MXPA05013188A

MXPA05013188A - Composiciones y metodos para regular polisacaridos de una celula vegetal.

Info

Publication number: MXPA05013188A
Application number: MXPA05013188A
Authority: MX
Inventors: Leonard N Bloksberg; Marie B Connett; Sarah Jane Emerson; Michael J Frost; Richard Llewellyn Sydn Forster; Steven Troy Lund; Andreas Magusin; Ilkka Havukkala; Murray Robert Grigor; Colleen M Higgins; Robert J Kodrzycki
Original assignee: Arborgen Llc
Priority date: 2003-06-06
Filing date: 2004-06-07
Publication date: 2007-01-30
Also published as: WO2005001051A2; JP2011036257A; AU2004252481B2; US20100186118A1; WO2005001051A3; EP1639081A2; BRPI0411028A; ZA200600002B; US8110726B2; AU2004252481A1; AU2011201695A1; CN1871352A; EP1639081A4; NZ544386A; JP2006526990A; CA2528544A1; US20070261137A1; CL2004001428A1; AU2011201695B2; IL172389A0

Abstract

Se proporcionan genes de la sintesis de polisacaridos de plantas novedosos y polipeptidos codificados por estos genes. Estos genes y secuencias polisacaridas son utiles para regular la sintesis de polisacaridos y el fenotipo de planta. Aun mas, estos genes son utiles para el perfilamiento de expresion de genes de la sintesis de polisacaridos.

Description

COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA REGULAR POLISACARIDOS DE UNA CÉLULA VEGETAL REFERENCIA CRUZADA CON SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reivindica el beneficio como se dispone en el titulo 35 del código de los EE.UU. sección 119 (e) de la solicitud de los EE.UU. No. 60/476,239, presentada el 6 de junio del 2003, que se incorpora a esta descripción como referencia en su totalidad.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona, en términos generales, con el campo de genes de la síntesis de polisacáridos vegetales y polipéptidos codificados por estos genes, y con el uso de este tipo de secuencias polinucleótidas y polipeptídicas para controlar el fenotipo de planta. La invención específicamente proporciona secuencias polinucleótidas y polipeptídicas de ciclo celular aisladas de Eucalyptus y Pinus y de secuencias relacionadas con estos elementos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las células vegetales están compuestas, principalmente, por celulosa, pectina y hemicelulosa . La celulosa está compuesta por microfibrillas cristalinas de ß-1, 4-glucano, que son extremadamente fuertes y resistentes a la degradación enzimática y mecánica. El contenido celulósico tiene un efecto profundo sobre las propiedades estructurales de las fibras vegetales y de los productos de madera, también aporta a los productos alimenticios para el consumo humano y animal una cantidad nutricional, digestibilidad y buen sabor. Además, la celulosa es el mayor componente estructural de las fibras vegetales industrialmente importantes como, por ejemplo, algodón, lino, cáñamo, yute y especies forestales como, por ejemplo, Eucalyptus ssp. y Pinus ssp. La celulosa también se emplea comúnmente en diversas aplicaciones industriales . Algunas cápsulas para medicamentos digeribles o de plásticos biodegradables, así como algunos agentes de carga medicínales y aditivos fibrosos para alimentos se pueden elaborar a partir de polisacáridos vegetales. Aún más, ciertos plásticos como, por ejemplo, acetato de celulosa y textiles sintéticos como, por ejemplo, el rayón, se derivan de la celulosa. Los polisacáridos tienen un profundo impacto en la calidad de los alimentos. Las paredes celulares contribuyen a encrespar las zanahorias, mientras que se requiere de la degradación de las paredes celulares para suavizar frutas como, por ejemplo, duraznos y tomates. En el maíz para alimento para ganado se desea incrementar el contenido de amilosa, más no en el maíz para consumo humano, y la resistencia incrementada de la pared celular reduce la digestibilidad. En los cultivos de fibra como, por ejemplo, madera industrial y de construcción, la celulosa es el polímero principal de interés. La densidad de la madera, una medida fundamental de la calidad estructural de la madera industrial y de construcción, es esencialmente una medida del contenido celulósico. En la industria del despulpado del papel, la eficiencia se mide en términos de producción de celulosa y, en consecuencia, resulta deseable un elevado contenido celulósico. La capacidad de alterar la expresión de los genes de la síntesis de polisacáridos es extremadamente poderosa, debido a que la síntesis de polisacáridos afecta el fenotipo de planta así como los índices de crecimiento. El control de la síntesis de polisacáridos tiene aplicaciones para, inter alia, la alteración de las propiedades de la madera y, en particular, en las propiedades de la madera y de la madera elaborada. Por ejemplo, las mejoras en la pulpa de madera que se puede efectuar al alterar la expresión de los genes de la síntesis de polisacáridos incluyen incrementar y disminuir el contenido celulósico y de lignina. Al manipular la síntesis de polisacáridos en un vegetal, también se puede diseñar mejor madera elaborada que tenga una superior estabilidad dimensional, mejor resistencia a la tensión, superior resistencia al esfuerzo cortante, superior resistencia a la compresión, superior madera de reacción, superior rigidez, superior o inferior dureza, una menor distorsión espiral de tejidos en puntos circulares, menor encogimiento y características deseables con respecto al peso, densidad y gravedad específica.

A. Genes y proteínas de polisacáridos La síntesis de celulosa se cataliza, en parte, por la celulosa sintasa. Las celulosas sintasas son miembros de la gran familia de las ß-glucosiltransferasas procesivas invertidas. Los genes de las celulosas sintasas { Ces , Cellulose Synthase) codifican las celulosas sintasas y son responsables, en parte, de regular la biosíntesis de la celulosa. La CesA, es una celulosa sintasa, pertenece a la superfamilia de la celulosa sintasa, que se caracteriza por cuatro dominios conservados, U1-U4. Cada uno de los dominios U1-U3 tienen un aspartato conservado así como un dominio de dedo de zinc N' . El dominio U4 posee un sitio de unión al substrato putativo, Q-x-x-R-W. Saxena et al . , J Bacteriol . 177 : 1419 (1995). Las proteínas CesA se predicen que son una proteína de ocho dominios transmembrana que tiene aproximadamente 1,100 aminoácidos. Las proteínas CesA funcionan como parte de un gran complejo enlazado con la membrana que polimeriza la glucosa activada en un polímero de celulosa. El substrato para la Ces en plantas superiores es UDP-Glucosa (UDPG) y más, si no toda la evidencia soporta la hipótesis de que los genes de la celulosa sintasa codifican una glucosiltransferasa que es integral a la trayectoria biosintética de la celulosa { Véase; Holland et al . , Plant Physiol . , 123 : 1313 (2000) ) . El análisis In silico identifica las proteínas similares a la celulosa sintasa ( Csl , cellulosa synthase-like) , una gran familia de proteínas en plantas consideradas ß-glucosiltransferasas procesivas de polisacáridos. Véase, por ejemplo, Goubet et al . , Plant Physiol . 131 : 547 (1993) . Las proteínas similares a la celulosa sintasa poseen los dominios conservados U1-U4, como las celulosas sintasas, pero carecen del dominio de dedo de zinc N' . Doblin et al . , Plant Cell Physiol . 43 : 1407 (2002) . Se considera que las enzimas similares a la celulosa sintasa controlan la producción de los polisacáridos de plantas no celulósicas.

B. Análisis de microensayo y perfila iento de expresión en la síntesis de polisacáridos El control multigénico de la síntesis de polisacáridos presenta dificultades en la determinación de los genes responsables de la determinación fenotípica. Un obstáculo importante en la identificación de genes y de las diferencias en la expresión genética que contribuyen a fenotipar las plantas, es la dificultad con la que la expresión de más de un puñado de genes se podrían estudiar al mismo tiempo. Otra dificultad en la identificación y entendimiento de la expresión genética y en la interrelación de los genes que contribuyen a fenotipar plantas, es el alto grado de sensibilidad a los factores ambientales que demuestran las plantan. Recientemente se han hecho adelantos haciendo uso del perfilamiento de expresión del genoma completo. En particular, el uso de microarreglos de ADN ha sido útil para examinar la expresión de un gran número de genes en un solo experimento. Varios estudios de genes vegetales sensibles al estímulo ambiental y evolutivo se han conducido utilizando el perfilamiento de expresión. Por ejemplo, se empleó el análisis de microarreglo para estudiar la expresión genética durante la maduración del fruto en fresas, Aharoni et al., Plant Physiol . 129: 1019-1031 (2002) , durante la respuesta a herida en Arabodopsis, Cheong et al . , Plant Physiol . 129: 661-7 (2002), durante la respuesta patógena en Arabodopsis, Schen et al . , Proc. Nat 'l Acad.

Sci . 97: 11655-60 (2000), y durante la respuesta auxina en soja, Thibaud-Nissen et al, Plant Physiol . 132:118.

Whetten et al . , Plant Mol . Biol . 47: 275-91 (2001) describe el perfilamiento de expresión de los genes biosintéticos de pared celular en Pinus taeda L . utilizando sondas de ADN. Whetten et al . examinó genes que se expresaron diferencialmente entre el xilema de diferenciación juvenil y el xilema de diferenciación secundario maduro. Además, para determinar el efecto de ciertos estímulos ambientales sobre la expresión genética, se comparó la expresión genética en madera comprimida con madera normal. 156 de los 2,300 elementos examinados mostraron una expresión diferencial. Whetten, supra, at 285. La comparación de madera joven con madera madura mostró 188 elementos diferencialmente expresados. Id. at 286. Aunque el perfilamiento de expresión y, en particular, los microarreglos de ADN brindan una conveniente herramienta para el análisis de la expresión del genoma completo, su uso se ha limitado a organismos para los cuales la secuencia del genoma completo o la gran recolección de ADNc está disponible. Véase Hertzberg et al., Proc . Nat 'l Acad. Sci . 98: 14732-7 (2001a), Hertzberg et al., Plant J. ; 25:585 (2001b). Por ejemplo, Whetten, Supra, establece, "Un análisis más completo de este asunto interesante que espera la finalización de un grupo mayor de la marca de la secuencia espresada EST (expressed Sequence tag) Pino como de álamo'S Whetten et al. at 286. Aún más, los microarreglos que comprenden sondas ETS y de ADNc no son capaces de distinguir genes de la misma familia debido a las similitudes entre los genes en la secuencia. Es decir, los ADNc o ETS, cuando se emplean como sondas de microarreglo, se pueden unir a más de un gen de la misma familia . Los métodos para la manipulación de la expresión genética para producir una planta con un fenotipo más deseable serían más fáciles al contar con una mayor compresión de la expresión del gen sintético de polisacárido en varios tipos de tejido vegetal, en distintas etapas del desarrollo de la planta, y con la estimulación de distintos indicios ambientales. La capacidad de controlar la arquitectura de la planta y atributos importantes, desde el punto de vista agronómico, se mejoraría contando con una mejor comprensión de cómo la expresión de los genes de la síntesis de polisacáridos afecta la formación de los tejidos de plantas y de cómo el crecimiento de la planta y la síntesis de polisacáridos están conectados. Entre el gran número de genes, cuya expresión se puede cambiar durante el desarrollo de una planta, es probable que únicamente una fracción efectúe cambios fenotípicos durante alguna etapa determinada del desarrollo de la planta.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN En consecuencia, existe la necesidad de herramientas y métodos útiles en la determinación de qué cambios en la expresión de los genes de la síntesis de polisacáridos producen fenotipos deseables. También existe la necesidad de polisacáridos útiles en estos métodos. Además existe la necesidad de métodos que pueden correlacionar cambios en la expresión de los genes de la síntesis de polisacáridos hacia un fenotipo. También existe la necesidad de métodos para la identificación de genes de la síntesis de polisacáridos y productos genéticos que tengan impacto en el fenotipo de la planta, y que se puedan manipular para obtener un fenotipo deseado. En un aspecto, la presente invención proporciona polipéptidos aislados que comprenden una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo formado por SEQ ID NOs: 1-29 y variantes conservativas de la misma. En otro aspecto, la presente invención proporciona una célula vegetal transformada con un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo formado por SEQ ID NOs: 1-29 y variantes conservativas de la misma. En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una planta transgénica que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo formado por SEQ ID NOs : 1-29 y variantes conservativas de la misma. En otro aspecto, la presente invención proporciona un constructo de ADN que comprende por lo menos un polinucleótido que tiene la secuencia de cualquiera de SEQ ID NOs: 1-29 y variantes conservativas de la misma. En un aspecto, la presente invención proporciona un método para elaborar una planta transformada, el método comprende transformar una célula vegetal con un constructo de ADN, cultivar la célula vegetal transformada bajo condiciones que fomenten el crecimiento de la planta. En otro aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende una secuencia que codifica el dominio catalítico o que se une al substrato de un polipéptido seleccionado de cualquiera de SEQ ID NOs: 30-58, en donde el polinucleótido codifica un polipéptido que tiene la actividad de este polipéptido seleccionado de cualquiera de SEQ ID NOs: 30-58. En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para la elaboración de una planta transformada, el método comprende transformar una célula vegetal con un constructo de ADN que comprende por lo menos un polinucleótido que tiene la secuencia de cualquier de SEQ ID NOs: 1-29, y cultivar la planta transformada bajo condiciones que fomenten el crecimiento de la planta.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona madera obtenida de un árbol transgénico que se ha transformado con el constructo de ADN de la presente invención. En un aspecto adicional, la presente invención proporciona pulpa de madera obtenida de un árbol transgénico que se ha transformado con el constructo de ADN de la presente invención. En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para la elaboración de madera, el método comprende trasformar una planta con un constructo de ADN que comprende un polinucleótido que tiene una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo formado por SEQ ID NOs: 1-29 y variantes conservativas de la misma; cultivar la planta transformada bajo condiciones que fomente el crecimiento de la planta; y obtener madera a partir de la planta. La invención también proporciona un método para la elaboración de pulpa de madera, el método comprende trasformar una planta con un constructo de ADN que comprende un polinucleótido que tiene una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo formado por SEQ ID NOs: 1-29 y variantes conservativas de la misma; cultivar la planta transformada bajo condiciones que fomente el crecimiento de la planta; y obtener pulpa de madera a partir de la planta. Otro aspecto de la presente invención proporciona un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por el polinucleótido aislado de la presente invención. En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por SEQ ID NOs: 30-58. En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para alterar un fenotipo de planta de una planta, el método comprende alterar la expresión en la planta de un polipéptido codificado por cualquiera de SEQ ID NOs: 1-29. En un aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo formado por SEQ ID NOs: 59-83. En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para correlacionar la expresión genética en dos distintas muestras, el método comprende detectar en una primera muestra el nivel de expresión de uno o más genes que codifican un producto codificado por una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo formado por SEQ ID NOs: 1-29 y variantes conservativas de la misma en una primera muestra, detectar en una segunda muestra el nivel de expresión de uno o más genes, comparar el nivel de expresión de uno o más genes en la primera muestra con el nivel de expresión de uno o más genes en la segunda muestra, y correlacionar una diferencia en el nivel de expresión de uno o más genes entre la primera y segunda muestras . En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para la correlación de la posesión de un fenotipo de planta con el nivel de expresión genética en la planta de uno o más genes, el método comprende detectar el nivel de expresión de uno o más genes que codifican un producto codificado por una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo formado por SEQ ID NOs: 1-29 y variantes conservativas de la misma en una primera planta que posee un fenotipo, detectar el nivel de expresión de uno o más genes en una segunda planta que carece el fenotipo, comparar el nivel de expresión de uno o más genes en la primera planta con el nivel de expresión de uno o más genes en la segunda planta y correlacionar una diferencia de uno o más genes entre la primera y segunda plantas con la posesión del fenotipo. En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para la correlación de la expresión genética con la tendencia a formar madera de reacción, el método comprende detectar el nivel de expresión de uno o más genes que codifican un producto codificado por una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo formado por SEQ ID NOs: 1-29 y variantes conservativas de la misma en una primera célula vegetal en xilema que muestra un fenotipo de madera normal, detectar el nivel de expresión de uno o más genes en una segunda célula vegetal en xilema que muestra un fenotipo de madera de reacción, comparar el nivel de expresión de uno o más genes en las primeras células vegetales con el nivel de expresión de uno o más genes en las segundas células vegetales y correlacionar una diferencia en el nivel de expresión de uno o más genes entre la primera y segunda muestras con la tendencia a formar una madera de reacción. En un aspecto, la presente invención proporciona una combinación para detectar la expresión de uno o más genes, el método comprende dos o más oligonucléotidos, en donde cada oligonucléotido es capaz de hibridarse con una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo formado por SEQ ID NOs: 1-29. En otro aspecto, la presente invención proporciona una combinación para detectar la expresión de uno o más genes, el método comprende dos o más oligonucléotidos, en donde el oligonucléotido es capaz de hibridarse con un producto genético codificado por una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo formado por SEQ ID NOs: 1-29. En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un microarreglo que comprende la combinación de la presente invención sobre un soporte sólido, en donde cada uno de los dos o más oligonucléotidos ocupa un sitio único en el soporte sólido. En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para detectar uno o más genes en una muestra, el método comprende poner en contacto la muestra con dos o más oligonucléotidos, en donde cada oligonucléotido es capaz de hibridarse con un gen que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo formado por SEQ ID NOs: 1-29 bajo condiciones estándares de hibridación y detectar uno o más genes de interés que se hibridizan hacia uno o más oligonucléotidos. En un aspecto, la presente invención proporciona un método para detectar una o más secuencias de ácido nucleico codificadas por uno o más genes en una muestra, el método comprende poner en contacto la muestra con dos o más oligonucléotidos, en donde cada oligonucléotido es capaz de hibridarse con una secuencia de ácido nucleico codificada por un gen que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo formado por SEQ ID NOs: 1-29 bajo condiciones estándares de hibridación, y detectar una o más secuencias de ácido nucleico que se hibridizan hacia uno o más oligonucléotidos . En un aspecto, la presente invención proporciona un equipo para detectar la expresión genética, el equipo comprende un microarreglo junto con uno o más amortiguadores o reactivos para una reacción de hibridación nucleótida. Otras características, objetivos y ventajas de la presente invención son evidentes a partir de la siguiente descripción detallada. Sin embargo, se debe comprender que la descripción detallada, si bien indica las modalidades preferidas de la invención, se brinda únicamente a manera de ejemplo, y no como una limitación. A partir de la descripción detallada, serán evidentes para aquellos experimentados en la técnica varios cambios y modificaciones que están dentro del espíritu y alcance de la invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Q FIGURAS Figura 1. Secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: . Se subraya el dominio conservado de la celulosa sintasa. Figura 2. Secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31. Se subraya el dominio conservado de la celulosa sintasa.

Figura 3. Secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32. Se subraya el dominio conservado de la celulosa sintasa . Figura 4. Secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33. Se subraya el dominio conservado de glucosiltransferasa familia 2. Figura 5. Secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34. Se subraya el dominio conservado de glucosiltransferasa familia 2. Figura 6. Secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: . Se subraya el dominio conservado de celulosa sintasa. Figura 7. Secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36. Se subraya el dominio conservado de celulosa sintasa. Figura 8. Secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 37. Se subraya el dominio conservado de glucosiltransferasa familia 2. Figura 9. Secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 38. Se subraya el dominio conservado nucleótida-difosfo-sucrosa transferasa. Figura 10. Secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 39. Se subraya el dominio conservado de celulosa sintasa. Figura 11. Secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 40. Se subraya el dominio conservado de celulosa sintasa. Figura 12. Secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 41. Se subraya el dominio conservado de celulosa sintasa.

Figura 13. Secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 42. Se subraya el dominio conservado de celulosa sintasa. Figura 14. Secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43. Se subraya el dominio conservado de glucosiltransferasa familia 2. Figura 15. Secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 44. Se subraya el dominio conservado de celulosa sintasa. Figura 16. Secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45. Se subraya el dominio conservado de celulosa sintasa. Figura 17. Secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46. Se subraya el dominio conservado de glucósido transferasa familia 2. Figura 18. Secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47. Se subraya el dominio conservado de glucosiltransferasa familia 2. Figura 19. Secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 48. Se subraya el dominio conservado de celulosa sintasa. Figura 20. Secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 49. Se subraya el dominio conservado de celulosa sintasa. Figura 21. Secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50. Se subraya el dominio conservado de celulosa sintasa. Figura 22. Secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 51. Se subraya el dominio conservado de celulosa sintasa. Figura 23. Secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 52. Se subraya el dominio conservado de celulosa sintasa.

Figura 24. Secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 53. Se subraya el dominio conservado de celulosa sintasa. Figura 25. Secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 54. Se subraya el dominio conservado de glucosiltransferasa familia 2. Figura 26. Secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 55. Se subraya el dominio conservado de celulosa sintasa. Figura 27. Secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 56. Se subraya el dominio conservado de glucosiltransferasa familia 2. Figura 28. Secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 57. Se subraya el dominio conservado de celulosa sintasa. Figura 29. Secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 58. Se subraya el dominio conservado de glucosiltransferasa familia 2. Figura 30. Mapa de vectores de pWVR 8. Figura 31. Mapa de vectores pART27. Figura 32. Parámetros de muestreo de microarreglo ilustrativo .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS Los inventores han descubierto genes polinucleótidos y genes de la síntesis de polisacáridos aislados útiles para alterar las propiedades fenotípicas de plantas. Los inventores también han descubierto métodos para identificar los factores multigénicos que contribuyen con un fenotipo y métodos para manipular la expresión genética para afectar un fenotipo de planta. Estos genes, que se derivan de plantas de género forestales comercialmente importantes, pino y eucalipto, están involucrados en la síntesis de polisacáridos de plantas y son, al menos en parte, responsables de la expresión de características fenotípicas importantes en madera comercial como, por ejemplo, rigidez, fuerza, densidad, dimensiones de las fibras, aspereza, contenido celulósico y de lignina, y del contenido de extractivos . Hablando en términos generales, los genes y polinucleótidos, los genes y polinucleótidos codifican una proteína que puede ser una celulosa sintasa, una proteína similar a la celulosa sintasa, una glucosiltransferasa o un polipéptido que tenga la misma función y la invención además incluye este tipo de proteínas y polipéptidos. Los métodos de la presente invención para la selección de secuencias de genes de la síntesis de polisacáridos para conducir la manipulación, permitirán un mejor diseño y control de plantas transgénicas con más fenotipos altamente diseñados. Con la información obtenida a partir de los métodos se mejorará la capacidad de controlar la arquitectura de la planta y de atributos importantes, desde el punto de vista agronómico, en especies forestales comercialmente importantes. A menos que se indique algo distinto, todos los términos técnicos y científicos se emplean en esta descripción de la misma manera como se hace en la técnica. En términos generales, la nomenclatura de esta descripción y de los procedimientos de laboratorio descritos, incluyendo el cultivo celular, genética molecular y la química e hibridación del ácido nucleico, respectivamente, son bien conocidos en la técnica y son de uso común. Se emplean técnicas estándares para los métodos del ácido nucleico recombinante, síntesis del oligonucléotidos, cultivo celular, cultivo de tejidos, transformación, transfección, traducción, química analítica, química sintética orgánica, síntesis químicas, análisis químicos y para la formulación y suministro farmacéuticos. En términos generales, las reacciones enzimáticas y los pasos de purificación y/o aislamiento se realizan de acuerdo con las especificaciones del fabricante. En caso de encontrarse una contradicción en las indicaciones, las técnicas y procedimientos en cuestión se realizarán de acuerdo con la metodología convencional descrita, por ejemplo, en Sambrook et al . , MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL, 2d ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) , y en los protocolos actuales en Molecular Biology, John Wiley & Sons, 1989) . Los métodos científicos específicos relevantes para la presente invención se discuten con mayor detalle más adelante. Sin embargo, esta discusión se proporciona únicamente a manera de ejemplo y no limita la manera en la cual los métodos de la presente invención se pueden llevar a cabo.

A. Genes y proteínas de la síntesis de polisacáridos de planta 1. Genes , secuencias polinucleótidas y polipeptidicas de la síntesis de polisacáridos Un aspecto de la presente invención se relaciona con novedosos genes de la síntesis de polisacáridos y con polipéptidos codificados por estos genes. La presente invención proporciona novedosos genes y polinucleótidos de la síntesis de polisacáridos y novedosas proteínas y polipéptidos de la síntesis de polisacáridos . De acuerdo con una modalidad de la presente invención, los novedosos genes de la síntesis de polisacáridos son los mismos que se expresan en una planta tipo silvestre de una especie de Pínus o Eucalyptus . Las novedosas secuencias de genes de la síntesis de polisacáridos ilustrativas de la presente invención se describen en la Tabla 1, que comprende las secuencias Pinus radiata, y la Tabla 2, que comprende las secuencias Eucalyptus grandis . Los productos genéticos correspondientes, es decir, los oligonucléotidos y polipéptidos, también se listan en la Tabla 3, Tabla 4 y en la Tabla 5. Las secuencias de la presente invención tienen actividad de síntesis de polisacáridos y codifican proteínas que son activas en la síntesis de polisacáridos como, por ejemplo, las proteínas de la celulosa sintasa y las familias similares a la celulosa sintasa discutidas en lo anterior. Tal como se discute más adelante con mayor detalle, la manipulación de la expresión de los genes y polinucleótidos de la síntesis de polisacáridos o la manipulación de la actividad de proteínas y polipéptidos codificados, puede producir una planta transgénica con un fenotipo deseado que difiere del fenotipo de una planta de tipo silvestre de la misma especie. A través de la toda la descripción, se hace referencia a los productos de los genes de la síntesis de polisacáridos. Como emplea en esta descripción, el término un "producto genético de la síntesis de polisacáridos" es un producto codificado por un gen de la síntesis de polisacáridos e incluye productos de nucleótidos como, por ejemplo, ARN, así como productos de aminoácidos como, por ejemplo, proteínas y polipéptidos. Los ejemplos de genes de la síntesis de polisacáridos específicos incluyen SEQ ID NOs: 1-29. Los ejemplos de productos de los genes de la síntesis de polisacáridos de la presente invención incluyen productos codificados por cualquier de SEQ ID NOs: 1-29. También se hace referencia en esta descripción a las proteínas de la síntesis de polisacáridos y a los polipéptidos de la síntesis de polisacáridos. Los ejemplos de proteínas y polipéptidos de la síntesis de polisacáridos específicos de la presente invención incluyen polipéptidos codificados por cualquier de SEQ ID NOs: 1-29 o polipéptidos que comprenden la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NOs: 30-58. Un aspecto de la presente invención se dirige a un subconjunto de estos genes de la síntesis de polisacáridos y de estos productos de los genes de la síntesis de polisacáridos, principalmente, SEQ ID NO: 1-2, 7-14, 16-18, 20-21, 24-25 y 27-30, sus respectivas variantes conservativas (tal término se define más adelante) , y los productos de polinucleótidos y aminoácidos codificados por estos subconjutos. La presente invención también incluye secuencias que son complementos, secuencias inversas o complementos inversos a las secuencias de nucleótidos descritas en este documento. La presente invención también incluye variantes conservativas de las secuencias descritas en este documento. El término "variante", como se emplea en esta descripción, se refiere a una secuencia de nucleótidos o aminoácidos que difiere en uno o más bases de nucleótidos o residuos de aminoácidos de la secuencia de referencia de la cual es una variante. En consecuencia, en un aspecto, la presente invención incluye polinucleótidos variantes conservativos. Como se emplea en esta descripción, el término "polinucleótido variante conservativo" se refiere a un polinucleótido que se hibridiza, bajo condiciones severas, a una sonda de oligonucléotido que, bajo condiciones comparables, se une al gen de referencia, la variante conservativa es una variante del mismo. En consecuencia, por ejemplo, una variante conservativa de SEQ ID NO: 1 se hibridiza, bajo condiciones severas, a una sonda de oligonucléotido que, bajo condiciones comparables, se une al SEQ ID NO: 1. Por ejemplo, las secuencias se consideran que se hibridizan cuando forman un complejo de dos hebras en una solución de hibridación de 6X de SSC, 0.5% de SDS, 5X de la solución de Denhardty y 100 µg del ADN portador no específico. Véase Ausubel et al . , sección 2.9, suplemento 27 (1994) . El término "severidad moderada" se define como una temperatura de 60 °C en una solución de hibridación de 6X de SSC, 0.5% de SDS, 5X de la solución de Denhardt y 100 µg del ADN portador no específico. Id. Las condiciones de hibridación de "severidad moderada" son, por ejemplo, 68 °C en una solución de hibridación de 6X de SSC, 0.5% de SDS, 5X de la solución de Denhardty y lOOµg del ADN portador no específico. Id. Enseguida de la reacción de hibridación en condiciones de severidad moderada, los nucleótidos se lavan cinco veces en una solución de 2X de SSC más 0.05% de SDS a la temperatura ambiente, con lavados posteriores con 0. IX de SSC más 0.1% de SDS a 60 °C durante 1 hora. Un aspecto de la presente invención proporciona polinucleótidos variantes conservativos que exhiben una identidad de secuencia de por lo menos aproximadamente el 75% con sus secuencias de referencia respectivas. La "identidad de secuencia" tiene un significado reconocido en la técnica y se puede calcular haciendo uso de las técnicas publicadas. Véase COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY, Lesk, ed. (Oxford University Press, 1988) , BIOCOMPUTING: INFORMATICS AND GENOME PROJECTS, Smith, ed. (Academic Press, 1993) , COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA, PART I, Griffin & Griffin, eds . , (Humana Press, 1994) , SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY, Von Heinje ed. , Academic Press (1987) , SEQUENCE ANALYSIS PRIMER, Gribskov & Devereux, eds . (Macmillan Stockton Press, 1991) , Gish et al . , J. MoL Biol . 215 : 403 (1990) ; Gish and States, Nature Genet . 3 : 266 (1993) ; Madden et al . , Meth . Enzymol . 266: 131 (1996) ; Al tschul et al . , Nucleic Acids Res . 25 : 3389 (1997) ; and Zhang and Madden, Genome Res . 7: 649-656 (1997) , y Carillo and Lípton, SIAM J. Applied Math . 48 : 1073 (1988) . Los métodos, que por lo común se emplean para determinar la identidad o similitud entre dos secuencias incluyen, pero sin limitarse a, las que se describen en GUIDE To HUGE COMPUTERS , Bishop, ed. , (Academic Press, 1994) y Carillo & Lipton, supra . Los métodos para determinar la identidad o similitud se codifican en programas de computadora. Los métodos por programas de computadora preferidos para determinar la identidad o similitud entre dos secuencias incluye, entre otros, al paquete de programa GCG (Devereux et al . , Nucleic Acids Research 12 : 387 (1984) ) , BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul et al . , J. MoL Biol . 215 : 403 (1990) ) , y FASTDB (Brutlag et al . , Comp . App. Biosci . 6:237 (1990) ) . La presente invención incluye polinucleótidos variantes conservativos que tiene una identidad de secuencia que es superior o igual al 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83"S, 82-s, 81-s, 80-s, 79-s, 78-s, 77-s, 76-s, 75-e, 74-s, 73-s, 72-s, 71%, 70%, 69%, 68%, 67%, 66%, 65%, 64%, 63%, 62%, 61% o 60% con cualquiera de SEQ ID NOs: 1-29. Es estas variantes, se pueden presentar diferencias entre la variante y la secuencia de referencia en las posiciones 5' o 3' terminal de la secuencia de referencia de nucleótidos o en cualquier otro sitio entre estas posiciones terminales, intercaladas ya sea individualmente entre los nucleótidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. Los polinucleótidos variantes conservativos adicionales contemplados por la presente invención y abarcados por la misma incluyen polinucleótidos que comprenden secuencias que difieren de las secuencias de polinucleótidos de SEQ ID NOs: 1-29 o complementos, complementos inversos o secuencias inversas de los mismos, como resultado de las deleciones y/o inserciones totalizan menos del 30% de la longitud completa de la secuencia. En una modalidad, las deleciones y/o inserciones totalizan menos del 20% o 10% de la longitud completa de la secuencia. La presente invención también incluye polinucleótidos variantes conservativos que, además de compartir un elevado grado de similitud en su estructura primaria (secuencia) con la SEQ ID Nos tienen por lo menos una de las siguientes características: (i) contienen un marco de lectura abierto o un marco de lectura abierto parcial que codifica un polipéptido que tiene prácticamente las mismas propiedades funcionales en la síntesis de polisacáridos que tiene el polipéptido codificado por el polinucleótidos de referencia, o (ii) tienen dominios de nucleótidos o dominios de proteínas codificados en común. La presente invención incluye variantes conservativas de SEQ ID NOs: 1-29 que codifican proteínas que tienen la actividad enzimática o biológica o propiedades de unión de la proteína codificada por el polinucleótido de referencia. Estas variantes conservativas son variantes funcionales, y tienen la actividad enzimática o enlazante de la proteína codificada por el polinucleótidos de referencia. De acuerdo con la presente invención, las variantes de polinucleótidos pueden incluir un "gen que ha cambiado de sitio" como, por ejemplo, los que se describen en las patentes de los EE.UU. Nos: 6,500,639, 6,500,617, 6,436,675, 6,379,964, 6,352,859, 6,335, 198, 6,326,204 y 6,287,862. Una variante de la secuencia de nucleótidos de 1 la presente invención también puede ser un polinucleótido modificado de la manera que se describe en la patente de los EE.UU. No. 6,132, 970, que se incorpora a esta descripción como referencia. De acuerdo con una modalidad, la presente invención proporciona un polinucleótido que codifica una proteína de la síntesis de polisacáridos como, por ejemplo, la celulosa sintasa y una proteína similar a la celulosa sintasa. La SEQ ID NOs: 1-29 proporciona ejemplos de estos polinucleótidos . De acuerdo con otra modalidad, un polinucleótido de la presente invención codifica el dominio de unión de proteína o catalítico de un polipéptido codificado por cualquiera de SEQ ID NOs: 1-29 o de un polipéptido que comprende cualquiera de SEQ ID NOs: 30-58. En la técnica se conocen los dominios de unión de proteína o catalíticos de las proteínas de la síntesis de polisacáridos de la presente invención. Las secuencias conservadas de estas proteínas se muestran en las Figuras 1 a 29, como un texto subrayado. La presente invención también abarca polinucleótidos variantes conservativos que difieren de las secuencias discutidas en lo anterior pero que, como consecuencia de la degeneración del código genético, codifican un polipéptido que es el mismo al codificado por un polinucleótido de la presente invención. La presente invención también incluye polinucleótidos variantes conservativos que comprenden secuencias que difieren de la secuencia de polinucleótidos discutida en lo anterior, como resultado de las substituciones que no afectan la secuencia de aminoácidos de la secuencia del polipéptidos codificado o que produce substituciones conservativas en la secuencia del polipéptido codificado. La presente invención también incluye un polipéptido aislado codificado por un polinucleótido que comprende cualquiera de SEQ ID NOs: 1-29 o cualquiera de las variantes conservativas de la misma discutidas en lo anterior. La presente invención también incluye polipéptidos que comprende SEQ ID NOs: 30-58 y variantes conservativas de estos polipéptidos. De acuerdo con la presente invención, un polipéptido o proteína variante se refiere a una secuencia de aminoácidos que se altera con la adición, deleción o substitución de uno o más aminoácidos . La presente invención incluye polipéptidos variantes conservativos. Como se emplea en esta descripción, el término "polipéptido variante conservativo" se refiere a un polipéptido que tiene propiedades estructurales, químicas o biológicas similares a la proteína de cual es una variante conservativa. Las directrices en la determinación de cuales residuos de aminoácidos se pueden substituir, insertar o eliminar, se pueden encontrar utilizando programas de computadora bien conocidos en la técnica como, por ejemplo, el software Vector NTI Suite (InforMax, MD) . En una modalidad de la presente invención, los polipéptidos variantes conservativos que exhiben una identidad de secuencia de por lo menos el 75% con sus secuencias de referencia respectivas . La proteína variante conservativa incluye una "isoforma" o un "análogo" del polipéptido. Las isoformas y análogos del polipéptido se refieren a proteínas que tienen las mismas propiedades físicas y fisiológicas y la misma función biológica, cuyas secuencias de aminoácidos difieren por uno o más aminoácidos o cuya secuencia incluye un aminoácido no natural . Los polipéptidos que comprenden secuencias que difieren de las secuencias del polipéptido de SEQ ID NOs: 30-58 como resultado de las substituciones, inserciones o deleciones de aminoácido que totalizan menos de 10% de la longitud completa de la secuencia se contemplan y abarcan por la presente invención. Un aspecto de la presente invención proporciona polipéptidos variantes conservativos que tienen una función en la síntesis de polisacáridos, determinada por uno o más ensayos apropiados como, por ejemplo, los que se describen más adelante. La presente invención incluye polipéptidos variantes que son celulosa sintasa o proteínas similares a la celulosa sintasa como, por ejemplo, aquellas capaces de convertir una glucosa activa en un polímero de celulosa y aquellos genes que codifican un péptido que tenga la actividad biológica de la glucosiltransferasa. Tal como se ha discutido en lo anterior, la presente invención incluye polinucleótidos variantes que codifican polipéptidos que funcionan como proteínas de la síntesis de polisacáridos. Las actividades y propiedades físicas de las proteínas de la síntesis de polisacáridos se pueden examinar utilizando cualquier método conocido en la técnica. Los siguientes ejemplos de métodos de ensayo no son exhaustivos y se incluyen para proporcionar algunas directrices sobre la examinación de la actividad y distinción de las características de la proteína de las variantes de la proteína de la síntesis de polisacáridos. La actividad de la celulosa sintasa se puede evaluar tal como se describe en, por ejemplo, Blanton et al, Planta 180: 324 (1990) y Blanton, Development 119: 703 (1993) . La actividad de la glucosiltransferasa se puede examinar tal como se describe en, por ejemplo, Stults et al . , Anal . Biochem . 174 : 151 (1988), Stults et al . , Arch . Biochem . Biophys . 280: 20-26. (1990), Stults and Macher, Arch . Biochem . Biophys . 303: 125 (1993), 4) Crawley et al . , Anal . Biochem . 185: 112 (1990), y en Yan et al . , Anal . Biochem . 223: 111 (1994). 2. Métodos de empleo de los genes, secuencias polinucleótidas y polipeptidicas de la síntesis de polisacáridos La presente invención proporciona métodos de empleo de los genes de la síntesis de polisacáridos y de las variantes conservativas de la misma. La presente invención incluye métodos y constructos para alterar la expresión de la celulosa sintasa y genes similares a la celulosa sintasa y/o productos genéticos para los propósitos que incluyen, pero sin limitarse a (i) investigar su función durante la síntesis de polisacáridos y el efecto final sobre el fenotipo de planta y (ii) para efectuar un cambio en el fenotipo de planta. Por ejemplo, la presente invención incluye métodos y herramientas para modificar la calidad de la madera, desarrollo de fibras, contenido de polisacáridos en la pared celular, maduración de la fruta y el crecimiento de la planta, y para producir una alteración en la expresión de uno o más genes de la síntesis de polisacáridos. La presente invención comprende métodos para alterar la expresión de cualquiera de los genes de la síntesis de polisacáridos y de las variantes discutidas en lo anterior. Por consiguiente, por ejemplo, la presente invención comprende alterar la expresión de un gen de la síntesis de polisacáridos presente en el genoma de una planta de tipo silvestre de una especie de Eucalyptus o Pinus . En una modalidad, el gen de la síntesis de polisacáridos comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de las secuencias SEQ ID NOs: 1-29 o las variantes conservativas de la misma, tal como se discute en lo anterior.

Las técnicas que se pueden emplear de acuerdo con la presente invención para alterar la expresión genética incluye, pero sin limitarse a: (i) sobreexpresar un producto genético, (ii) interrumpir el transcripto del gen como, por ejemplo, interrumpir el transcripto ARNm del gen; (iii) interrumpir la función de un polipéptido codificado por un gen, o (iv) interrumpir el gen mismo. La sobreexpresión de un producto genético, el uso de ARN antisentido, ribozimas y el uso de interferencia por ARN de doble hebra (iARNdh) son técnicas valiosas para descubrir los efectos funcionales de un gen y para generar plantas con un fenotipo que sea distinto al de una planta de tipo silvestre de la misma especie. La sobreexpresión de un gen diana a menudo se realiza al clonar el gen o el ADNc en un vector de expresión y al introducir el vector en las células receptora. O bien, la sobreexpresión se puede llevar a cabo al introducir promotores exógenos en células para conducir la expresión de los genes que residen en el genoma. El efecto de la sobreexpresión de un gen determinado sobre la función celular, propiedades bioquímicas y/o fisiológicas después se puede evaluar al comparar las plantas transformadas para sobreexpresar el gen en plantas que no hayan sido transformadas para sobreexpresar el gen.

Las tecnologías de ARN antisentido, ribozima y de iARNdh por lo habitual se dirigen a transcriptos de ARN de genes, usualmente ARNm. La tecnología de ARN antisentido implica expresar en, o introducir en, una célula una molécula de ARN (o un derivado de ARN) que sea complementario a, o antisentido a, secuencias encontradas en un ARNm particular en una célula. Al asociarse con el ARNm, el ARN antisentido puede inhibir la traducción del producto genético codificado. El uso de tecnología antisentido para reducir o inhibir la expresión de genes de plantas específicas se ha descrito en, por ejemplo, la publicación de patente europea No. 271988, Smith et al . , Nature, 334: 724-726 (1988); Smith et. al . , Plant Mol . Biol . , 14: 369-379 (1990)). Una ribozima es un ARN que tiene tanto un dominio catalítico como una secuencia que es complementaria a un ARNm particular. La ribozima funciona al asociarse con el ARNm (a través del dominio complementario de la ribozima) y después al escisionar (degradar) el mensaje utilizando el dominio catalítico. La interferencia por ARN (iARN) implica un proceso regulatorio de silenciamiento génico postranscripcional (PTGS, post-transcriptional gene silencing) , en el que el nivel del estado de lectura de un ARNm específico se reduce con la degradación específica de la secuencia del ARNm transcrito, por lo habitual completamente procesado, sin una alteración en el índice de transcripción de novo del gen diana mismo. La técnica de iARN se discute en, por ejemplo, Elibashir, et al., Methods Enzymol. 26: 199 (2002); McManus & Sharp, Nature Rev. Genetics 3: 737 (2002); la solicitud PCT WO 01/75164; Martínez et al., Cell 110: 563 (2002); Elbashir et al., supra; Lagos- Quintana et al., Curr. Biol. 12: 735 (2002); Tuschl et al., Nature Biotechnol. 20: 446 (2002); Tuschl, Chembiochem. 2: 239 (2001); Harborth et al., J. Cell Sci. 114: 4557 (2001); et al., EMBO J. 20: 6877 (2001); Lagos-Quintana et al., Science. 294: 8538 (2001); Hutvagner et al., loe cit, 834; Elbashir et al., Nature. 411: 494 (2001) . La presente, invención proporciona un constructo de ADN que comprende por lo menos un polinucleótido de SEQ ID NOs: 1-29 o variantes conservativas de la misma discutidas en lo anterior. Se puede utilizar cualquier método conocido en la técnica para generar los constructos de ADN de la presente invención. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., supra. La presente invención incluye constructos de ADN que opcionalmente comprenden un promotor. Se puede emplear cualquier promotor adecuado conocido en la técnica. Un promotor es un ácido nucleico, de preferencia ADN, que se une a ARN plimerasa y/u otros elementos regulatorios de la transcripción. Como con cualquier promotor, los promotores de la presente invención facilitan o controlan la transcripción del ADN o ARN para generar una molécula de ARNm a partir de una molécula de ácido nucleico que está unida de manera operable al promotor. El ARN puede codificar una proteína o un polipéptido o puede codificar una molécula de ARN antisentido o una molécula útil en la iARN. Los promotores útiles en la presente invención incluyen promotores constitutivos, promotores inducibles, promotores temporalmente regulados y promotores preferidos por los tejidos. Los ejemplos de promotores constitutivos de plantas incluyen: el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) , que confiere una expresión constitutiva de alto nivel en la mayoría de los tejidos de plantas (Odel et al . Nature 313: 810 (1985)); el promotor de la nopalina sintasa (An et al . Plant Physio . 88: 547 (1988)); y el promotor de la octopina sintasa (Fro m et al . , Plant Cell 1: 977 (1989)). Se debe observar que, aunque el promotor 35S del CaMV por lo común se denomina como un promotor constitutivo, se pueden observar alguna preferencia por los tejidos. La presente invención contempla el uso del promotor 35S del CaMV, independientemente de cualquier preferencia hacia los tejidos que se pudiera exhibir durante su uso en la presente invención. Los promotores inducibles regulan le expresión genética en respuesta a señales ambientales, hormonales o químicas. Los ejemplos de promotores inducibles por hormonas incluyen promotores inducibles por la auxina (Baumann et al . Plant Cell 11: 323-334 (1999)), promotores inducibles por la citoquinina (Guevara-García, Plant Mol . Biol . 38: 743-753 (1998)), y promotores inducibles por giberelina (Shi et al . Plant Mol . Biol . 38: 1053-1060 (1998)) . Adicionalmente, en los constructos de ADN y en los métodos de la presente invención se pueden utilizar promotores sensibles al calor, luz, lesiones, a la resistencia patógena y a compuestos químicos como, por ejemplo, jasmonato de metilo o ácido salicílico. Los promotores preferidos por los tejidos permiten la expresión preferida de los polinucleótidos de la presente invención en ciertos tejidos de planta. Los promotores preferidos por los tejidos también son útiles para dirigir la expresión del ARN antisentido o del ARNip en ciertos tejidos vegetales, que puede ser útil para inhibir o completamente bloquear la expresión de los genes diana, tal como se discutió en lo anterior. Como se emplea en esta descripción, el término tejido vascular de planta se refiere al xilema, floema o tejido cámbium vascular. Otros tejidos preferidos incluyen meristemo apical, la raíz, semilla y la flor. En un aspecto, los promotores preferidos por los tejidos de la presente invención son, ya sea, "preferidos por el xilema", "preferidos por el cámbium" o "preferidos por el floema", y de preferencia dirigen la expresión de una secuencia de ácido nucleico enlazada operablemente en el xilema, cámbium o floema, respectivamente. En otro aspecto, los constructos de ADN de la presente invención comprenden promotores que son de tejido específico para el xilema, cámbium o floema, en donde los promotores únicamente son activos en el xilema, cámbium o floema. Un promotor vascular preferido de preferencia es activo en cualquiera de los tejidos xilema, cámbium o floema o en por lo menos dos de los tres tipos de tejidos. Un promotor vascular específico es específicamente activo en cualquiera de los tejidos xilema, cámbium o floema, o en por lo menos dos de los tres. En otras palabras, los promotores son sólo activos en el tejido xilema, cámbium o floema de plantas. Sin embargo, adviértase que debido al transporte soluto en plantas, un producto que específica o preferentemente se expresa en un tejido se puede encontrar en otro sitio en la planta, después de que haya ocurrido la expresión. Además, los promotores de genes de la síntesis de polisacáridos particulares se pueden expresar únicamente dentro del cámbium en vasculatura secundaria en desarrollo. Dentro del cámbium, se pueden expresar promotores de los genes de la síntesis de polisacáridos particulares exclusivamente en el tronco o en la raíz. Aún más, los promotores de la síntesis de polisacáridos se pueden expresar sólo en la primavera (para la formación temprana de la madera) o sólo en el verano. Un promotor se puede enlazar de manera operable con el polinucleótido. Como se emplea es este contexto, enlazado de manera operable se refiere a enlazar un polinucleótido que codifica un gen estructural con un promotor, de modo que el promotor controle la transcripción del gen estructural. Si el polinucleótido deseado comprende una secuencia que codifica un producto de proteína, la región codificante se puede enlazar de manera operable con elementos regulatorios, por ejemplo un promotor y un ter inador, que causan la expresión de un transcripto de ARN mensajero asociado y/o un producto de proteína codificado por el polinucleótido deseado. En este caso, el polinucleótido se enlaza de manera operable en la orientación 5'- a 3' con una secuencia promotora y, opcionalmente, con una secuencia terminadora. Alternativamente, la presente invención proporciona constructos de ADN que comprenden un polinucleótido en una orientación "antisentido", cuya transcripción produce ácidos nucleicos que pueden formar estructuras secundarias que afectan la expresión de un gen endógeno de la síntesis de polisacáridos en la célula vegetal. En otra variación, el constructo de ADN puede comprender un polinucleótido que produzca un producto de ARN de doble hebra con la transcripción que inicia la interferencia por ARN de un gen de la síntesis de polisacáridos con el cual el polinucleótido está asociado. El polinucleótido de la presente invención se puede colocar dentro de un ADN-t, de modo que las secuencias de borde izquierda y derecha del ADN-t flanquean o están sobre ambos lados del polinucleótido. Se debe comprender que la presente invención incluye constructos de ADN que comprenden uno o más de cualquiera de los polinucleótidos discutidos en lo anterior. En consecuencia, un constructo puede comprender, por ejemplo, un ADN-t que comprenden uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más polinucleótidos . La presente invención también incluye constructos de ADN que comprenden un promotor que incluye uno o más elementos regulatorios. O bien, la polipéptido incluye constructos de ADN que comprenden un elemento regulatorio que está separado del promotor. Los elementos regulatorios confieren una gama de características importantes sobre una región del promotor. Algunos elementos se unen a factores de transcripción que intensifican el índice de transcripción del ácido nucleico enlazado de manera operable. Otros elementos se unen a represores que inhiben la actividad de la transcripción. El efecto de los factores de transcripción sobre la actividad del promotor puede determinar si la actividad del promotor es elevada o baja, es decir, si el promotor es "fuerte" o "débil". Un constructo de ADN de la presente invención puede incluir una secuencia de nucleótidos que sirva como un marcador genético útil en la identificación y selección de células vegetales o plantas transformadas. Los ejemplos de este tipo de marcadores incluyen, pero sin limitarse, el gen de la neomicina fosfotransferasa (nptll) (Potrykus et al . , Mol . Gen . Genet . 199: 183-188 (1985)), que confiere resistencia a la kanamicina. Las células que expresan el gen nptll se pueden seleccionar utilizando un antibiótico apropiado como, por ejemplo, la kanamicina o el antibiótico G418. Otros marcadores genéticos que por lo común se emplean incluyen un gen mutante EPSP sintetasa (Hinchee et ai., Bio/ Technology 6:915-922 (1988)), que confiere resistencia al glifosato; y un gen mutante de acetolactato sintasa (ALS, Acetolactate Synthase) , que confiere resistencia a la imidazolinona o sulfonilurea (solicitud de patente europea No. 154,204).

La presente invención también incluye vectores que comprenden los constructos de ADN anteriormente discutidos . Los vectores pueden incluir un origen de replicación (replicones) para una célula hospedera particular. Varios replicones procarióticos son conocidos por aquellos experimentados en la técnica y funcionan para dirigir la replicación autónoma y mantener una molécula recombinante en una célula hospedera procariótica. Por ejemplo, el vector pMON530 es un vector de transformación de una planta basado en la Agrobacterium que se emplea en la transformación de plantas dicotiledóneas, es un vector plásmido (Rogers et al . " Improved vectors for plant trans format ion : expression cassette vectors and new selectable markers . , "in METHODS IN ENZYMOLOGY. Ed. R . Wu and L . Grossman . p253-277. San Diego : Academic Press) . Otro plásmido útil es pMON530, un derivado de pMON505, preparado al transferir el fragmento Stul-Hindlll de 2.3 kb de pMON316 al pMON526. El plásmido pMON526 es un derivado simple de pMON505 en el cual el sitio Smal se retira mediante la digestión con X al, tratamiento con Klenow polimerasa y ligación. El plásmido pMON530 retiene todas las propiedades del pMON505 y del cásete de expresión CaMV35S-NOS, pero contiene un sitio de escisión único para Smal entre el promotor y la señal de poliadenilación. El pMON505 de vector binario es un derivado de pMON200 (Rogers et al . , supra,) en el cual la región de homología con el plásmido Ti, LIH, está reemplazada con un segmento del plásmido mini RK2 de Hindlil a Smal de 3. 8 kb, pTJS75 (Schmidhauser and Helinski . (1985) J. Bacteriol . 164-155) . Este segmento contiene el origen RK2 de replicación, oriV, y el origen de transferencia, oriT, para su conjugación en la Agrobacterium utilizando un procedimiento de apareamiento triparental. Horsch and Klee . , Proc . Nati . Acad. Sci . U. S . A. , 83:4428 (1986). El plásmidos pMON505 retiene todas las características importantes de pMON200 incluyendo el multiligador sintético para la inserción de fragmentos de ADN deseado, el gen quimérico NOS/NPTII ' /NOS para la resistencia a la kanamicina en células vegetales, la determinante de la resistencia a la espectinomicina/estreptomicina para la selección en E . coli y A. tumefaciens, un gen intacto de la opalina sintasa para el registro complaciente de los transformantes y la herencia en la descendencia, y un origen pBR322 de la replicación para facilitar la elaboración de grandes cantidades del vector en E. coli . El plásmido pMON505 contiene un solo borde del AND-t derivado del extremo derecho del ADN-t tipo pTiT37 nopalina . Los análisis de transferencia por absorción Southern demuestran que el plásmido pMON505 y cualquier ADN que el mismo porte están integrados en el genoma de la planta, es decir, el plásmido completo es el ADN-t que se inserta en el genoma de la planta. Un extremo del ADN integrado se ubica entre la secuencia de borde derecho y el gen de opalina sintasa y el otro extremo está entre la secuencia de borde y las secuencias pBR322. Un cásete del vector a partir plásmido Ti particularmente útil es pMON17227. Este vector se describe en el documento WO 92/04449 y contiene un gen que codifica una enzima que confiere resistencia a la glifosato (denominada CP4), que es un excelente gen marcador de selección para muchas plantas, entre las que se incluye la papa y el tomate. El gen se fusiona al péptido de tránsito al cloroplasto del gen EPSPS de Arabidopsis (CTP2), y la expresión se conduce mediante el promotor de elección. En una modalidad, la presente invención utiliza un vector pWVR8 que se muestra en la Figura 30 o el vector pART27 tal como se describe en Gleave, Plant Mol . Biol . , 20: 1203-27 (1992) y como se muestra en la Figura 31. La presente invención también proporciona células hospederas que se transforman con los constructos de ADN de la presente invención. De la forma como se emplea en esta descripción, el término célula hospedera se refiere a la célula en la cual se expresa el polinucleótido de la presente invención. En consecuencia, una célula hospedera puede ser una célula individual, un cultivo celular o células que sean parte de un organismo. La célula hospedera también puede ser una porción de un embrión, endospermo, esperma o célula ovárica. La presente invención además proporciona plantas transgénicas que comprenden los constructos de ADN de la presente invención. La presente invención incluye plantas transgénicas que son angiospermas o gimnospermas . Los constructos de ADN de la presente invención se pueden emplear para transformar una variedad de plantas, tanto monocotiledoneas (por ejemplo, hierba, maíz, granos, avena, trigo y cebada) , dicotiledóneas (por ejemplo, Arabidopsis, tabaco, legumbres, alfalfa, roble, eucalipto, arce) y gimnosperma (por ejemplo, pino Scots; véase Aronen, Finnish Forest Res. Papers, Vol. 595, 1996), abeto blanco (Ellis et al . , Biotechnology 11: 84-89,1993), y lárice (Huang et al . , In Vitro Cell 27 : 201-207,1991). Las plantas también pueden incluir malezas, trigo, maíz, arroz, remolacha azucarera, papa, tomate, lechuga, zanahoria, fresas, mandioca, camote, geranio, soja, y varios tipos de plantas leñosas. Las plantas leñosas incluyen árboles como, por ejemplo, roble de palma, pino, arce, abeto, manzana, higo, ciruela y acacia. Las plantas leñosas también incluyen rosas y los viñedos. En una modalidad, los constructos de ADN de la presente invención se emplean para transformar plantas leñosas, es decir, árboles o arbustos cuyos troncos o tallos viven durante varios años e incrementan su diámetro cada año con la adición de tejido leñoso. La presente invención incluye métodos para transformar plantas, entre las que se incluyen el eucalipto y especies de pino de importancia en la industria forestal comercial como, por ejemplo, plantas seleccionadas del grupo formado por Eucalyptus grandis y sus híbridos, y Pinus taeda, así como las plantas transformadas y madera y pulpa de madera derivadas de las mismas. Otros ejemplos de plantas adecuadas incluyen aquellas seleccionadas del grupo formado por: Pinus banksiana, Pinus brutia , Pinus caribaea, Pinus clausa, Pinus conforta , Pinus coulteri, Pinus echinata, Pinus eldarica , Pinus ellioti, Pinus jeff eyi, Pinus lambetiana , Pinus massoniana , Pinus montícola, Pinus nigra, Pinus palustris , Pinus pinas fer, Pinus ponderosa, Pinus radiata , Pinus resinosa, Pinus rígida, Pinus serótina, Pinus strobus, Pinus sylvestris, Pinus taeda, Pinus virginiana, Abies amabilis, Abies balsamea, Abies concolor, Abies grandis, Abies lasiocarpa, Abies magnifica, Abies procera, Chamaecyparis lawsoniona, Chamaecyparis nootkatensis , Chamaecyparis thyoides, Junipers virginiana, Larix decidua, Larix laricina, Larix leptolepis, Larix occidentalis , Larix siberica, Libocedrus decurrens , Picea abies, Picea engelmanni, Picea glauca, Picea mariana, Picea pungens, Picea rubens , Picea sitchensis , Pseudotsuga menziesii, Sequoia gigantea, Sequoia sempervirens , Taxodium distichum, Tsuga canadensis, Tsuga heterophylla, Tsuga mertensiana, Thuja occidentalis, Thuja plícata, Eucalyptus alba, Eucalyptus bañero ftii, Eucalyptus botryoides, Eucalyptus bridgesiana, Eucalyptus calophylla, Eucalyptus camaldulensis , Eucalyptus citriodora, Eucalyptus cladocalyx, Eucalyptus coccifera , Eucalyptus curtisii, Eucalyptus dalrympleana , Eucalyptus deglupta, Eucalyptus delagatensis , Eucalyptus diversicolor, Eucalyptus dunnii, Eucalyptus ficifolia, Eucalyptus globulus, Eucalyptus gomphocephala , Eucalyptus gunnii, Eucalyptus henryi, Eucalyptus laevopinea, Eucalyptus macarthurii, Eucalyptus macrorhyncha, Eucalyptus maculata , Eucalyptus marginata, Eucalyptus megacarpa , Eucalyptus melliodora, Eucalyptus nicholii, Eucalyptus nitens, Eucalyptus nova- ángel ica, Eucalyptus obliqua , Eucalyptus occidentalis, Eucalyptus obtusiflora, Eucalyptus oreades, Eucalyptus pauci flora, Eucalyptus polybractea, Eucalyptus regnans, Eucalyptus resinífera, Eucalyptus robusta , Eucalyptus rudis, Eucalyptus saligna , Eucalyptus sideroxylon, Eucalyptus stuartiana , Eucalyptus tereticornis , Eucalyptus torelliana, Eucalyptus urnigera , Eucalyptus urophylla, Eucalyptus vimínalis, Eucalyptus viridis, Eucalyptus wandoo y Eucalyptus youmanni .

De la forma como se emplea en esta descripción, el término "planta" también está destinada a incluir el fruto, semillas, flores, estróbilo, etc., de la planta. Una planta transformada de la presente invención puede ser un transíectante directo, lo que significa que el constructo de ADN se introdujo directamente en la planta como, por ejemplo, a través de la Agrobacterium, o la planta puede ser el progenitor de una planta transíectada. La segunda o posterior generación de la planta se puede producir mediante reproducción sexual, es decir, fertilización. Aún más, la planta puede ser un gametofito (etapa haploide) o un esporofito (etapa diploide) . De la forma como se emplea en esta descripción el término "tejido vegetal" abarca cualquier porción de una planta, incluyendo las células de la planta. Las células vegetales incluyen cultivos en suspensión, callo, embrión, regiones meristemática, tejidos calloso, hojas, raíces, brotes, gametofitos, esporofitos, polen, semillas y microsporas . Los tejidos vegetales se pueden hacer crecer en cultivo líquido o sólido, o en tierra o medios adecuados en macetas, invernaderos o campos. De la forma como se emplea en esta descripción, el término "tejido vegetal" se refiere a un clon de una planta, semilla, progenie o propágulo, generada ya sea sexual o asexualmente, y a los descendientes de cualquiera de éstos como, por ejemplo, cortezas o semillas. De acuerdo con un aspecto de la presente invención, una planta transgénica que se ha transformado con el constructo de ADN de la presente invención tiene un fenotipo que es distinto de una planta que no se ha transformado con el constructo de ADN. De la forma como se emplea en esta descripción, el término "fenotipo" se refiere a un aspecto distintivo o característica de una planta que se puede alterar de acuerdo con la presente invención al integrar uno o más constructos de ADN de la presente invención en el genoma de por lo menos una célula vegetal de una planta. El constructo de ADN puede conferir un cambio en el fenotipo de una planta transformada al modificar alguna o más de diversas características genéticas, moleculares, bioquímicas, fisiológicas, morfológicas o agronómicas de la célula vegetal transformada o de la planta como un todo. Por ejemplo, las proteínas similares a la celulosa sintasa han demostrado estar implicadas en el crecimiento de la planta. (Favery et al . , Genes Dev. 15: 79 (2001) ) . Por consiguiente, el crecimiento de la célula vegetal se puede modular al alterar los niveles de polisacáridos en una planta al cambiar la expresión de uno o más genes de la síntesis de polisacáridos. El crecimiento de la célula vegetal se efectúa a través del relajamiento de la pared celular de la planta y con la expansión ocasionada por la presión de turgencia de la célula vegetal. La relación entre la holgura de la pared celular de la planta y la presión de turgencia de la célula es tal, que las paredes celulares más holgadas requieren menos presión de turgencia para expandirse, mientras que las paredes celulares más firmes requieren más presión de turgencia para expandirse. De esta manera, los polinucleótidos de la presente invención se pueden emplear para modular los niveles de síntesis de polisacáridos y con ello mediar el crecimiento de la planta. De modo semejante, bajo condiciones de sequía o tensión, se presenta una disminución en la presión de turgencia de una célula vegetal así como en la síntesis de polisacáridos. Ray, Curr. Topics in Plant Biochem . & Phys . 11: 18-41 (1992). En consecuencia, la interacción entre la baja presión de turgencia y la resistencia de la pared celular evita o disminuye el crecimiento. Por consiguiente, incrementar la síntesis de polisacáridos al alterar la expresión del gen de la síntesis de polisacáridos permitiría que la pared celular de la planta se huelgue y permita el crecimiento en condiciones que originen la disminución de la presión de turgencia como, por ejemplo, condiciones de sequía. Aún más, el uso de promotores sensibles a la tensión haría posible la expresión regulada de sintasa, la enzima sintetizadora de polisacáridos de la presente invención (Véanse las patentes de los EE.UU'. Nos: 5,891,859; 5,929,305; 5,965,705; 5,892,009). En una modalidad, la transformación de una planta con el constructo de ADN de la presente invención puede producir un fenotipo que incluye, pero sin limitarse a, alguno o más de: una tolerancia a la sequía incrementada, resistencia a los herbicidas, una altura reducida o incrementada, ramificado reducido o incrementado, tolerancia mejorada al frío o helada, un mejor vigor, coloración intensificada, características nutricionales y de salud intensificadas, mejor almacenamiento, producción intensificada, una tolerancia intensificada al salitre, una resistencia intensificada de la madera contra la pudrición, una resistencia intensificada contra enfermedades fúngicas, atracción alterada hacia insectos dañinos, tolerancia incrementada a enfermedades, tolerancia incrementada a insectos, tolerancia incrementada a tensión hidráulica, textura mejorada, germinación incrementada, captación de micronutrientes incrementada, producción de resinas novedosas y producción de proteínas o péptidos novedosos . En otra modalidad, el fenotipo afectado incluye uno o más de los siguientes atributos: tendencia a formar una madera de reacción, un periodo reducido de juventud, un periodo incrementado de juventud, ramas de auto-abscisión, un desarrollo reproductivo acelerado o desarrollo reproductivo retrasado, en comparación con una planta de la misma especie que no haya sido transformada con el constructo de ADN. En una modalidad adicional, el fenotipo que es distinto en la planta transgénica incluye uno o más de los siguientes atributos: calidad de la lignina, estructura de lignina, composición de la madera, apariencia de la madera, densidad de la madera, solidez de la madera, rigidez de la madera, polimerización de la celulosa, dimensiones de las fibras, tamaño del lumen, proporción de rayos, proporción de elementos vasculares, otros componentes de la planta, división de la célula vegetal, desarrollo de la célula vegetal, número de células por unidad de área, tamaño celular, forma celular, composición de la pared celular, índice de formación de la madera, apariencia estética de la madera, formación de los defectos en el tronco, ángulo promedio de la microfibrilla, ancho de la capa de pared celular S2, tasa de crecimiento, índice de proporción de formación de raíz con respecto al desarrollo vegetativo de la rama, índice de área de hoja y forma de la hoja. El fenotipo se puede evaluar con cualquier medio adecuado. Las plantas se pueden evaluar en base a su morfología general. Las plantas transgénicas se pueden observar a simple vista, se pueden pesar y medir su altura.

La planta se puede examinar al aislar capas individuales del tejido vegetal, es decir, el cámbium y floema, que además se pueden seccionar en células meristemáticas, o mediante expansión temprana, expansión tardía, formación de la pared secundaria, y maduración de la célula tardía. Véase, por ejemplo, Hertzberg, supra . Las plantas también se pueden evaluar utilizando un análisis microscópico o análisis químico. El análisis microscópico incluye examinar los tipos de células, etapa de desarrollo y captación de coloración de los tejidos y células. La morfología de las fibras como, por ejemplo, el grosor de la pared fibrosa y el ángulo de las microfibrillas de las fibras de la pulpa de madera, se pueden observar haciendo uso de, por ejemplo, elipsometría de transmisión microscópica. Véase Ye and Sundstrom, Tappi OS, 80:181 (1997). La resistencia y densidad de la madera así como la pendiente de la veta en madera mojada y árboles en pie se puede determinar al medir los datos espectrales de infrarrojos visibles y cercanos junto con un análisis multivariable. Véase, las publicaciones de solicitud de patente de los EE.UU. Nos. 2002/0107644 y 2002/0113212. El tamaño del lumen se puede medir utilizando microscopía de electrones. La estructura de la lignina y las propiedades químicas se pueden observar utilizando espectroscopia de resonancia magnética nuclear, tal como se describe en Marita et al . , J. Chem . Soc , Perkin Trans . I 2939 (2001) . Las características bioquímicas de la lignina, celulosa, carbohidratos y otros extractos vegetales se pueden evaluar con cualquier método analítico estándar, entre los que se incluyen, la espectrofotometría, espectroscopia por fluorescencia, HPLC, espectroscopia de masas y métodos de tinción de tejidos. De la forma como se emplea en esta descripción, el término "transformación" se refiere a un proceso mediante el cual se inserta un ácido nucleico en el genoma de una célula vegetal. Dicha inserción abarca la introducción estable en la célula vegetal y la transmisión hacia la progenie. La transformación también se refiere a la inserción temporal de un ácido nucleico, en donde el transformante temporalmente expresa el ácido nucleico. La transformación puede suceder bajo condiciones naturales o artificiales utilizando varios métodos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Glick and Thompson, eds., METHODS IN PLANT MOLECULAR BIOLOGY, CRC Press, Boca Ratón, Fia. (1993)). La transformación se puede lograr mediante cualquier método conocido para la inserción de secuencias de ácido nucleico en una célula hospedera procariótica o eucariótica, entre los que se incluyen, los protocolos de transformación mediada por Agrobacterium { véase, por ejemplo, Horsch et al, Science, 227: 1229-31 (1985), infección viral, triquitas, electroporación (véase, por ejemplo, Rhodes et ai., Science 240 (4849): 204-207 (1988), microinyección, tratamiento con polietilénglicol (véase, por ejemplo, Lyznik et al . , Plant Mol . Biol . 13: 151-161 (1989) , choque térmico, lipofección y bombardeo de partículas (véase, por ejemplo, Klein et al . , Plant Physiol . 91: 440-444 (1989) y Boynton et al . , Science 240 (4858): 1534-1538 (1988)). Las transformación también se puede realizar utilizando transformación del cloroplasto, tal como se describe en, por ejemplo, Svab et al . , Proc . Nati Acad. Sci . 87: 8526-30 (1990). Las estrategias de transformación de plantas se describen en, por ejemplo, las patentes de los EE.UU. Nos. 5,159,135 (algodón), 5,981,840 (maíz), 5,914,451 (soja) y WO 00/12715 (eucalipto) , que se incorporan como referencia en su totalidad. Estrategias y técnicas de transformación de plantas adicionales se revisan en Birch, R. G., Ann . Rev. Plant Physiol . Plant Mol . Biol . 48: 297 (1997) y Forester et al . , Exp. Agrie. 33: 15-33 (1997), y se incorporan como referencia en su totalidad. Los métodos para la transformación de especies de árboles son bien conocidos en la técnica. De acuerdo con una modalidad de la presente invención, la transformación independiente del fenotipo de los explantes de Eucalyptus y la generación de progenie transgénica se puede llevar a cabo mediante la transformación haciendo uso de la Agrobacterium . Un explante de árbol se puede, aunque no necesariamente, cosechar y cultivar en un medio de pre-cultivo antes de su transformación. Aunque no es necesario un medio de pre-cultivo, el uso de semejante medio puede incrementar la eficacia de la transformación y la regeneración de la planta. Un medio de pre-cultivo es un medio nutritivo sobre el cual se pueden cultivar explantes antes de su transformación con Agrobacterium . Se puede emplear cualquier medio de pre-cultivo y periodos de tiempo. El medio de pre-cultivo contiene un inductor de Agrobacterium como, por ejemplo, la acetosiringona. El medio de pre-cultivo, opcionalmente, puede contener reguladores del crecimiento de la planta, entre los que se incluyen la auxina y la citocinina. Un medio de pre-cultivo se puede preparar utilizando un medio salino adecuado, entre los que se incluyen, sales de medio de planta leñosa (WPM) (Lloyd and McCown, Co bined Proceedings of the Interna tional Plant Propagators Society, 30: 421-427,1980), el medio de Murashige y Skoog (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) o el medio de Lepoivre . El medio de pre-cultivo puede contener inductores de la Agrobacterium como, por ejemplo, la acetosíringona. Opcionalmente, el medio de pre-cultivo puede contener auxina, citocinina, o tanto auxina como citocinina. A continuación se muestra un medio de pre-cultivo ilustrativo.

En este método de transformación, los explantes de plantas se pueden pre-cultivar durante cuatro días en el medio de pre-cultivo. El cultivo inducido de Agrobacterium se puede preparar con métodos conocidos en la técnica. El cultivo inducido se aplica a un explante de planta. Los explantes se pueden transformar con la aplicación de cultivo de Agrobacterium al explante, infiltración al vacío, inmersión floral, etc. Enseguida de la transformación, los explantes tratados con el cultivo de Agrobacterium se pueden cultivar con Agrobacterium bajo condiciones de luz o de oscuridad durante 2 a 10 días. En una modalidad, los explantes se co-cultivan con Agrobacterium bajo condiciones de luz o de oscuridad durante 4 días . Enseguida de la co-cultivación, los explantes se pueden transferir hacia un medio de regeneración con 400 mg/L de timentina. Los explantes se pueden cultivar en el medio de regeneración antes de transferirlos hacia un medio de selección. En una modalidad, los explantes se cultivan en el medio de regeneración durante cuatro días. Se puede emplear cualquier medio de selección. En una modalidad, el medio de selección es el medio de regeneración complementado con timentina y un agente de selección herbicida. La siguiente tabla proporciona un medio de regeneración ilustrativo.

Componentes por 1 litro de medio KN03 1 NH4H2P04 0.25 MgS04-7H20 0-25 CaCl2.2H20 0.10 FeS04.7H20 0.0139 Na2EDTA. 2H20 0.01865 MES (Duchefa ml501) 600.0 MS Micro (1/2 potencia) | MnS04.H20 0.00845 ZnS04.7H20 0.0043 CuS04.5H20 0.0000125 CoCl2.6H20 0.0000125 Kl 0.000415 H3B03 0.0031 Na2MoO .2H20 0.000125 Zeatina NAA (ácido naftalen acético) Glucosa/Sacarosa 20.0 Myo-inositol 0.100 Ácido nicotínico 0.010 Tiamina 0.010 Pantotenato de Ca 0.001 Piridoxina 0.001 Biotina 0.00001 Ácido ascórbico 0.050 L-glutamina 0.1 Arginina 0.0258 Glicina 0.00199 Lisina 0.0508 Metionina 0.0132 Fenilalanina 0.0257 Serina 0.00904 Treonina 0.00852 Trptofano 0.0122 Tirosina 0.0127 Gelrite 3.0 Los grupos de brotes que sobreviven a la selección, se mantienen en el medio de regeneración que contiene herbicida y timentina. Se pueden transferir los grupos de brotes hasta los brotes proliferen y de su inicial crecimiento. En una modalidad, los grupos de brotes se transfieren cada 3 semanas. Se puede emplear cualquier gen indicador como, por ejemplo, GFP, luciferasa o GUS . En una modalidad, la tinción del GUS se puede realizar para monitorear la frecuencia de infección con el Agrobacterium y para asegurar que los grupos seleccionados no se escapen o sean quiméricos. Los tejidos del tronco o tallo y hojas de los grupos regenerados se pueden teñir para la expresión del gen indicador inmediatamente después del desarrollo del grupo. Por ejemplo, para determinar la actividad del GUS, los explantes se pueden incubar en un substrato que comprenda 100 mM de amortiguador de fosfato (pH 7.0), 0.05% de sufóxido de dimetilo, 0.05% de Tritón X-100, 10 mM de EDTA, 0.5 mM de ferrocianuro de potasio y 1.5 mg/ml de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-ß-D-glucuronida (X-gluc) . Los explantes después se pueden someter a 10 minutos de vacío antes de una incubación durante la noche a 37 °C antes del conteo de GUS foci . De acuerdo con otra modalidad, la transformación de Pinus se realiza utilizando los métodos descritos en la publicación de solicitud de patente de los EE.UU. No. 2002/0100083. Otro aspecto de la presente invención proporciona métodos para la obtención de madera y/o para la elaboración de pulpa de madera obtenida de una planta transformada con el constructo de ADN de la presente invención. Los métodos para la producción de una planta transgénica se proporcionaron en lo anterior y son conocidos en la técnica. Una planta transformada se puede cultivar o hacer crecer bajo cualesquier condiciones adecuadas. Por ejemplo, se puede cultivar pino y hacer crecer de la manera que se describe en la publicación de solicitud de patente de los EE.UU. No. 2002/0100083. Se puede cultivar Eucalyptus y hacer crecer tal como se señala en, por ejemplo, Rydelius, et al . , "Growing Eucalyptus for Pulp and Energy", obra presentada en Mechanization in Short Rotation, Intensive Culture Forestry Conference, Mobile, AL, 1994. Se puede obtener madera y pulpa de madera a partir de la planta por medio de cualquier medio conocido en la técnica. Tal como se apunta en lo anterior, la madera o pulpa de madera obtenida de acuerdo con la presente invención puede demostrar características mejoradas, entre las que se incluyen, composición de la lignina, composición de la madera, polimerización de la celulosa, dimensiones de las fibras, proporción de fibras con respecto a otros componentes de la planta, división de las células vegetales, desarrollo de las células vegetales, número de células por unidad de área, tamaño de las células, composición de la pared celular, índice de formación de la madera, apariencia estética de la madera, formación de defectos en el tronco, tasa de crecimiento, índice de proporción de formación de raíz con respecto al desarrollo vegetativo de las ramas, índice del área de las hojas y la forma de las hojas, incluyendo el contenido disminuido o reducido de lignina, accesibilidad incrementada de la lignina a tratamientos químicos, reactividad mejorada de la lignina, contenido celulósico incrementado o disminuido, estabilidad dimensional incrementada o disminuida, resistencia incrementada a la tensión, resistencia incrementada al esfuerzo cortante, resistencia incrementada a la compresión, resistencia incrementada al choque, rigidez incrementada, dureza incrementada o reducida, distorsión en espiral disminuida, encogimiento disminuido y diferencias en peso, densidad y gravedad específica.

B. Perfilamiento de expresión de los genes de la síntesis de polisacáridos La presente invención también proporciona métodos y herramientas para realizar el perfil de expresión de genes de la síntesis de polisacáridos . El perfil de expresión es útil para determinar si los genes están transcritos o traducidos, en la comparación de niveles transcriptos de genes particulares en distintos tejidos, en la acción de genotipar, en la estimación del número de copias de ADN, en la determinación de la identidad de descendencia, en la medición de los índices de degradación del ARNm, en la identificación de sitios de unión a proteínas, en la determinación de la ubicación subcelular de productos genéticos, en la correlación de la expresión genética con un fenotipo y otro fenómeno y en la determinación del efecto sobre otros genes de la manipulación de un gen en particular. El perfil de expresión es particularmente útil en la identificación de la expresión genética en eventos complejos y multigénicos . Por esta razón, el perfil de expresión es útil en la correlación de la expresión de los genes de la síntesis de polisacáridos con el fenotipo de planta y en la formación de los tejidos vegetales y en la interconexión de los mismos con respecto a la biosíntesis de los polisacáridos. Sólo una pequeña fracción de los genes de la síntesis de polisacáridos de una planta se expresa en un momento determinado en una muestra de tejido determinada, y todos los genes expresados no pueden afectar el fenotipo de planta. Para identificar los genes capaces de afectar un fenotipo de interés, la presente invención proporciona el perfil de expresión de los genes de la síntesis de polisacáridos en un punto determinado en el desarrollo de la planta y un perfil de expresión de los genes de la síntesis de polisacáridos en una muestra de tejido determinada. La presente invención también ofrece métodos y herramientas para identificar genes de la síntesis de polisacáridos cuya expresión se puede manipular para alterar el fenotipo de planta. Para la sustentación de estos métodos, la presente invención también proporciona métodos y herramientas que distinguen la expresión de distintos genes de la misma familia como, por ejemplo, la celulosa sintasa o proteínas similares a la celulosa sintasa. De la forma como se emplea en esta descripción, el término "expresión genética" se refiere al proceso de transcripción de una secuencia de ADN a una secuencia de ARN, seguido de la traducción del ARN a una proteína, que puede o no experimentar un procesamiento de posttraducción. Por lo tanto, la relación entre el fenotipo de planta y la expresión de los genes de la síntesis de polisacáridos se puede observar al detectar, cuantitativa o cualitativamente, cambios en el nivel de una ARN o una proteína. De la forma como se emplea en esta descripción, el término "actividad biológica" incluye, pero sin limitarse a, la actividad de un producto genético de proteína como, por ejemplo, la actividad de la glucosiltransferasa . La presente invención proporcionar oligonucléotidos que son útiles en estos métodos de perfilamiento de la expresión. Cada oligonucléotido es capaz de hibridarse, bajo un conjunto determinado de condiciones, hacia los genes de la síntesis de polisacáridos o hacia un producto genético. En aspecto de la presente invención, se proporciona una pluralidad de oligonucléotidos, en donde cada oligonucléotido se hibridiza bajo un conjunto determinado de condiciones, hacia un distinto producto genético de la síntesis de polisacáridos. Los ejemplos de oligonucléotidos de la presente invención incluyen SEQ ID NOs: 59-83. Cada uno de los oligos de SEQ ID NOs: 59-83 hibridiza, bajo condiciones estándares, hacia un producto genético distinto de un producto genético de la SEQ ID NOs: 1-29. Los oligonucléotidos de la presente invención son útiles en la determinación de la expresión de uno o más genes de la síntesis de polisacáridos en cualquiera de los métodos antes descritos . 1. Muestras de células, tejido, ácido nucleico y proteina Las muestras que se emplean en los métodos de la presente invención se pueden derivar de tejido vegetal.

Los tejidos vegetales adecuados incluyen, pero sin limitarse a, embriones somáticos, polen, hojas, troncos o tallos, callo, estolones, microtubérculo, brotes, xilema, estrómboli, conos de polen, tejido vascular, meristemo apical, cámbium vascular, xilema, raíz, flores y semillas. De acuerdo con la presente invención, el término "tejido vegetal" se emplea tal como se ha descrito previamente en este documento. El tejido vegetal se pueden obtener de cualquier tipo o especie de planta descritos en lo anterior. De acuerdo con un aspecto de la presente invención, las muestras se pueden obtener de tejido vegetal en distintas etapas de desarrollo, a partir de tejido vegetal en varios momentos del año (por ejemplo, primavera versus verano) , a partir de tejidos vegetales sometidos a distintas condiciones ambientales (por ejemplo, variaciones en la luz y temperatura) y/o a partir de distintos tipos de tejido vegetal y células. De acuerdo con una modalidad, el tejido vegetal se obtiene durante varias etapas de maduración y durante las distintas estaciones del año. En una modalidad adicional, el tejido vegetal se obtiene a partir de plantas que muestran distintos fenotipos. Por ejemplo, el tejido vegetal se puede recolectar a partir de células divisorias del tallo o tronco, xilema de diferenciación, células de la madera en desarrollo temprano, células de madera diferenciadas en etapa temprana y células de la madera diferenciadas en etapa tardía. Como otro ejemplo, la expresión genética en una muestra obtenida de una planta con madera en desarrollo se puede comparar con la expresión genética en una muestra obtenida de una planta que no ha desarrollado madera. Como un ejemplo adicional, la expresión genética de una muestra obtenida de una planta que muestra una fenotipo de madera de reacción se puede comparar con la expresión genética de una muestra obtenida de una planta que no tiene madera de reacción. El xilema de diferenciación incluye muestras obtenidas de madera de reacción. La madera de reacción incluye madera comprimida, madera laminada y xilema vertical normal. Son de uso común los métodos para la obtención de muestras para el perfilamiento de la expresión de pino y eucalipto. Véase, por ejemplo, Aliona et al . , Proc . Nati Acad. Sci . 95:9693- 8 (1998) y Whetton et al . , Plant Mol . Biol . 47:275-91, y Kirst et al . , Int ' I Union of Forestry Research Organizations Biennial Conference, S6.8 (Junio 2003, Umea, Suecia) . En una modalidad de la presente invención, la expresión genética en un tipo de tejido se compara con la expresión genética en una tipo distinto de tejido o con la expresión genética en el mismo tipo de tejido en una distinta etapa de desarrollo. La expresión genética también se puede comparar en un tipo de tejido que se haya muestreado en varios momentos durante el año (distintas estaciones). Por ejemplo, la expresión genética en xilema secundario joven se puede comparar con la expresión genética en xilema secundario maduro. De modo semejante, la expresión genética en cámbium se puede comparar con la expresión genética en xilema. Aún más, la expresión genética en meristemo apical se puede comparar con la expresión genética en cámbium. En otra modalidad de la presente invención, se obtiene una muestra de una planta que tenga un fenotipo específico y la expresión genética en esa planta se compara con una muestra obtenida de una planta de la misma especie que no tenga ese fenotipo. Por ejemplo, se puede obtener una muestra de una planta que exhiba un índice de crecimiento rápido y se puede comparar la expresión genética con la de la muestra obtenida de la planta que exhibe un índice de crecimiento normal o lento. Los genes diferencialmente expresados identificados a partir de semejante comparación se pueden correlacionar con el índice de crecimiento y, por lo tanto, puede ser útiles para manipular el índice de crecimiento. En una modalidad adicional, se obtiene una muestra a partir de plantas clonalmente propagadas . En una modalidad, las plantas clonalmente propagadas son de las especies Pinus o Eucalyptus. Los rametos individuales obtenidos del mismo genotipo se pueden sacrificar en diferentes momentos del año. En consecuencia, para cualquier genotipo puede haber por lo menos dos árboles sacrificados genéticamente idénticos, temprano en la estación y tardío en la estación. Cada uno de estos árboles se puede dividir en muestras jóvenes (superior) o muestras maduras (inferiores) . Además, las muestras de tejidos se pueden dividir en, por ejemplo, de floema a xilema, en por lo menos 5 capas de descortezado. Cada una de estas muestras se le puede evaluar su fenotipo y expresión genética. Véase la Figura 32. Cuando los componentes celulares pueden interferir con una técnica analítica como, por ejemplo, un ensayo de hibridación, ensayo enzimático, un ensayo de unión, ensayo de unión del ligando o un ensayo de actividad biológica, se puede considerar deseable aislar los productos genéticos de estos componentes celulares. Los productos genéticos, entre los que se incluyen los productos genéticos de ácido nucleico y de aminoácidos, se pueden aislar de los fragmentos celulares o lisados con cualquier método conocido en la técnica. Los ácidos nucleicos empleados de acuerdo con la presente invención se pueden preparar con cualquier método o proceso disponible o con otros procesos que sean de uso común en la técnica. Las técnicas convencionales para el aislamiento de ácidos nucleicos se detallen en, por ejemplo, Tijssen, LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY, Hybridization With Nucleic Acid Probes , capítulo 3 (Elsevier Press, 1993) , Berger and Kimmel , Methods Enzymol . 152 : 1 (1987) , y Gibco BRL & Life Technologies Trizol RNA Isolation Protocol , No . de Forma 3786 (2000) . Las técnicas para la preparación de muestras de ácido nucleico y secuenciación de polipéptidos a partir de pino y eucalipto son de uso común. Véase, por ejemplo, Aliona et al . , supra y Whetton et al . , supra . Una muestra de ácido nucleico adecuada puede contener cualquier tipo de ácido nucleico derivado del transcripto de un gene de la síntesis de polisacáridos, es decir, ARN o una secuencia del mismo o un ácido nucleico para el cual un ARNm transcrito de un gene de la síntesis de polisacáridos funciona como un molde. Los ácidos nucleicos adecuados incluyen ADNc transcrito inverso a partir de un transcripto, ARN transcrito a partir de ese ADNc, ADN amplificado a partir del ADNc, y ARN transcrito a partir del ADN amplificado. La detección de estos productos o productos derivados es indicativo de la presencia y/o abundancia del transcripto en la muestra. Por ello, las muestras adecuadas incluyen, pero sin limitarse a, transcriptos del gen o genes, ADNc transcrito inverso a partir del transcripto, ARNc transcrito a partir del ADNc, ADN amplificado a partir de los genes, y ARN transcrito a partir del ADN amplificado. De la forma como se emplea en esta descripción, la categoría de "transcriptos" incluye, pero sin limitarse a, transcriptos nacientes del ARNm, intermediarios del procesamiento transcripto y ARNm maduros y productos de degradación de los mismos. No es necesario monitorear todos los tipos de transcriptos para poner en práctica la presente invención. Por ejemplo, los métodos de perfilamiento de la expresión de la presente invención se pueden realizar al detectar únicamente un tipo de transcripto como, por ejemplo, únicamente los niveles de ARNm maduro. En un aspecto de la presente invención, se prepara un ADN cromosomal o una genoteca de ADNc (que comprenda, por ejemplo, ADNc fluorescentemente marcado obtenido del ARNm de las células totales) para emplearse en los métodos de hibridación de acuerdo con métodos reconocidos en la técnica. Véase, Sambrook et al . , supra. En otro aspecto de la presente invención, el ARNm se amplifica utilizando, por ejemplo, el equipo MessageAmp (Ambion) . En un aspecto adicional, el ARNm se marca con un marcador genético. Por ejemplo, el ARNm se puede marcar con un cromóforo fluorescente como, por ejemplo, CyDye (Amersham Biosciences) .

En algunas aplicaciones, se puede considerar deseable inhibir o destruir la Rnasa que a menudo es encuentra presente en homogenados o lisados, antes de emplearse en las técnicas de hibridación. Los métodos para inhibir o destruir las nucleasas son bien conocidos. En una modalidad de la presente invención, las células o tejidos se homogeneizan en presencia de agentes caotrópicos para inhibir la nucleasa. En otra modalidad, la RNasa se inhibe o destruye con tratamiento térmico, seguido de un tratamiento con proteinasa. Las muestras de proteínas se pueden obtener á través de cualquier medio conocido en la técnica. Las muestras de proteínas útiles en los métodos de la presente invención incluyen lisados de células naturales y homogenados de células naturales. O bien, las muestras de proteínas se pueden purificar. Varios métodos de purificación de proteínas bien conocidos en la técnica se pueden encontrar en Marshak et al . , STRATEGIES FOR PROTEIN PURIFICATION AND CHARACTERIZATION: A LABORATORY COURSE MANUAL (Cold Spring Harbor Labora tory Press 1996) . 2. Nivel de detección de la expresión genética Para los métodos de la presente invención que comprende la acción de detectar un nivel de la expresión genética, se puede emplear cualquier método para la observación de la expresión genética, sin limitación alguna. Este tipo de métodos incluye técnicas tradicionales de hibridación del ácido nucleico, métodos basados en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, polymerase chain reaction) , y la determinación de proteínas. La presente invención incluye los métodos de detección que emplean formatos de ensayos basados en soporte sólido así como aquellos que emplean formatos de ensayos basados en una solución. No se hacen mediciones absolutas de los niveles de expresión, aunque se pueden hacer. La presente invención incluye métodos que comprenden comparaciones de diferencia en los niveles de expresión entre las muestras . La comparación de los niveles de expresión se puede realizar de manera visual o manual, o se puede automatizar y realizar con una máquina, utilizando, por ejemplo, medios de detección óptica. Subrahmanyam et al . , Blood. 97: 2457 (2001); Prashar et al . , Methods Enzymol . 303: 258 (1999) . Se encuentra disponibles hardware y software para el análisis de la expresión diferencial y se pueden emplear para poner en práctica la presente invención. Véase, por ejemplo, GenStat Software y GeneExpress®0 GX Explorer™ Training Manual, supra; Baxevanis & Francis-Ouellette, supra . De acuerdo con una modalidad de la presente invención, se emplean técnicas de hibridación del ácido nucleico para observar la expresión genética. Las técnicas de hibridación ilustrativas incluyen los ensayos de transferencia por adsorción Northern, transferencia por adsorción Southern, hibridación mediante solución y de protección de la nucleasa SI. La hibridación del ácido nucleico por lo habitual implica poner en contacto una sonda de oligonucléotido y una muestra que comprenda ácidos nucleicos bajo condiciones en donde la sonda pueda formar bicatenarios híbridos estables con su ácido nucleico complementario a través de apareo de pares base complementarios. Por ejemplo, véase la solicitud PCT WO 99/32660; Berger & Kimmel, Methods Enzymol . 152: 1 (1987). Los ácidos nucleicos que no forman bicatenarios híbridos después se lavan aparte, lo que permite que los ácidos nucleicos hibridizados sean detectados, por lo habitual a través de la detección de un marcador genético adherido. El marcador genético puede estar presente en la sonda o en la muestra de ácido nucleico. En una modalidad, los ácidos nucleicos de la muestra son polinucleótidos marcados genéticamente que representan los transcriptos de ARNm presentes en un tejido vegetal (por ejemplo, una genoteca de ADNc) . Los marcadores genéticos por lo común son marcadores radiactivos o fluorescentes, pero se puede emplear cualquier marcador capaz de efectuar la detección. Los marcadores se pueden incorporar mediante diversas metodologías descritas en, por ejemplo, la solicitud de PCT WO 99/32660, supra. En un aspecto, el ARN se puede amplificar utilizando el equipo MessageAmp (Ambion) con la adición de aminoalil-UTP así como también sin UTP. Los grupos aminoalilo incorporados en el ARN amplificado se puede hacer reaccionar con un cromóforo fluorescente como, por ejemplo, CyDye (Amersham Biosciences) . Los bicatenarios de ácidos nucleicos se desestabilizan al incrementar la temperatura o al disminuir la concentración salina del amortiguador que contiene los ácidos nucleicos. Bajos condiciones de severidad bajas (por ejemplo, temperatura baja y/o concentración salina elevada) se formarán bicatenarios híbridos (por ejemplo, ADN:ADN, ARN:ARN o ARN:ADN) incluso cuando las secuencias apareadas no sean perfectamente complementarias . Por consiguiente, se reduce la especificidad de la hibridación a una severidad más baja. Por el contrario, a una severidad más alta (por ejemplo, temperatura más alta y/o un contenido salino más bajo y/o en presencia de reactivos desestabilizadores) la hibridación tolera pocos apareamientos erróneos . Por lo habitual, las condiciones de severidad para sondas cortas (por ejemplo, 10 a 50 bases de nucleótidos) serán aquellas en las que la concentración salina es de por lo menos aproximadamente 0.01 a 1. OM a un pH de 7.0 a 8.3 y la temperatura es de por lo menos aproximadamente 30 °C. Las condiciones severas también se puede lograr con la adición de agentes desestabilizadores como, por ejemplo, la formamida. Bajo ciertas circunstancias, se puede considerar deseable realizar la hibridación en condiciones de baja severidad, por ejemplo, 6x de SSPE-T (NaCl 0.9 M, NaH2P0460 mM, pH 7.6, EDTA 6 mM, 0.005% Tritón) a 37°C, para asegurar la hibridación. Se pueden efectuar lavados posteriores a condiciones de severidad superiores (por ejemplo, Ix de SSPE-T a 37 °C) para eliminar bicatenarios híbridos mal apareados. También se pueden realizar lavados posteriores a condiciones de severidad cada vez más altas (por ejemplo, tan bajas como 0.25x de SSPE-T a 37°C a 50°C) hasta que se obtenga el nivel deseado de especificidad de hibridación. En general, las condiciones estándares para la hibridación son un equilibrio entre severidad (especificidad de hibridación) e intensidad de señal. En consecuencia, en una modalidad de la presente invención, los ácidos nucleicos hibridizados se lavan en condiciones de severidad sucesivamente más altas y se toma una lectura en cada lavado. El análisis de los conjuntos de datos producidos de esta manera revelará una severidad de lavado por arriba de la cual no se alterará de manera apreciable el patrón de hibridación y la cual proporciona una señal adecuada para las sondas de oligonucléotidos particulares de interés. Por ejemplo, el lavado final se puede seleccionar como el de la severidad más alta que produce resultados consistentes y que proporciona una intensidad de señal superior a aproximadamente 10% de la intensidad de procedencia. a. Sondas de oligonucléotidos Las sondas de oligonucléotidos útiles en las técnicas de hibridación de ácidos nucleicos empleadas en la presente invención son capaces de unirse a un ácido nucleico de secuencia complementaria a través uno o más tipos de enlaces químicos, usualmente a través del apareo de pares complementarios vía la formación de un enlace de hidrógeno. Una sonda puede incluir bases naturales (es decir, A, G, U, C ó T) o bases modificadas (7-deazaguanosine, inosina, etc.). Además, la bases nucleótidas en las sondas se pueden unir mediante un acoplamiento con otro enlace de fosfodiéster, en tanto no interfiera con la hibridación. Por consiguiente, las sondas pueden ser péptidos ácidos nucleicos en los cuales las bases constituyentes se acoplan mediante enlaces de péptido en lugar de hacer con acoplamientos de fosfodiéster. Las sondas de oligonucléotidos se pueden preparar con cualquier medio conocido en la técnica. Las sondas útiles en la presente invención son capaces de hibridarse hacia un producto de nucleótido de un gen de la síntesis de polisacáridos como, por ejemplo, una de SEQ ID NOs: 1-29. Las sondas útiles en la presente invención se pueden generar utilizando las secuencias de nucleótidos descritas en SEQ ID NOs: 1-29. La presente invención incluye sondas de oligonucléotidos que tienen por lo menos 2, 10, 15, 20, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 ó 100 fragmentos de nucleótido de una secuencia contigua correspondiente de cualquiera de SEQ ID NOs: 1-29. La presente invención incluye oligonucléotidos que tienen una longitud inferior de 2, 1, 0.5, 0.1 ó 0.05 kb . En una modalidad, el oligonucléotido tiene una longitud de 60 nucleótidos. Las sondas de oligonucléotidos se pueden diseñar con cualquier medio conocido en la técnica. Véase, por ejemplo, Li and Stormo, Bioinformatics 17: 1067-76 (2001). La sonda de oligonucléotidos se puede producir haciendo uso de un software. Un software de ejemplo incluye ArrayDesigner, GeneScan y ProbeSelect . Las sondas complementarias a una secuencia de ácido nucleico definida se pueden sintetizar de manera química, generar a partir de nucleótidos más largos haciendo uso de enzimas de restricción, o se pueden obtener utilizando técnicas como, por ejemplo, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, polymerase chain reaction) . Los métodos PCR son de uso común y se describen en, por ejemplo, Innis et al . eds . , PCR PROTOCOLS : A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS, Academic Press Inc . San Diego, Calif. (1990) . Las sondas se pueden marcar, por ejemplo, con un radiactivo, se pueden someter a biotinilación o etiqueta fluorescente. Opcionalmente, los ácidos nucleicos en la muestran se marcan y las sondas no se marcan. Las sondas de oligonucléotidos generadas con los anteriores métodos se pueden emplear en métodos basados en solución o basados en soporte sólido. La presente invención incluye sondas de oligonucléotidos que se hibridizan hacia un producto de la región codificante o a una región 3' sin traducir (3'UTR, untranslated región) de un gen de síntesis de polisacáridos. En una modalidad, la sonda de oligonucléotidos se híbrida con la 3'UTR de cualquiera de SEQ ID NOs: 1-29. La 3'UTR, en términos generales, es una región única del gen, incluso entre miembros de la misma familia. Por lo tanto, las sondas capaces de hibridarse hacia un producto de la 3'UTR pueden ser útiles para la diferenciación de la expresión de genes individuales dentro de una familia donde la región codificante de los genes probablemente sea muy homologa. Esto permite que se diseñen sondas de oligonucléotidos que se va a emplear como miembros de una pluralidad de oligonucléotidos, cada uno capaz de unirse únicamente a un solo gen. En otra modalidad, la sonda de oligonucléotidos comprende cualquiera de SEQ ID NOs: 59-83. En otra modalidad, la sonda de oligonucléotidos está formada por uno de SEQ ID NOs: 1-29. b. Métodos de arreglo de oligonucléotidos Una modalidad de la presente invención emplea dos o más sondas de oligonucléotidos en combinación con el fin de detectar el nivel de expresión de uno o más genes de la síntesis de polisacáridos como, por ejemplo, los genes de SEQ ID NOs: 1-29. En un aspecto de esta modalidad, se detecta el nivel de expresión de dos o más distintos genes. Los dos o más genes pueden provenir de las mismas o distintas familias del gen de síntesis de polisacáridos discutidas en lo anterior. Cada uno de los dos o más oligonucléotidos se pueden hibridar hacia uno de los genes distintos. Una modalidad de la presente invención emplea dos o más sondas de oligonucléotidos, cada una de las cuales específicamente se híbrida con un polinucleótido derivado del transcripto de un gen provisto por SEQ ID NOs: 1-29. Otra modalidad emplea dos o más sondas de oligonucléotidos, por lo menos una de las cuales comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NOs: 59-83. Otra modalidad emplea dos o más sondas de oligonucléotidos, por lo menos una de las cuales comprende SEQ ID NOs: 59-83. Las sondas de oligonucléotidos pueden comprender de aproximadamente 5 a 60, o de aproximadamente 5 a 500, bases de nucleótidos como, por ejemplo, de aproximadamente 60 a 100 bases de nucleótidos, incluso de aproximadamente 15 a 60 bases de nucleótidos. Una modalidad de la presente invención emplea métodos de hibridación de oligonucléotidos basados en soporte sólido, con el fin de detectar la expresión genética. Los métodos basados en soporte sólido adecuados para poner en práctica la presente invención son ampliamente conocidos y se describen por ejemplo, en la solicitud PCT WO 95/11755; Huber et al . , Anal . Biochem . 299: 24 (2001); Meiyanto et al , Biotechniques 31: 406' (2001); Relogio et al . , Nucleic Acids Res . 30:e51 (2002). Se puede emplear cualquier superficie sólida a la cual se pueden enlazar, de manera covalente o no covalente, los oligonucléotidos. Este tipo de soportes sólidos incluyen filtros, platos de cloruro de polivinilo, chips de base de silicio o vidrio. Una modalidad emplea arreglos de oligonucléotidos, es decir, microarreglos, que se pueden emplear para observar simultáneamente la expresión de un número de genes o productos genéticos. Los arreglos de oligonucléotidos comprenden dos o más sondas de oligonucléotidos provistas en un soporte sólido, en donde cada sonda ocupa un sitio único en el soporte. La ubicación de cada sonda se puede predeterminar, de modo que la detección de una señal genética en un sitio determinado sea un indicativo de la hibridación hacia una sonda de oligonucléotidos de una identidad conocida. Cada sitio predeterminado puede contener más de una molécula de una sonda, pero cada molécula dentro del sitio predeterminado tiene una secuencia idéntica. Estos sitios predeterminados son denominados peculiaridades. Puede haber, por ejemplo, de 2, 10, 100, 1,000, 2,000 ó 5,000 o más de estas peculiaridades en un solo soporte sólido. En una modalidad, cada oligonucléotido se ubica en una posición única en un arreglo de por lo menos 2, por lo menos 3, por lo menos 4, por lo menos 5, por lo menos 6 o por lo menos 10 veces. Los arreglos de sonda de oligonucléotidos para detectar la expresión genética se puede elaborar y emplear de acuerdo con técnicas convencionales descritas en, por ejemplo, Lockhart et al . , Nat'l Biotech. 14: 1675 (1996), McGall et al . , Proc. Nat'l Acad. Sci . USA 93: 13555 (1996), y en Hughes et al . , Nature Biotechnol . 19: 342 (2001). Una variedad de diseños de arreglos de oligonucléotidos es adecuada para poner en práctica la presente invención. En una modalidad, uno o más oligonucléotidos incluyen una pluralidad de oligonucléotidos donde cada uno se híbrida con un distinto gen expresado en un tipo de tejido particular. Por ejemplo, el tejido se puede desarrollar en madera. En una modalidad, una muestra de ácido nucleico obtenida de una planta se puede amplificar y, opcionalmente, marcar con un marcador genético. Se puede emplear cualquier método de amplificación de ácido nucleico y cualquier marcador genético adecuados para este propósito. Por ejemplo, las reacciones de amplificación se pueden realizar utilizando, por ejemplo, Ambion 's MessageAmp, que crea un ARN "antisentido" o "ARNa" (complementario, en la secuencia de ácido nucleico, al ARN extraído del tejido de muestra) . El ARN opcionalmente se puede marcar utilizando marcadores fluorescentes CyDye . Durante el paso de amplificación, se incorpora aaUTP en el ARNa resultante. Los marcadores fluorescentes CyDye se acoplan a los trifosfato de uridina aaUTP { uridine triphosphate) en una reacción no enzimática. Después de los pasos de amplificación y marcado, los ARN antisentido amplificado y marcado se precipitan y lavan con un amortiguador apropiado, y después se someten a ensayo para su pureza. Por ejemplo, la pureza se puede someter a ensayo utilizando un espectrofotometro NanoDrop . La muestra de ácido nucleico después se pone en contacto con un arreglo de oligonucléotidos que tiene, unidas al substrato sólido (un "portaobjetos de microarreglo"), sondas de muestras de oligonucléotidos capaces de hibridarse hacia los ácidos nucleicos de interés que puedan estar presentes en la muestra. El paso de poner en contacto se realiza bajo condiciones donde puede ocurrir la hibridación entre los ácidos nucleicos de interés y las sondas de oligonucléotidos presente en el arreglo. El arreglo después se lava para retirar ácidos nucleicos enlazados de manera no específica, y se detectan las señales de las moléculas marcadas que continúan hibridizadas hacia sondas de oligonucléotidos en el substrato sólido. El paso de detección se puede realizar utilizando cualquier método apropiado con el tipo de marcado empleado. Por ejemplo, el paso de detección se puede realizar haciendo uso de un explorador y detector de láser. Por ejemplo, alguien puede emplear un explorador Axon que, opcionalmente emplea el software GenePix para analizar la posición de la señal en el portaobjetos de microarreglo. Los datos obtenidos de uno o más portaobjetos de microarreglo se pueden analizar con cualquier método apropiado conocido en la técnica. Las sondas de oligonucléotidos empleadas en los métodos de la presente invención, entre las que se incluyen las técnicas de microarreglo, se pueden generar utilizando PCR. Los cebadores de PCR que se emplea para generar las sondas se eligen, por ejemplo, sobre la base de las secuencias de SEQ ID NOs: 1-29, para obtener una amplificación de fragmentos únicos de los genes de la síntesis de polisacáridos (es decir, fragmentos que se hibridizan hacia únicamente un polinucleótido de cualquier de SEQ ID NOs: 1-29 bajo condiciones de hibridación estándares) . Los programas de computadora son útiles en el diseño de cebadores con la especificidad requerida y con las propiedades de hibridación óptimas. Por ejemplo, Li y Stor o, supra at 1075, discuten un método de selección de sonda utilizando el programa ProbeSelect que selecciona una sonda de oligonucléotidos óptima basándose en la secuencia completa genética, así como en otras secuencias genéticas que se prueban al mismo tiempo. En una modalidad, también se emplean sondas de oligonucléotidos de control. Las sondas de control ilustrativas pueden estar dentro de por lo menos tres categorías llamadas en esta descripción como (1) controles de normalización, (2) controles del nivel de expresión y (3) controles negativos. En métodos de micro arreglo, se pueden proporcionar uno o más de estas sondas de control en el arreglo con los oligonucléotidos relacionados con el gen de la síntesis de polisacáridos. Los controles de normalización corrigen las imperfecciones de coloración, imperfecciones en el tejido, polvo o irregularidades en el portaobjetos, manchas mal formadas en el portaobjetos, etc. Los controles de normalización son oligonucléotidos y otros sondas de ácido nucleico que son complementarias a los oligonucléotidos marcados de referencia o a otras secuencias de ácido nucleico que se agregaron a la muestra de ácido nucleico que se va a cribar. Las señales obtenidas de los controles de normalización, después de la hibridación, proporcionan un control de las variaciones en las condiciones de hibridación, intensidad del marcado, eficiencia de la lectura y otros factores que pueden causar la señal de una hibridación perfecta, que varía entre los arreglos. En una modalidad, la o las señales (por ejemplo, la intensidad de fluorescencia y radioactividad) leídas a partir de todas las otras sondas empleadas en el método se dividen con la señal de las sondas de control, con lo que se normalizan las mediciones. Virtualmente cualquier sonda puede servir como un control de normalización. Sin embargo, la eficiencia de hibridación fluctúa con la composición base y la longitud de la sonda. Las sondas de normalización preferidas se seleccionan para reflejar la longitud promedio de las otras sondas que se están empleando, pero también se pueden seleccionar para cubrir un intervalo de longitudes . Además, el o los controles de normalización se pueden seleccionar para reflejar la composición base promedio de las otras sondas que se van a utilizar. En una modalidad, sólo se emplea una o unas pocas sondas de normalización, de modo que se hibridan de manera correcta (es decir, sin la formación de estructuras secundarias) y no se aparean con cualquiera de las sondas de prueba. En una modalidad, los controles de normalización son genes de mamíferos. Las sondas de control del nivel de expresión se hibridizan específicamente con genes constitutivamente expresados presente en la muestra biológica. Virtualmente cualquier gen constitutivamente expresado brinda un diana adecuado para las sondas de control del nivel de expresión. Por lo habitual, las sondas de control del nivel de expresión tienen secuencias complementarias a subseries de "genes de mantenimiento" constitutivamente expresados entre los que se incluyen, ciertos genes de fotosíntesis. Las sondas de "control negativo" no son complementarias a ninguna de los oligonucléotidos de prueba (es decir, los oligonucléotidos relacionados con el gen de la síntesis de polisacárídos de invención) , a los controles de normalización o a los controles de expresión. En una modalidad, el control negativo es un gen de mamífero que no es complementario a ninguna otra secuencia en la muestra. Los términos "fondo" e "intensidad de señal de fondo" se refieren a las señales de hibridación originadas de la unión no específica o de otras interacciones entre los ácidos nucleicos diana marcados (es decir, ARNm presente en la muestra biológica) y de los componentes del arreglo de oligonucléotidos . Las señales de fondo también se pueden producir con la fluorescencia intrínseca de los componentes de arreglos mismos . Se puede calcular una sola señal de fondo para el arreglo completo, o se puede calcular una señal de fondo distinta para cada ácido nucleico diana. En una modalidad, el fondo se calcula como la intensidad de señal de hibridación promedio para el 5 a 10 por ciento mínimo de las sondas de oligonucléotidos que se van a emplear o cuando se calcula una señal de fondo distinta para cada gen diana, para el 5 a 10 por ciento mínimo de las sondas de cada gen. Cuando las sondas de oligonucléotidos correspondientes a un gen particular de la síntesis de polisacáridos se hibridiza bien y, en consecuencia, parece estar unido específicamente a una secuencia diana, estas sondas no se emplean en el cálculo de la señal de fondo. O bien, el fondo se puede calcular como la intensidad de señal de hibridación promedio producida por la hibridación en sondas que no son complementarias a ninguna secuencia encontrada en la muestra (por ejemplo, sondas dirigidas a ácidos nucleicos del sentido opuesto o a genes no encontrados en la muestra) . En métodos de microarreglos, el fondo se puede calcular como la intensidad de señal promedio producida por las regiones del arreglo que de ninguna manera carecen de alguna sonda de oligonucléotidos. c . Métodos basados en PCR En otra modalidad, se emplean métodos basados en PCR para detectar la expresión genética. Estos métodos incluyen la reacción en cadena de polimerasa mediada con la transcriptasa inversa (RT-PCR, reverse-transcriptase-mediated polymerase chain reaction) incluyendo la reacción en cadena de polimerasa mediada con la transcriptasa inversa en tiempo real y de punto final (Q-RTPCR, real-time and endpoint quantitative reverse-transcriptase-media ted polymerase chain reaction) . Estos métodos son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, los métodos de PCR cuantitativa se pueden llevar a cabo utilizando equipos y métodos que están disponibles en el mercado distribuidos por, por ejemplo, Applied BioSystems y Stratagene® . Véase también Kochanowski , QUANTITATIVE PCR PROTOCOLS (Humana Press, 1999) ; Innis et al . , supra . ; Vandeso pele et al . , Genome Biol . 3 : RESEARCH0034 (2002) ; Stein, Cell Mol . Life Sci . 59 : 1235 (2002) .

La expresión genética también se puede observar en solución usando Q-RTPCR. La Q-RTPCR se basa en la detección de una señal fluorescente producida proporcionalmente durante la amplificación de un producto de PCR. Véase Innis et al . , supra . Al igual que el método PCR tradicional, este técnica emplea cebadores de oligonucléotidos para PCR, por lo habitual con un largo de 15 a 30 bases, que hibridizan a hebras opuestas y regiones que flanquean la región de ADN de interés. Además, una sonda (por ejemplo, TaqMan®, Applied Biosystems) se diseña para hibribrizarse hacia la secuencia diana entre los cebadores delantero e inverso tradicionalmente empleados en la técnica PCR. La sonda se marca en el extremo 5' con un fluoróforo indicador como, por ejemplo, 6-carboxifluoresceina (6-FAM) y un fluoróforo extintor de fluorescencia como la 6-carboxi-tetrametil-rodamina (TAMRA) . Siempre y cuando la sonda esté intacta, se presenta la transferencia de energía fluorescente que produce la absorbancia de la emisión de fluorescencia de fluoróforo indicador mediante el fluoróforo extintor de fluorescencia. Sin embargo, conforme la Taq polimerasa extiende el cebador, la actividad intrínseca de la nucleasa en las posiciones 5' a 3' de Taq degrada la sonda, lo que libera el fluoróforo indicador. El incremento en la señal de fluorescencia detectada durante el ciclo de amplificación es proporcional a la cantidad de producto generados en cada ciclo. Los cebadores delantero e inverso de la amplificación y la sonda de hibridación interna están diseñados para hibridarse específica y únicamente con un nucleótido ' derivado del transcripto de un gen diana. En una modalidad, los criterios de selección del cebador y las secuencias de sonda incorporan restricciones en lo que refiere al contenido y tamaño del nucleótido y para satisfacer los requerimientos del análisis TaqMan®. Se puede emplear SYBR Green® como un Q-RTPCR sin sonda alternativo al ensayo tipo Taqman®, discutido en lo anterior. ABI Prism® 7900 Sequence Detection System User Guide Applied Biosystems, capítulos 1-8, App . A-F. (2002). Un dispositivo mide los cambios en la intensidad de la emisión de fluorescencia durante la amplificación por PCR. La medición se efectúa en "tiempo real", es decir, conforme el producto de amplificación se acumula en la reacción. Se pueden emplear otros métodos para medir los cambios en la fluorescencia que se producen por la digestión de sonda. Por ejemplo, la polarización de la fluorescencia puede distinguir entre moléculas grandes y pequeñas basándose en la agitación molecular (véase, por ejemplo, la patente de los EE.UU. No. 5,593,867). d. Métodos de detección de proteínas Las proteínas se pueden observar con cualquier medio conocido en la técnica, entre los que se incluyen métodos inmunológicos, ensayos enzimáticos y arreglos de proteínas técnicas/técnicas proteómicas. La medición del estado traduccional se puede llevar a cabo de acuerdo con varios métodos de proteínas. Por ejemplo, el monitoreo del genoma completo de la proteína (el proteoma) se puede realizar con la construcción de un microarreglo en el cual sitios de unión comprendan anticuerpos inmobilizados, de preferencia monoclonales, específicos a una pluralidad de proteínas que tienen una secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NOs: 30-58 o proteínas codificadas por los genes de SEQ ID NOs: 1-29 o variantes conservativas de las mismas. Véase Wildt et al . , Nature Biotechnol . 18: 989 (2000). Los métodos para elaborar anticuerpos monoclonales o policlonales son bien conocidos en la técnica, y se describen en, por ejemplo, Harlow & Lañe, ANTIBODIES : A LABORATORY MANUAL (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988) . Alternativamente, las proteínas se pueden separar con sistemas de electroforesis bidimensional en gel. La electroforesis bidimensional en gel es bien conocida en la técnica y por lo habitual comprende un enfoque isoeléctrico a lo largo de una primera dimensión seguido por la electroforesis SDS-PAGE a lo largo de una segunda dimensión. Véase, por ejemplo, Hames et al, GEL ELECTROPHORESIS OF PROTEINS : A PRACTICA! APPROACH (IRL Press, 1990) . Los electroferogramas resultantes se pueden analizar con numerosas técnicas, entre las que se incluyen las técnicas espectrométricas de masas, transferencia por adsorción Western y el análisis de inmunotransferencia y con anticuerpos monoclonales y micro secuenciación interna y N-terminal. 3. Correlación de la expresión genética con el fenotipo y el desarrollo de tejido Tal como se ha discutido, la presente invención proporciona métodos y herramientas para correlacionar la expresión genética con el fenotipo de planta. La expresión genética se puede examinar en una planta que tenga un fenotipo de interés y se puede comparar con una planta que no tenga el fenotipo o tenga un fenotipo distinto. Semejante fenotipo incluye, pero sin limitarse a, una tolerancia a la sequía incrementada, resistencia a los herbicidas, una altura reducida o incrementada, ramificado reducido o incrementado, tolerancia mejorada al frío o helada, un mejor vigor, coloración intensificada, características nutricionales y de salud intensificadas, mejor almacenamiento, producción intensificada, una tolerancia intensificada al salitre, una resistencia intensificada de la madera contra la pudrición, una resistencia intensificada contra enfermedades fúngicas, atracción alterada hacia insectos dañinos, tolerancia incrementada a enfermedades, tolerancia incrementada a insectos, tolerancia incrementada a tensión hidráulica, textura mejorada, germinación incrementada, captación de micronutrientes incrementada, producción de resinas novedosas, contenido celulósico incrementado, contenido de lignina incrementado y producción de proteínas o péptidos novedosos . En otra modalidad, el fenotipo incluye uno más de los siguientes atributos : una tendencia a formar una madera de reacción, un periodo reducido de juventud, un periodo incrementado de juventud, ramas de auto-abscisión, un desarrollo reproductivo acelerado o desarrollo reproductivo retrasado . En una modalidad adicional, el fenotipo que se diferencia en las plantas comparadas incluye uno o más de los siguientes atributos: calidad de la lignina, estructura de lignina, composición de la madera, apariencia de la madera, densidad de la madera, solidez de la madera, rigidez de la madera, polimerización de la celulosa, dimensiones de las fibras, tamaño del lumen, proporción de rayos, proporción de elementos de vasos, otros componentes de la planta, división de la célula vegetal, desarrollo de la célula vegetal, número de células por unidad de área, tamaño celular, forma celular, composición de la pared celular, índice de formación de la madera, apariencia estética de la madera, formación de los defectos en el tronco, ángulo promedio de las microfibrillas, ancho de la capa de pared celular S2, tasa de crecimiento, índice de proporción de formación de raíz con respecto al desarrollo vegetativo de la rama, índice de área de hoja y forma de la hoja. El fenotipo puede evaluar con cualquier medio adecuado discutido en lo anterior como, por ejemplo, Hertzberg, supra, Ye and Sundstrom, supra, las publicaciones de solicitud de patente de los EE.UU. Nos. 2002/0107644 y 2002/0113212, Marita et al . , supra . Para aquellos experimentados en la técnica serán evidentes que se pueden hacer varias modificaciones y variaciones en los métodos y composiciones de la presente invención sin alejarse del espíritu y alcance la misma. En consecuencia, se pretende que la presente invención cubra las modificaciones y variaciones de la misma siempre y cuando se encuentren dentro del alcance de las reivindicaciones anexas y de sus equivalentes. Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar la presente invención. Sin embargo, se debe comprender que la presente invención no se limita a las condiciones específicas o detalles descritos en estos ejemplos. Toda la especificación, todas y cada una de las referencias hechas a un documento públicamente disponible, incluyendo una patente de los EE.UU., se incorporan específicamente como referencia en su totalidad.

EJEMPLOS Ejemplo 1 El ejemplo 1 demuestra cómo la celulosa sintasa y genes similares a la celulosa sintasa se aislan y caracterizan en E. grandis y P. radiata . Se extrajo el ARN total de un tejido vegetal (utilizando el protocolo de Chang et al . , Plant Mol . Biol . Rep. 11: 113-116 (1993). Se obtuvieron muestras de tejido vegetal de floema (P) , cámbium (C) , expandiendo el xilema (XI) , y diferenciando y lignificando el xilema (X2) . Se aisló el ARNm de la preparación de ARN total utilizando ya sea un equipo de aislamiento de ARNm Poly (A) Quik { Stratagene, La Jolla , CA) o un Dynal Beads Oligo (dT) ?s (Dynal , Skogen, Norway) . Se construyeron genotecas de expresión del ADNc a partir de ARNm purificado mediante síntesis de transcriptasa inversa seguido por la inserción de los clones de ADNc resultantes en Lambda ZAP haciendo uso de un equipo de síntesis de ADNc ZAP Express (Stratagene®) , de acuerdo con el protocolo de uso del fabricante. Se empacaron los ADNc resultantes utilizando el equipo Gigapack II Packaging Extract (Stratagene®) usando una alícuota (1-5 µL) de la reacción de ligación de 5 µL dependiente de la genoteca. La excisión de masas de la genoteca se realizó empleando células XLl-Blue MRF' y células XLOLR (Stratagene ®) con el fago ayudante ExAssist (Stratagene®) . Los fagémidos excisionados se diluyeron con caldos de cultivo NZY (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) y se colocaron en placas de agar LB-kanamicina que contenían X-gal e isopropiltio-beta-galactosida (IPTG) . De las colonias colocadas en placas y seleccionadas para la minipreparación de ADN, el 99% contenía un inserto adecuado para secuenciación. Las colonias positivas se cultivaron en caldo de cultivo NZY con kanamicina y se purificó el ADNc por medio de lisis alkalina y con precipitación con polietilenglicol (PEG) . Se empleó gel de agarosa al 1% para cribar moldes de secuenciación para la contaminación cromosomal. Se prepararon secuencias de cebador colorante utilizando una máquina Turbo Catalyst 800 (Perkin Elmer/Applied Biosystems División, Foster City, CA) de acuerdo con el protocolo del fabricante . La secuencia de ADN para clones positivos se obtuvo utilizando un secuenciador Perkin Elmer/Applied Biosystems División Prism 377. Primero se secuenciaron los clones de ADNc a partir del extremo 5' y, en algunos casos, también a partir del extremo 3'. Para algunos clones, la secuencia interna se obtuvo utilizando ya sea un análisis de deleción Exonucleasa III, produciendo una genoteca de subclones diferencialmente dimensionados en pBK-CMV, o mediante secuenciación directa utilizando cebadores específicos de un gen designados a regiones identificadas del gen de interés. Las secuencias de ADNc determinadas se proporcionan en SEQ ID NOs: 1-29. Las secuencias de polipéptidos predichas son SEQ ID NOs: 30-58. Para identificar la celulosa sintasa (Ces) y candidatos similares a la celulosa sintasa (Csl) en las bases de datos P. radiata y E. grandis, las secuencias de ADNc se compararon con la superfamilia de la celulosa sintasa de la Arabidopsis . Richmond and Somerville, Plant Physiol . 124: 495 (2000). Enseguida, se emplearon secuencias de dominio público (por SWISS-PROT/TrEMBL ID 's) para hacer una búsqueda en las bases de datos de pino y eucalipto (no redundante por contigo, aproximadamente <1.0e~2). Se obtuvieron 80 coincidencias para el pino y 82 coincidencias para el eucalipto. De estas coincidencias, 26 del pino y 15 del eucalipto fueron longitudes potencialmente completas (es decir, incluida la Met de iniciación) o secuencias de longitudes casi completas. Las secuencias proteínas y las secuencia consenso de cóntigos de ADN después se obtuvieron pata todas las 162 coincidencias y se identificaron las secuencias duplicadas . Después se llevo a cabo un alineamiento múltiple con las secuencias proteínas. Se creó el alineamiento de proteínas utilizando las restantes secuencias 29 del pino y eucalipto junto con los miembros de Arabidopsís, y la 2 calosa sintasas y 2 celulasas. A partir del alineamiento de proteínas, se creó un dendograma. Este dendograma agrupó las coincidencias de secuencia con la familia ees o la familia csl. Estas secuencias se analizaron con un paseo con cebador para proporcionar una secuencia de longitud total (una mejor captación de HT a partir del contigo analizado para secuencia de longitud completa) . Las secuencias de celulosa sintasa de dominio público a partir de maíz, algodón, arroz y álamo también se extrajeron y se compararon con las bases de datos del pino y eucalipto. Las secuencias de pino y eucalipto paseados con cebador y completadas también se compararon con propia secuencia y con de las mejores 500 coincidencias. Esto se realizo de modo que las secuencias se pudieran emplear para realizar una búsqueda adicional y para asegurar que nada en las bases de datos del pino y eucalipto se haya omitido al hacer uso de la superfamilia Arabidopsis . Esta búsqueda produce 4 secuencias adicionales que no se encontraron en las búsquedas anteriores. Estas secuencias después se mandaron buscar una secuencia de longitud completada paseada con un cebador. Después de retirar un pequeño número de duplicados adicionales después del paseo con cebador, se identificaron 30 miembros de pino y eucalipto de la superfamilia de la celulosa sintasa de pino y eucalipto paseados con cebador. La clasificación de estas secuencias como la CES o CSL se confirmó con su alineamiento con ClustalX, el dendograma correspondiente y con el análisis MEME/MAST.

Ejemplo 2 Para identificar el sitio 5 'o 3' de la secuencia adicional de una secuencia parcial de ADNc en una genoteca de ADNc, se realizó una amplificación rápida de los sitios 5 'y 3' de los extremos del ADNc (RACE) , utilizando el equipo de amplificación de ADNc SMART RACE (Clontech Laboratories, Palo Alto, Calif. ) . En términos generales, el método implicó en primer lugar aislar el poli (A) ARNm, realizar la síntesis de la primera y segunda hebra del ADNc para generar un ADNc de doble hebra, cortar en roma los extremos de ADNc, y después ligar el SMART RACE. Colocar un adaptor en el ADNc para formar una genoteca del ADNc de ligado al adaptador. Se diseñaron cebadores específicos para un gen que se emplearon junto con los cebadores específicos adaptadores para las dos reacciones RACE 5' y 3'. Haciendo uso de las reacciones RACE 5' y 3', se obtuvieron fragmentos RACE 5' y 3 ' , se secuenciaron y clonaron. El proceso se puede repetir hasta que se identifiquen los extremos 5' y 3'' del gen de longitud completa. Se puede generar ADNc de longitud completa utilizando PCR con cebadores específicos a los extremos 3 'y 5' del gen mediante PCR tipo de extremo a extremo. Por ejemplo, para amplificar la región 5' faltante de un gen a partir de la primera hebra ADNc, se diseño un cebador 5'?3' a partir de la hebra opuesta de la secuencia molde, y a partir de la región entre aproximadamente 100-200 pb de la secuencia molde. Una amplificación exitosa suministraría una superposición de aproximadamente 100 bp de la secuencia de ADN entre el extremo 5 ' del molde y del producto de PCR. Se extrajo ARN de cuatro tejidos de pino, es decir, plántula, xilema, floema y la raíz estructural haciendo uso del Concert Reagent Protocol { Invitrogen, Carlsbad, CA) y con métodos de aislamiento y extracción estándares. El ARN resultante después se trató con DNasa, empleando lOU/µl de DNasa I {Roche Diagnostics , Basel , Switzerland) . Para 100 µg de ARN, se emplearon 9 µl de amortiguador DNasa lOx { Invitrogen, Carlsbad, CA) , 10 µl de Roche DNasa I y 90 µl de agua libre de Rnasa. El ARN después se incubó a la temperatura ambiente durante 15 minutos y se agregó 1/10 volumen de EDTA 25 mM. Se empleó el miniequipo RNeasy { Qiagen, Venlo, The Netherlands) para la purificación del ARN de acuerdo con el protocolo del fabricante . Para sintetizar el ADNc, se empleó ARN extraído del xilema, floema, plántula y raíz, también se empleó el equipo de amplificación de ADNc SMART RACE (Clontech Laboratories Inc, Palo Al to, CA) siguiendo el protocolo del fabricante. Para la RACE PCR, se combinó el ADNc obtenido de cuatro tipos de tejido. Se creó la mezcla patrón para el PCR al combinar volúmenes iguales de ADNc a partir de tejidos de xilema, floema, plántula y raíz. Se llevaron a cabo reacciones de PCR en placas para PCR de 96 pozos, con 1 µl de cebador de la placa de dilución del cebador (10 mM) correspondiendo con las posiciones de los pozos . Se tomaron alícuotas de 49 µl de la mezcla patrón en la placa para PCR con cebadores. El ciclo térmico comenzó en GeneAmp 9700 {Applied Biosystems, Foster City, CA) en los siguientes parámetros: 94°C (5 seg) , 72°C (3 min) , 5 ciclos; 94°C (5 seg) , 70°C (10 seg) , 72°C (3 min), 5 ciclos; 94°C (5 seg) , 68°C (10 seg) , 72°C (3 min), 25 ciclos. Se separó ADNc en un gel de agarosa siguiendo procedimientos estándares . Se extirparon fragmentos de gel y diluyeron a partir del gel utilizando el equipo de elución gel de 96 pozos Qiagen, siguiendo las instrucciones del fabricante. Los productos de PCR se ligaron en pGEMTeasy { Promega , Madison, Wl) en una placa de 96 pozos durante la noche de acuerdo con las siguientes especificaciones: 60-80 ng de ADN, 5 µl de amortiguador de ligación rápida 2X, 0.5 µl del pGEMT Easy Vector, 0.1 µl de ADN ligasa, llenado hasta 10 µl con agua e incubándolo durante la noche. Cada clon se transformó a E. coli siguiendo procedimientos estándares y se extrajo ADN de 12 clones recolectados siguiendo protocolos estándares. La extracción de ADN y la calidad del mismo se verificaron en un gel con 1% de agarosa. La presencia del inserto de tamaño correcto en cada uno de los clones se determinó mediante digestiones de restricción, empleando la endonucleasa EcoRl de restricción y electroforesis con gel, siguiendo procedimientos estándares. La transformación de clones élite de Eucalyptus con una secuencia de dominio de unión a la UDP-glucosa sentido que se enlaza de manera operable con un promotor constitutivo confiere un fenotipo de crecimiento mejorado, como resulta evidente a partir de los incrementos en la síntesis de la celulosa, síntesis de la pared celular primaria, densidad de la madera y de la resistencia a la tensión. Los explantes de hojas se cosechan a partir de plantas comunes y corrientes de Eucalyptus y los explantes se cultivan en un medio predeterminado. El medio predeterminado comprende auxina, citoquinina y un inductor de Agrobacterium como, por ejemplo, la acetosiringona, para estimular la división celular a lo largo de los bordes extirpados del explante de tejido. Después de cuatro días de precultivo, los explantes se inocularon con la cepa GV2260 que contenía un plásmido que porta una porción del dominio de unión a la UDP-glucosa enlazado de manera operable con un promotor de ubiquitina. Los explantes se co-cultivaron durante 3 días antes de transferirlos a un medio de regeneración de Euc. Los explantes se cultivaron en un medio de regeneración de Euc durante 4 días antes de transferirlos a un medio de selección que contenía un herbicida. Después de la selección de transformantes resistentes al herbicida, los transformantes se sometieron a ensayo para la expresión GUS. Posterior a la confirmación de la expresión GUS, los brotes se cosecharon y transfirieron a un medio de enraizamiento. El medio de enraizamiento comprende sales BTM-1 complementadas con 5 g/l de carbón activado MeadWestvaco Nuchar, y el desarrollo de raíces por lo usual ocurre después de 2 a 4 semanas. Después del desarrollo del sistema de raíces primario, las plantes transformadas se transfieren a la tierra. Las plantas transgénicas de Eucalyptus que portan alguna de SEQ ID NOs. 1-29 enlazada de manera operable a un promotor de ubiquitina exhiben un crecimiento mejorado.

Ejemplo 3 El Ejemplo 3 ilustra un procedimiento para la extracción y purificación de ARN, que es particularmente útil para ARN obtenido de agujas de coniferas, xilema, cámbium y floema . Se obtuvo tejido de agujas de coniferas, xilema, cámbium y floema. El tejido se congeló en nitrógeno líquido y se trituró. El ARN total se extrajo utilizando el reactivo Concert Plant RNA (Invitrogen) . La muestra de ARN resultante se extrajo en fenol: cloroformo y se trató con DNasa. El ARN después se incubó a 65°C durante 2 minutos después de aplica una centrifugación a 4 °C durante 30 minutos. Después de la centrifugación, se extrajo el ARN en fenol por lo menos 10 veces para retirar los contaminantes. El ARN se limpió aún más utilizando columnas RNeasy (Qiagen) . El ARN purificado se cuantificó utilizando el reactivo RiboGreen (Molecular Probes) y se evaluó la pureza mediante electroforesis con gel. El ARN se amplificó utilizando MessageAmp (Ambion) . Se agregaron aminoalil-UTP y UTP libre a la transcripción in vitro del ARN purificado a una proporción de 4:1 de aminoalil-UTP a UTP. El aminoalil-UTP se incorporó en la nueva hebra de ARN conforme se transcribía. El grupo amino-alilo después se hizo reaccionar con tintes Cy para unirlo el marcador colorimétrico al ARN amplificado resultante, utilizando el procedimiento Amersham modificado por utilizarlo con ARN. El tinte no incorporado se retiró mediante precipitación con etanol. El ARN marcado se cuantificó mediante espectrofotografía {NanoDrop®) . El ARN marcado se fragmentó al calentarlo a 95 °C, tal como se describe en Hughes et al . , Nature Biotechnol . 19: 342 (2001) .

Ejemplo 4 El ejemplo 4 ilustra cómo se puede determinar la celulosa sintasa o genes similares a la celulosa sintasa importantes para el desarrollo de la madera en P. radiata y cómo se pueden diseñar oligonucléotidos que se unan únicamente a estos genes y cómo se pueden sintetizar para utilizarlos en un microarreglo. Se hicieron crecer árboles de pino de la especie P. radia ta bajo condiciones de luz natural. Se prepararon muestras de tejido tal como se describe en, por ejemplo, Sterky et al . , Proc . Nat 'l Acad. Sci . 95: 13330 (1998). Específicamente, se recolectaron muestras de tejido a partir de árboles leñosos que tenían una altura de 5 metros. Se prepararon muestras de tejido de los árboles leñosos al tomar secciones tangenciales a través de la región cambial del tronco. Los troncos se seccionaron de manera horizontal en secciones que fluctuaron de joven (parte superior) a madura (parte inferior) . Las secciones del tronco que se encontraban separadas por etapa de desarrollo se separaron aún más en 5 capas al descortezarlas en secciones de floema, floema de diferenciación, cámbium, xilema de diferenciación, xilema en desarrollo y xilema madura. Las muestras de tejido, incluyendo las hojas, retoños, brotes y raíces también se separaron del plantón de la especie P. radiata . Se aisló el ARN y se generaron EST tal como se describe en el Ejemplo 1 o en Sterky et al . , supra . Las secuencias de ácido nucleico de los elementos EST derivados de las muestras que contenían madera en desarrollo se compararon con secuencias de ácido nucleico de genes que se sabía estaban involucrados en la síntesis de polisacáridos. Los EST de las muestras que no contenían madera en desarrollo también se compararon con las secuencias de genes que se sabía estaban involucradas en el ciclo celular de la planta. Se realizó un análisis de hibridación In Silico utilizando BLAST (NCBl) . Las siguientes Tablas 6 y 7 muestran los datos de hibridación In Silicio para la celulosa sintasa y proteínas similares a la celulosa sintasa en E. grandis (Tabla 6) y P. radiata (Tabla 7) .

Tabla 6. Datos de hibridación In Silico para E. grandis Tabla 7. Datos de hibridación In Silico para P. radiata A partir de una examinación adicional se seleccionaron secuencias entre la celulosa sintasa y los genes de proteínas similares a la celulosa sintasa que muestran hibridación in silico para elaborar EST a partir de muestras que contienen madera en desarrollo, pero que no se hibridizan hacia EST a partir de muestra que no contienen madera en desarrollo. Los clones de ADNc que contienen secuencias que se hibridizan hacia los genes que muestran expresión preferida para la madera se seleccionan de genotecas de ADNc utilizando técnicas bien conocidas en la técnica de la biología molecular. Haciendo uso de la información de la secuencia, se diseñan oligonucléotidos, de modo que cada oligonucléotido sea específico para únicamente una secuencia de ADNc en la genoteca. Las secuencias de oligonucléotidos se proporcionan en la Tabla 5. Se diseñaron sondas de más de 60- oligonucléotidos empleando el método de Li y Stormo, arriba citado o utilizando un software como, por ejemplo, Ar ra e s igner , GeneScan y ProbeSelect . Los oligonucléotidos después se sintetizaron in situ tal como se describe en Hughes et al . , Nature Biotechnol . 19: 324 (2002) o tal como se describe Kane et al . , Nucleic Acids Res . 28: 4552 (2000) y se fijaron a un portaobjetos de vidrio activado (Sigma-Genosis, The Woodlands, TX) empleando un ligador 5 'amino. Se conocía la posición de cada oligonucléotido en el portaobjetos.

Ejemplo 5 El Ejemplo 5 ilustra cómo los ARN de tejidos de múltiples especies de pino, en este caso tanto los árboles de pino bronco P. taeda y P. radiata, se seleccionaron a partir del patrón de la expresión genética asociada con el desarrollo de la madera en madera joven y madera madura formando secciones de árboles empleando los microarreglos derivados de las secuencias de ADNC del P. radiata descritas en el Ejemplo 4. Se seleccionaron árboles polinizados abiertos de aproximadamente 16 años de edad de sitios de plantación, en los Estados Unidos para pino bronco y en Nueva Zelanda para pino radiata. Se talaron árboles durante las estaciones de primavera y verano para comparar la expresión de genes asociados con estas distintas etapas de desarrollo de la formación de la madera. Se talaron árboles individualmente y se quitaron secciones del tronco del área inferior aproximadamente de uno a dos metros a partir de la base y dentro de uno a dos metros arriba de la copa. La sección retirada del extremo de la base del tronco contenía madera madura. La sección retirada debajo de la copa contenía madera joven. Las muestras recolectadas durante la estación de primavera se denominaron madera temprana o madera de primavera, mientras que las muestras recolectadas durante la estación de verano se consideraron madera tardía o madera de verano. Larson et al . , Gen . Tech . Rep. FPL-GTR-129. Madison, Wl: U. S . Department of Agriculture, Forest Service, Forest Products Laboratory. p. 42. Los tejidos se aislaron de las secciones del tronco de modo que se retiraron el floema, cámbium, xilema en desarrollo y xilema madura. Estos tejidos se recolectaron sólo del anillo de crecimiento del año actual. Con la remoción del tejido en cada caso, el material se colocó de inmediato en nitrógeno líquido para conservar los ácidos nucleicos y otros componentes. La corteza se descortezó de la sección y se retiró el tejido de floema de la cara interna de la corteza al rasparla con una hoja de afeitar. El tejido de cámbium se aisló de la cara externa de la sección descortezada al rascar gentilmente la superficie. Se aislaron el xilema en desarrollo y el xilema de lignificación al raspar secuencialmente con mayor vigor el tejido restante. Los tejidos se trasladaron del nitrógeno líquido en recipientes para su almacenamiento durante un largo tiempo a -70 °C hasta que se realizó la extracción de ARN y su posterior análisis.

Ejemplo 6 El Ejemplo 6 ilustra procedimientos alternativos a aquellos empleados en el Ejemplo 3 para la extracción y purificación de ARN, particularmente útiles para ARN obtenido de una variedad de tejidos de plantas leñosas y un procedimiento para la hibridación y análisis de datos utilizando los arreglos descritos en el Ejemplo 4. Se aisló el ARN de acuerdo con el protocolo de Chang et al . , Plant Mol . Biol . Rep . 11: 113. Se retiró el ADN empleando DNasa I (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. La integridad de las muestras de ARN se determinó utilizando el equipo Agilent 2100 Bíoanalyzer (Agilent Technologies, EE. UU. ) . Utilizando métodos conocidos 10 µg del ARN total de cada tejido se transcribió de manera inversa ADNc. En el caso del tejido floema del Pinus radiata, puede resultar difícil extraer cantidades suficientes del ARN total para procedimientos de marcado normal . El ARN total se extrajo y trató tal como se describió anteriormente y se amplificaron 100 ng del ARN total empleando el sistema de Ovation® Nanosample RNA Amplification de NuGENTM® (NuGEN, CA, EE.UU.). Alternativamente, se pueden emplear equipos de amplificación similares como, por ejemplo, los que fabrica Ambion. El ARN amplificado se transcribió de manera inversa en ADNc y se marcó tal como se ha descrito en lo anterior. Se efectuaron lavados de hibridación y severidad utilizando el protocolo descrito en la solicitud de patente de los EE.UU. para "Methods and Kits for Labeling and Hybridizing cDNA for Microarray Analysis " (Métodos y equipos para el marcado e hibridación de ADNc para análisis de microarreglo) (supra) a 42 C. Los arreglos (portaobjetos) se exploraron utilizando ScanArray 4000 Microarray Analysis System (GSI Lumonics , Ottawa , ON, Canadá) . Se generaron valores en bruto y no normalizados de la intensidad al hacer uso del software QUANT ARRAY (GSI Lumonics , Ottawa , ON, Canadá) . Se empleó el diseño experimental de bloques incompletos completamente balanceados {Kerr and Churchill, Gen. Res . 123: 123,2001) con el fin de diseñar un experimento de arreglo que permita interferencia estadísticas máximas de los datos analizados. Los datos de la expresión genética se analizaron utilizando el paquete de software SAS® Microarray Solution (The SAS Institute, Cary, NC, EE. UU. ) . Los datos resultantes después se visualizaron empleando el equipo JMP® (The SAS Institute, Cary, NC, EE. UU. ) . El análisis realizado para este experimento fue una metodología ANOVA con una especificación de modelo mezclado { Wolfinger et al . , J. Comp . Biol . 8 : 625-637) . Se aplicaron dos pasos de los modelos mezclados lineales. Primero se aplicó uno, el modelo de normalización para la normalización global a nivel de portaobjetos. Se aplicó el segundo, el modelo genético, para hacer una interferencia estadística rigurosa en cada gen. Ambos modelos se establecen en los Modelos (1) y (2) . loga(TfiKft)~% +Dk *S} +DSM +& (I) S" -D *F+*#* +SSP+«« (2) Yijkis representa la intensidad del punto sa o en el portaobjetos lavo con el tinte kavo aplicando el tratamiento j vo para la línea celular iava. TÍJ, Dk, Si y DSki representan el efecto medio del tratamiento javo, y el efecto de interacción aleatoria del tinte kav0 en el portaobjetos lavo. El vocablo ?ij is es el error estocástico y representa los papeles similares a TÍ , D , Si y Dski, excepto que son específicos para el gen gav0. i?(g)ijkis representa el remanente del gen gavo del modelo (1) . µ±j (g) , Dk(g) , Sx(9) y DS (g) kl representa los papeles similares a TÍJ, Dk, Si y DSk?, excepto que son específicos para el gen gavo. SS(g)?s representa el punto por el efecto aleatorio del portaobjetos para el gen gavo. El vocablo eíg>ijk?s representa el error estocástico. Se asumen que los términos aleatorios se distribuyeron de manera normal y son mutuamente independientes dentro de cada modelo. De acuerdo con el análisis descrito en lo anterior, se descubrió que ciertos ADNc, algunos de los cuales se muestran en la Tabla 4, se expresaron diferencialmente .

Se infiere la intervención de estos genes específicos en el desarrollo de madera a través de la asociación de la regulación ascendente o regulación descendente de los genes con las etapas particulares del desarrollo de la madera. Tanto el desarrollo espacial así como el continuo de la madera a través de una sección (floema, cámbium, xilema en desarrollo y xilema de maduración) en una estación y posición en el tronco del árbol en particulares se consideran cuando se hacen asociaciones de la expresión genética con la relevancia en el desarrollo de la madera.

Ejemplo 7 El Ejemplo 7 demuestra cómo alguien puede correlacionar la expresión genética de oligonucléotidos con los fenotipos de plantas importantes desde el punto de vista agronómico como, por ejemplo, la densidad, rigidez, solidez, distancia entre las ramas y fibra revirada. Se seleccionaron árboles de pino maduros y clonalmente diseminados de entre la progenie de árboles progenitores conocidos por sus características superiores crecimiento y resistencia a enfermedades fúngicas importantes. Se retiró la corteza de la sección tangencial y a los árboles se les examinó su densidad de madera promedio en el quinto anillo anual a la altura del pecho, rigidez y solidez de la madera y la fibra revirada. Los árboles también se caracterizaron por su altura, distancia media entre las principales ramas, tamaño de la copa y bifurcación. Para obtener familias de plantón que se segreguen de genes transcendentales que afectan la densidad, rigidez, solidez, distancia entre las ramas y fibra revirada y otras características que pueden estar vinculadas con alguno de los genes que afectan estas características, se eligieron árboles que no tenían progenitores comunes por cruzas específicas basándose en el criterio que este tipo de árboles exhiben la más amplia variación entre sí con respecto a los criterios de densidad, rigidez, solidez, distancia entre las ramas y fibra revirada. En consecuencia, se emplea polen proveniente de un árbol que exhibe alta densidad, una distancia media entre las principales ramas y una elevada fibra revirada para polinizar conos de árboles plus no relacionados entre las selecciones que exhiben la más baja densidad, más alta distancia media entre las principales ramas y la más baja fibra revirada. Por ejemplo, es útil advertir que se cruzaron "árboles plus" de modo que se empleó polen proveniente de un árbol plus que exhibía una elevada densidad para polinizar conos en desarrollo de otro árbol plus que exhibía una elevada densidad, y se debería emplear polen proveniente de un árbol que exhiba una pequeña distancia media entre las principales ramas para polinizar conos en desarrollo de otro árbol plus que exhiba una pequeña distancia media entre las principales ramas. Se recolectaron semillas de estas polinizaciones controladas y se hicieron crecer de modo que la identidad paternal se mantenga en cada semilla y se empleó una diseminación vegetativa de manera que cada genotipo esté representado por múltiples rametos . La diseminación vegetativa se realizó utilizando una microdiseminación, cortes oblicuos y corte de fascículo. Algunos rametos de cada genotipo se almacenaron mientras los propágulos vegetativos de cada genotipo se hicieron crecer a un tamaño suficiente para el establecimiento de un campo de plantación. Los genotipos se arreglaron en un diseño replicado y se hicieron crecer bajo condiciones de campo donde se midieron y registraron la temperatura y lluvia diarias . Los árboles se midieron en varias etapas para determinar la expresión y segregación de la densidad, rigidez, solidez, distancia entre las principales ramas, fibra revirada y cualquier otra característica observable que pueda estar vinculada con algunos de los genes que afectan dichas características. Las muestras se cosecharon para la caracterización del contenido celulósico, contenido de lignina, ángulo de la microfibrilla de celulosa, densidad, rigidez, solidez, morfología de la traqueida, ancho del anillo, etc. A las muestras también se les examinó la expresión genética, tal como se describió en el Ejemplo 6. Los rametos de cada genotipo se compararon con los rametos del mismo genotipo en distintas etapas para establecer las correlaciones de edad: edad para estas características.

Ejemplo 8 El Ejemplo 8 demuestra cómo las respuestas a las condiciones ambientales como, por ejemplo, la luz y la estación, alteran el fenotipo de planta y se pueden correlacionar con la expresión de los genes de la síntesis de polisacáridos utilizando microarreglos. En particular, se examinaron los cambios en la expresión genética asociados con la densidad de la madera. Se hicieron crecer árboles de tres distintos genotipos híbridos E. grandis clonalmente diseminados en un sitio con una estación metereológica que midió las temperaturas y lluvias diarias. Durante la primavera y del posterior verano, primero se fotografiaron rametos genéticamente idénticos de los tres distintos genotipos con marcadores de orientación norte - sur, empleando una fotografía con una suficiente resolución para mostrar las características de la corteza de porciones jóvenes y maduras de la planta. La edad de los árboles se determinó al tomar registros de la plantación y se confirmó con un conteo de los anillos anuales. En cada uno de estos árboles, se definió la madera madura como los anillos más externos del árbol por debajo de la altura de pecho, y la madera joven como los anillos más internos del árbol por encima de la altura del pecho. Cada árbol se seccionó posteriormente de la siguiente manera: NM - NORTHSIDE MADURO SM - SOUTHSIDE MADURO NT - NORTHSIDE de TRANSICIÓN ST - SOUTHSIDE de TRANSICIÓN NJ - NORTHSIDE JOVEN SJ - SOUTHSIDE JOVEN El tejido se cosechó del tronco de la planta así como de hojas jóvenes y maduras. Las muestras se prepararon simultáneamente para el análisis del fenotipo, incluyendo la morfología del planta y las características bioquímicas para el análisis de la expresión genética. Se tomó registro de la altura y diámetro del árbol en el punto de cada sector y se tomó una muestra del suelo desde la base del árbol para su ensayo químico. Las muestras preparadas para el análisis de la expresión genética se pesaron y colocaron en nitrógeno líquido para la posterior preparación de muestras de ARN para emplearlas en el experimento de microarreglo. Los tejidos se denominaron de la siguiente manera: P floema C cámbium XI Xilema de expansión X2 Xilema de diferenciación y lignificación Se fijaron cortes en rebanadas delgadas en secciones tangenciales y radiales de cada uno de los sectores del tronco, tal como se describe en Ruzin, PLANT MICROTECHNIQUE AND MICROSCOPY, Oxford University Press, Inc . , New York, NY (1999) para la examinación anatómica y confirmación de la etapa en desarrollo de la madera. Se examinó el ángulo de las microfibríllas en distintas etapas de desarrollo de la manera, por ejemplo, en las fases juvenil, de transición y madura de la madera Eucalyptus grandis . Otras características examinadas son la proporción de las fibras con respecto a elementos vasculares y tejido de radios en cada sector. Además, a las muestras se les examinó las características que cambien entre la madera joven y madura y entre la madera de primavera y la madera de verano como, por ejemplo, la morfología de las fibras, tamaño del lumen y el ancho de la capa de polipéptido antagonista de la citoquina S2 (la más gruesa) . Las muestras también se examinaron haciendo mediciones de la densidad en el quinto anillo y con la determinación de módulo de elasticidad empleando técnicas bien conocidas por aquellos experimentados en las técnicas de ensayos de la madera. Véase, por ejemplo, Wang, et al . , Non-destructive Evaluations of Trees, EXPERIMENTAL TECHNIQUES, págs . 28-30 (2000) . Para el análisis bioquímico, 50 gramos de cada una de las muestras cosechadas son congelaron en seco y analizaron, haciendo uso de ensayos bioquímicos bien conocidos por aquellos experimentados en las técnicas de bioquímica vegetal de las cantidades de azúcares simples, aminoácidos, lípidos, otros extractos y de la celulosa. Véase, por ejemplo, Pettersen & Schwandt, J. Wood Chem . & Technol . 11: 495 (1991) . En el presente ejemplo, los fenotipos elegidos para su comparación fueron; la elevada densidad de la madera, densidad promedio de la madera y una baja densidad de la madera. Las muestras de ácidos nucleicos se prepararon tal como se describió en el Ejemplo 3, de árboles cosechados en la primavera y el verano. El perfilamiento de la expresión genética mediante hibridación y el análisis de datos se realizaron tal como se describió en lo anterior. Haciendo uso de técnicas similares y de individuos clonalmente diseminados alguien puede examinar la expresión genética de polisacáridos, ya que se relaciona con otras características complejas de la madera como, por ejemplo, densidad, rigidez, solidez y la distorsión espiral de tejidos en puntos circulares.

Ejemplo 9 El Ejemplo 9 demuestra cómo una celulosa sintasa se puede enlazar a un promotor preferido por un tejido y se puede expresar en pino, lo que produce una planta con una densidad de madera incrementada. El gen de la síntesis de polisacáridos, que tiene un nivel de expresión mucho mayor durante los primeros días de la primavera, se identificó con el método descrito en el Ejemplo 7. Se colocó un constructo de ADN, que tenía un polipéptido relacionado con la densidad unido de manera operable con un promotor, en un vector binario apropiado y se transformó en pino empleando los métodos descritos en este documento. Se transformaron plantas de pino tal como se describe en esta descripción y se emplearon plantas transgénicas de pino para establecer una plantación forestal. Se observó una densidad incrementada incluso en madera de primavera (madera temprana) en las plantas transgénicas de pino en comparación con plantas de pino de control que no se transformaron con el constructo de ADN relaciona con la densidad.

Ejemplo 10 Haciendo uso de técnicas bien conocidas por aquellos experimentados en la técnica de biología molecular, se analizó la secuencia de celulosa sintasa aislada en el Ejemplo 9 en ADN genómico aislado de alfalfa. Esto hizo posible la identificación de un ortólogo en la alfalfa cuya secuencia después se empleó para crear un constructo de knockout de la iARN. Véase, por ejemplo, Austin et al . , . Euphytica 85,381 (1995). Las plantas transgénicas regeneradas mostraron un inferior contenido de fibras y un incrementado contenido de células radiales en el xilema. Estas propiedades mejoran la digestibilidad lo que produce superiores tasas de crecimiento en alimento para ganado basándose en esta alfalfa, en comparación con la alfalfa tipo silvestre de la misma especie.

Ejemplo 11 El Ejemplo 11 demuestra cómo se puede emplear el análisis de la expresión genética para encontrar variantes de gen que se encuentren en plantas maduras que tengan un fenotipo deseable. La presencia o ausencia de semejante variante se puede emplear para predecir el fenotipo de una planta madura, lo que permite el cribado de las plantas en la etapa de plantón. Aunque este ejemplo emplea eucalipto, el método utilizado en esta descripción también es útil en programas de cultivo de pino y otras especies de árboles . La secuencia de un gen putativo relacionado con la densidad se empleó para explorar el ADN genómico aislado de Eucalyptus que fluctúa en densidad, tal como se describió en los ejemplos anteriores. Se examinaron híbridos de Eucalyptus que no se produjeron de manera genética. Un híbrido exhibió una elevada densidad de madera y otro híbrido exhibió una inferior densidad de madera. Se descubrió un marcador molecular en la porción 3' de la región codificante que distinguía una variante de gen de alta densidad a partir de una variante de gen de baja densidad. Este marcador molecular permite a cultivadores de árboles sometan híbridos de Eucalyptus no transgénicos a ensayos para los probables perfiles de densidad mientras que los árboles aún se encuentren en la etapa de plantón, cuando no se cuenta con este marcador, los cultivadores de árboles deben esperar hasta que los árboles crezcan durante varios años antes que se pueda predecir de manera confiable la densidad en la etapa de cosecha. Esto hace posible la plantación forestal selectiva de los mejores árboles en etapa de plantón, en lugar de una operación costosa de raleo y de la erosión resultante en la etapa de tala de árboles. Este marcador molecular además también es útil en el programa de cultivo para determinar qué progenitores deberían dar origen a una progenie de cruza de elevada densidad. También se consideran útiles los marcadores moleculares encontrados en la porción 3 ' de la región codificante del gen que no corresponden a las variantes observadas con mayor frecuencia en árboles híbridos no transgénicos de Eucalyptus de una inferior densidad de madera. Se descubrió que estos marcadores son útiles para la obtención de la huella genética de distintos genotipos de Eucalyptus, que se emplea en el seguimiento de la identidad en el programa de cultivo y en plantaciones .

Ejemplo 12 Este ejemplo describe microarreglos para la identificación de diferencias en la expresión genética que contribuyen con las características fenotípicas que son importantes en madera comercial, principalmente, la apariencia de la madera, rigidez, solidez, densidad, dimensiones de las fibras, aspereza contenido celulósico y de lignina, contenido de extractos, etc. Se talaron árboles leñosos de los géneros que producen productos madereros comercialmente importantes, en este caso Pinus y Eucalyptus, de varios sitios y en varios momentos del año para la recolección y aislamiento del ARN de xilema en desarrollo, cámbium, floema, hojas, brotes, raíces y otros tejidos. También se aisló el ARN de los plantones de los mismos géneros. Se compararon todos los cóntigos con los EST elaborados del ARN aislado de las muestras que contenían madera en desarrollo, así como con las secuencias de los EST elaborados de ARN de varios tejidos que no contenían madera en desarrollo. Se determinó que los cóntigos que contenían principalmente EST mostraron una mayor hibridación in silico para EST elaborados del ARN aislado de muestras que contenían madera en desarrollo en comparación con EST elaborados de ARN aislado de muestras que no contenían madera en desarrollo, en relación con posibles genes novedosos particularmente expresados en madera en desarrollo. Estos cóntigos después se emplearon para realizar búsquedas BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, Herramienta de Búsqueda por Alineamiento Local Básico) en secuencias de dominio público. Para la siguiente etapa se seleccionaron cóntigos que se hibridaron in silico con elevada dificultad hacia genes no conocidos o genes que se considera que tienen únicamente una "proteína hipotética" . Estos cóntigos se consideran genes putativos novedosos que muestran una expresión preferida por la madera. Los clones de ADNc más largos que contenían segunda sección que se hibridizan a genes putativos novedosos que muestra una expresión preferida por la madera se seleccionaron a partir de genotecas de ADNc utilizando técnicas bien conocidas por aquellos experimentados en la técnica de la biología molecular. Los ADNc se secuenciaron y se obtuvieron secuencias de longitud completa que codifican un gen junto con secuencias flanqueadoras no traducidas cuando fue posible. Se seleccionaron estiramientos de 45 a 80 nucleótidos (u oligonucléotidos) de cada una de las secuencias de genes putativos novedosos que mostraban una expresión preferida por la madera, de modo que cada sonda de oligonucléotidos se híbrido en una severidad elevada hacia la secuencia representada en los EST elaborados a partir de ARN aislado de árboles o plantones del mismo género. Después químicamente se sintetizaron oligómeros y colocaron sobre un portaobjetos de microarreglo, tal como se describió en el Ejemplo 4. Cada oligómero era correspondiente a una secuencia en particular de un gen putativo novedoso que mostraba una expresión preferida por la madera y no hacia otro gen cuya secuencia se representa entre los EST elaborados a partir de ARN aislado de árboles o plantones del mismo género. La preparación e hibridación de las muestras se llevó a cabo de la misma manera que en el Ejemplo 4. La técnica empleada en esta ejemplo es más efectiva que el uso de un microarreglo empleado sondas de ADNc, debido a que la presencia de una señal representa una evidencia importante de la expresión de gen particular, en lugar de cualquier número de genes que pudieran contener similitudes con el ADNc debido a dominios funcionales conservados o a la historia común evolutiva. Por consiguiente, es posible diferenciar genes homólogos como, por ejemplo, aquellos en la misma familia, pero que se puedan tener distintas funciones en la determinación del fenotipo. Con estos datos de hibridación, obtenidos empleando el método del Ejemplo 6, el usuario puede identificar cuáles genes putativos novedosos que realmente posee un patrón de expresión coordinada con genes conocidos, un patrón de expresión congruente con un papel evolutivo particular y/o un patrón de expresión que sugiera que el gen tiene un promotor que conduce la expresión de una manera valiosa. Los datos de hibridación obtenidos empleando este método se pueden utilizar para, por ejemplo, identificar un gen putativo novedoso que muestre un patrón de expresión particular hacia las traqueidas con el más bajo ángulo de las microfibrillas de celulosa en madera de primavera en desarrollo (madera temprana) . El promotor de este gen también se puede aislar de la misma manera que se muestra en el Ejemplo 8, y se puede unir de manera operable con el gen que se ha mostrado en el Ejemplo 9 que se va a asociar con madera tardía (madera de verano) . Las plantas transgénicas de pino que contenían este constructo se generaron empleando los métodos del Ejemplo 9 y la madera temprana de estas plantas después mostró diversas características de madera tardía como, por ejemplo, un superior ángulo de las micro fibrillas, una superior densidad, un inferior tamaño de lumen promedio, etc.

Ejemplo 13 El Ejemplo 13 demuestra el uso de un promotor específico al xilema unido funcionalmente a un gen de la síntesis de polisacáridos para incrementar la biomasa de una planta. Se identificaron los transcriptos de la síntesis de polisacáridos específicos al xilema de distintas capas vasculares secundarias, tal como se describe en el Ejemplo 6. Se clonaron promotores candidatos enlazados a los genes correspondientes a estos transcriptos a partir de un ADN genómico de pino empleando, por ejemplo, el equipo BD Clontech GenomeWalker y se evaluaron en tabaco transgénico vía un o varios ensayos de reportero para la especificidad/preferencia hacia el cámbium. Se empleó el promotor específico al xilema que sobreexpresa un gen de la síntesis de polisacáridos involucrado en la división celular del xilema secundario con el fin de incrementar la biomasa de la madera. También se construyó un promotor específico al xilema que condujo un marco de lectura abierto del gen de la síntesis de polisacáridos. Los niveles de transcripto mejorados del gen candidato de la síntesis de polisacáridos produjo un incremento en el fenotipo de biomasa del xilema. Si bien se describió la presente invención haciendo referencia a modalidades ilustrativas, aquellos experimentados en la técnica comprenderán que se pueden hacer varios cambios y se pueden substituir varios equivalentes con elementos de los mismos sin alejarse del alcance de la invención. Además, se pueden hacer muchas modificaciones para adaptar una situación o material en particular a las enseñanzas de la presente invención sin alejarse del espíritu esencial de la misma. En consecuencia, se pretende que la presente invención no se vea limitada a la modalidad particular descrita como la mejor manera contemplada de llevar a cabo esta invención. Todas las referencias y publicaciones citadas en esta descripción se incorporan en sus totalidades como referencia.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada a partir del grupo formado por SEQ ID NOs: 1-29 o variantes conservativas de las mismas .
2. El polinucleótido según la reivindicación 1, en donde la secuencia de ácido nucleico seleccionada a partir del grupo formado por SEQ ID NOs: 1-2, 7-14, 16-18, 20-21, 24-25 y 27-30 y de variantes conservativas de las mismas .
3. El polinucleótido aislado según la reivindicación 1, en donde el polinucleótido tiene una secuencia que es idéntica a una secuencia comprendida en un gen expresado en una planta de tipo silvestre de una especie de Eucalyptus o Pinus .
4. El polinucleótido aislado según la reivindicación 1, en donde la variante tiene una identidad de secuencia que es superior o igual a 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91 %, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81 %, 80%, 79%, 78%, 77%, 76%, 75%, 74%, 73%, 72%, 71 %, 70%, 69%, 68%, 67%, 66%, 65%, 64%, 63%, 62%, 61 % ó 60% con cualquiera de SEQ ID NOs: 1-29.
5. El polinucleótido aislado según la reivindicación 4, en donde la variante codificante tiene una identidad de secuencia que es superior o igual a 60%, 70%, 80%, 85%, 90% 95% con cualquiera de SEQ ID NOs: 1-29.
6. El polinucleótido aislado según la reivindicación 5, en donde la variante codifica una proteína con una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia que es superior o igual a 60%, 70%, 80%, 85%, 90% ó 95% con cualquiera de SEQ ID NOs: 30-58, y en donde la proteína codificada por el polinucleótido posee la actividad de la proteína codificada por cualquiera de SEQ ID NOs: 1-29.
7. Una célula vegetal transformada con el polinucleótido aislado según la reivindicación 1.
8. Una planta transgénica que comprende el polinucleótido aislado según la reivindicación 1.
9. Un constructo de ADN que comprende por lo menos un polinucleótido que tiene la secuencia de cualquiera de SEQ ID NOs: 1-29 y de las variantes conservativas de las mismas.
10. El constructo de ADN según la reivindicación 9, en donde además comprende un promotor, en donde el promotor y el polinucleótido están unidos de manera operable .
11. El constructo de ADN según la reivindicación 10, en donde el promotor se selecciona a partir del grupo formado por un promotor constitutivo, un promotor poderoso, un promotor inducible, un promotor regulable, un promotor temporalmente regulado y un promotor preferido por un tejido .
12. El constructo de ADN según la reivindicación 9, en donde el polinucleótido codifica un transcripto de ARN.
13. El constructo de ADN según la reivindicación 12, en donde el polinucleótido se encuentra en una orientación sentido o antisentido en relación con el promotor.
14. El constructo de ADN según la reivindicación 12, en donde el transcripto de ARN induce la interferencia por ARN de un polinucleótido que tiene una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo formado por SEQ ID NOs: 1-29.
15. Una célula vegetal transformada con el constructo de ADN según la reivindicación 14.
16. Una planta transgénica que comprende la célula vegetal según la reivindicación 15.
17. Un método para la elaboración de una planta transformada que comprende la acción de transformar una célula vegetal con el constructo de ADN según la reivindicación 14; cultivar la célula vegetal transformada bajo condiciones que promueven el crecimiento de una planta.
18. Una célula vegetal transformada con el constructo de ADN según la reivindicación 9.
19. Una planta transgénica que comprende la célula vegetal según la reivindicación 18.
20. La planta transgénica según la reivindicación 19, en donde un fenotipo de la planta es distinto al fenotipo de una planta de la misma especie que no ha sido transformada con el constructo de ADN.
21. La planta transgénica según la reivindicación 20, en donde un fenotipo que es distinto en la planta transgénica se selecciona a partir del grupo formado por calidad de la lignina, estructura de lignina, composición de la madera, apariencia de la madera, densidad de la madera, solidez de la madera, rigidez de la madera, polimerización de la celulosa, dimensiones de las fibras, tamaño del lumen, proporción de rayos, proporción de elementos vasculares, división de la célula vegetal, desarrollo de la célula vegetal, número de células por unidad de área, tamaño celular, forma celular, composición de la pared celular, índice de formación de la madera, apariencia estética de la madera, formación de defectos en el tronco, ángulo promedio de las microfibrillas, ancho de la capa de pared celular S2, tasa de crecimiento, índice de proporción de formación de raíz con respecto al desarrollo vegetativo de la rama, índice de área de hoja y forma de la hoja.
22. La planta transgénica según la reivindicación 19, en donde la planta es una plata leñosa.
23. La planta transgénica según la reivindicación 22, en donde la planta es un árbol.
24. La planta transgénica según la reivindicación 23, en donde la planta es de una especie de Eucalyptus o Pinus .
25. La planta transgénica según la reivindicación 19, en donde la planta exhibe uno o más atributos seleccionados del grupo formado por una incrementada tolerancia a la sequía, resistencia a los herbicidas, una altura reducida o incrementada, ramificado reducido o incrementado, tolerancia mejorada al frío o helada, un mejor vigor, coloración intensificada, características nutricionales y de salud intensificadas, mejor almacenamiento, producción intensificada, una tolerancia intensificada al salitre, una resistencia intensificada de la madera contra la pudrición, una resistencia intensificada contra enfermedades fúngicas, atracción alterada hacia insectos dañinos, tolerancia incrementada a enfermedades, tolerancia incrementada a insectos, tolerancia incrementada a tensión hidráulica, textura mejorada, germinación incrementada, captación incrementada de micronutrientes, producción de resinas novedosas, contenido celulósico incrementado, contenido de lignina incrementado y producción de proteínas o péptidos novedosos, en comparación con una planta de la misma especia que no ha sido transformada con el constructo de ADN.
26. La planta transgénica según la reivindicación 19, en donde la planta exhibe uno o más atributos seleccionados del grupo formado por un periodo reducido de juventud, un periodo incrementado de juventud, tendencia a formar madera de reacción, ramas de auto-abscisión, un desarrollo reproductivo acelerado o desarrollo reproductivo retrasado, en comparación con una planta de la misma especie que no haya sido transformada con el constructo de ADN.
27. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia que codifica el dominio catalítico o de unión al substrato de un polipéptido seleccionado de cualquiera de SEQ ID NOs: 30-58, en donde el polinucleótido codifica un polipéptido que tiene la actividad del polipéptido seleccionado de cualquiera de SEQ ID NOs: 30-58.
28. Un método para la elaboración de una perfil de expresión que comprende la acción de transformar una célula vegetal con un constructo de ADN que comprende por lo menos un polinucleótido que tiene la secuencia de cualquiera de SEQ ID NOs: 1-29 y la acción de cultivar la célula vegetal transformada bajo condiciones que promuevan el crecimiento de una planta.
29. El método según la reivindicación 28, en donde el constructo de ADN además comprende un promotor, en donde el polinucleótido y el promotor están unidos de manera operable.
30. El método según la reivindicación 28, en donde el o los polinucleótidos codifican una proteína que se selecciona a partir del grupo formado por celulosa sintasa y por una proteína similar a la celulosa sintasa.
31. El método según la reivindicación 28, en donde la célula vegetal se ubica dentro de un tejido explante de una planta .
32. El método según la reivindicación 28, en donde la planta transformada exhibe un fenotipo que es distinto al de una planta de la misma especie que no haya sido transformada con el constructo de ADN.
33. El método según la reivindicación 28, en donde el fenotipo que es distinto en la planta transformada se selecciona a partir del grupo formado por calidad de la lignina, estructura de lignina, composición de la madera, apariencia de la madera, densidad de la madera, solidez de la madera, rigidez de la madera, polimerización de la celulosa, dimensiones de las fibras, tamaño del lumen, proporción de rayos, proporción de elementos vasculares, división de la célula vegetal, desarrollo de la célula vegetal, número de células por unidad de área, tamaño celular, forma celular, composición de la pared celular, índice de formación de la madera, apariencia estética de la madera, formación de defectos en el tronco, ángulo promedio de las microfibrillas, ancho de la capa de pared celular S2, tasa de crecimiento, índice de proporción de formación de raíz con respecto al desarrollo vegetativo de la rama, índice de área de hoja y forma de la hoja.
34. El método según la reivindicación 28, en donde la planta transgénica exhibe uno o más atributos, se selecciona a partir del grupo formado por una incrementada tolerancia a la sequía, resistencia a los herbicidas, una altura reducida o incrementada, ramificado reducido o incrementado, tolerancia mejorada al frío o helada, un mejor vigor, coloración intensificada, características nutricionales y de salud intensificadas, mejor almacenamiento, producción intensificada, una tolerancia intensificada al salitre, una resistencia intensificada de la madera contra la pudrición, una resistencia intensificada contra enfermedades fúngicas, atracción alterada hacia insectos dañinos, tolerancia incrementada a enfermedades, tolerancia incrementada a insectos, tolerancia incrementada a tensión hidráulica, textura mejorada, germinación incrementada, captación incrementada de micronutrientes, producción de resinas novedosas, contenido celulósico incrementado, contenido de lignina incrementado y producción de proteínas o péptidos novedosos, en comparación con una planta de la misma especia que no ha sido transformada con el constructo de ADN.
35. Madera obtenida a partir del árbol transgénico que se ha transformado con el constructo de ADN según la reivindicación 9.
36. Pulpa de madera obtenida a partir del árbol transgénico que se ha transformado con el constructo de ADN según la reivindicación 9.
37. La pulpa de madera según la reivindicación 36, en donde el constructo de ADN comprende una secuencia nucleótida que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NOs: 30-58..
38. Un método para la elaboración madera, el método comprende : transformar una planta con el constructo de ADN que comprende un polinucleótido que tiene una secuencia de ácido nucleico seleccionada a partir del grupo formado por SEQ ID NOs: 1-29 o variantes conservativas de las mismas; cultivar la planta transformada bajo condiciones que promuevan el crecimiento de una planta; y obtener madera a partir de la planta.
39. Un método para la elaboración de pulpa de madera, el método comprende: transformar una planta con el constructo de ADN que comprende un polinucleótido que tiene una secuencia de ácido nucleico seleccionada a partir del grupo formado por SEQ ID NOs: 1-29 o variantes conservativas de las mismas; cultivar la planta transformada bajo condiciones que promuevan el crecimiento de una planta; y obtener pulpa de madera a partir de la planta.
40. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por el polinucleótido aislado según la reivindicación 1.
41. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo formado por SEQ ID NOs: 30-58.
42. Un método para alterar un fenotipo de planta de una planta, el método comprende alterar la expresión en la planta de un polipéptido codificado por cualquiera de SEQ ID NOs: 1-29.
43. El método según la reivindicación 42, en donde la expresión se regula en forma ascendente, regula en forma descendente, se hace imperceptible o se regula a través de un proyecto.
44. El método según la reivindicación 42, en donde la planta es una planta leñosa.
45. El método según la reivindicación 42, en donde el fenotipo de planta se selecciona a partir del grupo formado por calidad de la lignina, estructura de lignina, composición de la madera, apariencia de la madera, densidad de la madera, solidez de la madera, rigidez de la madera, polimerización de la celulosa, dimensiones de las fibras, tamaño del lumen, proporción de rayos, proporción de elementos vasculares, división de la célula vegetal, desarrollo de la célula vegetal, número de células por unidad de área, tamaño celular, forma celular, composición de la pared celular, índice de formación de la madera, apariencia estética de la madera, formación de defectos en el tronco, ángulo promedio de las microfibrillas, ancho de la capa de pared celular S2, tasa de crecimiento, índice de proporción de formación de raíz con respecto al desarrollo vegetativo de la rama, índice de área de hoja y forma de la hoja.
46. El método según la reivindicación 41, en donde la planta exhibe uno o más atributos seleccionados a partir del grupo formado por tolerancia incrementada a la sequía, resistencia a los herbicidas, una altura reducida o incrementada, ramificado reducido o incrementado, tolerancia mejorada al frío o helada, un mejor vigor, coloración intensificada, características nutricionales y de salud intensificadas, mejor almacenamiento, producción intensificada, una tolerancia intensificada al salitre, una resistencia intensificada de la madera contra la pudrición, una resistencia intensificada contra enfermedades fúngicas, atracción alterada hacia insectos dañinos, tolerancia incrementada a enfermedades, tolerancia incrementada a insectos, tolerancia incrementada a tensión hidráulica, textura mejorada, germinación incrementada, captación incrementada de micronutrientes, producción de resinas novedosas, contenido celulósico incrementado, contenido de lignina incrementado y producción de proteínas o péptidos novedosos, en comparación con una planta de la misma especia que no ha sido transformada con el constructo de ADN.
47. Un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada a partir del grupo formado por SEQ ID NOs: 59-83.
48. El polinucleótido según la reivindicación 47, en donde el polinucleótido está compuesto por menos por aproximadamente 100 bases de nucleótidos.
49. Un método para correlacionar la expresión genética en dos distintas muestras, el método comprende: detectar en una primera muestra el nivel de expresión de uno o más genes que codifican un producto codificado por una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo formado por SEQ ID NOs: 1-29 y de las variantes conservativas de la misma en una primera muestra; detectar en una segunda muestra el nivel de expresión de ese o esos genes; comparar el nivel de expresión del o los genes en la primera muestra con el nivel de expresión del o los genes en la segunda muestra; y correlacionar una diferencia en el nivel de expresión del o los genes entre la primera y segunda muestras .
50. El método según la reivindicación 49, en donde la primera muestra y la segunda muestra son cada una de un distinto tipo de tejido vegetal.
51. El método según la reivindicación 49, en donde la primera muestra es madera normal y la segunda muestra es madera de reacción.
52. El método según la reivindicación 49, en donde la primer muestra y la segunda muestra son del mismo tejido, y en donde la primera muestra y la segunda muestra cada una se cosechan durante una distinta estación del año.
53. El método según la reivindicación 49, en donde la primera muestra y la segunda muestra se obtienen de plantas en distintas etapas de desarrollo.
54. Un método para correlacionar la posesión de un fenotipo de planta con el nivel de expresión genética en la planta de uno o más genes, el método comprende: detectar el nivel de expresión del o los genes que codifican un producto codificado por una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo formado por SEQ ID NOs: 1-29 y de las variantes conservativas de las mismas en una primera planta que posee un fenotipo; detectar el nivel de expresión de uno o más genes en una segunda planta que carece del fenotipo; comparar el nivel de expresión del o los genes de la primera planta con el nivel de expresión del o los genes den la segunda planta; y correlacionar una diferencia en el nivel de expresión del o los genes entre la primera y segunda plantas con la posesión del fenotipo.
55. Un método para correlacionar la expresión genética con la tendencia a formar madera de reacción, el método comprende : detectar el nivel de expresión de uno o más genes que codifican un producto codificado por una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo formado por SEQ ID NOs: 1-29 y de las variantes conservativas de la misma en una primera célula vegetal en xilema que muestra un fenotipo de madera normal; detectar el nivel de expresión del o los genes en una segunda célula vegetal en xilema que muestra un fenotipo de madera de reacción; comparar el nivel de expresión del o los genes en las primeras células vegetales con el nivel de expresión del o los genes en las segundas células vegetales; y correlacionar una diferencia en el nivel de expresión del o los genes entre la primera y segunda muestras con la tendencia a formar madera de reacción.
56. El método según la reivindicación 54, en donde tanto la primera como la segunda plantas son de una misma especie seleccionada a partir del grupo formado por Eucalyptus y Pinus .
57. El método según la reivindicación 54, en donde la primera y segunda plantas o células vegetales son de una especie seleccionada a partir del grupo formado por Eucalyptus grandis o Pinus radiata .
58. El método según la reivindicación 54, en donde el paso de detección se efectúa empleando uno o más polinucleótidos capaces de hibridarse a una secuencia de ácido nucleico seleccionada a partir del grupo formado por SEQ ID NOs: 1-29 bajo condiciones estándares de hibridación.
59. El método según la reivindicación 54, en donde el paso de detección se efectúa empleando uno o más productos genéticos codificados por una secuencia de ácido nucleico seleccionada a partir del grupo formado por SEQ ID NOs: 1-29 bajo condiciones estándares de hibridación.
60. El método según la reivindicación 54, en donde el paso de detección se efectúa mediante la hibridación hacia un ácido nucleico marcado.
61. El método según la reivindicación 57, en donde uno o más polinucleótidos se marcan con un marcador genético.
62. el método según la reivindicación 58, en donde el o los polinucleótidos se hibrida con una región 3' no traducida de uno o más genes.
63. El método según la reivindicación 59, en donde el o los polinucleótidos se hibrida con una región 3' no traducida de uno o más genes .
64. El método según la reivindicación 58, en donde el o los polinucleótidos comprenden una secuencia de ácido nucleico seleccionada a partir del grupo formado por SEQ ID NOs: 59-83.
65. El método según la reivindicación 59, en donde el o los polinucleótidos comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada a partir del grupo formado por SEQ ID NOs: 59-83.
66. El método según la reivindicación 58, en donde el o los polinucleótidos se seleccionan a partir del grupo formado por ADN o ARN .
67. El método según la reivindicación 59, en donde el o los polinucleótidos se seleccionan a partir del grupo formado por ADN o ARN.
68. El método según la reivindicación 54, que además comprende, antes de los pasos de detección, el paso de amplificar uno o más genes en la primera y segunda plantas o células vegetales .
69. El método según la reivindicación 54, que además comprende, antes de los pasos de detección, el paso de marcado de uno o más genes en la primera y segunda plantas o células vegetales con un marcador genético.
70. Una combinación para detectar la expresión de uno o más genes que comprende dos o más oligonucléotidos, en donde cada olígonucléotido es capaz de hibridarse hacia una secuencia de ácido nucleico seleccionada a partir del grupo formado por SEQ ID NOs : 1-29.
71. Una combinación para detectar la expresión de uno o más genes que comprende dos o más oligonucléotidos, en donde cada oligonucléotido es capaz de hibridarse hacia producto genético codificado por una secuencia de ácido nucleico seleccionada a partir del grupo formado por SEQ ID NOs: 1-29.
72. La combinación según la reivindicación 70, en donde cada uno de los dos o más oligonucléotidos se hibrida con una de las secuencias distinta de ácido nucleico seleccionadas a partir del grupo formado por SEQ ID NOs: 1-29.
73. La combinación según la reivindicación 71, en donde cada uno de los dos o más oligonucléotidos se hibrida con una secuencia nucleótida codificada secuencia distinga de ácido nucleico seleccionadas a partir del grupo formado por SEQ ID NOs: 1-29.
74. La combinación según la reivindicación 71, en donde por lo menos uno de los dos o más oligonucléotidos se hibrida con una región 3' no traducida de una secuencia de ácido nucleico seleccionada a partir del grupo formado por SEQ ID NOs: 1-29.
75. La combinación según la reivindicación 71, en donde por lo menos uno de los dos o más oligonucléotidos se hibrida con una secuencia de ácido nucleico que es complementaria a una región 3' no traducida de una secuencia de ácido nucleico seleccionada a partir del grupo formado por SEQ ID NOs: 1-29.
76. La combinación según la reivindicación 70, en donde cada uno de los dos o más oligonucléotidos está compuesto por un poco más de aproximadamente 100 bases de nucleótidos .
77. La combinación según la reivindicación 70, en donde por lo menos uno de los dos o más oligonucléotidos comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada a partir del grupo formado por SEQ ID NOs: 59-83.
78. La combinación según la reivindicación 71, en donde por lo menos uno de los dos o más oligonucléotidos comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada a partir del grupo formado por SEQ ID NOs: 59-83.
79. La combinación según la reivindicación 70, en donde cada uno de los dos o más oligonucléotidos se hibrida con un gen que codifica una proteína seleccionada a partir del grupo formado por celulosa sintasa y una proteína similar a la celulosa sintasa.
80. La combinación según la reivindicación 71, en donde cada uno de los dos o más oligonucléotidos se hibrida con una secuencia de ácido nucleico codificada por un gen que codifica una proteína seleccionada a partir del grupo formado por celulosa sintasa y una proteína similar a la celulosa sintasa.
81. La combinación según la reivindicación 79, en donde cada uno de los dos o más oligonucléotidos se hibrida con un gen que codifica a una proteína distinta.
82. La combinación según la reivindicación 80, en donde cada uno de los dos o más oligonucléotidos se hibrida con una secuencia de ácido nucleico codificada por un gen que codifica a una proteína distinta.
83. La combinación según la reivindicación 79, en donde cada uno de los dos o más oligonucléotidos se hibrida con un distinto gen.
84. La combinación según la reivindicación 80, en donde cada uno de los dos o más oligonucléotidos se hibrida con una secuencia de ácido nucleico codificada por un distinto gen.
85. La combinación según la reivindicación 70, que donde comprende de aproximadamente 2 a 5,000 de los dos o más oligonucléotidos.
86. La combinación según la reivindicación 70, en donde cada uno de los dos o más oligonucléotidos se marca con un marcador genético.
87. Un microarreglo que comprende la combinación según la reivindicación 70 provisto en un soporte sólido, en donde cada uno de los dos o más oligonucléotidos ocupa un sitio único en el soporte sólido.
88. Un método para detectar uno o más genes en una muestra, el método comprende: poner en contacto la muestra con dos o más oligonucléotidos, en donde cada oligonucléotido es capaz de hibridarse hacia un gen que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo formado por SEQ ID NOs: 1-29 bajo condiciones estándares de hibridación; y detectar uno o más genes de interés que se hibridan hacia uno o más oligonucléotidos .
89. Un método para detectar una o más secuencias de ácido nucleico codificadas por uno o más genes en una muestra, el método comprende: poner en contacto la muestra con dos o más oligonucléotidos, en donde cada oligonucléotido es capaz de hibridarse hacia una secuencia de ácido nucleico codificada por un gen que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo formado por SEQ ID NOs: 1-29 bajo condiciones estándares de hibridación; y detectar la o las secuencias de ácido nucleico que se hibridan con uno o más oligonucléotidos.
90. El método según la reivindicación 88, en donde cada uno de los dos o más oligonucléotidos se hibrida con un gen que comprende una secuencia de ácido nucleico distinta de las secuencias de ácido nucleico seleccionadas a partir del grupo formado por SEQ ID NOs: 1-29.
91. El método según la reivindicación 89, en donde cada uno de los dos o más oligonucléotidos se hibrida con una secuencia de ácido nucleico codificada por un gen que comprende una secuencia distinta de las secuencia de ácido nucleico seleccionadas a partir del grupo formado por SEQ ID NOs: 1-29.
92. El método según la reivindicación 88, en donde por lo menos uno de los dos o más oligonucléotidos se hibrida con una región 3 ' no traducida de un gen que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada a partir del grupo formado por SEQ ID NOs: 1-29.
93. El método según la reivindicación 89, en donde por lo menos uno de los dos o más oligonucléotidos se hibrida con una secuencia de ácido nucleico que es complementaria a una región 3 ' no traducida de un gen que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada a partir del grupo formado por SEQ ID NOs: 1-29.
94. El método según la reivindicación 88, en donde cada uno de los dos o más oligonucléotidos está compuesto por un poco más de aproximadamente 100 bases de nucleótidos.
95. El método según la reivindicación 88, en donde por lo menos uno de los dos o más oligonucléotidos comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada a partir del grupo formado por SEQ ID NOs: 59-83.
96. El método según la reivindicación 89, en donde por lo menos uno de los dos o más oligonucléotidos comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada a partir del grupo formado por SEQ ID NOs: 59-83.
97. El método según la reivindicación 88, en donde cada uno de los dos o más oligonucléotidos se hibrida con un gen que codifica una proteína seleccionada a partir del grupo formado por celulosa sintasa o una proteína similar a la celulosa sintasa.
98. El método según la reivindicación 89, en donde cada uno de los dos o más oligonucléotidos se hibrida con una secuencia de ácido nucleico codificada por un gen que codifica una proteína seleccionada a partir del grupo formado por celulosa sintasa o una proteína similar a la celulosa sintasa.
99. El método según la reivindicación 97, en donde cada uno de los dos o más oligonucléotidos se hibrida con un gen que codifica una proteína distinta.
100. El método según la reivindicación 98, en donde cada uno de los dos o más oligonucléotidos se hibrida con una secuencia de ácido nucleico codificada por un gen que codifica una proteína distinta.
101. El método según la reivindicación 88, en donde los dos o más oligonucléotidos se proporcionan en un soporte sólido, en donde cada uno de los dos o más oligonucléotidos ocupa un sitio único en el soporte sólido.
102. El método según la reivindicación 101, en donde el soporte sólido comprende de aproximadamente 2 a 5,000 de los dos o más oligonucléotidos.
103. El método según la reivindicación 88, en donde además comprende; antes del paso de poner en contacto, el paso de amplificar uno o más genes o secuencias de ácido nucleico en la muestra.
104. El método según la reivindicación 88, en donde además comprende; antes del paso de poner en contacto, el paso de marcado de uno o más genes o secuencias de ácido nucleico en la muestra.
105. Un equipo para detectar la expresión genética que comprende el microarreglo según la reivindicación 87 junto con uno o más amortiguadores o reactivos para la reacción de hibridación de nucleótidos.