MXPA06001591A

MXPA06001591A - Productos de tabaco de exposicion reducida.

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Publication number: MXPA06001591A
Application number: MXPA06001591A
Authority: MX
Inventors: Joseph Pandolfino
Original assignee: 22Nd Century Ltd Llc
Priority date: 2003-08-19
Filing date: 2004-08-18
Publication date: 2006-05-19
Also published as: US9814258B2; US20070034220A1; EP1675454A4; CN1838878A; US20180153207A1; WO2005018307A1; KR20060128821A; EA200600449A1; BRPI0413733A; AR045466A1; EP1675454A1; ZA200600749B; CA2535763A1; OA13241A; AU2004266694A1; JP2007502621A; AP2006003550A0; AP2265A

Abstract

La presente invencion proporciona metodologias, incluyendo la utilizacion de tabacos geneticamente modificados (GM), para el desarrollo y produccion de PREPs aceptables para el consumo, que abarcan los siguientes: 1) produccion de cigarrillo con una relacion alquitran a nicotina baja, que permite a los fumadores obtener cantidades satisfactorias de nicotina mas eficientemente que con los cigarrillos convencionales mientras se reduce las administraciones de humo completo; por ello reduciendo la "compensacion" del fumador que se presenta con los cigarrillos de bajo rendimiento convencionales; 2) reduccion de nitrosaminas especificas de tabaco perjudiciales en productos de tabaco por medios geneticos y por extraccion de nicotina del tabaco y combinarlos con tabaco reducido en nicotina generalmente modificado, 3) produccion de tabaco expandido mejorado que utiliza tabaco incrementado en nicotina geneticamente modificado; y 4) produccion de tabaco reconstituido que incluye cualesquiera de las combinaciones de los siguientes: tabaco incrementado en nicotina geneticamente modificado, tabaco reducido en nicotina geneticamente modificado, fracciones de hojas de tabaco, y tabaco seco por congelado recientemente cosechado.

Description

PRODUCTOS DE TABACO DE EXPOSICION REDUCIDA Campo de la Invención La presente invención se refiere al campo de los productos de tabaco con exposición reducida, que incluyen, pero no se limitan a cigarrillos los cuales contienen tabaco genéticamente modificado, y a métodos de preparación de tales cigarrillos . Antecedentes de la Invención El uso del tabaco se considera que es una causa que causa enfermedades importantes y que provoca la muerte en los .Estados Unidos (U.S. Department of Health and Human Services (U.S. DHHS) , Enero 2000, Healthy People 2010) . Durante las varias décadas anteriores, la comunidad de salud pública ha resaltado repetidamente las consecuencias para la salud por fumar cigarrillos. Las enfermedades cardiovasculares, enfermedades respiratorias y cánceres que se atribuyen al tabaquismo, son amplias y crecen como se hace evidente por el informe más reciente del Surgeon General (The Health Consequences of Smoking, Surgeon General's Report, 2004). El Centro para el Control de las Enfermedades ha estimado que más de 440,000 muertes prematuras por año en los Estados Unidos se atribuyen al fumar cigarrillos. Aunque las tasas de tabaquismo en el mundo desarrollado se han abatido en los últimos treinta años, y han disminuido REF. :169779 en algunos países, las tasas de tabaquismo y las tasas de consumo de cigarrillos en los países en desarrollo se han incrementado durante este mismo periodo de tiempo, y probablemente continuarán haciéndolo en el futuro previsible. Las proyecciones actuales muestran que el número de fumadores a nivel mundial se incrementará' de los actuales 1,300 millones a más de 1,700 millones en 2025 (debido en parte a un incremento en la población global) si la prevalencia global del tabaco permanece sin cambio (Organización Mundial de la Salud, 2004) . El consumo total de cigarrillos a nivel mundial continúa incrementándose. En términos de volumen, el consumo mundial total de cigarrillos se incrementó en 4% entre 1995 y 1999 desde 4.763 trillones de cigarrillos a 4.953 trillones de cigarrillos. El mercado de productos manufacturados del tabaco está dominado por los cigarrillos que significan el 96% del valor del mercado global (The World Market for Tobacco Products, publicado por Euromonitor International, edición del 2000, p. 2). En 2002, el mercado mundial creció hasta 5.322 trillones de cigarrillos (Action on Smoking and Health, Factsheet No: 18; Enero 2004) . Considerando la magnitud y tasa de crecimiento de estos números, está claro que ' las personas fumarán cigarrillos todavía por mucho tiempo. Se predice que fumar cigarrillos pudiera provocar hasta 1000 millones de muertes prematuras a nivel mundial para finales del siglo XXI. Las estadísticas actuales demuestran que hay alrededor de una muerte de cáncer de pulmón por cada 3 trillones de cigarros consumidos (Nature Cáncer Reviews, Oct . 2001) . La solución ideal para este dilema de cuidado de la salud es que abandonen el cigarrillo todos los f madores. Sin embargo tal solución parece no realista. Las prohibiciones de las políticas antitabaco del cabildeo antitabaco no han sido exitosas en su mayor parte debido a un consumo mundial creciente de productos del tabaco. Estas políticas en el mundo occidental en donde han sido más frecuentes, han reducido fácilmente las tasas de tabaquismo en los últimos 20 años. Un porcentaje importante de los fumadores de cigarrillos no tiene el deseo de dejar el tabaco. Aunque decenas de millones de personas solamente en los Estados Unidos han dejado el tabaco, mucho antes del advenimiento de muchas formas de terapias de reemplazo de nicotinas (NRTs por sus siglas en inglés) , un segmento de los fumadores no ha sido exitoso en sus intentos por dejarlo. Una estrategia efectiva para reducir los efectos adversos del consumo del cigarrillo para estos dos grupos ha sido deficiente. Un informe reciente emitido por el Instituto de Medicina (IOM por sus siglas en inglés) de la Academia Nacional de Ciencias a solicitud de la Administración de Fármacos y Medicamentos de los EUA, ha creado los cimientos para un remedio potencial al estancamiento actual . El informe resultante de 656 páginas titulado Clearing the Smoke-, Assessing The Science Base For Tobacco Harm Reduction (Informe de IO ) , expresa una necesidad urgente de salud pública para los productos potenciales de exposición reducida ("PREPs" por sus siglas en inglés) especialmente los cigarrillos (Institute of Medicine, Washington, DC: National Academy Press, 2001) . La primera conclusión del informe del IOM es que: "Para muchas enfermedades que se atribuyen al uso del tabaco, un riesgo disminuido de la enfermedad al reducir la exposición a toxificantes del tabaco es factible. Esta conclusión se basa en los estudios que demuestran que para muchas enfermedades, la reducción de la exposición al humo del tabaco puede resultar en una incidencia de la enfermedad disminuida con una abstinencia completa que proporciona el mayor beneficio" . (Resumen Ejecutivo del Informe IOM página 4) . Por lo tanto, los PREP son una necesidad de política de salud pública cuando se consideran todas las dinámicas políticas y económicas. La mercadotecnia y reglamentación de los PREP basados en la ciencia, necesita incluirse como parte de cualquier estrategia completa de política pública sobre el tabaco. La meta global de reducción del uso del tabaco incluyendo restricciones de mercadeo razonables para el tabaco para adultos, la vigilancia estricta de las ventas y la comercialización a menores y la educación sobre los efectos dañinos del tabaquismo, debieran ir mano a mano con la disponibilidad de PREP para los consumidores para que reduzcan la cuota global del tabaco sobre la sociedad. El humo del cigarrillo se constituye de dos fases: una fase en partículas que se llama comúnmente "alquitrán" o materia total en partículas; y una fase vapor que contiene gases y compuestos semi-vol tiles . Una definición común para el "alquitrán" , es un humo seco libre de nicotina o materia en partículas secas libres de nicotina (NFDPM por sus siglas en inglés) . Más específicamente, el "alquitrán" es la materia en partículas totales aislada del humo, excluyendo el agua y compuestos alcaloides que incluyen, pero no se limitan a la nicotina. Aproximadamente 4 quintas partes del peso del humo del tabaco se constituye del aire del ambiente, el cual incluye el monóxido de carbono, dióxido de carbono, agua, hidrógeno, metano, nitrógeno y oxígeno. La quinta parte restante comprende los compuestos semi-volátiles y en fase de partículas. El alquitrán constituye menos del 10% en peso del humo del cigarrillo. Todavía es el componente del alquitrán el que contiene la mayoría de los compuestos más perjudiciales . El humo del cigarrillo es una mezcla extremadamente compleja de compuestos químicos. Años de análisis químico del humo del cigarrillo han demostrado arriba de 6,000 componentes (alquitrán más gases) . Se han identificado aproximadamente 4,800 compuestos en la porción del alquitrán del humo del cigarrillo (Green and Rodgman, Recent Advances in Tobacco Science, 22: 131-304, 1996) . Los métodos analíticos combinados con ensayos biológicos sensibles, han conducido a la identificación de 69 productos cancerígenos en el humo del tabaco (The Changing Cigarette : Chemical Studies and Bioassays, Dxetrich and Use Hoffman, Capitulo 5, Smoking and Tobaco Control Monograph No. 13, NIH Pub. No. 02-5074, Octubre 2001) . Ha sido claro para los investigadores, sin embargo, que no todos los componentes del humo del cigarrillo tienen una toxicidad igual. De manera notable, el primer informe del U.S. Surgeon General de tabaquismo de 1964 llegó a la conclusión de que la nicotina probablemente no era tóxica en los niveles inhalados por los fumadores, con la implicación de que la fuente de recompensa farmacológica principal para los fumadores no era de preocupación inmediata (Gori, p. 3, Virtually Safe Cigarettes - Reviving an Opportunity Once Tragically Rejected, 2000) . De hecho, el informe de Surgeon General indicó ??? hay evidencia aceptable de que la exposición prolongada a la nicotina provoque ya sea cambios funcionales peligrosos de una naturaleza objetiva o enfermedades degenerativas" (Informe del U.S. Surgeon General 1964 página 74) . De hecho, la Administración de Fármacos y Alimentos de los EUA, permite ahora la venta de parches de nicotina y gomas de mascar como dispositivos para suspender el tabaquismo, que pueden suministrar más nicotina que un paquete de cigarrillos. Los ^alcaloides" son compuestos complejos que contienen nitrógeno que se presentan naturalmente en la plantas, y tienen efectos farmacológicos en los humanos y los animales. La nicotina es el alcaloide natural principal en el tabaco para cigarrillos comercializado, e incluye alrededor del 90% del contenido de alcaloides en Nicotiana tabacum. Otros alcaloides importantes en el tabaco incluyen la cotinina, nornicotina, miosmina, nicotirina, anabasina y anatabina (J. C. Leffingwell, Capítulo 8 Leaf Chemistry, Tobacco: Production, Chemistry and Technology, página 275, 1999). Los alcaloides menores en el tabaco incluyen nicotina-n-óxido, N-metil anatabina, N-metil anabasina, pseudooxinicotina, 2,3 dipiridilo y otro ( "Biosynthesis and Metabolism of the Tobacco Alkaloids" , Edward Léete in Alkaloids : Chemical and Biological Perspectives , Volumen I. S. William Pelletier, Ed. 1983). Algunos de los efectos comunes de la nicotina en los humanos, son una- presión sanguínea y ritmo cardiaco aumentados, y mejoras en la concentración y en la memoria de corto plazo. Los análogos de nicotina y compuestos están sujetos a una investigación muy reciente desde que mostraron ser prometedores en el tratamiento de algunas enfermedades tales como Alzheimer y Parkinson. Otros alcaloides del tabaco tienen una actividad similar pero reducida en comparación a la nicotina. Las medidas más comunes de los suministros del humo del cigarrillo se reportan como alquitrán y nicotina. Las concentraciones de alquitrán y nicotina de los cigarrillos se muestran en todos los anuncios de cigarrillos al consumidor en los Estados Unidos y en diversos otros países. En muchos países, las concentraciones (por cigarrillos) para el alquitrán, nicotina y aún el monóxido de carbono, se requiere que se impriman en el empaque de los cigarrillos . Durante las pasadas varias décadas, las innovaciones en el diseño de cigarrillos se han enfocado principalmente en las reducciones de concentración del alquitrán y la nicotina, con base en una creencia abarcada por el U.S. Surgeon General y la comunidad de salud pública de que "menos debe ser lo mejor" (ver figura 1) · En los Estados Unidos las concentraciones de alquitrán, nicotina y monóxido de carbono se obtienen usando el método de prueba de la máquina para fumar de la Comisión de Comercio Federal (FTC por sus siglas en inglés) la cual define la medida del alquitrán como el material capturado por una almohadilla de Cambridge cuando el cigarrillo se fuma en la máquina menos la nicotina y el agua (Pillsbury, et al., 1969, "Tar and nicotine in cigarrette smoke" . J. Assoc. Off.

Analytical Chem. , 52, 458-62). Específicamente, el método de prueba de cigarrillos de la FTC recolecta muestras de humo al simular volúmenes de bocanadas de 35 mi de humo de cigarrillo por 2 segundos cada 58 segundos con ninguno de los orificios de ventilación en el filtro bloqueados (sí los hay) , hasta que la línea de encendido alcanza el papel de la boquilla más 2 mm o una línea dibujada 23 mm desde el final de un cigarrillo sin filtro. El método de prueba de la máquina de fumar de la FTC se ha utilizado en los Estados Unidos desde 1967 para determinar las concentraciones de fumar cigarrillos en cuanto al alquitrán y nicotina. La determinación de las concentraciones de monóxido de carbono en el humo del cigarrillo se agregó a este método en 1980. En 1967 cuando la FTC introdujo su método de prueba, emitió un boletín de noticias y explicó que el propósito de la prueba "no es determinar la cantidad de alquitrán y nicotina inhalados por ningún fumador humano, sino más bien determinar la cantidad de alquitrán y nicotina generados cuando se fuma un cigarro por una máquina de acuerdo con el método prescrito" . Sin embargo, el método sirve como un papel importante en suministrar una vía precisa para clasificar y comparar los cigarrillos de acuerdo a las concentraciones de alquitrán, nicotina y monóxido de carbono. La Organización Internacional ' de Estándares (ISO) desarrolló un método de prueba con una máquina de fumar muy similar para las concentraciones de alquitrán, nicotina y monóxido de carbono de los cigarrillos (ISO 1991 "Cigarrillos - Determinación de la materia en partículas secas libres de nicotina y totales usando una máquina para fumar analítica de rutina" ISO: 4387:1991). Los métodos de tabaquismo de FTC e ISO difieren en la siguientes 8 áreas. • El método de la FTC especifica condiciones ambientales de laboratorio de 75°F + 1°F (23.8°C + 1°C) y una humedad relativa de 60% + 2% para el equilibrio y la prueba. El tiempo del equilibrio es un mínimo de 24 horas y un máximo de 14 días. Esto se compara con las especificaciones de la ISO de 22°C + 1°C y 60% + 2% de humedad relativa para el equilibrio, 22°C + 2°C y 60% de humedad relativa +_ 5% para la prueba. El tiempo en equilibrio es un mínimo de 48 horas y un máximo de 10 días. • La FTC define la longitud de la colilla del cigarrillo como un mínimo de 23 milímetros o el papel de la boquilla más 3 milímetros lo que sea más largo. ISO define la longitud de la colilla con un máximo de 23 milímetros o el papel de la boquilla más 3 milímetros o el filtro más 8 milímetros. Ambos métodos especifican una longitud de la colilla de 23 milímetros para los cigarros que no tienen filtro. • La ISO define la posición del cenicero a 20-60 milímetros debajo de los cigarrillos en la máquina de fumar. FTC no especifica una posición.

• La ISO especifica un soporte de filtro reutilizable conjunto de conexión rápida de 2 piezas. Este soporte filtro contiene la almohadilla Cambridge y utiliza un depurador perforado de hule sintético para obstruir parcialmente el extremo de la colilla del cigarrillo. El método de FTC define el uso de la almohadilla del filtro Cambridge pero no especifica un ensamble de soporte de la almohadilla del filtro . • El método ISO especifica un flujo de aire a través de los cigarrillos al nivel del cigarrillo. La FTC especifica el uso de un cigarrillo de observación para ajusfar el flujo de aire. • El procedimiento de la ISO define el proceso de limpiar el material en exceso de partículas totales (TPM) fuera del soporte de filtro usado. Las superficies internas del soporte del filtro se limpian con 2 cuartos por separado de una almohadilla de filtro acondicionadas sin usar. El método FTC utiliza el respaldo (el lado opuesto del TPM atrapado) para limpiar la superficie interior del soporte del filtro. • La ISO especifica el uso de 20 mi por almohadilla Cambridge de la solución de extracción para analizar la nicotina y el agua en TPM. El procedimiento FTC define 10 mi por almohadilla Cambridge. • La ISO define los estándares internos para la determinación cromatográfica del gas de nicotina y agua. El procedimiento FTC no especifica los estándares internos.

Estas diferencias resultan típicamente en suministros medidos ligeramente inferiores para el método de la ISO contra el método de la FTC. Los valores medidos entre los métodos de FTC e ISO están dentro de los limites de detección de la prueba o alrededor de no más de 0.4 mg de alquitrán y alrededor de 0.04 mg de nicotina para cigarrillos que producen más de alrededor de 10 mg. La critica principal para los métodos de prueba de la máquina para fumar de FTC/ISO (^método FTC/ISO" o "método FTC o ISO") es que no predicen con precisión el nivel de exposición individual del fumador al alquitrán, nicotina o monóxido de carbono al fumar un cigarrillo en particular. (National Cáncer Institute Smoking and Tobacco Control Monografía 13, "Risks Associated with Smoking Cigarrettes with Low Machine-measured Yields of Tar and Nicotine) . Estos métodos obtienen resultados de prueba bajo condiciones estandarizadas. Sin embargo, un comportamiento individual al fumar puede y lo hace en la mayoría de los casos, variar ampliamente de cómo estas maquinas estandarizadas fuman los cigarrillos. Un fumador humano puede estar expuesto a niveles extremadamente diferentes de alquitrán, nicotina y monóxido de carbono por cigarrillo (para el estilo exacto de la misma marca de cigarrillos) en comparación con los valores derivados del método FTC/ISO dependiendo de diversos factores, incluyendo la frecuencia de las bocanadas del fumador y el volumen de la inhalación de tales bocanadas, la duración de la inhalación del humo que se mantiene antes de exhalar, el número de cigarrillos fumados dentro de un periodo especifico de tiempo, y el porcentaje del cigarrillo que se fuma (hasta donde se fuma el cigarrillo) . Dos personas que fumen el estilo de marca de cigarrillos exactamente igual y el mismo número de cigarrillos diarios, pueden no estar necesariamente expuestos a los mismos niveles de alquitrán, nicotina y monóxido de carbono. Adicionalmente, un fumador individual está expuesto a diferentes niveles de alquitrán, nicotina y monóxido de carbono por cigarrillo en momentos diferentes. Por ejemplo, si un fumador está en un vuelo trasatlántico y no ha tenido un cigarrillo por 8 horas, probablemente fumará el siguiente cigarrillo muy agresivamente y estará expuesto a niveles superiores de alquitrán, nicotina y monóxido de carbono que su promedio por cigarrillo. Por otro lado, si un fumador ha tenido muchos más cigarrillos que lo usual en un periodo breve de tiempo, los cigarrillos posteriores se pueden fumar menos agresivamente con lo cual se expone al fumador a menos alquitrán, nicotina y monóxido de carbono (en una base por cigarrillo) que el promedio para ese fumador. Otros factores, que incluyen la tensión, afectan qué tan a menudo y qué tan agresivamente f man las personas . La tensión generalmente incrementa el consumo de nicotina de un fumador (Informe de IOM p. 254) . Los cigarrillos con filtro se pueden diseñar para producir menos alquitrán, nicotina y monóxido de carbono de acuerdo con el método FTC/ISO. Esto se puede lograr al reducir las concentraciones de estas fracciones de humo por bocanadas . Se conoce que se pueden obtener cigarrillos con menor alquitrán, menor nicotina y menos monóxido de carbono, al incorporar alguna o más de las siguientes modificaciones ("Cigarrette Design" , Lynn T. Kozlo ski, et al., NCI Monografía 13, Capítulo 2, pg. 15) : • Hacer el filtro más eficiente de manera que filtre más cantidad de humo; • Usar papel para cigarrillos de mayor porosidad; · Colocar o incrementar el número de orificios de ventilación (incluyendo incrementar su tamaño) alrededor del material de la boquilla del filtro, de manera que cuando el fumador aspira el cigarrillo más aire viene en la mezcla de humo con lo cual se diluye la cantidad de humo inhalado; · Incrementar la velocidad de combustión del cigarrillo con aditivos químicos en el papel parar cigarrillos o el relleno; • Usar un mayor porcentaje de tabaco lámínado reconstituido hecho a partir de desechos de tabaco incluyendo los tallos y el polvo del tabaco • Utilizar tabaco expandido, el cual crea menos alquitrán y nicotina por cigarrillo ya que menos masa del tabaco de hoja entera llena el pitillo del cigarrillo,- • Reducir el diámetro del cigarrillo reduciendo así el peso del relleno e • Incrementar la longitud del papel de la boquilla lo cual cambia la longitud de la boquilla. La figura 1 pone estos métodos en una perspectiva histórica y muestra las disminuciones resultantes en las concentraciones de alquitrán y nicotina. "El tabaco reconstituido" ("recon") es una parte importante del relleno del tabaco hecho de polvo de tabaco y de otro material de desecho del tabaco, procesado en forma de lámina y cortado en tiras para asemejarse al tabaco. Además de los ahorros en costo, el tabaco reconstituido es muy importante por su contribución al sabor del cigarrillo a partir del desarrollo de sabor en el procesamiento utilizando reacciones entre el amoniaco y los azúcares. "El tabaco expandido" es otra parte importante del relleno del tabaco que se procesa a través de la expansión de gases adecuados de manera que el tabaco "toma una bocanada" resultando en una densidad reducida y una mayor capacidad de relleno. Reducir el peso del tabaco utilizado en los cigarrillos. Ventajosamente, el tabaco expandido reduce los suministros de alquitrán, nicotina y monóxido de carbono y encuentra uso por ejemplo en hacer cigarrillos con bajo suministro de alquitrán, baja nicotina y bajo monóxido de c rbono . El contenido de nicotina y con un menor grado el nivel de alquitrán que el humo del cigarrillo produce, también depende del tipo y variedad del tabaco usado para producir el cigarrillo. Los tres tipos de tabacos generalmente usados en las marcas americanas de cigarrillos son curado en atmósfera artificial, tabaco claro y delgado (burley) y oriental. Las mezclas de estos producen lo que se ha referido como cigarrillos de mezcla americana. Generalmente, el tabaco "burley" tiene el nivel más elevado de nicotina seguido por el curado en atmósfera artificial y el oriental . La mayoría de las variedades de tabaco curado al 15% de humedad contienen alrededor de 1 a 3% de nicotina en peso. El contenido de alcaloides en cigarrillos terminados es menor que la cantidad en la hoja de tabaco recientemente cosechada utilizada para hacer cigarrillos debido a que suceden pérdidas durante los procesos de curado, almacenamiento y manufactura . El "curado" es el proceso de añejamiento que reduce la humedad y genera la destrucción de la clorofila dándole a las hojas del tabaco un color dorado y por lo cual el almidón se convierte en azúcar. El tabaco curado por lo tanto tiene un contenido de azúcar reductor superior, y un contenido de almidón inferior en comparación con el de hoja verde cosechada. El "tabaco curado en atmósfera artificial" se refiere a un método para secar plantas de tabaco en un granero ventilado con calor y se característica por un color único, contenido alto de azúcar reductor, con cuerpo de mediano a pesado y con propiedades de fumado excepcionalmente uniformes (Bacon, E. W. , enger, R. & Bullock, J.F. (1952), Chemical changes in tobáceo during flue-curing, Ind. Eng. Chem. , 44, 292) . Se sabe que al variar el diseño de alguno de los componentes del pitillo del cigarrillo como se discute arriba, para virtualmente todos los rellenos de tabaco comercializados, se puede variar los niveles de alquitrán y de nicotina que se miden por el método FTC/ISO para un cigarrillo con filtro desde aproximadamente 1 mg de alquitrán y 0.05 mg de nicotina hasta aproximadamente 20 mg de alquitrán y 1.8 de nicotina. Cuando se diseñan los cigarrillos para ser "más ligeros", los niveles de alquitrán, nicotina y onóxido de carbono cuando se miden por el método FTC/ISO se reducen en proporciones ligeramente diferentes. Sin embargo, el nivel de alquitrán y monóxido de carbono no se reduce en un porcentaje notable sin una reducción correspondiente en el nivel de nicotina por aproximadamente el mismo porcentaje y viceversa. Aunque se han reducido las concentraciones de alquitrán y nicotina por el método FTC/ISO durante los últimos 50 años, la relación de concentración de alquitrán a nicotina ("TNR") de los cigarrillos ha permanecido bastante estable como se indica en la figura 1 y la figura 2. El término "cigarrillo" como se usa en la presente se define como el pitillo más el relleno. El pitillo del cigarrillo incluye el papel para el cigarrillo, el filtro, envoltorio de tapón (usado para contener los materiales de filtración) , papel de la boquilla que retiene el papel de cigarrillo (incluyendo el relleno) al filtro, y todos los pegamentos que mantienen en conjunto a estos componentes. Los únicos componentes del pitillo de un cigarrillo sin filtro son el papel para cigarrillos y el pegamento que los sella. El relleno incluye (1) todos los tabacos, incluyendo pero no limitado a tabaco reconstituido y tabaco expandido, (2) substitutos que no son de tabaco (incluyendo, pero no limitado a hierbas, materiales de plantas que no son de tabaco y otras especies que pueden acompañar a los tabacos enrollados dentro del papel para cigarrillos) , (3) envolventes, (4) saborizantes y (5) todos los otros aditivos (que se mezclan en los tabacos y substitutos y se enrollan en el cigarrillo) . El término "cigarrillo" como se usa en la presente también se define como (A) cualquier rollo de tabaco envuelto en papel o cualquier otra substancia que no contenga tabaco y (B) cualquier rollo de tabaco envuelto en cualquier substancia que contiene tabaco la cual debido a su apariencia el tipo de tabaco usado en el relleno o su empaque y etiquetado es probable que se ofrezca a, o se adquiera por consumidores como un cigarrillo descrito en un subíndice (A) (1967 Federal Cigarrette Labeling And Advertising Act, U.S. FTC) . Los términos "pitillo sin filtro", "pitillos de sabor completo", "pitillo ligero", y "pitillo ultra ligero" como se usa en la presente se definen como un cigarrillo sin filtro menos su relleno, un cigarrillo de sabor completo menos su relleno, un cigarrillo ligero menos su relleno y un cigarrillo ultraligero menos su relleno, respectivamente. Como se usa en la presente, "la relación de concentración de alquitrán a nicotina" o "TNR por sus siglas en inglés" de un cigarrillo, se calcula al dividir el concentración del alquitrán por el concentración de la nicotina, ambos de esos concentracions se miden por el método FTC o ISO. Las marcas de cigarrillos en los Estados Unidos y a lo largo de mayor parte del mundo se diferencian por categorías tales como sabor completo, ligeros y ultraligeros . Estas denominaciones aparecen usualmente en los paquetes de cigarrillos y en la publicidad. Tales categorías transmiten la fuerza del cigarrillo que es una función del nivel del alquitrán y la nicotina medidos por el método FTC o ISO. Cigarrillos de sabor más fuerte o con sabor completo tienen mayores concentracions de alquitrán y de nicotina. Las categorías o fuerza de los cigarrillos que se reconocen generalmente en los Estados Unidos en cuanto al método FTC son las siguientes : • "cigarrillo de sabor completo" (15 mg o más de alquitrán por cigarrillo) • "cigarrillo ligero" (7 a 14 mg de alquitrán por cigarrillo) • "cigarrillo ultraligero" (6 mg o menos de alquitrán por cigarrillo) . Las decisiones del consumidor sobre si fuma de sabor completo contra cigarrillos ligeros se basa únicamente en los niveles de alquitrán y de nicotina derivados del método FTC/ISO son problemáticas ("Public Understanding of Risk and Reasons for Smoking Low-Yield Products" , Neil Weinstein, NCI Monografía 13, Capítulo 6) . Ya que los humanos y las máquinas para fumar fuman de manera diferente los cigarrillos, el consumidor puede tener altas expectativas para un cigarrillo reportado que tenga bajo alquitrán ("Consumer Perception of Cigarette Yields: Is the Message Relevant?", Gio Gori, Regulatory Toxicology and Pharmacology volume 12, 64-68 1990) . El fumador no debiera creer equivocadamente que al cambiar de cigarrillos de sabor completo (el sabor completo de Marlboro® produce 15 mg de alquitrán y 1.1 de nicotina) hasta los cigarrillos ligeros (los ligeros de Marlboro® producen 11 mg de alquitrán y 0.8 mg de nicotina) reducirán necesariamente los riesgos asociados con el tabaquismo.

Cuando los fumadores de cigarrillos ligeros se comparan con los fumadores de cigarrillos de sabor completo (y los fumadores de ultraligeros se comparan con los fumadores de ligeros y los fumadores de ultraligeros en comparación con los fumadores del sabor completo) y/o cuando un fumador individual que fuma usualmente cigarrillos ligeros o de sabor completo cambia a cigarrillos de concentración reducido, o fuma ocasionalmente cigarrillos de concentración reducido, algunos o todos los siguientes comportamientos del tabaquismo pueden presentarse en cierto grado: • se toman más bocanadas por cigarrillo • bocanadas individuales más extensas o el volumen de la bocanada (por ejemplo 55 mi de humo se puede consumir contra 35 mi) . • Variación en la duración de las bocanadas individuales (por ejemplo 4 segundos contra 2 segundos) con lo cual se producen temperaturas de cono más calientes las cuales se, han asociado con una mutagenicidad aumentada del humo; • La retención del humo en los pulmones por una duración mayor antes exhalar; · Inhalación más profunda en los pulmones ; • Los fumadores de cigarrillos ligeros pueden bloquear los orificios de venteo de filtro con los dedos y los labios; y • Se fuman más cigarrillos por un periodo dado de tiempo.

* (Effect of pyrolysis temperature on the mutagenicity of tobáceo smoke condénsate," White, J. L. , et al . , Food and Chemical Toxicology 39, págs . 499-505 (2001)). Como se establece en el informe de IOM: "Con objeto de mantener la ingestión deseada de nicotina, muchos fumadores que cambiaron a productos de bajo concentración también cambiaron la manera en que fumaban en la forma previamente descrita. Así, su exposición a los tóxicos del tabaco es mayor que la que se había predicho por ensayos estandarizados y las personas que han continuado usando estos productos no han reducido significativamente el riesgo de enfermedad al cambiarlo (Informe de la IOM página 2) . Las diferencias en el comportamiento del tabaquismo observado entre los fumadores de cigarrillos de sabor completo, ligeros y ultraligeros se han denominado en conjunto "compensación" ( "Compensatory Smoking of Low Yield Cigarrettes" , Neal Beno itz, NCI Monograph 13). "La Compensación" es fumar más intensivamente debido a la presencia reducida de nicotina en el humo del tabaco. Los fumadores compensan con fumar cigarrillos de menor concentración (contra los cigarrillos de mayor concentración) más agresivamente con objeto de obtener su impacto en el nicotina deseado y la sensación en la boca del humo los cuales son propiedades sensoriales importantes (Jed E. Rose, "The role of upper airway stimulation in smoling" , Nicotine Replacement : A Critical Evaluation, p 95-106, 1988).

El grupo Wilcox ha concluido que los fumadores que cambian a cigarrillos de menor alquitrán y nicotina se compensan al aumentar su consumo de cigarrillos por dia en comparación con el grupo de control . Los datos acumulados de cuatro ensayos fallaron en mostrar un beneficio estadísticamente importante para cigarrillos de bajo alquitrán en términos de riesgo para cáncer de pulmón, aún entre niveles diferentes de tabaquismo (Tang et al . , 1995b) , como lo hizo otro ensayo grande en estudio (Sydney et al., 1993) . Lee y Garfinkel proporcionaron un resumen del riesgo de cáncer de pulmón y el tipo de cigarrillo fumado (Lee y Garfinkel, 1981) y no pudieron demostrar una disminución importante en el riesgo con base en el contenido de alquitrán (Informe de IOM p.401) . Los incrementos recientes de adenocarcinomas en las vías respiratorias inferiores de los fumadores se hace la hipótesis de que se debe a la denominada compensación del tabaquismo de productos de bajo concentración. Los fumadores de estos productos inhalan más profundamente para incrementar su dosis de nicotina (Informe de IOM p.285) . Consecuentemente, la tendencia del consumidor de tres décadas hacia cigarros más ligeros puede no haber sido benéfica para la salud de los fumadores . Generalmente en compensación, los fumadores de cigarrillos ligeros inhalan justo tanto alquitrán y nicotina como los fumadores de sabor completo. Por supuesto, los cigarrillos ligeros saben de manera diferente que los cigarrillos de sabor completo y estas diferencias de sabor son usualmente por lo que la mayoría de los fumadores escoge los estilos de marcas que hay. Sin embargo solamente en los EUA, existen actualmente millones de fumadores de cigarrillos ligeros y ultraligeros , que han cambiado desde cigarrillos de mayor concentración. La figura 2 muestra las concentraciones de alquitrán y nicotina a partir del método FTC para algunos estilos de marcas americanas . Los estilos de marcas son versiones diferentes de estilos de cigarrillos dentro de una familia de marcas (por ejemplo, la cajetilla dura con filtro de los ultra ligeros de Marlboro®) . La figura dos también muestra las TNR resultantes de tales estilos de marca. Ya sea que los estilos de marca sean tamaño grande (usualmente 85 rrm de longitud), 100's (100 ,de longitud) , de sabor completo, ligeros o ultra ligeros, sus TNR resultantes están relativamente cercanas en valor. Los ultra ligeros tienden a tener unas TNR de alguna manera inferiores, debido principalmente al hecho de que la ventilación adicional en el diseño de tales cigarrillos disminuye las concentraciones (a partir del método FTC/ISO) del alquitrán a una relación ligeramente superior que la nicotina. El TNR promedio sencillo de la figura 2 es 14.22. Las ventas promedio ponderadas de las concentraciones de alquitrán y nicotina para el informe de la FTC de 1998 fueron 12.0 mg de alquitrán y 0.88 mg de nicotina lo cual da una TNR de 13.64. La figura 1 demuestra que en 1950 el TNR promedio fue de alrededor de 14.44 (alrededor de 39 mg de alquitrán/alrededor de 2.7 mg de nicotina. Estos números demuestran que las TNR promedio de los cigarrillos americanos desde alrededor de 1950 a la actualidad han sido bastante consistentes. El informe de 1998 de la FTC se liberó en 2000, cubriendo las marcas de cigarrillos de 1998, y fue el último año que la FTC escogió liberar de manera pública las concentraciones de alquitrán, nicotina y monóxido de carbono de los cigarrillos. Fuera de los 1294 estilos de marcas de cigarrillos evaluados, solamente 3 tuvieron un TNR calculado debajo de 8. De hecho, solamente un total de 8 estilos de marcas tuvieron TNR calculados de menos de 10. Estos consisten de 1 Rothmans®, 3 Canadian Players®, 2 Oíd Gold®, 1 Now®, y 1 Cariton® . Aunque solamente se enlistaron en el informe los números de alquitrán, nicotina y monóxido de carbono, las TNR se pueden calcular fácilmente a partir de estos números al dividir el concentración de alquitrán por el concentración de nicotina. Otros dos estilos de marcas de Carlton® tuvieron concentracions de <0.5 de alquitrán y 0.1 de nicotina. Ya que los números brutos actuales de las concentraciones de alquitrán no se pueden determinar ya que hay un impacto enorme debido al redondeo de estos niveles, los números para estos dos estilos de marcas no parecen reflejar el arte previo. 2 de los 3 estilos de marcas con TN de menos de 8 (Carlton® 100 cajetilla suave con filtro y Now(R) cajetilla suave con filtro de tamaño grande) se reportaron en el informe FTC de 1998 por producir 1 mg de alquitrán y 0.2 mg de nicotina con lo cual se tiene un TNR de 5. Sin embargo, las TNR de estos 2 estilos de marca se deben principalmente a la naturaleza de redondeo de números pequeños . A partir del informe de 1998 de FTC, "las calificaciones de alquitrán y monóxido de carbono se redondean al miligramo más cercano (mg.); aquellos con 0.5 mg o mayor se redondean hacia arriba mientras que aquellos con 0.4 mg o menor se redondean hacia abajo. Las cifras de nicotina se redondean a la décima de miligramos más cercana. Aquellas con 0.05 mg o mayor se redondean arriba; aquellas con 0.04 mg o menor se redondean abajo". Por lo tanto, un cigarrillo ultraligero que suministra 1.4 mg de alquitrán y 0.15 mg de nicotina se reportaría como 1 mg de alquitrán y 0.2mg de nicotina (TNR de 5), aunque el TNR actual equivaldría a 9.33. Los cigarrillos que suministran 1 mg de alquitrán y 0.1 mg de nicotina tienen una baja aceptación en el consumidor debido a un adelgazamiento del humo (falta de sabor) y demasiada resistencia a la aspiración. En el 2000, la participación de mercado de los estilos de marca de cigarrillos que produjeron 1-3 mg de alquitrán siguiendo un método FTC tuvieron una participación de mercado en los EUA de solamente 1.3%.

Noventa y dos por ciento de los estilos de marca que producen 3 mg de alquitrán o menos alquitrán impreso en sus calificaciones de alquitrán y de nicotina de la FTC en sus paquetes. Esto contrasta con los estilos de marcas que produjeron 12 o más mg de alquitrán en los cuales solamente .01 de uno por ciento imprimió su calificación de alquitrán y nicotina de FTC en sus paquetes (FTC Cigarette Report for 2000, 2002, p. 15) . Debido a una petición de libertad de información al FTC en Octubre de 2003, la FTC emitió informes similares para los años 1999-2002. El estilo de marca de cajetilla dura sin filtro de Oíd Gold® no se incluyó en ninguno de los informes de la FTC para esos cuatro años o en el informe de la FTC de 1997. el único estilo de marcas sin filtro de Oíd Gold® que se enlista en estos 5 informes de la FTC (1997, 1999, 2000, 2001 y 2002) es la cajetilla suave sin filtro de Oíd Gold® que produce 25 mg de alquitrán y 1.8 mg de nicotina (TNR de 13.8) en 1997, 26 mg de alquitrán y 1.9 de nicotina (TNR de 14.2) en 2000, 27 mg de alquitrán y 2.0 de nicotina (TNR de 13.5) en 2001. Tar en alquitrán, no hay razón para que el estilo de marcas sin filtro de cajetilla suave produzca substancialmente ( o aún de manera despreciable) niveles diferentes de alquitrán que un estilo de marca de cajetilla dura. No se enlistaron ningunos estilos de marca Oíd Gold® en el informe de 2002 de FTC.

Para el informe de 2002 de FTC, solamente los siguientes 4 estilos de marca de 1250 tenían calculados TNR menos de 8 : • Ultima de filtro grande Merit®: 1 mg de alquitrán 0.2 de nicotina (TNR de 5) ; · Cajetilla suave mentolada de filtro grande No ® ultra ligero: 1 mg de alquitrán, 0.2 de nicotina (TNR de 5) ; • Cajetilla suave de filtro grande Now® ultra ligero: 1 mg de alquitrán, 0.2 de nicotina (TNR de 5) ; • Cajetilla suave de filtro 100 Now® ultra ligero: 2 mg de alquitrán, 0.3 de nicotina (TNR de 6.66) También hay otro estilo de marca exactamente igual enlistado como última filtro grande Merit, aunque esta produce 1 mg de alquitrán y 0.1 de nicotina (TNR de 10) . Se cree que los bajos TNR de estos estilos de marca son tales por las mismas razones como se enlistan en el reporte FTC de 1998 y no parecen reflejar con precisión el arte previo. Solamente un total de 5 estilos de marca (de un total de 1250) tienen TNR calculado de más de 8 y de menos de 10 en el reporte FTC de 2002. Estos consisten de 3 Canadian Players®, 1 Carlton®, y uno de otro Merit®. La tendencia reciente en los PREP de cigarrillos es reducir los agentes cancerígenos seleccionados en el humo del tabaco. Dos PREP de cigarrillos que se han introducido recientemente en los Estados Unidos : Advance®, fabricado por Brown & Williamson Tobacco Company, y Omni® fabricado por Vector Tobacco, Inc. Advance® logra reducciones de las nitrosaminas específicas del tabaco (TSNA) , con tecnologías patentadas (Ver patentes de EUA Nos.: 5,803,081, 5,845,647, 6,135,121, 6,202,649, 6,311,695, 6,338,348, 6,350,479, 6,425,401, RE38,123, y 6,569,470) y pendientes de patentes (Ver las publicaciones de EUA Nos. 20020174874 y 20030018997) para el curado de la hoja de tabaco en conjunto con tecnología de filtración especializada. Omni® reduce los hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAH) , TSN y los catecoles al usar un sistema catalítico de paladio (Ver la publicación de EUA No. 20030000538) agregada al relleno y a la filtración activada con carbón mineral. El Omni® de tamaño grande de sabor completo tiene 15 mg de alquitrán y 1.0 de nicotina (TNR de 15) . La cajetilla grande de los ligeros de Advance® tiene 10 mg de alquitrán y .8 mg de nicotina (TNR de 12.5) . Un dilema importante en el diseño de un PREP es que se pueden requerir años de estudios clínicos para entender los riesgos reducidos, si los hay, de un PREP comparado con los cigarrillos convencionales. Esto es especialmente verdad de PREP similar a Advance® y Omni® que no reducen los suministros completos de humo en el tabaco sino que solamente reducen algunos compuestos químicos en el humo del tabaco. Los hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAH) son el resultado de la combustión incompleta de lípidos y terpenos que se encuentran naturalmente en el tabaco. La comunidad científica considera que estos compuestos son agentes cancerígenos potentes en el humo del tabaco. Las nitrosaminas especificas del tabaco se forman durante el proceso de curado del tabaco y durante el fumado (Hoffman, D., Dong, M. , & Hecht, S.S. (1977), Origin in tobáceo smoke of N-nitrosonornicotine, a tobacco-specific carcinogen. BIRF Communication, J. Nati. Cáncer Inst . , 58, 1841-4). Estos se consideran cancerígenos potentes . Los TSNA se forman por una reacción entre un agente de nitrosación y los alcaloides que se encuentran naturalmente en el tabaco y también son agentes cancerígenos en el humo del tabaco (publicación de EUA No. 20040144397) . Aún con las reducciones en estos cancerígenos potentes, están todavía presentes muchos otros cancerígenos en el humo del tabaco los cuales no atienden estas tecnologías. Tampoco se reducen muchos otros compuestos que no pueden provocar cáncer pero que son perjudiciales para otros aspectos de la salud humana tales como enfermedades cardiovasculares y respiratorias. Eclipse® y Accord® proporcionan una experiencia de fumar lo más cercana posible con fumar un cigarrillo convencional pero con una combustión mínima o sin combustión (Pirólisis) del tabaco. La ventaja pretendida de estos productos es una reducción importante en la formación de compuestos que resulta de la combustión del tabaco en cigarrillos convencionales. Estos compuestos se aceptan generalmente como perjudiciales para los fumadores. Ya que estas dos marcas no se fuman como cigarrillos convencionales nunca han sido muy aceptadas por el mercado. La experiencia de fumar en ambos de estos productos se basa en los siguientes conceptos. El aerosol del humo en ambos productos se forma por el calentamiento de los materiales del tabaco que contienen un alto contenido de glicerina mas que hacer la combustión del tabaco. La glicerina cuando se calienta se vaporiza rápidamente, formando un aerosol que se inhala muy similar en apariencia y sensación al humo del cigarrillo. Además, el calentamiento de los materiales del tabaco contenidos en estos productos liberará sabores volátiles característicos del tabaco asi como nicotina. Se pueden liberar cualesquiera saborizantes agregados volátiles del tabaco también dentro del aerosol de humo . Eclipse® y Accord® utilizan métodos diferentes de aplicación del calor a los materiales de tabaco contenidos en sus productos respectivos. Accord® se basa en un dispositivo conocido como un encendedor que contiene baterías, circuitería y calentadores que aplicarán calor a un cigarrillo insertado dentro del dispositivo. Se diseña en tal forma como para suministrar seis bocanadas por cigarrillo insertado dentro del dispositivo. Los cigarrillos específicamente fabricados para este dispositivo se deben usar para un desempeño adecuado . Eclipse® basa una punta de carbono combustible que cuando se enciende proporciona una fuente de calor para formar un aerosol en humo a partir de los materiales de tabaco contenidos en el producto. El producto de Eclipse® tiene una apariencia similar al cigarrillo convencional excepto de que no se consume hasta las cenizas en comparación con un cigarrillo convencional. Ambos de estos productos plantean desafíos cuando se intenta determinar el suministro de alquitrán y nicotina por medio del método FTC. La determinación de la longitud de la colilla no tiene importancia ya que ningún producto se consume cuando se hace la bocanada. El número de bocanadas en cada producto se limita por la naturaleza de su diseño. Con el Eclipse®, el número de bocanadas se regula por la fuente de calor de carbono. Accord® se limita electrónicamente a seis bocanadas. Finalmente, Accord® no se enciende como se prescribe por el método en FTC. Se sabe que Nicotiana rustica, que es elevado en contenido de nicotina sin modificarse genéticamente, se puede cruzar con JTicotiana tabacum para producir una nueva planta (Wernsman, E.A., et al., Principies of Cultivar Development, Volume 2, Crop Specie, Ed. W. R. Fehr, Macmillan, New York 1987) . El tabaco Y-l que se desarrolló inicial y parcialmente por el Departamento de Agricultura de Estados Unidos es un ejemplo de esta cruza. Sin embargo, tal variedad toma muchos más años en crearse, que el tabaco con nicotina aumentada por medios transgénicos . Otras ventajas de crear tabaco con nicotina aumentada por medios transgénicos contra técnicas de cruza de plantas, es que los procesos transgénicos se pueden llevar a cabo en cualquier tipo de tabaco comercializado (curado en la atmósfera artificial, tabaco claro y delgado burley y oriental) o en cultivo (o variedad) del tabaco, con lo cual se mantiene la amplia mayoría de los rasgos de la linea precursora del tabaco antes de la modificación genética. Las características comerciales deseables de la variedad de N. Tabacum se afectarán de manera negativa cuando se cruzan con N. rustica. La figura 3 demuestra que solamente 36.4 por ciento de todas las muertes relacionadas con el tabaquismo en los EUA son provocadas por el cáncer, aunque la percepción del publico es que el cáncer es el mayor efecto perjudicial para la salud del tabaquismo. De hecho, las enfermedades cardiovasculares provocan 42.4 por ciento y las enfermedades respiratorias provocan 21.2 por ciento de tales muertes. Los estudios epidemiológicos muestran una caída substancial en el riesgo ya que la cantidad total de humo inhalado se disminuye (U.S. Surgeon General, 1924, 1979, 1989) . Ya que no se sabe cuales de las muchas toxinas provocan los efectos dañinos específicos, sería benéfico reducir los suministros completos de humo del tabaco al fumador para crear un PREP efectivo, no solamente un puñado de constituyentes del humo que sean agentes cancerígenos . El informe de la IOM concluye que wla nicotina es uno de los factores cruciales para el éxito de un producto de tabaco" (p.29) . De esta manera, conservar la nicotina en niveles placenteros mientras se reducen los componentes más tóxicos del tabaco sería otra estrategia general para la reducción del daño (Reporte IOM p.29). Al reducir la dosis del humo entero de tabaco que se inhala por cigarrillo y/o reducir el número de cigarrillos fumados por día, se reducirían todos los cancerígenos y los gases dañinos en porcentajes similares. La forma más efectiva de lograr las reducciones en los suministros enteros de humo de tabaco, dada la propensión de fumador a comenzar, es reducir el T R de los cigarrillos. Con cigarrillos reducidos en TNR, el nivel por bocanada del humo completo del tabaco que inhala el fumador, que incluye alquitrán y monóxido de carbono, se reduciría en muchos casos mientras se mantiene el nivel de nicotina requerido por el fumador. De acuerdo con la evidencia epidemiológica, el riesgo se le relaciona de manera lineal con la cantidad de cigarrillos fumados. La evidencia de la dosis reducida debiera ser la base de una reglamentación de cigarrillos menos peligrosos (Gori, 2002 Congress) . Una "relación de respuesta a la dosis" , se define como la relación entre la regresión del riesgo de enfermedad y la regresión a la exposición (por ejemplo, entre mayor la dosis, mayor incidencia de la enfermedad) . "Los datos actualmente disponibles permiten la estimación aunque imprecisa, de una relación de respuesta de dosis entre la exposición al humo del tabaco entero y enfermedades importantes que se pueden observar para la evaluación del potencial de reducción del daño" (Reporte p.9 IOM) . Ya que actualmente existe una relación de respuesta a la dosis para el humo entero del tabaco, los beneficios de los cigarrillos bajos en TNR que puedan reducir los suministros enteros de humo del tabaco a los fumadores, se puede evaluar rápidamente y autorizar por los regíamentadores de salud pública tales como la Administración de Fármacos y Medicamentos de los EU (FDA) . En la figura 2, si el concentración de alquitrán del método FTC para los de tamaño grande de sabor completo de Marlboro® de 15 mg, se compara con el concentración de alquitrán del método FTC para los ligeros de tamaño grande de Marlboro® de 11 mg, entonces se observa una reducción de alquitrán de 4 mg. Esto pudiera en la superficie, indicar que un fumador inhalaría 4 mg menos alquitrán al cambiar al producto ligero. Sin embargo, los valores TNR de 13.64 y 13.75 respectivamente no muestran una mejora en el cambio en términos de la cantidad de alquitrán inhalado por mg de nicotina por cigarrillo. Ya que puede suceder la compensación cuando se cambia desde un sabor completo a cigarrillos ligeros o ultra ligeros y de cigarrillos ligeros a ultraligeros, los valores TM pueden suministrar una representación más precisa del suministro verdadero de humo de una marca de cigarrillos con respecto al comportamiento humano al fumar. Es bien conocido que las motivaciones de los fumadores se extienden a una diversidad de factores tales como el gusto, estética, e incentivos de comportamientos, de los cuales las recompensas farmacológicas de la nicotina son por mucho las más importantes . Con la excepción de los cigarrillos de extremadamente bajo concentración, los fumadores en general manejan el uso de un promedio de alrededor de 1 mg de nicotina (por cigarrillo) de los cigarrillos de cualquier marca, independientemente de las concentraciones en máquina en una máquina de fumar estándar de FTC (Gori, pg. 3 Virtually Safe Cigarettes. Reviving an Opportunity Once Tragically Rejected, 2000) . "La cantidad de nicotina que un fumador inhala es de alrededor de 2 mg por cigarrillo. El número de bocanadas por cigarrillo promedia alrededor de ocho. Así un suministro superior de 250 microgramos por bocanada sería suficiente para satisfacer las demandas pico aunque usualmente los fumadores extraerían e inhalarín menos que este suministro máximo" (Gori, Gio, Less Hazardous Cigarette, Tobacco Repórter, p. 31, June, 2004). En un articulo de British Medical Journal (BMJ, 1976 Volume 1, pp. 1430-1433) y de nuevo en el 1980 Banbury Report (#3 ? Safe Cigarette, p . 297-310), Michael Russell aboga por los cigarrillos bajos en alquitrán con nicotina media y bajo monóxido de carbono como alternativas más seguras a los cigarrillos disponibles en el mercado en ese momento. Una revisión de la investigación de la industria del tabaco alemana a partir de documentos en Internet, indica que los científicos pensaban que un cigarrillo más seguro tendría una relación mayor de nicotina a alquitrán (menor TNR) (Tobacco Control 2000;9:242-248, pag.4). Un cigarrillo deseable de exposición reducida debiera suministrar un nivel deseado al fumador de nicotina por cigarrillo, lo más limpia y eficientemente posible mientras se mantiene un sabor aceptable. De hecho, la compensación inversa puede suceder en diversas situaciones con cigarrillos de bajo TNR, ya que los fumadores inhalan menos humo de tabaco entero mientras obtienen una cantidad satisfactoria de nicotina. La Compensación inversa" se define como fumar menos intensivamente debido a una presencia mejorada de nicotina en el humo del tabaco. Los cigarrillos con bajo TNR también beneficiarían a los no fumadores. Al suministrar de manera más eficiente la nicotina a los fumadores, se pueden fumar menos cigarrillos por día y menos de cada cigarrillo se puede fumar, lo cual generar menos humo colateral (lo que se eleva desde el extremo encendido de un cigarrillo, principalmente entre las bocanadas) y menos humo de tabaco ambiental (el humo presente en el aire que consiste del humo escalado de la corriente principal y el humo de la corriente lateral) . El humo de la corriente principal (humo de tabaco entero de la corriente principal) es lo que sale de la boca (del fumador) o del extremo de la colilla (boquilla del filtro) de un cigarrillo aspirado (Reporte IOM p.283) . De esta manera, existe la necesidad de cigarrillos con bajo TNR que se puedan suministrar más eficientemente en el efecto fisiológico de la nicotina sin tantos gases y alquitrán perjudiciales. Breve Descripción de la Invención La presente invención proporciona un cigarrillo que comprende una planta transgénica con nicotina mejorada o porción de la planta de una especie del genero Nicotiana y que tiene una relación de concentración de alquitrán a nicotina (TNR) de entre alrededor de 3 y alrededor de 8 cuando se mide por el método FTC ó ISO. La planta transgénica con nicotina mejorada o la porción de planta muestran nicotina mejorada en comparación con una planta precursora no transformada o porción de la planta a partir de la cual la planta transgénica o porción de la planta se produce y contiene y expresa al menos un ácido nucleico heterólogo que sobreregula la producción de nicotina en la planta transgénica o porción de la planta. La planta transgénica con nicotina mejorada o porción de planta en comparación con una planta de control no trasformada o porción de planta contiene y expresa un ADN heterólogo que codifican al menos un segmento de una enzima requerida para la biosíntesis de la nicotina en el tabaco, la planta transgénica o porción de la planta muestran niveles mejorados de la enzima en comparación con una planta.de control no transformada o porción de planta y un contenido de nicotina mejorado en comparación con una planta de control no trasformada o porción de planta. La enzima se puede seleccionar de un grupo que consiste de arginina descarboxilasa (ADC) , metilputrescina oxidasa (MPO) , NADH deshidrogenasa, ornitina descarboxilasa (ODC) , fosforibosilantranilato isomerasa (PRAI) , putrescina N-metiltransferasa (PMT) , quinolato fosforibosil transferasa (QPT) , y S-adenosil-metionina sintetasa (SAMS) . La especie de planta puede ser Nicotania tabacum. El cigarrillo puede producir alrededor de 1 mg de alquitrán y entre alrededor de 0.12 mg y alrededor de 0.34 mg de nicotina, alrededor de 2 mg de alquitrán y entre alrededor de 0.25 mg y alrededor de 0.68 mg de nicotina, alrededor de 3 mg de alquitrán y entre alrededor de 0.36 mg y alrededor de 1.0 mg de nicotina, alrededor de 4 mg de alquitrán y entre alrededor de 0.5 mg y alrededor de 1.36 mg de nicotina, alrededor de 5 mg de alquitrán y entre alrededor de 0.62 mg y alrededor de 1.7 de nicotina, alrededor de 6 mg de alquitrán y entre alrededor de 0.75 y alrededor de 2.0 mg de nicotina, alrededor de 7 mg de alquitrán y ente alrededor de 0.87 mg y alrededor de 2.33 mg de nicotina, o alrededor de 8 mg de alquitrán y entre alrededor de 1.0 mg y alrededor de 2.66 mg de nicotina. La presente invención también incluye un cigarrillo que comprende una planta transgénica con nicotina mejorada con una porción de planta en la especie del género Nicotiana . La invención también incluye un método de elaboración de un cigarrillo que comprende proporcionar una planta transgénica con alcaloide mejorado o porción de la planta, en comparación con una planta de control no trasformada o porción de planta de una especie del género Nicotiana, al cruzar la planta con una planta de la especie Nicotiana tabacum para obtener una planta de progenie y producir un cigarrillo que comprenda la planta de progenie. El cigarrillo puede tener una relación de concentración de alquitrán a nicotina de entre alrededor de 3 y alrededor de 8 , cuando se mide por el método FTC ó ISO. La invención también incluye un método de elaboración de un cigarrillo que comprende proporcionar una planta de Nicotiana tabacum transgénica con nicotina reducida o una porción de planta que tenga un contenido de nicotina reducido en comparación con una planta de control no trasformada o porción de planta, al cruzar la planta de nicotina reducida con una planta de Nicotiana rustica para obtener una planta de progenie y producir un cigarrillo que comprenda la planta de progenie. La planta de progenie o porción de la planta muestra una nicotina mejorada en comparación con la planta de Nicotiana tabacum a partir de la cual la planta transgénica o porción de la planta se produce. La planta de progenie se puede usar en un cigarrillo que tenga una relación de concentración de alquitrán a nicotina dentro alrededor de 3 y alrededor de 8 cuando se mide por el método FTC ó ISO. La invención también incluye un método para la elaboración de un cigarrillo que comprende suministrar una planta transgénica con nicotina incrementada o una porción de planta en comparación con una planta de control o transformada o porción de planta de una especie del género Nicotiana, que produce tabaco reconstituido a partir de la planta o porción de planta y que produce un cigarrillo que comprende el tabaco reconstituido. El cigarrillo puede tener una relación de concentración de alquitrán a nicotina de entre alrededor de 3 y alrededor de 8 cuando se mide por el método FTC o ISO. La invención también incluye un método de elaboración de un cigarrillo que comprende suministrar una planta transgenica con nicotina incrementada o porción de planta en comparación con una planta de control no transformada o porción de planta de la especie de género Nicotiana, que produce tabaco expandido de la planta o porción de la planta y produce un cigarrillo que comprende el tabaco expandido. El cigarrillo puede tener una relación de concentración de alquitrán a nicotina entre alrededor de 3 y alrededor de 8 cuando se mide por el método FTC o ISO. La invención también incluye un cigarrillo que comprende una planta transgenica o porción de planta de una especie del género Nicotiana que muestra nicotina aumentada cuando se compara con una planta precursora no transformada o porción de planta, a partir de la cual la planta transgénica o porción de planta se produce, y una relación de concentración inferior de alquitrán a nicotina cuando se compara con un cigarrillo de control que comprende la planta precursora no transformada o porción de la planta. La invención también incluye un método de elaboración de un cigarrillo que comprende proporcionar una planta transgénica con nicotina mejorada o porción de planta en comparación con una planta de control no transformada o porción de planta de una especie del género Nicotiana, al extraer la nicotina de la planta transgénica o porción de planta, proporcionando una planta o porción de planta de una especie del género Nicotiana, agregando la nicotina extraída a la especie para formar un material de planta con nicotina aumentada, producir un cigarrillo que comprende el material de planta de nicotina mejorada. La nicotina puede ser sales de nicotina de ácidos orgánicos. La invención también incluye un método de elaboración de un cigarrillo que comprende proporcionar una planta transgénica de nicotina mejorada o porción de planta en comparación con una planta de control no transformada o porción de planta de una especie del género Nicotiana, extraer la nicotina de la planta transgénica o porción de planta proporcionar una segunda planta o porción de planta de una especie del género Nicotiana, agregar la nicotina extraída a la segunda planta o porción de planta para formar un material de planta de nicotina mejorada, producir un cigarrillo que comprende el material de planta de nicotina mejorada y que tiene una relación de concentración inferior de alquitrán a nicotina en comparación con el cigarrillo de control que comprende la segunda planta o porción de planta sin la adición de la nicotina extraída. La invención también incluye un método de elaboración de un cigarrillo que comprende proporcionar una planta transgénica con nicotina reducida o porción de planta en comparación con una planta de control no transformada o porción de planta de una especie del género Nicotiana, al producir un tabaco para cigarrillo a partir de una planta transgenica o porción de planta, agregar la nicotina al tabaco del cigarrillo, producir una cigarrillo que comprende el tabaco de cigarrillo y tener un nivel de nitrosaminas especifico del tabaco debajo de alrededor de 0.5 microgramos por gramo. La nicotina pueden ser sales de nicotina de ácidos orgánicos o nicotina sintetizada. El nivel de nitrosaminas especifico del tabaco puede ser menor que alrededor de 0.05 microgramos (50 ppb) por gramo de tabaco, y el cigarrillo puede tener una relación de concentración de alquitrán a nicotina entre alrededor de 3 y alrededor de 8. La invención también incluye un método de elaboración de un producto de tabaco que comprende proporcionar una planta transgenica o porción de una planta de una especie del género Nícotiana, que muestra nicotina reducida en comparación con una planta precursora no transformada o porción de planta, a partir de la cual se produce la planta transgénica o porción de planta, producir el tabaco a partir de la planta transgenica o porción de planta, agregar la nicotina al tabaco, producir un producto de tabaco que comprende el tabaco, y tener un nivel de nitrosaminas inferior especifico del tabaco en comparación con un producto de control que comprende la planta precursora no transformada o porción de planta. La planta transgénica reducida de nicotina o porción de planta en comparación con la planta de control no transformada o porción puede contener y expresar al menos un ácido nucleico heterologo que subregula la producción de nicotina en la planta transgénica o porción de planta. La planta transgénica con nicotina reducida o porción de planta puede contener y expresar un ADN heterologo que codifica al menos un segmento de una enzima requerida para la biosxntesis de nicotina en el tabaco, la planta transgénica o porción de planta muestra niveles reducidos de la enzima en comparación con una planta de control no transformada o porción de planta y contenido reducido de nicotina en comparación con una planta de control no transformada o porción de planta. El nivel de nitrosaminas específico del tabaco puede estar deba o de alrededor de 1 microgramo por gramo (1 ppm) . El producto del tabaco puede estar en una forma seleccionada de un grupo que consiste de tabaco en hoja, tabaco machacado, y tabaco en corte y se puede seleccionar de un grupo que consiste de tabaco en polvo, tabaco para pipa, tabaco para puro, tabaco para mascar y tabaco para cigarrillo. La invención también incluye un método de elaboración de un tabaco expandido que comprende proporcionar una planta transgénica con nicotina aumentada o porción de planta en comparación con una planta de control no transformada o porción de planta, de una especie del género Nicotíana, que produce tabaco a partir de la planta transgénica o porción de planta y expandir el tabaco.

La invención también incluye un método de elaboración de tabaco reconstituido, que comprende proporcionar un material de planta seleccionado de un grupo que consiste de una planta transgénica con nicotina mejorada o porción de planta en comparación con una planta de control no transformada o porción de planta, de una especie del género Nicotiana, una planta transgénica con nicotina reducida o porción de planta en comparación con una planta de control no transformada o porción de planta de una especie del género Nicotiana, fibra de tabaco desproteinizada y tabaco secado por congelación y reconstituir el material de la planta. La invención también incluye un método de elaboración de tabaco reconstituido que comprende proporcionar una planta transgénica con nicotina reducida o porción de planta en comparación con una planta de control no transformada o porción de planta de una especie del género Nicotiana, y reconstituir la planta transgénica o porción de planta. La especie de planta puede seleccionarse de un grupo que consiste de Nicotiana tabacum y Nicotiana rustica. El tabaco reconstituido puede comprender además fibra de tabaco desproteinizada reconstituida. La invención también incluye un cigarrillo que comprende tal tabaco reconstituido y que tiene un concentración reducido de TSNA en comparación con un cigarrillo de control que comprende la planta precursora no transformada o porción de planta. TSNA como se usa en la presente se puede seleccionar a partir de un grupo que consiste de NNN, NNK, NAT y NAB y el cigarrillo puede tener un concentración reducido de compuestos seleccionados de un grupo que consiste de benzo (a) ireno, fenoles y catecoles en comparación con un cigarrillo de control que comprende tal planta precursora no transformada o porción de planta. La invención también incluye un método de elaboración de tabaco reconstituido que comprende proporcionar una planta transgénica con nicotina mejorada o porción de planta en comparación con una planta de control no transformada o porción de planta, de una especie del género Nicotiana, y reconstituir la planta transgénica o porción de planta. El método puede comprender además secar por congelación la planta transgénica o porción de planta después de cosecharlo.

La invención también incluye métodos para la creación y producción de variedades novedosas de tabaco para su uso en cigarrillos de bajo TNR de manera que tales cigarrillos sean más atractivos para producir productos aceptables por el consumidor. Tales variedades incluyen combinar aspectos transgénicos altos en nicotina con respaldos de azúcar reductora elevados y características de azúcar elevada transgénica. Otras variedades novedosas para incrementar la aceptación del consumidor de cigarrillos de bajo TNR incluye combinar características transgénicas de alta nicotina con características transgénicas de altos ácidos grasos. Tales métodos reducen el pH del humo de los cigarrillos bajos en TNR.

La invención también incluye métodos de agregación de azúcar, ácidos grasos, ácido cítrico, ácido láctico, y ácido málico al tabaco o el relleno de cigarrillos bajos en TNR para reducir el pH del humo de tales cigarrillos para producir productos más aceptables por el consumidor. Breve Descripción de las Figuras La figura 1 es una gráfica que muestra concentracions promedio de alquitrán y nicotina de cigarrillos .Americanos en 1950 y 1995. La figura 2 es una tabla que muestra una comparación de las concentraciones de alquitrán y nicotina (en cuanto a 2003) de ciertas marcas de cigarrillos y sus TNR resultantes.

La figura 3 es una diagrama en circulo que muestra las causas de muertes relacionadas con el tabaquismo en los Estados Unidos desde 1990-1994. La figura 4 es una tabla que demuestra las características de las plantas de una línea de plantas transgénica reducida en nicotina. La figura 5 es un diagrama esquemático de las trayectorias de ciertos alcaloides del tabaco y TSNA. La figura 6 es un diagrama esquemático de la biosíntesis de alcaloides de piridina en Nicotiana (subregulación mediada antisentido de la actividad de putrescína N-metiltransferasa en Nicotiana tabacum L. transgénica puede conducir a niveles elevados de anatabina a costa de la nicotina; Yupynn Chintapakorn and John D. Hamill; Plant Molecular Biology 53: 87-105, 2003).

Descripción Detallada de las Modalidades Preferidas Algunos aspectos de la presente invención reducen la relación de concentración de alquitrán a nicotina (TNR) de los cigarrillos al restringir el suministro de alquitrán al fumador mientras se proporcionan cantidades adecuadas de nicotina para mantener la satisfacción del fumador. El resultado es un cigarrillo que ofrece efectivamente a los fumadores una cantidad satisfactoria de nicotina con gases y alquitrán preferiblemente menos dañinos. La falla de los cigarrillos actuales comerciales, ligeros y ultraligeros en suministrar eficientemente un nivel satisfactorio de nicotina a los fumadores, resulta en un comportamiento agresivo al fumar llamado compensación, el cual puede provocar más daño al fumador. Esto se debe a que tales cigarrillos reducen las concentraciones de alquitrán y nicotina en paralelo y alrededor de la misma proporción. La presente invención en conjunto con niveles diferentes de filtración y/o dilución del humo proporciona el incremento del contenido de nicotina del relleno del cigarrillo, ya sea genéticamente dentro de la planta de tabaco o al agregar la nicotina al relleno con lo cual se permite que el suministro de nicotina del cigarrillo al fumador se mantenga mientras que se disminuye preferentemente el suministro de alquitrán del cigarrillo. Como se usa en la presente, "planta transgénica con nicotina aumentada" significa una planta de tabaco recombinante (o "Transgénica") que contiene un contenido superior de nicotina en comparación con la planta precursora no transgénica (o control sin modificar) a partir de la cual se produce la planta transgénica. Como se usa en la presente, "planta transgénica con alcaloides aumentados" significa una planta de tabaco recombinante (o transgénica) que contiene un contenido superior de alcaloides en comparación con la planta precursora no transgénica (o control sin modificar) a partir de la cual se produce la planta transgénica. Como se usa en la presente, "planta transgénica reducida en nicotina" significa una planta de tabaco recombinante (o transgénica) que contiene menos de la mitad, preferiblemente menos de 25% y más preferiblemente menos de 20% o menos de 10% del contenido de nicotina de la planta precursora no transgénica (o control sin modificar) a partir de la cual se produce la planta transgénica. Se apreciará que algún nivel pequeño de nicotina residual en el orden de al menos 1% o 5% en comparación con la planta de control correspondiente sin modificar, puede permanecer en tales plantas transgénicas usadas para llevar a cabo la presente invención. Como se usa en la presente, "nicotina" (C10H14N2) incluye análogos de nicotina (a menos que se refiera la nicotina a los alcaloides totales) , dos isómeros de nicotina, nicotina sintetizada y sales de nicotina de los ácidos orgánicos.

Las plantas? para uso en los métodos actuales son especies del género Nicotiana, o tabaco que incluye pero no se limita a Nicotiana tabacum, Nicotiana rustica, Nicotiana glauca, Nicotiana excelsior, Nicotiana benthamiana, Nicotiana sylvestris, Nicotiana clevelandii y Nicotiana attenuata. Como se usa en la presente, tabaco significa y abarca cualquier planta, especie, cruza o híbridos del gen Nicotiana. Se puede usar cualquier cepa o variedad de tabaco. Tales plantas de tabaco se modifican genéticamente para incrementar o reducir el contenido de nicotina dependiendo del intento, por lo tanto como se discute en mayor detalle a continuación. El término "planta" incluye porciones físicas y químicas de las mismas tales como partes de la planta y extractos de la planta, hidrolizados, etc. Como se usa en la presente, un "cigarrillo de bajo TN " o cigarrillo con una baja relación de concentración de alquitrán a nicotina de la presente invención, significa un cigarrillo que contiene una planta de tabaco recombinante con nicotina aumentada o porción de la planta, que incluye, pero no se limitan a nicotina de tal planta o porciones de planta. 1. Cigarrillos bajos en TNR (con tabaco transgénico con nicotina aumentada) : producción de variedades de tabaco novedosas y cigarrillos con bajo TNR más aceptables. Las plantas de tabaco transgénicas con nicotina aumentada usadas para llevar a cabo el primer aspecto de la presente invención, son en general plantas de tabaco recombinantes que contienen y expresan un nucleótido heterologo, la expresión del cual sobreregula una enzima (tal como arginina descarboxilasa (ADC) , metilputrescina oxidasa (MPO) , NADH deshidrogenasa, ornitina descarboxilasa (ODC) , fosforibosilantranilato isomerasa (PRAI) , putrescina N-metiltransferasa (PMT) , quinolato fosforibosilo transferasa (QPT) , y S-adenosil-metionina sintetasa (SAMS) ) en la planta, y con ello se incrementa la producción de nicotina en la planta. Las plantas recombinantes adecuadas se describen en M. Conkling et al., Solicitud PCT WO 98/56923 (publicada el 17 de Diciembre de 1998) y en M. Timko, Solicitud PCT WO 00/67558 (publicada el 16 Noviembre de 2000) . En general, el nucleótido heterologo comprende al menos un segmento de un ácido nucleico que codifica la enzima a ser sobreregulada. En esta modalidad, el tabaco con nicotina aumentada se incorpora dentro del relleno de un cigarrillo para lograr un cigarrillo deseado de TNR. Con la combinación de un pitillo de sabor completo preferiblemente un pitillo ligero y más preferiblemente de un pitillo ultraligero, los cigarrillos de tabaco con nicotina aumentada (que pueden incluir mezclas de tabaco convencionales) pueden suministrar ahora eficientemente la cantidad deseada al fumador de nicotina por cigarrillo mientras suministran menos alquitrán y gases perjudiciales. El cigarrillo de bajo TNR de la invención también se logra al usar un pitillo sin filtro ya que los fumadores de cigarrillos sin filtro tendrán todavía la presencia mejorada de nicotina la cual en algunos casos reducirá la inhalación de alquitrán y de gases perjudiciales. Un cigarrillo con TNR disminuido por lo tanto es una meta importante del PREP de la invención. Una modalidad específica utiliza una planta recombinante con nicotina mejorada que tiene una expresión de quinolato fosforibosil transferasa (OPRTasa) con relación a una planta de control no transformada, tal planta recombinante comprende células de planta recombinantes que contienen: un constructo de ADN exógeno que comprende en la dirección 5' hasta 3' un promotor que opera en tal célula de planta y un ADN heterólogo que codifica al menos un segmento de un ARm de quinolato fosforibosil transferasa de la planta, tal ADN heterólogo se asocia de manera operativa con tal promotor, tal planta muestra una expresión aumentada de QPRTasa en comparación con la planta de control no transformada y el contenido de nicotina mejorado en comparación con la planta de control no transformada. Se puede llevar a cabo otra modalidad con una planta recombinante con nicotina mejorada que tenga una expresión de putrescina N-metiltransferasa (PMTasa) aumentada con relación a una planta de control no transformada, tal planta recombinante comprende células de planta recombinantes que contienen: un constructo de ADN exógeno que comprende en la dirección 5 ' hasta 3 ' , promotor que opera en tal célula de planta y un ADN heterólogo que codifica al menos un segmento de un PMT ARNm de la planta, tal ADN heterólogo se asocia operativamente con tal promotor y con tal ADN heterólogo en la orientación de sentido o antisentido, tal planta muestra una expresión mejorada de PMT en comparación con la planta de control no transformada y un contenido mejorado de nicotina en comparación con la planta de control no transformada. Se pueden llevar a cabo todavía otras modalidades en una forma similar con las otras encimas arribas listadas. Los constructos de ácido nucleico como se describen arriba pueden incluir elementos aisladores en la dirección 5' y/o 3 ' del constructo descrito arriba como se establece por ejemplo en las patentes de ,EUA No. 6,100,448 y 6,037,525 para Thompson et al. Además, los constructos como se describen anteriormente pueden incluir regiones de unión (o andamiaje) en la matriz en la dirección ascendente y/o dirección descendente del constructo antes descrito como se establece por ejemplo en las Patentes de EUA No. 5,773,695 y 5,773,689 para Thompson et al . Todavía en otra modalidad, las plantas utilizadas pueden contener una pluralidad de ácidos nucleicos recombinantes que sobreregulan una pluralidad de enzimas en la trayectoria de la síntesis de nicotina. Las plantas descritas por poseer al menos un ácido nucleico recombinante pueden abarcar así-aquellas que contienen la pluralidad. Los beneficios de utilizar más de un ácido nucleico recombinante es que la nicotina u otros niveles de alcaloide se pueden incrementar a niveles mayores (en contra si solamente uno de tales ácidos nucleicos se utiliza) y diferentes relaciones deseadas de alcaloides (por ejemplo, la relación de nicotina a alcaloides de totales) se puede ajustar si se desea. En otra modalidad, la misma planta o célula puede contener al menos un ácido nucleico recombinante que sobreregula una enzima en la trayectoria de síntesis de la nicotina o el alcaloide, mientras que también contiene un ácido nucleico recombinante que subregula una enzima en la trayectoria de síntesis de la nicotina o el alcaloide. Como un ejemplo, si el P T se sobre regula y un QPT se subregula, se incrementará la relación de nicotina a alcaloides totales . Esta relación es preferentemente tan cercana a una como sea posible para la ventajas de prevención de la formación NAT, NAB y posiblemente otros TSNA. Ver la figura 5 y figura 6. En otra modalidad, la presente invención utiliza una planta recombinante con nicotina incrementada que tiene tanto una QPRT incrementada y una expresión PMT incrementada con relación a una planta de control no transformada, tal planta recombinante comprende células de planta recombinantes que contienen: (i) un primer constructo exógeno de ADN que comprende en la dirección 5' a 3', un promotor que opera en tal célula de planta y un ADN heterólogo que codifica al menos un segmento de un ARNm de la planta de quinolato fosforibosil transferasa de manera tal que el ADN heterólogo que se asocia operativamente con tal promotor; y (ii) un segundo constructo de ADN exógeno que comprende en la dirección 5' a 3', un promotor que opera en tal célula de planta y un ADN heterólogo que codifica al menos un segmento del ARN de PMT de la planta, tal ADN heterólogo se asocia operativamente con tal promotor, tal planta muestra un QPRT incrementado y una expresión de PMT incrementada en comparación con una planta de control no transformada y un contenido de nicotina incrementado en comparación con una planta de control no transformada. Como se usa en la presente, QPT, QPRT, y QPRTasa se usan de manera intercambiable, PMT y PMT también se usan de forma intercambiable . Los ejemplos de las plantas recombinantes que se pueden usar para llevar a cabo estas modalidades que incluyen pero no se limitan a plantas conocidas transformadas con el ADN que codifica el gen de tabaco de quinolato fosforibosil transferasa (NtQPTl) (ver, por ejemplo, solicitud PCT 098/56923 por Conkling et al.); el ADN que codifica la putrescina N-metiltransferasa del tabaco, tal como PMT1, PMT2 , PMT3 y PMT ; el ADN que codifica la arginina descarboxilasa de tabaco, tal como ADC1 y ADC2 ; ADN que codifica omitina descarboxilasa de tabaco (ODC) ; ADN que codifica S-adenosilmetionina sintasa de tabaco (SAMS) ,- ADN que codifica la NADH deshidrogensa de tabaco; y ADN que codifica fosforibosilantranilato isomerasa de tabaco (PRAI) (que se conocen y describen en la solicitud PCT WO 00/67558 por M. Timko et al) . Las patentes de E.U.A. Nos. 6,423,520, 6,586,661, 5,260,205, 5,369,023, 5,668,295 y la solicitud publicada de E.U.A. No. 20030018997 también describe el método de alteración del contenido de nicotina de plantas de tabaco al modificar genéticamente a cualquiera de QP T o PMT en la trayectoria biosíntetica de la nicotina. El contenido de nicotina de cada planta de tabaco individual transformada con nicotina incrementada con cada uno de los métodos anteriores es variable. Por lo tanto, se desea una línea de plantas de tabaco con aproximadamente 6.2% de contenido de nicotina (sobre una base en peso seco) , tomará un número razonable de transformaciones de plantas genéticas para alguien experto en la técnica obtener una planta homocigótica que tenga tal contenido de nicotina. Las semillas de las siembras de los transformantes primarios que contienen un lugar sencillo de transgen tendrán tres genotipos diferentes ya que el transgen (que le otorga una alta nicotina) se agrega 1:2:1, 25% no llevaran el transgen, 50% serán heterocigóticos para el transgen, y 25% serán homocigóticos para el transgen. La progenie de la clase de semillas heterocigóticas de nuevo segregará 1:2:1. La clase homocigótica de semillas será más útil para una propagación adicional debido a que el 100% de toda su progenie llevará el transgen (con dos copias si las plantas se siembran y una copia de la plantas transgénicas homocigóticas se cruzan con un precursor no transgenico) . Cuando las semillas de una siembra de la progenie homocigótica se plantan en el campo, contendrán contenidos muy similares de nicotina aumentada como la planta precursora que crece bajo clima similar, suelo y condiciones de plantación . Tales modalidades genéticas de producción de un tabaco con nicotina mejorada son más económicas de implementar en productos de tabaco comerciales con nicotina mejorada que agregar la nicotina o sales de nicotina de ácidos orgánicos directamente al tabaco procesado. Similarmente, el tabaco transgenico con nicotina mejorada sería también más económico que agregar la nicotina sintética o análogos de nicotina. Se ahorrarían mano de obra, tiempo y diversos otros recursos ya que el crecimiento de tabaco adicional para la extracción de nicotina, la extracción de nicotina y luego agregar tal nicotina al tabaco procesado no tendría que llevarse a cabo. Una vez que se producen las plantas transgénicas, producen internamente la nicotina adicional requerida muy eficientemente y no hay costos increméntales adicionales . Esta actualmente prohibido agregar nicotina y sales de ácidos orgánicos de nicotina (como se propone en las patentes de E.U.A. No. 4,830,028, 4,836,224 y 5,031,646) a productos de tabaco en muchos países incluyendo los Estados Unidos. En muchos países la nicotina y la sales de ácidos orgánicos de nicotina no están en la lista de los aditivos permitidos para productos del tabaco. El término "producto del tabaco" usado en la presente, incluye pero no se limita a cigarrillos, puros, tabaco para cigarrillo, tabaco para pipas-, tabaco para mascar, tabaco en polvo, grageas, y cualquier otro dispositivo de suministro de nicotina que no sea un producto de reertplazo de nicotina usado para terapia de reemplazo de nicotina. Otra ventaja de las modalidades anteriores de cigarrillos con bajos TR, es que el tabaco aumentado en nicotina es ms seguro que extraer mecánicamente la nicotina de una fuente, transportarla y luego agregarla al tabaco durante el procesamiento, debido a que la nicotina en su forma pura es altamente tóxica. La nicotina es difícil de mantener en forma pura ya que se oxida f cilmente . El almacenamiento de la nicotina pura agregaría costos y riesgos. Una desventaja potencial de métodos anteriores puede ser los TSMAs incrementados producidos a partir de niveles elevados de alcaloides, que son precursores de la nitrosamina. Esto se compensaría por la reducción de suministros completos de humo dentro de los cuales los TSNAs están contenidos . TSNAs son solo una clase de agentes cancerígenos múltiples en el humo del tabaco. Los métodos adecuados de curado junto con cigarrillos de baja TNR reducirán esta desventaja potencial hasta un nivel aceptable (Peele, D. M. , et al., "Formation of Tabacco Specific Nitrosamines in Flue-Cured Tobacco" , CORESTA 1999 AGRO-PHYTO Proceedings, Suzhou, China 1999) . Si un cigarrillo con bajo TNR produce una reducción del 35% en los suministros de los humo entero a los fumadores (incluyendo alquitrán y gases dañinos) , en comparación con un cigarrillo convencional promedio ligero o ultraligero, todavía su concentración de TSNAs es ligeramente superior, se podría hipotetizar que los estudios epidemiológicos probarían eventualmente que esta modalidad tendría ventajas importantes de riesgo reducido. El cigarrillo de bajo TNR de esta modalidad emplea preferentemente el material de tabaco a partir de una variedad transgénica de Nicotiana tabacum o un cultivo que tenga un genotipo caracterizado por un nivel incrementado de nicotina en comparación con la variedad o cultivo que carece del transgen como se describe arriba, y por un contenido de azúcar reductor curado que es muy alto, con relación al rango de valores de contenido de azúcar representado por variedades y cultivos ampliamente comercializados. Los intervalos preferidos de los contenidos de azúcar reductora en la variedad de tabaco son desde alrededor de 11% a alrededor de 20% o más preferiblemente de más de 20%. Son ilustrativos de tales variedades de N. Ta.ba.cvm de muy alto contenido de azúcar las K 394, NC 2326 y GL 939, que tienen un contenido de azúcar reductora, curada, de tres años en promedio de 15.7%, 15.5% y 15.2%, respectivamente (2000 Official Flue-Cured Variety Test at the University of Georgia, Tifton) . A este respecto, los términos "cultivo" y "variedad" se usan de manera sinónima para referirse a un grupo de plantas dentro de la especie N. Tabacum, que comparten ciertos caracteres constantes que los separan de la forma típica y de otras variedades posibles dentro de esa especie. Aunque poseen al menos un rasgo distintivo, también se puede caracterizar una variedad por una cantidad substanciadle variación global entre los individuos dentro de la variedad, con base principalmente en la segregación mendeliana de características entre la progenie de las generaciones sucesivas. Una "línea" como se distingue de una "variedad", denota un grupo de plantas que despliegan una menor variación entre los individuos, generalmente (aunque no exclusivamente) en virtud de diversas generaciones de la autopolinización. Además, se define una "linea" para el propósito de la presente invención, de manera suficientemente amplia para incluir un grupo de plantas que se propagan de manera vegetativa a partir de una planta precursora sencilla usando técnicas de cultivo de tejido. El uso de tales líneas Para desarrollar nuevos híbridos se describe en las patentes de E.U.A Nos. 4,326,358 7 4,381,624. Una "solución amortiguadora de nicotina", ayuda a mantener el pH del humo del cigarrillo. Ya que la nicotina es una base importante volátil presente en el humo del cigarrillo, el pH del humo imparte un papel importante en la percepción sensorial. El azúcar actúa como un amortiguador de nicotina, reduciendo cualquier aspereza de la nicotina aumentada, así, un alto contenido de azúcar es benéfico ya sea que el azúcar es natural de la planta del tabaco o se agrega por ejemplo, como jarabe de maíz de alta fructuosa, sacarosa, azúcar invertido, extracto de orozuz, fríjol de carob y extracto, y cacao y extractos de cacao durante el procesamiento del tabaco. Azúcares reductores, son cualquier azúcar (monosacárido o polisacarido) que tiene un aldehido libre o potencialmente libre o un grupo cetona. La glucosa y la fructosa actúan como amortiguadores de la nicotina en el humo del cigarrillo al reducir el pH del humo y reducir efectivamente la cantidad de nicotina libre no protonada. Los azúcares reductores balancean el sabor del humo por ejemplo al modificar el impacto sensorial de la nicotina y de otros alcaloides del tabaco. Generalmente, hay una relación inversa entre el contenido de azúcar y el contenido de alcaloide a través de las variedades de tabaco dentro de la misma variedad y dentro de la misma línea de planta provocada por las condiciones de la plantación. Por ejemplo, entre menor sea el nitrógeno en el suelo del tabaco menores los niveles de nicotina pero mayores los niveles de azúcar. Una lluvia incrementada produce niveles menores de nicotina y mayores niveles de azúcar. Los cigarrillos con bajos TNR puede producir un humo irritante y áspero especialmente respecto a la irritación de la garganta y la nariz. Una fuente de esta aspereza se le asigna generalmente a la cantidad de nicotina libre o volátil, no protonada en el humo. En general, a un pH de humo de 5.4, la nicotina es 100% protonada. A medida que el pH del humo se incrementa arriba 5.4, la mayor nicotina libre está presente en el humo lo cual es una causa de la aspereza. El pH del humo del cigarrillo se determina predominantemente por el contenido de azúcar y alcaloide del relleno del tabaco. La combustión del azúcar produce productos ácidos que disminuyen el pH y ayudan a reducir la aspereza. Por ejemplo, los cigarrillos que contienen todo el tabaco curado en atmósfera artificial (que contiene generalmente un contenido superior de azúcar que si se contuviera tanto el tabaco burley (claro y delgado) y el curado en atmósfera artificial) tiene un pH del humo de alrededor de 5.0 hasta alrededor de 6.0 que se calcula para producir 0-1% de nicotina no protonada. Los tabacos de mayor nicotina tales como burley (que contienen generalmente un contenido de azúcar interior que el curado en la atmósfera artificial) producirá generalmente un humo que tiene un pH del humo superior. Los cigarrillos de mezcla Americana (tabaco curado en atmósfera artificial mezclado con burley y posiblemente oriental) tienen un pH del humo de alrededor de 5.5 a alrededor 6.5 lo cual se calcula para producir 0.3-3% de nicotina no protonada (Morie, G.P., (1972) , la fracción de la nicotina protonada y no protonada en el humo del tabaco a diversos valores, Tob. Sci., 16, 167) . Así, los cigarrillos producidos a partir de tabaco transgénico de alta nicotina con un TNR debajo de alrededor de 9 tendrán usualmente un pH mayor que 6.5 y pudieran considerarse como ásperos para los fumadores, a menos que esté presente en el relleno suficiente azúcar u otro amortiguador de nicotina. Al usar un tabaco de muy elevada azúcar o agregar suficiente azúcar al relleno, el pH se reducirá y el cigarrillo bajo en TNR tendrá un sabor aceptable . Esta reducción del pH también se puede lograr al incrementar el contenido de ácidos grasos en el relleno como se describe a continuación. Otra modalidad de la presente invención proporciona un método de elaboración de un cigarrillo que comprende proporcionar una planta transgénica con alcaloide mejorado o porción de planta, en comparación con una planta de control no transformada o porción de planta, de una especie del genero Nicotiana, cruzar la planta con una planta de la especie Nicotiana tabacum para obtener una planta de progenie, y producir un cigarrillo que comprenda la planta de progenie, con el cigarrillo que tenga una relación de concentración de alquitrán a nicotina entre alrededor de 3 y alrededor de 8, cuando se mide por el método FTC o ISO. Las ventajas de esta nueva planta son que diversos alcaloides mejorados diferentes a la nicotina (incluyendo las relaciones particulares de nicotina a alcaloides totales) de diferentes especies de Nicotiana, se combinan con los aspectos deseados de Nicotiana tabacum. Por ejemplo, el alcaloide primario en Nicotiana glauca es la anabasina. La Patente de EUA No. 6, 534,527 describe N. glauca como útil en aliviar el antojo de la nicotina. Otra modalidad de la presente invención proporciona un método para la elaboración de un cigarrillo que comprende proporcionar una planta de Nicotiana tabacum transgénica reducida en nicotina o una porción de planta que tenga un contenido de nicotina reducido en comparación con una planta de control no transformada o porción de planta, cruzar la planta reducida en nicotina con una planta de Nicotiana rustica para obtener una planta de progenie, y producir un cigarrillo que comprenda la planta de progenie con la planta de progenie o porción de planta que muestra una nicotina mejorada en comparación con la planta de Nicotiana tabacum a partir de la cual se produjo la planta transgénica o porción de planta. Luego se usa la planta de progenie para producir un cigarrillo que tenga una relación de concentración de alquitrán a nicotina de entre alrededor de 3 y alrededor de 8 cuando se mide por el método FTC o ISO . Las ventajas de esta nueva planta son de nuevo que se pueden obtener relaciones únicas de nicotina a alcaloides totales. Siguiendo las técnicas convencionales de cruza, como se describen por ernsman, et al . , en 2 PRINCIPLES OF CULTIVAR DEVELOPMEN : CROP SPECIES (Macmillan 1997) , un transformante estable regenerado a partir del material de tabaco que contenga un transgen adecuado, se emplea para introducir un rasgo de alta nicotina en un antecedente genético comercialmente aceptable, con lo cual se obtiene un cultivo o variedad de técnica que combine un alto nivel de nicotina con un contenido muy alto de azúcar en el intervalo de por ejemplo de alrededor de 14 por ciento a alrededor de 20 por ciento, más preferiblemente 20 por ciento a 30 por ciento y más preferiblemente todavía por encima de 30 por ciento. Aunque se puede usar cualquier antecedente de tabaco de alta azúcar, para los propósitos de esta modalidad el cultivo o variedad así obtenidos son preferiblemente del tipo curado en atmósfera artificial . Después de rondas sucesivas de cruza y selección, se selecciona la progenie que contenga tanto un contenido alto de nicotina como un contenido alto de azúcar. Debido a que el tabaco es afín a los estudios genéticos, se puede introducir cualquier transgen en un antecedente de tabaco adecuado usando las técnicas y métodos bien conocidos en la biología molecular de plantas. Como se describe por Miki et al. in METHODS IN PLANT MOLECULAR BIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY (CRC Press 1993), cualquiera de la transíección, infección, transformación, absorción natural, electroporación y biolística se pueden usar para introducir un transgen dentro de un antecedente genético. Por ejemplo, y de acuerdo con la modalidad actual, un gen que confiere un fenotipo de alta azúcar se introducen en una célula de planta hospedadora de tabaco con lo cual se genera una planta que expresa un contenido elevado de azúcar. Por ejemplo, una célula de tabaco se transforma con un gen que codifica una enzima o un factor de transcripción que sobreregula la síntesis de azúcar, tal como un gen que otorga niveles elevados de glucosa y de fructuosa. Después de la selección sucesiva, se seleccionan plantas de progenie que tengan un contenido elevado de azúcar. Es ilustrativo de la presente invención, un transgen que confiere un fenotipo de alta nicotina que se puede introducir en un antecedente de tabaco de alta azúcar. Cualquier gen o porción de un gen que codifique un producto que confiere una biosíntesis mejorada de nicotina se puede emplear para la transformación. Son ilustrativos a este respecto los genes que codifican arginina descarboxilasa (ADC) , metilputrescina oxidasa (MPO) , NADH deshidrogenasa, ornitina descarboxilasa (ODC) , fosforibosilantranilato isomerasa (PRAI) , putrescina N-metiltransferasa (PMT) , quinolato fosforibosilo transferasa (QPT) , y S-adenosil-metionina sintetasa (SAMS) , respectivamente. Una vez que se introduce un transgen que confiere un fenotipo alto en nicotina dentro de una planta de tabaco con alta azúcar, se explotan las rondas sucesivas de selección en una forma convencional, para identificar y seleccionar una línea de tabaco que segregue de manera conjunta tanto un alto contenido de nicotina como alto contenido de azúcar. Se analizan el contenido de nicotina y azúcar por métodos estándar. En otra modalidad, un gen que confiere un fenotipo alto en nicotina se introduce en una planta que expresa una síntesis elevada de ácidos grasos. Al usar técnicas de biología molecular de plantas bien conocidas, se emplea cualquier gen o porción de gen que confiere una síntesis mejorada de ácidos grasos para la transformación. Son ilustrativos en este respecto los genes que codifican y/o regulan la síntesis de ácidos grasos saturados tales como los genes que codifican el ácido esteárico y el ácido palmítico.

Las plantas de progenie se ensayan para la síntesis elevadas de ácidos grasos usando métodos bien conocidos en el arte tale como PCR, análisis northern y análisis cromatográfico . Después de la identificación y selección de una línea estable que tenga una síntesis elevada de ácidos grasos, se introducen un transgen que confiere un fenotipo alto en nicotina dentro de la línea de síntesis elevada de ácidos grasos . Se explotan las rondas sucesivas de selección en una forma convencional, al identificar y seleccionar una línea de tabaco que segregue de manera conjunta tanto el contenido elevado de nicotina como un contenido elevado de ácidos grasos. Los niveles de nicotina y ácidos grasos se analizan por métodos estándar. Una variedad o cultivo se considera "cruza verdadera" para un aspecto en particular si es genéticamente homocigótico para ese aspecto al grado de que cuando la variedad o cultivo tiene la autopolinización, no se observa una cantidad importante de segregación independiente de la característica entre la progenie. Al calibrar el carácter de cruza verdadera de material en este contexto, aquellos expertos en la cruza del tabaco reconocerán que el nivel de azúcar de la hoja de tabaco varia entre las plantas de una línea idéntica, debido a que diferentes cosechas no se exponen a niveles idénticos de la luz del sol . Existe la variabilidad del nivel de azúcar aún dentro de una planta sencilla. Así, las hojas inferiores usualmente son cubiertas por la sombra de las hojas superiores, mientras que las plantas en los bordes de una hilera tienden a recibir más luz del sol que las plantas en el centro de una hilera. Por estas razones, el nivel de azúcar se incrementa generalmente con la posición del pedúnculo que va hacia arriba de la planta desde abajo hasta arriba. A través de la experimentación normal, el experto en cruzas tomaría estas y otras consideraciones en cuenta al desarrollar un cultivo o variedad que de acuerdo con una modalidad de la presente invención, sea una cruza verdadera para niveles altos de nicotina y contenido muy alto de azúcar. En otra modalidad, cualquier aspereza potencial de la nicotina aumentada en el humo producido a partir de la invención actual, se reduce a través de la adición de cantidades adecuadas de azúcares reductores al relleno del tabaco. Típicamente se agregan estos azucares reductores a la envoltura del tabaco de forma de jarabe de maíz de alta fructuosa, miel u orozuz. Los resultados óptimos se obtienen típicamente para relaciones de azúcar a nicotina de alrededor de 3.3 partes de azúcar con una parte de nicotina del relleno de tabaco en una base de peso seca (Status update of sugar/nicotine balance technology assessment (1992) RJ Reynolds documents, Bates 512842551/2) . Sin embargo, se puede ajustar esta relación de acuerdo a las preferencias del gusto del fumador, de manera que la relación de azúcar a nicotina esté en el intervalo entre alrededor de 3 y alrededor de 5. Como se discutió previamente, el pH del humo del cigarrillo es con bajo T R y el contenido de azúcar reductor de su relleno se deben considerar cuando se ajusten los aditivos para azúcar. Para este análisis, el contenido de nicotina en el tabaco se determina por extracción y análisis por cromatografía del gas . Los niveles de azúcar en el tabaco natural se determinan por extracción y análisis por cromatografía líquida de alto desempeño. Al haber obtenido las cantidades de la nicotina natural y los azúcares en una base de peso seca, se determina la cantidad de azúcares adicionales para obtener la relación deseada. En otra modalidad, se pueden usar ácidos grasos como amortiguadores de nicotina. Por ejemplo, se puede agregar los ácidos mirístico o palmítico a los rellenos de tabaco para funcionar como amortiguadores de nicotina. También, los ácidos grasos tales como los que se encuentran en aceite de coco o de cacao de grasa de mantequilla elevada se pueden agregar a la envolvente del tabaco. ¿iteratiamente, se puede modificar genéticamente la planta de tabaco para producir ácidos grasos elevados en los tejidos de hoja de tabaco. Se apreciará que las plantas de tabaco de la presente invención puede no ser transgénicas esto es, pueden no contener secuencias de ácidos nucleicos a partir de otros organismos incorporados en su genoma, aunque los niveles de nicotina, azúcares o ácidos grasos se modifiquen al producir plantas o células de plantas a través de mutagénesis dirigida de las secuencias específicas de ácido nucleico por la introducción de ácidos nucleicos que inducen la reparación o recombinación del ADW (Beetham et al., 1999; Zhu et al., 2002; WO 03/013226), o la introducción de virus modificados que pueden producir resultados finales similares como "plantas transgénicas que incrementan nicotina" , "plantas transgénicas con nicotina reducida" , "plantas transgénicas con azúcar aumentado" y "plantas transgénicas con ácidos grasos aumentados" aqui descritas. Un método para la cruza precisa (Publicación de EUA No. 20040107455) , en la cual solamente las secuencias de ácido nucleico derivadas de la especie objetivo o especies sexualmente compatibles se introducen en el genoma de la planta objetivo, se puede usar para producir plantas que son "plantas con nicotina" , "plantas con nicotina reducida" , "plantas con nicotina reducida" , "plantas con azúcar aumentada" y "plantas de ácidos grasos aumentadas" aquí descritos . 2. Cigarrillos con bajo TNR (al agregar nicotina de plantas transgénicas con nicotina incrementada) Un segundo aspecto de la presente invención es un método de agregar nicotina o una fracción que contiene nicotina extraída a partir de una planta transgénica con nicotina incrementada como se describe arriba, para tabaco convencional o tabaco con nicotina reducida en los niveles requeridos . Las Patentes de EUA 4,830,028; 4,836,224 y 5,031,646, describen la modificación del relleno del cigarrillo por la adición de sales de ácidos orgánicos y nicotina. En particular, dirigen la adición de nicotina en esta manera con objeto de disminuir la relación de concentración de alquitrán a nicotina. Una revisión por Brown and Williamson Tobacco Company in the Journal of the American Medical Association (volumen 274, No. 3, página 228, 1995) describe el proyecto Ariel cubierto por las Patentes de EUA 3,258,015 y 3,356,094 (Battelle) . Estas Patentes describen un aerosol con nicotina agregada en una forma tal capaz de reducir la relación de concentración de alquitrán a nicotina de los cigarrillos de la invención a un cuarto de aquel de los cigarrillos convencionales . Las fracciones que contienen nicotina como nicotina o sales de nicotina de los ácidos orgánicos obtenidos de plantas transgénicas con nicotina incrementada, se agregan a plantas transgénicas de nicotina reducida o de tabaco convencionales al rociar o usar cualquier otro método para alguien experto en la técnica del procesamiento del tabaco y aplicaciones de aditivos con o sin propilenglicol o cualquier otro solvente o agua para disolución sobre una hoja entera o tabaco de fragmentos de corte. La cantidad de nicotina que se tiene que agregar al diseñar un cigarrillo de bajo TNR es una función de lo siguiente: (1) el contenido de nicotina y el tipo de mezcla de tabaco que se usa - tabaco con fragmentos de corte de mezcla americana contienen generalmente aproximadamente de 2 a 2.5 por ciento de nicotina, (2) las especificaciones del pitillo del cigarrillo con consideración a la ventilación o propiedades de porosidad, (3) el TNR deseado del cigarrillo y (4) el concentración especifico de alquitrán deseado. Por ejemplo, supóngase que el fabricante de cigarrillos desea crear un cigarrillo de bajo TNR con concentraciones de 8 mg de alquitrán y los mimos 1.2 mg de nicotina que su estilo de marca de sabor completo produce como por el método FTC/ISO. Es un estilo de marca de sabor completo que produce 16 mg de alquitrán de manera que la meta es para el TNR de estilo de marca novedosa que sea la mitad del estilo de marca de sabor completo. También se desea usar el mismo relleno y luego agregar nicotina para crear el cigarrillo de bajo TNR.

La cantidad de nicotina que el fabricante agregaría inicialmente durante el desarrollo del producto para concentración de 8 mg de alquitrán y 1.2 mg de nicotina es alrededor de 2 veces tanto como el contenido de nicotina de su relleno para la marca de sabor completo. Se apreciará por alguien experto en la técnica que la ventilación adicional del pitillo ligero reducirá el concentración de alquitrán en una relación ligeramente -superior que el concentración de nicotina, de manera que al doblar la nicotina del relleno puede ser ligeramente demasiado. Sin embargo, se puede perder algo de nicotina durante el procesamiento del tabaco y los proceso de manufactura del cigarrillo, entonces el doblar la nicotina se pudiera justificar. El impacto desde la duración de tal tabaco se almacena después de la adición de nicotina pero antes de la manufactura del cigarrillo también se debe evaluar. Ya que la escala y forma de estos procesos son diferentes para cada fabricante, se apreciará que puede ser necesario alguna prueba y error. Un pitillo ligero que produce usualmente 8 mg de alquitrán por cigarrillo se puede escoger inicialmente por el fabricante. El resultado que se desea es un cigarrillo que produce 8 mg de alquitrán y 12 mg de nicotina con lo cual cortar el alquitrán más de la mitad aunque se mantenga el concentración de nicotina igual como la mayoría de los cigarrillos de sabor completo. Una cantidad seleccionada de tabaco después de agregar nicotina o sales de nicotina de ácidos orgánicos a alrededor de 13% de humedad, se coloca en la tolva de una máquina para elaborar cigarrillos. Luego pasa la máquina para elaborar cigarrillos los cigarrillos enrollados a otra máquina que pone el filtro en el cigarrillo enrollado sin filtro. Esta etapa se salta si se producen cigarrillos sin filtro.

Los cigarrillos terminados luego se prueban usando el método FTC/ISO de manera que los resultados finales se puedan evaluar. Si el cigarrillo produce 8 mg de alquitrán y 1.2 mg de nicotina, (un TNR de 6.66) y todas las consideraciones anteriores sean tomado en cuenta, entonces el desarrollo sea finalizado. Si el cigarrillo se clasifica como áspero en los grupos focales debido a la nicotina adicional, entonces se deben agregar aditivos al relleno para ayudar a aliviar el problema . Se pueden hacer ajustes menores si los cigarrillos fabricados producen más o menos de las concentraciones deseados . Estos incluye ¦ cambiar uno de los componentes del pitillo del cigarrillo. Algunos de los componentes de los pitillos se pueden modificar al variar los tipos del filtro, papel del cigarrillo, envolturas del tapón, el papel de la boquilla (el que mantiene al pitillo del cigarrillo con el filtro) , los orificios de ventilación, y sus variaciones correspondientes en combinación. Por ejemplo, si el cigarrillo esta produciendo 9 mg de alquitrán y 1.3 mg de nicotina, la filtración y/o dilución se incrementa ligeramente para reducir tanto los concentración de alquitrán como de nicotina en una proporción muy similar. Esto se logra usualmente al especificar el tamaño y cantidad de los orificios de ventilación y la porosidad de la envoltura del tapón de filtro para lograr el concentración deseado. Si el concentración del alquitrán está en el objetivo pero el concentración de la nicotina es mayor o menor que el deseado, entonces se pueden ajustar de esta manera los niveles de nicotina agregados . La mayoría de las marcas de cigarrillo tienen · desde alrededor del 10% de tabaco reconstituido en las marcas premio hasta alrededor de 30% en las marcas de descuento en el relleno del cigarrillo aunque no sean una parte necesaria del relleno. Otra modalidad de la presente invención es agregar nicotina a la porción reconstituida del relleno del cigarrillo con objeto de darle a los cigarrillos un menor TNR. Los ajustes en la cantidad de nicotina para agregar al cigarrillo de baja TNR es otra variable que se puede lograr por el fabricante. Por lo tanto, el contenido de nicotina del relleno es una función del contenido de nicotina del tabaco más el contenido de nicotina de cualquier tabaco reconstituido en el relleno incluyendo el reconocimiento de una nicotina incrementada y/o el reconocimiento de una nicotina reducida o ambos . Cualquier combinación de los tres se puede utilizar. Un documento de 1975 del sito Web de documento Philip Morris (Bates 2056140416, Titulado "Low Delivery Cigarettes and Increased Nicotine/Tar Ratios, A Replication" ) describe los resultados de un panel de sabor de cigarrillos con relaciones aumentadas de nicotina/alquitrán. Se encontró que un cigarrillo con un suministro de 10 mg de alquitrán y una relación de nicotina/alquitrán de 0.09 (equivalente T R de 11) fue igual en aceptación y fuerza a un control de sabor completo de Marlboro® (en tal tiempo 18 mg de alquitrán, 1.03 mg de nicotina, relación de nicotina/alquitrán de 0.06), que equivale a una TNR de 16.66. Se apreciará por alguien experto en la técnica que al extraer la nicotina del tabaco recombinante con nicotina aumentada para las modalidades anteriores, será más económico y eficiente que hacerlo a partir del tabaco convencional ya que se tendrán que hacer crecer menos plantas y procesar para obtener una cantidad suficiente de nicotina. 3. Reducción de las nitrosaminas dañinas específicas del tabaco en productos del tabaco Es bien conocido en la industria del tabaco que las nitrosaminas especificas del tabaco (TSNA) comúnmente referidas como un agente cancerígeno en el tabaco, se forman predominantemente mientras se cura el tabaco. Aunque otras TSNA están presentes en el tabaco, las cuatro que se coincide generalmente que son las más perjudiciales son las siguientes: N' -nitrosonornicotina (NNN) , 4- (N-nitrosometilamino) -1- (3-piridil) -1-butan-ona (NNK) , N' -nitrosoanatabina (NAT) , N' -nitrosoanabasina (NAB) . Las TSNA en el tabaco durante la curación se forman a partir de los precursores menores de alcaloide (Wiernik, et al., 1995; "Effect of air-curing on the chemical composition of tobáceo", Recent Advences in Tobacco Science 21, 39-80). Como se usa en la presente, la nitrosaminas específicas del tabaco o TSNAs se seleccionan del grupo de las siguientes: WW, NK, NAT y NAB. Las TSNA se analizan predominantemente por cromatografía de gas con detección de quimioluminiscencia después de una extracción con solvente (Charles Risner, et al., Quantification of Tobacco Specific Nitrosamines in Tobacco, Tobacco Science, 38 (1-6) , 1994) . Como un método alternativo para la separación y análisis se utiliza extracción supercritica de fluidos con detección de cromatografía de gas/espectometría de masas (Siqing song, et al., Supercritical fluid extraction and GC/MS for the analysis of tobacco-specific nitrosamines in cigarettes, Analytical chemistry, 1999, 71, 1303-1308) . Más recientemente, un procedimiento rápido utilizando extracción con acetato de amonio seguido por cromatografía líquida usando espectrometría de masas (MS/MS) se ha propuesto (Karl agner, et al., The rapid and quantitative analysis of tobáceo specific nitrosamines in whole tobáceo and mainstream smoke using LC/MS/MS ith positive ion electrospray, 55th Tobacco Science Research Conference 2001) . El nivel de nitrosaminas se correlaciona generalmente de forma positiva con el contenido de nicotina ya que los alcaloides están usualmente presentes en proporcionar el contenido de nicotina. Generalmente, para la mayoría de las variedades de iVícotíana tabacum, la nicotina constituye alrededor de 90% del contenido de alcaloides totales en la planta. Por lo tanto, otra modalidad de la presente invención es el uso de tabaco transgénico con nicotina reducida y agregar nicotina extraída, sales de nicotina derivadas de ácidos orgánicos (derivados de tabaco con nicotina incrementada convencional o modificada genéticamente) , o nicotina sintetizada en una base libre combinada con ácidos orgánicos, con objeto de crear un cigarrillo u otros productos de tabaco sin virtualmente nitrosaminas o alcaloides menores, y todavía uno que produzca una cantidad convencional de nicotina. Este método se utiliza con tabaco reducido a nicotina, modificado genéticamente al agregar suficiente nicotina para proporcionar el mismo concentración que los cigarrillos convencionales con el método FTC/ISO, por ejemplo, desde 0.05 a 1.5 mg por cigarrillo. La alteración genética del contenido de alcaloides en el tabaco se ha llevado a cabo por la alteración de la quinolato fosforibosil transferasa (QPT) y putrescina metiltransferasa (PMT) . La figura 4 muestras como los alcaloides que incluyen Nornicotina se han reducido al reducir la QPRTasa en una variedad burley para crear una variedad transg nica de bajo alcaloide nombrada Vector 21-41. Esta variedad de tabaco contiene niveles muy bajos de TSNA. La variedad Vector 21-41 se protege por la Oficina de Protección de Variedades de Plantas y su número de Protección de Variedades de Plantas es 200100039. Líneas de raiz transformadas se produjeron que contienen notablemente una actividad reducida de PMT, con una reducción con un concomitante en el contenido de nicotina comparado con los controles" (Yupynn Chintapakon and John D. Hamill, Plant Molecular Biology 53:87-105, 2003. © 2003 Klu er Academic Publishers . 87). La nornicotina, se correlaciona negativamente con la calidad del tabaco y el sabor del cigarrillo ("Natural Tobacco Flavor" , Roberts, D. L. Recent Advances in Tobacco Science, 14, pg. 49-81, 1988) . Un producto de cigarrillo producido con nicotina como el único alcaloide debe ser altamente aceptable solo sobre esta base . Las plantas de tabaco con nicotina reducida usadas para llevar a cabo la presente invención, son en general plantas de tabaco recombinantes que contienen y expresan un nucleótido lieterólogo, la expresión de cuyo nucleótido heterólogo subregula una enzima tal como las quinolato fosforibosil transferasa (QPRTasa) , putrescina metiltransferasa (PMTasa) , arginina descarboxilasa, ornitina descarboxilasa, S-adenosilmetionina sintetasa, NADH deshidrogenasa o fosforibosilantranilato isomerasa (PRAI) en la planta y con ello se reduce la producción de nicotina en la planta. Las plantas recombinantes adecuadas se describen en M. Conkling et al., Solicitud PCT WO 98/56923 (publicada el 17 Diciembre 1998) y en M. Timko, solicitud PCT WO 00/67558 (publicada el 16 Noviembre 2000) . En general, el nucleótido heterólogo comprende al menos un segmento de un ácido nucleico que codifica la enzima hacer subregulada, en la orientación sentido o antisentido. Preferiblemente el tabaco con nicotina reducida también contiene niveles reducidos (por ejemplo, por al menos 90, 95 ó 99% en peso o más) de nitrosaminas específicas del tabaco en comparación con aquel que se encontraría en ausencia de las reducciones correspondiente en nicotina. Otra modalidad de la presente invención utiliza una planta recombinante con nicotina reducida que tiene una expresión reducida de quinolato fosforibosil transferasa (QPRTase) con relación a una planta de control no transformada, tal planta recombinante comprende células de planta recombinantes que contienen un constructo de ADN exógeno que comprende en la dirección 5' a 3', un promotor que opera en tal célula de la planta y un ADN heterólogo que codifica al menos un segmento de un ARNm de la quinolato fosforibosil transferasa, tal ADN heterólogo se asocia opera ivamente con tal promotor y con tal ADN heterólogo en la orientación sentido o antisentido; tal planta muestra una expresión reducida de QP Tasa en comparación con una planta de control no transformada y el contenido de nicotina reducido en comparación con una planta de control no transformada. Otra modalidad de la presente invención se puede llevar a cabo por una planta recombinante con nicotina reducida que tiene una expresión de putrescina N-metiltransferasa (PMTasa) reducida con relación a una planta de control no transformada, tal planta recombinante comprende células de planta recombinante que contienen: un constructo de ADN exógeno que comprende en la dirección 5' a 3', un promotor que opera en tal célula de planta y un ADN eterólogo que codifica al menos un segmento de ARNm de PMT de planta, tal ADN heterólogo se asocia operativamente con tal promotor y con tal ADN heterólogo en la orientación sentido o antisentido; tal planta muestra una expresión reducida de PMT en comparación con la planta de control no transformada y un contenido de nicotina reducido en comparación con la planta de control no transformada. Se pueden llevar a cabo todavía otras modalidades de manera similar con otras enzimas antes listadas . Los constructos de ácido nucleico como se describen arriba pueden incluir elementos aisladores en dirección 5' y/o 3' del constructo antes descrito como se establece (por ejemplo) en las patentes de E.U.A. Nos. 6,100,448 y 6,037,525 a Thompson et al. Además, como se describen arriba pueden incluir regiones de colocación a la matriz (o de andamiaje) en dirección ascendente y/o dirección descendente del constructo antes descrito como se establece (por ejemplo) en las patentes de E.U.A. Nos. 5,773,695 y 5,773,689 a Thompson et al. En otra modalidad de la presente invención las plantas utilizadas pueden contener una pluralidad de ácidos nucleicos recombinantes que subregulan una pluralidad de enzimas en la trayectoria de síntesis de nicotina. Los beneficios de utilizar más de un ácido nucleico recombinante, es que los niveles de nicotina se pueden disminuir hasta un grado mayor (contra si uno de tales ácidos nucleicos se utilizaron) , posiblemente hasta cero, y se pueden ajustar diferentes relaciones de alcaloides deseadas (por ejemplo, la relación de nicotina a alcaloides totales) , si se prefiere. Así, otra modalidad de la presente invención utiliza una planta recombinante con nicotina reducida que tiene tanto una expresión reducida de QPRTasa como una expresión reducida de PMTasa con relación a una planta de control no transformada, tal planta recombinante comprende células de planta recombinantes que contienen: (i) un primer constructo de ADN exógeno que comprenden la dirección 5' a 3', un promotor que opera en tal célula de plantas y un ADN heterólogo que codifica al menos un segmento de una ARNm de la planta quinolato fosforibosil transferasa, tal ADN heterologo se asocia operativamente con tal promotor; y (ii) un segundo constructo de ADN exogeno que comprende en la dirección 5' a 3 ' , un promotor que opera en tal célula de planta y un ADN heterologo que codifica al menos un segmento de un ARNm de PMT de planta, tal ADN heterólogo se asocia operativamente con tal promotor y con tal ADN heterólogo en la orientación sentido o antisentido; tal planta muestra una expresión reducida de PMT en comparación con una planta de control no transformada y un contenido reducido de nicotina en comparación con una planta de control no transformada. Se apreciará que, en donde la subregulación de sentido y antisentido se describen en la presente, se pueden usar otras técnicas tales como el uso de repeticiones invertidas que produzcan ARNds que induce el silenciamiento de genes, ribozimas, o interfiere con el ARNm com lementario. También se apreciara que un constructo sencillo de ADN se puede usar que reduzca la actividad de más de una enzima. Por ejemplo, un constructo de ADN se puede usar para reducir tanto QPRTasa como PMTasa. Ejemplos de las secuencias de ácidos nucleicos que se pueden usar para llevar a cabo la presente invención, incluyen pero no se limitan a, un ADN conocido que codifica el gen de quinolato fosforibosil transferasa (NtQPTl) ; (ver por ejemplo, solicitud PCT W098/5556923 a Conkling et al.); el ADN que codifica la putrescina N-metiltransferasa del tabaco tal como PMT1, PMT2 , PMT3 y PMT4; el ADN que codifica la arginina descarboxilasa de tabaco tal como ADC1 y ADC2 ; ADN que codifica ornitina descarboxilasa (ODC) del tabaco; ADN que codifica la S-adenosilmetionina sintetasa (SAMS) de tabaco; ADN que codifica la NADH deshidrogenasa del tabaco y ADN que codifica fosforibosilantranilato isomerasa (PRAI) (que se conocen y describen en la solicitud PCT WO 00/67558 a M. Timko et al) . Las condiciones que permiten a otras secuencias de ADN codificar para la expresión de una proteína que tenga una actividad de enzimas deseada como se describen arriba para hibridizar el ADN como se describe arriba, o a otras secuencias de ADN que codifican la proteína de la enzima como se da arriba, se pueden determinar en una forma de rutina. Por ejemplo, la hibridación de tales secuencias se puede llevar a cabo bajo condiciones de severidad reducida o aun condiciones severas (por ejemplo, condiciones representadas por una severidad de lavado de 0.3 M NaCl, 0.03 M citrato de sodio, 0.1% SDS a 60°C o aun 70°C al ADN que codifica la proteína antes dada en una ensayo de hibridación estándar in situ. Ver J. Sambrook et al., Molécula Cloning, A Laboratory Manual (2d ED. 1989, Cold Spring Harbor Laboratory. En general, tales secuencias serán al menos 65% similar, 75% similar, 80% similar, 85% similar, 90% similar o aun 95% similar, o más con la secuencia dada arriba o secuencias de ADN que codifican las proteína dadas arriba. (Las determinaciones de la similitud de secuencias se hacen con las dos secuencias alineadas para una coincidencia máxima; los espacios en cualquiera de las dos secuencias que coinciden se permiten al maximizar la coincidencia. Se prefieren longitudes de espacio de 10 o menos, longitudes de espacio de 5 o menos son más preferidas y longitudes de especio de 2 o menos son todavía más preferidas) . La secuencia heteróloga utilizada en los métodos de la presente invención se pueden selecciona de manera de producir un producto de ARN complementario al mensaje completo que codifica la secuencia de la enzima o una porción de la misma. La secuencia puede ser complementaria a cualquier secuencia contigua del ARN mensajero natural. Esto es, puede ser complementaria a la secuencia del ARNm endógeno próximo a la terminación 5' o el sitio de cierra, en la dirección descendente desde el sitio de cierre, entre el sitio de cierre y el codón de inicio y puede cubrir toda o solamente una porción de la región no codificadora, puede puentear la región no codificadora y no codificadora, ser complementaria para todo o parte de la región 3 ' codificadora o complementaria a la región 3' no traducida del ARNm. Las secuencias antisentido adecuadas pueden ser desde al menos alrededor de 12, 14 o 15 o alrededor de 15, 25 ó 35 nucleótidos, al menos alrededor de 50 nucleótidos, al menos alrededor de 75 nucleótidos, al menos alrededor de 100 nucleótidos, al menos alrededor de 125 nucleótidos, al menos alrededor de 150 nucleótidos, al menos alrededor de 200 nucleótidos o más. Además, las secuencias se pueden extender o acortar en las terminaciones 3' ó 5' de las mismas (por ejemplo, por la adición de 1 a 4 u 8 residuos adicionales de ácidos nucleicos) . El producto antisentido puede ser complementario a las porciones codificadoras o no codificadoras (o ambas) del ARN objetivo que se presenta naturalmente. La secuencia antisentido en particular y la longitud de la secuencia antisentido variaran dependiendo del grado de inhibición deseado, la estabilidad de' la secuencia antisentido y similares . Alguien experto en la técnica estará guiado en la selección de las secuencias adecuadas antisentido de enzimas usando técnicas disponibles en el arte Y la información aquí proporcionada. Como se indica arriba, la presente invención se puede llevar a cabo con plantas que implementen la co-supresión en sentido de la producción de nicotina. Los ADNs sentido empleados en llevar a cabo la presente invención son de una longitud suficiente para cuando se expresan en una célula de planta supriman la expresión nativa de la enzima de planta como se describe en la presente en esa célula de planta. Tales ADNs de sentido puede ser esencialmente un ADN genómico o complementario completo que codifica la enzima o un fragmento del mismo con fragmentos tales que son típicamente de al menos 15 nucleótidos de longitud. Los métodos para determinar la longitud del ADN en sentido que resulta en la supresión de la expresión de un gen nativo en una célula están disponibles por aquellos expertos en la técnica. La presente invención también se puede llevar a cabo con plantas que contengan los ADN que codifican los ARN de hebra doble que comprenden las secuencias complementarias antisentido y sentido que cuando se expresan puede suprimir o silenciar los genes endógenos que contienen las secuencias. Las regiones complementarias adecuadas puede ser desde alrededor de al menos 20 a 25 nucleótidos y se puede separar por al menos alrededor de 5 nucleótidos. En todavía otra modalidad de la presente invención, las células de planta de Nicotiana se transforman con un constructo de ADN que contiene un segmento de ADN que codifica una molécula enzimática de ARN (por ejemplo, un "ribozima" ) cuya molécula enzimática de ARN se dirige contra (por ejemplo, desdoblar) el transcrito de ARNm del ADN que codifica una enzima de planta como se describe en la presente. Las ribozimas contienen dominios de enlace al substrato que se enlazan a regiones accesibles del ARNm objetivo y dominios que catalizan el desdoblamiento del ARN evitan la traducción y la producción de proteínas. Los dominios de enlace pueden comprender secuencias antisentido complementarias a la secuencia ARNm objetivo; la porción catalítica puede ser una porción de cabeza de martillo u otras porciones tales como una porción de horquilla. Los sitios de desdoblamiento de ribozxma dentro de un objetivo de AR se pueden identificar inicialmente al escanear la molécula objetivo para los sitios de desdoblamiento de ribozimas (por ejemplo, las secuencias GUA, GUU o GUC) . Una que vez que se identifican, las secuencias cortas de ARN de 15, 20, 30 o más ribonucleotidos que corresponden a la región del gen objetivo que contiene el sitio de desdoblamiento se pueden evaluar para las características estructurales predichas. La conveniencia de los objetivos candidato también se puede evaluar al probar su acceso a la hibridación con oligonucleótidos complementarios, usando ensayos de protección de ribonucleasa como se conocen en el arte . El ADN que codifica moléculas enzimáticas de ARN se pueden producir acuerdo con las técnicas conocidas (ver por ejemplo T. Cech et al., Patente de EUA No. 4,987,071; Donson et al., Patente de EUA No. 5,589,357; Torrence et al., Patente de EUA No. 5,583, 032; Joyce, Patente de EUA No. 5, 580,, 967; Wagner et al., Patente de EUA No. 5,591,601; y Patente de EUA No. 5,622,854. la producción de tal molécula enzim tica de ARN en una célula de planta y la disrupción de la producción de proteínas de enzimas reduce la actividad de las enzimas en las células de plantas esencialmente de la misma manera como la producción de la molécula de ARN antisentido que es al fragmentar la traducción de ARNm en la célula la cual produce la enzima. El término "ribozima" se usa en la presente para describir un ácido nucleico que contiene un ARN que funciona como una enzima (tal como una endoribonucleasa) y se puede usar de manera intercambiable con una molécula enzimática de ARN. Todavía en otra modalidad de la invención, la subregulacion de la producción de nicotina se puede lograr al emplear la inhibición de la traducción de ARNm utilizando ARNm que interfiere al complementario como se establece en la Patente de EUA No. 5,272,065. Para producir una planta de tabaco que contenga niveles de enzima disminuidos y asi disminuir el contenido de nicotina, en comparación con una planta de tabaco de control sin transformar, se puede transformar una célula de tabaco con una unidad transcripcional exógena que comprenda una secuencia de ácido nucleico de enzima parcial , una secuencia de ácido nucleico de enzima de longitud completa, en la orientación, sentido o antisentido con secuencias reguladoras apropiadas ligadas operativamente o una secuencia que codifique una ribozima como se describe arriba. Las secuencias reguladoras apropiadas incluyen una secuencia de inicio de la transcripción (promotor) que opera en la planta que se transforma y una secuencia de terminación de la poliadenilación/transcripción. Las técnicas estándar tales como el mapeo de restricción, hibridación por manchado Southern y análisis de secuencias de nucleótidos, luego se emplean para identificar los clones que soportan las secuencias de enzimas en la orientación antisentido, ligado operativamente a las secuencias reguladoras. Las plantas de tabaco luego se regeneran a partir de células exitosamente transformadas. Es más preferido que la secuencia antisentido utilizada sea complementaria con los secuencia endógena, sin embargo, se pueden tolerar variaciones menores en la secuencia exógenas y endógenas. Se prefiere que la secuencia antisentido de ADN sea de una similitud de secuencia suficiente que pueda enlazarse con la secuencia endógena en la célula a regularse bajo condiciones severas como se describen a continuación. Las técnicas particulares para producir plantas de tabaco recombinantes se conocen por aquellos expertos en la técnica y se explican con mayor extensión en M. Conkling et al., Solicitud PCT WO 98/55923 (publicada el 17 de Diciembre de 1998) y en M. Timko, Solicitud PCT WO 00/67558 (publicada el 16 de Noviembre de 2000) antes señalada. La variedad de tabaco con nicotina reducida, vector Burley 21-41 se desarrolló al modificar genéticamente Burley 21 LA como se describe en la Patente de EUA No. 6,586,661. Burley 21 LA es una variedad de Burley 21 con niveles substancialmente reducidos de nicotina en comparación con Burley 21 (por ejemplo, Burley 21 LA tiene 8% de los niveles de nicotina de Burley 21, ver Legg et al., (1971) Can. J. Genet. Cytol . 13:287-91; Legg et al., (1969) J. Hered. 60:213-17). El vector Burley 21-41 es el más similar a la variedad precursora, Burley 21 LA. En general, el vector Burley 21-41 es similar a Burley 21 LA en todas las características evaluadas con la excepción del contenido de alcaloides (por ejemplo nicotina y nornicotina) . El vector Burley 21-41 se puede distinguir del Burley 21 LA precursor por su contenido substancialmente reducido de nicotina, nornicotina y alcaloides totales. Como se muestra en la Figura 4 las concentraciones totales de alcaloides en el vector 21-41 se reducen hasta aproximadamente 10 por ciento de los niveles del Burley 21 LA precursor. Las concentraciones de nicotina y de nornicotina son menos que aproximadamen e 6.7% y 32% respectivamente en el vector Burley 21-41 en comparación con Burley 21 LA. Los niveles de QPRTase se correlacionan positivamente con la nicotina y con otros alcaloides del tabaco incluyendo anabasina y anatabina que a su vez producen ??? y NAT. Ver figura 5. Todavía en otra modalidad de la presente invención para agregar una cantidad igual de nicotina o sales de nicotina de ácidos orgánicos y análogos de nicotina (comparados con el tabaco convencional) a un tabaco con nicotina reducida para crear los productos de tabaco con TNSA reducidas . Los métodos convencionales para alguien experto en la técnica de procesamiento del tabaco incluyendo el uso de aditivos y saborizantes de tabaco, se usan para agregar nicotina a tales productos del tabaco . Otra modalidad de la presente invención es agregar una cantidad aún mayor de nicotina al tabaco reducido en nicotina (comparado al tabaco convencional) para crear un cigarrillo bajo en TNR. La ventaja principal de este método es que virtualmente no se forman nitrosaminas en el tabaco cuando el tabaco se cura debido a la ausencia de nicotina o alcaloides menores. Los cigarrillos producidos por este método no solamente tienen las ventajas de los cigarrillos bajos en TNR, sino que tampoco contienen virtualmente nitrosaminas o alcaloides menores si el QPRT se reduce o elimina. Otra modalidad de la presente invención es utilizar tabaco con nicotina reducida y luego agregar nicotina de manera que la cantidad convencional de nicotina está presente para los siguientes productos: tripa o envoltura de un puro, tabaco para enrollar para cigarrillos, tabaco para pipa, tabaco para mascar, tabaco en polvo, tabaco reconstituido y todas las otras versiones de tabaco sin humo. Las ventajas son que estos productos son extremadamente bajos en TSNA y/o alcaloides menores del tabaco. 4. Producción de tabaco mejorado expandido o abocanado usando tabaco transgénico con nicotina incrementada Se han concedido más de 150 patentes relacionadas a la expansión del tabaco (ver por ejemplo el Número de Patente de EUA 3,991,772) . El proceso de expansión de una mayor potencia de llenado al tabaco de manera que menos peso de tabaco se usa en el cigarrillo. Una ventaja de usar tabaco expandido es el suministro reducido de alquitrán. El tabaco expandido es particularmente útil en la elaboración de cigarrillos de bajo suministro de alquitrán. Los cigarrillos Carlton®, que se reclama que son el cigarrillo con el menor suministro de alquitrán y nicotina, se hacen frecuentemente con un gran porcentaje de tabaco expandido. Sin embargo, el uso de tabaco expandido también resulta en un suministro reducido de nicotina lo cual puede resultar en compensación. El principal beneficio del tabaco transgénico expandido con nicotina incrementada, es que tal tabaco proporciona un suministro reducido de alquitrán mientras que se mantiene alrededor del suministro de nicotina resultando en un cigarrillo con un suministro reducido de alquitrán y T R reducido. Por ejemplo, una mezcla de tabaco de un cigarrillo que incorpora tabaco transgénico con nicotina incrementada puede suministrar 16 mg de alquitrán y 2.0 de nicotina (TNR de 8) . La expansión de tal tabaco transgénico al 100% daría un relleno de tabaco con menos peso, pero ocuparía el mismo volumen en tal cigarrillo, con lo cual se reduce el TNR. El TNR de este cigarrillo sería menor que 8 sin la ventilación del filtro. Se puede usar cualquier método para la expansión del tabaco conocido en el arte en la presente invención. El método más común usado ahora incorpora dióxido de carbono liquido (Patente de EUA Nos. 4,340,073 y 4,336,814). El propano líquido se ha usado para hacer cigarrillos comerciales predominantemente en Europa (Patente de EUA NO. 4,531,529). El propano líquido ofrece ventajas sobre el dióxido de carbono ya que son posibles mayores grados de expansión en el rango de 200%. Bajo presión, el dióxido de carbono líquido (o el propano líquido) permea la estructura celular del tabaco. Cuando se calienta rápidamente el tabaco, se expande el dióxido de carbono (o el propano líquido) en la célula volviendo a su tamaño previo al curado. Es otra modalidad de la presente invención utilizar tabaco transgénico con nicotina incrementada, preferiblemente tabaco que fue creado a partir de un antecedente con alta azúcar y/o altos ácidos grasos y crear tabaco expandido a partir de tal tabaco transgénico para producir un cigarrillo con bajo TNR. Es otra modalidad utilizar tabaco desproteinizado, preferiblemente extraído a partir de tabaco transgénico con nicotina reducida y crear tabaco expandido a partir de tal tabaco desproteinizado . Un cigarrillo que contiene un tabaco expandido desproteinizado y un tabaco transgénico con nicotina incrementada se produce con ello. 5. Producción de tabaco reconstituido Es otra modalidad de la presente invención la producción de productos de tabaco con exposición reducida que pueden incluir cigarrillos con bajo TNR, al utilizar las invenciones previas anteriores, fibra de tabaco desproteinizada y tabaco secado por congelación en cualquier combinación o ' en conjunto con el tabaco reconstituido. El proceso para producir láminas de tabaco reconstituido ("recon") comenzó durante los años 1950. Los números de Patente de EUA que describen tales procesos incluyen: 3,499,454, 4,182,349, 4,962,774 y 6,761,175. El tabaco reconstituido se produce tradicionalmen e a partir de tallos de tabaco y/o partículas de hojas más pequeñas que se asemejan cercanamente a un proceso típico de elaboración de papel. Las concentraciones de alquitrán y nicotina del tabaco reconstituido son menores que aquellos de cantidades equivalentes de la hoja del tabaco enteras. Este proceso permite el procesamiento de las diversas porciones del tabaco que se van a hacer en el tabaco reconstituido. Después de que las láminas de Recon se producen se cortan en tamaño y forma que se asemejen a el tabaco en fragmentos de corte hecho a partir de tabaco de hoja entera. Este Recon de corte luego se mezcla con tabaco de fragmento de corte y esta listo para la elaboración de cigarrillos. Los cigarrillos pueden fabricar con solamente tabaco reconstituido, sin "recon" o con cualquier combinación de los mismos. La mayoría de las marcas principales tienen al menos 10% de Recon en el relleno. El beneficio principal del tabaco transgénico con nicotina incrementada para el "recon" es que tal tabaco reducirá el concentración de alquitrán de los cigarrillos, mientras se mantiene alrededor del concentración de nicotina.

Es otra modalidad de la presente invención agregar nicotina o sales de nicotina para producir "recon" , que se hace a partir de tabaco transgénico con nicotina reducida o cualquier material de planta que no sea de tabaco incluyendo pero no limitado a mezclas de hierbas de manera de que cuando se quema tal lámina reconstituida produce substancialmente menos nitrosaminas especificas del tabaco y otros agentes cancerígenos producidos a partir de cigarrillos convencionales aunque están presentes todavía cantidades satisfactorias de nicotina. Es otra modalidad de la presente invención utilizar tabaco transgénico con nicotina incrementada, preferiblemente tal tabaco que se creo a partir de un antecedente de alta azúcar y/o altos ácidos grasos y crear "recon" a partir de tal tabaco transgénico para producir un cigarrillo bajo en TN . Otra modalidad incrementa el contenido de azúcar, el contenido de ácido graso o ambos del "recon" durante el procesamiento . Recon a partir de la fibra de tabaco Las Patentes que describen los procesos para retirar proteínas del tabaco, creando con ellos una fibra de tabaco desproteinizada se describen en las Patentes de EUA Nos. 4,289,147 y 4,347,324. La fibra de tabaco es un subproducto principal después de retirar la proteína. Los restos fibrosos del tabaco desproteinizado se pueden incluir en cualquier porcentaje como un ingrediente del tabaco reconstituido. Los cigarrillos hechos de tabaco desproteinizado tienen un sabor diferente que los cigarrillos convencionales. Sin embargo, se pueden agregar cantidades adecuadas de aditivos incluyendo saborizantes y nicotina para ayudar a mejorar esta deficiencia en sabor. Los cigarrillos que contienen tabaco desproteinizado tienen una ventaja importante sobre los cigarrillos convencionales ya que producirían niveles reducidos de cancerígenos y productos dañinos de la combustión. "Una reducción del 71% del contenido de proteínas de una lámina de tabaco curada en atmósfera artificial, resulta en una reducción del 81% en la mutagenicidad ??98" del condensado pirolítico (Clapp, W.L. , et al., "Reduction in Ames Salmonella mutagenicity of cigarrette mainstream smoke condénsate by tobáceo protein removal" , Mutation Research, 446, pg 167-174, 1999) . La investigación previa en esta área había determinado que la proteína de hoja de tabaco pudiera ser el precursor principal de mutagenos en el condensado del humo del tabaco (Matsumoto et al . , "Mutagenicities of the pyrolysis of peptides and proteins" Mutation Research, 56, página 281-288, 1978) . La extracción de la fibra del tabaco a partir de tabaco genéticamente modificado con nicotina reducida (por ejemplo Vector 21-41) elimina efectivamente virtualmente todos los TSNA cancerígenos de tal tabaco, ya que las nitrosaminas requieren concentraciones relativamente altas de nicotina y otros alcaloides para formarse a niveles detectables . Ver figura 4. Por lo tanto, es ventajoso utilizar tabaco con nicotina reducida en cigarrillos de exposición reducida u otros productos de tabaco para reducir además las nitrosaminas . La nicotina se deja fuera o se introduce posteriormente en el proceso lo cual también puede estar en forma de sales de nicotina. Los hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAHs) se forman a partir de la pirólisis a alta temperatura de aminoácidos, azúcares, parafinas, terpenos, fitoesteroles , celulosas y otros componentes del tabaco. La mayoría de estos componentes se reducen ampliamente en la fibra del tabaco reduciendo efectivamente la formación de PAH. Los catecoles y fenoles, cofactores cancerígenos reconocidos en el humo del cigarrillo, también se reducirían ya que están presentes los niveles bajos de azúcar soluble en la fibra del tabaco. Los compuestos dañinos en fase gaseosa tales como el cianuro de hidrógeno, óxidos de nitrógeno y monóxido de carbono, también se reducen cuando los cigarrillos que contienen solamente fibra de tabaco se fuman en comparación con los cigarrillos hechos con el tabaco de hoja entera. El cianuro de hidrógeno se forma a partir del quemado de proteínas y la clorofila. Los óxidos de nitrógeno se forman a partir de proteínas de quemados solubles, clorofila, nitratos y alcaloides . Estos componentes no estarían presentes en cantidades importantes en el tabaco desproteinizado. La fibra de tabaco tiene aproximadamente un 85% menos de almidones y de material celulósico reduciendo así los precursores pirolíticos importantes del monóxido de carbono. Es otra modalidad de la presente invención producir tabaco reconstituido que incluya fibra de tabaco extraída derivada del tabaco convencional, tabaco transgénico con nicotina reducida o tabaco transgénico con nicotina aumentada . Recon a partir de tabaco secado por congelación. Si el proceso de curado del tabaco es evitado, no estarán presentes virtualmente los TSNA en los productos tradicionales del tabaco tales como cigarrillos, tripa o envoltura para puros, tabaco para enrollar para cigarrillos, tabaco para pipas, tabaco para mascar, tabaco en polvo, tabaco reconstituido y otras preparaciones hechas con tabaco secado por congelación no contendrían virtualmente TSNA ya que se eliminarían los procesos tradicionales de curado. Otra modalidad de la presente invención es la virtual eliminación de los TSNA a través del procesamiento del tabaco recientemente cosechado usando liofilización. Esto se logra al procesar tabaco recientemente cosechado a través de unidades de secado por congelación localizadas cerca de las granjas de tabaco. El tabaco procesado de esta manera puede crecer en una forma tradicional con espaciamiento de plantas o en un entorno de biomasa. Además de las ventajas económicas de eliminar los costos asociados con el proceso de curado, el tabaco puede crecer ahora en una forma de biomasa que puede crear cientos de miles de libras de tabaco fresco por acre . Al crecer el tabaco en un ambiente de biomasa y secar inmediatamente por congelación el tabaco fresco para los cigarrillos, tabaco para enrollar, tabaco para pipa, tripa o envolvente para puros, tabaco para mascar, tabaco en polvo y otras versiones de tabacos sin humo se reduce la mano de obra no solamente al eliminar el transplante de cada planta desde el invernadero al campo, sino también al eliminar el cosechado y curado tradicional del tabaco. También se reduce ampliamente la tierra de cultivo necesaria para este propósito. El concentración de tabaco de un acre de tabaco que crece en biomasa es equivalente a aproximadamente 100 acres de tabaco que crecen en una forma tradicional . La biomasa de tabaco se logra al sembrar directamente un acre de tierra con cantidades copiosas de semilla de tabaco dentro de unas cuantas pulgadas una de la otra en el campo. A diferencia del tabaco plantado con espaciamiento tradicional, las plantas individuales ya no se pueden diferenciar cuando el tabaco se planta en una forma de biomasa. Un acre de biomasa de tabaco tiene la apariencia de una carpeta verde densa continua. Solicitud de Patente publicada de EUA No. 20020197688 describe tales métodos. La liofilización retira la mayoría del agua (-80%) del peso de la biomasa de tabaco fresca cosechada. El resultado es tabaco secado por congelación ("FDT") . El FDT se pulveriza fácilmente en partículas finas adecuadas para procesar en una lámina de tabaco reconstituida (recon) . Este ¾recon" se puede cortar y hacer en cualquier tipo de producto de tabaco tal como un relleno para cigarrillos, tabaco para enrollar, tabaco para pipa, tripa o envolvente para puros, tabaco para mascar, tabaco en polvo y otras formas de tabacos sin humo. Se pueden incorporar saborizantes, aditivos incluyendo azucares dentro del proceso para "recon" . Tal "recon" se puede hacer a partir del 100% de FDT o en cualquier proporción que prefieran los consumidores. El proceso de liofilización puede tener efectos adversos en el sabor .de tales productos de tabaco. Por lo tanto, el FDT se puede incluso mezclar en cualquier porcentaje con el tabaco tradicional pulverizado y curado de manera que la mezcla se pueda hacer en tabaco reconstituido. Alternativamente, FDT se puede mezclar en cualquier porcentaje con cualquier forma de tabaco tradicional dirigido a la manufactura de cigarrillos, tabaco para enrollar, tabaco para pipa, tripa o envolvente para puros, tabaco para mascar, tabaco en polvo y otras versiones de tabaco sin humo con objeto de satisfacer los sabores del mercado masivo. Otra modalidad de la presente invención es el uso de tabaco con nicotina reducida genéticamente modificada para reducir los TSNA como se describen arriba, creando con ello un beneficio adicional tal cigarrillos, tabaco para enrollar, tabaco para pipa, tripa o envolvente para puros, tabaco para mascar, tabaco en polvo y otras versiones de tabaco sin humo, que no son adictivos y sin ningunas nitrosaminas . Es otra modalidad de la presente invención agregar nicotina en cantidades que suministren la respuesta fisiológica deseada devuelta al FDT para usos en cigarrillos, tabaco para enrollar, tabaco para pipa, tripa o envolvente para puros, tabaco para mascar, tabaco en polvo y otras versiones de tabaco sin humo de manera que no contendrán virtualmente TSNA. Los cigarrillos producidos a partir de fibra de tabaco obtenida de la hoja verde tendrían incluso TSNA adicionales reducidos ya que estos se encuentran de manera aplastante en el tabaco curado . En otra modalidad de la presente invención, Nicotiana rustica y/o la Nicotiana tabacum transgénica con nicotina incrementada se secan por congelación después de la cosecha y se incorporan en el "recon" . Los beneficios son que se conserva un alto contenido de alcaloides para cigarrillos con bajo TNR y que se ahorra la etapa de curado del tabaco. También, el incremento asociado en TSNA con tabacos con altos alcaloides no se materializará. Se hace constar que con esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a cabo la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

Reivindicaciones Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones.

1. Un cigarrillo, que comprende una planta de Nicotiana tabacum transgénica incrementada en nicotina, caracterizado porque (i) una relación de rendimiento alquitrán a nicotina de entre alrededor de 3 y alrededor de 8, como se mide por el método FTC o ISO, y (ii) humo de cigarrillo que tiene un pH de alrededor de 5.5 o menor.

2. El cigarrillo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la planta expresa al menos un ácido nucleico heterologo que sobreregula la producción de nicotina en la planta transgénica o porción de planta.

3. El cigarrillo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la planta expresa un ácido nucleico heterologo que codifica al menos un segmento de QPT y PMT.

4. Un método para producir un amortiguador de nicotina, caracterizado porque comprende: a) cruzar una planta de Nicotiana tabacum transgénica incrementada en nicotina con una planta de Nicotiana tabacum incrementada en azúcar; b) seleccionar una planta de progenie de Nicotiana tabacum incrementada en azúcar e incrementada en nicotina; y c) producir un cigarrillo que comprende una porción de la planta de Nicotiana tabacum incrementada en nicotina e incrementada en azúcar.

5. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la planta de Nicotiana tabacum transgénica incrementada en nicotina se produce al : a) transformar una planta de Nicotiana tabacum con un constructo que comprende, en la dirección 5' a 3', un promotor ligado operablemente a un ácido nucleico heterólogo que codifica una enzima o un factor de transcripción que sobreregula la síntesis de nicotina; b) regenerar las plantas de Nicotiana tabacum transgénicas de la planta transformada; y c) seleccionar una planta de Nicotiana tabacum transgénica que tiene un contenido incrementado de nicotina con relación a una planta de control no transformada.

6. Un método para producir un amortiguador de nicotina, caracterizado porque comprende a) proporcionar una planta de Nicotiana tabacum transgénica que expresa una secuencia de ácido nucleico heteróloga que confiere niveles de ácido graso y nicotina elevados, con relación a una planta de control no transformada, y b) producir un cigarrillo que comprende una porción de la planta.

7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la etapa (a) comprende: 1) transformar la planta de Nicotiana tabacum con (i) un primer constructo que comprende, en la dirección 5' a 3', un promotor ligado operablemente a un ácido nucleico heterólogo que codifica una enzima o factor de transcripción que sobreregula la síntesis de nicotina/ y (ii) un segundo constructo que comprende, en la dirección 5' a 3', un promotor ligado operablemente a un ácido nucleico heterólogo que codifica una enzima o factor de transcripción que sobreregula la síntesis de ácido graso 2) regenerar plantas transgénicas de Nicotiana tabacum de la planta transformada; y 3) seleccionar una planta de Nicotiana tabacum transgénica que tiene un contenido de nicotina incrementado y ácidos grasos incrementados con relación a una planta de control no transformada.

8. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la etapa (a) comprende: a) cruzar una planta de Nicotiana tabacum transgénica incrementada en nicotina con una planta transgénica de Nicotiana incrementada en ácido graso; b) seleccionar una planta de progenie de Nicotiana tabacum incrementada en ácido graso e incrementada en nicotina; y c) producir un cigarrillo que comprende una porción de la planta de progenie.

9. Un método para incrementar el contenido de azúcar reducida curada y nicotina en una planta de Nicotiana tabacum, caracterizado porque comprende: a) transformar una planta de Nicotiana que tiene un contenido elevado de azúcar reducida curada con un ácido nucleico que confiere un fenotipo de nicotina incrementado; b) regenerar las plantas de Nicotiana tabacum transgénicas de la planta transformada; y c) seleccionar una planta de progenie que tiene un contenido incrementado de azúcar reducida curado y un contenido de nicotina incrementada con relación a una planta de control no transformada.

10. Un método para incrementar la biosintesis alcaloide en una planta de Nicotiana tabacum o parte de la misma, caracterizado porque comprende: a) transformar una planta de Nicotiana tabacum con al menos una secuencia de ácido nucleico, en donde el ácido nucleico incrementa la expresión de quinolato fosforibosil transferasa y putrescina N-metiltransferasa; b) regenerar las plantas de Nicotiana tabacum transgénicas de la planta transformada; y c) seleccionar una planta que tiene una biosintesis alcaloide incrementada, en donde la planta tiene una expresión de quinolato fosforibosil transferasa y putrescina N-metiltransferasa incrementada con relación a una planta de control no transformada.

11. Una planta de tabaco, caracterizada porgue tiene niveles de nicotina incrementados y alto contenido de azúcar reducido curado, en donde al menos un transgene confiere los niveles incrementados de nicotina.

12. La planta de tabaco de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque la planta tiene un contenido de nicotina mayor de 3.5 por ciento y un contenido de azúcar reducida curada desde entre alrededor del 12 por ciento y alrededor del 30 por ciento.

13. Un método para hacer un producto de tabaco que tiene niveles inferiores de nitrosaminas específicas de tabaco, caracterizado porque comprende: a) proporcionar una planta de Nicotiana tabacum transgénica reducida en nicotina o porción de la planta, en donde la planta o porción de la planta expresa al menos un ácido nucleico heterólogo que subregula la producción de nicotina; b) producir tabaco de la planta transgénica o porción de planta; c) agregar nicotina al tabaco; y d) producir un producto que comprende el tabaco, en donde el producto tiene un nivel inferior de nitrosaminas específicas de tabaco con relación al producto de control que comprende una planta de control no transformada o porción de la planta.

14. Un producto producido por el método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el producto es un tabaco para cigarrillo.

15. El producto de tabaco de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el tabaco para cigarrillo comprende un relleno que tiene un nivel de nitrosaminas específicas de tabaco debajo de alrededor de 0.5 microgramos por gramo de tabaco.

16. El producto de tabaco de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el nivel de nitrosaminas específicas de tabaco es de menos de 0.05 microgramo (50 ppb) por gramo de tabaco.

17. Un método para hacer tabaco reconstituido, caracterizado porque comprende: a) proporcionar material de planta seleccionado del grupo que consiste de (i) una planta de Nicotiana tabacum transgénica incrementada en nicotina o porción de planta, en donde la planta o porción de planta expresa al menos un ácido nucleico heterólogo que sobreregula la producción de nicotina en la planta transgénica o porción de planta; (ii) una planta de Nicotiana tabacum transgénica reducida en nicotina o porción de planta, en donde la planta o porción de planta expresa al menos un ácido nucleico heterólogo que subregula la producción de nicotina en la planta transgénica o porción de planta; (iii) fibra de tabaco desproteinizada o porción de fibra de tabaco; y (iv) secar por congelado el tabaco o porción de tabaco; y b) combinar y reconstituir cualquier combinación del material de planta.

18. Un cigarrillo, caracterizado porque comprende el tabaco reconstituido de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el cigarrillo tiene un rendimiento reducido de compuestos seleccionados de grupo que consiste de hidrocarburos aromáticos policíclicos , nitrosaminas específicas de tabaco, benzo (a) pireno, fenoles, y catecoles con relación al cigarro hecho de una planta de control.