MXPA06001621A - Proceso para producir rosas con color modificado - Google Patents

Abstract

Un proceso para producir una rosa, caracterizado en que la trayectoria metabólica intrínseca de la rosa se suprime artificialmente y de manera que una codificación genética para flavonoide 3,5'-hidroxilasa derivada de pensamiento se expresa.

Description

PROCESO PARA PRODUCIR ROSAS CON COLOR MODIFICADO Campo Técnico La presente invención se relaciona a un nuevo método para producir una rosa con colores alterados . Más específicamente, se relaciona a un método para producir una rosa inhibiendo artificialmente la trayectoria metabólica endógena de la rosa, y expresando el gen que codifica el flavonoide 3 ' , 5 ' -hidroxilasa del pensamiento y el gen que codifica la dihidroflavonol reductasa, la cual reduce dihidromiricetina .

Antecedentes de la Técnica Los pétalos de las flores realizan el papel de atraer polinizadores tales como insectos y aves, los cuales transportan polen de las plantas, y por consiguiente los colores, formas, patrones y olores de las flores se han desarrollado en tándem con los polinizadores (Honda, T. et al., Gendai Kagaku, May, 25-32(1998)). Probablemente, como un resultado de esto, es raro para una sola especie de flores exhibir varios colores diferentes, y por ejemplo, la rosa o las variedades de claveles que exhiben colores violeta a azul no existen, mientras las variedades de iris o de genciana que exhiben colores rojo brillante no existen. Debido a que el color de las flores es el aspecto más importante de los pétalos para propósitos de apreciación también, se han cultivado tradicionalmente flores de diferentes colores por hibridización. La rosa, conocida como la "reina de las flores" y la cual tiene un valor comercial elevado, se ha cruzado en todo el mundo . Por ejemplo, el cultivo de rosas amarillas actuales se creó por el cruce de Rosa foetida, originaria del oeste asiático, con una variedad de rosas no amarillas. Sin embargo, debido a que el color de las flores se determina por la capacidad genética de la planta, ha habido un limite para los colores de las flores que pueden producirse actualmente en cepas de hibridización cuyas fuentes genéticas disponibles se restringen (Tanaka et al. Plant Cell Physiol . 39, 1119-1126, 1998; Mol. et al. Curr. Opinión Biotechnol . 10, 198-201 1999) . Entre estos, el cultivo de rosas azules se ha pensado imposible y se ha considerado el "santo grial" de los colores (Oba, H., "Bara no Tanjo", 1997, Chukoshinsho ; Suzuki, M. , "Shokubutsu Bio no Mahou: Aoi Bara mo Yume dewanakunatta" , 1990, Kodansha Bluebacks ; Saisho, H. , "Aoi Bara", 2001, Shogakkan) . Aunque las variedades de "rosa azul" existen actualmente, estos son de hecho rosas violeta pálido. La primera variedad mejorada de "rosa azul" por hibridización es aquella que se ha matizado de color gris violeta claro "Grey Pearl" creada en 1945. La "Staring Silver" de color rosa violeta claro se creó finalmente en 1957, y estas variedades se cruzaron para producir varias rosas violeta pálido tales como "Blue Moon" (1964) y "Madame Violet" (1981) . Estas rosas violeta pálido y otras rosas se utilizaron entonces en cultivo adicional para crear rosas de color gris claro tales como "Seiryu" (1992) y "Blue Haven" (2002) que fueron aclamadas como nuevos tipos de "rosas azules" . Sin embargo, estos colores de flores no son realmente azules, sino simplemente rosa con matices grises y a pesar de muchos años de esfuerzos en la reproducción, no existe aún ejemplos de una rosa "azul" realmente. En la industria de la horticultura, el grupo de colores desde el violeta a azul se considera generalmente "azul" de acuerdo a RHSCC (la Gráfica de Colores de la Real Sociedad de Horticultura) . Es un propósito de la presente invención crear plantas de rosas que tengan colores de flores que caigan dentro del "grupo violeta" , grupo "azul violeta" y "grupo azul" de acuerdo a la Gráfica de Colores de la Real Sociedad de Horticultura. Los colores de las flores derivados principalmente a partir de los tres grupos de compuestos de antocianinas, carotenoides y betalainas, aunque es la antocianina, la que tienen el rango de longitud de absorción más amplio (desde anaranjado a azul) , que son responsables del color azul. Las antocianinas pertenecen a la familia de los flavonoides y se biosintetizan por la trayectoria metabólica mostrada en la Figura 1. Las antocianinas se ubican normalmente en las vacuolas de las células epiteliales . El tono del color de las antocianinas (es decir, el color de las flores) depende en gran medida de la estructura de las antocianinas, con grupos hidroxilo más numerosos en el anillo B que resultan en un color azul. La hidroxilación del anillo B se cataliza por flavonoide 3 ' -hidroxilasa (F3 ?) y flavonoide 3 ',5'-hidroxilasa (F3'5'H) . La ausencia de la actividad de F3'H y F3'5'H conduce a síntesis de pelargonidina (colores anaranjado a rojo), la presencia de la actividad F3 'H conduce a síntesis de cianidina (colores rojos a carmesí) y la presencia de síntesis de la actividad F3 ' 5 'H conduce a síntesis de delfinidina (color violeta) . Estas antocianidinas se modifican con azúcares y grupos acilo para producir una variedad de antocianinas . Generalmente hablando, un gran número de grupos acilo aromáticos modificados se correlaciona a antocianinas más azules . Las antocianinas producen también colores muy diferentes dependiendo del pH de la vacuola y los flavonoles y flavones co-presentes o los iones metálicos (Saito, N. , Tanpakushitsu akusan Kouso, 47 202-209, 2002; Broullard y Dangles, In the flavonoids : Advances in Research since 1986 (Ed. por Harborne) Capmann y Hall, London pp . 565-588; Tanaka et al. Plant Cell Physiol. 39 1119-1126, 1998; Mol et al., Trends in Plant Science 3, 212-217, 1998; Mol et al., Curr. Opinión Biotechnol . 10, 198-201 1999) . Las antocianinas de los pétalos de flores de rosas se derivan de pelargonidina, cianidina y peonidina, mientras que no se conocen derivados de delfinidina (Biolley and May, J. Experimental Botany, 44, 1725-1734 1993; Mikanagi Y., Saito N. , Yokoi M. and Tatsuzawa F. (2000) Biochem. Systematics Ecol . 28:887-902). Esto se considera que es la principal razón para la carencia de rosas azules . Las rosas existentes se han creado por la hibridización de especies de rosas relacionadas cruzables (R . mul ti flora, R . chinensis, R . gigantean, R . moschata, R . galile , R . whichuraiana, R . foetida, etc . ) . El hecho de que no se ha conseguido ninguna rosa azul a pesar de esfuerzos repetidos en la hibridización se atribuye a la carencia de la capacidad de producción de delfinidina por variedades relacionadas con rosas. La producción de delfínidina en pétalos de rosa requeriría la expresión de F3'5'H en los pétalos como se menciona anteriormente, pero F3'5'H se cree que no se expresa en los pétalos de las rosas y variedades relacionadas con rosas. De este modo, es probablemente imposible obtener una roza azul acumulando delfinidina en los pétalos a través de la hibridización. Se sabe que cantidades trazas de rosacianina de pigmento azul se encuentran en los pétalos de rosas y su estructura química se ha determinado (Solicitud de Patente Japonesa No Examinada No. 2002-201372), pero no se conocen reportes con respecto al aumento de rosacianina para crear una rosa azul, y no se ha publicado ningún hallazgo en la trayectoria de la biosíntesis de la rosacianina o las enzimas o genes relevantes . Ejemplos de colores azul o violeta producidos por organismos biológicos incluyen también añil producido por plantas índigo (por ejemplo, Appl . Microbiol . Biotechnol. Feb. 2003, 60(6) :720-5) y violaceina producida microbialmente (J. Mol. Microbiol. Biotechnol. Oct . 2000 2(4):513-9; Org. Lett., Vol. 3, No. 13, 2001, 1981-1984), y se han estudiado su derivación del triptofano y sus trayectorias biosintéticas . Los pigmentos azules basados en compuestos iridoides derivados de frutos del gardenia (S. Fujikawa, Y. Fukui, K. Koga, T. Iwashita, H. Komura, K. Nomoto, (1987) Structure of genipocyanin Gl, a spontaneous reaction product between genipin and glycine. Tetrahedron Lett. 28 (40), 4699-700; S. Fujikawa, Y. Fukui, K. Koga, J. Kumada, (1987), Brilliant skyblue pigment formation from gardenia fruits, J. Ferment . Technol . 65 (4), 419-24) y azúlenos derivados de liquen (Wako Puré Chemical Industries Co . , Ltd) se conocen también, pero no se conocen reportes que expresen estos pétalos de flores de plantas para producir flores de color azul . Se había esperado que una rosa azul podría crearse transfiriendo el gen F3 ' 5 'H expresado en otras plantas en rosas y expresando éste en pétalos de rosas (Saisho, H. , "Aoi Bara", 2001, Shogakkan) . El gen F3 ' 5 'H se ha obtenido a partir de varias plantas incluyendo la petunia, la genciana y Eustoma russellianum (Holton et al. Nature 366, 276-279, 1993; Tanaka et al. Plan Cell Physiol, 37, 711-716 1996; W093/18155) . Existen también reportes de variedades transformadas de rosas (por ejemplo, Firoozababy et al. Bio/Technology 12:883-888 (1994); US 5480789; US 5792927; EP 536,327 Al; US 20010007157 Al). Se ha reportado también la transferencia actual del gen F3'5'H de la petunia en rosas (W093/18155, O94/28140) . Sin embargo, no ha sido posible obtener una rosa azul , y se cree que obtener una rosa azul requerirá una modificación, la cual altere el metabolismo de los pigmentos de las flores adaptados para rosas. Por otro lado, se ha confirmado que la transferencia del gen F3'5'H en el clavel rojo, el cual produce pelargonidina en lugar de delfinidina, conduce a la acumulación tanto de pelargonidina como de delfinidina, pero aquel color de flores se altera solamente a un rojo ligeramente púrpura ( O94/28140) . Este resultado sugiere que no es posible obtener un clavel "azul" simplemente por la expresión de F3'5'H, y que es necesario inhibir la trayectoria metabólica a síntesis endógena de la pelargonidina por el clavel . Con el fin de evitar la competencia con la trayectoria metabólica endógena del clavel (reducción de dihidrocaenferol (DHK) por dihidroflavonol reductasa (DFR) ) , una variedad que carece de DFR se seleccionó de entre los claveles blancos. El gen F3'5'H y el gen de petunia DFR (la cual se conoce que reduce eficientemente dihidromiricetina (DHM) sin reducir DHK) se transfirieron en el clavel. Esto resulta en un caso al obtener exitosamente un clavel recombinante con un contenido de delfinidina de aproximadamente 100% y un color de flores azul-violeta no encontrado previamente en el clavel (Tanpakushitsu Kakusan Kouso, Vol. 47, No. 3, p228, 2002) . De este modo, la modificación adicional fue necesaria para realizar un flor de clavel azul, además de acumular delfinidina por la expresión del gen F3'5'H. La DFR se ha clonado ya a partir de varias plantas (petunia, tabaco, rosa, Torenia, cabeza de dragón, margarita transvaal , orquídea, cebada, maíz, etc.) (Meyer et al., Nature 330, 677-678, 1987; Helariutta et al., Plant Mol. Biol. 22, 183-193 1993; Tanaka et al., Plant Cell Physiol. 36, 1023-1031; Johnson et al., Plant J. 19, 81-85, 1999). La especificidad del sustrato del gen DFR difiere dependiendo de la variedad de la planta, y se sabe que los genes DFR de la petunia, el tabaco y la orquídea no pueden reducir DHK, mientras que el gen de DFR de la petunia reduce más eficientemente DHM entre los dihidroflavonoles (Forkmann et al., Z. Naturfosch. 42c, 1146-1148, 1987; Johnson et al. Plant J. 19, 81-85, 1999) . No obstante, no se han reportado casos para la expresión de estos genes DFR en las rosas. Como un medio para evitar la competencia con la trayectoria metabólica endógena o entre la enzima y la enzima derivada del gen exógeno tal como F3'5'H, como se mencionó anteriormente, el gen puede transferirse en una variedad que carece del gen. También, se sabe que la expresión del gen objetivo puede inhibirse artificialmente por eliminación de métodos que implican la recombinación homologa del gen objetivo, pero debido a la frecuencia baja de recombinación homologa y el número limitado de variedades de plantas adecuadas, esto no se ha implementado en la práctica (por ejemplo, Nat . Biotechnol. 2002, 20:1030-4). Los métodos de inhibición en el nivel de transcripción incluye el método antisentido que utiliza transcripciones de ARN antisentido para ARNm del gen objetivo (van der Krol et al., Nature 333, 866-869, 1988), el método sentido (co-supresión) que utiliza transcripciones de ARN equivalentes a ARNm del gen objetivo (Napoli et al., Plant Cell 2, 279-289, 1990) y un método para utilizar transcripciones de ARN dúplex, que corresponden a ARNm del gen objetivo (método ARNi ; Waterhouse et al., Pro. Nati. Acad. Sci. USA 95, 13959-13964, 1998) . Se han publicado numerosos ejemplos exitosos de estos tres métodos. Para las rosas, la co-supresión del gen chalcon sintasa (CHS) que es necesaria para la síntesis de antocianinas se reportó para alterar exitosamente el color de las flores de rojo a rosa (Gutterson HortScience 30:964-966 1995) , pero esta supresión CHS es incompleta y por lo tanto no ha sido posible suprimir totalmente la síntesis de antocianina para obtener una reserva de flores blancas . Documento 1 de patentes: Publicación de Patente Japonesa no Examinada No. 2002-201372 Documento 2 de Patente: W093/18155 Documento 3 de Patente: USP 5480789 Documento 4 de Patente: USP 579927 Documento 5 de Patente: EP 536 327 Al Documento 6 de Patente: US 20010007157 Al Documento 7 de Patente: O94/28140 Documento 1 que no es patente: Honda T. et al.

Gendai Kagaku, May, 25-32 (1998) Documento 2 que no es patente : Tanaka et al . Plant Cell Physiol. 39, 1119-1126, 1998 Documento 3 que no es patente: Mol et al. Curr. Opinión Biotechnol. 10, 198-201 1999 Documento 4 que no es patente: Oba, H. , "Bara no Tanjo", 1997, Chukoshinsho Documento 5 que no es patente: Suzuki, M. , "Shokubutsu Bio no Mahon: Aoi Bara mo Yume dewanakunatta" , 1990, Kodansha Bluebacks Documento 6 que no es patente: Saisho, H. , "Aoi Bara", 2001, Shogakkan Documento 7 que no es patente: Saito, N. , Tanpakushitsu Kakusan Kouso, 47 202-209, 2002 Documento 8 que no es patente: Broullard et al. En los flavonoides: Advances in Research since 1986 (Ed por Harborne) Capmann and Hall, London pp 565-588 ++++ escanear REFERENCIA. Documento 9 no es patente: Tanaka et al. Plant Cell Physiol. 39 1119-1126, 1998 Documento 10 que no es patente: Mol et al, Trends in Plant science 3, 212-217 1998 Documento 11 que no es patente: Mol et al. Curr. Opinión Biotechnol. 10, 198-201 1999 Documento 12 que no es patente: Biolley and May, J. Experimental Botany, 44, 1725-1734 1993 Documento 13 que no es patente: Mikanagi Y, et al. (2000) Biochem Systematics Ecol . 28:887-902 Documento 14 que no es patente: Appl . Microbiol. Biotechnol. 2003 Feb; 60(6):720-5 Documento 15 que no es patente: J. Mol. Microbiol.

Biotechnol. 2000 Oct; 2 (4):513-9 Documento 16 que no es patente: Org. Lett., Vol. 3, No. 13, 2001, 1981-1984 Documento 17 que no es patente: S. Fujikawa, et al. (1987) Tetrahedron Lett. 28 (40), 4699-700 Documento 18 que no es patente: S. Fujikawa, et al. (1987) J. Ferment. Technol . 65 (4), 419-24 Documento 19 que no es patente: Holton et al. Nature 366, 276-279, 1993 Documento 20 que no es patente: Tanaka et al. Plant Cell Physiol. 37, 711-716 1996 Documento 21 que no es patente: Firoozababy et al. Bio/Technology 12 : 883-888 (1994) Documento 22 que no es patente: Tanpakushitsu Kakusan Kouso, Vol. 47, No. 3, p228, 2002 Documento 23 que no es patente: Meyer et al. Nature 330, 677-678, 1987 Documento 24 que no es patente: Helariutta et al. Plant Mol. Biol. 22 183-193 1993 Documento 25 que no es patente: Tanaka et al. Plant Cell Physiol. 36, 1023-1031 Documento 26 que no es patente: Johnson et al. Plant J. 19, 81-85, 1999 Documento 27 que no es patente: Forkmann et al . Z. Naturforsch. 42c, 1146-1148, 1987 Documento 28 que no es patente: Nat Biotechnol 2002, 20:1030-4 Documento 29 que no es patente: van der Krol et al. Nature 333, 866-869, 1988 Documento 30 que no es patente: Napoli et al. Plant Cell 2, 279-289, 1990 Documento 31 que no es patente: Waterhouse et al. Pro. Nati. Acad. Sci. USA 95, 13959-13964 1998 Documento 32 que no es patente: Gutterson HortScience 30:964-966 1995 Documento 33 que no es patente: Suzuki, S., "Bara, Hanazufu" , Shogakkann, p.256-260, 1990 Descripción de la Invención Como se menciona anteriormente, los colores de flores de rosas se han alterado exitosamente transfiriendo el gen F3 ' 5 'H en rosas y expresando éste en los pétalos. En el clavel, el gen F3 ' 5 'H y el gen DFR de petunia se ha expresado en las variedades deficientes de DFR para crear claveles azul-violeta. Sin embargo, una "rosa azul" no se ha creado aún. Es por lo tanto un objeto de la presente invención proporcionar una rosa con florescencias con una flor azul . La invención proporciona así (1) un método para producir una rosa caracterizada por suprimir artificialmente la trayectoria metabólica endógena de la rosa y expresar la codificación genética del pensamiento para flavonoide 3 ',5'-hidroxilasa . La invención proporciona además (2) un método para producir una rosa, caracterizado por suprimir artificialmente la trayectoria metabólica endógena de la rosa, y expresar el gen del pensamiento que codifica para el flavonoide 3 ',5'-hidroxilasa y el gen que codifica para la dihidroflavonol reductasa. La invención proporciona aún (3) un método para producir una rosa, caracterizado por suprimir artificialmente la expresión de la dihidroflavonol reductasa endógena de la rosa, y expresar la codificación genética del pensamiento para flavonoide 3 ' , 5 ' -hidroxilasa y la codificación genética para dihidroflavonol reductasa derivada a partir de una planta diferente de la rosa. La invención proporciona además todavía (4) un método para producir una rosa caracterizada al suprimir artificialmente la expresión del flavonoide 3 ' -hidroxilasa endógena de la rosa y expresa la codificación genética del pensamiento para flavonoide 3 ', 5 ' -hidroxilasa. La codificación genética del pensamiento antes mencionada para el flavonoide 3 ', 5 ' -hidroxilasa es, por ejemplo, el gen listado como la SEC. DE IDENT. NO.: 1 ó la SEC. DE IDENT. NO.: 3. La codificación genética para dihidroflavonol reductasa se deriva de preferencia a partir de iris, Nierembergia, petunia, orquídea, genciana o Eustoma russellianum. La invención proporciona además todavía (5) una rosa obtenida para el método de producción de acuerdo a cualquiera de (1) a (4) anterior, o una progenie o tejido de la misma que tiene las mismas propiedades como la rosa. La invención proporciona todavía además (6) una rosa obtenida por el método de producción de acuerdo a cualquiera de (1) a (4) anteriores, o una progenie o tejido del mismo, en donde el color del pétalo de la rosa es violeta, azul-violeta o azul. La invención proporciona además (7) una rosa de acuerdo a (6) anterior, o una progenie o tejido del mismo, en donde el color del pétalo de la rosa pertenece al "grupo violeta" , grupo "violeta-azul" o "grupo azul" de acuerdo a la Gráfica de Color de la Real Sociedad de Horticultura (RHSCC) . La invención proporciona además (8) una rosa de acuerdo a (7) anterior, o una progenie o tejido de la misma, en donde el color del pétalo de la rosa pertenece a un "grupo violeta" 85a u 85b de acuerdo con la Gráfica de Color de la Real Sociedad de Horticultura (RHSCC) .

Breve Descripción de los Dibujos La Figura 1 muestra la trayectoria de biosíntesis de flavonoide. CHS: chalcon sintasa, CHI : chalcon isomerasa FNS : flavona sintasa, F3H: flavanona 3-hidroxilasa F3'H: flavonoide 3 ' -hidroxilasa F3'5'H: flavonoide 3'5'-hidroxilasa, FLS : Flavonol sintasa DFR: dihidroflavonol 4-reductasa ANS : antocianidina sintasa, AS: aurona sintasa C2'GT: chalcon 2 ' -glucosil transferasa La Figura 2 muestra la estructura del plásmido pBERDl . La Figura 3 muestra la estructura del plásmido pBPDBP2. La Figura 4 muestra la estructura del plásmido pBPDBPd . La Figura 5 muestra la estructura del plásmido pSPB461. La Figura 6 muestra la estructura del plásmido pSPB472. La Figura 7 muestra la estructura del plásmido pSPB130. La Figura 8 muestra la estructura del plásmido pSPB919. La Figura 9 muestra la estructura del plásmido pSPB920. La Figura 10 muestra la estructura del plásmido pSBP1106.

Mejor Modo Para Llevar A Cabo la Invención Varias razones pueden postularse para una falta de color azul en rosa aún con la producción de delfinidina. La estabilidad, la solubilidad y el color de antocianinas varían dependiendo de la modificación con grupo acilo y azúcares. Específicamente, se sabe que un número incrementado de grupos acilo aromáticos resulta en azulado mayor. También, la formación de complejos entre co-pigmentos flavonoles y flavona y antocianinas produce un color azul y el cambio de la longitud de onda de absorción máxima hacia el extremo de longitud de onda más largo mientras que se incrementa también la absorbancia. El color de antocianina es dependiente también del pH. Ya que un pH inferior tiende hacia la rojez y un pH más neutro produce un grado azulado, el color de las flores depende del pH de las vacuolas en donde las antocianinas se ubican. Además, la formación de quelatos metálicos en la co-presencia de los iones metálicos tales como Al3+ y Mg2+ puede afectar significativamente el color de las flores también. El ensayo y error y la investigación asidua conduce a la propuesta para una modificación por lo que la proporción de delfinidina en los pétalos de las flores se incrementa. En primer lugar, se intenta crear una rosa azul por el mismo método utilizado para crear un clavel azul-violeta. Específicamente, se intentó analizar una variedad 112 de rosas blancas e identificar una línea deficiente de DFR, pero diferente del clavel, una línea no completamente deficiente de DFR podría obtenerse . Esto se debe presumiblemente al hecho que el clavel es diploide mientras que la rosa ordinariamente cultivada es tetraploide, de manera que es difícil encontrar una línea deficiente en un solo gen. Enseguida, el gen F3'5'H del pensamiento y el gen DFR de la petunia se transfirieron en la variedad de flores blancas Tíneke y se detectó la variedad de delfinidina, pero la cantidad fue mínima y una rosa azul no se obtuvo. De acuerdo con la presente invención, el gen DFR, una enzima que participa en la trayectoria de la síntesis del flavonoide endógeno, se suprime artificialmente por una técnica de ingeniería genética, y el gen F3 ' 5 'H del pensamiento se expresa mientras que un gen DFR de reducción de dihidromiricetina se expresa también, con el fin de incrementar el contenido de delfinidina a aproximadamente 80-100% de las antocianidinas totales en los pétalos de la flor, por lo que se permite la realización de una rosa azul. Los genes DFR de reducción de dihidromiricetina utilizados en este caso se derivaron de iris (Iridaceae) , Nierembergia (Solanaceae) y petunia (Solanaceae) , pero como otras fuentes del gen DFR de reducción de dihidromiricetina, puede haberse mencionado plantas que no acumulan pelargonidina tales como el tabaco ( Solanaceae) , ciclamino (Primulaceae) , delfinio (Ranunculaceae) , orquídea (Orchidaceae) , genciana ( Gentianaceae) , Eustoma russellianum (Gentianaceae) y similares (Forkmann 1991, Plant Breeding 106, 1-26; Johnson et al., Plant J. 1999, 19, 81-85). Los genes DFR utilizados para la presente invención son genes que reducen de preferencia la dihidromiricetina. De acuerdo con la invención, el gen flavonoide 3'-hidroxilasa (F3'H), una enzima que participa en la trayectoria de síntesis del flavonoide endógena de la rosa, se suprime artificialmente por una técnica de ingeniería genética, y el gen F3'5'H del pensamiento se expresa, con el fin de incrementar el contenido de delfinidina a aproximadamente 80-100% de las antocianidinas totales en los pétalos de las flores, por lo que se permite la realización de una rosa azul . La rosa obtenida de acuerdo a la invención tiene hasta ahora colores de flores no existentes, y la invención puede proporcionar rosas con colores de flores que pertenecen no sólo al grupo rojo-púrpura, al grupo púrpura y el grupo púrpura-violeta también al grupo violeta, el grupo violeta-azul y el grupo azul, de acuerdo a la Gráfica de Color de la Real Sociedad de Horticultura.

Ejemplos La presente invención se explicará ahora en mayor detalle por los siguientes ejemplos. A menos que se especifique de otra manera, los protocolos biológicos moleculares utilizados se basan en Molecular Cloning (Sambrook and Russell, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) .

Ejemplo 1. Método de medición de color de las flores El tono de color de los pétalos de las flores se evalúo por la medición utilizando un colorímetro espectrofotométrico CM2022 (Minolta Japan) con un campo visual de 10° y una fuente de luz D65, y el análisis utilizando el software de control de color SpectraMagic (Minolta Japan) . El número de la Gráfica de Color de la Real Sociedad de Horticultura (RHSCC) es el color más cercano cuando se compara contra la Versión 2.1.1 del Sistema de Clasificación de Color (The Japan Research Institute Co., Ltd.; Publicación de Patente Japonesa no Examinada No. 2002-016935) , con base en el valor del color (CIÉ L*a*b* del sistema de color) obtenido por discriminación visual y la medición con el dispositivo mencionado anteriormente. Este sistema puede utilizarse para selección objetivo del número RHSCC más cercano . Al medir los tonos de color de pétalos de las flores de los cultivos convencionalmente referidos como "rosas azules" y determinando los colores más cercanos de acuerdo a RHSCC por este método, se determinó que la Blue Moon y la Madam Violet fueron 186d (grupo Agrisado-Púrpura) , Lavanda fue 186c (Grupo Agrisado-Púrpura) , Seiryu fue 189d (Grupo Agrisado-Verde) y Azul Cielo fue 198d (grupo Agrisado-Verde) . Estos cultivos se llamaron rosas azules, pero se clasificaron en grupos "Grises" de acuerdo al número RHSCC y por lo tanto no exhiben el color azul, el cual es el objeto de la presente invención.

Ejemplo 2. Análisis de Flavonoides 1) Extracción del color de pétalos de la flor Se sometió a extracción una porción de 0.5 g de pétalos de rosas secadas por congelamiento en 4 mi de 50% de acetonitrilo (CH3CN) conteniendo 0.1% de TFA durante 20 minutos bajo vibración ultrasónica y luego se filtraron con un filtro de 0.45 µm. La cromatografía líquida de rendimiento elevado (HLPC) de las antocianinas en el extracto se condujo bajo las siguientes condiciones. Se llevó a cabo la elusión isocrática utilizando una columna RSpak DE-413L (4.6 mmf x 25 c , Shoko Co . , Ltd.) con una tasa de flujo de 0.6 ml/minutos, y una fase móvil en un gradiente de concentración lineal de 10%—50% de CH3CN/H20 que contiene 0.5% de ácido trifluoroacético (TFA) durante 15 minutos seguido por 50% de CH3CN/H20 que contiene 0.5% de TFA durante 10 minutos. Se realizó la detección utilizando un detector de disposición de fotodiodo SPD-M10A (Shimadzu Laboratories) , con la detección en el rango de longitud de onda de 600-250 nm y el cálculo de la relación de abundancia de cada antocianina basada en el área de absorbancia de 520 nm. 2) Análisis de antocianidina Se secó completamente una porción de 0.2 mi del filtrado bajo presión reducida en un tubo de prueba de vidrio y se disolvió en 0.2 mi de ácido clorhídrico 6N (HCl), y se sometió a hidrólisis a 100°C durante 20 minutos. Las antocianidinas hidrolizadas se extrajeron con 0.2 mi de 1-pentanol, y la capa orgánica se analizó por HPLC bajo las siguientes condiciones. La columna utilizada fue una ODS-A312 (6 mmf x 15 cm, YMC Co . , Ltd.) y la elusión se realizó a una tasa de flujo de 1 ml/min utilizando una solución CH3C00H:CH30H:H20 = 15:20:65 como la fase móvil. Se realizó la detección por medición espectral a 600-400 nm utilizando un detector de disposición de fotodiodo SPD-M10A (Shimadzu Laboratories) , la identificación basada en la máxima absorción (?max) , y el tiempo de retención (RT) y la cuantificación basada en 520 nm del área de absorbancia. El tiempo de retención y ?max de delfinidina y cianidina bajo estas condiciones de HPLC fueron 4.0 minutos, 5.2 minutos y 534 nm, 525 nm, respectivamente. El clorhidrato de delfinidina y el clorhidrato de cianidina adquiridos de Funakoshi Co., Ltd. Se utilizaron como muestras para la identificación y la cuantificación. 3) Análisis de flavonol Una porción de 0.2 mi del filtrado extraído de los pétalos de las flores se secó a dureza bajo presión reducida en un tubo Eppendorf de 1.5 mi y se disolvió en 0.2 mi de tampón de fosfato de potasio 0.1 M (KPB) en pH 4.5, y luego 6 unidades de ß-glucosidasa (Shinnihon Kagaku Co . , Ltd.) y 1 unidad de naringenasa (Sigma Chemical Co., MO, USA) se agregaron y la mezcla se mantuvo a 30°C durante 16 horas. Después de la reacción, se agregó 0.2 mi de 90% de CH3CN a la solución de reacción de enzima para terminar la reacción. La solución se filtró con un filtro de 0.45 µm y se sometió a HPLC bajo las siguientes condiciones. Se llevó a cabo la elusión isocrática utilizando una columna Develosil C30-UG-5 (4.6 mmf x 15 cm, Nomura Chemical Co., Ltd.) con una tasa de flujo de 0.6 ml/minutos, y una fase móvil en un gradiente de concentración lineal de 18%-»63% de CH3CN/H20 que contiene 0.1% de TFA durante 10 minutos, seguido por 63% de CH3CN/H20 conteniendo 0.1% de TFA durante 10 minutos. Se realizó la detección utilizando un detector de disposición de fotodiodo, con la detección en el rango de longitud de onda de 400-250 nm. El R.T. y ?max de canferol y cuarcetín bajo estas condiciones fueron 11.6 minutos, 365 nm y 10.3 minutos, 370 nm, respectivamente. El canferol y el cuarcetín adquiridos de Funakoshi Co., Ltd., se utilizaron como muestras para la cuantificación basada en el área A330 nm.

Ejemplo 3. Método de medición de pH Aproximadamente 2 g de pétalos de rosas congeladas a -80°C durante 1 hora o más, se prensó con un homogenizador para obtener el jugo de los pétalos. Se midió el pH conectando un microelectrodo 6069-10C (Horiba Laboratories) a un medidor de pH(F-22, Horiba Laboratories) .

Ejemplo 4. Transformación de rosas Varios métodos se han reportado para la transformación de rosas (por ejemplo, Firoozababy et al., Bio/Technology 12:883-888 (1994); US 5480789; US 5792927; EP 536,327 Al; US 20010007157 Al), y la transformación puede llevarse a cabo por cualquiera de estas técnicas. Específicamente, los callos de las rosas tomados a partir de hojas de plántulas asépticas se sumergieron durante 5 minutos en una suspensión bacteriana de Agrobacterium tumef ciens AglO (Lazo et al., Bio/Technology 9:963-967, 1991), la suspensión bacteriana en exceso se lavó con papel filtro estéril , y los callos se transfirieron a un medio de subcultivo y se co-cultivaron durante 2 días en un cuarto oscuro . Después de enjugar subsecuentemente con un medio líquido MS que contiene 400 mg/1 de carbenicilina, los callos se transfirieron a un medio de selección/eliminación preparado agregando 50 mg/L de kanamicina y 200 mg/L de carbenicilina a un medio de subcultivo. En la transferencia de repetición y el cultivo de las porciones que crecen normalmente en el medio de selección sin inhibición de crecimiento, se seleccionaron los callos resistentes a kanamicina. Se cultivaron callos transformados resistentes a kanamicina en un medio de rediferenciación que contienen 50 mg/1 de kanamicina y 200 mg/1 de carbenicilina para obtener brotes resistentes a kanamicina. Los brotes obtenidos se enraizaron en un medio de 1/2MS y luego se habituaron. Las plantas habituadas se plantaron y luego se cultivaron en un invernadero cerrado hasta que florecieron.

Ejemplo 5. Obteniendo el gen de flavonoides de rosas Una biblioteca de ADNc derivada de una variedad de pétalos de flores de rosas Kardinal se seleccionó utilizando el gen DFR de petunia (descrito en 096/36716) como la sonda, para obtener el ADNc de DFR de rosas que se diseñaron como pCGP645. Se han reportado ya detalles (Tanaka et al., Plant Cell Physiol. 36, 1023-1031 (1995). Así mismo, la misma biblioteca se seleccionó con el gen de chalcon sintasa-A de la petunia (CHS-A) (Koes et al., Gene (1989) 81, 245-257) y el gen de antocianidina sintasa (ANS) (Martin et al., Plant J. , (1991) 1, 37-49) de acuerdo a un procedimiento públicamente conocido (Tanaka et al . , Plant Cell Physiol, 36, 1023-1031 1995) para obtener homólogos de chalcon sintasa (CHS) y antocianidina sintasa (ANS) de las rosas los cuales se diseñaron como pCGP634 y pCGP1375, respectivamente. La secuencia de nucleótido para CHS de rosas se lista como la SEC. DE IDENT. NO.: 5, y la secuencia de nucleótido para ANS de rosas se lista como la SEC. DE IDENT. NO. : 6.

Ejemplo 6. Selección para rosas blancas Para la creación de un cultivo azul por recombinación genética, los cultivos que carecen sólo del gen DFR pueden seleccionarse, con el fin de evitar la competencia entre la trayectoria de síntesis de antocianina endógena y los genes introducidos (particularmente el gen F3'5'H), y el gen DFR de petunias y el gen F3'H transferido en aquellos cultivos ( 096/36716) . Se condujo una selección entre las numerosas variedades de rosas blancas existentes, para aquellas que carecen sólo del gen DFR y que expresan normalmente otros genes de enzimas de biosíntesis de antocianina. La causa de color de blanqueamiento de color de las flores se cree que sea una mutación o eliminación ocasional de genes estructurales implicados en biosíntesis de antocianina, y la pérdida ocasional de transcripción que regula lo factores que controlan la transcripción de genes estructurales implicados en biosíntesis de antocíanína. Las rosas que carecen del ARNm del gen DFR se examinaron de acuerdo al método descrito en 096/36716. En primer lugar, se seleccionaron 122 líneas de rosas blancas principalmente se analizaron para composición de flavonoide de los pétalos de las flores por el método descrito en el Ejemplo 1, y las líneas con alta acumulación de flavonoles. El pH de cada jugo de pétalo se midió entonces y 80 cultivos con valores de pH relativamente elevados se eligieron como candidatos primarios . El ARN se extrajo entonces de los pétalos de estos cultivos. La extracción de ARN se logró por un método públicamente conocido (Tanaka et al., Plant Cell Physiol. 36, 1023-1031, 1995) . El ARN obtenido se utilizó para examinar la presencia o ausencia de ARNm que corresponde al gen de DFR de la rosa (Tanaka et al., Plant Cell Physiol. 36, 1023-1031, 1995) y el gen de antocianidina sintasa (ANS) de la rosa. Se efectúo el RT-PCR y se seleccionaron ocho cultivos (WKS-11, 13, 22, 36, 43, White Killarney, Tsuru No. 2, Tineke) teniendo expresión endógena baja de ARNm de DFR y niveles de ARNm de ANS. Se llevó a cabo el RT-PCr con un Sistema de Síntesis de una Primera Hebra de Escritura para RT-PCR (Invitrogen) utilizando ARN obtenido a partir de pétalos de cada cultivo. El ARNm de DFR se detectó utilizando DFR-2F (5'-CAAGCAATGGCATCGGAATC-3' ) (SEC. DE IDENT . NO.: 13) y DFR-2B (5'TTTCCAGTGAGTGGCGAAAGTC-3' ) (SEC. DE IDENT . NO.: 14) cebadores, y el ARNM de ANS se detectó utilizando cebadores ANS-2F (5' -TGGACTCGAAGAACTCGTCC-3' ) (SEC. DE IDENT . NO.: 15) y ANS-2B (5 ' -CCTCACCTTCTCCCTTGTT-3 ' ) (SEC. DE IDENT. NO.: 16) . Estos ocho cultivos mostraron niveles más bajos de ARNm de DFR y niveles normales de ARNm de ANS en transferencia Northern (Tabla 1) y sus propiedades de cultivo fueron excelentes. Dos de los cultivos transformables (Tineke, WKS36) fueron definitivos para la transferencia actual de la construcción de producción de delfinidina.

Tabla 1 +: ARNm detectado en el mismo nivel que rosas coloreadas (cultivo de rutina de Rosa) -: ARNm detectado en un nivel más bajo que rosas coloreadas (Cultivo de rutina de Rosa) Q: Cuercetín, K: canferol Ejemplo 7. Transferencia del gen DFR de rosas en Tineke El plásmido PE2113 (Mitsuhara et al., Plant Cell Physiol. 37, 45-49, 1996) comprende el promotor del virus 35S de mosaico de coliflor que contiene una repetición de secuencia mej oradora (E1235S) y el terminador de la nopalina sintasa. Este plásmido se digirió con Sacl y los extremos se despuntaron utilizando un Equipo de despuntado (Takara) . El fragmento de ADN se ligó con un enlazador de 8pb Salí (Takara) y el plásmido obtenido se designó como pUE5. El plásmido pUE5 se digirió con HindIII y EcoRI para obtener un fragmento de ADN de aproximadamente 3kb, el cual se introdujo en pBinl9 (Bevan M. , Binary Agrobacterium Vector for plant transformation. Nucí. Acid Res. 12. 8711-21, 1984) digerido previamente con HindIII y EcoRI , para obtener el plásmido pBE5. Después, pCGP645 se digirió con BamHI y Xhol para obtener un fragmento de ADN que contiene ADNc de DFR de rosas de longitud total . Esto se ligó con pBE4 digerido con BamHI y Xhol para construir pBERDl (Figura 2) . El plásmido se transfirió en Agrobacterium tumefaciens AglO . Se transfirió el plásmido pBERDl (Figura 2) en el cultivo de rosas blancas "Tineke" y 18 transformantes se obtuvieron. Se alteró el color de las flores en seis de las transformantes obtenidas. El análisis del pigmento de las dos plantas en donde el color claro cambió de blanco a rosa se observó para la acumulación confirmada de la cianidina y la pelargonidina en ambas (Tabla 2) . Estos resultados sugieren que el cultivo Tineke es un cultivo carente del gen DFR.

Tabla 2 Cya: cianídina, Peí: Pelargonidina Ejemplo 8. Transferencia del gen F3'5'H (#18) y del gen DFR de petunia en Tineke Se extrajo el ARN a partir de pétalos de pensamientos en capullo jóvenes (variedad de Pensamiento Negro) por el método de Turpén y Griffith (BioTechniques 4:11-15, 1986) y Oligotex-dT (Qiagen) se utilizó para la purificación de polyA+RNA. Este polyA+RNA y un equipo de clonación ?ZAPIl/GigapackII (Stratagene) se utilizaron para construir una biblioteca de ADNc a partir de los pétalos de pensamientos en capullo jóvenes. Después de la transferencia aproximadamente 100,000 pfu de las placas fago se cultivaron en una placa NZY sobre Colony/PlaqueScreen (DuPont) , el tratamiento se condujo por el protocolo recomendado por el fabricante. Las placas se etiquetaron 32P y seleccionaron utilizando ADNcHfl de petunia (pCGP602, Holton, et al., Nature, 366, p276-279, 1993) como la sonda. La membrana se sometió a pre-hibridización durante 1 hora a 42 °C en un tampón de hibridización (10% (v/v) de formamida, 1 M de NaCl, 10% (p/v) de sulfato de dextrano, 1% de SDS) , y luego la sonda etiquetada 32P se agregó a 1 x 106 cpm/ml y se realizó la hibridización durante 16 horas a 42 °C. La membrana se enjuagó entonces durante 1 hora en 2xSSC, 1% de SDS a 42 °C, se intercambió la solución de enjuague fresco, y el enjuague se realizó de nuevo durante 1 hora. La membrana enjuagada se expuso en una película Kodak XAR junto con un tamiz de intensificación y se detectó la señal de hibridización. Los resultados del análisis de ADNc demostraron que los dos ADNc obtenidos tuvieron identidad elevada con Hfl de petunia. Los dos tipos de ADNc se designaron como ADNc F3 ' 5 'H del pensamiento, BP#18 (pCGP1959) y BP#40 (pCGP1961) . La secuencia del nucleótido para el #18 se lista como en la SEC. DE IDENT. NO. : 3 y su secuencia de aminoácido correspondiente se lista como en la SEC. DE IDENT. NO.: 2, la secuencia de nucleótido para #40 se lista como en la SEC. DE IDENT. NO. -.3, y su secuencia de aminoácido correspondiente se lista como en la SEC. DE IDENT. NO.: 4. BP#18 y BP#40 tienen 82% de identidad en el nivel de ADN. También, BP#18 y BP#40 exhiben 60% de identidad con Hfl de petunia y 62% de identidad con Hf2 de petunia (Holton et al., Nature, 366, p276-279, 1993), en el nivel del ADN. De manera separada, el plásmido pUE5 se digirió con EcoRI y los extremos se despuntaron utilizando un Equipo de Despuntado (Takara) , y el fragmento de ADN obtenido se ligó con un enlazador HindIII de 8 pb (Takara) , produciendo un plásmido el cual se designó como pUE5H. Se recuperó un fragmento de ADN de 1.8 kb obtenido sometiendo el plásmido pCGP1959 que contiene el ADNc F3 ' 5 'H #18 de pensamiento para completar la digestión con BamHI y la digestión parcial con Xhol. El plásmido obtenido por ligación de esto con pUE5H digerido con Ba HI y Xhol se designó como pUEBPld. De manera separada, un fragmento de ADN que contiene ADNc de DFR de petunia se recuperó por la digestión de pCGP1403 ( 096/36716) con BamHI y Xhol, y este fragmento de ADN se ligó con pBE5 que se había digerido con BamHI y Xhol, para preparar pBEPD2. Enseguida, el pUEBP18 se digirió parcialmente con HindIII y un fragmento de ADN de aproximadamente 2.8 kb se recuperó conteniendo el promotor E1235S, el ADNc F3'5'H #18 y el terminador nos. Este fragmento se ligó con el fragmento de ADN obtenido por digestión parcial de pBEPD2 con HindIII para obtener un plásmido de vector binario pBPDBP2 (Figura 3) . Este plásmido se introdujo dentro de Agrobacterium tumefaciens AglO.

Se transfirió el plásmido pBPDBP2 (Figura 3) dentro del cultivo de rosas blancas "Tineke" y 40 transformantes se obtuvieron. El color de las flores se alteró en 23 de las transformantes obtenidas, y el análisis de pigmento confirmó la acumulación de delfinidina en 16 de las 19 transformantes analizadas (Tabla 3) . El contenido de delfinidina fue 100% máximo (promedio: 87%), pero la cantidad máxima del pigmento fue muy baja en 0.035 mg por gramo de los pétalos y el color de las flores se alteró sólo a partir de la Gráfica de Color RHS 158d (grupo Amarillo-Blancol) a 56a (grupo Rojo) o 65b (grupo Rojo-Púrpura) , aunque ningún color del grupo violeta, el grupo violeta-azul o el grupo azul de acuerdo a RHSCC se logró y el rosa azul objetivo no pudo obtenerse.

Tabla 3 Del: delfinidina, M: mir?cetina Ejemplo 9. Transferencia del gen F3'5'H del pensamiento (#40) y el gen DFR de la petunia en Tineke El plásmido pE2113 (Mitsuhara et al., Plant Cell Physiol. 37, 45-59, 1996) se digirió con HindIII y Xbal para obtener un fragmento de ADN de aproximadamente 800 pb, el cual se ligó con pBinl9 (Bevan M. , Binary Agrobacterium Vector for plant transformation, Nucí. Acid Res. 12. 8711-21, 1984) digerido previamente con HindI y Xbal. El plásmido obtenido se designó como pCGP1391. Otro plásmido, pCGP669 (WO94/21840) , contiene promotor genético de chalcon sintasa A de la petunia (CHS-A) . Este plásmido se digirió con EcoRI , se despuntó y luego se digirió con HindIII . El fragmento de ADN de aproximadamente 700 pb se ligó con pCGP1391 el cual se había digerido con HindIII y SnaBI , y el plásmido obtenido se designó como pCGP1707. También, se había recuperado un fragmento de ADN de aproximadamente 1.8 kb obtenido al someter el plásmido pCGP1961 que contiene el ADNc de F3'5'H #40 para completar la digestión con BamHI y la digestión parcial con Xhol. El plásmido obtenido por ligación de éste con pUE5H digerido con BamHI y Xhol se designó como pUEBP40. El plásmido pUEBP40 se digirió con EcoRV y Xbal y un fragmento de ADN de aproximadamente 5.5 kb se recuperó. Este fragmento se ligó con un fragmento de aproximadamente 700 pb digiriendo el plásmido pCGP1707 con HindIII, despuntando los extremos y digiriendo además con Xbal, para obtener el plásmido pUEBP40. Después, el pUEBP40 se digirió parcialmente con Hindlll y un fragmento de ADN de aproximadamente 3.4 kb se recuperó conteniendo el me orador del promotor 35S de coliflor, el promotor CHS-A, el ADNc de F3'5'H #40 y el terminador nos. Este fragmento se ligó con un fragmento de ADN obtenido por digestión parcial de pBEPD2 con HindIII para obtener un plásmido pBPDBPd del vector binario (Figura 4) . Este plásmido se introdujo en Agrobacterium tumefaciens AglO . El plásmido pBPDBPd (Figura 4) se transfirió al cultivo de rosas blanca "Tineke" , y se obtuvieron 53 transformantes. El color de la flor se alteró en 17 de las transformantes obtenidas, y el análisis de pigmento confirmó la acumulación de delfinidina en 8 de las 9 tranformantes analizadas (Tabla 4) . El contenido de delfinidina fue 93% máximo (promedio: 79%), pero la cantidad máxima del pigmento fue muy baja en 0.014 mg por gramo de pétalos y el color de flores se alteró solamente a partir de la Gráfica de Color RHS 158d (grupo Amarillo-Blanco) a 56a (grupo Rojo) o 65b (grupo Rojo-Púrpura) , aunque ningún color del grupo Violeta, grupo Violeta-Azul o grupo Azul de acuerdo a RHSCC se logró y el rojo azul objetivo no pudo obtenerse. Esto sugiere que la variedad de Tineke no es una variedad que carece sólo del gen DFR . Tabla 4 na: sin análisis/medida Ejemplo 10: Transferencia del gen F3'5'H de pensamiento (#18) y el gen DFR de petunia en WKS36 El plásmido pBPDPB2 (Figura 3) se transfirió en la rosa blanca " KS36" , y se obtuvieron 138 transformantes. El color de la flor se alteró en 10 de las transformantes obtenidas, y la acumulación de delfinidina se confirmó en todas las plantas (Tabla 5) . El contenido de delfinidina fue 91% máximo (promedio: 60%), pero la cantidad máxima del pigmento fue muy baja a 0.033 mg por gramo de pétalos y el color de flores se alteró sólo a un rosa muy claro, aunque ningún color del grupo Violeta, el grupo Violeta-Azul o grupo Azul de acuerdo a RHSCC se logró y el rosa azul objetivo no pudo obtenerse. Esto sugiere que la variedad de WKS36 no es una variedad que carece sólo del gen DFR.

Tabla 5 Ejemplo 11. Transferencia del gen F3f5'H de pensamiento (#18) y el gen DFR de petunia en KS36 Un plásmido obtenido al reemplazar el sitio AscI del plásmido pUCAP (van Engelen et al . , Transgenic Research 4, 288-290, 1995) con el enlazador Pací se designó como pUCPP . De manera separada, un cásete de expresión preparado al unir el promotor de chalcón sintasa de la rosa, ADNc F3'5'H #18 del pensamiento y el terminador nos se obtuvo en la siguiente manera. El ADN cromosomal se extrajo a partir de hojas jóvenes del cultivo de rosas Kardinal (Tanaka et al., Plant Cell Physiol. 36, 1023-1031, 1995). Una porción de aproximadamente 100 µg de ADN se digirió parcialmente con Sau3AI , y fragmentos de ADN de aproximadamente 20 kb se recuperaron por el gradiente de densidad de sacarosa. Estos se ligaron con EMBL3 de fago lambda (por ejemplo, Stratagene) que se había digerido con BamHI , y una biblioteca de ADN cromosomal se preparó por el protocolo recomendado del fabricante. La biblioteca se seleccionó por un método públicamente conocido (Tanaka et al., Plant Cell Physiol. 356, 1023-1031, 1995), utilizando ADNc de chalcon sintasa de rosas (base de datos ADN: No. de Acceso GenBank AB038246) como la sonda. Entre los clones de cromosomas chalcon sintasa obtenidas, existieron CHS20 lambda que incluyeron una secuencia de ADN de aproximadamente 6.4 kb corriente arriba a partir del codón de inicio de chalcon sintasa. El fragmento de ADN de aproximadamente 2.9 kb obtenida por digestión de CHS20 lambda con HindIII y EcoRV incluye la región del promotor chalcon sintasa. Este fragmento se ligó con un fragmento obtenido por digestión de pUC19 (Yanisch-Perron C et al., Gene 33:103-119, 1985) con HindIII y Smal . Esto se designó como pCGP1116. La secuencia de la región del promotor de chalcon sintasa incluida en la presente se lista como la SEC. DE IDENT. NO.: 21. Un fragmento de ADN de aproximadamente 2.9 kb obtenida por digestión de pCGP1116 con HindIII y Kpnl se ligó con un fragmento de ADN obtenido por la digestión de pJBl (Bodeau, Molecular and genetic regulation of Bronze-2 and other maize anthocyanin genes. Dissertation, Stanford University, USA, 1994) con HindIII y Kpnl para obtener pCGP197. De manera separada, un fragmento ADN de aproximadamente 300 pb que contiene el terminador de nopalina sintasa, obtenido por digestión de pUE5 con Sacl y Kpnl, se despuntó y enlazó con pBluescriptSK, el cual se ha digerido con EcoRV y BamHI y se despuntó. Un plásmido de aquellos obtenidos en donde el extremo 5 ' y el terminador se cerró al sitio Salí de pBluescriptSK- se designó como pCGP1986. Un fragmento de ADN obtenido digiriendo pCGP1986 con Xhol, despuntando los extremos y dirigiendo además con Salí se enlazó con un fragmento de ADN obtenido digiriendo pCGP197 con HindIII, despuntando los extremos y además digiriendo con Salí, para obtener pCGP2201. Después, un fragmento de ADN obtenido digiriendo pCGP2201 con Salí y despuntando los extremos se enlazó con un fragmento de ADN de aproximadamente 1.7 kb (conteniendo el gen flavonoide 3 ', 5' -hidroxilasa del pensamiento) obtenido digiriendo pCGP1959 con BamHI y Kpnl y despuntando los extremos. Un plásmido de aquellos obtenidos en donde el promotor de chalcon sintasa de rosas se había insertado en una dirección que permite la transcripción del gen flavonoide 3 ', 5' -hidroxilasa del pensamiento en la dirección delantera se designó como pCGP2203. Se recuperó el plásmido pCGP2203 por digestión con HindIII y Sacl . El fragmento de ADN se clonó en sitios HindIII y Sacl de pUCPP, y el plásmido resultante se designó como pSPB459. Después, el plásmido pE2113 se digirió con SnaBI y un enlazador BamHI (Takara) se insertó para obtener un plásmido designado como pUE6. Un fragmento de ADN de aproximadamente 700 pb obtenido por digestión de pUE6 con HindIII y BamHI se enlazó con un fragmento de ADN de aproximadamente 2.2 kb obtenido por digestión de pCGP1405 (W096/36716) con BamHI y BglII y con el vector binario pBinplus (van Engelen et al . , Transgenic Research 4, 288-290, 1995) digerido con HindIII y BamHI , para obtener pSPB460. Un fragmento de ADN de aproximadamente 5 kb obtenido por digestión de pSPB459 con Pací se introdujo dentro del sitio Pací de pSPB460 para obtener pSPB461 (Figura 5) teniendo el DFR de petunia y los genes F3'5'H #18 del pensamiento enlazados en la dirección delantera en el vector binario. Este plásmido se modifica por expresión constitutiva del gen DFR de petunias en plantas y la transcripción específica del gen F3'5'H #18 del pensamiento en pétalos de flores. El plásmido se transfirió en Agrobacterium tumefaciens AglO. El plásmido pSPB461 (Figura 5) se transfirió en la rosa blanca " KS36" y 229 transformantes se obtuvieron. El color de la flor se alteró en 16 de las transformantes obtenidas, y la acumulación de delfinidina se confirmó en todas las 12 plantas analizadas con pigmentos (Tabla 6) . El contenido de delfinidina fue 79% máximo (promedio: 58%), pero la cantidad de pigmento fue muy baja a 0.031 mg por gramo de pétalos y el color de la flor se alternó solamente a rosa muy ligero, aunque ningún color del grupo Violeta, el grupo Violeta-Azul o el grupo Azul de acuerdo a RHSCC se logró y la rosa azul objetivo no pudo obtenerse. Esto sugiere que la variedad de KS36 no es una variedad que carece sólo del gen DFR.

Tabla 6 Ejemplo 12. Transferencia del gen F3'5'H del pensamiento (#18) , el gen DFR de petunia y el gen de 3-glucosida aciltransferasa de antocianina de perilla en WKS36 Un gen que comprende un codón de inicio agregado al gen (3AT) hidroxicinamoil CoA: antocianina 3-glucósida aciltransferasa de perilla se designó como pSAT208F (Yonekura-Sakakibara et al., Plant Cell Physiol. 41, 495-502, 2000) . Un fragmento de ADN de aproximadamente 3.9 kb obtenido por digestión de pSPB580 (PCT/AU03/00079) con BamHI y Xhol se enlazó con un fragmento de ADN de aproximadamente 1.8 kb por digestión de pSAT208F con BamHI y Xhol. El plásmido obtenido se digirió con AscI, y un fragmento de ADN se recuperó conteniendo el promotor E1235S, el gen 3AT de perilla y el terminador de proteína de transferencia de fosfolípido de petunia. El fragmento de ADN se insertó en el sitio Acl de pSBP461 para obtener pSPB472 del plásmido (Figura 6) teniendo el 3AT de perilla, el DFR de petunia y las direcciones de transcripción del gen F3 ' 5 'H #18 de pensamiento en la dirección delantera. Este plásmido se modifica para expresión constitutiva del gen3AT de perilla y el gen DFR de petunia en plantas y la transcripción específicas del gen F3'5'H #18 del pensamiento en pétalos de flores. El plásmido se transfirió en Agrobacterium turne faciens AglO . El plásmido pSPB472 (Figura 6) se transfirió en la rosa blanca "WKS36", y 75 transformantes se obtuvieron. El color de flores se alteró en cuatro de las transformantes obtenidas, y la acumulación de delfinidina se confirmó en todas las tres plantas analizadas de pigmento (Tabla 7) . El contenido de delfinidina fue 67% máximo (promedio: 49%), pero la cantidad del pigmento fue muy baja en 0.011 mg por gramo de pétalos y el color de las flores se alteró sólo a rosa muy claro, aunque ningún color del grupo Violeta, el grupo Violeta-Azul o el grupo Azul de acuerdo al RHSCC se logró y la rosa azul objetivo no pudo obtenerse. Esto sugiere que la variedad KS36 no es una variedad que carece sólo del gen DFR.

Tabla 7 De este modo, a pesar de la selección de varias rosas blancas, no fue posible obtener un cultivo que carezca sólo del gen DFR. En otras palabras, no fue posible obtener una rosa azul por el método para la creación de clavel azul ( O94/28140) . Ejemplo 13. Inhibición de gen DFR de rosas por co-supresión Los plásmidos pBERDl se transfirieron en la rosa violeta pálido "Lavanda" y se obtuvieron 26 transformantes.

Sin embargo, ninguna de las plantas exhibió el color de la flor alterada, sugiriendo que es difícil para inhibir el gen DFR endógena de la rosa por co-supresión. Ejemplo 14. Selección para rosas de color Los cultivos para la creación de rosas azules se seleccionaron entonces de entre rosas de color. Después de seleccionar visualmente 136 líneas de cultivos de rosas de color con tonos relativamente azules, 89 de las líneas se sometieron a análisis de pigmento. Los valores obtenidos para las rosas de color examinadas se muestran en las Tablas 8 a Tabla 8 Peo: Peonidina Tabla 9 Peo: Peonidina Tabla 10 Peo: Peonidina Ejemplo 15. Transferencia de gen F3'5'H de pensamiento (#40) y gen de antocianina 5-aciltransferasa de Torenia en Lavanda La modificación de antocianinas con grupos acilo aromáticos puede estabilizar las antocianinas y produce un color más azul (por ejemplo WO96/25500) . El siguiente experimento se condujo con el propósito de producir antocianinas del tipo de delfinidina acilada. El ARN se obtuvo a partir de pétalos de flores de ondulación de verano Torenia, y el polyA+RNA se preparó a partir de las mismas. Una biblioteca de ADNc se preparó a partir del polyA+RNA con ?ZAPII (Stratagene) como el vector, utilizando un equipo de preparación de la biblioteca de ADNc direccional (Stratagene) de acuerdo al protocolo recomendado del fabricante. La mayor antocianina de Torenia se modifica con un grupo acilo aromático en la glucosa en la posición 5 (Suzuki et al., Molecular Breeding 2000 6, 239-246) y por lo tanto la antocianina aciltransferasa se expresa en pétalos Torenia . La antocianina aciltransferasa incluye la secuencia de aminoácido conservada Asp-Phe-Gly-Trp-Gly-Lys, y el ADN sintético correspondiente puede utilizarse como el cebador para obtener el gen de antocianina aciltransferasa (WO96/25500) . Específicamente, 10 ng del ADNc de una sola hebra sintetizada para la construcción de la biblioteca de ADNc Torenia se utilizó como la plantilla, y 100 ng del cebador ATC (5 ' -GA (TC) TT (TC) GGITGGGGIAA-3 ' , I: inosina) (SEC. DE IDENT. NO.: 17) y 100 ng del cebador oligo dT (5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTCTCGAG-3' ) (SEC. DE IDENT. NO.: 18) se utilizaron como cebadores para PCR con Taq polimerasa (Takara, Japan) , bajo las condiciones recomendadas del f bricante . El PCR se llevó a cabo en 25 ciclos de reacción con un ciclo que consiste de 1 minuto a 95°C, 1 minuto a 55°C y 1 minuto a 72 °C. El fragmento de ADN de aproximadamente 400 pb que se obtuvo se recuperó con el Gene Clean II (BIO, 101. Inc.) de acuerdo al protocolo recomendado del fabricante, y se subclonó en pCR-TOPO. La determinación de la secuencia de nucleótido reveló un homólogo de secuencia al gen de aciltransferasa de genciana (Fujiwara et al., 1998, Plant J. 16 421-431) . La secuencia de nucleótido se determinó por el método de Cebador de Tinte (Applied Biosystems) , utilizando el Secuenciador 310 ó 377 (ambos por Applied Biosystems) . El fragmento de ADN se etiquetó con DIG utilizando un equipo de detección de etiqueta DIG (Japan Roche) , y se utilizó para la selección de la biblioteca de ADNc de Torenia por hibridización de placa de acuerdo al protocolo recomendado del fabricante. Doce de los clones de señal positiva obtenidos se seleccionaron aleatoriamente, los plásmidos se recuperaron y sus secuencias de nucleótido se determinaron. Estos exhibieron homología elevada con antocianina aciltransferasa. La secuencia de nucleótido total del ADNc en el clon diseñado como pTAT7 se determinó. La secuencia de nucleótido se lista como la SEC. DE IDENT. NO.: 7, y la secuencia de aminoácido correspondiente se lista como la SEC. DE IDENT. NO.: 8. Después de digerir pBE2113-GUS (Mitsuhara et al., Plant Cell Physiol. 37, 45-59, 1996) con Sacl, los extremos se despuntaron y un enlazador Xhol de 8 pb (Takara) se insertó. Un fragmento de ADN de aproximadamente 1.7 kb obtenidos digiriendo pTAT7 con BamHI y Xhol se insertó en los sitios BamHI y Xhol de este plásmido, para obtener pSPB120. Después de digerir pSPB120 con SamBI y BamHI , los extremos se despuntaron y la ligación se realizó para obtener pSPB120' . De manera separada, el plásmido pCGP1961 que contiene el ADNc de F3'5'H #40 del pensamiento se digirió completamente con BamHI y luego se dirigió parcialmente con Xhol para obtener un fragmento de ADN de aproximadamente 1.8 kb el cual se recuperó y se ligó con pUE5H previamente con BamHI y Xhol, para obtener un plásmido el cual se designó como pUEBP40. Después de digerir pUEBP40 con SnaBI y BamHI, los extremos se despuntaron y la ligación se realizó para obtener pUEBP40'. Este plásmido pUEBP40' se digirió parcialmente con HindIII para obtener un fragmento de ADN de aproximadamente 2.7 kb el cual se recuperó y se enlazó con un fragmento de ADN obtenido por digestión parcial de pSPB120' con HindIII . De los plásmidos obtenidos, un vector binario que tiene el gen de nemocina fosfotransferasa, el gen F3'5'H #40 del pensamiento y el gen 5AT Torenia enlazado en ese orden en la misma dirección a partir de la secuencia de borde derecho en el vector binario, se designó como pSPB130 (Figura 7) . Este plásmido se modifica para expresión constitutiva del gen F3'5'H #40 del pensamiento y el gen 5AT de la Torenia en plantas y la transcripción específica de los genes en los pétalos de las flores. El plásmido se transfirió en Agrobacterium tumefaciens AglO. El plásmido pSPB130 (Figura 7) se transfirió en la variedad de rosa violeta pálido "Lavanda" , y 41 transformantes se obtuvieron. La acumulación de delfinidina se confirmó en 20 de las 32 plantas analizadas con pigmento (Tablas 11 y 12) . El contenido de delfinidina fue 71% máximo (promedio: 36%) . El color de las flores se alteró a partir de la Gráfica del Color RHS 186c (grupo Agrisado-Púrpura) a 79d (grupo Púrpura) . La proporción de antocianinas aciladas fue sólo aproximadamente 30% de las antocianinas totales. En la medición espectral de las antocianinas aciladas, la longitud de onda de absorción máxima tuvo un cambio hacia delante de la longitud de onda más larga mediante 4 nm a partir de la delfinidina 3 , 5-diglucósido, pero debido a la proporción baja entre las antocianinas totales, no se logró ningún efecto claro para el color de las flores Tabla 11 na: sin análisis/medida Tabla 12 na: sin análisis/medida Ejemplo 16. Transferencia del gen de F3'5'H del pensamiento (#40) y el gen de antocianina 5-aciltransferasa de Torenia en KS100 El plásmido pSPB130 (Figura 7) se transfirió en la variedad de rosa violeta pálido "WKS100" y 146 transformantes se obtuvieron. La acumulación de la delfinidina se confirmó en 56 de las 63 plantas analizadas con pigmento (Tablas 13-15) . El contenido de delfinidina fue 95% máximo (promedio: 44%) . El color de las flores se alteró a partir de la Gráfica de Color RHS 56d (grupo Rojo) a 186d (grupo Agrisado-Púrpura) . Sin embargo, ningún color del grupo Violeta, del grupo Violeta-Azul o grupo Azul de acuerdo a RHSCC se obtuvo y la rosa azul no pudo obtenerse .

Tabla 13 na: sin análisis/medida Tabla 14 na: sin análisis/medida Tabla 15 na: sin análisis/medida Ejemplo 17. Transferencia del gen F3,5,H de pensamiento (#40) y el gen de antocianina 5-aciltransferasa de Torenia en KS116 Se transfirió el plásmido pSPB130 (Figura 7) en la variedad de rosas violeta pálido "WKS116" y 282 transformantes se obtuvieron. La acumulación de delfinidina se confirmó en 33 de las 36 plantas analizadas con pigmento (Tablas 16 y 17) . El contenido de delfinidina fue 80% máximo (promedio: 73%) . El color de las flores se alteró a partir de la Gráfica de Color RHS 196d (grupo Agrisado-Verde) a 186d (grupo Agrisado-Púrpura) . Sin embargo, ningún color del grupo Violeta, el grupo Violeta-Azul o el grupo Azul de acuerdo a RHSCC se logró y la rosa azul objetivo no pudo obtenerse.

Tabla 16 na: sin análisis/medida Ejemplo 18. Transferencia del gen F3 ' 5 'H del pensamiento (#40) y el gen de antocianina 5-aciltransferasa de Torenia en KS12 El plásmido pSPB130 (Figura 7) se transfirió en la variedad de rosas anaranjado pálido " KS124" y 50 transformantes se obtuvieron. La acumulación de la delfinidina se confirmó en 13 de las 15 plantas analizadas con pigmento (Tabla 18) . El contenido de delfinidina fue 95% máximo (promedio: 82%) . El color de las flores se alteró a partir de la Gráfica de Color RHS 52d (grupo Rojo) a 71c (grupo Rojo-Púrpura) . Sin embargo, ningún color del grupo Violeta, el grupo Violeta-Azul o el grupo Azul de acuerdo a RHSCC se logró y la rosa azul objetivo no pudo obtenerse.

Tabla 18 na: sin análisis/medida Ejemplo 19. Transferencia del gen 3'5'H del pensamiento (#40) y el gen de antocianina 5-aciltransferasa de Torenia en KS132 El plásmido pSPB130 (Figura 7) se transfirió en la variedad de rosas rojo brillante "WKS132" , y 24 transformantes se obtuvieron. La acumulación de la delfinidina se confirmó en 6 de las 7 plantas analizadas con pigmento (Tabla 19) . El contenido de delfinidina fue 43% máximo (promedio: 12%) . El color de la flor se alteró a partir de la Gráfica de Color RHS 57a (grupo Rojo-Púrpura) a 66a (grupo Rojo-Púrpura) . Sin embargo, ningún color del grupo Violeta, el grupo Violeta-Azul o el grupo Azul de acuerdo a RHSCC se logró y la rosa azul objetivo no pudo obtenerse.

Tabla 19 Ejemplo 20. Transferencia del gen F3'5'H de pensamiento (#40) y el gen de antocianina 5-aciltransferasa de Torenia en WKS133 El plásmido pSPB130 (Figura 7) se transfirió en la variedad de rosas rojo oscuro-violeta "WKS133" y se obtuvieron 16 transformantes. La acumulación de delfinidina se confirmó en todas las ocho de las plantas analizadas con pigmento (Tabla 20) . El contenido de delfinidina fue 34% máximo (promedio: 11%) . El color de las flores se alteró a partir de la Gráfica de Color RHS 53a (grupo Rojo) a 61a (grupo Rojo-Púrpura) . Sin embargo, ningún color del grupo Violeta, grupo Violeta-Azul o el grupo Azul de acuerdo al RHSCC se logró y la rosa azul objetivo no pudo obtenerse.

Tabla 20 (Ti f-> na: sin análisis/medida Ejemplo 21: Transferencia del gen F3'5'H de pensamiento (#40) y el gen de antocianina 5-aciltransferasa de Torenia en WKS137 El plásmido pSPB130 (Figura 7) se transfirió en la variedad de rosas rojo oscuro-violeta " KS137" y se obtuvieron 20 transformantes. La acumulación de delfinidina se confirmó en todas las 17 plantas analizadas con pigmento (Tabla 21) . El contenido de delfinidina fue 1.3% máximo (promedio: 0.4%) . Ninguna alteración en color de las flores se observó a partir de la Gráfica de Color RHS 61b (grupo Rojo-Púrpura) . t H si o si o L? Tabla 21 na: sin análisis/medida Ejemplo 22. Transferencia del gen F3'5'H de pensamiento (#40) y el gen de antocianina 5-aciltransferasa de Torenia en WKS140 El plásmido pSPB130 (Figura 7) se transfirió en la variedad de rosas violeta pálido " KS140" y 197 transformantes se obtuvieron. La acumulación de delfinidina se confirmó en 37 de las 45 plantas analizadas con pigmento (Tablas 22 y 23) . El contenido de delfinidina fue 94% máximo (promedio: 47%) . El color de las flores se alteró a partir de la Gráfica de Color RHS 186d (grupo Agrisado-Púrpura) a 79d (grupo Púrpura) . Sin embargo, ningún color del grupo Violeta, el grupo Violeta-Azul o grupo Azul de acuerdo a RHSCC se logró y la rosa azul objeto no pudo obtenerse.

Tabla 22 na: sin análisis/medida Tabla 23 na: sin análisis/medida Ejemplo 23. Transferencia del gen F3 ' 5 'H de pensamiento (#40) y el gen de antocianina 5-aciltransferasa de Torenia en WKS77 El plásmido pSPB130 (Figura 7) se transfirió en la variedad de rosas rojo oscuro-púrpura "WKS77" , y se obtuvieron 35 transformantes. La acumulación de delfinidina se confirmó en todas las 17 plantas analizadas con pigmento (Tabla 24) . El contenido de delfinidina fue 57% máximo (promedio: 33%) . El color de las flores se alteró a partir de la Gráfica de Color RHS 57a (grupo Rojo-Púrpura) a 71a (grupo Rojo-Púrpura) . Sin embargo, ningún color del grupo Violeta, el grupo Violeta-Azul o el grupo Azul de acuerdo a RHSCC se logró y la rosa azul objetivo no pudo obtenerse.

Tabla 24 na: sin análisis/medida Ejemplo 24: Transferencia de gen F3'5'H de pensamiento (#40) y el gen de antocianina 5-aciltransfersa de Torenia en WKS82 El plásmido pSPB130 (Figura 7) se transfirió en la variedad de rosas violeta pálido "WKS82" y se obtuvieron 89 transformantes. La acumulación de delfinidina se confirmó en todas las 44 plantas analizadas con pigmento (Tablas 25 y 26) . El contenido de delfinidina fue 91% máximo (promedio: 49%) . El color de las flores se alteró a partir de la Gráfica de Color RHS 186d (grupo Agrisado-Púrpura) a 80c (grupo Púrpura-Violeta) . Sin embargo, ningún color del grupo Violeta, el grupo Violeta-Azul o el grupo Azul de acuerdo a RHSCC se logró y la rosa azul objetivo no pudo obtenerse. Tabla 25 na: sin análisis/medida Tabla 26 na: sin análisis/medida Ejemplo 25: Transferencia del gen F3'5'H de pensamiento (#40) y el gen de antocianina 5-aciltransferasa de Torenia en KS91 El plásmido pSPB130 (Figura 7) se transfirió en la variedad de rosas anaranjado claro " KS91" y se obtuvieron 10 transformantes. La acumulación de delfinidina se confirmó en sólo una de las dos plantas analizadas con pigmento (Tabla 27) . El contenido de delfinidina fue 2% máximo. No se observó ninguna alteración en el color de las flores a partir de la Gráfica de Color RHS 43c (grupo Rojo) .

Tabla 27 Ejemplo 26. Expresión del gen F3/5/H de pensamiento (#40) y el gen de DFR iris y la supresión del gen DFR endógeno de rosas en Lavanda Se obtuvo el ARN a partir de pétalos de iris azul de flores cortadas, y se preparó el polyA+RNA a partir del mismo. Una biblioteca de ADNc se preparó a partir del polyA+RNA con ?ZAPII (Stratagene) como el vector, utilizando un equipo de preparación de biblioteca de ADNc (Stratagene) de acuerdo al protocolo recomendado del fabricante. Un fragmento del gen DFR de iris se preparó por el mismo método como se reporta obteniendo el fragmento de gen de DFR de genciana (Tanaka et al. Plant Cell Physiol. 37, 711-716 1996) . El fragmento de ADN de aproximadamente 400 pb obtenido se recuperó con el Gen Clean de acuerdo al protocolo recomendado por el fabricante, y se subclonó en pCR-TOPO. La determinación de la secuencia de nucleótido reveló un homólogo de secuencia al gen DFR de rosas . El fragmento de ADN se utilizó para seleccionar la biblioteca del ADNc de iris, y el ADNc de DFR de iris incluyendo la secuencia de aminoácido de longitud total se obtuvo. La secuencia de nucleótido total del ADNc en el clon designado como pSPB906 se determinó. La secuencia de nucleótido se lista como la SEC. DE IDENT. NO . : 9, y la secuencia de aminoácido correspondiente se lista como la SEC. DE IDENT. NO.: 10. Después, un fragmento de ADN de aproximadamente 3.9 kb obtenido por digestión de pSPB580 con BamHI y Xhol se enlazó con un fragmento de ADN de aproximadamente 1.5 kb obtenido por digestión de pSPB906 con BamHI y Xhol, y el plásmido obtenido se designó como pSPB909. Un vector para la transcripción de ARN de doble hebra para el ADNc de DFR de rosas en plantas se preparó en la siguiente manera. Un fragmento de ADN de aproximadamente 3.5 kb (incluyendo el promotor Macl, el ADNc de DFR de rosas y el terminador mas) obtenido por digestión parcial de pCGP1364 (Tanaka et al., Plant Cell Physiol. (1995) 36, 1023-1031) con PstI se insertó en el sitio Pstl de pUC19 (Yanisch-Perron C et al., Gene 33:103-119, 1985) para obtener plásmidos, entre los cuales un plásmido que tiene el sitio HindIII de pUC19 cerca del promotor Macl se designó como pCGP1394. Después , un fragmento de ADN de aproximadamente 1.4 kb obtenido por digestión de pCGP1394 con HindIII y SacII se ligó con un fragmento de ADN de aproximadamente 1.9 kb obtenido por digestión de pCGP1394 con PstI, despuntando los extremos y la digestión adicional con SacII, y con un fragmento de vector binario obtenido por digestión de pBinPLUS con Sacl, despuntando los extremos y la digestión adicional con HindIII, para obtener pSPB185. El plásmido pSPB185 se digirió con Xbal, despuntado y ligado con un enlazador Salí para obtener pSPB521. Un fragmento de ADN de aproximadamente 700 pb obtenido por digestión de pUE6 con HindIII y Ba HI se ligó con un fragmento de ADN del vector binario obtenido por digestión de pSPB521 con HindIII y Sacl y con un fragmento del gen GUS obtenido por la digestión de pE2113 con BamHI y Sacl, para obtener pSPB528. El plásmido pSPB528 es un vector binario que tiene un gen estructural insertado entre el promotor del virus 35S de mosaico de coliflor que contiene el mejorador y el terminador de manopina sintasa, el cual es expresable en plantas. También, con el fin de acortar la secuencia no traducida del extremo 5' del ADNc de DFR de rosas, pCGP645, el pCGP645 de plásmido se digirió con SamI y Pvul , se despuntó y volvió a ligar para obtener pCGP645s. La secuencia del extremo 5' del ADNc de DFR de rosas se obtuvo por la amplificación de PCR utilizando pCGP645s como la plantilla y un cebador inverso y el cebador RDF310 sintético (5 ' -CCCTCGAGCCCTTGATGGCCTCGTCG-3 ' ) (SEC. DE IDENT. NO. : 19) como los cebadores, y se clonó en pCRTOPO. La secuencia de nucleótido de ADN se determinó y la ausencia de errores por PCR se confirmó. Este plásmido se designó como pSPB569. También, una secuencia de extremo 5' del ADNc de DFR de rosas con una diferente longitud se obtuvo por amplificación utilizando pCGP645s como la plantilla y un cebador inverso y el cebador sintético RDF830 (5'-GGGTCGACGCGGCCCTCTGCTTTCGG-3' ) (SEC. DE IDENT. NO.: 20) como los cebadores, y se clonó en pCRTOPO. La secuencia del nucleótido de ADN se determinó y la ausencia de errores por PCR se confirmó. Este plásmido se designó como pSPB570. Un fragmento de ADN del vector binario obtenido por digestión de pSPB528 con BamHI y Sacl, y un fragmento de ADN de aproximadamente 0.3 kb obtenido por digestión de pSPB569 con Sacl y Xhol, se ligaron con un fragmento de ADN obtenido por digestión de pSPB570 con BamHI y Salí, para obtener pSPB572. Este vector se diseña para la transcripción de ARN de doble hebra para ADNc de DFR de rosas en plantas . El plásmido pUE6 se digirió con Sacl y se despuntó, y un enlazador Salí se insertó para obtener pUE8. Un fragmento de ADN obtenido digiriendo pUE8 con HindlII y EcoRI se introdujo en los sitios HindIII y EcoRI de pBinPLUS para obtener el plásmido pSPB189. Un fragmento de ADN de aproximadamente 3.7 kb obtenido por digestión de pSPB189 con BamHI y Salí se ligó con un fragmento de ADN de aproximadamente 1.8 kb obtenido por digestión completa de pCGP1961 con BamHI seguido por digestión parcial con Xhol, para obtener el plásmido pSPB567. Después de la digestión de Pací y el tratamiento de desfosforilación de pSPB572, se enlazó con un fragmento de ADN de aproximadamente 2.8 kb obtenido por digestión de pSPB567 con Pací, y un plásmido con la transcripción del gen nptll y el pensamiento F3'5'H #40 en la misma dirección se seleccionó y se designó como pSPB905. Después de la digestión de AscI y el tratamiento de desfosforilación de pSPB905, se enlazó con un fragmento de ADN de aproximadamente 2.5 kb obtenido por digestión de pSPB909 con AscI , y un plásmido con la transcripción del gen DFR iris en la misma dirección como el gen nptll se obtuvo y se designó como pSPB919 (Figura 8) . Este plásmido se espera que permita la transcripción del gen DFR iris y el gen F3'5'H #40 de pensamiento en rosas, mientras se suprime la expresión del gen de DFR de rosas debido a la transcripción del ARN de doble hebra. El plásmido se transfirió en Agrobacterium tumefaciens AglO. El plásmido pSPB919 (Figura 8) se transfirió en la variedad de rosas violeta pálido "Lavanda" y se obtuvieron 87 transformantes . La acumulación de delfinidina se confirmó en 31 de las 38 plantas analizadas con pigmento (Tablas 28 y 29) . El contenido de delfinidina fue 100% máximo (promedio 76%) . El color de las flores se alteró a partir de la Gráfica de Color RHS 186c (grupo Agrisado-Púrpura) a 85a, b (grupo Violeta) . El ARN se extrajo a partir de pétalos de rosas en la misma manera como se explica anteriormente, y después de separar el ARN por electroforesis de gel de agarosa, se transfirió sobre Hybond N (Amersham) (por ejemplo, Tanaka et al., 1995) . El ARNm se detectó utilizando un Equipo del Iniciador Northern DIG (Roche) por el protocolo recomendado por el fabricante. El ARNm de DFR de la rosa se detectó utilizando pCGP645 (Tanaka et al., Plant Cell Physiol, 36, 1023-1031, 1995) como plantilla y una transcripción de cebador T7 como la sonda. La detección del ARNm de F3 ' 5 'H #40 de pensamiento se logró utilizando pCGP1961 como plantilla y una transcripción del cebador T7 como la sonda. La detección del ARNm de DFR de iris se logró utilizando pSPB906 como plantilla y una transcripción del cebador T7 como la sonda. El ARNm del gen de DFR del iris y el F3'5'H #40 del pensamiento se detectaron en las rosas de color alterado. Por otro lado, el ARNm de DFR de rosas se redujo significativamente en comparación con el huésped y se detectó una banda en la posición de peso molecular bajo, indicando la descomposición del ARNm de DFR de rosas.

Tabla 28 na: sin análisis/medida Tabla 29 na: sin análisis/medida Ejemplo 27. Expresión del gen F3'5 H de pensamiento (#40) y el gen DFR Nierembergia y la supresión del gen DFR endógeno de rosas en Lavanda Se obtuvo el ARN a partir de pétalos del cultivo de Nierembergia hybrida Fairy Bell Patio Light Blue (Suntory Flowers Co . , Ltd.) y se preparó el polyA+RNA a partir del mismo. Se preparó una biblioteca de ADNc a partir del polyA+RNA con ?ZAPII (Stratagene) como el vector, utilizando un equipo de síntesis de biblioteca de ADNc (Strategene) de acuerdo al protocolo recomendado por el fabricante. La biblioteca de ADNc se seleccionó utilizando el ADNc de DFR de petunia etiquetada con DIG (de pCGP1405) .

Las condiciones de selección fueron de acuerdo al método de hibridización de placa utilizando un sistema de etiquetado DIG, de acuerdo al protocolo recomendado por el fabricante. Sin embargo, la concentración de formaldehído fue 30% para la pre-hibridización y los tampones de hibridización, y la hibridización se llevó a cabo durante la noche a 37°C. La membrana se enjuagó a 55 °C en 5xSSC conteniendo 1% de SDS. Los plásmidos se recuperaron a partir de 20 placas entre las numerosas señales positivas, y sus secuencias de nucleótido se determinaron utilizando el Cebador Inverso (Takara) . Estos exhibieron alta homología con los genes DFR de otras plantas que incluyen petunia. La secuencia de nucleótido total del ADNc en el clon designada como pSPB709 se determinó. La secuencia de nucleótido se lista como la SEC. DE IDEN . NO . : 11, y la secuencia de aminoácido correspondiente se lista como la SEC. DE 1DENT. NO. : 12. Un fragmento de ADN de aproximadamente 3.9 kb obtenido por digestión de pSPB580 con BamHI y Xhol se enlazó con un fragmento de ADN de aproximadamente 1.5 kb obtenido por digestión de pSPB709 con BamHI y Xhol, para obtener el plásmido pSPB910. Después de la digestión de AscI y el tratamiento de desfosforilación de pSPB910. Se enlazó con un fragmento de ADN de aproximadamente 2.5 kb obtenido por digestión de pSPB910 con AscI, y un plásmido con la transcripción del gen DFR Nierembergia en la misma dirección como el gen nptll se obtuvo y se designó como pSPB920 (Figura 9) . Este plásmido se espera que permita la transcripción del gen DFR de Nierembergia y el gen F3'5'H #40 de pensamiento en rosas, mientras se suprime la expresión del gen DFR de rosas debido a la transcripción de ARN de doble hebra. El plásmido se transfirió en Agrobacterium tumef ciens AglO . El plásmido pSPB920 (Figura 9) se transfirió en la variedad de rosas violeta pálido "Lavanda" y se obtuvieron 56 transformantes. La acumulación de delfinidina se confirmó en 23 de las 24 plantas analizadas con pigmento (Tabla 30) . El contenido de delfinidina fue 100% máximo (promedio: 43%) . El color de las flores se alteró a partir de la Gráfica de Color RHS 186c (grupo Agrisado-Púrpura) a 85b (grupo Violeta) .

Tabla 30 na: sin análisis/medida Ejemplo 28. Herencia de ensayos a progenie Se llevó a cabo la hibridización utilizando una transformante (LA/91'9-2-13) obtenido por la transferencia de pSPB919 (Figura 8) en la variedad de rosas violeta pálido "Lavanda" como el progenitor de polen y el WKS77 o WKS133 no recombinante como el progenitor maternal (Suzuki, S., "Bara, Hanazufu" , Shogakkann, p. 256-260, 1990). El fruto se recolectó en el día 100 después de la polinización. La producción de semillas se logró pelando primero el fruto, cosechando el aquenio, pelando el aquenio, y luego removiendo el germen y incrustándolo en papel filtro humectado en un plato. El agua utilizada para la producción de semillas se esterilizó con agua conteniendo 1 tnl/1 de PPM™ (Mezcla de Conservador de Planta, Plant Cell Technology, Inc.) y 50 mg/1 de kanamicína, y las plántulas se cultivaron plantando sólo las plantas normalmente germinadas. La acumulación de delfinidina se confirmó en todas las 40 de la progenie de transformante analizada con pigmento (Tablas 31 y 32) . El contenido de delfinidina fue 99% máximo (promedio: 46%) .

Tabla 31 Tabla Ejemplo 29. Expresión del gen F3'5'H #40 de pensamiento y el gen DFR de iris y la supresión del gen DF endógeno de rosas en WKS140 El plásmido pSPB919 se transfirió en la variedad de rosas violeta pálido "WKS140" y se obtuvieron 89 transformantes . La acumulación de delfinidina se confirmó en 74 de las 79 plantas analizadas con pigmento. El contenido de delfinidina fue 100% máximo (promedio: 68%). El color de las flores se alteró a partir de la Gráfica de Color RHS 186d (grupo Agrisado-Púrpura) a principalmente 84c (grupo Violeta) 'Tabla 33 na: sin análisis/medida Ejemplo 30. Expresión del gen F3'5'H #40 de pensamiento y el gen DFR de iris y la supresión del gen DFR endógeno de rosas en KS77 Se transfirió el plásmido pSPB919 en la variedad de rosas rojo-púrpura " KS77" y se obtuvieron 50 transformantes. La acumulación de la delfínidina se confirmó en 21 de las 23 plantas analizadas con pigmento. El contenido de delfinidina fue 81% máximo (promedio: 19%) . El color de las flores se alteró a partir de la Gráfica de Color RHS 57a (grupo Rojo-Púrpura) a 77b (grupo Púrpura) . Tabla .34 na: sin análisis/medida Ejemplo 31. Expresión del gen F3 ' 5 'H #40 y el gen DFR de Nierembergia y la supresión del gen DFR endógeno de rosas en KS77 Se transfirió el plásmido pSBP20 en la variedad de rosas rojo-púrpura "WKS77" y se obtuvieron 30 transformantes. La acumulación de delfinidina se confirmó en 26 de las 27 plantas analizadas con pigmento. El contenido de delfinidina fue 98% máximo (promedio: 60%) . El color de las flores se alteró a partir de la Gráfica de Color RHS 57a (grupo Rojo-Púrpura) a 77b (grupo Púrpura) .

Tabla 35 na: sin análisis/medida Ejemplo 32. Expresión del gen F3 ' 5 'H #40 del pensamiento y el gen DFR de petunia y la supresión del gen DFR endógeno de rosas en WKS77 Se transfirió el plásmido pSPB921 en la variedad de rosas rojo-púrpura "WKS77" , y se obtuvieron 15 transformantes. La acumulación de delfinidina se confirmó en 12 de las 13 plantas analizadas con pigmento. El contenido de delfinidina fue 98% máximo (promedio: 60%) . El color de las flores se alteró a partir de la Gráfica de Color RHS 57a (grupo Rojo-Púrpura) a 72b (grupo Roj o-Púrpura) . Tabla 36 na: sin análisis/medida Ejemplo 33: Herencia de ensayos a progenie Se llevó a cabo la hibridización en la misma manera como el Ejemplo 28, utilizando una transformante (La/919-4-10) obtenida por transferencia del pSPB919 en la variedad de rosas violeta pálido "Lavanda" como el progenitor de polen y la variedad de rosas no recombinante "Bacará Negro" como el progenitor maternal. El fruto se recolectó en el día 100 después de la polinización. La producción de semillas se logró pelando primero el fruto, cosechando el aquenio, pelando el aquenio, y luego removiendo el germen e integrándolo en papel filtro humectado en un plato. El agua utilizada para la producción de semillas se esterilizó en agua conteniendo 1 mi/l de PPM™ (Mezcla de Conservador de Plantas, Plant Cell Technology, Inc.) y 50 mg/1 de kanamicina y las plántulas se cultivaron plantando sólo las plantas normalmente germinadas . La acumulación de delfinidina se confirmó en todas las 18 progenies transformantes analizadas con pigmento. El contenido de delfinidina fue 99.8% máximo (promedio: 98.7%). Tabla 37 na: sin análisis/medida Ejemplo 34. Expresión del gen F3 ' 5 ' ?L #40 de pensamiento y la supresión del gen F3 'H de rosas en KS77 Se transfirió el plásmido pSPB1106 (Figura 10) en la variedad de rosas rojo-púrpura "WKS77" y se obtuvieron 40 transformantes . La acumulación de delfinidina se confirmó en todos las 26 plantas analizadas con pigmento. El contenido de delfinidina fue 80.0% máximo (promedio: 30.5%). El color de las flores experimentó una mayor alteración a partir de la Gráfica de Color RHS 57a (grupo Rojo-Púrpura) a 83d (grupo Violeta) . Tabla 38 na: sin análisis/medida Ejemplo 35. Expresión del gen F3'5'H #40 de pensamiento y la supresión del gen F3 'H endógeno de rosas en Lavanda Se transfirió el plásmido pSPB1106 en la variedad de rosas violeta pálido "Lavanda" y se obtuvieron 40 transformantes. La acumulación de la delfinidina se confirmó en 23 de las 25 plantas analizadas con pigmento. El contenido de delfinidina fue 98.3% máximo (promedio: 46.9%) . Tabla 3.9 na: sin análisis/medida Estos resultados demuestran que el gen exógeno transferido se heredó y se expresó por la progenie, y que el ensayo de la producción de delfinidina el cual no se encuentra en pétalos de rosas ordinarios se heredó exitosamente por la progenie de la rosa. De este modo, este gen puede utilizarse para cultivo de hibridización de rosas con colores alterados para crear rosas con nuevos colores incluyendo azul y púrpura . Aplicabilidad Industrial Al suprimir artificialmente la función de la trayectoria metabólica endógena tal como por ejemplo, la expresión de la dihidroflavonol reductasa, en rosas, y al expresar la codificación genética para flavonoide 3 ',5'-hidroxilasa del pensamiento y una codificación genética para dihidroflavonol reductasa a partir de especies diferentes de las rosas, es posible crear rosas azules a violetas. Estos genes se heredan por generaciones subsecuentes, y el ensayo de rosa azul puede utilizarse para hibridización.

Claims (8)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método para producir una rosa, caracterizado por suprimir artificialmente la trayectoria metabólica endógena de la rosa y expresando la codificación genética del pensamiento para flavonoide 3 ', 5' -hidroxilasa.
2. 2. Un método para producir una rosa, de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por suprimir artificialmente la trayectoria metabólica endógena de la rosa, y expresar la codificación de gen del pensamiento para flavonoide 3 ', 5 ' -hidroxilasa y la codificación del gen para la dihidroflavonol reductasa.
3. 3. Un método para producir una rosa de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizado por suprimir artificialmente la expresión de la dihidroflavonol reductasa endógena de la rosa, y expresar la codificación genética del pensamiento para flavonoide 3 ' , 5 ' -hidroxilasa y la codificación genética para dihidroflavonol reductasa derivada de una planta diferente de la rosa.
4. 4. Un método para producir una rosa, de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por suprimir artificialmente la expresión del flavonoide 3 ' -hidroxilasa endógena de la rosa y expresar la codificación genética del pensamiento para flavonoide 3 '.5 ' -hidroxilasa.
5. 5. Una rosa obtenida por el método de producción de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o una progenie o tejido de la misma, que tiene las mismas propiedades como la rosa.
6. 6. Una rosa obtenida por el método de producción de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o una progenie o un tejido de la misma, que tiene las mismas propiedades como la rosa, en donde el color de los pétalos de la rosa es violeta, azul-violeta o azul.
7. 7. Una rosa de acuerdo con la reivindicación 6, o una progenie o un tejido de la misma, que tiene las mismas propiedades como la rosa, en donde el color de los pétalos de la rosa pertenece al "grupo Violeta" , el grupo "Azul-Violeta" o el "grupo Azul" de acuerdo a la Gráfica de Color de la Real Sociedad de Horticultura (RHSCC) .
8. 8. Una rosa de acuerdo con la reivindicación 7, o una progenie o un tejido de la misma, que tiene las mismas propiedades como la rosa, en donde el color del pétalo de la rosa pertenece al "grupo Violeta" 85a u 86b de acuerdo a la Gráfica de Color de la Real Sociedad de Horticultura (RHSCC) .