MXPA05011159A - Metodo para identificar ligandos especificos para isoformas estructurales de proteinas. - Google Patents

Abstract

Un metodo de identificar un ligando especifico para una isoforma estructural de una proteina, uniendo la isoforma estructural a un ligando sobre un soporte, una transferencia posicional directa de la isoforma estructural y una forma de control entre dos o mas diferentes soportes solidos o semisolidos y la deteccion por lo menos de una de las isoformas sobre cada soporte, permitiendo asi tecnicas sustractivas de identificacion que se han de usar para identificar el subconjunto de ligandos, o un ligando, especificos para la isoforma estructural.

Description

I R). OAPI (BK fíi. CK CG, Cl, CM. ??. ON. GQ, GW, hiir wu-letler redes an ot er ahbro tatiom: referi the. "Guid- ML. MR. NH. SN. D. TG). am e Notes on Codes and Abbreviations" ' ppearíng ai ¡lie begin- Publiühed- nina f arh regular issue »f ihe l'Cl Oa:ett . — w ilhmii intemalional seareh repon ii d lo be republtshed upon rereipl of tliat repon METODO PARA IDENTIFICAR LIGANDOS ESPECIFICOS PARA ISOFORMAS ESTRUCTURALES DE PROTEINAS CAMPO DE LA INVENCION La invención concierne generalmente a métodos para identificar ligandos que tengan especificidad de enlace por una isoforma de proteína.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION La formación de conjuntos y la desintegración de conjuntos de proteínas normalmente solubles en aglutinados insolubles, conformacionalmente alterados, se piensa que es un proceso causal en una variedad de enfermedades. Ejemplos de algunas proteínas insolubles y sus enfermedades asociadas incluyen, pero no se limitan a, el ß-péptido en la enfermedad de Alzheimer y en la angiopatía amiloide cerebral; depósitos de a-sinucleínas en los cuerpos de Lewy de la enfermedad de Parkinson; tau en marañas neurofibrilares en la demencia temporal frontal t la enfermedad de Pick; la superóxido dismutasa en esclerosis lateral amiotrófica; y huntingtinas en la enfermedad de Huntington. La autoformacion de conjuntos anormales de transtiretina humana en fibrilos amiloides causa dos formas de enfermedad humana, es decir amiloidosis generalizada senil y polineuropatía amiloide familiar. Un cambio conformacional en la estructura de la proteína priona, parece estar involucrado en el proceso neurodegenerativo de encefalopatías espongiformes transmisibles (TSEs) tales como la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob. A menudo estas proteínas muy insolubles forman aglutinados compuestos de fibrilos con una conformación laminar ß-plegada característica. En el sistema nervioso central (CNS, Central Nervous System), pueden estar presentes amiloides en los vasos sanguíneos meníngicos y cerebrales (depósitos cerebrovasculares) y en el parénquima cerebral (placas). Un mecanismo preciso por el cual se forman las placas neuríticas y la relación de la formación de aglutinados con procesos neurodegenerativos asociados con la enfermedad son desconocidos ampliamente. La proteína priona celular o nativa, "PrPc", está distribuida ampliamente en todos los mamíferos y tiene una secuencia de aminoácidos y estructura proteínica particularmente bien conservadas. Se piensa que los priones infecciosos se componen de una forma modificada de la proteína priona celular normal (PrPc) y se ha mencionado como "PrPc" (indicando la forma fragmentada de la proteína); como "PrPcjd" indicando la forma CID de la proteína); y como "PrPres" indicando la proteinasa K ( forma resistente-(PK) de la proteína). Las prionas tienen algunas propiedades en común con otros patógenos infecciosos, pero no parecen contener un ácido nucleico. Preferiblemente, se ha propuesto que un cambio conformacional post-translacional está involucrado en la conversión de PrPc no infecciosas en PrPsc infecciosas, durante el cual helicoidales-a son transformadas en láminas ß. PrPc contiene tres helicoidales-a y tiene pocas estructuras laminares-ß; en contraste, PrPsc es rica en láminas-ß. Se cree que la conversión de PrPc a PrPsc conduce al desarrollo de encefalopatías espongiformes transmisibles (TSEs, Transmisible Spongiform Encephalopaties) durante las cuales PrPsc se acumula en el sistema nervioso central y es acompañada por cambios neuropáticos y mal funcionamiento neurológico. Una forma infecciosa de la proteína priona es considerada necesaria y posiblemente suficiente para la transmisión y patogénesis de estas enfermedades neurodegenerativas transmisibles de animales y de humanos. (Ver Prusiner 1991 Science 252:1515-1522). Ejemplos de enfermedades por TSE que afectan a animales incluyen, pero no se limitan a, prurito en ovejas, encefalopatía espongiforme bovina (BSE, Bovine Spongiform encephalopathy) o "Enfermedad de las vacas locas" en ganado, encefalopatía transmisible del visón (TME, Transmissible Mink Encephalopathy), y enfermedad por agotamiento crónico (CWD, Chronic Wasting Disease) en ciervos y alces. El espectro de enfermedades por TSE en humanos, incluye, pero no se limita a, kuru, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (CID, Creutzfeldt-Jakob Disease), enfermedad de Gertzmann-Straussler-Scheinker (GSS), e insomnio familar fatal. Recientemente se ha desarrollado evidencia de que la BSE es transmisible a un amplio rango de otros mamíferos incluyendo humanos. La forma humana de esta enfermedad es mencionada como CID variante (vCID). Son necesarias metodologías que pueden separar fácilmente o que pueden distinguir entre dos o más formas conformacionales diferentes de una proteína, tales como PrPc y PrPsc, para entender el proceso de conversión y para encontrar estructuras que interactúen específicamente con las formas asociadas con la enfermedad. Las metodologías actuales para separar o distinguir entre isoformas incluyen la movilidad diferencial en geles de pollacrilamida en la presencia de un caótropo, tal como urea, particularmente, geles con gradiente transversal de urea (TUG, Transversal Urea Gradiente), sensibilidad diferencial al tratamiento con proteasa, tal como el tratamiento con PK, y la detección del producto de la digestión resistente a PK de PrPsc mencionado como PrPsc; precipitación diferencial por fosfotungstato de Na; estabilidad a temperatura diferencial; solubilidad relativa en detergentes no iónicos; y la efectividad de estructuras fibrilares para enlazar a ciertos productos químicos, tales como Rojo Congo e isoflavina S. Persiste una necesidad de identificar ligandos o reactivos de alta afinidad que sean específicos para la proteína alterada conformacionalmente, especialmente formas asociadas con la enfermedad. Dichos ligandos o reactivos son útiles para una variedad de usos, que incluyen, pero no se limitan a, desarrollar equipos de posible diagnóstico, separación y purificación de las diferentes formas de proteína; remoción de formas infecciosas de la enfermedad de los agentes terapéuticos, productos biológicos, vacunas y forraje, y para terapia.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION Se proporcionan en la presente métodos para la identificación de ligandos que son específicos para una isoforma estructural de una proteína, también mencionada como una isoforma estructural objetivo. Estos ligandos se usan, por ejemplo, para separar, concentrar, o diferenciar entre ¡soformas estructurales de proteínas y otros objetivos en una muestra, solución, o una mezcla compleja. En una modalidad preferida, la proteína es una proteína priona y la isoforma estructural es una isoforma priona infecciosa. De conformidad con una modalidad del método de conformidad con ciertos aspectos de la presente invención, uno o más ligandos inmovilizados son puestos en contacto con una muestra que contenga una isoforma de proteína objetivo bajo condiciones suficientes, o que permitan, ocasionar la formación de un complejo isoforma-ligando. El ligando o el complejo de isoforma-ligando es inmobilizado sobre o en un primer soporte. En otra modalidad, antes de la inmovilización sobre el primer soporte, una biblioteca de ligandos de prueba es inmovilizada sobre una fase sólida, tai como, pero no limitándose a, perlas poliméricas, que dan como resultado una pluralidad de perlas que poseen diferentes ligandos, con múltiples copias de un ligando de prueba único, individual presente sobre la superficie de la perla. Estas perlas son inmovilizadas subsecuentemente sobre o en un primer soporte. De esta manera, el ligando es inmovilizado indirectamente sobre el primer soporte.

De manera alternativa, los ligandos de prueba son inmovilizados por acoplamiento directo al primer soporte, tal como una membrana o gel. Por ejemplo, una biblioteca de ligandos es inmovilizada sobre un primer soporte, tal como una retícula bi-dimensional, donde cada especie de ligando de prueba es colocada en una posición única en la retícula. Una isoforma de proteína es así capturada en una posición única en la retícula con base en su interacción con un ligando de prueba específico. Se detectaron complejos de isoforma-ligando después de inmovilización de los complejos sobre el primer soporte. La detección está asociada directamente con un complejo isoforma-ligando, tal como una detección sobre perla, o indirectamente, tal como una captura de una señal quimioluminiscente sobre una película de rayos-X. Las isoformas son entonces transferidas a un segundo soporte e inmovilizadas sobre éste de modo que estén presentes en posiciones que correspondan a las posiciones de inmovilización sobre el primer soporte. Preferiblemente, las isoformas son separadas de los ligandos y luego inmovilizadas sobre el segundo soporte, dejando a los ligandos de prueba enlazados al primer soporte. Las isoformas inmovilizadas sobre el segundo soporte son entonces detectadas. En una modalidad preferida, tanto una isoforma objetivo como una isoforma control, que difiera de la isoforma objetivo en el patrón de dualidad funcional u otra estructura secundaria o terciaria, son inmovilizadas sobre el segundo soporte, y la isoforma objetivo es modificada antes del segundo evento de detección. La isoforma objetivo puede ser modificada por cualquier medio conocido por los expertos en la materia, pero preferiblemente es modificada por desnaturalización o por fragmentación enzimática para formar una isoforma diferentes de la misma proteína como la isoforma objetivo. En una modalidad, tanto la isoforma objetivo modificada como la isoforma control son detectadas sobre el segundo soporte usando un marcador para detección. Los patrones de detección sobre el primer y segundo soporte son entonces alineados y comparados. Primero, se hace una determinación de la localización de la isoforma objetivo sobre el segundo soporte. En una modalidad, la localización es indicada por la presencia de una señal de detección sobre el segundo soporte y la ausencia de una señal de detección correspondiente sobre el primer soporte o viceversa. Por consiguiente, la primera detección identifica ya sea un sub-grupo de ¡soformas o todas las isoformas y la segunda detección identifica el sub-grupo de isoformas no detectadas en la primera etapa y viceversa. El término "sub-grupo" como se usa en la presente con referencia a isoformas de proteínas denota un grupo de isoformas de una proteína. El sub-grupo comprende desde cero a todas las isoformas de proteínas. Por alinear el primer y el segundo soportes y analizar, o comparar, los resultados de detección, los ligandos a los cuales fueron inicialmente enlazados los varios sub-grupos de isoformas pueden ser detectadas, identificadas y aisladas. Esto es, una vez que la posición única de la proteína es identificada sobre el segundo soporte, puede determinarse su posición formadora sobre el primer soporte (donde fue capturado por el ligando), conduciendo a la identificación y al aislamiento del ligando responsable de su captura original. El método descrito en la presente ofrece numerosas ventajas sobre los métodos disponibles actualmente para identificar ligandos para la separación de isoformas estructurales de proteínas. Primero, una proteína y su ligando del mismo origen pueden ser identificados después de su disociación. Tanto la proteína como su ligando son identificados sin la necesidad de modificación previa de uno o de otro, tal como, pero no limitándose a, por marcado con moléculas fluorescentes, moléculas o aminoácidos radioactivos, biotinilación, y derivatización de anticuerpos. Por consiguiente, cuando la detección sigue a la transferencia, se evita completamente la interacción entre los componentes del sistema de detección y el ligando, soportes, u otros elementos del sistema. Segundo, porque los métodos de detección pueden ser separados en tiempo y espacio, no interfieren entre sí, y pueden ser diseñados para detectar poblaciones diferentes de las isoformas. Tercero, pueden emplearse métodos que requieren desnaturalización o inactivación en el mismo procedimiento como métodos que mantienen la actividad biológica, y puede mantenerse la efectividad de las proteínas para identificar el ligando al cual fueron enlazados originalmente. Finalmente, pueden identificarse ligandos que diferencian entre formas múltiples de la proteína y pueden usarse para separar, purificar, concentrar, o diagnosticar, o cualquier combinación de los mismos, la presencia de diferentes formas estructurales o isoformas, de la proteína.

Ninguna de estas ventajas se realiza para tecnologías comparables disponibles actualmente.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS La Figura 1, es un esquema que muestra la transferencia de los isómeros objetivo y control a partir de perlas insertadas en un gel de agarosa (primer soporte) a una membrana (segundo soporte). La Figura 2, es un esquema que muestra un método de cribado para ligandos específicos de PrPsc, en donde isómeros de PrPc no desnaturalizados son detectados sobre un primer soporte, isoformas de PrPsc y PrPc desnaturalizadas son detectadas sobre un segundo soporte, y en donde los resultados de la detección sobre el segundo soporte son comparados coh el primer soporte de gel de agarosa que contiene perlas teñidas con rojo naftiónico.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Se describen en la presente métodos para identificar ligandos específicos para, o que tengan especificidad de enlace por, una isoforma estructural de una proteína. Los métodos generalmente incluyen enlazar a una isoforma estructural objetivo a un ligando de prueba para formar un complejo isoforma-ligando, en donde el ligando o complejo está inmovilizado sobre un primer soporte, detectar isoformas enlazadas sobre el primer soporte, transferir la isoforma a un segundo soporte por transferencia posicional directa, y detectar la isoforma sobre el segundo soporte, considerando así el uso de las técnicas de identificación sustractivas para identificar ligandos específicos para las isoformas estructurales objetivo. Las Figuras 1 y 2, muestran ejemplos representativos no limitantes de métodos para transferir las isoformas entre el uno o más soportes y las técnicas de identificación sustractiva. El ligando o complejo es inmovilizado sobre el primer soporte en una variedad de maneras conocidas por los expertos en la materia. Por ejemplo, el ligando es inmovilizado en o sobre el primer soporte directa o indirectamente. El término "sobre", cuando se refiere a la fijación de un ligando a un soporte, incluye la fijación del ligando al exterior o a la superficie del soporte así como también a la inserción del ligando en el soporte. En una modalidad, el primer soporte es una sustancia sólida o semi-sólida, tal como un gel, que endurece o solidifica a partir de la polimerización. En esta modalidad, el primer soporte contiene una fase sólida dispersa en él, a la cual está fijado el ligando. Por ejemplo, en una modalidad preferida, la fase sólida es una partícula, tal como una perla polimérica, la cual está recubierta con el ligando enlazado. De este manera, una concentración más alta de ligando puede ser mantenida en una localización particular sobre el soporte. De manera alternativa, el ligando es fijado directamente al soporte, tal como en una retícula o matriz uni- o bi-dimensional, por medios de acoplamiento conocidos por los expertos en la materia. El ligando es puesto en contacto con una muestra que contiene la isoforma objetivo de interés, creando así un complejo de ¡soforma-ligando, ya sea antes de o después de que el ligando es inmovilizado sobre el primer soporte. De manera opcional, una isoforma control es también inmovilizada sobre el primer soporte. Como se usa en la presente, el término "isoforma control" se refiere a una proteína que tiene la misma secuencia de aminoácidos que la isoforma objetivo, pero que difiere en su patrón de dualidad funcional o en otra estructura secundaria o terciaria. La isoforma objetivo, la isoforma control, o tanto la isoforma objetivo como la isoforma control pueden ser detectadas sobre el primer soporte. Subsecuentemente, la isoforma objetivo y opcionalmente, la isoforma control, son transferidas a un segundo soporte, tal como, pero no limitándose a, una membrana, para lograr la transferencia posicional directa de las isoformas del primer soporte al segundo soporte. Ya sea la isoforma objetivo, la isoforma control, o ambas son detectadas sobre el segundo soporte teniendo en cuenta la alineación del primer soporte y del segundo soporte y la determinación de la localización del ligando que enlazó a la isoforma objetivo sobre el primer soporte usando técnicas de identificación sustractiva. En una modalidad preferida, la isoforma objetivo es modificada antes de la segunda etapa de detección. Las proteínas de isoforma estructural objetivo y control descritas en la presente incluyen isoformas de cualquier proteína que tenga más de una isoforma estructural que incluye, pero no se limita a, una isoforma de proteína priona; una isoforma del péptido ß como involucrados en la enfermedad de Alzheimer y angiopatía amiloide cerebral; una isoforma a-sinucleína; una isoforma de proteína tau como involucradas en marañas neurofibrilares en demencia temporal frontal y la enfermedad de Pick; una isoforma superoxido dismutasa; una isoforma de huntingtina; y una proteína de la isoforma transtiretina humana. En una modalidad, la proteína de isoforma estructural es una isoforma que causa enfermedad o infecciosa. En otra modalidad la proteína de isoforma estructural es una proteína priona tal como, pero no se limita a, PrPc, PrPsc o PrPres.

Definiciones Los términos "un", "uno" y "el, la" como se usa en la presente se definen como "uno o más" el incluyen el plural a menos que el contexto sea inapropiado. Los términos "proteína", "péptido", "polipéptido" y "oligopéptido" se usan indistintamente y se definen en la presente como una cadena de aminoácidos en la cual los carbonos están unidos a través de enlaces peptídicos formados por una reacción de condensación entre el grupo carboxilo de un aminoácido y el grupo amino de otro aminoácido. El término "PrPc" se refiere a una molécula de proteína priona nativa, la cual es natural y ampliamente expresada en el cuerpo de los Mammalia. Su estructura es muy conservada y no está asociada con un estado de enfermedad. El término "PrPsc", se refiere a una forma alterada conformacionalmente de la molécula de PrPc que los expertos en la materia creen que es infecciosa y que está asociada con enfermedades tales como, pero no se limitan a, enfermedades por priona/TSE, que incluyen vCID, CID, kuru, insomnio fatal, GSS, prurito, BSE, CWD, y otros TSE de animales experimentales y cautivos. PrPsc tiene la misma secuencia de aminoácidos que la PrPc celular, normal, pero ha convertido algunos de los helicoidales-a a láminas ß-plegadas y está asociada con un estado de enfermedad. Por consiguiente, el término "PrPsc" abarca las formas de la proteína priona mencionada como las formas "PrPtse" y "PrPcjd". El término "PrPres" se refiere a derivados resistentes a la proteinasa de la proteína PrPsc de 27-30kDa que permanece después de digestión parcial de PrPsc con PK. El término "PrPr", se refiere a una proteína priona expresada por medio de tecnología recombinante. El término "PrP", se refiere a una proteína priona en general. El término "específico para" o "que tiene especificidad de enlace por", que pude usarse indistintamente con el término "congénere", cuando se refiere a un ligando, significa un ligando que enlaza a una proteína objetivo con suficiente afinidad y avidez para dar como resultado la producción de un complejo de proteína objetivo-ligando. El término "¡soformas estructurales", se refiere a formas de proteínas que difieren solamente en su patrón de dualidad funcional o en otra estructura secundaria o terciaria, pero tiene la misma secuencia de aminoácidos primaria. El término "3F4", se refiere al anticuerpo monoclonal específico para las formas nativas de PrPc, pero no para PrPsc nativa o PrPres. El anticuerpo tiene especificidad por formas desnaturalizadas de PrPc, PrPsc y PrPres, de hámster y humanas.

Ligandos El término "ligando", se refiere a una molécula a la cual una proteína enlaza, incluyendo pero no se limita a, una molécula pequeña, un péptido, una proteína, un polisacárido o un ácido nucleico. Los ligandos de prueba preferidos son péptidos, particularmente péptidos de 1 a aproximadamente 15 residuos de aminoácidos. Los péptidos ligandos pueden ser producidos por medio de técnicas que se usan para elaborar una biblioteca combinatoria tal como métodos de "recombinar, acoplar, subdividir" así como también por medio de otros procedimientos descritos en la literatura. Ver, por ejemplo, Furka y colaboradores, Int. J. peptide Protein Res., 37, 487-493 (1991); K. S. Lam y colaboradores, Nature, 354, 82-84 (1991); Publicación de PCT WO 92/00091; patente U.S. No. 5,133,866; Patente U.S. No. 5,010,175; Patente U.S. No. 5,498,538. Se describe la expresión de bibliotecas peptídicas en Devlin y colaboradores, Science, 249, 404-406 (1990). Usando métodos conocidos por un experto en la materia, vastas bibliotecas de ligandos pueden ser sintetizadas por medio de una serie de reacciones de acoplamiento directamente sobre una perla que puede ser después inmovilizada sobre un primer soporte sólido, o sintetizada sobre una perla, fragmentada y luego fijada al primer soporte sólido, o sintetizada directamente sobre el primer soporte sólido. De manera típica, los ligandos son sintetizados sobre perlas de modo que múltiples copias de un ligando individual son sintetizados sobre cada perla. Un experto en la materia apreciará también que los ligandos pueden ser fijados a la perla o primer soporte sólido por medio de fijación covalente, directamente o a través de una molécula enlazadora.

Soportes Como se estableció anteriormente, los métodos descritos en la presente incluyen una transferencia posicional directa de una isoforma objetivo entre dos o más soportes que permite la detección diferencial de la isoforma sobre cada soporte e identificación subsecuente de un ligando que tenga especificidad de enlace por una isoforma que usa técnicas de identificación sustractiva. En una modalidad, se emplean un primer soporte y un segundo soporte. El término "soporte", se refiere a cualquier material en o sobre el cual el ligando o la isoforma es inmovilizada. La isoforma puede ser fijada a un ligando inmovilizado sobre el soporte, o la isoforma misma puede ser inmovilizada sobre el soporte. Por ejemplo, es preferible que el ligando sea inmovilizado sobre el primer soporte y la isoforma sea enlazada al ligando inmovilizado pero que solamente la ¡soforma (no el ligando) sea transferida a e inmovilizada sobre el segundo soporte. El término "inmovilizado", se refiere tanto a una retención temporal como a una semi-permanente de una molécula en una posición particular sobre un soporte. Las isoformas son inmovilizadas temporalmente sobre un soporte hasta su transferencia a otro soporte, y los ligandos son preferiblemente inmovilizados semi-permanentemente sobre un soporte de modo que la transferencia de la isoforma no afecte también la transferencia del ligando. Aunque un primer soporte preferido es un gel, tal como gel de agarosa, que contenga una sustancia en fase sólida, tal como perlas poliméricas, el primer soporte puede también incluir cualquier material sobre el cual los ligandos son acoplados directamente para formar una retícula. El término "retícula" se usa en la presente para denotar una distribución espacial, de modo que una distribución de moléculas sobre un soporte sólido, e incluye una distribución dimensional, una distribución bi-dimensional, una distribución tri-dimensional, una distribución circular o cualquier modificación o variación de éstas. Una variedad de matrices porosas son útiles como primer material soporte que incluye, pero no se limita a, polímeros sintéticos, tales como, poliacrilamidas, gelatinas, lipopolisacáridos, y silicatos. El primer soporte puede también componerse de vidrio, nitrocelulosa, silicio, o difluoruro de polivinil nylon. Cuando se usa una perla, o partícula, como un componente del primer soporte, el ligando es fijado a la perla en cualquier manera prevista anteriormente. La perla puede ser de cualquier material capaz de formar una partícula que incluya, pero no se limita a, acrílico, poliacrilamida, polimetacrilato, poliestireno, dextrano, agarosa, celulosas, polisacáridos, polímeros hidrofílicos de vinilo, celita, sefarosa, derivados polimerizados de los mismos, y combinaciones de éstos. Un material para perlas particularmente preferido es un polímero de metacrilato polihidroxilado, y más preferiblemente una resina amino Toyopearl™ 650-M Tosoh Bioscience, Montgomeryville, PA). Otras varias resinas poliméricas de metacrilato están comercialmente disponibles y son comúnmente empleadas en una forma de perla. Se comprende que las perlas que poseen ligandos pueden ser inmovilizadas sobre o en el primer soporte antes, durante o después del contacto con la muestra que contenga la isoforma proteínica. Se comprenderá que los ligandos pueden ser directamente fijados al soporte, directamente sintetizados sobre el soporte, y/o directamente insertados en el soporte en vez de ser primero fijados a una perla. De conformidad con los métodos descritos en la presente, las isoformas son transferidas desde el primer soporte a un segundo soporte. La isoforma objetivo, y opcionalmente la isoforma control, son transferidas entre soportes usando cualquiera de los métodos conocidos por los expertos en la materia, incluyendo, pero no limitándose a, acción capilar. Los reactivos representativos para transferir la isoforma al segundo soporte incluyen, pero no se limitan a, agua, soluciones salinas, soluciones que contienen agentes desnaturalizantes tales como clorhidrato de guanidinium, solventes orgánicos, compuestos que compiten específicamente con el enlace de al menos una isoforma al ligando, y otros reactivos estándares para remover proteínas de ligandos de afinidad bajo condiciones suficientes para remover al menos una isoforma del ligando. Un ejemplo no limitante de la transferencia es expuesta esquemáticamente en la Figura 1. El término "segundo soporte", se refiere a cualquier material capaz de inmovilizar la isoforma proteínica después de remoción o de elución del primer soporte. Los materiales del segundo soporte, por ejemplo, nitrocelulosa, difluoruro de polivinilo, nylon y membranas de celulosa, vidrio y silicio. Uno o ambas de las isoformas control y objetivo son detectadas después de inmovilización sobre el segundo soporte. Un ejemplo no limitante de dicha transferencia es expuesta esquemáticamente en la Figura 1. El término "segundo soporte", se refiere a cualquier material capaz de inmovilizar la isoforma de proteína después de remoción o elución del primer soporte. Los materiales del segundo soporte incluyen, por ejemplo, nitrocelulosa, difluoruro de polivinilo, nylon y membranas de celulosa, vidrio y silicio. Uno ambas de las isoformas objetivo y control son detectadas después de inmovilización sobre el segundo soporte.

Modificación En una modalidad preferida, la isoforma es modificada entre la primera etapa de detección y la segunda etapa de detección a fin de cambiar una característica de detección. Dicha modificación puede tener lugar antes, durante, o después de transferencia de la isoforma desde un soporte a otro.

Preferiblemente, la modificación de una isoforma permite el uso de un agente de detección individual durante ambas etapas de detección, la primera y la segunda mientras que aún producen diferentes grupos de primera y segunda detección tratables para técnicas de identificación sustractiva. Las características de detección pueden ser modificadas por desnaturalización o de fragmentación de la isoforma, por derivatización de la isoforma con un marcador o un enlazador, por modificación o inactivación de la actividad enzimática de la isoforma, o por cualquiera de los medios conocidos por los expertos en la materia. En una modalidad preferida, la isoforma objetivo es una PrPsc que es desnaturalizada usando un agente desnaturalizante. Los agentes desnaturalizantes representativos incluyen clorhidrato de guanidinium; urea; beta-mercaptoetanol; detergentes; reactivos de tioles que incluyen tiosulfato de sodio y ditiotreitol (DTT); dodecil sulfato de sodio (SDS), Tween, y Sarcosil. La determinación de la PrPsc permite la detección de la isoforma sobre el segundo soporte por medio de un marcador de detección tal como el anticuerpo monoclonal 3F4 disponible comercialmente. Este anticuerpo particular enlaza con especificidad tanto a la forma nativa como a la desnaturalizada de PrPc y a las formas desnaturalizadas de PrPsc, pero no enlaza a PrPsc nativa, no desnaturalizada. Un complejo de isoforma-ligando inmovilizado sobre el primer soporte no sería detectado por el anticuerpo monoclonal 3F4, no obstante, la isoforma modificada sería detectada por el anticuerpo cuando está inmovilizada sobre el segundo soporte. Una señal de detección observada sobre el segundo soporte, pero ausente sobre el primer soporte, indicaría la presencia de la isoforma PrPsc en la localización correspondiente sobre el primer soporte. Uno podría concluir que el ligando inmovilizado en la localización correspondiente sobre el primer soporte enlaza con especificidad a la isoforma PrPsc. Por consiguiente, en una modalidad preferida, la identificación de un ligando específico para una isoforma estructural de una proteína se logra practicando lo siguiente: poner en contacto una muestra que contenga una isoforma objetivo con un ligando de prueba bajo condiciones suficientes para ocasionar la formación de un complejo de isoforma-ligando; inmovilizar el complejo de isoforma-ligando y, opcionalmente, una isoforma control sobre un primer soporte, detectar la isoforma sobre el primer soporte, transferir la isoforma a un segundo soporte e inmovilizar la isoforma sobre éste; detectar la isoforma sobre el segundo soporte, en donde la detectabilidad de la isoforma es modificada antes de detección; alinear el primero y segundo soportes y determinar una localización de la isoforma objetivo sobre el segundo soporte, en donde la localización es indicada por la presencia de una señal de detección sobre el segundo soporte y la ausencia de una señal de detección correspondiente sobre el primer soporte; determinar una localización de la isoforma objetivo sobre el primer soporte; e identificar al ligando en esa localización. En una modalidad alternativa, la detección diferencial entre el primer y el segundo soportes se logra usando métodos de detección diferencial para las varias isoformas presentes sobre cada soporte. En el caso de serpinas tales como el inhibidor de alfa-1 proteasa (API, Alpha-1 Protease Inhibitor), existen tanto la isoforma activa como la latente. API pierde su actividad cuando se "sacude" su estructura. Ligandos que son específicos para una de las isoformas pueden ser identificadas incubándolas con los materiales iniciales que contengan API. Los ligandos son entonces inmovilizados en un gel e incubados con una enzima contra la cual API tiene actividad, tal como la elastasa porcina. Los ligandos complejados con isoformas de API activas son identificadas vía un ensayo colorimétrico. Las isoformas de proteínas son transferidas subsecuentemente de los ligandos bajo condiciones no desnaturalizantes a un segundo soporte sólido, tal como una membrana. La membrana es entonces incubada con un marcador de detección tal como un anticuerpo que detecta todas las formas de API. Es posible que algunos ligandos puedan enlazar tanto la forma activa como la forma latente de API; no obstante, con este método, se identificaron ligandos que enlazan solamente la forma activa de la proteína. Pueden también ser contempladas en el alcance de este método, otras modalidades, que incluyen la identificación de ligandos que enlazan solamente ciertas formas de proteínas amiloides. En aún otras modalidades, la detección diferencial entre el primer y el segundo soportes se logra cuando solamente una de las isoformas objetivo o control es transferida a y detectada sobre el segundo soporte después de detección tanto de la isoforma control como de la isoforma objetivo sobre el primer soporte. Por ejemplo, puede usarse PK para diferir la isoforma priona control (PrPc) y fraccionar la isoforma objetivo PrPsc en fragmentos resistentes a PK, conocidos como PrPres, sobre el primer soporte. Dicho tratamiento da como resultado la transferencia solamente de PrPres al segundo soporte. Un marcador de detección, tal como un anticuerpo 3F4 disponible comercialmente (disponible de Signet Laboratories, Inc., Dedham, MA), puede entonces ser usados para detectar PrPres sobre el segundo soporte. La alineación del primer y el segundo soportes indica la localización de uno o más ligandos de prueba específicos para la isoforma PrPsc.

Detección En varios de los métodos de detección descritos anteriormente, se usa un ligando detectable, o marcador, para determinar la presencia de una isoforma de proteína. Los términos "marcador detectable" o "método de detección", se refieren a entidades o métodos con los cuales puede ser determinada la presencia de una proteína. Cuando se emplea un marcador detectable, el marcador o grupo detectable particular usado para detectar la isoforma no es crítico mientras que sea compatible con los requerimientos del ensayo. El marcador detectable puede ser cualquier material que tenga una propiedad física o química detectable. Dichos marcadores detectables han sido bien desarrollados y, en general, cualquier marcador útil en dichos métodos puede ser aplicado al presente método. Por consiguiente, un marcador es cualquier composición detectable por medios espectroscopios, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, eléctricos, ópticos o químicos. Los marcadores útiles incluyen colorantes fluorescentes (tales como isotiocianato de fluoresceína, rojo Texas, rodamina, y los similares), radiomarcadores (tales como 3H, i25l, 35S, 14C, o 32P), enzimas tales como LacZ, CAT, peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina y otras, usadas comúnmente como enzimas detectables, ya sea en un inmunoensayo enzimático (EIA, Enzyme ImmunoAssay) o en un ensayo inmunosorbente vinculado con enzimas (ELISA, Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay), y marcadores colorimétricos tales como perlas de oro coloidal o vidrio o plástico coloreado (tal como poliestireno, polipropileno, látex, etc.). El marcador puede ser acoplado directa o indirectamente al componente deseado del ensayo de conformidad con métodos bien conocidos en el arte. Como se indicó anteriormente, pueden usarse una amplia variedad de de marcadores, con la selección del marcador que depende de la sensibilidad requerida, facilidad de conjugación del compuesto. Requerimientos de estabilidad, instrumentación disponible, propiedad para el ensayo, y condiciones de desecho. Marcadores no radioactivos son a menudo fijados por medios indirectos. De manera general, una molécula de ligando secundario (tal como biotina) es enlazada covalentemente al primer ligando. El ligando secundario enlaza entonces a una molécula de ligando terciario (tal como estreptavidina) que es detectable inherentemente o bien enlazada covalentemente a un sistema de señal, tal como una enzima detectable, un compuesto fluorescente, o un compuesto quimioluminiscente. Pueden usarse numerosos ligandos primarios, secundarios y terciarios. Cuando un ligando secundario tiene un ligando terciario natural, por ejemplo, biotina, tirosina, o cortisol, puede usarse conjuntamente con los ligandos terciarios como se encuentran de manera natural, marcados. De manera alternativa, puede usarse cualquier compuesto hapténico o antigénico en combinación con un anticuerpo. Los ligandos secundarios pueden también ser conjugados directamente a compuestos generadores de señal, tal como por conjugación con una enzima o fluoróforo. Las enzimas de interés como marcadores será primeramente particularmente fosfatasas, estearasas y glicosidasas, u oxido reductasas, particularmente peroxidasas. Los compuestos fluorescentes incluyen fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, umbeliferona, etc. Los compuestos quimioluminiscentes incluyen luciferina, y 2, 3- dihidroftalazinodionas, tal como luminol. Los medios de detectar marcadores son bien conocidos por los expertos en la materia. Así, por ejemplo, cuando el marcador es un marcador radioactivo, los medios para detección incluyen un contador por centelleo o película fotográfica como en autoradiografía. Cuando el marcador es un marcador fluorescente, puede ser detectado por excitación del fluorocromo con la longitud de onda de rayos apropiada y detectar la fluorescencia resultante, tal como por microscopía, inspección visual, vía película fotográfica, por medio del uso de detectores electrónicos tal como dispositivos acoplados a la carga (CCDs) o fotomultiplicadores y los similares. De manera similar, los marcadores enzimáticos son detectados proporcionando sustratos apropiados para la enzima y detectar el producto de reacción resultante. Finalmente, los marcadores colorimétricos simples pueden ser detectados simplemente por observación del color asociado con el marcador. Se comprenderá que puede emplearse una combinación de diferentes marcadores detectables en este método para lograr la diferenciación de las isoformas. Los marcadores detectables de la presente invención pueden ser cualquier entidad biológica o molecular que interactúe con varias isoformas en diferentes maneras. Por ejemplo, el marcador puede ser una enzima o anticuerpo que interactúe específicamente con una o varias isoformas, una secuencia de ácidos nucleicos que enlaza a una o varias isoformas a través de la hibridación o una entidad molecular que sufre una reacción química detectable en la presencia de una o varias isoformas. De manera similar, el marcador puede ser específico para una proteína que esté complejada con otras entidades biológicas tales como co-factores o enzimas. De manera alternativa, la proteína misma puede ser detectada directamente por medio de una señal espectral, que incluye fluorescencia o por un peso molecular o secuencia de proteína, a través de espectrometría de masa, u otros medios. La detección de una isoforma puede lograrse también por detección de una actividad biológica, bioquímica, o química de la misma isoforma. Es una ventaja de la presente invención que la proteína pueda ser transferida a otro soporte usando condiciones bajo las cuales retiene su actividad biológica. Por ejemplo, una isoforma puede retener o adquirir una actividad no presente en una isoforma diferente, y esta actividad puede ser usada para diferenciar entre ligandos que discriminan entre las isoformas.

Muestras Las ¡soformas de proteínas para uso en el método descrito en la presente pueden estar contenidas en numerosos tipos de muestras que incluyen muestras biológicas y ambientales. Las ¡soformas pueden co-existir en un ambiente purificado, semipuro o complejo en la muestra. Las muestras ambientales incluyen, pero no se limitan a, agua de una fuente tal como un lago, océano, corriente, río, acuífero, pozo, instalaciones de tratamiento de aguas o agua recreacional. En algunas modalidades de la invención, la muestra contiene isoformas objetivo sintéticas, que incluyen ¡soformas de péptídos sintéticos, ¡soformas de proteínas recombinantes, especies de ¡soformas de ácidos nucleicos sintéticos, bibliotecas de ¡soformas combinatorias, solventes orgánicos, extractos de suelos, alimentos, aire y suministro de agua, limpieza de superficies ambientales, y los similares. Los ejemplos de muestras biológicas que pueden contener las isoformas de proteínas incluyen, pero no se limitan a, sangre entera, composiciones o componentes derivados de sangre, suero, fluido cerebroespinal, orina, saliva, leche, fluidos ductales, lágrimas, semen, o pueden ser derivados orgánicos, que incluyen cerebro, bazo, composiciones homogeneizadas de tejido, humano o animal, homogeneizados celulares, medio acondicionado, caldos de fermentación, preparaciones de anticuerpos, homogeneizados y extractos vegetales, y alimentos, que incluyen suplementos nutricionales. Otras muestras biológicas incluyen aquellas que contengan colágeno o extractos glandulares. Como se usa en la presente, los términos "composiciones derivadas de sangre" y "composiciones de sangre" se usan indistintamente y se quiere decir que incluyen sangre entera, concentrados celulares de sangre roja, plasma, fracciones pobre en plaquetas y ricas en plaquetas, precipitados plasmáticos, sobrenadantes plasmáticos, preparaciones de inmunoglobulinas intravenosas que incluyen IgA, IgE, IgG e IgM, concentrados del factor de coagulación purificados; serpinas, que incluyen inhibidor de a-1 proteasa, anti-trombina III, antiplasmina a2, concentrado de fibrinógeno, y albúmina; u otras varias composiciones que se derivan de humano o animal. El término también incluye proteínas derivadas de sangre purificadas preparadas por medio de cualquiera de varios métodos comunes en el arte que incluyen cromatografía por intercambio iónico, por afinidad, por permeación sobre gel, y/o hidrofóbica o por precipitación diferencial. Muestras biológicas que contienen las isoformas de la presente invención incluyen adicionalmente productos alimenticios o suplementos nutricionales ya sea para consumo humano o animal. Por ejemplo, la muestra biológica puede contener material derivado de cualquier animal incluyendo, pero no limitándose a los animales bovino; ovino; porcino; equino; roedores tales como ratón y hámster; y un Cervidae, tal como ciervo o alce. El término "materiales derivados de animal", se refiere a los materiales descritos anteriormente así como también a materiales que contienen partes animales tales como músculo, tejido conectivo y/o tejidos de órganos. Los materiales derivados de animales incluyen adicionalmente, pero no se limitan a, harina de hueso, ganado vacuno, sub-productos de ganado vacuno, ovinos, subproductos de ovinos, ciervos, sub-productos de ciervos, puerco, sub-productos de puerco, salsas, hamburguesas, alimentos para bebé, gelatinas, jaleas, leche; y fórmulas infantiles.

Identificación de un ligando específico para PrPsc Se describe en la presente un método preferido para la identificación de un ligando específico para la isoforma priona PrPsc, y no para PrPc, con referencia a la Figura 3, que es un diagrama de flujo que representa esquemáticamente un método para identificar ligandos de PrPsc de conformidad con cierta modalidad preferida de la presente invención. En una modalidad, una muestra de complejo que contenga tanto PrPc como PrPsc es incubada con una biblioteca de ligandos generados combinatoriamente que han sido sintetizados sobre perlas de resina por cromatografía de modo que cada perla contenga millones de copias de un ligando único, individual, y cada perla posee un ligando diferente. De manera preferible la muestra es un homogeneizado de cerebro de hámsters que han sido infectados con el prurito lumbar. Este homogeneizado cerebral contiene tanto la forma celular normal de la proteína priona, PrPc, como la forma infecciosa, PrPsc. De manera alternativa, la muestra es un homogeneizado cerebral de un humano infectado con la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (CJD) esporádica o un homogeneizado cerebral de un paciente infectado con CJD variante (vCJD). Producir la biblioteca de ligandos (sobre fase sólida, tal como perlas o membrana Incubar con material inicial que contenga ambas isoformas (tales como homogeneizado cerebral que contenga PrPc y PrPsc) i Incubar con el primer marcador de detección (tal como 3F4), el cual detecta solamente PrPc nativa J, Incubar con el marcador de detección secundario (anticuerpo - conjugado de AP + sustrato) PrPc + 3F4 + fase sólida es detectable (tal como las perlas se tornan rojas) Incubar opcionalmente la biblioteca con agente de digestión (tal como PK, que digiere a PrPc) Inmovilizar las perlas en el primer soporte (gel de agarosa) Procesar el primer soporte para producir película con manchas que corresponden a perlas con 3F4 + PrPc (película 1) i Transferir con agente desnaturalizante (GuHCI 6M) sobre el segundo soporte (membrana) Incubar el segundo soporte con el segundo marcador de detección (3F4 enlaza tanto a PrPc xomo a PrPsc desnaturalizadas) Incubar con el marcador de detección secundaria (anticuerpo - conjugado de AP + sustrato) Procesar el segundo soporte para producir película con manchas que corresponden a perlas + 3F4, PrPc y PrPsc (película 2) i Alinear las películas 1 y 2 para encontrar manchas sobre la película 2 que no estén presentes sobre la película 1 (que indican las manchas que son específicas para PrPsc) Alinear las películas (manchas) con el soporte (gel de agarosa que contiene perlas) i Identificar manchas que corresponden a perlas que enlazan solamente a PrPsc i Identificar perlas que enlazan a PrPsc Identificar Iigandos La muestra es incubada con la biblioteca sobre perlas por un período de tiempo suficiente para las ¡soformas de proteínas enlacen a los varios Iigandos vía interacciones por afinidad muy específicas. Las proteínas no enlazadas o débilmente enlazadas son retiradas por lavado. Las proteínas enlazadas son detectadas por medio de un primer método de detección, usando un marcador de detección específico para PrPc. Un marcador de detección preferido es el anticuerpo monoclonal designado 3F4 (Signet Laboratories, Inc., Dedham, MA). Este anticuerpo puede detectar PrPc en sus formas nativa y desnaturalizada; no obstante, puede solamente detectar PrPsc cuando es desnaturalizada. Las perlas que poseen Iigandos, sobre los cuales son fraccionadas las proteínas, son incubadas con el marcador de detección. El marcador de detección enlazado, es detectado usando un marcador de detección secundario tal como un anticuerpo detectable que enlaza al primer marcador de detección. Preferiblemente, el marcador de detección secundario es un anticuerpo conjugado a la fosfatasa alcalina (AP, Alkaline Phosphatase), el cual forma un precipitado coloreado, insoluble que tiñe a las perlas que poseen el anticuerpo secundario rojo a partir de la reacción con un sustrato de AP. Así, las perlas rojas indican la presencia de ligandos a los cuales ha enlazado PrPc o el marcador de detección o el anticuerpo secundario. En una modalidad, la biblioteca completa que ha sido incubada con el material inicial es entonces incubada con PK, la cual preferiblemente digiere a PrPc. Este remueve a PrPc de las perlas, dejando solamente a PrPres para transferencia y detección. En estas y otras modalidades, la biblioteca tratada puede entonces ser inmovilizada sobre un primer soporte tal como un gel, preferiblemente como un gel de agarosa. Este primer soporte inmoviliza las perlas en una monocapa fina. En una modalidad, el primer soporte y las perlas son incubadas con una sustancia quimioluminiscente tal como sustrato de fosfatasa alcalina quimioluminiscente y sustancialmente es expuesta a película radiográfica para producir una película con manchas en la localización de perlas que enlazaron a PrPc-marcador de detección-marcador secundario (película 1). En estas y otras modalidades las proteínas enlazadas a las perlas son entonces separadas por transferencia de las perlas, tal como de una manera capilar por difusión de un regulador de transferencia en una dirección a través del gel, hasta las perlas, y hasta un segundo soporte tal como una membrana de enlace de la proteína, sobre la cual se capturaron las proteínas que han sido separadas de las perlas. Son capturadas en la misma posición relativa sobre el segundo soporte en el que fueron inmovilizadas en el primer soporte. En una modalidad, el regulador de transferencia es un agente modificador, preferiblemente desnaturalizante, tal como Guanidina HCI 6 M (GuHCI), el cual remueve y desnaturaliza a las proteínas, disociándolas de las perlas y manteniéndolas en un estado desnaturalizado durante la transferencia. El segundo soporte, al cual están enlazadas las proteínas, es retirado del primer soporte y procesado. En una modalidad, PrPc y PrPsc desnaturalizados, enlazados (PrPres si la biblioteca ha sido tratada con PK) sobre una membrana, son detectadas usando un marcador de detección tal como el anticuerpo 3F4. Bajo las condiciones anteriormente mencionadas, el anticuerpo 3F4 permite la detección tanto de PrPc como de PrPsc sobre la membrana, cuando ambos están desnaturalizados. El anticuerpo 3F4 enlazado es detectado vía un anticuerpo secundario, tal como un anticuerpo conjugado a peroxidasa de rábano (HRP). Esta enzima es entonces detectada vía un sustrato de HRP quimioluminiscente, y es expuesta a película radiográfica. Esta incubación da como resultado una película con manchas que indican la presencia de PrPc, PrPsc/PrPres y el anticuerpo 3F4 (película 2). La superposición de las películas 1 y 2 indica perlas que enlazaron solamente al anticuerpo 3F4 (enlazadoras de anticuerpo), PrPc o al anticuerpo 3F4, PrPc y PrPsc/PrPres (manchas superponibles presentadas sobre las películas 1 y 2), y que han enlazado solamente a PrPsc/PrPres (manchas presentes sobre la película 2). La alineación de la película con el primer soporte que contiene las perlas facilita la recuperación de una perla específica con las características deseadas.

Uso de ligandos para detectar y remover isoformas estructurales Los ligandos identificados usando los métodos descritos en la presente son preparaciones de anticuerpos, proteínas, péptidos, aminoácidos, ácidos nucleicos, carbohidratos, azúcares, lípidos, moléculas orgánicas, polímeros, y/o agentes terapéuticos putativos, y los similares. En una modalidad preferida, los ligandos son ligandos peptídicos. Los ligandos que son específicos para isoformas estructurales o fragmentos de isoformas estructurales identificados usando los métodos descritos anteriormente son útiles para una variedad de aplicaciones analíticas, preparativas y de diagnóstico. En una modalidad, los ligandos identificados usando los métodos proporcionados en la presente son usados para detectar la presencia de isoformas estructurales en un fluido biológico. El fluido biológico, tal como una muestra de prueba, es conectado con uno o más ligandos de conformidad con los métodos descritos en la presente bajo condiciones suficientes para causar la formación de un complejo entre la isoforma estructural y uno o más de los ligandos. El complejo es entonces detectado, identificando así la presencia de la isoforma estructural en el fluido biológico. Los ligandos identificados por medio de los métodos descritos en la presente pueden también ser usados para detectar isoformas objetivo extraídas en solución a de un material sólido. Por ejemplo, puede extraerse una muestra sólida con un solvente orgánico o acuoso o con un fluido crítico, y el sobrenadante resultante puede ser puesto en contacto con el ligando. Los ejemplos de muestras sólidas incluyen productos vegetales, particularmente aquellos que han sido expuestos a agentes que transmiten priones, tales como harina de hueso derivada de fuentes bovinas; productos derivados de animales, particularmente aquellos que han sido expuestos a agentes que transmiten priones, tal como harina de hueso derivada de fuentes bovinas. Otras muestra sólidas incluyen tejido cerebral, tejido córneo, materia fecal, harina de hueso, sub-productos de ganado vacuno, ovejas y sub-productos de ovejas, ciervo y alce, subproductos de ciervo y alce, y otros animales y productos derivados de animales. Los ligandos en algunas modalidades pueden ser usados para detectar la presencia de isoformas estructurales en suelo. En otra modalidad, ligandos que enlazan a isoformas estructurales son inmovilizados sobre un soporte, tal como una perla o una membrana, y se usan para enlazar y remover isoformas estructurales de una muestra. Las perlas y membranas para remoción de contaminantes son bien conocidas en el arte, y se describen por ejemplo, en Baumbach y Hammond (1992), Buettner (Patente U.S. No. 5,834,318). En esta modalidad, una muestra biológica es puesta en contacto con un ligando que enlaza a una isoforma estructural de conformidad con la invención bajo condiciones suficientes para ocasionar la formación de un compuesto o complejo de ligando-isoforma estructural. El complejo puede ser entonces removido de la muestra biológica, removiendo así la isoforma estructural de la muestra biológica. Como se indicó anteriormente, los ejemplos de muestras biológicas incluyen, tales como sangre, composiciones derivadas de sangre, plasma o suero. Los fluidos biológicos adicionales incluyen fluido cerebro espinal, orina, saliva, leche, fluido ductal, lágrimas o semen. Otros fluidos biológicos pueden contener colágeno, extractos vegetales y cerebrales. Puesto que los ligandos identificados usando los métodos descritos en la presente son específicos para una isoforma particular, los ligandos pueden ser usados para la concentración o remoción selectiva de una de las isoformas sobre otra. En algunas modalidades, los ligandos distinguen entre isoformas infecciosas y no infecciosas, y estos ligandos pueden ser usados para el diagnóstico y el pronóstico de enfermedades en un humano o animal que involucran isoformas que causan enfermedades o infecciones. Los ejemplos de enfermedades que se cree que son causadas por una isoforma individual de una proteína son enfermedades relacionadas con el prión que incluyen, pero no se limitan a, TSEs ta! como prurito lumbar, el cual afecta a ovejas y cabras; BSE, que afecta a ganado vacuno; encefalopatía transmisible del visón, encefalopatía espongiforme felina y CWD de ciervos híbridos, ciervo de cola blanca, y alces, kuru, CJD, GSS, insomnio fatal (vCJD), que afecta a humanos. La invención será descrita con mayor detalle a manera de ejemplos específicos. Los ejemplos siguientes se ofrecen para propósitos ilustrativos, y no se pretende que limiten ni definan la invención en manera alguna.

EJEMPLO 1 Identificación de péptídos que enlazan a PrPc v a PrPsc de homogeneizado cerebral de hámster infectado de prurito lumbar Un uso de los métodos descritos en la presente es la identificación de ligandos que enlazan preferentemente a y permiten así la detección y la separación de formas isoformas versus normales de las proteínas prionas PrPc y PrPsc. Diferentes propiedades bioquímicas de PrPc y de PrPsc y el enlace de anticuerpos, es decir, el anticuerpo monoclonal 3F4 (Signet Laboratories, Inc., Dedham, MA)fueron utilizados para encontrar ligandos que enlacen selectivamente a PrPsc. El anticuerpo monoclonal 3F4 enlaza a PrPsc y a PrPc desnaturalizadas con afinidad considerablemente más alta que a PrPsc no desnaturalizada.

A. Biblioteca Peptídica Se sintetizaron bibliotecas de péptidos mono- di- y trímeros por Peptides International (Lexington, KY) directamente sobre la resina amino Toyopearl™ 650- (Tosoh Bioscience, Montgomeryville, PA usando la química de Fmoc estándar basada en los métodos descritos por Buettner y colaboradores, 1996. Bibliotecas de péptidos tetra-, penta- y hexámeros incluyeron un espaciador de ácido épsilon-amino caproico entre el grupo amino y la generación de la biblioteca. Las densidades peptídicas logradas con el esquema anterior estuvieron típicamente en el intervalo de 0.1 - 0.5 mmoles/gramo de peso seco de resina.

B. Protocolo para la Preparación de Homogeneizado Cerebral de Hámster (material que contiene PrP) Se prepararon homogeneizado al 10 % (en volumen) de cerebros de hámster infectado de prurito lumbar y sin infectar en solución salina regulada con fosfato, pH de 7.4 (PBS) y se congelaron a - 80 °C (cortesía del Dr. Robert Rohwer, VA Medical Center, Baltimore). Antes de uso los homogenizados fueron descongelados sobre hielo húmedo y se solubilizaron 1.2 mi de homogeneizado (no infectado) y de homogeneizado 0.5 mi (infectado) con Sarcosil al 0.5 % con agitación lenta por 30 minutos a temperatura ambiente. Se centrifugaron las muestras a 14,000 rpm por cinco minutos, y se colectaron los sobrenadantes que contenía ambas formas, PrPc (infectada y sin infectar) y PrPsc (solamente infectada). Se prepararon cinco mililitros de material cerebral combinando 1 mi de material cerebral de hámster normal con 0.33 mi de material cerebral infectado de prurito lumbar y 3.67 mi de regulador de solución salina regulada con Tris (TBS), pH de 7.2, que contenía bloqueador de caseína al 1 % (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL) y albúmina de suero bovino al 1 % (BSA, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). La proporción final de homogeneizados cerebral normal al infectado con prurito lumbar fue de tres a uno, la cual dio como resultado aproximadamente cantidades equivalentes de PrPc y de PrPsc.

C, Protocolo para Cribar el Enlace de Bibliotecas Peptídicas Se colocaron cinco miligramos de perlas secas de la biblioteca peptídica en una columna para cromatografía Bio-Spin™ desechable (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), y se lavaron con 20 volúmenes de columna (CV) de metanol al 20 % en agua para remover posibles impurezas y solventes orgánicos usados en la síntesis peptídica. Las perlas fueron entonces lavadas y equilibradas usando 20 CV de 1x TBS, pH de 7.6 (1x TBS se preparó por dilución de 10 veces de 10x TBS (Biosource International, Camarillo, CA). Se detuvo el flujo y se suspendieron las perlas en 1 mi de TBS 1x recientemente preparado y se dejaron esponjar por 15 minutos adicionales. Se drenó el TBS y la columna se cerró de nuevo. Para evitar enlaces no específicos, se aplicó a las perlas 1 mi de solución de Caseína Bloquer™ en TBS (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL) con BSA al 5 % adicionado (Sigma-Aldrich). Después de cubrir ambos extremos de la columna, se efectuó el bloqueo toda la noche a 4 °C, bajo agitación lenta. Se drenó la solución bloqueadora y se aplicó a la resina 1 mi del homogeneizado cerebral de hámster preparado anteriormente. La columna fue cerrada herméticamente en ambos extremos y se colocó en posición horizontal y agitada lentamente a temperatura ambiente por una a tres horas. El homogeneizado cerebral se separó por drenado y las perlas se lavaron (lavado activado gravitacionalmente) con 10 mi de TBS que contenía 0.05 % de Tween 20 (T-TBS), seguido por 10 mi de TBS.

D. Protocolo para la Detección de PrPc Enlazada Se efectuó la detección colorimétrica de PrPc normal usando el anticuerpo monoclonal de ratón 3F4 (Signet, Dedham, MA) diluido 1:8,000 en TBS que contenía caseína al 1 %. El anticuerpo monoclonal enlaza a haPrPc nativa, pero tiene poca o ninguna afinidad por haPrPsc nativa; no obstante, enlaza a haPrPsc y a haPrPc desnaturalizadas. Se añadió 1 mi del anticuerpo 3F4 diluido a las perlas expuestas anteriormente. La columna fue agitada lentamente a temperatura ambiente por 1 hora. La solución que contenía el anticuerpo se separó por drenado y las perlas se lavaron con 10 mi de TBS y 10 mi de T-TBS. Las perlas fueron entonces incubadas en 1 mi de fosfatasa alcalina marcada con el anticuerpo secundario anti-ratón de cabra (KPL, Gaithersburg, MD) diluido 1 :2,000 en caseína al 0.5 %/BSA al 0.5 % en TBS. Se llevó a cabo la incubación con agitación lenta por una hora a temperatura ambiente. La solución del anticuerpo secundario se retiró por drenado y las perlas se lavaron con 10 mi de TBS y 10 mi de T-TBS. Se preparó un mililitro del sustrato ImmunoPure Fast Red™ para fosfatasa alcalina (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) como describió el fabricante y se aplicó a las perlas. Procedió la incubación a temperatura ambiente por aproximadamente 15 minutos, o hasta que las perlas comenzaron a tornarse rosa pálido y aparecieron unas cuantas perlas rojo oscuro. La solución sustrato se drenó y las perlas se lavaron con 10 mi de TBS. La columna se cerró en ambos extremos y se conservó a 4 °C toda la noche.

E. Protocolo para la Detección de Perlas Enlazadas a PrP Insertadas en Agarosa. Resumiendo, las perlas incubadas con homogeneizado cerebral de hámster descritas anteriormente fueron insertadas en agarosa. Primero, la capa base de agarosa se preparó cubriendo la superficie de una bandeja de 49 cm2 (Bio-Rad™ Laboratories, Hercules, CA) con 9 mi de agarosa al 1 % (Invitrogen, Carisbad, CA) disuelta en agua, la cual fue precisamente fundida y enfriada a aproximadamente 40 °C. La agarosa se dejó solidificar. Se añadieron noventa microlitros de solución de perlas suspendidas a 1.923 mg/m! a 800 µ? de agarosa de bajo punto de fusión al 0.5 % (See Plaque GTG Agarose™, FMC BioProducts (ahora conocido como Cambrex Bioscience, Inc., Baltimore, MD) disuelta en agua, fundida y enfriada a aproximadamente 40 °C. La mezcla se sometió a vórtice brevemente y se extendió sobre la superficie completa de la capa base. Una gota del material que contenía PrP se colocó directamente en la esquina del gel y sirvió como un control positivo para los procedimientos siguientes. Se dejó solidificar el gel a 4 °C antes de comenzar la detección por quimioluminiscencia de perlas enlazadas a PrP.

F. Protocolo para la Detección Quimioluminscente de Perlas Enlazadas a PrP Insertadas en Agarosa Después de insertar las perlas en el gel, se añadió un volumen suficiente del sustrato de fosfatasa alcalina quimioluminscente CDP-Star (Tropix Inc., (Applied Biosystems), Bedford, MA), para cubrir la superficie del gel y se incubaron por cinco minutos a temperatura ambiente como recomendó el fabricante. El gel se separó por drenado del sustrato en exceso, se colocó sobre una película de transparencia plástica clara, se selló en una bolsa de plástico, y se expuso a película de autoradiog rafia por 30 minutos. La película (película 1) identificó solamente a PrPc nativa, y las perlas que enlazaron a 3F4 y al anticuerpo secundario y se usaron subsecuentemente para alinear las películas obtenidas después de transferencia de proteína a una membrana de nitrocelulosa.

G. Protocolo para la Transferencia de Proteínas de las Perlas Insertadas a la membrana de Nitrocelulosa Esta tecnología eluye proteínas de perlas y las transfiere por medio de acción capilar sobre membranas de nitrocelulosa o de PVDF. Una pieza de papel filtro 3M (Schleicher y Schuell, Keene, NH) actúa como mecha para la transferencia de regulador (el cual puede ser cualquier regulador que esté adaptado a las necesidades particulares del experimento) desde un tanque a través del gel en el cual las perlas son inmovilizadas. Por consiguiente, la mecha de papel 3 M fue prehumedecida con solución de transferencia y colocada sobre una superficie con los extremos del papel sumergidos en el tanque de regulador. Se usó clorhidrato de Guanidinium (GuHCI) 6M (seis molar) como la solución de transferencia y fue suficiente para disociar y desnaturalizar las proteínas enlazadas desde las perlas durante la transferencia. Se colocó el gel, el lado de las perlas hacia arriba, sobre el papel 3MM húmedo, asegurándose de que no haya burbujas de aire entre el papel y el gel. Una pieza de membrana cortada al tamaño del gel (ECL-nitrocelulosa estándar Hybond™ (Amersham Biosciences Corp, Piscataway, NJ) se humedeció en el regulador de transferencia y se colocó en la parte superior del gel. Se rodó un a pipeta sobre la membrana para eliminar burbujas de aire. Se colocaron dos piezas de papel 3MM pre-humedecido sobre la membrana y se rodó con una pipeta para eliminar las burbujas de aire. Una pila de toallas de papel seco u otro papel absorbente se colocó sobre la parte superior, y pesaron con 300 gramos. La transferencia procedió por 16 horas a temperatura ambiente, y dio como resultado la transferencia e inmovilización de las proteínas que fueron enlazadas sobre la membrana de captura.

H. Protocolo para la Detección de ECL (quimioluminiscente) Se colocó la membrana sobre la cual fueron transferidas las proteínas en un contendor de plástico con 10 mi de leche bovina libre de grasa, secada al 5 % (peso/volumen) resupendida en T-TBS (3F4 no reconoce a la PrPc bovina presente en leche bovina). La membrana se incubó con agitación lenta por 16 horas a 4 °C para evitar el enlace no específico de anticuerpos a la membrana. Después del bloqueo la membrana fue incubada con 10 mi de una dilución 1:4000 veces de anticuerpo primario, 3F4 (Signet), en leche al 5 % en TBS con agitación lenta por 1.5 horas a temperatura ambiente. La solución del anticuerpo primario fue descartada y la membrana se enjuagó dos veces con T-TBS, se lavó por 15 minutos en T-TBS, luego dos veces por cinco minutos en T-TBS recientemente preparado. Todos los lavados se efectuaron con agitación lenta. La membrana se incubó entonces por 1.5 horas a temperatura ambiente con agitación lenta con 10 mi de una dilución 1 :10,000 veces de peroxidasa de rábano (HRP) marcada con anticuerpo secundario anti-ratón de cabra (KPL), en leche al 5 % en T-TBS. La solución de anticuerpo secundario fue descartada y las membranas fueron enjuagadas y lavadas como anteriormente. Se logró la detección quimioluminiscente preparando el sustrato ECL-Plus (Pierce) quimioluminiscente HRP de conformidad con las instrucciones del fabricante. Se añadieron a cada membrana 10 mi de la mezcla, lado superior de la proteína. El sustrato fue agitado lentamente manualmente por 1 minuto y las membranas saturadas con sustrato fueron retiradas y colocadas sobre papel filtro 3MM para drenar rápidamente, luego envueltas en un protector laminar (Boise Cascade Products, Boise, IL). El lado de proteínas de la membrana fue puesto en contacto con película de autoradiografía por varias veces y se revelaron las películas (película 2).

I. Detección de Enlazadores Triméricos Específicos para PrPsc de Cerebro de Hámster con Prurito Lumbar El protocolo anterior dio como resultado la producción de un gel con un por ciento de perlas que fueron teñidas de rojo, indicando que enlazaron a PrPc nativa o al anticuerpo secundario, una primera película con una señal de estas perlas, y una segunda película con señales de perlas que enlazaron tanto al PrPc nativa como al anticuerpo secundario (teñidos de rojo sobre el gel) y a PrPc y PrPsc desnaturalizadas, y/o al anticuerpo secundario. Después de alineación de las manchas sobre las películas 1 y 2 con las perlas previamente teñidas, fueron posibles cuatro poblaciones de perlas: 1) aquellas que enlazaron a 3F4 se teñirían de rojo y producirían una señal sobre las películas 1 y 2; 2) aquellas que enlazaron a PrPc y a PrPsc se teñirían de rojo y producirían una señal sobre las películas 1 y 2; 3) aquellas que enlazaron a PrPc sola se teñirían de rojo y producirían una señal sobre las películas 1 y 2; y 4) aquellas que enlazaron solamente o preferentemente a PrPc producirían una señal sobre la película 2, pero no se teñirían de rojo, ni producirían una señal sobre la película 1. Esta alineación y selección se presenta diagramáticamente en la Figura 2. El cuarto grupo de perlas fue seleccionado como perlas específicas para PrPsc. Las perlas representativas de la biblioteca de trímeros que no produjo la señal en la primera detección por quimioluminiscencia (película 1 , antes de la etapa de desnaturalización) pero que produjeron la señal en la segunda detección por quimioluminiscencia (película 2, después de la etapa de desnaturalización), se secuenciaron. Varias secuencias de aminoácidos de ligandos se identificaron en estos y en otros experimentos (incluyendo experimentos en donde se usó PK) se enlistan en el Cuadro 1 posterior, Se sintetizaron varios gramos de resina DVR.

CUADRO 1 Péptido que enlaza a PrPc y a PrPsc de homogeneizado cerebral de hásmter infectado de prurito lumbar (na indica 2-naftil-alanina) Se incubaron cinco miligramos (5 mg) de DVR (SEC ID NO: 3) y Amino 650-M (como un control) con homogeneizado cerebral spCJD al 1 % solubilizado con Sarkosil al 1 %, por una hora a temperatura ambiente. Se detectó la presencia de PrPc enlazado a las perlas con Rojo Naftiónico como se describió previamente. Las perlas fueron entonces inmovilizadas en un gel de agarosa, se detectaron sobre el primer soporte, se transfirieron con GuHCI, y se detectaron sobre el segundo soporte. Las perlas de DVR fueron blancas bajo el microscopio después de la detección sobre las perlas y la señal sobre el primer soporte fue débil, indicando poco enlace de PrPc. Las perlas Amino fueron rosas y la señal sobre el primer soporte fue fuerte, indicando que la resina Amino enlaza a PrPc. Después de desnaturalización y transferencia, la señal de las perlas de DVR (SEC ID NO: 3) sobre el segundo soporte fue fuerte. La señal de las perlas Amino fue también fuerte, indicando que enlazaron a PrPc y pueden también enlazar a PrPsc. Estos resultados indican que DVR (SEC ID NO: 3) enlaza preferencialmente a PrPc y confirma que el método puede identificar ligandos que enlazan preferencialmente a diferentes isoformas de proteínas.

EJEMPLO 2 Detección de Enlazadores a partir de Bibliotecas de Trímeros. Específicos para PrPres de CJD Esporádica En este ejemplo se cribó una biblioteca de trímeros para enlazadores de PrPsc de homogeneizado cerebral preparado a partir de un paciente con CJD esporádica humana, y las perlas fueron tratadas con proteínasa K (PK) antes de la inmunodetección de enlazadores específicos para PrPsc. Se efectuó el experimento de conformidad con los procedimientos descritos en el ejemplo previo con los siguientes cambios: 1) 10 mg de resina por columna se incubaron con 1 mi de homogeneizado cerebral al 1.= % diluido en regulador de CPD (citrato, fosfato, dextrosa (Baxter Healthcare/Fenwal, Deerfield, IL) y que contenía Sarkosil al 0.05 % (Sigma-Aldrich) y 0.2 mM de fluoruro de fenilnnetansulfonilo (PMSF, Sigma-Aldrich); 2) después de detección con el sustrato ImmunoPure Fast Red™, las perlas fueron incubadas con 1 mi de PK (100 pg/ml) a 37 °C por una hora. Los resultados del tratamiento con PK fueron la digestión de PrPc antes de transferencia, dejando solamente PrPres sobre las perlas y la membrana subsecuente. Esto da como resultado la película 2 que tiene solamente la señal generada por 3F4 que reconoce a PrPres. La alineación de la película 2 con el gel que contiene las perlas indicó aquellas perlas que son específicas para PsPsc. Las secuencias obtenidas a partir de este cribado fueron FPK (SEC ID NO: 19), HWK (SEC ID NO: 20), WEE (SEC ID NO: 21), y LLR (SEC ID NO: 22). Aunque pueden usarse en la práctica o pruebas de la presente invención, métodos y materiales similares a los descritos en la presente los métodos y materiales adecuados se describieron anteriormente. Todas las publicaciones, solicitudes de patentes, patentes y otras referencias citadas mencionadas en la presente se incorporan íntegramente como referencia. Además, los materiales, métodos, y ejemplos son solamente ilustrativos y no se pretende que sean limitantes. Se proporciona la descripción anterior para describir varias modalidades relacionadas con la invención. Pueden hacerse varias modificaciones, adiciones y eliminaciones a estas modalidades y/o estructuras sin alejarse del alcance y del espíritu de la invención.

Claims (10)

49 NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1.- Un método para identificar a un ligando que tiene especificidad de enlace por una isoforma de proteína en una muestra, que comprende: a. poner en contacto a uno o más ligandos con la muestra que contenga al menos dos isoformas de proteínas bajo condiciones que permitan la formación de uno o más complejos entre el uno o más ligandos y una o más isoformas de proteínas; b. poner en contacto el uno o más complejos con un primer marcador detectable bajo condiciones que permitan la generación de una primera señal detectable y detectar una presencia o ausencia de la primera señal detectable; c. transferir la una o más isoformas de proteínas desde un primer soporte a un segundo soporte; d. poner en contacto las isoformas transferidas con un segundo marcador detectable bajo condiciones que permitan la generación de una segunda señal detectable y detectar una presencia o ausencia de la segunda señal detectable; e. comparar la primera señal con la segunda señal, en donde la presencia o ausencia de la primera señal y la presencia o ausencia de la segunda señal identifican al uno o más ligandos que tengan especificidad de enlace por la una o más isoformas de proteínas.

2.- El método de conformidad con la Reivindicación 1, caracterizado además porque la una o más isoformas de proteínas es una 50 isoforma de una proteína priona.

3. - El método de conformidad con la Reivindicación 1, caracterizado además porque el primer y segundo marcadores detectables detectan diferentes ¡soformas de una misma proteína.

4. - El método de conformidad con la Reivindicación 1, caracterizado además porque el ligando es inmovilizado directa o indirectamente sobre un soporte sólido.

5. - El método de conformidad con la Reivindicación 1, caracterizado además porque el ligando es enlazado a una fase sólida que es inmovilizada sobre el soporte sólido.

6. - El método de conformidad con la Reivindicación 1, caracterizado además porque el uno o más ligandos son inmovilizados sobre el primer soporte antes de o después de poner en contacto a los ligandos con la muestra que contiene las al menos dos ¡soformas de proteínas.

7. - El método de conformidad con la Reivindicación 1, caracterizado además porque la una o más ¡soformas de proteínas son modificadas para formar una proteína diferentes antes de, durante o después de la transferencia al segundo soporte, y la isoforma de proteína diferente es puesta en contacto con el segundo marcador detectable.

8. - El método de conformidad con la Reivindicación 7, caracterizado además porque la una o más ¡soformas de proteínas son modificadas por digestión o por desnaturalización.

9. - El método de conformidad con la Reivindicación 1, 51 caracterizado además porque el ligando identificado como que tiene especificidad de enlace por la una o más isoformas de proteínas es un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NOS.: 1-22.

10. El método de conformidad con la Reivindicación 1 , caracterizado además porque el ligando identificado como que tiene especificidad de enlace por la una o más isoformas de proteínas es un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 3 o análogos de la misma.