la proteína YbjE. El microorganismo de la presente invención preferiblemente es uno en el cual se mejora la capacidad de exportación del L-aminoácido debido a una modificación la cual resulta en un incremento en la expresión del gen ybjE. La frase "se mejora la capacidad de exportación del L-aminoácido" utilizada en la presente invención significa que cuando se cultiva un microorganismo el cual ha sido modificado para mejorar la expresión del gen ybjE, la cantidad de L-aminoácido exportado hacia el medio por el microorganismo es mayor que aquella de un L-aminoácido exportado a partir de una cepa no modificada, tales como una cepa parental o una cepa que corresponde al tipo silvestre. El incremento en la capacidad de exportación del L-aminoácido se observó mediante la determinación del incremento en la concentración del L-aminoácido en el medio. Además, también se observó el incremento en la capacidad de exportación del L-amlnoácido mediante la determinación de la disminución en la concentración intracelular del L-aminoácido después de la introducción del gen ybjE dentro de un microorganismo. La cantidad de L-aminoácido exportado a partir del microorganismo de la presente invención preferiblemente se incrementó en un 10% o más, más preferiblemente 30% o más, particularmente de manera preferible en un 50% o más, cuando se comparó con la cantidad de L-aminoácido exportado a partir de una cepa no modificada. Además, el incremento en la capacidad de exportación del L-am¡noácido también se observó en términos de una disminución en la concentración intracelular del L-aminoácido después de la introducción del gen ybjE dentro de un microorganismo. Por ejemplo, la concentración intracelular de un L-aminoácido se puede medir como sigue: se añadió una cantidad apropiada de aceite de silicón que tiene gravedad específica de 1.07 a un medio que contenía células microbianas, y las células se recolectaron a partir del medio mediante centrifugación, preferiblemente a 12,000 rpm por 2 minutos. Posteriormente las células se tratan con 22% de ácido perclórico (A. Ishizaki et al, Biotech. Teqniq. (1995) Vol 9, No. 6, p 409). Utilizando células así preparadas, se puede medir una concentración intracelular de un L-aminoácido. Además, la "capacidad de exportación del L-aminoácido" se puede examinar indirectamente mediante la medición de la toma celular de L-aminoácido radiomarcado utilizando vesículas membranales invertidas (J. Biol. Chem., Vol. 277, Publicación 51 , 49841-49849). Por ejemplo, las vesículas membranales invertidas se prepararon a partir de células dentro de las cuales se introdujo el gen ybjE. Posteriormente, se añadieron a las vesículas ATP u otros sustratos los cuales proveen energía direccionadora, y se midió la toma celular del L-aminoácido radiomarcado. Alternativamente, se puede examinar la "capacidad de exportación del L-aminoácido" mediante la medición de la velocidad de la reacción de intercambio entre un aminoácido no marcado y un aminoácido marcado en células activas.

Además, el microorganismo de la presente invención preferiblemente es un microorganismo que se ha vuelto más resistente a un L-aminoácido o análogo de L-aminoácido debido a una modificación que resulta en la mejoría de la expresión del gen ybjE. Es decir, preferiblemente el microorganismo de la presente invención es un microorganismo que es capaz de crecer en la presencia de un L-aminoácido o análogo de L-aminoácido a una concentración en la cual la cepa no modificada no puede crecer. El crecimiento celular en la presencia del L-aminoácido o análogo de L-aminoácido se puede confirmar en un medio mínimo que contenía una alta concentración del L-aminoácido o análogo de L-aminoácido, por ejemplo, 0.3 g/L o mayor. La resistencia al L-aminoácido o análogo de L-aminoácido de la cepa mejorada por el gen ybjE se puede confirmar mediante la medición del crecimiento de la cepa en un medio mínimo que contenía altas concentraciones del L-aminoácido o análogo de L-aminoácido, y comparando el crecimiento de una cepa parental o cepa no modificada. El método de comparación del crecimiento incluye un método de comparación de una densidad óptica a 580-660 nm de un medio en el cual dicha cepa se encuentra en crecimiento. La concentración de un L-aminoácido o análogo de L-aminoácido el cual ha sido añadido a un medio no se limita particularmente siempre y cuando inhiba el crecimiento de una cepa no modificada, preferiblemente no menor de 0.3 g/L. Por ejemplo, el clorhidrato de L-lisina se añade a 80 g/L, clorhidrato de L-arginina se añade a 90 g/L, clorhidrato de L-ornitina se añade a 45 g/L, clorhidrato de L-histidina se añade a 30 g/L, L- isoleucina se añade a 12 g/L, L-treonina se añade a 40 g/L, glutamato de L- monosódico se añade a 15 g/L, L-fenilalanina se añade a 8 g/L, L-prolina se añade a 85 g/L, y L-cisteína se añade a 0.3 g/L. El microorganismo de la presente invención puede ser uno que se ha vuelto más resistente a L-lisina o un análogo de L-lisina debido a la modificación que resulta en mejoría en la expresión del gen ybjE. Los ejemplos del análogo de L-lisina incluyen oxalislna, hidroxamato de lisina, S- (2-aminoetil)-L-cisteína (AEC), y ?-metil-lisina, oc-clorocaprolactamo, y así sucesivamente, pero no se limitan a éstos. La resistencia a la L-lisina se puede confirmar de la misma manera que se mencionó anteriormente la resistencia al L-aminoácido o al análogo de L-aminoácido. El microorganismo de la presente invención puede ser uno que se ha vuelto más resistente a L-arginina o un análogo de L-arginina debido a la modificación que resulta en mejoría en la expresión del gen ybjE. Los ejemplos del análogo de L-arginina incluyen hidroxamato de arginina, homoarginina, D-arginina, canavanina, hidroxamato de arginina, y así sucesivamente. La resistencia a L-arginina o al análogo de L-arginina se puede confirmar de la misma manera que se mencionó anteriormente la resistencia a L-aminoácido o al análogo de L-aminoácido. < 2 > Método para la producción de L-aminoácido El método de producción de la presente invención comprende cultivar el microorganismo de la presente invención en un medio para producir y ocasionar la acumulación del L-aminoácido en el medio o células del microorganismo, y recolectar el L-aminoácido a partir del medio o de las células. El medio a ser utilizado en la presente invención se puede seleccionar a partir de medios bien conocidos convencionalmente utilizados para la producción fermentativa de L-aminoácidos mediante fermentación utilizando microorganismos. Es decir, se puede utilizar un medio usual que contiene una fuente de carbono, fuente de nitrógeno, iones inorgánicos, y si es necesario, otros ingredientes orgánicos. Como la fuente de carbono, se pueden utilizar sacáridos tales como glucosa, sacarosa, lactosa, galactosa, fructosa, o hidrolizado de almidón, alcoholes tales como glicerol o sorbitol, o ácidos orgánicos tales como ácido fumárico, ácido cítrico, o ácido succínico. Como la fuente de nitrógeno, se pueden utilizar sales de amonio inorgánico tales como sulfato de amonio, cloruro de amonio, o fosfato de amonio, nitrógeno orgánico tales como proteína de hidrolizado de frijol de soya, gas amoniaco, amoniaco acuoso, y así sucesivamente. Es deseable añadir al medio sustancias tales como vitamina B1 y L-homoserina, extracto de levadura, y así sucesivamente en cantidades apropiadas como nutrientes orgánicos traza. A diferencia de los anteriores, se añaden fosfato de potasio, sulfato de magnesio, ion de hierro, ion de manganeso, y así sucesivamente en cantidades pequeñas, si es necesario. El medio utilizado para la presente invención puede ser un medio natural o un medio sintético, siempre y cuando contenga una fuente de carbono, fuente de nitrógeno, iones inorgánicos, y si es necesario, otros ingredientes orgánicos. Preferiblemente el cultivo se lleva a cabo bajo condiciones aeróbicas por 1 a 7 días. Preferiblemente la temperatura de cultivo se controla de 24°C a 37°C, y preferiblemente el pH se controla de 5 a 9 durante el cultivo. Las sustancias inorgánicas u orgánicas, ácidas o alcalinas así como el gas amoniaco y así sucesivamente se pueden utilizar para ajustar el pH. Los L-aminoácidos se pueden recolectar a partir del caldo de fermentación usualmente mediante una combinación de técnicas bien conocidas, tales como mediante el uso de resinas de intercambio iónico, precipitación, y otras técnicas. Cuando se acumula un L-amlnoácido en las células, por ejemplo, las células se pueden fragmentar mediante ultrasonicación, las células fragmentadas se pueden remover mediante centrifugación, y el L-aminoácido se puede recolectar a partir del sobrenadante obtenido utilizando una resina de intercambio iónico o las similares. Si se utiliza metanol como la principal fuente de carbono en el método de producción de la presente invención, se disminuye el costo, y por lo tanto son preferibles los microorganismos tales como bacterias Methylophilus y Methylobacillus, las cuales tienen ¡a capacidad de asimilar el metanol. En este caso, el cultivo se puede llevar a cabo de conformidad con un método de cultivo típico para un microorganismo usual que asimila metanol (referiérase a, por ejemplo, WO 00/61723, JP2001-120269A etc.). Cuando el cultivo se lleva a cabo utilizando metanol como una fuente de carbono principal, preferiblemente en metanol se añadie al medio a una concentración de 0.001 a 30%. Para el cultivo de un microorganismo que asimila metanol, preferiblemente se añade sulfato de amonio y así sucesivamente al medio y se utiliza como una fuente de nitrógeno. Además, preferiblemente se añaden los componentes en cantidades traza tales como fosfato de potasio, fosfato de sodio, sulfato de magnesio, sulfato ferroso, y sulfato de manganeso en cantidades pequeñas. El cultivo de un microorganismo que asimila metanol preferiblemente se llevó a cabo bajo condiciones aeróbicas con agitación o agitación para aeración, a un intervalo de pH de 5 a 9, y a una temperatura de 20 a 45°C, usualmente por 24 a 120 horas. Los L-aminoácidos se pueden recolectar a partir del cultivo mediante una combinación de técnicas bien conocidas, tales como resinas de intercambio iónico, precipitación, y otras técnicas. La recolección de los L-aminoácidos a partir de las células se puede llevar a cabo de la misma manera como se describió anteriormente.

EJEMPLOS En adelante, la presente invención se explicará más específicamente con referencia a los siguientes ejemplos no limitantes. Los reactivos utilizados en los siguientes ejemplos se obtuvieron a partir de Wako Puré Chemicals o Nakarai Tesque a menos que se indique de otra manera. A continuación se muestra la composición del medio utilizado en cada ejemplo. El pH se ajustó con NaOH o HCI para todo el medio. Medio L: Bacto triptona (Difco) 10 g/L Extracto de levadura (Difco) 5 g/L Cloruro de sodio 10 g/L pH 7.0 Estos se sometieron a esterilización al vapor a 120°C por 20 minutos. Medio L agar: Medio L Bacto agar 15 g/L Estos se sometieron a esterilización al vapor a 120°C por 20 minutos. Medio mínimo: (siguiendo Molecular cioning Vol. 3) Sales 5*M9 200 mi Glucosa al 20% 20 mi Sulfato de magnesio 1 M 2 mi Cloruro de calcio 1M 0.1 mi Adicionar hasta 1 L, ajustado a pH 7.0 Sales 5*M9 Fosfato d ¡sódico 64 g Fosfato de potasio 15 g Cloruro de sodio 2.5 g Cloruro de amonio 5.0 g Adicionar hasta 1 L Después de adicionar hasta 1 L, éstos se sometieron a esterilización por vapor a 15°C por 10 minutos, y se añadió L-lisina en un tiempo apropiado.

Medio mínimo con agar: Medio mínimo Bacto agar 15 g/L Estos se sometieron a esterilización al vapor a 115°C por 10 minutos. Medio para producción de L-lisina para bacteria Escherichia: Glucosa 40 g/L Sulfato de amonio 24 g/L Fosfato diácido de potasio 1.0 g/L Sulfato de magnesio heptahidratado 1.0 g/L Sulfato de hierro (IV) heptahidratado 0.01 g/L Sulfato de manganeso (IV) heptahidratado 0.01 g/L Extracto de levadura 2.0 g/L Pharmacopeia carbonato de calcio 30 g/L El pH se ajustó a 7.0 con hidróxido de potasio, y los componentes se sometieron a esterilización por vapor a 115°C por 10 minutos, excepto glucosa y MgS04'7H20, los cuales se esterilizaron separadamente. Como un antibiótico, se añadieron 50 mg/L de cloramfenicol.

Medio para producción de L-arginina para bacteria Escherichia: Glucosa (separadamente esterilizada) 60 g/L Sulfato de magnesio hepta idratado (separadamente esterilizado) 1 g/L Sulfato de amonio 25 g/L Fosfato diácido de potasio 2 g/L Extracto de levadura (Difco) 5 g/L Vitamina B1 0.1 mg/L pH 7.2 Pharmacopeia carbonato de calcio (separadamente esterilizado) 25 g/L El pH se ajustó a 7.2 con hidróxido de potasio, y los componentes se sometieron a esterilización por vapor a 115°C por 10 minutos, excepto glucosa y IVIgSC^TI-bO, los cuales se esterilizaron separadamente. Como un antibiótico, se añadieron 50 mg/L de cloramfenicol.

Medio de producción de L-lisina la para bacteria Methylophilus (medio SEII): Fosfato diácido de potasio 1.9 g/L Fosfato diácido de sodio 1.56 g/L Sulfato de magnesio 0.2 g/L Sulfato de amonio 5 g/L Sulfato de cobre pentahidratado 5 µg/L Sulfato de manganeso (IV) pentahidratado 25 µg/L· Sulfato de zinc (IV) heptahidratado 23 µg/L Cloruro de calcio (II) dihidratado 72 mg/L Cloruro de hierro (II) hexahidratado 9.7 mg/L Carbonato de calcio (Kanto Kagaku) 30 g/L Metanol 2% (vol/vol) pH 7. 0 Los componentes diferentes al metanol se sometieron a esterilización por vapor a 121°C por 15 minutos, y se añadió metanol después de que los componentes se encontraban lo suficientemente fríos. Este medio se preparó con referencia al Journal of General Microbiology (1989) 125, 135, 3153-3164, Silman N. J., Carver M. A. & Jones C. W. En lugar de sulfato de amonio, se utilizaron 1.18 g de acetamida, y se añadió cloruro de calcio a una concentración de 72 mg/L.

Medio SEII agar: Fosfato diácido de potasio 1.9 g/L Fosfato diácido de sodio 1.56 g/L Sulfato de magnesio 0.2 g/L Sulfato de amonio 5 g/L Sulfato de cobre pentahidratado 5 µg/L Sulfato de manganeso (IV) pentahidratado 25 g/L Sulfato de zinc (IV) heptahidratado 23 g/L Cloruro de calcio (II) deshidratado 72 mg/L Cloruro de hierro (II) hexahidratado 9.7 mg/L Carbonato de calcio (Kanto Kagaku) 30 g/L Metanol 2% (vol/vol) pH 7.0 Bacto agar (Difco) 15 g/L Los componentes diferentes al metanol se sometieron a esterilización por vapor a 121 °C por 15 minutos, y se añadió metanol después de que los componentes se encontraban lo suficientemente fríos.

Medio CM2S para bacteria Coryneform: Polipeptona 10 g/L Extracto de levadura 10 g/L Cloruro de sodio 5 g/L Sacarosa 5 g/L DL-metionina 0.1 g/L El pH se ajustó a 7.2 con hidróxido de potasio, y los componentes se sometieron a esterilización por vapor a 120°C por 30 minutos. Cuando el medio se utilizó para cultivo de siembra, se añadieron 20 g/L de agar.

Medio de producción de L-lisina para bacteria Coryneform: Glucosa 100 g/L Sulfato de amonio 55 g/L Hidrolizado de frijol de soya 1.05 nitrógeno total/L Fosfato diácido de potasio 1.0 g/L Sulfato de magnesio heptahidratado 1.0 g/L Sulfato de hierro (IV) hexahidratado 0.01 g/L Sulfato de manganeso (IV) pentahidratado 0.01 g/L Sulfato de magnesio 0.2 g/L GD113 0.05 ml/L Pharmacopeia carbonato de calcio (separadamente esterilizado) 50 g/L El pH se ajustó a 7.5 con hidróxido de potasio, y los componentes se sometieron a esterilización por vapor a 1 15°C por 10 minutos, excepto glucosa y MgS04'7H20, los cuales se esterilizaron separadamente.

EJEMPLO 1 Selección del gen para exportación de L-lisina La búsqueda para un gen exportador de L-lisina se llevó a cabo como sigue. <1-1 > Construcción de la cepa de Escherichia coli dentro de la cual se introduce la librería plasmídica El ADN cromosomal se extrajo de manera convencional a partir de una cepa obtenida mediante la deleción de lysA (gen de diaminopimelato decarboxilasa) en la cepa de MG1655 (ATCC 47076). Los fragmentos de 2 a 4 kpb obtenidos mediante digestión parcial del ADN cromosomal con la enzima de restricción Sau3AI se introdujeron dentro de cada uno de los vectores pTWV229 (Takara Bio), pSTV28 (Takara Bio), y pMW118 (Nippon Gene), todos los cuales se digirieron con BamHI previamente, y así se obtuvieron las librerías plasmídicas. Cada una de estas librerías plasmídicas se introdujeron dentro de la cepa MG1655 mediante electroporación. <1-2> Selección del gen para resistencia a L-lisina Las cepas MG1655 que se introdujeron con las librerías plasmídicas se seleccionaron en el medio L basándose en la resistencia a la ampicilina para la cepa introducida con pTWV229, resistencia a cloramfenicol para la cepa introducida con pSTV28, y resistencia a ampicilina para la cepa introducida con pMW118. Se obtuvieron aproximadamente 80,000 colonias transformadas en total. Estos transformantes se sembraron en el medio mínimo que contenía 60 g/L de clorhidrato de lisina, en el cual la cepa MG1655 puede formar muy pocas colonias, si es que las forma. Después de cultivar a 37°C por 36 horas, se seleccionaron aproximadamente 50 colonias que aparecieron en el medio que contenía altas concentraciones de lisina como cepas candidatas resistentes a lisina. Con el objeto de determinar las secuencias insertadas dentro de los vectores de las cepas candidatas resistentes a lisina, se llevó a cabo PCR mediante la utilización de oligonucieótidos sintéticos que tienen una secuencia de SEQ ID NO: 3 (iniciador M13 hacia adelante), y SEQ ID NO: 4 (iniciador M13 reverso), las cuales son complementarias a las secuencias de ADN localizadas alrededor del sitio de clonación múltiple del plásmido, y se determinaron las secuencias de los fragmentos amplificados. Como un resultado de la determinación de las secuencias nucleotídicas, se encontró que casi todos los fragmentos contenían ybjE, localizados en los números 913181 a 914128, en las cepas resistentes a L-lisina. Se analizó la secuencia pronosticada de aminoácidos a partir de la secuencia del gen ybjE. Cuando la secuencia de la proteína se analizó para propiedades hidrófobas, se encontró que la proteína era altamente hidrófoba. Por lo tanto, se sugirió que la proteína codificada por ybjE era una proteína membranal y podría participar en la exportación del aminoácido.

EJEMPLO 2 Efecto de la amplificación del gen vbiE en Escheríchia coli <2-1 > Construcción de un plásmido para amplificación de ybjE e introducción del mismo dentro de Escheríchia coli Posteriormente, con el objeto de estudiar el efecto de la amplificación del gen ybjE, se construyó un vector para la amplificación de ybjE y se introdujo dentro de G1655. Se ha reportado la secuencia nucleotídica total del cromosoma de Escheríchia coli (cepa Escheríchia coli K- 12) (Science, 277, 1453-1474 (1997), y por lo tanto se prepararon el oligonucleotido sintético de SEQ ID NO: 5, el cual tiene una secuencia complementaria a la secuencia de nucleótidos números 4085 a 4104 de GenBank número de acceso AE000 89, y el oligonucleotido sintético de SEQ ID NO: 6 el cual corresponde a la secuencia de nucleótidos números 2689 a 2708 de la misma secuencia nucleotídica, con base en la secuencia nucleotídica del gen ybjE reportada en la literatura anteriormente mencionada y utilizada como el iniciador 5' y el iniciador 3', respectivamente, para formar PCR. El ADN cromosomal de la cepa Escheríchia coli G1655 se utilizó como un molde. El producto de PCR obtenido se ligó al vector pSTV28, el cual había sido digerido con Smal (Takara Bio), para construir un plásmido pSYBJE para amplificación de ybjE. El esquema de construcción se muestra en la figura 1. Un plásmido en el cual el gen ybjE se ligó en la dirección hacia adelante con respecto al promotor lac se designó pSYBJEI , y un plásmido en el cual éste se ligó en la dirección reversa se designó pSYBJE2. Los plásmido para la amplificación del gen ybjE, pSYBJEI , pSYBJE2, y un plásmido control pSTV28 (Takara Bio) se introdujeron cada uno dentro de MG1655 (ATCC 47076) de manera convencional. Los transformantes se seleccionaron basándose en la resistencia al cloramfenicol, y la cepa introducida con pSYBJEI se designó MG1655/pSYJE1 , la cepa introducida con pSYBJE2 se designó MG1655/pSYBJE2, y la cepa introducida con pSTV28 se designó MG1655/pSTV28. <2-2> Efecto de la amplificación del gen vbi'E en bacteria Escherichia Se examinó el efecto de la amplificación del gen ybjE sobre la resistencia de la cepa Escherichia coli MG1655 a diversos aminoácidos utilizando la cepa introducida con pSYBJEI o con pSYBJE2. Las cepas MG1655/pSYBJE1 , MG1655/pSYBJE2, y la cepa control MG1655/pSTV28 se inocularon cada una dentro de 5 mL de medio L que contenía 50 µg mL de cloramfenicol y se cultivaron por aproximadamente 6 horas utilizando un aparato para cultivo con agitación mediante movimiento recíproco. Se centrifugó el caldo de cultivo en el cual las células habían proliferado hasta una turbidez de OD600 = de aproximadamente 1.0, y posteriormente las células se lavaron dos veces con medio mínimo M9. A continuación, las células se inocularon dentro de medio mínimo 9 que contenía 50 µg/mL de cloramfenicol y medio mínimo M9 que contenía 80 g/L de clorhidrato de lisina a una turbidez de OD600 = 0.05, y se cultivaron por aproximadamente 70 horas. Los resultados se muestran en las figuras 2A y 2B, las cuales muestran que la mejoría en la expresión del gen ybjE mejoró la velocidad de crecimiento en una etapa temprana, así como la velocidad de división celular durante la fase de crecimiento logarítmico, en la presencia de altas concentraciones de L-lisina en comparación con la cepa control.

EJEMPLO 3 Efecto de la desorganización del gen ybjE sobre la resistencia a aminoácido de una bacteria Escheríchia <3-1> Construcción de una cepa desorganizada en el gen ybjE La deleción del gen ybjE se obtuvo mediante el método desarrollado por Datsenko y Wanner denominado "integración dirigida por el rojo" (Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 2000, vol. 97, No. 12, pp. 6640-6645). De conformidad con este método, se obtuvo un producto de PCR utilizando un oligonucleótido sintético que contenía un gen objetivo en el lado 5' y un gen para la resistencia al antibiótico en el lado 3'. Utilizando este método, se puede construir una cepa desorganizada del gen en un solo paso. De conformidad con este método, se diseñaron los iniciadores complementarios a las regiones alrededor del gen ybjE o el gen que imparte resistencia al antibiótico a un plásmido molde, y se obtuvo el producto de PCR del gen endógeno ybjE. Se puede obtener el producto de PCR mediante la utilización del plásmido pACYC184 (NBL Gene Sciences Ltd., U. K., GenBank/E BL número de acceso X06403) como un molde y oligonucleótidos sintéticos que tienen una secuencia de SEQ ID NOS: 7 y 8 como iniciadores. El producto de PCR amplificado se purificó en un gel de agarosa y se utilizó para electroporación de la cepa Escheríchia coli MG1655, la cual contiene el plásmido pKD46 que tiene la capacidad de replicación sensible a temperatura. El plásmido pKD46 (Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 2000, vol. 97, No. 12, pp. 6640-6645) contiene un fragmento de ADN de 2154 nucleótidos del fago ? que contenía genes del sistema de recombinación homologa ? Rojo (genes ?, ß, exo), los cuales son controlados por el promotor ParaB inducible por arabinosa (GenBank/EMBL número de acceso J02459, nucleótidos 31088 a 33241 ). El plásmido pKD46 es necesario para incorporar el producto de PCR dentro del cromosoma de la cepa MG1655. Las células competentes para electroporación se prepararon como sigue. La cepa Escheríchia coli MG1655 se cultivó durante toda la noche a 30°C en medio LB que contenía 100 mg/L de ampicilina, y luego se diluyó 100 veces con 5 mL de medio SOB (Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2a Edición, Sambrook, J. et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) que contenía ampicilina y L-arabinosa (1 mM). Las células diluidas se crecieron a 30°C con aereación hasta que la DO600 se volvió aproximadamente 0.6, y luego se concentró 100 veces y se lavó tres veces con agua deionizada enfriada con hielo de manera que las células pudieron ser utilizadas para la electroporación. La electroporación se llevó a cabo mediante la utilización de 70 µ? de las células competentes y aproximadamente 100 ng del producto de PCR. Las células después de la electroporación se añadieron dentro de 1 mL del medio SOC (Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2a Edición, Sambrook, J. et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)), se cultivaron a 37°C por 2.5 horas, y luego se sembraron sobre el medio L agar a 37°C. De esta manera, se seleccionaron las cepas recombinantes resistentes a Cm (cloramfenicol). Posteriormente, con el objeto de curar el plásmido pKD46, las células se subcultivaron dos veces a 42°C sobre medio L agar que contenía Cm (cloramfenicol), y se examinó la resistencia a ampicilina de las colonias obtenidas. De esta manera, se obtuvieron las cepas sensibles a ampicilina en las cuales se curó el pKD46. La desorganización del gen ybjE en la cepa muíante, la cual pudo ser identificada mediante resistencia a cloramfenicol, se confirmó mediante PCR. La longitud del producto de PCR obtenido mediante la utilización de ADN en células de la cepa desorganizada por el gen ybjE MG1655AybjE::cat, fue más largo que aquel obtenido para una cepa de tipo silvestre. Por lo tanto, se confirmó que el gen para resistencia a cloramfenicol se insertó dentro del gen ybjE, y se confirmó que el gen ybjE había sido desorganizado. La cepa desorganizada en ybjE que tenía el gen para resistencia a cloramfenicol insertado se designó MG1655AybjE::Cm <3-2> Confirmación de resistencia al aminoácido de la cepa deficiente en el gen ybjE Se examinó la influencia de la cepa deficiente en el gen ybjE MG1655AybjE::Cm sobre la resistencia al aminoácido. Los caldos de cultivo (DO600 = 1.0) obtenidos mediante el cultivo de MG1655AybjE::Cm y la cepa control MG1655 en medio L por aproximadamente 6 horas en un aparato para cultivo con agitación mediante movimiento recíproco se centrifugaron. Posteriormente, las células se lavaron dos veces con medio mínimo M9 y se inocularon dentro del medio mínimo M9 o medio mínimo M9 que contenía 80 g/L de clorhidrato de lisina a DO600 = 0.05, y se cultivaron por aproximadamente 70 horas. Posteriormente, se examinó el crecimiento. Los resultados se muestran en la figura 3. Como se muestra en la figura 3, la deleción del gen ybjE redujo el crecimiento en una etapa temprana al encontrarse en presencia de altas concentraciones de L-lisina, en comparación con la cepa control. A partir de este resultado y los resultados del ejemplo 2, se reveló que el gen ybjE impartió resistencia a L-Iisina.

EJEMPLO 4 El efecto de la amplificación de ybjE sobre la producción de L-lisina de una bacteria Escherichia Como una cepa productora de L-lisina de Escherichia coli, se utilizó la cepa WC196 (AJ 13069 (FERM BP-5252), WO 96/1 930), la cual es resistente a AEC (S-(2-aminoetil)cisteína). La cepa WC196 se transformó con el plásmido pSYBJEI para amplificación de ybjE. El plásmido pSTV28 (Takara Bio) se transformó separadamente como un control (como en el ejemplo 2). Por lo tanto, se obtuvieron las cepas resistentes a cloramfenicol. Se confirmó la introducción de los plásmidos, y la cepa introducida con el plásmido pSYBJEI se designó WC196/yjb/E, y la cepa introducida con el plásmido control pSTV28 se designó WC196/pSTV28. Las cepas WC1 QQIybjE y WC196/pSTV28 se cultivaron cada una a 37°C en medio L que contenía 50 mg/L de cloramfenicol hasta que la DO600 se volvió aproximadamente 0.6. Posteriormente, se x añadió un volumen igual de solución de glicerol al 40% a cada caldo de cultivo, se agitó, y luego se dividió en volúmenes apropiados, y se almacenó a -80°C. Estas se refieren en la presente invención como soluciones para almacenamiento de glicerol. Las soluciones para almacenamiento de glicerol de estas cepas de descongelaron, y se sembraron 100 µL· de cada solución para almacenamiento de manera uniforme en una placa L que contenía 50 mg/L de cloramfenicol y se incubó a 37°C por 24 horas. Aproximadamente 1/8 de las células recolectadas a partir de la placa se inocularon dentro de 20 mL de medio para fermentación (medio mínimo M9) que contenía 50 mg/L de cloramfenicol en un matraz Sakaguchi de 500 mL, y se cultivaron a 37°C por 27 horas en un aparato para cultivo con agitación mediante movimiento recíproco. Después del cultivo, se midió la cantidad de lisina la cual se había acumulado en el medio utilizando un analizador Biotech AS210 (Sakura Seiki). Así como para la concentración de L-lisina en las células, se añadió un volumen adecuado del caldo de cultivo al aceite de silicón que tenía una gravedad específica de 1.07 y las células se recolectaron mediante centrifugación a 12000 rpm por 2 minutos. Posteriormente, las células recolectadas se fragmentaron mediante tratamiento con 22% de ácido perclórico, y se midió la concentración de lisina. En el cuadro 1 se muestran la acumulación y producción de L-lisina así como la relación de concentración extracelular a intracelular de lisina después de 24 horas. La relación de concentración extracelular a intracelular de lisina indicada con un * se determinó mediante la división de la concentración extracelular de lisina (mg/g de célula en peso seco) por la concentración intracelular de lisina (mg/g de célula en peso seco). Como se muestra en el cuadro 1 , la cepa WC196/pSYBJE1 acumuló una mayor cantidad de lisina en comparación con la cepa WC196/pSTV28, la cual no había sido introducida con el gen ybjE. Además, en la cepa WC196/pSYBJE1 introducida con el gen ybjE, la concentración extraceluiar de L-lisina se incrementó en relación con la concentración intracelular de L-lisina debido a una marcada disminución de la concentración intracelular de lisina en comparación con la cepa control WC196/pSTV28, y así se sugirió que el gen ybjE era un gen para exportación de L-lisina.

CUADRO 1 EJEMPLO 5 El efecto de la amplificación de ybjE sobre la producción de L-arginina de una bacteria Escherichia Se observó que tanto la acumulación como la producción de L-lisina se incrementaron en la cepa amplificada por el gen ybjE en comparación con la cepa control. También se examinó el efecto de la amplificación de ybjE sobre la producción de L-arginina, la cual es un aminoácido básico conocido semejante a L-lisina. Como una bacteria productora de L-arginina de Escherichia coli, se utilizó la cepa 237 que tiene inhibición por retroalimentación de N-acetilgl uta mato sintasa liberada (VKPM B-7925, Solicitud de Patente Rusa No. 2000117677). < 5-1 > Preparación de una cepa amplificada por el gen ybjE de la cepa Escherichia coli 237 Mediante la utilización del mismo método como en el ejemplo 4, se prepararon la cepa 237/pSYBJE1 amplificada para el gen ybjE y una cepa control 237/pSTV28. < 5-2 > Producción de L-arqinina Medíante la utilización del medio, métodos de cultivo, y métodos de análisis como se describen a continuación, se examinó el efecto de la amplificación del gen ybjE sobre la producción de L-arginina. Como un pre-cultivo, se inocularon 100 µ?_ de solución para almacenamiento de glicerol en medio L agar, éstos se sembraron de manera uniforme sobre una placa L que contenía 50 mg/L de cloramfenicol, y se incubó a 32°C por 24 horas. Aproximadamente 1/8 de las células recolectadas a partir de la placa se inocularon dentro de 20 mL del medio para producción de arginina y se cultivaron a 32°C por 90 horas. El cultivo de las cepas introducidas con el plásmido se llevó a cabo con la adición de cloramfenicol. Se tomó 1 mi de caldo de cultivo durante el cultivo, y se midió la concentración de glucosa y la acumulación de L-arginina en las células y en el caldo de cultivo. Para determinar la concentración de glucosa y la concentración de L-arginina en el caldo de cultivo, el caldo de cultivo se centrifugó a 15,000 rpm por 5 minutos, el sobrenadante obtenido se diluyó apropiadamente con agua, y las concentraciones se midieron en el sobrenadante diluido mediante la utilización de un analizador Biotech (Sakura Seiki) y un analizador de aminoácidos L-8500 (Hitachi Instrument Service). Para determinar la concentración de L-arginina en las células, se añadió un volumen adecuado de caldo de cultivo al aceite de silicón que tenía una gravedad específica de 1.07 y se centrifugó a 12000 rpm por 2 minutos, posteriormente las células recolectadas se fragmentaron mediante un tratamiento con 22% de ácido perclórico, y se midió la concentración de L-arginina. En el cuadro 2 se muestra la acumulación y producción de L-arginina así como la relación de concentración extracelular a intracelular de L-arginina después de 90 horas. La relación extracelular a intracelular indicada con * se determinó mediante la división de la concentración extracelular de L-arginina (mg/g de célula en peso seco) por la concentración intracelular de L-arginina (mg/g de célula en peso seco).

CUADRO 2 Producción de L-arqinina con la cepa amplificada por el gen ybjE Se observó que la acumulación y producción de L-arginina se incrementaron en una cepa amplificada por el gen ybjE en comparación con la cepa control. Además, también se incrementó la relación de la concentración extracelular a intracelular de arginina. Por lo tanto, se sugirió que el gen también estaba implicado en la exportación de L-arginina.

EJEMPLO 6 El efecto de la introducción del gen ybjE derivado a partir de una bacteria Escheríchia dentro de una bacteria Methylophilus <6-1> Construcción del plásmido pRSybiE por amplificación de ybjE Con el objeto de introducir el gen ybjE dentro de una bacteria Methylophilus, el plásmido conocido pRS (JP 3-501682A) se utilizó para construir un plásmido pRSybjE para la expresión de ybjE. pRS es un plásmido que tiene un segmento vector del plásmido pVIC40, el cual (WO 90/04636, JP 3-501682A) se obtiene mediante la deleción de una región de ADN que codifica para el operón de treonina. El plásmido pVIC40 se deriva a partir del vector de amplio espectro de hospedero plásmido pAYC32 (Chistorerdov, A. Y., Tsygankov, Y. D., Plasmid, 1986,16, 161-167), el cual es un derivado de RSF1010. Primero, un plásmido pRStac el cual contiene el promotor tac se construyó a partir de pRS de conformidad con el esquema mostrado en la figura 3 y como sigue. El vector pRS se digirió con las enzimas de restricción EcoRI y Pstl, se añadió a una solución de fenol/cioroformo, y se mezcló para terminar la relación. Después de que la mezcla de reacción se centrifugó, se recolectó la capa superior, y los ADNs se recolectaron mediante precipitación con etanol y se separaron en gel de agarosa al 0.8%. Un fragmento de ADN de aproximadamente 8 kilopares de bases (en adelante"kpb") se recolectó mediante la utilización de EASY TRAP Ver. 2 (equipo para recolección de ADN, Takara Bio). Alternativamente, la región promotora tac se amplificó mediante PCR utilizando el plásmido pKK223-3. (vector de expresión, Pharmacia) como un molde y los iniciadores que tiene una secuencia de SEQ ID NOS: 16 y 17 (un ciclo que consiste de la desnaturalización a 94°C por 20 segundos, fijación a 55°C por 30 segundos, y reacción de extensión a 72°C por 60 segundos se repitió por 30 ciclos). Se utilizó la ADN polimerasa Pyrobest (Takara Bio) para PCR. El fragmento de ADN amplificado que contenía el promotor tac se modificó utilizando PCR prep (Promega) y luego se digirió con las enzimas de restricción EcoRI y EcoT22l, los sitios de reconocimiento de las mismas han sido diseñados en los iniciadores. Posteriormente, la mezcla de reacción se añadió a una solución de fenol/cloroformo, y se mezcló para terminar la reacción. Después de que la mezcla de reacción se centrifugó, se recolectó la capa superior, y los ADNs se recolectaron mediante precipitación con etanol y se separaron en un gen de agarosa al 0.8%. Un fragmento de ADN de aproximadamente 0.15 kpb se recolectó mediante la utilización EASY TRAP Ver. 2. El producto de digestión del vector pRS y el fragmento de la región del promotor tac preparado como se describió anteriormente se ligaron mediante la utilización del equipo para ligación de ADN Ver. 2 (Takara Bio). Esta solución para la reacción de ligación se utilizó para transformar Escherichia coli (células competentes de Escherichia coli JM109, Takara Bio). Las células se sembraron en medio LB agar que contenía 20 mg/L de estreptomicina y se incubaron durante toda la noche a 37°C. Las colonias que aparecieron sobre el medio con agar se inocularon cada una dentro de medio LB líquido que contenía 20 mg/L de estreptomicina y se cultivaron a 37°C por 8 horas con agitación. El ADN plasmídico se extrajo a partir de cada cultivo mediante el método de álcali-SDS, y la estructura de cada plásmido se confirmó mediante digestión con enzimas de restricción. Se seleccionó un plásmido en el cual la dirección de la transcripción del gen de resistencia a estreptomicina y el promotor tac fueron los mismos, y se designó pRStac. pRStac obtenido como se describió anteriormente se digirió con Sse8387I (Takara Bio), y se mezcló con una solución de fenol/cloroformo para terminar la reacción. Después de que la mezcla de reacción se centrifugó, la capa superior se recolectó, y los ADNs se recolectaron mediante precipitación con etanol seguido por realización de extremos romos con un equipo para realización de extremos romos en ADN. Además, pSYBJEI como se describió anteriormente se digirió con la enzima de restricción Pvull, y se mezcló con una solución de fenol/cloroformo para terminar la reacción. Después de que la mezcla de reacción se centrifugó, se recolectó la capa superior, y los ADNs se recolectaron mediante precipitación con etanol y se separaron en un gen de agarosa al 0.8%. Un fragmento de ADN de aproximadamente 1.5 kpb que contenía el promotor lac y el gen ybjE se recolectó utilizando EASY TRAP Ver. 2 (equipo para recolección de ADN, Takara Bio). El producto de digestión del vector pRStac y el fragmento de la región del gen ybjE preparado como se describió anteriormente se ligaron juntos utilizando el equipo para ligación de ADN Ver. 2 (Takara Bio). Esta solución para la reacción de ligación se utilizó para transformar Escherichia coli (células competentes Escherichia coli JM109, Takara Bio). Las células se sembraron en medio LB agar que contenía 20 mg/L de estreptomicina y se incubaron durante toda la noche a 37°C. Las colonias que aparecieron en el medio con agar se inocularon con medio LB líquido que contenía 20 mg/L de estreptomicina y se cultivaron a 37°C por 8 horas con agitación. El ADN plasmídico se extrajo a partir de cada caldo de cultivo mediante el método de álcali-SDS, y la estructura de cada plásmido se confirmó mediante digestión con enzimas de restricción y secuenciación de ADN para seleccionar pRSybjE (figura 4). En el plásmido pRSybjE, el gen ybjE se localiza de manera que se transcribe en la misma dirección que el promotor tac. <6-2> La introducción de pRSvbiE dentro de una bacteria Methylophilus pRSybjE obtenido como se describió anteriormente se introdujo dentro de la cepa Methylophilus methylotrophus AS1 (NCIMB10515) mediante electroporación (Canadian Journal of Microbiology, 43, 197 (1997)). Además, pRS también se introdujo dentro de la cepa AS1 como un control. Los transformantes se obtuvieron a partir de pRSybjE y pRS basándose en la resistencia a estreptomicina. La cepa Methylophilus methylotrophus AS1 que contiene pRS o pRSybjE (AS1/pRS, AS1/pRSybjE) se sembró en una placa SEII que contenía 20 mg/L de estreptomicina y de cultivó durante toda la noche a 37°C. Posteriormente, se rasparon las células a partir de aproximadamente 0.3 cm2 de la superficie del medio, se inocularon dentro del medio de producción SEII (20 mL) que contenía 20 mg/L de estreptomicina y se cultivaron a 37°C por 34 horas con agitación. Después del término del cultivo, las células se removieron mediante centrifugación, y la concentración de L-lisina en el sobrenadante de cultivo se determinó mediante la utilización de un analizador de aminoácidos (Nihon Bunko, cromatografía líquida de alta solución). Los resultados se muestran en el cuadro 3.

CUADRO 3 Como un resultado de la amplificación del gen ybjE, las cantidades acumuladas de L-lisina y L-arginina se incrementaron marcadamente en comparación con la cepa control AS1/pRS. Por lo tanto, se sugirió que ybjE también funciona en la exportación de L-aminoácidos básicos en Methylophilus methyiotrophus.

EJEMPLO 7 Evaluación de Methylophilus methyiotrophus en la cual se introdujeron un gen que codifica el tipo de liberación por retroalimentación de dihidrodipicolinato sintasa y el gen ybjE Debido a que se encontró que la introducción del gen ybjE promovía la exportación de L-lisina en la cepa Methylophilus methyiotrophus AS1 , se mejoró una actividad de la enzima biosintética de L-lisina en la cepa introducida con el gen ybjE para intentar la mejoría adicional de la producción de L-lisina. <7-1> Construcción del plásmido pRSdapA que contenía un gen que codifica dihidrodipicolinato sintasa resistente a inhibición por retroalimentación mediante L-lisina Un plásmido que contenía un gen que codifica dihydrodipicolinato sintasa resistente a inhibición por retroalimentación mediante L-lisina (referido como "dapA*" en adelante) se preparó de conformidad con el esquema de construcción que se muestra en la figura 5. pRStac preparado en el ejemplo 6 se digirió con Sse8387l y Xbal y se mezcló con una solución de fenol/cloroformo para terminar la solución. Después de que la mezcla de reacción se centrifugó, la capa superior se recolectó, y los ADNs se recolectaron mediante precipitación con etanol y se separaron en un gel de agarosa al 0.8%. Como un resultado, se recolectó un fragmento de ADN de aproximadamente 8.2 kpb. El fragmento del gen dapA* se amplificó mediante PCR utilizando el plásmido RSFD80 (refiérase a la Patente de E.U.A. No. 6,040,160) que contenía el gen dapA* como un molde y los iniciadores que tienen SEQ ID NOS: 14 y 15 (desnaturalización a 94°C por 20 segundos, fijación a 55°C por 30 segundos, y reacción de extensión a 72°C por 60 segundos). La ADN polimerasa Pyrobest (Takara Bio) se utilizó para PCR. El fragmento dapA* obtenido se purificó mediante la utilización de PCR prep (Promega) y luego se digirió con enzimas de restricción Sse8387l y Xbal. La solución de reacción se mezcló con una solución de fenol/cloroformo para terminar la reacción. Después de que la mezcla de reacción se centrifugó, se recolectó la capa superior, y Los ADN se recolectaron mediante precipitación con etanol y se separaron en un gel de agarosa al 0.8%. Como un resultado, se recolectó un fragmento de ADN de aproximadamente 1.0 kpb. El producto de digestión del vector pRStac y el fragmento del gen dapA* preparado como se describió anteriormente se ligaron entre sí mediante la utilización de un equipo para la ligación de ADN Ver. 2 (Takara Bio). Esta solución para la reacción de ligación se utilizó para transformar las células Escherichia coli (células competentes Escherichia coli JM109, Takara Bio). Las células se sembraron sobre medio LB agar que contenía 20 mg/L de estreptomicina y se incubaron durante toda la noche a 37°C. Las colonias que aparecieron en el medio con agar se inocularon cada una dentro del medio LB líquido que contenía 20 mg/L de estreptomicina y se cultivaron a 37°C por 8 horas con agitación. El ADN plasmídico se extrajo a partir de cada cultivo mediante el método de álcali-SDS, y la estructura de cada plásmido se confirmó mediante digestión con enzimas de restricción y secuenciación de ADN para seleccionar un plásmido pRSdapA. En el plásmido pRSdapA, el gen dapA* se colocó de manera que se transcribiera en la misma dirección que el promotor tac. La cepa Escherichia coli JMÍ09 transformada con el plásmido pRSdapA se designó AJ13831 , y esta cepa se depositó en la agencia administrativa independiente, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary el 4 de junio de 2001 y recibió un número de acceso de FERMP-18370. Posteriormente, el depósito se convirtió a un depósito internacional bajo las condiciones del Tratado de Budapest el 13 de mayo de 2002, y recibió un número de acceso de FERM BP-8041. Por lo tanto, el plásmido pRSdapA también se puede obtener a partir de esta cepa. <7-2> Construcción del plásmido que contenía vbiE y dapA* Con el objeto de evaluar el efecto de la combinación de ybjE y dapA*, se construyó un plásmido obtenido mediante la inserción del gen ybjE dentro del plásmido pRSdapA de conformidad con el método mostrado en la figura 5. pRSybjE preparado en el ejemplo 6 se digirió con la enzima de restricción Sapl, y se realizaron extremos romos utilizando el equipo para formación de extremos romos en ADN (Takara Bio). Además, el plásmido pRSdapA se digirió con enzimas de restricción EcoRI y Sapl, y se separó un fragmento de aproximadamente 1 kpb que contenía el promotor tac y la región dapA* en un gel de agarosa al 0.8% y se recolectó utilizando EASY TRAP Ver. 2 (Takara Bio). A este fragmento se le realizaron extremos romos de la misma manera como se describió anteriormente y se ligó al producto de digestión anteriormente mencionado de pRSybjE mediante la utilización del equipo para ligación de ADN Ver. 2 (Takara Bio). Esta solución para la reacción de ligación se utilizó para transformar las células Escheríchia coli (células competentes Escherichia coli JM109, Takara Bio). Las células se sembraron sobre medio LB agar que contenía 20 mg/L de estreptomicina y se incubaron durante toda la noche a 37°C. Las colonias que aparecieron en el medio con agar se inocularon cada una dentro del medio LB líquido que contenía 20 mg/L de estreptomicina y se cultivaron a 37°C por 8 horas con agitación. El ADN plasmídico se extrajo a partir de cada cultivo mediante el método de álcali-SDS, y las estructuras de los plásmidos se confirmaron mediante digestión con enzimas de restricción y secuenciación de ADN para seleccionar el plásmido pRSybjEdapA. En este plásmido, el gen ybjE y el gen dapA* se localizaron de manera que éstos se transcriben en la misma dirección relativa entre sí. pRSybjEdapA obtenido como se describió anteriormente así como pRSybjE, pRSdapA, y plásmido control pRS se introdujeron dentro de la cepa Methylophilus methylotrophus AS1 (NCI B10515) mediante electroporación, respectivamente. <7-3> Producción de L-lisina mediante la bacteria Methylophilus que contiene vbiE y dapA* Cada una de las cepas AS1 introducidas con pRSybjEdapA, pRSybjE, pRSdapA, o pRS, las cuales se obtuvieron como se describió anteriormente, se sembraron sobre una placa de medio SEII que contenía 20 mg/L de estreptomicina y se cultivó durante toda la noche a 37°C. Posteriormente, se rasparon las células a partir de aproximadamente 0.3 cm2 de la superficie del medio, se inocularon dentro de medio de producción SEN (20 mL) que contenía 20 mg/L de estreptomicina, y se cultivaron a 37°C por 34 horas con agitación. Después del término del cultivo, las células se removieron mediante centrifugación, y la concentración de L-lisina en el sobrenadante de cultivo se determinó mediante la utilización de un analizador de aminoácidos (Nihon Bunko, cromatografía líquida de alta resolución). Los resultados se muestran en el cuadro 4. La cepa la cual había sido introducida con pRSybjEdapA mostró acumulación incrementada de L-lisina en comparación con las cepas introducidas solamente con pRSdapA o pRSybjE. Por lo tanto, se encontró que la mejoría tanto del gen ybjE como del gen dapA* tuvo un efecto sinergístico sobre la producción de L-lisina.

CUADRO 4 EJEMPLO 8 El efecto de la amplificación de ybjE sobre la resistencia al análogo de Usina Posteriormente, se examinó el efecto de la amplificación del gen ybjE sobre una resistencia al análogo de lisina. Las cepas Methylophilus methylotrophus AS1 anteriormente mencionadas que contienen AS1/pRSybjE o pRS control se cultivaron cada una durante toda la noche en medio SEII que contenía 20 mg/L de estreptomicina. Cada cultivo se inoculó dentro de medio SEN recientemente preparado (que contenía 20 mg/L de estreptomicina) en un volumen de 10% y se cultivaron a 37°C con agitación hasta que las células alcanzaron la fase de crecimiento logarítmica. Cada cultivo se inoculó en un volumen de 4% dentro del medio SEII que contenía 20 mg/L de estreptomicina y 0,3 ó 5 g/L de S-(2-aminoetil)cisteína (AEC), y se cultivaron a 37°C con agitación. Durante el cultivo, se midió el valor de DO a 660 nm cada 30 minutos para examinar el grado de resistencia a AEC de las cepas. Los resultados se muestran en las figuras 6A y 6B. Se utilizó un biofotoregistro TN-1506 producido por Advantec para medir el grado de resistencia, y 5 mL del cultivo se colocaron dentro de un tubo de ensayo y se analizaron. Los resultados se muestran en las figuras 6A y 6B. Como un resultado, y con la adición de AEC, no se observó retraso del crecimiento para la cepa AS1/pRSybjE, mientras que el crecimiento de la cepa AS1/pRS se retrasó marcadamente. Por lo tanto, se reveló que la amplificación del gen ybjE no solamente impartió resistencia a L-lisina, sino que también impartió resistencia al análogo de L-lisina.

EJEMPLO 9 El efecto de la amplificación de ybjE sobre la producción de L-treonina La cepa Escheríchia coli B-5318 (EP 0593792) se utilizó como una cepa inicial. La cepa B-5318 se transformó con el plásmido pSYBJEI como se describió en el ejemplo 2 o un plásmido control pSTV28 (TakaraBio) para obtener una cepa resistente a cloramfenicol. Después de la determinación de la secuencia, se puede seleccionar la cepa B-5318/pSYBJE1 y la cepa B-5318/pSTV28. Estas cepas se cultivaron en L-medio que contenía 50 mg/L de cloramfenicol a 37°C hasta que la DO600 se vuelve aproximadamente 0.6. El cultivo se mezcló con la misma cantidad de solución de glicerol al 40% y se dividió en porciones cada una teniendo un volumen apropiado y se almacenó a -80°C. La solución para almacenamiento de glicerol se descongeló y se inocularon 100 µ? de ésta de manera uniforme sobre una placa L que contenía 50 mg/L de cloramfenicol y se incubó a 37°C por 24 horas. Posteriormente, las células se recolectaron a partir de aproximadamente un octavo de la superficie del medio, se inocularon dentro de medio para producción de L-treonina y se cultivaron a 37°C por 24 horas con agitación. Después del término del cultivo, las células se removieron mediante centrifugación, y se determinó la concentración de L-treonina en el sobrenadante de cultivo mediante la utilización de un método convencional. Por lo tanto, se pudo obtener una cepa en la cual se amplificó el gen ybjE y tiene una capacidad protectora de L- treonina mejorada.

EJEMPLO 10 El efecto de la amplificación del gen vbiE en bacteria Corvneform <10-1> Construcción de un plásmido para amplificación del gen vbiE pSYBJE2 como se describe en el ejemplo 2 se digirió con EcoRI y PstI, y el fragmento digerido se ligó a pVK7 (US 20030175912) el cual había sido digerido con las mismas enzimas. El plásmido obtenido se denominó pVYBJEI . <10-2> Efecto de la amplificación del gen vbiE sobre la producción de L-lisina utilizando bacteria Corvneform La cepa Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium lactofermentum) ATCC13861 se utilizó como la cepa inicial. La cepa ATCC13861 se transformó con el plásmido pVYBJEI o un plásmido control pVK7 para obtener una cepa resistente a canamicina. Después de la determinación de la secuencia, se seleccionó la cepa ATCC13861 /pVYBJEI y la cepa ATCC13861/pVK7. Estas cepas se cultivaron en medio M-CM2S que contenía 25 mg/L de canamicina a 31.5°C hasta que la DO600 se volvió aproximadamente 0.6. El cultivo se mezcló con una cantidad igual de solución de glicerol al 40% y se dividió en porciones cada una que tiene un volumen apropiado y se almacenaron a -80°C. La solución de almacenamiento de glicerol se descongeló y se inocularon 100 µ? de manera uniforme en una placa M-CM2S que contenía 25 mg/L de canamicina, y se incubó a 31.5°C por 24 horas. Posteriormente, las células se recolectaron a partir de aproximadamente un octavo de la superficie del medio, se inocularon dentro de 20 mi de medio para fermentación que contenía 25 mg/L de canamicina y se cultivaron a 31.5°C por 42 horas con agitación a 115 rpm. Después del término del cultivo, las células se removieron mediante centrifugación, y la concentración de L-lisina en el sobrenadante de cultivo se determinó utilizando un analizador Biotech AS210 (Sakura Seiki). Toda la glucosa en el medio había sido completamente consumida después de cultivo por 42 horas. Los resultados se muestran en el cuadro 5. ATCC13861/pVYBJE1 en la cual el gen ybjE amplificado fue capaz de ocasionar acumulación de L-lisina en una cantidad mayor en comparación con la cepa control ATCC13861/pVK7. Se encontró que el gen ybjE también funciona en la exportación del L-aminoácido y mejora la producción de L-lisina en bacteria Coryneform.

CUADRO 5 EJEMPLO 11 El efecto de la amplificación del gen ybjE sobre el crecimiento bajo altas concentraciones de L-aminoácidos La cepa Escherichia coli MG1655 (ATCC47076) se transformó con pSYBJEI incluyendo el gen ybjE o el plásmido control pTSV28 (TakaraBio). Además, la cepa MG1655 también se transformó con pSYJE1*2-1 incluyendo un gen muíante ybjE que tenía una secuencia de SEQ ID NO: 1 en la cual el nucleóíido (guanina) en la 3a posición se reemplaza con adenina. Los íransformaníes iníroducidos con estos plásmidos se seleccionaron de conformidad con la resistencia al cloramfenicol y las cepas seleccionadas se denominaron MG1655/pSYJE1 , MG1655/pSYJE1*2-1 , y MG1655/pSTV28, respectivameníe. pSYJE1*2-1 se construyó como sigue. El gen mutanfe ybjE se amplificó medianíe PCR ufilizando iniciadores que íienen cada uno una secuencia de SEQ ID NOS: 5 ó 6 a partir de un ADN cromosomal de la cepa productora de L-lisina NVC578 de E. coli. El ADN amplificado se secuenció y se encontró que tiene una secuencia de SEQ ID NO: 1 en la cual el nucleótido (guanina) en la 3a posición se reemplaza con adenina. El ADN amplificado se ligó con pTV28 digerido con Smal y se seleccionó un plásmido en el cual el gen mutante ybjE se colocó de manera que se expresó por un promotor lac y se denominó pSYJE1*2-1. El gen mutante ybjE también se puede obtener mediante la introducción de la mutación dentro del gen de tipo silvestre ybjE utilizando métodos tales como PCR por extensión de superposición (Nucleic Acids Res, 25, 2227-8. 1997), en el cual el gen mutante ybjE se amplifica con iniciadores uno de los cuales tiene el reemplazo del nucleótido. Posteriormente, se examinó el crecimiento de las cepas MG1655/pSYJE1 , MG1655/pSYJE1*2-1 , y MG1655/pSTV28 en la presencia de altas concentraciones de cada L-aminoácido. Estas cepas se cultivaron con agitación en 5 mi de medio L que contenía 50 mg/L de cloramfenicol por aproximadamente 6 horas. Después de que la DO600 del medio alcanzó aproximadamente 1.0, el cultivo se centrifugó y las células se lavaron dos veces con medio mínimo M9 y se inocularon a DO600 = 0.05 dentro de medio mínimo M9 que contenía 50 mg/L de cloramfenicol y cada L-aminoácido (12 g/L de isoleucina, 40 g/L de treonina, 15 g/L de glutamato sódico, 30 g/L de clorhidrato de histidina, 45 g/L de clorhidrato de ornitina, 90 g/L de clorhidrato de arginina, 8 g/L de fenilalanina, 85 g/L de prolina o 0.3 g/L de cisteína), y se cultivó por 70 horas. La L-isoleucina se eligió como un representante de los L-aminoácidos alifáticos, L-treonina se eligió como un representante de los hidroxil L-aminoácidos, L-prolina se eligió como un representante de L-aminoácidos circulares, L- fenilalanina se eligió como un representante de L-aminoácidos aromáticos, L- cisteína se eligió como un representante de L-aminoácidos que contienen azufre, L-ácido glutámico se eligió como un representante de L-aminoácidos ácidos y sus amidas. Los resultados se muestran en las figuras 7-15. Se encontró que la amplificación del gen ybjE mejoró el crecimiento de la cepa MG1655 en la presencia de altas concentraciones de L-aminoácidos, especialmente L-arginina, L-ornitina, L-isoleucina, L-ácido glutámico, L-treonina, L-histidina, L-prolina, L-fenilalanina, y L-cisteína. También se encontró que el gen mutante ybjE confiere resistencia al aminoácido a la cepa MG1655 más eficientemente que el gen ybjE de tipo silvestre.

EJEMPLO 12 Efecto del gen ybjE que tiene una secuencia nucleotídica de nucleótidos números 49-948 de SEQ ID NO; 1 El gen ybjE, el cual tiene una secuencia nucleotídica de nucleótidos números 49-948 de SEQ ID NO: 1 (referido como ybjE-900 en adelante) se amplificó a partir de un ADN cromosomal de la cepa MG1655 mediante PCR utilizando iniciadores que tienen una secuencia nucleotídica de SEQ ID NO: 13 ó 12. El gen ybjE que tiene una secuencia nucleotídica de nucleótidos números 1-948 de SEQ ID NO: 1 en la cual la guanina en la posición 1 se reemplaza con adenina (referido como ybjE-948 en adelante) también se amplificó mediante PCR utilizando iniciadores que tienen una secuencia nucleotídica de SEQ ID NO: 11 ó 12. El producto de PCR obtenido a partir de cada reacción se purificó y cada uno se ligó a un vector pTV28 digerido con Smal (Takara Bio), obteniendo así un plásmido para la amplificación del gen ybjE-900 o del gen ybjE-948. Se seleccionó un plásmido en el cual el gen ybjE-900 se colocó de manera que se expresó por el promotor lac y se denominó pSYBJE900, y se seleccionó un plásmido en el cual el gen ybjE-948 se colocó para ser expresado por el promotor lac y se denominó pSYBJE948. La cepa Escherichia coli MG1655 (ATCC47076) se transformó con pSYBJE900, pSYBJE948, pSYBJEI utilizados en el ejemplo 2, o el plásmido control pSTV28. Los transformantes introducidos con estos plásmidos se seleccionaron de conformidad con la resistencia al cloramfenicol y las cepas seleccionadas se denominaron MG1655/pSYBJE900, MG1655/pSYBJE948, MG1655/pSYJEI y MG 655/pSTV28, respectivamente. Posteriormente, se examinó el crecimiento de las cepas G1655/pSYBJE900, MG1655/pSYBJE948, MG1655/pSYJE1 , y MG1655/pSTV28 en la presencia de altas concentraciones de L-lisina. Estas cepas se cultivaron con agitación en 3 mi de medio L que contenía 50 mg/L de cloramfenicol por aproximadamente 6 horas. Después de la DO600 el medio se volvió aproximadamente 1.0, el cultivo se centrifugó y las células se lavaron dos veces con medio mínimo M9 y se inocularon a DO600 = 0.05 dentro de medio mínimo M9 que contenía 50 mg/L de cloramfenicol y 80 g/L de clorhidrato de lisina, y se cultivaron por aproximadamente 20 horas. Los resultados se muestran en la figura 16. Se encontró que la amplificación del gen ybjE-900 mejora el crecimiento de la cepa MG1655 en la presencia de altas concentraciones de L-lisina en la fase de crecimiento temprano así como en la fase de crecimiento logarítmico en casi el mismo grado que los genes ybjE-948 y ybjEs contenidos en pSYJEI . Estos datos sugieren que una secuencia de nucleótidos números 49-948 en la secuencia del gen ybjE (SEQ ID NO: 1 ) es suficiente para ejercer su efecto de exportación del L-aminoácido.

Aplicabilidad industrial De conformidad con la presente invención, los L-aminoácidos, especialmente L-lisina, L-treonina, L-isoleucina, L-prolina, L-arginina, L-omitina, L-histidina, L-fenilalanina, y L-ácido glutámico se pueden producir eficientemente mediante fermentation. L-lisina, L-treonina, L-isoleucina y L-prolina son útiles como aditivos para forraje animal, componentes de alimento saludable, e infusiones de aminoácido. L-arginina y L-ornitina son útiles como agentes promotores de la función hepática, infusiones de aminoácido, y componentes de preparaciones comprensivas de aminoácidos. L-histidina es útil como un agente promotor de la función hepática y un precursor de histamina. L-fenilalanina es útil como un precursor de edulcolorantes.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES 1.- Un microorganismo que tiene una capacidad productora de L-aminoácido, en donde dicho microorganismo se modifica de manera que se mejora la expresión de un gen ybjE. 2 - El microorganismo de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la expresión de dicho gen ybjE ha sido mejorada al incrementar un número de copias de dicho gen ybjE, o al modificar una secuencia reguladora de la expresión de dicho gen ybjE. 3. - El microorganismo de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la secuencia de aminoácidos de una proteína codificada por dicho gen ybjE se seleccionó a partir del grupo que consiste de SEQ ID NO: 2, 9 y 10, en donde dicha proteína tiene una capacidad de exportación del L-aminoácido. 4. - El microorganismo de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho gen ybjE se selecciona a partir del grupo que consiste de: (a) un ADN que comprende una secuencia nucleotídica de SEQ ID NO: 1 ; y (b) un ADN hibridizable bajo condiciones severas con una secuencia nucleotídica de SEQ ID NO: 1 o una sonda que se puede preparar a partir de la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO: 1 , y en donde dicho ADN codifica una proteína que tiene una capacidad de exportación del L- aminoácido. 5. - El microorganismo de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho gen ybjE se selecciona a partir del grupo que consiste de: (a) un ADN que tiene una secuencia nucleotídica de nucieótidos números 49 a 948 en SEQ ID NO: 1 ; y (b) un ADN que puede hibridar bajo condiciones severas con una secuencia nucleotídica de nucieótidos números 49 a 948 en SEQ ID NO: 1 o una sonda que se puede preparar a partir de la secuencia nucleotídica de nucieótidos números 49 a 948 en SEQ ID NO: 1 , y en donde dicho ADN codifica una proteína que tiene una capacidad de exportación del L-aminoácido. 6. - El microorganismo de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado además porque dicha capacidad de exportación del L-aminoácido de dicho microorganismo se incrementa mediante dicha expresión mejorada de dicho gen ybjE. 7. - El microorganismo de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado además porque una resistencia del microorganismo a un L-aminoácido o análogo de L-aminoácido se incrementa mediante dicha expresión mejorada de dicho gen ybjE. 8. - El microorganismo de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado además porque dicho L-aminoácido se selecciona a partir del grupo que consiste de L-lisina, L-arginina, L-ornitina, L- histidina, L-isoleucina, L-treonina, L-prolina, L-fenilalanina, L-cisteína, y L- ácido glutámico. 9. - El microorganismo de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado además porque dicho microorganismo pertenece a una familia Enterobacteriaceae. 10. - El microorganismo de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque dicho microorganismo pertenece a una familia Enterobacteriaceae es un microorganismo que pertenece al género Escherichia. 11. - El microorganismo de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado además porque dicho microorganismo es una bacteria Coryneform. 12. - El microorganismo de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado además porque dicho microorganismo es una bacteria que asimila metanol. 13. - El microorganismo de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque dicha bacteria que asimila metanol es un microorganismo que pertenece al género Methylophilus o Methylobacillus. 14. - Un método para la producción de un L-aminoácido que comprende cultivar el microorganismo que se reclama en cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 13 en un medio para producir y ocasionar acumulación de dicho L-aminoácido, y recolectar dicho L-aminoácido a partir del medio o del microorganismo. 15. - Un método para la producción de un L-aminoácido, que comprende cultivar el microorganismo que se reclama en las reivindicaciones 12 ó 13 en un medio líquido que contenía metanol como una fuente principal de carbono para producir y ocasionar acumulación de dicho L-aminoácido, y recolectar el L-aminoácido a partir del medio o del microorganismo. 16. - El método de conformidad con las reivindicaciones 14 ó 15, caracterizado además porque el L-aminoácido se selecciona a partir del grupo que consiste de L-lisina, L-arginina, L-ornitina, L-histidina, L-isoleucina, L-treonina, L-prolina, L-fenilalanina, L-cisteína, y L-ácido glutámico.