MXPA05010411A - Material activo biologicamente conjugado con polimeros biocompatibles con el complejo 1:1, metodo de preparacion del mismo y composicion farmaceutica que lo contienen. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a conjugados de polimeros biocompatibles y moleculas biologicamente activas, en que el polimero biocompatible activado esta conjugado a un grupo carboxilo de material biologicamente activo en una relacion molar de 1:1 y a metodos de preparacion del mismo y a una composicion farmaceutica que comprende el mismo.

Description

MATERIAL ACTIVO BIOLOGICAMENTE CONJUGADO CON POLIMEROS BIOCOMPAT1BLES CON EL COMPLEJO 1:1, METODO DE PREPARACION DEL MISMO Y COMPOSICION FARMACEUTICA QUE LO CONTIENEN CAMPO DE LA INVENCION La presente invención concierne a conjugados de polímeros biocompatibles y a moléculas activas biológicamente con una proporción molecular de 1:1 y a métodos de preparación de los mismos y a una composición farmacéutica que los comprende. Particularmente, la presente invención concierne a conjugados formados por el enlace específicamente de polímeros biocompatibles a un grupo carboxilo de moléculas activas biológicamente en una proporción molar de 1:1 y a métodos de preparación de los mismos, y a una composición farmacéutica que los comprende.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION El uso de proteínas y péptidos como productos medicinales generalmente ha sido limitado por varios problemas. Por ejemplo, los péptidos o proteínas son muy bajos en la eficiencia de absorción in vivo porque son fácilmente hidrolizados o degradados por proteasas en un corto período de tiempo después de ser captados en el cuerpo, y también inducen la respuesta inmune con la administración repetida. Por consiguiente, la mayoría de los fármacos con proteínas y péptidos han requerido ser administrados por inyección al menos una vez al día o más. Esta administración frecuente por inyección, no obstante, causa dolor y riesgo a los pacientes. También, inyecciones frecuentes durante períodos prolongados son costosas e inconvenientes para los pacientes. Para desarrollar fármacos estables para resolver los problemas anteriores, se requirieron varios intentos y se ha desarrollado la tecnología para modificar materiales activos biológicamente tales como proteínas o polipéptidos con polímeros biocompatibles. Conjugados de proteínas o de moléculas activas farmacéuticamente con polímeros biocompatibles pueden producir grandes ventajas cuando se aplican in vivo e in vitro. Los materiales biocompatibles biológicamente, cuando son enlazados covalentemente a polímeros biocompatibles pueden exhibir propiedades superficiales y solubilidad modificadas y por consiguiente pueden ser de solubilidad creciente en agua o en solventes orgánicos. Adicionalmente, la presencia de polímeros biocompatibles puede hacer a las proteínas y/ o polipéptidos conjugados a ellos más estables in vivo, incrementar la biocompatibilidad de las proteínas y reducir la respuesta inmune, y reducir la velocidad de eliminación de las proteínas por el intestino, el riñon, el bazo, o el hígado. Aunque la conjugación de los materiales activos biológicamente tales como una proteína o un péptido de interés con polímeros biocompatibles tales como PEG tiene muchas ventajas, algunos problemas permanecen en conjugación por medio de métodos conocidos. La mayoría de los métodos de conjugación se logran por enlace de PEG activado al grupo amino de residuos de aminoácidos tales como lisina. Cuando el sitio activo sobre una superficie proteínica está conjugada a PEG, la actividad biológica del conjugado polímero-proteína es sustacialmente decreciente a causa de que uno o más residuos lisina libres de muchas proteínas son frecuentemente adyacentes a los sitios activos de las proteínas, generalmente. También, la reacción entre los residuos lisina de las proteínas y de PEG activado tiene lugar fácilmente y se obtienen conjugados PEG-proteína en donde dos o más moléculas de PEG son conjugadas a una molécula de proteína. Por ejemplo, cuando dos o más moléculas de PEG enlazan a la superficie de citoquinas tales como ¡nterferón, CSF, e interleuquina o polipéptidos tales como EGF, hGH, e insulina, la actividad biológica del conjugado es reducida rápidamente dando como resultado la pérdida de la función. También, estas reacciones tienen lugar aleatoriamente y da como resultado una mezcla de muchas clases de conjugados de PEG-proteína, que complica y dificulta la purificación de los conjugados deseados. Si demasiadas moléculas de polímero están fijadas a proteína so péptidos objetivo, los conjugados pierden toda o mucha de su actividad biológica. También, si se ha usado un enlazador reactivo expresivamente o se han fijado un número insuficiente de polímeros a moléculas de proteínas objetivos, puede disminuir la eficiencia terapéutica de estos conjugados. Para superar estos problemas, se han hecho muchos intentos para conjugar polímeros biocompatibles a residuos de aminoácidos de proteínas sustituidas por medio de ingeniería genética en polímeros conjugados en un sitio específico de las proteínas. No obstante, este método generalmente altera las propiedades originales de las proteínas. También necesita probarse la seguridad de estas moléculas diseñadas genéticamente como fármacos terapéuticos. Se ha intentado resolver los problemas por medio de la modificación química de sitios específicos de materiales activos biológicamente con polímeros biocompatibles. La Patente No. 5,951,874 y 5,985,263 describe la conjugación de moléculas de PEG al residuo histidina de interferon para incrementar la eficiencia de los fármacos por prolongación de la vida media in vivo y los similares. No obstante, este método aún usó el grupo amino reactivo y produjo isómeros de PEG-IFN fijados aleatoriamente a varios sitios histidina, y requiere una etapa de purificación adicional usando una columna de intercambio iónico para separar el complejo 1 : 1 deseado del conjugado PEG-IFN muy activo. Adicionalmente, el grupo imidazolilo de histidina al cual se fijó PEG es fácilmente hidrolizado en comparación con otros grupos amino de aminoácidos, y el interferon es liberado fácilmente del conjugado PEG-interferón. La Patente US No. 5,766,897 describe la conjugación de macromoléculas y de formas mutantes de las mismas a sus residuos cisteina a moléculas de PEG activadas. A causa del enlace disulfuro la mayoría de las moléculas de proteínas tienen una cisteina ya sea libre o no disponible. Por consiguiente, un aminoácido que no está relacionado al sitio activo puede ser cambiado a un residuo cisteina por mutagénesis para conjugar el nuevo residuo cisteina con polímeros. Este método, no obstante, tiende a producir conjugados con actividad significativamente disminuida en comparación con conjugados a grupos amino o carboxilo de proteínas, aunque tiene una ventaja de fijar el polímero en un sitio específico de moléculas activas biológicamente. La Patente US No. 5,985,265 describe conjugados en sitio específico a residuos N-terminales de G-CSF e IFN con moléculas de PEG. No obstante , la reactividad de estos polímeros activados es baja, y la reacción necesita un tiempo de reacción más prolongado. Además, el rendimiento de la reacción es bajo y la estabilidad de las proteínas es pobre. En el caso en el que el sitio activo de moléculas de proteínas está especialmente cerca del N-terminus, la conjugación en el grupo amino N-teminal da como resultado la disminución significativa o la pérdida de la actividad biológica. La Patente US No. 5,824,778 describe conjugados de G-CSF a grupos amino y carboxilo por PEG. Se añadió exceso de EDAC para activar los grupos carboxilo de la proteína y muchas moléculas de PEG se fijaron a grupos carboxilo activados de varios residuos. Se ha determinado que el conjugado PEG-G-CSF obtenido es una mezcla heterogénea que tiene varios números de moléculas de PEG fijadas, y la actividad biológica del conjugado se redujo significativamente. Por consiguiente, si la actividad biológica de moléculas activas biológicamente puede ser mantenida después de la conjugación con el polímero en una proporción deseada, y puede obtenerse una especie homogénea de conjugados en sitio específico, la utilidad clínica de dichas moléculas se incrementará notablemente.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION Los inventores de la presente invención prepararon conjugados de moléculas activas biológicamente-PEG en una proporción de 1:1 , en donde PEG es fijado a un grupo carboxilo de moléculas activas biológicamente. Los grupos carboxilo de moléculas activas biológicamente tienen reactividad más baja que grupos amino. Se observó que estos conjugados muestran eficiencia terapéutica hasta de 20 veces más alta que las proteínas nativas (no conjugadas)porque tienen una vida media prolongada y estabilidad más alta en comparación con proteínas nativas. También se observó que el complejo 1:1 mostró características superiores a los conjugados de proporción molar mayor de 1 :1 a grupos carboxilo o conjugados a grupos amino. Por consiguiente, la presente invención proporciona conjugados de moléculas activas biológicamente con polímeros biocompatibles en donde los polímeros biocompatibles son fijados específicamente a un grupo carboxilo de moléculas activas biológicamente en una proporción de 1:1, métodos de preparación de los mismos y una composición farmacéutica que los comprende. Los conjugados de la presente invención retienen actividad biológica de moléculas activas biológicamente nativas y tienen estabilidad, biodisponibilidad y vida media creciente.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS Las Figuras 1A y 1B muestran el grado de conjugación para mPEG(5K)-Hz-G-CSF por HPLC y SDS-PAGE. Las Figuras 2A y 2B muestran el grado de conjugación para mPEG(20 K)-Hz-G-CSF por HPLC y SDS-PAGE. La Figura 3, muestra mPEG(5 K)-Hz-1FN con la proporción molar de 1:1 sobre SDS-PAGE La Figura 4, muestra la productividad del conjugado mPEG(20K)-Hz-IFN de conformidad con la cantidad de EDAC añadido sobre SDS PAGE. La Figura 5 muestra el grado de reactividad para el conjugado mPEG(20K)-Hz-IFN de conformidad con el método de adición de EDAC y la cantidad de EDAC sobre SDS-PAGE. La Figura 6, muestra SDS-PAGE del conjugado mPEG(20K)-Hz-IFN purificado por medio de una columna de intercambio iónico. La Figura 7, muestra la comparación de la actividad biológica del conjugado mPEG(20K)-Hz-G-CSF, G-CSF nativo, y Neulasta™ (PEG-G-CSF, desarrollado por Amgen, aprobado por la FDA en 2002) por medio de ensayos basados en células. La Figura 8, muestra la vida media plasmática de mPEG(20K)- Hz-G-CSF, G-CSF nativo y Neulasta1™ (PEG-G-CSF, desarrollado por Amgen, aprobado por la FDA en 2002). La Figura 9, muestra glóbulos blancos (WBC) de conjugados mPEG(20K)-Hz-G-CSF, G-CSF nativo, y NeulastaT (PEG-G-CSF, desarrollado por Amgen, aprobado por la FDA en 2002). La Figura 10 muestra la actividad biológica del conjugado mPEG(12K)-Hz-IFN, IFN nativo, y PEG-IFN (desarrollado por Schering-Plough) por ensayo por CPE. La Figura 11 , muestra la comparación de la actividad biológica del conjugado mPEG(20K)-Hz-IFN con IFN nativo por ensayo por CPE. La Figura 12, muestra la comparación de la actividad biológica entre Di-mPEG-Hz-IFN, dos moléculas de PEG fijadas a una molécula de IFN y mono-m-PEG-Hz-IFN, una molécula de PEG fijada a una molécula de IFN, por ensayo por CPE. La Figura 13, muestra la comparación de la vida media en plasma del conjugado PEG(20K)-Hz-IFN, IFN nativo, y PEG-IFN (desarrollado por Schering Plough). Las Figuras 14A y 14B, muestra la comparación de la estabilidad entre PEG-IFN conjugado a un grupo carboxilo y a un grupo amino. La Figura 15, muestra el cromatograma por HPLC para PTH nativo el cual no ha sido modificado por polímeros biocompatibles. La Figura 16, muestra el programa por HPLC para una mezcla de reacción (PTH sin reaccionar, mPEG(20K)-HZ-PTH, mPEG(20K)-Hz) de PTH con mPEG(20K)-Hz antes de purificación (pico 1: PTH sin reaccionar con el polímero de PEG, pico 2: mPEG(20K)-Hz-PTH) La Figura 17, muestra el cromatograma por HPLC del mPEG(20K)-Hz-PTH después de conjugar PTH con mPEG(20K)-Hz. La Figura 18, muestra SDS-PAGE, teñido con azul de Coomassie para el producto de reacción entre PTH y mPEG(20K)-Hz (banda 1: marcador de peso molecular, banda 2: PTH, banda 3: PTH, conjugado de PTH-mPEG(20K)-Hz antes de purificación, banda 4: conjugado de PTH-mPEG(20K)-Hz después de purificación. La Figura 19 muestra la actividad biológica in vivo para PTH y el conjugado PTH y PEG-PTH. La Figura 20, muestra la vida media de PTH y del conjugado PEG-PTH en ratas.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION En un aspecto, la presente invención concierne a los conjugados de polímeros biocompatibles-material activo biológicamente, en donde el polímero biocompatible está conjugado a un grupo carboxilo del material activo biológicamente en una proporción molar de 1:1. En otro aspecto, la presente invención concierne a una composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva terapéuticamente de los conjugados de polímeros biocompatibles-moléculas activas biológicamente y portadores aceptables farmacéuticamente. En un aspecto adicional, la presente invención concierne a un método de preparación de conjugados de polímeros biocompatibles-materiales activos biológicamente en una proporción molar de 1 :1, en donde el polímero biocompatible está conjugado a un grupo carboxilo del material activo biológicamente, que comprende la etapa de conjugar el material activo biológicamente al polímero biocompatible activado con la adición progresiva del reactivo de acoplamiento bajo la condición en donde la proporción molar del material activo biológicamente al polímero biocompatible activado es de 1:1 a 1: 20, la proporción de material activo biológicamente al reactivo acoplador es 1 :1 a 1 :50, y el pH en el intervalo de 2 a 5. En el método anterior, EDAC, como un ejemplo del reactivo acoplador, se añadieron progresivamente más de 5 veces, preferiblemente 5 o 6 veces, porque EDAC es fácilmente hidrolizado en solución acuosa. El método descrito anteriormente proporciona los conjugados en los que los polímeros biocompatibles están fijados a un grupo carboxilo de moléculas activas biológicamente en una proporción de 1:1. En otras palabras, la presente invención proporciona conjugación en sitio específico por el enlace de polímeros activados a un grupo carboxilo de materiales activos biológicamente en una proporción molar de 1:1. Estos conjugados retienen la actividad biológica de materiales activos biológicamente por prevención de la fijación de polímeros a sitios activos. La presente invención también proporciona los conjugados con una proporción molar de 1:1 evitando la reacción aleatoria con muchos residuos reactivos a sitios activos par producir varias clases de mezclas heterogéneas. Adicionalmente, los conjugados de la presente invención tienen varias ventajas tales como estabilidad creciente in vivo, incremento de la biodisponibilidad, y vida media prolongada causadas por los polímeros biocompatibles. Por consiguiente, la producción de conjugados homogéneos de polímeros biocompatibles-material activo biológicamente de la presente invención proporciona el procedimiento efectivo en tiempo y costo, en comparación con otros procedimientos del arte previo. WO 92/16555 describe la reacción de ovalbúmina al grupo carboxilo o carbohidrato con ei espaciador de aminoácidos que contiene PEG-hidrazida. No obstante, solamente describe los conjugados con un número de moléculas de PEG fijadas sin mencionar un método de preparación para conjugados de materiales activos biológicamente con polímeros biocompatibles con la proporción de VA , y la actividad biológica de conjugados. También, la Patente US No. 5,824,779 describe el enlace de PEG al grupo carboxilo de G-CSF, pero el conjugado preparado de conformidad con su método tuvo muy poca actividad porque varias moléculas de PEG fueron fijadas aleatoriamente a ácidos aspárticos o a ácidos glutámicos de G-CSF. Hubieron problemas para controlar la condición de reacción para enlace específico o el número de polímeros de fijación usando la diferencia en la reactividad de conformidad con el pKa de aminoácidos. Cuando se intentó hacer reaccionar el grupo amino de lisina en el intervalo de pH de 7 a 8, los grupos histidina también reaccionaron aleatoriamente. Y, cuando el pH fue abatido a aproximadamente 6 a 6.5, ios grupos histidina se volvieron más reactivos con PEG que los grupos lisina (la Patente US No. 5,951,974 y la Patente US No. 5,985,263). Los inventores de la presente invención observaron que PEG puede ser fijado a grupos carboxilo, especialmente C-terminus de materiales activos biológicamente en una proporción de 1:1 a pH igual a o inferior a 3 de conformidad con el método anterior. Por consiguiente en un aspecto, la presente invención concierne al conjugado de polímero biocompatible-material activo biológicamente, en donde el polímero biocompatible es conjugado en el C-terminus del material activo biológicamente en una proporción molar de 1 :1. En otro aspecto, la presente invención concierne a una composición farmacéutica que comprende una cantidad aceptable farmacéuticamente del conjugado, en donde el polímero biocompatible es conjugado al C-terminus del material activo biológicamente en una proporción molar de 1:1 y portadores aceptables farmacéuticamente. En otro aspecto adiciona!, la presente invención concierne a un método de preparación del conjugado de polímero biocompatible-material activo biológicamente en el C-terminus del material activo biológicamente con una proporción molar de 1 :1, que comprende la etapa de conjugar el material activo biológicamente al polímero biocompatible activado con la adición progresiva de reactivo acoplador bajo la condición en donde la proporción molar de material activo biológicamente al polímero biocompatible activado es de 1:1 a 1 :20, la proporción de material activo biológicamente al reactivo acoplador es de 1:1 a 1:150, y el pH está en el intervalo de 2 a 5.

Polímeros Biocompatibles El término "material de conjugación" usado para la conjugación de moléculas activas biológicamente significa cualquier polímero biocompatible que pueda ser enlazado a moléculas activas biológicamente tales como polímeros sintéticos o naturales. El término "biocompatibilidad" significa biocompatible con tejidos o sistemas vivientes, y que no es tóxico, no inflamatorio, y no cancerígeno sin causar daño, inflamación, respuesta inmune y carcinogénesis en el cuerpo. Los polímeros biocompatibles son conjugados con materiales activos biológicamente. Los polímeros útiles de la presente invención son fácilmente solubles en varios solventes y tienen peso molecular de entre aproximadamente 300 y aproximadamente 100,000 Da y preferiblemente entre aproximadamente 2,000 y aproximadamente 40,000 Da. Los polímeros biocompatibles incluyen, pero no se limitan a, polietilen glicol (PEG), polipropilen glicol (PPG), polioxietileno (POE), politrimetilen glicol, ácido poliláctico y sus derivados, ácido poliacrílico y sus derivados, ácido poliamino, alcohol polivinílico, poliuretano, polifosfazeno, poli(L-lisina), óxido de polialquileno (PAO), polisacáridos, dextrano, polivinü pirrolidona, poliarilamida, copolímeros de los mismos y otros polímeros no inmunogénicos. Los polímeros biocompatibles de la presente invención se pretende que incluyan no solamente polímeros lineales sino también los polímeros siguientes. Los polímeros biocompatibles de la presente invención incluyen polímeros solubles, no antigénicos enlazados a un grupo funcional activado que es capaz de ser sustituido nucleofílicamente a través de un residuo enlazador alifático (Patente US No. 5,643,575 y 5,919,455). También, los polímeros biocompatibles de la presente invención incluyen polímeros de múltiples brazos, monofuncionales y estables hidrolíticamente, que tienen dos fragmentos enlazadores que tienen brazos poliméricos alrededor de un átomo de carbono central, un residuo que es capaz de ser activado por fijación a materiales activos biológicamente tales como proteínas, y cadenas laterales que pueden ser hidrógeno o grupo metilo, u otro fragmento enlazador (Patente US No. 5,932,462). Además, los polímeros biocompatibles de la presente invención incluyen polímeros de PEG ramificados en los cuales los grupos funcionales de los polímeros están fijados a materiales activos biológicamente vía los brazos del enlazador que tienen residuos informadores (WO 00/33881). Entre ellos, PEG es uno de los polímeros biocompatibles más comunes de la presente invención. En general, PEG es un polímero hidrofílico no tóxico que tiene la unidad de repetición, HO-(CH2CH20)n-H. Se reportaron varias proteínas que muestran vidas medias prolongadas, solubilidad creciente, estabilidad creciente, e inmunogenicidad decreciente en plasma cuando es conjugado con PEG. El intervalo de peso molecular de moléculas de PEG conjugadas a materiales activos biológicamente tales como proteínas o peptidos es desde aproximadamente 1 ,000 a 100,000 Da y la toxicidad de PEG sobre 1,000 Da es conocida por ser muy baja. PEGs en el intervalo desde 1 ,000 a 6,000 Da se distribuyen en el cuerpo entero y se elimina en el riñon. PEG ramificado con peso molecular de 40,000 Da se distribuyen en sangre y órganos incluyendo el hígado, y es metabolizado en el hígado. PEG es el polímero biocompatible más preferible porque PEG está comercialmente disponible en varios intervalos de pesos moleculares, cada unidad de oxietileno es hidrofílico para se accesible a enlazar 2-3 moléculas de agua, derivados de PEG con un grupo funcional terminal de metoxi polietilen glicol son fáciles de sintetizar, PEG tiene muy bajo riesgo de reacción antígeno-anticuerpo, y está bien desarrollada la tecnología relacionada. Materiales Activos Biológicamente El término "molécula activa biológicamente" significa todos los nucleófilos conjugados con polímeros biocompatibles activados, y que retienen al menos algo de su actividad biológica después de conjugación. El término "actividad biológica" usado en la presente no se limita por actividad fisiológica o farmacológica. Por ejemplo, algunos conjugados de enzimas que contienen nucleófilos pueden catalizar reacciones en solventes orgánicos. De manera similar, pueden también ser usados algunos conjugados poliméricos que incluyen proteínas tales como Con-canavalina A, o inmunoglobulina. En diagnósticos en el laboratorio.. En general, moléculas activas biológicamente pueden ser aisladas de la naturaleza o sintetizadas recombinantemente o químicamente, e incluyen proteínas, péptidos, polipéptidos, enzimas biomedicinas, genes, plásmidos, o residuos orgánicos. Proteínas, péptidos, y polipéptidos de interés incluyen, pero no se limitan a, hemoglobulina, proteínas séricas (por ejemplo, factores sanguíneos que incluyen el Factor VII, VIII, y IX), inmunoglobulinas, citoquinas (por ejemplo, interleuquinas), a-, ß- y ?-interferones factores estimuladores de colonias que incluyen G-CSF y GM-CSF, factores de crecimiento derivados de plaquetas (PDGF), proteínas activadores de fosfolipasas (PLAP), y hormona paratiroidea (PTH). Otras proteínas de interés terapéutico o biológico general incluyen insulinas, proteínas vegetales (por ejemplo lectinas y ricinos), factor de necrosis de tumor (TNF) y alelos relacionados, factores de crecimiento (por ejemplo, factores de crecimiento de tejido tales como TGFa y TGF y factores de crecimiento epidérmico), hormonas (por ejemplo, hormona estimuladora del folículo, hormona estimuladora de tiroides, hormonas antidiuréticas, hormonas pigmentarias, hormona liberadora de la hormona luteal y derivados de éstas), calcitonina, péptido relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP), encefalina sintética, somatomedinas, eritropoyetina, factores de liberación hipotalámica, prolactina, gonadotropina coriónica, activador del plasminógeno de tejido, péptido liberador de la hormona de crecimiento (GHRP), factor humoral tímico (THF) y los similares. Las inmunoglobulinas de interés incluyen IgG, IgE, IgM, IgA, IgD, y fragmentos de los mismos. Cuando dos o más polímeros biocompatibles son fijados a polipéptidos de peso molecular especialmente bajo tales como Interferon y G-CSF, estos conjugados exhiben actividad biológica considerablemente baja. También, dos o más polímeros son fijados cuando grupos amino relativamente muy reactivos son conjugados y por consiguiente la separación de conjugados en un complejo 1 :1 no es fácil. Sin embargo, la presente invención proporciona la preparación selectiva de conjugados de IFN-polímeros biocompatibles o G-CSF-polímero biocompatible en un complejo 1 :1, en donde estos conjugados muestran alta actividad biológica, vida media creciente, y excelente biodisponibilidad. Los materiales activos biológicamente de la presente invención también incluyen cualquier porción de un polipéptido que demuestra bioactividad in vivo. Esto incluye secuencias de aminoácidos, oligómeros antisentido, fragmentos de anticuerpos, antígeno lineal (Ref. Patente US 4,946,778), enlazar moléculas que incluyen fusiones o fragmentos de anticuerpos, anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos catalíticos, nucleótidos, oligonucleótidos. Los materiales activos biológicamente también incluyen enzimas.

Las enzimas de interés incluyen enzimas específicas de carbohidratos, enzimas proteolíticas, oxidoreductasas, transferasas, hidrolasas, liasas, isomerasas y ligasas. Sin limitarse a enzimas particulares, los ejemplos de enzimas de interés incluyen asparaginasa, arginasa, arginina desaminasa, adenosina desaminasa, superóxido dismutasa, endotoxinasas, catalasas, quimiotripsina, lipasas, uricasas, adenosina difosfatasa, tirosinasas y bilirubina oxidasa. Las enzimas específicas de carbohidratos de interés incluyen glucosa oxidasa, glucosidasas galactosidasas, glucocerebrosidasas, glucouronidasas, etc. Los ejemplos descritos anteriormente son ejemplos de nucleófilos activos biológicamente adecuados conjugados con los polímeros biocompatibles activados de la presente invención. Todos los materiales activos biológicamente adecuados con el grupo nucleofílico se incluyen en la presente invención aunque no se hayan mencionado anteriormente. Los materiales activos biológicamente para la presente invención necesitan poseer al menos un grupo carboxilo libre para conjugación por el polímero. Los conjugados de la presente invención son activos biológicamente para el propósito de aplicación terapéutica. Los mamíferos pueden ser tratados por administración de la dosis efectiva terapéuticamente de conjugados poliméricos que contienen materiales activos biológicamente.

Preparación de conjugados de polímero biocompatible-material activo biológicamente Para conjugar polímeros biocompatibles a las moléculas activas biológicamente, uno de los grupos terminales de los polímeros es convertido en un grupo funcional reactivo. Este procedimiento es mencionado como "activación" y el producto es llamado un polímero activado. Por ejemplo, para conjugar óxidos de poli(alquileno), PAO) a péptidos o proteínas, uno de los grupos hidroxilo terminales del polímero puede ser convertido en un grupo funcional reactivo tal como carbonato y se produce PAO activado, el cual es soluble a temperatura ambiente. Este grupo incluye derivados de po!i(óxido de alquileno) mono sustituidos tales como mPEG u otros derivados de PAO alquilo sustituido adecuado que contienen grupos terminales de 1 a 4 átomos de carbono. El término "grupo funcional reactivo" usado en el arte y en la presente es el grupo los polímeros biocompatibles activadores del residuo para enlazar con materiales activos biológicamente. El grupo funcional reactivo de la presente invención es seleccionado de los grupos funcionales capaces de reaccionar con ácido carboxílico y el grupo carbonilo reactivo, por ejemplo, amina primaria, o grupos funcionales hidrazina e hidrazida (tales como acil hidrazida, carbazato, semicarbazato, tiocarbazato, etc.). El término "reactivo de acoplamiento del grupo carboxilo" (en lo sucesivo mencionado como reactivo de acoplamiento) usado en el arte y en la presente significa cualquier reactivo para acoplar los grupos carboxilo de materiales activos biológicamente a polímeros biocompatibles que han sido activados en el grupo funcional reactivo anterior. Los reactivos de acoplamiento del grupo carboxilo en la presente invención de interés incluyen, pero no se limitan a, agentes de acoplamiento carbodiimidilo, por ejemplo, clorhidrato de EDAC[3-dimetil-aminoprop¡l)-N'-etilcarbodiimida], DIC[1,3-düsoprop¡l carbodiimida], DCC[diciclohexil carbodiimida], y EDC[1-etil-3-(3-dimetilamino propil)- carbodiimida]. El agente de acoplamiento preferible para el grupo carboxilo es EDAC. Él método de preparar los conjugados de la presente invención incluye la etapa de hacer reaccionar moléculas activas biológicamente que contienen nucleófilos capaces de realizar la reacción de sustitución con polímeros biocompatibles activados bajo la condición en la cual puede ser posible suficiente conjugación mientras que retiene al menos una porción de bioactividad intrínseca de moléculas activas biológicamente. Los conjugados de polímero biocompatible-material activo biológicamente con la proporción de 1:1 se obtienen por reacción de los materiales activos biológicamente con una cantidad de polímeros en exceso estequiométrico. Por ejemplo, en la preparación de los conjugados proteína polímero, péptido-polímero, enzima-polímero, anticuerpo-polímero, y fármaco-polímero, la proporción molar de material activo biológicamente a polímero biocompatibles está en el intervalo desde aproximadamente 1 :1 a 1:20, más preferiblemente desde 1:1 a 1 :10. Los reactivos para activar grupos carboxilo de materiales activos biológicamente son seleccionados del grupo como sigue, pero no se limita a ellos. Por ejemplo, clorhidrato N-(3-dimetil-aminopropil)-N'-etilcarbodiimida (EDAC), el grupo carbodiimida soluble en agua tal como 3-[2- morfolinil- (4)- etil], y sales de isoxazolinio 5-sustituidas tales como sulfonato de p-tolueno, Reactivo K de Woodward.

La proporción molar de materiales activos biológicamente a EDAC usada en la presente invención está en el intervalo desde aproximadamente 1:1 a 1:50, más preferiblemente desde aproximadamente 1 :1 a 1:30, y más preferiblemente desde aproximadamente 1:1 a 1:20. No obstante, se observó aumento en el rendimiento de los conjugados de PEG-material activo biológicamente cuando la adición de EDAC se dividió en más de cinco veces, preferiblemente 5 o 6 veces preferiblemente a añadir 20 veces exceso molar de EDAC a una vez porque EDAC es fácilmente hidrolizado en solución acuosa. La reacción de conjugación de materiales activos biológicamente con polímeros activados es dependiente del pH de solventes solubles en agua que funcionan como un regulador. En general, el pH del regulador de la reacción para proteínas/péptidos está en el intervalo de 2 a 5, preferiblemente desde 2.5 a 4.5. Las condiciones óptimas de reacción para estabilización de estas sustancias y el rendimiento de la reacción han sido conocidos en el arte. La temperatura adecuada para la reacción de conjugación está en el intervalo de 0 a 60 °C y preferiblemente en el intervalo de 4 a 30 °C. La temperatura de ios solventes no deberá exceder la temperatura de desnaturalización de proteínas o péptidos. También, el tiempo de reacción de 10 minutos a 5 horas es preferible en esta preparación. Los conjugados preparados pueden ser recuperados y purificados por cromatografía de columna, diafiltración o una combinación de los dos procedimientos anteriores.

Composición Farmacéutica La presente invención también concierne a una composición farmacéutica que comprende una dosis efectiva terapéuticamente de los conjugados de material activo biológicamente-polímero biocompatible activado como un ingrediente activo. El término "aceptable farmacéuticamente" usado en el arte y en la presente significa que no causa reacción alérgica o reacción similar cuando se administra a humanos. El conjugado de polímero biocompatible-material activo biológicamente como un ingrediente activo de la composición farmacéutica puede ser usado como tal o ser formulado en combinación con portadores aceptables farmacéuticamente para prevención y tratamiento de enfermedades. El término "portador aceptable farmacéuticamente" usado en el arte y en la presente significa moléculas, composiciones, o vehículos aceptables farmacéuticamente tales como soluciones, diluyentes, excipientes, o solventes para transportar los materiales activos biológicamente desde un órgano o tejidos a otros órganos o tejidos. La composición farmacéutica de la presente invención puede ser administrada por la ruta oral, local, inyección o ruta parenteral y su formulación incluye dosis efectivas terapéuticamente de los conjugados de polímero biocompatible material activo biológicamente como un ingrediente activo. La formulación para administración oral de la presente invención incluye pildoras, tabletas tabletas recubiertas, granulos, pastillas, obleas, elíxires y cápsulas de gelatina blanda, soluciones, jarabes, emulsiones, suspensiones, o rocíos, etc. y para administración parenteral, se incluyen soluciones inyectables, microcápsulas, parches, y otras. La formulación farmacéutica puede ser preparada de conformidad con el método conocido por el uso de aditivos orgánicos e inorgánicos inactivos aceptables farmacéuticamente. Por ejemplo, lactosa, almidón de maíz, y sus derivados, talco, o ácido esteárico y sus sales pueden ser usados para preparar pildoras, tabletas, y cápsulas de gelatina dura. Los aditivos de cápsulas de gelatina blanda y supositorios son por ejemplo, aceite, cera, poliol líquido o semi-sólido, y aceite natural o solidificado. Los aditivos adecuados para la preparación de soluciones o jarabes son por ejemplo, agua, sacarosa, invertasa, glucosa, y poliol. Los aditivos adecuados para la preparación de soluciones inyectables son agua, alcohol, glicerol, poliol, aceite vegetal, etc. Puede usarse la solución inyectable como la combinación de conservadores, agentes indolentes, solubilizantes, y estabilizantes. La formulación para administración local puede ser también usada como la combinación de gas, diluyentes, lubricantes, y conservadores. Los aditivos adecuados para microcápsulas o trasplante son copolimeros o ácido glicólico y ácido láctico. La dosis de los conjugados de polímero biocompatible-material activo biológicamente de la presente invención varía dependiendo de la velocidad de absorción de los materiales activos biológicamente, solubilidad, edad del paciente, sexo, condición y severidad de las enfermedades, etc, como se sabe bien en el arte. De manera particular, la administración de conjugados de polímero biocompatible-material activo biológicamente de la presente invención reduce los intervalos de inyección desde diariamente hasta una inyección una vez cada dos días o semanal o bisemanalmente. Por consiguiente, la toxicidad y los efectos secundarios de los fármacos por administración frecuente se reducen sustancialmente. Los siguientes ejemplos describen y demuestran adicionalmente modalidades en el alcance de la presente invención. Los ejemplos se dan solamente para el propósito de ilustración y no se pretende que limiten la invención, son posibles muchas variaciones de los mismos sin alejarse del espíritu y el alcance de la invención.

EJEMPLOS 1. Preparación de conjugados de polímero biocompatible-material activo biológicamente vía un grupo carboxilo del material activo biológicamente EJEMPLO 1 Preparación del conjugado mPEG(12000)-Hz-G-CSF Se dializó (Centricon-10, Amicon, USA) 1 mg de una solución de G-CSF (0.00005 mmoles, Dong-A Pharm LEUCOSTIM) contra 50 mM de solución reguladora MES (pH de 3.0) a la concentración final de 2 mg/ml. A esta solución, se añadieron 6.6 mg de mPEG(12000)-Hz(ISU Chemical, Korea, 0.0005 mmoles), y se siguió con 2 µ? (0.001 mmoles, exceso molar de 20 veces) de solución de EDAC, preparada por disolución de 2 mg de EDAC en 20 µ? de agua desionizada. La reacción se llevó a cabo por 1 hora a temperatura ambiente (20-25 °C) con agitación. Después de 1 hora, se eliminaron el G-CSF y el exceso de reactivo sin reaccionar por columna de exclusión de tamaños o columna de intercambio iónico. Se obtuvieron 0.3 mg del conjugado mPEG(12000)-Hz-CSF. Por cambio de la cantidad de EDAC desde 20 a 200 veces de exceso molar y de mPEG(12000)-Hz desde 10 a 20 veces de exceso molar, la reacción se repitió. Se observó que dos o más mPEG(12000)-Hz fueron fijados al grupo carboxilo de G-CSF cuando la cantidad de EDAC es superior a 50 veces de exceso molar.

EJEMPLO 2 Preparación del conjugado mPEG(5000)-Hz-G-CSF Se dializó (Centricon-10, Amicon, USA) 1 mg de una solución de G-CSF (0.00005 mmoles) contra 50 mM de solución reguladora MES (pH de 3.0) a la concentración final de 5 mg/ml. A esta solución de proteína, se añadieron 1.3 mg de mPEG(5000)-Hz (ISU Chemical, Korea, 0.00025 mmoles), seguido por 2 µ? (0.001 mmoles, 20 veces de exceso molar) de solución de EDAC preparada por disolución de 2 mg de EDAC en 20 pl de agua desionizada. La reacción se llevó a cabo por 1 hora a temperatura ambiente (20- 25 °C) con agitación. Después de 1 hora, se eliminó el G-CSF sin reaccionar y el exceso de reactivo por columna de exclusión de tamaño o columna de intercambio iónico. Se obtuvo más de 0.3 mg de mPEG(5000)-Hz-G-CSF. Las Figuras 1A y 1B muestran la producción del conjugado mPEG(5000)-Hz-CSF por SDS-PAGE y el perfil de HPLC (cromatografía por exclusión de tamaño).

EJEMPLO 3 Preparación de» conjugado mPEG(2000O)-Hz-G-CSF Se dializó 1 mg de una solución de G-CSF (0.00005 mmoles) contra 50 mM de solución reguladora de MES (pH de 3.0) por ultrafiltración (Centricon-10, Amicon, USA) hasta la concentración final de 5 mg/ml. A esta solución de proteína, se añadieron 5 mg de mPEG(20000)-Hz(ISU Chemical, Korea, 0.00025 mmoles), seguido por 2 µ? (0.001 mmoles, 20 veces de exceso molar) de solución de EDAC preparada por disolución de 2 mg de EDAC en 20 µ? de agua desionizada. La reacción se llevó a cabo por 1 hora a temperatura ambiente (20 - 25 °C) con agitación. Después de una hora, se eliminaron el G-CSF sin reaccionar y el exceso de reactivo por cromatografía por exclusión de tamaño o por columna de intercambio iónico. Se obtuvo más de 0.3 mg de mPEG(20000)-Hz-G-CSF. Las Figuras 2A y 2B muestran la producción del conjugado mPEG(20000)-Hz-G-CSF por SDS-PAGE.

EJEMPLO 4 Preparación del conjugado mPEG(5000)-Hz-IFN Se dializaron (Centricon-10, Amicon, USA) cuatro tubos que contenían 200 g de solución de IFN cada uno (0.00001 mmoles, Korea Green Cross Corp., Green Alpha) respectivamente, contra 50 mM de solución reguladora de MES (pH de 3.0) hasta la concentración final de 1 mg/ml. A cada tubo se añadió 2.16 mg de mPEG(5000)-Hz, seguido por 0.8 µ? (40 veces de exceso molar) de solución de EDAC preparada por disolución de 2 mg de EDAC en 20 µ? de agua desionizada. La reacción se llevó a cabo por 1 hora a temperatura ambiente (20 - 25 °C) con agitación . Después de 1 hora, se eliminó el IFN sin reaccionar y el exceso de reactivo por columna por exclusión de tamaños o por columna de intercambio iónico. La Figura 3 muestra la conjugación de mPEG(5000)-HZ a moléculas de IFN por SDS-PAGE.

EJEMPLO 5 Preparación del Conjugado mPEG(12000)-Hz-IFN Se dializó (Centricon-10, Amicon, USA) 1 mg de solución de IFN (0.00005 mmoles) contra 50 rn de solución reguladora de MES (pH 3.0) hasta la concentración final de 1 mg/ml. A esta solución de proteína, se añadieron 6.6 mg de mPEG(12000)-Hz (0.0005 mmoles), seguido por 2 pl (0.001 mmoles, 20 veces de exceso molar) de solución de EDAC preparada por disolución de 2 mg de EDAC en 20 pl de agua desionizada. La reacción se llevó a cabo por 1 hora a temperatura ambiente (20 - 25 °C) con agitación. Después de 1 hora, se eliminó el IFN sin reaccionar y el exceso de reactivo por columna de exclusión por tamaños o columna de intercambio iónico. Se obtuvo más de 0.3 mg de mPEG(12000)-Hz-IFN.

EJEMPLO 6 Preparación del Conjugado mPEG(20000)-Hz-IFN Se dializaron (Centricon-10, Amicon, Usa) 4 tubos que contenían 200 pg de solución de IFN (0.00001 mmoles) en cada tubo contra 50 mM de solución reguladora de MES (pH 3.0) hasta la concentración final de 2 mg/ml. A cada tubo se añadieron, 4.32 mg de mPEG(20000)-Hz (0.0002 mmoles, ISU Chemical, Korea), seguido por 1 µ? (exceso molar de 50 veces) o 4 pl (exceso molar de 200 veces) de solución de EDAC preparada por disolución de 2 mg de EDAC en 20 µ? de agua desionizada. Además, se añadió 30 veces en exceso molar de sulfo-NHS para acelerar la reacción y se compararon los resultados. La reacción se llevó a cabo por 1 hora a temperatura ambiente (20 - 25 °C) con agitación. La condición de reacción de cada muestra se describe en el Cuadro siguiente. Después de 1 hora, se eliminaron el exceso de reactivos y el IFN sin reaccionar por columna de exclusión por tamaños o por columna de intercambio iónico. Se comparó por SDS-PAGE el producto de cada reacción.

Como un resultado, la reacción con 200 veces en exceso molar de EDAC mostró que demasiados PEGs fueron fijados al grupo carboxilo de IFN y la separación del conjugado PEG-IFN con la proporción molar de 1:1 no fue exitosa y la estimación del número de PEGs fijados no fue fácil. También, la reacción con 50 veces en exceso molar de EDAC procedió pero el conjugado PEG-IFN con la proporción de 1:1 no fue fácilmente diferenciable porque el conjugado PEG-IFN fue difuso sobre SDS-PAGE debido a la cantidad en exceso de EDAC usado. Cuando se añadió sulfo-NHS a la reacción para mejorar la eficiencia, no hubo diferencia con el control en el que no se añadió sulfo-NHS (Figura 4). También, la eficiencia de la reacción a partir de la adición de EDAC varias veces se efectuó de conformidad con las condiciones de reacción como se describe en el cuadro siguiente.

Muestra IFN mPEG-Hz Regulador Tiempo de No. (mg/ml) (x 5) Rx (horas) 1 5 20K 50 mM de MES a pH de 4.4 1 EDAC (x10) añadido 6 veces cada 10 minutos. Exceso molar total de EDAC: 60 veces 2 5 20K 50 mM de MES a pH de 4.4 1 EDAC (x 10) añadido 5 veces cada 10 minutos Exceso molar total de EDAC: 50 veces 3 5 20K 50 mM de MES a pH de 4.4 1 EDAC (x 5) añadido 6 veces cada 10 minutos Exceso molar total de EDAC: 30 veces Muestra IFN mPEG-Hz Regulador Tiempo de No. (mg/ml) (x 5) Rx (horas) 4 5 20K 50 mM de MES ph de 4.4 1 EDAC (x 3) añadido 6 veces cada 5 minutos Exceso molar total de EDAC: 18 veces Como un resultado, cuando EDAC se añadió gradualmente a la mezcla de reacción, el rendimiento del conjugado mPEG-IFN con la proporción molar de 1 :1 fue alto (Figura 5). Cuando la cantidad de EDAC fue superior a 50 veces de exceso molar aunque la adición de EDAC se efectuó gradualmente, dos o más PEGs fueron fijados aleatoriamente al IFN como se muestra en la Figura 5.

EJEMPLO 7 Preparación del conjugado mPEG(20000)-Hz-IFN Se dializó (Centricon- 0(Amicon, USA)) 1 mg de solución de IFN (0.00005 mmoles) contra 50 mM de solución reguladora de MES (pH 2.5) hasta la concentración de 5 mg/ml. A esta solución de proteína, se añadieron 10.8 mg de mPEG(20000)-Hz(0.0005 mmoles, 10- veces de exceso molar), seguido por 2 µ? (0.001 mmoles, 20 veces en exceso molar) de solución de EDAC preparada por disolución de 2 mg de EDAC en 20 µ? de agua desionizada. Se llevó a cabo la reacción por 1 hora a temperatura ambiente (20 - 25 °C) con agitación. Después de 1 hora, se eliminaron el IFN sin reaccionar y el exceso de reactivo por columna de exclusión por tamaños o por columna de intercambio iónico. Se obtuvo más de 0.3 mg del conjugado mPEG(20000)-Hz-IFN.

EJEMPLO 8 Purificación de conjugados mPEG(20000)-Hz-IFN con la proporción molar de 1:1 Se diluyó el conjugado mPEG(20000)-Hz-IFN (Ejemplo 6) con 10 mM de regulador de acetato de sodio (pH de 4.4) hasta la concentración final de 1 mg/ml. La mezcla de reacción de mPEG(20000)-Hz-IFN se cargó sobre columna de SP-Sepharose de Flujo Rápido (5 x 50 mm, volumen total de la columna de 1 mi), la cual ha sido previamente equilibrada con 10 mM de solución reguladora de acetato de sodio (pH de 4.4). Después de lavar la columna por 3 volúmenes de columna de 10 mM de regulador de acetato (pH de 4.4), se usó un gradiente de 10 mM de regulador de acetato (a pH de 4.4) que contenía 500 mM de NaCI para separar mPEG(20000)-Hz-IFN con la proporción molar de 1 :1 de IFN intacto sin reaccionar. El mPEG(20000)-Hz-IFN purificado anteriormente se confirmó que fue el conjugado en donde un PEG fue fijado al grupo carboxilo de IFN (Figura 6).

EJEMPLO 9 Determinación de la Actividad Biológica del Conjugado PEG-G-CSF, el Ensayo por CPE (Efecto Citotóxico) se efectuó como sigue Se sub-cultivaron 2.5 x 106 células (5 x 105 células/ml) de M- NFS-60 sobre placas de 60 mm (medio RP I-1640, FBS al 10 %, 37 °C, C02 al 5 %). Cada uno de los G-CSF nativa (control) y mPEG(20000)-Hz-G-CSF (Ejemplo 3) se diluyó hasta la concentración de 1 ng/µ? y se añadió a I aplaca de 96 pocilios que contenían 1 x 106 células en cada pocilio, seguido por dilución seriada. La placa se incubó a 37 °C por 2 días. Luego cada pocilio fue tratado con 50 µ? de equipo para XTT (Roche, Alemania) y se incubó por otras 4 horas a 37 °C, y el valor del O.D. de la placa se leyó a 490 nm usando el lector ELISA. Como un resultado, mPEG(20000)-Hz-G-CSF de la presente invención se mostró que retuvo una actividad similar a la del conjugado mPEG(20000)-G-CSF, en donde PEG fue fijado al grupo amino de G-CSF (Figura 7).

EJEMPLO 10 Determinación de la vida media del conjugado PEG-G-CSF Ratas Sprague-Dawley de 7 semanas de edad (5 ratas por grupo) que pesaban 220 - 240 g fueron anestesiadas usando Ketamina/Rompum y un tubo PE se insertó a la vena cava de cada rata por cirugía. Después de que se recuperó la rata, se administraron 100 Mg/kg de mPEG(20000)-Hz-G-CSF (Ejemplo 3) a través de inyección intravenosa. Se usaron PBS y 100 Mg/kg de G-CSF nativo como placebo y control, respectivamente, para comparación. Se sacaron 300 µ? de sangre a través de la cánula a intervalos de tiempo de 0, 0.5, 1, 2, 4, 6, 12, 24, y 48 horas después de inyección. Se separó el suero por centrifugación (13,000 rpm, 10 min, 4 °C) y se almacenó a - 20 °C para estudio adicional. Después de incubación de las células por 24 horas con medio libre de G-CSF, a cada pocilio de la placa de 96 pocilios se añadió 1.5 x 104 células. Cada muestra de suero almacenado como se describe anteriormente se diluyó 100 veces y 50 µ? de las muestras diluidas se añadieron a cada pocilio de la placa de 96 pocilios. Las placas fueron incubadas a 37 °C por 48 horas bajo C02 gas. Luego cada pocilio fue tratado con 50 pl del equipo para XTT (Roche, Alemania). Las placas fueron incubadas por otras 4 horas a 37 °C y el valor de O.D. de la placa fue leído a 490 nm usando el lector para ELISA. Se comparó la vida media de mPEG(20000)-Hz-G-CSF (Ejemplo 3) a la de G-CSF nativa y Neulasta™ (PEG fijado a N-terminal de G-CSF, Amgen) en la Figura 8. mPEG(20000)-Hz-G-CSF (Ejemplo 3) de la presente invención mostró una vida media mucho más prolongada en comparación con el G-CSF nativo, y tuvo una vida media similar a la de Neulasta™.

EJEMPLO 11 Determinación de el conteo de glóbulos blancos (WBC, White Blood CelH de ratas tratadas con PEG-G-CSF Ratas Sprague-Dawley de 7 semanas de edad que pesaban 220 - 240 g, fueron adquiridas de Charles River Co. (Atsugi, Japón). Se inyectaron 100 pg/kg de mPEG(20000)-Hz-G-CSF (Ejemplo 3) en la vena de la cola de las ratas. La misma cantidad de G-CSF nativo y de solución salina se inyectó respectivamente como un control. Se sacaron muestras de sangre a intervalos de tiempo de 0, 6, 12, 24, 48, 72, 96 horas después de inyección a través de la vena de la cola. El conteo de glóbulos blancos (WBC, White Blood Cells) se midió por medio del analizador de Hematología Automático (Cysmex K-4500) como se muestra en la Figura 9, Como un resultado, mPEG(20000)-Hz-G-CSF de la presente invención mostró conteo de glóbulos blancos más alto que ambos, G-CSF nativo y Neulasta™.

EJEMPL012 Determinación de la Actividad Biológica del Conjugado PEG-IFN Se suspendieron células MDBK contadas en una concentración de 7.5 x 105 células/ml usando un hemocitómetro, en medio FBS al 5 %/MEM. Se diluyó mPEG(12000)-Hz-IFN (Ejemplo 5) a la concentración de 100 Ul (1 mg/ml = 2 x 108 Ul). Cada pocilio fue suplementado con 100 µ? de medio FBS al 5 %/MEM y se añadieron al primer pocilio 100 µ? de las muestras diluidas seguido por dilución seriada. Luego se añadieron 100 µ? de suspensión celular a cada pocilio de la placa de 96 pocilios. Las placas se incubaron a 37 °C por 20 horas. Se añadieron 100 µ? de Virus de Estomatitis Vesicular (VSV, ATCC VR-158) diluido 100 veces a cada pocilio y se incubaron otras 20 horas a 37 °C. Se eliminó la solución de medio de crecimiento que contenía el Virus de la Estomatitis Vesicular (VSV, ATCC VR-158) de la placa de 96 pocilios, se añadieron a cada pocilio 50 µ? de solución colorante de cristal violeta al 0.05 %, y se leyó el O.D. de cada pocilio a 550 nm por medio del lector ELISA para determinar la actividad de IFN. Como un resultado, se encontró que la actividad de mPEG(12000)-Hz-IFN (Ejemplo 5)retuvo 40 - 50 % de la actividad de IFN nativa y mostró actividad similar a la del PEG-IFN comparativo (Schering -Plough, USA, PEG fijado a grupos amino de IFN, aprobado por la FDA) (Figura 10). También, la actividad de mPEG(20000)-Hz-IFN (Ejemplo 6) se determinó que fue aproximadamente 40 % de la IFN nativa (Figura 11). También, la actividad de Di-mPEG-Hz-IFN (Dos PEGs fijadas a un IFN) y mono-PEG-IFN (complejo 1:1 , un PEG fijado a una IFN) se comparó por ensayo por CPE y mono-mPEG-Hz-IFN mostró alta actividad biológica (Figura 12).

EJEMPLO 3 Determinación de la vida media del conjugado PEG-IFN Se suspendieron células MDBK contadas en una concentración de 7.5 x 105 células/ml, en medio de FBS al 5 %/MEM. Se pusieron 100 pl de la suspensión celular en cada pocilio de la placa de 96 pocilios. Se obtuvo suero después de inyectar mPEG(20000)-Hz-IFN (Ejemplo 6) por ruta intravenosa a ratas y se diluyó 50 veces. A cada pocilio se añadió el suero diluido y se incubaron en una incubadora de C02 por 20 horas, A cada pocilio se añadió el Virus de la Estomatitis Vesicular diluido 100 veces (100 mi) y se continuó incubando por 20 horas. Se retiró la solución del medio del virus en cada pocilio, y se añadieron a cada pocilio 50 µ? de solución colorante de cristal violeta al 0.05 %. Se leyó la absorbancia a 550 nm por medio de un lector de microplacas para medir la vida media de IFN. La Figura 13 muestra la vida media de mPEG(20000)-Hz-IFN (Ejemplo 6) conjugado al grupo carboxilo y la comparación de mPEG(20000)-Hz-IFN con IFN nativa y el producto comparativo, PEG-IFN, mPEG(20000)-Hz-IFN de la presente invención mostró una vida media mucho mayor que la IFN nativa y vida media más prolongada que el producto comparativo, PEG-IFN.

EJEMPLO 14 Estabilidad del conjugado PEG-IFN La estabilidad de mPEG(20000)-Hz-IFN preparada y purificada en el Ejemplo 6 y PEG-IFN, en donde PEG(10 )2 ramificada-NHS (fijada al grupo amino de IFN de conformidad con el método general en la literatura seguido por la separación de monoPEG-IFN por columna de exclusión por tamaño, Nektar, USA), se determinó sobre SDS-PAGE después de incubación a 4 °C en solución de PBS observando la disociación de IFN intacta sobre la SDS-PAGE. La concentración de cada muestra se ajustó a la concentración final de 1 mg/ml. Como un resultado, se observó que aproximadamente 14 % de IFN intacta se disoció del conjugado PEG-IFN a través del grupo amino de IFN aproximadamente 2 semanas después, mientras que la disociación de IFN de PEG(20000)-Hz-IFN conjugado a través del grupo carboxilo de IFN de la presente invención no se detectó aún después de 6 meses después (Figuras 14A y 14B).

EJEMPLO 15 Preparación del conjugado mPEG(5000)-Hz-PTH Se hicieron reaccionar 1 mg de PTH humano (hormona paratiroidea, 0.00012 mmoles, 1- 84 aa, Dong-Kook Pharm, Korea) y 3.0 mg de mPEG(5000)-Hz activado (0.0006 mmoles, ISU Chemical, Korea) en 0.5 mi de 50 mM de solución reguladora de MES, pH de 4.4, por 10 minutos con agitación a temperatura ambiente. Se añadieron entonces 2.5 pl de EDAC (0.001125 mmoles, exceso molar de 10 veces) preparado a una concentración de 100 pg/µ?, y se hicieron reaccionar por 1 hora con agitación a temperatura ambiente. Se eliminaron mPEG(5000)-Hz sin reaccionar y PTH utilizando el Centricon-10 (Amicon, USA) y se obtuvieron 0.4 mg de mPEG(5000)-Hz-PTH.

EJEMPLO 16 Preparación de los Conjugados mPEG(12000)-Hz-PTH Se hicieron reaccionar 1 mg de PTH humano (0.00012 mmoles) y 7.14 mg de mPEG(12000)-Hz activado (0.0006 mmoles, exceso molar de 5 veces, ISU Chemical, Korea) en 0.5 mi de 50 mM de solución reguladora de MES, pH de 4.4, por 10 minutos con agitación a temperatura ambiente. Se añadieron entonces 2.5 µ? de EDAC (0.00125 mmoles, exceso molar de 10 veces) preparado a una concentración de 100 pg/µ?, y se hicieron reaccionar por 1 hora con agitación a temperatura ambiente. mPEG(12000)-Hz sin reaccionar y PTH se eliminaron usando el Centricon-10 (Amicon, USA) y se obtuvieron 0.3 mg de mPEG (12000)-Hz-PTH.

EJEMPLO 17 Preparación de los Conjugados mPEG(20000)-Hz-PTH Se hicieron reaccionar 1 mg de PTH humano (0.00012 mmoles) y 12 mg de mPEG(20000)-Hz(0.0006 mmoles, exceso molar de 5 veces, ISU Chemical, Korea) en 0.5 mi de 50 mM de solución reguladora de MES, pH de 4.4, por 10 minutos con agitación a temperatura ambiente. Se añadieron entonces 2.5 µ? de EDAC (0.00125 mmoles, exceso molar de 10 veces) preparada a una concentración de 100 µ? µ? y se hicieron reaccionar por 1 hora con agitación a temperatura ambiente. mPEG(20000)-Hz sin reaccionar y PTH se eliminaron usando Centricon-30 (Amicon, USA) y se obtuvieron 0.3 mg de mPEG(20000)-Hz-PTH.

EJEMPLO 18 Preparación del conjugado mPEG(12000)-Hz-PTH Se hicieron reaccionar 1 mg de PTH humano (0.00012 mmoles) y 14.4 mg de mPEG(12000)-Hz activado (0.0012 mmoles, exceso molar de 10 veces, ISU Chemical, Korea) en 0.5 mi de 50 mM de solución reguladora, pH de 2.5, por 10 minutos con agitación a temperatura ambiente. Se añadieron entonces 5 µ? de EDAC (0.0025 mmoles, exceso molar de 20 veces) preparado a una concentración de 100 g lI y se hicieron reaccionar por 1 hora con agitación a temperatura ambiente. Se eliminaron mPEG(12000)-Hz sin reaccionar y PTH usando Centricon-10 (Amicon, USA) y se obtuvieron 0.2 mg de mPEG(12000)-Hz-PTH.

EJEMPLO 19 Preparación del conjugado mPEG(20000)-Hz-PTH Se hicieron reaccionar 1 mg de PTH humano (0.00012 mmoles) y 24 mg de mPEG(20000)-Hz activado (0.0012 mmoles, exceso molar de 10 veces, ISU Chemical, Korea) en 0.5 mi de 50 mM de solución reguladora de MES, pH de 2.5, por 10 minutos con agitación a temperatura ambiente. Se añadieron entonces 5 µ? de EDAC (0.0025 mmoles, exceso molar de 20 veces) preparado a una concentración de 100 Mg/µ? y se hicieron reaccionar por 1 hora con agitación a temperatura ambiente. Se eliminaron mPEG(20000)-Hz sin reaccionar y PTH usando Centricon-10 (Amicon, USA) y se obtuvieron 0.2 mg de mPEG(20000)-Hz-PTH.

EJEMPLO 20 Análisis del conjugado mPEG-Hz-PTH Se obtuvieron el conjugado PEG-PTH y PTH nativo a partir de los ejemplos anteriores, determinados a las condiciones de HPLC siguientes.

Condiciones de Elución por HPLC Columna: LoChroCART 125-4 RP-8 (5 µ?t?) (Merck, USA) Solvente: A; agua desionizada que contenía 0.1 % de TFA, B; acetonitrilo que contenía 0.1 % de TFA Gasto: 0.8 ml/min Detector: detector UV a 220 nm Volumen de inyección: 20 µ? Por el uso de LiChro CART 125-4 RP-8 (5 µ??) por HPLC, solamente se detectaron el PTH y otras proteínas a 220 nm mientras que no se detectó PEG a 220 nm. Se determinó la RT de PTH por HPLC. Se vio un pico agudo de PTH que no es modificad por el polímero a alrededor de 6.8 minutos, luego aumentó lentamente hasta aproximadamente 18 minutos, y disminuyó otra vez (Figura 15). Se eluyó mPEG-Hz-PTH preparado como se describió anteriormente a 6.8 minutos para PTH sin reaccionar y 7.3 minutos para PEG-PTH, respectivamente, en el intervalo de las condiciones de elución entre el número 1 y 2 en el Cuadro anterior. Hay tres clases de productos (PTH sin reaccionar, mPEG(20000)-Hz-PTH, mPEG(20000)-Hz) presentes inmediatamente después de la conjugación y antes de purificación. Solamente se detectaron dos picos a 220 nm sobre HPLC, PTH sin reaccionar y el conjugado mPEG(20000)-Hz-PTH, mientras que no se detectó mPEG(20000)-Hz a 220 nm (Figura 16). La Figura 17 muestra el mPEG(20000)-Hz-PTH finalmente purificado sobre HPLC y la Figura 18 muestra SDS-PAGE teñido con azul de Coomassie efectuada después de hacer reaccionar mPEG(20000)-Hz con PTH.

EJEMPLO 21 Determinación de la actividad biológica in vitro del conjugado mPEG PTH Se usaron los mPEG-Hz activado que tiene pesos moleculares de 5000(5K), 12000(12K), y 20000(20K) para determinar la actividad biológica de conformidad con el peso molecular de PEG. Se compararon las actividades biológicas in vitro de PTH nativo, mPEG(5000)-Hz-PTH, mPEG(12000)-Hz-PTH, y mPEG(20000)-Hz-PTH por determinación de la cantidad de cA P sintetizado por medio del equipo cAMP (Amersham Pharmacia, PN 225, USA) usando la línea celular UMR-106. Se encontró que la actividad biológica de mPEG-Hz-PTH disminuyó cuando aumentó el peso molecular de PEG. Se encontró que mPEG(5000)-Hz-PTH, mPEG(12000)-Hz-PTH, y mPEG(20000)- Hz-PTH a la concentración de 10-8 moles retuvieron 40 %, 30 %, y 20 % de actividad del PTH sin reaccionar, respectivamente (Figura 19).

EJEMPLO 22 Determinación de la vida media de mPEG-Hz-PTH Se administraron 100 pg/kg de PTH y mPEG-Hz-PTH por medio de inyección intravenosa, respectivamente a cada una de las ratas machos que pesaron 300- 350 g. Se les sacó sangre a través de la cánula a intervalos de tiempo de 0, 5, 10, 15, 30, 60 y 120 minutos después de inyección. Se separó el suero por centrifugación (10,000 rpm, 10 minutos, 4 °C ) y se determinó indirectamente la vida media de mPEG-Hz-PTH por medio del cálculo de la concentración del PTH remanente midiendo la concentración de cAMP en plasma usando el equipo c-AMP (Amersham Pharmacia, RPN 225, USA). Como un resultado, no se detectó PTH sin reaccionar y mPEG(5000)-Hz-PTH después de 15 minutos de administración. No obstante, se detectaron mPEG(12000)-Hz-PTH y mPEG(20000)-Hz-PTH después de 1 hora y 2 horas, respectivamente, después de administración (Figura 20). Aunque se han descrito las modalidades preferidas de la presente invención, los expertos en la materia realizaran que pueden efectuarse otras modalidades sin alejarse del espíritu de la invención, la cual incluye todas las modificaciones y cambios adicionales como vienen en el significado, alcance verdadero de las reivindicaciones expuestas en la presente y equivalentes de las mismas. Los ejemplos anteriores describen adicionaimente y demuestran modalidades en el alcance de la presente invención. Los ejemplos se dan solamente con el propósito de ilustración y no se construyeron como limitaciones de la presente invención, muchas variaciones de la misma son posibles sin alejarse del espíritu y del alcance de la invención.

Aplicación de la presente invención La presente invención proporciona los conjugados polímero biocompatible-material activo biológicamente en una proporción molar de 1:1 en donde el polímero biocompatible es fijado a un grupo carboxilo del material activo biológicamente tal como proteínas o péptidos y método de preparación de los mismos. Estos conjugados que tienen la biodisponibilidad creciente y vida media prolongada debido a su estabilidad in vivo creciente, pueden reducir la frecuencia de la administración significativamente cuando se usan como fármacos terapéuticos para enfermedades.

Claims (1)

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1 - Un conjugado de polímero biocompatible-material activo biológicamente, en donde el polímero biocompatible está conjugado a un grupo carboxilo del material activo biológicamente en una proporción molar de 1:1. 2. - El conjugado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque el polímero biocompatible es seleccionado del grupo que consiste de polietilen glicol, polipropilen glicol, polioxietileno, politrimetilen glicol, ácido poliláctico y derivados de los mismos, ácido poliacrílico y derivados de los mismos, poli(aminoácido), poliuretano, polifosfazeno, poli(L-lisina), óxido de polialquileno, polisacáridos, dextrano, polivinil pirrolidona, alcohol polivinílico, poliacril amida, y copolímeros de los mismos. 3. - El conjugado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque el material activo biológicamente es seleccionado del grupo que consiste de a-, ß-, y ?- interferón, hormona paratiroidea, asparaginasa, arginasa, arginina desiminasa, adenosina desaminasa, superóxido dismutasa, endotoxinasa, catalasa, quimiotripsina, lipasa, uricasa, adenosina difosfatasa, tirosinasa, glucosa oxidasa, glucosidasa, galactosidasa, glucouronidasa, hemoglobina, factores sanguíneos VII, VIII y IX, inmunoglobulina, citoquina, factor estimulador de la colonia granulocítica, factor estimulador de la colonia de macrófagos granulocíticos, factor de crecimiento derivado de glóbulos blancos, lectina, ricino, factor de necrosis de tumor, factor de crecimiento transformador, factor de crecimiento epidérmico, calcitonina, insulina, encefalina sintética, interleuquina, eritropoyetina, péptido liberador de la hormona de crecimiento, hormona liberadora de la hormona luteal y derivados de los mismos, factores de liberación hipotalámica, péptidos relacionados con el gen de calcitonina, hormona estimuladora tiroide y factor humoral tímico. 4. - El conjugado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque el material activo biológicamente es interferón, G-CSF, o la hormona paratiroidea. 5. - Una composición farmacéutica que comprende una cantidad aceptable farmacéuticamente del conjugado que se reclama en la reivindicación 1 y el portador aceptable farmacéuticamente. 6. - Un método de preparación de un conjugado de polímero biocompatible-material activo biológicamente, en donde el polímero biocompatible activado está conjugado a un grupo carboxilo del material activo biológicamente en una proporción molar de 1:1 , el método comprende la etapa de conjugar el material activo biológicamente al polímero biocompatible activado con la adición gradual de reactivo acoplador bajo la condición en donde la proporción molar de material activo biológicamente a polímero biocompatible activado es de 1:1 a 1 :20, la proporción de material activo biológicamente al reactivo acoplador es de 1 :1 a 1:50, y el pH está en el intervalo de 2 a 5. 7. - El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque el polímero biocompatible es activado con un grupo funcional reactivo, el cual es capaz de reaccionar con el grupo de ácido carboxilo y carbonilo reactivo. 8. - El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque el polímero biocompatible es seleccionado del grupo que consiste de polietilen glicol, polipropilen glicol, polioxietileno, politrimetilen glicol, ácido poliláctico y derivados del mismo, ácido poliacrílico y derivados del mismo, poli(aminoácido), poliuretano, polifosfazeno, poli(L-lisina), óxido de polialquileno, polisacáridos, dextrano, polivinil pirrolidona, alcohol polivinílico, poliacril amida, y copolímeros de los mismos. 9. - El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque el material activo biológicamente es seleccionado del grupo que consiste de a-, ß-, ?-interferón, hormona paratiroidea, asparaginasa, arginasa, arginina desiminasa, adenosina desaminasa, superóxido dismutasa, endotoxinasa, catalasa, quimiotripsina, lipasa, uricasa, adenosina difosfatasa, tirosinasa, glucosa oxidasa, glucosidasa, galactosidasa, glucouronidasa, hemoglobina, factores sanguíneos VII, VIII y IX, inmunoglobulina, citoquina, factor estimulador de la colonia granulocítica, factor estimulador de la colonia de macrófagos granulocíticos, factor de crecimiento derivado de plaquetas, lectina, ricino, factor de necrosis de tumor, factor de crecimiento transformador, factor de crecimiento epidérmico, calcitonina, insulina, encefalina sintética, ¡nterleuquina, eritropoyetina, péptido liberador de la hormona de crecimiento, hormona liberadora de la hormona luteal y derivados de los mismos, factores de liberación hipotalámica, péptidos relacionados con el gen de calcitonina, hormona estimuladora tiroide y factor humoral tímico. 10.- El conjugado de polímero biocompatible-material activo biológicamente de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque el polímero biocompatible está conjugado a un grupo carboxilo del material activo biológicamente en una proporción molar de 1:1. 11- El conjugado de polímero biocompatible-material activo biológicamente, caracterizado además porque el polímero biocompatible está conjugado al C-terminus del material activo biológicamente en una proporción molar de 1:1. 12. - El conjugado de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado además porque el polímero biocompatible es seleccionado del grupo que consiste de polietilen glicol, polipropilen glicol, polioxietileno, politrimetilen glicol, ácido poliláctico y derivados del mismo, ácido poliacrílico y derivados del mismo, poli(aminoácido), poliuretano, polifosfazeno, poli(L-lisina), óxido de polialquileno, polisacáridos, dextrano, polivinil pirrolidona, alcohol polivinílico, poliacril amida, y copolímeros de los mismos. 13. - El conjugado de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado además porque el material activo biológicamente es seleccionado del grupo que consiste de a-, ß-, ?-interferón, hormona paratiroidea, asparaginasa, arginasa, arginina desiminasa, adenosina desaminasa, superóxido dismutasa, endotoxinasa, catalasa, quimiotripsina, lipasa, uricasa, adenosina difosfatasa, tirosinasa, glucosa oxidasa, glucosidasa, galactosidasa, glucouronidasa, hemoglobina, factores sanguíneos VII, VIII y IX, inmunoglobulina, citoquina, factor estimulador de la colonia granulocítica, factor estimulador de la colonia de macrófagos granulocíticos, factor de crecimiento derivado de plaquetas, lectina, ricino, factor de necrosis de tumor, factor de crecimiento transformador, factor de crecimiento epidérmico, calcitonina, insulina, encefalina sintética, interleuquina, eritropoyetina, péptido liberador de la hormona de crecimiento, hormona liberadora de la hormona luteal y derivados de la misma, factores de liberación hipotalámica, péptidos relacionados con el gen de calcitonina, hormona estimuladora tiroide y factor humoral tímico. 14. - El conjugado de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque el material activo biológicamente es interferón, G-CSF, o la hormona paratiroidea. 5. - Una composición farmacéutica que comprende una cantidad aceptable farmacéuticamente del conjugado que se reclama en la reivindicación 11 y un portador aceptable farmacéuticamente. 16. - Un método de preparación del conjugado de polímero biocompatible-material activo biológicamente en el C-terminus del material activo biológicamente con una proporción molar de 1:1, el método comprende la etapa de conjugar el material activo biológicamente al polímero biocompatible activado con la adición gradual de reactivo acoplador bajo la condición en donde la proporción molar de material activo biológicamente al polímero biocompatible activado es 1 :1 a 1:20, la proporción de material activo biológicamente al reactivo acoplador es 1:1 a 1:50, y el pH está en el intervalo de 2 a 5. 17. - El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque el polímero biocompatible es activado con un grupo funcional reactivo que es capaz de reaccionar con el grupo ácido carboxilo y carbonilo reactivo. 18. - El conjugado de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque el polímero biocompatible es seleccionado del grupo que consiste de polietilen glicol, polipropilen glicol, polioxietileno, politrimetilen glicol, ácido poliláctico y derivados del mismo, ácido poliacrílico y derivados del mismo, poli(aminoácido), poliuretano, polifosfazeno, poli(L-lisina), óxido de polialquileno, polisacáridos, dextrano, polivinil pirrolidona, alcohol polivinílico, poliacril amida, y copolímeros de los mismos. 19. - El conjugado de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque el material activo biológicamente es seleccionado del grupo que consiste de a-, ß-, ?-interferón, hormona paratiroidea, asparaginasa, arginasa, arginina desiminasa, adenosina desaminasa, superóxido dismutasa, endotoxinasa, catalasa, quimiotripsina, lipasa, uricasa, adenosina difosfatasa, tirosinasa, glucosa oxidasa, glucosidasa, gaiactosidasa, glucouronidasa, hemoglobina, factores sanguíneos VII, VIII y IX, inmunoglobulina, citoquina, factor estimulador de la colonia granulocítica, factor estimulador de la colonia de macrófagos granulocíticos, factor de crecimiento derivado de plaquetas, lectina, ricino, factor de necrosis de tumor, factor de crecimiento transformador, factor de crecimiento epidérmico, calcitonina, insulina, encefalina sintética, interleuquina, eritropoyetina, péptido liberador de la hormona de crecimiento, hormona liberadora de la hormona luteal y derivados de la misma, factores de liberación hipotalámica, péptidos relacionados con el gen de calcitonina, hormona estimuladora tiroide y factor humoral tímico. 20.- El conjugado de polímero biocompatible-material activo biológicamente preparado de conformidad con la reivindicación 16, en donde el polímero biocompatible es conjugado al C-terminus del material activo biológicamente en una proporción molar de 1:1.