MXPA06002459A

MXPA06002459A - Vacuna.

Info

Publication number: MXPA06002459A
Application number: MXPA06002459A
Authority: MX
Inventors: Beatrice Arsene Virginie D Vos
Original assignee: Glaxosmithkline Biolog Sa
Priority date: 2003-09-02
Filing date: 2004-08-31
Publication date: 2006-06-20
Also published as: EP1660123B1; CA2536734A1; NZ545639A; BRPI0414073A; PL2272532T3; RU2368392C2; EP2272532B1; EP2272532A2; IL173921A0; NO20060976L; WO2005021033A3; RU2006106427A; WO2005021033A2; JP2007516215A; JP5588586B2; PL1660123T3; NO342397B1; IS8325A; EP2272532A3; HRP20160299T1

Abstract

La presente invencion proporciona un metodo para inducir una respuesta inmune contra una infeccion por rotavirus mediante un serotipo de rotavirus, comprendiendo el metodo, la administracion a un sujeto de una composicion que comprende una vacuna de rotavirus atenuado de un serotipo deferente.

Description

VACUNA Campo de la Invención Esta invención se refiere a las formulaciones de la vacuna del rotavirus. La presente invención se refiere al uso de una población de rotavirus atenuado de un serotipo de rotavirus en la prevención de las enfermedades asociadas con la infección por rotavirus de otros serotipos de rotavirus. En particular, la presente invención se refiere al uso de una población de rotavirus atenuado del serotipo G1 en la prevención de enfermedades asociadas con la infección por rotavirus de serotipos que no son G1. Antecedentes de la Invención La diarrea infecciosa aguda es la causa principal de enfermedades y muerte en muchas áreas del mundo. En los países en desarrollo, el impacto de la enfermedad diarreíca es desbastador. Para Asia, África y América Latina, se ha estimado que existen entre 3 y 4 billones de casos de diarrea cada año y de esos casos aproximadamente de 5 a 10 millones resultan en la muerte (Walsh, J.A. et al.: N. Engl. J. Med., 301: páginas 967 a 974 (1979)). Se ha reconocido el rotavirus como una de las causas más importantes de la diarrea severa en los bebes y niños chicos (Estes, M.K. "Rotavirus y su Duplicación en la Virología de los Campos" (Rotaviruses and Their Replication in Fields Virology), Tercera Edición, editado por Fields et al., Raven Publishers, Philadelphia, 1996). Se estima que la enfermedad por el rotavirus es responsable de más de un millón de muertes anualmente. La enfermedad inducida por el rotavirus afecta más generalmente a niños entre 6 y 24 meses de edad y la prevalencia pico de la enfermedad, generalmente ocurre durante los meses más fríos en climas templados, y durante el año en las áreas tropicales. El rotavirus es generalmente transmitido de persona a persona, por ruta oral-fecal con un período de incubación desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 3 días. A diferencia de la infección en el grupo de edad de 6 meses a 24 meses, los neonatos generalmente son asintomáticos o tienen solamente una enfermedad ligera. En contraste con la enfermedad severa que se encuentra generalmente en los niños chicos, la mayor parte de los adultos son protegidos como un resultado de una infección previa por rotavirus, de modo que la mayor parte de las infecciones de los adultos son suaves o asintomáticas (Offit, P.A. et al. Comp. Ther., 8(8): páginas 21 a 26, 1982). El rotavirus es generalmente esférico y su nombre se deriva de su estructura del cápsido con caparazón doble o exterior e interior. Generalmente, la estructura del cápsido con caparazón doble del rotavirus rodea la caparazón o núcleo de la proteína interior que contiene el genoma. El genoma de un rotavirus está compuesto en 11 segmentos de ARN de hilo doble, el cual codifica por lo menos 11 proteínas virales diferentes. Dos de estas proteínas virales designadas como VP4 y VP7 están acomodadas en el exterior de la estructura del cápsido de caparazón doble. El cápsido interior del rotavirus presenta una proteína, la cual es la proteína del rotavirus designada como VP6. La importancia relativa de estas tres proteínas particulares del rotavirus en promover la respuesta inmune que sigue de la infección por el rotavirus, todavía no es clara. Sin embargo, la proteína VP6 determina el grupo o subgrupo del antígeno, y las proteínas VP4 y VP7 son los determinantes de la especificidad del serotipo. Hasta la fecha, han sido identificados por lo menos 14 serotipos G del rotavirus, y 11 serotipos P del rotavirus (Linhares A.C. & Bresse J.S., Pan. Am. J. Publ. Health 2000, 9, páginas 305 a 330). Entre estos, han sido identificados entre el rotavirus humano 10 serotipos G y 6 serotipos P. La proteína VP7 es una glicoproteína con un peso molecular de 38,000 (PM 34,000 cuando no está glicosilado) el cual es el producto de la traducción del segmento genómico 7, 8 ó 9, dependiendo de la cepa. Esta proteína estimula la formación de un anticuerpo neutralizante después de la infección por rotavirus. La proteína VP4 es una proteína no glicosilada de un PM de aproximadamente 88,000 el cual es el producto de la traducción del segmento genómico 4. Esta proteína también estimula el anticuerpo neutralizante después de la infección por rotavirus.

Debido a que las proteínas VP4 y VP7 son las proteínas virales contra las cuales están dirigidos los anticuerpos neutralizantes, se considera que son los candidatos principales para el desarrollo de vacunas para el rotavirus, brindando protección contra la enfermedad por rotavirus. Es sabido que la infección natural por el rotavirus durante la infancia temprana promueve la inmunidad protectora. Por lo tanto, es altamente deseable una vacuna de rotavirus vivo atenuado. De preferencia, esta debe de ser una vacuna oral, ya que esta es la ruta natural de la infección del virus. El desarrollo temprano de la vacuna para evitar las infecciones por el rotavirus comenzó en la década de 1970 después del descubrimiento del virus. Inicialmente, las cepas atenuadas de animales y humanos fueron estudiadas y tuvieron resultados mezclados o decepcionantes. Los esfuerzos que ha tenido más éxito más recientes, se han enfocado en el virus humano-animal. Una cepa del rotavirus conocida como la 89-12 ha sido descrita por Ward; ver la Patente Norteamericana No. 5,474,773 y la publicación de Bernstein, D.L. et al, en Vaccine, 16 (4), páginas 381 a 387, 1998. La cepa 89-12 fue aislada de una muestra de deposición recolectada de un niño de 14 meses de edad con la enfermedad natural por rotavirus en 1988. De acuerdo con la Patente Norteamericana No. ,474,773, el rotavirus humano HRV 89-12 fue entonces adaptado en los cultivos mediante 2 pasos en las células de Riñon del Mono Verde Africano (AGMK) y 4 pasos en las células MA-104 como lo describe Ward en su publicación de J. Clin. Microbiol., 19, páginas 748 a 753, 1984. Entonces fue purificada la placa 3 veces en células MA-104 (hasta el paso 9) y cultivada después de 2 pasos adicionales en estas células. Se hizo un paso adicional (paso 12) de la deposición con un ATCC bajo el número de acceso ATCC VR 2272. La cepa depositada es conocida como 89-12C2. El documento 1998 en la Vacuna de Bernstein et al, es al que nos referimos más adelante como la Vacuna (1998). El documento describe la seguridad e inmunogenicidad de los candidatos de vacuna de rotavirus vivos humano administrados oralmente. Esta vacuna fue obtenida de la cepa 89-12 atenuada pasándola sin purificación de placa 26 veces en las células AGMK primarias y luego otras 7 veces en una línea celular AGMK establecida (33 pasos en total). En lo sucesivo, el material anteriormente mencionado el cual había sido pasado en serie 26 veces, es al que nos referimos como P26 y el material el cual ha sido pasado en serie 33 veces será al que nos referiremos como P33. En general, el rotavirus derivado pasando de 89-12 veces es al que nos referiremos como Pn. En los ejemplos siguientes, el material P33 fue pasado 5 veces adicionales en células Vero. A este nos referimos como el P38. Los aislados P26 y P33 descritos en el documento de la Vacuna (1998) no fueron depositados en una colección de cultivos, ni fueron analizados para establecer su caracterización genética. Se ha descubierto que la población P26 descrita en la literatura comprende una mezcla de variantes. Esta ha sido establecida por la caracterización genética, tal y como se describe más adelante (ver los ejemplos). Por lo tanto, la P26 no es una población confiablemente consistente para los pasos adicionales, en particular, para la producción de lotes de vacuna. De un modo similar, el P33 comprende una mezcla de variantes y no es consistente confiablemente para la producción de lotes de vacunas. Se ha descubierto que el material P26 es una mezcla de por lo menos tres variantes del gen VP4. El P33 y el P38 son de un modo similares a una mezcla de dos variantes. Estas variantes parecen ser antigénicamente diferentes, en términos de los epítopes neutralizantes, para la cepa 89-12C2 depositados en la ATCC cuando se evalúan los títulos del anticuerpo neutralizante del suero proveniente de niños vacunados con P33 contra estas variantes. Además se ha descubierto que cuando el material P33 es administrado en los niños, se duplican y excretan dos variantes identificadas. De los 100 niños vacunados, solamente 2 mostraron signos de gastroenteritis debido a la infección por rotavirus, mientras que el 20% de un grupo de placebo fue infectado. Estos descubrimientos sugieren que las variantes identificadas están asociadas con la protección de la enfermedad del rotavirus. El Documento WO 0112797 describe un método para separar las variantes de rotavirus y una vacuna de rotavirus atenuado vivo mejorada derivada de una cepa de rotavirus humano clonada (homogénea). También se describe una población de rotavirus atenuada (aislado), caracterizada en que comprende una sola variante o substancialmente una sola variante, siendo definida dicha variante por la secuencia de nucleótidos que codifican por lo menos una de las proteínas principales del virus designada como VP4 y VP7. La eficacia protectora de dicha vacuna de rotavirus humano atenuado oral contra la cepa heterológa G9 ha sido reportado, en los niños de América Latina (Pérez et al., 42a Conferencia Interciencia sobre Agentes Antimicrobianos y Quimioterapia (ICAAC 2002), del 27 al 30 de Septiembre, 2002, en San Diego, California). A la presente descripción se incorpora como referencia el contenido del documento WO0112797 en su totalidad. Breve Descripción de los Dibujos La figura 1 es la secuencia de nucleótidos que codifican la proteína VP4 del P43. La figura 2 es la secuencia de nucleótidos que codifican la proteína VP7 del P43. Descripción Detallada de la Invención En la presente invención hemos determinado que una población de rotavirus atenuada caracterizada en que comprende una sola variante o substancialmente una sola variante y dicha variante definida por una secuencia de nucleótidos que codifican por lo menos una de las proteínas principales del virus designada como VP4 y VP7, puede ser utilizada como una vacuna para proporcionar una protección cruzada contra la enfermedad ocasionada por la infección por rotavirus de un serotipo diferente al utilizado en la vacuna. En particular, el uso de la población de rotavirus G1 [por ejemplo, como está depositado en la Colección Europea de Cultivos de Células de Animales (ECACC), Laboratorio de Producción e Investigación de Vacunas, Servicio de Laboratorio de Salud Pública, Centro de Microbiología e Investigación Aplicada, Portón Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 OJG, Reino Unido, en Agosto 13, 1999, bajo el número de depósito 99081301, bajo los términos del Tratado de Budapest], puede ser utilizada para prevenir la enfermedad ocasionada por ambos serotipos de rotavirus el G1 y por lo menos uno que no es G1, tales como los serotipos del rotavirus G2, G3, G4 y G9.

Por consiguiente, la presente invención se refiere al uso de una población de rotavirus atenuada de un serotipo del rotavirus en la prevención de la enfermedad asociada con la infección por rotavirus de otros serotipos de rotavirus, en donde el serotipo de preferencia es definido por la referencia a una secuencia de la proteína G del rotavirus. Preferentemente, la población de rotavirus es caracterizada porque comprende una sola variante o substancialmente una sola variante, siendo definida dicha variante por una secuencia de nucleótidos que codifica por lo menos una de las proteínas principales del virus designada como VP4 y VP7. Preferentemente, la población del rotavirus comprende las proteínas virales VP4 y/o VP7 del depósito ECACC, 99081301 adecuada para proporcionar un efecto de protección cruzada. Preferentemente, el serotipo del rotavirus atenuado es G1, y puede proporcionar una protección cruzada con la enfermedad ocasionada por los serotipos de rotavirus G1 y que no es G1, tales como los serotipos seleccionados del grupo consistente de: G2, G3, G4, G5, G6, G7, G8, G9, G10, G11, G12, G13 y G14. En particular, el uso de la población del rotavirus G1 atenuada [por ejemplo, como fue depositada en la Colección Europea de Cultivos de Células de Animales (ECACC), Laboratorio de Producción e Investigación de Vacunas, Servicio de Laboratorio de Salud Pública, Centro de Microbiología e Investigación Aplicada, Portón Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 OJG, Reino Unido, en Agosto 13, 1999, bajo el número de depósito 99081301, bajo los términos del Tratado de Budapest], puede ser utilizada para prevenir la enfermedad ocasionada por el G1 y por lo menos uno, preferentemente por lo menos dos, y más preferentemente por lo menos tres y aún más preferente por lo menos cuatro serotipos de rotavirus que no es G1 seleccionados del grupo consistente de: G2, G3, G4, G5, G6, G7, G8, G9, G10, G11, G12, G13 y G14. En un aspecto particularmente preferido, se induce una respuesta inmune contra dos o más serotipos de rotavirus que no son G1, generalmente contra cualquier serotipo seleccionado del grupo consistente de: G2, G3, G4, G5, G6, G7, G8, G9, G10, G11, G12, G13 y G14. Se prefiere tener una protección heterotípica contra por lo menos dos, por lo menos tres, por lo menos cuatro y más preferentemente por lo menos cinco o más de estos serotipos diferentes al de la composición de la vacuna. Más preferentemente, se induce una vacuna inmune contra por lo menos uno, preferentemente por lo menos dos, más preferentemente por lo menos tres y aún más preferentemente por lo menos cuatro de los siguientes tipos de serotipo que no son G1: G2, G3, G4 y G9, además de la protección homotípica (G1).

En particular de acuerdo con la presente invención, se proporciona el uso de una cepa de rotavirus atenuada de un serotipo G1 en la fabricación de una composición de vacuna para la inducción de una respuesta inmunológica contra el rotavirus, el cual no es G1 ó G9. En un aspecto preferido, la respuesta inmunológica es inducida adicionalmente contra la infección por rotavirus por el serotipo G9 y/o el serotipo G1. En un aspecto particular preferido, se induce una respuesta inmune contra dos o más serotipos de rotavirus, no siendo estos serotipos G1 ó G9. Generalmente cualquier serotipo que no sea G1 ó G9 son seleccionados de la lista consistente de: G2, G3, G4, G5, G6, G7, G8, G10, G11, G12, G13 y G14. Se prefiere tener una protección heterotípica contra por lo menos dos, por lo menos tres, por lo menos cuatro, más preferentemente por lo menos cinco o más de estos serotipos diferentes al de la composición de la vacuna. Más preferentemente, se induce una respuesta inmune contra todos los serotipos que no son G1 siguientes: G2, G3, G4 y G9. La presente invención también se refiere a un método para inducir una respuesta inmune contra la infección por rotavirus de un serotipo de rotavirus, comprendiendo el método la administración a un sujeto de una composición que comprende una vacuna de rotavirus atenuado de un serotipo diferente.

Preferentemente, el método es una respuesta para inducir una respuesta inmune contra el serotipo de rotavirus que no es G9, comprendiendo el método, la administración a un sujeto de una composición que comprende una vacuna de serotipo de rotavirus G1 que comprende una sola variante o substancialmente una sola variante como aquí se describe. Preferentemente, la población de rotavirus dentro de la composición de la vacuna, es de especificidad G1P1A P[8]. Más preferentemente, la población de rotavirus comprende las proteínas virales VP4 y/o VP7 del depósito ECACC 99081301 adecuados para promover una respuesta inmune y, generalmente, proporcionar un efecto protector cruzado. Preferentemente, la vacuna del rotavirus utilizada es el depósito ECACC 99081301 o es derivado de ese depósito. En una modalidad, la presente invención excluye el uso de la cepa de rotavirus correspondiente al ECACC 99081301, en un método o uso como se indica anteriormente para inducir una respuesta inmune del serotipo G9 solo, aunque generalmente no está excluido el uso de dicha cepa G1 para la inducción de las respuestas inmunes al G9 en combinación con la inducción de respuestas inmunes a otros serotipos G. De manera adecuada la presente invención se refiere a las cepas de rotavirus G1P8 en métodos o usos que se describieron anteriormente. Preferentemente la vacuna es usada en un régimen de 2 dosis. Preferentemente la vacuna proporciona una protección cruzada contra la gastroenteritis. Por consiguiente, en otro aspecto se proporciona un método de acuerdo con la presente invención, en donde la composición es hasta un 60% protectora, en una población de individuos vacunados contra la diarrea ocasionada por la infección de un rotavirus de un tipo diferente al del rotavirus atenuado presente en la composición. En otro aspecto, se proporciona un método de acuerdo con la presente invención, en donde la composición es hasta un 81% protectora contra la gastroenteritis ocasionada por la infección de un rotavirus de un tipo diferente al del rotavirus atenuado presente en la composición. Todavía en un aspecto adicional, se proporciona un método de acuerdo con la presente invención, en donde la composición comprende una cepa de rotavirus G1, la cual es hasta 83% protectora en una población de individuos vacunados contra la gastroenteritis severa ocasionada por la infección del rotavirus en por lo menos dos serotipos que no son G1. Preferentemente, el índice de protección contra la diarrea y/o la gastroenteritis y/o gastroenteritis severa, logrado en una población de individuos vacunados infectados por un rotavirus de un tipo diferente al del rotavirus atenuado presente en la composición, es de entre el 10% y el 90%, más preferentemente entre el 20% y el 80%, y más preferentemente por lo menos el 50%. La vacuna de rotavirus utilizada para proporcionar una protección cruzada tiene las siguientes características preferidas: De preferencia, la población de rotavirus de acuerdo con la presente invención es una variante clonada. Por una población que comprende una sola variante, o substancialmente una sola variante, nos referimos a una población de rotavirus la cual no contiene más del 10%, preferentemente no más del 5% y aún más preferentemente menos del 1 % de una variante o variantes diferentes. Las poblaciones de virus pueden ser purificadas hasta la homogeneidad o la homogeneidad substancial, pasándolas por tipos de células adecuadas o realizando una serie de uno o más pasos de clonación. Una ventaja de la presente invención, es que una población que comprende una sola variante es más adaptable para la formulación de un lote de vacuna consistente. Las variantes particulares definidas por las secuencias de nucleótidos que codifican las proteínas principales del virus pueden estar también asociadas con una eficacia mejorada en la prevención de la infección por rotavirus. En un aspecto preferido, la única variante o substancialmente única variante en la población de rotavirus de la presente invención, es una variante en la cual el gen VP4 comprende una secuencia de nucleótidos que comprende por lo menos uno de los siguientes aminoácidos: una base de adenina (A) en la posición 788, una base de adenina (A) en la posición 802 y una base de timina (T) en la posición 501 del codón de partida. En un aspecto adicional, la única variante o variante substancialmente única en la población de la presente invención, es una variante en la cual el gen VP7 comprende una secuencia de nucleótidos que comprenden por lo menos uno de los siguientes: una timina (T) en la posición 605, una adenina (A) en la posición 897, o una guanina (G) en la posición 897 del codón de partida. Preferentemente en la posición 897 existe una adenina (A). En un aspecto preferido, la variante única en la población de acuerdo con la presente invención tiene una adenina (T) en las posiciones 788 y 802 y timina (T) en la posición 501 del codón de partida en la secuencia del gen VP4. En otro aspecto preferido, la única variante de la población de acuerdo con la presente invención, tiene una timina (T) en la posición 605 y una adenina/guanina (A/G) en la posición 897 del codón de partida en la secuencia del VP7. Más preferentemente, en la secuencia del VP7 existe una adenina (A) en la posición 897.

En un aspecto particularmente preferido, la variante única de la población de acuerdo con la presente invención tiene una adenina (A) en las posiciones 788 y 802, y una timina (T) en las posición 501 del codón de partida en la secuencia del gen VP4 y una timina (T) en la posición 605 y adenina/guanina (A/G) en la posición 897 del codón de partida en la secuencia del VP7. Más preferentemente, en la secuencia del VP7 existe una adenina (A) en la posición 897. En otro aspecto, la variante única comprende una secuencia de nucleótidos que codifican una proteína VP4 en donde la secuencia de nucleótidos es tal y como se muestra en la figura 1, y/o una secuencia de nucleótidos que codifican una proteína VP7 en donde la secuencia de nucleótidos es tal y como se encuentra en la figura 2. Las poblaciones preferidas de rotavirus para utilizarse en la presente invención pueden ser obtenidas por un método el cual comprende: pasar una preparación de rotavirus en un tipo celular adecuado; opcionalmente seleccionar un cultivo homogéneo utilizando los pasos de cualquiera: a) dilución limitada; o b) aislamiento de placa individual; y revisando la presencia substancialmente una sola variante llevando a cabo una determinación de secuencias de una región apropiada de la secuencia del gen VP4 y/o VP7. Preferentemente la población es derivada de las cepas P33 ó P26 como se describieron anteriormente. La determinación de la secuencia se puede llevar a cabo de manera adecuada mediante una técnica de hibridación cuantitativa o semi-cuantitativa, tal como hibridación de tinte de ranura o hibridación de placa. Preferentemente, la variante seleccionada en la variante en la cual es replicada y excretada cuando la preparación de rotavirus de partida es administrada a un sujeto humano, en particular a un niño. La población resultante del virus clonado del método de acuerdo con la presente invención puede ser amplificada mediante el paso adicional en una línea celular adecuada. Los tipos celulares adecuados para pasar la población de rotavirus en el método anterior incluyen las células de riñon del mono verde Africano (AGMK), las cuales pueden ser líneas celulares establecidas o células AGMK primarias. Las líneas celulares AGMK adecuadas incluyen por ejemplo, células Vero (ATCC CCL-81), DBS-FRhL-2 (ATCC CL-160), BSC-1 (ECACC 85011422) y CV-1 (ATCC CCL-70). También son adecuadas las líneas celulares MA-104 (rhesus monkey) y MRC-5 (humana - ATCC CCL- 71). Las células Vero son particularmente preferidas con propósitos de amplificación. El paso sobre las células Vero produce un rendimiento alto del virus. Las técnicas para revisar si existe una sola variante en una población de virus resultante del método y para determinar la naturaleza de esa sola variante comprenden la elaboración de secuencias estándar o procedimientos de hibridación conocidos en la técnica y se describen más adelante. En un aspecto preferido, el método de la presente invención se lleva a cabo utilizando un rotavirus apropiado, particularmente un rotavirus que tiene las características de la cepa 89-12 o de un derivado del mismo que ha sido sometido a pases. Una población de una sola variante particularmente preferida es la P43, la cual fue obtenida del P33 (pasada 33 veces en el cultivo de tipos celulares apropiados del rotavirus humano aislado), mediante una serie de pasos de clonación de dilución final seguidos por el paso del material clonado en las células Vero para la amplificación. La población P43 fue depositada en la Colección Europea de Cultivos de Células de Animales (ECACC), Laboratorio de Producción e Investigación de Vacunas, Servicio de Laboratorio de Salud Pública, Centro de Microbiología e Investigación Aplicada, Portón Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 OJG, Reino Unido, en Agosto 13, 1999, bajo el número de depósito 99081301, bajo los términos del Tratado de Budapest. Aunque esta disponibilidad pública indicada es el método más simple para obtener el rotavirus humano P43, se pueden producir rotavirus substancialmente idénticos en cuanto a la funcionalidad mediante estos y otros métodos en vista de las enseñanzas de la presente invención. Dichos rotavirus substancialmente idénticos en la funcionalidad son considerados que son biológicamente equivalentes al rotavirus humano P43 de la presente invención, y por lo tanto, se encuentran dentro del alcance general de la presente invención. Por lo tanto, deberá quedar entendido que la presente invención comprende poblaciones de rotavirus que tienen las características de la variante P43 como aquí se describe. También deberá quedar entendido que la presente invención comprende materiales derivados de la variante P43 ECACC 99081301 depositada sometiéndola a un procesamiento adicional, tal como la propagación del mismo mediante un paso adicional, clonación u otros procedimientos que utilizan el virus vivo o modificando el P43 de cualquier modo incluyendo técnicas de ingeniería genética o ténicas derivadas. Dichos pasos y técnicas son bien conocidos en el arte. Los materiales derivados del P43 depositados que están cubiertos por la presente invención incluyen el material de proteínas y genético. Son de particular interés los rotavirus los cuales comprenden por lo menos un antígeno o por lo menos un segmento de P43, por ejemplo, los derivados, los cuales comprenden una cepa virulenta del rotavirus en la cual uno o parte de uno de los 11 segmentos del genoma han sido reemplazados por el segmento del genoma o parte del mismo de la variante P43. Específicamente, puede tener propiedades útiles un derivado de rotavirus en el cual el segmento o la codificación parcial del segmento para el NSP4 es un segmento P43 o un segmento parcial. Los rotavirus derivdos y las técnicas para prepararlos son bien conocidos (Foster, R. H. y Wagstaff, A. J. Tetravalent Rotavirus Vaccine, una revisión. La evaluación de los fármacos de ADIS, BioDrugs, Gev, 9 (2), páginas 155 a 178, 1998). Los materiales de interés particular son la progenie del P43 y los derivados inmunológicamente activos del P43. Los derivados inmunológicamente activos son materiales obtenidos de o con el virus P43, particularmente antígenos del virus, los cuales tienen la capacidad de promover una respuesta inmune que es reactiva contra el Rotavirus cuando es inyectada en un animal huésped. Al adaptar el rotavirus a una línea celular apropiada, por ejemplo, las células Vero, puede ser necesario tratar el virus para deshacerse de cualesquiera contaminantes potenciales, tales como cualesquiera agentes adventicios que pueden estar presentes y los cuales podrían ocasionar de otro modo la contaminación. En el caso de virus adventicios sensibles al éter, esto se puede hacer mediante el tratamiento del éter como se describe más adelante. La presente invención también se refiere a la inclusión de dicho tratamiento del éter como un paso opcional en el procedimiento general para obtener un rotavirus vivo atenuado, o vacuna formulada con el mismo. La vacuna que comprende una sola variante o substancialmente variantes solas de rotavirus es la preferida, sin embargo, el uso de variantes únicas o variantes substancialmente únicas, no es esencial. La cepa protectora cruzada del rotavirus de la presente invención, puede ser combinada con otras cepas de rotavirus para proporcionar una protección adicional o una protección cruzada contra la infección o enfermedad por rotavirus. Por lo tanto, también se encuentran dentro del alcance de la presente invención las mezclas del P43 con otras variantes del rotavirus, por ejemplo, otras variantes clonadas, o con otros virus, en particular otros virus atenuados. Dichas mezclas son útiles en las vacunas de la presente invención las cuales se describen más adelante. La presente invención también proporciona una vacuna de rotavirus vivo atenuado con capacidad para proporcionar protección cruzada, preferentemente la cual comprende una población de substancialmente una sola variante, mezclada con un adyuvante adecuado o un vehículo farmacéutico. Preferentemente, la vacuna de rotavirus de acuerdo con la presente invención, es una vacuna monovalente de rotavirus que contiene una sola cepa de rotavirus. La presente invención es particularmente provechosa para proporcionar una vacuna de rotavirus vivo en la cual el rotavirus vivo atenuado es un rotavirus humano y no ocasiona la intususcepción. Los vehículos farmacéuticos adecuados para utilizarse con la cepa de rotavirus atenuada de acuerdo con la presente invención incluye aquellos conocidos con la técnica como adecuados para la administración oral, especialmente para niños. Dichos vehículos incluyen y no están limitados a carbohidratos, polialcoholes, aminoácidos, hidróxido de aluminio, hidróxido de magnesio, hidroxiapatita, talco, óxido de aluminio, hidróxido de hierro, estearato de magnesio, carboximetilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, celulosa microcristalina, gelatina, peptona vegetal, xantano, carrágena, goma arábica, ß-ciclodextrina. La presente invención también proporciona un proceso para preparar una vacuna de rotavirus, por ejemplo, mediante el secado por congelación del virus en la presencia de estabilizadores adecuados o mezclando el virus de acuerdo con la presente invención con un adyuvante adecuado o un vehículo farmacéutico. También puede ser provechoso formular el virus de la presente invención en vehículos basados en lípidos, tales como virosomas o liposomas, en emulsiones de aceite en agua o con partículas portadoras. Alternativamente o además pueden ser incluidos en la formulación inmunoestimulantes, tales como los conocidos en la técnica para las vacunas orales. Dichos inmunoestimulantes incluyen toxinas bacterianas, particularmente la toxina del cólera (CT) en la forma de holotoxina (molécula completa) o solamente la cadena B (CTB) y la enterotoxina lábil al calor de E. coli (LT). El LTs mutado (mL Ts) los cuales es más probable que se conviertan en su forma activa que el LT natural, tal y como se describe en los documentos WO 96/06627, WO 93/13202 y la Patente Norteamericana No. 5,182,109. Los inmunoestimulantes adicionales que pueden ser incluidos ventajosamente son derivados de saponina, tales como QS21 y lípido A monofosforilo, en particular, lípido A monofosforilo acilado 3-de-0 (3D-MPL). Las saponinas purificadas como adyuvantes orales se describen en el documento WO 98/56415. Las saponinas y el lípido A monofosforilo pueden ser empleados por separado o en combinación (por ejemplo, documento WO 94/00153) y pueden ser formulados en sistemas adyuvantes junto con otros agentes. El 3D-MPL es un adyuvante bien conocido fabricado por Ribi Immunochem, Montana y su fabricación se describe en la Patente GB 2122204. Una explicación general de los vehículos y adyuvantes para la inmunización oral se puede encontrar en el libro "Diseño de Vacunas, la Subunidad y el Método Adyuvante" (Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach), editado por Powell y Newman, Plenum Press, New York, 1995.

La presente invención también proporciona un método para la vacunación de sujetos humanos, especialmente niños, mediante la administración de una cantidad efectiva de una composición de vacuna de acuerdo con la presente invención a un sujeto que la necesita. Preferentemente la vacuna viva atenuada es administrada mediante la administración oral. En un aspecto preferido, la cepa de rotavirus atenuado de acuerdo con la presente invención es formulada con un antiácido para minimizar la inactivación de la vacuna mediante el ácido en el estómago. Los componentes antiácidos adecuados incluyen antiácidos inorgánicos, por ejemplo, hidróxido de aluminio AI(OH)3, e hidróxido de magnesio Mg(OH)2. Los antiácidos comercialmente disponibles que son adecuados para utilizarse en la presente invención incluyen Mylanta (marca comercial), la cual contiene hidróxido de aluminio e hidróxido de magnesio. Estos son ¡nsolubles en agua y se administran en una suspensión.

El hidróxido de aluminio es un componente particularmente preferido de una composición de vacuna de acuerdo con la presente invención, ya que puede proporcionar no solamente un efecto antiácido, sino también un efecto de auxiliar. También son adecuados para utilizarse como antiácidos en la vacuna de la presente invención, los antiácidos orgánicos, tales como las sales de carboxilato de ácido orgánico. Un antiácido preferido en la composición de vacuna de la presente invención contiene una sal de carboxilato de ácido orgánico, preferentemente una sal de ácido cítrico, tal como citrato de sodio o citrato de potasio. Un antiácido particularmente preferido que puede ser utilizado en la composición de vacuna de la presente invención, es la sal inorgánica insoluble, carbonato de calcio (CaC03). El carbonato de calcio puede asociarse con el rotavirus y la actividad del rotavirus es mantenida durante la asociación con el carbonato de calcio. Para evitar la sedimentación del carbonato de calcio durante el paso de llenado, de preferencia están presentes agentes viscosos en la presente formulación. Los agentes viscosos posibles que pueden ser utilizados incluyen excipientes pseudoplásticos. Una solución pseudoplástica se define como una solución que tiene una viscosidad más alta en reposo comparada con su viscosidad bajo agitación. Los excipientes de este tipo son polímeros naturales tales como goma arábiga, goma de adraganto, agar-agar, alginatos, pectinas y polímeros semi-sintéticos, por ejemplo, carboximetilcelulosa (Tyloses C®), metilcelulosa (Methocels A®, Viscotrans MC®, Tylose MH® y MB®), hidroxipropilcelulosa (Klucels®), e hidroxipropilmetilcelulosa (Methocels E® y K®, Viscontrans MPHC®). En general estos excipientes pseudoplásticos son utilizados junto con agentes tixotrópicos. Alternativamente, pueden ser utilizados agentes viscosos con una capacidad baja de flujo como excipientes pseudoplásticos. Estos polímeros, en una concentración suficiente, originan la adaptación del fluido estructural resultante en una solución de alta viscosidad que tiene poca capacidad de flujo en reposo. Necesita dársele una cierta cantidad de energía al sistema para permitir que fluya y se transfiera. Son necesarias las energías externas (agitación) para destruir . temporalmente la adaptación del flujo estructural con el objeto de obtener una solución fluida. Los ejemplos de dichos polímeros son Carbopols® y la goma de xantano. Los excipientes tixotrópicos se convierten en una estructura de gel en reposo mientras que en bajo agitación forman una solución fluida. Los ejemplos de los agentes tixotrópicos son Veegum® (Silicato de aluminio-magnesio) y Avicel RC® (aproximadamente 89% de celulosa microcristalina y 11% de Carboximetilcelulosa Na). La composición de vacuna de la presente invención comprende preferentemente un agente viscoso seleccionado entre goma de xantano o almidón. Por lo tanto, la composición de vacuna de la presente invención es formulada preferentemente con una combinación de carbonato de calcio y goma de xantano. Otros componentes utilizados en la composición de la presente invención incluyen de manera conveniente azúcares, por ejemplo, sacarosa y/o lactosa. La composición de vacuna de acuerdo con la presente invención puede contener componentes adicionales incluyendo, por ejemplo, saborizantes (particularmente para una vacuna oral) y agentes bacteriostáticos. Están contempladas presentaciones diferentes de la composición de vacuna de la presente invención. En una modalidad preferida, la vacuna es administrada en la forma de una formulación líquida. Preferentemente, la formulación líquida es reconstituida antes de la administración de por lo menos los siguientes dos componentes: i) componente del virus ¡i) componente líquido En esta modalidad, el componente del virus y el componente líquido están presentes normalmente en contenedores separados, los cuales pueden ser convenientemente, con compartimentos separados de un solo recipiente o recipientes separados, los cuales pueden estar conectados de un modo tal que la composición de vacuna final es reconstituida sin exponerlos al aire. Antes de la reconstitución, el virus puede estar en forma seca o en forma líquida. Preferentemente, el componente de virus es liofilizado. El virus liofilizado es más estable que el virus en una solución acuosa. El virus liofilizado puede ser reconstituido de manera adecuada utilizando una composición antiácida líquida para producir una formulación de vacuna líquida. Alternativamente, el virus liofilizado puede ser reconstituido con una solución acuosa o con agua, en cuyo caso, la composición del virus liofilizado preferentemente contiene un componente antiácido. Preferentemente, la formulación de vacuna comprende un componente de virus formulado con carbonato de calcio y goma de xantano en un compartimiento o recipiente y este es reconstituido con el agua o la solución acuosa presente en el segundo compartimento o recipiente. En otra modalidad preferida, la composición de vacuna es una formulación sólida, preferentemente una torta liofilizada la cual es adecuada para la disolución inmediata cuando es colocada en la boca. Las formulaciones liofilizadas pueden ser producidas convenientemente en la forma de tabletas en un empaque farmacéutico blister. En otro aspecto, la presente invención proporciona una vacuna de rotavirus en la forma de una tableta de disolución rápida para la administración oral. En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición que comprende una cepa de rotavirus vivo atenuado, en particular una cepa de rotavirus humano, en donde la composición es un sólido liofilizado con capacidad para la disolución inmediata cuando es colocada en la boca. Preferentemente, la tableta de disolución rápida de acuerdo con la presente invención se disuelve en la boca del sujeto lo suficientemente rápido para evitar que se pueda tragar la tableta sin disolver. Este método es particularmente provechoso para vacunas pediátricas de rotavirus. Preferentemente el virus es un rotavirus humano atenuado vivo el cual es formulado con un antiácido inorgánico, tal como carbonato de calcio y un agente viscoso, tal como goma de xantano. En un aspecto adicional de la presente invención se proporciona una formulación liofilizada en donde el componente del virus es cualquier cepa de rotavirus que es formulada con carbonato de calcio y goma de xantano. Las vacunas de la presente invención pueden ser formuladas y administradas mediante técnicas conocidas, utilizando una cantidad adecuada del virus vivo para producir una protección efectiva contra la infección por rotavirus, sin los efectos laterales adversos importantes de las vacunas típicas. Una cantidad adecuada de rotavirus vivo generalmente será en un enfoque entre 104 y 107 unidades de formación del foco (ffu) por dosis. Una dosis típica de vacuna puede comprender 105 y 106 ffu por dosis y puede ser administrada en varias dosis por un período de tiempo, por ejemplo, en dos dosis administradas con intervalos de dos meses. Sin embargo, se ppueden obtener beneficios, teniendo más de 2 dosis, por ejemplo, un régimen de dosis de 3 ó 4, particularmente en los países en desarrollo. El intervalo entre las dosis puede ser más o menos de un lapso de dos meses. Una cantidad óptima del virus vivo para una sola dosis o para un régimen de dosis múltiples y una temporización óptima para la dosis pueden ser aseguradas mediante estudios estándar que comprenden la observación de los títulos de anticuerpos y otras respuestas en el sujeto. La vacuna de la presente invención también puede comprender otros virus vivos adecuados para la protección contra otras enfermedades, por ejemplo, el virus de la polio. Alternativamente, otras vacunas de virus vivo adecuadas para la administración oral pueden ser proporcionadas en una dosis separada, pero en la misma ocasión que la composición de la vacuna del rotavirus de acuerdo con la presente invención.

El suero de doce niños de 4 a 6 meses de edad con el material P33 como se describió en el documento de Vacuna (1998), fue probado o analizado para determinar la neutralización del P33, P38, P43 y 89-12C2. El rango de títulos de neutralización de todos los sueros probados es similar para el P33, el P38 y el P43. El análisis estadístico muestra que no existe una diferencia importante en los títulos generales de neutralización contra los tres virus. Esto sugiere que los epítopes de conformación y no conformación de la neutralización del P33, P38 y P43, son igualmente bien reconocidos por el suero anti-P33 de los infantes vacunados con P33. Esta observación sugiere indirectamente que las epítopes de neutralización revelados en este ensayo in vitro no fueron alterados entre el P33, el P38 y el P43. El rango de títulos de neutralización del P89-12C2, sin embargo, difiere de manera importante de los P33, P38 y P43. Esta observación sugiere que los epítopes de conformación y no conformación de la neutralización de P33, P38 y P43 son igualmente bien reconocidos por el suero anti-P33 de los infantes vacunados con P33. Esta observación sugiere indirectamente que los epítopes de neutralización revelados en este ensayo in vitro fueron alterados entre el 89-12C2 y el P33, el P38 y el P43. Las modalidades altamente preferidas de la presente invención incluyen: 1. El uso de las cepas atenuadas del rotavirus de un serotipo G1 en la fabricación de una composición de vacuna para inducción de una respuesta inmune contra un rotavirus el cual no es G1 ó G9. 2. El uso de acuerdo con el punto 1 en donde la respuesta inmune es inducida adicionalmente contra la infección por rotavirus por el serotipo G9 y/o el serotipo G 1. 3. El uso de acuerdo con los puntos 1 ó 2 en donde la respuesta inmune es inducida contra dos o más serotipos de rotavirus, no siendo estos serotipos G1 ó G9. 4. El uso como se define en cualquiera de los puntos del 1 al 3 caracterizado porque un serotipo que no es G1 ó G9 es seleccionado de la lista consistente de G2, G3, G4, G5, G6, G7, G8, G10, G11, G12, G13 y G14. 5. El uso de acuerdo con cualquiera de los puntos del 1 al 4 caracterizado porque la respuesta inmunológica es inducida contra todos los siguientes serotipos que no son G1 : G2, G3, G4 y G9. 6. El uso como se define en cualquiera de los puntos del 1 al 5, caracterizado porque la composición de vacuna contra el rotavirus G1 comprende una sola variante de rotavirus o substancialmente una sola variante de rotavirus, siendo definida esa variante por una secuencia de nucleótidos que codifica por lo menos una de las proteínas principales del virus designadas como VP4 y VP7. El uso tal y como se define en el punto 6, caracterizado porque la composición comprende un rotavirus que tiene un gen VP4 comprendido, en la secuencia de nucleótidos, y por lo menos uno de los siguientes: una base de adenina (A) en la posición 788, una base de adenina (A) en la posición 802 y una base de timina (T) en la posición 501 del codón de partida. El uso como se define en el punto 7, caracterizado porque el gen VP4 comprende una secuencia de nucleótidos que contiene una base de adenina (A) en las posiciones 788 y 802, y una base de timina (T) en la posición 501 a partir del codón de partida. El uso como se define en el punto 6, caracterizado porque la composición comprende un rotavirus que tiene un gen VP7 que comprende, en la secuencia de nucleótidos, por lo menos uno de los siguientes: una timina (T) en la posición 605, una adenina (A) en la posición 897 y una guanina (G) en la posición 897 del codón de partida. El uso como se define en el punto 7, caracterizado porque el gen VP7 comprende una secuencia de nucleótidos que comprende una timina (T) en la posición 605 y una adenina (A) o guanina (G) en la posición 897 del codón de partida. El uso de acuerdo con cualquiera de los puntos del 1 al 10, caracterizado porque la composición comprende un rotavirus que tiene un gen VP4 que comprende, la secuencia de nucleótidos, una adenina (A) en las posiciones 788 y 802 y una timina (T) en la posición 501 del codón de partida; y en donde el gen VP7 comprende, la secuencia de nucleótidos, una timina (T) en la posición 605 y una adenina (A) en la posición 897 del codón de partida. El uso de acuerdo con cualquiera de los puntos del 1 al 11, en donde la composición tiene la capacidad de proteger contra la gastroenteritis y/o diarrea ocasionada por la infección por un rotavirus de un tipo diferente al serotipo G1 del rotavirus atenuado presente en la composición. El uso de acuerdo con el punto 12 en donde la composición es hasta 83% protectora en una población de individuos vacunados contra la gastroenteritis severa ocasionada por la infección de rotavirus en por lo menos dos serotipos, siendo diferentes estos serotipos al serotipo G1 del rotavirus atenuado presente en la composición. 14. El uso de acuerdo con el punto 13, en donde la gastroenteritis severa es ocasionada por la infección de un rotavirus de por lo menos cuatro serotipos que no son G1. 15. El uso de acuerdo con el punto 14, en donde el serotipo que no es G1 es no de los serotipos G2, G3, G4 y G9. 16. El uso de acuerdo con cualquiera de los puntos del 1 al 15, en donde la cepa rotavirus es el depósito ECACC 99081301, o que se pueda obtener o derivar de un depósito ECACC 99081301. 17. El uso de acuerdo con cualquiera de los puntos del 1 al 16, en donde la vacuna es utilizada en un régimen de 2 dosis. Los siguientes son ejemplos no limitativos, que ¡lustran la presente invención. EJEMPLOS Ejemplo 1: Demostración de que la cepa 89-12 en el paso 26 (P26) es una mezcla de variantes Elaboración de secuencias de los genes VP4 y VP7 de lotes de pasos diferentes Se llevó a cabo la elaboración de secuencias de los genes VP4 y VP7 del paso P26 (células primarias AGMK), el paso P33 (establecido en la línea celular AGMK (opuesta a la primaria)), el paso P41 y el paso P43. La extracción total del ARN fue transcrito inverso y amplificado a través de PCR en un tubo/un paso. Los cebadores Rota 5bis y Rota 29bis amplificaron el gen VP4 completo y los cebadores Rota 1 y Rota 2bis amplificaron el gen VP7 completo. El material del PCR ha formado las secuencias utilizando cebadores diferentes (ver Tabla 1). La secuencia del paso P26 difiere de la secuencia del paso P33 por 3 bases (en las posiciones 501, 788 y 802 bp del codón de partida) en el VP4, y por tres bases en el VP7 (108, 605 y 897 bp del codón de partida). Las exploraciones de la secuencia del paso P26 del VP4 y el VP7 muestran las posiciones mutadas de la secuencia del paso P33 como el fondo. Por lo tanto, se puede apreciar que el paso P26 es una mezcla de por lo menos 2 variantes. Las exploraciones de la secuencia del paso P33 parecen homogéneas en el VP4 y heterogéneas para el VP7 (ver Tabla 2)· El paso P38 (derivado del paso 33) fue pasado 5 veces en células Vero y desplegado en el mismo conjunto de secuencias de VP4 y VP7 que el paso P33 (línea celular AGMK). Por lo tanto, no existe un cambio mayor en las poblaciones entre el P33 y el P38.

TABLA 1: Oligonucleótidos utilizados para el RT-PCR y elaboración de secuencias. nombre secuencia posición VP7 Rotal GGC TTT AAA AGA GAG AAT TTC CGT CTG G -49 a -22 Rota 1 bis GGT TAG CTC CTT TTA ATG TAT GGT A -16 a 10 Rota 2bis GGT CAC ATC GAA CAA TTC TAA TCT AAG 014-988 Rota 7 CAA GTA CTC AAA TCA ATG ATG G 266-287 Rota 12 TGT TGA III I I C TGT CGA TCC AC 372-394 Rota 46 GGT TGC TGA GAA TGA GAA ATT AGC TAT 651-682 AGTGG Rota 18 CCA CTA.TAG CTA ATT TCT CAT TCT CAG 682-651 CAACC VP4 Rota 5 "IGGCI l CGC CAI I I I Al A GAC A 2-23 Rota 6 ATT TCG GAC CAT TTA TAA CC 878-859 Rota 5bis TGG CTT CAC TCA TTT ATA GAC A 2-23 Rota 6bis ATT TCA GAC CAT TTA TAA CCT AG 878-856 Rota 25 GGA GTA GTA TAT GAA AGT ACA AAT AAT 268-296 ?G5 Rota 26 CTA TTA TTT GTA CTT TCA TAT ACT ACT CC 296-268 Rota 27bis TCG ATA CAG TAT AAG AGA GCA CAA G 721-745 Rota 28 Rota 31 TTC ATT AAC TTG TGC TCT CTT ATA CTG 753-727 Rota 32 GTA TAT GTA GAC TAT TGG GAT G 1048-1070 Rota 45 CAT CCC AAT AGT CTA CAT ATA C 1070-1048 Rota 53 TGT AAC TCC GGC AAA ATG CAA CG 1205-1227 Rota 54 CGT TGC ATT TTG CCG GAG TTA CA 1227-1205 Rota 55 GTA AGA CAA GAT TTA GAG CGC CA 1465-1487 Rota 40 TGG CGC TCT AAA TCT TGT CTT AC 1487-1465 Rota 39 CTT GAT GCT GAT GAA GCA GCA TCT G 1703-1727 Rota 33 CAG ATG CTG CTT CAT CAG CAT CAA G 1727-1703 Rota 34 CGA TCA TAT CGA ATA TTA AAG GAT G 2008-2032 Rota 29bis CAT CCT TTA ATA TTC GAT ATG ATC G 2032-2008 AGC GTT CAC ACA ATT TAC ATT GTA G 2335-2311 TABLA 2: oligonucleótidos utilizados en la hibridación Las bases mostradas en tipos de negritas en la Tabla 2 son los sitios de la variación específica de la secuencia VP4 y el VP7. TABLA 3: variación de la secuencia de los genes VP4 y VP7 3.1 N.B. En un segundo clon de los 3 clones los cuales fueron desarrollados al nivel del lote de producción, los nucleótidos de la posición VP7 897 bp es G, en vez de A como en el clon seleccionado P43. Esto da como resultado una metionina en lugar de una ¡soleucina en la secuencia de aminoácidos. Las variantes correspondientes a ambos clones seleccionados el P43 y el clon en el cual existe un G en la VP7 en la posición 897 bp del codón de partida, fueron excretadas en las deposiciones de los infantes que habían sido vacunados con el material P33. En la Tabla 3.1, hubieron dos bases alternativas en una posición particular, la primera de las dos representa la base que aparece en la población mayor y la segunda es la base que aparece en la población menor. Las poblaciones de las variantes mayor y menor son juzgadas por la fuerza de la señal en la elaboración de la secuencia. 3.2 La tabla 3.2 muestra los cambios de aminoácidos resultantes de las diferencias de nucleótidos entre las variantes.

TABLA 4 Hibridación de tinción de ranura El cambio en las poblaciones entre los pasos del P26 al P33 en las células AGMK ha sido confirmada además por la hibridación de tinción de ranura. Los fragmentos del gen VP4 y el VP7 generados por el RT/PCR fueron hibridados con muestras específicas de oligonucleótidos para cada variante (ver Tabla 3.1 y Tabla 3.2). En contraste con el P26, el cual se híbrido con Rota 16, Rota 35 y Rota 36 y no con Rota 15, el fragmento VP4 PCR del material de P33 en las posiciones 788 y 802 híbrido solamente con el Rota 16 y no con cualquiera del Rota 15 o el Rota 35 o el Rota 36. Estos resultados establecieron la presencia de por lo menos 3 variantes en el paso P26 (ver Tabla 4). Para el fragmento VP7 PCR del material P33, la posición 897 híbrido con Rota 41 y Rota 42. Estos resultados establecieron la presencia de por lo menos dos variantes en el material P33.

Ejemplo 2: Aislamiento y caracterización del clon P43 Para aislar los componentes P33 como una población de virus homogénea, se realizaron tres diluciones de punto final del P33/AG K en células Vero y el virus resultante fue utilizado para infectar las células Vero. Los depósitos positivos fueron seleccionados utilizando dos criterios: proliferación demostrada por el número más grande de focos detectados en los depósitos y los depósitos positivos más aislados en las placas, como se hace clásicamente. Después de 3 pasos de dilución final en placas de micro-titulación de 96 depósitos, se amplificaron sucesivamente 10 depósitos positivos en células Vero y fueron evaluados por su producción. Basados en la producción, se desarrollaron tres clones al nivel de paso de lote de producción. El reconocimiento inmunológico por los anticuerpos policlonales fue similar ambos tanto entre los tres clones y como entre el clon y el P33. La homogeneidad de los clones fue evaluada mediante la hibridación de tinción de ranura. La selección final de un solo clon estuvo basada en la producción y la secuencia. El clon seleccionado fue amplificado mediante pasos sucesivos sobre células Vero para generar una semilla Maestra y una semilla de Trabajo y finalmente los lotes de producción. El clon seleccionado fue caracterizado genéticamente en diferentes niveles de pasos mediante la elaboración de secuencias del VP4 y VP7 (identidad) y mediante la hibridación específica de tinción de ranura del VP4 y VP7 (homogeneidad) de los materiales amplificados por PCR. La secuencia de los genes VP4 y VP7 del material P43 se proporcionan en las figuras 1 y 2, respectivamente y son idénticas a la del P41. La homogeneidad del clon seleccionado fue evaluada mediante hibridación selectiva utilizando muestras de oligonucleótidos que discriminan los cambios de nucleotidos en las regiones VP4 y/o VP7 para cada variante identificada durante la elaboración de secuencia primaria de P26/AGMK (ver Tabla 4). El fragmento VP4 hibridó con Rota 16, y no con Rota 15, Rota 35 ó Rota 36. El fragmento VP7 hibridó con Rota 41 y no con Rota 42. Estos resultados confirmaron que el P43 es una población homogénea. Ejemplo 3: Remoción del virus adventicio potencial Se agregó éter al material P33 (cultivado en AGMK) a una concentración final de 20% por 1 hora. Luego se hizo burbujear el éter con N2 durante 35 minutos. No se observó impacto alguno en el título de la semilla P33. Ejemplo 4: Formulación de la vacuna viva atenuada Los lotes de producción descritos anteriormente son formulados para la administración oral a infantes mediante el siguiente método. . Virus liofilizado Se utilizan técnicas estándar para preparar las dosis de virus. El granel viral purificado congelado es deshelado y diluido con una composición de medio apropiado, en este caso, Medio Eagle modificado de Dulbecco, hasta una concentración viral estándar deseada, en este caso 106 2 ffu/ml. El virus diluido entonces fue diluido adicionaimente con estabilizador de liofilización (sacarosa 4%, dextrano 8%, sorbitol 6%, aminoácidos 4%) hasta un título viral objetivo, en este caso 105 6 ffu/dosls. Se estabilizaron alícuotas de 0.5 mi de la composición viral los cuales son transferidos asépticamente a frascos de 3 mi. Cada frasco entonces es cerrado parcialmente con una tapa de hule, la muestra es secada por congelación al vacío y el frasco entonces es completamente cerrado y se le adhiere una tapa de aluminio en el lugar alrededor del frasco para mantener el tapón en su lugar. Para el uso, el virus es reconstituido utilizando uno de los siguientes reconstituyentes antiácidos: (a) Reconstituyente de citrato El citrato de sodio se disuelve en agua, es esterilizado mediante filtración y transferido asépticamente en contenedores de reconstituyente en cantidades de 1.5 mi en una concentración de 544 mg Na3Citrate.2H20 por dosis de 1.5 mi. Los contenedores del reconstituyente pueden ser por ejemplo, frascos de 3 mi o frascos de 4 mi, o jeringas de 2 mi, o cápsulas suaves de plástico que se pueden exprimir para la administración oral. Como una alternativa para mantener los componentes estériles bajo condiciones estériles, el contenedor final puede ser sometido a autoclave. (b) Reconstituyente AI(OH)¾ Una suspensión aséptica de hidróxido de aluminio (Mylanta - marca comercial) es diluida asépticamente en agua estéril, transferida asépticamente a los contenedores de reconstituyente (por ejemplo, jeringas de 2 mi, o cápsulas de plástico suave que se pueden exprimir) en cantidades de 2 mi conteniendo cada una 48 mg de AI(OH)3. Una alternativa para utilizar componente estériles bajo condiciones estériles, es irradiar con ? la suspensión de hidróxido de aluminio (preferentemente en la etapa diluida). Se incluyeron ingredientes estándar para evitar que la suspensión se asentara. Dichos ingredientes estándar incluyen por ejemplo, estearato de magnesio, carboximetilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, celulosa microcristalina y polímeros de silicona. También pueden estar incluidos agentes bacteriostáticos, por ejemplo, butilparabeno, propilparabeno u otros agentes bacteriostáticos estándar utilizados en los alimentos y saborizantes. 2. Virus liofilizado con AI(OH)¾ en formulación líquida Se utilizaron técnicas estándar para la preparación de las dosis de virus. El granel viral purificado congelado es deshelado y diluido con una composición de medio apropiado, en este caso, Medio Eagle modificado de Dulbecco, hasta una concentración viral estándar deseada, en este caso 106 2 ffu/ml. Se le agregó suspensión de hidróxido de aluminio para alcanzar una cantidad final de 48 mg/dosis y la composición del virus es diluida con estabilizador de liofilización (sacarosa 4%, dextrano 8%, sorbitol 6%, aminoácidos 4%) hasta un título viral objetivo, en este caso 105 6 ffu/dosis. Se estabilizaron alícuotas de 0.5 mi de la composición viral los cuales son transferidos asépticamente a frascos de 3 mi. Entonces se llevó a cabo la liofilización y cierre de los frascos, tal y como se describió en la parte 1. 3. Virus liofilizado con AI(OH)a para presentación blister Se utilizan técnicas estándar para la preparación de dosis del virus. El granel viral purificado congelado es deshelado y diluido con una composición de medio apropiada, en este caso, Medio Eagle modificado de Dulbecco, hasta una concentración viral estándar deseada, en este caso 106 2 ffu/ml. Se agrega una suspensión de hidróxido de aluminio para alcanzar una cantidad final de 48 mg/dosis y la composición del virus es diluida con el estabilizador de liofilización el cual puede ser sacarosa, dextrano o aminoácidos al 4% o gelatina o peptona vegeta, o xantano, hasta el título viral objetivo de 105 6 ffu/dosis. Se emplea una operación de llenado aséptica para transferir la dosis de 0.5 mi o preferentemente menores, a las cavidades de las burbujas. La composición es liofilizada y las cavidades de las burbujas son selladas mediante sellado térmico. Están incluidos ingredientes opcionales estándar para evitar que la suspensión de hidróxido de aluminio se asiente. Dichos ingredientes estándar incluyen, por ejemplo, estearato de magnesio, corboximetilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, celulosa microcristalina y polímeros de silicona. También se pueden incluir saborizantes. Ejemplo 5: Titulación viral del rotavirus para varias formulaciones 5.1: Comparación entre formulaciones basadas en lactosa y sacarosa: Tabla 5 Lote n° Composición de la Título viral antes de la Título viral después de la formulación liofilización liofilización y 1 semana a temperatura de 37°C 98G06/01 Lactosa:2%; Dextrano:4%; Sorbitol:3%; Aminoácidos:2% 98G06/03 Sacarosa:2%; 104·92 Dextrano:4%; Sorbitol:3%; Aminoácidos:2% El rotavirus P43 fue formulado, ya sea con sacarosa o con lactosa como se muestra en la tabla anterior. La titulación viral antes de la liofilización es el título viral del líquido formulado terminado (que contiene sacarosa, dextrano, sorbitol, aminoácidos) y sin el paso de liofilización.

Se pueden lograr buenos resultados como aquellos en los cuales el <0.5 log disminuye en el paso de liofilización y el <0.5 log de disminución durante "una semana a temperatura de 37°C" (prueba de estabilidad acelerada). La precisión de la titulación viral es de alrededor de + ó - 0.2 log. Los resultados indican que la sacarosa puede ser utilizada, en vez de la lactosa. 5.2: Efecto de la arginina y el remplazo de sorbitol por maltitol: Tabla 6 Los resultados demuestran que la acición de arginina (la cual es sabido que mejora la estabilidad del virus durante la liofllización y también proporciona un medio básico, con el objeto de compensar la acidez en el estomago) mantiene el título viral. El sorbitol tiende a disminuir la temperatura de transición al vidrio de la torta liofilizada en un grado mayor. Esto puede superarse utilizando maltitol, en vez de sorbitol, como se muestra anteriormente y el título viral todavía se mantiene. 5.3: Varias composiciones de la formulación Este experimento demuestra que son posibles un número de formulaciones.

Tabla 7 .4: Asociación entre el rotavirus y el antiácido AI(OH)3 Tabla 8 Se utiliza el AI(OH)3 como un antiácido. Esto muestra que el rotavirus está asociado con la sal inorgánica insoluble (AI(OH)3 desde que se centrifugó junto con el AI(OH)3 (disminución de la actividad viral en el sobrenadante). 5.5: Disolución del antiácido AI(OH)3 mediante Citrato de Sodio antes de la titulación viral Tabla 9 Cuando el rotavirus está asociado con el AI(OH)3, es posible liofilizar todo (incluyendo el AI(OH)3). Después de la liofilización es posible recuperar el rotavirus disolviendo el AI(OH)3 en Citrato de Sodio. Este paso no daña el rotavirus y retiene su actividad después del paso de disolución. 5.6: Infectividad del Rotavirus después de la liberación de la asociación de Rotavirus-AI(OH)3: El mecanismo de liberación del virus (mediante disolución del vehículo), puede ocurrir muy bien in vivo. Indudablemente debajo de un pH 6, el hidróxido de aluminio se convierte en completamente soluble y por lo tanto, el rotavirus será liberado en el estómago. AI(OH)3 + 3 H + > Al+++ (soluble en agua) + 3 H20 En el estómago, los iones de Al+++ no son absorbidos (J.J. Powel, R. Jugdaohsingh y R.P.H. Thompson, ("La regulación de la adsorción mineral en el aparato gastrointestinal") ("The regulation of mineral adsorption in the gastrointestinal track,") Reportes de la Nutrition Society (1999), 58, páginas 147-153). En el intestino, debido al aumento del pH, las formas insolubles del aluminio son precipitadas (AI(OH)3 ó AIP04), y eliminadas por el medio natural. Se desconoce si el precipitado de AI(OH)3 (ó AIP04) recientemente formado podrá volverse a asociar con el Rotavirus libre. Esto origina la pregunta de la infectividad del Rotavirus-AI(OH)3 en asociación por el mismo.

También es posible la liberación del Rotavirus de la asociación de Rotavirus-AI(OH)3 por otros mecanismos. Por ejemplo, la Usina interfiere con la adsorción viral en el AI(OH)3. Es sabido que otros aniones similares al borato, sulfato, carbonato y fosfato son adsorbidos específicamente en el hidróxido de aluminio, por lo tanto, teóricamente, deberá ser posible desplazar (mediante la competencia del sitio de adsorción) del rotavirus de la asociación del Rotavirus- AI(OH)3.

DRVC003A46 + 12 mg deAI(OH)3 en 0,120 mi + 65 mg de Usina 1 ,380 mi de H20 + 30 minutos a Temperatura Ambiente + Centrifugación 8000rpm 10 min Sobrante + Sobrenadante disolución en Citrato debajo de la detección 3.8 Por lo tanto, el Rotavirus puede ser liberado de la asociación de Rotavirus-AI(OH)3 y el Rotavirus liberado permanece activo. Esta liberación se puede hacer, ya sea disolviendo el Al(OH)3 (mediante HCI en el estómago o mediante Na3Citrato in vitro) desplazando el Rotavirus por medio de un aminoácido básico (Usina). 5.7: Infectividad de la asociación de Rotavirus-AI(OH)3 Una sola dosis del Rotavirus liofiiizado fue reconstituida con agua y dividida en dos partes. La primera parte, considerada como la referencia, recibió un volumen adicional de agua. La segunda parte recibió 24mg de AI(OH)3 suspendido en 0.240 mi de agua (titulaciones virales Preclínicas).

DRVC003A46 + 1,5 mi H20 0,750 mi + 0,750 mi + 0,240 mi 24 mg H20 AI(OH)3 en 0,240 mi 1 hora 1 hora 5.55 6.22 Cuando está presente el AI(OH)3, el Rotavirus es activo, y el valor de titulación viral es más alto comparado con la muestra de referencia. Este experimento se repitió sin dividir la dosis liofilizada y agregando 12mg de AI(OH)3 o 24 mg de AI(OH)3. Aquí la muestra de referencia fue reconstituida con regulador de Citrato-Bicarbonato. Por lo tanto, el título viral es nuevamente más alto en la presencia de AI(OH)3.

DRVC003A46 DRVC003A46 DRVC003A46 + + 1,5 mi de 12 mg de AI(OH)3 24 mg de AI(OH)3 en regulador de WL en 0.120 mi 0,240ml 1,380ml de H20 1,260ml de H20 .34 6.24 6.05 5.32 5.95 6.26 Como en el ejemplo anterior, el rotavirus se asocia con las partículas de AI(OH)3, debido a que el Rotavirus puede ser descartado mediante centrifugación. El DRVC003A46 es un Rotavirus formulado liofilizado (Sacarosa:2%; Dextrano:4%, Sorbitol:3%; Aminoácidos:2%).

DRVC003A46 DRVC003A46 + + 12 mg de AI(OH)3 en 24 mg de AI(OH)3 en 0,120 mi 0,240 mi + + 1,380 mi de H20 1,260 mi de H20 + + Centrifugación Centrifugación 8000rpm 10min 8000rpm 10 min \ Sobrante + Sobrenadante Sobrante + Sobrenadante 1,5 mi 1,5 mi SDSAA SDSAA 5.78 <1,44 5.92 <1,44 5.96 <1,44 6.11 <1,44 SDSAA= Sacarosa 2%, Dextrano 4%, Sorbitol 3%, Aminoácido 2%. De acuerdo con la titulación viral llevada a cabo en el sobrenadante, la cantidad de AI(OH)3 necesaria para adsorber el Rotavirus parece ser baja (iniciando con la dosis liofilizada 5.7 log y escalando hasta la titulación viral): Tabla 10 Al(OH)3 Tiempo de Adsorpción Título en el sobrenadante 12 mg 1 hora a Temperatura Ambiente 2.7 24 mg 1 hora a Temperatura Ambiente 3.4 48 mg 1 hora a Temperatura Ambiente 3.4 72 mg 1 hora a Temperatura Ambiente 2.0 96 mg 1 hora a Temperatura Ambiente Debajo de la detección 12 mg Durante la noche 2.7 24 mg Durante la noche Debajo de la detección 48 mg Durante la noche 2.5 12 mg Inmediata Debajo de la detección 24 mg Inmediata 2.0 48 mg Inmediata Debajo de la detección El tiempo necesario para adsorber el Rotavirus en el AI(OH)3 parece ser corto: Una dosis de Rotavirus liofilizado fue reconstituida en la presencia de 24 mg de AI(OH)3 y centrifugado después de 0, 15, 60 minutos y 24 horas. El "sobrante" se volvió a suspender en SDSAA antes de la titulación viral: Tabla 11 .8: El uso de CaCo3 como antiácido Con el objeto de evitar el aluminio en la vacuna, el antiácido Al(OH)3 fue reemplazado por otra sal inorgánica insoluble: CaCC>3 (carbonato de calcio). El fenómeno observado con el CaCÜ3 es paralelo a los que se describen para el AI(OH)3: Asociación del Rotavirus con la sal inorgánica: - Mantenimiento de la actividad del Rotavirus cuando es asociado con la sai inorgánica: Posibilidad de liberación del Rotavirus de la asociación mediante la disolución de la base inorgánica por un ácido; La posibilidad de la co-liofilización del antiácido y el Rotavirus. Asociación de CaCOa Y Rotavirus En un primer ensayo, el Rotavirus liofilizado (título viral 5.7) fue reconstituido con una suspensión de CaC03 en agua (50mg en 1.5ml); y luego centrifugada y el título viral del sobrenadante comparado con el gránulo. DRVC003A46 DRVC003A46 + 50 mg de CaC03 en 1 ,5 50 mg de CaC03 en mi de H20 1,5 mi de H20 Centrifugación 8000rpm Centrifugación 10 min 8000rpm 10 min Sobrante + Sobrenadante Sobrante + Sobrenadante 1,5 mi 1,5 mi de Na SDSAA Citrato 5.83 4.46 5.88 4.33 Esto indica que más del 90% del Rotavirus está asociado con el CaC03. También, cuando el virus fue asociado, fue posible realizar la titulación y recuperar las cantidades virales originales. También, los títulos virales son ligeramente más altos que los obtenidos sin CaC03.

DRVC003A46 DRVC003A46 + + 1,5 mi de H20 1 ,5 mi de Regulador W.L Centrifugación 8000rpm 10 min "Sobrante" Sobrenadante 4.99 5.03 5.35 Cantidad de asociación de CaCOa y Rotavirus El Rotavirus liofilizado fue reconstituido con una suspensión en agua de CaC03 (1.5ml): 10 mg 50 mg 100 mg y luego centrifugado, y el título viral del sobrenadante comparado con el sobrante.

Tabla 12 Por lo tanto, claramente, más CaC03 y más virus está asociado, y se ha encontrado menos en el sobrenadante. Sin embargo, la dosis completa no es recuperada completamente (esperada a un total de 5.3 por lo menos o hasta 5.8 como se obtuvo anteriormente "ver lo anterior") Protección del CaCO¾ del Rotavirus durante la titulación del antiácido Babv Rossett-Rice Utilizando 10 dosis de Rotavirus liofilizado (DRVC003A46) y 50 mg de CaC03, se llevaron a cabo 2 títulos de titulación Baby Rossett-Rice: En una titulación de Rossett-Rice clásica, el antiácido es mezclado con el Rotavirus y el HCI es vertido dentro de este medio. En el ensayo babby Rossett-Rice "inverso", la situación es invertida: el antiácido es vaciado en el conjunto de HCI, (como ocurre ¡n vivo).

Tabla 13 Por lo tanto, en este experimento in vitro, el carbonato de calcio puede proteger aproximadamente el 20% del Rotavirus de la presencia del HCI, mientras que el hidróxido de aluminio no puede hacerlo. 5.9: Liofilización del Rotavirus en presencia de antiácido CaC03: Tabla 14 00C24/01 Sacarosa:2% Dextrano:4% Sorbitol:3% Aminoácidos:2% CaCO3:60 mg Xantano 0,3% 00C24/03 Sacarosa:2% Dextrano:4% Sorbitol:3% Aminoácidos:2% CaCO3:60 mg Xantano 0,3% 00E09/25 Sacarosa:2% Dextrano:4% Sorbitol: 3% Am¡noácidos:2% CaCO3:60 mg Xantano 0,25% 00E09/30 Sacarosa:2% 10s.oi Dextrano:4% Sorbitol: 3% Aminoácidos:2% CaCO3:60 mg Xantano 0,30% O0F26/O6 Sacarosa:2% 10 ·50 Dextrano:4% Sorbitol: 3% Aminoácidos:2% CaCo3: 60 mg Almidón: 2% Esta es la liofilización "todo en uno" del Rotavirus y el antiácido (CaC03) juntos en el mismo frasco. Para evitar la sedimentación del CaC03 durante el paso de llenado, se necesitan agentes viscosos. Los ejemplos de dichos agentes viscosos incluyen goma de Xantano y almidón. La actividad del Rotavirus es mantenida aún en la presencia de goma de Xantano y almidón. .10 Tabletas liof ilizadas para la desintegración rápida cuando son colocadas en la boca: Las siguientes formulaciones demuestran el concepto "lyoc". Es decir, la disolución rápida de la torta liofiiizada en la boca. Tabla 15 En el "concepto lyoc" se pueden utilizar tanto el Xantano como el almidón (manteniendo las propiedades de disolución rápida de la torta liofilizada). Ejemplo 6: Uso de carbonato de calcio como antiácido para la composición de vacuna de Rotavirus Cuando se utilizó una suspensión de CaC03 en agua, como antiácido para el Rotavirus existió el problema de que las partículas de carbonato de calcio sedimentan rápidamente cuando son colocadas en agua, ya que el valor de la densidad del polvo se aproxima a 2.6 y el tamaño de partícula promedio es de 30µ??. Esta sedimentación puede ser disminuida mediante: 1 el aumento de la densidad del medio que la rodea 2 aumentando la viscosidad del medio que la rodea 3 reduciendo el tamaño de partículas 4 manteniendo las partículas lejos entre ellas 6.1: Aumento de la densidad del medio que la rodea: Cuando una suspensión de CaC03-Agua (cuando es colocada en al jeringa) es colocada en la torta liofilizada (con un contenido de sacarosa de 2%, dextrano 4%, sorbitol 3%; aminoácidos 2%), la densidad del medio que la rodea es aumentada, pero la velocidad de sedimentación del CaC03 no es muy diferente a la de la suspensión de Agua-CaC03. 6.2: Aumento de la viscosidad del medio que lo rodea: Excipientes pseudoplásticos Una solución pseudoplástica es definida como una solución que tiene una viscosidad más alta en reposo comparada con su viscosidad bajo agitación. Los excipientes usuales de este tipo son: por ejemplo, polímeros naturales: goma arábica goma de adraganto agar-agar alginatos pectlnas por ejemplo, polímeros semi-sintéticos: carboximetilcelulosa (Tyloses C®) metilcelulosa (Methocels A®, Viscotrans MC®, Tylose MH® y BD) hidroxipropilcelulosa (Klucels®) hidroxipropilmetilcelulosa (Methocels E® y K®, Viscontrans MPHCD) En general esos excipientes pseudoplásticos son utilizados juntos con agentes tixotrópicos. Excipientes pseudoplásticos con una capacidad baja de flujo. Esos polímeros, en una concentración suficiente, originan una adaptación del fluido estructural que resulta en una solución de alta viscosidad que tiene poca capacidad de flujo en reposo. Necesita proporcionarse al sistema cierta cantidad de energía para permitir que fluya y se transfiera. Son necesarias las energías externas (agitación) para destruir temporalmente la adaptación del fluido estructural con el objeto de obtener una solución fluida. Los ejemplo de dichos polímeros son Carbopols® y goma de Xantano. Excipientes Tixotrópicos Con estos excipientes, en reposo, se obtiene una estructura de gel; mientras bajo agitación se obtiene una solución fluida. Los ejemplos de los excipientes tixotrópicos son: Veegum ©(Magnesio-silicato de aluminio) y Avicel RC® (aproximadamente 89% de celulosa microcristalina y 10% de carboximetilcelulosa en Na). 6.3 Reducción del tamaño de partículas Una reducción en el tamaño de las partículas de CaC03 da como resultado una disminución en la capacidad antiácida del compuesto. 6.4 Mantenimiento de las partículas alejadas entre ellas Este es el caso en los compuestos Veegum® y Avicel® para los cuales las partículas insolubles más pequeñas (aproximadamente 1µ??), que las partículas de CaC03l son colocadas entre las partículas de CaC03 con el objeto de evitar la agregación.

Ejemplo 7: Diseño del producto Los siguientes esquemas demuestran ejemplos de diseños de productos posibles. 7.1 CaCOa en la jeringa Ya teniendo lotes clínicos del Rotavirus en frascos liofillzados, el antiácido puede ser colocado en el fluido reconstituido contenido en la jeringa.

Aguja Rotavirus Liofilizado En esta presentación del producto, la sedimentación de CaC03 debe estar bajo control, no solamente durante los pasos del llenado, sino también durante la vida en el almacén completa del producto (por lo menos dos años) 7.2 CaCOa en el frasco liofilizado Aguja Frasco Liofilizado Rotavirus + CaC03 (60mg) Xantano 7.3 Liofilización en una tableta blister En este caso el Rotavirus, el CaC03 y la goma d Xantano son liofilizados juntos directamente en la burbuja.

"Taafl [_a¡ le. Gas Ejemplo 8: Liofilización de diferentes cepas de Rotavirus Tabla 16 Lote n° Cepa de rotavirus Composición de la Título viral en Título viral después formulación tiempo = cero de la liofilización y 1 después de la semana a liofilización temperatura de 37°C 00F26/01 G1 Sacarosa:2% 10 '7 SB purificado n°61 Dextrano:4% PRO/0232 Sorbitol:3% Aminoácidos: 2% 00F26/02 G2 (DS-1) Sacarosa:2% 104·4 10 iA Dextrano:4% Sorbitol: 3% Aminoácidos:2% 00F26/03 G3(P) Saoarosa:2% 10 « Dextrano:4% Sorbitol: 3% Aminoácidos: 2% OOF26/04 G4 (VA-70) Sacarosa:2% 104 Dextrano:4% Sorbitol: 3% Aminoácidos:2% 00F26/05 G9(W161) Sacarosa:2% 104'6 Dextrano:4% Sorbitol: 3% Aminoácidos: 2% Las cepas DS-1, P y VA70 se describen como cepas de referencias del Rotavirus humano para el serotipo G2, G3 y G4 respectivamente en la pág.1361, de "Campos" Raven press 1990, segunda edición. En este experimento se han liofilizado diferentes cepas de Rotavirus. Para todas, ambos de los títulos virales han sido mantenidos durante la liofilización y se ha mostrado la estabilidad acelerada (una semana a una temperatura de 37°C). Ejemplo 9: Estudios de seguridad de fase 1 en adultos de una administración oral de la vacuna de Rotavirus. Se llevó a cabo un estudio de la Fase 1 para evaluar la seguridad y la reactogenicidad de una sola dosis oral de 106 0 de la vacuna P43 en adultos sanos de una edad de 18 a 45 años.

El ensayo clínico fue doble ciego y aleatorizado. Se controló por placebo y fue autocontenido. El estudio se realizó en un solo centro en Bélgica Población en Estudio Un total de 33 sujetos, 11 en el grupo de placebo y 22 en el grupo de la vacuna, se inscribieron y todos terminaron el estudio. Todos los voluntarios fueron Caucacianos. Su edad promedio en el momento de la vacunación fue de 35.3 años, con un rango de 18 a 44 años. El ensayo comenzó en enero y siguió justamente por un mes. Material Vacuna Se produjeron, purificaron, formularon y liofilizaron lotes clínicos de la vacuna P43 de acuerdo con las Buenas Prácticas de Manufactura. Los lotes fueron liberados por Control de Calidad y Aseguramiento de Calidad. Cada frasco de vacuna contenía los siguientes componentes: Ingrediente Activo: Cepa P43 Min. 1 O5,8 ffu Excipientes, estabilizadores: Sacarosa 9 mg Dextrano 18 mg Sorbitol 13.5 mg Aminoácidos 9 mg Placebo Se prepararon y fueron liberados los frascos de placebo. Cada frasco de placebo contenía los siguientes componentes: Excipientes, estabilizadores: Sacarosa 9 mg Dextrano 18 mg Sorbitol 13.5 mg Aminoácidos 9 mg Diluyente Se utilizó agua para inyección como diluyente para reconstituir la vacuna y el placebo. Administración Aproximadamente de 10 a 15 minutos antes de la administración de la vacuna o el placebo, a los sujetos de ambos grupos se les dieron 10 mi de Mylanta® oralmente. El Mylanta® es un antiácido registrado. El antiácido aumenta el pH del estómago y evita la desactivación del rotavirus durante su paso a través del estómago. Para preparar la vacuna, se reconstituyeron dos frascos de P43 liofilizado con un contenido de 105,8 ffu por frasco reconstituido con 1.5 mi de agua diluyente parar inyección.

Esto logró un título viral calculado de 106 1 ffu por dosis. La vacuna reconstituida fue administrada rápidamente como una sola dosis oral. frascos del placebo liofilizado con 1.5 mi de agua para inyección y se administraron oralmente como una sola dosis. Seguridad y Reactogenicidad Se aplicaron los siguientes criterios de seguridad y reactogenicidad: Los síntomas solicitados generales fueron fiebre, diarrea, vómito, náuseas, dolor abdominal y pérdida de apetito. Se registraron durante 8 días posteriores a la administración. Los síntomas no solicitados fueron registrados durante los 30 días posteriores a la administración. Los efectos adversos serios se registraron durante el período de estudio completo. Las muestras de diarrea van a ser recolectadas durante 8 días posteriores a la administración. Los resultados fueron: No se reportaron síntomas solicitados, no solicitados ni efectos adversos serios durante los períodos de observación respectivos. Tampoco se reportaron casos de diarrea. Conclusiones La vacunas SB de P43 biológico fue segura en relación con el placebo cuando se administró oralmente en una modalidad de doble ciego como una sola dosis en una dosis de 106·1 ffu a voluntarios adultos saludables de una edad de 18 a 44 años. Ejemplo 10 -Eficacia de dos dosis de vacuna de Rotavirus monovalente humano, Rotarix™ en la prevención de la Gastroenteritis debida al Rotavirus G1 y que no es G1 (G9) Una Fase II del ensayo controlado por placebo, doble ciego y aleatorizado se llevó a cabo para evaluar la eficacia protectora de la vacuna derivada de la cepa humana G1P 89-12 para la inmunización de infantes. Específicamente, la vacuna utilizada se denominó Rotarix™ y comprende como componentes de rotavirus la cepa G1 humana atenuada depositada en el depósito ECACC 99081301. 493 infantes saludables recibieron dos dosis de Rotarix™ en una concentración viral (106 ffu) o placebo (504) en una edad de 2 y 4 meses, consecutivamente con las vacunas de DTPw-HBV e Hib, el OPV fue administrado dos semanas aparte. Las muestras de diarrea fueron analizadas por la presencia del rotavirus (ELISA) y los serotipos determinados por muestras positivas (RT-PCR). Los episodios de diarrea reportados desde las dos semanas posteriores a la segunda dosis fueron considerados para el análisis de la eficacia. La severidad fue determinada utilizando una escala de 20 puntos (Ruuska y Vesikari, 1990). Una calificación >11 definió la enfermedad severa. Resultados. Un análisis de la eficacia intermedia se realizó en el grupo mencionado anteriormente y los serotipos aislados fueron G1 y G9, casi distribuidos de una manera uniforme. El índice general de ataque en el grupo de placebo varió del 4.8% para el G1 al 3.6% para el G9 durante un período de observación de 6 meses. Dos dosis de Rotarix™ en una concentración de 106 ffu protección contra todos los tipos de diarrea ocasionados por el G1 con un 83% de eficacia [95% Cl: 50.4-95.7], y 92% de eficacia [95% Cl: 47.6-99.8] contra la gastroenteritis severa. Si la diarrea fue ocasionada por el G9, la protección contra todos los tipos de diarrea fue del 60% [95% Cl: 0.2-86.0] y 81% [95% Cl: 33.0-96.4] contra la gastroenteritis severa. Por cada uno de estos puntos finales de eficacia, existió una disminución estadísticamente importante en los episodios de diarrea en el grupo de HRV comparado con el grupo de placebo (p < 0.05, prueba exacta de Fisher de dos lados). Conclusión. Estos resultados soportan altamente la eficacia de dos dosis de una vacuna de HRV monovalente, Rotarix™ para proteger infantes pequeños contra el homólogo de la cepa G1, y una protección cruzada contra la cepa G9. Ejemplo 11 -Eficacia de dos dosis de vacuna de rotavirus monovalente humano, Rotarix™ administrada en tres concentraciones diferentes del virus para prevenir la Gastroenteritis ocasionada por el Rotavirus G1 y el que no es G1 (G2, G3, G4, G9) Una Fase II del ensayo controlada por placebo, doble ciego, aleatorizado se llevó a cabo para evaluar la eficacia protectora y la eficacia contra la hospitalización de una vacuna derivada de la cepa 89-12 del G1P humano para la inmunización de infantes. Específicamente, la vacuna utilizada se denominó Rotarix™ y comprende como componentes de rotavirus la cepa G1 humana atenuada depositada en el depósito ECCAC 99081301. Los infantes saludables recibieron dos dosis de Rotarix™ en tres concentraciones diferentes del virus (468 recibieron 104·7 ffu, 460 recibieron 1052 ffu; 464 recibieron 105·8 ffu) o placebo (454) a una edad de 2 y 4 meses. Consecutivamente con las vacunas DTPw-HBV y Hib, el OPV fue administrado dos semanas aparte. Las muestras de diarrea fueron analizadas por la presencia del rotavirus (ELISA) y los serotipos determinados en las muestras positivas (RT-PCR). Los episodios de diarrea reportados a partir de las dos semanas posteriores a la segunda dosis hasta que los sujetos tenían un año de edad fueron considerados para el análisis de eficacia. La severidad fue determinada utilizando una escala de 20 puntos (Ruuska y Vesikari, 1990). Una calificación de >. 11 definió la enfermedad severa.

Resultados: Los resultados se ilustran en las tablas siguientes. Los infantes en los grupos de vacuna tuvieron episodios de gastroenteritis de manera importante menos de los niños que el grupo de placebo (p < 0.001, prueba exacta de Fisher de dos lados). Dependiendo de la dosis, la eficacia protectora contra la gastroenteritis severa por el rotavirus alcanzó el 86% (95%CI: 63%-96%) y el 70% (95%CI, 46%-84%) contra cualquier gastroenteritis por rotavirus. Para cada uno de estos puntos finales de eficacia, existió una disminución estadísticamente importante en los episodios de diarrea del grupo HRV comparado con el grupo de ' placebo (<0.001 prueba exacta de Fisher de dos lados). Los serotipos múltiples de rotavirus (G1, G2, G3, G4 y G9) fueron identificados por las deposiciones de gastroenteritis (ELISA y RT-PCR) permitiendo calcular también la eficacia de la vacuna contra los serotipos que no son G1. Como se puede observar en la tabla 19, en particular, para los serotipos que no son G1 (G2, G3, G4 y G9) y dependiendo de la dosis, la eficacia contra la gastroenteritis severa por rotavirus alcanzó el 83% (95%CI: 40%-97%), proporcionando una prueba del concepto de que la vacuna de rotavirus humana G1P1A P[8] basada en G1 promueve la protección cruzada contra las cepas heterotípicas (por ejemplo, que no son G1). Características de episodios de gastroenteritis por rotavirus reportados durante el estudio Tabla 17 RIX44141052 ffu ffu ffu Cualquier gastroenteritis por rotavirus 21 22 15 51 no. de episodios (porcentaje) con característica específica entre todas las gastroenteritis por rotavirus episodios reportados Calificaciones de severidad <7 4(19) 8(36) 2(13) 5(10) 7-10 5(24) 4(8) 8(53) 12 (24) >11 2 (57) 10 (45) 5(33) 34 (67) Serotipos de rotavirus identificado G1 silvestre 12 (57) 6 (27) 7 (47) 30 (59) G2 0 0 1 (7) 3 (6) G3 1 (5) 0 0 2 (4) G4 0 0 1 (7) 0 G9 8(38) 14(64) 7(47) 15(29) Canina 0 0 0 1 (2) Desconocido 0 2(9) 0 0 Eficacia protectora de dos dosis de vacuna RIX4414 d rotavirus humana contra la gastroenteritis por rotavirus Tabla 18 Cualquier Gastroenteritis por Hospitalización por gastroenteritis por rotavirus severa gastroenteritis por rotavirus rotavirus Eficacia .... Eficacia .„ .. Eficacia (95% (95% CI) n ( o) (95% Cl) n (/o' CI) Grupos de 1392 58 (4)* 61 (42-74) 27 (2)* 74 (56-85) 9 (0.6)* 79 (48-92) vacuna conjuntados R1X4414 464 15(3)* 70 (46-84) 5(1)* 86 (63-96) 3 (0.6) f 79(25-96) 1058 ffu RIX4414 460 22 (5)* 56 (25-75) 10(2)* 71 (40-87) 1 (0.2)* 93 (54-100) 10 2 ffu RIX4414 468 21 (4)* 58 (29-76) 12 (3)* 66 (32-84) 5(1) † 65 (-2-90) 104 ffu Placebo 454 49 (11) - 34(7) - 14(3) - *p<0.001 para cada comparación entre los grupos de vacuna y placebo para la prueba exacta de Fisher de dos lados (un nivel importante de a = 0.05). †p = 0.037 para la comparación entre los grupos de vacuna y placebo para la prueba exacta de Fisher de dos lados (nivel de importancia de a=0.05). f? = 0.007 para la comparación entre los grupos de vacuna y placebo en la prueba exacta de Fisher de dos lados (nivel de importancia de a = 0.05) N= número de sujetos n/%= número de sujetos que reportan por lo menos un episodio de gastroenteritis por rotavirus especificado. Se muestran intervalos de confianza del 95% exactos.

Eficacia protectora de dos dosis de la vacuna RIX4414 de rotavirus humano contra un serotipo específico para la gastroenteritis por rotavirus severa Tabla 19 Gastroenteritis por rotavirus severa ) Eficacia (95% Cl) valor- otavirus de tipo silvestre G1 Grupos de vacuna conjuntados 1392 13 (0.9) 74 (41-88) <0.001 RIX4414105'8ffu 464 2 (0.4) 88 (48-99) <0.001 RIX4414105-2ffu 460 4 (0.9) 75 (24-94) 0.006 RIX4414104Jffu 468 7(15) 58 (-9-85) 0.057 Placebo 454 16(4) - - Rotavirus que no es G1 (generalmente G9 con los tipos G2, G3 y G4) Grupos de vacuna conjuntados 1392 14(1) 73 (42-88) <0.007 RIX44141058ffu 464 3 (0.6) 83 (40-97) 0.001 RIX44141052ffu 460 6(1) 65 (7-89) 0.020 RIX44141047ffu 468 5(1) 71 (19-92) 0.009 Placebo 454 17(4) - - *Prueba exacta de Fisher de dos lados (nivel de importancia de a = 0.05) utilizado para cada comparación entre los grupos de vacuna y placebo. N= número de sujetos n/%= número de sujetos que reportan por lo menos un episodio especificado de gastroenteritis por rotavirus. Se muestran niveles de confianza exactos del 95%. Conclusión: Estos resultados soportan altamente la eficacia de 2 dosis de la vacuna HRV monovalente, Rotarix™, para proteger a los infantes contra cualquier gastroenteritis y la gastroenteritis severa por rotavirus ocasionada por la cepa homologa G1 y una protección amplia cruzada, contra las cepas heterologas, es decir, G2, G3, G4 y G9.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Un método para inducir un una respuesta inmune contra la infección por rotavirus de un serotipo de rotavirus, comprendiendo el método la administración a un sujeto de una composición que comprende una cepa atenuada de rotavirus de un serotipo diferente.
2. Un método tal y como se describe en la reivindicación 1 caracterizada porque el serotipo es definido por referencia a la secuencia de la proteína G del rotavirus.
3. El método tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el rotavirus atenuado tiene la capacidad de inducir una respuesta inmune contra por lo menos dos de otras cepas de rotavirus.
4. El método tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el rotavirus atenuado tiene la capacidad de inducir una respuesta inmune contra por lo menos tres de otras cepas de rotavirus.
5. Un método tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el rotavirus atenuado tiene la capacidad de inducir una respuesta inmune contra por lo menos cuatro de otras cepas de rotavirus.
6. Un método tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque la cepa de rotavirus atenuado es una sola variante de rotavirus, o substancialmente una sola variante de rotavirus, definida dicha variante por una secuencia de nucleótidos que codifican por lo menos una de las proteínas virales mayores designadas como VP4 y VP7, preferentemente VP7.
7. Un método tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque la composición comprende un rotavirus que tiene un gen VP4 que comprende en la secuencia de nucleótidos, por lo menos uno de los siguientes: una base de adenina (A) en la posición 788, una base de adenina (A) en la posición 802 y una base de timina (T) en la posición 501 del codón de partida.
8. Un método tal y como se describe en la reivindicación 7, en el cual el gen VP4 comprende una secuencia de nucleótidos que comprende una base de adenina (A) en las posiciones 788 y 802 y una base de timina (T) en la posición 501 del codón de partida.
9. Un método tal y como se describe en la reivindicación 1, en el cual la composición comprende un rotavirus que tiene un gen VP7 que comprende, en la secuencia de nucleótidos, por lo menos unos de los siguientes: una timina (T) en la posición 605, una adenina (A) en la posición 897 y una guanina (G) en la posición 897 del codón de partida.
10. Un método tal y como se describe en la reivindicación 9, en el cual el gen VP7 comprende una secuencia de nucleótidos que comprende una timina (T) en la posición 605 y una adenina (A) o una guanina (G) en la posición 897 del codón de partida.
11. Un método tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque la composición comprende un rotavirus que tiene un gen VP4 que comprende, en la secuencia de nucleótidos, una adenina (A) en las posiciones 788 y 802 y una timina (T) en la posición 501 del codón de partida; y en donde el gen VP7 comprende, en la secuencia de nucleótidos, una timina (T) en la posición 605, y una adenina (A) en la posición 887 del codón de partida.
12. Un método tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque la composición comprende una cepa de rotavirus G1 y es utilizado para inducir una respuesta inmune al G1 en por lo menos uno de los serotipos que no son G1 seleccionados del grupo consistente de serotipos: G2, G3, G4, G5, G6, G7, G8, G9, G10, G11, G12, G13, y G14.
13. Un método tal y como se describe en la reivindicación 12, caracterizado porque la composición comprende una cepa de rotavirus G1 y es utilizada para inducir una respuesta inmune al G1 en por lo menos dos de los serotipos que no son G1 seleccionados del grupo consistentes de serotipos: G2, G3, G4, G5, G6, G7, G8, G9, G10, G11, G12, G13, y G14.
14. El método tal y como se describe en la reivindicación 12 ó 13 caracterizado porque la composición, comprende una cepa de rotavirus G1 y es utilizada para inducir una respuesta inmune a los serotipos G1 y G2, G3, G4 y G9.
15. Un método tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque la composición es hasta el 60% protectora, en una población de individuos vacunados, contra la diarrea ocasionada por la infección de un rotavirus de un tipo diferente al tipo presente en el rotavirus atenuado de la composición.
16. Un método tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque la composición es hasta el 81% protectora contra la gastroenteritis ocasionada por la infección de un rotavirus de un tipo diferente al del rotavirus atenuado presente en la composición.
17. Un método tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque la composición comprende una cepa de rotavirus G1 la cual es hasta 83% protectora en una población de individuos vacunados contra la gastroenteritis severa ocasionada por la infección de rotavirus de por lo menos dos serotipos que no son G1.
18. Un método tal y como se describe en la reivindicación 17, caracterizado porque la gastroenteritis es ocasionada por la infección de un rotavirus de por lo menos cuatro serotipos que no son G1 seleccionados del grupo consistente de G2, G3. G4, G5, G6, G7, G8, G9, G10, G11, G12, G13 y G14.
19. Un método tal y como se describe en la reivindicación 17 ó 18 caracterizado porque la gastroenteritis es ocasionada por una infección con los serotipos G2, G3, G4 Y G9.
20. Un método tal y como se describe en la reivindicación 1 caracterizado porque la cepa de rotavirus es el depósito ECACC 99081301 y se puede obtener o derivar del depósito ECACC 99081301.
21. Un método tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque la composición es administrada en un régimen de dos dosis.
22. Un método tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque la cepa de rotavirus atenuado es formulada con un vehículo farmacéutico adecuado o con un regulador antiácido o ambos.
23. El uso de una cepa de rotavirus atenuada de un serotipo en la preparación de un medicamento para inducir una respuesta inmune contra una infección por rotavirus de un serotipo de rotavirus diferente.
24. El uso tal y como se describe en la reivindicación 23, en donde el serotipo es definido por referencia a la secuencia de la proteína G del rotavirus.
25. El uso tal y como se describe en la reivindicación 23 ó 24, caracterizado porque el rotavirus atenuado tiene la capacidad de inducir una respuesta inmune contra por lo menos dos de otras cepas de rotavirus.
26. El uso tal y como se describe en las reivindicaciones de la 23 a la 25, en donde el rotavirus atenuado tiene la capacidad de inducir una respuesta inmune contra por lo menos tres de otras cepas del rotavirus.
27. El uso tal y como se describe en las reivindicaciones de la 23 a la 26, caracterizado porque el rotavirus atenuado tiene la capacidad de inducir una respuesta inmune contra por lo menos otras cuatro cepas de rotavirus.
28. El uso tal y como se describe de las reivindicaciones de la 23 a la 27, caracterizado porque la cepa de rotavirus atenuado es una sola variante de rotavirus, o substancialmente una sola variante de rotavirus, siendo definida dicha variante por una secuencia de nucieotidos que codifican por lo menos una de las proteínas virales mayores designadas como VP4 y VP7, preferentemente VP7.
29. El uso tal y como se describe en las reivindicaciones de la 23 a la 28, en donde la composición comprende un rotavirus que tiene el gen VP4 que comprende en la secuencia de nucieotidos, por lo menos uno de los siguientes: una base de adenina (A) en la posición 788, una base de adenina (A) en la posición 802, y una base de timina (T) en la posición 501 del codón de partida.
30. El uso tal y como se describe en la reivindicación 29, en el cual el gen VP4 comprende una secuencia de nucleótidos que comprende una base de adenina (A) en las posiciones 788 y 802 y una base de timina (T) en la posición 501 del codón de partida.
31. El uso tal y como se describe en las reivindicaciones de la 23 a la 28, en el cual la composición comprende un rotavirus que tiene un gen VP7 que comprende en la secuencia de nucleótidos, por lo menos uno de los siguientes: una timina (T) en la posición 605, una adenina (A) en la posición 897 y una guanina (G) en la posición 897 del codón de partida.
32. El uso tal y como se describe en la reivindicación 31 en el cual el gen VP7 comprende una secuencia de nucleótidos que comprende una timina (T) en la posición 605, y un adenina (A) o una guanina (G) en la posición 897 del codón de partida.
33. El uso tal y como se describe en la reivindicación 30 ó 32 en donde la composición comprende un rotavirus que tiene un gen VP4 que comprende, en la secuencia de nucleótidos, una adenina (A) en las posiciones 788 y 802, y una timina (T) en la posición 501 del codón de partida; y en donde el gen VP7 comprende, en la secuencia de nucleótidos, una timina (T) en la posición 605 y una adenina (A) en la posición 897 del codón de partida.
34. El uso tal y como se describe en las reivindicaciones de la 23 a la 33, en donde la composición comprende una cepa de rotavirus G1 y es utilizada para inducir una respuesta inmunológica al G1 y por lo menos uno de los serotipos que no son G1 seleccionados del grupo consistente de serotipos G2, G3, G4, G5, G6, G7, G8, G9, G10, G11, G12, G13 y G14.
35. El uso tal y como se describe en la reivindicación 34, en donde la composición comprende una cepa de rotavirus G1 y es utilizada para inducir una respuesta inmune al serotipo G1 y por lo menos 2 de los serotipos que no son G1 seleccionados del grupo consistente de serotipos: G2, G3, G4, G5 G6, G7, G8, G9, G10, G11, G12, G13, y G14.
36. El uso tal y como se describe en la reivindicación 35, en donde la composición comprende, una cepa de rotavirus G1 y es utilizada para inducir una respuesta inmune a los serotipos G1 y G2, G3, G4 y G9.
37. El uso tal y como se describe en las reivindicaciones de la 23 a al 36 en donde la composición es hasta 60% protectora, en una población de individuos vacunados, contra la diarrea ocasionada por la infección de un rotavirus de un tipo diferente al del rotavirus atenuado presente en la composición.
38. El uso tal y como se describe en las reivindicaciones de la 23 a la 37, en donde la composición es hasta 81% protectora contra la gastroenteritis ocasionada por infección de un rotavirus de un tipo diferente al rotavirus atenuado presente en la composición.
39. El uso tal y como se describe en las reivindicaciones de la 23 a la 38, en donde la composición comprende una cepa de rotavirus G1 la cual es hasta 83% protectora en una población de individuos vacunados contra la gastroenteritis severa ocasionada por infección por rotavirus de por lo menos dos serotipos que no son G1.
40. El uso tal y como se describe en las reivindicaciones 38 y 39 en donde la gastroenteritis es ocasionada por la infección de un rotavirus de por lo menos cuatro serotipos que no son G1 seleccionados del grupo consistente de serotipos G2, G3, G4, G5, G6, G7, G8, G9, G10, G11, G12, G13 y G14.
41. El uso tal y como se describe en las reivindicaciones de la 38 a la 40 en donde la gastroenteritis es ocasionada por una infección con los serotipos G2, G3, G4 y G9.
42. El uso tal y como se describe en las reivindicaciones de la 23 a la 41, en donde la cepa de rotavirus es el depósito ECCAC 99081301, o se puede obtener o derivar del depósito ECCAC 99081301.
43. El uso tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 23 a la 42, en donde la composición es administrada en un régimen de dos dosis.
44. El uso tal y como se describe en las reivindicaciones de la 23 a la 43, en donde la cepa de rotavirus atenuado es formulada con un vehículo farmacéutico adecuado o con un regulador antiácido o ambos.
45. Un método o uso tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la cepa de rotavirus es un serotipo G1 y puede inducir una respuesta Inmune contra el serotipo que no es G1 el cual no es el serotipo G9