MXPA06001326A

MXPA06001326A - Peptidos antigenicos de artritis reumatoide.

Info

Publication number: MXPA06001326A
Application number: MXPA06001326A
Authority: MX
Inventors: Anne Vogt
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 2003-08-07
Filing date: 2004-07-30
Publication date: 2006-05-04
Also published as: KR20060033923A; BRPI0412668A; CA2532721A1; JP2007527226A; ES2330748T3; EP1654272A2; EP1654272B1; WO2005014622A2; ATE442377T1; RU2359974C2; WO2005014622A3; CN100584858C; RU2006106729A; DE602004023096D1; CN1845936A; AU2004263303A1; US20080193457A1; JP4532486B2; KR100769338B1

Abstract

La presente invencion proporciona peptidos antigenicos de la clase II de MHC procesados naturalmente, novedosos, los cuales se originan de la tiol reductasa lisosomica inducible con interferon ?, integrina beta-2, fosfatitilinositol-4,5-bifosfato 3-cinasa, activador del plasminogeno del tipo de la urocinasa, region V-III de cadena pesada de la inmunoglobulina (VH26), proteina DJ-1, apolipoproteina B-100, subunidad reguladora 8 diferente de la ATPasa de la proteasoma 26S, receptor de la interleucina-1, fibromodulina, receptor de GM-CSF/IL-3/IL-5, nexina 3 clasificada, cadena pesada H4 del inhibidor de inter-a-tripsina, C4 complementaria, C3 complementaria (cadena a), C3 complementaria (cadena ??), proteina 3 semejante y enriquecida en acido glutamico para la aglutinacion al domino de SH3, proteina 1 inducida con interleucina 4, proteina de interaccion con Hsc70, cadena no variable (Ii), proteina 2 de respuesta al receptor del acido retinoico, fibronectina, catepsina B, tripeptidil-peptidasa II, legumaina, receptor del factor de activacion de las plaquetas, poli-2.8-sialiltransferasa, y proteina Rab-11B relacionada con ras. Tambien son provistos peptidos antigenicos y proteinas que son derivados como marcadores para la RA erosiva y/o no erosiva. Ademas, se proporcionan estos peptidos antigenicos enlazados a las moleculas de la clase II de MHC, anticuerpos reactivos con los peptidos antigenicos, acidos nucleicos que codifican los peptidos antigenicos, y construcciones de acidos nucleicos, celulas hospederas y metodos para expresar los peptidos antigenicos. Los peptidos antigenicos de la invencion pueden ser utilizados como marcadores en el diagnostico de RA y en la terapia como vacunas anti-RA.

Description

PEPTIDOS A TIGENICOS DE ARTRITIS REUMATOIDE Descripción de la Invención La presenten invención proporciona péptidos antigénicos de RA (artritis reumatoide, por sus siglas en inglés) procesados de manera natural, novedosos, los cuales son los marcadores candidatos para la RA erosiva y no erosiva. Estos péptidos antigénicos son presentados por las moléculas de HLA-DR de la clase II de MHC humanas. Además, estos péptidos antigénicos enlazados a las moléculas de la clase II de MHC, así como los anticuerpos reactivos con los péptidos antigénicos, los ácidos nucleicos que codifican los péptidos antigénicos, y las construcciones de ácido nucléico y las células hospederas para expresar los péptidos antigénicos, son provistos. Los péptidos antigénicos de la invención así como los polipéptidos de los cuales son derivados los mismos pueden ser utilizados como marcadores en el diagnóstico de RA y en terapia como vacunas anti-RA. La artritis reumatoide (RA) , originalmente llamada poliartritis crónica, es una enfermedad autoinmune sistémica y una de las formas más debilitantes de la inflamación articular (Feldamn, M. et al., Cell 85 (1996) 307-310; Dedhia, H.V. & DiBartolomeo, A., Critical care clinics 18 (2002) 841-854) . Típicamente, la RA provoca dolor de las articulaciones, deformidades y rigidez severa de las articulaciones. La enfermedad también puede tener su Eef.169534 manifestación de .manera externa a las articulaciones, especialmente en pacientes que son positivos para un autoanticuerpo, llamado factor "reumatoide" (RF) (Mageed, R.A. en: van Venrooij , W.J. & Maini, R.N. eds . , Manual of biological markers of disease, Kluwer Academic Publishers (1996) 1-18) . La RA se presenta muy frecuentemente en la población caucásica con susceptibilidad a RA que está influida por la genética y factores ambientales. Ambos tiene un efecto crucial sobre el inicio y el progreso de esta enfermedad autoinmune. Aproximadamente 4% de la población total tiene una susceptibilidad genética incrementada a la RA, aproximadamente 20% de la cual (alrededor de 1% de la población total) desarrolla RA como un resultado de, aún todavía, factores no hereditarios no caracterizados. Más allá de esto, la RA muestra una desviación significativa en la proporción del sexo: las mujeres tienen un riesgo tres veces más elevado para la RA que los hombres, indicando que las hormonas del sexo también pueden estar involucradas en la patogénesis . Al inicio, la RA progresa lentamente. Los síntomas de la etapa inicial típicos son sudor de las palmas, rigidez matutina de los dedos e inflamación de las articulaciones simétricas. Además, pueden aparecer nodulos reumáticos que son una indicación de esta afección del tejido- fuera de las articulaciones. En un modelo simplificado, el sistema inmune produce anticuerpos contra el tejido sano. Estos anticuerpos atacan .al cartílago articular en la articulación conduciendo a su inflamación y. más tarde a su destrucción. Esta destrucción estimula al sistema inmune a producir más autoanticuerpos . Además, las citosinas semejantes a la interleucina-1 (IL-1) y el factor alfa de la necrosis del tumor (TNF-oc) son producidos, los cuales mejoran la reacción inflamatoria aún adicionalmente (Houssian, F.A., Clin Rheumatol 14 Suppl. 2 (1995) 10-13) . La sinovia empieza a hincharse debido a la infiltración de células adicionales del sistema inmune, tales como macrófagos y células T. Estas células están involucradas activamente para provocar la muerte celular adicional y en la promoción de la inflamación de las articulaciones (Fox, D.A. Arthritis Rheum 40 (1997) 598-609: Choy, E.H. & Panayi, G.S., N Engl J Med 344 (2001) 907-916) . Este proceso se asemeja a un círculo vicioso de producción de autoanticuerpos, inflamación de las articulaciones y destrucción de las articulaciones. Típicamente, . la RA progresa crónicamente, con 85-90% de todos los paciente de RA que muestran un desarrollo de la enfermedad de ligero a moderado. La enfermedad agresiva se forma conduciendo a una pérdida completa de la función de la articulación hasta que el grado de invalidez es experimentado por 10-15% de los pacientes. En este estado de RA avanzada, los pacientes tienen una inflamación articular permanente y exhiben nodulos reumatoides . Los mismos padecen de dolor crónico fuerte y la inflamación conduce a una rigidez severa de los dedos y a deformaciones irreversibles de las articulaciones o dislocaciones. Diagnóstico Existe una evidencia creciente de que la intervención terapéutica al principio de la enfermedad puede reducir el grado de daño de las articulaciones (Egsmose, C. et al., J Rheumatol 22 (1995) 2208-2213; Van der Heide, A. et al., Ann Intern Med 124 (1996) 699-707). Puesto que el tratamiento con varios fármacos antirreumáticos modificadores de la enfermedad (DMARDs) está justificado solamente cuando las relaciones de riesgo-beneficio o de costo-eficacia, son favorables, es obligatorio ser capaces de diferenciar entre RA y otras formas de artritis brevemente después del inicio de la enfermedad (Kirwan, J.R. & Quilty, B., Clin Exp Rheumatol 15 (1997) 15-25). El diagnóstico se hace por los criterios establecidos basado en la historia clínica, el examen físico y pruebas de laboratorio. La American Society of Rheumatism publicó un catalogo de criterios para ayudar a obtener evidencia efectiva de la RA (Arnett, F.C. et al., Arthritis Rheum 31 (1987) 315-324) . Pero en cuanto a esto, ninguna prueba única está disponible la cual sea específica para RA. Varios marcadores biológicos y bioquímicos, por ejemplo la proteína reactiva C (CRP) , la velocidad de sedimentación de los eritrocitos (E3R) , los anticuerpos antinucleares (ANA) o RF son utilizados para la evaluación de RA. Sin embargo, estos marcadores son no específicos, porgue los mismo aparecen también en otras enfermedades autoinmunes o inflamatorias. La RF, por ejemplo, es un autoanticuerpo que está presente en el suero de aproximadamente 50 % de los pacientes de RA. Puesto que los niveles incrementados de los mimos autoanticuerpos también pueden ser encontrados en el contexto de otras enfermedades inflamatorias, tal como el síndrome de Sjogren, la endocarditis o hepatitis crónica, la RF es inadecuada para servir como uñ marcador de diagnóstico para RA. En lugar de que sea de valor diagnóstico per se, los marcadores bioquímicos y biológicos mencionados anteriormente son útiles para evaluar la actividad de la enfermedad y el pronóstico así como en el tratamiento y manejo de los pacientes de RA (Nakamura, R.M. J Clin Lab Anal 114 (2000) 305-313) . Recientemente, un conjunto de criterios de diagnóstico fue desarrollado que consiste de aspectos clínicos y bioquímicos que fueron reivindicados para discriminar, en un estado inicial, entre la RA erosiva, persistente y la RA no erosiva, persistente, auto-limitante (Visser, H. et al., Arthritis Rheum 46 (2002) 357-365) . La artritis auto-limitante estuvo caracterizada por la remisión natural: no existió artritis en el examen de un paciente durante un cierto periodo de tiempo. La artritis erosiva fue definida con base en la presencia de erosiones sobre las radiografías de las manos y/o de los pies. En particular, el uso de anticuerpos que reconocen los péptidos citrulinados cíclicos parece que va a ser promisorio y sugiere un papel importante para los antigenos citrulinados en el pronóstico y diagnóstico inicial de la RA erosiva (Schellekens, G.A. et al., J Clin Invest 101 (1998) 273-281; Vincent, C. et al, J Rheumatol 25 (1998) 838-846) . El reconocimiento inicial de la RA erosiva permite la intervención inicial con DMARDs, las cuales conducirán al control inicial de la enfermedad y a la mejora de las desventajas de la enfermedad (Symmons, D.M.P. et al., J Rheumatol 25 (1998) 1072-1077; Anderson, J.J. et al., Artritis Rheum 43 (2000) 22-29). De manera semejante, el reconocimiento inicial de la artritis auto-limitante y no erosiva prevendrá el tratamiento innecesario con características terapéuticas potencialmente tóxicas (Fríes, J.F. et al., Arthritis Rheum 36 (1993) 297-306. Terapia La meta de cualquier terapia anti-reumática es aliviar el dolor para facilitar las actividades de la vida diaria. En cuanto a esto, un sanado completo de la RA no es posible, pero aplicando terapias modernas el progreso de la enfermedad puede ser más lento y aún detenido. Debido a las diferencias individuales, cada paciente requiere una terapia individualizada y. un diagnóstico inicial, como se mencionó anteriormente, es deseable. La terapia de RA es compleja e incluye un tratamiento medicinal que prolongue la vida asi como la fisio y radioterapia. Los DMARDs utilizados en la terapia de RA son características terapéuticas básicas (por ejemplo metotrexato, sulfasalazina, hidroxicloroquina, leflunomida, Azatioprina) , cortisona, fármacos antiinflamatorios no esferoidales (NSAID) o anticuerpos monoclonales contra las citocinas pro-inflamatorias TNF-a, IL-?ß o sus receptores respectivos (http : //rheuma-on line.de) . Estos fármacos todos tienen en común que los mismos son inhibidores de la inflamación por la supresión de la respuesta inmune. La desventaja principal es su falta de especificidad hacia la RA, sus efectos adversos y su incapacidad para ubicar como blanco de manera efectiva las causas do la RA. Autoinmunidad Las pruebas de autoinmunidad empiezan cuando una respuesta inmune adaptable específica es iniciada contra los antígenos propios (autoantígenos) manifestados por el desarrollo de las células T o B auto-reactivas. La consecuencia normal de una respuesta inmune adaptable contra un antígeno extraño es la depuración del antígeno del cuerpo. Sin embargo, cuando se desarrolla una respuesta inmune adaptable contra un auto-antígeno, el antígeno en muchos casos' puede no ser removido completamente del cuerpo, conduciendo a una respuesta inmune sostenida. Como consecuencia, los mecanismos efectores de inmunidad provocan una lesión inflamatoria crónica a los tejidos. Los mecanismos de daño del tejido son esencialmente los mismos en la enfermedad autoinmune que aquellos que operan en la inmunidad protectora y en la hipersensibilidad. Aunque no es bien entendido que es lo que desencadena la autoinmunidad, varios eventos que no se cree en nuestros días que contribuyen a la inducción de las enfermedades autoinmunes y la selección de objetivos auto-antigénicos ha sido resumidos muy recientemente (Marrack, P. et al., Nat Med 7 (2001) 899-905) . Las enfermedades autoinmunes son controladas por las propiedades de los genes particulares de cada factor individual y del medio ambiente. Los genes hospederos afectan la susceptibilidad a la autoinmunidad al menos en tres niveles. En primer lugar, algunos de los genes afectan la reactividad total del sistema inmune, y, por consiguiente, pueden predisponer al individuo a ciertos o a varios tipos diferentes de enfermedades autoinmunes. En segundo lugar, esta inmunorreactividad ' alterada está dirigida a autoantigenos y tejidos particulares por otros genes que afectan el reconocimiento de los péptidos antigénicos por las células T. En tercer lugar, todavía otros genes actúan sobre la capacidad de los tejidos objetivo para modular el ataque inmune , por ejemplo teniendo influencia en la actividad de las células efectoras del sistema inmune que están destinadas a iniciar un ataque autoagresivo . Estos dos últimos conjuntos de genes dictan cuales genes- serán los objetivos de la autoinmunidad y por consiguiente cuales órganos serán atacados y que daño ocurrirá. Además, las señales del medio ambiente tienen influencia en el desarrollo de la autoinmunidad a los mismos tres niveles, afectando la reactividad total del sistema inmune, la especificidad del antigeno y el estado del tejido objetivo potencial. Y finalmente, existen una comunicación cruzada entre los factores genéticos y del medio ambiente. Complejo principal de histocompatibilidad (MCE) (por sus siglas en inglés) Los estudios de la población, los métodos de formación de genotipos y los métodos modernos a nivel molecular han mostrado unánimemente que ciertos genes codificados por el complejo de histocompatibilidad principal (MHC) confieren un riesgo significativamente más elevado para el desarrollo de RA (Stastny, P., Tissue Antigens 4 (1974) 571-579; Words orth, P. et al., PNAS 86 (1989) 10049-10053; Wordsworth, P. & Bell, J. Springer Semin Immunopathol 14 (1992) 59-78) . En particular, los alelos HLA-DBR1*0101, *0401, *0404 y *0405 de MHC de la clase II en varios grupos étnicos incrementan la susceptibilidad a RA (Reveille, J.

Curr Opin Rheumatol 10 (1998) 187-200) . Por ejemplo, más de 90 % de los' pacientes con RA positivos a RF llevan uno de estos alelos de susceptibilidad. Las moléculas de la clase II de HLA son proteínas de la superficie de MHC que se aglutinan a los péptidos antigénicos dentro de la célula y los presentan sobre la superficie de las células que presentan el antígeno para la interacción con los receptores de la célula T de los linfocitos T auxiliadores de CD4+, iniciando por esto una respuesta inmune celular (Banchereau, J. y Steinman, R.M., Nature 392 (1998) 245-252) . La asociación de RA de las moléculas de la clase II de HLA particulares junto con la presencia de números grandes de células T de CD4+ activada en el te ido sinovial ha soportado el modelo de la inducción de la enfermedad en el cual las moléculas de HLA-DR asociadas con la enfermedad presentan autoantigenos relevantes para la enfermedad (por ejemplo sinoviales) y provocan la estimulación y expansión de las células T sinoviales, lo cual puede promover entonces el proceso inflamatorio (Striebich, C.C. et al., J Immunol 161 (1998) 4428-4436) .' Las proteínas de HLA-DR de la clase II de MHC (de manera abreviada: DR) son heterodímeros que consisten de cadenas monomórficas y ß extremadamente polimórficas que se aglutinan a los antígenos del péptido en una ranura de aglutinación del péptido. Esta ranura generalmente tiene cuatro cavidades principales para aceptar las cadenas laterales en las posiciones relativas 1, 4, 6 y 9 del péptido (Stern, L.J. et al., Nature 368 (1994) 215-221) . Las variaciones alélicas entre las moléculas de la clase II de HLA se toman en cuenta para la capacidad diferencial para aglutinar a los péptidos antigénicos. Esto es algo racional porque los individuos que difieren en sus alelos de HLA tiene repertorios de péptidos antigénicos divergentes, por lo cual conducen a diferencias en la calidad de las respuestas inmune (Messaoudi, I. et al., Science 298 (2002) 1797-1800) . Los péptidos unidos por las moléculas de MHC de la clase II son típicamente más largos y más homogéneos en su tamaño (11-25 aminoácidos) que los péptidos unidos por las moléculas de MHC de la clase I (8-10 aminoácidos) . Esta diferencia surge a causa de que la ranura de aglutinación del péptido de las proteinas de la clase II está abierta y mientras que los péptidos son sujetados en la parte media, sus extremos pueden extenderse fuera de la ranura de un modo variable (Jones, E.Y. Curr Opin Immunol 9 (1997) 75-79) . Como consecuencia, las moléculas de la clase II típicamente se aglutinan a conjuntos de péptidos superpuestos que comparten una secuencia central común, llamada "epítopo de la célula T", pero tienen diferentes longitudes. Hace más de una década, se -reconoció que las cadenas de DRp codificadas por los alelos de DRB1 enlazados a RA, aunque exhiben diferencias polimórficas, todos comparten una extensión de aminoácidos idénticos o casi idénticos en las posiciones 67-74, conocidos como el "epitopo compartido" (Gregersen, P.K. et al., Arthritis Rheum 30 (1987) 1205-1213) . Puesto que la inmunidad para los autoantigenos ha sido considerada como un asunto central con respecto a la patogénesis de RA, se tiene la hipótesis de que el epitopo compartido podría imponer un enlace de enfermedad sobre las moléculas de DR respectivas por al menos dos mecanismos diferentes: en primer lugar, seleccionando los péptidos autoantigénicos relevantes para la presentación, y en segundo lugar, por la selección de las especificidades de la célula T auto-reactivas apropiadas durante la ontogenia. La estructura tridimensional de las moléculas de DR ha revelado realmente que el epitopo compartido está localizado en el centro de la hélice a que flanquea un lado de la ranura de aglutinación del péptido (Stern, L.J. et al., Nature 368 (1994) 215-221) . Por consiguiente, estratégicamente esta región del epitopo compartida está colocada de tal manera que pueda interactuar tanto con el péptido unido como con el receptor de la célula T. Sin embargo, uno de los misterios no resueltos en la investigación de la reumatología es la cuestión de que son los antígenos y epítopos artritogénicos clave en el hombre los que desencadenan el inicio y el desarrollo de la RA. Aunque los autoanticuerpos de diferente especificidad han sido identificados en el suero y el fluido sinovial de pacientes, frecuentemente no está claro que los antigenos si los antigenos que fueron liberados en el tiempo de la degradación del cartílago, estuvieron iniciando la patogenicidad o si los mismos son solamente una consecuencia de la dispersión del antígeno como resultado de la inflamación (Corrigall, V.M. & Panayi G.S. Crit Re Immunol 22 (2002) 281-293) . Además es difícil definir los mecanismos patógenos en los cuales el antígeno está presente en todo el cuerpo, incluyendo las articulaciones pero la patología está ubicada de manera única o predominante con respecto a la articulació . Autoantígenos El gran número de posibles autoantígenos en RA es derivado de los estudios que utilizan el suero o, menos frecuentemente, las células T de los pacientes con RA crónica establecida. Uno de los antígenos específicos de las articulaciones más convincentes que ha sido propuesto en el contexto de las moléculas de DR, es el colágeno del tipo II (CII), la proteína predominante en el cartílago articular. Los autoanticuerpos contra CII fueron encontrados en concentraciones elevadas en el suero y en las articulaciones de pacientes con RA aunque no está claro todavía ya sea si cualesquiera anticuerpos de anti-CII son patógenos en RA (Banerjee, S. et al., Clin Exp Rheumatol 6 (373-380) . Snowden y colaboradores han mostrado que las células T de la sangre periférica, de los pacientes con RA, proliferaron hasta CII, aún más pronunciado en aquellos pacientes con anticuerpos anti-CII . Sin embargo, la respuesta fue observada solamente en 50 % de los pacientes (Snowden, N. et al., Rheumatology 40 (1997) 1210-1218) . En una inmunización de modelo de ratón con CII se mostró que induce la artritis en los ratones que expresan los alelos DRB1*0401 y *0101 de MHC de la clase II (Rosloniec, E.F. et al., J. Exp Med 185 (1997) 1113-1122; Rosloniec, E.F. et al., J. Immunol 160 (1998) 2573-2578) . El epitopo inmunodominante en los ratones transgénicos tanto de *0401 como de *0101 estuvo localizado con respecto a los péptidos dentro de los residuos 261-273 de CII humana (Fugger, L. et al., Eur J. Immunol 26 (1996) 928-933) . El mismo epitopo de CII fue capaz de estimular una respuesta de la célula T con pacientes con RA, particularmente en las etapas iniciales de la enfermedad. Las células T del fluido sinovial tuvieron una respuesta especial (Kim, H.Y. et al., Arthritis Rheum 42 (1999) 2085-2093) . Aunque otras proteínas del cartílago han sido propuestas como antígenos candidatos de RA, los epítopos de aglutinación de R4 han sido definidos solamente para la glucoproteína 39 del cartílago humano (HCgp39) . Esta proteína es secretada por las células sinoviales y los condrocitos articulares y su expresión es regulada ascendentemente en el plasma y las articulaciones durante la inflamación (Vos, K. et al., Ann Rheum Dis 59 (2000) 544-548) . De manera semejante a la CII, el tratamiento de HCgp39 induce la artritis en los ratones. Además de una respuesta de HCgp39 de las células T de la sangre periférica de los pacientes con RA fue detectada (Verheijden, G.F. et al., Arthritis Rheum 40 (1997) 1115- 1125) . El epitopo predominante reconocido por las células T en los pacientes con DR4 estuvo definido entre los residuos 263-275 e idénticos al epitopo inmunodominante encontrado en los ratones transgénicos de DRB1*0401 después de la inmunización con HCgp39 natural (Cope, A.P. et al., Arthritis Rheum 42 (1999) 1497-1507) . Aunque no son especificas para la enfermedad, las respuestas a este péptido se correlacionaron con la actividad de la enfermedad en pacientes con RA (Baeten, D. et al.r Arthritis Rheum 43 (2000) 1233-1243). Los anticuerpos para HCgp39, sin embargo también han sido detectados en los sueros de pacientes con enfermedades inflamatorias, tales como la enfermedad inflamatoria del • intestino y lupus eritematoso sistémico (SLE) , quizás a un' nivel inferior que en RA. En un intento de rastrear las células T específicas del antígeno en RA, los complejos tetraméricos del péptido soluble-DR4 fueron utilizados para detectar las células T de CD4+ sinoviales con CII o HCgp39 en pacientes con DR4+ (Kotzin, B.L. et al, PNAS 97 (2000) 291-296). El complejo de CII-DR4 se unió de una manera especifica a los hibridomas de la célula T reactiva con el péptido CII, pero no tiñe una fracción detectable de las células de CD4+ sinoviales. Se obtuvieron resultados casi semejantes con el complejo de HCgp39-DR4 sugiriendo que las expansiones de la célula ? de CD4+ oligoconal, principales, presentes en las articulaciones con RA no son específicas para los determinantes de CII y HCgp39 dominantes descritos anteriormente. En resumen, a pesar de unas indicaciones fuertes para una asociación de CII y HCgp39 con RA, la evidencia de que las mismas son antigenos importantes en RA es pequeña. Una prueba directa de que los péptidos de CII o HCgp39 son presentados de una manera restringida para MHC de la clase II por las células que presentan el antígeno con estimulación y activación subsiguiente de las células T de CD4+ sinoviales está todavía faltando. Además, un problema principal de los modelos de animales es su relevancia desconocida para RA porque la artritis inducida con CII por la inmunización de ratas o ratones difiere en muchos aspectos de la RA. Péptidos asociados con la clase II de MHC procesados de manera natural Una estrategia alternativa para la identificación de los autoanticuerpos específicos para RA y las células T está basado en el análisis de secuencias de los antígenos del péptido procesados de manera natural unidos a las moléculas de la clase II de MHC. Con la ayuda de los anticuerpos monoclonales, las moléculas de MHC de la clase II que confieren susceptibilidad a RA pueden ser purificados de las células análogas. Los antigenos del péptido asociado con RA pueden ser eluidos con ácidos a partir de las moléculas de la clase II de HLA purificadas. La mezcla de péptidos pequeños puede ser separada por CLAR y la secuencia del péptidos puede ser determinada por secuenciación de Edman o espectrometría de masa. Debido a las limitaciones con las técnicas de purificación y secuenciación de péptidos, las secuencias de péptidos" fueron obtenidas solamente, de manera todavía adicional, de las moléculas de MHC que han sido aisladas de las líneas de las células B cultivadas o cantidades grandes de tejido, y el análisis fue restringido a pocos péptidos abundantes ( ropshofer et al., J. Exp. Med. 175 (1992) 1799-1803; Chicz, R.M. et al., J. Exp Med 178 (1993) 27-47) . Como resultado del desarrollo de columnas de CLAR microcapilares de alta resolución y espectros de masa más sensibles, los péptidos unidos a MHC pueden ser analizados de manera más eficiente (Dongre, A.R. et al., Eur J. Immunol 31 (2001) 1485-1494; Engelhard, V.H. et al., Mol Immunol 39 (2002) 127-137) . En la presente invención, una técnica de aislamiento y secuenciación de péptidos modificados, fue utilizada para investigar el repertorio de antígenos del péptido de las moléculas de HLA-DR4 derivadas de las células de dendriticas autólogas (DCs) (por sus siglas en inglés) que fueron sometidas a impulsos de suero o fluido sinovial derivado de los pacientes con RA. La ventaja principal de este método nuevo es el uso de DCs humanas que son profesionales en el procesamiento y participación del antigeno relevante para RA, en lugar de usar modelos animales transgénicos o lineas celulares B artificiales. Las DCs están enriquecidas en el tejido y el fluido sinovial reumatoide y son derivadas de precursores inmaduros circulantes (Thomas, R. et al., J. Immunol 152 (1994) 2613-2623) . Las mismas son las células que presentan el antigeno más potente, las cuales expresan niveles elevados de moléculas de MHC junto con una variedad de moléculas accesorias (Mellman, I. et al, Trends Cell Biol 8 (1998) 231-237) . En un estudio más reciente se mostró que las DCs humanas diferenciadas ex vivo y los macrófagos que son semejantes fenotípicamente a las células que presentan el antigeno y a las articulaciones sinoviales con RA, fueron capaces de generar y presentar epitopos inmunodominantes de CII y HCgp39 (Tsark, E.C. et al J. Immunol 169 (2002) 6625-6633) . La DC tiene la capacidad para cebar las células T auxiliadoras de CD4+ y para activar de manera efectiva las células T de CD8+ citotóxicas (Ridge, T. et al, Nature 393 (1998) 474-478) . Por consiguiente, los péptidos unidos a las moléculas de la clase II de HC y presentadas por DCs desempeñan un papel superior en la patogénesis de enfermedades que involucran respuestas inmune activadas por la célula T. Por lo tanto, el problema planteado por la falta de conocimiento de los péptidos antigénicos respectivos de la clase II de MHC para RA es resuelto por la provisión de péptidos antigénicos de RA asociados con la clase II de MHC procesados naturalmente, novedosos, y los polipéptidos son derivados como marcadores para RA. La presente invención proporciona péptidos antigénicos procesados naturalmente, novedosos, los cuales son marcadores de RA candidatos en RA erosiva y no erosiva. Estos péptidos antigénicos son presentados por las moléculas de HLA-DR de la clase II de MHC humanas, derivadas de las células dendriticas que fueron sometidas a impulsos con el fluido sinovial o el suero derivado de los pacientes con RA erosiva o no erosiva, establecida. El péptido antigénico de la clase II de MHC de la invención, está comprendiendo (a) al menos una secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOs . 49 a 57 y SEC ID NOs . 103 a 122, o (b) al menos la secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOs. 49 a 57 y las SEC ID NOs. 103 a 122 con secuencias de flanqueo N- y C-terminales, adicionales, de una secuencia correspondiente seleccionada del grupo que consiste de las -SEC ID NOs . 1 a 39 o las SEC ID NOs. 58 a 102, y se origina de la tiol reductasa lisosómica inducible con interferón ?, integrina beta-2, fosfatitilinositol- , 5-bifosfato 3-cinasa, activador de plasminógeno del tipo de urocinasa, región V-III de la cadena pesada de inmunoglobulina (VH26) , proteina DJ-1, apolipoproteina B-100, subunidad reguladora 8 diferente de la ATPasa de proteasoma 26S, receptor de interleucina-1, fibromodulina, receptor GM-CSF/IL-3/IL-5, nexina 3 clasificada, cadena pesada H4 del inhibidor de inter-a-tripsina, C4 complementaria, C3 complementaria (cadena a) , C3 complementaria (cadena ß) , proteina 3 semejante y enriquecida en' ácido glutámico de aglutinación al dominio SH3, proteina 1 inducida por la interleucina-4 , hemopexina, proteina de interacción con Hsc70, cadena no variable (Ii) , proteina 2 de respuesta al receptor del ácido retinóico, fibronectina, catepsina B, tripeptidil-peptidasa II, legumaina, receptor del factor de activación de las plaquetas, poli-alfa-2.8-sialyltransferasa, y proteina Rab-llB relacionada con ras. Las presente invención también proporciona estos péptidos antigénicos y las proteínas de las cuales son derivadas las mismas como marcadores para la RA erosiva y/o no erosiva. Además, estos péptidos antigénicos relacionados con las moléculas de la clase II de MHC, asi como de los cuerpos reactivos con los péptidos antigénicos, los ácidos nucléicos que codifican los péptidos antigénicos, y las construcciones de ácido nucléico, las células hospederas y los métodos para expresar los péptidos antigénicos, son provistos. Los métodos adicionales son provistos para el aislamiento e identificación de los péptidos antigénicos de RA. Figura 1. Esquema del análisis mediado por las células dendriticas (DC) (por sus siglas en inglés) de las muestras del tejido: las células dendriticas (DCs) , las células qtie presentan el antigeno más especializado (APCs) (por sus siglas en inglés) , son llevadas en contacto con una fuente de antigeno (por ejemplo el fluido sinovial) bajo condiciones óptimas para la recepción del antigeno y el procesamiento del antígeno. Como un control, las DCs son cultivadas bajo las mismas condiciones en la ausencia de los antigenos del fluido sinovial. Después de la maduración de las DCs, las moléculas de la clase II de MHC cargadas con el antigeno son purificadas y los péptidos antigénicos asociados con la clase II de MCH respectivos, son aislados e identificados . Figura 2?: Cromatograma de picos base de ION-TRAP MS de los péptidos antigénicos asociados con la clase II de MHC que fueron aislados de las células dendriticas a las que les aplicaron impulsos del suero de un paciente con RA. Los péptidos fueron eluidos directamente desde una columna RP-C18-HPCL en el espectrómetro de masa con trampa de iones para identificación de MS/MS inmediata. Los números indican los tiempos de retención (valor superior) y las masas moleculares (valor inferior) de los picos del péptido más prominente en la mezcla, en el tiempo respectivo. Figura 2B: Espectro de ION-TRAP MS de los péptidos antigénicos a un tiempo de retención de 65.4 min. El pico marcado fue fragmentado adicionalmente y correspondió a un ion del péptido doblemente cargado desde el inhibidor ITIH4 de inter-alf -tripsina (cotéjese la tabla 3) . Figura 2C: Espectro de ION-TRAP MS/MS del ion del péptido doblemente cargado en m/z 977·.1. Las masas de f agmentación, junto con la masa del ion original, fueron investigadas contra una base de datos humana más redundante utilizando el algoritmo SEQUEST. La secuencia recuperada MPKNWFV1DKSGSMSGR (código de una letra) , correspondió al epitopo dominante ITIH4 (271-288) del inhibidor de inter-alfa-trisina . Las posiciones de las series asignadas de los iones B N-terminales y los iones Y C-terminales, están marcadas . Figura 3 : Resumen de la capacidad de aglutinación diferencial de los antigenos de RA candidatos, probados, en el contexto de la aglutinación al alelo HLA-DRB*0401. La porción de aglutinación HLA-DRB1*0401 putativa está encerrada en un cuadro con fondo gris y como una medida de la afinidad, la concentración del péptido fue determinada y que es aquella que se determinó que es necesaria para reducir la aglutinación de una cantidad fija del péptido HA(307-319) biotinilado en 50 % (IC50) por medio de competición. El reciproco (1/IC50) se correlaciona directamente con la afinidad del péptido. Como un reportero, el péptido de HA(307-319) biotinilado de la hemaglutinina de la influenza (Rothbard, J.B. et al., Cell 52 (1988) 515-523) fue incluido en el estudio. Los péptidos antigénicos de la invención son péptidos, los cuales están asociados con y presentados por las moléculas de MHC y por lo cual pueden tener el potencial para activar o tolerar las células T. Los péptidos antigénicos presentados por las moléculas de la clase II de MHC por lo tanto son péptidos antigénicos de la clase II de MHC o asociados con la clase II de MHC, mientras que los péptidos antigénicos presentados por las moléculas de la clase I de MHC son péptidos antigénicos de la clase I de MHC o asociados con la clase I de MHC. Los péptidos que son derivados de las proteínas que son codificadas en el genoma del cuerpo o un APC son denotados como "auto-péptidos" . La función principal de los auto-péptidos presentados por las DCs en los órganos linfoides periféricos se piensa que va a ser la inducción de la tolerancia de la célula T a las auto-proteínas. La tolerancia es la falla para responder a un antígeno; cuando este antígeno es llevado por los propios tejidos, la tolerancia es llamada auto-tolerancia. Los antígenos que son derivados del propio cuerpo de un individuo, son llamados "antigenos propios" o "auto-antígenos". üna respuesta inmune adaptable dirigida contra los auto-antígenos es llamada una respuesta autoinmune. De manera semejante, la inmunidad adaptable específica para los auto-antígenos es llamada autoinmunidad. La autorreactividad describe la respuesta inmune dirigida contra los auto-antígenos. La RA es probablemente debido a una respuesta autoinmune que está basada en el involucramiento de las células T auto-reactivas y/o anticuerpos auto-reactivos. El péptido inmunogénico incluye, pero no está limitado a, un péptido antigénico capaz de provocar o estimular una respuesta inmune celular o humoral. Tales péptidos también pueden ser reactivos con anticuerpos. Los péptidos derivados de las proteínas codificadas en el genoma de la bacteria, virus u otros invasores extraños y que difiere de las auto-proteínas, son llamados péptidos "extraños" o w antígenos extraños". Los mismos son capaces de producir una respuesta de la célula T contra las proteínas extrañas que son derivadas de las mismas. Los péptidos antigénicos de RA son auto-péptidos que funcionan como auto-antigenos y como una consecuencia de la enfermedad desencadenan erróneamente una auto-reactividad contra los propios tejidos. La presente invención proporciona un péptido antigénico de la clase II de MHC que comprende: (a) al menos una secuencia de aminoácido de la porción de aglutinación del péptido seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOs. 49 a 57 y SEC ID NOs . 103 a 122, o (b) al menos la secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido seleccionado del grupo que consiste de las SEC ID NOs. 49 a 57 y las SEC ID NOs . 103 a 122, con secuencias de flanqueo N- y C-terminales , adicionales, de una secuencia correspondiente seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOs. 1 a 39 o las SEC ID NOs. 58 a 102. Preferentemente, el péptido antigénico de la clase II de MHC tiene una longitud de menos de 26 aminoácidos, más preferentemente una longitud de 11 a 25 aminoácidos. Es aún más preferido el péptido antigénico de la invención con una longitud de 11 a 19 aminoácidos. Es más preferido el péptido antigénico de la invención que consiste de la porción de aglutinación del péptido que comprende los cuatro aminoácidos de fijación. La presente invención también proporciona un péptido antigénico de la clase II de MHC que comprende: (a) al menos la secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido de la SEC ID NO. 49, o (b) al menos la secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido de la SEC ID NO. 49 con secuencias de flanqueo N y C-terminales adicionales de una secuencia correspondiente seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOs. 1 a 3. Además, se proporciona un péptido antigénico de la clase II de MHC que comprende: (a) al menos la secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido de la SEC ID NO. 103, o (b) al menos la secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido de la SEC ID NO. 103 con secuencias de flanqueo N y C-terminales adicionales de la secuencia correspondiente de las SEC ID NOs. 58 y 59. Además, se proporciona un péptido antigénico de la clase II de MHC que comprende: (a) al menos la secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido de la SEC ID NO. 104, o (b) al menos la secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido de la SEC ID NO. 104 con secuencias de flanqueo N y C-terminales adicionales de la secuencia correspondiente de la SEC ID NO. 60. Además, se proporciona un péptido antigénico de la clase II de MHC que comprende: (a) al menos la secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido de la SEC ID NO. 105, o (b)' al menos la secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido de la SEC ID NO. 105 con secuencias de flanqueo N y C-terminales adicionales de la secuencia correspondiente de la SEC ID NO. 61. Además, se proporciona un péptido antigénico de la clase II de MHC que comprende: (a) al menos la secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido de la SEC ID NO. 105, o (b) al menos la secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido de la SEC ID NO. 106 • con secuencias de flanqueo N y C-terminales adicionales de la secuencia correspondiente de la SEC ID NO. 62. Además, se proporciona un péptido antigénico de la clase II de MHC que comprende: (a) al menos la secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido de la SEC ID NO. 107, o (b) al menos la secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido de la SEC ID NO. 107 con secuencias de flanqueo N y C-terminales adicionales de la secuencia correspondiente de la SEC ID NO. 63. Además, se proporciona un péptido antigénico de la clase II de MHC que comprende: (a) al menos la secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido de la SEC ID NO. 50, o (b) al menos la secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido de la SEC ID NO. 50 con secuencias de flanqueo N y C-terminales adicionales de la secuencia correspondiente de la SEC ID NO. 5. Además, se proporciona un péptido antigénico de la clase II de MHC que comprende: (a) al menos la secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido de la SEC ID NO. 108, o (b) al menos la secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido de la SEC ID NO. 108 con secuencias de flanqueo N y C-terminales adicionales de la secuencia correspondiente de las SEC ID NOs . 64 a 67. Además, se proporciona un péptido antigénico de la clase II de MHC que comprende: (a) al menos la secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido de la SEC ID NO. 109, o (b) al menos la secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido de la SEC ID NO. 109 con secuencias de flanqueo N y C-terminales adicionales de la secuencia correspondiente de la SEC ID NO. 68. Además, se proporciona un péptido antigénico de la clase II de MHC que comprende: (a) al menos la secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido de la SEC ID NO. 110, o (b) al menos la secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido de' la SEC ID NO. 110 con secuencias de flanqueo N y C-terminales adicionales de la secuencia correspondiente de las SEC ID NOs. 69 y 70. Además, se proporciona un péptido antigénico de la clase II de MHC que comprende: (a) al menos la secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido de la SEC ID NO. 111, o (b) al menos la secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido de la SEC ID NO. 111 con secuencias de flanqueo N y C-terminales adicionales de la secuencia correspondiente de la SEC ID NO. 72.

Además, se proporciona un péptido antigénico de la clase II de MHC que comprende: (a) al menos la secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido de la SEC ID NO. 112, o (b) al menos la secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido de la SEC ID NO. 112 con secuencias de flanqueo N y C-terminales adicionales de la secuencia correspondiente de la SEC ID NO. 73. ' Los péptidos antigénicos novedosos asociados con la clase II de MHC de la invención se originan de la tiol reductasa lisosómica inducible con interferón ? (SEC ID NOs. 1 a 3), integrina beta-2 (SEC ID NOs. 58 y 59), fosfatitilinositol-4, 5-bifosfato-3-cinasa (SEC ID NO. 60), activador del plasminógeno del tipo de urocinasa (SEC ID NO. 61) , región V-III de la cadena pesada de inmunoglobulina (VH26) (SEC ID NO. 62), proteina DJ-1 (SEC ID NO. 63), apolipoproteína B-100 (SEC ID NOs. 4 y 5) , la subunidad reguladora 8 diferente de la ATPasa del proteasoma 26S (SEC ID NOs. 64 a 67), receptor de interlucina-1 (SEC ID NO. 68), fibromodulina (SEC ID NOs. 69 y 70), receptor de GM-CSF/IL-3/IL-5 (SEC ID NOs. 71 y 72), nexina 3 clasificada (SEC ID NO. 73), cadena pesada H4 del inhibidor de inter-a-tripsina (SEC ID NOs. 6 a 12), C4 complementaria (SEC ID NOs. 13 a 18), C3 complementaria (cadena a) (SEC ID NOs. 19 a 23, 74 y 75), C3 complementaria (cadena ß) (SEC ID NOs. 76 y 77), proteina 3 semejante y enriquecida en ácido glutámico de aglutinación al dominio de SH3 (SEC ID NOs . 24 a 27), proteina 1 inducida por la interlucina-4 (SEC ID NOs. 28 a 30), hemopexina (SEC ID NOs . 31 a 35 y 78), proteina de interacción con Hsc70 (SEC ID NOs. 36 a 39), cadena no variable (Ii) (SEC ID NOs. 79 a 83), proteina 2 de respuesta al receptor de ácido retinóico (SEC ID NOs. 84 a 86), fibronectina (SEC ID NOs. 87 a 91), catepsina B (SEC ID NO. 92), tripeptidil-peptidasa II (SEC ID NOs. 93 y 94), legumaina (SEC ID NO. 95), receptor del factor de activación de las plaquetas (SEC ID NO. 96), y poli-alfa-2.8-sialiltransferasa (SEC ID NO. 97), y proteina Rab-llB relacionada con ras (SEC ID NOs. 98 a 102). La ranura de aglutinación del péptido' único de las moléculas de la clase II de MHC es de aproximadamente 25 A de longitud, pero en contraste con las moléculas de la clase I de MHC, ambos lados están abiertos (Stern LJ et al., Nature 1994; 368, 215-221) . Por consiguiente, los péptidos antigénicos procesados naturalmente, eluidos de las moléculas de la clase II de MHC, humanas tienen una longitud mínima de aproximadamente 11 residuos y logran una longitud máxima de aproximadamente 25 residuos (Chicz RM et al., J Exp Med 1993; 178, 27-47) . La estabilidad de la interacción del péptido-MHC es determinada por más de una docena de enlaces de hidrógeno que involucran el soporte del péptido y la complementariedad entre las cavidades especificas de la ranura de unión y las cadenas laterales del aminoácido localizadas apropiadamente del péptido. Los aminoácidos del péptido que se encajan en las cavidades respectivas fueron llamados residuos de "fijación". Con respecto a la mayoría de los alelos de HLA-DR, estos sitios de fijación están localizados en las posiciones relativas Pl, P4, P6 y P9. La combinación de aminoácidos en estas 4 posiciones de fijación confieren una aglutinación de estabilidad elevada al producto alélico de HLA-DR respectivo y varía de alelo a alelo. La porción de aglutinación del péptido está definida aqui como la secuencia de nueve aminoácidos que comprende los cuatro aminoácidos de fijación. La porción de aglutinación del péptido del péptido antigénico de la clase II de HC de la invención es mostrada en la SEC ID NO. 49 para los péptidos derivados de la tiol reductasa lisosómica inducible con interferón ? (SEC ID NOs. 1 a 3) , en la SEC ID NO. 103 para los péptidos derivados de la integrina beta-2 (SEC ID NOs. 58 y 59), en la SEC ID NO. 104 para los péptidos derivados de la fosfatitilinositol-4, 5-bifosfato-3-cinasa (SEC ID NO. 60), en la SEC ID NO. 105 para los péptidos derivados del activador de plasminógeno del tipo de urocinasa (SEC ID NO. 61) , en la SEC ID NO. 106 para los péptidos derivados de la región V-III de la cadena pesada de inmunoglobulina (VH26) , (SEC ID NO. 62), en la SEC ID NO. 107 para los péptidos derivados de la proteína DJ-1 (SEC ID NO. 63) , en la SEC ID NO. 50 para los péptidos derivados de apolipoproteina B-1D0 (SEC ID NOs . 4 y 5) , en la SEC ID NO. 108 para los péptidos derivados de la subunidad reguladora 8 diferente de la ATPasa de la proteosoma 26S (SEC ID NOs. 64 a 67), en la SEC ID NO. 109 para los péptidos derivados del receptor de interlucina-1 (SEC ID NO. 68) , en la SEC ID NO. 110 para los péptidos derivados de fibromodulina (SEC ID NOs. 69 y 70) , en la SEC ID NO. 111 para los péptidos derivados del receptor de GM-CSF/IL-3/IL-5 (SEC ID NOs. 71 y 72), en la SEC ID NO. 112 para los péptidos derivados de la nexina 3 clasificada (SEC ID NO. 73), en la SEC ID NO. 51 para los péptidos derivados de la cadena pesada H4 del inhibidor de inter-a-tripsina (SEC ID NOs. 6 a 12), en la SEC ID NO. 52 para los péptidos derivados de la C4 complementaria (SEC ID NOs. 13 a 18), en la SEC ID NO. 53 para los péptidos derivados de la C3 complementaria (cadena a) (SEC ID NOs. 19 a 23, 74 y 75), en la SEC ID NO. 113 para los péptidos derivados de la C3 complementaria (cadena ß) (SEC ID NOs. 76 y 77), en la SEC ID NO.54 para los péptidos derivados de la proteina 3 semejante y enriquecida en ácido glutámico de aglutinación al dominio SH3 (SEC ID NOs. 24 a 27), en la SEC ID NO. 55 para los péptidos derivados de la proteina 1 inducida por la interleucina-4 (SEC ID NOs. 28 a 30), en la SEC ID NO. 56 para los péptidos derivados de hemopexina (SEC ID NOs. 31 a 35 y 78), en la SEC ID NO. 57 para los péptidos derivados de la proteína de interacción con Hsc70 (SEC ID NOs. 36 a 39), en la SEC ID NO. 114 para los péptidos derivados de la cadena no variable (Ii) (SEC ID NOs. 79 a 83), en la SEC ID NO. 115 para los péptidos derivados de la proteina de respuesta 2 del receptor del ácido retinóico (SEC ID NOs. 84 a 86), en la SEC ID NO. 116 para los péptidos derivados de la fibronectina (SEC ID NOs. 87 a 91), en la SEC ID NO. 117 para los péptidos derivados de la catepsina B (SEC ID NO. 92) , en la SEC ID NO. 118 para los péptidos derivados de la tripeptidil-peptidasa II (SEC ID NOs. 93 y 94), en la SEC ID NO. 119 para los péptidos derivados de legumaína (SEC ID NO. 95), en la SEC ID NO. 120 para los péptidos derivados del receptor del factor de activación de las plaquetas (SEC ID NO. 96) , en la SEC ID NO. 121 para los péptidos derivados de poli-alfa-2.8-sialiltransferasa (SEC ID NO. 97) y en la SEC ID NO. 122 para los péptidos derivados de la proteína Rab-llB relacionada con Ras (SEC ID NOs. 98 a 102) . La porción de aglutinación del péptido también puede comprender al menos una, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro o al menos cinco modificaciones de la secuencia de aminoácidos mientras que todavía se logre la capacidad de aglutinación de la porción de aglutinación del péptido no modificado. Preferiblemente, la porción de aglutinación del péptido modificado comprende al menos tres de los cuatro aminoácidos de fijación de la porción de aglutinación del péptido no modificada. La modificación del aminoácido puede ser una substitución del aminoácido conservador como se describe posteriormente. La energía de aglutinación adicional es provista por los enlaces de hidrógeno que involucran residuos en la parte frontal del sitio de fijación Pl y debajo del sitio de fijación P9. De acuerdo con esto, en la mayoría de los péptidos procesados naturalmente la región central nonamérica (P1-P9) está flanqueada N- y C-terminalmente por 3-4 residuos. Por consiguiente, la mayoría de los péptidos son 15-17-meros. Los péptidos más largos sobresalen de la ranura, por lo cual permiten el acceso de exopeptidasa las cuales están recortando ambos extremos . Por lo tanto, el péptido antigénico de la clase II de MHC de la invención que comprende: (a) al menos la secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido seleccionado del grupo que consiste de las SEC ID NOs. 49 a 57 y SEC ID NOs . 103 a 122, o (b) al menos la secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOs. 49 a 57 y SEC ID NOs. 103 a 122 con las secuencias de flanqueo N- y C-terminales adicionales de una secuencia correspondiente seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NOs. 1 a 39 y SEC ID NOs. 58 a 102', preferentemente comprenden residuos de aminoácidos de flanqueo N- y C-terminales adicionales, proporcionando energía de aglutinación adicional. Preferentemente, el péptido antigénico de la clase II de MHC de la presente invención tiene una capacidad de aglutinación con respecto a la molécula de la clase II de MHC correspondiente de entre una décima parte y diez veces la IC50 de un péptido correspondiente seleccionado del grupo que consiste de las SEC ID NOs . 1 a 39 y las SEC ID NOs . 58 a 102. La capacidad de aglutinación de un péptido es medida por la determinación de la concentración necesaria para reducir la aglutinación de un péptido reportero etiquetado en el 50 %. Este valor es llamado IC50. Un péptido antigénico de la clase II de MHC de la invención mantiene su capacidad de aglutinación con respecto a las moléculas de la clase II de HLA relevantes siempre que el mismo logre los valores de IC50 entre una décima y diez veces el valor de IC50 de los péptidos de referencia establecidos. Puesto que el recorte de los péptidos ocurre de un modo individual tanto antes como después de la aglutinación en la ranura de aglutinación del péptido, la presentación de variantes truncadas diversas que comparten una región del núcleo nonamérica común es una característica común de los péptido unidos a la clase II de MHC. De manera importante, se mostró que las variantes truncadas C- o N-terminales del mismo epítopo pueden desencadenar las respuestas de las células T divergentes (Arnold et al, (2002) J. Immunol . 169, 739-749) . Varios parámetros pueden ser contemplados que tienen una influencia sobre la abundancia relativa de las variantes truncadas de un epitopo particular, por ejemplo la abundancia e integridad del antigeno de relevancia, las proteínas asociadas con el antígeno, la abundancia de las proteasas, el tipo de proteasas disponibles y el suministro con los antigenos y/o péptidos competitivos. Puesto que el suministro del antigeno es una característica principal que se puede correlacionar con el origen de una muestra, la relación de variantes truncadas particulares de un epitopo, puede ser de valor diagnóstico. Un péptido de la invención es un péptido que ya sea no tiene una contraparte que está presente de manera natural (por ejemplo, tal como un antígeno del péptido mutado) , o que ha sido aislada, es decir separada o purificada de los componentes que la acompañan de manera natural, por ejemplo, en los tejidos tales como el páncreas, hígado, bazo, ovarios, testículos, músculos, tejido de las articulaciones, tejido neural, tejido gastrointestinal, o fluidos corporales tales como la sangre, el suero, fluido sinovial u orina. Típicamente, el péptido es considerado "aislado" cuando una preparación que comprende un péptido de la invención consiste de hasta al menos 70%, por peso seco del péptido y hasta menos del 30 % de las proteínas y las moléculas orgánicas que están presentes de manera natural con las cuales el mismo está asociado naturalmente. De manera preferente, una preparación de un péptido de la invención consiste de al menos 80 %, más preferentemente de al menos 90 %, y aún más preferentemente de al menos 99 %, por peso seco, del péptido de la invención. Euesto que un péptido que es sintetizado químicamente, por su naturaleza, es separado de los componentes que lo acompañan de manera natural, el péptido sintético es "aislado"'. La invención proporciona además análogos del péptido antigénico de la invención. El término análogo incluye cualquier péptido que exhiba los aspectos funcionales de estos péptidos antigénicos que comprenden la IC50 de la capacidad de aglutinación y el reconocimiento por los anticuerpos y células del sistema inmune. Los análogos exhiben esencialmente la misma IC50 que el péptido de referencia correspondiente. El término análogo también incluye substituciones conservadoras o derivados químicos de los péptidos. El término "análogo" incluye cualquier polipéptido que tenga una secuencia de residuo de aminoácido substancialmente idéntica a las secuencias descritas aquí en las cuales uno o más residuos han sido substituidos conservadoramente con un residuo funcionalmente semejante y que exhibe los aspectos funcionales de los péptidos como se describió aqui. Los ejemplos de las substituciones conservadoras incluyen la substitución de un residuo no polar (hidrofóbico) tal como fenilalanina, tirosina, isoleucina, valina, leucina o metionina por otro, la substitución de un residuo polar (hidrofilico) por otro tal como entre la arginina y la lisina, entre glutamina y asparagina, entre treonina y serina, la substitución de un residuo básico tal como, lisina, arginina o histidina por otro, o la substitución de un residuo ácido, tal como el ácido aspártico o el ácido glutámico por otro. La frase "substitución conservadora" también incluye el uso de un aminoácido derivado químicamente en lugar de un aminoácido no derivado. "Derivado químico" se refiere a un polipéptido objetivo que tiene uno o más aminoácidos derivados químicamente por la reacción de un grupo lateral funcional. Los ejemplos de tales moléculas derivadas incluyen por ejemplo, aquellas moléculas en las cuales los grupos de amino libre han sido derivados para formar clorhidratos de amina, grupos de p-tolueno sulfonilo, grupos de carbobenzoxi, grupos de t-butiloxicarbonilo, grupos de cloroacetilo, grupos de acetilo o grupos de formilo. Los grupos de carboxilo libre pueden ser derivados para formar sales, ésteres de metilo y etilo u otros tipos de ésteres o hidrazidas. Los grupos de hidróxido libre pueden ser derivados para formar los derivados de O-acilo u O-alquilo. El nitrógeno del imidazol de la histidina puede ser derivado para formar la N-im-bencilhistidina . También están incluidos como derivados químicos estas proteínas o péptidos, que contienen uno o más derivados de aminoácidos que están presentes de manera natural de los veinte aminoácidos estándares. Por ejemplo: la 4-hidroxiprolina puede ser substituida por prolina; la 5-hidroxilisina puede ser substituida por lisina; la 3-metilhistidina puede ser substituida por histidina; la homoserina puede ser substituida por serina; y la ornitina o citrulina puede ser substituida por la lisina. Los péptidos antigénicos de la clase II de MHC de la invención y las proteínas de las cuales las mismas son derivadas, pueden ser utilizadas como marcadores en el diagnóstico de RA y en la terapia como vacunas anti-RA. El término marcador como se utiliza aquí, se refiere a una biomolécula, preferentemente un péptido o un polipéptido, que es expresado en un grupo de pacientes con una enfermedad diagnosticada, por ejemplo, RA, y logra una abundancia que es incrementada o reducida significativamente cuando se compara con un grupo de control. El marcador de la presente invención puede ser utilizado como un marcador de pronóstico para predecir la susceptibilidad a una enfermedad, por ejemplo para predecir la susceptibilidad a RA, como un marcador de diagnóstico para el diagnóstico de una enfermedad, por ejemplo para el diagnóstico de RA, como un marcador de diagnóstico diferencial, para diferenciar entre las diferentes formas de una enfermedad, por ejemplo, para diferenciar entre las diferentes formas de RA, como un marcador de pronóstico para la predicción de los resultados de una enfermedad, por ejemplo, para el pronóstico de RA, y como un marcador de respuesta para determinar la eficacia de un régimen terapéutico, por ejemplo, como un marcador de respuesta en el tratamiento de la RA. En una modalidad adicional, el péptido antigénico de la clase II de MHC gue comprende: (a) al menos la secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido seleccionado del grupo que consiste de las SEC ID NOs . 49 a 57 y las SEC ID NOs. 103 a 122, o (b) al menos la secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOs. 49 a 57 y las SEC ID NOs. 103 a 122, con las secuencias de flanqueo N- y C-terminales adicionales de una secuencia correspondiente seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOs. 1 a 39 y las SEC ID NOs. 58 a 102, es utilizada como un marcador para la RA erosiva y/o no erosiva. En una modalidad adicional, el péptido antigénico de la clase II de MHC que comprende: (a) al menos la secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido de la SEC ID NO. 49, o (b) al menos la secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido de la SEC ID NO. 49 con secuencias de flanqueo N y C-terminales adicionales de una secuencia correspondiente seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOs. 1 a 3, es utilizado como un marcador para la RA no erosiva. Además, se proporciona un péptido antigénico de la clase II de MHC que comprende: (a) al menos la secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido de la SEC ID NO. 103, o (b) al menos la secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido de la SEC ID NO. 103 con secuencias de flanqueo N y C-terminales adicionales de la secuencia correspondiente de las SEC ID NOs. 58 y 59 es utilizada como un marcador para la RA no erosiva. Además, se proporciona un péptido antigénico de la clase II de MHC que comprende: (a) al menos la secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido de la SEC ID NO. 104, o (b) al menos la secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido de la SEC ID NO. 104 con secuencias de flanqueo N y C-terminales adicionales de la secuencia correspondiente de la SEC ID NO. 60 es utilizada como un marcador para la RA no erosiva. Además, se proporciona un péptido antigénico de la clase II de MHC que comprende: (a) al menos la secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido de la SEC ID NO. 105, o (b) al menos la secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido de la SEC ID NO. 105 con secuencias de flanqueo N y C-terminales adicionales de la secuencia correspondiente de la SEC ID NO. 61 es utilizada como un marcador para la RA no erosiva. Además, se proporciona un péptido antigénico de la clase II de MHC que comprende: (a) al menos la secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido de la SEC ID NO. 106, o (b) al menos la secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido de la SEC ID NO. 106 con secuencias de flanqueo N y C-terminales adicionales de la secuencia correspondiente de la SEC ID NO. 62 es utilizada como un marcador para la RA no erosiva. Además, se proporciona un péptido antigénico de la clase II de MHC que comprende: (a) al menos la secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido de la SEC ID NO. 107, o (b) al menos la secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido de la SEC ID NO. 107 con secuencias de flanqueo N y C-terminales adicionales de la secuencia correspondiente de la SEC ID NO. 63 es utilizada como un marcador para la RA no erosiva. Además, se proporciona un péptido antigénico de la clase II de MHC que comprende: (a) al menos la secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido de la SEC ID NO. 50, o (b) al menos la secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido de la SEC ID NO. 50 con secuencias de flanqueo N y C-terminales adicionales de la secuencia correspondiente de la SEC ID NO. 5 es utilizada como un marcador para la RA erosiva. Además, se proporciona un péptido antigénico de la clase II de MHC que comprende: (a) al menos la secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido de la SEC ID NO. 108, o (b) al menos la secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido de la SEC ID NO. 108 con secuencias de flanqueo N y C-terminales adicionales de la secuencia correspondiente de las SEC ID NOs . 64 a 67 es utilizada como un marcador para la RA erosiva. Además, se proporciona un péptido antigénico de la clase II de MHC que comprende: (a) al menos la secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido de la SEC ID NO. 109, o (b) al menos la secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido de la SEC ID NO. 109 con secuencias de flanqueo N y C-terminales adicionales de la secuencia correspondiente de la SEC ID NO. 68 es utilizada como un marcador para la RA erosiva. Además, se proporciona un péptido antigénico de la clase II de MHC que comprende: (a) al menos la secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido de la SEC ID NO. 110, o (b) al menos la secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido de la SEC ID NO. 110 con secuencias de flanqueo N y C-terminales adicionales de la secuencia correspondiente de las SEC ID NOs . 69 y 70 es utilizada como un marcador para la RA erosiva. Además, se proporciona un péptido antigénico de la clase II de MHC que comprende: (a) al menos la secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido de la SEC ID NO. 111, o (b) al menos la secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido de la SEC ID NO. 111 con secuencias de flanqueo N y C-terminales adicionales de la secuencia correspondiente de la SEC ID NO. 72 es utilizada como un marcador para la RA erosiva. Además, se proporciona un péptido antigénico de la clase II de MHC que comprende: (a) al menos la secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido de la SEC ID NO. 112, o (b) al menos la secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido de la SEC ID NO. 112 con secuencias de flanqueo N y C-terminales adicionales de la secuencia correspondiente de la SEC ID NO. 73 es utilizada como un marcador para la RA erosiva. En una modalidad adicional, los péptidos antigénicos de la clase II de MHC de la invención como se describieron anteriormente, son provistos enlazados a una molécula de la clase II de MHC. Los multimeros (por ejemplo, dimeros, trímeros, tetrámeros, pentámeros, hexámeros u oligómeros) de una molécula de la clase II de MHCV que contienen un péptido unido covalentemente o no covalentemente de acuerdo con la presente invención, si está conjugado con una etiqueta detectable (por ejemplo, una porción fluorescente, un radionúclido, o una enzima que cataliza una reacción que conduce a un producto que absorbe o emite luz de una longitud de onda definida) pueden ser utilizados para cuantificar las células T de un sujeto (por ejemplo, un paciente humano) que lleva receptores de la superficie de la célula que son específicos para, y por lo tanto se aglutinarán, a tales complejos. Números relativamente elevados de tales células T es probable que sean diagnosticadas como una enfermedad o como una indicación de que las células T están involucradas en la inmunidad con respecto a tal enfermedad. Además, la verificación continua de los números relativos de las células T de aglutinación al multímero pueden ser útiles en el establecimiento del curso de una enfermedad o de la eficacia de la terapia. Tales ensayos han sido desarrollados utilizando tetrámeros de las moléculas de MHC de la clase I que contienen un péptido derivado del virus 15 de la influenza o derivados de VHI-1 (Altman et al (1996) , Science 274:94-96; Ogg et al. (1998), Science 279:2103- 21061), y los multímeros de MHC de la clase II correspondientes se podría esperar que sean útiles de manera semejante. Tales complejos podrían ser producidos por la reticulación química de las moléculas de MHC de la clase II purificadas ensambladas en la presencia de un péptido de interés o por la modificación de técnicas recombinantes ya establecidas para la producción de moléculas de MHC de la clase II que contienen un solo péptido definido (Kazono et al (1994), Nature 369:151-154; Gauthier et al (1998), Proc Nati. Acad. Sci. Ü.S.A. 95:11828-118331). Los monómeros de la molécula de MHC de la clase II de tales multimeros pueden ser moléculas naturales compuestas de cadenas alfa y beta de longitud total. Alternativamente, las mismas pueden ser moléculas que contienen ya sea los dominios extracelulares de las cadenas alfa y beta o los dominios de las cadena alfa y beta que forman las "paredes'" y el "piso" de la hendidura de aglutinación del péptido. La invención también se refiere a un anticuerpo, fragmentos o derivados del mismo, dirigidos a y reactivos con los péptidos antigénicos de la clase II de MHC descritos anteriormente. La metodología general para producir anticuerpos es bien conocida y se describe por ejemplo en Kohler y Milstein, 1975, Nature 256,494 o en J. G. R. Hurrel, Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications C C Press Inc. Boco Raron, FL (1982) . Los anticuerpos pueden ser policlonales o, preferentemente, monoclonales, o fragmentos de anticuerpos semejantes serán F(ab')2, Fab, Fv o scFv. Los anticuerpos de la presente invención también pueden ser humanizados (Merluzzi S. et al., (2000), Adv. Clin.

Path., 4(2): 77-85) o anticuerpos humanos (Aujame L. et al., Hum. Antibodies, (1997), 8(4): 155-168). La presente invención también proporciona una molécula de ácido nucléico que codifica un péptido antigénico de la invención de la clase II de MHC, que comprende (a) al menos la secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NO. 49 a 57 y las SEC ID NO. 103 a 122, o (b) al menos la secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NO. 49 a 57 y las SEC ID NO. 103 a 122, con las secuencias de flanqueo N- y C-terminales adicionales de una secuencia correspondiente seleccionada de grupo que consiste de las SEC ID NO. 1 a 39 y las SEC ID NO. 58 a 102. Preferentemente, la molécula de ácido nucléico es una molécula de ADN. Además, una molécula de ácido nucléico es provista la cual codifica un péptido antigénico de la clase II de MHC de la invención enlazado a una molécula de la clase II de MHC . Esta invención también proporciona una construcción de ácido nucléico recombinante que comprende las moléculas de ácido nucléico como se describieron anteriormente, enlazadas operativamente a un vector de expresión. Los vectores de expresión adecuados para su uso en la presente invención comprenden al menos un elemento de control de la expresión enlazado operativamente a la secuencia del ácido nucléico que codifica el péptido antigénico o el péptido antigénico enlazado a una molécula de la clase II de HC. La construcción de expresión recombinante puede ser una construcción de ADN. Los elementos de control de la expresión son insertados en el vector para controlar y regular la expresión de la secuencia del ácido nucléico que codifica el péptido antigénico de la invención. Los ejemplos de los elementos de control de la expresión incluyen, pero no están limitados a, el sistema lac, las regiones promotora y operadora del fago lambda, promotores de levadura y promotores derivados del polioma, adenovirus, retrovirus o SV40. Los elementos operativos preferidos o referidos adicionalmente incluyen, pero no están limitados a, la secuencia líder, los codones de terminación, las señales de poliadenilación, y cualesquiera otras secuencias necesarias o preferidas para la transcripción apropiada y la traducción subsiguiente de la secuencia de ácido nucléico en el sistema hospedero. Se entenderá por un experto en el arte que la combinación correcta de los elementos de control de la expresión requeridos o preferidos dependerán del sistema hospedero elegido. Se entenderá además que el vector de expresión debe contener elementos adicionales necesarios para la transferencia y replicación subsiguiente del vector de expresión que contienen la secuencia de ácido nucléico en el sistema hospedero. Los ejemplos de tales elementos incluyen, pero no están limitados a, los orígenes de la replicación y marcadores seleccionábales . Se entenderá además por un experto en el arte que tales vectores son construidos fácilmente utilizando métodos convencionales C"DNA Isolation and Sequencing", Bruce A. Roe, Judy S. Crabtree and Akbar S. Khan, Publicada por John Wiley & Sons, 1996) o están disponibles comercialmente . Otro aspecto de esta invención se refiere a un organismo hospedero o a una célula hospedera dentro de la cual una construcción de ácido nucléico recombinante que comprende las moléculas de ácido nucléico como se describió anteriormente, enlazadas operativamente a un vector de expresión, ha sido insertada. Las células hospederas transformadas con las construcciones del ácido nucléico abarcadas por esta invención incluyen eucariotas, tales como células de animales, de plantas, de insectos y de levadura y procariotas, tales como E. coli.-Los medios por los cuales la construcción de ácido nucléico que lleva la secuencia de ácido nucléico pueden ser introducida en la célula incluyen, pero no están limitados a, microinyección, electroporación, transducción o transíección, usando DEAE-dextrano, lipofección, fosfato de calcio u otros procedimientos conocidos por aquellos expertos en el arte (Sambrook et al-, (1989) en "Molecular Cloning". A laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press, Plainview, New York) . En una modalidad preferida, los vectores de expresión eucariótica que funcionan en las células eucarióticas son utilizados. Los ejemplos de tales vectores incluyen, pero no están limitados a, vectores retrovirales, vectores del virus de vaccinia, vectores de adenovirus, vector del virus del herpes, vector del virus de viruela aviar, plásmidos, o vectores de transferencia de baculovirus . Las lineas celulares eucarióticas preferidas incluyen, pero no están limitadas a células COS, células CHO, células Hela, células NIH/3T3, células 293 (ATCC# CRL15731) , células T2, células dendriticas, monocitos o células B transformadas con el virus de Eptein Barr 15. Un péptido antigénico de la Invención puede ser obtenido, por ejemplo, por la extracción de una fuente natural (por ejemplo, la elución desde las moléculas de MHC II) ; por la expresión de un ácido nucléico recombinante que codifica el péptido, o por síntesis química. Un péptido que es producido en un sistema celular diferente de la fuente de la cual se origina el mismo es "aislado", a causa de que el mismo estará separado de los componentes que la acompañan de manera natural. El péptido recombinante expresado por un organismo hospedero puede ser obtenido como un lisado crudo o puede ser purificado por procedimientos de la proteina estándares conocidos en el arte, los cuales pueden incluir precipitación diferencial, cromatografía de exclusión de tamaño, cromatografía de intercambio iónico, enfocamiento isoeléctrico, electrofóresis de gel, cromatografía de afinidad e inmunoafinidad y semejantes. La extensión del aislamiento o pureza puede ser medido por cualquier método apropiado, por ejemplo espectrometría de masa o análisis de CLAR. Los péptidos pueden ser preparados sintéticamente por los procedimientos descritos en Merrifield, (1986) Science 232:341-347, y Barany y Merrifield, The Peptides, Gross and Meienhofer, eds (N.Y., Academic Press), pp. 1-284 (1979). La síntesis puede ser llevada a cabo en solución o en fase sólida o con un sintetizador automático (Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis, segunda edición, Rockford III, Pierce Chemical Co. (1984)). Por lo tanto, la presente invención proporciona además un método para producir un péptido de la clase II de MHC que comprende (a) al menos la secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido seleccionado del grupo que consiste de las SEC ID NOs . 49 a 57 y las SEC ID NOs . 103 a 122, o (b) al menos la secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOs. 49 a 57 y las SEC ID NOs.103 a 122, con secuencias de flanqueo N- y C-terminales adicionales de una secuencia correspondiente seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOs. 1 a 39 y las SEC ID NOs. 58 a 102, que comprenden las etapas de cultivar la célula hospedera que contiene una construcción de ácido nucléico recombinante como se describió anteriormente bajo condiciones que permitan la expresión del péptido y recuperar el péptido de las células o del medio de cultivo. En una modalidad adicional de la presente invención, se proporciona un método para aislar e identificar los péptidos antigénicos de RA asociados con la clase II de MHC en cantidades femtomolares, tal método comprende (a) proporcionar células dendriticas inmaduras en un número que comprende 0.1 a 5 g de moléculas de la clase II de MHC; (b) poner en contacto las células de (a) con el suero o el fluido sinovial e inducir la maduración de las células dendriticas agregando TNFalfa, (c) aislar los complejos del péptido antigénico-molécula de MHC del tipo II de las células con métodos que comprenden la solubilización de las células y la captura de los complejos de las moléculas de la clase II de MHC con péptidos antigénicos por inmunoprecipitación o cromatografía de inmunoafinidad; (d) lavar los complejos capturados de las moléculas de la clase II de MHC con péptidos antigénicos con agua en un tubo de ultrafiltración; (e) eluir los péptidos antigénicos asociados de las moléculas de la clase II de MHC a 37 °C con ácido trifluoroacético diluido,, y (f) separar, detectar e identificar los péptidos aislados por cromatografía liquida y espectrometría de masa. Además, en la etapa (f) del método, la cromatografía líquida comprende una primera etapa de elución lineal del material de fase inversa con un volumen suficiente para eluir la mayoría de los contaminantes previo a la elución del péptido. Además, el método puede comprender además (g) analizar los péptidos identificados por los métodos que comprenden una base de datos y un software desarrollado para efectuar el análisis de datos comparativo a través de conjuntos de datos múltiples. La cantidad de tejido o fluido corporal necesario para obtener por ejemplo 100 ng de las moléculas de la clase II de MHC depende del número de las células que expresan la clase II de MHC y sobre la velocidad de expresión de las moléculas de la clase II de MHC: por ejemplo 100 ng de la clase II de MHC son equivalentes aproximadamente 2 x 105 de DCs maduras o 5 hasta 10 x 106 monocitos de sangre periférica o aproximadamente 5 x 107 células mononucleares periféricas las cuales pueden ser obtenidas a partir de aproximadamente 50 mi de sangre. Para la purificación de los complejos del péptido antigénico-molécula de MHC de la clase II de las células o tejido, las membranas de las células o el tejido tienen que ser solubilizadas . La lisis celular puede ser llevada a cabo con los métodos conocidos en el arte, por ejemplo ciclos de congelamiento y descongelamiento y el uso de detergentes y combinaciones de los mismos. Los métodos de lisis preferidos son la solubilización utilizando detergentes, preferentemente TX-100, NP40, n-octilglucosida, Zwittergent, Lubrol, CHAPS, más preferentemente TX-100 o Zwittergent 3-12. Los desechos celulares y los núcleos tienen que ser removidos de los Usados celulares que contienen los complejos del péptido-receptor solubilizados por centrifugación. Por lo tanto, los complejos de las moléculas de MHC de la clase II con los péptidos antigénicos son aislados de las células con los métodos que comprenden la solubilización con un detergente. Además, los complejos de péptido-molécula de la clase II de MHC son purificados a partir de los Usados celulares por los métodos que comprenden inmunoprecipitación o cromatografía de inmunoafinidad. Para la inmunoprecipitación o la cromatografía de inmunoafinidad, los anticuerpos específicos para las moléculas de la clase II de MHC y adecuados para estos métodos, son utilizados. Los anticuerpos específicos son preferentemente anticuerpos monoclonales, y están unidos covalentemente o no covalentemente por ejemplo por medio de la Proteina A, a perlas, por ejemplo perlas de sefarosa o agarosa. Una selección del panel amplio de anticuerpos de anti-HLA utilizados en el arte previo comprenden: anticuerpos de anti-HLA-DR: anticuerpos de L243, TU36, DA6.147, preferentemente L243; anticuerpos de anti-HLA-DQ: SPVL3 , TU22, TU169, preferentemente TU22 y TU169, el anticuerpo B7/21 de anti-HLA-DP y los anticuerpos W6/32 y B9.12 de anti-HLA-A, B, C. Los anticuerpos monoclonales específicos para diferentes moléculas de la clase II de MHC pueden ser obtenidos comercialmente (por ejemplo Pharmingen, Dianova) o purificados del sobrenadante de las células del hibridoma respectivo utilizando cromatografía de afinidad de la proteína A o de la proteína G. Los anticuerpos monoclonales purificados pueden ser unidos por varios métodos conocidos en el arte preferentemente por los grupos de amino del anticuerpo que se unen covalentemente a la sefarosa activada por CNBr. El inmunoaislamiento de las moléculas de MHC puede ser efectuado por la incubación de las perlas de un anticuerpo con el lisado celular bajo rotación durante varias horas o cromatográfreamente por el bombeo del lisado celular a través de una micro-columna. El lavado de las perlas-anticuerpo puede ser efectuado en tubos de eppendorf o en la microcolumna . La eficacia de la inmunoprecipitación puede ser analizada por SDS-PAGE y transferencia de Western utilizando anticuerpos que reconocen las moléculas de MHC desnaturalizadas (anti-HLA-DRalfa: 1B5; anti-HLA clase I: HC10 o HCA2) . Los complejos del péptido-molécula de la clase II de MHC capturados son lavados con agua o el amortiguador con bajo contenido de sal antes de la elución para remover los contaminantes detergentes residuales. El amortiguador con contenido bajo de sal puede ser un amortiguador de Tris, fosfato o acetato en una intervalo de concentración de 0.5-10 rn , preferentemente a una concentración de 0.35 mM. En una modalidad mas preferida, los complejos de péptido-molécula de la clase II de MHC son lavados con agua ultra pura (grado de secuenciación) utilizada convencíonalmente para el análisis de CLAR, preferentemente agua ultra pura (grado de secuenciación) de MERCK. La etapa de lavado puede ser llevada a cabo por ultrafiltració . La ultrafiltración puede ser llevada a cabo en un tubo de ultrafiltración con un corte de 30 kD, 20 kD, 10 kD, o 5kD, preferentemente de 30 kD y un volumen del tubo de 0.5-1.0 mi (tubos "Ultrafree"; Millipore) . El lavado en el tubo de ultrafiltración puede ser llevado a cabo 4 a 12 veces, preferentemente 6 a 10 veces, con un volumen de 10 a 20 veces el volumen de las perlas que llevan los complejos del receptor-péptido, preferentemente con un volumen de 15 veces las perlas. Los péptidos eluidos pueden ser separados de las moléculas de la clase II de MHC restantes utilizando el mismo tubo de ultrafiltración. Los péptidos eluidos pueden ser liofilizados entonces. Por la elución de los péptidos a partir de las moléculas de la clase II de MHC, una mezcla compleja de los péptidos procesados naturalmente derivados de la fuente del antigeno potencial y de los polipéptidos de origen intra- o extra celular, es obtenida. Solamente después de la elución, los péptido pueden ser separados y sometidos al análisis de la secuencia. Los péptidos antigénicos en el método de la presente invención pueden ser eluidos por una variedad de métodos conocidos en el arte, preferentemente utilizando el ácido diluido, por ejemplo, acetonitrilo diluido (Jardetzki TS et al. , Nature 1991 353, 326-329), ácido acético diluido y calentamiento (Rudensky AY et al. Nature 1991, 353, 622-626; Chicz RM et al., Nature 1992, 358, 764-768) o ácido trifluoroacético diluido a 37 °C (Kropshofer H et al., J Exp Med 1992, 175, 1799-1803) . Más preferentemente, los péptidos son eluidos a 37 °C con ácido trifluoroacético diluido. Los péptidos antigénicos aislados son separados, detectados e identificados entonces. Por detección se entiende que la secuencia de aminoácidos de los péptidos individuales en la mezcla de los péptidos antigénicos aislados es discernida por los métodos adecuados para detectar y secuenciar cantidades femtomolares de los péptidos. Por identificación se entiende que la misma es establecida a partir de tales proteínas o polipéptidos de los cuales los péptido antigénicos son derivados y cada secuencia que los mismos constituyen dentro de estas proteínas o polipéptidos . En una primera etapa, la mezcla compleja de péptidos eluidos puede ser separada por uno de una variedad de métodos cromatográficos posibles, por ejemplo por cromatografía de intercambio catiónico, intercambio aniónico, o de fase inversa o una combinación de las mismas. Preferentemente la separación es efectuada por cromatografía de fase inversa de C18 o por CLAR bidimensional de intercambio catiónico/fase inversa, denotada como MudPit (Washburn MP et al., Nat Biotechnol., (2001), 19, 242-247) . La separación se hace en un modo de CLAR utilizando columnas microcapilares de sílice fundido las cuales están ya sea conectadas a una fuente de electrorrociado de nano-flujo de un espectrómetro de masa o a un dispositivo de micro-fraccionamiento que aplica como puntos las fracciones sobre una placa para el análisis de MALDI . La cromatografía líquida comprende el fraccionamiento del péptido por el uso de un material de intercambio iónico fuerte y un material de fase inversa hidrofóbico. Para la elución de los péptidos del material de fase inversa y de intercambio iónico, se corren diferentes programas de elución, uno después del otro, que comprenden las eluciones con la sal y con solventes orgánicos, por ejemplo, acetonitrilo . La elución a partir del material de fase inversa es llevado a cabo en varias etapas de gradientes lineales de diferentes longitudes y pendientes. Una contaminación en la muestra que va a ser fraccionada puede ser cualquier contaminación cuya elución compita con la detección de los picos del péptido en el espectrómetro de masa. Por lo tanto, para prevenir la elución simultánea, los contaminantes tienen que haber sido eluidos con un volumen de solvente suficiente previo a la etapa de elusión del péptido. Dependiendo de la columna utilizada para la cromatografía líquida, el solvente suficiente para eluir los contaminantes previo a la etapa de elución del péptido puede ser de 100 a 200 veces el volumen de la columna. Una variedad de técnicas espectrométricas de masa son adecuadas, preferentemente MS de la descomposición de la fuente de MALDI-post (PSD) o espectrometría de masa en serie con ionización por electrorrociado (ESI-MS) , más preferentemente ESI-MS con trampa de iones. Las secuencias de los péptidos individuales pueden ser determinadas por medios conocidos en el arte. Preferentemente, el análisis de la secuencia es efectuado por fragmentación de los péptidos e interpretación auxiliada por computadora de los espectros de los fragmentos utilizando algoritmos, por ejemplo MASCOT o SEQUEST. Ambos algoritmos de computadora utilizan bases de datos de la secuencia de proteínas y nucleótidos para realizar análisis de correlación cruzada del espectro de masa en serie generado de manera experimental y teórica. Esto permite el análisis de la secuencia de rendimiento elevado, automático. Los péptidos antigénicos aislados e identificados de la invención pueden ser validados por la porción de aglutinación de MHC, la capacidad de aglutinación de MHC, y/o el reconocimiento de la célula . Porción de aglutinación de MHC Los péptidos asociados a una molécula de MHC particular (variante alélica) tienen características estructurales comunes, denotadas como porciones de aglutinación, necesarias para formar complejos estables con moléculas de MHC. Los ligandos del péptidos eluidos de las moléculas de la clase I de MHC son relativamente cortas, que varían desde 8-11 aminoácidos. Además, 2 o 3 cadenas laterales del péptido son relevantes para la aglutinación. La posición de las cadenas laterales del aminoácido, respectivas, varían con el alelo HLA, más frecuentemente dos de estos residuos así llamados "de fijación" están localizados en las posiciones 2 y 9. Con respecto a la posición de fijación particular, solamente 1 o 2 aminoácidos normalmente pueden funcionar como aminoácidos de fijación, por ejemplo, la leucina o valina V en la posición 2 en el caso de HLA-A2. En el caso de las moléculas de la clase II de MHC, la longitud del péptido varía desde 11 a 25 aminoácidos, porque los péptidos más largos pueden aglutinarse puesto que ambos extremos de la ranura de aglutinación del péptido están abiertos. La mayoría de las moléculas de la clase II de HLA acomodan hasta 4 residuos de fijación en las posiciones relativas Pl, P4, P6 y P9 contenidas en una región central nonamérica. Esta región central, sin embargo, puede tener una distancia variable desde la terminación N del péptido. En la mayoría de los casos, los residuos 2-4 N-terminales preceden a la región central. Por consiguiente, los residuos de fijación de Pl están localizados en las posiciones 3, 4 ó 5 en la mayoría de los péptidos asociados de la clase II de HLA. Los péptidos eluidos de las moléculas de la clase II de HLA-DR comparten un sitio de fijación Bl hidrofóbico, grande, representado por la tirosina, fenilalanina, triptófano, metionina, leucina, isoleucina o valina. La posición y el tipo exacto de los residuos de fijación constituyen la porción de aglutinación del péptido que es conocida para la mayoría de los productos alélicos de la clase II de HLA que están presentes frecuentemente. Un algoritmo de computadora que permite la validación de la porción en las secuencias del péptido es el "Tepitope", disponible para Vaccinome. Capacidad de aglutinación de MHC Los péptidos identificados por el método de la invención pueden ser probados para verificar su capacidad para aglutinarse a la molécula de la clase II de MHC apropiada por los métodos conocidos en el arte utilizando, por ejemplo, moléculas de la clase II de MHC y péptidos sintéticos con secuencias de aminoácidos idénticas a aquellas identificadas por el método de la invención (Kropshofer H et al., J. Exp. Med. 1992; 175, 1799-1803; Vogt AB et al., J. Immunol. 1994; 153, 1665-1673; Sloan VS et al., Nature 1995; 375, 802-806) . Alternativamente, un ensayo de aglutinación celular utilizando las lineas celulares que expresan la clase II de MHC y los péptidos biotinilados puede ser utilizado para verificar el epitopo identificado (Arndt SO et al., EMBO J. , 2000; 19, 1241-1251) . En ambos ensayos, la capacidad de aglutinación relativa de un péptido es medida por la determinación de la concentración necesaria para reducir la aglutinación de un péptido reportero etiquetado en el 50%. Este valor es llamado IC50. La aglutinación del péptido con una afinidad razonable hacia las moléculas de la clase II de HLA relevante, logra valores de 1C50 que no exceden 10 veces la IC50 de los péptidos de referencia establecidos. Los mismos ensayos de aglutinación también pueden ser utilizados para probar la capacidad de los péptidos para aglutinarse a las moléculas de MHC de la clase II alternativas, es decir, las moléculas de MHC de la clase II diferentes de aquellas de las cuales las mismas fueron eluidas utilizando el método de la invención. Los métodos de diagnóstico de la invención que utilizan tales péptidos y métodos terapéuticos de la invención, que utilizan ya sea los péptidos o los péptidos derivados de ellos, pueden ser aplicados a sujetos que expresan tales moléculas de MHC de la clase II alternativa. Reconocimiento de la célula T El procedimiento de verificación del epitopo puede involucrar la prueba de los péptidos identificados por el método de la invención para verificar su capacidad para activar las poblaciones de la célula T de CD4+. Los péptidos con secuencias de aminoácidos ya sea idénticas a aquellas identificadas en la presente invención o que corresponden a una secuencia central derivada de un grupo encajado de péptidos identificados en la presente invención son sintetizados. Los péptidos sintéticos son probados entonces para verificar su capacidad para activar las células T de CD4+ a partir de: (a) sujetos de prueba que expresan la molécula de la clase II de MHC de interés y que tiene al menos un síntoma de la enfermedad; y (b) sujetos de control que expresan la molécula de interés de la clase II de MHC y que no tiene síntomas de la enfermedad. Los sujetos de control adicionales pueden ser aquellos con síntomas de la enfermedad y que no expresan la molécula de la clase II de MHC de interés.

En algunas enfermedades (por ejemplo, aquellas con un componente autoinmune, la capacidad de respuesta en las células T de CD4+ de los sujetos de prueba pero no en las células T CD4+ de los sujetos de control descritos en (b) proporciona una evidencia confirmatoria de que el péptido relevante es un epitopo que activa las células T de CD4+ que pueden iniciar, promover o agravar la enfermedad relevante. En otras enfermedades (por ejemplo, cáncer o enfermedades infecciosas sin un componente autoinmune) , una configuración semejante de capacidad de respuesta y de incapacidad de respuesta con respecto a aquella descrita en la oración previa, podría indicar que el péptido relevante es un epitopo que activa las células T de CD4+ que puede tener una acción mediadora de inmunidad con respecto a la enfermedad o, al menos, una reducción de los síntomas de la enfermedad. Las respuestas de la célula T de CD4+ pueden ser medidas por una variedad de métodos in vitro bien conocidos en el arte. Por ejemplo las células mononucleares de la sangre periférica entera (PBMC) (por sus siglas en inglés) pueden ser cultivadas con y sin un péptido sintético candidato y sus respuestas proliferativas medidas, por ejemplo, por la incorporación de [3H]-timidina en su ADN. Que las células de T proliferantes sean células T de CD4+ puede probado ya sea eliminando las células T de CD4+ del PBMC/ previo al ensayo o agregando anticuerpos inhibidores que se aglutinan a la molécula de' CD4+ sobre las células T, inhibiendo por medio de esto la proliferación de estas últimas. En ambos casos, la respuesta proliferativa será inhibida solamente que las células T de CD4+ sean las células proliferativas . Alternativamente, las células T de CD4+ pueden ser purificadas a partir de PBMC y probadas para las respuestas proliferativas con respecto a los péptidos en la presencia de APC que expresa la molécula de la clase II de MHC apropiada. Tal APC puede ser de linfocitos B, monocitos, macrófagos, o células dendriticas, o PBMC enteras. La APC también puede ser de lineas celulares inmortalizadas derivadas de los linfocitos B, monocitos, macrófagos, o células dendriticas. La APC puede expresar endógenamente la molécula de la clase II de MHC de interés o las mismas pueden expresar los polinucleótidos transfectados que codifican tales moléculas. En todos los casos, la APC, previo al ensayo, se puede hacer no proliferativa por el tratamiento, por ejemplo, por radiación ionizante o mitocina-C. Como una alternativa a medir la proliferación celular, la producción de citocina por las células T de CD4+ puede ser medida por los procedimientos conocidos por aquellos expertos en el arte. Las citosinas incluyen, sin limitación, interleucina-2 , (IL-2) , interferón-gamma (IFN-gamma) , interleucina-4 (IL-4), TNF-alfa, interleucina-6 (IL-6), interleucina-10 (IL-10) , interleucina-12 (IL-12) , o TGF-beta. Los ensayos para medirlos incluyen, sin limitación, ELISA, y bio-ensayos en los cuales las células de respuesta a la citocina relevante son probadas para verificar su capacidad de respuesta (por ejemplo, la proliferación) en la presencia de una muestra de prueba. Alternativamente, la producción de citocina por los linfocitos de CD4+ puede ser visualizada directamente por teñido de inmunofluorescencia intracelular y citometria de flujo . Además, los péptidos antigénicos de la clase II de MHC de la presente invención pueden ser utilizados en el diagnóstico de la RA. Por lo tanto, una modalidad adicional de la invención es el uso de un péptido antigénico de acuerdo con la presente invención como un marcador para la RA. Preferentemente, una péptido antigénico de la clase II de MHC que comprende: (a) al menos la secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOs . 49 a 57 y las SEC ID NOs. 103 a 122, o (b) al menos la secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOs. 49 a 57 y las SEC ID NOs. 103 a 122, con secuencias de flanqueo N-y C-terminales , adicionales, de una secuencia correspondiente seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOs. 1 a 39 y las SEC ID NOs. 58 a 102, es utilizado como un marcador para RA. En otra modalidad, los péptidos antigénicos de la invención pueden ser utilizados como marcadores de respuesta para rastrear la eficacia de un régimen terapéutico. Esencialmente, un valor de la linea base para un péptido antigénico puede ser determinada, luego un agente terapéutico dado es administrado, y los niveles del péptido antigénico son verificados subsiguientemente, mientras que un cambio en el nivel del péptido antigénico es indicativo de la eficacia de un tratamiento terapéutico. Además, los péptidos antigénicos que son encontrados solamente en ciertas etapas o fases de una enfermedad, preferentemente de RA, pueden ser utilizados como marcadores específicos de la etapa. Esencialmente, los niveles de los péptidos antigénicos que han sido relacionados con una cierta etapa de una enfermedad son verificados regularmente, por lo cual proporcionan información acerca de la etapa de la enfermedad y su progreso. La invención también incluye el uso de los polipéptidos . Los péptidos antigénicos de RA son derivados como marcadores para el diagnóstico y verificación de una enfermedad, preferentemente de RA, y en particular, de la RA erosiva contra la no erosiva. El raciocinio para el uso de las proteínas respectivas es que las DCs radican en muchos tejidos en donde ellas capturan antígenos exógenos por medio de receptores específicos y por medio de mecanismos endocitóticos especializados (por ejemplo macropinocitosis) seguido por la presentación de los antigenos procesados como péptidos sobre las moléculas de la clase II de MHC. Los estudios previos han mostrado que la frecuencia de un epitopo del péptido encontrado en el contexto de las moléculas de la clase II de MHC, por ejemplo los péptidos antigénicos de RA, en la mayoría de los casos refleja la abundancia de la proteína a partir de la cual el péptido particular fue derivado. Por lo tanto, no solamente los péptidos antigénicos de RA sino también las proteínas correspondientes pueden servir como marcadores para RA. Por lo tanto, en una modalidad adicional de la presente invención, el uso de un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de la tiol reductasa lisosómica inducible por el interferón gamma (SEC ID NO. 40) , integrina beta-2 (SEC ID NO. 123), fosfatitilinositol-4 , 5-bifosfato-3-cinasa (SEC ID NO. 124) , activador del plasminogeno del tipo de la urocinasa (SEC ID NO. 125), región V-III de la cadena pesada de inmunoglobulina (VH26) (SEC ID NO. 126), proteína DJ-1 (SEC ID NO. 127), apolipoproteína B-100 (SEC ID NO. 41), subunidad reguladora 8 diferente de la ATPasa de la proteasoma 26S (SEC ID NO. 128), receptor de interleucina-1 (SEC ID NO. 129), fibromodulina (SEC ID NO. 130), receptor del GM-CSF/IL-3/IL-5 (SEC ID NO. 131), nexina 3 clasificada (SEC ID NO. 132), cadena pesada H4 del inhibidor de inter-alfa-tripsina (SEC ID NO. 42), C4 complementaria (SEC ID NO. 43), C3 complementaria (SEC ID NO. 44), proteina 3 semejante y enriquecida en ácido glutámico de aglutinación al dominio de SH3 (SEC ID NO. 45) , proteina 1 inducida por la interleucina-4 (SEC ID NO. 46), hemopexina (SEC ID NO. 47), proteina de interacción con Hsc70 (SEC ID NO. 48), cadena no variable (Ii) (SEC ID NO. 133), proteina 2 de respuesta al receptor de ácido retinóico (SEC ID NO. 134) , fibronectina (SEC ID NO. 135), catepsina B (SEC ID NO. 136), tripeptidil-peptidasa II (SEC ID NO. 137), legumaina (SEC ID NO. 138), receptor del factor de activación de las plaquetas (SEC ID NO. 139), poli-alfa-2.8-sialiltranferasa (SEC ID NO. 140), proteina Rab-llB relacionada con ras (SEC ID NO. 141) como un marcador para RA, es provisto. Preferentemente el polipéptido es utilizado como un marcador para la RA erosiva. También se prefiere utilizar el polipéptido como un marcador para la RA no erosiva. Es preferido especialmente el uso de la proteina 1 inducida por la interleucina-4 (SEC ID NO. 46) como un marcador para la RA. El polipéptido Figl no ha sido conocido como un marcador para la RA hasta ahora, y se considera como un marcador candidato importante para la RA. El diagnóstico de RA se puede hacer examinando la expresión y/o composición de un polipéptido o marcador del péptido para RA, por una variedad de métodos, incluyendo ensayos inmunosorbentes enlazados a la enzima (ELISAs) , transferencias de Western, inmunoprecipitaciones e inmunofluorescencia . Una muestra de prueba de un individuo es evaluada para verificar la presencia de una alteración en la expresión y/o una alteración en la composición de un polipéptido o un péptido de la presente invención. Una alteración en la expresión de un polipéptido o péptido puede ser, por ejemplo, una alteración en la expresión del polipéptido cuantitativo (es decir, la cantidad del polipéptido producido) ; una alteración en la composición de un polipéptido es una alteración en la expresión cualitativa del polipéptido (por ejemplo, la expresión de un polipéptido mutante o de una variante de empalme diferente) . Ambas de tales alteraciones (cuantitativa y cualitativa) también pueden estar presentes. Una "alteración" en la expresión o en la composición del polipéptido, como se utiliza aquí, se refiere a una alteración en la expresión o composición en una muestra de prueba, cuando se compara con la expresión o composición del péptido o polipéptido en una muestra de control. Una muestra de control es una muestra que corresponde a la muestra de prueba (por ejemplo, que es del mismo tipo de las células) y es de un individuo que no está afectado por la RA. Una alteración en la expresión o composición del péptido o polipéptido en la muestra de prueba, cuando se compara con la muestra de control, es indicativa de RA o una susceptibilidad a RA. Varios medios para examinar la expresión o composición de un péptido o polipéptido de la presente invención pueden ser utilizados, incluyendo espectroscopia, colorimetría, electrofóresis, enfocamiento isoeléctrico e inmunoensayos (por ejemplo, David et al., Pat U.S. No. 4,376,110) tal como inmunotransferencia (véase también Current Protocols in Molecular Biology, particularmente capitulo 10). Por ejemplo, en una modalidad, un anticuerpo capaz de aglutinación al polipéptido (por ejemplo, como se describió anteriormente) , preferentemente un anticuerpo con una etiqueta detectable, puede ser utilizado. Los anticuerpos pueden ser policlonales, o más preferentemente, monoclonales . Un anticuerpo intacto, o un fragmento del mismo (por ejemplo, Fab o F(ab' )2) puede ser utilizado. El término "etiquetado", con respecto a la sonda o anticuerpo, está propuesto para abarcar la etiquetacion directa de la sonda o anticuerpo por unión (es decir, enlazar físicamente) una substancia detectable a la sonda o anticuerpo, así como la etiquetacion indirecta de la sonda o anticuerpo por la reactividad con otro reactivo que está etiquetado directamente. Los ejemplos de la etiquetacion directa incluyen la detección de un anticuerpo primario utilizando un anticuerpo secundario etiquetado fluorescentemente y la etiquetacion final de una sonda de ADN con biotina de tal modo que la misma pueda ser detectada con • streptavidina etiquetada fluorescentemente. El análisis Western, que utiliza un anticuerpo como se describió anteriormente que se aglutina específicamente a una péptido o- polipéptido de la presente invención, puede ser utilizado para medir el nivel o cantidad de un péptido o polipéptido en una muestra de prueba y compararla con el nivel o cantidad del péptido o polipéptido en una muestra de control. Preferentemente, el péptido o polipéptido en una muestra de prueba es medido en un inmunoensayo homogéneo o en uno heterogéneo. Un nivel o cantidad del polipéptido en la muestra de prueba que es más elevado o inferior que el nivel o cantidad del polipéptido en la muestra de control, de tal modo que la diferencia sea estadísticamente significativa, es indicativo de una alteración en la expresión del polipéptido, y es de diagnóstico para una RA o una susceptibilidad a RA. Por lo tanto, la presente invención también se refiere a una composición de diagnóstico que comprende un anticuerpo reactivo con un péptido antigenico de la clase II de MHC de la invención. En una modalidad adicional, los péptido antigénicos de la invención o las proteínas de las cuales las mismas son derivadas, pueden ser utilizados en la prevención y tratamiento de una enfermedad, preferentemente de RA. Un aspecto de la invención es un propósito terapéutico, en donde uno o más de los péptidos antigénicos identificados son utilizados para vacunar pacientes contra RA, preferentemente contra RA erosiva y/o no erosiva. En el curso de la vacunación, el péptido antigénico podria inducir una tolerancia a la célula T especifica para el antigeno en el paciente la cual podria conducir por último a la regresión de la enfermedad o a una atenuación del desarrollo de la enfermedad. Una estrategia prometedora para inducir la tolerancia inmune especifica en ensayos clínicos futuros es el uso de vacunas tolerantes de ADN. Las vacunas tolerantes de ADN que codifican los autoantígenos solos, se mostró que reducen las respuestas proliferativas de la célula T (Ruiz, P. et al., J Immunol 162 (1999) 3336-3341), mientras que las vacunas que toleran el ADN co-suministran el autoantígeno más IL4 también indujeron respuestas de TH2 protectoras (Garren, H. et al., Immunity 15 (2001) 15-22) . Los ejemplos de las terapias tolerantes específicas diferentes de los nucleótidos bajo desarrollo, incluyen antígenos de la proteína, péptidos procesados naturalmente, ligandos de péptidos alterados, otras biomoléculas, tales como ADN, o proteínas y péptidos que contienen modificaciones post-translacionales, y antígenos derivados oralmente para inducir la "tolerancia oral" (revisado en: Robinson, W. H. et al., Clin Immunol 103 (2002)' 7-12) . Un efecto potencial adverso con respecto a las terapias tolerantes es el desarrollo de autoinmunidad. Para este fin, los péptidos antigénicos de RA relevantes pueden ser administrados directamente al paciente en una cantidad suficiente para que los péptidos se aglutinen a las moléculas de.MHC; y provoquen la tolerancia periférica de las células T. Alternativamente, los péptidos antigénicos de la invención puede ser utilizados para la generación de vacunas basadas en DCs . En este caso, las DCs autólogas derivadas de los rnonocitos de los pacientes pueden ser sometidas a impulsos de péptidos relevantes o proteínas recombinantes que contienen las secuencias del péptido relevante. Por lo tanto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un péptido antigénico de la clase II de MHC que comprende (a) al menos la secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido seleccionado del grupo que consiste de las SEC ID NOs. 49 a 57 y SEC ID NOs. 103 a 122, o (b) al menos la secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido seleccionado del grupo que consiste de las SEC ID NOs. 49 a 57 y SEC ID NOs . 103 a 122, con secuencias de flanqueo N- y C-terminales adicionales de . una secuencia correspondiente seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOs. 1 a 39 y SEC ID NOs. 58 a 102, un anticuerpo reactivo con el péptido antigénico, o un péptido seleccionado del grupo que consiste de las SEC ID NOs. 40 a 48 y SEC ID NOs. 123 a 141, y opcionalmente un excipiente, diluyente o portador farmacéuticamente aceptable. El péptido antigénico tiene que estar presente en una cantidad suficiente para tolerar los linfocitos específicos. Tal cantidad dependerá del péptido utilizado, la administración, la severidad de la enfermedad que va a ser tratada y las condiciones generales del paciente, y usualmente variará desde 1 hasta 50 mg/ml, por ejemplo en el caso de los péptidos que son cargados sobre las células dendríticas. Un excipiente, diluyente o portador aceptable puede ser una solución salada amortiguada con fosfato para estudios in vitro y soluciones de sal fisiológica para aplicaciones in vivo . "Vacunación" significa aquí tanto la inmunización activa, es decir, la administración in vivo de los péptidos para producir una tolerancia inmuno in vivo directamente en el paciente como la inmunización pasiva, es decir el uso de los péptidos para tolerar los linfocitos de la célula T de CD4+ o para estimular las células dendríticas autólogas o alogenéicas, las cuales son re-inoculadas subsiguientemente en el paciente. La presente invención también proporciona los péptidos antigénicos, anticuerpos, ácidos nucléicos, células hospederas, métodos, composiciones y usos substancialmente como se describió aquí anteriormente, de manera especial con referencia a los ejemplos. Habiéndose descrito ahora de manera general esta invención, la misma llegará a ser mejor entendida por la referencia a los ejemplos específicos, los cuales están incluidos aquí para propósitos de ilustración solamente y no están propuestos para ser limitativos a menos que se especifique de otra manera, con relación a las siguientes figuras . Ejemplos Los ejemplos que se dan enseguida son ilustrativos de manera relacionada con las figuras descritas anteriormente y basado en la metodología en la figura 1, como se describe a continuación. Los reactivos disponibles comercialmente referidos en los ejemplos, fueron utilizados de acuerdo con las instrucciones del fabricante a menos que se indique de otra manera. Metodología de la Invención Células dendríticas y su cultivo El estudio fue efectuado con células dendríticas humanas que fueron diferenciadas de los monocitos, como se describe posteriormente. Los monocitos fueron purificados a partir de la sangre periférica humana. La sangre fue tomada de donadores sanos con los siguientes haplotipos: (1) HLA-DRB1*0401, *03011, (2) HLA-DRB1*0401, *0304, (3) HLA-DBR1*0401, *1301, (4) HLA-DRB1*0401, *0701, HLA-DRB1*0401, *0407. Todas las células fueron cultivadas en un medio RPMI 1640 (de manera resumida: RPMI) suplementado con 1 mM Piruvato, 2 mM glutamina y 10 % de suero de bovino fecal inactivado con calor (Gibco BRL, Rockville, MD) . Aislamiento de células mononucleares de la sangre periférica ( PBMCs ) La sangre periférica fue obtenida del banco de sangre en Mannheim, Alemania, como preparaciones de recubrimiento amortiguadas estándares de donadores sanos. La heparina (200 I.U./ml de sangre, Liquemine Roche) fue utilizada para prevenir la formación de coágulos. Las células mononucleares de la sangre periférica (PBMCs) fueron aisladas por centrifugación en LSM® (1.077-1.080 g/ml; ICN, Aurora, OH) a 800 g (temperatura ambiente) durante 30 minutos. Las PBMCs fueron colectadas de la inferíase y se lavaron 2 veces en RPMI que contiene 20 mM de Hepes (500 g durante 15 minutos, 300 g durante 5 minutos) . . Para remover los eritrocitos, los PBMCs fueron tratados con el amortiguador ALT (140 mM cloruro de amonio, 20 mM Tris, pH 7.2) durante 3 minutos a 37 °C. Las PBMCs fueron lavadas dos veces con RPMI que contienen 20 mM de Hepes (200 g durante 5 minutos) .

Generación de células dendríticas a partir de monocitos de la sangre periférica. Los monocitos fueron aislados de PBMCs por clasificación positiva utilizando perlas magnéticas anti-CD14 (Milteny Biotech, Auburn, CA) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los monocitos fueron cultivados en RPMI suplementado con 1 %de aminoácidos no esenciales (Gibco, BRL, Rockville, MD) , 50 ng/ml de factor estimulante de la colonia de macrófagos de los granulocitos humanos recombinantes (GM-CSF; S.A. l.lxlO7 U/mg) (Leucomax; Novartis, Basilea, Suiza) y 3 mg/ml de IL-4 humana recombinante (S.A. 2.9 x 104 ü/µg) (R&D Systems, Minneapolis, MN) . Los monocitos fueron sembrados a 0.3 x 106/ml en placas de 6 cavidades (Costar) durante 5 dias para obtener las células dendriticas inmaduras . La calidad de las células dendriticas inmaduras derivadas de los monocitos fue verificada rutinariamente por análisis citométrico de flujo y se evaluó que sean apropiadas cuando las mismas exhibieron el siguiente fenotipo: CDla (elevado), CD3 (neg. ) , CD14 (bajo), CD19 (neg.), CD56 (neg.), CD80 (bajo), CD83 (neg.), CD86 (bajo) y HLA-DR (elevado) . En contraste, las células dendriticas maduras (cotéjese posteriormente) exhiben el siguiente fenotipo: CDla (bajo), CD80 (elevado), CD83 (elevado), CD86 (elevado), y HLA-DR (elevado) . Los anticuerpos monoclonales contra CDla, CD3, CD14, CD19, CD56, CD80, CD83, CD86 así como, los controles de isotipo respectivos, fueron comprados de Pharmingen (San Diego, CA) . Exposición de las células dendríticas al suero o fluido sinovial El suero y el fluido sinovial fueron irradiados durante 30 minutos con 137Cs (70 TBq) . Para alimentar las células dendríticas con el antígeno derivado del suero o de la sinovia, las células dendríticas inmaduras en una cantidad de 6 x 106 fueron sometidas a impulsos con ya sea 1 mi de suero o 0.6 mi de fluido sinovial. Al mismo tiempo se indujo la maduración de las células dendríticas agregando 10 ng/ml del factor alfa de la necrosis del tumor, humano, recombinante (TNFa; S.A. 1.1 x 105 ?/µ?) . Como un control, 6 x 106 células dendríticas inmaduras fueron incubadas sólo con TNFa. Después de 24 horas en cultivo, las células dendríticas maduras fueron colectadas por centrifugación a 300 g durante 10 minutos. Las células fueron lavadas con PBS y transferidas a un tubo eppendorf. Después de la centrifugación a 400 g durante 3 minutos, el sobrenadante fue removido completamente y las células fueron congeladas a -70 °C. Generación de perlas de la clase II de anti-HLA El anticuerpo monoclonal anti-HLA-DR (mAb) L243 (ATCC, Manassas, VA) fue producido por el cultivo de la linea celular del hibridoma del ratón respectivo. mAb L243 fue purificado utilizando proteina A sefarosa (Pharmacia, Uppsala, Suecia) y se inmovilizó hasta perlas de sefarosa activadas con CNBr (Pharmacia) a una concentración final de 2.5 mg/ml, de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las perlas de L243 fueron almacenadas en PBS que contienen 0.1 %, de Zwittergent 3-12 (Calbiochem, La Jolla, CA) . Purificación a nano-escala de los complejos de HLA-DR-péptido Las pelotillas de las células dendriticas congeladas fueron resuspendidas en 10 veces el volumen del amortiguador de la lisis enfriado con hielo (1 % Triton-X-100, 20 mM Tris, pH 7.8, 5 mM MgCl2, que contienen inhibidores de proteasa como la quimiostatina, pepstatina, PMSF y leupeptina (Roche, Mannheim, Alemania) ) y se lisó en un agitador horizontal a 1000 rpm, 4 °C durante 1 hora. El lisado celular se despejó de los desechos celulares y los núcleos por centrifugación a 10000 g, 4°c durante 10 minutos. El lisado fue co-incubado con perlas de L243 (5-10 µ? de perlas de L243 por 100 µ? lisado celular) en un agitador horizontal a 1000 rpm, 4°C durante 2 horas. Los complejos de HLA-DR inmunoprecipitados unidos a las perlas L243 fueron sedimentados por centrifugación a 1000 g, 4°C durante 1 minuto y se lavaron 4 veces con 500 µ? de 0.1 % de Zwittergent 3-12 (Calbiochem) en PBS .

La eficacia de agotamiento de los complejos de HLA-DR-péptido fue verificada por el análisis de los Usados celulares respectivos y después inmunoprecipitación y las alícuotas de las perlas por transferencia de Western utilizando el mAb 1B5 específico de anti-HLA-DRoc (Adams, T.E. et al., Immunology 50 (1983) 613-624). Elución de los péptidos asociados con HLA-DR Los complejos de HLA-DR-péptido unidos a las perlas de 1243 fueron resupendidos en 100 µ? de H20 (grado CLAR; Merck, Darmstadt, Alemania) , transferidos a un tubo de ultrafiltración, Ultrafree MC, corte de 30 kD (Millipore, Bedford, MA) y se lavaron 10 veces con 100 µ? de H20 (grado CLAR) por centrifugación durante 1-2 minutos a 10000g a TA. Para elución de los péptidos unidos, 60 µ? de ácido trofluoroacético al 0.1 % (Fluka, Buchs, Suiza) en H20 (grado CLAR) fueron agregados y la incubación se efectuó durante 30 minutos a 37 °C. Los péptidos eluidos fueron colectados en un tubo de eppendorf nuevo por centrifugación de la unidad Ultrafree a 10000 g durante 3 minutos a TA e inmediatamente se liofilizaron en una máquina centrífuga de vacío Speed-Vac™. Fraccionamiento por LC de nanoflu o bidimensional Para efectuar la secuenciación de alto rendimiento de las mezclas de péptidos complejas, la MudPIT (tecnología de identificación de proteína multidimensional) fue utilizada (Washburn, M.P. et al., Nat Biotechnol 19 (2001), 242-247) la cual está basada en el fraccionamiento cromatográfico liquido seguido por determinación de la secuencia espectrométrica de masa. Para este fin, los péptidos liofilizados eluidos de las moléculas de BLA fueron resuspendidas en un amortiguador que contiene 5 % (v/v) de acetonitrilo (ACN) , 0.5 % (v/v) de ácido acético, 0.012 % (y/v) de ácido heptafluoro butírico (HFBA) y 1 % (v/v) de ácido fórmico. La mezcla de péptidos se fraccionó sobre una columna microcapilar de sílice fundido (100 µ?a i.d. x 375 µ?a) generado por un extractor lasérico modelo P-2000 (Sutter Instrument Co. Novato, CA) . La microcolumna fue empacada con 3 µp?/material de fase inversa C18 (C18-ACE 3 pm [ProntoSIL 120-3-C18 ACE-EPS, Leonberg, Alemania]) seguido por tres cm de material de intercambio catiónico de 5 µ?t? (Partisphere SCX, hatman, Clifton, EUA) . Una separación del gradiente de 8 etapas totalmente automática sobre una columna de CLAR LC Packings UltiMate (LC Packings, San Francisco, EUA) fue llevada a cabo, utilizando los siguientes amortiguadores: 5 % ACN/0.012% HFBA/0.5 % ácido acético (amortiguador A), 80 % ACN/0.012 % HFBA/0.5 % ácido acético (amortiguador B) , 250 mM acetato de amonio/5 % ACN/0.012 % HFBA/0.5 % ácido acético (amortiguador C) , y 1.5 M acetato de amonio/5 % ACN/0.012 % HFBA/0.5 % ácido acético (amortiguador D) . La primera etapa de 116 minutos consistió de un gradiente de 75 minutos desde 0 hasta 40 % del amortiguador B seguido por 10 minutos del gradiente desde 40 hasta 80 % del amortiguador B, un periodo de retención de 6 minutos a 80 % del amortiguador B y una etapa de equilibrio de 10 minutos con 100 % del amortiguador ?. Las siguientes 5 etapas (de 146 minutos cada una) estuvieron caracterizadas por el siguiente perfil: 5 minutos de 100 % del amortiguador A, 5 minutos del gradiente desde 0 hasta x % del amortiguador C, 5 minutos de 100 % del amortiguador A, 30 minutos del gradiente desde 0 hasta 10 % del amortiguador B, 55 minutos del gradiente desde 10 hasta 35 % del amortiguador , 20 minutos del gradiente desde 35 hasta 50 % del amortiguador B, 10 minutos del gradiente desde 50 hasta 80 % del amortiguador B, un periodo de retención de 6 minutos a 80 % del amortiguador B, y una etapa de equilibrio de 10 minutos con 100 % del amortiguador ?. Los porcentajes del amortiguador C (x) en las etapas 2-6 fueron como sigue: 20, 40, 60, 80, y 90 %. El gradiente de 30 minutos desde 0 hasta 10 % del amortiguador B, el cual es la primera etapa de elución lineal desde el material de fase inversa, fue necesario para separar suficientemente la elución del péptido de la elución de un contaminante principal (m/z=945) el cual podría conducir de otra manera a la pérdida de los picos del péptido más hidrofílicos . La etapa 7 consistió del siguiente perfil: 5 minutos del amortiguador A al 100 %, 20 minutos del amortiguador C al 100 %, 5 minutos del gradiente desde 0 hasta 10 % del amortiguador B, 35 minutos del gradiente desde 10 % hasta 35 % del amortiguador B, 50 minutos del gradiente desde 35 hasta 50 % del amortiguador B, 10 minutos del gradiente desde 50 hasta 80 % del amortiguador B, un período de retención de 5 minutos al 80 % del amortiguador B y una etapa de equilibrio de 10 minutos con 100 % del amortiguador A. La etapa 8 fue idéntica a la etapa 7 con la excepción de la utilización del amortiguador D en lugar del amortiguador c. Espectrometría de masa de MS/MS con trampa de iones La columna de CLAR fue acoplada directamente a un espectrómetro de masa con trampa de iones Finnigan LCQ Deca XV (Thermo Finnigan, San José, USA) equipado con una fuente de ionización por electrorrociado nano-LC. La espectrometría de masa en el modo de MS/MS fue efectuada de acuerdo con le protocolo del fabricante. Los péptidos fueron identificados por el algoritmo de SEQUEST (patentes Ü.S. 6,017,693 y 5,538,897) . Espectrometría de masa de MALDI-TOF Los péptidos aplicados como manchas sobre una placa AnchorChip fueron co-cristalizados con la matriz (5 mg/ml; ácido a-ciano-4-hidroxi-cinámico (Merck, Darmstadt, Alemania), 50 % de acetonitrilo, 0.1 % de ácido trifluoroacético) . Para el análisis cualitativo del repertorio del péptido completo, las muestras fueron analizadas sobre un espectrómetro de masa MALDI-TOF Ultraflex™ (Brukerr Bremen, Alemania) , de acuerdo con el protocolo del fabricante. Identificación de la secuencia por SEQÜEST y análisis del conjunto de datos diferencial Los datos de fragmentación de MS/MS fueron analizados con el software SEQÜEST (Thermo Finnigan, San José, USA) . Desde una base de datos de proteina doméstica, la cual fue creada con base en las bases de datos públicas Swiss-Prot y TrEMBL, SEQÜEST extrajo para cada espectro la totalidad de secuencias del péptido que correspondieron a la masa molecular del ion original y midió el grado de semejanza entre el espectro experimental y el espectro generado in silico, teórico. Solamente la secuencia candidata de evaluación superior fue listada. Las secuencias del péptido derivadas del análisis SEQÜEST y su información acompañante sobre la exactitud de la masa, los parámetros de evaluación y el origen del péptido fueron almacenados en una base de datos relacionada diseñada apropiadamente y se procesaron adicionalmente . Ciertas restricciones fueron forzadas para garantizar el almacenamiento de sólo las secuencias significativas con evaluaciones de SEQÜEST satisfactorias. Las dos restricciones más importantes fueron (i) mantener solamente estas secuencias que tienen un coeficiente de correlación cruzada (CC) más elevado que un cierto valor y (ii) desde las secuencias restantes, cuidar aquellas que tienen una delta del coeficiente de correlación cruzada (ACC) predefinido. Para ambos criterios, los valores elegidos mínimos están basados en el conocimiento empírico de la interpretación de los resultados de SEQÜEST. El conjunto de datos fue definido como la suma de datos desde un conjunto particular de espectros. El diseño de la base de datos y el software permitieron averiguaciones sobre un conjunto de datos único así como comparaciones de los conjuntos de datos múltiples. Tal base de datos y diseño de software hacen posible el análisis de muestras comparativas, lo cual no es provisto por SEQUEST. Por ejemplo, las posibles averiguaciones sobre un conjunto de datos único podría proporcionar información sobre la distribución de la evaluación entre los espectros almacenados, sobre la existencia de gradientes de la longitud de la secuencia adicionales o substancias comunes, o sobre el origen proteínico de las secuencias del péptido. Puesto que la presentación de variantes truncadas del mismo epítopo es una característica general de los péptidos unidos a MHC de la clase II, la existencia de variantes de longitud en un conjunto de datos proporciona una fuerte evidencia adicional de la presencia de un epítopo en un conjunto de espectros.

La característica más importante en el análisis de los conjuntos de datos múltiples es la posibilidad de extraer un subconjunto común de secuencias que satisfagan un criterio dado. Tal criterio podría estar basado en la semejanza de la secuencia, por ejemplo, dentro de todas las secuencias de una colección de conjuntos de datos, estas secuencias fueron seleccionadas porque tuvieron al menos una subsecuencia en común con cualquier otra secuencia. Tales comparaciones a través de diferentes conjuntos de datos constituyen el método diferencial (muestras de RA contra las muestras de control) y por medio de esto optimizan la búsqueda de los péptidos marcadores de RA candidatos. Las evaluaciones de semejanza por pares entre las secuencias fueron calculadas por una rutina del software, la cual es una implementación de un algoritmo de comparación de la hebra estándar. Subsiguientemente, estas evaluaciones fueron utilizadas para agrupar las secuencias relacionadas estrechamente (secuencias que comparten una subsecuencia común) en grupo bien separados por una rutina de software desarrollada adicionalmente, la cual está basada en un algoritmo bien establecido (agrupación jerárguica, UPG A) . Los grupos generados (por ejemplo de variantes truncadas del péptido) fueron utilizadas entonces para identificar las secuencias relacionadas estrechamente a través de conjuntos de datos diferentes.

Por lo general, el software de evaluación de los datos proporcionó la capacidad para efectuar de manera rápida y reproducible lo siguiente: - Seleccionar de los resultados de la secuencia generados por SEQÜEST aquellas secuencias que satisfagan de manera confiable los criterios empíricos. -Almacenar los datos en una base de datos diseñada apropiadamente para el proceso descubierto a mano. - Extraer la información acerca del contenido de la secuencia de cada conjunto de datos almacenado. Esta información es valiosa en la evaluación de la importancia de las secuencias individuales dentro de la base de datos dada y, en consecuencia, a través de conjuntos de datos múltiples. - Proporcionar, en virtud de comparaciones de bases de datos múltiples, una herramienta que realice el método diferencial, especialmente el estudio del contenido de la secuencia actual de una muestra contra las otras. Purificación de las moléculas de HLA-DR Las moléculas de HLA-DR fueron purificadas a partir de 1010 líneas de la célula B transformadas con EBV o transfecatantes T2 por cromatografía de afinidad, usando el anticuerpo monoclonal anti-DR L243, como se describió previamente (Krospshofer H. et al, PNAS 92 (8313-8317) . Ensayo de aglutinación del péptido in vitro La HA (307-319), PKYVKQNTLKLA , es un epítopo inmunodominante de la hemaglutinina del virus de la influenza que se aglutina bien a las moléculas de HLA-DR4 y fue utilizado como un péptido reportero en un ensayo de aglutinación del péptido in- vitro (Rothbard, J.B. et al, Cell (1988) 52:515-523) . Las moléculas de HLA-DR4 solubilizadas con detergente, purificadas (200 mM) fueron co-incubadas con el péptido HA(307-319) biotinilado (200 mM) y cantidades graduadas del péptido competidor (100 mM - 10 µ?) durante 24 horas a 37°C en un amortiguador de aglutinación (fosfato de sodio 50 mM, citrato de sodio 50 mM, pH 4.8, 0.1 % Zwittergent 3-12) en un volumen total de 50 µ?. Los péptidos competidores fueron derivados de los antigenos de RA candidatos identificados en este estudio y comprados como péptidos sintéticos de Medprobe (Lund, Suecia) . 3 x 10 (il fueron diluidos entonces 10 veces en PBS que contienen 0.05 % de Tween-20 y 1 % de BSA y se incuba durante 2 horas en una placa de microtitulación (Nalge Nunc) , la cual ha sido recubierta durante la noche con el anticuerpo monoclonal anti-DR L243. Después de esto las muestras fueron desarrolladas por incubación con 0.1 µg/ml de estreptavidina etiquetada con EU ( allay Yo, Turku, Finlandia) durante 45 minutos de acuerdo con el protocolo del fabricante. Después del lavado intensivo con 0.05 % de Tween-20 en PBS, la florescencia de europio fue medida con un fluorómetro de resolución durante el transcurso del tiempo (VICTOR 1420, Wallac/Perkin Elmer Life Sciences) para cuantificar el péptido ?? (307-319) biotinilado a las moléculas de HLA-DR4 (Ardnt, S.O. et al., EMBO J. 19 (2000) 2141-1251). Ejemplo 1 En este ejemplo, la técnica mencionada en la figura 1 fue utilizada para identificar los marcadores del péptido asociados con HLA-DR novedosos derivados del suero y el fluido sinovial de pacientes con RA no erosiva. 6 x 106 células dendriticas inmaduras fueron sometidas a impulsos con ya sea 1 mi de suero (5 muestras) o 0.6 mi de fluido sinovial (2 muestras) de pacientes con RA no erosiva y se cultivaron 24 horas en la presencia de 10 mg/ml de TNFa. Como un control, 6 x 106 células dendriticas fueron cultivadas en la presencia de TNFa (10 mg/ml) sin agregar suero sino 1 mi de PBS . En un experimento adicional 6 x 106 células dendriticas fueron sometidas a impulsos con 1 mi de suero de 2 personas de prueba sanas y se cultivaron durante 24 horas en la presencia de TNFa (10 mg/ml) . Las células dendriticas fueron Usadas en TX-100 detergentes y las moléculas de HLA-DR fueron - aisladas utilizando mAb L243. Los péptidos asociados con HLA-DR fueron eluidos con 0.1 % de TFA y se analizaron por tecnología 2D-LC-MS/MS de alto rendimiento. La identificación del péptido fue lograda utilizando el algoritmo SEQUESST. Las secuencias del péptido derivadas del análisis SEQUEST y la información acompañante para la exactitud en serie, los parámetros de evaluación y el origen del péptido fueron almacenados en una base de datos y procesados adicionalmente. , Las secuencias del péptido identificadas de las DCs no sometidas a impulsos (control 1) y de las DCs sometidas a impulsos con el suero de personas de prueba sanas (control 2 ) fueron comparadas con las secuencias del péptido identificadas de DCs sometidas a impulsos del suero de pacientes con RA no erosiva. Entre las secuencias específicas de RA, solamente estos péptidos fueron seleccionados para la evaluación adicional que volvió a ocurrir en al menos 3 de 5 muestras de RA no erosiva. En cada muestra de suero aproximadamente 600 + 150 secuencias del péptido individual (coeficiente de correlación cruzado CC > 3.0 y ACC > 0.15) fueron identificadas. En las muestras sinoviales el número de secuencias del péptido individual fue ligeramente más pequeño (400+30) . Aproximadamente 80-85 % del péptido encontrado en las muestras de RA también fueron identificadas en las muestras de control, subrayando la alta capacidad de reproducción del análisis. En la mayoría de los casos, diversas variantes de longitud del mismo epítopo podrían ser identificadas, lo cual es una característica típica de los antígenos unidos a MHC de la clase II y soporta la validez de los resultados (Jones, E.

Y., Curr Opin Imirtunol 9 (1997) 75-79). La confianza adicional en la calidad de los datos esta basada en el hecho de que varios de los péptidos o proteínas identificadas ya han sido descritos en el contexto de los epítopos de las moléculas de la clase II de MHC derivados de proteínas adecuadas semejantes a Hsp70, enolasa, anexina II , catepsina C o colágeno II así como de las moléculas de MHC (HLA-A, -B, -C, -E, -G, y p2-irLÍcroglobulina) y CLIP (Chicz, R.M. et al, J. Exp Med 178 (1993) 27-47; Siniglagia, F. y Hammer, J. Curr Opin Immunol 6 (1994) 52-56; Arnold-Schild, D. et al., J Immunol 162 (1999) 3757-3760; Vogt, A.B. y Kropshofer, H. Trends Biochem Sci 4 (1999) 150-154) fueron detectados frecuentemente . Las secuencias del péptido específicas para RA fueron validadas adicionalmente con respecto a la aglutinación al alelo DRB1*0401 con susceptibilidad a RA utilizando el software TEPITOPE (Hammer, J. et al., Adv Immunol 66 (1997) 67-100) . Este software proporciona medios para la predicción cualitativa y cuantitativa de los epítopos de la célula . La producción del estudio consiste de un epxtopo que estuvo presente, aparte de una excepción, solamente en las muestras de RA no erosiva (Tabla 1) . Tiol reductasa lisosómica inducible por interferón gamma Un epxtopo muy interesante que fue identificado en 3 de 7 muestras de RA no erosivas del suero y la sinovia es derivado de la tiol reductasa lisosómica inducible por el interferón gamma (GILT) : el 16-mer GILT (192-207) con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO. 3 (Tabla 1) . Las variantes de longitud adicional en tres de las otras muestras soportan la relevancia de este epitopo (Tabla 1) : el 14- mer GILT (192-205; SEC ID NO. 1) y el 17- mer GILT (192-208; SEC ID NO. 2) . Como se juzgó de la variante de longitud más corta, GILT (192-205) , el epitopo contiene una porción de aglutinación adecuada, con respecto a la aglutinación al alelo DRB1*0401 de susceptibilidad a la RA: 196 M sirve como un sitio de fijación Pl, 199M como un sitio de fijación P4 y 201A como un sitio de fijación P6. De acuerdo con la evaluación de TEPITOPE, el epitopo tiene una evaluación de aglutinación (valor de umbral del 1% el cual es semejante al valor de aglutinación de un epitopo de la hemaglutinina de la influenza (307-319) que se mostró que va a ser un aglutinador de DRB1*0401 fuerte (Tabla 1) (Rothbard, J. B. et al., Cell 52 (1988) 515-523). GILT es expresado constitutivamente en las células que presentan el antigeno, tales como las células dendriticas, macrófagos y células B, y facilita el despliegue de los antigenos endocitosados en los compartimientos que contienen la clase II de MHC ( IIC) por la reducción enzimática de los enlaces de disulfuro, (Phan, Ü.T. et al., J Biol Chem 275 (2000) 25907-25914) . La aglutinación directa de GILT a las moléculas de HLA-DR ha sido reportada para las células B (Arunachalam, B. et al, J Immunol 160(1998) 5797-5806) . ün segundo epxtopo más bien largo de GILT se encontró que se aglutina a las moléculas de HLA-DR3: el 22-mer GILT (38-59) que ' tienen la secuencia de aminoácidos SPLQALDFFGNGPPVNYKTGNL (Chicz, R.M. et al., J Exp Md 178 (1993) 27-47). Además de GILT (192-207) , otro epitopo de la misma proteína fue identificado en varias muestras de RA, pero también en las muestras de control: GILT (210-227) con la secuencia de aminoácidos QPPHEYVPWVTVNGKPLE . Este epitopo estuvo acompañado por otras 3 variantes de longitud: el 16-mer GILT (210-225) , el 17-mer GILT (210-226) y el 19-mer GILT (210-228) . Como está indicado por su nombre, la expresión de GILT puede ser inducida por el interferón gamma de la citosina pro-inflamatoria (IFN-?) en varios tipos de células, incluyendo los macrófagos, las células endoteliales y los fibroblastos (Luster, A.D. et al., J Biol Chem 263 (1988) 12036-12043) . Como el IFN-? ya se sabe que está presente en las articulaciones inflamadas de los pacientes con RA, GILT podría llegar a ser sobre-expresado en la sinovia y en el suero y, por consiguiente, podría ser absorbido por las DCs como un antigeno exógeno. GILT (192-207) puede ser derivado de GILT exógeno. El otro epitopo de GILT, el cual también está presente en las muestras de control, puede ser derivado de GILT endógeno, expresado por las DCs. Alternativamente, tanto GILT (192-207) como GILT (210-227) pueden ser derivados de GILT endógeno, en el caso de que el procesamiento de GILT y la presentación del epitopo derivado de GILT por las DCs fueran alterados criticamente durante el contacto con el material asociado con RA. El epitopo identificado de GILT de la tiol reductasa lisosómica inducible por el interferón gamma (192-205) el cual ya ha sido descrito a detalle, fue analizado además en un ensayo de aglutinación in vitro utilizando el péptido de GILT (192-205) sintético y las moléculas de HLA-DR4 purificadas (figura 3) : de acuerdo con la evaluación de TEPITOPE, el péptido se mostró que se aglutina a HLA-DR4 con afinidad elevada, comparable con el péptido de HA(307-319) viral . Integrina beta-2 El análisis extendido reveló la presencia de un epitopo que fue identificado en dos de siete muestras de RA no erosivas del suero y sinovia y que es derivado de la sub unidad beta de la integrina (ITB2) : el 17-mer ITB2 (315-331; SEC ID NO. 58) con la secuencia de aminoácidos IQPIFAVTSRMVKTYE (Tabla 1) . Una variante de longitud fue encontrada: el 19-mer ITB2 (313-331; SEC ID NO. 59) soportando la validez del epítopo identificado (Tabla 1) . La secuencia del péptido contiene una porción de aglutinación de HLA-DRbl*0401 moderada con 3161 y 3191 que sirve como los sitios de fijación Pl y P4, respectivamente (valor de aglutinación TEPITOPE: 2 %) . Las integrinas son una familia de receptores de la superficie celular que desempeñan papeles importantes en la embriogénesis, sanado de las heridas, respuestas inmune, y adhesión celular. ITB2 es un receptor heterodimérico para las moléculas de adhesión intercelular y vascular (ICAMs y VCAMs) y expresadas exclusivamente sobre los leucocitos. Las ICAMs y VCAMs son miembros de la superfamilia de la inmunoglobulina que tienen una función central en las respuestas inmune humoral y mediada por la célula. Muchas citocinas, tales como interferón ?, IL-1 y TNFa, las cuales regularon ascendentemente las enfermedades inflamatorias semejantes a RA, inducen la expresión de ICAMs sobre la superficie de las células endoteliales . Se mostró que la expresión de ICAM-1 y VCAM-1 es más elevada en el tejido sinovial de los pacientes con RA cuando se compara con los pacientes con osteoartritis (Furuzawa-Carballeda, J. et al., Scand J Immunol 50 (1999) 215-222) . La aglutinación de ITB2 y otras integrinas a los ICAMs permite que los leucocitos se infiltren en sus tejidos objetivo, por ejemplo los sitios de inflamación. Para que funcionen de un modo circulante o no adherente, los leucocitos expresan consecutivamente ITB2 y otras integrinas con una capacidad de aglutinación baja del ligando. La interacción de ITB2-ICAM1 ha llegado a ser un objetivo estratégico importante para aproximarse a la inflamación, enfermedades autoinmunes y cáncer (Yusuf-Makagiansar, H. et al., Med Res Rev 22 (2002) 146-167), por consiguiente estos descubrimientos apoyan fuertemente la validez del epítopo de ITB2 identificado como un marcador candidato para RA. Fosfatidilinositol-4 , 5-bifosfato 3-cinasa Otro epítopo con una porción de aglutinación de HLA-DRB1*0401 moderada fue identificado en dos muestras de suero no erosivas: el 17-mer PI3K (792-808; SEC ID NO. 60) con la secuencia de aminoácidos NKVFGEDSVGVIFKNGD derivada de la fosfatidilinositol 3-cinasa (PI3K) (Tabla 1) . En este péptido 794V podría servir como un sitio de fijación de Pl hidrofóbico, 979E como un sitio de fijación P4 cargado negativamente, y 795S como un sitio de fijación DR4-P6 típico (valor de aglutinación TEPITOPE: 3%) . PI3K es expresado adecuadamente en muchos tipos celulares y lípidos fosforilados, predominantemente fosfatidilinositol-4, 5-bifosfato . La proteína ha surgido como un transductor clave de la señal para los receptores del factor de supervivencia, incluyendo los factores de crecimiento, citosinas, e integrinas (revisado por Toker, A. y Cantley, L. Nature 387 (1997) 673-676) . Además, la PI3K desempeña un papel importante en la ruta de señalización de los receptores semejantes a Toll (TLRs) que reconocen una variedad de productos microbianos, llamados colectivamente configuraciones moleculares asociadas al patógeno (PAMPs) (Fukao, T. y Koyasu, S., Trends Immunol 24 (2003) 358-363) . La estimulación por medio de TLRs por PAMPs, tales como el lipolisacárido (LPS) (endotoxina) desencadena la producción de varias citosinas, incluyendo IL-12, la cual es una citocina clave en las respuestas de Thl mediadas por TLR. Se mostró que PI3K es un supresor endógeno de la producción de IL-12 mediadas por TLR y limita la polarización de Thl excesiva. Por consiguiente, la PI3K se sugirió que va a ser un regulador negativo de las respuestas inmune innatas para prevenir la activación prolongada de la inmunidad innata perjudicial para el elemento hospedero. El conocimiento de que las respuestas autoinmunes en RA están basadas en las citosinas de Thl, enlaza por último la PI3 con RA. Aunque ningún patógeno especifico ha sido enlazado consistentemente con el desarrollo de RA, se cree que la RA se desarrolla en dos etapas en las cuales una respuesta inicial inducida por los antigenos extraños, se desarrolla subsiguientemente en una respuesta autoinmune autosostenida (Klinman, D., Arthritis Rheum 48 (2003) 590-593) . Activador del plasminogeno del tipo de la urocinasa Otro epitopo que fue encontrado solamente en las muestras no erosivas fue derivado de un activador de plasminogeno del tipo de la urocinasa (uPA) : la 16-mer uPA (328-343; SEC ID NO. 61) con la secuencia de aminoácidos YPEQLKMTVVKLISHR (Tabla 1) . Con respecto a la aglutinación de HLA-DRB1*0401, la secuencia revela una porción de aglutinación moderada: 332L, 335T, y 337V son sitios de fijación Pl, P4 y P6 putativos, respectivamente (valor de la evaluación de TEPITOPE: 2%). Los activadores del plasminogeno (PAs) son proteasas de serina altamente especificas que generan la plasmina a partir del plasminogeno. Dos tipos de PAs una del tipo de urocinasa (uPA) y una del tipo del tejido (tPA) han sido identificados en los mamíferos. Las actividades de PAs son controladas por los inhibidores naturales (PAIs) . La plasmina está involucrada en las reacciones inflamatorias por la inducción de las citosinas tales como TGF , y en la degradación del cartílago y fibrina. Las evidencias para la coagulación en curso dentro de la articulación reumatoide junto con una mejora de la síntesis de uPA y la activación en las articulaciones artríticas, han conducido a la hipótesis de que el sistema de PA/plasmina está asociado con la severidad clínica de la artritis (revisado por Busso, N. y Hamilton, J. A. Arthritis Rheum 46 (2002) 2268-2279) . Con base en los estudios in vitro, existen varios tipos de células presentes en las articulaciones inflamadas de los pacientes de RA, en particular los monocitos y los fibroblastos sinoviales que pueden expresar PAs y PAIs y que podrían contribuir por lo tanto a los niveles in vivo. La actividad de PAs (es decir uPA) es estimulada por las citocinas, tales como IL-1 y TNFcc, las cuales se sabe que van a ser altamente reguladas ascendentemente en el suero asi como en el fluido sinovial de los pacientes con RA. Estas lineas de evidencia hacen a la uPA (328-343) un marcador del péptido putativo para RA. Región V-III de la cadena pesada de de la inmunoglobulina (VH26) Uno de los epitopes identificados que exhibe una porción de aglutinación muy fuerte con respecto a la aglutinación de HLA-DRB1*0401 es derivada del segmento del gen VH26 de la cadena pesada de inmunoglobulina: la 16-mer VH26 (95-110; SEC ID NO. 62) con la secuencia de aminoácidos KNTLYLQMNSLRAEDT (Tabla 1) . El valor de aglutinación de TEPITOPE elevado (1 %) es una característica substancial del funcionamiento de 99Y como un sitio de fijación Pl muy potente, 102M como un sitio de fijación P4 moderado y 104S como un sitio de fijación P6 de HLA-DR típico. Las inmunoglobulinas (Ig) son responsables de la aglutinación del antigeno y estimulan las reacciones inmune adicionales, por ejemplo por la aglutinación a los receptores de Fe específicos para el isótopo. De manera interesante, el segmento del gen de VH26 humano parece que codifica un factor reumatoide sinovial de afinidad elevada y por consiguiente parece que tiene un impacto sobre el progreso de la RA (Wong, A., et al, Autoimmunity 20 (1995) 191-199) . El hecho de que el epitopo de VH26 identificado (95-110) se encontró en el suero de dos pacientes con RA seropositivos (Tabla 1) se correlaciona con la observación anterior. Proteína DJ-1 En dos muestras de RA no erosiva los estudios continuos de los inventores revelaron la presencia de un epitopo que es derivado de una proteina llamada DJ-1: la 16-raer DJ-1 (135-150; SEC ID NO. 63) con la secuencia de aminoácidos NGGHYTYSENRVEKDG (Tabla 1) . De acuerdo con la evaluación de TEPITOPE el péptido contiene una porción de aglutinación de HLA-DRB1*0401 más bien débil con 139Y que sirve como un sitio de fijación de Pl, 142S como un sitio de fijación P4 y 144N como un sitio de fijación de P6 posible (valor de la aglutinación 8 %) . DJ-1 pertenece a la familia de proteínas de ThiJ/PfpI cuyos miembros son distribuidos de manera evolucionada desde Archaea hasta Eukaria. Las proteínas de ThiJ/PfpI comparten un dominio de ThiJ conservado que está relacionado estructuralmente con el dominio de glutamina amidotransferasa del tipo I (Lee, S.J. et al., J Biol Chem 25 (2003) publicación E arriba de la impresión) . DJ-1, la cual es expresada preferentemente en los testículos y moderadamente en otros tejidos, fue identificada primero como un candidato novedoso del producto del oncógeno que transformó las células de NIH3T3 del ratón en cooperación con ras. En el tiempo promedio los papeles fisiológicos adicionales de la DJ-1 fueron revelados incluyendo una fuerte correlación con la enfermedad de Parkinson y fertilización con esperma. DJ-1 parece que tiene funciones múltiples - aquí se proporciona la primera indicación para una asociación de DJ-1 con RA. Ejemplo 2 En este ejemplo, la misma tecnología fue utilizada que aquella que ha sido descrita con detalle en el ejemplo 1. El suero (6 muestras) y el fluido sinovial (2 muestras) de los pacientes con RA erosiva diagnosticada fueron utilizados en este caso para identificar los marcadores candidatos específicos para la RA erosiva. Las secuencias del péptido encontradas en las muestras de RA erosiva fueron comparadas con las secuencias identificadas en las DCs no sometidos a impulsos (control 1) y en las DCs sometidas a impulsos con el suero de personas de prueba sanas (control 2) . Entre las secuencias específicas de RA, solamente fueron seleccionados estos péptidos para la evaluación adicional que volvió a ocurrir en al menos tres de seis muestras de RA erosiva. En este estudio un epitopo fue descubierto el cual estuvo presente, aparte de una excepción, solamente en las muestras de RA erosiva. Apolipoproteina B-100 El epitopo que fue encontrado principalmente en el suero con RA erosiva (4 de 8 muestras con RA erosiva) es derivado de la apolipoproteina B-100: la 16-mer ApoB (2877- 2892) con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO. 4 (Tabla 2) . Además, una variante de longitud del mismo epitopo fue identificada (Tabla 2) : la 17-mer ApoB (2877-2893; SEC ID NO. 5) . La siguiente porción de aglutinación de DRB1*0401 puede ser predicha: 2881L como un sitio de fijación Pl, 2884D como un sitio de fijación P4 y 2886N como un sitio de fijación P6 (valor de la aglutinación: 3%) . En un estudio inicial sobre las células, EBV-B, el epitopo ApoB (2885-2900) , el cual se superpone parcialmente con el epitopo descrito aquí, ha sido encontrado en el contexto de HLA-DR4 (Chicz, R.M. et al., J Exp Med 178 (1993) 27-47) . La apolipoproteina B-100 es un constituyente de lipoproteinas de densidad muy baja (VLDL) y lipoproteinas de densidad baja (LDL) y funciona como una señal de reconocimiento para la aglutinación celular y la internalizacion de las partículas de LDL por el receptor de ApoB/E (Yang, C.Y. et al., Nature 323 (1986) 738-742) . De manera interesante, una relación incrementada de colesterol de LDL con respecto al colesterol de HDL fue observada entre pacientes con RA diagnosticados recientemente (Park, Y.B. et al J Rheumatol 26 (1999) 1701-1704). El perfil de lípidos adverso en la RA activa podría ser mejorado por el tratamiento de los pacientes con RA con D ARDs sin el uso de agentes reductores de los lípidos (Park, Y.B. et al., Am J. Med 113 (2002) 188-193) . Puesto que una mortalidad cardiovascular incrementada entre los pacientes con enfermedades inflamatorias crónicas, tal como RA, esta bien documentada (Simmons D.P. et al, J Rheumatol 25 (1998) 1072-1077) se sugirió que la inflamación local en la RA conduce a niveles alterados de los lípidos en la sangre, por lo cual se aumenta el riesgo de ateroesclerosis . La cuestión de que si los componentes del metabolismo de lipoproteína son la causa de la patogénesis o solamente son afectados por las reacciones inmunes en curso durante el desarrollo de la RA, no puede ser contestada todavía. Sin embargo, la observación de perfiles de lípidos adversos en pacientes con RA soporta la validez del epítopo de ApoB presentado como un marcador candidato de RA derivado del suero. La ApoB de longitud variable (2877-2892) , pero no la ApoB (2877-2893), ha sido identificada en muestras de dos controles sanos (Tabla 2) . Puesto que la apolipoproteina B constituye 1 % de todas las proteínas del plasma, la presencia de epítopos de ApoB de muestras de control de individuos sanos no es sorprendente. Los resultados sugieren que solamente la ApoB de longitud variable (2877-2893; SEC ID NO. 5) es específica para la RA erosiva. Subunidad reguladora 8 diferente de la ATPasa de la proteasoma 26S Un epítopo que fue identificado muy frecuentemente en la mayoría de muestras de RA erosiva tanto del suero como de la sinovia, es derivado de la subunidad reguladora 8 de la proteasoma 26S (PSMD8) : la 15-mer PSMD8 (218-232; SEC ID NO. 64) con la secuencia de aminoácidos GPNNYYSFASQQQKP (Tabla 2) . Tres variantes de longitud adicional fueron identificadas: la 16-mer PSMD8 (218-233; SEC ID NO. 65), la 17-mer PSMD8 (218-234; SEC ID NO. 66) y la 18-mer PSMD8 (218-234; SEC ID NO. 67) (Tabla 2) . La presencia de las variantes de longitud soporta la validez del epítopo identificado como un péptido antigénico derivado de MHC de la clase II. El péptido exhibe una porción de aglutinación moderada con respecto a la aglutinación de DRB1*0401 (valor de aglutinación de TEPITOPE: 3 %) . La aglutinación a HLA-DR4 podría ser confirmada en un ensayo de aglutinación in vitro utilizando el péptido PSMD8 (218-233) sintético y moléculas de HLA-DR4 purificadas (figura 3) . De acuerdo con su valor de IC50 contra el péptido reportero Ha (308-319), la PSMD8 (218-233; SEC ID NO. 65) se aglutina a HLA-DR4 con una afinidad moderada, confirmando la predicción de TEPITOPE. La 15-mer PSMD8 (218-232; SEC ID NO. 64) fue identificada una vez en una muestra de control no sometida a impulsos. La proteasoma se cuantifica en aproximadamente 1 % de la proteina citoplásmica agrupada y está involucrada en la degradación dependiente de ATP de las proteínas adecuadas . Además, la proteasoma es responsable del procesamiento de varios factores de transcripción, es decir el factor nuclear kB) , para el control del ciclo celular y la generación de antigenos restringidos de la clase I de MHC. Las subunidades reguladoras de la proteasoma son importantes para la selectividad de la degradación de la proteina. La subunidad reguladora 8 diferente de la ATPasa, en particular, se sabe que va a ser necesaria para la activación de la proteina de control 28 de la división celular (Cdc28) , un regulador del ciclo celular esencial en la levadura. De manera importante, los niveles incrementados fuertemente de proteasomas circulantes (cProteasomas) fueron detectados en muestras de suero obtenidas de pacientes con diferentes enfermedades autoinmunes sistémicas, incluyendo RA (Egerer, K. et al J Reumatol 29 (2002) 2045-2052). Parece que va a existir una correlación estrecha entre los niveles de cProteasoma y la actividad de la enfermedad y las concentraciones de la proteína reactiva C en pacientes con RA severa. La cProteasoma se describe que desencadena respuestas inmunes subsiguientes, lo cual podría indicar un mecanismo de activación de antígeno. La concentración de antígeno de proteasoma liberado parece que refleja la magnitud del daño celular en las enfermedades autoinmunes. A partir de sus descubrimientos Egerer y colaboradores concluyeron que las cProteasomas podrían representar un marcador novedoso para la severidad de la enfermedad en procesos autoinmunes. Puesto que la PSMD8 del epítopo (218-232; SEC ID NO. 64) fue identificada principalmente en muestras de RA erosiva, el análisis de los inventores soporta esta conclusión. Receptor de interleucina-1 Otro marcador candidato para la RA erosiva es el receptor de interleucina-1 (IL-lR) que fue identificado en dos muestras del suero erosivas por medio de su péptido IL-lR (79-94, SEC ID NO. 68) con la secuencia de aminoácidos EKLWFVPAKVEDSGHY (Tabla 2) . La IL-lR (79-94; SEC ID NO. 68), con 83F como un sitio de fijación Pl, 86A es un sitio de fijación P4 y 88V como un sitio de fijación P6, contiene una porción de aglutinación fuerte con respecto a la aglutinación al alelo DRB1*0401 de susceptibilidad a RA (valor de la aglutinación de TEPITOPE: 1 %) . En un ensayo de aglutinación in vitro el péptido sintético se mostró que se aglutina a las moléculas de HLA-DR4 con afinidad elevada (figura 3) , semejante al péptido HA(309-319) . La ínterleucina-1 (IL-1) es una citocina proinflamatoria y está implicada en una variedad de respuestas inmune infecciosas asi como en RA y otras enfermedades inflamatorias (Dinarello, C, Blood 87 (1996) 2095-2147) . La misma se aglutina a su receptor respectivo que funciona como un transductor de la señal para desencadenar la proliferación celular o para estimular la síntesis de proteínas. La producción de IL-1 incrementada ha sido observada en pacientes con RA y desempeña un papel central en sus manifestaciones clínicas (Dayer, J.M. Rheumatology 42 (2003) ii3-iil9) . La IL-1 es observada como un medidor clave en RA por medio de la activación de los macrófagos y los linfocitos T y B. Además, IL-1 contribuye a la inflamación por la inducción de la expresión de las moléculas de adición celular, otras citocinas y quimiocinas. Además la IL-1 también desempeña un papel central en la destrucción de huesoso y cartílagos en RA por la estimulación de la producción de las metaloproteinasas de la matriz. Por consiguiente, el complejo de IL-1/IL-1R es un objetivo de primera clase para las características terapéuticas antiinflamatorias. El uso de un antagonista del receptor de IL-1 humano recombinante (IL-1RA) ha sido aprobado para el tratamiento de los pacientes con RA.

Fibromodulina Tres muestras de RA erosiva ocasionaron un epitopo derivado de la fibromodulina de la proteina de la matriz secretada (FM) : la 13-mer FM (178-190; SEC ID NO. 70) con la secuencia de aminoácidos LRELHLDHNQISR (Tabla 2) . Además, la 14-mer FM (177-190; SEC ID NO. 69) fue identificada, la cual también fue encontrada una vez en un experimento de control no sometido a impulsos. El epitopo muestra una porción de aglutinación de DRB1*0401 fuerte con 181L que sirve como un sitio de fijación de Pl, 184D como un sitio de fijación P4 y 186N como un sitio de fijación P6 (valor de aglutinación de TEPITOPE: 1%) . La fibromodulina pertenece a la familia- de los proteoglicanos ricos en leucina, pequeños (SLRPs) que se aglutinan a TGF s y a los colágenos y otras moléculas de la matriz extracelular . In vitro, las SLRPs se mostró que regulan la fibrilogénesis de colágeno, un proceso esencial en el desarrollo, la reparación del tejido y la metástasis. Para entender mejor la función de SLRPs in vivo, los ratones deficientes en SLRP fueron generados y se mostró que desarrollan una amplia gamma de enfermedades (por ejemplo osteoporosis y osteoatritis) , la mayoría de ellos que resultan principalmente de una fibrilogénesis del colágeno anormal (Ameye, L. e Young, M.F., Glycobiology 12 (2002) 107R-116-R) . Puesto que la formación de colágeno y la degradación son mejoradas altamente en la articulaciones inflamadas de pacientes con RA, puede ser contemplado un nivel incrementado de fibromodulina. De acuerdo con esta consideración, este es el hecho por el cual el epitopo de FM identificado fue encontrado principalmente en las muestras de RA de origen sinovial (3 de 4 muestras de la sinovia) . Receptor de G -C5F/IL-3/IL-5 En 5 de 8 muestras de pacientes con RA erosiva un epitopo de la cadena ß del receptor CYRB de citocinas múltiples podría ser identificado: el 15-mer CYRB (359-373; SEC ID NO. 71) con la secuencia de aminoácidos ETMKMRYEHIDHTFE y su variante de longitud, la 17-mer CYRB (359-375; SEC ID NO. 72) (Tabla 2) . En un ensayo de aglutinación in vitro el péptido sintético CYRB (359-375) se mostró que se aglutina a las moléculas de HLA-DR4 con afinidad moderada (figura 3) . Esto está de acuerdo con TEPITOPE que predijo una porción de aglutinación del péptido moderada con respecto a la aglutinación de DRB1*0401 (valor de aglutinación de TEPITOPE: 3 %) . El epitopo fue sobre-representado claramente en las muestras de RA puesto que el mismo fue identificado en el suero de solamente una persona de prueba sana. El receptor de GM-CSF/IL-3/IL-5 es una proteína de la membrana del tipo I y expresada diferencialmente en todo el sistema hematopoyético (revisado por Geijsen, N. et al., Citokine Growth Factor Rev 12 (2001) 19-25) . Sus ligandos, IL-3 y GM-CSF, son secretados por las células I de CD4+ y estímulos importantes para la formación de las células dendriticas que se originan de las células madre en la médula ósea. El papel critico de las células dendriticas en el inicio y desarrollo de una respuesta inmune sugiere que las mismas desempeñan un papel clave en el desarrollo de trastornos inflamatorios autoinmunes, tal como RA, por el transporte del autoantígeno al nodo linfático de drenaje en donde las DCs encuentran y preparan las células T naturales. La actividad de GM-CSF ha sido relacionada con los efectos proinflamatorios en RA que soportan el epitopo CYRB del receptor identificado (359-373; SEC ID NO. 71) como un marcador del péptido candidato putativo para el diagnóstico de RA. Nexina 3 clasificada Otro epitopo que parece que va a ser indicativo de la RA erosiva es derivado de una proteina llamada nexina clasificada 3 (SNX3) : la 16-mer SNX3 (142-157; SEC ID NO. 73) que tiene la secuencia de aminoácidos HMFLQDEIIDKSYTPS (Tabla 2) . En este epitopo 144F, 147D y 1491 podrían servir como los sitios de fijación Pl, P4 y P6, respectivamente en la ranura de aglutinación del alelo DRB1*0401 de susceptibilidad a RA (valor de aglutinación de TEPITOPE: 2%) . Las nexinas clasificadas son un grupo diverso de proteínas de tráfico celular que comparten una porción de aglutinación de fosfolípido común (revisado por Worby, C.A. & Dixon J.E. Nat Rev Mol Cell Biol 3 (2002) 919-31) . La capacidad de estas proteínas para aglutinarse a los fosfolipidos específicos, así como su propensión a formar complejos de proteína-proteína, apunta a involucrar estas proteínas en el tráfico de la membrana y la clasificación de la proteína. La nexina clasificada 3 en particular está presente en el citosol y en los endosomas y parece que va a estar involucrada en el tráfico de la membrana desde los endosomas iniciales hasta los endosomas de reciclaje. Si la nexina clasificada 3 desempeña un papel en RA, por ejemplo teniendo influencia en las rutas de presentación del antígeno, permanece desconocido hasta el momento. El epítopo SNX3 (142-157; SEC ID NO. 73) identificado en este estudio sugiere una relación entre las nexinas clasificadas y la autoinmunidad. Ejemplo 3 Todas las secuencias del péptido identificadas en los ejemplos 1 y 2 de las muestras de RA erosiva y no erosiva fueron utilizadas en este ejemplo para la búsqueda de marcadores comunes relevantes para ambos tipos de RA. Las secuencias específicas de RA fueron comparadas nuevamente con las secuencias del péptido de las muestras de control (DCs no sometidas a impulsos y DCs sometidas a impulsos con el suero de dos personas de prueba sanas) y solamente estos péptidos fueron seleccionados para la evaluación adicional que podría volver a ocurrir en al menos tres de quince muestras de RA conjuntas (RA erosiva y no erosiva) . Inhibidor de inter-alfa-tripsina Diez de once muestras de suero (RA erosiva y no erosiva) ocasionaron un epitopo derivado de la cadena pesada H4 del inhibidor de inter-alfa-tripsina : ITIH4 (271-287) con la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO. 8 (Tabla 3) . Aparte de esta variante de longitud principal del epitopo de ITIH4, seis variantes de longitud del mismo epitopo de ITHI4 podrían ser identificadas (Tabla 3) : la 19-mer ITIH4 (271-289; SEC ID NO. 6), la 18-mer ITIH4 (271-288; SEC ID NO. 7), la 16-mer ITIH4 (274-289; SEC ID NO. 12), la 15-mer ITIH4 (273-287; SEC ID NO. 10), la 15-mer (274-288; SEC ID NO. 11) y la 14-mer ITIH4 (274-287; SEC ID NO. 9) . Como se juzga de la variante de longitud más corta, ITIH4 (274-287) , el epitopo contiene una porción de aglutinación muy fuerte, con respecto a la aglutinación al alelo DRB1*0401 de susceptibilidad a RA: 277F sirve como un sitio de fijación Pl, 280D como un sitio de fijación P4 y 282S como un sitio de fijación P6 (valor de aglutinación: 1 %) - ITIH4 pertenece a la familia del inhibidor de inter-alfa (Ial) el cual es un grupo de inhibidores de la proteasa del suero que se aglutinan al ácido hialurónico (HA) y parece que va a estar involucrada en reacciones de fase aguda (Salier, J. P. et al, Biocheraical Journal 315 (1996) 1-9) . HA es un polisacárido encontrado en todos los tejidos del cuerpo, en particular, en tejidos conectivos blandos, por ejemplo el fluido de las articulaciones (Evered, D. y Whelan, J. eds., The Biology of Hyaluronan, John Wiley & Sons (1989) ) . La HA tiene una función estructural importante en el cartílago y otros cartílagos en donde la misma estabiliza la matriz extracelular por la formación de agregados con proteoglicanos . También se han asignado funciones biológicas importantes por la regulación de actividades celulares por medio de la aglutinación a las proteínas de la superficie celular, tales como CD44 e ICAM-1 (Knudson, C.B. y Knudson, W. , FASEB J 7 (1993) 1233-1241; Hall, C.L. et al., J Cell Biol 126 (1994) 575-588). RA esta acompañada por un incremento grande en HA total en el fluido de las articulaciones así como en el suero, sugiriendo que la HA circulante se origina desde las articulaciones reumatoides (Engstróm-Laurent, A. et al., Scand J Clin Lab Invest 45 (1985) 497-504) . Los complejos de HA y algunos miembros de la familia Ial fueron observados en grandes cantidades en el fluido sinovial de pacientes con RA (Jessen, T.E. et al Biological Chemistry Hoppe-Seyler 375 (1994) 521-526) . El papel del complejo de ?a?-?? en las reacciones inflamatorias podría ser para modificar la interacción de CD44-HA que tiene un papel de mediación en la activación e invasión de leucocitos (Isacke, C.M. e Yarwood, H., Int J Biochem Cell Biol 34 (2002) 718-721) . Adicionalmente, el fluido sinovial de pacientes con RA contiene niveles elevados de TSG-6, una glicoproteína anti-inflamatoria y un miembro de la familia de hialadherina de las proteínas de aglutinación a HA (Wisniewski, H.G. et al., J Immunol 151 (1993) 6593-6601) . Se ha mostrado que un complejo de TSG-6 con miembros de la familia de Ial inhibe la actividad de plasmina, una molécula central en la activación de las enzimas asociadas con la inflamación (Wisniewski, H.G. et al., J Immunol 156 (1996) 1609-1615) . Una regulación de la actividad de plasmina por varias proteínas del plasma de fase aguda, especialmente TSG-6 y miembros de la familia de Ial, puede probar que va a ser importante en RA, dados los altos contenidos de HA, TSG-6 y miembros de la familia de Ial en el fluido sinovial de las articulaciones inflamadas. Esta evidencia, junto con la identificación de variantes de longitud múltiples del mismo epítopo y una porción de aglutinación de HLA-DR4 fuerte, soportan convincentemente la validez del epítopo de ITIH4 presentado como un marcador candidato de la RA derivado del suero.

C4 complementaria En ocho de once sueros con RA (erosiva y no erosiva) probados, otro epitopo dominante fue identificado, el cual es derivado de la C4 complementaria: la 15-mer C4 (1697-1711) con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO. 13 (Tabla 3) . Cinco variantes de longitud adicionales del mismo epitopo podrían ser encontradas (Tabla 3) : la 12-mer C4 (1697-1708; SEC ID NO. 18), la 13-mer C4 (1698-1710; SEC ID NO. 17), la 14-mer C4 (1697-1710; SEC ID NO. 15), la 16-mer C4 (1697-1712; SEC ID NO. 14) y la 18-mer C4 (1697-1714; SEC ID NO. 16) . Además, el epitopo presentado exhibe una porción de aglutinación de DRB1*0401 muy fuerte: 1700Y como un sitio de fijación Pl, 1704D como un sitio de fijación P2 y 1706N como el sitio de fijación P6 (valor de aglutinación: 1%) . C4 la cual constituye aproximadamente 0.5 % de la masa de proteína del plasma desempeña un papel crítico en la activación de la ruta central del sistema de complemento. La proteína es sintetizada como un precursor de una sola cadena y, previo a la secreción, es segmentada enzimáticamente para formar un trímero de cadenas , ß y ? no idénticas . El epitopo C4 identificado (1697-1711) está localizado en la. misma terminación C de la cadena y de C4. La cadena a de C4 es degradada proteolíticamente de manera adicional por Cl activada para formar la anafilatoxina C4a, la cual es un mediador de los procesos inflamatorios locales (Moon, K.E. et al., J Biol Chem 256 (1981) 8685-8692). En general, la cascada complementaria está involucrada en la inducción y progreso de las reacciones inflamatorias y es un sistema de defensa principal contra varios agentes patógenos, incluyendo bacterias, virus y otros antigenos (Morgan, B.P., Methods Mol Biol 150 (2000) 1-13). Sin embargo, la activación inapropiada puede conducir a daño del tejido y manifestación de enfermedad (Speth, C. et al., Wien Klin Wochenschr 111 (1999) 378-391) . La activación del sistema complementario ha estado implicado repetidamente en la patogénesis de RA, basado en estudios que muestran niveles incrementados de metabolitos complementarios, incluyendo C4 y C4a, en el plasma, fluido sinovial y tejido sinovial de los pacientes con RA (Neumann, E. et al., Arthritis Rheum 46 (2002) 934-945). Además, la artritis inducida por el colágeno (CIA) en los ratones está caracterizada por la presencia de productos de activación complementarios (Linton, S.M. y Morgan, B.P. Mol Immunol 36 (1999) 905-914) . La CIA es prevenida después del tratamiento con anticuerpos monoclonales anti-C5 (Wang, Y. et al., PNAS 92 (1995) 8955-8959) o con CRl soluble, un inhibidor del sistema complementario, suministrado por terapia genética (Dreja, H. et al., Arthritis Rheum 43 (2000) 1698-1709) . La activación de factores complementarios en las articulaciones es inducida posiblemente por la presencia de varios complejos inmune y se tiene la hipótesis de que la estimulación del sistema inmune innato por agentes infecciosos y citocinas puede contribuir al inicio de RA (Friese, .A. et al., Clin Exp Immunol 121 (2000) 406-414) . Dos de los seis epitopos de C4 presentados, el 15- y el 18-mer, también fueron identificados en muestras de control de personas sanas (Tabla 3) indicando que solamente algunas variantes de longitud de este epitopo de C4 son específicos para RA, especialmente los péptidos antigénicos de las SEC ID NOs. 14, 15, 17 y 18. C3 complementaria Otro epitopo que fue encontrado en las muestras de RA erosiva y no erosiva es derivado de la C3 complementaria (cadena alfa) : la 14-mer C3 (1431-1444) con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO. 21 (Tabla 3) . Seis variantes de longitud adicionales del mismo epitopo fueron identificadas en el suero (Tabla 3) : la 13-mer C3 (1431-1443; SEC ID NO. 23), la 14-mer C3 (1429-1442; SEC ID NO. 74), la 15-mer C3 (1431-1445; SEC ID NO. 22), la 15-mer C3 (1449-1443; SEC ID NO. 20), la 17-mer C3 (1427-1443; SEC ID NO. 75) y la 19-mer C3 (1426-1444; SEC ID NO. 19) . Como se juzga de la variante de longitud más corta, C3 (1431-1443) , una porción de aglutinación de DRB1*0401 puede ser postulada: 1434Y sirve como un sitio de fijación Pl, 1437D como un sitio de fijación P4 y 1439A como un sitio de fijación P6.

En muestras de RA erosiva y no erosiva, un epitopo adicional fue encontrado, el cual es derivado de C3 complementaria (cadena beta) : la 19-mer C3 (157-175) con la secuencia de aminoácidos con la SEC ID NO. 76 (Tabla 3) . Una variante de longitud adicional del mismo epitopo fue identificada en el suero (Tabla 3) : 20-msr C3 (157-176; SEC ID NO. 77) . La C3 complementaria que constituye aproximadamente 1-2 % de la masa de la proteina del plasma desempeña una papel central en la activación del sistema complementario y pertenece a la familia de las proteínas de fase aguda. Su procesamiento por la C3 convertasa a C3a anafilatoxina y C3b es la etapa central en las rutas de complemento tanto clásica como alternativa (Barrington, R. et al., Immunol Rev 180 (2001) 5-15) . Después de la activación, C3b puede aglutinarse covalentemente, por medio de un tioléster reactivo, a los carbohidratos de la superficie celular o a los agregados inmunes (Isaac, L. e Isenman, D.E., J Biol Chem 267 (1992) 10062-10069). El epitopo C3 identificado (1431-1444) está localizado en la terminación C de C3b. Como ya se describió en el contexto del epitopo C4 complementario (1697-1711), existe una evidencia creciente de un papel importante de componentes de la cascada complementaria en la patofisiología de RA. El resultado de este estudio, en el cual dos epítopos principales derivados de C3 y C4 complementarias fueron identificados en el suero de los pacientes de RA, subraya la relación estrecha entre el sistema complementario activado y la patogénesis de RA. Esta coincidencia hace un argumento fuerte para la validez de los epitopos C3/C4 presentados como marcadores de RA candidatos derivados del suero. Proteina 3 semejante y enriquecida en ácido glutámico de aglutinación al dominio de SH3 Otro epitopo que fue observado muy frecuentemente en el suero de los .pacientes con RA (seis de once muestras de RA erosivas y no erosivas) es derivado de la proteina 3 semejante y enriquecida en ácido glutámico de aglutinación al dominio de SH3 (SH3BGRL3) : la SH3BGRL3 (15-26) con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO. 25 (Tabla 3) . Tres variantes de longitud del mismo epitopo fueron identificadas (Tabla 3): la 14-mer SH3BGRL3 (13-26; SEC ID NO. 26), la 14-mer SH3BGRL3 (15-28; SEC ID NO. 27) y la 16-mer SH3BGRL3 (13-28; SEC ID NO. 24) . La porción de aglutinación de DRB1*0401 es: 171 como el sitio de fijación Pl, 20Q como el sitio de fijación P4 y 22S como el sitio de fijación P6 (valor de la aglutinación: 4%) . La SH3BGRL3 es una proteina de 10 kD pequeña que pertenece a la familia de SH3BGR. La función precisa de la proteina es desconocida pero un papel como un modulador de la actividad biológica de la glutarredoxina es postulado (Mazzoco, M. et al., Biochem Biophys Res Commun 285 (2001) 540-545) . En cuanto a esto, SH3BGRL3 no ha sido descrita en el contexto de RA. De manera interesante, el análisis ha discernido un segundo epitopo de la misma proteina, que fue altamente abundante en todas las muestras de RA y de control: la 16-mer SH3BGRL3 (29-44) con la secuencia de aminoácidos DGKRIQYQLVDISQDN. Se encontraron variantes de longitudes múltiples adicionales del mismo epitopo en la mayoría de las muestras también. Como se juzga de la variante de longitud más corta, SH3BGRL3 (31-42) , el epitopo contiene residuos de fijación de DRB1*0401 casi semejantes comparado con SH3BGRL3 (15-26) 331 sirve como un sitio de fijación Pl, 36Q como un sitio de fijación P4 y 38V como un sitio de fijación P6 (valor de la aglutinación: -2) . Esta semejanza es reflejada por los valores de aglutinación comparables. La presencia de este segundo epitopo de SH3BGRL3 apoya la validez del epitopo SH3BGRL3 (15-26) a causa de que ambos péptidos son derivados de la misma proteina sin embargo, sólo una de ellas, el epitopo SH3BGRL3 (15-26), parece que va a ser generado de una manera específica para RA. Ya se ha descrito una observación semejante para GILT en el ejemplo 1. Entre las cuatro variantes de longitud de SH3BGRL3 la variante más larga, SH3BGRL3 (13-28), también fue identificada como una muestra de control de una persona sana (Tabla 3) . Sin embargo, esta variante de la longitud particular se encontró solamente una vez, lo cual indica un enriquecimiento significativo del epitopo de SH3BGRL3 en el contexto de RA. Proteina 1 inducida por interleucina-4 (IL-4) En todos los fluidos sinoviales investigados (RA erosiva y no erosiva) y en ocho de once sueros (RA erosiva y no erosiva) un epitopo altamente dominante fue identificado el cual es derivado del homólogo humano de la proteína 1 inducida por IL-4 (Figl) : Figl (293-309) con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO. 28 (Tabla 3) . La validez del epitopo fue apoyada adicionalmente por la presencia de variantes de longitud adicionales en varias muestras (Tabla 3): la 16-mer Figl (293-308; SEC ID NO. 30) y la 19-mer Figl (293-311; SEC ID NO. 29) . Además, la secuencia de aminoácidos exhibe una porción de aglutinación de DRB1*0401 típica: 299V sirve como un sitio de fijación Pl, 302E como un sitio de fijación P4, y 304S como un sitio de fijación de P6 (valor de la aglutinación: 1 %) . Las dos variantes de la longitud del mismo epitopo, Figl (293-308) y Figl (293-309), fueron identificadas en una muestras no tratada con impulsos y una muestra de control de una persona sana también (Tabla 3) . Sin embargo, la presencia del epítope de Figl en casi todas las muestras de RA pero no en la totalidad de las muestras de control probadas indica fuertemente un enriquecimiento en el contexto de RA. El gen de figl humano fue identificado primero en los cultivos de la célula B estimulados con IL-4 (Chu, C.C. y Paul, W.E., PNAS 94 (1997) 2507-2512) . La figl humana radica en el cromosoma 19ql3.3-19ql3.4 , una región previamente identificada que va a estar involucrada en la susceptibilidad a las enfermedades autoinmunes, incluyendo SLE, artritis, esclerosis múltiple, y diabetes mellitus dependiendo de la insulina (Becker K.G. et al., PNAS 95 (1998) 9979-9984) . Puesto que su expresión está limitada ampliamente a los tejidos inmune y su regulación depende de la IL-4, un modulador clave de la respuesta inmune, figl es por consiguiente un gen candidato atractivo para la susceptibilidad de la enfermedad autoinmune (Chavan, S.S. et al., Biochim Biophys Acta 1576 (2002) 70-80). La presentación restringida de HLA-DR4 de un epítope de Figl proporciona la primera indicación de que la proteina de Figl es producida y posiblemente está involucrada en el desarrollo de la enfermedad de RA. El polipéptido de Figl no ha sido conocido como un marcador para RA hasta ahora, y se considera como un marcador candidato importante para RA. Hemopexina Otro marcador candidato de RA que fue identificado frecuentemente en las muestras del suero (diez de once muestras) y en las muestras de la sinovia (dos de cuatro muestras) (RA erosiva y no erosiva) es derivado de la hemopexina (HPX) : HPX (351-637) con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO. 32 (Tabla 3) . Varias variantes de longitud fueron encontradas, lo cual apoya la validez de este epitopo (Tabla 3) : la 13-mer HPX (351-363; SEC ID NO. 33), la 14-mer HPX (350-363; SEC ID NO. 34), la 15-mer HPX (351-365; SEC ID NO. 35), la 18-mer HPX (351-368; SEC ID NO. 31), y la 18-mer HPX (350-367; SEC ID NO. 78). Además, el epitopo contiene una porción de aglutinación de DRB1*0401 muy fuerte: 3551 sirve como un sitio de fijación Pl, 358D sirve como un sitio de fijación P4, y 360V como un sitio de fijación P6 (valor de la aglutinación 1 %) . Dos variantes de longitud del mismo epitopo, HPX (351-367; SEC ID NO. 32) y HPX (351-365; SEC ID NO. 35), podrían también ser identificadas en muestras de control sanas (Tabla 3) indicando que solamente algunas variantes de longitud son específicas para RA, especialmente los péptidos antigénicos de las SEC ID NO. 31, 33, 34 y 78. HPX es una glucoproteína del plasma de 60 kD con una afinidad de aglutinación elevada a heme (Müller-Eberhard, U. Methods Enzymol 163 (1988) 536-565). La misma es expresada principalmente en el hígado, y pertenece a las proteínas de fase aguda, la síntesis de las cuales es inducida en una situación inflamatoria. La RA es una enfermedad autoinmune inflamatoria crónica y los niveles elevados de varias proteínas de la fase aguda, incluyendo la proteína reactiva C y el amiloide A del suero, han sido reportados (Nakamura, R. J Clin Lab Anal 14 (2000) 305-313) . HPX se activa en respuesta a las citocinas IL-1 e IL-6, las cuales son reguladas ascendentemente en los pacientes que padecen RA (Feldmann, M. y Maini, R.N., Rheumatology 38, Suplemento 2 (1999) 3-7) . HPX es el vehículo principal para el transporte de heme en el plasma y su papel principal es prevenir la tensión oxidante mediada por heme y la pérdida de hierro unido a heme (Tolosano, E, y Altruda, F. , DNA Cell Biol 21 (2002) 297-306) . La misma puede proteger a las células contra la tensión oxidante por la inducción de la expresión de los antioxidantes intracelulares tales como la heme oxigenasa, metalotioneinas y ferritina. Las metalotioneinas son proteínas citosólicas que son expresadas particularmente en los fibroblastos de la sinovia (Backman, J.T. et al., Vircho s Arch 433 (1998) 153-160) . Existe una evidencia experimental significativa de la presencia de tensión oxidante en el tejido sinovial de pacientes con RA (revisado en Schett, G. et al., Artritis Res 3 (2000) 80-86) . Además, la HPX se reportó que promueve la proliferación de linfocitos T humanos (Smith, A, et al., Exp Cell Res 232 (1997) 246-254) . Estos estudios hacen probable que la HPX pertenezca a las proteínas reguladas ascendentemente en el suero y la sinovia de pacientes con RA, por lo cual proporcionan una característica racional para la relevancia de HPX (351-367) como una marcador candidato específico para RA. Proteína de interacción con Hsc7Q Un epítopo que fue identificado principalmente en las muestras del suero (4 de once muestras de RA erosiva y no erosiva) y el cual también esta relacionado con las respuestas de la tensión es derivado de la proteína de interacción de Hsc70 Hip: la Hip (83-98) con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO. 38 (Tabla 3) . Dos variantes de longitud de este epítopo fueron identificadas (Tabla 3) : la 18-mer Hip (83-100; SEC ID NO. 36) y la 15-mer Hip (84-98 %; SEC ID NO. 39) . Una variante de longitud adicional fue descubierta en una muestra de sinovia erosiva (Tabla 3) : la 15-mer Hip (85-99; SEC ID NO. 37). Como se juzga de la variante Hip de longitud más corta (84-98), una porción de aglutinación de DRB1*0401 que logra un valor moderado de 8 %, puede ser postulada: 891 como sitio de fijación Pl, 92D como sitio de fijación P4, 94D como sitio de fijación P6. En el citosol de las células eucarióticas, las proteínas Hip y Hop se asocian con Hsc70 para participar en la regulación de la actividad de acompañamiento de Hsc70 (Frydman, J. y Hohfeld, J. Trends Biochem Sci 22 (1997) 87-92) . La proteína de Hip de 42 kD se aglutina al dominio de ATPasa de Hsc70. Se postuló que la Hip podría incrementar la vida media del complejo de acompañamiento-substrato proporcionando la base molecular para una cooperación eficiente de Hsc70 con sistemas de acompañamiento corriente abajo. Hsc70 y Hsc90 se ha mostrado que cooperan durante el pliegue de la proteína in vitro (Jakob, U. y Buchner, J., Trends Biochem Sci 19 (1994) 205-211; Freeman, B.C. y Morimoto, R.I. EMBO J 15 (1996) 2969-2979) y desempeña un papel en la desnaturalización térmica (Schneider, C. et al., PNAS 93 (1996) 14536-14541) . La asociación de Hsc70 y Hsc90 con la adaptación de la tensión relaciona por último Hip con las respuestas a la tensión, incluyendo la inducción de las proteínas del choque térmico, en el tejido sinovial de los pacientes con RA (revisado en: Schett, G. et al., Arthritis Res 3 (2001) 80-86) . Propiedades de aglutinación de ITIH4, C4, C3, SH3BGRL3, Figl, HPX y Hip Para investigar adicionalmente las propiedades de aglutinación de los péptidos antigénicos descritos anteriormente de ITIH4, C4, C3, SH3BGRL3, Figl, HPX y Hip con respecto a las moléculas de HLA-DR4, se efectuaron ensayos de aglutinación in vitro (figura 3) : de acuerdo con sus valores de IC50 contra el péptido reportero HA (309-317), los péptidos sintéticos ITIH4 (274-287), SH3BGRL3 (13-26), y Figl (293-309) , se aglutinan a HLA-DR4 con afinidad elevada (Fig. 3) .

La aglutinación moderada a HLA-DR4 fue medida para los péptidos sintéticos C4 (1696-1709) y HPX (351-365) . El péptido sintético C3 (1431-1444) unido solo débilmente a HLA-DR4 lo cual está de acuerdo a su vez con la evaluación de TEPITOPE (9 %) . Ninguna aglutinación fue medida para el epitope de Hip (84-98) (datos no mostrados) . Cadena no variable (Ii) Entre los peptidos marcadores candidatos que parece que van a ser indicativos de la RA erosiva y no erosiva está un epitopo que es derivado de la cadena no variable asociada con HLA-DR (Ii) : la 15-mer Ii (110-124; SEC ID NO. 83) con la secuencia de aminoácidos ATPLLMQALPMGALP (Tabla 3) . Además, cuatro variantes de longitud fueron identificadas: la 16-mer Ii (109-124; SEC ID NO. 81), la 17-mer Ii (109-125; SEC ID NO. 80), la 18-mer Ii (109-126; SEC ID NO. 79) y la 21-mer Ii (109-129, SEC ID NO. 82) (Tabla 3). La presencia de variantes de longitud proporciona confianza en la secuencia del péptido identificado que exhibe una porción de aglutinación de DRB1*0401 moderada (evaluación de aglutinación de TEPITOPE: 5 %) con 114L que -sirve como un .sitio de fijación Pl, 117A como un sitio de fijación P4, y 119P como un sitio de fijación P6. El epitopo fue identificado en dos muestras erosivas de RA y tres muestras no erosivas de RA. Dos variantes de longitud de Ii fueron encontradas en una muestra no tratada con impulsos dos muestras de personas de prueba sanas.

La carga del péptido de las moléculas de la clase II de MHC es regulada por dos moléculas accesorias en la ruta de la clase II, la cadena no variable Ii y HLA-DM (revisado por Bakke, 0. y Nordeng T.W., Immunol Rev 172 (1999) 171-187 y Kropshofer, H. et al., Immunol Today 18 (1997) 77-82). Los trímeros de Ii se aglutinan a las moléculas de la clase II de MHC nacientes en el retículo endoplásmico rugoso (ER) y bloquean la ranura de aglutinación del péptido, estabilizando la molécula de la clase II y previniendo la aglutinación de los ligandos disponibles en el ER. Los complejos de Ii/clase II son transportados por medio del aparato de Golgi a los endosomas, en donde Ii es degradado hasta un conjunto encajado de péptidos Ii asociados con la clase II (CLIP) . La liberación de CLIP hace posible que los péptidos endosomicos se aglutinen a las moléculas de la clase II de MHC que son presentadas a los receptores de la célula T sobre la superficie de la célula. El epítopo Ii identificado (110-124) se superpone con la parte C-terminal de CLIP. De manera interesante, una interacción reducida de CLIP con HLA-DR asociado a RA fue descrita (Patil, N.S. et al., J Immunol 167 (2001) 7157-7168), indicando que una interacción reducida puede contribuir a la patofisiología de autoinmunidad en RA. Proteína 2 de respuesta al receptor del ácido retinóico En 4 de 11 muestras de suero (RA erosiva y no erosiva) un epitope fue identificado el cual es derivado de la proteina 2 de respuesta al receptor del ácido retinóico (RARRES2) : el 22-mer RARRES2 (40-61/ SEC ID NO. 86) con la secuencia de aminoácidos de HPPVQWAFQETSVESAVDEPFP (Tabla 3) . En la parte C-terminal del epitopo dos variantes de longitud podrían haber sido identificadas: la 23-mer RARRES2 (40-62; SEC ID NO. 84) y la 24-mer RARRES2 (40-63; SEC .ID NO. 85) (Tabla 3) . Con 45W como el sitio de fijación Pl, 48Q como el sitio de fijación P4 y 50T como el sitio de fijación P6, el epitopo exhibe una porción de aglutinación moderada en el contexto de DRB1*0401 (valor de evaluación de TEPITOPE: 3 %) . RARRES2 es una proteína de 18.6 kD pequeña y expresada en su mayoría en el endotelio y epidermis. La expresión parece que va a ser dependiente de las hormonas y una respuesta al ácido retinóico en la piel y a algunas hormonas osteotróficas en las células del estroma derivadas de la médula ósea fueron identificadas (Nagpal, S. et al., J Invest Dermatol 109 (1997) 91-95 y Adams, A.E., et al., J Cell Biochem 74 (1999) 587-595) . La función de RARRES2 es desconocida ampliamente y una asociación con RA, por ejemplo por medio de osteoclastogénesis alterada, es imaginable. Fibronectina Otro péptido asociado con HLA-DR4 que fue encontrado exclusivamente en 3 de las 4 muestras sinoviales (RA erosiva y no erosiva) es derivada de fibronectina (Fn) , una glucoproteína principal en el plasma de la sangre y en la matriz extracelular : la 15-mer Fn (1881-1895; SEC ID NO. 90) con la secuencia de aminoácidos IYLYTLNDNARSSPV (Tabla 3) . El epitopo parece que va a ser un muy buen aglutinador de DRB1*0401 con 1885? que sirve como un sitio de fijación Pl idrofóbico, 1888N como un sitio de fijación P4 y 1890N como un sitio de fijación P6 (valor de aglutinación de TEPITOPE: 1 %) . Cuatro variantes de longitud fueron identificadas adicionalmente: la 16-mer Fn (1881-1896; SEC ID NO. 91), la 1'6-mer Fn (1880-1895; SEC ID NO. 88), la 17-mer Fn (1881-1897; SEC ID NO. 89) y la 17-mer Fn (1880-1896; SEC ID NO. 87), apoyando fuertemente la validez del epitopo de Fn identificado (Tabla 3) . La fibronectina desempeña un papel importante en la adición celular, la motilidad celular y en la opsonización. La misma se aglutina al colágeno y la fibrina y tiene un papel de mediación en la adhesión de los fibroblastos a las fibrillas del colágeno. La fibronectina es expresada fuertemente en la capa de revestimiento sinovial de pacientes tanto con RA como osteoartritis y se correlaciona con hiperplasia de las articulaciones enfermas. La identificación del epitopo Fn (1881-1895) en solamente las muestras de origen sinovial está en linea con estos descubrimientos y apunta a un papel putativo de fibronectina altamente abundante en la autoinmunidad.

Catepsina B Tres de quince muestras de RA (RA erosiva y no erosiva) condujeron a un epitopo que se origina de la Catepsina B (CatB) : la 15-mer CatB (227-241; SEC ID NO. 92), con la secuencia de aminoácidos YNSYSVSNSSKTIMA (Tabla 3) . El péptido exhibe una porción de aglutinación de DRB1*0401 moderada con 230 Y como un sitio de fijación Pl hidrofóbico y los residuos de serina en las porciones 233 y 235 como sitios de fijación P4 y P6 putativos (valor de aglutinación de TEPITOPE: 6 %) . La catepsina B es una tiol peptidasa y se cree que participa en la degradación intracelular y el cambio de proteínas, por ejemplo el colágeno. La misma está localizada en los lísosomas de diferentes tipos de células incluyendo los leucocitos. En el contexto de la inflamación y la enfermedad se mostró que la catepsina B contribuye a la destrucción del cartílago en la osteoartritis y a la proteólisis patológica en RA y el cáncer (Cunnane, G. et al., Arthritis Rheum 44 (2001) 1744-1753) . Las actividades de enzima de catepsina B y otras peptidasas lisosómicas se correlación con la progresión de RA que soporta la validez del epitopo CatB (227-241) como un péptido marcador de RA putativo (Sonar, N. et al., Biol Chem 383 (2002) 865-869). Tripeptidil-peptidasa II Otro epitopo derivado de peptidasa que fue encontrado en tres de quince muestras de RA (RA erosiva y no erosiva) es derivada de la tripeptidil-peptidasa II (TPP2) : la 15-mer TPP2 (970-984; SEC ID NO. 93) que tiene la secuencia de aminoácidos AGSLTLSKTELGKKA ' (Tabla 3) . Adicionalmente, la variante de longitud TPP2 (970-985; SEC ID NO. 94) fue identificada. El epitopo de peptidasa contiene una porción de aglutinación de DRB1*0401 típica con 937L, 9 6S y 978T como los sitios de fijación Pl, P4 y P6 respectivamente (valor de aglutinación de TEPITOPE: 3 %) . De manera semejante a la catepsina B, la tripeptidil-peptidasa II está involucrada en la degradación de la proteina lisosómica . La identificación del epitopo TPP2 (970-984) en el contexto de RA proporciona la primera indicación de que la TPP2 podría estar implicada en la degradación de la proteína alterada en el contexto de la inflamación y RA. Legumaína La legumaína (LGMN) completa el conjunto de tres peptidasas que fueron encontradas en esta investigación. El epitopo encontrado LGMN (99-112; SEC ID NO. 95) con la secuencia de aminoácidos VPKDYTGEDVTPQN (Tabla 3) exhibe una porción de aglutinación típica con respecto al alelo DRB1*0401 de HLA en el cual 103Y podría servir como un sitio de fijación Pl, 106E como un sitio de fijación P4 y 108V como un sitio de fijación P6 (valor de aglutinación TEPITOPE: 1 %) · La legumaina está presente en las fracciones endosó-mica y lisosómica de las células que presentan el antigeno tales como las células dendriticas (Schwarz, G. et al., Biol Chem 383 (2002) 1813-1816) . La misma tiene una especificidad estricta para la hidrólisis de los enlaces de asparagxnilo y se mostró que exhibe un papel importante en el procesamiento de los antigenos bacterianos para la presentación de la clase II de MHC (Manoury, B. et al., Nature 396 (1998) 695-699) . Si la legumaina está involucrada en las enfermedades autoinmunes, tales como RA, permanece desconocido pero el hecho de que tres peptidasas lisosómicas junto con las , GILT y la proteosoma 26S fueron identificadas en esta investigación, sugiere que la maquinaria de degradación de la proteina que facilita el procesamiento del antigeno podría ser alterada significativamente en el contexto de la RA. Receptor del factor de activación de las plaquetas Un epítopo que fue identificado en tres de once muestras de RA del suero (RA erosiva y no erosiva) es derivado de un receptor para el factor de activación de las plaquetas (PAFR) : la 13-mer PAFR (264-276; SEC ID NO. 96) con la secuencia de aminoácidos DSKFHQAINDAHQ (Tabla 3) . De acuerdo con la evaluación de TEPITOPE (3 %) , el epítopo contiene una porción de aglutinación de DRB1*0401 moderada con 267F como un sitio -de fijación Pl, 2 OA como un sitio de fijación P4 y 272N como un sitio de fijación P6 (Tabla 3) . El factor de activación de las plaquetas (PAF) es un mediador de lipidos proinflamatorios que se aglutina a un receptor de la transmembrana de siete proteínas G acopladas sobre la superficie de una amplia gama de células. Por la aglutinación al receptor, PAF transduce las funciones pleiotróficas que incluyen la motilidad celular, contracción de los músculos lisos, y síntesis y liberación de citocinas (revisado por Honda, Z. et al., J Biochem 131 (2002) 773-779) . Los estudios farmacológicos y el establecimiento en ratones PAFR (-/-) ha sugerido que las funciones de PAF en una variedad de medios variantes incluyendo la alergia, inflamación, funciones neurales,. reproducción, y ateroesclerosis . De manera interesante, la PAF se encontró en niveles elevados en el fluido sinovial de pacientes con RA y se muestra que inducen la neoangeogénesis, la cual es observada frecuentemente en la sinovitis reumatoide (Lupia, E. et al., Eur J Immunol 26 (1996) 1690-1694) . Este tipo de evidencia proporciona una evidencia adicional en el epítopo PARF (264-276) que es un péptido del marcador asociado con RA. Poli-alfa-2, 8-sialiltransferasa Otro epítopo fue encontrado en tres de once muestras del suero (RA erosiva y no erosiva) se origina de la polisialiltransferasa (PST) : la 15-mer PST (333-347; SEC ID NO. 97), MPLEFKTLNVLHNRG (Tabla 3), exhibe una porción de aglutinación moderada con respecto a la aglutinación de DRB1*0401 (evaluación de TEPITOPE: 2 %) . 337F podría servir como un sitio de fijación Pl, 340L como un sitio de fijación P4 y 342V como un sitio de fijación P6. El ácido polisiálico es un carbohidrato compuesto de un homopolímero lineal de residuo del ácido siálico enlazado a a-2,8. El glicano es fijado principalmente a la molécula de adhesión de las células neuronales (N-CAM) y está implicado en muchos procesos morfogénicos de las células neürales por la modulación de la propiedad adhesiva de N-CAM. La polisialiltransferasa de la proteína de la membrana cataliza la policondensación de los residuos del ácido siálico y es expresada altamente en el cerebro fetal, los pulmones y el riñon, en el corazón adulto, el bazo y el timo, y a un grado menor en los leucocitos de la sangre periférica (Nakayama, J. et al., Proc Nati Acad Sci 92 (1995) 7031-7035) . Los niveles de PST elevados fueron observados en el suero de los pacientes con tumores metastáticos y una actividad enzimática incrementada también estuvo asociada con la artritis reumatoide (Berge, P.G. et al., Klin Wochenschr 60 (1982) 445-449) . La identificación del epítopo PST (337-347) en varias muestras de RA está en línea con estas observaciones y soporta el papel putativo de PST en RA.

Proteína Rab-llB relacionada con Ras El ultimo epítopo presentado en este análisis de las muestras de RA es derivado de la proteína Rab-llB relacionada con Ras: la 13-mer Rab-llB (51-63; SEC ID NO. 102) con la secuencia de aminoácidos RSIQVDGKTIKAQ (Tabla 3, la secuencia del péptido fue validada con respecto a la aglutinación al alelo DRB1*0301 de susceptibilidad a RA utilizando el software ' TEPITOPE (Hammer, J. et al., Adv Immunol 66 (1997) 67-100) ) . Este epítopo y cuatro variantes de longitud adicionales, la 14-mer Rab-llB (50-63; SEC ID NO. 100), la 15-mer Rab-llB (49-63; SEC ID NO. 98), la 17-mer Rab-llB (49-65; SEC ID NO. 101) y la 18-mer Rab-llB (49-66; SEC ID NO. 99) fueron encontradas en tres muestras de RA erosivas y dos no erosivas (Tabla 3) . La 15-mer Rab-llB (49-63) fue identificada en una de doce muestras de control. Las proteínas de Rab son GTPasa pequeñas que desempeñan un papel importante en el tráfico de la membrana a lo largo de la ruta eiido y exocítica. Rab-llB se supone que va a ser esencial para el transporte de la transferrina internalizada desde el comportamiento de reciclaje hasta la membrana del plasma. Además, la Rab-llB fue identificada en los osteoclastos de la rata y podrían desempeñar un papel adicional en la resorción ósea. El epítopo Rab-llB (51-63) proporciona la primera indicación de un papel de Rab-llB en el desarrollo de RA.

Tabla 1: antigenos del péptido asociados con HLA-DR del suero y el fluido sinovial de pacientes con la mayoría aRA tipo de RA del paciente basado en el diagnóstico clínico: RA erosiva persistente (E) o no erosiva persistente (N) bFactor reumatoide "Descripción de la muestra: células dendríticas tratadas con impulsos del suero (S) o el fluido sinovial (Syn) dHaplotipo de la cubierta de la membrana inflamada: (1) HLA-DRB 1*0401, *03011; (2) HLA-DRB 1 *0401, *030.4; (3) HLA-DRB 1 *0401, *1301; (4) HLA- DRB1*0401, *0701; (5) HLA-DRB 1*0401, *0407, *0401, *1301; (4) HLA-DRB 1*0401, *0701 Secuencias de los péptidos derivados de RA en el código de una letra. La porción de aglutinación de HLA-DRB 1 *0401 está encerrada en un cuadro con fondo gris. alor del epítopo en el contexto del alelo de HLA-DRB 1 *0401 basado en el programa TEPITOPE (Hammer, J. et al., Adv Immunol 66 (1997) 67-100). sNombre de la proteína de acuerdo con la base de datos Swiss-Prot/TrEMBL. Los números entre corchetes representan la variante de longitud más corta del epítopo respectivo. h(¾Rothbard, J. B. et al., Cell 52 (1988) 515-523. h(ii)Ch¡cz, R.M. et al., J Exp Med 178 (1993) 27-47. h(iii)van Scliooten, W.C. et al., Eur J Immunol 19 (1989) 2075-2079. 25 Tabla 2: antígenos del péptido asociados con HLA-DR del suero y el fluido sinovial de pacientes con la mayoría con KA erosiva.

°RA tipo de RA del paciente basado en el diagnóstico clínico: RA erosiva persistente (E) o no erosiva persistente (N) bFactor reumatoide Descripción de la muestra: células dendríticas tratadas con impulsos del suero (S) o el fluido sinovial (Syn) dHaplotipo de la cubierta de la membrana inflamada: (1) HLA-DRB 1 *0401, *03011; (2) HLA-DRB 1*0401, *0304; (3) HLA-DRB 1*0401, *1301 ; (4) HLA- DRB 1 *0401, *0701; (5) HLA-DRB1*0401, *0407 25 'Secuencias de los péptidos derivados de RA en el código de una letra. La porción de aglutinación de HLA-DRB 1 *0401 está encerrada en un cuadro con fondo gris. Valor del epítopo en el contexto del alelo de HLA-DRB 1*0401 basado en el programa TEPITOPE (Hammer, J. et al., Adv Immunol 66 (1997) 67-100). 6Nombre de la proteína de acuerdo con la base de datos Swiss-Prot/TrEMBL. Los números entre corchetes representan la variante de longitud más corta del epítopo respectivo. ¦¾Q * Variante de longitud del epítopo respectivo que fue identificado en 1 muestra de control sana también. ** Variante de longitud del epítopo respectivo, que fue identificado en 2 muestras de control sanas también.

Tabla 3: Antígenos del péptido asociados con HLA-DR del suero o el fluido sinovial de pacientes con RA erosiva y no erosiva.

O CN ¾A tipo de RA del paciente basado en el diagnóstico clínico: RA erosiva persistente (E) o no erosiva persistente (N) 'Factor reumatoide "Descripción de la muestra: células dendríticas tratadas con impulsos del suero (S) o el fluido sinovial (Syn) dHaplotipo de la cubierta de la membrana inflamada: (1) HLA-DRB 1*0401, *03011; (2) HLA-DRB1*0401, *0304; (3) HLA-DRB 1 *0401 , *1301; (4) HLA- DRBF0401, *0701; (5) HLA-DRB 1*0401, *0407, 'Secuencias de los péptidos derivados de RA en el código de una letra. La porción de aglutinación de HLA-DRB 1*0401 (T *0301) putativa está encerrada en un cuadro con fondo gris. fValor del epítopo en el contexto del alelo de HLA-DRB1*0401 († *0301) basado en el programa TEPITOPE (Hammer, I. et al., Adv Immunol 66 (1997) 67- 100). BNombre de la proteína de acuerdo con la base de datos Swiss-Prot/TrEMBL. Los números entre corchetes representan la variante de longitud más corta del epítopo respectivo. *(**) Variante de longitud del epítopo respectivo que fue identificada en 1 (2) muestra (s) de control sanas también. 20 Tabla 4: Resumen de los marcadores candidatos de RA . Tipo de RA Fuente de Proteínaa Frecuencia en las Número de Acceso0 muestras de RAb la mayorfa no erosiva Tiol reductasa lisosómica inducible por interferón ? 3de7N P13284 Integrina beta-2 2de7N P05107 Fosfatidilinositol- ,5-bifosfato-3-cinasa 2de7N P42338 Activador del plasminógeno del tipo de urocinasa 2de7N P00749 Región V-III de cadena pesada de inmunoglobulina (VH26) 2de7N P01764 ProteinaDJ-1 2de7N Q99497 la mayoría erosiva Apolipoproteína B-100 4de8E P04114 Subunídad reguladora 8 diferente de la ATPasa de proteasoma 26S 4de8E P48556 Receptor de interleucina-1 2de8E P14778 Fibromodulina 3 de8E Q06828 Receptor de GM-CSF/IL-3/IL-5 5 de8E P32927 Nexina 3 clasificada 2de8E 060493 erosina y no erosiva Cadena pesada H4 del inhibidor de inter-a-tripsina 6de8E/4de7N Q14624 C4 Complementaria 5de8E/3de7N P01028 C3 Complementaria 2de8E/3de7N P01024 Proteína 3 semejante y enriquecida en ácido glutámico de 4de8E/2de7N Q9H299 aglutinación al dominio de SH3 Proteína 1 inducida por la4-interleucira 7 de 8 E / 5 de 7 N Q96RQ9 Hemopexina 5de8E/7de7N P02790 Proteína de interacción con Hsc70 2de8E/3de7N P50502 Cadena no variable (Ii) 2de8E/3de7N P04233 Proteína 2 de respuesta al receptor de ácido retinóico 2de8E/2de7N Q99969 Fibronectina 2de8E/l de7N P02751 Catepsina B 2 de 8 E / 1 de 7 N P07858 Tripeptidil-peptidasa II 2de8E/lde7N P29144 Legumaina 1 de8E/2de7N Q99538 Receptor del factor de activación de las plaquetas 2de8E/lde7N P25105 Alfa-2,8-sialiltransferasa 2 de 8 E / 1 de 7 N Q92187 Proteína Rab-1 IB relacionada con Ras 3de8E/2de7N Q15907 "Nombre de la proteína de acuerdo con la base de datos Swiss-Prot/TrEMBL. frecuencia del epítopo identificado en las muestras de RA. El tipo de RA del paciente estuvo basado en el diagnóstico clínico: RA erosiva persistente (E) o RA no erosiva persistente (N) °Se refiere a la base de datos Swiss-Prot Se hace constar que con relación a esta fecha el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones. . 1. Un péptido antigénico de la clase II de HC, caracterizado porque comprende: (a) al menos la secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOs . 49 a 57 y SEC ID NOs . 103 a 122, o (b) al menos la secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOs. 49 a 57 y las SEC ID NOs. 103 a 122 con secuencias de flanqueo N- y C-terminales, adicionales, de una secuencia correspondiente seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOs. 1 a 39 o las SEC ID NOs. 58 a 102.
2. Un péptido antigénico de la clase II de MHC, caracterizado porque comprende: (a) al menos la secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido de la SEC ID NO. 49, o (b) al menos la secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido de la SEC ID NO. 49 con secuencias de flanqueo N y C-terminales adicionales de una secuencia correspondiente seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOs. 1 a 3.
3. Un peptido antigénico de la clase II de MHC, caracterizado porque comprende: (a) al menos la secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido de la SEC ID NO. 103, o (b) al menos la secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido de la SEC ID NO. 103 con secuencias de flanqueo N y C-terminales adicionales de la secuencia correspondiente de las SEC ID NOs. 58 y 59.
4. Un péptido antigénico de la clase II de MHC, caracterizado porque comprende: . (a) al menos la secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido de la SEC ID NO. 104, o (b) al menos la secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido de la SEC ID NO. 104 con secuencias de flanqueo N y C-terminales adicionales de la secuencia correspondiente de la SEC ID NO. 60.
5. Un péptido antigénico de la clase II de MHC, caracterizado porque comprende: (a) al menos la secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido de la SEC ID NO. 105, o (b) al menos la secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido de la SEC ID NO. 105 con secuencias de flanqueo N y C-terminales adicionales de la secuencia correspondiente de la SEC ID NO. 61.
6. Un péptido antigénico de la clase II de MHC, caracterizado porque comprende: (a) al menos la secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido de la SEC ID NO..106, o (b) al menos la secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido de la SEC ID NO. 106 con secuencias de flanqueo N y C-terminales adicionales 'de la secuencia correspondiente de la SEC ID NO. 62.
7. Un péptido antigénico de la clase II de MHC, caracterizado porque comprende: (a) al menos la secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido de la SEC ID NO. 107, o (b) al menos la secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido de la SEC ID NO. 107 con secuencias de flanqueo N y C-terminales adicionales de la secuencia correspondiente de la SEC ID NO. 63.
8. Un péptido antigénico de la clase II de MHC, caracterizado porque comprende: (a) al menos la secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido de la SEC ID NO. 50, o (b) al menos la secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido de la SEC ID NO. 50 con secuencias de flanqueo N y C-terminales adicionales de la secuencia correspondiente de la SEC ID NO. 5.
9. Un péptido antigénico de la clase II de MHC, caracterizado porque comprende: (a) al menos la secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido de la SEC ID NO. 108, o (b) al menos la secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido de la SEC ID NO. 108 con secuencias de flanqueo N y C-terminales adicionales de la secuencia correspondiente de las SEC ID NOs . 64 .y 67.
10. Un péptido antigénico de la clase II de MHC, caracterizado porque comprende: (a) al menos la secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido de la SEC ID NO. 109, o (b) al menos la secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido de la SEC ID NO. 109 con secuencias de flanqueo N y C-terminales adicionales de la secuencia correspondiente de la SEC ID NO. 68.
11. Un péptido antigénico de la clase II de MHC, caracterizado porque comprende: (a) al menos la secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido de la SEC ID NO. 110, o (b) al menos la secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido de la SEC ID NO. 110 con secuencias de flanqueo N y C-terminales adicionales de la secuencia correspondiente de las SEC ID NOs. 69 y 70.
12. Un péptido antigénico de la clase II de MHC, caracterizado porque comprende: (a) al menos la secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido de la SEC ID NO. 111, o (b) al menos la secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido de la SEC ID NO. 111 con secuencias de flanqueo N y C-terminales adicionales de la secuencia correspondiente de la SEC ID NO. 72.
13. Un péptido antigénico de la clase II de MHC, caracterizado porque comprende: (a) al menos la secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido de la SEC ID NO. 112, o (b) al menos la secuencia de aminoácidos de la porción de aglutinación del péptido de la SEC ID NO. 112 con secuencias de flanqueo N y C-terminales adicionales de la secuencia correspondiente de la SEC ID NO. 73.
14. El péptido antigénico de la clase II de MHC de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque está enlazado a la molécula de la clase II de MHC.
15. Un anticuerpo, caracterizado porque es reactivo con un péptido antigénico de la clase II de MHC de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.
16. Una molécula de ácido nucléico, caracterizada porque codifica un péptido o polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14.
17. Una construcción de ácido nucléico recombinante, caracterizada porque comprende la molécula de ácido nucléico de conformidad con la reivindicación 16 enlazada operativamente a un vector de expresión.
18. Una célula hospedera, caracterizada porque contiene la construcción de ácido nucléico de conformidad con la reivindicación 17.
19. Un método para la producción de un péptido antigénico de la clase II de MHC de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque comprende las etapas de cultivar la célula hospedera de conformidad con la reivindicación 18 bajo condiciones que permitan la expresión del péptido y la recuperación del péptido de las células o el medio de cultivo.
20. Un método para el aislamiento e identificación de los péptidos antigénicos de RA asociados de la clase II de MHC en cantidades femtomolares , caracterizado porque comprende : (a) proporcionar células dendriticas inmaduras en un número que comprende 0.1 a 5 µg de moléculas de la clase II de MHC; (b) poner en contacto las células de (a) con el suero o el fluido sinovial e inducir la maduración de las células dendriticas agregando TNFalfa, (c) aislar los complejos del péptido antigénico-molécula de MHC de la clase II de las células con métodos que comprenden la solubilización de las células y la captura de los complejos de las moléculas de la clase II de MHC con péptidos antigénicos por inmunoprecipitación o cromatografía de inmunoafinidad; (d) lavar los complejos capturados de las moléculas de la clase II de MHC con péptidos antigénicos con agua en un tubo de ultrafiltración; (e) eluir los péptidos antigénicos asociados de las moléculas de la clase II de MHC a 37 °C con ácido trifluoroacético diluido, y (f) separar, detectar e identificar los péptidos aislados por cromatografía líquida y espectrometría de masa.
21. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque en la etapa (f) del · método la cromatografía líquida comprende una primera etapa de elución lineal del material de fase inversa con un volumen suficiente para eluir los contaminantes previo a la etapa de elución del péptido.
22. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 y 21, caracterizado porque además comprende (g) analizar los péptidos identificados por métodos que comprenden una base de datos y un software desarrollado para efectuar un análisis comparativo de datos a través de conjuntos de datos múltiples.
23. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende un péptido antigénico de la clase II de MHC de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 15, o un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de las SEC ID NOs. 40 a 48 y SEC ID NOs. 123 a 141, y opcionalmente un portador farmacéuticamente aceptable .
24. Una composición de diagnóstico, caracterizada porque comprende el anticuerpo de conformidad con la reivindicación 15.
25. El uso del péptido antigénico de la clase II de MHC de conformidad con la reivindicación 1, en donde el péptido antigénico es un marcador para la RA erosiva y/o no erosiva .
26. El uso del péptido antigénico de la clase II de MHC de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, en donde el péptido antigénico es un marcador para la RA no erosiva.
27. El uso del péptido antigénico de la clase II de MHC de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13, en donde el péptido antigénico es un marcador para la RA erosiva.
28. El uso de un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de las SEC ID NOs. 40 a 48 y SEC ID NOs. 123 a 141 como un marcador para RA, preferentemente para la RA erosiva y/o no erosiva. RESUMEN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona péptidos antigénicos de la clase II de MHC procesados naturalmente, novedosos, los cuales se originan de la tiol reductasa lisosómica inducible con interferón ?, integrina beta-2, fosfatitilinositol-4 , 5-bifosfato 3-cinasa, activador del plasminogeno del tipo de la urocinasa, región V-III de cadena pesada de la inmunoglobulina (VH26) , proteína DJ-1, apolipoproteína B-100, subunidad reguladora 8 diferente de la ATPasa de la proteasoma 26S, receptor de la interleucina-1 , fibromodulina, receptor de GM-CSF/IL-3/IL-5, nexina 3 clasificada, cadena pesada H4 del inhibidor de inter-a-tripsina, C4 complementaria, C3 complementaria (cadena ) , C3 complementaria (cadena ß) , proteína 3 semejante y enriquecida en ácido glutámico para la aglutinación al dominio de SH3 , proteína 1 inducida con interleucina 4, proteína de interacción con Hsc70, cadena no variable (Ii) , proteína 2 de respuesta al receptor del ácido retinóico, fibronectina, catepsina B, tripeptidil-peptidasa II, legumaína, receptor del factor de activación de las plaquetas, poli-2.8-sialiltransferasa, y proteína Rab-llB relacionada con ras. También son provistos péptidos antigénicos y proteínas que son derivados como marcadores para la RA erosiva y/o no erosiva. Además, se proporcionan estos péptidos antigénicos enlazados a las moléculas de la clase II de MHG, anticuerpos reactivos con los péptidos antigenicos, ácidos nucléicos que codifican los péptidos antigenicos, y construcciones de ácidos nucleicos, células hospederas y métodos para expresar los péptidos antigénicos. Los péptidos antigénicos de la invención pueden ser utilizados como marcadores en el diagnóstico de RA y en la terapia como vacunas anti-RA.