MXPA06000080A - Mutagenesis por revision - Google Patents

Abstract

Un método de mutagénesis mediante el cual se introduce un aminoácido predeterminado encada una de las posiciones de un conjunto seleccionado de posiciones en una región preseleccionada (o varias regiones diferentes) de un polipéptido para producir una librería de análogos de polipéptidos;el método estábasado en la premisa que determinados aminoácidos desempeñan un papel crucial en la estructura y función de proteínas;pueden generarse librerías que contenganúnicamente análogos de polipéptidos deseados y que sean de tamaño razonable para selección;las librerías pueden usarse para estudiar el papel de aminoácidos específicos en la estructura y función de polipéptidos y para desarrollar polipéptidos nuevos o mejorados, tales como anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, anticuerpos de una sola cadena, enzimas y ligandos.

Description

UTAGENESIS POR REVISIÓN Solicitudes relacionadas e información Esta solicitud reivindica prioridad a la solicitud provisional de Estados Unidos N° 60/483282, presentada el 27 de junio de 2003, cuyo contenido entero se incorpora en esta memoria descriptiva como referencia. El contenido entero de todas las otras patentes, solicitudes de patentes, y referencias citadas a lo largo de la siguiente memoria descriptiva se incorporan también como referencia en su totalidad.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La mutagénesis es una herramienta útil en el estudio y función de estructura de proteínas. La mutagénesis se puede realizar en la secuencia de nucleótidos de un gen clonado que codifica una proteína de interés y el gen modificado se puede expresar para producir mutantes de la proteína. Comparando las propiedades de la proteína de tipo salvaje y los mutantes generados, a menudo es posible identificar aminoácidos individuales o dominios de aminoácidos que son esenciales para la integridad estructural y/o función bioquímica de la proteína, tal como su unión y/o actividad catalítica. Sin embargo, el número de mutantes que se puede generar a partir de la proteína individual hace difícil seleccionar mutantes que serán informativos o tienen la propiedad deseada, incluso si los mutantes seleccionados que abarcan las mutaciones están únicamente en regiones supuestas importantes de una proteína (por ejemplo, regiones que conforman un sitio activo de una proteína). Por ejemplo, la sustitución, supresión, o inserción de un aminoácido particular puede tener un efecto local o global sobre la proteína. Los procedimientos anteriores para la mutagenización de polipéptidos han sido o bien demasiado restrictivos, demasiado incluso, o limitados para inactivar la función de las proteínas en lugar de ganar o mejorar la función. Por ejemplo, un planteamiento altamente restrictivo es de mutagénesis selectiva o dirigida al sitio que se usa para identificar la presencia de un sitio funcional particular o entender las secuencias de realización de una alteración muy especificada dentro del sitio funcional. Una aplicación común de mutagénesis dirigida al sitio en el estudio de las fosfoproteínas en las que un resto aminoácido, que ordinariamente se fosforilaría y permitiría que el polipéptido llevara a cabo su función, se altera para confirmar la unión entre la actividad do fosforilación y funcional. Este planteamiento es muy específica para el polipéptido y resto que se esta estudiando. Recíprocamente, un planteamiento altamente inclusivo es la saturación o mutagénesis al azar que se diseña para producir un gran número de mutaciones que abarcan todas las alteraciones posibles dentro de una región definida de un gen o proteína. Esto se basa en el principio de que, generando esencialmente todas las posibles variantes de un dominio proteico relevante, la disposición apropiada de aminoácidos a producir como uno de los mutantes generados al azar. Sin embargo, en la práctica, el vasto número de combinaciones al azar de mutaciones generadas pueden prevenir la capacidad de seleccionar de manera significante un candidato deseado debido a la presencia del llamado "ruido" de de esta forma muchos candidatos indeseados. Otro planteamiento, denominado mutagénesis de "espera" (véase, las patentes números 5,830,650; 5,798,208) se ha usado para mutagenizar una región definida de un polipéptido sintetizando una mezcal de oligonucleótidos degenerados que, estadísticamente, contienen un conjunto deseado de mutaciones. Sin embargo, debido a la síntesis de polinucleótidos degenerados, la mutagénesis de paseo por produce un número de alteraciones no deseadas además del conjunto deseado de mutaciones. Por ejemplo, para introducir secuencialmente una mutación a través de una región definida de cinco posiciones de aminoácidos solamente, se puede preparar un conjunto de alrededor de 100 polinucleótidos (y seleccionar) (véase, por ejemplo, la figura 6). De acuerdo a lo anterior, para preparar y seleccionar, por ejemplo, dos o tres regiones que llegan a ser complejo creciente, es decir, que requiere la preparación y selección de 200 a hasta 300 polinucleótidos, respectivamente, para la presencia de 10 a 15 mutaciones solamente. Todavía en otro planteamiento que se ha usado para mutagenizar proteínas es la mutagénesis de exploración de alanina, en la que un resto alanina se "explora" a través de una porción de una proteína para identificar posiciones en las que la función de proteínas está interrumpida. Sin embargo, este planteamiento solamente mira la pérdida de la función de proteínas por medio de la sustitución de un resto alanina neutro en una posición dada, en lugar de ganar o mejorar la función. De este modo, no es un planteamiento útil para generar proteínas que han mejorado la estructura y función. De acuerdo con lo anterior, permanece una necesidad de una forma sistemática de mutagenizar una proteína para una función nueva o mejorada.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a un procedimiento de mutagénesis para la generación de proteínas novedosas o mejoradas (o polipéptidos) y a librerías de análogos de polipéptidos y polipéptidos específicos generados por los procedimientos. El polipéptido dirigido para mutagénesis puede se un polipéptido natural, sintético o modificado por ingeniería genética, que incluye fragmentos, análogos y las formas mutantes de los mismos. En una modalidad, el procedimiento comprende la introducción de un aminoácido predeterminado esencialmente en cada posición dentro de una región definida (o varias regiones diferentes) de la secuencia de aminoácidos de un polipéptido. Una librería de polipéptidos de genera de manera que contenga análogos de polipéptidos que no tienen individualmente más de un aminoácido predeterminado, pero que colectivamente tienen el aminoácido predeterminado en cada posición dentro de la (s) región (es) definida (s). El procedimiento se puede denominar "revisión" de mutagénesis debido a que, en efecto, un aminoácido individual, predeterminado (y solamente el aminoácido predeterminado) se sustituye posición por posición a lo largo de una (s) región (es) más definida (s) de un polipéptido. De este modo la invención permite "revisar" las consecuencias estructurales y funcionales de la sustitución de manera separada de un aminoácido predeterminado en cada posición de aminoácido dentro de una región definida del polipéptido por lo tanto segregando una química de proteínas específica a la región definida sin ninguna interferencia o "ruido" de la generación de análogos de polipéptidos no deseados (es decir análogos que contienen sustituciones de aminoácidos distintas de las que siguen al esquema de "revisión") véase por ejemplo la figura 6. De acuerdo con lo anterior, la presente invención permite la evaluación sistemática altamente eficaz y precisa del papel de un cambio de aminoácidos específico en una o más regiones definidas de un polipéptido. Esto llega a ser particularmente importante cuando la evaluación (mediante mutación) de dos o más regiones definidas, de manera que el número de análogos de polipéptidos requeridos se incrementa en gran medida y, de este modo, también se incrementa la presencia de análogos no deseados. La presente invención obvia este problema mediante la eliminación completa de análogos no deseados y, de este modo, el potencial de que cualquier cambio en la estructura o función de proteína observada son el resultado de cualquier cosa sino la sustitución del aminoácido predeterminado. De este modo, el efecto de la segregación de una química de proteínas específica a incluso regiones múltiples con una proteína se puede estudiar con alta precisión y eficacia. De manera importante, esto ¡ncluye el estudio de cómo la mutagénesis puede efectuar la interacción de tales regiones, por lo tanto mejorando la estructura y función global de la proteína. En una modalidad particular de la invención, la librería de los análogos de polipéptidos se genera y selecciona sintetizando primero los polinucleótidos individuales que codifican una región o regiones de un polipéptido en las que, de manera colectiva, los polinucleótidos representan todos los polinucleótidos posibles variantes de acuerdo con el criterio de revisión descrito en esta memoria descriptiva. Los polinucleótidos variantes se expresan, por ejemplo, usando transcripción y traducción in vitro y/o usando una tecnología de representación, tal como representación de ribosomas, representación de fagos, representación bacteriana, representación de levaduras, representación en serie o cualquier otro sistema de representación adecuada conocido en la técnica. Los polipéptidos expresados se rastrean y seleccionan después usando ensayos funcionales, tales como ensayos de unión o ensayos enzimáticos/catalíticos. En una modalidad, los polipéptidos se expresan en asociación con el polinucleótido que codifica el polipéptido, por lo tanto permitiendo la identificación de la secuencia de polinucleótidos que codifica el polipéptido. Todavía en otra modalidad, los polipéptidos se sintetizan directamente usando química de proteínas. De este modo, la presente invención proporciona un procedimiento de mutagénesis que se puede usar para generar librerías de análogos de polipéptidos que son de un tamaño práctico para la selección, en parte, debido a que las librerías están desprovistas de cual polipéptido análogo no deseado o también llamado ruido. El procedimiento se puede usar para estudiar el papel de aminoácidos específicos en la estructura y función de polipéptidos y para desarrollar polipéptidos nuevos o mejorados tales como anticuerpos, fragmentos de unión o análogos de los mismos, anticuerpos de cadenas individuales, anticuerpos catalíticos, enzimas y ligandos. Además, el procedimiento se puede realiza con el beneficio de una información a priori., por ejemplo, mediante modelado por ordenador, que se puede usar para seleccionar un subconjunto inicial de análogos de polipéptidos a producir y estudiar usando mutagénesis por "revisión". Otras ventajas y aspectos de la presente invención serán fácilmente evidentes a partir de la descripción y ejemplos siguientes.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1 ilustra las regiones definidas de manera ejemplar (o regiones D) que se pueden examinar usando mutagénesis por revisión (LTM) y ensayos funcionales para identificar análogos de polipéptidos deseados a partir de tales regiones D.

La figura 2 ilustra el uso de LTM entres regiones definidas en una región variable de anticuerpo (es decir, CDR1, CDR2, y CDR3 de una región variable de cadena pesada de anticuerpo). La región variable de la cadena ligera se puede explorar de manera similar, o bien sola o en combinación con la región variable de la cadena pesada. Para conveniencia en los ensayos de selección posterior, la región variable de la cadena pesada se puede explorar en el contexto de un anticuerpo de la cadena individual (sFv) como se muestra. La figura 3 ilustra el uso de LTM en una región definida (es decir, posiciones 31 - 25 de CDR1) de una región variable de la cadena pesada. La figura 4 ilustra el uso de LTM en una región definida (es decir, posiciones 55 - 68 de CDR2) de una región variable de la cadena pesada. La figura 5 ¡lustra el uso de LTM en una región definida (es decir, posiciones 101 - 111 de CDR3) de una región variable de la cadena pesada. La figura 6 ilustra las ventajas de LTM comparada con la mutagénesis por espera. La LTM de una región representativa definida, es decir CDR1 de una región variable de cadena pesada de anticuerpo, da como resultado la alteración secuencial de cada posición de aminoácidos mediante la región definida, sin la introducción de ningún residuo de aminoácidos no deseados o también llamado ruido. La figura 7 ilustra la integración de tres regiones definidas de una proteína de nuevo en el contexto de las proteínas siguiendo la mutagénesis por revisión, en particular, la integración de las tres CDR de una región variable de la cadena pesada en un formato de anticuerpo de una sola cadena siguiendo la mutagénesis por revisión. La figura 8 ilustra el uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para construir regiones definidas de una cadena pesada y ligera de anticuerpo sometida a LTM en un contexto de gen mayor. La figura 9 ¡lustra de manera ejemplar la diversidad de formatos de cada una de las CDR en una región variable de anticuerpo para obtener un sitio cartalítico que comprende, por ejemplo, una serina, histidina, y/o ácido aspártico y como se pueden disponer. La figura 10 ilustra la integración de las seis CDR de una región de unión de un anticuerpo que se ha sometido a LTM y la diversidad resultante si se usa un resto de aminoácido predeterminado de veinte restos de aminoácidos predeterminados diferentes. La figura 11 ilustra la integración de las seis CDR de un anticuerpo de cadena individual anti - TNF (sFv) y que se ha sometido a LTM y la diversidad resultante si se usa un resto de aminoácido predeterminado de tres restos de aminoácidos predeterminados diferentes. La figura 12 ilustra una librería ordenada que representa alguno de los posibles análogos de polipéptidos de las seis CDR de una región de unión de anticuerpo que se puede lograr usando LTM. La figura 13 ilustra la selección de una librería de expresión ordenada usando representación de ribosomas libres. La figura 14 ¡lustra la química combinatoria explorada cuando la región de unión de una región variable de anticuerpo (es decir, las seis CDR) se somete a LTM. La figura 15 muestra la secuencia de la región variable (en formato de cadena individual) de varias moléculas de unión anti - TNF representativas que están sometidas a LTM. La figura 16 muestra un esquema para llevar a cabo el ensayo de selección de proteasa para candidatos catalíticos de selección de LTM. La figura 17 muestra un esquema que detalla el mecanismo (y ventajas) del ensayo de selección de proteasa cuando se lleva a cabo en células bacterianas. La figura 18 muestra un diagrama de flujo que detalla la mecánica de librerías génicas de selección para actividad catalítica, por ejemplo, actividad de anticuerpo catalítica, que usa representación o bien de ribosomas o de levaduras. La figura 19 muestra un esquema para llevara cabo LTM cuando se puede coordinar una información (por ejemplo, información de moldeo por ordenador) y empírica (resultados de ensayos) para ¡n diseño y desarrollo de molécula más eficaz. Este planteamiento guiado de LTM se denomina mutagénesis "a través de guía" La figura 20 muestra una secuencia de tipo salvaje hipotética VH CDR3 (óvalos sombreados en la parte superior) y las secuencias resultantes en los miembros de la librerías de la sustitución His por LTM (en óvalos en blanco). Las sustituciones LTM His individuales están codificadas por oligonucleótidos individuales, por ejemplo, oligonucleótidos sintetizados de una manera de alto rendimiento. Las librerías de subconjuntos de LTM para las otras sustituciones de aminoácidos (LTM) en este dominio de CDR se construyen de una manera similar. La figura 21 ilustra la generación de librerías scFv. En la línea de la parte superior del eje x y la columna alejada de la parte izquierda del eje x los tres dígitos representan las 3 CDR sobre cada una de las cadenas ligeras y pesadas. Un "0" indica una secuencia de CDR de tipo salvaje, mientras que un "1" indica una CDR mutada por LTM. El número sobre la cuadrícula indica la complejidad de la librería subconjunto. Por ejemplo en el extremo superior izquierdo de la matriz es un "0" cuando los ejes x e y correspondientes son "000" y "000" que indican que ninguna de las CDR en o bien el VH y VL están respectivamente mutados. Al mover una fila desde el extremo "0" a la posición de la cuadrícula vecina "1" estaría diseñada por el eje a "100" y "000" en el eje y que indica que VH CDR1 está mutada mientras que V CDR permanece de tipo salvaje. De este modo, de manera similar, una numeración de cuadrícula de "4" significaría que existen una numeración de cuadrícula e "4" significaría que existen cuaíro CDR mutadas simultáneamente. Inicialmente las siete cadena VH y VL (indicadas por las flechas) se preparan usando SOE - PCR. Las cadenas VH y VL se amplifican después y se mezclan y se emparejan mediante un cebador mega para generar las combinaciones VH y VL restantes en una etapa.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Con el fin de prevenir un entendimiento claro de la memoria descriptiva y reivindicaciones, se proporcionan a continuación las siguientes definiciones.

Definiciones Como se usa en esta memoria descriptiva el término "análogo" se refiere a un polipéptido variante o polipeptídico (o un ácido nucleico que codifica tal polipéptido) que tiene una o más sustituciones de aminoácidos. El término "molécula de unión" se refiere a cualquier molécula de unión, incluyendo proteínas, polipéptidos, péptidos, y pequeñas moléculas, que se unen a un sustrato o diana. En una modalidad, la molécula de unión es un anticuerpo o fragmento de unión (por ejemplo, un fragmento Frab), anticuerpo de dominio individual, anticuerpo de cadena individual (por ejemplo, sFv), o péptido capaz de unirse a un ligando. El término "región definida" se refiere una región seleccionada de un polipéptido. Típicamente, la región definida incluye todo o una porción de un sitio funcional, por ejemplo, el sitio de unión de un ligando, el sitio de unión de una molécula de unión o receptor, o un sitio catalítico. La región definida también puede incluir porciones múltiple de un sitio funcional. Por ejemplo, la región definida puede incluir todas, o porciones múltiples de una región determinante de complementariedad (CDR) o una región variable (VR) de cadena pesada y/o ligera completa de un anticuerpo. De este modo, el sitio funcional puede incluir una región individual o múltiple definida que contribuye a la actividad funcional de la molécula. El término "librería" se refiere a dos o más moléculas mutagenizadas de acuerdo con el procedimiento de la invención. Las moléculas de la librería pueden estar en al forma de polinucleótidos, polipéptidos, polinucleótidos y polipéptidos, polinucleótidos y polipéptidos en un extracto libre de células, o como polinucleótidos y/o polipéptidos en el contexto de un fago, células procarióticas, o en células eucarióticas. El término "mutagenización" se refiere a la alteración de una secuencia de aminoácidos. Esto se puede lograr alterando o produciendo un ácido nucleico (polinucleótido) capaz de codificar la secuencia de aminoácidos alterados, o mediante la síntesis directa de un polipéptido alterado usando química de proteínas. El término "polinucleótido (s)" se refiere a ácidos nucleicos tales como moléculas de ADN y moléculas de ARN y análogos de los mismos (por ejemplos, ADN o ARN generado usando análogos de nucleótidos o usando química de de ácidos nucleicos). Según se desea, los polinucleótidos se pueden preparar de manera sintética, por ejemplo, usando química de ácidos nucleicos reconocidos en la técnica o enzimáticamente usando, por ejemplo, una polimerasa. Las modificaciones típicas incluyen mutilación, biotinilación, y otras modificaciones conocidas en al técnica. Además, la molécula de ácido nucleico puede ser de cadena sencilla o de cadena doble, cuando se desea, unida o asociada (por ejemplo, de manera covalente o no covalente) a un resto detectable. El término "polinucleótido variante" se refiere a un polinucleótido que codifica un análogo de polipéptido correspondiente (o porción del mismo) de la invención. De este modo, los polinucleótidos variantes contienen uno o más codones que se han cambiado para dar como resultado la expresión de un aminoácido diferente. El término "polipéptido (s)" se refiere a dos o más aminoácidos unidos mediante un enlace peptídico, por ejemplo, péptidos (por ejemplo, de a aproximadamente 50 restos aminoácidos), así como secuencias de péptidos más largos por ejemplo, decencias de proteínas que comprenden típicamente secuencias de aminoácidos de cómo poco 50 restos aminoácidos a más de 1000 restos aminoácidos. El término "combinación" se refiere a la combinación de variantes de polipéptidos o análogos de polipéptidos para formar librerías que representan la mutagénesis por revisión de una región polipeptídica entera. Las moléculas pueden estar en al forma de un polinucleótido y/o polipéptido y puede coexistir en la forma de una sublibrería, como moléculas de un soporte sólido, como moléculas en solución, y/o como moléculas en uno o más organismos (por ejemplo, fago, células procarióticas, o células eucarióticas). El término "aminoácido predeterminado" se refiere a un resto aminoácido seleccionado para sustitución en cada posición dentro de una región definida o polipéptido a mutagenizar. Esto no incluye posición (es) dentro de la región que ya (por ejemplo, naturalmente) contiene el aminoácido predeterminado y, de este modo, que necesita no estar sustituida con el aminoácido predeterminado. De acuerdo con lo anterior, cada análogo de polipéptido generado de acuerdo con la presente invención contiene no más de un resto "aminoácido predeterminado" en una región determinada dada. Sin embargo, de manera colectiva, la librería de análogos de proteína generados contiene el aminoácido predeterminado en cada posición de la región que se está mutagenizando. Típicamente, un aminoácido predeterminado se selecciona para un tamaño particular o química usualmente asociado con el grupo lateral del aminoácido. Los aminoácidos predeterminados adecuados ¡ncluyen, por ejemplo, glicina y alanina (esteáricamente pequeño); serina, treonina, y cisteína (nucleófila); valina, leucina, isoleucina, metionina, y prolina (hidrófoba); fenilalanina, tirosina, y triptófano (aromático); aspartato y glutamato (ácido); asparagina, glutamina, e histidina (amida); y lisina y arginina (básica).

MODALIDAD PREFERIDA DE LA INVENCIÓN El estudio de proteínas ha revelado que ciertos aminoácidos juegan un papel crucial en su estructura y función. Por ejemplo, parece que solamente un número de aminoácidos participan en la unión de un anticuerpo a un antígeno o están implicados en el caso catalítico de una enzima. Aunque está claro que ciertos aminoácidos son críticos para la actividad o función de proteínas, es difícil identificar qué aminoácidos están implicados, cómo están implicados, y qué sustituciones pueden mejorar la estructura o función de proteína. En parte, esto se debe a la complejidad de la configuración espaciadle cadenas laterales de aminoácidos en polipéptidos y la interrelación de porciones diferentes del polipéptido que contribuye a formar un sitio funcional. Por ejemplo, la interrelación entre las seis CDR de las regiones variables de lea cadenas pesadas y ligeras de un anticuerpo contribuyen al bolsillo de unión a antígeno o ligando. Los procedimientos de mutagénesis previa, tales como mutagénesis selectiva (dirigida al sitio) y mutagénesis por saturación, son de utilidad limitada para el estudio de estructura de proteínas y función en vista del número enorme de posibles variantes en polipéptidos complejos. Esto es especialmente cierto dado que combinaciones deseables están a menudo acompañadas por la presencia de vastas cantidades de combinaciones no deseables o también llamadas ruido. El procedimiento de esta invención proporciona un planteamiento sistemático, práctica, y altamente exacto de evaluación del papel de los aminoácidos particulares y su posición, dentro de una región definida de un polipéptido, en la estructura o función del polipéptido y, de este modo, para producir polipéptidos mejorados. 1. Selección de una región definida De acuerdo con la presente ¡nvención, una región o regiones definidas dentro de una proteína se seleccionan por mutagénesis. Típicamente, las regiones se cree que son importantes para la estructura o función de las proteínas (véase, por ejemplo, la figura 1). Esto se puede deducir, por ejemplo, a partir de los que los aspectos estructurales y funcionales se conocen o se pueden deducir de la comparación de la (s) región (es) definidas que se conocen a partir del estudio de otras proteínas, y se pueden ayudar mediante modelado de la ¡nformación. Por ejemplo, la región definida puede ser una que tieen un papel en un sitio funcional, por ejemplo, en catálisis de unión, u otra función. En una modalidad, la región de finida es una región hipervariable o región determinante de complementariedad (CDR) de una molécula de unión a antígeno. En otra modalidad, la región definida es una porción de una región determinante de complementariedad (CDR). En otra modalidad, dos o más regiones definidas, por ejemplo, CDR o porciones de la misma, se seleccionan para mutagénesis. 2. Selección de un residuo de aminoácidos predeterminado El resto de aminoácidos elegido para sustitución dentro de la 8s) región (es) definida (s) generalmente se selecciona entre las conocidas que están implicadas en la estructura o función de interés. Los veinte aminoácidos de origen natural difieren con respecto a su cadena secundaria. Cada cadena secundaria es responsable de propiedades químicas que hacen cada aminoácido único. Para el propósito de alteración de la unión o creación de nuevas afinidades de unión, se puede seleccionar en general cualquiera de los aminoácidos de origen natural. De este modo, los procedimientos previos de mutagénesis, que crean vastos números de análogos para cada sustitución, no eran prácticos para evaluar el efecto sobre la unión de proteína de sustitución de cada uno de los veinte aminoácidos. Por el contrario, los procedimientos de la presente invención crean un número práctico de análogos para cada una de las sustituciones de de los aminoácidos y, de este modo, permite la evaluación de una diversidad de químicas de proteínas dentro de una región o regiones de una proteína. En contraste con la unión de proteínas, solamente un subconjunto de restos de aminoácidos participan típicamente en episodios enzimáticos no catalíticos. Por ejemplo, a partir de las propiedades químicas de las cadenas secundarias, solamente un número seleccionado de aminoácidos naturales participan preferentemente en episodio catalíticos. Estos aminoácidos pertenecen al grupo de aminoácidos polares y neutros tales como Ser, Thr, Gln, Tyr, y Cys, el grupo de aminoácidos cargados, Asp y Glu, Lys y Arg, y especialmente el aminoácido His. Otras cadenas secundarias polares y neutras son las de Cys, Ser, Thr, Asn, Gln y Tyr. Gly se considera también que es un miembro límite de este grupo. Ser y Thr juegan un papel importante en la formación de enlaces hidrógeno. Thr tiene una asimetría adicional en le carbono beta, por lo tanto solamente se usa uno de los estereoisómeros. El aminoácido Gln y Asn también puede formar enlaces hidrógeno, los grupos amido que funcionan como dadores de hidrógeno y los grupos carbonilo que funcionan como aceptores. Gln tiene un grupo más CH2 que Asn que hace que el grupo polar sea más flexible y reduce su interacción con la cadena principal. Tyr tiene un grupo hidroxilo muy polar (OH fenólico) que se puede disociar a valores de pH altos. Tyr se comporta de alguna manera como una cadena secundaria cargada; sus enlaces hidrógeno son bastante fuertes. Los ácidos polares neutros se encuentran en la naturaleza así como en el interior de las moléculas de las proteínas. Como residuos internos, usualmente forman enlaces de hidrógeno can cada otro o con la estructura principal del polipéptido. Cys puede formar puentes disulfuro. Histidina (His) tiene una cadena lateral aromática heterocíclica con un valor de pK de 6.0. En el intervalo de pH fisiológico, su anillo imidazol puede estar o bien no cargado o cargado, después de recoger un ion hidrógeno de la solución. Ya que estos dos estados están fácilmente disponible, His es completamente adecuado para catalizar reacciones químicas. Se encuentra en la mayoría de los centros activos de las enzimas, por ejemplo, serina proteasas. Asp y Glu están cargados negativamente pH fisiológico. Debido a su corta cadena secundaria, el grupo carboxilo de Asp en bastante rígido con respecto a la cadena principal. Esta puede ser la razón por la que el grupo carbonilo en muchos sitios catalíticos se proporciona mediante Asp y no mediante Glu. Los ácidos cargados se encuentran generalmente en la superficie de un polipéptido. Además, Lys y Arg se encuentran en la superficie. Tienen cadenas secundarias largas y flexibles que presentan múltiples rotámeros o energías similares. En varios casos, Lys y Arg toman parte en la formación de puentes de sal interna o su ayuda en catálisis. Debido a su exposición a la superficie del polipéptido, Lys es un resto reconocido más frecuentemente por enzimas que o bien modifican la cadena secundaria o escinden la cadena peptídico en el extremo carbonilo de los restos Lys. Mientras que la química de grupo secundario de un aminoácido puede guiar la selección de un resto de aminoácido predeterminado, la carencia de una química de grupo secundario deseado puede ser un criterio para excluir un resto aminoácido para uso como el aminoácido predeterminado. Por ejemplo, los aminoácidos estéricamente pequeños y químicamente neutros, tales como alanina, se pueden excluir de la mutagénesis por revisión para carecer de una química deseada. 3. Síntesis de librerías de análogos de polipéptidos En una modalidad, una librería de análogos de polipéptidos se genera para seleccionar mediante síntesis de oligonucleótidos individuales que codifican la región definida del polipéptido y no tienen más de un codón para el aminoácido predeterminado. Esto se lleva a cabo incorporando en cada posición de codón dentro del oligonucleótido o bien el codón requerido para la síntesis de polipéptido de tipo salvaje o un codón para el aminoácido predeterminado. Esto se diferencia de los oligonucleótidos producidos en mutagénesis por saturación, mutagénesis al azar, o mutagénesis por revisión porque, para cada oligonucleótido, solamente se realiza una mutación, opuesta a mutaciones múltiples. Los oligonucleótidos se pueden producir de manera individual y después mezclarse o combinarse como se desee. Cuando e codón de la secuencia de tipo salvaje y el codón para el aminoácido son los mismos, no se realiza ninguna sustitución. De acuerdo con lo anterior, el número de posiciones de aminoácidos dentro de la región definida determinará el número máximo de oligonucleótidos preparados. Por ejemplo, si cinco posiciones de codón están alteradas con el aminoácido predeterminado, entonces se sintetizan cinco oligonucleótidos más un polinucleótido que representa la secuencia de aminoácidos de tipo salvaje. Pueden estar alteradas simultáneamente dos o más regiones. La mezcla de oligonucleótidos para la generación de la librería se puede sintetizar fácilmente mediante procedimientos conocidos para la síntesis de ADN. El procedimiento preferido implica el uso de química de beta - cianoetil fosforamidita de fase sólida. Véase la patente de Estados Unidos N° 4,725,677. Por conveniencia, se puede usar un instrumento para la síntesis de ADN automática que contenga recipientes de reactivo específico de nucleótidos. Los polinucleótidos también se pueden sintetizar para que contengan sitios de restricción o sitios de hibridación de cebadores para facilitar la introducción o ensamblaje de los polinucleótidos que representan, por ejemplo, una región definida en un contexto de genes mayor. Los polinucleótidos sintetizados se pueden insertar en un contexto de genes más grande del polipéptido que se está mutagenizando usando técnicas de ingeniería genética convencional. Por ejemplo, los polinucleótidos se pueden preparar para que contengan sitios flanqueantes de reconocimiento para las enzimas de restricción. Véase, Crea, R., patente de estados Unidos N° 4,888,286. Los sitios de reconocimiento se diseñan para que correspondan a sitios de reconocimiento que o bien existen de manera natural o se introducen en el gen próximo al ADN que codifica la región. Después de la conversión en la forma de cadena doble, los polinucleótidos se ligan en el gen mediante técnicas convencionales. Mediante un vector apropiado (que ¡ncluye, por ejemplo, vectores de fagos, plásmidos) los genes se pueden introducir en un extracto sin células, células procarióticas, o células eucarióticas adecuadas para la expresión de los polipéptidos mutantes. En los casos en los que se conoce la secuencia de aminoácidos del polipéptido a mutagenizar o cuando se conoce la secuencia de ADN, la síntesis de genes en un posible planteamiento. Por ejemplo, polinucleótidos solapados parcialmente, típicamente se pueden diseñar aproximadamente 20 - 60 nucleótidos de longitud. Los polinucleótidos internos se fosforilan después hibridados a su pareja complementaria para proporcionar una molécula de ADN de doble cadena con extensiones de cadena sencilla útiles para hibridación adicional. Los pares hibridados se pueden después mezclar juntos y ligarse para formar una molécula de doble cadena de longitud completa (véase, por ejemplo, la figura 8). Los sitios de restricción convenientes de pueden diseñar cerca de los extremos del gen sintético para la clonación en un vector adecuado. Las moléculas de longitud completa se pueden escindir con las enzimas de restricción y ligarse en un vector adecuado. Los sitios de restricción convenientes también se pueden incorporar en la secuencia del gen sintético para facilitar la introducción de módulos mutagénicos. Como alternativa para la síntesis de polinucleótidos que representan el gen de doble cadena de longitud completa, los polinucleótidos que se superponen parcialmente en sus extremos 3' (es decir, con extremos 3' complementarios) se pueden ensamblar en una estructura abierta y después cargarse con una polimerasa adecuada para preparar un gen de doble cadena de longitud completa. Típicamente, los polinucleótidos de superposición son entre 40 - 90 nucleótidos de longitud. Los polinucleótidos extendidos se ligan después. Los sitios de restricción convenientes se pueden introducir en Iso extremos y/o internamente para propósitos de clonación. Después de la digestión con una enzima o enzimas de restricción apropiada (s), el fragmento de gen se liga en un vector adecuado. Como alternativa, el fragmento de gen puede estar ligado en el extremo romo en un vector apropiado. En estos planteamientos, si están disponibles sitios de restricción convenientes (de manera natural o modificados por ingeniería genética) después del ensamblaje de genes, los polinucleótidos degenerados de pueden introducir posteriormente mediante clonación del módulo en un vector apropiado. Como alternativa, los polinucleótidos degenerados se pueden incorporar en la fase de ensamblaje de genes. Por ejemplo, cuando ambas cadenas del gen se sintetizan completamente químicamente, se puede producir polinucleótidos degenerados complementarios. Los pares complementarios se hibridarán entre sí. Cuando se usan polinucleótidos parcialmente superpuestos en el ensamblaje de genes, un conjunto de nucleótidos degenerados también se puede incorporar directamente en lugar de uno de los polinucleótidos. La cadena complementaria apropiada se sintetiza durante la reacción de extensión a partir de un polinucleótido complementario parcialmente de la otra cadena mediante extensión enzimática con una polimerasa. La incorporación de los polinucleótidos degenerados en la fase de síntesis también simplifica la clonación cuando se mutageniza más de un dominio o región definida de un gen. En otro planteamiento, el gen de interés está presente en un plásmido de cadena sencilla. Por ejemplo, el gen se puede clonar en un vector de fago o un vector con un origen de fago filamentoso de replicación que permite la propagación de moléculas de cadena sencilla con el uso de un fago auxiliar. El molde de cadena sencilla se puede hibridar con un conjunto de polinucleótidos degenerados que representan las mutaciones deseadas y alargarse y ligarse, incorporando de esta manera cada cadena análoga en una población de moléculas que se pueden introducir en un huésped apropiado (Sayers, J. R. y col., Nucleic Acids Res. 16: 791 - 802 (1988). Este planteamiento puede evitar muchas etapas de clonación cuando los dominios múltiples se seleccionan para mutagénesis. La metodología de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) también se puede usar para incorporar polinucleótidos en un gen. Por ejemplo, los propios polinucleótídos se pueden usar como cebadores para extensión. En este planteamiento, los polinucleótidos que codifican que codifican los módulos mutagénicos que corresponden a la región definida (o porción de la misma) son complementarios entre sí, al menos en parte, y se pueden extender para formar un módulo de genes grande que usa una polimerasa, por ejemplo, usando amplificación de PCR. El tamaño de la librería variará dependiendo de la longitud y número se regiones y aminoácidos dentro de una región que se mutageniza. Preferiblemente, la librería se diseñar para que contenga menos de 1015, 1014, 1013, 1212, 1011, 1010, 109, 108, 107 y más preferiblemente, 106 análogos de polipéptidos o menos. La descripción anterior se ha centrado en la mutagénesis de polipéptidos y librerías de polipéptidos alterando el polinucleótido que codifica el polipéptido correspondiente. Sin embargo, se entiende que el alcance de la invención también abarca procedimientos de mutagenización de polipéptidos mediante al síntesis directa de los análogos de polipéptidos deseados usando química de proteínas. Cuando se lleva a cabo este planteamiento, los polipéptidos resultantes todavía incorporan las características de la invención excepto que se elimina el uso de un polinucleótidos. Para las librerías descritas anteriormente, bien en la forma de polinucleótidos y/o polipéptidos correspondientes, se entiende que las librerías también pueden estar unidas a un soporte sólido, tal como un microchip, y preferiblemente ordenadas, usando técnicas reconocidas en la técnica. 4. Sistemas de expresión y selección Las librerías de polínucleótidos generadas mediante cualquiera de las técnicas anteriores u otras técnicas adecuadas se pueden expresar y seleccionar para que identifiquen análogos de polipéptidos que tienen la estructura y/o actividad deseada. La expresión de los análogos de polipéptidos se puede llevar a cabo usando cualquier sistema de representación de expresión adecuada conocida en la técnica incluyendo, pero no limitada a, sistema de representación de extractos sin células (por ejemplo, representación de ribosomas y sistemas de representación ordenada (por ejemplo, microordenadas o macroordenadas), sistemas de representación bacteriana, sistemas de representación de fago, células procarióticas, y/o células eucarióticas (por ejemplo, sistemas de representación de levaduras). En una modalidad, los polinucleótidos se modifican por ingeniería genética para que sirvan como moldes que se pueden expresar en un extracto sin células. Los vectores y extractos como se describen, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos N° 5,324,637; 5,492,817; ,665,563, se pueden usar y muchos están comercialmente disponibles. Se puede usar la representación de ribosomas y otras técnicas sin células para la unión a un polinucleótido (por ejemplo, un genotipo) a un polipéptido (es decir, un fenotipo) por ejemplo, Profusión ™ (véase por ejemplo, las patentes de Estados Unidos números 6,348,315; 621 ,804; 6,258,558; y 6,214,553). Como alternativa, los polinucleótidos de la invención se pueden expresar en un sistema de expresión conveniente de E. coli, tal como el descrito por Pluckthum y Skerra. (Pluckthum, A. y Skerra, A., Meth. Enzymol. 178: 476 - 515 (1989); Skerra, A. y col., Biotechnology 9: 273 - 178 (1991)). Las proteínas mutantes se pueden expresar para la secreción en el medio y/o en el citoplasma de la bacteria, como describen M. Better y A. Horwitz, Meth. Enzymol. 178: 476 (1989). En una modalidad, los dominios individuales que codifican VH y VL están cada uno unidos al extremo 3' de una secuencia que codifica una secuencia señal, tal como la secuencia señal ompA, phoA o pelB (Lei, S. P. y col., J. Bacterial. 169: 4379 (1987). Estas fusiones de genes se ensamblan en una construcción dicistrónica, de manera que se pueden expresar a partir de un vector individual, y secretarse en el espacio periplásmico de E. coli cuando se repliegan y se pueden recuperar en una forma activa, (Skerra, A. y col., expresada simultáneamente con los genes de las cadenas ligeras de anticuerpos que producen anticuerpos y fragmentos de anticuerpos. Todavía en otra modalidad, los polinucleótidos se pueden expresar en células eucarióticas tales como el uso de levaduras, por ejemplo, representación de levaduras como se describe por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos números 6,423,538; 6,331 ,391 ; y 6,300,065: En este planteamiento, los análogos de polipéptidos de al librería se condensan a un polipéptido que se expresa y se representa sobre la superficie de la levadura. También se pueden usar otras células eucarióticas para la expresión de los polipéptidos de la ¡nvención, tales como células de mamíferos, por ejemplo células de mieloma, células de hibridoma, o células de ovarios de hámster chino (CHO). Típicamente, los análogos de polipéptidos cuando se expresan en células de mamíferos se diseñan para que se expresen en el medio de cultivo, o expresarse sobre la superficie de tal célula. El anticuerpo o fragmento de anticuerpos se puede producir, por ejemplo, una molécula de anticuerpo entera o como fragmentos VH y VL individuales, fragmentos Fab, dominios individuales, o como cadenas individuales (sFv) (véase, Huston, J. S. y col., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85: 5879 - 5883 (1988)). La selección de los análogos de polipéptidos expresados (o polipéptidos producidos mediante síntesis directa) se pueden hacer mediante cualquier medio apropiado. Por ejemplo, la actividad de unión se puede evaluar mediante inmunoensayo convencional y/o cromatografía de afinidad y actividad catalítica se puede determinar mediante ensayos adecuados para la conversión de sustratos. La selección de los análogos de polipéptidos de la invención para la función proteolítica se puede llevar a cabo usando un ensayo en placa de hemoglobina convencional como se describe, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos N° 5,798,208.

. Mutapénesis por revisión asistida por modelado por ordenación La mutagénesis por revisión de la invención también se puede llevar a cabo con el beneficio de información estructural o modelado concerniente a los análogos de polipéptidos a generar, de manera que el potencial para generar análogos que tienen la función deseada mejorada se incrementa. La ¡nformación estructural o de modelado se pueda también usar para guiar la selección de aminoácidos predeterminado para introducir en las regiones definidas. Todavía adicionalmente, los resultados reales obtenidos con los análogos polipeptídicos de la invención pueden guiar la selección (o exclusión) de polipéptidos posteriores a preparar y seleccionar de una manera interactiva. De acuerdo con lo anterior, la información estructural o de modelado se puede usar para generar subconjuntos iniciales de análogos de polipéptidos para uso en la invención, por lo tanto incrementando adicionalmente la eficacia de generación de polipéptidos mejorados. En una modalidad particular, el modelado en silico se usa eliminar la producción de cualquier análogo de polipéptido predicho que tiene un estructura pobre o indeseada y/o función. De esta forma, el número de análogos de polipéptidos a producirse se puede reducir notablemente incrementando por lo tanto la señal a ruido en ensayos de selección posteriores. En otra modalidad particular, el modelado silico se actualiza continuamente con modelado adicional, a partir de cualquier fuente relevante, por ejemplo, a partir de una secuencia de genes y de proteínas y la base de datos de tres dimensiones y/o resultados de los análogos ensayados previamente, de manera que la base de datos en silico se hace más precisa en su capacidad predictiva (figura 19). Todavía en otra modalidad, la base de datos en silico se proporciona con los resultados de ensayo de los análogos de polipéptidos previamente ensayados y clasifica los análogos, basándose en el criterio o criterios de ensayo, como efectores o no efectores, por ejemplo, como análogos de polipéptidos que se unen bien o no tan bien o por ser enzimática /catalítica o no ser tan enzimática/catalítica. De esta forma la mutagénesis mediante guía de la invención puede igualar un intervalo de respuesta funcional con información estructural particular y usarse tal como información para guiar la producción de análogos de polipéptidos futuros a ensayar. De acuerdo con lo anterior el procedimiento es especialmente adecuado para seleccionar anticuerpos o fragmentos de anticuerpos para una función particular, tal como afinidad de unión (por ejemplo, especificidad), estabilidad (por ejemplo, vida media) y/o función efectora (por ejemplo, activación de complementos y ADCC). De acuerdo con lo anterior, la mutagénesis de restos no contiguos dentro de una región puede ser deseable si se conoce, por ejemplo, mediante un modelado en silico que ciertos restos en la región no participarán en al función deseada. La estructura coordenada e interrelación espacial entre las regiones deseadas, por ejemplo, los restos aminoácidos funcionales en las regiones definidas del polipéptido, por ejemplo, el (los) aminoácido (s) predeterminado (s) que se han introducido, se pueden considerar y modelar. Tales criterios de modelado, por ejemplo, química de grupos secundarios de aminoácidos, distancias atómicas, datos de cristalografía, etc. De acuerdo con residuos alo anterior, el número de análogos de polipéptidos a producir se pueden minimizar de manera inteligente. En una modalidad preferida, uno o más de las etapas anteriores están asistidas por ordenador. El procedimiento también es capaz de llevarse a cabo, en parte o en conjunto, mediante un dispositivo dirigido por ordenador. De acuerdo con lo anterior, las instrucciones para llevar a cabo el procedimiento, en parte o en conjunto, se pueden conferir a un medio adecuado para uso en un dispositivo electrónico para llevar a cabo las instrucciones. En total, los procedimientos de la invención son capaces de un planteamiento de alto rendimiento que comprende software (por ejemplo, ¡nstrucciones legibles de ordenador) y hardware (por ejemplo, los ordenadores, robots y chips). 6. Exploración de la química combinatoria de regiones múltiples definidas La presente invención proporciona la importante ventaja de permitir la evaluación por mutagénesis de varias regiones o dominios diferentes de un polipéptido simultáneamente. Esto se puede hacer usando el mismo o diferente aminoácido diferente predeterminado dentro de cada región, permitiendo la evaluación de sustituciones de aminoácidos en regiones relacionadas de manera conformacional, de forma que las regiones que tras el plegamiento del polipéptido, están asociadas para preparar un sitio funcional (por ejemplo, el sitio de unión de un anticuerpo o el sitio catalítico de una enzima). Esto, a su vez, proporciona una forma eficaz de crear sitios funcionales nuevos o mejorados. Por ejemplo, como se muestra en la figura 14, las seis CDR de un anticuerpo que preparan los aspectos únicos del sitio de unión de antígeno (región Fv), se puede mutagenizar simultáneamente, o separadamente en las cadenas VH o VL, para estudiar las interrelaciones de tres dimensiones de aminoácidos seleccionados en este sitio. En una modalidad, la química combinatoria de las tres o más regiones se exploran de manera sistemática usando mutagénesis por revisión, y preferiblemente seis regiones definidas, por ejemplo las seis CDR de una región variable de la cadena pesada y ligera de anticuerpo. Para realizar esta mutagénesis por revisión sobre una CDR, típicamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, o más posiciones de aminoácidos se alteran. De acuerdo con lo anterior, la presente invención abre nuevas posibilidades para el diseño de tipos muy diferentes de polipéptidos nuevos uy mejorados. El procedimiento se puede usar para mejorar una estructura o función existente de una proteína. Por ejemplo, se puede introducir un sitio de unión para un anticuerpo o fragmento de anticuerpo o afinidad para un antígeno preexistente, función efectora y/o estabilidad mejorada. Como alternativa, la introducción de aminoácidos de aminoácidos "catalíticamente importantes" adicionales en un dominio catalítico de una enzima se puede realizar dando como resultado una actividad modificada o potenciada hacia un sustrato. Como alternativa, las estructuras completamente enteras, las especificidades o actividades se pueden introducir en un polipéptido. La síntesis de novo de actividad enzimática se puede lograr también. Las nuevas estructuras se pueden edificar sobre la "estructura" natural o de consenso de una proteína existente mediante mutación de regiones solamente relevantes mediante el procedimiento de la invención. 7. Mutagénesis por revisión para preparar anticuerpos nuevos o mejorados El procedimiento de esta ¡nvención se usa específicamente para modificar moléculas de anticuerpos. Como se usa en esta memoria descriptiva, las moléculas de anticuerpos o anticuerpos de refiere a anticuerpos o porciones de los mismos, tales como anticuerpos de longitud completa, moléculas Fv, u otros fragmentos de anticuerpos, cadenas individuales o fragmentos de los mismos (por ejemplo, una sola cadena de Fv), anticuerpos de cadena individual, y anticuerpos quiméricos. Se pueden introducir alteraciones en la región variable y/o en la región marco conservada (constante) de un anticuerpo. La modificación de la región variable puede producir anticuerpos con mejores propiedades de unión de antígeno, y, si se desea, propiedades catalíticas. La modificación de la región marco conservada también puede conducir a la mejorar de las propiedades quicio - físicas, tales como solubilidad o estabilidad (por ejemplo, vida media), que son especialmente útiles, por ejemplo, en producción comercial, biodisponibilidad, función efectora (por ejemplo, activación de complementos y/o ADCC) y afinidad de unión (por ejemplo, especificidad) para el antígeno. Típicamente, al mutagénesis dirigirá la región Fv de al molécula de anticuerpo, es decir, la estructura responsable para la actividad de unión de antígeno que se compone de regiones variables de dos cadenas, una de la cadena pesada (VH) y una de la cadena ligera (VL). Una vez que las características de unión de antígeno se identifican, la (s) región (es) variable (s) se pueden modificar por ingeniaría genética en una clase de anticuerpo apropiada tal como igG, IgM, IgA, IgD, o IgE. 8. Mutagénesis por revisión para preparar/mejorar polipéptidos catalíticos/enzimáticos El procedimiento de la invención también es particularmente adecuada para el diseño de proteínas catalíticas, anticuerpos particularmente catalíticas. Actualmente, los anticuerpos catalíticos se pueden preparar mediante una adaptación de técnicas de fusión de células somáticas convencionales. En este procedimiento, un animal se inmuniza con un antígeno que parece el estado de transición del sustrato deseado para inducir la producción de un anticuerpo que une el estado de transición y cataliza la reacción. Las células que producen anticuerpos se recogen a partir del animal y se condensan con una célula de inmortalización para producir células híbridas. Después las células se seleccionan para la secreción de un anticuerpo que cataliza la reacción. Este procedimiento depende de la disponibilidad de análogos del estado de transición de un sustrato. El procedimiento puede estar limitado debido a tales análogos son probablemente que sean difíciles de identificar o sintetizar en la mayoría de los casos. El procedimiento de la invención proporciona un planteamiento diferente que elimina la necesidad de y análogo del estado de transición. Mediante el procedimiento de al ¡nvención, un anticuerpo se puede hacer catalítico mediante la introducción de aminoácidos adecuados en el sitio de unión de una inmunoglobulina (región Fv), El sitio de unión de antígeno (Fv) se compone de seis bucles hipervaraibles (CDR), tres derivadas de la cadena pesada de inmunoglobulina (H) y tres de la cadena ligera (L), que conecta cadenas beta con cada subunidad. Las restos de aminoácidos de los bucles CDR contribuyen casi enteramente a las características de cada anticuerpo monoclonal específico. Por ejemplo, las triadas catalíticas (constituidas por restos de aminoácidos serina, histidina, y ácido aspártico) modeladas después de serina proteasas se pueden crear en los regiones hipervariables de la región Fv de un anticuerpo con afinidad conocida para la molécula de sustrato y seleccionada para actividad proteolítica del sustrato. En particular, el procedimiento de la invención se puede usar para producir muchas enzimas diferentes o anticuerpos catalíticos, incluyendo óxidorreductasas, transferasas, hidrolasas, liasas, isomerasas y ligasas. Entre estas clases, de particular importante será la producción de proteasas, carbohidrasas, lipasas, dioxigenasas y peroxidasas mejoradas. Éstas y otras enzimas que se pueden preparar mediante el procedimiento de al ¡nvención tienen aplicaciones comerciales importantes para las conversiones enzimáticas en asistencia sanitaria, cosméticos, alimentos, elaboración de cerveza, detergentes, ambiente (por ejemplo, tratamiento de aguas residuales), agricultura, curtido, textiles, y otros procedimientos químicos. Estos incluyen, pero no se limitan a, aplicaciones diagnósticas y terapéuticas, conversiones de grasas, carbohidratos y proteína, degradación de contaminantes orgánicos y síntesis de agentes químicos. Por ejemplo, las proteasas terapéuticamente eficaces con actividad fibrinolítica, o actividad contra estructuras virales necesarias para ¡nfectividad, tal como proteínas de revestimiento viral, se pueden modificar por ingeniería genética. Tales proteasas pueden ser útiles agentes anti - trombolíticos o agentes anti - virales contra virus tales como, por ejemplo, VIH, rinovirus, influenza, o hepatitis. En el caso de oxigenasas (por ejemplo, dioxigenasas), una clase de enzimas que requieren un co - factor para oxidación de anillos aromáticos y otros dobles enlaces, aplicaciones industriales en procesos de formación de biopulpa, conversión de biomasas en combustibles u otros agentes químicos, conversión de contaminantes de aguas residuales, bioprocesamiento de carbón, y detoxificación de compuestos orgánicos peligrosos son posibles aplicaciones de proteínas novedosas. La presente ¡nvención se ¡lustra adicionalmente en los siguientes ejemplos, que no se deben considerar como limitantes.

Ejemplificación A lo largo de los ejemplos, se usaron los siguientes ejemplos y procedimientos salvo que se especifique otra cosa.

Materiales y procedimientos En general, la práctica de la invención emplea, salvo que se indique otra cosa, técnicas convencionales de química, biología molecular, tecnología de ADN recombinante, tecnología de PCR, inmunología (especialmente, por ejemplo, tecnología de anticuerpos), sistemas de expresión (por ejemplo, expresión sin células, representación de fagos, representación de ribosomas, y Profusión ™), y cualquier cultivo de células necesario que están dentro de la habilidad en la técnica y se explican en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Sambrook, Fritsch y Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989): DNA Cloning, Volúmenes 1 y 2, (D. N. Giover, Ed. 1985); Oligonucleotides Synthesis (M. J. Gait, Ed. 1984); PCR Handbook Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, . Beaucage, Ed. John Wiley y Sons (1999) (Editor); Oxford Handbook of Nucleic Acid Structure, Neidle, Ed., Oxford Univ. Press (1999); PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis y col., Academic Press (1990); PCR Essential Techniques: Essential Techniques, Burke, Ed., John Wiley y Sons Ltd (1996); The PCR Techníque: RT - PCR, Siebert, Ed, Eaton Pub. Co. (1998); Antibody Engineering Protocols (Methods in Molecular Biology), 510, Paul, S., Humana Pr (1996); Antibody Engineering: A Practical Approach (Practical Approach Series, 169), McCafferty, Ed., Irl Pr (1996); Antibodies; A Laboratory Manual, Harlow y col., C. S. H. L. Press, Pub. (1999): Current Protocols in Molecular Biology, eds, Ausubel y col., John Wiley y Sons (1992); Large - Scale Mammalian Cell Culture Technology, Lubieniecki, A., Ed., Marcel Dekker, Pub., (1990). Phage Display: A Laboratory Manual, C. Barbas (Ed.), CSHL Press, (2001); Antibody Phage Display, P. O'Brien (Ed.), Humana Press (2001); Border y col., Yeast surface display for screening combinatorial polypeptide libraries, Nature Biotechnology, 15 (6): 553 - 7 (1997; Border y col.; Yeast surface display for directed evolution of protein expression, affinity, and stability, Methods Enzymol., 328: 430 - 44 (2000); representación de ribosomas como describen Pluchthum y col., en la Patente de Estados Unidos N° 6,348,315, y Profusión ™ como describen Szostak y col., Patente de Estados Unidos Números 6,258,558; 6,261 ,804; y 6,214,553.

EJEMPLO 1 Mutaqénesis por revisión de las tres regiones definidas RN una molécula de unión de antígeno En este ejemplo, se describe a mutagénesis por revisión de tres CDR de un anticuerpo para mejorar la unión y proteolisis de un sustrato. En particular, se realiza la mutagénesis "por revisión" de tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) de un anticuerpo monoclonal. CDR1 , CDR2, y CDR3 de la región variable de la cadena pesada (VH) son regiones definidas seleccionadas para la mutagénesis por revisión, Para esta modalidad, los aminoácidos predeterminados seleccionados son los tres restos de la triada catalítica de las serina proteasas, Asp, His y Ser. Asp se selecciona para VH CDR1 , His se selecciona para VL CDR2, y Ser ase selecciona para VH CDR3. La selección de tres aminoácidos predeterminados permite el usóte un ensayo de proteasa conveniente con el fin de detectar cuando los tres restos están posicionados correctamente para mostrar una actividad funcional, es decir, proteolisis de un sustrato de ensayo. Un anticuerpo ejemplar, MCPC 603, se reconoce como un buen modelo para investigar la unión y catálisis debido a que la región de unión de anticuerpo se ha caracterizado bien. La secuencia de aminoácidos y la secuencia de ADN del MCPC 603 VH y regiones VL están públicamente disponibles (véase, por ejemplo, Rudikoff, S. y Potter, M., Biochemistry 13: 4033 (1974); Plukthun, A. y col., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., Vol. Lll: 105 - 112 (1987)). Las CDR para el anticuerpo MCPC 603 se han identificado como se muestra en la figura 2. En la cadena pesada, las posiciones 31 - 35 de los residuos de aminoácidos de los tramos CDR1 , las posiciones 50 - 69 de los tramos CDR2, y las posiciones 101 - 111 de los tramos CDR3. En la cadena ligera, los restos de aminoácidos de CDR1 son 24 - 40, los aminoácidos 55 - 62 de los tramos CDR2, y los aminoácidos 95 -103 de los tramos de CDR3.

El diseño de los oligonucleótidos para la mutagénesis por revisión en las CDR de MCPC 603 es tal que los análogos de polipéptidos resulta que tienen la secuencia de aminoácidos para CDR1 , CDR2, y CDR3 como se muestran en las figuras 3 - 5. Se entiende que los oligonucleótidos sintetizados pueden ser mayores que las regiones CDR a alterar para facilitar la inserción en la construcción diana como se muestra en la figura 7. Un formato de anticuerpo de cadena individual se elige por conveniencia en la expresión posterior y etapas de selección. Los oligonucleótidos se pueden convertir en cadenas de doble cadena mediante técnicas enzimáticas (véase, por ejemplo, Oliphant, A. R. y col., 1986, anteriormente) y después se ligan e un plásmido restringido como se muestra en la figura 8. Los sitios de restricción pueden ser sitios de origen natural o sitios de restricción modoificados por ingeniería genética. Los polinucleótidos que codifican los análogos de polipéptidos se pueden expresar en cualquiera de sistemas de expresión convenientes descritos en esta memoria descriptiva y seleccionarse usando el ensayo de la serina proteasa descrito, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos N° 5,798,208 (véase también las figuras 16 - 17). En resumen, los análogos de polipéptidos expresados se exponen a un sustrato de ensayo y examinarse para proteolisis del sustrato de ensayo. La cantidad de proteolisis, revelado por una zona de eliminación de! sustrato, indica un análogo de polipéptido que tiene la actividad funcional deseada.

EJEMPLO 2 Mutagénesis por revisión de seis regiones definidas en una molécula de unión a antígenos En este ejemplo, se describe la mutagénesis por revisión de los seis CDR de un anticuerpo para mejorar la unión y proteoilisis de un sustrato. En particular, se realiza una mutagénesis por "revisión" de las seis regiones hipervariable o regiones determinantes de complementariedad (CDR) del anticuerpo de modelo mencionado anteriormente (MCPC 603). En este ejemplo, la mutagénesis por "revisión" se lleva a cabo a partir de dos a tres veces con un aminoácido diferente en una región o dominio dada. Por ejemplo, Asp,, Ser e His están secuencialmente en el camino de espera de las cadenas pesadas y ligeras como se muestra en la figura 10. La mutagénesis de los residuos continuos dentro de una región puede ser deseable si se conoce, o si se puede deducir, que ciertos residuos en la región no participará en la función deseada. Además, el número de análogos se puede minimizar. Otras consideraciones en la selección del aminoácido predeterminado y las posiciones particulares a alterar son que los residuos pueden ser capaces de hidrogenar enlaces entre sí. Esta consideración puede imponer una restricción de proximidad sobre las variantes deseadas. De este modo, solamente ciertas posiciones dentro de las CDR pueden permitir que los aminoácidos de la triada catalítica interaccione de manera apropiada. De este modo, el modelo molecular u otra información estructural se puede usar para enriquecer variantes funcionales. En este caso, la información estructural conocida se usó para identificar restos en las regiones que pueden estar suficientemente cerca para permitir el enlace hidrógeno entre Asp, His y Ser, así como el intervalo de restos a mutagenizar. Roberts y col., han identificado regiones de estrecho contacto entre porciones de las CDR (Roberts, V. A. y col., Proc. Nati. Acad.

Sci. USA 87: 6654 - 6658 (1990)). Esta información junto con los datos de la estructura de rayos x de MCPC 603 se usa para seleccionar áreas prometedoras de estrecho contacto entre las CDR dirigidas para mutagénesis. Este tipo de mutagénesis por revisión guiada por información estructural/de modelo se puede denominar como mutagénesis "a través de guía". La mutagénesis por revisión se lleva a cabo como se ilustra en la figura 10 en la que cada CDR se somete a un aminoácido resultante predeterminado que produce los análogos de polipéptidos 8x10E5 y si se exploran los veinte aminoácidos, análogos de polipéptidos 5x10E13. Los polinucleótidos se pueden expresar si cualquiera de los sistemas de expresión convenientes descritos en esta memoria descriptiva y seleccionarse usando la serina proteasa descrita, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos N° 5,798,208. En resumen, los análogos de polipéptidos expresados se exponen a un sustrato de ensayo y se examinan para evaluar proteollsis del sustrato de ensayo. La cantidad de proteolisis, revelada mediante una zona de eliminación del sustrato, indica un análogo de polipéptido que tiene la actividad funcional deseada.

EJEMPLO 3 Mutagénesis por revisión de moléculas de unión a anti - tnf para mejorar la función En este ejemplo, se describe la mutagénesis por revisión de un anticuerpo anti - TNF para mejorar la unión. En particular, se realiza la mutagénesis por "revisión" de las seis regiones hipervariables o regiones determinantes de complementariedad (CDR) de dos anticuerpos anti - TNF. Los anticuerpos anti - TNF tienen aplicación general en el tratamiento de una enfermedad inmune en pacientes que tienen niveles inapropiados del ligando TNF (factor de necrosis tumoral). Existen dos anticuerpos anti - TNF disponibles comercialmente. Para conveniencia en la realización de mutagénesis por revisión y posterior selección, las regiones variables de cadena ligera y pesada (véase las SEQ ID números 2 - 4) de estos anticuerpos se convirtieron en nun formato de cadena individual usando un engarce poli Gly - Ser (véase la figura 15). Las regiones definidas seleccionadas por mutagénesis por revisión con una aminoácido predeterminado se identifican mediante la presencia de una barra negra como se muestra en al figura 15. Estas regiones definidas corresponden alas CDR de los anticuerpos de las cadenas individuales. Los polinucleótidos que representan las seis regiones CDR y regiones flanqueantes suficientes para permitir el ensamblaje de los polipéptidos en la secuencia de cadena individual completa mostrada en al figura 15 se sintetizan como se describe en esta memoria descriptiva. Los restos de aminoácidos predeterminados se seleccionan para cada región CDR y separadamente y secuencialmente introducidos en cada posición de aminoácidos a través de las seis regiones CDR. Los polinucleótidos se modifican por ingeniería genética adicionalmente para que sirvan como moldes capaces de soportar la transcripción de una transcripción de ARN correspondiente que se pueden después traducir en un polipéptido usando representación de ribosomas. Los polinucleótidos que codifican los análogos de polinucleótidos correspondientes se expresan usando una transcripción sin células y extractos de traducción. Las transcripciones de ARN están unidas covalentemente a un resto detectable tal como un resto fluorescente. Como alternativa, la secuencia de interés se puede condensar en marco a un resto fluorescente tal como una proteína fluorescente verde (GFP) para permitir la detección conveniente de expresión y normalización de aglutinantes frente a no aglutinantes. Preferiblemente, los polinucleótidos que codifican ios análogos de polipéptidos están al menos parcialmente ordenados, por ejemplo, expresados en un pocilio que tienen múltiples análogos de polipéptidos pero se pueden fácilmente des- replegar. De acuerdo con lo anterior, cada pocilio contiene un subconjunto de análogos de polipéptidos unidos ahora a la transcripción correspondiente unida a un resto fluorescente usando representación de ribosomas. El pocilio se sonda con ligando diana, es decir TNF y se ensaya para análogos de polipéptidos que se unen y con los que la afinidad de unión comparad al polipéptido de tipo salvaje. Los análogos de polipéptidos que se unen mejor que los polipéptidos de tipo salvaje se vuelven a modificar después por ingeniería genética en un formato de anticuerpo IgG de longitud completa para ensayo paralelo con los análogos de anticuerpos comerciales para unión mejorada usando técnicas convencionales.

EJEMPLO 4 Mutagénesis por revisión de anticuerpos contra el serotipo B de toxina nerviosa de botulinum (BoNT/B) y serotipo A de toxina nerviosa de botulinum (BoNT/A) para mejorar la función En este ejemplo, anticuerpos mejorados contra el serotipo Bb de toxina nerviosa de botulinum (BoNT/B) y serotipo a de toxina nerviosa de botulinum (BoNT/A) se generan usando mutagénesis por revisión (LTM) para mejorar la función. El planteamiento LTM se basa en la creación de mutaciones sencillas por CDR a través del bolsillo de unión, basándose en un subconjunto (el conjunto de LTM) de los 20 aminoácidos que exploran las características de tamaño, carga, hidrofobicidad y unión por hidrógeno. Los criterios para seleccionar los aminoácidos en el conjunto de LTM se describen más adelante. 1. Purificación de anticuerpos y secuenciación de genes y diseño de cadenas individuales (scFv) Los fragmentos de anticuerpos murinos (Fab) con afinidad de unión a BoNT/B se pueden obtener como se describe en Emaneul y co!., (1996) Journal of Immunological Methods 193: 189 - 197. Se pueden usar los anticuerpos BotFab 20 (SEQ ID números 12 y 13, polipéptidos de cadena ligera y pesada, respectivamente), el BotFab 20(SEQ ID Números 14 y 15, polipéptidos de cadena ligera y pesada, respectivamente). Las secuencias foráneas se describen en la patente de Estados Unidos N° 5,932,449, cuyo contenido se ¡ncorpora en esta memoria descriptiva como referencia. El antígeno BoNT/B (toxina de longitud completa, cadena ligera, y/o cadena pesada) se puede obtener a partir de Metabiologics, Inc., Wl. Los anticuerpos anti - BoNT/A descritos en Pless y col., (2001) Infecí. Immun. 69: 570 se pueden usar con el objetivo de mejorar sus afinidades mediante al menos un orden de magnitud. El antígeno de dominio de unión de cadena pesada BoNT/A (BoNT/A) se puede obtener a partir de Metabiologics, Une, Wl. Los fragmentos V y VH del (de los) anticuerpo (s) se clonan y se secuencias usando técnicas de biología molecular convencionales. Las regiones variable de las moléculas se amplifican mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y se unen con un engarce poli - Gly - Ser (típicamente SGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID N° 7)) para generar anticuerpos de cadena individual (csFv). Una etiqueta poli - His (HHHHHH (SEQ ID N° 8)) y una etiqueta myc (EQKLISEEDL (SEQ ID n° 9)) también se anexan al extremo C de los genes para facilitar la purificación y detección.

Estas moléculas se muestran en cualquiera de las tecnologías bien conocidas (por ejemplo, tecnologías basadas en levaduras, bacterias o fagos) y se ensayaron para evaluar su capacidad de unirse a BoNT/B o BoNT/A. La versión monovalente de scFv de anticuerpos completos proporcionan un buen formato para acometer estudios de mutagénesis y se conocen para reproducir generalmente el mecanismo de unión de la molécula completa, con la excepción de los efectos de avidez mostrados por moléculas multivalentes. 2. Mejora de anticuerpos usando mutagénesis por revisión (LTM) y diseño de genes Para la mutagénesis por revisión (LTM), se eligen los siguientes nueve aminoácidos y sus características funcionales representativas: Alanina y Leucina (alifáticos), Serina (grupo hidroxilo), Ácido aspártico (ácido) y Glutamina (amida), Lisina e Histidina (básicos), Tirosina (aromático), Prolina (hidrófobo). Estos aminoácidos muestran diversidad química adecuada en tamaño, carga, hidrofobicidad, y unión por hidrógeno para proporcionar información inicial significativa sobre la funcionalidad química necesaria para mejorar las propiedades de anticuerpo. Las elecciones también se basan en la frecuencia de aparición de sus aminoácidos en las CDR de los anticuerpos. Por ejemplo, dado entre tirosina y fenilamlanina para representar aminoácidos con cadenas secundarias aromáticas, el anterior se elige debido a su preponderancia significativamente más alta en las CDR de anticuerpos y su capacidad a enlace por hidrógeno. LTM se emplea inicialmente para identificar aminoácidos específicos y propiedades químicas que son beneficiosas para unión, neutralización y/o cualesquiera propiedades adicionales deseadas en el anticuerpo final. Sin embargo, LTM no se limita a estos nueve aminoácidos o nueve aminoácidos totales. El análisis de LTM se puede realizar con cualquier combinación de aminoácidos y el subconjunto de LTM puede ser tan alto como 18 aminoácidos (1 corto de mutagénesis por saturación). 2.1 Síntesis de oligonucleótidos de LTM En el análisis primario de LTM, el objetivo es explorar cada contribución de la cadena de aminoácidos a la afinidad de unión global dentro de cada CDR. Para generar eficazmente la diversidad significativa, cada uno de los aminoácidos del subconjunto de LTM se dirige en cada posición individual dentro de la secuencia de CDR con una sustitución solamente por CDR. De este modo, cada oligonucleótido individual codifica solamente una mutación de CDR individual. Por ejemplo, con el fin de realizar la mutagénesis de histidina de LTM sobre un dominio VH CDR3 de once aminoácidos hipotéticos, se sintetizan 11 oligonucleótidos que codifican 11 mutaciones posibles individuales (véase al figura 20). Tal análisis ensaya los efectos de tener una amida voluminosa en cada posición en la CDR. Por lo tanto para generar una librería de VH CDR3 LTM, solamente se sintetizan 99 oligonucleótidos para el análisis de LTM (9 aminoácidos de LTM x 11 posiciones de VH CDR3). Las secuencias de oligonucleótidos se ensayan para codones de parada accidentales, duplicación de tipo salvaje, uso de codón ineficaz, horquillas, bucles, y otras estructuras secundarias que usan software disponible públicamente. 2.2 Síntesis de oligonucleótidos degenerados para las combinaciones de mutaciones de LTM beneficiosas Al emplear el reemplazo de LTM sistemático de aminoácidos individuales dentro de un CDR, la preferencia de las funcionalidades químicas en cada posición está sin cubrir. Con el fin de combinar todas las mutaciones de las selecciones de LTM y explorar la posible aditividad y sinergia energética entre éstas, se sintetizan los oligonucleótidos degenerados que codifican estas mutaciones y la secuencia de tipo salvaje. La combinación degenerada de oligonucleótidos con 1.6 x 104 variantes se usa posteriormente para generar una segunda librería de generación que explora la naturaleza aditiva de estas sustituciones. 2.3 Diseño de oligonucleótidos asistido por ordenador, librería, v base de datos de los resultados. El software acoplado con sintetizadores de ADN de construcciones de costumbre automáticos permite la síntesis rápida de oligonucleótidos. La primera etapa implica la decisión de qué aminoácidos diana se incorporarán en las CDR. El software determina la preferencia de codón (por ejemplo, preferencia de codón de levadura, bacteriano, o de fago, dependiendo del sistema elegido) necesario para introducir los aminoácidos diana y también elimina cualquier duplicación de al secuencia de tipo salvaje que se puede generar mediante este procedimiento de diseño. Después se analiza para evaluar las estructuras de los codones de parada potenciales, horquillas, y otras bucles o para secuencias problemáticas que se corrigen posteriormente antes de la síntesis. El plan de diseño de LTM completo se envía después al sintetizador de ADN, que realiza una síntesis automática de los oligonucleótidos. De esta manera, los oligonucleótidos necesarios para crear las librerías se pueden generar rápidamente. Una base de datos electrónica puede almacenar información de todas las secuencias de oligonucleótidos de LTM, detalles de las sustituciones de las CDR de las librería de scFv, y resultados de los ensayos de unión para un antígeno diana. El archivo de los datos de los oligonucleótidos permite las iteraciones racionales de las estrategias del diseño, y reutilización de los oligonucleótidos de reactivos. 3. Estrategia de LTM global LTM se emplea ¡nicialmente para identificar aminoácidos específicos y propiedades químicas que son beneficiosas para propiedades de unión, neutralización y/o cualquier propiedad adicional deseada en el anticuerpo final. También rápidamente identifica las regiones que no toleran ninguna mutagénesis sin la pérdida significativa de afinidad (o cualquier propiedad física que se selecciona). Por lo tanto, no solamente es el análisis de LTM una buena metodología para explorar los requerimientos químicos en cada posición en todas las CDR de un anticuerpo, pero también determina rápidamente los aminoácidos absolutamente requeridos para la unión a anticuerpo. Después de la identificación de las mutaciones beneficiosas mediante LTM, los esquemas de mutagénesis combinatoria se pueden emplear para que en primer lugar incorporen todas estas mutaciones de aminoácidos distintas para generar CDR múltiplemente mutadas. Adicionalmente o como alternativa, la mutagénesis en espera (WTM) se puede usar para sondar los efectos de mutaciones múltiples del mismo aminoácido en una CDR (como se describe, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos números 5,830,650; 5,798,208). 4. Librerías LTM scFv Las técnicas de LTM descritas anteriormente se usan para crear combinaciones de oligonucleótidos con mutaciones en una CDR individual de la cadena ligera o pesada. Estos oligonucleótidos se sintetizan para que incluyan algunos de los marcos conservados circundantes para facilitar la superposición e hibridación durante PCR. Estas combinaciones de oligonucleótidos se utilizan para generar todas las posibles cadenas VL y VH en las que existen mutaciones en CDR individuales, dobles, y triples (combinaciones individuales, dobles, y triples de CDR1 , 2, y 3) usando PCR de extensión de superposición individual (SOE - PCR) (como se describe en Horton y col., (1989) Gene 77: 61 - 68). SOE - PCR es un procedimiento rápido y sencillo para combinar los fragmentos de ADN que no requieren sitios de restricción, endonucleasas de restricción, o ligasas de ADN. En dos regiones SOE - PCR en el gen se amplifican primero mediante PCR usando cebadores diseñados de manera que los productos de PCR compartan una secuencia complementaria en un extremo. Bajo estas condiciones de PCR, las secuencias complementarias se hibridizan, formando un solapamiento. Las secuencias complementarias actúan después como cebadores, permitiendo la extensión mediante la ADN polimerasa para producir una molécula recombinante. Por ejemplo, para crear la combinación de las cadenas VH en las que tanto CDR - H1 como CDR - H2 están mutadas y la CDR - H3 es de tipo salvaje, que se llama "110" (1 significa una CDR mutante y oO significa una CDR de tipo salvaje), los genes mutantes de CDR - H1 se usan como moldes y SOE - PCR se lleva a cabo para unir los oligonucleótidos de CDR - H2 para generar la combinación doblemente mutada (figura 21). Considerando que cada CDR puede ser o bien de tipo salvaje o mutante, existen siete posibles combinaciones (mostradas mediante flechas en al figura 21) para cada una de las combinaciones de las cadenas V y V (no incluyendo la molécula de tipo salvaje "000"). La combinación de las siete combinaciones V y VH crea 63 combinaciones VL - VH de tipo no salvaje (scFv), figura 21). Cada una de las 64 combinaciones VL y VH (incluyendo la secuencia de tipo salvaje) se denomina un "subconjunto" del conjunto de librería de LTM scFv entera. Un conjunto de la librería de scFv se crea para cada aminoácido seleccionado para sustitución. El número de secuencias de aminoácidos representadas dentro de cada librería subconjunto depende de la longitud de la CDR, la secuencia de aminoácidos dentro de la CDR, y la estrategia de diseño de oligonucleótidos de LTM.

. Selección de librerías de revisión y selección de anticuerpos mejorados Están disponibles una diversidad de procedimientos para la expresión y representación de anticuerpos. Éstos incluyen bacteriófago, Escherichia coli, y levadura. Aunque cada uno de estos procedimientos se ha usado para mejora de anticuerpos, el sistema de representación de levaduras produce varias ventajas (Poder y Wittrup (1997) Nat. Biotechnol. 15: 553 -557). La levadura se puede acomodar fácilmente tamaños de librerías de hasta 107, con 103 - 105 copias de cada anticuerpo mostrándose en cada superficie celular. Las células de levaduras se pueden seleccionar fácilmente y separarse usando citometría de flujo y separación de células activadas por fluorescencia (FACS) o perlas magnéticas. Las levaduras también producen rápida selección y re - crecimiento. El sistema de secreción eucariótica y rutas de glucosilación de levadura permiten un subconjunto mucho mayor de moléculas scFv para plegarse correctamente y mostrarse sobre la superficie celular que los sistemas de representación procarióticos. La representación de levaduras acoplada a la evolución directa se ha usado para incrementar la KD de un fragmento anticuerpo scFv para fluoresceína a 48 fM, dos órdenes de magnitud más fuerte de unión que cualquier ligando monovalente reseñado previamente (Border y col., (2000) PNAS 97: 10701 - 10705). El sistema de representación utiliza el receptor de adhesión de levaduras de aglutinina a para representar proteínas sobre la superficie celular. Las proteínas de interés, en el caso presente, librerías de anti - BoNT/B scFv LTM o librerías de anti - BoNT/A scFv LTM, se expresan como parejas de fusión con la proteína Aga2. Estas proteínas de fusión se seleccionan a partir de la célula y se llegan a unir por disulfuro a la proteína Aga1 , que se une a la pared de las células de levaduras (véase Invitrogen, bibliografía del producto de representación de levaduras pYD1). Además, existen marcas terminales carboxilo incluido que se pueden utilizar para controlar los niveles de expresión y/o normalizar mediciones de afinidad de unión. Las perlas magnéticas revestidas con estreptavidina (Spherotech) se usan para rastrear y seleccionar anticuerpos que se unen a BoNT/B o BoNT/A con alta afinidad. Esta metodología emplea unión de anticuerpos de alta afinidad a antígeno biotinilado que se une después a perlas revestidas con estreptavidina con el fin de seleccionar los clones de levaduras (Yeung y Wittrup (2002) Biotechnol. Prog 18: 212 - 220) y Feldhaus y col., (2003) Nature Biotech.1V. 163 - 170). El polipéptido BoNT/A o BoNT/A (Metabiologics) se biotinila usando protocolos convencionales (Pierce) y la selección se realiza usando procedimientos bien conocidos en al técnica.

Usando selección basada en equilibrio y cinética, los anticuerpos con afinidades mejoradas se seleccionan a partir de estas librerías. La eficacia de cada ronda de selección se controla mediante FACS analítica (FACScan). Además, las afinidades de unión relativa de las moléculas Individuales representadas sobre la superficie de levaduras se miden mediante valoración del antígeno. Esto permite una rápida identificación de moléculas con afinidad mejorada. Los clones de scFv se secuencian después para identificar mutaciones beneficiosas. 6. Generación de anticuerpos solubles para mediciones de afinidad BIAcore Los anticuerpos de interés de subclonan en sistemas de expresión solubles (Picchia pastoris y/o E. coli) y se genera proteína soluble. Existen vectores comercialmente disponibles y las líneas celulares para expresión de anticuerpos solubles, que incluyen los de Invitrogen (por ejemplo, pPlC9 para P. pastoris) y Novagen (pET20b para expresión periplásmica en E. coli). Estos sistemas se usan de manera rutinaria para generar anticuerpos de cadena individual o de longitud completa solubles. El sistema de expresión de P. pastoris (Invitrogen) produce de manera rutinaria 1 - 5 mg por litro de scFv purificado soluble. La purificación d proteínas está facilitada por la presencia de His - tag en el extremo C de la molécula, en el caso de cadenas individuales o mediante columnas de proteína A o proteína G para anticuerpos de longitud completa. Los anticuerpos de cadena individual o de longitud completa solubles se generan para obtener mediciones de velocidad cinética de afinidad BIAcore. Esta etapa es necesaria como moléculas de scFv de alta afinidad sobre la superficie celular de clones de levaduras se debe verificar como una molécula soluble sin células. Los anticuerpos solubles de cadena individual y de longitud completa generados de la manera anterior se puede usar para obtener mediciones de afinidad BIAcore, así como en el ensato de crecimiento hacia fuera de neuritas o el ensayo de letalidad de ratón descrito más adelante. 7. Selección de anticuerpos seleccionados para neutralización in vivo o in vitro Un ensayo basado en células que usa el crecimiento hacia fuera de neuritas de neuronas primaras de pollo como un indicador de intoxicación de BoNT y, de esta manera, como medio de cuantificar la neutralización de toxinas se puede usar para seleccionar los anticuerpos seleccionados. Los experimentos preliminares que usan cultivos de explantes de ganglios de la raíz dorsal de huevos de pollos fertilizados han indicado que existía menos crecimiento hacia fuera axonal de plantas tratadas con BoNT/A que los controles. Como alternativa, se puede usar un ensayo de articulación neuromuscular de músculo de gaglio - iris ciliar de pollo (como se describe en Lomneth y col., (1990) Neuroscience Letters 113: 211 - 216). El ensayo de letalidad de ratón (MLA, como describen, por ejemplo, Schantz y Kautter (1978) J. Assoc. Off. Anal. Chem. 61: 96 - 99) es otro procedimiento bien conocido y aceptado in vivo para ensayar la neutralización de BoNT. El ensayo implica la inyección interperitoneal de aproximadamente 0.5 ml de preparaciones de muestra de BoNT/B o BoNT/A con y sin el anticuerpo en 20 a 30 gramos, ratones blancos de la raza ICR. La mortandad debida a la Insuficiencia respiratoria de observa durante 1 - 4 días. La cuantificación de la neutralización requiere diluciones en serie de los MAbs con niveles variables de DL 5o de BoNT/B o BoNT/A de ratón. La MLA se poseed usar para determinar la capacidad de neutralización de Iso anticuerpos optimizados identificados en la selección in vitro. La capacidad de neutralización de anticuerpos también se puede medir in vitro mediante el ensayo de protección de ratón (MPA, Goeschel y col., (1997) Exp. Neurol. 147: 96 - 102). En la MPA el nervio frénico izquierdo, junto con el hemidiagramam izquierdo, se escinde del ratón. El nervio frénico se electroestimula continuamente en un baño de tejido. Los anticuerpos purificados se incuban con BoNT/B o BoNT/A y se añaden al baño de tejido. La parálisis inducida por toxina se define como un 50% de reducción en el temblor músculo inicial.

Equivalentes Los expertos en la técnica reconocerán, o serán capaces de averiguar usando nada más que experimentación rutinaria, muchos equivalentes a las modalidades específicas de la ¡nvención, descritas en esta memoria descriptiva. Tales equivalentes de pretende que están abarcadas por las siguientes reivindicaciones. Habiendo descrito la ¡nvención como antecede, se declara como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones.

Claims (61)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES 1.- Un procedimiento de generación de una librería de análogos de polipéptidos en los que un aminoácido predeterminado aparece en cada posición en una región definida del polipéptido que comprende: seleccionar una región definida de la secuencia de aminoácidos del polipéptido; determinar un resto aminoácido a sustituir en cada posición de aminoácido dentro de la región definida; sintetizar polinucleótidos individuales que codifican la región definida, representando los polinucleótidos colectivamente posibles polinucleótidos variantes de acuerdo con los siguientes criterios: i) contener cada polinucleótido en cada posición de codón en la región definida, o bien un codón requerido para el resto aminoácido del polipéptido o un codón para el resto aminoácido predeterminado, y ii) contener cada polinucleótido no más de un codón para el resto aminoácido predeterminado por lo tanto generando una librería de polinucleótidos en la que el resto aminoácido predeterminado aparece en cada posición aminoácido dentro de la región definida. 2.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque los polinucleótidos se combinan juntos. 3.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dos o más regiones definidas dentro del polipéptido se mutagenizan. 4.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizado además porque el mismo aminoácido predeterminado se selecciona para sustitución dentro de cada una de las dos o más regiones definidas. 5.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque diferentes aminoácidos predeterminados se seleccionan para sustitución dentro de cada una de las dos o más regiones definidas, respectivamente. 6.- El procedimiento de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque la región definida o regiones definidas comprende un dominio funcional del polipéptido. 7.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque el dominio funcional se selecciona entre el grupo constituido por un sitio de unión de anticuerpo, una región de marco conservada de anticuerpo, una región efectora de anticuerpo, un sitio de unión de receptor, y un sitio catalítico. 8.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque el sitio de unión de anticuerpo o porción del mismo comprende un dominio CDR seleccionado entre el grupo constituido por CDR1 , CDR2, CDR3, CDR4, CDR5, CDR6 y una combinación de las mismas. 9.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque la región marco conservada de anticuerpo comprende un dominio seleccionado entre el grupo constituido por FR1 , FR2, FR3, FR4 y una combinación de los mismos. 10.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque la región efectora de anticuerpo comprende un dominio seleccionado entre el grupo constituido por un sitio de unión de complemento y una región de unión Fc. 11- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el resto aminoácido predeterminado se selecciona entre el grupo constituido por Ser, Thr, Asn, Gln, Cys, His, Asp, Lys, Arg, Ala, Gly, lie, Leu, Met, Phe, Pro, Trp, y Val. 12.- El procedimiento de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque la región definida comprende al menos 3 a 40 aminoácidos. 13.- El procedimiento de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque los polinucleótidos se sintetizan como librería de expresión. 14.- El procedimiento de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque los polinucleótidos se sintetizan usando medios enzimáticos. 15.- El procedimiento de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque los polinucleótidos se sintetizan usando reacción en cadena de la polimerasa. 16.- El procedimiento de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque la librería de expresión se selecciona entre el grupo constituido por una librería de representación de fagos, una librería de representación de ribosomas/polisomas, una librería de representación de levaduras, una librería de representación de bacterias y una librería de representación ordenada. 17.- Una librería de análogos de polipéptidos mediante el procedimiento que se describe en la reivindicación 1. 18.- Un procedimiento de identificación de un polipéptido que tiene una estructura deseada o función que comprende: seleccionar una región definida de la secuencia de aminoácidos del polipéptido; determinar un resto aminoácido a sustituir en cada posición de aminoácido dentro de la región definida; sintetizar polinucleótidos individuales que codifican la región definida, representando los polinucleótidos colectivamente posibles polinucleótidos variantes de acuerdo con los siguientes criterios: i) contener cada polinucleótido en cada posición de codón en la región definida, o bien un codón requerido para el resto aminoácido del polipéptido o un codón para uno del resto aminoácido predeterminado, y ii) contener cada polinucleótido no más de un codón para el resto aminoácido predeterminado, por lo tanto generando una librería de polinucleótidos que contiene los polinucleótidos; expresar la librería de expresión para producir análogos de polipéptidos; y seleccionar los análogos de polipéptidos para seleccionar un polipéptido que tenga una estructura o función deseada. 19.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque el procedimiento comprende adicionalmente la etapa de identificar el polinucleótido que codifica el análogo de polipéptido seleccionado. 20.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque la selección comprende, poner en contacto un polipéptido con un sustrato diana, estando el polipéptido asociado al polinucieótido que codifica el polipéptido, comprendiendo el polinucleótido adicionalmente un resto detectable, de manera que se detecta un polipéptido variante capaz de unirse a un sustrato diana y por lo tanto se identifica como codificado por el polinucleótido. 21.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque el resto detectable se selecciona entre el grupo constituido por un resto fluorescente, un resto UV, y un resto que absorbe la luz visible. 22.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque el resto detectable se selecciona entre el grupo constituido por un resto de biotina, un resto GST, y un resto His tag. 23.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque el polinucleótido está asociado con el análogo de polipéptido usando representación de ribosoma. 24.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque dos o más regiones definidas dentro del polipéptido se mutagenizan. 25.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque el mismo aminoácido predeterminado se selecciona para sustitución dentro de cada una de las dos o más regiones definidas. 26.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque ios aminoácidos predeterminados diferentes se seleccionan para sustituciones dentro de cada una de las os o más regiones definidas. 27.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque el polipéptido es un anticuerpo de una sola cadena (sFVs) 28.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque la región definida comprende un dominio funcional del polipéptido. 29.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque la región definida comprende una CDR o poción de la misma seleccionada entre el grupo constituido por CDR1 , CDR2, CDR3, CDR4, CDR5, CDR6 y una combinación de las mismas. 30.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque la región definida es una región marco conservada de anticuerpo que comprende un dominio seleccionado entre el grupo constituido por FR1 , FR2, FR3, FR4 y una combinación de los mismos. 31.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque la región efectora de anticuerpo comprende un dominio seleccionado entre el grupo constituido por un sitio de unión de complemento y una región de unión Fc. 32.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque el resto aminoácido predeterminado se selecciona entre el grupo constituido por Ser, Thr, Asn, Gln, Cys, His, Asp, Lys, Arg, Ala, Gly, lie, Leu, Met, Phe, Pro, Trp, y Val. 33.- Una librería de polinucleótidos que codifica análogos de polipéptidos que comprende una o más regiones definidas en el que un resto aminoácido predeterminado está sustituido en cada posición aminoácido dentro de la región definida, representando los polinucleótidos colectivamente todas las posibles variantes de acuerdo con los siguientes criterios: i) cada polinucleótido contiene en cada posición de codón en la región definida, o bien un codón requerido para el resto aminoácido del polipéptido o un codón para uno del resto aminoácido predeterminado, y ii) cada polinucleótido contiene no más de un codón para el resto aminoácido predeterminado. 34.- La librería de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada además porque dos o más regiones definidas dentro del polipéptido están mutagenizadas. 35.- La librería de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada además porque el mismo aminoácido predeterminado se selecciona para sustitución dentro de cada una de las dos regiones definidas. 36.- La librería de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada además porque los aminoácidos predeterminados diferentes se seleccionan para sustitución dentro de cada una de las dos regiones definidas. 37.- La librería de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada además porque la librería es una librería de expresión. 38.- La librería de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada además porque la librería de expresión se selecciona entre el grupo constituido por una librería de representación de fagos, una librería de representación de ribosomas/polisomas, una librería de representación de levaduras, una librería de representación de bacterias y una librería de representación ordenada. 39.- La librería de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada además porque los polinucleótidos comprenden adicionalmente uno o más elementos reguladores transcripcionales. 40.- La librería de conformidad con la reivindicación 39, caracterizada además porque los polinucleótidos, cuando se transcriben y traducen in vitro, están asociados con los polipéptidos codificados por los polinucleótidos correspondientes. 41- La librería de conformidad con la reivindicación 40, caracterizada además porque los pollnucleótidos, están asociados con el polipéptido usando representación de ribosomas/polisomas. 42.- La librería de conformidad con la reivindicación 41 , caracterizada además porque los polinucleótidos comprenden ARN. 43.- La librería de conformidad con la reivindicación 42, caracterizada además porque los polinucleótidos comprenden adicionalmente un resto detectable. 44.- La librería de conformidad con la reivindicación 43, caracterizada además porque el resto detectable comprende un resto fluorescente. 45.- La librería de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada además porque la librería comprende al menos 106 polinucleótidos diferentes. 46.- La librería de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada además porque la librería comprende al menos 45 - 1012 polinucleótidos diferentes. 47.- La librería de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada además porque el polipéptido codifica un polipéptido de unión. 48.- La librería de conformidad con la reivindicación 47, caracterizada además porque el polipéptido de unión se selecciona entre el grupo constituido por una región variable de cadena pesada (VH), una región variable de cadena ligera (VL), y un anticuerpo de una sola cadena (sFv). 49.- La librería de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada además porque el polipéptido codifica una enzima. 50.- La librería de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada además porque el polipéptido codifica un inhibidor de enzima. 51- La librería de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada además porque el polipéptido codifica un polipéptido catalítico. 52.- La librería de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada además porque la librería está inmovilizada sobre un soporte sólido. 53.- La librería de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada además porque el soporte sólido es un microchip. 54.- La librería de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada además porque la librería es una librería ordenada. 55.- Un microchip que comprende una serie de polinucleótidos inmovilizados de acuerdo con la librería que se define en la reivindicación 33. 56.- Un análogo de polipéptido identificado de acuerdo con la librería que se define en la reivindicación 33, en el que el polipéptido se une a una molécula diana y comprende una región de unión seleccionada entre el grupo constituido por una región variable de cadena pesada (VH), una región variable de cadena ligera (VL), y un anticuerpo de una sola cadena (sFv). 57.- El análogo de polipéptido de conformidad con la reivindicación 56, caracterizado además porque la molécula diana especificada es TNFa. 58.- El análogo de polipéptido de conformidad con la reivindicación 56, caracterizado además porque el polipéptido tiene al menos un 70% de identidad con la decencia de aminoácidos de la SEQ ID N° 1 , 2, 3, 4, 5 ó 6. 59.- Un procedimiento de generación de un subconjunto de análogos de polipéptidos que tienen una estructura o función deseada que comprende: seleccionar una región definida de la secuencia de aminoácidos del polipéptido; determinar un resto aminoácido a sustituir en cada posición de aminoácido dentro de la región definida; sintetizar polinucleótidos individuales que codifican la región definida, representando los polinucleótidos colectivamente posibles polinucleótidos variantes de acuerdo con los siguientes criterios: i) contener cada polinucleótido en cada posición de codón en la región definida, o bien un codón requerido para la síntesis del resto aminoácido del polipéptido o un codón para el resto aminoácido predeterminado, y ¡i) contener cada polinucleótido no más de un codón para el resto aminoácido predeterminado por lo tanto generando una librería de expresión que contiene los polinucleótido; exponer la librería de expresión a condiciones bajo las que la librería se expresa; seleccionar la librería expresada para identificar un polipéptido que tiene una estructura o función deseada; comparar la estructura o función del polipéptido cuando se compara con un criterio de control, en el que un polipéptido que corresponde o excede el criterio de control se clasifica como un efector y un polipéptido que incumple el criterio de control se clasifica como un no efector; categorizar los efectores y no efectores en una base de datos; y consultar la base de datos para determinar la secuencia de un subconjunto de polipéptidos a sintetizar. 60.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado además porque una o más de las etapas anteriores está computarizada. 61- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado además porque el criterio de control se selecciona entre el grupo constituido por afinidad de unión, estabilidad y función efectora. 62.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado además porque el criterio es actividad catalítica sobre un sustrato especificado. 63.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado además porque el polipéptido se selecciona entre el grupo constituido por una región variable de cadena pesada (VH), una región variable de cadena ligera (V ), y un anticuerpo de una sola cadena (sFv). 64.- Un medio adecuado para uso en un dispositivo electrónico que tiene instrucciones para llevar a cabo una o más etapas del procedimiento que se describe en la reivindicación 59.