MEDIOS Y PROCESOS LIBRES DE PRODUCTO ANIMAL PARA OBTENER UNA TOXINA BOTULINA
CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un medio y a un proceso para obtener toxina botulina biológicamente activa. En particular, la presente invención se refiere a producto animal, sustancialmente libre de medios, cultivos y procesos de fermentación anaeróbica de un organismo, tal como la bacteria Clostridium botulinum, para obtener toxina botulina abundante, biológicamente activa. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Una composición farmacéutica adecuada par-a administración a un humano o animal, para un propósito terapéutico, de diagnóstico, de investigación o cosmético, puede comprender un ingrediente activo. La composición farmacéutica puede también incluir uno o más excipientes, amortiguadores, portadores, estabilizadores, conservadores y/o agentes de volumen. El ingrediente activo en una composición farmacéutica puede ser uno biológico, tal como una toxina botulina. La toxina botulina se puede obtener a través de procesos de cultivación, fermentación y formación de compuestos, los cuales hacen uso de uno o más productos derivados de animales (tales como un medio de cultivo de caldo de carne, y una fracción de sangre o excipiente derivado de la REF.:i70441 sangre) . La administra ión a un paciente de una composición farmacéutica en donde el ingrediente activo biológico se obtiene a través de un proceso -el cual hace uso de productos derivados de animales, puede someter al paciente a un riesgo potencial de recibir varios patógenos o agentes infecciosos . Por ejemplo, pueden estar presentes priones en una composición farmacéutica. Un prión es una partícula infecciosa proteinácea,. la cual se presume, origina como una isoforma conformacional anormal a partir de la mi-sma secuencia de ácido nucleico, lo cual hace la proteína normal. Se ha presumido además, que la inefectividad reside en una "reacción de reclutamiento" de la proteína de isoforma normal a la isoforma de proteína prión en un nivel post-traduccional . Aparentemente, la proteína celular endógena normal, es inducida para desplegarse en una conformación de prión patogénico. La enfermedad de Creutzfeldt-Jacob es un trastorno neurodegenerativo raro de encefalopatía espongiforme transmisible, en donde el agente transmisible es aparentemente una isoforma anormal de una proteína prión. Un individuo con enfermedad de Creutzfeldt-Jacob, puede deteriorarse desde aparente salud perfecta hasta mutismo acinético dentro de seis meses. De este modo, puede existir un riesgo potencial -de adquirir una enfermedad mediada por priones, tal como la enfermedad de Creutzfeldt-Jacob, a partir de la administración de una composición farmacéutica la cual contiene un biológico, tal como una toxina botulina, obtenida usando productos derivados de animales . Toxina Botulina El género Clostridium tiene más de ciento veintisiete especies, agrupadas por morfología y función. La bacteria gram positiva anaeróbica, Clostridium botulinu , produce una neurotoxina polipeptídica potente, la toxina botulina, la cual causa una enfermedad neuroparalítica en humanos y anímalas, conocida como botulismo. La Clostridium botulinum y sus esporas, se encuentran comúnmente en -el suelo y la bacteria puede crecer en recipientes de alimentos salados e incorrectamente esterilizados, de productos de conservas elaborados en el hogar, los cuales son la causa de muchos de los casos de botulismo. Los efectos del botulismo típicamente aparecen 18 a 36 horas después de comer los alimentos infectados con un cultivo o esporas de Clostridium botulinum. La toxina botulina puede aparentemente, pasar no atenuada a través del revestimiento del intestino y atacar neuronas motores periféricas. Los síntomas de la intoxicación con toxina botulina pueden progresar desde dificultad para caminar, tragar y hablar, hasta parálisis de los músculos respiratorios y muert . La toxina botulina tipo A, es el agente biológico natural más letal conocido para el hombre. Aproximadamente 50 picogramos de toxina botulina (complejo de neurotoxina purificada) tipo A, son un LD50 en ratones. En una base molar, la toxina botulina tipo A es 1.8 billones de veces más letal que la difteria, 600 millones de veces más letal que el cianuro de sodio, 30 millones de veces más letal que la cobrotoxina y 12 millones de veces más letal que -el cólera. Singh, Critical Aspects of Bacterial Protein Toxins, páginas 63-84 (capítulo 4) de Natural Toxins II, editado por B.R. Singh et al., Plenum Press, New York (1976) (-en donde el LD50 declarado de toxina botulina tipo A de 0.3 ng igual a 1U, -es corregido por el hecho de que aproximadamente .05 ng de BOTOX® es igual a 1 unidad) . El BOTOX® es la marca comercial de un complejo de neurotoxina purificada -de toxina botulina tipo A, disponible comercialmente de Allergan, Inc., de Irvine, California. Una unidad (U) de toxina botulina, es definida como el LD50 después de la inyección intraperitoneal en ratones hembra S iss Webster, que pesan 18-20 gramos cada una. En otras palabras, una unidad de toxina botulina es la cantidad de toxina botulina que elimina 50% de un grupo de ratones hembra Swiss Webster. Se han caracterizado siete neurotoxinas botulinas de manera general, inmunológi-camente distintas, estas son respectivamente, neurotoxinas botulinas serotipos A, B, Ci, D, E, F y <3, cada uno de los cuales .está distinguido por neutralización con anticuerpos específicos del tipo. Los diferentes serotipos de toxina botulina varían en las especies animales que afectan y en la severidad y duración de la parálisis que evocan. Por -ejemplo, se ha determinado que la toxina botulina tipo A, es 500 veces más potente, medida por la relación de parálisis producida en la rata, -que la toxina botulina tipo B. Adicionalmente , la toxina botulina tipo B, ha sido determinada por no ser tóxica en primates a una dosis de 480 U/kg, lo cual es aproximadamente 12 veces el LD50 de primate para la toxina botulina tipo A. Las toxinas botulinas aparentemente se enlazan con alta afinidad a las neuronas motoras colinérgicas, son translocadas en la neurona y bloquean la liberación presináptica de aoetilcolina . Las toxinas botulinas han sido usadas .en establecimientos clínicos para el tratamiento de por ejemplo, trastornos neuromusculares caracterizados por músculos esqueletos hiperactivos . La toxina botulina tipo A, ha sido probada por la Administración Estadounidense de Alimentos y Fármacos, para el tratamiento de blefaroespasmos esenciales, estrabismo y espasmos hemifaciales en pacientes mayores de doce años, para el tratamiento de distonia cervical y para el tratamiento de arrugas de líneas glabelares (faciales) . La FDA también ha aprobado una toxina botulina tipo B para el tratamiento de distonia cervical . Ef-ectos clínicos de inyección periférica (es decir, intramuscular o subcutánea) , de toxina botulina tipo A, son usualmente vistos dentro de una semana de la inyección, y a menudo, dentro de unas cuantas horas después de la inyección. La duración típica del alivio sintomático (es decir, parálisis del músculo flácido) , a partir de una inyección intramuscular única de toxina botulina tipo A, puede ser aproximadamente tres meses hasta aproximadamente seis meses. Aunque todos los serotipos -de toxinas botulinas aparentemente inhiben la liberación de la ace ilcolina neurotransmisora en la unión neuromuscular, también afectan diferentes proteínas neurosecretorias y/o desdoblan estas proteínas en diferentes sitios. La toxina botulina A, es una endopeptidasa de zinc, la cual puede específicamente, hidrolizar un enlace peptídico de la proteína asociada a la vesícula, intracelular, SNAP-25. La botulina tipo E, también desdobla la proteína asociada al sinaptosomal de 25 kiloDaltons (kD) (SNAP-25) , pero dirige diferentes secuencias de aminoácido dentro de esta proteína, comparada con la toxina botulina tipo A. La toxina botulina tipos B, D, F y G, actúa en la proteína asociada a la vesícula (VAMP, también llamada sinaptobrevina) , con cada serotipo que desdobla la proteína en un sitio diferente. Finalmente, la toxina botulina tipo Ci, ha sido mostrada por desdoblar tanto la sintaxina como la SNAP-25. Estas diferencias en el mecanismo de acción pueden afectar la potencia relativa y/o duración de la acción de los varios serotipos de toxinas botulinas. Con respecto al -serotipo, el mecanismo molecular de intoxicación de toxina parece ser muy similar e involucrar al menos, tres etapas o estados. En la primera etapa del proceso, la toxina se enlaza a la membrana presináptica de la neurona objetivo, a través de una interacción especifica entre la cadena pesada (cadena H) y un receptor de la superficie celular; el receptor se piensa, es diferente para -cada serotipo de toxina botulina y para la toxina botulina. El segmento del extremo carboxilo de la cadena H, Hc, parece ser importante para el objetivo de la toxina a la superficie celular. En la segunda etapa, la toxina cruza la membrana plasmática de la célula envenenada. La toxina es primero absorbida por la célula a través de endocitosis mediada por el receptor, y se forma un endosoma que contiene la -toxina. La toxina entonces escapa del endosoma en el citoplasma de la célula. Esta última etapa se piensa, es mediada por el segmento del extremo amino de la cadena H, HN, el cual activa un cambio conformacional de la toxina en respuesta a un pH de aproximadamente 5.5 o inferior. Los endosomas son conocidos por poseer una bomba de protones, los cuales disminuyen el pH intraendosomal . El cambio conformacional expone residuos hidrofóbicos en la toxina, los cuales permiten a la toxina incrustarse en la membrana endosomal . La toxina entonces se trasloca a través de la membrana endosomal en el citosol . La última etapa del mecanismo de actividad -de la toxina botulina, parece involucrar la reducción del enlace disulfuro que une la cadena H y L. La actividad tóxica completa de botulina y toxinas botulina, .está contenida en la cadena L de la holotoxina; la cadena L es una endopepti-dasa de zinc (Zn++) , la cual desdobla selectivamente las proteínas esenciales para reconocim ento y acoplamiento de las vesículas que contienen neurotransmisores con la superficie citoplasmica de la membrana plasmática, y la fusión de las vesículas con la membrana plasmática. La neurotoxina botulina, toxina botulina B, D, F y G, causan degradación de la sinaptobrevina (también llamada proteína de la membrana asociada con la vesícula (VAMP)), una proteína de la membrana sinaptosomal . La mayoría de la VAMP presente en la superficie citosólica de la vesícula sináptica es removida como un resultado de cualquiera de estos eventos de desdoblamiento. Cada toxina, específicamente desdobla un enlace diferente. El peso molecular de la molécula de proteína botulina, para los siete serotipos ole toxina botulina conocidos, es aproximadamente de 150 kD. De manera interesante, las toxinas botulinas son liberadas por la bacteria Clostridial como complejos que comprenden la molécula de proteína toxina botulina de 150 kD, junto con proteínas no toxinas asociadas. De este modo, el complejo de toxina botulina tipo A, puede ser producido por la bacteria Clostridial como formas de 900 kD, 500 kD y 300 kD. La toxina botulina tipos B y Clf es aparentemente producida como únicamente un complejo de 500 kD. La toxina botulina tipo D, es producida como tanto complejos de 300 kD -como de 500 kD. Finalmente, la toxina botulina tipos E y F, es producida como únicamente complejos de aproximadamente 300 kD. Los complejos (es decir, el peso mayor de aproximadamente 150 kD) , se cree, contienen una proteína de hemaglutinina no toxina y una proteína no hemaglutinina no tóxica y no toxina. Estas dos proteínas no toxinas (las cuales junto con la molécula de toxina botulina, pueden comprender el complejo de neurotoxina relevante) , pueden actuar para proporcionar estabilidad contra la desnaturalización a la molécula toxina botulina y protección contra los ácidos digestivos, cuando la toxina es ingerida. Adicionalmente, es posible que los complejos de toxinas botulinas más grandes (mayores de aproximadamente 150 kD de peso molecular) , puedan resultar en una velocidad más lenta de difusión de la toxina botulina lejos de un sitio de inyección intramuscular de un complejo de toxina botulina. Los complejos de toxinas pueden ser disociados en la proteína toxina y las proteínas de hemaglutinina, tratando el -complejo con células de sangre roja a pH 7.3. La proteína toxina tiene una inestabilidad marcada después de la remoción de la proteína hemaglutinina. Todos los serotipos de toxinas botulinas son elaborados por la bacteria Clostriáium botulinum como proteínas de cadenas únicas inactivas, las cuales pueden ser desdobladas o melladas por proteasas para llegar a ser neuroactivas . Las cepas bacterianas que hacen los serotipos A y G de toxinas botulinas, poseen proteasas endógenas y los serotipos A y G pueden por lo tanto, se recuperados de los cultivos bacterianos en su forma predominantemente activa. Por el contrario, los serotipos Ci, D y E de toxina botuli-na, son sintetizados por cepas no proteolíticas y son por lo tanto, típicamente inactivados cuando se recuperan del cultivo. Los serotipos B y F son producidos por cepas tanto proteolíticas como no proteolíticas, y por lo tanto, pueden ser recuperados en ya sea la forma activa o inactiva. Sin embargo, aún las cepas proteolíticas que producen, por ejemplo, el serotipo B de la toxina botulina, solamente desdoblan una porción de la toxina producida. La proporción exacta de las moléculas melladas a no melladas, depende de la longitud de incubación y la temperatura del cultivo. Por lo tanto, un cierto porcentaje de cualquier preparación de, por ejemplo, la toxina tipo B de toxina botulina, probablemente será inactivo, posiblemente contando por la potencia conocida significantemente inferior de la toxina botulina tipo B, comparada con la toxina botulina • tipo A. La presencia de las moléculas de toxina botulina en una preparación clínica, contribuirán a la proteína total cargada de la preparación, la cual ha sido ligada a antigenicidad incrementada, sin contribuir a su eficacia clínica. Adicionalmente, se sabe que la toxina botulina tipo B tiene, después de la inyección intramuscular, una duración de actividad más corta y es también menos potente -que la toxina botulina tipo A al mismo nivel de dosis. Estudios in vitro, han indicado que la toxina botulina inhibe la liberación inducida por los cationes -de potasio de acetilcolina y norepinefriña, a partir de cultivos de células primarias de tejido del tronco cerebral. Adicionalmente, se ha reportado que la toxina botulina inhibe la liberación evocada de tanto glicina como -glutamato en cultivos primarios de neuronas de la médula espinal y aquellas en la toxina botulina de preparaciones de sinaptosoma cerebral, inhiben la liberación de cada uno de los neurotransmisores acetilcolina, dopamina, norepinefriña, CGRP y glutamato. La toxina botulina tipo A cristalina de alta calidad, puede ser producida a partir de la cepa Hall A de Clostridiun? Jbotulinum, con características de >3 x 107 -U/mg, un A26o/A278 de menos de 0.60 y un patrón di-stinto de bandas -en la electroforesis en gel. El proceso conocido de Schantz, puede ser usado para obtener toxina botulina cristalina tipo A, como se expone en Schantz, E.J. et al., Properties and use of Botulinum toxin and Other Microbial Neurotoxins in Medicine, Microbiol Rev. 56:80-99 (1992). De manera general, el complejo de toxina botulina tipo A, puede ser aislado y purificado de una fermentación anaeróbica cultivando Clostridium botulinum tipo A, en un medio adecuado. La toxina sin refinar puede ser colectada por precipitación con ácido sulfúrico y concentrada por ultramicrofiltración. La purificación se puede llevar a cabo disolviendo el precipitado ácido en cloruro de calcio. La toxina puede entonces ser precipitada con etanol frío. Lo precipitado puede ser disuelto en amortiguador de fosfato de sodio y centrifugado. Después del secado, se puede obtener entonces, aproximadamente 900 kD de complejo de toxina botulina cristalina tipo A, con potencia específica de 3 x 107 LD50 U/mg o mayor. Este proceso conocido también se puede usar después de la separación de las proteínas no toxinas, para obtener toxinas botulinas puras, tales como por ejemplo: toxina botulina purificada tipo A, con un peso molecular de aproximadamente 150 kD con una potencia específica de 1-2 x 10B LD50 U/mg o mayor; l toxina botulina purificada tipo B, con un peso molecular de aproximadamente 156 kD con una potencia específica de 1-2 x 108 LD50 U/mg o mayor; y, la toxina botulina tipo F, -con un peso molecular de aproximadamente 155 kD con una potencia específica de 1-2 x 107 LDso U/mg o mayor. Las toxinas botulinas (la molécula de 150 kilodaltons) y los complejos de toxinas botulinas (300 kDa hasta 900 kDa) , se pueden obtener a partir de, por e emplo, List Biological Laboratories, Inc., Campbell, California; the Centre for Applied Microbiology and Rsearch, Portón Down, U.K.; Wako (Osaka, Japón), así como también de Sigma Chemicals de St Louis Missouri. La toxina botulina comercialmente disponible que contiene composiciones f rmacéuticas incluye, Botox® (Complejo de neurotoxina de toxina botulina tipo A con albúmina de suero humano y cloruro de sodio) , disponible -de Allergan, Inc., de Irvine, California en viales de 100 unidades como un polvo liofilizado, para ser reconstituido con 0.9% de cloruro de sodio antes del uso), Dysport® (Complejo de hemaglutinina de toxina botulina de Clostridium tipo ?, con albúmina de suero humano y lactosa en la formulación) disponible de Ipsen Limited, Berkshire, U.K., como un polvo para ser reconstituido con 0.9% de cloruro de sodio antes del uso) , y MyoBloc™ (una solución inyectable que comprende toxina botulina tipo B, albúmina de suero humano, succinato de sodio y cloruro de sodio, a aproximadamente pH 5.6, disponible de Elan Corporation, Dublin, Irlanda) . El éxito de la toxina botulina tipo A para tratar una variedad de condiciones clínicas, ha conducido a interés en otros serotipos de toxina botulina. De este modo, al menos toxinas botulinas tipos A, B, E y F, han sido usadas clínicamente en humanos. Adicionalmente, la toxina botulina pura (aproximadamente de 150 kDa) , ha sido usada para tratar humanos. Véase por -ejemplo, Kohl A., et al., Comparison of the effect -of botulinum toxin A {Botox (R) ) with the hi-ghly-purified neuro oxin (NT201) in the extensor digitorum brevis muscle test, Mov Disord 2000; 15 Suppl 3): 165. Por lo tanto, una composición farmacéutica puede ser preparada usando una toxina botulina pura (aproximadamente 150 kDa) . La toxina botulina tipo A, se conoce por ser soluble en soluciones acuosas dilatadas a pH 4-6.8. A pH arriba de aproximadamente 7, las proteínas no tóxicas estabilizantes se disocian de la neurotoxina, resultando en una pérdida gradual de toxicidad, particularmente conforme el pH y la temperatura se elevan. Schantz E. J., et al Preparation and characterization of botulinum toxin type A for human treatment (en particular páginas 44-45) , en el capítulo 3 de Jankovic, J. , et al, Therapy with Botulinum Toxin, Marcel Dekker, Inc (1994) . Como con las enzimas de manera general, las actividades biológicas de las toxinas botulina-s (las cuales son peptidasas intracelulares) son dependientes, al menos en parte, sobre su conformación tridimensional. De este modo, la toxina botulina tipo A es destoxificada por calor, varios químicos de estiramiento de superficie y secado de superficie. Adicionalmente, se sabe que la dilución del complejo de toxina obtenido por el cultivo, fermentación y purificación conocida a concentraciones de toxinas mucho muy inferiores usadas para formulación de la composición, resulta en rápida destoxificación -de la toxina, a menos que esté presente un agente de estabilización adecuado. La dilución de la toxina a partir de cantidades de un miligramo a una solución que contiene nanogramos por mililitro presente, significa dificultades, debido a la rápida pérdida de toxicidad específica sobre tal dilución mayor. Puesto que la toxina puede ser usada meses o años después que la composición farmacéutica que contiene toxina es formulada, la toxina puede ser estabilizada con un agente de estabilización tal como albúmina y gelatina. Se ha reportado que una toxina botulina ha si-do usada en varios establecimientos clínicos, incluyendo como sigue : (1) aproximadamente 75-125 unidades de BOTOX® por inyección intramuscular (músculos múltiples) para tratar distonia cervical; (2) 5-10 unidades de BOTOX® por · inyección intramuscular para tratar líneas glabelares (surcos de la frente) (5 unidades inyectadas intramuscularmente en el músculo proceroso y 10 unidades inyectadas intramuscularmente en cada músculo corrugador del supercílio) ; (3) aproximadamente 30-80 unidades de BOTOX® para tratar estreñimiento por inyección intraesfinter del músculo uborectal ; (4) aproximadamente 1-5 unidades por músculo de BOTOX® inyectado intramuscularmente para tratar blefaroespasmos inyectando el músculo orbicularis oculi pre-tarsal lateral del párpado superior y el orbicularis oculi pre-tarsal lateral del párpado inferior. para tratar estrabismo, los músculos extraoculares han sido inyectados intramuscularmente con entre aproximadamente 1-5 unidades de BOTOX®, la cantidad inyectada varía basada en el tamaño del músculo a ser inyectado y la extensión de la parálisis muscular deseada (es decir, la cantidad de corrección diópter deseada) . Para tratar espasticidad de la -extremidad superior después de apoplejía, por inyecciones intramusculares de BOTOX® en cinco diferentes músculos flexores de la extremidad superior, como sigue : (a) flexor común profundo de los dedos: 7.5 U hasta 30 U (b) flexor superficial de los dedos: 7.5U hasta 30U (c) cubital anterior: 10U hasta 0U (d) palmar mayor: 15U hasta €0U (e) bíceps braquial : 50U hasta 200U. Cada uno de los cinco músculos indicados ha sido inyectado en la misma sesión -de tratamiento, de manera que el paciente recibe desde 90U ¦hasta 360U de BOTOX® en el músculo flexor de la extremidad superior por inyección intramuscular en cada sesión de tratamiento. (7) para tratar la migraña, inyectada pericranealmente (inyectada simétricamente en músculos glabelares, frontales y temporales) , la inyección de 25U de BOTOX® ha mostrado beneficio significante como un tratamiento profiláctico de la migraña, comparado con el vehículo, medido por mediciones disminuidas de frecuencia de migraña, severidad máxima, asociada con vómito y uso de medicación aguda durante el periodo de tres meses después de la inyección de 25U. Se sabe que la toxina botulina tipo A, puede tener una eficacia por hasta 12 meses ( {European J. Neurology 6 (-Supp 4): S111-S1150.1999) , y en algunas circunstancias, tan larga como 27 meses. The Laryngoscope 109:1344-1346:1999. Sin embargo, la duración usual de una inyección intramuscular de Botox® es típicamente de aproximadamente 3 hasta 4 meses. Una toxina de botulina comercialmente disponible -que contiene composición farmacéutica, es vendida bajo la marca comercial BOTOX® (disponible de AlLergan, Inc., de Irvine, California) . El BOTOX® consiste de un complejo de toxina botulina purificada tipo A, albúmina de suero humano, y cloruro de sodio envasado en forma seca a vacio, estéril. La toxina botulina tipo A, es elaborada de un cultivo de la cepa Hall de Clostridium botulinum que crece en un medio que contiene amina N-Z y extracto de levadura. El complejo de toxina botulina tipo A, es purificado de la solución de cultivo por una serie de precipitaciones acidas de un complejo cristalino que consiste de la proteína toxina de alto peso molecular activa y una proteína hemaglutinina asociada. El complejo cristalino es re-disuelto en una solución que contiene salina y albúmina y es filtrado -estéril (0.2 micrones) , previo al secado a vacío. El BOTOX® puede ser reconstituido con salina no preservada, estéril, previo a la inyección intramuscular. Cada vial de BOTOX® contiene aproximadamente 100 unidades (U) de complejo de toxina Clostridium botulinum tipo A, 0.S miligramos de albúmina de suero humano y 0.9 miligramos de cloruro de sodio en una forma seca a vacío, estéril, sin un conservador. Para reconstituir BOTOX® secado a vacío se usa salina normal estéril sin un conservador (0.9% de inyección de cloruro de sodio) , retirando la cantidad apropiada de diluyente en la jeringa de tamaño apropiado. Puesto que el BOTOX® es desnaturalizado por burbujeado o agitación violenta similar, el diluyente es suavemente inyectado en el vial. Por razones de esterilidad, el BOTOX® debe ser administrado -dentro de cuatro horas después de la reconstitución. Durante este periodo de tiempo, el BOTOX® reconstituido es almacenado en un refrigerador (2°C hasta 8°C) . El BOTOX® reconstituido es transparente, incoloro y libre de materia particulada. El producto secado a vacio es almacenado en un congelador a, o por debajo de -5°C. En general, cuatro grupos fisiológicos de C. jbotulinujn son reconocidos (I, II, III y IV) . Los organismos capaces de producir una toxina serológicamente distinta, pueden llegar de más de un grupo fisiológico. Por ejemplo, las toxinas Tipo B y F, pueden ser producidas por cepas del Grupo I ó II. Además, se han identificado otras cepas de especies clostridiales (C. baratii, tipo F; C. butyricum, tipo E; C. novyi, tipo Ci ó D) , las cuales pueden producir neurotoxinas botulinicas. Los grupos fisiológicos de tipos Clostridium botulinum, se listan en la Tabla I. Tabla I. Grupos Fisiológicos de Clostridium botulinum
Grupo Tipo de DigesFermenLipasa Fagos y Clostridium Sero- Bioquímica tión de tación de plásmi- fenotípica- toxina leche glucosa dos mente relacionado (notoxigénico)
1 A,B,F proteolitica sacarolítica + + + + C. sporogenes
II BÍ.F no proteolitica sacarolítica - + + + psicotrófica III C,D no proteolitica sacarolítica + + + + C. novyi
IV G proteolitica no-sacarolírjca + - - - €. subtenrínale Estos tipos de toxinas pueden ser producidos por selección del grupo fisiológico apropiado de organismos de Clostridium botulinum. Los organismos designados como Grupo I, son usualmente referi-dos como proteolíticos y producen toxinas botulinas de tipos A, B y F. Los organismos designados como Grupo II son sacarolíticos y producen toxinas botulinas de tipos B, E y F. Los organismos designados como Grupo III producen solamente toxinas botulinas tipos C y D, y se distinguen de los organismos de los Grupos I y II por la producción de cantidades significantes de ácido propiónico. Los organismos del Grupo IV producen solamente neurofcoxinas de tipo G. Se conoce obtener una toxina tetánica usando medio específico sustancialmente libre de productos animales. Véase por ejemplo, Patente Estadounidense 6,558,926. Pero notablemente, aún el medio "libre de producto animal", descrito en este documento por esta patente, usa Bacto-peptona, un asimilador de carne) . Significantemente, la producción de toxinas tetánicas por Clostridum t tani contra la producción de una toxina botulina por una bacteria Clostridium botulinum, exige parámetros y consideraciones de crecimiento, medio y fermentación diferentes. Véase por ejemplo, Johnson, E. A., et al., Clostridium botulinum and its neurotoxins: a metabolic and cellular perspectiva, Toxicon 39 (2001), 1703-1722.
Lo que se necesita por lo tanto, son medios y procesos los cuales están libres o sustancialmente libres de productos animales, tales como proteínas, derivadas de animales, para obtener o producir biológicamente toxina botulina biológicamente activa. SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención cumple esta necesidad y proporciona medios y procesos los cuales están libres o sustancialmente libres de productos animales, tales como proteínas derivadas de animales, para obtener o producir una toxina botulina biológicamente activa. La toxina botulina obtenida puede ser usada para elaborar composiciones farmacéuticas con ingrediente activo de toxina botulina. Definiciones Como se usa en este documento, las palabras o términos expuestos abajo, tienen las siguientes definiciones. "Aproximadamente", significa que el punto, parámetro o término así calificado, abarca un intervalo de más o menos diez por ciento arriba y abajo del valor declarado en el punto, parámetro o término. "Administración" o "administrar", significa la etapa de dar (es decir, administrar) , una composición farmacéutica a un sujeto. Las composiciones farmacéuticas descritas en este documento, son "localmente administradas", por ejemplo, mediante rutas de administración intramuscular {i.m), intradérmica, administracion subcutánea, administración intratecal, intracraneal, administración intraperit-oneal (i.p.), tópica <transdérmica) e implantación (-es decir, de un dispositivo de liberación lenta, tal como un implante polimérico o bomba osmótica) . "Libre de producto animal" o "sustancialmente libre de producto animal", abarca respectivamente, "libre de proteina animal" o "sustancialmente libre de proteína animal" y significa la ausencia o sustancial ausencia de derivado de sangre, sangre combinada y otros productos o compuestos derivados de animales. "Animal" significa un mamífero (tal como un humano) , ave, reptil, pez, insecto, araña u otras especies animales. "Animal" excluye microorganismos, tal-es como bacterias. De este modo, un medio o proceso libre de producto animal o medio o proceso sustancialmente libre de producto animal, dentro del alcance de la invención, puede incluir una toxina botulina o una bacteria Clostridium botulinum. Por ejemplo, un proceso libre de producto animal o un proceso sustancialmente libre de producto animal, significa un proceso el cual es ya sea sustancialmente libre o esencialmente libre o completamente libre -de proteínas derivadas de animales, tales como inmunoglobulinas, asimiladores de carne, carne por productos y leche o productos lácteos o asimiladores. De -este modo, un ejemplo de un proceso libre de producto animal, es un proceso (tal como un cultivo de bacterias o proceso de fermentación bacteriana) , el cual excluye carne y productos lácteos -o carne o lácteos por productos . "Toxina botulina" , significa una neurotoxina producida por Clostridium botulinum, así como también una toxina botulina (o la -cadena ligera o la cadena pesada de la misma) , elaborada recombinantemente por especies no Clostridiales . La frase "toxina botulina" , como se usa en este documento, abarca los ser-otipos de toxina botulina A, B, C, D, E, F y G. La toxina botulina, como se usa -en este documento, también abarca tanto un complejo de toxina botulina (es decir, los complejos de 300, 600 900 kDa) , asi -como también la toxina botulina purificada (es decir, aproximadamente 150 kDa). "Toxina botulina purificada", es definida como una toxina botulina que es aislada, o sustancialmente aislada de otras proteínas , que incluyen proteínas que forman un complejo de toxina botulina. Una toxina botulina purificada puede -ser mayor de 95% pura, y preferiblemente es mayor del 99% pura. Las citotoxinas C2 y C3 de botulina, no son neurotoxinas, son excluidas del alcance de la presente invención. "Neurotoxina Clostridial" , significa una neurotoxina producida de, o nativa a, una bacteria Clostridial, tal como Clostridium botulinum, Clostridium butyricum o Clostridium beratti , así como también una neurotoxina Clostridial elaborada recombinantemente por especies no Clostridial-es .
"Completamente libre" (es decir, la terminología "que consiste de"), significa que dentro del intervalo de detección del instrumento o proceso a ser usado, la sustancia no puede ser detectada o su presencia no puede ser confirmada. "Esencialmente libre" (o "que consiste esencialmente de") , significa que solamente trazas de la sustancia se pueden detectar. "Inmovilizante" , significa una etapa que previene a un sujeto de mover una o más partes del cuerpo. Si un número suficiente de partes del cuerpo son inmovilizadas, el sujeto por consiguiente, será inmovilizado. De este modo, "inmovilizante", abarca la inmovilización de una parte del cuerpo, tal como una extremidad, y/o la -completa inmovilización de un sujeto. "Toxina botulina modificada" , significa una toxina botulina que ha tenido al menos, uno de sus aminoácidos suprimidos, modificados o reemplazados, comparados con una toxina botulina nativa. Adicionalmente, la toxina botulina modificada puede ser una neurotoxina recombinantemente producida, o un derivado o fragmento de una neurotoxina elaborada recombinantemente. Una toxina botulina modificada, retiene al menos una actividad biológica de la toxina botulina nativa, tal como, la capacidad para enlazarse a un receptor de toxina botulina, o la capacidad para inhibir la liberación del neurotransmisor a partir de una neurona. Un ejemplo de una toxina botulina modificada, es una toxina botulina que tiene una cadena ligera -de un serotipo de toxina botulina (tal como serotipo A) , y una -cadena pesada de un serotipo de toxina botulina diferente (tal como serotipo B) . Otro ejemplo de una toxina botulina modificada es una toxina botulina acoplada a un neurotransmisor, tal como la sustancia P. "Paciente", significa un sujeto humano -o no humano que recibe cuidados médicos o veterinarios. Por consiguiente, como se describe en este documento, las composiciones pueden ser usadas en el tratamiento de cualquier animal, tal -como mamíferos . "Composición farmacéutica" , significa una formulación en la cual un ingrediente activo -puede ser una toxina botulina. La palabra "formulación", significa que existe al menos un ingrediente adicional -en la composición farmacéutica además de un ingrediente activo neurotóxico. Una composición farmacéutica es por lo tanto, una formulación la cual es adecuada para diagnóstico o administración terapéutica (es decir, por inyección intramuscular o subcutánea o por inserción de un depósito o implante) a un sujeto, tal como un paciente humano. La composición farmacéutica puede estar: en una condición liofilizada o secada a vacío; una solución formada después de la reconstitución de la composición farmacéutica secada a vacío o liofilizada con salina o agua; o, como una solución la cual no requiere reconstitución. El ingrediente activo puede ser uno de los serotipos -de toxina botulina A, B, Ci, D, E, F o G, o una toxina -botulina, las cuales todas pueden ser elaboradas nativamente por la -bacteria Clostridial . Como se declaró, una composición farmacéutica puede ser líquida o sólida, por ejemplo, secada a vacio. Los ingredientes constituyentes de una composición farmacéutica pueden ser incluidos en una composición única (est-o es, todos los ingredientes constituyentes, excepto para algún fluido de reconstitución requerido, están presentes al tiempo de la formación de compuestos iniciales de la composición farmacéutica) , o como un sistema de dos componentes, por ejemplo, una composición secada a vacío, reconstituida con un diluyente tal como salina, en la cual, el diluyente contiene un ingrediente no presente en la formación de compuesto inicial de la composición farmacéutica. -Un sistema de dos componentes, proporciona el beneficio de permitir la incorporación de ingredientes, los cuales no son suficientemente compatibles para almacenamiento de anaquel de largo término, con el primer componente del sistema de dos componentes. Por ejemplo, el vehículo o diluyente de reconstitución puede incluir un conservador el cual proporciona suficiente protección contra el crecimiento microbiano por el periodo usado, por ejemplo, una semana de almacenamiento refrigerado, pero no está presente durante el periodo de almacenamiento en congelador por dos años, tiempo en el cual podría degradar la toxina. Otros ingredientes, los cuales no pueden ser -compatibles con una toxina Clostridial u otros ingredientes pueden ser incorporados de esta manera por periodos largos de tiempo; -esto es, se agregan en un segundo vehículo (es decir, en el fluido de reconstitución) en el tiempo aproximado de uso. Métodos para formular una composición farmacéutica -con ingrediente activo de toxina botulina, se describen en la Publicación de Patente Estadounidense 2003 0118598 Al. "Sustancialmente libre", significa presentar a un nivel de menos de uno por ciento en peso de la composición farmacéutica . "Formulación terapéutica", significa una formulación que puede ser usada para tratar y con ello, aliviar un trastorno o enfermedad, tal como un trastorno o una enfermedad caracterizada por hiperacti idad (es decir, espasticidad) de un músculo periférico. La presente invención proporciona medios los cuales comprenden al menos, niveles reducidos de derivados de animales o lácteos y están preferiblemente sustancialmente libres de derivados de animales o lácteos. "Derivados de animales o lácteos" , significa cualquier compuesto o combinación de compuestos los cuales fueron producidos en o por una célula animal (excluyendo una bacteria) , sea in vivo o in vitro. Fuentes no animales preferidas de ingredientes de medios tales como proteínas, aminoácidos y nitrógeno, incluyen vegetales, microbios (tales como levaduras) y compuestos sintéticos . La invención también proporciona métodos para obtener toxina botulina usando al menos, un medio que est sustancialmente libre de derivados animales lácteos. Por ejemplo, la toxina botulina se puede obtener cultivando Clostridium botulinum en un medio de fermentación, el cual está sustancialmente libre de productos animales. La invención también abarca una toxina botulina obtenida cultivando Clostridium botulinum en un medio de •fermentación sustancialmente libre de productos animales y el cual comprende productos derivados de vegetales. Adicionalmente, se puede obtener una toxina botulina cultivando Clostridium botulinum en un medio de fermentación, el cual está sustancialmente libre de productos animales y el cual comprende algunos productos a base de soya . En otra modalidad preferida, se puede obtener una toxina botulina cultivando Clostridium botulinum en un medio de fermentación sustancialmente libre de productos animales y que contiene soya hidrolizada, como un sustituto para productos derivados de animales. Preferiblemente, el crecimiento en un medio de fermentación procede hasta que ocurre al menos la lisis celular. La fuente de Clostridium botulinum usada para inoculación del medio de fermentación se puede obtener a partir de un medio de siembra ue contiene Clostridium botulinum. La Clostridium botulinum que crece en un medio de siembra y s-e usa como un inoculante para un medio de fermentación, no se ha sometido a lisis celular. La fuente de Clostridium botulinum usada para inoculación del medio de siembra, se puede obtener a partir de un cultivo liofilizado. La Clostridium botulinum puede ser liofilizada como un cultivo en leche animal o 1-eche de soya. Preferiblemente, la Clostridium jotulinum es liofilizada como un cultivo en leche de soya. La presente invención también proporciona una composición que comprende un medio sustancialmente libre -de productos derivados de animales para cultivar Clostridium botulinum. En una modalidad, la composición comprende un medio sustancialmente libre de productos derivados de animales, mientras contienen al menos un producto derivado de una fuente de animal, y también comprende una Clostridium botulinum. En otra modalidad, la composición comprende un medio sustancialmente libre de productos derivados de animales, mientras contiene al menos un producto derivado de un vegetal, y también comprende una Clostridium botulinum. Una modalidad final de la invención puede ser una composición la cual comprende un medio, el cual está sustancialmente libre de productos derivados de animales, mientras contiene al menos un producto derivado de soya, y también comprende una Clostridium botulinum. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se basa en el descubrimiento de medios y procesos, los cuales -están libres o sustancialmente libres de un producto animal o un derivado animal útil para cultivo y fermentación de un organismo (tal como una bacteria de Clostridium botulinum) , capaz de producir toxina botulina biológicamente activa. La toxina botulina obtenida se puede usar para elaborar composi-ci-ones farmacéuticas con ingrediente activo de toxina botulina. De este modo, el medio de crecimiento se describe en este documento, el cual tiene niveles significantemente reducidos de derivados cárnicos o lácteos y modalidades de medios preferidos están sustancialmente libres de tales productos animales . La presente invención abarca el sorprendente hallazgo de que los productos a base de animales no son requeridos en el medio de -crecimiento de Clostridium botulinum, y particularmente, que los productos a base de vegetales, pueden reemplazar los productos a base dé animales, empleando típicamente tal medio por el crecimiento de Clostridium botulinum. Los medios que están en uso actual para crecimiento y fermentación -de la -bacteria, usualmente comprenden uno -o más de los ingredientes derivados de animales . De conformidad con la invención, el medio preferido para crecimiento de Clostridium botulinum contiene ingredientes derivados -de animales, los cuales comprenden no más de aproximadamente cinco hasta aproximadamente diez por ciento del peso total del medio. Más preferiblemente, el medio dentro del alcance de la invención, comprende no más de aproximadamente uno a menos -de aproximadamente cinco por ciento del peso total del medio de productos derivados de animales. Más preferiblemente, todos los medios y cultivos usados para el crecimiento de Clostridium botulinum para la producción de toxina botulina, están completamente libres de productos derivados de animales. Estos medios incluyen, pero no se limitan a medios para fermentación a escala pequeña y grande de Clostridium botulinum, medios para crecimiento de -cultivos de Clostridium botulinum usados para inocular el medio de siembra (primero) y medio de fermentación (segundo) , así como también medio usado para almacenar a largo término, cultivos de Clostridium botulinum (por ejemplo, cultivos base) . En ciertas modalidades preferidas de la invención, el medio para el crecimiento de Clostridium botulinum y producción de toxina botulina, puede comprender productos a base de soya para reemplazar productos derivados de animales . Alternativamente, en lugar de productos a base de soya, se pueden usar semillas no amargas de Lupinus campestris. Se sabe que el -contenido de proteína de la semilla de L. campestris es muy similar a aquel de la semilla soya. Preferiblemente, este medio incluye productos derivados de semilla soya o L. campestris, que son hidrolizados y que son solubles en agua. Sin embargo, productos insolubles de soya o L. campestris, pueden también ser usados en la presente invención para reemplazar productos animales . Los productos derivados de animales comunes, los cuales pueden ser sustituidos por productos de soya o L. campestris, incluyen infusión de corazón de res (BHI) , productos de peptona derivada de animal, tales como Bacto-peptona, caseínas idrolizadas y derivados lácteos tales como leche animal . Los medios preferiblemente que contienen productos a base de soya o a base -de L. campestris, para el crecimiento de Clostridium bot linum, son similares a los medios de crecimiento comúnmente usados que contienen productos derivados de animales, excepto que sustancialmente todos los productos derivados de animales son reemplazados con productos derivados de vegetales. Por ejemplo, el medio de fermentación a base de soya puede comprender un producto a base de soya, una fuente de carbono tal como glucosa, sales tales como NaCl y KCl, ingredientes que contienen fosfato, tales como Na2HP04/ KH2P4, cationes divalentes tales como hierro y magnesio, polvo de hierro y aminoácidos tales como L-cisteína y L-tirosina. El medio usado para hacer crecer cultivos de Clostridium botulinum para inoculación (es decir, la siembra o primer medio) del medio de fermentación (segundo) , preferiblemente contienen al menos, un producto a base de soya, una fuente de sal tal como NaCl , y una fuente de carbono tal como glucosa . La presente invención proporciona un método para el crecimiento de Clostridium botulinum, que maximiza la producción de una toxina botulina usando medios que están sustancialmente libres de productos derivados de animales. El crecimiento para la producción de Clostridium botulinum y toxina botulina, puede tomar lugar por la fermentación en medios que contienen derivados de soya que reemplazan ingredientes derivados de subproductos animales. El inoculante para el medio de fermentación se puede derivar de un medio de crecimiento a escala más pequeño (un medio de siembra) . Dependiendo del tamaño y volumen de la etapa de fermentación, el número de crecimientos sucesivos en el medio de siembra para incrementar la biomasa del cultivo, puede variar. Para hacer crecer una cantidad adecuada de Clostridium botulinum para inocular el medio de fermentación, se puede realizar una etapa o etapas múltiples que involucran crecimiento en un medio de siembra. Para un método de crecimiento de Clostridium botulinum que está libre de productos derivados de animales, es preferible que el crecimiento -de Clostridium botulinum -se origine a partir de un cultivo almacenado en un medio derivado no de animal. El cultivo almacenado, preferiblemente liofilizado, es producido por crecimiento en medio que contiene proteínas derivadas de soya, y que carecen de derivados animales . El crecimiento de Clostridium botulinum en un medio de fermentación, puede tomar lugar inoculando directamente a partir de un cultivo liofilizado, cultivado. En una modalidad preferida de la presente invención, el crecimiento de Clostridium botulinum procede en dos fases de crecimiento de siembra y fermentación. Ambas fases se llevan a cabo en ambientes anaeróbicos . La fase de crecimiento de siembra es usada generalmente para "escalar", la cantidad de los microorganismos que forman un cultivo almacenado. El propósito de la fase de crecimiento de siembra, es incrementar la cantidad del microorganismo disponible para fermentación. Además, la fase de crecimiento de siembra permite a microbios relativamente dormantes en cultivos almacenados rejuvenecer y crecer en cultivos activamente en crecimiento. Además, el volumen y cantidad de los microorganismos disponibles usados para inocular el cultivo de fermentación, puede ser controlada más exactamente a partir -de un cultivo activamente en crecimiento, que de un cultivo almacenado. De este modo, se prefiere el crecimiento de un cultivo de siembra para inoculación del medio de fermentación. Además, -se puede usar cualquier número de etapas consecutivas que involucran crecimiento en medio de siembra para escalar la cantidad de Clostridium botulinum para inoculación del medio de fermentación. Se nota que el -crecimiento de Clostridium botulinum en la fase de fermentación puede proceder directamente a partir del medio de cultivo por inoculación directa. En la fase de fermentación, una porción de un medio de siembra o todo el medio de siembra que contiene Clostridium botulinum a partir del crecimiento de siembra, es usado para inocular un medio de fermentación. Preferiblemente, aproximadamente 2-4% del medio de siembra que tiene Clostridium botulinum a partir de la fase de crecimiento de siembra, se usa para inocular el medio de fermentación. La fermentación se usa para producir la cantidad máxima de microbio a gran escala en un ambiente anaeróbico (Ljungdahl et al . , Manual of industrial microbiology and biotechnology (1986) , edited by Demain et al, American Society for Microbiol-ogy, Washington, D. C. página 84) . Una toxina botulina puede ser aislada y purificada usando métodos de purificación de proteína, bien conocidos por aquellos de habilidad ordinaria -en la técnica de purifi-cación de proteína (Coligan et al. Current Protocols in Protein Science, Wiley £k Sons,- Ozutsumi et al. Appl . Environ. Microbiol. 49; 939-943:1985). Para la producción de toxina botulina, cultivos de Clostridium botulinum se pueden hacer crecer en un medio de siembra para inoculación del medio de fermentación. El número de etapas sucesivas que involucran el crecimiento en un medio de siembra puede variar, dependiendo de la escala de la producción de toxina botulina en la fase de fermentación. Sin embargo, como se discute previamente, el crecimiento en la fase de fermentación puede proceder directamente de la inoculación a partir de un cultivo almacenado. El medio de siembra a base de animal, generalmente está comprendido de BHI, bacto-peptona, NaCl, y glucosa para crecimiento de Clostridium botulinum. Como se discutió previamente, el medio de siembra alternativo, puede ser preparado de conformidad con la presente invención en el cual, los componentes basados en animal son sustituidos con componentes no basados en animal. Por ejemplo, pero sin limitación, productos a base de soya pueden sustituirse por BHI y bacto-peptona en el medio de siembra para crecimiento de Clostridium Jotulinum y producción de toxina botulina. Preferiblemente, el producto a base de soya es soluble en agua y comprende soya hidrolizada, aunque los cultivos de Clostridium Jotulijium pueden crecer en medio que contiene soya insoluble. Sin embargo, niveles de crecimiento y producción de toxina subsecuente, son mayores en medios derivados de productos de soya solubles . Cualquier fuente de productos a base de soya puede ser usada de conformidad con la presente invención. Preferiblemente, la soya es soya hidrolizada. Las fuentes de soya hidrolizada son disponibles de una variedad de vendedores comerciales. Estos incluyen pero no se limitan a Hy-Soy (Quest International) , Peptona de Soya (Gibco) Bac-soytone (Difco) , AMISOY (Quest), soya NZ (Quest), soya NZ BL4 , soya NZ BL7, SE50 (DMV International Nutritionals , Fraser, N. Y.), y SE50MK (DMV) . Más preferiblemente, la fuente -de soya hidrolizada es Hy-Soy o SE50MK. Se conocen otras fuentes potenciales de soya hidrolizada. Concentraciones de Hy-Soy en el medio de siembra de conformidad con la presente invención varían entre 25-5?0 g/L. Preferiblemente, la concentración de Hy-Soy .en el medio de siembra . varía entre 50-150 g/L. Más preferibl-emente, la concentración de Hy-Soy en el medio de siembra es aproximadamente 100 g/L. Además, la concentración de NaCl varía entre 0.1-2.0 g/L. Preferiblemente, la concentración de NaCl varía entre 0.2-1.0 g/L. Más preferiblemente, la concentración de NaCl en el medio de siembra es aproximadamente 0.5 g/L. La concentración de glucosa varía entre 0.1 g/L y 5.0 g/L. Preferiblemente, la -concentración de glucosa varía entre 0.5-2.0 g/L. Más preferiblemente, la concentración de glucosa en -el medio de siembra es aproximadamente 1.0 g/L. También se prefiere, pero no necesariamente para la presente invención, que la glucosa sea esterilizada sometiéndola a autoclave junto con los otros componentes del medio de siembra. El nivel de pH preferido del medio de siembra previo al crecimiento varía entre 7.5-8.5.
Más preferiblemente, el pH del medio de siembra previo al crecimiento de Clostridium botulinum es aproximadamente 8.1. El crecimiento de Clostridium botulinum en el medio de siembra, puede proceder en una o más etapas. Preferiblemente, el crecimiento en el medio de siembra procede en dos etapas. En la etapa uno, un cultivo de Clostridium botulinum se suspende en una cantidad de medio -de siembra e incuba a 34 + 1°C, por 24-48 horas en un ambiente anaeróbico. Preferiblemente, el crecimiento la etapa uno procede por aproximadamente 48 horas. En la etapa dos, una porción o todo el medio de la etapa uno que contiene Clostridium botulinum, es usado para inocular un medio de siembra de la etapa dos para crecimiento adicional. Después de la inoculación, el medio de la etapa dos es incubado a 34 + 1°C, por aproximadamente 1-4 días, también en un ambiente anaeróbico. Preferiblemente, el crecimiento en el medio de siembra de la etapa dos, procede por aproximadamente 3 días. También es preferible que el crecimiento en el medio de siembra en cualquier etapa, no resulte en lisis celular antes de la inoculación del medio de fermentación con el crecimiento final en el medio de siembra. El medio de fermentación estándar que contiene derivados de animales para el crecimiento de Clostridium botulinum, se pude basar en un recipiente de Mueller y Miller (MM; J. Bacteriol . 67:271, 1954). Los ingredientes en el medio MM que contiene derivados animales, incluyen BHI y NZ-CaseTT. La NZ-CaseTT es una fuente de péptidos y aminoácidos comercialmente disponibles, los cuales se derivan de la digestión enzimática de caseínas, un grupo de proteínas encontradas en la leche animal . La presente invención demuestra que productos no a base de animales, pueden ser sustituidos por BHI y NZ-CaseTT en el medio de fermentación. Por ejemplo, pero sin limitación, los productos a base de soya pueden reemplazar los componentes a base de animales del medio MM usado para fermentación de Clostridium botulinum. Preferiblemente, los productos a base de soya son solubles en agua y derivados de soya hidrolizada, aunque como se discute previamente, los productos de soya insolubles pueden también ser usados para practicar la presente invención. Cualquier fuente de productos a base de soya puede ser usada de conformidad con la presente invención. Preferiblemente, la soya hidrolizada se obtiene de -Quest International (Sheffield) bajo el nombre comercial Hy-Soy o de DMV International Nutritionals (Frase, NY) bajo el nombre comercial SE50MK. Los productos de soya solubles, también se pueden obtener a partir de una variedad de fuentes que incluyen pero no se limitan a, Peptona de soya (Gibco) Bac-soytone (Difco) , AMISOY {Quest) , soya NZ (Quest) , soya NZ BL4, soya NZ BL7, y SE50MK (DMV International Nutritionals, Fraser, N. Y. ) .
En otra modalidad preferida de la presente invención, el medio usado para fermentación de Clostridium botulinum está libre de derivados de animales y comprende, soya hidrolizada, glucosa, NaCl, Na2HP04, MgS047H20, H2P0 , L-cisteína, L-tirosina y hierro en polvo. Como se describe para el medio de siembra, la soya hidrolizada puede reemplazar derivados de animales en el medio de fermentación. Estos derivados de animales incluyen BHI y NZ-CaseTT (caseína digerida enzimáticamente) . La concentración de Hy-Soy -en el medio de fermentación para producción de toxina botulina, preferiblemente varía entre aproximadamente 10-1?0 g/L. Preferiblemente, la concentración de Hy-"Soy varía entre aproximadamente 20-60 g/L. Más preferiblemente, la concentración de Hy-Soy en el medio de fermentación es aproximadamente 35 g/L. Para producción máxima de toxina botulina, las concentraciones particularmente preferidas de componentes en el medio de fermentación son aproximadamente 7.5 g/L de glucosa; 5.0 g/L de NaCl; 0.5 g/L de Na2HP04; 175 mg/L de KH2P04; 50 mg/L de MgS047H20; 125 mg/L de L-cisteína; y 125 mg/L de L-tirosina. La cantidad de hierro en polvo usada puede variar desde 50 mg/mL hasta 2000 mg/L. Preferiblemente, la cantidad de hierro en polvo varía entre aproximadamente 100 mg/L y 1000 mg/L. Más preferiblemente, la cantidad de hierro en polvo usada en el medio de fermentación varía entre aproximadamente 200 mg/L y 600 mg/L. Para niveles óptimos de producción de toxina, el pH inicial (antes de someterlo a autoclave) , del medio de fermentación a base de soya, preferiblemente varia entre aproximadamente 5.5 hasta 7.1. Preferiblemente, el pH inicial del medio de fermentación está entre aproximadamente .0 hasta 6.2. Como se describe para el medio de siembra, los componentes del medio de fermentación, que incluyen glucosa y hierro, son preferiblemente sometidos a autoclave juntos para esterilización. Preferiblemente, una porción del medio de siembra de la segunda etapa, usado para crecimiento de Clostridium botulinum, es usado para inocular el medio de fermentación. La fermentación ocurre en una cámara anaeróbica a aproximadamente 34 + 1°C, por aproximadamente 7 a 9 días. El crecimiento es monitoreado midiendo la densidad óptica (O.D) del medio. La fermentación es detenida preferiblemente después que ha procedido la lisis celular por al menos, 48 horas como se determina por la medición de crecimiento (densidad óptica) . Como la lisis celular, la O.D. del medio disminuirá. En una modalidad preferida de la presente invención, cultivos de Clostridium botulinum usados para almacenaje de largo término de Clostridium botulinum e inoculación del medio de siembra, se hacen crecer y liofilizan en leche de soya, previo al almacenamiento a 4°C. Los cultivos de -Clostridium botulinum en leche animal liofilizada para almacenamiento, pueden también ser usados para la producción de toxina botulina. Sin embargo, para mantener el medio que está sustancialmente libre de derivados animales a través de la producción de toxina botulina, se prefiere que el cultivo inicial de Clostridium botulinum sea preservado en leche -de soya y no en leche animal . EJEMPLOS Los siguientes ejemplos exponen métodos específicos abarcados por la presente invención, y no están propuestos para limitar el ámbito de la invención. Se pueden obtener cultivos de Clostridium botulinum de varias fuentes, que incluyen List Laboratories, Campbell, California. Todos los experimentos y medios pueden ser preparados con agua doblemente destilada. En todos los ejemplos siguientes, "Clostridium botulinum" significa la cepa Hall A (ATCC número de designación 3502) de Clostridium botulinum tipo A. Ejemplo 1 Preparación de un Medio de siembra Libre de Producto Animal de ClOstridium botulinum Se puede preparar un medio de siembra de control, usando los siguientes ingredientes para cada 1 litro de medio:
NaCl (5 g) , Bacto-peptona (10 g) , glucosa (10 g) , BHI (hasta 1 litro) , pH 8.1 (ajustado con NaOH 5N) : "Se puede preparar un medio de -siembra de prueba (libre de producto animal) , usando los siguientes ingredientes para cada 1 litro de medio: NaCl (5 g) , Peptona de soya (10 g) , glucosa (10 g) , Hy-Soy (35 g/litro, para elaborar hasta 1 litro de fluido de medio) , pH 8.1 (ajustado con NaOH 5N) . Ejemplo 2 Cultivar Clostridium botulinum en un Medio de siembra Libre de Producto Animal Se puede suspender un cultivo liofilizado de Clostridium botulinum en 1 mi de cada uno de medio de siembra de prueba y de control del Ejemplo 1, dividido (cada medio de siembra) en dos tubos cada uno de l-os cuales puede contener 10 mi de medio de siembra respectivo, y después se incuba a 34°C, por aproximadamente 24-48 horas. Un mi de cultivo puede entonces ser usado para inocular un Matraz de Cultivo DeLong Bélico de 125 mi que contiene 40 mi (respectivo) de medio de siembra. El cultivo inoculado puede ser incubado a 33 °C + 1°C por 24 horas, en una Cámara Anaeróbica Coy (Coy Laboratory Products Inc., Grass Lake, Mich.). Ejemplo 3 Preparación de un Medio de Fermentación Libre de Producto Animal de Clostridium botulinum Se puede preparar un medio de fermentación basal usando los siguientes ingredientes para cada dos litros de medio: glucosa (15 g) , NaCl (10 g) , NaH2P04 (1 g) , KH2P04, (0.350 g) , -MgS047H20 (0.1 g) , ciste£na-HC (0.250 g) , tirosina-HC1 (?.250 g) , hierro en polvo (1 g) , ZnCl2 (0.250 g) , y MnCl2 (0.4 g) . Se puede preparar un medio de fermentación de control usando los siguientes ingredientes para cada dos litros de medio preparados: BHI (500 mi; esto corresponde a aproximadamente 45.5 gramos de infusión de -corazón de res en peso seco) , NZ-CaseTT {30 g) , y medio basal (a 2 litros) , pH 6.8. El medio de fermentación basal puede ser preparado primero y ajustado a pH 6.8. La infusión de corazón de res (BHI) BHI, puede entonces ser preparada y ajustada a .8 con NaOH 5N. La HBI puede entonces ser agregada al medio basal. Después, se puede preparar NZ-CaseTT. El NZ-CaseTT es agregado, entonces al medio basal al cual la infusión de corazón de res ya ha sido agregada, y disuelta por adición de HCl . El pH pueden entonces ser ajustado a 6.8 con NaOH 5N. Este medio puede entonces ser separado en porciones 5e ß mi en cada uno de los dieciséis tubos de prueba de 100 mm, segui-do por sometimiento a autoclave por 25 minutos a 120°C. Un medio de fermentación de prueba (libre de producto animal) , puede ser preparado sustituyendo una fuente de nitrógeno de prueba por la BHI presente en el medio de fermentación de control. Las fuentes de nitrógeno del medio de fermentación de prueba adecuado incluyen: Hy-Soy (Quest) , ? ?-Soy (Quest), Soya NZ (Quest), Soya NZ BL4 {-Quest) , Soya NZ BL7 (Quest) , Sheftone D (Sheffield) , SE50 (DMV) , SE50 (DMV) , SE%) MK (DMV) , Peptona de Soya (Gibco) , Bacto-Soyton (Difco) , Nutrisoy 2207 (ADM) , Bakes Nutrisoy <ADM) harina Nutrisoy, harina de Soya, Extracto de levadura Bacto (Difco) Extracto de Levadura (Gibco) , Hy-Yest 412 (Quest) , Hy-Yest 441 (Quest) , Hy-Yest 444 (Quest) , Hy- Yest (455 (Quest) Extracto de Malta Bacto (Difco) , Maíz Escarpado, y Proflo (Traders) . El medio de fermentación de prueba puede ser preparado como se expone anteriormente para un medio de fermentación de control, excepto que la BHI es excluida y la fuente de nitrógeno relevante puede ser ajustada primero a pH 6.8 con HC1 3N o con NaOH 5N. El medio puede ser asignado -en porciones de 8 mi en dieciséis tubos de prueba de 100 mra, seguidos por sometimiento a autoclave por 20-30 minutos a 120°C. Ejemplo 4 Crecimiento de Clostridium botulinum en un Medio de Fermentación Libre de Producto Animal Una porción de 40 µ? del cultivo de medio de siembra de prueba (libre de producto animal) , puede ser usada para inocular cada alícuota de 8 mi del medio de fermentación de prueba o de control, en un tubo de prueba de 8 mi 16 x 100 mm. Los cultivos pueden entonces ser incubados a 33 + 1°C, por 24 horas . Los tubos entonces pueden ser incubados en una -cámara 4€
anaeróbica para permitir el crecimiento de la bacteria. Cada ensayo de medio puede ser realizado por triplicado (es decir, puede involucrar tres inoculaciones independientes del mismo medio) , y puede también incluir un control no inoculado, el cual puede ser usado como el blanco para el espectrofotómetro) . El crecimiento (determinado por densidad óptica, OD) , puede ser medido cada 24 horas con un Espectrofotómetro Turner (Modelo 330) a 660 nm. El cultivo debe ser detenido después que la lisis celular ha durado aproximadamente 48 horas y entonces puede ser medida la producción de toxina botulina. Se pueden llevar a cabo experimentos adicionales con un medio de fermentación Hy-Soy que contiene los siguientes ingredientes para cada 500 mi del medio: Hy-Soy (17.5 g) , glucosa (3.75 g) ; NaCl (2.5 g) ; a2HP04 (0.25 g) , MgSO47H20 (0.025 g) , KH2P04 (0.0875 g) , L-cisteína (0.0625 g) , L-tirosina (0.0625 g) , hierro en polvo (0.25 g) , pH 6.8. Ejemplo 5 Determinación de Producción de Toxina Botulina por .crecimiento de Clostridium botulinum en un Medio de Fermentación Libre de Producto Animal Las -células cultivadas del Ejemplo 4 pueden ser centrifugadas, y el pH del sobrenadante entonces determinado. Se pueden medir los niveles de toxina botulina en una muestra dada, agregando una antitoxina estándar y midiendo el tiempo transcurrido antes de la floculación. Se puede determinar tanto el Kf (el tiempo requerido para -que la floculación ocurra, en minutos) como el Lf (el límite de floculación; equivalente a 1 unidad internacional de antitoxina estándar, como se establece por la floculación) . 4 mi de caldo de fermentación pueden ser tomados de cada tubo de fermentación para un cultivo dado, y se pueden combinar juntos, de manera que un total de 12 mi pueden ser mezclados en un tuvo centrífugo de 15 mi. Los tubos son entonces centrifugados a 5000 rpm (3400 g) por 30 minutos a 4°C. Se puede agregar 1 mi de alícuotas de sobrenadante a los tubos que -contienen 0.1-0.6 mi de antisuero de toxina botulina estándar, y los tubos pueden ser cuidadosamente sacudidos para mezclar sus contenidos . Los tubos pueden entonces ser colocados en un baño maría a 45 + Í°C, y se puede registrar el tiempo inicial. Los tubos pueden ser verificados f ecuentemente, y el tiempo al cual comienza la floculación, puede ser registrado como Kf . La concentración de toxina en el tubo en el cual la floculación puede ser iniciada primero, puede ser designada LfFF. La concentración de toxina en el tubo en el ual la segunda floculación puede ser iniciada, puede ser designada LfF. Se pueden llevar a cabo ensayos paralelos de producción de toxina, fermentación y crecimiento, para tanto: (a) el medio de control de siembra (usado para inocular el medio de fermentación de control) , como el medio de fermentación de control, y; (2) el medio de siembra de prueba (libre de producto animal) (usado para inocular el medio de fermentación de prueba) y el medio de fermentación de prueba (libre de producto animal) . Significantemente, se puede determinar que la fermentación de Clostridium botulinum en medio libre de productos animales e inoculada de cultivos también libres de productos animales (oon productos a base de soya y que reemplazan los productos animales) , puede resultar en un Lftoxina de aproximadamente 50 o más. Mínimamente, Lftoxina se iguala a aproximadamente 10. Preferiblemente, la Lft0xina es al menos 20. Más preferiblemente, la Lftoxina es mayor de 50. Adicionalmente, se puede determinar que varios productos de soya, soportan el crecimiento de Clostridium botulinum en medio de fermentación que carece de BHI . De este modo, las preparaciones de soya solubles, pueden reemplazar la HBHI para crecimiento de Clostridium botulinum. La mejor concentración puede ser 12.5 ó 25 g/L. La Hy-Soy (Sheffield) , puede dar el crecimiento más alto. Las preparaciones de soya insolubles, puede ser menos efectivas. Además, se pueden obtener resultados por mostrar que
Hy-Soy de Quest, SE50MK de DMV, y soya NZ de Quest, pueden ser productos de soya efectivos en términos de su capacidad para reemplazar la BHI para crecimiento de Clostridium botulinum. Los resultados pueden revelar que los productos de soya (tales -como Hy-Soy -de -Quest, SE50MK de DMV y Soya NZ de Quest), que pueden ser óptimos para el crecimiento, pueden ser efectivos también reemplazando la BHI para la producción de toxina. La mejor producción de soya para la producción de toxina puede ser Hy-Soy de Quest a 22.75 g/1. Concentraciones superiores de este producto pueden producir mejor crecimiento, pero no mejoran la producción de toxina. Resultados similares pueden, si se propone, obtenerse con SE50 K, para el cual una concentración superior puede generar crecimiento incrementado, pero no incremento en la producción de toxina. La Soya NZ por otro lado, puede dar crecimiento superior y producción de toxina superior en su concentración más alta . Finalmente, se puede determinar que los productos de soya pueden reemplazar efectivamente la BHI, así como también la NZ-CaseTT. La remoción de NZ-Case-TT de medio a base de soya, puede reducir el crecimiento de aproximadamente 2-4 veces. El mejor producto de soya para el crecimiento tanto en la presencia como ausencia de NZ-CaseTT, puede ser SE50M . La Hy-Soy puede reemplazar tanto BHI como NZ-CaseTT para la producción de toxina. Sin embargo, puede ser necesario un ciclo de fermentación más largo de 1 ó 2 días. La Hy-Soy podría reemplazar tanto la BHI como NZ-CaseTT en medio para la producción de toxina. Sin embargo, se puede determinar que los extractos de levadura pueden ser inhibitorios para la producción de toxina. Se puede determinar que Hy-Soy a 22.75 g/1, puede reemplazar completamente tanto BHI como HY-CaseTT para la producción de toxina. Distinto el efecto en el crecimiento en donde puede ser mejor 56.88 g/l de Hy-Soy, 34.13 g/l -de Hy-Soy pueden ser mejor para la fase de producción de toxina. De este modo, se ha determinado de manera sorprendente, si Hy-Soy o [Hy-Soy+Hy-Yest] , pueden reemplazar a BHI y Bacto-peptona en medio para crecimiento de la siembra de Clostridium botulinum. Además, se pueden diseñar experimentos para determinar las concentraciones óptimas de componentes en el medio de siembra para producir los niveles máximos de producción de toxina botulina por Clostridium botulinum. La producción de toxina por Clostridium botulinum que crece en medio de siembra y medio de fermentación que está libre de BHI y ZN-CaseTT, puede alcanzar o exceder niveles logrados en medio que -contiene BHI y NZ-CaseTT. Se pueden determinar las concentraciones óptimas de Hy-Soy o [Hy-Soy+Hy-Yest] para crecimiento en el medio de siembra. Experimentos pueden confirmar que Hy-Soy puede reemplazar la BHI y Bacto-peptona como la fuente de nitrógeno en el medio de siembra, para el crecimiento de Clostridium botulinum y para la producción de toxina botulina en la fase de fermentación subsecuente. También, Hy-Soy como la fuente -de nitrógeno en el medio de siembra, comparada con Hy-Soy más Hy-Yest, puede producir niveles superiores de toxina botulina en la etapa de fermentación subsecuente. Las concentraciones de Hy-Soy en el medio de siembra que producen los niveles más altos de toxina, varían desde aproximadamente 62.5 g/L hasta 100 g/L. Experimentos adicionales se diseñan para determinar las concentraciones óptimas de Hy-Soy en el medio de siembra para la producción máxima de toxina botulina por Clostridium botulinum por fermentación. De este modo, 30 g, 50 g, 75 g y 100 g de Hy-Soy en el medio de siembra, pueden resultar -en la producción de toxina botulina por fermentación de Clostridium jbotulinum y de este modo, es comparable o excede los niveles de toxina botulina elaborados en el medio de siembra que contiene BHI y Bacto-peptona como una fuente de nitrógeno. Se puede .encontrar que una concentración de 100 g/L de Hy-Soy en el medio de siembra, resulta -en niveles más altos de producción de toxina en la etapa de fermentación subsecuente. Además, los datos indican que la etapa-1 de siembra del medio de siembra Hy-Soy, produce mayor crecimiento después de 48 horas que después de 24 horas. Varias publicaciones, patentes y/o referencias, han sido citadas en este documento, contenidos de las cuales en su totalidad, están incorporados en este documento por referencia . Aunque la presente invención ha sido descrita en detalle con respecto a ciertos métodos preferidos, son posibles otras modalidades, versiones y modificaciones dentro del alcance de la presente invención. Por ejemplo, una amplia variedad de procesos libres de producto animal están dentro del alcance de la presente invención. Por consiguiente, el alcance y ámbito de las siguientes reivindicaciones no debe ser limitado a las descripciones de las modalidades preferidas como se expone abajo . Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.