MXPA05011714A

MXPA05011714A - Prevencion de una infeccion por hiv-1 mediante la inhibicion de la reorganizacion y/o la alteracion del contenido de los dominios con balsas de la membrana celular, mediadas por rho.

Info

Publication number: MXPA05011714A
Application number: MXPA05011714A
Authority: MX
Inventors: Real Gustavo Del
Original assignee: Consejo Superior Investigacion
Priority date: 2003-04-30
Filing date: 2004-04-30
Publication date: 2006-04-27
Also published as: WO2004096194A2; US20070082942A1; BRPI0409822A; EP1618874A2; WO2004096194A9; WO2004096194A3; CA2522089A1

Abstract

El presente invento se refiere en general a la prevencion o retraso de una infeccion retroviral mediante el uso de agentes que previenen la agregacion de receptores retrovirales asociados con los dominios con balsas de las membranas celulares. El presente invento se refiere mas concretamente a la prevencion o tratamiento de una infeccion por HIV-1 mediante el uso de agentes que inhiben la activacion de Rho-A, actuando sobre la actividad de GTPasa o sobre la isoprenilacion de proteinas. El presente invento se refiere tambien a la prevencion o retraso de una infeccion por HIV-1 mediante el desplazamiento de los receptores para citoquinas de los dominios con balsas de las membranas celulares.

Description

PREVENCIÓN DE UNA INFECCIÓN POR HTV-1 MEDIANTE LA INHIBICIÓN DE LA REORGANIZACIÓN Y/O LA ALTERACIÓN DEL CONTENIDO DE LOS DOMINIOS CON BALSAS DE LA MEMBRANA CELULAR, MEDIADAS POR Rho PRIORIDAD Esta solicitud reivindica la prioridad de la solicitud provisional de EE.UU., serie 60/466.429, presentada el 30 de Abril de 2.003 CAMPO TÉCNICO El presente invento se refiere en general a la prevención o retraso de una infección retroviral mediante la administración de agentes que previenen la agregación de receptores retrovirales asociada con los dominios con balsas (del inglés, "rafl domams") de las membranas celulares. El presente invento se refiere más concretamente a la prevención o tratamiento de una infección por HTV-1 mediante el uso de agentes que inhiben la activación de Rho-A actuando sobre la actividad de GTPasa o sobre la isoprenilación de proteínas. El presente invento se refiere también a la prevención o retraso de una infección por HTV-1 mediante el desplazamiento de los receptores para citoquinas de los doniinios con balsas de las membranas celulares. Más en particular, el presente invento se refiere al uso de inhibidores de la isoprenilación de proteínas en el tratamiento de una infección por HTV, tal como el HTV-1, y de infecciones retrovirales genéticamente relacionadas (y del síndrome de inmunodeficiencia adquirida resultante, SIDA).

ANTECEDENTES La información que se proporciona a continuación no se admite que constituya la técnica anterior del presente invento, pero se proporciona para ayudar al lector a su comprensión. La membrana plasmática es una estructura especializada que canaliza e integra la información que fluye de manera continua entre una célula y su entorno. La membrana plasmática celular constituye también la primera barrera frente a una infección producida por patógenos intracelulares. De manera contraria a la consideración de la membrana plasmática como una estructura fosfolipídica homogénea cargada con proteínas, la última década ha puesto de relieve la heterogeneidad de las fases que conforman la membrana plasmática. En particular, la evidencia acumulada indica que dominios lipidíeos especializados, denominados balsas, desempeñan papeles fundamentales en la regulación de un conjunto de procesos celulares, que van desde la transducción de señales hasta las entradas de infecciones con patógenos intracelulares (Simons, K y Toomre, D (2000) Nat Rev. Mol. Cell Biol. 1.31-39; Brown, D. y London, E. (2000) J. Biol. Chem. 275, 17221-17224; Manes, S. y col. (2001) Semin. Immunol. 13, 147-157; Mellado, M. y col. (2001) Annu. Rev. Immunol. 19, 397-421). La evidencia actual apoya la idea de un papel principal de la estructura de los dominios con balsas en la regulación de las diferente interacciones entre los componentes de la membrana. Además, la evidencia apoya la idea de un papel para los dominios con balsas en la infectividad y propagación de patógenos, incluyendo de manera particular los virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) (Mañes, S. y col. (2003) Nat. Rev. Immunol. 3, 557- 568). La organización de los Iípidos en una membrana está en gran medida determinada por la fase de la bicapa. Las diferentes fases de las membranas lipídicas representan estados físicos que difieren en el empaquetamiento, el grado de orden y la movilidad de los Iípidos constituyentes (Brown, D. y London. E. (1998) J. Membr. Biol. 164, 101-114; Rietveld, A. y Simons, K. (1998) Biochim. Biophys. Acta 1376, 467-479; Brown, D. (2001) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 98, 10517-10518. Las dos fases extremas son la fase líquido-cristalina de gel cuasi sólida (Ic) y la fase líquida desordenada (¾). Las bicapas homogéneas formadas a partir de fosfolípidos o esfingolípidos purificados, exhiben una transición brusca, dependiente de la temperatura entre la fase de gel y la fase desordenada, que se produce a una temperatura de fusión característica (Tm) (del inglés, "melting temperature"). Esta separación de fases en la membrana es consecuencia de la capacidad de empaquetamiento diferencial de los esfingolípidos y los fosfolípidos. Los esfingolípidos contienen largas cadenas de acilo enormemente saturadas, que confieren una Tm mucho más alta que las que poseen los glicerofosfolípidos, que son ricas en cadenas de acilo insaturadas y curvadas. Por lo tanto, las bicapas glicerolipídicas se encuentran en una fase l¿ muy fluida y sus Iípidos presentan una movilidad rotacional y una movilidad lateral altas. Por el contrario, las membranas enriquecidas con esfingolípidos están muy ordenadas, teniendo sus lípidos densamente empaquetados y con una movilidad fuertemente reducida en el plano de la bicapa. En presencia de colesterol, las bicapas lipídicas también pueden adoptar una tercera fase intermedia denominada fase liquida-ordenada (í0). Cuando está presente en una bicapa, el colesterol tiende a ocupar los espacios situados entre las cadenas hidrocarbonadas saturadas de los lípidos (Smaby, J.. y col., (1996) Biochemistry 35, 5696-5704). Alineándose con los fosfolípidos y esfingolípidos, la presencia de colesterol en las membranas aumenta el orden de las cadenas hidrocarbonadas pero, lo que es más importante, disminuye la formación de las fases de gel (Bittman, . (1997) Subcell. Biochem. 28, 145-171). Por consiguiente, la fase L, se caracteriza por una sustancial movilidad lateral y rotacional de los lípidos. Estudios sobre modelos de membranas apoyan la idea de que las fases I0 e Ic podrían coexistir en las membranas biológicas. En estas bicapas artificiales, el colesterol se reparte preferencialmente con lípidos de alta Tm en el interior de los dominios de membranas I0, mientras que se separa de los dornmios de fase I_ enriquecidos en lípidos de baja Tm (Sanharam, M. y Thompson, T. (1991) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88, 8686-8690; Ahmed, S. y col., (1997) Biochemistry 36, 10944- 10953. De acuerdo con esto, en bicapas lipídicas complejas, tales como la membrana plasmática, se piensa que el colesterol se asocia con lípidos que contienen cadenas hidrocarbonadas saturadas en el interior de dominios con balsas de las membranas (Ge, M. y col. (1999) Biophys. J. 77, 925-933). Los dominios con balsas pueden por lo tanto definirse como membranas en la fase ¾>, o en un estado con propiedades similares, resultantes del empaquetamiento lateral preferencia! de lípidos de alta Tm y de colesterol en la hoja externa de la bicapa. La hipótesis de las balsas expone que la separación de dominios discretos de fases liquidas-ordenadas y de fases líquidas desordenadas tienen lugar en membranas que contienen cantidades suficientes de esfingolípidos y esteróles, tales como la membrana celular plasmática. Aunque estudios realizados en membranas celulares apoyan este concepto, la existencia de balsas, sin embargo, no ha sido aún demostrada de manera concluyente en membranas celulares. No obstante, algunas estrategias sugieren con fuerza que las membranas celulares no contienen balsas. Estos métodos incluyen la insolubilidad en detergentes dependiente del contenido en colesterol y la co-localización de proteínas y lípidos agregados independientemente en parches sobre la superficie celular (Brown, D. y London, E. supra), la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) entre proteínas ancladas a glicosilfosfatidil-inositol (GPI) (del inglés, "GlycosylPhosphatidyl Inositol") (Varma, R. y Mayor, S. (1998) Nature 394, 798-801; Kenworthy, A. y col., (2000) Mot Biol. Cell. 11, 1645-1655), seguimiento de partículas individuales (Pralle, A. y col, (2000) J. Cell. Biol. 48, 997-1007), y microscopía de moléculas individuales (Schütz, G. Kada, G. Pastushenko, V. y Schindler, H. (2000) EMBO J. 19, 892-901). Las estimaciones del tamaño de las balsas varía desde unos cuantos nanómetros a micrometros (Varma, R. y Mayor, S. supra; Kenworthy, A. y col., supra; Pralle, A. y col., supra; Schütz, G. y col., supra). Esto sugiere que las balsas de las células probablemente son más complejas que las de las membranas de los modelos. Una estrategia bioquímica frecuentemente utilizada para identificar dominios con balsas en membranas celulares es la purificación de membranas resistentes a detergentes (DRM) en gradientes de densidad de flotación. Este método se basa en la insolubilidad relativa de las bicapas lipídicas de fase lo en detergentes no iónicos tales como Tritón X-100 a bajas temperaturas (Brown, D. y London E. (1997) Biochem. Biophys. Res. Commun. 240, 1-7). Esta propiedad se ha demostrado en sistemas de membranas artificiales bifásicas lo/Id, en los que la insolubilidad en detergente se correlaciona con el contenido de la fase lo de la membrana (Dietrich, C. y col. (2001) Biophys. J. 80, 1417-1428). Estudios realizados en membranas artificiales indican también que algunos de los lípidos abundantes en las DRM, tales como el colesterol, en realidad se requieren para mantener y/o asociar los dominios lo (Dietrich, C, y col. supra). Además de su composición específica en lípidos, las DRM están enriquecidas en varias clases de proteínas (Simons, K. y Toomre, D.) (Fig. 1). Las proteínas ancladas a GPI constituyen una de las principales clases de proteínas asociadas a balsas, unidas a la hoja exoplásmica de la membrana plasmática a través de un resto de fosfatidü-inositol. Las cadenas de acilo y alquilo de GPI generalmente están saturadas de acuerdo con su afinidad por membranas lo y por asociaciones de balsas (Dietrich, C. y col. (2001) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 98, 10642-10647). Las proteínas citoplásmicas doblemente adiadas son otra clase importante de proteínas asociadas a DRM. Incluyen miembros específicos de la familia de las src-quinasas y determinados tipos de subunidades Ga de GTPasas heterotriméricas. Se piensa que estas proteínas se anclan a través de sus cadenas de acilo, muy probablemente de ácido palmítico saturado (Resh, M. (1999) Biochim. Biophys. Acta 1451, 1-16; Liang, X. y col. (2001) J. Biol. Chem. 276, 30987-30994). Por el contrario, tanto las proteínas que se extienden por la membrana como las proteínas preniladas son difíciles de acomodar en un entorno ordenado. Realmente, las DRM tienen una cantidad relativamente escasa de proteínas de transmembrana y contienen niveles muy bajos de proteínas preniladas (Melkonian, K. y col. (1999) J. Biol. Chem. 274, 3910-3917). No obstante, algunas proteínas de transmembrana están también enriquecidas en las DRM. La palmitoilación contribuye a que algunas proteínas de transmembrana se dirijan a las DRM (Melkonian, . y col. (1999) supra), aunque no todas las proteínas de transmembrana palmitoiladas se encuentran en DRM. Además, la secuencia del dominio de extensión por la membrana puede afectar al reparto de las DRM (Persch, A. y col. (1995) J. Cell Sci. 108, 1033-1041; Scheiffele, P. y col., (1997) EMBO J: 16, 5501-5508). Sin embargo, las mutaciones en dominios citoplásmicos puede también afectar a la asociación de proteínas de transmembrana con las DRM (Polyak, M. y col. (1998) J. Immunol. 161, 3242-3248), incluso cuando las CYTOPLSMIC TAELS colas citoplásmicas probablemente no interaccionan directamente con la bicapa lipídica. Una posibilidad para explicar estas observaciones es que esos mutantes citoplásmicos no son capaces de interaccionar con sus parejas de unión, que dirigen y/o anclan las proteínas de transmembrana naturales en las balsas lipídicas (Brückner, K. y col. (1999) Neuron 22, 511-524; Oliferenko, S. y col., (1999) J. Cell. Biol. 146, 843-854; Machleidt, T. y col. (2000) J. Cell. Biol. 148, 17-28). Las DRM representan agregaciones de membranas post-lisis y por lo tanto es difícil hacer comparaciones cuantitativas entre las DRM y las balsas naturales (London, E. y Brown, D. (2000) Biochim. Bipohys. Acta 1508 182-195). Como se ha comentado anteriormente, se han utilizado nuevas estrategias técnicas diferentes para analizar la estructura y la dinámica de las balsas en células vivas y/o fijadas. El seguimiento de partículas individuales utilizando anticuerpos conjugados con oro coloidal demostró que el gangliósido GM1 y la proteína asociada a las balsas, Thy-1) estaban confinados transitoriamente a zonas del interior de la mebrana plasmática (Sheets, E. y col. (1997) Biochemistry 36, 12449-12458). Recientemente, la medida del movimiento lateral de moléculas individuales, ya sean lípidos (Schütz, G. y col., (2000) EMBO J. 19, 892-901) o proteínas (Pralle, A. (2000) J. Cell Biol. 48, 997-1007) asociados o no a las balsas, demostró el confinarniento de marcadores específicos en membranas liquidas-ordenadas situadas en la superficie de células vivas. El reparto de las moléculas dentro y fuera de las balsas en estos estudios fue muy dinámico, pero por lo menos algunas proteínas de las balsas residieron en el interior de las balsas durante varios minutos. Mientras que las zonas de confinamiento detectadas mediante seguimiento de moléculas individuales coinciden en experimentos independientes, los análisis de FRET de marcadores de balsas proporcionan por el contrario resultados controvertidos. En realidad, las medidas de proximidad entre proteínas ancladas a GPI indicaron en algunos casos que los marcadores asociados a balsas están concentrados en microdoininios de la membrana plasmática de una manera sensible a colesterol (Varrna, Y. y Mayor, S. (1998) Nature 394, 798-801; De Angelis, D. y col., (1998) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 95, 12312-12316). En otros estudios, sin embargo la FRET detectada entre proteínas ancladas a GPI y el glicoesfíngolípido GM1 se correlacionó con la densidad en superficie del marcador de balsas (Kenworthy, A. y col. (2000) Mol. Biol. Cell 11, 1645-1655), un hallazgo que no concuerda con la agregación en microdominios. Por lo tanto, aunque algunos marcadores de balsas podrían encontrarse en una proximidad de submicrómetros en la membrana, no están confinados en balsas estabilizadas. Las discrepancias no se han resuelto todavía. Una estrategia ampliamente utilizada para TO PROBE la presencia de balsas en células vivas es la manipulación de los niveles de lípidos que forman las balsas. En algunos casos esta estrategia se utiliza como una "estrategia funcional" para demostrar la implicación de las balsas en una función celular particular. El agotamiento de colesterol es un método perfectamente documentado para romper la estructura de los dominios con balsas (Simons, K. y Toomre, D. (2000) supra). Fármacos de unión a esteróles, toxinas o detergentes son capaces de secuestrar al colesterol. Las ciclodextrinas se utilizan a menudo para rebajar los niveles de colesterol drásticamente o, si están formando un complejo con el colesterol, para introducir el colesterol en exceso en el interior de las membranas celulares ( eller, P. y Simons K. (1998) J. Cell. Biol., 140, 1357-1367). De todas maneras, el tratamiento con ciclodextrinas debe realizarse por espacios cortos de tiempo ya que el fármaco afecta tanto a la membrana plasmática como a los orgánulos intracelulares conectados a ella cuando se aplican durante varias horas a las células (Hansen, G y col., (2000) J. Biol. Chem. 275, 5136-5142; Grimmer, S. y col., (2000) Mol. Biol. Cell. 11, 4205-4216). Rebajar los niveles de esfingolípidos en la membrana plasmática mediante tratamiento de las células con inhibidores de la biosíntesis de esfingolípidos o mediante su degradación con esfingolielinasa bacteriana, también rompe la asociación con D M de varios marcadores de balsas (Scheiffele, P. y col., (1997) supra\ Hanada, K. y col. (1995) J. Biol. Chem. 270, 6254-6260). De manera notable, las DRM pueden incluso formarse en ausencia de glicoesfingolípidos. Esto se demostró utilizando una línea células deficiente en síntesis de glicoesfingolípidos (Ostermeyer, A. y col., (1999) J. Biol. Chem. 274, 34459-34466). Es interesante destacar que estas células produjeron cantidades aumentadas de esfingomielina posiblemente para compensar la disminución de lipidos que prefieren las balsas o para mantener ordenados los dominios con balsas de las membranas. En conjunto, las alteraciones en el estado de los esfingolípidos de las células no son predecibles como sucede con el colesterol. La evidencia anteriormente comentada dibuja la membrana plasmática como un equilibrio dinámico entre dominios en las fases ordenadas de balsas y en las fases desordenadas de no balsas. Sin embargo, el uso de detergentes distintos de Tritón X-100 ha sugerido que las células de mamífero pueden tener diferentes subtipos de balsas en la superficie. Esta intrigante posibilidad proviene de la observación originaria de Madore y colaboradores (Madore, N. y col. (1999) EMBO J. 18, 6917-6926) que mostraron que dos proteínas de las células neuronales, ancladas a glicofosfatidñ-inositol, Thy-1 y una proteína prión, podía asignarse a membranas extraídas de modo diferente, con Tritón X-100 y con Brij 96. Asimismo, en células epiteliales se ha descrito la presencia de dos subtipos de balsas basándose en la insolubilidad diferencial en detergentes; las balsas insolubles en Lubrol (pero solubles en Tritón X-100) y las balsas insolubles en Tritón X-100 (Roper, K. y col. (2000) Nat. CeU. Biol. 2, 582-592). Aunque la integridad de los dos subtipos de balsas propuestas es dependiente de colesterol, por ahora se desconoce la dependencia potencial de distintas especies de esfingolípidos que tienen estos dominios. Sin embargo, en los linfocitos T se han identificado dos subtipos diferentes de balsas basándose en la composición en glicoesfingohpidos. Estudiando la polarización de células T inducida por un quimioatractor, Gómez-Mounton y colaboradores (Gómez-Mounton, C. y col., (2001) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 98, 9642-9647) encontraron que proteínas de membrana, tales como el receptor de quindoquina CXCR4 o el receptor de plasminógeno, se repartían de manera específica en balsas enriquecidas en GM3 mientras que otras proteínas, tales como las moléculas de adhesión intercelular ICAM-1 o CD44, se repartían mayoritariamente en balsas enriquecidas en GM1. Las balsas enriquecidas en GM1 y las balsas enriquecidas en GM3 son iguales de sensibles a la extracción de colesterol pero también igual de resistentes a la extracción con diferentes detergentes. Es importante indicar que las células usan la segregación de proteínas hacia diferentes subtipos de balsas para dirigir a proteínas específicas hacia localizaciones de la membrana espacialmente restringidas. En verdad, una alta densidad de balsas enriquecidas con proteínas-priones se encuentran en el cuerpo celular, mientras que las balsas que contienen Thy-1 se encuentran mayormente en las neuritas (Madore, N. y col., (1999) EMBO J. 18, 6917-6926); las balsas insolubles en lubrol, de células epiteliales, están asociadas selectivamente a las micro-vellosidades, pero permanecen separadas de las balsas planares, insolubles en Tritón (Roper, K. y col., (2000) Nat. Cell. Biol., 2, 582-592); por último, las balsas enriquecidas en GM3 transportan proteínas específicas de membrana y proteínas de citoesqueleto hasta el borde conductor de linfocitos migratorios, mientras que las balsas basadas en GM1 portan receptores de adhesión célula-célula para el urópodo, en la parte posterior de células T. Aunque se propuso que las balsas eran una señal de separación en la red del trans-Golgi para organizar las proteínas y lípidos en superficies celulares específicas de células epiteliales y neuronales polarizadas (Simons, K. y Toomre, D. (2000), supra; Rodriguez-Boulan, E. y González, A. (1999) Trends Cell Biol. 9,291-294), se ha hecho de cada vez más evidente que las balsas lipídicas ejercen una influencia multifacetada sobre diferentes procesos celulares que incluyen la proliferación (mokuchi, J. y col. (2000) Glycoconj. J. 17, 239-245), apoptosis (Grassme, H. y col., (2001) J. Biol. Chem. 276, 20589-20596), migración (Manes, S. y col., (1999) EMBO J.5 18, 6211-6220; Khanna, . y col., (2002) J. Clin. Invest, 109, 205-211), adhesión (Krauss, . y Altevogt, P. (1999) J. Biol. Chem. 274, 36921-36927; Lacalle, R. y col., (2002) J. Cell Biol. 157, 277-289), e infección por patógenos (van der Goot, F. y Harder, T. (2002) Semin. Tmmunol. 13, 89-97), entre otros (para una revisión más general, véanse Simons, . y Toomre, D. (2000) supra; Brown, D. y London, E. (2000) J. Biol. Chem. 275, 17221-17224; Mañes, S. y col., (2003) Nat. rev. Immunol. supra). Los dominios con balsas participan en estas acciones fisiológicas principalmente mediante la regulación espacial y temporal de las interacciones proteína-proteína requeridas para llevar a cabo estos procesos. Ciertamente, una importante característica general de las balsas parece que es la de estabilización de múltiples interacciones débiles que se producen después de un estímulo (Simons, K. y Toomre, D. (2000), supra). Esta propiedad, junto con la elevada movilidad de las unidades de las balsas en el plano de la membrana, puede facilitar la interacción (o aumentar la eficiencia) entre diferentes parejas de transducción de señales, como se ha revisado en lo que antecede, entre diferentes receptores celulares implicados en la entrada de patógenos o de toxinas. Pueden contemplarse varias posibilidades en las que las balsas actúan como dispositivos que controlan las interacciones proteína-proteína en las membranas (Fig. 2). Considerando el tamaño más pequeño de las balsas, una determinada balsa puede contener solamente un número bajo de proteínas. Por lo tanto, una etapa importante en la iniciación de estos procesos es la capacidad de las pequeñas balsas individuales para agregarse en balsas más grandes. Este proceso de coalescencia lleva a los componentes de la maquinaria asociados en la balsa a otra plataforma de mayor tamaño, en donde puede tener lugar el encuentro entre dos proteínas anteriormente separadas en la balsa. Estas balsas más grandes pueden ser más estables que los dominios con balsas más pequeñas, las proteínas de la balsa pueden inducir la estabilización del citoesqueleto de actina subyacente (Oliferenko, S. (1999) J. Cell. Biol. 146, 843-854; Villalba, M. y col., (2001), J. Cell. Biol., 155, 331-338), lo cual podría además multiplicar las fuerzas de atracción y promover la asociación de complejos funcionales que inducirían una respuesta coordinada (Lacalle, R. y col. (2002) supra). Es importante señalar que las agregaciones de proteínas asociadas en las balsas permanecen separadas de las asociaciones de proteínas de membrana no asociadas a las balsas, cuando ambos tipos de proteína son inducidos artificialmente a que se junten (Harder, T. y col., (1998) J. Cell Biol., 141, 929-942). Por lo tanto, la segregación espacial de las proteínas del interior de membranas con diferente separación de las fase puede prevenir interacciones ebtre componentes de las balsas y componentes que no son de las balsas. Además, las proteínas asociadas a las balsas pueden separarse en diferentes subtipos de balsas que contienen grupos específicos de proteínas. Como se ha comentado anteriormente, la coalescencia de las balsas parece tener lugar sólo entre el mismo subtipo de balsa, por lo tanto, las interacciones proteína-proteína en la membrana plasmática pueden controlarse no sólo mediante la separación espacial de los componentes entre balsas y no balsas, sino también mediante el reparto de cada componente en subtipos de balsas específicos. Las balsas también pueden controlar interacciones entre proteínas secuestrando un elemento particular de la membrana, residiendo inicialmente en una región menos ordenada de la membrana, dentro de un dominio con balsas preexistente. Esto podría tener lugar arrastrando a una proteína hacia el interior de las balsas, mediante interacciones mediadas por proteínas, o cambiando su afinidad por las fases líquidas-ordenadas. La oligomerización es un factor bien documentado que aumenta la afinidad de un componente de la membrana por las balsas (Harder, T. y col. (1998) J. Cell Biol. 141, 929-942). La monitorización de las balsas en células vivas sugiere que al menos algunos componentes de las balsas están en equilibrio dinámico con membranas sin balsas. Por consiguiente, para todo elemento de las balsas existe un coeficiente de reparto que determina la fracción del marcador de las balsas que reside dentro o fuera de las balsas. El intercambio de componentes de las balsas con regiones circundantes sin balsas probablemente se restringiría a los límites entre los dominios de membrana. Al igual que la relación del área superficial con respecto a la circunferencia depende del tamaño de la balsa, las cinéticas de intercambio dependerán también del tamaño de la balsa. Por lo tanto, la oligomerización de una proteína de membrana que tiene un intercambio alto entre regiones de membrana con balsas y sin balsas, puede estabilizar la asociación de estas proteínas dentro de dominios con balsas-ordenados de la membrana. De manera alternativa, las balsas pueden formarse de novo alrededor de proteínas de transmembraba oligomerizadas, una vez que son lo suficientemente estables para residir en estos dominios ordenados. La entrada de virus con cubierta puede dividirse en tres etapas: la unión del virus al receptor(es) de superficie celular específico, el cambio conformacional en la proteína de fusión viral, y la reacción de fusión propiamente dicha de las membranas celulares del virus y del hospedador. La proteína g l60 de la cubierta (Env) (del inglés, "Envelope") del HTV-1 es una proteína integral de membrana de tipo I que media en la unión del virus y en la fusión de las membranas. Sintetizada en forma de un único precursor polipeptídico que forma trímeros, Env se escinde para generar dos subunidades asociadas no covalentemente, gpl20 y gp41. La subunidad gpl20 se une al receptor principal de superficie celular, específico para HIV-1, CD4 (Maddon, P. y col. (1986) Cell 47, 333-348). Aunque la unión a CD4 es un prerrequisito para la entrada del HTV-1, la unión del virus per se es insuficiente para mediar la infección viral. Se ha observado que algunos miembros de la familia de receptores de quimioquinas actúan como co-receptores necesarios para la entrada del HIV-1 (Berger, E. y col., (1999) Annu. ev. Immunol. 17, 657-700). La interacción inicial con CD4 promueve cambios conformacionales en gpl20, lo cual da lugar a regiones crípticas de la glicoproteína viral por interacción adicional con un miembro de la familia de receptores de quimioquinas. Este segundo evento de unión conduce a la fusión de la membrana del hospedador y de la membrana viral mediante un proceso mediado por gp41 (Berger, E. y col., (1999) Annu Rev. Immunol., 17, 657-700; Doms, R. y Trono, D. (2000) Genes Dev. 14, 2677-2688). La utilización de los receptores de quimioquinas varía dependiendo de la cepa viral y es el determinante principal del tropismo viral. Las cepas más principales de HIV-1 usan el receptor CCR5 de quimioquinas junto con el receptor CD4 para la entrada del virus (denominadas cepas R5 del virus). En algunos individuos, los virus evolucionan de manera que usan un receptor relacionado, CXCR4, ya sea en lugar del receptor CCR5 (cepas X4 del virus) o además del receptor CCR5 (cepas R5X4). Aunque el descubrimiento de los receptores de quimioquinas como receptores esenciales para la entrada del HTV ha proporcionado un gran poder explicativo para el entend miento del tropismo y de la patogénesis virales, todavía faltan algunas piezas cruciales del puzzle. Ciertamente, algunas moléculas de superficie celular modulan la susceptibilidad a una infección por HIV-1, incluso aunque esas moléculas no interaccionen directamente con la Env viral. Por ejemplo, el entrecruzamiento de CD26, CD28 o CD44 aumenta la permisividad de las células frente al HIV-1, mientras que CD38, disminuye la susceptibilidad a la infección (Callebaut, C. y col., (1993) Science 275, 2045-2050; Dukes, C. y col. (1995) J. Virol. 69, 4000-4005; Savarino, A. y col., (1999) FASEB J. 13, 2265-2276). Es possibles que estas moléculas modulen la entrada de HTV-1 de manera indirecta regulando la densidad de los receptores virales. Además, la fusión entre la membrana viral y la membrana de las células hospedadoras es un proceso cooperativo que requiere la suma de múltiples complejos de co-receptores CD4-gpl20. En la actualidad se estima que cuatro de cada seis receptores CCR5 (Kuhmann, S y col., (2000) J. Virol. 74, 71305-7015) multiplican las moléculas de CD4 (Layne S. y col., (1990) (Nature 346, 277-279), y que tres de cada seis trímeros de Env son necesarios para formar un poro de fusión. Parece por lo tanto, que la infección por HTV-l depende de múltiples interacciones intermoleculares sobre la superficie celular; CD4 unido a gpl20 debe encontrar el co-receptor apropiado sobre la superficie celular y, por lo tanto, diferentes complejos de co-receptores CD4-gpl20 deben agregarse para llevar a cabo la fusión de las membranas viral-celular. La consecuencia lógica es que moléculas de la superficie celular del hospedador o rutas de señalización que promueven o previenen estos eventos de agregaciones, impactarían en la tasa y en la eficiencia de la entrada del virus. En este sentido, la remodelación de actina mediada por GTPasas de Rito puede desempeñar un papel central en estos eventos de agregación. En verdad, la unión de HTV-1 a la superficie celular desencadena la activación específica de Rho-A, un evento crucial para la entrada del virus. Informes recientes sugieren que los dominios de balsas pueden actuar como una estructura en la que tienen lugar estas asociaciones laterales. En primer lugar, estudios fisicoquímicos han demostrado la interacción directa de gpl20 con glicoesfingolípidos definidos Harause J. y col. (1991) Science, 253, 320-323; Yabi, N. y col. (1992) J. Virol. 66 4848-4854; Hammache, D. y col. (1998) J. Biol Chem, 273, 7967-7971; Hammache, D. y col., (1999) J. Virol. 73, 5244-5248), sugiriendo que algunas etapas de la entrada del virus tienen lugar en los dominios de balsas. Además, la inhibición de la síntesis de glicoesfingolípidos (Hug, IP. y col. (2000) J. Virol. 74, 6377- 6385) y los anticuerpos anti-glicoesfingolípidos (Harouse, J. y col., (1991) Science 253, 320-323) previenen la infección in vitro por HTV-I, indicando que la interacción de gpl20 con glicoesfingolípidos es importante para la infección del virus. En segundo lugar, el tratamiento de las células con fármacos que secuestran el colesterol, y que rompen las membranas lo, inhibe la infección por HTV-I in vitro (Mañes, S. y col. (2000) EMBO Rep. 1, 190-196; Liao, Z. y col. (2001) AIDS Res. Hum. Retroviruses 17, 1009-1019) e in vivo ( hanna, K. y col. (2002) J. Clin. Invest. 109, 205-211), indicando que la dinámica de las balsas puede influir de modo espectacular sobre la eficiencia de la entrada del virus. En tercer lugar, el direccionamiento de CD4 hacia una fracción de membrana sin balsas impide la entrada de HTV-l, aunque este muíante de CD4 se une a la Env viral con la misma afinidad que el CD4 de tipo salvaje (del Real, G. y col., (2002) J. Exp. Med., suprd . Esta evidencia indica con fuerza que la entrada del virus tiene lugar debido al reparto de receptores para HTV dentro de la misma fase de membrana. En este sentido, mientras que la asociación de CD4 con las balsas está perfectamente establecida (Xavier, R. y col., (1998) Tmmunity 8, 723-732), el reparto de receptores de quimioquinas en las balsas es un asunto a debatir. Se ha informado que los co-receptores CCR5 y CXCR4 de HIV-1 se co-purifican en la fracción de DRM después de la agregación de ligandos o de la inducida por gpl20 (Manes, S. y col. (2001) Semin. Immunol. 13,147-157; Gómez Mounton, C. y col., (2001) Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 98, 9642-9647; Manes, S. y col., (1999) EMBO J., 18, 6211-6220, Mañes S. y col (2000) EMBO Rep, 1, 190-196; Sorice, M. y col., (2001) FEBS Letters 506, 55-60). Además, CCR5 y CXCR4 señalan las balsas (Mellado M. y col., (2001) suprd) y están constitutivamente asociadas con otras proteínas de las balsas tales como CD4 (Xiao, X. y col. (1999) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 96, 7496-7501). De manera importante, la co-localización de CXCR4 con CD4 tiene lugar en el subtipo de balsa enriquecida con GM3 (Gómez-Mounton, C. y col., (2001) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 98, 9642- 9647; Sorice, M y col. (2001) FEBS Letters 506, 55-60). Por último, la inhibición de la síntesis de glicoesfíngolípidos reduce los niveles de CCR5 en la membrana celular (Hug, IP. y col. (2000) J. Virol. 74, 6377- 6385), sugiriendo que la asociación temprana de CCR5 con las balsas es necesaria para el transporte correcto del receptor. Aunque varias evidencias funcionales sugieren que el HTV-1 explota los dominios de membrana con balsas del hospedador como portales de entrada, el mecanismo exacto que subyace en este proceso está siendo sólo elucidado. Los dominios con balsas del hospedador pueden ser usados por el virus para regular espacial y temporalmente la interacción entre gpl20, Cd4 y el co-receptor CXCR4 o CCR5 (Mañes, S. y col., EMBO Rep., 1, 190-196; del Real, G. y col., (2002) supra) (Fig. 3). Según este modelo, la unión del virus a CD4 en las balsas induce la difusión y la coalescencia laterales de los complejos gpl20/CD4 con las balsas que contienen los co-receptores CXCR4 o CCR5, proceso conducido por el citoesqueleto de actina. La evidencia más importante que apoya este modelo es la incapacidad para obtener el co-receptor CD4- g l20 ni en células que expresan el muíante CD4 no en balsas, ni en células con el colesterol agotado, en las que la difusión lateral de las balsas está gravemente alterada. De manera adicional, algunos lípidos que están enriquecidos en las balsas pueden ser necesarios para poner en marcha las asociaciones supramoleculares y cambios conformacionales masivos en la Env viral requerida para la formación del complejo de fusión (Hug, EP. y col. (2000) J. Virol. 74, 6377-6385). Este modelo puede explicar la función de CD44 y CD28 en la co-estimulación del HTV, ya que la activación de estas moléculas asociadas a las balsas media en la reorganización de las balsas de lípidos en las células vivas (Oliferenko S. y col., (1999) I Cell Biol. 146, 843-854; Viola, A. y col., (1999) Science 283, 680-682). Es importante destacar que otros virus tales como el virus Ébola, también usan las balsas de los hospedadores como portales de entrada (Bavari, S. y col. (2002) J. Exp. Med. 195, 593-602; revisiones en van der Goot, F. y Harder, T. (2001) Semin. Tmmunol. 13, 89-97). Es por lo tanto bastante tentador especular que la agregación de los dominios con balsas puede constituir un mecanismo bastante general para la entrada utilizada por distintos patógenos intracelulares. Durante varios años, los virólogos han observado que la composición lipídica de las membranas de la cubierta de diversos virus, incluyendo algunos retrovirus, es distinta de la de la membrana plasmática del hospedador del que derivan, lo que sugiere que los virus se han ensamblado en microdominios de la membrana (Aloia, R y col. (1992), Vol. 6, Wiley-Liss, Nueva York). La cubierta del HTV, al igual que todas las membranas biológicas, está constituida por proteínas incrustadas en la bicapa lipídica. Esta bicapa presenta sin embargo una relación en moles de colesterol/fosfolípidos sorprendentemente elevada (>1,00). También hay un enriquecimiento en esfingolípidos en la membrana viral, pareciéndose por ello a la composición de los dominios de membrana con balsas (Aloia, R. y col. (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90, 5181-5185). Ya que los genes de las enzimas que metábolizan los lípidos no están presentes en el genoma de los retrovirus, la bicapa lipídica de la cubierta del H3V deriva necesariamente de la membrana lipídica de la célula hospedadora. ,; Observaciones recientes han proporcionado la evidencia adicional de que los viriones nuevos del HTV emergen de la célula hospedadora mientras envuelven los alrededores de los dominios con balsas (Nguyen, D. y Hildreth, J. (2000) J. Virol. 74, 3264-3272). La formación de viriones nuevos en las balsas de lípidos conduce a la exclusión de la CD-45-fosfatasa, abundante en membranas celulares, de la cubierta de HtV-l, mientras que otras moléculas asociadas a las balsas, incluyendo las proteínas Thy-1 y CD59 de anclaje a GPI, las moléculas de adhesión intercelular (ICAM-1, -2 y -3) (Gómez-Mouton C. y col., (2001) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 98, 9642-9647), las integrinas LFA-1 y VL-4 (Brown, D. y London E. (2000) J- Biol. Chem. supra), y el gangliósido GM1, presentan niveles enriquecidos en la partícula viral. La incorporación de partículas del hospedador en la partícula viral puede tener varias consecuencias sobre la infección y la patogenicidad de los virus, desencadenando la activación de rutas de señalización en las células recién infectadas, tras la fusión de las membranas viral y celular (Fivaz, M y col. (1999) Trends Cell Biol. 9, 212-213; Liao, Z. y col., (2000) AIDS Res. Hum. Retrovir. 16, 355-366). La incorporación de otras glicoproteínas de la membrana de hospedador, tales como la clase ? de HLA-DR, que suponen el 4,4% de la proteína total de la partícula viral, es utilizada probablemente por el virus para producir la desregulación de la respuesta inmune celular y humoral contra HIV-1 (Henderson, L. y col, (1987) J. Virol., 61, 629-632). Además de la incorporación de proteínas del hospedador asociadas a las balsas, en la cubierta viral, se ha descrito el reparto de proteínas estructurales del HTV-I dentro de las membranas con balsas del hospedador, durante el ensamblaje de las nuevas partículas virales. En particular, las proteínas Gag y Env de HTV-1 se han detectado en dominios con balsas (Nguyen, D. y Hildreth, J. (2000) J. Virol. 74, 3264-3272: Rousso, I. y col. (2000) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 97, 13523-13525). La proteína Gag de HJV-1 se sintetiza en forma de una poliproteína precursora, Pr55Gag, que se compone de matriz (MA), cápside (CA), nucleocápside (CN) y dominios p6, así como de los péptidos espaciadores p2 y pl (Frankel. A y Young, J. (1998) Annu. Rev. Biochem. 67, 1-25). Se ha informado que la asociación de Pr55Gag se inicia con la unión del dominio MA a la membrana plasmática. Esta etapa de unión implica, directa o indirectamente, al menos varios dominios repartidos por toda la proteína MA. La especificidad de unión a la membrana plasmática la confiere el dominio M, que está constituido por una combinación de un resto N-terminal de miristoilo y por una agregación de residuos con carga positiva que actúan de manera sinergística (Frankel, A. y Young, J. (1998) Annu. Rev. Biochem. 67, 1-25). La mutación del residuo N-terminal de Gly, que sirve como sitio de modificación del ácido mirístico, alteró la unión de Gag a la membrana y bloqueó el ensamblaje del virus (Freed, E. y col. (1994) J. Virol. 68, 5311-5320).

Aunque la acilación es una modificación frecuente en proteínas asociadas a las balsas, la roiristoilación MA no es un factor importante para dirigir a la Pr55Gag hacia las balsas. Estudios realizados con mutantes de Pr55Gag sugieren que la asociación profusa de Gag con las balsas tiene lugar después de interacciones de Gag unida a membrana-Gag. El espaciador p2 y la Pr55Gag se requieren para la oligomerización de Gag (Accoia, M. y col., (2000) J. Virol. 74, 5395-5402) y, por consiguiente, mutantes por deleción de Pr55 Gag, que caren de p2, mostraron una asociación defectuosa a las balsas (Ono, A. y Freed, E. (2001) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 98, 13925-13930). Es importante señalar que una porción de la proteína Gag total presente en las células infectadas, está presente en dominios densos similares a los dominios con balsas, denominados lanchas (del inglés, "barges") (Lindwasser, O y Rosh M. (2001) J. Virol., 75, 7913-7924). Las lanchas son probablemente el resultado de una agregación extensiva de Gag mediada por los dominios NC y p6. Se ha propuesto que los oligómeros de Gag pueden presentar una afinidad más fuerte por las balsas debido a un número aumentado de sitios de unión por complejo, o a una conformación alterada inducida por la interacción Gag-Gag. Los oligómeros de Gag pueden por otra parte estabilizar las agregaciones de balsas dando lugar a las grandes y densas estructuras de lanchas observadas. La agregación de Pr55Gag induce la formación de una yema en la membrana y la posterior liberación de las partículas virales (Fig. 4). Durante la formación de la yema, las glicoproteínas de la Env viral se incorporan a las nuevas partículas virales, una función que también realiza el doniinio MA de Pr55Gag. La cola citoplásmica de Env contiene dos residuos, que son dianas putativas para la modificación por palmitoilación. La retirada de estos aminoácidos parece no afectar ni a la expresión de la cubierta, ni al transporte de las proteínas, ni a la interacción Env-Gag (Yang, C. y col. (1995) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 92, 9871-9875). Sin embargo, otros estudios han mostrado la acilación de Env, que se ha demostrado que es crítica para un direccionamiento eficiente hacia la membrana y para la formación de virus infecciosos. Por lo tanto, el dominio citoplásmico de gpl60 dirige a la proteína de la cubierta hacia las balsas de lípidos, incluso en ausencia de Gag (Rousso, I. y col. (2000) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 97, 13523-13525). Se destaca que las balsas están concentradas en los sitios de contacto célula-célula de las células T; por lo tanto, el cm*eccionamiento de la proteína Env hacia las balsas del hospedador puede facilitar la transmisión célula a célula del HTV-1 La evidencia sugiere que las balsas pueden estar implicadas en el ensamblaje y liberación del HTV-1. La importancia funcional de las balsas en la formación de las yemas de los viriones inmaduros de HTV-1 se destaca ya que el agotamiento del colesterol disminuye la producción de partículas de HTV-1 en las células infectadas (Ono, A. y Freed, E. (2001) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 98, 13925-13930; Maziere. J. y col., (1994) Biomed. Pharmacother. 48, 63-63). Las balsas pueden actuar en este proceso como plataformas para la oligomerización de Gag en la membrana plasmática (Ono, A. y Freed, E. (2001) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 98, 13925-13920; Lmdwasser, O. y Rosh. M (2001) J. Virol. 75, 7913-7924), que a su vez reuniría la Env viral necesaria para formar nuevas partículas infecciosas. De manera adicional, la formación de las yemas virales puede depender de componentes específicos de las balsas del hospedador, tanto lípidos como proteínas, que regulan la liberación de los viriones (Vogt, V. (2000) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 97 12945-12947). Esto puede explicar el hecho de que el agotamiento de colesterol disminuye notablemente la producción de partículas de HTV-1, aunque este tratamiento no afecta a la síntesis de proteínas Gag o Env, ni a los procesamientos ni/o a la expresión en la superficie celular. Además de las proteínas estructurales del HTV-1, la proteína reguladora Nef se asocia también con los dominios de balsas (Wang, J.-K. (2000) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 97, 394-399). Este importante factor de virulencia en la patogénesis viral se ha informado que utiliza las balsas del hospedador para activar inmunológicamente a las células T, en relación con la activación a través de los receptores CD3 y CD28 (Wang, J.- . (2000) Proc. NaÜ. Acad. Sci. USA 97, 394-399). Durante la infección, las células se activan y se polarizan, y las balsas, que normalmente están dispersas, tienden a coalescer junto con las proteínas unidas a GPI y con proteínas de señalización intracelular asociadas. La coalescencia de las balsas inducida por Nef concentra de esta manera a los mediadores de la activación de las células T, incluyendo Lck, Fyn y LAT (Lanzavecchia, A. y col. (1999) Cell 98, 1-4) y dando como resultado la iniciación de las cascadas de señalización, que promueve la secreción de TL-2 y la estimulación de la actividad transcripcional de HTV-1 (Doms, R. y Trono, D. (2000) Genes Dev. 14, 2677-2688).

En resumen, el HTV utiliza los dominios con balsas para concentrar las proteínas virales Env y Gag, que constituyen solamente una pequeña fracción de las proteínas totales de la célula hospedadora, en el interior de áreas relativamente pequeñas; esta etapa de concentración probablemente es crítica para otras interacciones proteína-proteína virales, conduciendo al ensamblaje, producción de yemas y maduración de las nuevas partículas virales. No obstante, las balsas del hospedador probablemente no se utilizan sólo como dispositivos de concentración, sino también para regular la actividad transcripcion l del genoma viral. Además, el HTV no es capaz de ensamblarse ni de formar yemas correctamente en células murinas, lo que sugiere que estas células, o bien carecen de un factor celular necesario para la formación de las yemas, o bien contienen un factor que inhibe este proceso (Manará, R. y col. (2000) J. Virol. 74, 3859-3970). No es prudente especular que un inductor o inhibidor de este tipo pueda corifinarse o excluirse de manera selectiva de estos dominios con balsas. Las quimioquinas son citoquinas quimiotácticas que son liberadas por una amplia variedad de células para atraer a macrófagos, células T, eosinófílos, basófilos y neutrófilos hacia sitios de inflamación (revisiones de Schall, (1991) Cytokine, 3, 165-183 y de Murphy, (1994) Rev. Immunol 12, 593-633). Existen dos clases de quimioquinas, C-X-C(alfa) y C-C(beta), dependiendo de si las dos primeras cisteínas están separadas por un único aminoácido (C-X-C) o son adyacentes (C-C). Las alfa-quimioquinas, tales como la mterleuquina-8 (IL-8), la proteína-2 activadora de neutrófilos (NAP-2) y la proteína de actividad estimuladora del crecimiento de melanomas (MGSA) son quimiotácticas principalmente para neutrófilos, mientras que las beta-quimioquinas, tales como RANTES, ???-lalfa, MCP-lbeta, la proteína-1 quimiotáctica de monocitos (MCP-1), MCP-2, MCP-3 y la eotaxina son quimiotácticas para macrófagos, células T, eosinófílos y basófilos (Deng y col. (1996) Nature 381, 661-666). Las quimioquinas se unen específicamente a receptores de superficie celular pertenecientes a la familia de siete proteínas de dominios de transmembrana, acopladas a proteina G (revisiones de Horuk, (1994) Trends Pharm. Sci., 15, 159-165) denominadas "receptores de quimioquinas". Al unirse a sus ligandos análogos, los receptores de quimioquinas transducen señales ntracelulares a través de las proteínas G triméricas asociadas, produciendo un rápido aumento en la concentración de calcio intracelular. Existen al menos dieciséis receptores de quirnioquinas humanas que se unen a beta-quirráoquinas o responden a ellas, con el siguiente patrón característico: : CCR-1 ("CKR-1", "CC-CKR-G) [MIP-lalpha, ???-Ibeta MCP-3 characteristic pattera: CCR-1 ("C R-1", characteristic pattern: CCR-1 ("CKR-1", «CC-CKR-G) [MIP-lalpha. ???-Ibeta, MCP-3 i- -..^...u.un me I líuWing characteristic partera: CCR-1 ("CKR-1", XC-CKR-G) [MIP-lalpha, ???-lbeta, MCP-3 me lUIIUWtllg characteristic pattern: CCR-1 ("CKR-1 "CC-CKR-G) [MIP-lalpha, MlP-lbeta, MCP-3 «ifítii me íoii'uwing characteristic pattern: CCR-1 ("CKR-1", "CC-CKR-G) [MIP-lalpha, MlP-lbeta. MCP-3 characteristic pattern: CCR-1 C CKR- ", C-CKR-G) [MIP-lalpha, ???-lbeta. MCP-3 characteristic partera: CCR-1 ("CKR-1", "CC-CKR-1") [MIP-lalpha. MlP-lbeta, MCP-3 characteristic pattern: CCR-I ("CKR-I" — - y el antígeno Duffy de grupos sanguíneos [RANTES, MCP-l] (Chaudhun, y col. (1994). J. Biol Chem, 269, 7835-7838). Las ß-quimioquinas incluyen eotaxina, MEP ("proteína inflamatoria de macrófagos", MCP ("proteína quimioatractora de monocitos" y RANTES (del inglés, "Regulation-upon-Activation, Normal T Expressed and Secretea* '^'regulación después de la activación, expresada y secretadas en células T normales"). El virus de la inmunodeficiencia humana (HIV-1), un retrovirus, es el agente etiológico de una enfermedad compleja que incluye la destrucción progresiva del sistema inmune (síndrome de inmunodeficiencia adquirida, SIDA) y de la degeneración del sistema nervioso central y periférico. Este virus en trabajos previos era conocido como LAV, HTLV-IH o ARV. A pesar del uso de las medidas profilácticas disponibles, la infección por HIV-1 constituye una pandemia en crecimiento, en particular en los países menos desarrollados, para la que falta un liatamiento adecuado. El régimen terapéutico más común, la terapia antirretroviral altamente activa (HAART) (del inglés, "Highly Active Antiretroviral Therapy") ha mejorado la calidad de vida de muchos individuos infectados por HTV-1. Sin embargo es un tratamiento pesado, con grandes efectos secundarios, y puede dar como resultado la aparición de virus resistentes a fármacos.

Uno de los objetivos de la investigación sobre el HTV-1 consiste en comprender la interacción entre el virus y la célula hospedadora durante en ciclo replicativo del HIV, para bloquear las interacciones clave entre las proteínas virales y las del hospedador, y prevenir la propagación del virus sin los inconvenientes del HAART. Los esfuerzos se han concentrado en los procesos de entrada y de gemación del HIV-1, que requieren la formación de grandes agregaciones entre proteínas virales y proteínas de la célula hospedadora (Mañes, S. y col (2003) Nat. Rev. Tmmunol. 3, 557-568). Los resultados sugieren que la entrada y salida del HIV-1 de la célula hospedadora requieren la reordenación del citoesqueleto de actina y unos niveles de colesterol adecuados en las membranas del hospedador y en las membranas virales. (Mañes, S. et al (2000) EMBO Rep. 1:190-196; Nguyen, D., and J. Hildreth. (2000) J. Virol. (Manes, S, et al (2000) EMBO Rep. 1:190-196; Nguyen, D., and J. Hildreth. (2000) J. Virol. (Mañes, S. et al (2000) EMBO Rep. 1:190-196; Nguyen, D., and J. Hildreth. (2000) J. \¾ol. (Mañes, S. et al (2000) EMBO Rep. 1: 190-196; Nguyen, D., and J. Hildreth. (2000) J. Virol. (Manes. S. et ai (2000) EMBO Rep. 1:190-196; Nguyen, D., and J. Hildreth. (2000) J. Virol. (Mañes, S, et al (2000) EMBO . p n 1 l Qn , ??· ?" - ^ . « t .

Aún no se ha encontrado un medio de ataque específico a estos factores del hospedador para evitar la propagación del HIV-1 con una toxicidad mínima. Se ha demostrado que algunos compuestos inhiben la replicación del HTV, incluyendo la proteína CD4 soluble y sus derivados sintéticos (Smith y col. (1987) Science 238, 1704-1707), sulfato de dextrano, colorantes tales como el Amarillo Directo 50, Azul de Evans y deterniinados azocolorantes (Patente de EE.UU. n.° 5.468.469). Alguno de estos agentes antivirales se ha visto que actúan bloqueando la unión de gpl20, la proteína de cubierta del HJV a su diana, a la glicoproteína CD4 de la célula. La entrada de HTV-1 en la célula diana requiere al receptor CD4 de superficie celular y cofactores adicionales de la célula hospedadora. La fusina se ha identificado como un cofactor requerido para la infección con un virus adaptado a crecer con células C transformadas, aunque la fusina no promueve la entrada de virus macrofagotrópicos que se cree que son las cepas patógenas clave del HTV in vivo. Recientemente se ha reconocido que para su entrada eficiente en las células diana, el virus de la inmunodeficiencia humana requiere un receptor de quimioquinas, muy probáblemente CCR-5 o CXCR4, así como el receptor principal CD4 (Levy, N.(14 de Noviembre de 1966) Engl. J. Med. 335(20), 1528-1530). El cofactor principal para la entrada mediada por las glicoproteínas de la cubierta de las principales cepas macrofagotrópicas de HIV-1 es CCR5, un receptor para las ß-quimioquinas RANTES, MlP-lalfa y MEP-lbeta (Deng, y col (1996) Nature, 381, 661-666). El HTV se une a la molécula CD4 sobre las células a través de una región de su proteína de cubierta g l20. Se piensa que el sitio de unión a CD4 en la gpl20 del HIV interacciona con la molécula de CD4 dispuesta sobre la superficie celular y experimenta cambios conformacionales que la permiten unirse a otro receptor de superficie celular, tal como CCR5 y/o CXCR-4. Esto lleva a la cubierta viral más cerca de la superficie celular y permite la interacción entre la gp41 dispuesta sobre la cubierta viral y un dominio de fusión dispuesto sobre la superficie celular, la fusión con la membrana celular y la entrada del núcleo del virus en la célula. Se ha demostrado que los ligandos de las bete-quimioquina evitan que el HTV-1 se fusione con la célula (Dragic, y col. (1996) Nature, 381, 667-673). También se ha demostrado que un complejo de gpl20 y CD4 soluble interacciona de manera específica con CCR-5 e inhibe la unión de los ligandos naturales de CCR-5, MlP-lalfa y MIP-lbeta (Wuy col. (1996) Nature, 384, 179-183, Trkolay col. (1996) Nature, 384, 184-187). Los seres humanos que son homocigotos para receptores CCR-5 mutantes que no sirven como co-receptores para el HIV-1 in vitro, se manifiestan inusualmente resistentes a la infección por HIV-1 y no resultan inmunocomprometidos por la presencia de esta variante genética (Nature (1996) 382, 722-725). La ausencia de CCR-5 parece conferir una protección sustancial frente a una infección por HTV-1 (Nature (1996) 382, 668-669). Otros receptores de quimioquinas pueden ser usados por algunas cepas del HTV-1 o pueden ser favorecidos por vías de transmisión no sexuales. Aunque la mayoría de las muestras clínicas aisladas de HTV-1 y estudiadas hasta la fecha utilizan CCR-5 o fusina, algunas pueden utilizar las dos así como los CCR-2B y CCR-3 relacionados, como co-receptores (Nature Medicine, (1996) 2(11), 1240-1243). No obstante, los fármacos que se dirigen a receptores de quimioquinas pueden no ser indebidamente comprometidos por la diversidad genética del HTV-1 (Zhang y col., (1996) Nature 383, 768). Por consiguiente, un agente que bloqueara los receptores de quimioquinas en seres humanos que poseen receptores de quimioquinas normales, prevendrían la infección en individuos sanos y frenarían o pararían la progresión del virus en pacientes infectados.

Centrándose en la respuesta inmunocelular del hospedador frente a la infección por HLV, se proporcionarían tratamientos mejores para todos los subtipos de HTV. Estos resultados indican que la inhibición de los receptores de quirrúoquinas representa un método viable para la prevención o tratamiento de una infección por HIV y para la prevención o tratamiento del SIDA. Se sabe que la eotaxina, RANTES, MP-lalfa, MlP-lbeta, MCP-1 y MCP-3 se unen a receptores de quir oquinas. Como se ha indicado anteriormente, los inhibidores de la replicación del HTV-1, presentes en sobrenadantes de células T CD8+, han sido caracterizados como las beta-quimioquinas RANTES, IVEOP-lalfa y MEP-lbeta. La mayor parte de la evidencia anteriormente resumida indica que la entrada del HIV requiere la participación activa de CD4, co-receptores, y otros posibles participantes tales como glicoesfigolípidos, que a su vez pueden inducir la agregación de las balsas lipídicas en una manera dependiente del citoesqueleto de actina. Las Rho-GTPasas (una familia de 20 proteínas de mamíferos) son interruptores moleculares que controlan una amplia variedad de rutas eucariotas de transducción de señales. Se conocen principalmente por su papel central en la regulación del citoesqueleto de actina, pero su capacidad para influir sobre la polaridad celular, la (linárnica de los microtúbulos, las rutas de transporte a través de membrana, y la actividad de factores de transcripción, puede ser igualmente importante. Las Rho-GTPasas controlan procesos celulares complejos creando ciclos entre un estado conformacional "activo" unido a GTP y un estado "inactivo" unido a GDP. La hidrólisis de GTP a GDP regula la interconversión. En el estado (GTP) activo "077" las GTPasas reconocen proteínas diana y generan una respuesta hasta que la hidrólisis de GTP vuelve al estado inactivo "qff". La transducción de señales mediada por Rho-GTPasas es totalmente dependiente de la prenilación C-terrninal. Las tres Rho-GTPasas principales (Rho, Rae, y Cdc42) son gerarmgeraniladas postraduccionalmente, una reacción catalizada por la enzima geranil-transferasa. La isoprenilación de Rho-GTPasas permite la unión a membranas, la localización subcelular y el transporte intracelular de estas proteínas. Debido a que la isoprenilación se requiere para su función, se ha propuesto que la Rho-GTPasas sean dianas de fármacos que previenen o reducen la síntesis de isoprenoides.

Las estatinas son inhibidores potentes de la 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzimaA (HMG-CoA)-reducatasa y se utilizan para tratar la hipercolesterolemia con escasos efectos secundarios. La HMG-CoA-reductasa es la enzima que transfiere la HMG-CoA al ácido L-mevalónico, la etapa limitante de la velocidad en la biosíntesis del colesterol. El ácido L-mevalónico es un precursor de la biosíntesis de colesterol y de la generación de isoprenoides que modifican postraduccionalmente proteínas celulares específicas. Inhibiendo la síntesis de ácido L-mevalónico, las estatinas también previenen la síntesis de otros intermediarios isoprenoides de la ruta biosintética del colesterol, que incluyen pirofosfato de farnesilo (FPP) y pirofosfato de geranilgeranilo (GGPP). De hecho, las estatinas inducen cambios en el citoesqueleto de actina y en el ensamblaje de complejos de adhesión focales inhibiendo la isoprenilación de RhoA y acL Las Kho-GTPasas, que deben estar premiadas en su extremo C-tenninal para que actúen, son interruptores moleculares que crean un ciclo entre los estados GTP-unido (activo) y GDP-unido (inactivo) para controlar la remodelación del citoesqueleto de actina en respuesta a estímulos (Etienne-Manneville, S. y A. Hall (2002) Nature 420, 629-635). Dirigiéndose a la HMG-CoA, las estatinas bloquean la síntesis de colesterol, pero también afectan al reordenamiento del citoesqueleto de actina inhibiendo las Rho-GTPasas (Koch, G. y col. (1997) J. Pharmacol. Exp. Ther.283, 901-909). Por consiguiente, se necesitan medios que inhiban la capacidad del HTV y de otros virus para explotar las estructuras de los dominios con balsas presentes en células humanas y de otros animales como medio para entrar en las células y propagar partículas virales adicionales. Otros objetivos y ventajas resultarán evidentes a partir de la siguiente descripción.

SUMARIO DEL INVENTO El presente invento proporciona composiciones farmacéuticas que inhiben la entrada del virus de la inmunodeficiencia humana (HTV) en células eucariotas. Un aspecto del presente invento proporciona composiciones farmacológicas que inhiben la producción de viriones del HTV en las células infectadas por HTV. Un aspecto del presente invento proporciona composiciones farmacéuticas que contienen un compuesto que reduce los depósitos celulares de intermediarios isoprenoides y/o inhibe la isoprenüación de proteínas y/o la actividad de la Rho-GTPasa. En particular, el presente invento se refiere ai uso de un inhibidor de la isoprenüación de proteínas o de una de sus sales, solvatos o derivados farmacéuticamente aceptables, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una infección por HIV, de una infección por un retrovirus genéticamente relacionado con. el HIV, o del SIDA. En otro aspecto, el presente invento abarca, el uso de un inhibidor de isoprenüación de proteínas o de una de sus sales o solvatos farmacéuticamente aceptables, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una infección por HTV, de una infección por un retrovirus genéticamente relacionado con el HTV, o del SIDA. Se tendrá en cuenta que el inhibidor de la isoprenüación de proteínas puede ser un inhibidor de la geranilgeranüpfrofosfato-smtetasa, geranügeranü-transferasa o un inhibidor de la activación de Rho. Por eüo, los inhibidores preferidos son estatinas y sus análogos, que incluyen pero que no se limita a eüos, lovastatina, simvastatina, pravastatina, mevastatina, atorvastatina y fluvasMina. Opcionalmente, el inhibidor de la isoprenüación de proteínas puede estar mezclado con un vehículo, aglutinante, agente de reUeno, düuyente o excipiente farmacéuticamente aceptables, o cualquiera de sus combinaciones. En otra realización del invento, el inhibidor de la isoprenüación de proteínas se a<iministra en combinación con uno o más agentes terapéuticos diferentes, seleccionados entre el grupo que comprende un inhibidor de la proteasa de HTV", un inhibidor de la transcriptasa inversa no nucleosídico, un inhibidor de la transcriptasa inversa nucleosídico/nucleotídico, un antagonista de CCR5, un inhibidor de la integrasa, un inhibidor de RNasaH, un agente inhibidor de los dominios con balsas, un agente que disminuye los niveles de colesterol, un agente que disminuye la premiación de proteínas, un inhibidor de la Rho-AGTPasa, y un agente que disminuye los niveles de glicoesfingolípidos. Ejemplos de agentes que disminuyen los niveles de glicoesfingolípidos incluyen D-t-3'54'-etüendioxi-l -fenü-2-palmitoüammo-3-pirrohdino-l -propanol, D-t-41- droxi- 1 -ferñl-2-palrm^oüamino-3-pirrolidüio- 1 -propanol, 1 -feriü-2-palmitoilarnirio-3-pirrolidino-l-propanol, y sus sales y sus mezclas farmacéuticamente aceptables. En una realización preferida el agente inhibidor de los dominios con balsas disocia los dominios con balsas. En otra realización preferida, el agente inhibidor de los dominios con balsas inhibe la formación de los dominios con balsas. En una realización alternativa, el agente modulador de los receptores de quirnioquinas inhibe la formación de los dorninios de membrana con balsas y/o los disocia. En otra realización más, el inhibidor de Rho-A GTPasa puede ser una estatina o uno de sus análogos, que incluyen, pero no se limitan a ellos, lovastatina, simvastatina, pravastatina, mevastatina, atorvastatinay fluvastatina. Se apreciará que la combinación de uno o más de los agentes puede administrarse de modo independiente secuencial o simultáneo. Se apreciará también que uno o más de los agentes puede ir mezclado con un vehículo, aglutinante, agente de relleno, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptables, o cualquiera de sus combinaciones. En otro aspecto, el presente invento reside en un inhibidor de isoprenilación de proteínas o de una de sus sales, solvatos o derivados farmacéuticamente aceptables, para usar en el tratamiento de una infección por HTV, de una infección por un retrovirus genéticamente relacionado con el HIV, o del SIDA. Otro aspecto más del presente invento proporciona una monoterapia para tratar un ser humano infectado con HTV administrando a dicho ser humano una composición que contiene una cantidad farmacéuticamente efectiva de un compuesto que &srninuye los depósitos celulares de intermediarios isoprenoides y/o inhibe la isoprelinación de proteínas y/o inhibe la actividad de Rho-GTPasa. En particular, el presente invento proporciona un método para tratar a un m-Ltnífero que padece una infección por HIV, una infección por un retrovirus genéticamente relacionado con el HTV, o SIDA, que comprende tratar a dicho mamífero con una cantidad terapéuticamente efectiva de uno o más agentes capaces de inhibir la isoprenilación de proteínas, o de una de sus sales, solvatos, o derivados farmacéuticamente aceptables. -25- El presente invento está dirigido a una terapia combinada que comprende a<iministrar a un paciente que necesita dicha terapia una composición farmacológica que inhibe la entrada del virus de la inmunodefíciencia humana (HTV) en las células diana y tiene valor en la prevención de una infección por HTV, en el tratamiento de una infección por HTV. y en la prevención y/o tratamiento del síndrome de inmunodefíciencia adquirida (SIDA) resultante. La composición del presente invento comprende además compuestos que disminuyen los niveles de isoprenoides celulares o que inhiben la isoprenilación de proteínas o que inhiben la actividad de Rho-A, compuestos que poseen actividad antiviral, moduladores de la actividad de los receptores de quimioquinas, agentes que disminuyen los niveles de glicoesfingolípidos y agentes que disminuyen el nivel de colesterol. El presente invento se refiere también a composiciones farmacéuticas que contienen estos compuestos y a un método de uso de la presente composición para la prevención y tratamiento del SEDA y de una infección viral por HTV. Un aspecto del presente invento proporciona que moduladores de la actividad de los receptores de quimioquinas son agentes que actúan de manera específica para romper la organización de los dominios con balsas. Esta rotura incluye acciones que inhiben la formación de balsas y acciones que disocian las balsas formadas con anterioridad. Un aspecto del presente invento proporciona variantes mutantes sin balsas de receptores para HTV-1. Estos mutantes sin balsas son variantes de receptores para HTV, que se construyen por ingeniería genética, tales como CD4, CXCR4, CCR5, u otro receptor implicado en el proceso de infección por HTV. Un aspecto del presente invento proporciona péptidos construidos por ingeniería genética que tienen como objetivo los dominios con balsas e inhibe la fusión del virus HTV a la membrana. Un aspecto del presente invento inhibe el (iireccionamiento del HTV hacia los dominios de balsas. Se proporcionan receptores mutantes para el HTV en los que la interacción de la unión virus-receptor tiene lugar con normalidad, pero el receptor unido al HTV no se agrega en los dominios de balsas. Debido a ello la dimerización del receptor, un prerequisito para la entrada del virus en la célula, no puede tener lugar.

Un aspecto del presente invento proporciona receptores murantes sin balsas para el HTV, siendo dichos receptores mutantes CD4, CXCR4. CCR5, o cualquier otro receptor implicado en la entrada del HTV en las células. Un aspecto del presente invento proporciona un método para tratar a un paciente que padece una infección por HTV, que comprende administrar al paciente una composición farmacéuticamente aceptable que comprende una cantidad farmacéuticamente efectiva de un agente reductor de pirofosfato de geranil-geranilo u otros agentes que inhiben la geramlgeranilización de Rho-GTPasas. Un aspecto del presente invento proporciona un método para tratar a un paciente que padece una infección por HTV, que comprende administrar al paciente una composición farmacéuticamente aceptable que comprende una cantidad farmacéuticamente efectiva de un agente antiviral y un agente reductor de pirofosfato de geranil-geranilo u otros agentes que inhiben la geramlgeranilización de Rho-GTPasas. Un aspecto del presente invento proporciona un método para tratar a un paciente que padece una infección por HTV, que comprende administrar al paciente una composición farmacéuticamente aceptable que comprende una cantidad farmacéuticamente efectiva de un agente antiviral, una cantidad farmacéuticamente efectiva de un agente que disminuye la isoprenilación de proteínas, una cantidad farmacéuticamente efectiva de un modulador de la actividad de los receptores de quimioquinas, y una cantidad farmacéuticamente efectiva de un agente que disminuye los niveles de glicoesfingolípidos. Un aspecto del presente invento proporciona un método para tratar a un paciente que padece una infección por HIV, que comprende administrar al paciente una composición farmacéuticamente aceptable que comprende una cantidad farmacéuticamente afectiva de un agente conocido que (Hsminuye la isoprenilación de proteínas, una cantidad farmacéuticamente efectiva de un modulador de la actividad los receptores de quimioquinas, y una cantidad farmacéuticamente efectiva de un agente conocido que disminuye los niveles de glicoesfingolípidos. Un aspecto del presente invento proporciona medios para tratar a un paciente que padece una infección producida por el virus Ébola, que comprende administrar a dicho paciente una composición farmacológica que inhibe la entrada del virus Ébola en las células diana y que tiene valor en la prevención de una infección producida por el virus Ébola, el tratamiento de la infección producida por el virus Ébola, y la prevención y/o el tratamiento del síndrome de inmunodeficiencia adquirida resultante. La composición del presente invento comprende además compuestos que poseen actividad antiviral, que son moduladores de la actividad de los receptores de quindoquinas, agentes que disminuyen los niveles de glicoesfingoKpidos y agentes que disminuyen la isoprenilación de proteínas. El presente invento se refiere también a composiciones farmacéuticas que contienen estos compuestos y a un método de uso de la presente composición para la prevención y tratamiento de una infección viral producida por el virus Ébola y de sus secuelas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Incluidas en los dibujos se encuentran las siguientes figuras: La Figura 1 representa las balsas de las membranas, enriquecidas con GPI-proteínas, ancladas en la hoja externa de la bicapa, y enriquecidas en proteínas aciladas ancladas en la hoj a interna. La Figura 2 muestra balsas de la membrana a modo de dispositivos que controlan las interacciones proteína-proteína en la superficie celular. La Figura 3 muestra las interacciones entre proteínas que permiten la entrada del HTV en las balsas. La Figura 4 muestra el ensamblaje de partículas nuevas de HTV-1 que tiene lugar en las balsas. La Figura 5 ilustra que las estatinas inhiben in vitro e in vivo la infección de PBMC humanas, producida por HTV-1. A, Infección de PBMC humanas activadas con PHA, no tratadas (?), tratadas con lovastatina (?), o tratadas con lovastatina + mevalonato (?), producida por cepas X4 o R5 del virus HTV-1. Los datos corresponden a la media ± SD de puntos triplicados (n=3). B. PBMC aisladas de voluntarios humanos tratados con vehículo o tratados con pravastatina, se expusieron a dos dosis de la cepa BaL de HTV-1. Los datos corresponden al cociente entre los niveles de p24 antes del tratamiento y después del tratamiento, en PBMC procedentes de cada uno de los individuos, expresado en forma de porcentaje (**p<0,05). C-D, Ratones SCID reconstituidos con PBMC humanas, se trataron con lovastatina durante dos semanas antes de la infección con HTV-1; se determinó la carga viral (C) y el cociente (D) CD4/CD5 humanos en cada uno de los animales una semana después de la infección. Se muestra uno de los dos experimentos representativos (**p<0,05). E. Ratones SCID tratados con lovastatina se reconstituyeron con PBMC teñidas con CellTracker y se estudió el mareaje de las células per toneales a los tiempos indicados; los números muestran el porcentaje de las células marcadas. La Figura 6 muestra que las Estatinas inhiben la entrada y la salida del HIV-1. A. Se realizaron infecciones de una sola ronda en células MT2-CCR5 no tratadas, tratadas con lovastatina y tratadas con lovastatina + mevalonato, utilizando un virus NL4-3 defectivo en. la replicación y seudotipificado con las cubiertas de HTV-lAda o VSV-G. La infección de las células se normalizó usando las células no tratadas como 100%. B. La producción de virus se midió mediante titulación de las existencias de virus producidas en células HE -293T transfectadas con un virus NL4-3, defectivo en la replicación igual que en el apartado A), no tratadas, tratadas con lovastatina y tratadas con lovastatina + mevalonato. Las RLU se calcularon después de la normalización con la actividad de luciferasa procedente de extractos de las células producidas en las existencias. C. Se analizó la expresión génica dirigida por LTR en células de Jurkat transfectadas con pLTR-luc, pcDNA-tat y renilla sin promotor para la normalización, no tratadas, tratadas con lovastatina y tratadas con lovastatina + mevalonato. Todos los datos corresponden a la media ± SD de puntos duplicados (n=3). La Figura 7 ilustra que los efectos de las estatinas son revertidos por adición de GGPP. A. Se realizaron experimentos de una sola ronda infección utilizando el virus NL4-3 defectivo en la replicación igual que en la Figura 2A, en células MT2-CCR5 tratadas con lovastatina o con lovastatina más los compuestos indicados. La infección de las células se normalizó considerando las células no tratadas como el 100%. Los datos corresponden a la media ± SD de puntos duplicados (n=4). B. Infecciones de una sola ronda realizadas con el virus HTV-lAda seudotipificado, en células MT2-CCR5 tratadas con lovastatina, GGTI-286 (un inhibidor de la geranil-transferasa) o FTI-277 (un inhibidor de la farnesil-transferasa). Los valores de RLU son la media ± SD de puntos duplicados (n=3). C. Niveles de colesterol libre o esterificado en células MT2-CCR5 no tratadas, tratadas con lovastatina y tratadas con lovastatina + mevalonato. Se muestra uno de los dos experimentos representativos. D. Expresión génica dirigida por LTR en células MT2-CCR5 tratadas con lovastatina, lovastatina más los compuestos indicados, o con GGTI-286 o FTI-277. Los datos corresponden a la media ± SD de puntos duplicados (n=3). La Figura 8 muestra que las estatinas inhiben la asociación lateral de CD4 y CXCR4, inducida por gpl20, previniendo la activación de Rho. A. Células PBMC no tratadas, tratadas con lovastatina y tratadas con lovastatina + mevalonato, se incubaron con gpl20HIB y fueron tratadas con un anticuerpo anti-gpl20. Después de fijadas, las células se tiñeron con anti-CXCR4 y se analizaron por microscopía confocal. Dos células representativas se muestran para cada uno de los casos (n=25). Barra, 2 um. B. Células MT2-CCR5 privadas de suero, se incubaron con HTV-1 y los Usados celulares se ensayaron para determinar Rho o Rae. El valor de Rho o Rae total se analizó en paralelo en extractos celulares en crudo como un control de la carga de la proteína. Se muestra uno de los tres experimentos. C. Se determinó la Rho activa en células no tratadas, tratadas con lovastatina y tratadas con lovastatina + GGPP, igual que en el caso anterior. Las transferencias Western de tres experimentos independientes se cuantificaron por densitometría y los valores se normalizaron usando Rho en extractos celulares en crudo como control de la carga. Los puntos correspondientes a los datos se representan con respecto a los valores medios de las células no expuestas al virus (tiempo 0) para cada uno de los casos. D. Infecciones de una sola ronda de células MT2-CCR5 transfectadas con Rho de tipo salvaje o con Rho-N19 muíante utilizando un virus HEV-lAda seudotipificado y defectivo en la repiieación. E. Células HeLa-CD4 transfectadas con Rae de tipo salvaje, Rho de tipo salvaje, Rac-N17 o Rho-N1 , se mezclaron con células BSC40 que expresan gpl60 de HIV, y se midieron los eventos de fusión celular. D, E, los datos corresponden a la media ± SD de puntos duplicados (n=3).

DESCRIPCIÓN DETALLADA El presente invento se refiere al uso de un inhibidor de la isoprenilación de proteínas o de una de sus sales, solvatos o derivados farmacéuticamente aceptables, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una infección por HTV, de una infección por un retrovirus genéticamente relacionado con el HIV, o del SIDA. El inhibidor de la isoprenilación de proteínas puede ser un inhibidor de la gerarmgeranilpirofosfato-sintetasa, geranilgeranil-transferasa o un inhibidor de la activación de ho. Este inhibidor puede ser una estatina o uno de sus análogos, tal como lovastatina, simvastatina, pravastatina, mevastatina, atorvastatinay fluvastatina. El presente invento también se refiere a un tratamiento, que comprende adrninistrar a un paciente que necesita ese tratamiento una composición farmacológica que inhibe la entrada del virus de la inmunodeficiencia humana (HTV) en las células diana y tiene valor en la prevención de una infección por HIV, en el tratamiento de una infección por HTV, y en la prevención y/o tratamiento del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) resultante. La composición del presente invento comprende además compuestos que inhiben la isoprenilación de proteínas disminuyendo los depósitos celulares de isoprenoides, y/o previniendo la activación de Rho-GTPasas. El presente invento se refiere a una terapia combinada que comprende administrar a un paciente que necesita dicha terapia una composición farmacológica que inhibe la entrada del virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) en las células diana y tiene valor en la prevención de una infección por HTV, en el tratamiento de una infección por HTV, y en la prevención y/o tratamiento del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SEDA) resultante. La composición del presente invento comprende además compuestos que poseen actividad antiviral (tales como los inhibidores de proteasa del HIV, inhibidores de la transcriptasa inversa no nucleosídicos, inhibidores de la transcriptasa inversa nucleosídicos/nucleotídicos, antagonistas de CCR5), inhibidores de la integrasa, e inhibidores de RNasaH, que son moduladores de la actividad de los receptores de quirnioquinas, agentes que disminuyen los niveles de glicoesfingolípidos y agentes que disminuyen la isoprenilación de proteínas. El presente invento se refiere también a composiciones farmacéuticas que contienen estos compuestos y a un método de uso de la presente composición para la prevención y tratamiento del SIDA y de una infección viral por HTV. En la técnica se conocen terapias combinadas para la prevención o tratamiento de una infección por HTV. Por ejemplo, 1 Patente de EE.UU. 6.432.981 describe una terapia combinada que comprende un agente antiviral, un agente que disminuye el nivel de colesterol, y un modulador de la actividad de los receptores de la qviimioquina. El presente invento proporciona un avance en la técnica apuntando a la membrana celular y en concreto los dominios de balsas presentes en ella, para prevenir la entrada y/o la gemación de los viriones de HTV. El presente invento proporciona también un avance apuntando a la entrada y a la gemación del HTV, regulando la agregación de los dominios de balsas. Una realización del presente invento proporciona una dosis efectiva de un compuesto farmacéuticamente aceptable que inhibe la síntesis de los esfingoglicolípidos. Una realización del presente invento proporciona una dosis efectiva de un inhibidor de la actividad de los receptores de quimioquinas. Una realización del presente invento proporciona una dosis efectiva de un compuesto que baja los niveles de colesterol. Una realización del presente invento proporciona una dosis efectiva de un inhibidor de la isoprenilación de proteínas. Una realización más del presente invento proporciona una dosis efectiva de un compuesto antiviral. Agente inhibidor de receptores de quirnioquinas. La utilidad de los compuestos según el presente invento como inhibidores de la actividad de receptores de quirnioquinas puede demostrarse mediante la metodología conocida en la técnica, tal como el ensayo de unión a quimioquinas descrito por Van Riper y col., J. Exp. Med., 177, 851-856 (1993) que puede adaptarse fácilmente para medir la unión a CCR-5, y el ensayo de unión de CCR-3 se encuentra descrito por Daugherty y col. J. Exp. Med., 183, 2349-2354 (1996). Las líneas celulares encargadas de expresar el receptor de interés incluyen las que expresan el receptor en la naturaleza, tales como EOL-3 o ???-l, o una células construida por ingeniería genética para expresar un receptor recombinante, tal como una línea de células T linfoblásticas de Jurkat transfectada con CCR5. La utilidad de los compuestos según el presente invento como inhibidores de la diseminación de la infección del HJV en las células puede demostrarse por medio de metodología conocida en la técnica, tal como el ensayo de cuantificación de HEV descrito por Nunberg y col., (1991) J. Virology, 65(9),4887-4892. En particular, los moduladores de quimioquinas, y más en particular los moduladores de CCR5, se encuentran descritos en la Patente de EE.UU 6.432.981. Otros moduladores de la actividad de receptores de quimioquinas se encuentran descritos en la Patente de EE.UU. 6.441.001. Inhibidores de 3-hidroxi-3-metil-glutaril-coenzima A-reductasa / agentes que disminuyen los niveles de colesterol e isoprenoides. Los fármacos estatinas (véase eri y col., documento U.S. 6.444.452) actualmente son los fármacos más terapéuticamente efectivos para disminuir el nivel de LDL en el torrente sanguíneo de un paciente en riesgo de padecer una enfermedad cardiovascular. Esta clase de fármacos incluye, ínter alia, compactina, lovastatina, simvastatina, pravastatina, mevastatina, atorvastatina y fluvastatina. Los mecanismos de acción de los fármacos estatuías se han elucidado con cierto detalle. Alteran la síntesis de colesterol y de otros esteróles en el hígado uniéndose competitivamente a la 3-Mdroxi-3-metil-glutaril-coenzima A-reductasa (HMG-CoA-reductasa). La HMG-CoA-reductasa cataliza la conversión del HMG-CoA en ácido L-mevalónico, que es la etapa que determina la velocidad en la biosíntesis de colesterol. A consecuencia de ello, su inhibición conduce a una disminución en la velocidad de formación de colesterol en el hígado. Datos clínicos y experimentales recientes indican sin embargo que los beneficios globales del tratamiento con estatinas puede exceder sus propiedades de disminución de los niveles de colesterol. Estos efectos adicionales se basan en la capacidad de las estatinas para inhibir la síntesis de intermediarios isoprenoides en la ruta biosintética del colesterol. La célula utiliza estos intermediarios isoprenoides para la modificación postraduccional de diferentes proteínas celulares, que incluyen la GTPasas de tamaño pequeño de la superfamilia Rho y Ras. Por consiguiente, la inhibición de la HMG-CoA-reductasa mediada por estatinas conduce a una disminución tanto en la velocidad de formación del colesterol en el hígado, como en la isoprenilación de proteínas. Ya que el anclaje a membrana y la activación de las Rho-GTPasas es dependiente de una modificación producida por isoprenoides, las estatinas pueden también prevenir la función de la Rho-GTPasa. La Pravastatina es el nombre medicinal común del compuesto químico, ácido [lS-[lalfa(beta*.delta*)2 alfa,6alfa,8beta(R*)8alfa331,2,6,7,8,8,a-hexabidro-beta,delta, 6-trMdroxi-2-metü-l-oxobutoxi)l-na. én-heptanoico (Registro de CAS, n.° 81093-370). La Pravastatina exhibe una importante ventaja terapéutica sobre otras estatinas. Una cantidad farmacéuticamente efectiva de Pravastatina inhibe selectivamente la síntesis de colesterol en el hígado e intestino delgado pero conserva la síntesis de colesterol en las células periféricas sustancialmente no afectadas ( oga T. y col. (1990) Biochim. Biophys. Acta. 1045, 115-120). Esta selectividad parece ser debida, en parte, a la presencia de un grupo hidroxilo en la posición C-6 del núcleo de hexahidronaftaleno. La posición C-6 está ocupada por un átomo de hidrógeno en la compactina y por un grupo metilo en la lovastatina. La Pravastatina es menos capaz de pasar a través de las membranas lipófilas de las células periféricas que los otros congéneres más lipófilos (Serajuddin y col., (1991) J. Pharm. Sci.s 80, 830-834). Esta movilidad limitada de la pravastatina se piensa que es la responsable de su acción más localizada en hígado e intestino. La composición farmacéutica del presente invento preferiblemente incluye al menos una estatina como agente que disminuye los niveles de colesterol y/o como inhibidor de la isoprenilación de proteínas y/o como inhibidor de la Rho-GTPasa. Sin embargo, el agente que disminuye/o que inhibe los niveles de colesterol, o de isoprenoides o de Rho-GTPasa de la composición farmacéutica del invento no se limita a una estatina. Agentes antivirales. Se define que un agente antiviral es cualquier sustancia que inhibe la actividad biológica de una DNA-polimerasa viral, la transcripción del genoma viral, RNA-polimerasa, transcriptasa inversa, helicasa, primasa, integrasa, o que inhibe la traducción y la maduración de proteínas virales, la formación (desarrollo) de proteínas reguladoras virales, o de proteínas estructurales virales, y proteínas similares. También se incluyen en esta relación los inhibidores de proteasas virales. Preferiblemente, un agente antiviral inhibe la actividad, o actividades, biológica de retrovirus. Muy preferiblemente, el agente antiviral inhibe la actividad, o actividades, biológica del HIV. Ejemplos de agentes antivirales adecuados incluyen inhibidores de la proteasa de HTV, inhibidores no nucleosídicos de la transcriptasa inversa, inhibidores nucleosídicos/nucleotídicos de la transcriptasa inversa, antagonistas de CCR5, inhibidores de integrasa e inhibidores de RNAsaH. En relación con su estructura química, los agentes antivirales conocidos son principalmente derivados de purina y pirimidina, nucleósidos y nucleótidos. El presente invento no está limitado a los agentes antivirales conocidos. El presente invento contempla el uso de otros agentes antivirales a medida que vayan siendo conocidos. Sin limitación, entre los nucleósido y nucleótidos antivirales se incluyen: aciclovir: 9-[(2- droxietoxi)metü]-9H-guanina, valacyclovir: éster de L-valilo de aciclovir, penciclovir: 9-[4-Mdroxi-3(hidroximetü)-but-l-ü]guanina famciclovir: éster diacetüico de penciclovir, ganciclovir : 9-(l ,3 -<n droxi-2-propo.dmetil)guamna, idoxiuridina: 2'-desoxi-5-yodouridinaa, floxuridina: 2'-desoxi-5-fluoridina, sorivudina: trifluridina: 5 rffluorometn-2'-desoxiuridnia, vidarabina: 9beta-D-robofuranosüadenina, zidovudina (AZT): S'-azido-S'-desoxitimidina, didanosina: 2',3'-didesoxisnosina zalcitabina: 2', 3'-didesoxicitidina, cytarabina: 4-amino- 1 -D-arabmofuranosilo-2( lH)-pirimi-dinona didesoxiadenosina: 2',3'-didesoxiadenosina, y edoxnciiria^'-desoxi-S-etüuriciina. Un agente antiviral puede utilizarse en forma de su sal de adición de ácido terapéuticamente útil, si su estructura química permite la preparación de una sal de adición de ácido. De manera similar, el agente antiviral puede utilizarse en forma de su sal terapéuticamente adecuada, p. ej., una sal de metal, una sal de amonio o sales formadas con bases orgánicas, cuando su estructura química es adecuada para la preparación de esas sales. Derivados nucleosídicos o nucleotídicos adecuados como el agente antiviral del presente invento están descritos en la Patente de EE.UU. 6.456.851, de la que todos sus contenidos se incorporan aquí como referencia. Una realización preferida de la composición farmacéutica del presente invento comprende un nucleósido, preferiblemente zidovudina como agente antiviral. O Inhibidores de proteasas: La replicación del HTV implica la síntesis de una larga cadena polipeptídica que contiene muchas proteínas. Estos precursores de las proteínas, denominados Gag y Gag-Pol, deben ser escindidos por una proteasa específica de HTV en 9 puntos específicos con el fin de producir las proteínas funcionales. El precursor gag en su momento dará lugar a proteínas estructurales y el precursor pol dará 5 lugar a enzimas tales como la transcriptasa inversa, integrasa y proteasa. La proteasa del HTV no se encuentra en células de mamíferos. La proteasa del HTV es una aspartil- proteasa y es única porque puede escindir entre fenilalanina y tirosina o prolina, reacción no catalizada por enzimas humanas. Los inhibidores específicos para la proteasa de HIV bloquean la escisión de Gag y Pol, mterfiriendo de este modo con la producción de O nuevas partículas virales. Cualquier inhibidor de la proteasa de HTV, farmacológicamente aceptable, es adecuado para el presente invento.

Derivados de piridiminona y p dinona. Se sabe que algunos derivados de pmmidinona y piridinona inhiben la transcriptasa inversa de HIV. En concreto, los derivados de l-[(2-Mdroxietoxi)metil]-6-(fenüu^)tírmm (HEPT) son muy conocidos por sus propiedades inhibitorias de la transcriptasa inversa del HTVI. La solicitud de Patente europea, documento EP-0 462 800 (Merck and Company Inc.) describe piridinonas sustituidas en la posición 3 con un grupo arilo o un grupo heterocíclico, unido al anillo de piridinona a través de una cadena. Dolle y col. describen 4-arü-tio-pMciinonas (1995, J. Med. Chem. 38, 4679-4686), y en la correspondiente solicitud de Patente PCT, documento WO 97/05 113). Bisagni (documento U.S. 6.451.822) describe derivados de 3-(am¾no- o arninoalquil) pirodinona que también inhiben la transcriptasa inversa del Virus de la Inmunodeficiencia Humana (HIV). Estos derivados de pirimidinona y piridinona son adecuados, pero sin que se esté limitado a ellos, como el agente antiviral de la composición farmacéutica del presente invento. Agente que disminuye los niveles de glicoesfingolípidos. Un agente que disminuye los niveles de glicoesfingolípidos es cualquier compuesto cuya acción biológica da como resultado cantidades más bajas de glicoesfingolípidos celulares. Cientos de glicoesfingolípidos (GSL) derivan de la glucosñceramida (GlcCer), que se forma mediante reacción enzimática a partir de ceramida y UDP-glucosa. La enzima implicada en la formación de GlcCer es la UDP-glucosa:N-acilesfingosina glucosiltransferasa (GlcCer-sintetasa). La velocidad de formación de GlcCer en condiciones fisiológicas puede depender del nivel de UDP-glucosa del tejido, que a su vez depende del nivel de glucosa en un tejido particular (Zador, I. Z. y col. (1993), J. Clin. Invest. 91, 797-803). Ensayos in vitro basados en la ceramida endógena producen velocidades de síntesis más bajas que las mezclas que contienen ceramida añadida, lo que sugiere que los niveles de ceramida en los tejidos normalmente son también limitadores de la velocidad (Brekert, A. y col. (1972) Brain Res. 36, 183-193). Se ha encontrado que el nivel de GSL controla diversas funciones celulares, tales como el crecimiento, diferenciación y adhesión entre células o entre células y proteínas de matrices, unión de microorganismos y virus a las células, incluyendo la unión del HIV, y metástasis de células tumorales. Además, el precursor de la GlcCer, la ceramida, puede producir diferenciación o inhibición del crecimiento celular (Bielawska, A. y col. (1992) FEBS Letters, 307, 211-214). Es probable que todos los GSL experimenten una hidrólisis catabólica, por lo que cualquier bloqueo en la GleCer-sintetasa conduciría en último término al agotamiento de los GSL y a cambios profundos en el funcionamiento de una célula u organismo. Un inhibidor de la GlcCer-sintetasa, el PDMP (lR-fenol-2R-decanoilarnmo-3-morfolmo-l-propanol), previamente identificado en forma del D-treo isómero (Inokuchi, J. y col., (1987) J. Lipid Res. 28, 565-571), se ha encontrado que produce diversos cambios químicos y fisiológicos en células y en animales (Radin, N.S. y col., (1993) NeuroProtocols, A Companion to Methods in Neuroscienees, S.K. Fisher y col., Ed., (Academic Press, San Diego) 3, 145-155, y Radin, N.S. y col., (1993) Advances in Lipid Research; Sphingolipids in Signaling. Parte B., R.M. Bell y col., Ed (Academic Press, San Diego) 28:183-213). Se ha descubierto que compuestos con grupos acilo grasos de cadena más larga son sustancialmente más efectivos (Abe, A. y col., (1992) J. Biochem 111, 191-196). Shayman y col. (Patente de EE.UU. 6.255.336) describen compuestos amino similares a la ceramida que inhiben la formación de glucosil-ceramida (GlcCer) inhibiendo la enzima GlcCer-sintetasa y disrnimtyendo de este modo el nivel de glicoesfingolípidos. En particular, describen el D-t-3^4'-etüendioxi-l-fenil-2-palrmtoilammo-3-pirroHdmo-l-propanol y el D-t-4'-hidroxi- 1 -ferdl-2-palmitoilarni.no-3 -pirroHdino-1 -propanol y sus sales farmacéuticamente aceptables. Shayman y col., (Patente de EE.UU. 6.051.598) describe el uso de l-ferdl-2-palrrdtoilainmo-3-pirrohdino- 1-propanol y sus sales farmacéuticamente aceptables. Murantes de receptores para HTV-1 presentes en dominios sin balsas. CD4, CXCR4 y CR5 son receptores que están implicados en la entrada del HTV en las células. Los receptores de tipo salvaje se incorporan en dominios con balsas. Una realización del presente invento proporciona receptores modificados, mutados de manera tal que conservan la actividad de unión al HTV, los receptores no se localizan en dorr nios con balsas y/o dichos receptores no promueven la agregación de las balsas. Estos murantes se generan mediante mutación de los receptores naturales utilizando procedimientos estándar de ingeniería genética (Molecular Cloning: A laboratory manual (1989). J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. maniatis, Eds. Cold Spring Harbor Laboratory Press). Como ejemplo, el CD4-LDL es un receptor artificial para HIV-1, localizado en dorrünios sin balsas, al que el virus se une con la misma afinidad que al receptor CD4 natural. El receptor CD4-LDL no media en la entrada del HTV-1 en células CD4-negativas, y actúa como un receptor trampa en linfocitos CD4-positivos (del Real y col. (2002) J. Exp. Med. 196, 193-301). El receptor CD4-LDL se generó mediante clonación del dominio CD4 extracelular en el plásmido pcDNA3,lA digerido con Hindin pril (Invitrogen) por PCR utilizando 5'- GCCAAGCTTATGAACCGGGGAGTC-3 ' [SEQ ID NO: 1] y 5'-AGAGGTACCCATTGGCTGCACCGG-3' [SEQ ID NO: 2] para producir el pCD4ext. Los dominios de transmembrana y yuxtamembrana del receptor de lipoproteínas de baja densidad (LDL-R) se rescataron del plásmido pLGFP-GT46 utilizando 5'-GCAACGGTACCGCTCTGTCCATTG-3' [SEQ ID NO: 3] y 5'-CTACTCGAGGTTCTTAAGCCGCCA-3' [SEQ ID NO: 4], y se clonaron en el plásmido pCD4ext abierto con Kpnl EcoRI. Como consecuencia de ello, la quimera CD4-LDL contiene la secuencia de aminoácidos correspondiente al dominio extracelular del receptor CD4 natural, seguida de la secuencia sintética: GTALSIVLPIVLLVFLCLGVFLLWKNWRLKN [SEQ ID NO: 5]. La proteína artificial, pLGFP-GT46, contiene la secuencia señal de la lactasa-florizin-bidrolasa de conejo, la GFP, un sitio de consenso de N-glicosilación, el dominio de transmembrana del receptor LDL-humano generado por PCR [5 - CTGTACAAGCTTAACGGATCCAAGCTTCAGCGGCCGCACCAAGCTCTGGGCG A-3' [SEQ ID NO: 6] (cebador directo) y 5*-??????????????????????????????-3* [SEQ ID NO: 7] (cebador inverso), y la cola citoplásmica de CD46 (Maisner y col. (1997)). La proteína cofactor de membrana (CD46) es una proteína basolateral que no está endocitosada. Irthibidores de fusión dirigidos a las balsas. La fusión entre la membrana del hospedador y la membrana del virus es el resultado de un cambio conformacional en la gp41 viral, que da como resultado la formación de una hélice enrollada en espiral. La formación de un paquete de seis hélices puede ser inhibida mediante al adición de péptidos tomando como base el dominio helicoidal carboxi-terminal de gp41. Esos péptidos se unen al enrollamiento en espiral de tres cadena en el extremo amino terminal dé gp41, bloqueando la formación del paquete de seis hélices. Estos péptidos incluyen: T-20 (YTSLIHSL1EESQNQQE NEQELLELD ASLWNWT) [SEQ. ID. NO: 8] DP-207 ( ffiRDRElNNYTSLIHSL)EESQNQQEKNEQELLELDKVVASLW7 'WF) [SEQ. ID. -NO 9], DP-208 (L1EESQNQQEKNEQELLELD WASLW WF) [SEQ. ID. NO: 10], DP-209 (HSLIEESQNQQEKHEQELLELDKWASLWNWF) [SEQ. ID. NO: 11], DP-210 (LIHSLIEESQNQQEKNEQELIJELDKWASLWNWF) [SEQ. ID. NO: 12].

DP-211 (TSLÍHSLIEESQNQQE NEQELLELD WASLWNWF) [SEQ. ID. NO: 13], and DP-213 (LIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASL) [SEQ. ID. NO: 14] (WUd et al. (1994) Proc Nati Acad Sd USA 91: 9770-9774; ilby et al. (1998) Nat. Med. 4: 1302-1307).

Una realización del presente invento proporciona péptidos modificados basados en gp41 tales que se concentren en los dominios con balsas, introduciendo una secuencia de consenso unida a GPI en sus extremos C-tenninales. El Solicitante en trabajos previos ha demostrado que el GPI orienta eficazmente a los péptidos de anclaje hacia la hoja externa de los dominios con balsas (del Real y col. (2002) J. Exp. Med. 196, 293-301). Como se muestra en la Figura 8A, la fusión del HTV-1 se impide con el péptido: YTSLfflSLIEESQNQQE ^QELLELDK VASLV 'NWFYDPRPSSGHS YALIPlPLAVIT YTSLMSLIEESQNQQEKNEQELL resultante de la fusión de T20 y de la secuencia de unión unida a GPI, procedente del antígeno asociado a la función leucocitaria-3 (LFA-3; Seed, B. 1987. Án LFA-3 cDNA encodes a phospholipid-linked membrane protein ho ologous to its receptor CD2. Nature 329, 840-842). La señal de consenso-GPI, derivada de LFA-3 es una secuencia de aminoácidos preferida del presente invento. Sin embargo, la señal-GPI de las quimeras del invento no se limita a LFA-3. Inhibidores de proteasa dirigidos a las balsas. La proteasa activa de HTV-1 tiene una estructura homodimérica en la que las subunidades están conectadas por una interfase de lámina ß formada por los segmentos de los aminoácidos N-tenninal y C- terminal. Péptidos cortos derivados de estos segmentos son capaces de inhibir la actividad de la proteasa. Estos péptidos incluyen: : ISYEL [SEQ. ID. NO: 161 YEL TSEQ. inhibit the protease actívity. These peptides include ISYEL [SEQ. ID. NO: 16], YEL [SEQ í-nfaibitthe protease actívity. These peptides include ISYEL [SEQ. ID. NO: 16J. YEL [SEQ Una realización del presente invento proporciona péptidos modificados derivados de la proteasa de HTV, de manera tal que dichos péptidos se concentren en los dominios con balsas, introduciendo una secuencia de consenso de doble palrnitoilación en sus extremos N4erminales. Se ha observado que esta señal dirige a las proteínas citosólicas hacia la hoja interna de los doininios con balsas (Lacalle y col., (2002) J. Cell. Biol. 157, 277-289). Como se muestra en la Fig. 8B, la producción de partículas virales Luc-Ada está drásticamente disrninuida en células que expresan el péptido MGCGCSSHPEDDISYEL [SEQ ID NO: 21], que corresponde a la fusión de los 12 aminoácidos procedentes del dominio único Lck y del péptido ISYEL [SEQ ID NO: 16] de la proteasa de HTV-1, utilizando técnicas convencionales de ingeniería genética. Asimismo, el procesamiento de Gag disminuye enormemente en células que expresan este péptido quimera. La señal de consenso de palrnitoilación derivada de Lck es una secuencia de aminoácidos preferida del presente invento. No obstante, la señal de doble acilación de las quimeras del invento no se limitan a Lck. La frase "farmacéuticamente aceptables" se utiliza aquí para hacer referencia a los compuestos, materiales, composiciones y/o formas de dosificación que, dentro del alcance de un juicio médico ponderado, son adecuados para utilizar en contacto con tejidos de seres humanos y animales, sin que presenten una toxicidad, irritación o respuesta alérgica excesivas, u otro problema o complicación, compensados con una proporción razonable de beneficio/riesgo. Según aquí se utiliza, la expresión "sales farmacéuticamente aceptables" incluye las sales, solvatos o derivados farmacéuticamente aceptables (derivados entre los que se incluyen complejos, formas polimórficas, profármacos y compuestos marcados isotópicamente, así como sus sales, solvatos y sus sales solvatos), y sus isómeros, de los compuestos descritos.

En una realización más, los compuestos del invento incluyen estatinas y sus sales y solvatos farmacéuticamente aceptables. Debe entenderse que los compuestos del invento anteriormente mencionados incluyen sus formas polimórficas y sus isómeros. Las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos del invento incluyen sus sales de adición de ácido y sus sales básicas. Las sales de adición de ácido adecuadas se forman a partir de ácidos que forman sales no tóxicas. Como ejemplos se incluyen las sales acetato, aspartato, benzoato, besilato, bicarbonato, bisulfato, borato, bromuro, camsilato, carbonato, cloruro, citrato, edisilato, esilato, formiato, fumarato, glucepato, gloconato, glucoronato, hexafluorofosfato, hibenzato, hidrobromuro, hidrocloruro, hidroyoduro, yoduro, isetionato, lactato, malato, maleato, malonato, mesilato, metilsulfato, naftilato, 2-napsilato, nicotinato, nitrato, orotato, oxalato, palmitato, pamoato, fosfato/bidrógenofosfato/dihidrógenofosfato, sacarato, estearato, succinato, sulfato, tartrato, tosilato y trifluoroacetato. Las sales básicas adecuadas se forman a partir de bases que forman sales no tóxicas. Como ejemplos se incluyen las sales de aluminio, arginina, benzatina, calcio, colina, dietílamina, diolamina, glicina, lisina, magnesio, meglumina, olamina, potasio, sodio, trometamina y zinc. También pueden formarse semisales de ácidos y bases, por ejemplo, las sales semisulfato y semicálcicas. Para una revisión de sales adecuadas, véase Hanáboók of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, por Stahl y Wermuth (Wiley-VCH, Weinheim, Alemania, 2002). Las sales farmacéuticamente aceptables del presente invento pueden preparase a partir del compuesto de origen que contiene un resto básico o ácido, mediante métodos químicos convencionales. Generalmente, estas sales pueden prepararse haciendo reaccionar las formas de ácido libre o de base de estos compuestos con una cantidad estequiométrica de la base o del ácido apropiados, en agua o en un disolvente orgánico o en una mezcla de ambos; generalmente se prefieren medios no acuosos como éter, acetato de etilo, etanol, isopropanol o acetonitrilo. Las listas de sales adecuadas se encuentran en Remington's Pharmaceutical Sciences, 17a Edición, ack PubHshing Company, Easton, Pa., 1985, pág. 1418, cuya descripción se incorpora aquí como referencia.

La composición farmacéutica del invento puede administrarse en forma de productos cristalinos o amorfos. Estos productos pueden obtenerse, por ejemplo, en forma de rellenos sólidos, polvos, o películas, mediante métodos tales como precipitación, cristalización, liofilización, secado por pulverización o secado por evaporación. El secado por microondas o radiofrecuencia puede utilizarse para este fin. Pueden administrarse solas o en combinación con uno o más de otros compuestos del invento, o en combinación con uno o más de otros fármacos (o en alguna de sus combinaciones). Generalmente, pueden administrarse como una formulación en asociación con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptable. El término "excipientes" se usa aquí para describir cualquier componente distinto del compuesto(s) del invento. La elección del excipiente dependerá en gran medida de factores tales como el modo particular de administración, el efecto del excipiente sobre la solubilidad y estabilidad, y la naturaleza de la forma de dosificación. Las composiciones farmacéuticas adecuadas para el suministro de los compuestos del invento y los métodos para su preparación resultarán evidentes para los expertos en la técnica. Estas composiciones y los métodos para su preparación pueden encontrarse, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, 19a Edición, (Mack Publishing Compan , 1995). Los compuestos del invento pueden administrarse por vía oral. La administración oral puede implicar la deglución, de modo que el compuesto entra en el tracto gastrointestinal, o pueden utilizarse la administración bucal o sublingual mediante las cuales el compuesto entra en el torrente sanguíneo directamente desde la boca. Las formulaciones adecuadas para aclministración oral incluyen formulaciones sólidas tales como comprimidos, cápsulas que contienen partículas, líquidos, o polvos, pastillas para chupar (incluyendo las rellenas de líquido) chicles, multipartículas y nanopartículas, geles, disoluciones sólidas, liposomas, películas (incluyendo mucoadhesivas), óvulos, pulverizadores y formulaciones líquidas. Las formulaciones líquidas incluyen suspensiones, disoluciones, jarabes y elixires. Estas formulaciones pueden utilizarse como agentes de relleno en cápsulas duras o blandas y típicamente comprenden un excipiente, por ejemplo, agua, etanol, poHetilenglicol, propilenglicol, metilcelulosa, o un aceite adecuado, y uno o más agentes emulsionantes y/o agentes favorecedores de la supensión. Las formulaciones líquidas también pueden preparase medíante la reconstitución de un sólido, por ejemplo, de un sobre. Los compuestos del invento también pueden utilizarse en formas de dosificación de disolución rápida y desintegración rápida tales como las descritas en Expert Opinión in Therapeutic Patents, 11(6), 981-986, de Liangy Chen (2001). Para las formas de dosificación en comprimidos, dependiendo de la dosis, el fármaco puede constituir desde el 1% en peso hasta 80% en peso de la forma de dosificación, más típicamente, desde 5% en peso hasta 60% en peso de la forma de dosificación. Además del fármaco, los comprimidos generalmente contienen un disgregante. Ejemplos de disgregantes incluyen glicolato de sodio y almidón, carboximetilcelulosa sódica, carboximetilcelulosa calcica, croscarmelosa sódica, crospovidona, polivímlpirrolidina, metilcelulosa, celulosa microcristalina, hidroxipropilcelulosa sustituida con un alquilo inferior, almidón, almidón pregelatírdzado y alginato sódico. Generalmente, el disgregante comprenderá desde 1% en peso hasta 25% en peso, preferiblemente desde 5% en peso hasta 20% en peso de la forma de dosificación. Los aglutinantes generalmente se utilizan para impartir cualidades cohesivas a una formulación de comprimidos. Aglutinantes adecuados incluyen celulosa microcristalina, gelatina, azúcares, polietilenglicol, gomas naturales y sintéticas, poHvinilpirrolidona, almidón pregelatinizado, hidroxipropilcelulosa e nidroxipropilmetilcelulosa. Los comprimidos también pueden contener diluyentes, tales como lactosa (en forma monohidrato, monobidrato secada por pulverización, anhidra y formas similares), manitol, xilitol, dextrosa, sacarosa, sorbitol, celulosa microcristalina, almidón y fosfato calcico dibásico dihidratado. Los comprimidos también pueden incluir de manera opcional agentes tensioactivos, tales como laurilsulfato sódico y polisorbato 80, y deslizantes tales como dióxido de silicio y talco. Cuando están presentes, los agentes tensioactivos pueden constituir desde el 0,2% en peso hasta el 5% en peso del comprimido, y los deslizantes pueden comtituir desde el 0,2% en peso hasta el 1% en peso del comprimido. Los comprimidos contienen también lubricantes tales como estearato de magnesio, estearato de calcio, estearato de zinc, estearilfumarato sódico, y mezclas de estearato de magnesio con laurilsulfato sódico. Los lubricantes generalmente constituyen desde el 0,25% en peso hasta el 10% en peso del comprimido, preferiblemente desde el 0,5% en peso hasta el 3% en peso del comprimido. Otros componentes posibles incluyen antioxidantes, colorantes, sáborizantes, conservantes, y agentes enmascaradores del sabor. Las mezclas para la preparación de comprimidos pueden comprimirse directamente o por medio de rodillos para formar los comprimidos. Las mezclas para la preparación de comprimidos, o porciones de las mezclas, pueden de manera alternativa someterse a una granulación por vía húmeda, granulación por vía seca, o granulación de un material tundido, a una congelación de un material rundido, o a una extrusión, antes de la formación de los comprimidos. La formulación final puede comprender una o más capas y puede estar recubierta o no recubierta; puede incluso ir encapsulada. La formulación de comprimidos se trata en "Pharmaceuñcal Dosage Forms: Tablets, Vol. 1", de H. Lieberman y L. Lachman, Marcel Dekker, N.Y., N. Y. 1980 (ISBN 0-8247-6918-X) Las formulaciones sólidas para administración oral pueden formularse para que sean de liberación inmediata y/o modificada. Las formulaciones de liberación modificada incluyen la liberación retardada, prolongada, pulsada, controlada, dirigida y programada. Formulaciones de liberación modificada adecuadas para los fines del invento se encuentran escritas en la patente de EE.UU. n.° 6.106.864. Los detalles de otras tecnologías de liberación adecuadas tales como dispersiones de alta energía y partículas osmóticas y recubiertas se pueden encontrar en Verma y col., (2001) Pharmaceutical Technology On-line, 25(2), 1-14. El uso de goma de mascar para conseguir una liberación controlada se encuentra descrito en el documento O 00/35298. Los compuestos del invento también pueden administrarse directamente al torrente circulatorio, al músculo, o a un órgano interno. Medios adecuados de administración parenteral incluyen las vías intravenosas, intraarterial, intraperitoneal, intratecal, intraventricular, intrauretral, intraesternal, intracraneal, intramuscular, y subcutánea. Los dispositivos adecuados para una administración parenteral incluyen inyectores de aguja (incluyendo microagujas), inyectores sin aguja y técnicas de infusión.

Las formulaciones parenterales son típicamente disoluciones acuosas que pueden contener excipientes tales como sales, carbohidratos y agentes tampón (preferiblemente a un pH de 3 a 9), pero en el caso de algunas aplicaciones, las disoluciones pueden formularse de modo más adecuado en forma de una disolución esterilizada no acuosa o en una forma seca para ser utilizada junto con un vehículo adecuado tal como agua esterilizada y libre de pirógenos. La preparación de formulaciones parenterales en condiciones estériles, por ejemplo, por liofilización, puede llevarse a cabo fácilmente utilizando técnicas farmacéuticas estándar muy conocidas por los expertos en la técnica. La solubilidad de los compuestos del invento utilizados en la preparación de disoluciones parenterales puede aumentarse mediante el uso de técnicas de formulación apropiadas, tales como la incorporación de agentes potenciadores de la solubilidad. Las formulaciones para la administración parenteral pueden formularse para que sean de liberación inmediata y/o modificada. Las formulaciones de liberación modificada incluyen la liberación retardada, prolongada, pulsada, controlada, dirigida y programada. De este modo los compuestos del invento pueden administrarse en forma de un sólido, semisólido, o líquido tixotrópico para en una forma depot implantada que proporciona la liberación modificada del compuesto. Ejemplos de estas formulaciones incluyen los dispositivos revestidos de fármaco y las microesferas de PGLA. Los compuestos del invento pueden también administrarse por vía tópica en la piel o mucosas, esto es por vía dérmica o transdérmica. Las formulaciones típicas para este fin incluyen geles, hidrogeles, lociones, disoluciones, cremas, ungüentos, polvos sueltos, vendajes, espumas, películas, parches dérmicos, láminas, implantes, esponjas, fibras, apositos y microemulsiones. También pueden utilizarse liposomas. Los vehículos típicos incluyen alcohol, agua, aceite mineral, vaselina líquida, vaselina blanca, gficerina, polietinelglicol y propinelglicol. Pueden incorporarse agentes potenciadores de la penetración, véase por ejemplo, J. Pharm. Sci, (Octubre 1999) 88(10), 955-958 de Finnin y Morgan.

Otros medios de administración tópica incluyen el suriiinistro por electroporación, iontoforesis, fonoforesis, sonoforesis, y inyección con microagujas o sin agujas (p. ej.s Powderject™, Bioject™, etc.) Las formulaciones para adnmustración tópica pueden formularse para que sean de liberación inmediata y/o modificada. Las formulaciones de liberación modificada incluyen la liberación retardada, prolongada, pulsada, controlada, dirigida y programada. Los compuestos del invento también pueden administrarse por vía intranasal o mediante inhalación, típicamente en forma de un polvo seco (ya sea sólo, en forma de una mezcla, por ejemplo, en una mezcla seca con lactosa, o en forma de partículas de componentes mezclados, por ejemplo, mezclados con fosfolípidos, tales como fosfatidilcolina) con un inhalador de polvo seco o en forma de aerosol con un recipiente presurizado, bomba, pulverizador, atomizador preferiblemente un atomizador que utiliza compuestos electrodinámicos para producir una niebla fina), o un nebulizador, con o sin el uso de un propelente adecuado, tal como 1,1,1,2-tetrafiuoroetano o 1,1,1,2,3,3,3-heptafluoropropano. Para uso intranasal, el polvo puede incluir un agente bioadhesivo, por ejemplo, quitosán o ciclodextrina. El recipiente presurizado, bomba, pulverizador, atomizador o nebulizador, contiene una disolución o suspensión del compuesto que comprende, por ejemplo, etanol (opcionalmente, etanol acuoso) o un agente alternativo adecuado para dispersar, solubilizar, o prolongar la liberación del compuesto, el propelente(s) en forma de disolvente y un tensioactivo opcional, tal como trioleato de sorbitán, ácido oleico o un ácido oligoláctico. Antes de su utilización en una formulación en forma de polvo seco o suspensión, el producto del fármaco se microniza hasta alcanzar un tamaño adecuado para su suministro por inhalación (típicamente menor que 5 micrómetros). Esto puede conseguirse mediante cualquier método de triturado apropiado, tal como molido de chorro espiral, molido de chorro en lecho fluido, procesamiento de fluidos supercríticos, para formar nanopartículas, una homogeneización a alta presión o secado por pulverización. Las cápsulas (fabricadas, por ejemplo, con gelatina o HPMC), envases blíster y cartuchos para usar en un inhalador o insuflador, pueden formularse de manera que contengan una mezcla pulverizada del compuesto del invento, una base pulverizada adecuada tal como lactosa o almidón y un modificador de la funcionalidad, tal como leucina, manitol o estearato de magnesio. La lactosa puede ser anhidra o estar en forma de monohidrato, preferiblemente esto último. Otros excipientes adecuados incluyen dextrano, glucosa, maltosa, sorbitol, xilitol, fructosa, sacarosa y trealosa. Una formulación de una disolución adecuada para usar en un atomizador utilizando compuestos electrodmámicos para producir una niebla fina puede contener desde 1 microgramo hasta 20 miligramos del compuesto del invento por dispensación, y el volumen de dispensación puede variar desde 1 microlitro hasta 100 microlitros. Una formulación típica puede comprender un compuesto del invento, propilenglicol, agua esterilizada, etanol y cloruro sódico. Disolventes alternativos que pueden utilizarse en lugar del propilenglicol incluyen glicerol y polietilenglicol. Aromatizantes adecuados tales como mental y levomentol, o edulcorantes tales como sacarina o sacarina sódica, pueden añadirse a aquellas formulaciones del invento destinadas a una administración inhalada intranasal. Las formulaciones destinadas a una administración inhalada/intranasal pueden formularse para que sean de liberación inmediata y/o modificada, usando, por ejemplo, ácido poli DL)-láctico-coglicólico (PGLA). Las formulaciones de liberación modificada incluyen la liberación retardada, prolongada, pulsada, controlada, dirigida y programada. En el caso de inhaladores de polvo seco y aerosoles, la unidad de dosificación se determina por medio de una válvula que libera una cantidad medida. Las unidades de acuerdo con el invento se distribuyen típicamente para administrar una unidad medida o "p ff" que contiene desde 1 microgramo hasta 10 miligramos del compuesto del invento. La dosis diaria total típicamente estará en el intervalo de 1 microgramo a 200 miligramos que pueden administrarse en una sola dosis o, más usualmente, en dosis divididas a lo largo del día. Los compuestos abarcados por el invento pueden administrase por vía rectal o vaginal, por ejemplo, en forma de supositorios, óvulos vaginales o enemas. La manteca de cacao es una base tradicional para supositorios, pero pueden utilizarse distintas alternativas como apropiadas.

Las formulaciones destinadas a una administración rectal/vaginal pueden formularse para que sean de liberación inmediata y/o modificada. Las formulaciones de liberación modificada incluyen la liberación retardada, prolongada, pulsada, controlada, dirigida y programada. Los compuestos incluidos en el invento también pueden administrase directamente en ojo u oído, típicamente en forma de gotas de una suspensión micronizada o de una disolución en disolución salina isotónica, de pH ajustado y esterilizada. Otras formulaciones adecuadas para la administración ocular y aural incluyen ungüentos, implantes biodegradables (p. ej., esponjas de gel ábsorbibles, colágeno) e implantes no biodegradables (p. ej., silicona), láminas, lentillas y sistemas de partículas o vesículas, tales como niosomas o liposomas. Un polímero tal como poli(ácido acrílico), poli(alcohol vinílico), ácido hialurónico, un polímero celulósico, por ejemplo, Mdroxipropilmetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, o metücelulosa, o un polímero de heteropolisacáridos, por ejemplo, goma gelán, reticulados, puede incorporarse junto con un conservante tal como cloruro de benzalconio. Estas formulaciones también pueden surrrinistrarse por iontoforesis. Las formulaciones destinadas a una administración ocular/aural pueden formularse para que sean de liberación inmediata y/o modificada. Las formulaciones de liberación modificada incluyen la liberación retardada, prolongada, pulsada, controlada, O dirigida y programada. Los inhibidores de isopre ilación de proteínas del invento pueden mezclarse con entidades macromoleculares solubles, tales como ciclodextrina y sus derivados adecuados o polímeros que contienen polietilenglicol, con el fin de mejorar su solubilidad, velocidad de disolución, enmascaramiento del sabor, biodisponibilidad y/o 5 estabilidad, para usar en los modos de administración anteriormente mencionados. Los complejos de fámiaco-ciclodextrina, por ejemplo, generalmente se encuentra que son útiles para la mayoría de las formas de dosificación y vías de administración. Pueden utilizarse complejos de inclusión y complejos de no inclusión. Como alternativa a una formación directa de complejos con el fármaco, la ciclodextrina O puede utilizarse como aditivo auxiliar, es decir, como vehículo, diluyeme, o solubilizante.

Las ciclodextrinas más comúnmente utilizadas para estos fines son las ciclodextrinas a, beta y gamma, de las que pueden encontrarse ejemplos en las solicitudes de Patente Internacional, documentos WO 91/11172, WO 94/02518 y WO 98/55148. En la medida en que puede ser conveniente administrar un inhibidor de isoprenilación de proteínas en combinación con otro agente terapéutico, por ejemplo, con el fin de tratar una enfermedad o estado particular, está incluido en el alcance del presente invento que dos o más composiciones farmacéuticas, de las que al menos una contenga un inhibidor de isoprenilación de proteínas, puedan mezclarse convenientemente en forma de un kit adecuado para la coadministración de las composiciones. Así, el kit del invento comprende dos o más composiciones farmacéuticas independientes, de las cuales al menos una contiene un inhibidor de isoprenilación de proteínas o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, y medios para conservar dichas composiciones por separado, tales como un recipiente, un frasco con divisiones, o un empaquetamiento en lámina metálica con divisiones. Un ejemplo de un kit de este tipo es el envase blíster familiar utilizado para el envasado de comprimidos, cápsulas y formulaciones similares. El kit del invento es particularmente adecuado para administrar formas de dosificación diferentes, por ejemplo, oral y parenteral, para administrar las composiciones individuales a intervalos de dosificación diferentes, o para titular las composiciones individuales una frente a otra. Para ayudar al cumplimiento terapéutico, el kit incluye típicamente pautas para la administración y puede ir provisto de una de las denominadas ayudas para la memoria. Para la adnrinistración a pacientes humanos, que tienen un peso desde aproximadamente 65 kg hasta 70 kg, la dosis diaria total del inhibidor de isoprenilación de proteínas está típicamente en el intervalo de 1 mg a 10.000 mg, tal como una dosis de 10 mg a 1.000 mg, por ejemplo, de 25 mg a 500 mg, dependiendo por supuesto del modo de adniinistración, de la edad, estado y peso del paciente, y estará en cualquier caso a criterio final del médico. La dosis diaria total puede adrninistrarse en dosis únicas o divididas. Por consiguiente, en otro aspecto el invento proporciona una composición farmacéutica que incluye un inhibidor de isoprenilación de proteínas o una de sus sales, solvatos o derivados farmacéuticamente aceptables, junto con uno o más excipientes, diluyentes o vehículos farmacéuticamente aceptables.

Los inhibidores de isoprerdlación de proteínas y sus sales, solvatos y derivados faimacéuticameríte aceptables, pueden adrmnistrarse solos o como parte de un tratamiento combinado. Por ello, incluidas en el alcance del invento existen realizaciones que comprenden la coadmdnistración de composiciones que contiene, ademas de un compuesto del invento, uno o más agentes terapéuticos adicionales. Estos regímenes de múltiples fármacos, usualmente denominados tratamiento combinado, puede utilizarse en el tratamiento y prevención de una infección producida por el virus de la inmunodeficiencia humana, HTV. El uso de un tratamiento combinado de este tipo es especialmente pertinente en relación con el tratamiento y prevención de la infección y multiphcación del virus de la inmunodeficiencia humana, HIV, y de retrovirus patogénicos emparentados, en un paciente que necesita el tratamiento o en un paciente que está en riesgo de convertirse en ese paciente. La capacidad de esos patógenos retrovirales para evolucionar en un período de tiempo relativamente corto hacia cepas resistentes a cualquier monoterapia que haya sido administrada a dicho paciente es muy conocida en la literatura. Un tratamiento recomendado para el HTV es un tratamiento combinado de fármacos denominado Terapia retroviral sumamente activa, o HAART (del inglés, " ighly Active Anti-Retroviral Therapy"). La HAART mezcla tres o más fármacos contra HTV. Así, los métodos de tratamiento y las composiciones farmacéuticas del presente invento pueden utilizar un inhibidor de la isopremlación de proteínas en forma de monoterapia, pero dichos métodos y composiciones pueden también utilizarse en forma de una terapia combinada en la que uno o más inhibidores de la isopre dlación de proteínas se coadrninistran en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales tales como los que aquí se describen con detalle en lo que antecede y en lo que viene a continuación. En una realización más del invento, las combinaciones del presente invento incluyen el tratamiento con un inhibidor de isoprerdlación de proteínas, o con una de sus sales, solvatos o derivados farmacéuticamente aceptables, y uno o más agentes terapéuticos adicionales seleccionados entre los siguientes: inhibidores de la proteasa de HIV, que incluyen, pero no se limitan a ellos, indinavir, ritonavir, saquinavir, nelfmavir, lopinavir, amprenavir, atazanavir, tipranavir, AG1859 y TMV114; inhibidores no nucleosídicos de la transcriptasa inversa ( NRTI) (del inglés, "Non-N cleoside Reverse Transcriptase Inkibitors"), que incluyen, pero no se limitan a ellos, neviparina, delavirdina, capravirina, efavirenz, GW-8248, GW-5634 y TMC125; inhibidores nucleosídicos/nucleotídicos de la transcriptasa inversa que incluyen, pero no se limitan a ellos, zidovudina, didanosina, zalcitábina, estavudina, lamivudina, abacavir, adefovir, dipivoxil, tenofovir y emtricitabina; antagonistas de CCR5, que incluyen, pero no se limitan a ellos, N-{(lS)-3-[3-(3-isopropü-5-metil-4H-l52,4-triazol-4-il)-exo-8-azabaciclo[3.2 ]oct-8-ü]l-fenilpropil} ,4,-difluorociclohexanocarboxamida o una de sus sales, solvatos o derivados farmacéuticamente aceptables, l-endo-{8-[(3S)-3-(acetüamino)-3-(3-fluorofenil) propil]-8-azabiciclo[3.2.1]oct-3-il}-2-metil-l,4,6,7-tetraMdro-5H-irnidazol[4,5-c]pMdina-5-carboxi^ de metilo o una de sus sales, solvatos o derivados farmacéuticamente aceptables; l-endo-{8-[(3S)-3-(acetilamino)-3-(3-fluorofenU)propil]-8-azabiciclo[3.2^]oct-3-ñ}-2-metü-4,5,6,7-tetrahidro-lH-irmdazol[4,5-c]pMdina-5-carboxilato de etilo o una de sus sales, solvatos o derivados farmacéuticamente aceptables; Sch-D, ONO-4128, GW-873140, AMD-887 y CMPD-167; inhibidores de integrasa, que incluyen pero no se limitan a ellos, L-870.810; inhibidores de la entrada (p. ej., fusión), que incluyen pero no se limitan a ellos, enfuviritida; otros agentes que inhiben la interacción de gpl20 con CD4, que incluyen pero no se limitan a ellos, BMS806 y BMS-488043; e inhibidores de la RNasaH. También se incluyen en el alcance del presente invento, combinaciones de un inhibidor de isoprenilación de proteínas, o una de sus sales, solvatos, o derivados farmacéuticamente aceptables, junto con uno o más agentes terapéuticos adicionales, seleccionados de manera independiente entre el grupo constituido por, p. ej., hidroxiurea; inmunomoduladores tales como factores de crecimiento estimuladores de colonias de granulocitos-macrófagos (p. ej., sargramostin), y distintas formas de interferón o de derivados de interferón; otros agonistas/antagonistas de receptores de quirráoquinas, tales como antagonistas de CXC 4 (p. ej., AMD-070 y AMD-3100); moduladores de receptores de taquiquininas (p. ej., antagonistas de NK1) y distintas formas de interferón o de derivados de interferón; inhibidores de la transcripción viral y de la replicación del RNA viral; agentes que influyen, en particular regulan por disminución, la expresión de receptores CCR5; quinuoquinas que inducen la internalización de receptores CCR5 tales como ???-? , ???-?ß, RANTES y sus derivados; y otros agentes que inhiben infecciones virales o que mejoran el estado o la respuesta de individuos infectados por HTV a través de diferentes mecanismos.

Agentes que influyen, (en concreto, regulan por disminución) la expresión de receptores CCR5 incluyen inmunosupresores tales como inhibidores de calcmeurina (p. ej.5 tacrolimus y ciclosporín A); esteroides; agentes que interfieren con la producción o señalización de citoquinas, tales como inhibidores de las quinasas de Janus (JA ) (p. ej, inhibidores de JAK-3, que incluyen 3-{(3R, 4R.)-4-metil-3-[metil-(7H-pirrolo[2,3,-d]pirirrüdm-l-ü}-3-oxo-propiomtrilo) y sus sales solvatos o derivados farmacéuticamente aceptables; anticuerpos contra citoquinas (p. ej., anticuerpos que inhiben al receptor de la mterleuquina-2 (JL-2), incluyendo basiliximab y daclizumab); y agentes que interfieren con la activación celular o con los ciclos celulares, tales como la rapamicina. También están incluidas en el alcance del presente invento, combinaciones de un inhibidor de isoprenilación de proteínas, o una de sus sales, solvatos o derivados farmacéuticamente aceptables, junto con uno o más agentes terapéuticos adicionales que frenan la velocidad del metabolismo de los compuestos del invento, produciendo con ello una exposición incrementada en los pacientes. Aumentar la exposición de esta manera se conoce como reforzar. Esto tiene el beneficio de aumentar la eficacia del compuesto del invento o de dismmuir la dosis requerida hasta alcanzar la misma eficacia que con una dosis sin reforzar. El metabolismo de los compuestos del invento incluye procesos oxidativos llevados a cabo por enzimas P450 (CYP450), concretamente CYP3A4, y conjugación por acción de UDP glucoronosil-transferasa y enzimas de sulfatación. Así, entre los agentes que pueden utilizarse para aumenta la exposición de un paciente a un compuesto del presente invento se encuentran aquellos agentes capaces de actuar como inhibidores de la menos una de las isoformas de las enzimas del citocromo P450 (CYP459). Las isoformas de CYP450 que pueden ser inhibidas ventajosamente incluyen, pero no se limitan a ellas, CYP1A2, CYP2D6, CYP2C9, CYP2C19 y CYP3A4. Los agentes adecuados que pueden utilizarse para inhibir CYP3A4 incluyen, pero no se limitan a ellos, ritonavir, saquinavir o ketoconazol. Un experto en la técnica apreciará que un tratamiento combinado de fármacos, según se ha descrito aquí en lo que antecede, puede comprender dos o más compuestos que tienen el mecanismo de acción igual o diferente. Así, sólo a modo de ilustración, una combinación puede comprender un compuesto del invento y: uno o más NNRTI; uno o más NRTI y un PI; uno o más NRTI y un antagonista de CCR5; un PI; un PI y un NNRTI; y así sucesivamente.

Además del requerimiento de una eficacia terapéutica, que puede necesitar el uso de agentes terapéuticos además de los inhibidores de isoprenilación de proteínas, pueden existir razonamientos adicionales que empujen o recomienden enormemente el uso de una combinación de un compuesto del invento y de otro agente terapéutico, tal como en el tratamiento de enfermedades o estados que son resultado directo de la enfermedad o estado básico o subyacente, o que indirectamente lo acompañan. Por ejemplo, puede ser necesario, o al menos conveniente, tratar infecciones producida por el Virus de la Hepatitis C (HCV), Virus de la Hepatitis B (HBV), Papilomavirus Humano HPV), infecciones oportunistas (que incluyen infecciones bacterianas y fúngicas), neoplasmas y otros estados que se producen como resultado del estado inmunocomprometido del paciente que está siendo tratado. Otros agentes terapéuticos pueden utilizarse con los compuestos del invento, p. ej., con el fin de proporcionar inmunoestimulación o para tratar el dolor y la inflamación que acompañan la infección inicial y fundamental del HTV. Por consiguiente, los agentes terapéuticos para utilizar en combinación con los compuestos de la fórmula (I) y con sus sales, solvatos o derivados farmacéuticamente aceptables, incluyen también interferones, interferones tratados con polietilenglicol (p. ej., peg-interferón alfa-2a y peg-interferón alfa-2b), lamivudina, ribavirina y emtricitábina, para el rratamiento de hepatitis; compuestos antifúngicos tales como fluconazol, itraconazol y voriconazol; compuestos antibacterianos tales como azitromicina y claritromicina; interferones, daunorrubicina, doxorruhicina y paclitaxel para el tratamiento del sarcoma de aposi relacionado con el SIDA; y cidofovir, fomivirsen, foscarnet, ganciclovir y valcyte para el tratamiento de la retinitis producida por citomegalovirus (CMV). Otras combinaciones para usar conforme al invento incluyen combinaciones de un inhibidor de isoprenilación de proteínas, o una de sus sales, solvatos o derivados farmacéuticamente aceptables, junto con antagonistas de CCR1, tales como BX-471; un agonista de ß-adrenoceptores tal como salmeterol; un agonista de corticosteroides tal como propionato de fluticasona; un antagonista de LTD4 tal como montelukast; un antagonista muscarínico tal como bromuro de tiotropium; un inhibidor de PDE4 tal como colimilast o roflurnilast; un inhibidor de COX-2, tal como celecoxib, valdecoxib o rofecoxib; un ligando de a-2-delta tal como gabapentín o pregabalín; un interferón beta tal como REBIF; un modulador de receptores de TNF tal como un inhibidor de TNF-a (p. ej., adalimumab), un inhibidor de la HMG-CoA-reductasatal como una estatina (p. ej., atorvaestatina), o un iranunosupresor, tal como ciclosporina o un macrólido tal como tacrolimus. En las combinaciones anteriormente descritas, el inhibidor de isoprenilación de proteínas, o una de sus sales, solvatos o derivados farmacéuticamente aceptables, y otro agente(s) terapéutico, puede administrarse, con respecto a las formas de dosificación, o bien por separado o bien al mismo tiempo uno en relación con el otro, y con respecto a su tiempo de a&ninistración pueden administrarse simultáneamente o en orden secuencia!. Así, la administración de uno de los agentes componentes puede ser antes, al mismo tiempo, o después de la administración del otro agente(s) componente. Por consiguiente, en un aspecto más el invento proporciona una composición farmacéutica que comprende un inhibidor de isoprenilación de proteínas, o una de sus sales, solvatos o derivados farmacéuticamente aceptables, y uno o más agentes terapéuticos adicionales. Se tendrá en cuenta que todas las referencias aquí incluidas al tratamiento incluyen tratamiento curativo, paliativo y profiláctico. La composición farmacéutica del invento puede ser también adecuada para terapia génica de células diana del HTV. Además de a primates, tales como los seres humanos, otros mamíferos diversos pueden ser tratados conforme al método del presente invento. Por ejemplo, los mamíferos que incluyen, pero no se limitan a ellos, vacas, ovejas, cabras, caballos, perros, gatos, cobayas, ratas u otros animales bovinos, ovinos, equinos, felinos, roedores o especies murinas, pueden ser tratados. No obstante el método también puede practicarse en otras especies.

EJEMPLOS Como se ha ilustrado anteriormente, las estatuías inhiben una infección de ratones SCID injertados con células mononucleares de sangre periférica humana, adultas, (PBMC; SCED.hu-PBMC), un modelo in vivo de una infección aguda por HTV. Los resultados ilustran también que las estatinas inhibeE la entrada de virus, y la salida de las células diana, atacando la geranilación de Rho. Sorprendentemente, la administración oral de estatina durante un mes disminuye el número de copias del KNA del HIV-1 en individuos que padecen una infección crónica por HIV-1 y que no están recibiendo HAART (Tabla 1).

Tabla I. Parámetros clínicos de pacientes infectados con HIV-1 y tratados con estatuías Estos datos proporcionan la evidencia que apoya el principio del uso de estatinas agentes terapéuticos anti-retrovirales.

MATERIALES Y MÉTODOS Infección por HIV-l. Se llevaron a cabo infecciones de una sola ronda con un pNL4-3.Luc.R-E, defectivo en replicación, seudotipificado con las cubiertas del HTV-IADA O del virus de la estomatitis vesicular (VSV) (Mañes, S. y col. (2000) EMBO Rep, 1, 190-196). Células MT2-CCR5 (obsequio de J. Alcamí, Inst. Salud Carlos ?, Madrid, España) se trataron con lovastatina 10 µ? (4S h, 37°C) sola o mezclada con L-mevalonato (200 µ?, pirofostado de geranilgeranilo (GGPP, 5 µ?) pirofosfato de farnesilo (FPP, 5 µ?) o colesterol (5 µ?, todo ello procedente de Sigma), o con GGRT-286 (10 µ?) o FTI-277 (10 µ?, ambos procedentes de Calbiochem) antes de transducirlas con los sobrenadantes virales (multiplicidad de infección 0.1 ; 2 h, 37°C). La infectividad de determinó pasadas 24 h midiendo la actividad de luciferasa (Mañes, S. y col. EMBO Rep. 1, 190-196, del Real G. y col., (2002). J. Exp. Med 196, 293-301). Experimentos similares se llevaron a cabo utilizando células MT2-CCR5 que expresan Rho de tipo salvaje, marcado de GFP, Rae de tipo salvaje, o los murantes Rho-N19 o Ra-N17 (obsequio de F.Sánchez-Madrid, Hospital de la Princesa, Madrid, España. Los ensayos de fusión célula-célula inducidos por gpl60 fueron según los descritos (Mañes, S. y col. (2000) EMBO Rep, 1, 190-196). PBMC purificadas en gradientes de Ficoll-Hypaque (Amersham Biosciences) se activaron durante 2 días con fitohematoglutinina (PHA; 1 µ^???) e IL-2 (50 ng ml), y se trataron (48 h, 37°C) con lovastatina o lovastatina + mevalonato. Las PBMC tratadas se incubaron con preparaciones virales de reserva de L4-3 o BaL (1 ó 10 ng de antígeno p24/106 células, 3 h, 37°C). Diariamente se recogieron sobrenadantes libres de células procedentes de las células cultivadas (0,5 x 106 ml) y se ensayaron con respecto a la presencia del antígeno p24 (Coulter). Para la infección ex vivo, células PBMC se purificaron procedentes de donantes informados tratados co pravastatina (40 mg/día, 14 días, oral) antes y después del tratamiento. Ambas muestras se infectaron simultáneamente con dos dosis infecciosas de preparaciones de reserva de HTV-1. Después de lavadas, las células se sembraron en placa con PHA e IL-2, y se midió p24 a los 4 y 5 días después de la infección (Coulter). Modelo murino de SCDI-hu-PBMC. Ratones CB.17 SCID/SCID, de 8- 10 semanas de edad, de fenotipo no secretor, se reconstituyeron mediante una inyección i.p. de 50 x 106 PBMC humanas. Una semana más tarde, los ratones que tenían niveles séricos comparables de irimunoglobulinas humanas, prueba de la reconstitución con células humanas, recibieron lovastatina (i.p.: 5 mg kg) una inyección cada tres días, comenzando una semana antes de la sensibilización inmunológica con NL-4-3 de HTV (i.p.; 100 TCDI 50/ml) hasta ser sacrificados. Se midió el número de copias de RNA de HIV-1 en plasma (Amplicor HIV-1 Monitor Assay, Roche Molecular Systems) una semana después de la infección. Dos semanas después de la sensibilización inmunológica con el virus, células peritoneales (106) procedentes de los ratones sacrificados se incubaron con 2 x 106 PBMC humanas activadas con PHA, en presencia de JL-2 y se determino p24 después de 2 semanas de co-cultivo. Las células peritoneales también se analizaron por FACS (EPICS Elite, Coulter) utilizando un anticuerpo (Ab) anti-CD5 marcado con FITC y un anticuerpo anti-CD4 unido a ficoeritrina (Pharmingen). Ratones no tratados, o ratones tratados con lovastatina se reconstituyeron con PBMC teñidas con Cell Tracker Green CMFDA (Molecular Probes). A los 3 y 7 días después de la reconstitución, se obtuvieron células peritoneales procedentes de dos ratones, se reunieron, y se analizaron por FACS. Titulación de la producción viral. Células HEK 293T, co-transfectadas con pNL4,3.Luc.R.E. y con cDNA que codifica las cubiertas de HIV-1 ADA O VSV, se trataron con lovastatina o con lovastatina + mevalonato. Se recogieron preparaciones virales de reserva pasadas 48 h y se titularon midiendo la actividad de luciferasa después de la transducción de células T HEK293 que expresan CD4. Los valores se normalizaron con respecto a la actividad de luciferasa medida en extractos de las células productoras de reserva. Expresión génica dirigida por LTR. Células de Jurkat transfectadas con pLTR-luc (Schwartz, O. y col. (1990) Gene 88:197-205), con pcDNA-tat y con el plásmido que porta la luciferasa de renilla, carente de promotor, se trataron pasadas 4 h de la transfección, con inhibidores y metabolitos en las concentraciones indicadas (véase la sección correspondiente a las infecciones por HIV-1). Se calcularon las unidades relativas de lucifarasa (RLU) en forma del cociente entre la actividad en luciérnaga y la actividad en renilla pasadas 48 h. Determinación de la masa de colesterol celular. El contenido en colesterol de las células MT2-CCR5, no tratadas, tratadas con lovastatina o tratadas con lovastatina + mevalonato, se analizó en un cromatógrafo de gases de Hewlett-Packard (Chropack, Middelburg. Países Bajos) según la manera descrita (Llaverías, G. y col. (2002) Eur. J. Pharmacol. 451, 11-17). La masa del éster de colesterilo se calculó restando el colesterol libre del contenido total de colesterol. Formación de parches inducida por gpl20. Células PBMC no estimuladas, sembradas en cámaras recubiertas con ICAM-l Fc (R&D Systems) se incubaron (30 min, 12°C) con gpl20 recombinante (virus X4 adaptado a una línea de células T, muestra aislada ??; Intracel) en PBS/albúmina de suero bovino al 0,2%, seguido de anticuerpo anti-gpl20 de conejo y Cy2-Ab anti-conejo (Jackson IrnmunoResearch). Las células se fijaron con paraformaldehído al 3,7% en PBS en hielo, y después se incubaron por orden con anticuerpo anti-CXCR4 biotinilado (FAB1272; R&D Systems) y Cy3-estreptavidina. Por último, las células se montaron en medio de Vectashield (Vector Laboratories) y se visualizaron por microscopía confocal con láser (Leica). Ensayo de activación de Rho y Rae. Células MT2-CCR5 (3 x 106) tratadas con lovastatína sola o mezclada con GGPP, se sometieron a privación (3 h), y después se incubaron con preparaciones de reserva de HPV-1. A los tiempos indicados, las células se lavaron con PBS enfriado en hielo y se prepararon lisados utilizando kits de ensayos de activación de Rho o Rae (Upstate Biotechnology). Rho unida a GTP se precipitó con bolitas de agarosa unidas a RBD, y GTP-Rac se precipitó con bolitas de agarosa unidas a PBD. Rho activada o Rae activada se midieron en los sedimeritos mediante transferencia Western con anticuerpos específicos, utilizando extractos celulares en crudo para la normalización. Se llevó a cabo una densitometría usando un programa NHIImage. Tratamiento con lovastatína de pacientes infectados con JAlV-l. Seis pacientes informados, infectados con HTV-l, en una etapa Al de la enfermedad, que no habían recibido HAART, se trataron con lovastatína (40 mg/día, oral) durante un mes. Se midieron el número de copias en plasma del R A de HTV, los recuentos de linfocitos T CD4 circulantes, y los niveles de colesterol plasmáticos, antes e inmediatamente después del tatamiento, así como a los tres meses de haber finalizado el tiatamiento con lovastatina, utilizando técnicas clínicas estándar.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN Las estatinas inhiben la infección por HTV-1 in vitro e in vivo Se ha sugerido que las estatinas pueden tener efectos anti-HIV-1 (Maziere, J. y col. (1994) BiomedPharmacother. 48:63-67). Células PBMC humanas, activadas con PHA, pretratadas durante 48 h con lovastatina 10 µ?, se expusieron a las cepas X4( L4-3) o R5(BaL) de HIV-1; no se observaron efectos citotóxicos a esta dosis (no mostrado). La lovastatina inhibió la repliación de HTV-1, según se indica por la reducida producción de antígeno p24 en los cultivos infectados con X4 y R5 (Fig. 5A). Este efecto se revertió mediante una co-incubación de las células con L-mevalonato, el producto de la HMG-CoA-reductasa. Para analizar el efecto anti-HIV-1 inducido por la estatina, la susceptibilidad a una infección por el virus R5 que presentaban células PBMC procedentes de voluntarios humanos tratados con pravastatina, se comparó antes y después del tratamiento con estatina. La infectividad de PNBM procedentes de individuos tratados con el vehículo no se afectó de manera significativa a dos dosis de HTV-1 diferentes (Fig. 5B; p=0,812 para 1 ng de p24/106 células; p=0,218 para 10 ng de p24/106 células, prueba de Wilcoxon Signed-Rank de dos colas). La infectividad se redujo drásticamente en las PBMC procedentes de voluntarios tratados con estatinas (p=0,032 para ambas dosis del viras, prueba de Wilcoxon Signed-Rank de dos colas). El bloqueo de la replicación de HTV-1 producido por estatinas se midió en ratones SCTD injertados con PBMC humanas (SCID-hu-PBMC), un modelo de infección por HTV-1 in vivo (del Real, G. y col. (1998) AIDS 12, 865-872), inyectando lovastatina antes de la sensibilización inmunológica con NL4-3 de HTV-1. La carga viral media se redujo significativamente en ratones tratados con lovastatina (p=0,028, prueba de Mann- Withney de dos colas) comparada con la de los animales tratados con vehículo (Fig. 5 C). El RNA viral fue indetectable en el plasma de 4 de los 10 ratones tratados con lovastatina; un co-cultivo de células peritoneales procedentes de dos de estos ratones, con PBMC humanas activadas por PHA, no rescató virus. Una semana después de la infección, los ratones SCDI-hu-PBMC tratados con lovastatina mostraron recuentos más altos de células T CD4* que los controles; el cociente medio CD47CD5" fue del 51% en los ratones tratados con lovastatina y del 28% en los ratones tratados con vehículo (Fig. 5D), indicando una pérdida específica de células CD4" en los controles (p=0,048, prueba de Mann-Whitney de dos colas). Para detenninar si las estatinas afectaba a la viabilidad o proliferación de dos poblaciones específicas de células humanas infectadas, ratones SCID se reconstituyeron con células humanas activadas con PHA y tratadas con lovastatina igual que en el caso anterior. No se encontró diferencia en el número de células marcadas ni en la intensidad del mareaje (Fig. 5), lo que sugiere que el tratamiento con lovastatina no es deletéreo para PBMC injertadas.

Las estatinas afectan al ciclo replicativo de HIV-1, reduciendo la geranilgeranilación Una infección de una sola ronda con una variante NL4-3 de HTV-1, defectiva en la replicación, mostró que la lovastatina inhibía la entrada de variantes seudotipificadas con R5 (Fig. 6A) o X4 (no mostrado), pero no la de virus seudotipificados con la cubierta de VSV (Fig. 6A). El tratamiento con lovastatina también redujo la producción viral seudotipificada con HTV-1-X4, pero no la de los virus seudotipificados con VSV-G-, en células T HEK293 transfectadas con NA de TS5L4-3.Luc defectivo en replicación (Fig. 6B). No es probable que la reducción específica inducida por lovastatina en la producción viral seudotipificada con HIV-1 sea debida a un procesamiento y síntesis diferenciales de Gag, ya que los seudotipos de HTV-1 y de VSV comparten el mismo genoma vírico. No obstante, la lovastatina aumentó la actividad promotora dirigida por LTR de HTV-1 (Fig. 6), lo que sugiere que el fármaco es capaz de regular al actividad de factores nucleares implicados en la transcripción de HTV. Estos resultados indican que la lovastatina tiene efectos pleiotrópicos sobre la replicación del HTV-1, debido a que el fármaco es capaz de promover la replicación del virus aumentando la transcripción del genoma viral, y tiene efectos anti-HTV-1 que inhiben la entrada y la salida del virus en la célula diana. Ambos efectos pro-HTV-1 y anti-HTV-1 inducidos por la lovastatina, estuvieron mediados a través de la ruta del mevalonato., ya que fueron revertidos mediante la co-incubación de las células con L-mevalonato (Fig. 6A-C). La inhibición de la ruta del mevalonato disminuye la biosíntesis de colesterol, pero disminuye también los depósitos celulares de GGPP y FPP, ambos implicados en la modificación postraduccional de las proteínas. El solicitante ha descubierto que la inhibición de la entrada de HIV-1 en células permisivas, inducida por lovastatina, era revertida mediante la co-adición de GGPP, pero no de FPP ni de colesterol (Fig. 7A). Esto sugiere que la lovastatina inhibe la infección por HTV-1 bloqueando la gerarúlgeranilación de las proteínas en lugar de previniendo la farnesilación o disminuyendo la biosíntesis de colesterol. La entrada del virus seudotipificado con R5 fue inhibida mediante el tratamiento de las células con un inhibidor de gerardlgera il-transferasa, pero no por un inhibidor de la farnesil-transferasa (Fig. 7B); estos fármacos no afectaron la entrada de virus seudotipificados con VSV (no mostrado). La medida del contenido del colesterol celular indicó la existencia de niveles de colesterol comparables en células tratadas y no tratadas con lovastatina; el fármaco sin embargo redujo drásticamente la masa de ésteres de colesterilo (Fig. 7C), probablemente debido a una inhibición concomitante de la acil-CoA:colesterol aciltransferasa (Kam. N. y col.,(1990) Biochem J. 272:427-433). Aunque no puede excluirse que el colesterol esterificado represente un papel en la infección por HTV-1, el descubrimiento de que el GGPP revierte la inhibición de la entrada del virus inducida por lovastatina, sugiere que los efectos de la lovastatina están mediados principalmente por la alteración de la geranügeranilación de las proteínas. La suplementación con GGPP, pero no con FPP ni con colesterol libre, también revertió el aumento en la transcripción dirigida por LT e inducida por lovastatina (Fig. 7 D). El tratamiento de células con un inhibidor de la geranilgeranil-transferasa aumentó también la transcripción del HTV (Fig. 7D), lo que sugiere la existencia de una mecanismo molecular general para la mediación de lovastatina sobre los efectos pro-HIV-1 y anti-HIV-1.

Las estatuías inhiben la agregación de receptores inducida por HTV-1, impidiendo la activación de Rho Para identificar la proteína(s) isoprenilada implicada en los efectos anti- HTV-1 inducidos por estatuías, se estudió el mecanismo mediante el cual la lovastatina inhibe la entrada del virus. Se analizó la formación de complejos moleculares de orden superior de gpl20 con los receptores CD4 y CXCR4 de HTV-1. Células PBMC tratadas y no tratadas con lovastatina, se incubaron por orden con gpl20nB, Ab anti-gpl20 y Ab anti-CXCR4. Las células tratadas con lovastatina presentaron parches de gpl20 de menor tamaño que las células no tratadas (Fig 8A); los parches se co-localizaron con CD4 en ambos caso (no mostrado). Aunque la lovastatina no afectó a la unión de gpl20 a CD4, la co-localización entre gpl20 y CXCR4 se redujo de manera drástica en los cultivos tratados con lovastatina (Fig. 8A), lo que sugiere que la lovastatina inhibe la agregación de receptores inducida por gpl20. El tamaño de los parches y la co-localización de gpl20-CXCR4 fueron restituidos en las células tratadas con lovastatina mediante adición de mevalonato (Fig. 8A), pero no mediante adición de coleterol (no mostrado). La geranilgeranilación es necesaria para la modificación lipídica postraduccional de varias proteínas ancladas en la hoja interna de la membrana, que incluyen las Rho-GTPasas (Kock, G. u col. (1997) J. Pharmacol. Exp. Ther. 283, 901-909). Además, la unión de gp 120 a las células diana modifica la masa molecular de Rho y aumenta la expresión de Cdc42 (Cicala, C. y col., (2002) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 99, 9380-9385). La incubación de las células diana con HTV-1 produjo la activación de Rho, pero no de Rae (Fig. 8B) ni de Cdc42 (no mostrado). La incubación de las células con lovastatina antes de la exposición al virus, inhibió la activación de Rho inducida por mV-1, la cual revertió cuando las células se co-incubaron con GGPP (Fig. 8C), lo que indica que la lobastatina impidió la activación de Rho inducida por HTV-1 mediante un mecanismo dependiente de la geranilgeranilación. La activación de Rho inducida por el virus se requiere para la entrada del virus, ya que la infección por HTV-1 pseudotipificado con R5 se redujo en células que expresan el mutante RhoN19 dornínante-negativo (Fig. 8D); la expresión de RhoN19 impidió también específicamente la fusión de la cubierta de HTV-1 con la membrana de las células diana en un ensayo de fusión célula-célula (Fig. 8E). Los resultados sugieren que la lovastatina inhibe la entrada de HTV-1 en las células diana, al menos en parte, impidiendo la activación de Rho. La inhibición de Rho se ha asociado con un aumento en la transcripción de HTV-1 (Wang. L. y col., (2000) J. Immunol. 164: 5369-5374), lo que sugiere que los efectos pro-HTV-1 y anti-HTV-1 inducidos por lovastatina pueden estar mediados por Rho.

Las estatinas disminuyen el número de copias del R A de HTV-1 en plasma en individuos que padecen una infección crónica Las estatinas se usan en el tratamiento de la lipodistrofia asociada a HAART. Tomando como base los anteriores resultados in vitro, se estudió el uso potencial de las estatinas para un tratamiento in vivo de pacientes con HTV. En un estudio preliminar realizado para probar la idea, seis pacientes infectados con HTV-1 en fase Al, no tratados con HAART, que habían presentado una carga viral estable durante al menos seis meses (Tabla 1) se trataron con lovastatína durante un mes como única terapia. El tratamiento con estatinas en un plazo de tiempo corto indujo una clara disminución en las cargas de RNA viral en suero en todos los pacientes (Tabla G). La interrupción del tratamiento con estatinas produjo un rebrote en la carga viral (Tabla G). Los datos sugieren que las estatinas son capaces de inhibir la replicación de HTV-1 en individuos que padecen una infección crónica, y apoya el uso de las estatinas como agentes anti-retrovirales. Las estatinas pueden tener varias células diana en el sistema inmunológico (Romano. M. y col. (2000) Lab. Invest. 80, 1095-1100); wak, B. y col., (2000) Nat. Med. 6, 1399-1402). El solicitante ha demostrado que la inhibición de la entrada de HTV-1 y de la producción de viriones inducidas por estatinas, así como el aumento en la transcripción viral, están mediados a través de la irihibición de la ruta metabólica del mevalonato. La entrada de HIV-1 y la gemación son procesos cooperativos que requieren la co-agregación de proteínas en la superficie de la célula hospedadora: de CD4 y de los co-receptores de quimioquinas para la entrada, de Gag y de g l60 para la gemación (Mañes, S. y col. Nat. Rev. IMIVÍUNOL., 3, 557-568). Se ha sugerido que estos procesos están mediados por la asociación de las proteínas con las balsas lipídicas (Mañes, S. y col. (2000) EMBO Rep. 1, 190-196); Nguyen, D. y J. ffildreth.(2000) J. Virol. 74, 3264-3272; Ono, A y E. Freed (2001) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 98, 13925-13930; del Real, G. y col. (2002) J. Exp. Med. 196, 293-301; Wang, J.- . (2000) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 97, 394-399); Lindwasser, O. y Resh, M. (2001) J. Virol., 75, 7913-7924; Mañes, S. y col. (2001) Semin. Tmmunol. 13, 147-157), y dirigidos por el citoesqueleto de actina (Iyegar, S. y col. (1998) J. Virol. 72, 5251-525; Viard, M. y col. (2002) J. Virol. 76, 11584-11595; Steffens, C, y T. Hope (2003) J. Virol. 77, 4985-4991). La agregación de las balsas conlleva una reorganización del citoesqueleto de actina, para el cual algunos informes implicas a Rho como efector principal (Mañes, S. y col (2003) Trend Tmmunol. 24, 320-326). Las estatinas son capaces de inhibir la infección por HTV-1, en pare disminuyendo la geranilgeranilación de Rho, esencial para la localización y función de Rho, que incluyen la reorganización del citoesqueleto requerida para la entrada y salida de virus.

En resumen, se proporciona la evidencia de que las estatinas impiden la infección por HIV-1 en células de cultivos primarios, en modelos animales, y en individuos que padecen una infección crónica. Se ha puesto de manifiesto que, a nivel celular, las estatinas inhiben la entrada y la gemación de los virus, impidiendo la geranilgeranilación de Rho, necesaria para la infección por HTV-1. Partiendo de la capacidad de las estatuías para reducir la carga viral en individuos infectados por HTV-1, se sugiere que esos compuestos presentan efectos anti-retrovirales directos y pudieran ser fármacos apropiados para un tratamiento más accesible de la pandemia del SIDA.

INCORPORACIÓN A MODO DE REFERENCIA Todas las publicaciones y solicitudes de Patentes citadas en esta memoria descriptiva, quedan aquí incorporadas a modo de referencia como si cada publicación individual o cada solicitud de Patente estuvieran indicadas de modo específico e individual para ser incorporadas como referencia. Más concretamente, las siguientes publicaciones se incorporan por ello en su totalidad y para todo fin: i G. del follo ing publications are hereby incorporated in their entirety and for al! purposes: G. del following publications are hereby incorporated in their entirety and for all purposes: G. del following publications are hereby incorporated in their entirety and for all purposes: G. del following publications are hereby incorporated in their entirety and for all purposes: G. del following publications are hereby incorporated in their entirety and for all purposes: G. del A. & S. Manes, Specific SHP-2 partifion g m mft domaim iriggers iiMgi-m-mediaíecI Mgi ahfig viaRho acüvatkm, J. Cell Biol.157, 277-290, 2002.

Todos los contenidos y la descripción en su totalidad de la solicitud, Número 21910/001, del Expediente del Apoderado, en tramitación junto con la presente, y titulada "Method To Screen For Chemofáne Agonists And Ant gonists" se incorporan de modo específico como referencia y para todo fin.

DECLARACIÓ DE UTILIDAD INDUSTRIAL Con el fin de cumplir con el Tratado de Cooperación de Patentes, el presente invento declara una utilidad industrial. El presente invento proporciona medios para diagnosticar y tratar a seres humanos y a otros animales afectados con una enfermedad o estado mediado por procesos de señales a través de receptores de quimioquinas.

Claims

REIVINDICACIONES

1. El uso de un inhibidor de la isoprenilación de proteínas o de una de sus sales, solvatos o derivados farmacéuticamente aceptables, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una infección por tUV, de una infección por un retrovirus genéticamente relacíonádo con ~elTBIV7 o oel SIDA.

2. El uso según la reivindicación 1, en el que el inhibidor de la isoprenilación de proteínas es un inhibidor de la geranflgeranilpirofosfato-sintetasa.

3. El uso según la reivindicación 1, en el que el inhibidor de la isoprenilación de proteínas es un inhibidor de la geranilgeranil-transferasa.

4. El uso según la reivindicación 1, en el( que el inhibidor de la isoprenilación de proteínas es un inhibidor de la activación de Rho.

5. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 4, en el que el inhibidor es una estatina o uno de sus análogos.

6. El uso según la reivindicación 5, en el que la estatina se selecciona entre el grupo que comprende lovastatina, simvastatina, pravastatina, mevastatina, atorvastatina fluvastatina.

7. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 6, en el que el inhibidor de la isoprenilación de proteínas está mezclado con un vehículo, aglutinante, agente de relleno, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptables, o cualquiera de sus combinaciones.

8. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 7, en el que el inhibidor de la isoprenilación de proteínas se adrmnistra en combinación con uno o más agentes terapéuticos diferentes, seleccionados entre el grupo que comprende un inhibidor de la proteasa de HTV, un inhibidor de la transcriptasa inversa no nucleosídico, un inhibidor de la transcriptasa inversa nucleosídico/nucleotídico, un antagonista de CCR5, un inhibidor de la integrasa, un inhibidor de RNasaH, un agente inhibidor de los dominios con balsas, un agente que disminuye los niveles de colesterol, un agente que o^sminuye la premiación de proteínas, un inhibidor de la Rho-A GTPasa, y un agente que disminuye los niveles de gücoesfingohpidos.

- ?- - 9. El uso según la reivindicación 8, en el que dicho agente que disminuye los niveles de glicoesfíngolípidos es un compuesto seleccionado entre el grupo constituido por: D-t-3',4'-e1ilendioxi-l-fenü-2-palnntoüamm D -4'-Mdroxi-l-fenil-2-palmitoüammo-3-pirroH^ 1 -fenil-2-palmitoüamino-3 -pirrolidino- 1 -propanol, y sus sales y sus mezclas farmacéuticamente aceptables.

10. El uso según la reivindicación 8 ó 9, en el que dicho agente inhibidor de los dominios con balsas disocia los dominios con balsas.

11. El uso según la reivindicación 8 ó 9, en el que dicho agente inhibidor de los dominios con balsas inhibe la formación de dominios con balsas.

12. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones de 8 a 11, en el que dicho agente modulador de los receptores de quinnoquinas inhibe la formación de los dominios de membrana con balsas y/o los disocia.

13. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones de 8 a 11, en el que dicho inhibidor de Rho-A GTPasa es una estatina.

14. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones de 8 a 13, en el que la combinación comprende la administración independiente, secuencial o simultánea de uno o más de los agentes.

15. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones de 8 a 14, en el que el uno o más agentes está mezclado con un vehículo, aglutinante, agente de relleno, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptables, o cualquiera de sus combinaciones.

16. Un inhibidor de la isoprenilación de proteínas o una de sus sales, solvatos o derivados farmacéuticamente aceptables, para usar en el tratamiento de una infección por HTV, de una infección por un retrovirus genéticamente relacionado con el MV, o del SIDA.

17. Un método de tratamiento de un mamífero que padece una infección por HTV, una infección por un retrovirus genéticamente relacionado con el HIV, o SIDA, que comprende tratar a dicho mamífero con una cantidad terapéuticamente efectiva de uno o más agentes capaces de inhibir la isoprenilación de proteínas, o de una de sus sales, solvatos, o derivados farmacéuticamente aceptables.

18. El método de la reivindicación 9, que comprende además adiriinistrar al paciente una cantidad farmacéuticamente efectiva de al menos un agente seleccionado entre el grupo constituido por un agente antiviral, un agente modulador de los receptores de quirrúoqxiinas, un agente inhibidor de los dominios con balsas, un agente que disminuye los niveles de colesterol, un agente que disminuye la premiación de proteínas, un inhibidor de la Rho-A GTPasa, y un agente que disminuye los niveles de gHcoesfingolipidos.

19. El método de la reivindicación 17 o de la reivindicación 18, en el que el uno o más agentes se mezcla con un vehículo, aglutinante, agente de relleno, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptables, o cualquiera de sus combinaciones.

20. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, en el que dicho agente antiviral es una sal de adición seleccionada entre el grupo constituido por una sal de adición de ácido, una sal de adición de metal, una sal amónica, y una sal formada con una base orgánica.

21. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20, en el que dicho agente que disminuye los niveles de gHcoesfingolipidos es un compuesto seleccionado entre el grupo constituido por. D-t-3 ',4'«etüendioxi- 1 -feriü-2-paImitoüamino-3 -pirrolidino- 1 -propanol, D-t-4 -hidroxi- 1 -fenü-2-palmitoüarnino-3 -pirrolidino- 1 -propanol, l-feriü-2-palrmtoüarrimo-3-pmoU y sus sales y sus mezclas farmacéuticamente aceptables.

22. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 21, en el que dicho agente antiviral es un compuesto seleccionado entre el grupo constituido por nucleósidos, nucleótidos, inhibidores de proteasas, pirirnidmonas y pmdinonas.

23. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 22, en el que dicho agente inhibidor de los dominios con balsas disocia los dominios con balsas.

24. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 22, en el que dicho agente inhibidor de los dominios con balsas inhibe la formación de los dornirdos con balsas.

25. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 24, en el que dicho agente modulador de los receptores de quimioquinas inhibe la formación de los dominios de membrana con balsas y/o los disocia.

26. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 25, en el que dicho rnhibidor de Rho-A GTPasa es una estatina.

27. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 26, en el que el método comprende además la administración independiente, secuencial o simultánea de uno o más de los agentes.

28. Un método de tratamiento de un mamífero que padece una infección por HTV, una infección por un retrovirus genéticamente relacionado con el HTV". o SIDA, previniendo la acumulación de receptores para HTV en los dominios con balsas, que comprende proporcionar un receptor para citoquinas muíante, dirigido a dominios sin balsas.

29. El método según la reivindicación 28, en el que dicho receptor muíante une a HTV pero éste no entra en los dominios con balsas.