MXPA05002699A - Inmunizacion contra grelina autologa. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a nuevos metodos que confian generalmente en la inmunizacion contra la grelina autologa. La inmunizacion es preferiblemente efectuada por administracion de analogos de grelina autologa, dichos analogos son capaces de inducir la produccion de anticuerpo contra los polipeptidos de grelina autologos. Especialmente preferida como un inmunogeno esta la grelina autologa, la cual ha sido modificada por introduccion de un unico o algunos epitopes de celulas T inmunodominantes y promiscuas, extranos. Tambien estan descritas vacunaciones de acido nucleico contra grelina y vacunacion usando vacunas vivas, asi como tambien metodos y medios empleados para la vacunacion. Tales metodos y medios incluyen metodos para la preparacion de analogos y formulaciones farmaceuticas, asi como tambien fragmentos de acido nucleico, vectores, celulas transformadas, polipeptidos y formulaciones farmaceuticas.

Description

INMUNIZACION CONTRA GRELINA AUTÓLOGA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presenté invención se refiere a vacunación terapéutica ("inmuno-terapia terapéutica activa") . En particular, se refiere a la vacunación terapéutica que se dirige a la proteina ("misma'"] grelina autóloga y a terapia dirigida a la obesidad y otras enfermedades, caracterizada por exceso de depósitos de grasa corporal o, alternativamente, condiciones en donde un incremento en peso corporal es de interés. La presente invención de este modo, se refiere a mejoramientos en terapia y prevención de obesidad, caracterizados por exceso de deposición de grasa, pero también a me oramientos en terapia y prevención de condiciones caracterizadas por pérdida de peso corporal. Más específicamente, la presente invención proporciona un método para regular descendentemente depósitos (indeseados) de grasa permitiendo la producción de anticuerpos contra grelina o componentes de los mismos en sujetos que sufren de, o en peligro de sufrir de obesidad que involucra exceso de deposición de grasa. La invención además, proporciona un método para regular ascendentemente depósitos deseados de grasa corporal permitiendo la producción de anticuerpos contra grelina o componentes de los mismos en sujetos que KEÍ\: 162660 sufren de, o en peligro de sufrir de emancipación. La invención también proporciona métodos para producir polipéptidos empleados en estos métodos, asi como también para los polipéptidos modificados como tales. También abarcados por la presente invención están fragmentos de ácido nucleico que codifican los polipéptidos modificados, asi como también vectores que incorporan estos fragmentos de ácido nucleico y células hospedadoras y líneas celulares transformadas junto con estos. La invención también proporciona un método para la identificación de análogos de los depósitos de polipéptidos, los cuales son empleados en los métodos de la invención, así como también para composiciones que comprenden polipéptidos modificados o que comprenden ácidos nucleicos que codifican polipéptidos modificados. Finalmente, la presente invención también proporciona inmunogenos de péptidos de grelina conjugados.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Durante Tas pasadas tres décadas, la prevalencía de la obesidad se ha elevado hasta alcanzar proporciones epidémicas, no solamente en los Estados Unidos y Europa, sino también en países desarrollados como China, Latinoamérica, países del Medio Este y África del Norte están ahora reportando incidencias incrementadas de obesidad ente las poblaciones. A pesar de los esfuerzos en salud pública, no hay cambios marcados hacia formas de vida más sanas probablemente durante los próximos diez años. De conformidad con estadísticas recientes, los resultados indican que un estimado del 61% de adultos en Estados Unidos son ya sea de sobre peso u obesos, definidos por tener un índice de masa corporal (IMC = Peso en kilogramos ÷ [Altura en metros]2) de 25 o más (National Health and Nutrition Examination Survey (NHANES) 1999) . En la misma población la obesidad (definida como IHC mayor que o igual a 30.0) se ha duplicado casi desde aproximadamente 15% en 1980 a un estimado del 27% en 1999. Esto, de acuerdo con la WHO, se estima que globalmente 300 millones de personas son obesas. Individuos con sobre peso y obesos (IMC de 25 y superior) , están en riesgo incrementado de- dolencias físicas tales como: presión sanguínea alta, hipertensión; colesterol alto en la sangre, dislipidemia; Diabetes Tipo 2 (no dependiente de insulina) ; resistencia a la insulina, tolerancia a la glucosa; hiperinsulinemia; enfermedad cardiaca coronaria; angina de pecho; insuficiencia cardiaca congestiva; apoplejía; cálculos; colescistitis y cplelitiasis; gota; osteoartritis; apnea obstructiva del sueño y problemas respiratorios; algunos tipos de cáncer (tales como endometrial, mama, próstata y colon) ; complicaciones del embarazo; escasa salud reproductiva femenina (tal como irregularidades menstruales, infertilidad, ovulación irregular); problemas de control de vejiga (tales como incontinencia por estrés) ; nefrolitiasis de ácido úrico; trastornos psicológicos (tales como depresión, trastornos alimenticios, imagen distorsionada del cuerpo, y autoestima baja) . Las consecuencias de salud varían desde riesgo incrementado de muerte prematura hasta condiciones crónicas serías que reducen la calidad total de vida. Además, la obesidad severa está asociada con un incremento de 12 veces en mortalidad en 25-35. años de edad, cuando se compara con individuos delgados. Actitudes negativas hacia los obesos pueden conducir a discriminación en muchas áreas de su vida incluyendo cuidados y empleo de salud. El costo directo de diagnosis, tratamiento y manejo de obesidad dentro de sistemas de salud nacional ha sido solamente valorado en algunos países a la fecha. Aunque la metodología varió considerablemente entre estudios, hace difícil comparar costos a través de los países y extrapolar los resultados de un país a otro, estos estimados sugieren que entre 2-8% de los costos totales del cuidado de enfermos en los países del Oeste, son atribuibles a la obesidad. Esto representa una fracción principal de presupuestos al cuidado de la salud nacional, comparables con por ejemplo, el costo total de terapia de cáncer. El impacto potencial en recursos al cuidado de la salud en los sistemas al cuidado de la salud menos desarrollados de países desarrollados es probablemente aún más severo (WHO) . El sobrepeso y obesidad resultan de un desequilibrio que involucra consumo, excesivo de calorías y/o actividad física inadecuada. Para cada individuo, el peso corporal es el resultado de una combinación de influencias genéticas, metabólicas, conductas, ambientales, culturales y socioeconómicas. Los factores de conducta y ambientales son grandes contribuyentes al sobre peso y obesidad y proporcionan la mayor oportunidad para acciones e intervenciones designadas para prevención y tratamiento. Por lo tanto, muchos estudios han demostrado que la reducción en la obesidad por dieta y ejercicio, reduce los factores de riesgo mencionados dramáticamente anteriormente.

Desafortunadamente, estos tratamientos son ampliamente no exitosos con una tasa de falla que alcanza 95%. Esta falla puede ser debido a un mecanismo corporal complejo, el cual en tiempos antiguos nos ayudaba a sobrevivir cuando los suministros de alimentos no eran confiables. El mecanismo puede contribuir a apetito incrementado, preferencia por alimentos altamente calóricos, actividad física reducida, y metabolismo lipogénico incrementado como una respuesta a la dieta y ejercicio. La leptina, descubierta en 1995, es una hormona la cual suprime el apetito. Producida principalmente en tejido graso, la leptina circula generalmente en proporción a los almacenes de grasa. Anima a personas a detener la comida cuando sus células grasas están llenas. Una hormona recientemente descrita (1999) , llamada grelina, parece tener el efecto contrario. La hormona es una hormona gástrica que · ha sido identificada como un ligando endógeno para el receptor secretagogo de la hormona de crecimiento (HC) subtipo la (SHC-Rla) , la cual estimula la secreción de la hormona de crecimiento en ratas y humanos (Kojima M et al., Nature, 1999, 402: 656-60; Kojima M et al., Trends in Endocrinology and Metabolism, 2001, 12: 118-22; Takaya K et al., J Clin Endocrinol Metab, 2000, 85: 4908-11). Basados en observaciones de efectos orexigénicos y adipogénicos en roedores (Tschóp M et al,, Nature, 2000, 407: 908-913; Wren A et al., Endocrinology, 2000, 141: 4325-28; Nakazato M et al., Nature, 2001, 409: 194-8; Shintani M et al., Diabetes, 2001, 50: 227-232), se ha asumido un papel adicional para grelina en la regulación del balance de energía (Inui A, Nature Reviews Neuroscience', 2001, 2: 551-60; Horvath TL et al., Endocrinology, 2001, 142 (10): 4163-9). Estudios han revelado que la infusión de grelina estimula la alimentación y produce obesidad en roedores (Tschóp M et al., Nature, 2000, 908-13) independientemente de cambios en la secreción de la hormona de crecimiento (Nakazato M et al., Nature, 2001, vol. 409: 194-89. En sujetos humanos, la infusión de grelina conduce a incrementos a corto término en el hambre (Wren M et al . , J Clin Endocrinol Metab, 2001, 86: 5992). Cummings DE et al. (M Etig J Med, 2002, 346: 1623-30) reporta que los niveles de grelina se elevan solo antes de las comidas y con restricción de alimento o hambre y que caen rápidamente después de las comidas. Los autores hipotetizan que el incremento pre-cómida observado acciona el deseo a comer, y el incremento en niveles con restricción de alimentos a largo término puede contribuir al hambre y posiblemente otras adaptaciones que acompañan el balance negativo de energía. La teoría es consistente con la evidencia que la grelina actúa en neuronas hipotalámicas que son conocidas por regular el balance de energía (Nakazato M et al., Nature, 2001, vol. 409: 194-8). Cummings DE et al. (2002), reportó que los niveles de grelina del plasma pre-comidas incrementan después de la pérdida de peso inducida por dieta. A más peso que un individuo ha perdido, más grande el incremento post-dieta en los niveles de grelina. Esto es consistente con la hipótesis" de que la grelina tiene una función n la regulación a largo término del peso corporal . Además, se reportó que la cirugía de derivación gástrica fue asociada con niveles de grelina marcadamente suprimidos, posiblemente contribuyendo al efecto reductor de peso de pacientes con derivación. La cirugía de derivación previene a las células del estómago de estar expuestas al alimento y esto conduce a un decremento en la producción de grelina a niveles casi indétectables (> 75% de reducción) . De manera interesante, la mayoría de los pacientes con derivación reportan una pérdida completa de interés en alimento subsecuente a la operación, lo cual puede ser debido al decremento significante en la producción de grelina. De este modo, la grelina juega un papel importante en la obesidad y la necesidad de una reducción marcada en la producción de grelina en pacientes obesos que se someten a dietas es esencial para i. pérdida de peso es decir, reducir el exceso de grasa corporal y 2. subsecuentemente retener una pérdida de peso inducida por dieta.

Estructura de grelina La grelina muestra una estructura única con un n-octanoil éster en residuos de serina-3. Se ha mostrado que en los primeros residuos de grelina madura procesada, el segmento de Gly-Ser-Ser (n-octanoil) -Phe constituye el componente activo de este péptidó (Bednarek ?? et al., 2000) .

Homología de Grelina a otras proteínas La Grelina se ha identificado en el estómago humano y es homologa a la grelina de rata aparte de 2 aminoácidos. La pre-progrelina humana, aislada de una biblioteca de ADN de estómago, consiste de 117 aminoácidos. Las pre-progrelinas de rata y humanas son 82.9% idénticas. La grelina no porta alta homología con cualquier otro de los péptidos no grelina identificados hasta ahora.

Actividad biológica de grelina La grelina se. piensa altera la alimentación en parte, a través de la modulación del control del SNC de la función gástrica (Date Y et al., 2001; Masuda Y et al., 2000) . Específicamente, la administración de ICV de la secreción de ácido gástrico es estimulada por grelina de una manera sensible a la atropina y dependiente de dosis. La inmunohistoquímica demostró la inducción de la expresión Fos en los núcleos del tracto solitario y núcleo dorsomotor del nervio vago de rata. Asakawa A et al. mostró en el 2001, que la grelina presentó actividad gastroprocinética con semejanza estructural a motilina y actividad orexigénica potente (alimentación) a través de la acción en el receptor del neuropéptido hipotalámico Y y Y(l), el cual se perdió después de la vagotomía. La grelina disminuyó la descarga aferente vaga gástrica contrario a otros péptidos anorexigénicos que incrementan la actividad. Estos autores y otros (Toshinai K et al., 20?1), reportan que la expresión del gen grelina en el estómago fue incrementada por ayuno, insulina y en ratones ob/ob.

Demostración in vivo del papel de grelina Asi como el aumento en la liberación de la HC, la grelina exógena también incrementó la absorción de alimento, causó ganancia de peso y redujo la utilización de grasa en ratones y ratas (Wren AM et al., 2000; Tschop M et al, 2000) . Del mismo modo, la administración intracerebroventricular (ICV) de grelina también generó u incremento dependiente de dosis en la absorción de alimento y peso corporal. Las concentraciones de grelina en suero de rata fueron incrementadas por ayunos y fueron reducidas por realimentación administración de glucosa oral, pero no por ingestión de agua. Estos autores proponen que la grelina, además de su papel en la regulación de la secreción de la HC, alerta al hipotalamo cuando es necesario un incremento en la eficiencia metabólica. Nakazato M et al (2001) , demostró que la grelina está involucrada en la regulación hipotalámica de homeostasis de energía. Las inyecciones intracere roventriculares de grelina, estimularon fuertemente la alimentación en ratas e incrementaron la ganancia de peso corporal. La grelina también incrementó la alimentación en ratas que fueron genéticamente deficientes en HC. La inmunoglobulina G anti-grelina fuertemente suprime la alimentación. Después de la administración de grelina icv, la proteina FOS, un marcador de activación neuronal, se encontró en regiones de importancia primaria en la regulación de alimentación, que incluye neuronas del neuropéptido Y y neuronas de proteínas relacionadas con agoutis. Los anticuerpos y antagonistas del neuropéptido Y y proteínas relacionadas con agouti, suprimen la alimentación inducida por grelina. La grelina aumenta la expresión del gen del neuropéptido Y y "bloquea la reducción de alimentación inducida por leptina, implicando que existe una interacción competitiva entre grelina y leptina en la regulación de la alimentación. Se concluyó por lo tanto, que la grelina es un mediador fisiológico de alimentación. Además de estudios animales, la grelina se ha investigado también en un número de estudios clínicos . Los niveles de grelina demostraron un incremento de dos veces 1 hora previo a la comida y cayó a noveles inferiores dentro de 1 hora de comida (véase inserción) , sugiriendo que la grelina juega un papel importante en la iniciación de la comida (Cumming DE et al., 2001) . Esto se confirmó por estudios que muestran que la grelina incrementa el apetito y la absorción de alimento en humanos (Wren AM et al., 2001).

Tratamiento de obesidad en la actualidad y en el futuro Se estima qué algunos -entre 34 y 61 millones de personas en los EUA son obesos y en muchos del mundo desarrollado ésta incidencia está incrementando por aproximadamente 1% por año, Después de retirar los tratamientos recientes, el mercado para farmacéuticos antiobesidad fue re-establecido en Noviembre de 1991, cuando la FDA aprobó la sibutramina de Abbott (Reductil/Meridia) , para uso en la obesidad y todavía además, en abril de 1999, cuando Xenical de Roche (orlistat) fue también aprobado. El mercado mundial de la obesidad se ha predicho alcanzar $3.7 billones al 2008 con una tasa de crecimiento anual por compuesto de 21.1%. Este mercado potencial ha causado que compañías farmacéuticas tengan como prioridad la identificación de nuevos productos anti-obesidad y consecuentemente, el número de fármacos en desarrollo se ha elevado 3 veces durante los pasados 7 años, ampliamente debido a un incremento en las actividades · de investigación pre-clínica. Las clases farmacéuticas que reciben la mayor atención incluyen fármacos de modulación de 5-HT; agonistas adenoreceptores beta 3; inhibidores de la lipasa; agonistas 4 de melanocortina; y agonistas de leptina. Los agonistas de leptina han creado una tormenta de interés, puesto que este mediador es capaz de reducir la alimentación, sin embargo, observaciones recientes de que individuos obesos producen niveles altos y son resistentes a la leptina, han conducido a la búsqueda para alternativas . La grelina representa uno de los objetivos más prometedores de ruptura en el campo de la obesidad. Aunque científicos solamente identificaron la grelina en 1999, más de 200 documentos en la sustancia ya han sido publicados. La grelina actúa para estimular la absorción de alimento, pero los niveles de plasma son reducidos en pacientes obesos, sugiriendo que este mediador representa un regulador clave en la absorción de alimento. Líderes en el campo actualmente creen que la reducción adicional de la actividad de grelina puede ofrecer un objetivo terapéutico y por lo tanto, antagonistas de enlace al receptor de grelina están surgiendo como una opción farmacológica en el tratamiento de la obesidad. Correspondientemente, un número de herramientas están ahora disponibles para la selección de antagonistas del receptor de grelina. Debido al potencial para el descubrimiento del fármaco, los antagonistas del receptor de grelina tienen todavía parecer aunque la publicación de un número de patentes sugiere que tales moléculas pueden estar en la forma. Considerando la prueba de concepto que soporta el desarrollo de los antagonistas de grelina, el tamaño potencial del mercado de la obesidad y la falta relativa de tratamientos disponibles al especialista, ahora es un tiempo ideal para investigar el desarrollo de esta clase terapéutica excitante .

Condiciones en donde un incremento en grasa corporal es de interés Pacientes que sufren de un número de enfermedades podrían beneficiarse de un incremento en la grasa corporal, casi contrario a los pacientes obesos discutidos anteriormente. Condiciones que existen en donde el problema parece ser una carencia de apetito y no acceso insuficiente a suministros de alimento. Tales condiciones incluyen caquexia y anorexia.

OBJETO DE LA INVENCIÓN El objeto de la presente invención es proporcionar nuevas terapias contra condiciones caracterizadas por la deposición de exceso de grasa corporal, que resulta de la absorción de energía que excede el consumo de energía como es característico de la obesidad. Otro objeto es proporcionar terapias y tratamientos que inducen un incremento en la grasa corporal. Un objeto adicional es desarrollar una autovacuna contra la grelina.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Descrito aquí está el uso de una tecnología autovacunación para generar respuestas inmunes fuertes contra una proteína misma no inmunogénica de otro modo, grelina, involucrada en el exceso de deposición de grasa corporal. Con ello, una respuesta inmune fuerte es generada contra la grelina. Se describe también la preparación de tales vacunas para la prevención, posible cura o alivio de los síntomas de tales enfermedades asociadas con el exceso de depósitos de grasa corporal, asi también para inducir un incremento en la grasa corporal . La última indicación es el resultado del hallazgo sorprendente que un número de análogos de grelina inmunogénica de la presente invención, parecen afectar una elevación en la grelina del suero en animales inmunizados con las variantes. Esta elevación en la grelina del suero está acompañada por un incremento significante en el peso corporal en animales inmunizados, aún a pesar de que el animal no presente una absorción incrementada en alimento. Además, el incremento en los niveles de grelina circulante proporciona inmunización activa contra grelina autóloga, una alternativa inesperada a la administración directa de grelina en sujetos que 1) podrían beneficiarse de los efectos fisiológicos ejercidos por la grelina y 2) tienen la capacidad para producir grelina ellos mismos. De este modo, en el ámbito más amplio y más general, la presente invención se refiere a un método para producir una respuesta inmune contra la grelina autóloga en un animal, que incluye un ser humano, el método comprende efectuar la presentación al sistema inmune del animal de una cantidad inmunogénicamente efectiva de un inmunógeno seleccionado del grupo que consiste de - al menos un polipéptido de grelina o subsecuencia del mismo, el cual ha sido formulado para que la inmunización del animal con el polipéptido de grelina o subsecuencia del .mismo, induzca producción de anticuerpos contra la grelina autóloga del animal, y - al menos un análogo de grelina que incorpora en la misma molécula al menos, un epitope de células B de grelina y al menos una porción química no derivada de grelina para que la inmunización del animal con el análogo induzca producción de anticuerpos contra grelina. Como- parecerá de la discusión de la invención expuesta abajo, el método puede ser usado para ya sea efectuar la regulación descendente in vivo de la actividad de grelina o efectuar la regulación ascendente in vivo de la actividad de grelina. El aspecto más atractivo de este procedimiento es que por ejemplo, la obesidad puede ser controlada y/o invertida por inmunizaciones periódicas pero no muy frecuentes, contrario a un procedimiento terapéutico, el cual involucra la administración de anti-grelina o moléculas que tienen una afinidad de enlace a análogos de grelina junto con estos. Se espera que 1-4 inyecciones anuales con una composición ínmunogénica de conformidad con la invención, sean suficientes para obtener el efecto deseado, mientras la administración de otros inhibidores de la actividad de grelina hará o requerirá diariamente, o al menos semanalmente, administraciones. Existe una ventaja similar para indicaciones en donde es deseado un incremento en la grasa corporal. La invención también se refiere a análogos de grelina asi como también a fragmentos de ácido nucleico que codifican una subserie de estos. También, composiciones inmuriogénicas que comprenden los análogos o los fragmentos de ácido nucleico son parte de la invención. La invención también se refiere a un método para identificar análogos de grelina, asi como también a un método para preparar una composición que comprende los análogos de grelina. Finalmente, la invención también se proporciona para terapia inmune .pasiva, en donde los anticuerpos anti-grelina monoclonales son administrados para obtener un efecto similar de aquel de la vacunación activa.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1. Tituladores de anticuerpo anti-grelina en ratas inmunizadas contra grelina autóloga. Grupos de ratas (n=10) fueron vacunadas con diferentes péptidos Autovac de Grelina (péptido 3, 4, 5, que corresponde a las SEC ID NOs: 15, 16 y 17, respectivamente) , Grelina de rata tipo nativa (péptido 2) , o un péptido de control negativo derivado de IgE (péptido 1) . Combinaciones de sueros (después de la 3era. vacunación) de cada uno de los cinco grupos fueron probadas para la respuesta anticuerpo anti-grelina en un ELISA directo,- en donde la placa fue revestida con grelina (Bachera, 2 ug/ml) . Los sueros fueron titulados tres veces con una dilución de inicio de 1:10. Como un control negativo para el enlace no especifico de suero a .la placa ELISA, los sueros de ratas vacunadas con el péptido 5 fueron agregados a cavidades no revestidas (sin revestir) . El enlace de anticuerpos anti-grelina fue detectado con un anticuerpo secundario anti-rata Ig conjugado con HRP (1:1000 dilución, Dako) .

Figura 2. Peso corporal de ratas inmunizadas. El peso corporal se midió una vez a la semana en todos los grupos a partir de la iniciación del estudio al Tiempo = 0.0. Todos los grupos están ganando peso en las 10 semanas del estudio, pero la ganancia de peso es superior en animales con niveles elevados de Grelina (Péptidos 3-5) , comparados con el peso y control (Péptidos 2 y 1, respectivamente) .

Figura 3. Absorción de alimento en ratas inmunizadas . La absorción de alimento en las ratas vacunadas fue medida una vez a la semana en todos los grupos a partir de la iniciación del estudio al Tiempo = 0.0. La gráfica muestra la absorción de alimento cumulativo durante las 10 semanas de duración del estudio. Aparentemente, las diferencias demostradas en el peso corporal no son reflejadas directamente en la absorción de alimento cumulativo.

Figura . Niveles de grelina en el plasma en animales vacunados. Muestras sanguíneas se retiraron después de 18 horas de ayuno para normalizar los niveles de Grelina. Los sueros combinados fueron analÍ2ados para Grelina de rata usando un kit RIA comercial de Phoenix (Kit RIA de Grelina (Rata-Ratón) ) , de conformidad con las instrucciones del fabricante. Los primeros datos de 11/4 son de un pre-sangrado, mientras las combinaciones restantes son de sangrados tomados 1 semana después de las inyecciones.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Definiciones En lo siguiente, un número de términos usados en la presente especificación y reivindicaciones serán definidos y explicados en detalle para clarificar las metas y límites de la invención. El término "inmunógeno" en el presente contexto, se refiere a un agente (una sustancia o una composición de materia) que induce una respuesta inmune. Se entenderá que ciertas moléculas (por ejemplo, haptenos pequeños tradicionales o proteína mismas que son toleradas en el hospedero autólogo) , son incapaces de inducir una respuesta inmune. Sin embargo, algunas proteina mismas son, cuando se formulan en adyuvantes inmunológicos muy fuertes, capaces de inducir una respuesta inmune no obstante del estado normalmente tolerante del animal inmunizado. En tal contexto, el winmunogeno" es por lo tanto la composición de materia (proteína misma con adyuvante) y no solo una molécula única. Los términos "linfocito T" y ^célula T" serán usados intercambiablemente por linfocitos de origen tímico los cuales son responsables por varias respuestas inmunes mediadas por las células, así como también por la actividad auxiliadora en la respuesta inmune humoral. Del mismo modo, los términos wlinfocito B" y ^células Bf, serán usados intercambiablemente para linfocitos que producen anticuerpos. Un "polipéptido de grelina'" es aquí propuesto para denotar polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácido de las proteínas de grelina discutidas anteriormente derivadas de humanos · y otros mamíferos (o truncados del mismo que portan una cantidad sustancial de epitopes de células B con grelina intacta) , pero también polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácido idéntica a xeno-análogos de estas proteínas aisladas de otras especies están abarcados por el término; incluido en el término está tanto el péptido de grelina maduro así como también el propéptido de grelina y el pre-propéptido de grelina. También, formas no glicosiladas de grelina las cuales son preparadas en sistema procariótico están incluidas dentro de los límites del término como son formas que tienen patrones de glicosilación variantes debido al uso de por ejemplo, levaduras y otros sistemas de expresión eucariótica no de mamíferos. Debe ser sin embargo notado que cuando se usa el término "un polipéptido de grelina", se pretende que el polipéptido en cuestión sea normalmente no ínmuiiogénico cuando se presenta al animal a ser tratado. En otras palabras, el polipéptido de grelina es una proteína misma o es un xeno-análogo de tal proteína misma la cual normalmente no dará origen a una respuesta inmune contra la grelina del animal en cuestión. Un ^análogo de grelina" es un polipéptido de grelina el cual ha sido sometido a cambios en su estructura primaria. Tal cambio puede por ejemplo, ser en la forma de fusión de un polipéptido de grelina a un asociado de fusión adecuado (es decir, un cambio en la estructura primaria exclusivamente que involucra adiciones C y/o N-terminales de residuos de aminoácidos) y/o puede estar en la forma de inserciones y/o supresiones y/o sustituciones en la secuencia de aminoácido del polipéptido de grelina. También abarcados por el término están moléculas de grelina derivatizadas, cotéjese la discusión abajo de modificaciones de grelina. Se debe notar que el uso como una vacuna en un humano de por ejemplo, un análogo canino de grelina humana podría ser imaginado para producir la inmunidad deseada contra grelina. Tal uso de un xeno-análogo para inmunización es considerado por ser un ttanálogo de grelina" como se define anteriormente. Cuando se usa . la abreviatura ^grelina" aquí, esta está propuesta como una referencia a la secuencia de aminoácido de grelina tipo nativa (también denotada ^grelina" y wgrelina-nt" aquí) . Esté término abarca tanto el polipéptido como el péptido maduro, así la grelina madura es llamada grelina-m. La grelina madura humana es denotada h-grelina, h-grelina-m, y grelina madura murina es denotada m-grelina, m-grelina-m, o m-grelina-nt, etc. En casos en donde un constructo de ADN incluye información que codifica una secuencia líder u otro material, esto normalmente será claro del contexto . El término "polipéptido" está en el presente contexto propuesto para significar tanto péptidos cortos desde 2 a 10 residuos de aminoácido, oligopéptidos desde 11 a 100 residuos de aminoácido y polipéptidos de más de 100 residuos de aminoácido. Además, el término también está propuesto para incluir proteínas, es decir, biomoléculas funcionales que comprenden al menos, un polipéptido; cuando comprenden al menos dos polipéptidos, estos pueden formar complejos, ser covalentemente ligados o puede ser no covalentemente ligados. El (los) polipéptido (s) en una proteina puede ser glicosilado y/o lipidado y/o comprender grupos prostéticos. También, el término "'"poliaminoácido"' es un equivalente al término ^polipéptido" . ¦ El término ^subsecuencia" significa cualquier alargamiento consecutivo de al menos 3 aminoácidos, o cuando es relevante, de al menos 3 nucleótidos, derivados directamente de una secuencia de aminoácido de grelina que se origina naturalmente o secuencia de ácido nucleico, respectivamente . El término ""animal"- está en el presente contexto en general, propuesto para denotar una especie animal (preferiblemente .mamífero) , tal como Homo sapiens, Canis domesticus, etc. y no sólo un animal único. Sin embargo, el término también denota una población de tales especies animales, puesto que es importante que los individuos inmunizados de conformidad con el método de la invención, todos alberguen substancialmente la misma grelina permitiendo la inmunización de los animales con el mismo inmunogeno (s) . Si por ejemplo, variantes genéticas de grelina existen en diferentes poblaciones humanas, puede ser necesario usar diferentes inmunógenos en estas poblaciones diferentes para ser capaz de interrumpir la auto-tolerancia hacia la grelina en cada población. 'Será claro para la persona experta que un animal en el presente contexto" es un ser viviente el cual tiene un sistema inmune. 'Se prefiere que el animal sea un vertebrado, tal como un mamífero. Por el término "regulación descendente in vivo de la actividad de grelina" significa aquí reducción en el organismo vivo del número de interacciones entre grelina y sus receptores (o entre grelina y otros asociados de enlace biológicamente importantes posibles para esta molécula) . La regulación descendente puede ser obtenida por medio de varios mecanismos: De estos, la simple interferencia con el sitio activo en grelina por enlace anticuerpo es la más simple. Sin embargo, está también dentro, del ámbito de la presente invención, que el enlace anticuerpo resulta en la remoción de grelina en células depuradoras (tales como macrófagos y otras células fagocíticas) . Otra posibilidad es el enlace de anticuerpos anti-grelina que son capaces de interferir con el desdoblamiento normal de progrelina que resulta en grelina madura. La expresión "que efectúa presentación.... al sistema inmune" está propuesta para denotar que el sistema inmune del animal es sometido a una respuesta inmunogénica de una manera controlada. Como será aparente de la discusión abajo, tal respuesta del sistema inmune puede ser efectuada en un número de formas de las cuales las más importantes son la vacunación con polipeptxdos que contienen "farmacinas" (es decir, una vacuna la cual es administrada para tratar o aminorar el curso de la enfermedad) , o vacunación de ¾farmacina de ácido nucleico. El resultado importante para lograr esto es que las células competentes inmunes en el animal son confrontadas con el antigeno de una manera inmunológicamente efectiva, mientras el modo preciso de lograr esto resulta de menos importancia para la idea inventiva subyacente á la presente invención. El término *cantidad inmunogénicamente efectiva" tiene su significado usual en la técnica de inmunología, es decir, una cantidad de un inmunógeno el cual es capaz de inducir una respuesta inmune la cual significantemente acopla moléculas las cuales portan características inmunológicas con el inmunógeno. Cuando se usa la expresión que la grelina ha sido ""modificada'", esto aquí significa una modificación química del polipéptido el cual constituye la estructura de la grelina. Tal modificación por ejemplo, puede ser derivatización (por ejemplo, alquilación, acilación, esterificación, etc.) dé ciertos residuos de aminoácido en la secuencia de grelina, pero como se apreciará de la descripción abajo, las m'odificaciones preferidas comprenden cambios de (o adiciones a) la estructura primaria de la secuencia de aminoácido de grelina. Una modificación particular es la omisión del grupo n-octanoilo que se origina naturalmente en la grelina. Cuando se discute ^auto-tolerancia hacia grelina" se entiende que puesto que la grelina es una proteína misma en la población a ser vacunada, individuos normales en la población no montan una respuesta inmune contra grelina; no se puede excluir, a pesar de que, tales individuos ocasionales en una población animal podrían ser capaces de producir anticuerpos contra grelina nativa, por ejemplo, como parte de un trastorno autoinmune. En cualquier relación, un animal normalmente solamente será auto-tolerante hacia su propia grelina, pero no se puede excluir que los análogos de grelina derivados de otras especies animales o de una población que tiene un fenotipo de grelina diferente podrían también ser toleradas por dicho animal. Un "epitope de células T extraño" (o: epitope del linfocito T extraño;") es un péptido el cual es capaz de enlazarse a una molécula MHC y el cual estimula las células T en una especie animal. Los epitopes de células T extraños preferidos en la invención son epitopes ^promiscuos", es decir, epitopes los cuales se enlazan a una fracción substancial de una clase particular de moléculas MHC en una especie o población animal. Solamente un número muy limitado de tales epitopes de células T promiscuos son conocidos, y serán discutidos en detalle, abajo. Se debe notar que para que los inmunogenos los cuales son usados de conformidad con la presente invención, sean efectivos como una gran fracción de una población animal posible, puede ser necesario 1) insertar varios epitopes de células T extrañas en el mismo análogo de grelina o 2) preparar varios análogos de grelina en donde cada análogo tiene un epitope promiscuo diferente insertado. Se debe notar también que el concepto de epitopes de células T extrañas también abarca usos de epitopes de células T crípticas, es decir, epitopes los cuales son derivados de una proteína misma y los cuales solamente ejercen un comportamiento inmunogénico cuando existen en forma aislada sin ser parte de la proteína mismá en cuestión. Un "epitope de linfocito auxiliador T extraño" (un epitope TH extraño) es un epitope de células T extrañas, el cual se enlaza a una molécula MHC de Clase II y puede ser presentado en la superficie de una célula que presenta antígeno (APC) unida a la molécula MHC de Clase II. Una Aparté funcional de una (bio) molécula está en el presente contexto propuesta para significar la parte de una molécula la cual, es responsable por al menos, de uno de los efectos bioquímicos o fisiológicos ejercidos por la molécula. Es bien conocido en la técnica, que muchas enzimas y otras moléculas efectoras tienen un sitio activo el cual es responsable por los efectos ejercidos por la molécula en cuestión. Otras partes de la molécula pueden servir a un propósito para mejorar la estabilización o solubilidad y pueden por lo tanto, dejarse si estos propósitos no son de relevancia en el contexto de una cierta modalidad de la presente invención. Por ejemplo, es posible usar ciertas citocinas como una porción de modificación en grelina (cotéjese la discusión detallada abajo), y en tal caso, la emisión de estabilidad puede ser irrelevante puesto que el acoplamiento a grelina proporciona la estabilidad necesaria. El término "adyuvante tiene su significado usual en la técnica de la tecnología de vacunas, es decir, una sustancia o una composición de materia la cual es 1) no es la misma capaz de montar una respuesta' inmune específica contra el inmunógeno de la vacuna, pero la cual es 2) sin embargo, capaz de mejorar la respuesta inmune contra el inmunógeno. O en otras palabras, la vacunación con el adyuvante solo no proporciona una respuesta inmune contra el inmunógeno, la vacunación con el inmunógeno puede o no puede dar origen a una respuesta inmune contra el inmunógeno, pero la combinación de vacunación con el inmunógeno y adyuvante induce una respuesta inmune contra el inmunógeno el cual es más fuerte que el inducido por el inmunógeno solo. "Objetivo" de una molécula está en el presente contexto propuesto para denotar la situación en donde una molécula después de la introducción en el animal, aparecerá preferencialmente en ciertos tejido (s) o será preferencialmente asociada con ciertas células o tipos de células. El efecto puede estar acompañado en un número de formas que incluyen la formulación de la molécula en la composición que facilita el objetivo o por introducción en la molécula de grupos los cuales facilitan el objetivo. Estas emisiones serán discutidas en detalle abajo. "Estimulación del sistema inmune" significa que una sustancia o composición de materia presenta un efecto general, no especifico inmunoestimulatorio . Un número de adyuvantes y adyuvantes putativos (tales como ciertas citocinas) , portan la capacidad para estimular el sistema inmune. El resultado de usar un agente inmunoestimulante es una "vigilancia''' incrementada del sistema inmune que significa que la inmunización simultánea o subsecuente con un inmunógeno induce una respuesta inmune significantemente más efectiva comparada con el uso aislado del inmunógeno. "Enlace productivo"" significa enlace de un péptido a la molécula MHC (Clase I o II) por ser capaz de estimular células T que se acoplan a una célula que presenta el péptido unido a la molécula MHC. Por ejemplo, un péptido unido a una molécula MHC Clase II en la superficie de un APC se dice, es productivamente unido si este APC estimulará una célula ?? que se enlaza al complejo de péptido-MHC de Clase II presentado.

Modalidades preferidas de inmunización anti-grelina Como se mencionó anteriormente de manera breve, la inmunización contra grelina puede ser activa asi como también pasiva. Aún a pesar de que el enfoque de la presente invención es la administración de agentes que inducen respuesta inmune activa contra grelina, está también dentro del ámbito de la presente invención administrar agentes que se enlazan a la grelina in vivo. Por ejemplo, es posible utilizar la tecnología bien conocida de administración de anticuerpo monoclonal en la presente invención. Es en este contexto preferido, usar anticuerpos monoclonales completamente humanos o humanizados, por ejemplo, empleando ratones transgénicos que expresan cadenas ligera y pesada de inmunoglobulina humana. La persona experta sabrá como hacer la dosis y administrar tales composiciones anticuerpo. Alternativamente, una versión soluble del receptor de grelina puede ser inyectada, resultando en un enlace efectivo en la corriente sanguínea a grelina. Sin embargo, como se mencionó, la modalidad preferida ocasiona la inmunización activa contra grelina. Se prefiere que el péptido de grelina usado como un inmunógeno en el método de la invención, sea una molécula modificada en donde al menos un cambio está presente en la secuencia de aminoácido de polipéptido de grelina, puesto que las oportunidades de obtener el rompimiento completo importante de la auto-tolerancia hacia la grelina son mayormente facilitadas de tal forma. Se debe notar que esto no excluye la posibilidad de usar tal grelina modificada en formulaciones las cuales además, facilitan el rompimiento de la auto-tolerancia contra grelina, por ejemplo, formulaciones qué contienen ci-ertos adyuvantes, discutidas en detalle abaj o . Se ha mostrado (en Dalüm I et al., G996, J. Immunol . 157: 4796-4804) que los ünfocitos B potencialmente auto-reactivos reconocen píoteina mismas, están fisiológicamente presentes en individuos normales. Sin embargo, para que estos linfocitos B sean inducidos para producir actualmente anti-cuerpos reactivos con las proteina mismas relevantes, se necesita asistencia de citocinas que producen linfocitos T-auxiliadores (células TH o linfocitos TH) . Normalmente, esta ayuda no se proporciona debido a que los linfocitos T en general no reconocen epitopes de células T derivadas de proteína mismas cuando se presentan por células que presentan antígenos (APCs) . Sin embargo, proporcionando un elemento "extraño" en una proteína misma (es decir, introduciendo una modificación inmunológicamente significante) , las células T que reconocen el elemento extraño son activadas después de reconocer el epitope extraño en un APC (tal como, inicialmente una célula mononuclear) . Los linfocitos B policlonales (los cuales son también APC especializados) capaces de reconocer auto-epitopes en la proteína misma modificada, también internalizan el antígeno y subsecuentemente presentan el (los) epitope(s) de células T extrañas de los mismo, y los linfocitos T activados subsecuentemente proporcionan citocinas que ayudan a estos linfocitos B policlonales auto-reactivos. Puesto que los anticuerpos producidos por estos linfocitos B policlonales son reactivos con epitopes diferentes en el polipéptido modificado, incluyen aquellos los cuales están también presentes en el polipéptido nativo, y se inducen anticuerpos reactivos reticulados con la proteína misma no modificada. En conclusión, los linfocitos pueden conducir a actuar como si la población de linfocitos B policlonales ha reconocido un antígeno completamente extraño, mientras en efecto solamente el (los) epitope (s) insertados es/están extraños al hospedero. En esta forma, se inducen los anticuerpos capaces de reaccionar reticulado con antígenos mismos no modificados. Varias formas' de modificar un antígeno mismo de péptido para obtener rompimiento de auto-tolerancia se conocen en la técnica. Por lo tanto, de conformidad con la invención, la modificación puede incluir aquella que - al menos un epitope de células T ajeno es introducido, y/o - al menos una primera porción es introducida la cual efectúa el objetivo de la molécula modificada a una célula que presenta antigeno (APC) , y/o - al menos una segunda porción es introducida la cual estimula el sistema inmune y/o - al menos una tercera porción es introducida la cual optimiza la presentación del polipéptido de grelina modificado al sistema inmune. Sin embargo, todas estas modificaciones deben ser llevadas a cabo mientras se mantiene una fracción substancial de los epitopes de linfocitos B originales en grelina, puesto que el reconocimiento de linfocitos B de la molécula nativa está con ello incrementado. En una modalidad preferida, grupos laterales (en la forma de epitopes de células T extrañas o la primera, segunda y tercera porciones mencionadas anteriormente) , son covalentemente y no covalentemente introducidos. Esto está propuesto por significar que el alargamiento de residuos de aminoácido derivados de grelina son derivatizados sin alterar la secuencia de aminoácido primaria, o al menos sin introducir cambios en los enlaces peptidicos entre los aminoácidos individuales en la cadena. Una modalidad alternativa, y preferida, utiliza substitución y/o supresión y/o inserción y/o adición de aminoácido (la cual puede ser efectuada por medios recombinantes o por medio de síntesis peptídica; modificaciones las cuales involucran alargamientos más grandes de aminoácidos pueden dar origen a polipéptidos de fusión) . Una versión especialmente preferida de esta modalidad es la técnica descrita en el documento WO 95/05849, la cual describe un método para inmunizar contra las proteina mismas mediante inmunización con análogos de las proteina mismas, en donde un número de secuencia (s) de aminoácido ha sido sustituida con un número correspondiente de secuencia (s) de aminoácido, las cuales comprenden cada una un epitope de células T inmunodominantes extrañas, mientras al mismo tiempo se mantiene la estructura 3 dimensional total de la proteina misma en el análogo. Para propósitos de la presente invención, es sin embargo suficiente si la modificación (sea una inserción, adición, supresión o sustitución de aminoácido) da origen a un epitope de células T extrañas y al mismo tiempo preserva un número substancial de epitopes de células B en grelina. Sin embargo, para obtener máxima eficacia de la respuesta inmune inducida, se prefiere que la estructura terciaria total de la grelina se mantenga en la molécula modificada. La siguiente fórmula describe los constructos de grelina cubiertos de manera general por la invención: La siguiente fórmula describe los constructos moleculares cubiertos de manera general por la invención: (MODi)5l(ghrel)rtl(MOD2)E2(ghre2)n2....(MODx)sx(ghrei£)nx (I) - en donde ghei-ghrex son x epitopes de células B que contienen substancias de un polipéptido de grelina,- los cuales son independientemente idénticos o no idénticos y los cuales pueden contener o no contener ' grupos laterales extraños, x es un número entero > 3, nl-nx son x números enteros > 0 (al menos uno es > 1) , MODi~MODx son modificaciones introducidas entre los epitopes de células B preservadas, y si-sx son x número enteros > 0 (al menos uno es > 1 si no se introducen grupos laterales en las secuencias ghrex) . De este modo, dada las retenciones funcionales generales en la inmunogenidad de1 los constructos, la invención se permite para todas las clases de permutaciones de la secuencia original del polipéptido de grelina, y todas las clases de modificaciones aquí. De este modo, incluidos en la invención están polipéptidos de grelina modificados obtenidos por omisión de partes de la secuencia del polipéptido de grelina, los cuales por ejemplo, presentan efectos adversos in vivo y de este modo podrían dar origen a reacciones inmunológicas indeséadas. Una modalidad preferida de la invención utiliza múltiples presentaciones de epitopes de linfocitos B del polipéptido de grelina (es decir, la fórmula I en donde al menos un epitope de células B está presente en las dos posiciones) . Este efecto puede lograrse en varias formas, por ejemplo, preparando simplemente los polipéptidos de fusión que comprenden la estructura (polipéptido de grelina) m, en donde m es un número entero > 2 y después introducir las modificaciones discutidas aquí en al menos una de las secuencias de grelina. Se prefiere que las modificaciones introducidas incluyan al menos, una duplicación de un epitope de linfocitos B y/o la introducción de un hapteno. Estas modalidades que incluyen presentaciones múltiples de epitopes seleccionados son especialmente preferidas en situaciones en donde partes meramente menores del polipéptido de grelina son empleadas como constituyentes en un agente de vacuna. Como se mencionó anteriormente, la introducción de un epitope de células T extraño puede estar acompañada por introducción de al menos una inserción, adición, supresión o sustitución de aminoácido. Por supuesto, la situación normal será la introducción de más de un cambio en la secuencia de aminoácido (por ejemplo, inserción de o substitución por un epitope de células T completas) , pero la ineta importante a alcanzar es que el análogo, cuando se procesa por una célula que presenta antigeno (APC) , dará origen a tal epitope de células G inmunodominante extraño siendo presentado en el contexto de una molécula MCH de Clase II en la superficie del APC. De este modo, si la secuencia de aminoácido del polipéptido grelina . en posiciones apropiadas comprende un número de residuos de aminoácido los cuales pueden también ser encontrados en un epitope TH extraño, entonces la introducción de un epitope TH extraño püede acompañarse proporcionando los aminoácidos restantes del epitope extraño por medio de la inserción, adición, supresión y substitución de aminoácido. En otras palabras, no es necesario introducir un epitope TH completo por inserción o sustitución para cumplir completamente el propósito de la presente invención. Se prefiere que el número de inserciones, supresiones, substituciones o adiciones de aminoácido sea al menos 2, tal como 3, 4, 5, 6, 7, Q> 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 y 25 inserciones, substituciones, adiciones o supresiones. Además se prefiere que el número de inserciones, substituciones, adiciones o supresiones de aminoácido no exceda de 15Ó, de manera tal a lo sumo 10Ó, a lo sumo 90, a lo sumo 80 y a lo sumo 70. Es especialmente preferido que el número de substituciones, inserciones, supresiones o adiciones no exceda 60, y en particular el número no debe exceder 50 o aún 40. Más preferido es un número de no más de 30. Con respecto a las adiciones de aminoácido, se debe notar que estas, cuando el constructo resultante está en la forma de un polipéptido de fusión, es a menudo considerablemente superior que 150. Modalidades preferidas de la invención incluyen modificación introduciendo al menos un epitope de células T inmunodominante extraño. Se entenderá que la cuestión de la dominancia inmune de un epitope de células T depende de las especies animales en cuestión. Como se usa aquí, el término "inmunodominancía"' se refiere simplemente a epitopes los cuales en los individuos/población vacunada dan origen a una respuesta inmune significante, pero es un hecho bien conocido que un epitope de células T el cual es inmunodominante en un individuo/población, no es necesariamente inmunodominante en otro individuo de la misma especie, aún a pesar de que puede ser capaz de enlazar moléculas MHC-II en el último individuo. Por lo tanto, para los propósitos de la presente invención, un epitope de células T inmunodominante es un epitope de células T el cual será efectivo en proporcionar ayuda a las células T cuando se presenta en un antígeno. Típicamente, los epitopes de células T inmunodominantes tienen una característica inherente que estarán substancialmente siempre presentes unidos a una molécula MHC de Clase II, irrespectivo del polipéptido en donde aparezca. Otro punto importante es la emisión de la restricción de MHC de los epitopes de células T. En general, 'los epitopes de células T que se originan naturalmente son restringidos en MHC, es decir, ciertos péptidos que constituyen un epitope de células T solamente serán enlazados efectivamente a una subserie de moléculas MHC de Clase II. Esto en cambio, tiene el efecto que en muchos casos, el uso de un epitope de células T específico resultará en un componente de vacuna el cual es solamente efectivo en una fracción de la población, y dependiendo del tamaño de tal fracción, puede ser necesario incluir más epitopes de células T en la misma molécula, o alternativamente, preparar una vacuna de componente múltiple en donde los componentes son variantes del polipéptido de grelina las cuales se distinguen entre si por la naturaleza del epitope de células T introducido. Si la restricción MHC de las células T usada es completamente desconocida (por ejemplo, en una situación en donde el animal vacunado tiene una composición MHC escasamente definida) , la fracción de la población cubierta por una composición de vacuna especifica puede ser determinada por medio de la siguiente fórmula - en donde pi es la frecuencia en la población de respondedores al epitope de células T extrañas ±tb presentes en la composición de vacuna, y n es el número total de epitopes de células T extrañas en la composición de vacuna. De este modo, una composición de vacuna que contiene 3 epitopes de células T extrañas que tienen frecuencias de respuesta en la población de 0.8, 0.7 y 0.6, respectivamente, podrían dar - es decir, 97.6 por ciento de la población estadísticamente montará una respuesta mediada por MHC-II a la vacuna. La fórmula anterior no aplica en situaciones en donde se conoce un patrón de restricción de MHC más o menos preciso de los péptidos usados. Si, por ejemplo, cierto péptido solamente enlaza las moléculas MHC-II humanas codificadas por los alelos de HLA-DR DR1, DR3, DR5 y DR7, entonces el uso de este péptido junto con otro péptido el cual se enlaza a las moléculas MHC-II restantes codificadas por los alelos HLA-DR acompañará 100% de cobertura en la población en cuestión. Del mismo modo, si el segundo péptido solamente enlaza DR3 y DR5, la adición de este péptido no incrementará la cobertura en todos. Si uno basa el cálculo de respuesta de población meramente en restricción de MHC de los epitopes de células T en la vacuna, la fracción de la población cubierta por una composición de vacuna específica puede ser determinada por medio de la siguiente fórmula: - en donde <¾- es la suma de frecuencias en la población de haplotipos alélicos que codifican moléculas MHC las cuales se enlazan a cualquiera de los epitopes de células T en la vacuna y las cuales pertenecen al j"1 del sitio 3 HLA conocido (DP, DR y DQ} ; en la práctica, se determina primero cual molécula MHC reconocerá cada uno de los epitopes de células T en la vacuna y posteriormente estas son listadas por el tipo (DP, DR y DQ)- entonces, las frecuencias individuales de loá diferentes haplotipos alélicos listados son resumidas por cada tipo, con ello proporcionando f%, ??? y Puede ocurrir que el valor p± en la fórmula II exceda el valor teórico correspondiente ¾: - en donde Uj es la suma de frecuencias en la población de aplotipo alélico que codifica moléculas MHC las cuales se enlazan al epitope de células T ith en la vacua y las cuales pertenecen al 0th del sitio 3 HLA conocido (DP, DR y DQ) . Esto significa que en de la población es una frecuencia de respondedores de fresiduai_i = (??_¾ ) / (l-ni) . Por lo tanto, la fórmula III puede ser ajustada para proporcionar la fórmula V: - en donde el término 1-iresiduai-í se fija a cero si es negativo. Se debe notar que la fórmula V requiere que todos los epitopes hayan sido haplotipos mapeados contra series idénticas de haplotipos.

Por lo tanto, cuando se seleccionan los epitopes de células T a ser introducidas en los análogos, es importante incluir todos los conocimientos de los epitopes los cuales son disponibles: 1) La frecuencia de respondedores en la población a cada epitope, 2) datos de restricción de MHC, y 3) frecuencia en la población de los haplotipos relevantes. Existe un número de epitopes de células T "promiscuos" que se originan naturalmente, las cuales son activas en una gran proporción de individuos de una especie animal o una población animal y estos son preferiblemente introducidos en la vacuna reduciendo con ello la necesidad para un numeró muy grande de análogos diferentes en la misma vacuna . El epitope promiscuo puede de conformidad con la invención, ser un epitope de célula T que se origina naturalmente tal como epitopes desde tetanus toxoide (por ejemplo, los epitopes P2 y P3) , difteria toxoide, hemaglutinina del virus de influenza (??) r y antigeno CS de P. falciparum CS . Durante los años un número de otros epitopes de células T promiscuas han sido modificados. Péptidos especialmente capaces de enlazar una gran proporción de moléculas. HLA-DR codificadas por los diferentes alelos HL2-DR han sido identificados y estos son todos epitopes de células T posibles a ser introducidos en los análogos usados de conformidad con la presente invención. Cotéjese, también, los epitopes discutidos en las siguientes referencias, las cuales están con ello todas incorporadas por referencia aquí: documento WO 98/23635 (Frazer IH et al., asignado' a la University of Queensland) ; Southwood S et al., 1998, J Immunol. 160: 3363-3373; Sinigaglia F et aJ 1988, Nature 336: 778-780; Chicz RM et al., 1993, J. Exp. Med 178: 27-47; Hammer J et al., 1993, Cell 74: 197-203; y Falk K et al., 1994, Immunogenetics 39: 230-242. La última referencia también trata de ligandos HLA-DQ y -DP, Todos los epitopes listados en estás 5 referencias son relevantes como epitopes naturales candidatos a ser usados en la presente invención, son epitopes los cuales portan porciones comunes con estos . Alternativamente, el epitope puede ser cualquier epitope de células T artificial, el cual es capaz de enlazar una gran proporción de moléculas MHC dé Clase II . En este contexto los péptidos de epitopes pan DR ("PADRE ) descritos en el documento WO 95/07707 y en el documento correspondiente de Alexander J et al., 1994, Immunity 1: 751-761 (ambas descripciones están incorporadas aquí por referencia) son candidatos interesantes para epitopes a ser usados de conformidad con la presente invención. Se debe notar que los péptidos PADRE más efectivos descritos en estos documentos portan D-aminoácidos en el C y N-término para mejorar la estabilidad cuando se administran. Sin embargo, la presente invención principalmente se dirige a incorporar los epitopes relevantes como parte del polipéptido grelina modificado,- el cual debe entonces ser subsecuentemente roto enzimáticamente dentro del compartimiento lisosomal de APC, para permitir la presentación subsecuente en el contexto de una molécula MHC-II y por lo tanto, no es conveniente incorporar D-aminoácidos en los epitopes usados en la presente invención. Un péptido PADRE especialmente preferido es uno que tiene la secuencia de aminoácido AKFVAAWTLKAAA o una subsecuencia inmunológicamente efectiva del mismo. Estos y otros epitopes que tienen la misma carencia de restricción MHC son epitopes de células T preferidos, los cuales deben estar presentes en los análogos usados en el método inventivo. Tales epitopes super-promiscuos se permitirán para las modalidades más simples de la invención, en donde solamente un polipéptido de grelina único modificado es presentado al sistema inmune del animal vacunado . Como se mencionó anteriormente, la modificación del polipéptido de grelina puede también incluir la introducción de una primera porción la cual se dirige al polipéptido de grelina modificado a un linfocito B o APC. Por ejemplo, la primera porción puede ser un patrón de enlace específico para un antígeno de superficie específico del linfocito B o para un antígeno de superficie específico de APC. Muchos de tales antígenos específicos de la superficie son conocidos en la técnica. Por ejemplo, la porción puede ser un carbohidrato por el cual existe un receptor en el linfocito B o el APC (por ejemplo, manan o ma osa) . Alternativamente, la segunda porción puede ser un hapteno. También un fragmento anticuerpo el cual específicamente reconoce una molécula de superficie en APC o linfocitos puede ser usado como una primer porción (la molécula de superficie puede por ejemplo, ser un receptor FCy o macrófagos y monocitos, tales como FCyRI o, alternativamente cualquier otro marcador de superficie específico tal como CD40 o CTLA-4) . Se debe notar que todas estas moléculas ejemplares objetivo pueden ser usadas como parte de un adyuvante también, cotéjese, abajo. Como una alternativa o suplemento para dirigir el polipéptido de grelina modificado a un cierto tipo celular para lograr una respuesta inmune mejorada, es posible incrementar el nivel de responsabilidad del sistema ' inmune incluyendo la segunda porción mencionada anteriormente, la cual estimula el sistema inmune. Ejemplos típicos de tales segundas porciones son citocinas, y proteínas de golpe por calor o chaperonas moleculares, así como también partes efectivas de los mismos . Las citocinas adecuadas a ser usadas de conformidad con la invención, son aquellas las cuales normalmente también funcionan como adyuvantes en una composición de vacuna, es decir, por e emplo, interferona ? (iFN-y) , interleucina 1 (IL-i), interleucína 2 (IL-2), interíeucina 4 (IL-4) , interleucina 6 (IL-6) , interíeucina 12 (IL-12) , interíeucina 13 (IL-13), interíeucina 15 (IL-15) y factor de estimulación de colonias de macrófago del granulocito (GM-CSF) ; alternativamente, la parte funcional de la molécula de citocina puede ser suficiente como la segunda porción. Con respecto al uso de tales citocinas como substancias adyuvantes, cotéjese la discusión abajo. De conformidad con la invención, las proteínas de golpe por calor adecuadas o chapetonas moleculares usadas como la segunda porción, pueden ser HSP70 (proteína 70 de golpe por calor) , HSP90 (proteína 90 de golpe por calor) , HSC70 (proteína 70 cognada de golpe por calor) , GRP94 (también conocida como gp96, cotéjese Wearsch PA et al. 1998, Biochemistry 37: 5709-19), y CRT (calreticulina) . Alternativamente, la segunda porción puede ser una toxina, tal como listeriolicina (LLO) , lípido A y enterotoxina estable en calor. También un número de derivados .micobacterianos tales como MDP (dipéptido rauramilo), CEA (adyuvante completo Freund) y los diésteres de trehalosa TDM y TDE son posibilidades interesantes. También la posibilidad para introducir una tercera porción la cual mejora la presentación del polipéptido de grelina modificado al sistema inmune es una modalidad importante de la invención. La técnica ha mostrado varios ejemplos de este principio. Por ejemplo, se sabe que el anclaje de lipidación de palmitoilo en la proteina OspA de Borrelia burgdorferi puede ser utilizado para proporcionar polipéptidos auto-adyuvantes (cotéjese, por ejemplo, documento WO 96/40718) - parece que las proteínas lipidadas forman hasta estructuras similares a micelios con un núcleo que consiste de las partes de anclaje de lipidación de los polipéptidos y las partes restantes de la molécula sobresalientes desde ahí, resultando en presentaciones múltiples de las determinantes antigénicos. Por lo tanto, el uso de este y procedimientos relacionados usando diferentes anclajes de lipidación (por ejemplo, un grupo miristilo, un grupo miristilo, un grupo farnesilo, un grupo geranilo-gerañilo, un anclaje CPI, y un grupo N-acil diglicérido) , son modalidades preferidas de la invención, especialmente puesto que la provisión de tal anclaje de lipidación en una proteína recombinantemente producida es bastante directo y meramente requiere el uso de por ejemplo, una secuencia señal que se origina naturalmente como un patrón de fusión para el polipéptido de grelina modificado. Otra posibilidad es el uso del fragmento C3d del factor complemento C3 o C3 mismo (cotéjese, Dempsey et al., 1996, Science 271, 348-350 y Lou & ohler, 1998, Wature Biotechnology 16, .458-462) . Otra forma atractiva de presentar copias múltiples de regiones epitópicas es la tecnología descrita en el documento WO 00/32227, en donde los antígenos están presentados en patrones repetitivos, en orden, con ello dando origen a inmunógenos independientes de células T que parecen cápsidos de virus. En el contexto de la presente invención, la tecnología de WO 00/32227 es considerada como aplicación de un adyuvante especializado. La descripción del documento WO 00/32227 está con ello incorporada por referencia aquí, üna modalidad alternativa de la invención la cual también resulta en la presentación preferida de copias múltiples (por ejemplo, al menos 2) de las regiones epitópicas importantes del polipéptido grelina al sistema inmune, es el acoplamiento covalente de poliaminoácidos seleccionados del polipéptido grelina, la subsecuencia de los mismos, o los análogos de los mismos a ciertas moléculas y, cuando es necesario, junto con los epitopes TH extraños o una de las primera, segunda o tercera porciones discutidas anteriormente. Por ejemplo, pueden ser usados polímeros por ejemplo, polihidroxipolímeros, notablemente carbohidratos tales como dextrano, cotéjese, por ejemplo, Lees ? et al., 1994, Vaccine 12: 1160-1166; Lees A et al., 1990, J Immunol. 145: 3594-3600, pero también ma osa y mañano son alternativas útiles. Las proteínas de membrana integral de por ejemplo, E. coli y otras bacterias son también .patrones de conjugación empleados. Las moléculas portadoras tradicionales tales como hemocianina de keyhole limpet (KLH) , tetanus toxoide, difteria toxoide, y albúmina de suero bovino (BSA) son también patrones de conjugación empleados y preferidos. Modalidades preferidas del acoplamiento covalente del polipéptido grelina a polihidroxipolimeros farmacéuticamente aceptables tales como carbohidratos, involucran el uso de al menos un polipéptido de grelina y al menos un epitope T auxiliador extraño, los cuales están acoplados de manera separada al polihidroxipolimero (es decir, el epitope T auxiliador extraño y el polipéptido grelina no. son fusionados entre si, sino unidos al polihidroxipolimero el cual entonces sirve como una estructura portadora) . Nuevamente, tal modalidad es la más preferida cuando el epitope de células B adecuadas que porta regiones del polipéptido grelina es constituido por alargamientos de péptidos cortos'- esto es debido a que este procedimiento es una forma muy conveniente para lograr las múltiples presentaciones de epitopes seleccionados en el agente inmunogénico resultante. Es especialmente preferido que el acoplamiento de los poliaminoácidos al polihidroxipolimero sea por medio de un enlace amida el cual puede ser -desdoblado por una peptidasa. Esta estrategia tiene el efecto que el APC será capaz de tomar el conjugado y al mismo tiempo, ser capaz de procesar el conjugado y subsecuentemente presentar el epitope de células T extraño en un contexto de MHC de Clase II. Una forma para lograr el acoplamiento de péptidos (tanto el polipéptído de grelina de interés, asi como también el epitope extraño) es activar un polihidroxipolimero adecuado con grupos tresilo (trifluoroetil-sulfonilo) u otros grupos de activación adecuados tales como maleimido, p-Nitrofenil cloroformiato (para activación de grupos OH y formación de un enlace peptidico entre el péptido y el polihidroxipolimero), y tosilo (p-toluensulfonilo) . Es posible sin embargo, preparar polisacáridos activados como se describe en el documento WO 00/05316 y US 5,874,469 (ambos incorporados por referencia aqui) y acoplar estos a péptidos grelina y epitopes de células T preparados por medio de técnicas convencionales de sintesis de péptido de fase sólida o liquida. El producto resultante consiste de una estructura de polihidroxipolimero (por ejemplo, una estructura dextrano) que tiene, unida a esto por su N-término o por otras porciones de nitrógeno disponibles, los polip ptidos de grelina y epitopes de células T extrañas. Si se desea, es posible sintetizar los polipéptidos de grelina para proteger todos los grupos aminos disponibles, pero uno al N-término, subsecuentemente acopla los polipéptidos protegidos resultantes a la porción de dextrano tresilada, y finalmente des-proteger el conjugado resultante, ün ejemplo especifico de este procedimiento se describe en los ejemplos abajo. En lugar de usar las moléculas de polisacáridos solubles en agua como se muestra en el documento WO 00/05316 y US 5,874,469, es igualmente posible utilizar moléculas de polisacáridos reticuladas, con ello, se obtiene un conjugado particulado entre polipéptidos . y polisacáridos -esto se cree conduce a una presentación mejorada al sistema inmune de los polipéptidos, puesto que se alcanzan dos metas, es decir, obtener un efecto de depósito local cuando se inyecta el conjugado y obtener partículas las cuales son objetivos atractivos para APCs. El procedimiento para usar tales sistemas particulados es también detallado en los ejemplos. Consideraciones fundamentales que eligen áreas para introducir modificaciones en los polipéptidos de grelina son a) preservación de epitopes de células B conocidas y predichas, b) preservación de la estructura 3D, c) evitar los epitopes de células B presentes en "células productoras"', etc. En cualquier relación, como se discutió anteriormente, es bastante fácil seleccionar una serie de moléculas de grélina modificadas las cüales han sido todas sometidas a la introducción de un epitope de células T en diferentes ubicaciones . La vacunación dirigida tanto a la forma madura de grelina como a la forma de propéptido, puede ser contemplada, y ambas formas están disponibles para ocasionar desventajas distintas. Dirigiendo el polipéptido debe ser posible interferir con el proceso enzimático que conduce a la formación de grelina madura. Si el inmunógeno usado incluye epitopes de células ?3 de tanto grelina madura como de progreliha, entonces los anticuerpos formados podrían tener la máxima capacidad para la regulación descendente de la grelina madura: No solamente podría ser posible neutralizar la grelina madura, sino también su formación podría ser reducida puesto que el procesamiento enzimático podría ser inhibido debido a los anticuerpos fuertemente enlazantes que podrían "enmascarar" el sitio desdoblado y otros sitios importantes para que el desdoblamiento enzimático tome lugar. Si, por otro lado, fuera deseado reducir el nivel de grelina madura a una extensión menor, entonces podría ser preferible vacunar contra la parte del polipéptido que no incluye cantidades substanciales de la grelina madura. Haciendo esto, la grelina madura no podría estar unida por anticuerpos, pero solamente la formación de la grelina madura podría ser reducida. Finalmente, si fueron solamente de interés al objetivo de la molécula madura (la cual tiene muy poca identidad de secuencia con cualquier no grelina conocida) , entonces el inmunogeno debe incluir predominantemente epitopes de células B a partir de la grelina madura. - Puesto que las modalidades más preferidas de la presente invención involucran inmunización contra la grelina humana, es consecuentemente preferido que el polipéptido de grelina discutido anteriormente sea un polipéptido de grelina humano - sin embargo, cualquier discusión abajo de la grelina humana podría ser usada para la grelina de otras especies, notablemente aquellas listadas en el listado de secuencia de esta solicitud. Se entenderá entonces que las muestras relacionadas con cambios en la secuencia humana deben ser transpuestas a la secuencia relevante en el animal relevante: Del listado de secuencia aparece en donde se pueden encontrar los límites para la secuencia peptídica de grelina madura, y se entenderá que cualquiera de los datos de secuencia específica referidos en la secuencia humana deban ser tomados - equivalentes en las secuencias correspondientes en las varias secuencias de grelina de mamífero. En las modalidades que se refieren a grelina humana, es especialmente preferido que el polipépt-ido de grelina humana haya sido modificado substituyendo al menos una secuencia de aminoácido en la SEC ID NO: 11, con al menos una secuencia de aminoácido de igual o diferente longitud y que contiene un epitope ¾ extraño. Alternativamente, el epitope TH extraño puede simplemente ser insertado en la SEC ID NO: 11. Más específicamente, un TH que contiene (o completa) secuencia de aminoácido la cual se introduce en la SEC ID NO: 11, puede ser introducido en cualquier aminoácido en la SEC ID NO: 11. Esto es, la introducción es posible después de cualquiera de los aminoácidos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102 , 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, y 117 en la SEC ID NO: 11, y, en el caso de una adición, también antes del aminoácido 1. Esto se puede acompañar por la supresión de aminoácido ( s ) 1 y/o 2 y/o 3 y/o 4 y/o 5 y/o 6 y/o 7 y/u 8 y/o 9 y/o 10 y/o 11 y/o 12 y/o 13 y/o 14 y/o 15 y/o 16 y/o 17 y/o 18 y/o 19 y/o 20 y/o 21 y/o 22 y/o 23 y/o 24 y/o 25 y/o 26 y/o 27 y/o 28 y/o 29 y/o 30 y/o 31 y/o 32 y/o. 33 y/o 34 y/o 35 y/o 36 y/o 37 y/o 38 y/o 39 y/o 40 y/o 41 y/o 42 y/o 43 y/o 44 y/o 45 y/o 46 y/o 47 y/o 48 y/o 49 y/o 50 y/o 51 y/o 52 y/o 53 y/o 54 y/o 55 y/o 56 y/o 57 y/O 58 y/o 59 y/o 60 y/o 61 y/o 62 y/o 63 y/o 64 y/o 65 y/o 66 y/o 67 y/o 68 y/o 69 y/o 70 y/o 71 y/o 72 y/o 73 y/o 74 y/o 75 y/o 76 y/o 77 y/o 78 y/o 79 y/u 80 y/u 81 y/u 82 y/u 83 y/u 84 y/u 85 y/u 86 y/u 87 y/u 88 y/u 89 y/u 90 y/o 91 y/o 92 y/o 93 y/o 94 y/o 95 y/o 96 y/o 97 y/o 98 y/o 99 y/o 100 y/o 101 y/o 102 y/o 103 y/o 104 y/o 105 y/o 106 y/o 107 y/o 108 y/o 109 y/o 110 y/o 111 y/o 112 y/o 113 y/o 114 y/o 115 y/o 116 y/o 117 en la SEC ID NO: 11. Sin embargo, puesto que no se espera que la inmunización contra la forma pre-propéptido de grelina podría ser de cualquier relevancia comparada con la . inmunización contra el polipéptido, se prefiere que la introducción se preforme después de cualquiera de los aminoácidos 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, y 117 en la SEC ID NO: 11 (puesto que el aminoácido 23 es el último aminoácido en la secuencia señal en grelina humana, de manera que la introducción se realiza en la región propéptido de la molécula grelina) y que substancialmente no es parte los aminoácidos de la secuencia señal del inmunógeno. En modalidades en donde se desea dirigir el polipéptido completo, cotéjese anteriormente, se prefiere evitar la destrucción de epitopes de células B en progrelina - por lo tanto, la introducción de epitopes TH extraños debe en esta modalidad, ser acompañada sin o solamente supresiones muy limitadas (supresiones que no destruyen los epitopes de células E) de cualquiera de los aminoácidos 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, y 117 en la SEC ID NO: 11. Si, por otro lado, sé desea proporcionar una grelina "inmunogenizada que no incluya la secuencia de grelina madura, cotéjese anteriormente, la introducción preferiblemente incluirá supresión de un número substancial de aminoácidos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, '39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, y 51 en la SEC ID NO:ll. Consecuentemente, se prefiere que . solamente supresiones/substituciones no destructivas (es decir, conservación de ép'itope de células B) ) se hagan entre los aminoácidos 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, ' 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 1Ú9, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, y 117 en la SEC ID NO: 11. En esta modalidad es más preferido que todos los aminoácidos 1-51 sean suprimidos . Finalmente, si se desea proporcionar una variante de grelina que no incluya algún epitope de células B de la parte de progrelina que no forma parte de la molécula madura, entonces la introducción del epitope TH extraño debe ser acompañada por la supresión de un número substancial de aminoácidos 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114,115, 116, y 117 en la ¦ SEC ID NO: 11. Consecuentemente, se prefiere que solamente supresiones/substituciones no destructivas (es decir, conservación del epitope de células B) ) se hagan entre los aminoácidos 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, y 51 en la SEC ID NO: 11. Es en esta modalidad más preferida que todos los aminoácidos 52-117 son suprimidos. Otra modalidad de la presente invención es la presentación de análogos de grelina los cuales no incluyen cualquier subsecuencia de grelina que se enlaza productivamente a las moléculas MHC de Clase II, que inician una respuesta a las células T. Lo racional de tras de tal estrategia para diseñar el inmunógeno que se acopla al sistema inmune para inducir una respuesta inmune anti-grelina es lo siguiente: Se ha notado que cuando se inmuniza con proteínas autólogas formuladas en un adyuvante el cual es suficientemente fuerte para romper la tolerancia del cuerpo hacia la proteina autóloga, existe un peligro de que en algunos individuos vacunados, la respuesta inmune inducida no pueda ser descontinuada simplemente descontinuando la inmunización. Esto es debido a que la respuesta inmune inducida en tales individuos es más probablemente accionada por un epitope TH nativo de la proteína autóloga, y esto tiene el efecto adverso que la proteina propia del individuo vacunado será capaz de funcionar como un agente inmunizante en su derecho propio: Una condición autoinmune ha sido de este modo establecida. Los métodos preferidos incluyen uso de epitopes TH extraños que tienen lo mejor del conocimiento del inventor nunca han sido observados para producir este efecto, debido a que la respuesta anti-auto inmune es accionada por un epitope TH extraño, y ha sido repetidamente demostrado por los inventores que la respuesta inmune inducida invocada por la tecnología preferida sin embargo, declina después de la descontinuación de inmunizaciones. Sin embargo, en teoría podría ocurrir en unos cuantos individuos que la respuesta inmune podría también ser accionada por un epitope TH autólogo de la proteína misma relevante inmunizada contra uno) , esto es especialmente relevante cuando se consideran proteína mismas que son relativamente abundantes, mientras otras proteína mismas terapéuticamente relevantes son solamente actualmente presentes o en tales cantidades bajas en el cuerpo, que un "efecto de auto-inmunización"' no es una posibilidad; sin embargo, para grelina este efecto no puede ser excluido. Una forma muy simple de evitar esta auto-inmunización es por lo tanto, evitar en conjunto la inclusión en el inmunógeno de las secuencias peptidicas que podrían servir como epitopes TH (y puesto que los péptidos más cortos de aproximadamente 9 aminoácidos no pueden servir como epitopes TH, el uso de fragmentos más cortos es un procedimiento simple y factible) . Por lo tanto, esta modalidad de la invención también sirve para asegurar que el inmunógeno no incluye secuencias peptidicas de la grelina objetivo que podrían servir como "auto-estimulación de epitopes TH") , incluyendo secuencias que meramente contienen substituciones conservativas en una secuencia dé la proteína objetivo que podría de otro modo, funcionar como un epitope TH. Modalidades preferidas de la presentación de sistema inmune de los análogos de grelina · involucran el uso de un péptido quimérico que comprende al menos un péptido derivado de grelina, el cual no se enlaza productivamente a moléculas MHC de clase II, y al menos un epitope T-auxiliador extraño. Sin embargo, se prefiere que el péptido derivado de grelina albergue epitopes de células B. Es especialmente ventajoso si el análogo inmunogénico es uno, en donde las secuencias de amino ácido que comprenden uno o más epitopes de célula B sean representadas ya sea como una secuencia continua, o como una secuencia que incluye insertos, en donde los insertos comprenden epitopes T auxiliadores extraños. Nuevamente, tal modalidad es más preferida cuando el epitope de células B adecuado que porta regiones de grelina está constituido por alargamientos de péptidos cortos que en ninguna forma podrían ser capaces de enlazarse productivamente a una molécula MHC de clase II. El epitope de célula B seleccionado o epitopes de grelina seleccionados debe por lo tanto, comprender al menos 9 amino ácidos consecutivos de grelina de un animal relevante, esto es, al menos 9 amino ácidos consecutivos en por ejemplo, la SEC ID ÑO: 9, 10, 11, 12, 13 ó 14. Sé prefieren péptidos más cortos, tales como aquellos que tienen al menos 8, 7, 6, 5, 4 ó 3 amino ácidos consecutivos de la secuencia de amino ácido de grelina. Se prefiere que el análogo comprenda al menos una subsecuencia de la SEC ID NO: 9, 10, 11, 12, 13 ó 14 de manera, que cada una de al menos una subsecuencia indepéndientemente consiste de aminó ácidos alargados de grelina seleccionados del grupo que consiste de 9 amino ácidos consecutivos, 8 amino ácido consecutivos, 7 amino ácidos consecutivos, 6 aminó ácidos consecutivos, 5 amino ácidos consecutivos, 4 amino ácidos consecutivos y 3 amino ácidos consecutivos. Es especialmente preferido que los amino ácidos consecutivos comiencen en un residuo de amino ácido seleccionado del grupo que consiste de residuo 1 y/o 2 y/o 3 y/o 4 y/o 5 y/o 6 y/o 7 y/o 8 y/o 9 y/o 10 y/o 11 y/o 12 y/o 13 y/o 14 y/o 15 y/o 16 y/o 17 y/o 18 y/o 19 y/o 20 y/o 21 y/o 22 y/o 23 y/o 24 y/o 25 y/o 26 y/o 27 y/o 28 y/o 29 y/o 30 y/o 31 y/o 32 y/o 33 y/o 34 y/o 35 y/o 36 y/o 37 y/o 38 y/o 39 y/o 40 y/o 41 y/o 42 y/o 43 y/o 44 y/o 45 y/o 46 y/o 47 y/o 48 y/o 49 y/o 50 y/o 5.1 y/o 52 y/o 53 y/o 54 y/o 55 y/o 56 y/o 57 y/o 58 y/o 59- y/o 60 y/o 61 y/o 62 y/o 63 y/o 64 y/o 65 y/o 66 y/o 67 y/o 68 y/o 69 y/o 70 y/o 71 y/o 72 y/o 73 y/o 74 y/o 75 y/o 76 y/o 77 y/o 78 y/o 79 y/o 80 y/o 81 y/o 82 y/o 83 y/o 84 y/o 85 y/o 86 y/o 87 y/o 88 y/o 89 y/o 90 y/O 91 y/o 92 y/o 93 y/o 94 y/o 95 y/o 96 y/o 97 y/o 98 y/o 99 y/o 100 y/o 101 y/o 102 y/o 103 y/o 104 y/o 105 y/o 106 y/o 107 y/o 108 y/o 109 y/o 110 y/p 111 y/o 112 y/o 113 y/o 114 y/o 115 y/o 116 en la SEC ID NO; 9, 10, 11, 12, 13 ó 14, donde esto es posible dando la longitud del alargamiento consecutivo y el polipéptido de grelina relevante. En todas las variantes descritas anteriormente donde la serina de n-octaniolada de grelina madura podría estar presente, se prefiere preparar el constructo inmunogénico en tal manera que la n-octanilación está ausente (ya sea preparando ios constructos por medio de síntesis de péptido o usando un sistema de expresión que no introducirá la n-octanilación) . En .esta manera se asegura que los constructos no sean fisiológicamente activos en el SNC.

Formulación de grelina y polipéptidos de grelina modificados Cuando se efectúa la presentación del polípéptido de grelina o el polipéptido de grelina modificado a un sistema inmune animal por medio de administración del mismo al animal, la formulación del péptido sigue los principios generalmente reconocidos en la técnica. La preparación de vacunas las cuales contienen secuencias de péptidos como ingredientes activos es generalmente bien entendida en la técnica, como se ejemplifica por las Patentes Estadounidenses 4, 608,251; 4,601,903; 4,544,231; 4,599,230; 4,596,792 y 4,578,770, todas incorporadas aqui por referencia. De manera típica, tales vacunas son preparadas co o inyectables ya sea como soluciones líquidas o suspensiones; también se pueden preparar formas sólidas adecuadas para solución en, o suspensión en, líquido antes de la inyección. La preparación puede también ser emulsificada. El ingrediente inmunogénico activo es a menudo mezclado con excipientes los cuales son farmacéuticamente aceptables y compatibles con el ingrediente activo. Excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, salina, dextrosa, glicerol, etanol o similares, y combinaciones de los mismos. En adición, si se desea, la vacuna puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsificantes, agentes amortiguadores de pH o adyuvantes que mejoran la efectividad de las vacunas; cotéjese, la discusión detallada de adyuvantes debajo. Las vacunas son convencionalmente administradas parenteralmente, por inyección, por ejemplo, ya sea subcutáneamente, intravenosamente, intradermalmente, su dermalmente o intramuscularmente . Formulaciones adicionales las cuales son adecuadas para otros modos de administración incluyen supositorios y, en algunos casos formulaciones oral, bucal, sublingual, intraperitoneal, intravaginal, anal, epidural, espinal e intracraneales. Para supositorios, aglutinantes y portadores tradicionales pueden incluir, por ejemplo, polialcalenglicoles o triglicéridos; tales supositorios pueden ser formados de mezclas que contienen el ingrediente activo en el intervalo de 0.5% hasta 10%, preferiblemente 1-2%. Formulaciones orales incluyen tales excipientes empleados normalmente como, por ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, celulosa, carbonato de magnesio y similares. Estas composiciones toman la forma de soluciones, suspensiones, tabletas, pildoras, cápsulas, formulaciones o polvos de liberación sostenida y que contienen 10-95% de ingrediente activo, preferiblemente 25-70%. Para formulaciones orales, la toxina del cólera es un asociado de formulación interesante (y también un asociado de conjugación posible) . Los polipéptidos pueden ser formulados en las vacunas como formas neutrales o salinas. Sales farmacéuticamente aceptables incluyen sales de adición acida (formadas con los grupos amino libres del péptido) y las cuales están formadas con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o tales ácidos orgánicos como acético, oxálico, tartárico, mandélico y similares. Las sales formadas con grupos carboxilos libres pueden también ser derivadas de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, sodio, potasio, amonio, calcio o hidróxidos férricos, y dichas bases orgánicas como isopropilamina, trimetilamina, etanol de 2-etilamino, histidina, procaína y similares . Las vacunas son administradas en una manera compatible con la formulación de dosificación, y en tal cantidad como sean terapéuticamente e inmunogénicamente efectivas. La cantidad a ser administrada depende del sujeto a ser tratado, que incluye, por ejemplo, la capacidad del sistema inmune del individuo a cantidad en respuesta inmune, y el grado de protección deseado. Intervalos de dosificación adecuados son del orden de varios cientos de microorganismos del ingrediente activo por vacunación con un intervalo preferido de alrededor de 0.1 µg hasta 2, 000 \ig (se contemplan aún aunque en cantidades grandes en el intervalo de 1-10 g , tal como en el intervalo de alrededor de 0.5 µg hasta 2,000 ]ig o 0,5 ]ig hasta 1,000 µg, preferiblemente en el intervalo de 1 \ig hasta 500 \ig y especialmente en el intervalo de alrededor de 10 ]ig hasta 100 ]ig. Regímenes adecuados para administración inicial y disparos de refuerzo son también variables pero son tipificados por una administración inicial seguida por inoculaciones subsecuentes u otras administraciones. La manera de aplicación puede' ser ampliamente variada. Son aplicables cualquiera de los métodos convencionales para administración de una vacuna. Estas aplicaciones orales incluyen en una base fisiológicamente aceptable sólida en una dispersión fisiológicamente aceptable, parenteralmente, por inyección o similares. La dosificación de la vacuna dependerá en la ruta de administración y variará de conformidad a la edad de la persona a ser vacunada y la formulación del antígeno. Alguno de los polipéptidos de la vacuna son suficientemente inmunogénicos en una vacuna, pero para algunos de los otros la respuesta inmune se reforzará si la vacuna además comprende una sustancia adyuvante, Se conocen varios métodos para lograr el efecto adyuvante para la vacuna. Se detallan principios y métodos generales en "The Theory and Practical Application of Adjuvants", 1995, Duncan E.S. Stewart-Tull (ed.), John Wiley & Sans Ltd, ISBN 0-471-95170-6, y también en "Vaccines : New Generation immunological Adjuvants", 1995, Gregoriadis G et al. (eds.), Plenum Press, New York, ISBN 0-306-45283-9, ambos de los cuales son incorporadas por la presente por referencia aqui . Es especialmente preferido usar un adyuvante el cual puede ser demostrado para facilitar el rompimiento de la auto-tolerancia a antigenos mismos; en efecto, esto es esencial en casos donde se usa grelina sin modificar como el ingrediente activo en la autovacuna. Ejemplos no limitantes de adyuvantes adecuados se seleccionan del grupo que consiste de un adyuvante objetivo inmune; un adyuvante de modulación inmune tal como una toxina, una citoxina y un derivado micobacteriano; una formulación de aceite; un polímero; un adyuvante que forma micelio; una saponina; una matriz de complejo de inmunoestimulación (matriz ISCOM) ; una partícula; DDA; adyuvantes de aluminio; adyuvantes de ADN; ?-inulina y un adyuvante de encapsulación. En general se notará que las descripciones anteriores las cuales se refieren a compuestos y agentes usados como primeras, segundas y terceras porciones en los análogos también se refieren mutatis mutandis a su uso en el adyuvante de una vacuna de la invención.

La solicitud de adyuvantes incluyen el uso de agentes tales como idróxido o fosfato de aluminio (alum) , comúnmente usados como 0.05 hasta 0.1 por ciento de solución en salina amortiguada, mezclados con polímeros sintéticos de azúcares (por ejemplo, Carbopol®) usados como 0.25 por ciento de solución, agregación de la proteína en la vacuna por tratamiento de calor con temperaturas que varían entre 70° hasta 101 °C por periodos de 30 segundos hasta 2 minutos respectivamente y también la agregación es posible por medio de agentes de reticulado. Puede también ser* empleada la agregación por reactivación con anticuerpos tratados con pepsina (fragmento Fab) para albúmina, mezclas con células bacterianas tales como C. parvum o endotoxinas o componentes de lipoposacáridos de bacterias gram-negativas, emulsión en vehículos aceitosos farmacéuticamente aceptables tales como mono^oleato de manida (Aracel A) o emulsión con 20 por ciento de solución de un perfluorocarbono (Fluosol-DA) usado como un sustituto de bloque. Se prefieren mezclas con aceites tales como escualeno e IFA. De acuerdo con la invención, el DDA (bromuro de dimetildioctadecilamonio) es un candidato interesante para un adyuvante como es ADN y ?-inulina, pero también adyuvantes completos e incompletos. Freund así como saponinas qulllaja tales como QullA y QS21 son interesantes como es RIBI . Posibilidades adicionales son lípidos de monofosforilo A (MPL) , el C3 y C3d mencionados anteriormente, y dipéptido de muramilo (MDP) . Se conocen también formulaciones de liposomas para conferir efectos adyuvantes, y por lo tanto se prefieren adyuvantes de liposomas de conformidad con la invención. También son selecciones preferidas adyuvantes de tipo matriz de complejo de inmunoestimulacion (ISCOM® matrix) de conformidad con la invención, especialmente puesto que se ha mostrado que este tipo de adyuvantes son capaces de regular ascendentemente la expresión de MHC de Clase II por APCs. Una matriz ISCOM® consiste de (opcionalmente fraccionada) saponinas (triterpenoides) de Quillaja saponaria, colesterol y fosfolipidos . Cuando se mezcla con la proteina inmunogénica, la formulación de partícula resultante es aquella conocida como una partícula ISCOM donde la saponina constituye 60-70% p/p, el colesterol y el fosfolípido 10-15% p/p, y la proteína 10-15% p/p. Detalles que se relacionan con la composición y uso de complejos de inmunoestimulacion pueden por ejemplo, ser encontrados en los libros de texto mencionados anteriormente tratando adyuvantes, pero también Morein B et al., 1995, Clin. Immunother. 3: 461-475 así como Barr IG y Mitchell GF, 1996, Immunol. y Cell Biol. 74: 8-25 (ambos incorporados por referencia aquí) proporcionan instrucciones útiles para la preparación de complejos de inmunoestimulacion completos.

Otra posibilidad altamente interesante (y asi, preferida) de lograr el efecto adyuvante es emplear la técnica descrita en Gosselin et al., 1992 (la cual está con ello incorporada por referencia aquí) . En breve, la presentación de un antigeno relevante tal como un antigeno de la presente invención puede ser mejorada conjugando el antigeno a anticuerpos (o fragmentos de anticuerpo que se enlazan a antigenos) contra los receptores Fcy en monocitos/macrófagos . Especialmente conjugados entre antigenos y anti-FcyRI han sido demostrados por mejorar la inmunogenicidad para propósitos de vacunación. Otras posibilidades involucran el uso de las sustancias de modulación inmune y objetivo (i. a. citocinas) mencionadas anteriormente como candidatos para las primera y segunda porciones en las versiones modificadas de grelina. En esta conexión, son posibilidades también inductores sintéticos de citocina similares al poli I : C . Se seleccionan derivados micobacterianos adecuados del grupo que consiste de dipéptido de muramilo, adyuvante Freund completo, RIBI y un diéster de trehalosa tal como TDM y TDE. Se seleccionan adyuvantes objetivo inmune adecuados del grupo que consiste de ligandos CD40 y anticuerpos CD40 o específicamente que enlazan fragmentos del mismo (cotéjese, la discusión anterior), mañosa, un fragmento Fab y CTLA-4.

Se seleccionan adyuvantes de polímero adecuados del grupo que consiste de un carbohidrato tales como dextrano,, PEG, almidón/ manan y ma osa/ un polímero plástico como tal; y látex tal como cuentas de látex. Aún otra forma interesante de modular una respuesta inmune es incluir el inmunógeno de grelina (opcionalmente junto con adyuvantes y portadores y vehículos farmacéuticamente aceptables) en un wnudo linfático virtual" (NLV) (una propiedad de dispositivo médico virtual desarrollado por ImmunoTherapy, Inc.,- 360 Lexington Avenue, New York, NY 10017-6501) . El NLV (un dispositivo tubular delgado) imita la estructura y función de un nudo linfático. La inserción de un NLV bajo la piel crea un sitio de inflamación estéril con una sobre-tensión de citocina y quimocina. Las células T y B así como la respuesta rápidamente de APCs a las señales de peligro, albergan el sitio inflamado y se acumula dentro de la matriz porosa del NLV. Se ha mostrado que la dosis de antígeno necesaria requerida para montar una respuesta inmune a un antígeno se reduce cuando se usa el NLV y tal protección inmune se confiere por vacunación usando una inmunización convencional superada de NLV- usando Ribi como adyuvante. La tecnología es i. a descrita brevemente en Gelbert C et al., 1998, "Elicitation of Robust Cellular and Humoral Immune Responses to Small Amounts of Immunogens Using a Novel Medical Deviced Designated the Virtual Lymph Node", en: ¾From the Laboratory to the Clinic, Book of Abstracts, Octubre 12Eh - 15th 1998, Seascape Resort, Aptos, California'". Se han mostrado formulaciones de macroparticulas de vacunas en muchos casos para incrementar la inmunogenicidad de antígenos dé proteína y es por lo tanto otra modalidad preferida de la invención. Se elaboran macroparticulas ya sea como co-formulaciones de antígenos con un polímero, un lípido, un carbohidrato u otras moléculas adecuadas para hacer que las partículas o las micropartículas puedan ser partículas homogéneas que consisten únicamente de ese -antígeno . Ejemplos de micropartículas basadas en polímeros son partículas basadas en PLGA y PVP (Gupta RK et al., 1998) donde el polímero y el antígeno se condensan en una partícula sólida. Las partículas basadas en lípidos se pueden hacer como micelios del lípido (así llamado íiposomas) que atrapan al antígeno dentro del micelio (Pietrobon PJ, 1995) . Las partículas basadas en carbohidratos son típicamente hechas de un carbohidrato degradable adecuado tal como almidón o quitosan. El carbohidrato y el antígeno se mezclan y se condensan en las partículas en un proceso similar a alguno usado para partículas de polímeros (Kas HS et al., 1997) . Las partículas' que consisten únicamente del antígeno pueden ser elaboradas por varias técnicas de rociado y secado por congelamiento. Especialmente adecuada para ios propósitos de la presente invención, es la tecnología de fluido supercrítico que se usa para hacer partículas muy uniformes de tamaño controlado (York P, 1999 & Shekunov B et al., 1999) . Se espera que la vacuna debe ser administrada al menos una vez al año, tal como al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 12 veces al año. Más específicamente, se espera que 1-12 veces por año, tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ó 12 veces al año para un individuo en necesidad del mismo. Se ha mostrado previamente que la inmunidad de memoria inducida por el uso de la auto-vacuna preferida de conformidad con la invención no es permanente, y por lo tanto el sistema inmune necesita ser periódicamente cambiado con los análogos . Debido a la variación genética, diferentes individuos pueden reaccionar con respuestas inmunes de estiramiento variado al mismo péptido. Por lo tanto, la vacuna de conformidad con la invención puede comprender varios polipéptidos diferentes, para incrementar la respuesta inmune, cotéjese, también la discusión anterior concerniente a la selección de introducciones de epitopes de célula T extrañas. La vacuna puede comprender dos o más polipéptidos, donde todos los polipéptidos son como se definen anteriormente . La vacuna ¦ puede consecuentemente comprender 3-20 diferentes polipéptidos modificados o sin modificar, tal como 3-10 polipéptidos diferentes. Sin embargo, normalmente el número de polipéptidos será buscado mantenido a un mínimo tal como 1 6 2 polipéptidos. Como una alternativa para los análogos de grelina de la invención, es también posible inmunizar usando anticuerpos anti-idiopáticos o aún inimotopes. Se conocen en la técnica tecnologías para la preparación de anticuerpos anti-idiopáticos que imitan un epitope de grelina, pero una versión especialmente interesante involucra el uso de anticuerpos anti-idiopáticos autologos, los cuales reaccionan con un anticuerpo anti-grelina y los cuales son modificados por introducción de un epitope T auxiliador extraño como generalmente se describe aquí. Se pueden aislar mimotopes a partir de bibliotecas de péptidos al azar que son protegidas en despliegue de fago contra anticuerpos que se enlazan específicamente a grelina.

"Vacunación de ácido nucleico Como una alternativa para administración clásica de una vacuna basada en péptido, la tecnología de vacunación de ácido nucleico (también conocida como ""inmunización de ácido nucleico''', ""inmunización genética e ^inmunización del gen") ofrece un número de características atractivas. Primero, contrario con el procedimiento de vacuna tradicional, la vacunación de ácido nucleico no requiere producción a gran escala que consume recursos del agente inmunogénico (por ejemplo, en la forma de fermentación a escala industrial de microorganismos que producen grelina modificada) . Además, no se necesita purificación del dispositivo y esquemas de replegado para el inmunógeno. Y finalmente, puesto que la vacunación de ácido nucleico cuenta con el aparato bioquímico del individuo vacunado para producir el producto de expresión del ácido nucleico introducido, se espera se origine el proceso de posttraducción óptimo del producto de expresión; esto es especialmente importante en el caso de autovácunacion, puesto que, como se mencionó, anteriormente, una fracción significante de los epitopes de células B de grelina original serán preservados en la molécula modificada, y puesto que los epitopes de células B en principio pueden ser constituidos por partes de cualquier (bio) molécula (por ejemplo, carbohidrato, lípido, proteína, etc.). Por lo tanto, la glicosilación nativa y modelos de lipidacíón del inmunógeno pueden ser muy bien de importancia para la inmunogenidad total y esto se espera se asegure por tener el hospedador que produce el inmunógeno. Por lo tanto, una modalidad preferida de la invención comprende presentación efectiva de grelina modificada para el sistema inmune introduciendo ácido (s) nucleicos que codifican la grelina modificada en las células animales y con ello obtener expresión in vivo para las células de ácido (s) nucleico (s) introducidas. En esta modalidad, es preferiblemente ADN el ácido nucleico introducido en cual puede estar en la forma de ADN desnudo, ADN formulado con lipidos cargados o descargados, ADN formulado en liposomas, ADN que incluye un vector viral, ADN formulado con una proteina que facilita la transfección o polipéptido, ADN formulado con una proteina objetivo o polipéptido, ADN formulado con agentes que precipitan calcio, ADN acoplado a una molécula portadora inerte, ADN encapsulado en un polímero, por ejemplo en PLGA (cotéjese, la tecnología de mincroencapsulación descrita en WO 98/31398 ) o en quitina quitosan, y ADN formulado con un adyuvante. En este contexto, se nota que prácticamente todas las consideraciones que pertenecen al uso de adyuvantes en formulación de vacunas tradicionales aplican para la formulación de vacunas de ADN. Por lo tanto, todas las descripciones aquí las cuales se refieren a uso de adyuvantes en el contexto de vacunas basadas en polipéptidos, aplica mutatis mutandis a su uso en tecnología de vacunación de ácido nucleico. Para rutas de administración y esquemas de administración de vacunas basadas en polipéptidos las cuales se han detallado anteriormente, esto es también aplicable para vacunas de ácido nucleico de la invención y todas las discusiones anteriores que pertenecen a rutas de administración o esquemas de administración para polipéptidos, aplican mutatís mutandís a ácidos nucleicos. A esto se deberá agregar que las vacunas de ácido nucleico pueden adecuadamente ser administradas intravenosamente e intraarterialmente. Además, es bien conocido en la técnica que las vacunas de ácido nucleico pueden ser administradas para uso de un asi llamado disparo de gen, y por lo tanto, también estos y modos equivalentes de administración son considerados como partes de la presente invención. Finalmente, también el uso de un NLV en la administración de ácidos nucleicos ha sido reportado por producir buenos 'resultados, y por lo tanto este modo particular de administración es particularmente preferido. Además, los ácidos nucleicos usados como un agente de inmunización pueden contener regiones que codifican las lras, 2das y/o 3eras porciones, por ejemplo en la forma de sustancias, de inmunomodulación descritas anteriormente tales como las citocinas discutidas como adyuvantes usados. Una versión preferida de esta modalidad abarcada, tienen la región que codifica para el análogo y la región que codifica para el inmunomodulador en diferentes estructuras lectoras o al menos bajo el control de diferentes promotores. Con ello se evita que el análogo o epitope se produzcan como un asociado de fusión al inmunomodulador. Alternativamente, pueden ser usados dos distintos fragmentos de nucleótidos, pero esto es menos preferido debido a las ventajas de coexpresión asegurada cuando tienen ambas regiones codificadas incluidas en la misma molécula. Por consiguiente, la invención también se refiere a una composición para inducir producción de anticuerpos contra grelina, la composición comprende - un fragmento de ácido nucleico o un vector de la invención (cotéjese, la discusión de vectores de bajo), y - un vehículo y/o portador y/o adyuvante farmacéuticamente e inmunológicamente aceptable como se discute anteriormente. Bajo circunstancias normales, el ácido nucleico que codifica una variante de grelina es introducido en la forma de un vector en donde -la expresión está bajo control de un promotor viral. Para discusiones más detalladas de vectores y fragmentos de ADN de conformidad con la invención, cotéjese la anterior discusión. También, están disponibles las descripciones detalladas que se refieren a la formulación y uso de vacunas de ácido nucleico, cotéjese Donnelly JJ et al, 1997, Annu. Rev. Immunol . 15: 617-648 y Donnelly JJ et al., 1997, Life Sciences 60: 163:172. Ambas de estas referencias son incorporadas por referencias aquí .

Vacunas vivas Una tercera alternativa para presentación efectiva de grelina modificada para el sistema inmune, es el uso de tecnología de vacunas vivas. En la vacunación viva, la presentación al sistema inmune es efectuada administrando, al animal, un microorganismo no patogénico el cual ha sido transformado con un fragmento de ácido nucleico que codifica una grelina modificada o con un vector que incorpora tal como fragmento de ácido nucleico. El microorganismo no patogénico puede ser cualquier cepa bacteriana atenuada adecuada (atenuada por medio de pasar o por medio de remover productos de expresión patogénica por tecnología de M)N recombinante) , por ejemplo, Mycobacterium bovis BCG. , Streptococcus spp. no patogénico, E. colí, Salmonella spp., Vibrio cholerae, Shigella, etc. Revisiones que tratan de la preparación de vacunas vivas del estado de la técnica pueden por ejemplo, ser encontradas en Saüou P, 1995, Rev. Prat. 45: 1492-1496 y Walker PD, 1992, Vaccine 10: 977-990, ambos incorporados por referencia aquí. Para detalles a cerca de los fragmentos de ácido nucleico y vectores usados en tales vacunas vivas, cotéjese la discusión debajo. Como una alternativa para vacunas vivas bacterianas, el fragmento de ácido nucleico de la invención discutida de bajo puede ser incorporado en un vector de vacuna viral no virulenta tal como una cepa de vaccinia o cualquier otro virus pox adecuado. Normalmente, el microorganismo no patogénico o virus es administrado únicamente una vez al animal, pero en ciertos casos puede ser necesario administrar el microorganismo más de una vez en un tiempo de vida para mantener ¡inmunidad productiva. Se contempla aún que los esquemas de inmunización como aquellos detallados anteriormente para vacunación de polipéptido serán usados cuando se usan vacunas de virus o vivas. Alternativamente, la vacunación de virus o vivas se combina con vacunación de polipéptidos previos o subsecuentes y/o de ácido nucleico. Por ejemplo, es posible efectuar inmunización primaria con una vacuna de virus o viva seguida por inmunizaciones de refuerzo subsecuentes usando el procedimiento de polipéptido o ácido nucleico. El microorganismo o virus puede ser transformado con ácido (s) nucleicos que contienen regiones que codifican las lras, 2das y/o 3eras porciones, por ejemplo, en la forma de sustancias de inmunomodulación descritas anteriormente tales como citocinas discutidas como adyuvantes usados. Una. ersión preferida de esta modalidad abarcada, tiene la región codificada para el análogo y la región para el inmunomodulador en diferentes estructuras lectoras o al menos bajo el control de diferentes promotores. Con ello se evita que los análogos o epitopes sean producidos como asociados de fusión al inmunomodulador. Alternativamente, dos distintos fragmentos de nucleótido pueden ser usados como agentes de transformación. Por supuesto, teniendo las leras, 2das y/o 3eras porciones en la misma estructura lectora se pueden proporcionar como un producto de expresión, un análogo de la invención, y tal modalidad es especialmente preferida de conformidad con la presente invención. üso del método de la invención en tratamiento de enfermedad y otras situaciones Como se apreciará anteriormente, la vacunación contra grelina se espera proporcione un medio efectivo para • reducir el exceso de grasa corporal en - individuos en necesidad del mismo. Además, se ha mostrado que la coexpresión del receptor de grelina (GSH-R) y grelina se origina en células de cáncer de próstata (Jeffery PL et al., 2002, J Endocrinol, 172(3): R7-11) . También se ha reportado la expresión de GSG-R en algunos tumores endocrinos (Volante M et al., 2002 J. Clin Endocrinol Metab, 87(3): 1300-8), y Papotti M et al. (2001, J Clin Endocrinol Metab, 86(10): 5052-9) reporta que la mayoría (75%) de carcinoides gástricos y 25% de tumores endocrinos intestinales se inmunoreactivaron por grelina. En otras palabras, los métodos de la invención pueden ser practicados como tratamiento de la obesidad y de grelina y cánceres relacionados con el receptor de grelina. Se debe notar que cantidades muy bajas de grelina de circulación pueden resultar en una pérdida de interés en la alimentación - el individuo que tiene tal concentración baja de grelina no tiene una acción para comer cuando es necesario. Asi, de este modo se contempla que el tratamiento iiímunoterapéutico actualmente sugerido de humanos, debe ser acompañado por una dieta controlada para asegurar que la persona que es sometida a tratamiento ingiera nutrientes necesario, Al mismo tiempo, la relación- de pérdida de peso debe ser cuidadosamente monitoreada ' para evitar también reducciones drásticas en peso corporal sobre tiempo y se debe asegurar que el sujeto tratado ejerza un comportamiento físico que se dirija a preservar la masa muscular, etc. En los Ejemplos se reportan experimentos con pocas variantes inmunogénicas de grelina de rata, las cuales se usaron como inmunógenps para inducir una respuesta inmune contra grelina autóloga en ratas. Como se espera, las inmunizaciones resultaron en la inducción en las ratas de anticuerpos altamente titulados reactivos con los análogos de grelina de rata. Sorprendentemente, sin embargo, estos tituladores altos de anticuerpo fueron acompañados por un incremento en los niveles de grelina de circulación en estas ratas, y esto también se correlaciona con un incremento en el peso corporal en todas las ratas probadas. Si el incremento de peso corporal fue debido al incremento en la masa muscular, no se conoce aún la grasa corporal o ambos. No es de esperarse que estos efectos constituyan un fenómeno general y existan varias explicaciones que pueden contar (solas o en cualquier combinación) para el incremento en nivel de suero de grelina en respuesta a la inmunización: - la existencia de un bucle de retroalimentación negativa que naturalmente regula la producción de grelina en respuesta a la concentración moléculas las cuales son reguladas ascendentemente por grelina. - un efecto directo de alguno de los anticuerpos anti-grelina inducidos en un receptor que compite con grelina para enlazarse a una molécula reguladora. - activación por alguno de los anticuerpos anti-grelina inducidos de una molécula efectora la cual es normalmente activada por una proteína que se enlaza grelina con ello, estimulando la producción de grelina, - una sobre concentración de grelina de suero total en la corriente sanguínea debido a la presencia de los anticuerpos que se enlazan a grelina (es decir, una capacidad de compartimiento - de grelina) la cual conduce a una combinación más grande, de grelina accesible y posiblemente también a una de vida media del suero prolongada de grelina, - bloquear los efectos por algunos de los anticuerpos en la interacción 'entre grelina y un "receptor sensor" o "receptor señuelo'' involucrado en el control de la expresión de grelina, etc. Ninguna de estas posibles explicaciones puede ser regida basada en los experimentos presentes. En particular, es notable que todos los constructos probados en los Ejemplos incluyan la secuencia completa de grelina de rata madura, que significa que los anticuerpos contra todos los posibles epitopes de células B de grelina se debe esperar estén presentes en los sueros de las ratas inmunizadas. Y, si por ejemplo, la sobre regulación aparente en grelina es una consecuencia de anticuerpos que se enlazan a un sitio que interactúa con una molécula o receptor de enlace a grelina, entonces un número de constructos de grelina descritos aqui, no conducirán a la inducción de anticuerpos que tienen el efecto de estimulación en la producción de grelina y con ello estos constructos conducirán a la regulación descendente inicialmente esperadá de grelina. Alternativamente, si el efecto es simplemente una consecuencia de una expansión de la cantidad 'total disponible • de grelina en el suero y una prolongación la vida media del suero, esto abre un procedimiento terapéutico completamente nuevo cuando se usa vacunación contra proteínas autólogas y otras moléculas. Por ejemplo, algunas hormonas similares a grelina necesitan cruzar una barrera la cual no es permeable para anticuerpos antes de que puedan ejercer su efecto en el tejido objetivo. Cuando se inmuniza activamente contra tales moléculas, el nivel de suero de la molécula (anticuerpo- enlazado y libre) y su vida media se incrementarán, conduciendo con éÜo a una combinación más grande de moléculas accesibles. Debido al estado de equilibrio entre la molécula unida al receptor en los órganos objetivos y la combinación total en el suero, el efecto paradójicamente será un incremento neto en la estimulación ejercida por la molécula debido a que cantidades grandes de la molécula pueden atravesar la barrera impermeable de anticuerpo. Por lo tanto, la presencia de anticuerpos que se enlazan a las moléculas conduce a un incremento en el efecto ejercido por la molécula. Este concepto se cree es nuevo, y puede también ser aplicado usando otras tecnologías donde la combinación de suero de una molécula particular puede ser incrementada (administración de receptores solubles que se enlazan a la molécula, administración de anticuerpos monoclónales que se enlazan a la molécula, etc.) . A cualquier proporción, estos hallazgos particulares han identificado un uso inesperado de inmunización contra grelina, es decir, en condiciones donde un nivel incrementado de grelina es de interés. Condiciones tales como anorexia y caquexia han sido previamente sugeridas como indicaciones para terapia de grelina por tener enfermedades cardiovasculares tales como insuficiencia cardiaca. Tales enfermedades y condiciones todas son interesantes en modalidades de la presente invención donde la inducción de una respuesta inmune anti-grelina conduce a un incremento en niveles de grelina de circulación. Además, es también de interés utilizar este aspecto inesperado en la industria agrícola. Es de valor incrementar la producción de grasa en vacas que producen leche y en un número de otros animales, donde los depósitos de grasa y la producción de grasa son relevantes para el sabor y calidad de la producción agrícola en cuestión. También, se conoce a la grelina por ser un estimulador de la descarga de la hormona de crecimiento, asi en condiciones o situaciones donde los efectos de un incremento en la producción de la hormona de crecimiento es de interés, el método presente ofrece una alternativa, donde las administraciones repetidas de la hormona de crecimiento pueden ser evitadas . Tales aplicaciones involucran el uso para una fertilización in vitro (donde el tratamiento GH ha sido sugerido como adyuvante de terapia) , el uso en la sanación de heridas (por ejemplo, después de quemaduras severas) y generalmente en el tratamiento de trauma severo, como se mencionó anteriormente, para inducir el crecimiento de animales de granja, para prolongar la supervivencia en pacientes con insuficiencia cardiaca, y el uso como un fármaco "anti-envejecimiento".

Péptidos, polipéptidos y composiciones de la invención Como será aparente de lo anterior, la presente invención se basa en el concepto de inmunizar individuos contra el antígeno grelina. La forma preferida para obtener tal inmunización es usar versiones modificadas de grelina, con ello proporcionar moléculas las cuales no han sido previamente descritas en la técnica. " Se cree que las moléculas de grelina modificadas discutidas aquí son inventivas en su propio derecho, y por lo tanto, una parte importante de la invención pertenece a un análogo de grelina el cual es derivado de una grelina animal en dónde se introduce una modificación la cual tiene como un resultado tal inmunización del animal con el análogo que induce la producción de anticuerpos que reaccionan transversalmente con el polipéptido de grelina sin modificar. Preferiblemente, la naturaleza de la modificación se conforma con los tipos de modificaciones descritas anteriormente cuando se discuten varias modalidades del método de la invención, cuando se usa grelina modificada. Por lo tanto, cualquier descubrimiento presentado aquí que pertenece a moléculas de grelina modificadas es relevante para el propósito de describir los análogos de grelina de la invención, y cualquier descripción aplica mutatis mutandis para la descripción de estos análogos . Se debe notar que las moléculas de grelina modificadas preferidas comprenden modificaciones las cuales resultan en ün polipéptido que tiene una identidad de secuencia de ai menos 70% con grelina o con una sub-secuencia del mismo de al menos 10 aminoácidos én longitud. Se prefieren identidades de secuencia superiores, por ejemplo al menos 75% o aún al menos 80% 6 85%. La identidad de secuencia para proteínas y ácido nucleicos pueden ser calculada como (Nref - Ndif)»100/Nref en donde Ndif es el número total de residuos no idénticos en las dos secuencias cuando se alinean y en donde Nref es el número de residuos en una de las secuencias. Por lo tanto, la secuencia AGTCAGTC de ADN tendrá una identidad de secuencia de 75% con la secuencia TAATCAATC (Ndif = 2 y Nref = 8 ) . La invención también pertenece a composiciones empleadas en el ejercicio del método de la invención. Por lo tanto, la invención también se refiere a una composición inmunogénica que comprende una cantidad inmunogénicamente efectiva de un polipéptido de grelina el cual es una proteína misma en un animal o una sub-secuencia de tal poüpéptido de grelina, dicho polipéptido o subsecuencia de grelina es formulado junto con un adyuvante inmunologicamente aceptable, para romper la auto-tolerancia del animal hacia el polipéptido de grelina, la composición además comprende un vehículo y/o portador farmacéuticamente e inmunologicamente aceptable. En otras palabras, esta parte de la invención pertenece a las formulaciones de polipéptidos/subsecuencias de grelina que se originan naturalmente las cuales se han descrito en conjunto con modalidades del método de la invención. La invención también se refiere a una composición inmunogénica que comprende una cantidad inmunológicamente efectiva de un análogo de grelina definida anteriormente, dicha composición además comprende un diluyente y/o vehículo y/o portador y/o excipiente inmunológicamente aceptable y opcionalmente un adyuvante. En otras palabras, esta parte de la invención se refiere a formulaciones de grelina modificada, esencialmente como se describe aquí anteriormente. La selección de adyuvantes, portadores y vehículos es de conformidad en línea con lo que se ha discutido anteriormente cuando se refiere a formulaciones de grelina modificada y sin modificar para uso en el método inventivo para la inmunización contra autoanálogos de grelina. Los polipéptidos son preparados de conformidad a métodos bien conocidos en la técnica. Se preparan normalmente polipéptidos más largos por medio de tecnología de gen recombinante que incluye, la introducción de una secuencia de ácido nucleico que codifica el análogo de grelina en un vector adecuado, transformación de una célula hospedadora adecuada con el vector, expresión de la secuencia dé ácido nucleico, recuperación del producto de expresión de las células hospedadoras o su cultivo sobrenadante, y purificación subsecuente y modificación adicional opcional, por ejemplo, replegado o derivación. Son preferiblemente preparados péptidos más cortos por medio de técnicas bien conocidas de síntesis de péptido de fase sólida o liquida. Sin embargo, avances recientes en esta tecnología han considerado posible la producción de polipéptidos y proteínas de longitud completa por estos medios, y por lo tanto están también dentro del ámbito de la presente invención para preparar los constructos largos por medios sintéticos.

Fragmentos de ácido nucleico y vectores de la invención Se apreciará de la declaración anterior que los' polipéptidos de grelina modificados pueden ser preparados por medio de tecnología de gen recombinante, pero también por medio de síntesis o semisíntesis química; las dos opciones posteriores son especialmente relevantes cuando la modificación consiste en acoplar a portadores de proteína (tal como KLH, difteria toxoide, tetanus toxoide y BSA) y moléculas no proteináceas tales como polímeros de carbohidratos y por supuesto, también cuando la modificación comprende adición de cadenas laterales o grupos laterales a una cadena peptídica derivada de polipéptido de grelina. Para propósitos de tecnología de gen recombinante, y por supuesto, también para propósitos de inmunización de ácido nucleico, fragmentos de ácido nucleico que codifican grelina modificada son productos químicos importantes. Por lo tanto/ una parte importante de la invención pertenece a un fragmento de ácido nucleico el cual codifica un análogo de grelina, es decir, un polipéptido derivado de grelina el cual ya sea comprende la secuencia de grelina natural a la cual se ha agregado o insertado un asociado de fusión o, preferiblemente, un polipéptido derivado de grelina en donde se ha introducido un epitope de célula T extraño por medio de inserción y/o adición, preferiblemente por medio de sustitución y/o supresión. Los fragmentos de ácido nucleico de la invención son ya sea' fragmentos de ADN o ARN. Los fragmentos de ácido nucleico de la invención serán normalmente insertados en vectores adecuados para formar vectores de expresión o clonación que portan los fragmentos de ácido nucleico de la invención; tales nuevos vectores también son parte de la invención. Detalles que se relacionan con la construcción de estos vectores de la invención deben ser discutidos en contexto de células transformadas y microorganismos posteriores. Los vectores pueden, dependiendo del propósito y tipo de aplicación, estar en la forma plásmidos, fagos, cósmidos, mino-cromosomas, o virus, pero también el ADN" desnudo, el cual es solamente temporalmente expresado en ciertas células, es un vector importante. Los vectores de expresión y clonación preferidos de la invención son capaces de réplicación autónoma/ con ello permiten los altos números de copias para propósitos de expresión de alto nivel o rerilícación de alto nivel para clonación subsecuente. El perfil general de un vector dé la invención comprende las siguientes características en la dirección 5'—> 3' y en enlace operable: un promotor para accionar la expresión del fragmento de ácido nucleico de la invención, opcionalmente una secuencia dé ácido nucleico que codifica un péptido líder que permite la secreción (para la fase extracelular o, donde es aplicable, en el periplasma) de o integración en la membrana del fragmento de polipéptido, el fragmento de ácido nucleico de la invención, y opcionalmente una secuencia de ácido nucleico que codifica un terminador. Cuando se opera con vectores de expresión en cepas productoras o líneas celulares, es para propósitos de estabilidad genética de la célula transformada preferida que el vector cuando se introduce en una célula ñospedadora, es integrado en el genoma de la célula hospedadora. Por el contrario, cuando se trabaja con vectores a ser usados efectivamente en expresiones in vivo en un animal (es decir, cuando se usa el vector en vacunación de ¾DN) por razones de seguridad, se prefiere que el vector no sea capaz de ser integrado en el genoma de la célula hospedadora; típicamente, son usados ADN desnudo o se usan vectores virales no integrados, la selección de los cuales es bien conocida por la persona experta en la técnica. Los vectores de la invención se usan para transformar células hospedadoras para producir el polipeptido de grelina modificado de la invención. Dichas células transformadas, las cuales también son parte de la invención, pueden ser células cultivadas o lineas celulares usadas para la propagación de los fragmentos de ácido nucleico y vectores de la invención, o usadas para producción recombinante de los polipéptidos de grelina modificados de la invención. Alternativamente, las células transformadas pueden ser cepas de vacunas vivas adecuadas en donde el fragmento de ácido nucleico (una sola o copias múltiples) se ha insertado para efectuar secreción o integración en la membrana bacteriana o pared celular de la grelina modificada. Células transformadas preferidas de la invención son microorganismos tales como bacterias (tal como las especies Escherichia [por ejemplo, E. coli] , Bacillus [por ejemplo, Bacillus subtilis , Salmonella, o Mycobacterium [preferiblemente no patogénica, por ejemplo M. bovis BCG] ) , levaduras (tales como Saccharomyces cerevisiae) y protozoarios . Alternativamente, las células transformadas son derivadas de un organismo multicelular tal como hongos, una célula de insecto, una célula de planta o una célula de mamífero. Más preferidas son células derivadas de un humano, cotéjese la discusión de lineas celulares y vectores posteriores. Resultados resientes han mostrado gran promesa en el uso de una linea celular de Drosophila melanogaster comercialmente disponible (la linea celular Schneider 2 (S2) y sistema de vector disponible de Invitrogen) para la producción recombinante de análogos de grelina de la invención, y por lo tanto este sistema de expresión es particularmente preferido. También las células de spodoptera (células SF) SF9 y SF21 son preferidas. Para propósitos de clonación y/o expresión optimizada se prefiere que la célula transformada sea capaz de replicar el fragmento de ácido nucleico de la invención. Células que expresan el fragmento nucleico son modalidades útiles preferidas de la invención; pueden ser usadas para preparación a pequeña escala o gran escala de la grelina modificada o en el caso de bacterias no patogénicas, como constituyentes de vacuna en una vacuna viva. Cuando se produce la grelina modificada de la invención por medio de células transformadas, es conveniente, aunque lejos de lo esencial, que el producto de expresión sea ya sea exportado en el medio de cultivo o portado en la superficie de la célula transformada. Cuando una célula producida efectiva ha sido identificada, se prefiere en base a esto, establecer una linea celular estable la cual porta el vector de la invención y la cual expresa el fragmento de ácido nucleico que codifica la grelina modificada. Preferiblemente, esta linea celular estable secreta o porta el análogo de grelina de la invención, con ello facilita la purificación del mismo. En general, los vectores de plásmidos contienen replicón y secuencias de control las cuales se derivan de especies compatibles con las células hospedadoras usadas en conjunto con los hospedadores . El vector ordinariamente porta un sitio de replicación, asi como secuencias de marcado las cuales son capaces de proporcionar selección fenotipica en células transformadas. Por ejemplo, E. coli es típicamente transformada usando pBR322, un plásmido derivado de unas especies de E. coli (véase, por ejemplo, Bolívar et al., 1977) . El plásmido pBR322 contiene genes para resistencia a la ampicilina y tetraciclina y así proporciona medios fáciles para identificar células transformadas. El plásmido pBR, u otro plásmido microbiano o fago, también deben contener, o ser modificados para contener, promotores, los cuales pueden ser usados por el microorganismo procariotico para expresión.. Estos promotores más comúnmente usados en construcción de ADN recombinante procariotico incluyen la B-lactamasa (penicilinasa) y sistemas promotores de lactosa (C ang et al., 1978; Itakura et al., 1977; Goeddel et al., 1979) y un sistema promotor de triptofano (trp) (Goeddel et al., 1979; EP-A-0 036 776). Mientras estos son los más comúnmente usados, otros promotores microbianos se han descubierto y utilizado, y se han publicado detalles concernientes a sus secuencias de nucleótido, permitiendo a un experto trabajador ligarlos funcxonalmente con vectores de plásmido (Siebwenlist et al., 1980). Ciertos genes de procariotas pueden ser expresados eficientemente en E. coli de sus propias secuencias de promotor, evitando la necesidad para adición de otro promotor por medios artificiales . Además de procariotas, microbios eucarióticos, también pueden ser usados cultivos como levaduras, y aquí el promotor debe ser capaz de accionar la expresión. La Saccharomyces cerevisíae, o levadura común de horneado es la más comúnmente usada entre microorganismos eucarióticos, aunque un número de otras cepas están comúnmente disponibles. Para expresión en Saccharomyces, el plásmido YRp7, por ejemplo, es comúnmente usado (Stinchcomb et al., 1979; ingsman et al., 1979; Tschemper et al., 1980). Este plásmido ya contiene el gen trpl el cual proporciona una selección marcada para una cepa mutante de levadura que carece de la habilidad para crecer en triptofano por ejemplo ATCC No. 44076 ó PEP4-1 (Jones, 1977} . La presencia de la lesión trpl como una característica del genoma de la célula hospedadora de levadura, proporciona un medio ambiente efectivo para detectar la transformación por crecimiento en la ausencia de triptofano.

Secuencias promotoras adecuadas en vectores de levadura incluyen los promotores para cinasa de 3-fosfoglicerato (Hitzman et ál., 1980] u otra enzima glicolitica (Hess et al., 1968; Holland et al., 1978) tal como enolasa, deshidrogenasa de gliceraldehido-3-fosfato, hexocinasa, descarboxilasa de piruvato, fosfofructocinasa, isomerasa de glucosa-6-fosfato, mutasa de 3-fosfoglicerato, cinasa de piruvato, isomerasa de triosefosfato, isomerasa de fosfoglucosa y glucocinasa. En construcción de plásmidos de expresión adecuada, las secuencias de terminación asociadas con estos genes también son ligadas en el vector de expresión 3' de la secuencia deseada a ser expresada para proporcionar poliadenilación del ARNm y terminación. Otros promotores, los cuales tienen la ventaja adicional de transcripción controlada por condiciones de crecimiento son la región promotora para deshidrogenasa de alcohol 2, isocitocromo C, fosfatasa ácida, enzimas degradativas asociadas con metabolismo de nitrógeno y la deshidrogenasa de gliceraldehido-3-£osfatasa antes mencionada, y enzimas responsables por la utilización de maltosa y galactosa. Cualquier vector de plásmido que contiene un promotor compatible con levadura, es adecuado el origen de replicación y secuencias de terminación. Además de microorganismos, cultivos de células derivadas de organismos multicelulares pueden también ser usados como hóspedadores . En principio, cualquiera de los cultivos celulares es trabajable, sea de cultivos vertebrados o invertebrados. Sin embargo, el interés ha sido mayor en células de vertebrado, y la propagación de vertebrado en cultivo (cultivo de tejido) se ha vuelto un procedimiento de rutina en años recientes (Tisue Culture, 1973) . Ejemplos de tales líneas celulares hospedadoras usadas son VERO y células HeLa, líneas celulares (CHO) de ovario de hámster chino, y W1138, BH , COS-7 293, células (SF) de Spodoptera frugiperda « (comercialmente disponible como sistemas de expresión completa de i. a. Protein Sciences, 1000 Research Parway, Meriden, CT 06450, U.S.A. y de Invitrogen) , y líneas celulares MDCK. En la presente invención, una línea celular especialmente preferida es S2 disponible de Invitrogen, PO Box 2312, 9704 CH Groningen, Holanda. Vectores de expresión para tales células ordinariamente incluyen (sí' es necesario) un origen de replicación, un promotor localizado en el frente del gen a ser expresado, junto con cualquier sitio de enlace necesario al ribosoma, sitios de empalme al ARN, sitio de poliadenilación y secuencias terminadoras transcripcionales . Para uso en células de mamífero, las funciones de control en los vectores de expresión son a menudo proporcionadas por material viral. Por ejemplo, promotores comúnmente usados se derivan de polioma, Adenovirus 2, y más frecuentemente Simian Virus 40 (SV40) . Los promotores tempranos y tardíos del virus SV40 son particularmente usados debido a que ambos son pbtenidos fácilmente del virus como un fragmento el cual también contiene el origen viral SV40 de replicacion (Fiers et al., 1978). Fragmentos SV40 cortos o largos pueden también ser usados, con tal que se incluya la secuencia de aproximadamente 250 pb que se extiende desde el sitio Hindlll hacia el sitio Bgll localizado en el origen viral de replicacion. Además, también es posible, y a menudo deseable utilizar secuencias de control o promotoras normalmente asociadas con la secuencia del gen deseado, siempre que tales secuencias de control sean compatibles con los sistemas de células hospedadoras . Un origen de replicacion puede ser proporcionado ya sea por construcción del vector para incluir un origen exógeno, tal como puede seí derivado de SV40 u otro virus (por ejemplo, Polioma, Adeno, VSV, BPV) o puede ser proporcionado por el mecanismo de replicacion cromosomal de la célula hospedadora. Si el vector es integrado · en el cromosoma de la célula hospedadora, al último es a menudo suficiente .

Identificación de análogos de grelina útiles Será claro para la persona experta que no todas las variantes o modificaciones de la grelina nativa tendrán la capacidad para estimular anticuerpos en animales los cuales no son reactivos reticulados con la forma nativa. Esto no es, sin embargo, difícil para fijar tina selección estándar efectiva para moléculas de grelina modificadas las cuales cubren completamente los requerimientos mínimos para la reactividad inmunológica descrita aquí. Por lo tanto, otra parte de la invención se refiere a un método para la identificación de un polipéptido de grelina modificado el cual es capaz de inducir anticuerpos contra grelina no modificada en especies animales en donde el polipéptido de grelina no modificada es una proteina misma, el método comprende preparar, por medio de síntesis peptídica o por medios biológicos moleculares, una serie de polipéptidos de grelina mutuamente distintos modificados, en donde los aminoácidos han sido agregados a, insertados, en, suprimidos de, o substituidos en la secuencia de aminoácido de un polipéptido de grelina de las especies animales, dando origen con ello a secuencias de aminoácido en la serie la- cual comprende epitopes de células T, en las cuales están y extrañas a las especies animales, o preparar una serie de fragmentos de ácido nucleico que codifican la serie de polipéptidos de grelina mutuamente distintas modificadas, elementos de prueba de la seria por su habilidad para inducir producción de anticuerpos por las especies animales contra la grelina no modificada, e identificación y aislamiento opcionalmente de los elemento (s) de la serie, los cuales inducen significantemente la producción de anticuerpos contra grelina no modificada en las especies animales, o identificar y opcionalmente aislar los productos de expresión polipéptido codificados por elementos de la serie de fragmentos de ácido nucleico los cuales inducen significantemente producción de anticuerpos contra el polipéptido de grelina no modificado en las especies animales . En este contexto, la "serie de polipéptidos de grelina mutuamente distintos modificados", es una colección de polipéptidos de grelina no idénticos modificados los cuales han sido por ejemplo, seleccionados en base del criterio discutido anteriormente (por ejemplo, en combinación con estudios de dicroismo circular, espectro de RMN, y/o patrones de difracción de rayos X en grelina) . La serie puede consistir de solamente algunos elementos, pero se contempla que la serie puede contener varios cientos de elementos. Del mismo modo, la serie de fragmentos de ácido nucleico es una colección de fragmentos de ácido nucleico no idénticos, cada uno que codifica un polipéptido de. grelina modificado seleccionado de la misma manera. La prueba de elementos de la serie puede ser finalmente realizada in vivo, pero un número de pruebas in vitro pueden ser aplicadas las cuales estrechan hacia abajo el número de moléculas modificadas las cuales servirán para él propósito de la invención. Puesto que la meta de introducir los epitopes de células T extrañas es soporte a la respuesta de las células B por células T auxiliadoras, un prerrequisito es que la proliferación de células T se induzca por la grelina modificada. La proliferación de las células T puede ser probada por ensayos de proliferación estandarizados in vitro. En cortó, una muestra enriquecida para células T se obtiene de un sujeto y subsecuentemente se mantiene en cultivo. Las células T cultivadas están en contacto con APC del sujeto los cuales han tomado previamente la molécula modificada y procesado en la actualidad a- sus epitopes de células T. La proliferación de células 1 es monitoreada y comparada con un control adecuado (por ejemplo, células en cultivo puestas en contacto con APC el cual ha procesado intacto la grelina nativa) . Alternativamente, la proliferación puede ser medida determinando la concentración de citocinas relevantes liberadas por las células T en respuesta a su reconocimiento de células T extrañas. Habiendo considerado altamente probable que al menos una grelina modificada de la serie es capaz de inducir la producción de anticuerpo contra grelina/ es posible preparar una composición inmunogénica que comprende al menos, un polipéptido de grelina modificado el cual es capaz de inducir anticuerpos contra grelina no modificada en una especie animal, en donde el polipéptido de grelina no modificado es una proteina misma, el método comprende mezclar el (los) elemento (s) de la serie los cuales significantemente inducen la producción de anticuerpos en las especies animales las cuales son reactivas con grelina con un portador farmacéuticamente y/o inmunológicamente aceptable y/o vehículo y/o diluyente y/o excipiente, opcionalmente en combinación con al menos un adyuvante farmacéuticamente e inmunológicamente aceptable. Del mismo modo, es posible también preparar una composición inmunogénica la cual como un inmunogeno, contiene un fragmento de ácido nucleico que codifica un análogo de grelina inmunogénico, cotéjese, la discusión de la vacunación de ácido nucleico anterior. Los aspectos anteriores de la invención son convenientemente llevados a cabo preparando inicialmente un número de secuencias de ácido nucleico mutualmente distintas o vectores de la invención, insertando estos en vectores de expresión apropiados, transformando células hospedadoras adecuadas con los vectores, y expresando las secuencias de ácido nucleico de la invención. Estas etapas pueden ser seguidas por aislamiento de los productos de expresión. Se prefiere que las secuencias de ácido nucleico y/o vectores se preparen por métodos que comprenden ejercer una técnica de amplificación molecular tal como PCR o por medio de síntesis de ácido nucleico.

Acoplamiento de grelina a un polihidroxipolímero Se pueden obtener moléculas que comprenden un epitope T auxiliador y péptidos que representan o incluyen epitopes de células B unidos covalentemente a una molécula de polímero no inmunogénico actuando como un vehículo, por ejemplo, un poli-hidroxipolímero multivalente activado, que funcionará como moléculas de vacuna que solamente contienen las partes inmunologicamente relevantes. Los promiscuos o así llamados epitopes T auxiliadores universales pueden ser usados si por ejemplo, el objetivo para la vacuna es un antígeno mismo. Además, los elementos que mejoran la respuesta inmunológica podrían ser también acoplados al vehículo y con ello, actuar como un adyuvante. Tales elementos podrían ser mañosa, tuftsina, muramil dipéptido, porciones CpG, etc., por ejemplo, péptidos de estimulación inmune u objetivo. En tal caso, la formulación subsecuente de adyuvante del producto de vacuna puede ser necesaria y el producto podría ser administrado en agua pura o salina. Acoplando los epitopes de células T citotóxicas (CTL) junto con los epitopes T auxiliadores, será también posible generar CTL específicos para el antígeno a partir del cual el epitope CTL se derivó. Los elementos que promueven la captación del producto al citosol tales como mañosa, del APC, por ejemplo, un macrófago, podrían también estar acoplados al vehículo junto con el CTL y el epitope T auxiliador y mejorar la respuesta CTL. La relación de epitopes de células B y epitopes T auxiliadores . (P2 y P30) en el producto final, puede ser variada variando la concentración de estos péptidos en la etapa de síntesis. Como se mencionó anteriormente, la molécula inmunogénica puede ser etiquetada con por ejemplo, ma osa, tuftsina, porciones CpG u otras substancias de estimulación inmune (descritas aquí) agregadas a estas, si es necesario, usando por ejemplo, derivados aminados de la substancias, al amortiguador de carbonato en la etapa de síntesis . Si el polímero polihidroxi insoluble activado es usado para combinar los péptidos que contienen el epitope de las células B y los epitopes T auxiliadores puede, como se mencionó anteriormente, ser formado como una síntesis de fase sólida y el producto final puede ser cosechado y purificado por lavado y filtración. Los elementos a ser acoplados a un polihidroxipolímero tresil activado (péptidos, etiquetas, etc.), pueden ser agregados al polihidroxipolímero a pH bajo, por ejemplo, pH 4-5, y permitir ser igualmente distribuidos en el wgel" por difusión pasiva. Subsecuentemente, el pH puede ser elevado a pH 9-10 para iniciar la reacción de los grupos amino primarios en los péptidos y extremos a los grupos tresilo en el poli idroxipolímero. Después del acoplamiento de los péptidos y por ejemplo,- elementos de estimulación inmune, el gel es molido para formar partículas de tamaño adecuado para inmunización. Esta parte particular de la invención por lo tanto, se -refiere a un inmünogeno que comprende al menos una primera secuencia de aminoácido derivada de una proteína de interés, en donde al menos una primera secuencia de aminoácido contiene al menos una célula B y/o al menos un epitope CTL, y al menos una segunda secuencia de aminoácido que incluye un epitope de células T auxiliadoras extrañas, en donde cada una de las primeras y al menos segundas secuencias de aminoácido están acopladas a un portador polihidroxipolímero activado farmacéuticamente aceptable. Para que las secuencias de aminoácido se acoplen al polihidroxipolímero, es necesario normalmente "activar" el polihidroxipolímero con un grupo reactivo adecuado que puede formar el enlace necesario a las secuencias de aminoácido. El término ^polihidroxipolímero" está propuesto por tener el mismo significado como en el documento WO 00/05316, es decir, el polihidroxipolímero puede tener exactamente las mismas características como se muestra específicamente en tal solicitud. Por lo tanto, el polihidroxipolímero puede ser soluble en agua o insoluble (de este modo, requiere diferentes etapas de síntesis durante la preparación del i munógeno) . El polihidroxipolímero puede ser seleccionado de compuestos polihidroxi que se originan naturalmente y compuestos polihidroxi sintéticos. Los polihidroxipolímeros específicos y preferidos son polisacáridos seleccionados de acetan, amilopectina, goma agar-agar, agarosa, alginatos, goma Arábiga, carragenina, celulosa, ciclodextrinas, dextrano, furcelarano, galactomanano, gelatina, ghatti, glucano, glicógeno, guar, carayá, conjac/A, goma de algarroba, ma ano, pectina, psyllium, almidón, tamarina, tragacanto, xantano, xilano, y xiloglucano. El dextrano es especialmente preferido. Sin embargo, el polihidroxipolímero puede también ser seleccionado de poli (etilenimina) (PEI), tetratienilen vinilo, Kevlar (cadenas largas de poli-parafenil tereftalamida) , Poli (üretanos) , Poli (siloxanos) , polidimetilsiloxano, silicona, Poli (metil metacrilato) (PMMA) , Poli (alcohol vinilico) , Poli (vinil pirrolidona) , Poli (2-hidroxi etil metracrilato) , Poli (N-vinil pirrolidona), Poly (alcohol viníüco) , Poli (ácido acrílico) , Politetrafluoroetileno (PTFE) , 'Poliacrilamida, Poli (acetato de etileno-co-vinilo) , Poli (etilenglicol) y derivados, Poli (ácido metacrílico) , Poliláctidos (PLA) , Poliglicólídos (PGA), Poli (láctidos-co-glicólidos) (PLGA), Polianhídridos y Poliortoésteres altamente ramificados. El (peso) peso molecular promedio del polihidroxipolímero en cuestión (es decir, antes de la activación) , es típicamente al menos 500, tal como al menos 1,000, preferiblemente en el intervalo de 2,500-2,000,000, más preferiblemente en el intervalo de 3,000-1,000,000 en particular en el intervalo de 5,000-5000,000. Se ha mostrado en los ejemplos, que los polihidroxipolímeros que tienen un peso molecular promedio en el intervalo de 10,000-200,000 son particularmente ventajosos. El polihidroxipolímero es preferiblemente soluble en agua a una extensión de al menos 10 mg/ml, preferiblemente al menos 25 mg/ml, tal como al menos 50 mg/ml, en particular al menos 100 mg/ml, tal como al menos 150 mg/ml a temperatura ambiente. Se sabe que el dextrano, aún cuando se activa como se describe aquí, cubre completamente los requerimientos con respecto a la solubilidad en agua. Para algunos de los polihidroxipolímeros más interesantes, la relación entre grupos C (átomos de carbono) y OH (grupos hidroxi) de los polihidroxipolímeros inactivados (es decir, él polihidroxipolímero nativo .antes de la activación) está en el intervalo de 1.3 a 2.5, tal como 1.5-2.3, preferiblemente 1.6-2.1, en particular 1.85-2.05. Sin ser ligado por alguna teoría específica, se cree que tal relación C/OH del polihidroxipolímero inactivado representa un nivel altamente ventajoso de hidrofilicidad. El polivinilalcohol y polisacáridos son ejemplos de polihidroxipolimeros los cuales cubren completamente este requerimiento. Se cree que la relación mencionada anteriormente debe ser severamente la misma para el polihidroxipolímero activado como la tasa de activación debe ser preferentemente baja. El término "portador de polihidroxipolímero" está propuesto para denotar la parte del inmunogeno que porta las secuencias de aminoácido. COmo una regla general, el portador de polihidroxipolímero tiene sus límites exteriores en donde las secuencias de aminoácido pueden ser desdobladas de una peptidasa, por ejemplo, en un antígeno que presenta células que están procesando el inmunogeno. Por lo tanto, el portador de polihidroxipolímero puede ser el polihidroxipolímero con un grupo de activación, en donde el enlace entre el grupo de activación y la secuencia de aminoácido se puede desdoblar por una peptidasa en un APC, o el portador de polihidroxipolímero puede ser un polihidroxipolímero con grupo de activación y por ejemplo, un enlazador tal como un L-aminoácido único o un número de D-aminoácidos, en donde la última parte del enlazador puede unirse a las secuencias de aminoácido y ser desdobladas por una peptidasa en un APC. Como se mencionó anteriormente, los grupos funcionales portan polihidroxipolímeros (grupos de activación), los cuales facilitan el anclaje de péptidos al portador. Un amplio intervalo de grupos funcionales aplicables son conocidos en la técnica, por ejemplo, tresilo ( rifluoroetilsulfonilo) , maleiinido, cloroformiato de p-nitrofenilo, cianogenobromuro, tosilo (p-toluensulfonilo) , triflilo . (trifluorometansulfonilo) , pentafluorobencensulfonilo y grupos vinilsulfona. Ejemplos preferidos de grupos funcionales dentro de la presente invención son tresilo, aleimido, tosilo, triflilo, pentafluorobencen-sulfonilo, cloroformiato de p-nitrofenilo y grupos vinilsulfona, entre los cuales tresilo, maleimido y grupos tosilo son particularmente relevantes. Los polihidroxipolímeros activados con tresilo pueden ser preparados usando cloruro de tresilo como se describe por activación de dextrano en el Ejemplo 1 en el documento WO 00/05316 o como se describe en Gregorius et al., J, Immunol. Meth. 181 (1995) 65-73. Los polihidroxipolímeros activados con maleimido pueden ser preparados usando isocianato de p-maleimidofenilo como se describe por activación de dextrano en el Ejemplo 3 del documento WO 00/05316. Alternativamente, los grupos maleimido podrían ser introducidos a un polihidroxipolímero, tal como dextrano, por derivatización de un polihidroxipolímero activado con tresilo (tal como dextrano activado con tresilo (TAD) ) ' con un compuesto diamina (generalmente ¾N-CnH2n-NH2, en donde n es 1-20, preferiblemente 1-8) , por ejemplo, 1-3-diamínopropano, en exceso y subsecuentemente reaccionar los grupos amino introducidos en ??? ¦ con reactivos tales como 4- (N-maleimidometil) ciclohexan-l-carboxilato de succinimidilo (SMCC) , 4- (N-maleimidometil) ciclohexan-1-carboxilato de sulfo-succinimidilo (sulfo-SMCC) , 4- (p-maleimidofenil) butirato de succinimidilo (SMPB) , 4- (p-maleimidofenil) butirato de sulfo-succinimidilo (sulfo-SMPB) , éster de ?-?-maleimidobutiriloxi-succinimida (GMBS) o éster de N-y-maleimidobutiril-oxi-sulfosuccinimida. Aunque los reactivos diferentes y rutas para activación formalmente resultan en productos activados con maleimida ligeramente diferentes con respecto ai enlace entre la funcionalidad maleimida y el resto del grupo hidroxi original en el cual la activación se realiza, todos y cada uno son considerados como "polihidroxipolímeros activados con maleimida". Los polihidroxipolímeros activados con tosilo pueden ser preparados usando cloruro de tosilo como se describe por activación de dextrano en el Ejemplo 2 en el documento WO 00/05316. Los polihidroxipolímeros activados con triflilo y pentafluorobencensulfonilo son preparados como los análogos activados con tosilo o tresilo, por ejemplo, usando los cloruros de ácido correspondientes . Puede ser preparado el polihidroxipolímero activado con cianogenobromuro haciendo reaccionar el polihidroxipolímero con cianogenobromuro usando métodos convencionales . Lós grupos funcionales resultantes son normalmente ésteres de cianato con dos grupos hidroxi del polihidroxipolímero . El grado de activación puede ser expresado como la relación entre los grupos hidroxi libres y los grupos de activación (es decir, grupos hidroxi funcionalizados) . Se cree que una relación entre los grupos hidroxi libres del polihidroxipolímero y los grupos de activación deben ser entre 250:1 y 4:1 para obtener un balance ventajoso entre la hidrofilicidad y la reactividad del polihidroxipolímero. Preferiblemente, la relación está entre 100:1 y 6:1, más preferiblemente entre 60:1 y 8:1, en particular entre 40:1 y 10:1. Los polihidroxipolímeros activados especialmente interesantes para uso en el método para producir el inmunógeno aplicable de manera general de conformidad con la invención, son polisacáridos activados con tresilo, tosilo y maleimido, especialmente dextrano activado con tresilo (TAD) , dextrano activado con tosilo (TosAT)) y dextrano activado con maleimido (MAD) . Se prefiere que el enlace entre el portador de polihidroxipolímero y las secuencias de aminoácido unidas a estas sean desdobladas por una peptidasa, por ejemplo, como una peptidasa activa en el procesamiento de antígenos en APC. Se prefiere por lo tanto, que al menos las primeras y al menos la segunda secuencia de aminoácido estén acopladas al portador de polihidroxipolimero activado via un enlace amida o un enlace peptidico. Se prefiere especialmente que al menos las primeras y segundas secuencias de aminoácido cada una proporcionen una porción de nitrógeno de sus respectivos enlaces amida. El portador de polihidroxipolimero puede ser substancialmente libre de residuos de aminoácido, necesitando que el grupo de activación se proporcione para parte de un enlace que se puede desdoblar de peptidasa, pero como se mencionó anteriormente, el portador puede también simplemente incluir un espaciador que incluye al menos un L-aminoácido . Sin embargo, al menos las primeras y segundas secuencias de aminoácido están normalmente unidas a la versión activada del polihidroxipolimero via el nitrógeno al N-término de la secuencia de aminoácido.

EJEMPLO 1 Inmunización de ratas con grelina de rata inmunogenizada Se produjeron 5 péptidos por métodos estándares en un aparato de síntesis peptidica. Los péptidos fueron: péptido 1, un péptido de control irrelevante derivado de IgE y también que incluye los epitopes P2 y P30 (SEC ID NO: 7 y 8, respectivamente) , péptido 2/ grelina de rata madura, péptido 2, SEC ID NO: 9, residuos 24-53, y péptidos 3-5, es decir, las SEC ID NOsi 15-17, respectivamente. Los 5 polipéptidos fueron inyectados en 5 grupos (n=10) de ratas macho Sprague-Dawley. Cuatro inyecciones fueron dadas subcutáneamente con intervalos de 3 semanas que contienen 100 ig de péptido en un volumen total de 400 µ? (incluyendo adyuvante; adyuvante Freund completo, CFA, en primera inmunización, adyuvante Freund incompleto, IFA en las inmunizaciones de refuerzo) . Las muestras de sangre se retiraron después de 18 horas de ayunos al inicio del estudio y después de una semana después de cada inyección. Las muestras de sangre fueron analizadas para Grelina de rata en plasma usando un kit RIA comercial de Phoenix (kit RIA de Grelina (Ratón Rata)-), de conformidad con las instrucciones del fabricante, cotéjese Figura 4.

Fueron medidos tituladores anti-grélina usando un ELISA, en donde el enlace de anticuerpos anti-grelina a Grelina de rata en peso (Bachem) se detectó con un anticuerpo secundario inmunoglobulina anti-rata conjugado con HRP (Dáko) , cotéjese, Fig. 1. El peso corporal, así como también el alimento y agua absorbidos fueron medidos una vez a la semana, cotéjese figuras 2 y 3, respectivamente. Los resultados muestran que los péptidos 3-5 son capaces de inducir anticuerpos reactivos con gxelina de rata, mientras el control irrelevante (péptido 1) y la grelina de tipo nativo (péptido 2) no son. Sin embargo, de manera sorprendente, la inducción de anticuerpo se correlaciona con incrementos en niveles de grelina en sueros de ratas inmunizadas y con un incremento en peso corporal, mientras la absorción de alimento en los 5 grupos de ratas no difiere significantemente . El incremento en peso corporal puede por lo tanto, no ser adscrito a un incremento en la absorción de alimento, sino más probablemente es adscrito a un cambio en la metabolización en los animales que demuestran anticuerpos contra grelina.

EJEMPLO 2 Estudios pilotos de vacunas contra variantes adicionales El estudio en el Ejemplo 1 puede en principio, hacerse con varias otras moléculas de vacuna candidatas . Los candidatos ejemplares para una autovacuna de grelina pueden por ejemplo, ser construidos de conformidad con los conceptos descritos anteriormente (descritos i. a en detalle · en el documento WO 95/05849) por substitución o inserción con epitopes de células T promiscuas conocidas en la proteina de tipo nativa de grelina (o en su variante de propéptido) . Las substituciones en la proteína de tipo nativa de grelina (o en su variante de propéptido) . Las substituciones son substituciones peptídicas, en donde el péptido insertado puede ser de la misma o diferente longitud que el péptido suprimido en la secuencia de tipo nativa. Para combinación inicial del concepto por pruebas y selección in vivo, los constructos expuestos en las SEC ID NOs: 1-5 pueden ser usados en ratones. Las variantes correspondientes pueden hacerse con los epitopes P2 y P30 substituyendo la secuencia PADRE. Estos constructos serán preparados sintéticamente por medio de síntesis peptídica de fase sólida. Esto asegurará que los constructos carecerán de la actividad biológica de grelina madura, puesto que parece que la n-octanoilación de serina-3 (en grelina madura) , es esencial para la actividad biológica de grelina. Por su puesto, este efecto puede también ser logrado utilizando un sistema de expresión recombinante que no se permite para esta modificación post-traduccional particular. Una población de animales experimentales será vacunada de conformidad con un protocolo estándar (cebando con un constructo formulado en adyuvante Freund completo y reforzando con constructo formulado en adyuvante Freund incompleto), tal como uno usado en el Ejemplo 1 con cantidades optimizadas de estos 5 constructos formulados de conformidad con los procedimientos estándares y los animales serán acompañados a un grupo de control con respecto a la ganancia/pérdida de peso con el tiempo . Las variantes que producen una pérdida en peso (y también disminuyen en niveles de grelina) , serán adecuadas como candidatos para indicaciones en donde la pérdida de peso es de interés, mientras la variantes que imitan los resultados en el Ejemplo 1, tendrán las otras aplicaciones descritas aqui.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (60)

REIVINDICACIONES Habiéndose , descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un método para tratar y/o prevenir y/o aminorar la obesidad u otras enfermedades y condiciones caracterizadas por exceso de depósitos de grasa corporal, caracterizado porque el método comprende regular descendentemente la grelina inmunizando contra grelina autóloga en un animal, que incluye un ser humano, el método comprende efectuar la presentación al sistema inmune del animal de una cantidad inmunogénicamente efectiva de un inmunógeno, seleccionado del grupo que consiste de - al menos un polipéptido de grelina o subsecuencia del mismo, el cual ha sido formulado para que la inmunización del animal con el polipéptido de grelina o subsecuencia del mismo induzca producción de anticuerpos contra la grelina autóloga del animal, y - al menos un análogo de grelina que incorpora en la misma molécula al menos un epitope de células B de grelina y al menos una porción química no derivada de grelina para que la inmunización del animal con el análogo induzca producción de anticuerpos contra grelina.

2. Método para incrementar la masa corporal en un animal tal como un ser humano, caracterizado porque el método comprende la regulación ascendente de la grelina autóloga en el animal inmunizando contra la grelina autóloga en un animal, que incluye un ser humano, el método comprende efectuar la presentación al sistema inmune del animal de una cantidad inmunogénicamente efectiva de un inmunógeno seleccionado del grupo que consiste de - al menos un polipéptido de grelina o subsecuencia del mismo, el cual ha sido formulado para que la inmunización del animal con el polipéptido de grelina o subsecuencia del mismo induzca producción de anticuerpos contra la grelina autóloga del animal, y - al menos un análogo de grelina que incorpora en la misma molécula al menos un epitope de células B de grelina y al menos una porción química no derivada de grelina para que la inmunización del animal con el análogo induzca producción de anticuerpos contra grelina.

3. Método de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque el inmunógeno es un análogo de grelina.

4. Método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el análogo ha preservado una fracción substancial de epitopes de células B de grelina y en donde el análogo también comprende - al, menos un epitope del linfocito T auxiliador extraño (epitope TH) r y/o - al menos una primera porción la cual efectúa el objetivo del análogo a una célula que presenta antigeno (APC) , o un linfocito B, y/o - al menos una segunda porción la cual estimula el sistema inmune y/o - al menos una tercera porción la cual optimiza la presentación del análogo al sistema inmune.

5. Método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el epitope TH extraño y/o la primera y/o la segunda y/o tercera porción es/están presentes en el análogo siendo unidas a grupos laterales adecuados de grelina o a una subsecuencia del mismo.

6. Método de conformidad con la reivindicación 4 ó 5, caracterizado porque el análogo es un polipéptido de grelina que es modificado por al menos una substitución y/o supresión y/o inserción y/o adición de aminoácido.

7. Método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el análogo es un polipéptido de fusión.

8. Método de conformidad con la reivindicación 6 ó 7, caracterizado porque la substitución y/o supresión y/o inserción y/o adición de aminoácido permite una preservación substancial de la estructura terciaria total de la grelina en el análogo .

9. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 y 5-8, a pesar de esta dependencia en la reivindicación 4, caracterizado porque el análogo incluye duplicación de al menos un epitope de células B de grelina y/o introducción de un hapteno.

10. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 y 5-9, a pesar de esta dependencia en la reivindicación 4, caracterizado porque el epitope de células T extrañas es inmunodominante en el animal.

11. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 y 5-10, a pesar de esta dependencia en la reivindicación 4, caracterizado porque el epitope de células T extrañas es promiscuo.

12. Método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque al menos un epitope de células T extrañas se selecciona de un epitope de células T promiscuo natural y una secuencia peptídica enlazada a MHC-II artificial .

13. Método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado' porque el epitope de células T natural se selecciona de un epitope de Tetanus toxoide tal como P2 o P30, un epitope de difteria toxoide, un epitope de hemaglutinina del virus de la influenza, y un epitope CS de P. falciparum.

14. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 y 5-13, a pesar de esta dependencia en la reivindicación 4, caracterizado porque la primera porción es un asociado de enlace substancialmente específico para un antigeno de superficie específico del linfocito B o por un antígeno de superficie específico de APC, tal como un hapteno o un carbohidrato para el cual existe un receptor en el linfocito B o el APC.

15. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 y 5-14, a pesar de esta dependencia en la reivindicación 4, caracterizado porque la segunda porción se selecciona de una citocina y una proteína de golpe por calor.

16. Método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la citocina se selecciona de, o es una parte efectiva de interferona ? (IFN-?) , Flt3L, interleucina 1 (IL-1) , interleucina 2 (IL-2) , interleucina 4 (IL-4) , interleucina 6 (IL-6) , interleucina 12 (IL-12) , interleucina 13 (IL-13) , interleucina 15 (IL-15) y factor de estimulación de colonias de macrófago del granulocito (GM-CSF) , y la proteína de golpe por calor se selecciona de, o es una parte efectiva de cualquiera de HSP70, HSP90, HSC70, GRP94, y calreticulina (CRT) .

17. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 y 5-16, a pesar de esta dependencia en la -reivindicación 4, caracterizado porque la tercera porción es de naturaleza lípida, tal como el grupo palmitoilo, un grupo miristilo, un grupo farnesilo, un grupo geranil-geranilo, un anclaje GPI, y un grupo N-acil dlglicérldo.

18. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el inmunógeno comprende una substitución de al menos una secuencia de aminoácido dentro del polipéptido grelina con una secuencia de aminoácido de igual o diferente longitud la cual da origen a un epitope TH extraño en el análogo.

19. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el polipéptido de grelina comprende una secuencia de aminoácido que corresponde a los aminoácidos 24-51 en la SEC ID NO: 11 o una secuencia del mismo, en donde está insertado una secuencia de aminoácido que da origen a un epitope TH extraño en el análogo o en donde al menos una secuencia de aminoácido es substituida por una secuencia de aminoácido de igual o diferente longitud para dar origen a un epitope TH extraño en el análogo, en donde la introducción se realiza después de cualquiera de los aminoácidos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, y 117 en la SEC ID NO: 11, y, en donde los aminoácidos 1 y/o 2 y/o 3 y/o 4 y/o 5 y/o 6 y/o 7 y/u 8 y/o 9 y/o 10 y/o 11 y/o 12 y/o 13 y/o 14 y/o 15 y/o 16 y/o 17 y/o 18 y/o 19 y/o 20 y/o 21 y/o 22 y/o 23 y/o 24 y/o 25 y/o 26 y/o 27 y/o 28 y/o 29 y/o 30 y/o 31 y/o 32 y/o 33 y/o 34 y/o 35 y/o 36 y/o 37 y/o 38 y/o 39 y/o 40 y/o 41 y/o 42 y/o 43 y/o 44 y/o 45 y/o 46 y/o 47 y/o 48 y/o 49 y/o 50 y/o 51 y/o 52 y/o 53 y/o 54 y/o 55 y/o 56 y/o 57 y/o 58 y/o 59 y/o 60 y/o 61 y/o 62 y/o 63 y/o 64 y/o 65 y/o 66 y/o 67 y/o 68 y/o 69 y/o 70 y/o 71 y/o 72 y/o 73 y/o 74 y/o 75 y/o 76 y/o 77 y/o 78 y/o 79 y/u 80 y/u 81 y/u 82 y/u 83 y/u 84 y/u 85 y/u 86 y/u 87 y/u 88 y/u 89 y/o 90 y/o 91 y/o 92 y/o 93 y/o 94 y/o 95 y/o 96 y/o 97 y/o 98 y/o 99 y/o 100 y/o 101 y/o 102 y/o 103 y/o 104 y/o 105 y/o 106 y/o 107 y/o 108 y/o 109 y/o 110 y/o 111 y/o 112 y/o 113 y/o 114 y/o 115 y/o 116 y/o 117 en la SEC ID NO: 11 pueden ser suprimidos.

20. Método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porgue el análogo se selecciona del grupo que consiste de polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácido seleccionada de la SEC ID NO:l, SEC ID NO-.2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4 y SEC ID NO:5.

21. Método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el inmunógeno tiene poliaminoácidos covalentemente o no covalentemente ligados a una molécula portadora capaz de efectuar la presentación de copias múltiples de determinantes antigénicas, en donde los poliaminoácidos sé seleccionan del grupo que consiste de un polipéptido de grelina, una secuencia de grelina, y un análogo de grelina.

22. Método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque la molécula portadora contiene o consiste de un polihidroxipolimero activado farmacéuticamente aceptable.

23. Método de conformidad con la reivindicación 22 a pasar de que depende de la reivindicación 4, caracterizado porque el polihidroxipolimero sirve como una estructura portadora a la cual están separadamente unidos 1) un polipéptido de grelina o subsecuencia del mismo y 2) un epitope TH extraño.

24. Método de conformidad con la reivindicación 22 ó 23, caracterizado porque los poliaminoácidos están unidos al polihidroxipolimero vía un enlace que se puede desdoblar por una peptidasa, tal como un enlace amida o un enlace peptidico .

25. Método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque los poliaminoácidos proporcionan para la porción de nitrógeno de su enlace amida respectivo.

26. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 22-25,- caracterizado porque el portador de polihidroxipolimero es substancialmente libre de residuos de aminoácidos .

27. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 22-26, caracterizado porque los poliaminoácidós están unidos al polihidroxipolimero activado via el nitrógeno al N-término de la secuencia de aminoácidos.

28. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 22-27, caracterizado porque el polihidroxipolimero es soluble en aguaT

29. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 22-26, caracterizado porque el polihidroxipolimero es soluble en agua.

30. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 22-29, caracterizado porque el polihidroxipolimero se selecciona de compuestos polihidroxi que se originan naturalmente y compuestos polihidroxi sintéticos .

31. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 22-30, caracterizado porque el polihidroxipolimero es un polisacárido.

32. Método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque el polisacárido se selecciona del grupo que consiste de acetan, amilopectina, goma agar-agar, agarosa, alginatos, goma Arábiga, carragenina, celulosa, 12€ ciclodextrinas, dextrano, furcelarano, galactomanano, gelatina, ghatti, glucano, glicógeno, guar, carayá, conjac/A, goma de algarroba, mañano, pectina, psyllium, almidón, tamarina, tragacanto, xantano, xilano, y xiloglucano.

33. Método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado' porque el polihidroxipolimero es dextrano.

34. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 22-30, caracterizado porque el polihidroxipolimero se selecciona del grupo que consiste de poli (etilenimiha) (PEI), tetratienilen vinilo, Kevlar (cadenas largas de poli-parafenil tereftalamida) , Poli (uretanos) , Poli (siloxanos) , polidimetilsiloxano, silicona, Poli (metil metacrilato) (PMMA) , Poli (alcohol viniüco) , Poli (vinil pirrolidona), Poli (2-hidroxi etil metracrilato) , Poli (N-vinil pirrolidona), Poly (alcohol vinílico) , Poli (acido acrilico) , Politetrafluoroetileno (PTFE) , Poliacrilamida, Poli (acetato de etileno-co-vinilo) , Poli (etilenglicol) y derivados, Poli (ácido metacrilico) , Poliláctidos (PLA) , Poliglicólidos (PGA) , Poli (láctidos-co-glicólidos) (PLGA) , Polianhidridos y Poliortoésteres altamente ramificados.

35. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 22-34f caracterizado porque el peso molecular promedio del polihidroxipolimero antes de la activación es al menos 500.

36. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 22-35, caracterizado porque el polihidroxipolimero es activado con grupos funcionales seleccionados de tresilo (trifluoroetilsulfonilo) / maleimido, cloroformiato de p-nitrofenilo, y tosilo (p-toluensulfonilo) .

37. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 22-36, caracterizado porque además comprende al menos un poliaminoácido que está acoplado al polihidroxipolimero, al menos un poliaminoácido adicional se selecciona del grupo que consiste de péptidos de estimulación inmune o un péptido objetivo.

38. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque una cantidad efectiva del inmunógeno se administra al animal via una ruta seleccionada de la ruta parenteral tal como las rutas intradermal, subdermal, intracutánea, subcutánea e intramuscular; ruta peritoneal; ruta oral; ruta bucal; ruta sublingual; ruta epidüral; ruta espinal; ruta anal; y la ruta intracraneal .

39. Método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque la cantidad defectiva está entre 0.5 µg y 2,000 g del polipéptido de grelina, la subsecuencia del mismo o el análogo del mismo.

40. Método de conformidad con la reivindicación 37 o 38, caracterizado porque el polipéptido de grelina o análogo está contenido en un dispositivo de nudo linfático virtual (NLV) . ·

41. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 38-40, caracterizado porque el polipéptido de grelina, la subsecuencia del mismo, o el análogo de grelina han sido formulados . con un adyuvante el cual facilita el rompimiento de la auto-tolerancia a antígenos mismos.

42. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-20, caracterizado porque la presentación del inmunógeno al sistema inmune se efectúa introduciendo ácido (s) nucleico (s) que codifican el inmunógeno en las células del animal y con ello, obtienen la expresión in vivo por las células del ácido (s) nucleico introducido.

43. Método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque el (los) ácido (s) nucleico (s) introducidos son/se seleccionan de ADN desnudos, ADN formulado con lipidos cargados o no cargados, ADN formulado en liposomas, ADN incluido en un vector viral, ADN formulado con una protexna o polipéptido que facilitan la transfección, ADN formulado con una proteína objetivo o polipéptido, ADN formulado con agentes que precipitan calcio, ADN acoplado a una molécula portadora inerte, ADN encapsulado en quitina o quitosan, y ADN formulado con un adyuvante.

44. Método de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque el (los) ácido (s) nucleico (s) es/son obtenidos en un dispositivo NLV.

45. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 38-44, caracterizado porque incluye al menos una administración/introducción por año, tal como al menos 2 , al menos 3, al menos 4, al menos 6, y al menos 12 administraciones/introducciones .

46. Análogo de un polipéptido de grelina, caracterizado porque se deriva de un polipéptido de grelina animal, en donde es introducida una modificación la cual tiene como un resultado que la inmunización del animal con el análogo induzca producción de anticuerpos contra el polipéptido de grelina autóloga del animal y el cual está definido en cualquiera de las reivindicaciones 4-37.

47. Composición inmunogénica caracterizada porque comprende una cantidad inmunogénicamente efectiva de un análogo de conformidad con la reivindicación 46, caracterizada porque la composición además comprende un portador y/o vehículo farmacéuticamente e inmunogénicamente aceptable y opcionalme te un adyuvante.

48. Fragmento de ácido nucleico caracterizado porque codifica un análogo como se define en cualquiera de las reivindicaciones 4-20.

49. Vector caracterizado porque porta el fragmento de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 48, tal como un vector que es capaz de replicación autónoma.

50. Vector de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado porque se selecciona del grupo que consiste de un plásmido, un fago, un cósmido, un mini-cromosoma, y un virus .

51. Vector de conformidad con la reivindicación 49 o 50, caracterizado porque comprende en la dirección 5;-3' y en enlace operable, un promotor para accionar la expresión del fragmento de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 48, opcionalmente una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido lider que permite la secreción de o integración en la membrana del fragmento de polipéptido, el fragmento de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 48, y opcionalmente un terminador.

52. Vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 49-51, caracterizado porque cuando se introduce en una célula hospedadora, es capaz o incapaz de ser integrado en el genoma de la célula hospedadora.

53. Vector de conformidad con la reivindicación 51 o 52, caracterizado porque un promotor acciona la expresión en una célula eucariótica y/o en una célula procariótica.

54. Célula transformada que lleva el vector de cualquiera de las reivindicaciones 49-53, caracterizada porque una célula transformada es capaz de replicar el fragmento de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 48.

55. Célula transformada de conformidad con la reivindicación 54, caracterizada porque es un microorganismo seleccionado de una bacteria, levadura, protozoario, o una célula derivada de un organismo multicelular seleccionado de un hongo, una célula de insecto, tal como una célula S2, o SF, una célula de planta, y una célula de mamífero.

56. Célula transformada de conformidad con la reivindicación 54 o 55, caracterizada porque expresa el fragmento de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 48, tal como una célula transformada, la cual secreta o porta en su superficie, el análogo de conformidad con la reivindicación 46.

57. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-20, caracterizado porque la presentación al sistema inmune se efectúa por administración de un microorganismo no patogénico o virus, el cual es portador de un fragmento de ácido nucleico el cual codifica y expresa el polipéptido, subsecuencia o análogo de grelina.

58. Composición para inducir producción de anticuerpos contra un polipéptido de grelina en el hospedador autólogo, caracterizada porque la composición comprende - un fragmento de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 48 o un vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 49-53 y un portador y/o vehículo y/o adyuvante farmacéuticamente e inmunológicamente aceptable.

59. Línea celular estable caracterizada · porque porta el vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 49-53 y la cual expresa el fragmento de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 48, y el cual opcionalmente secreta o porta el análogo de conformidad con la reivindicación 46 en su superficie.

60. Método para la preparación de la célula de conformidad don cualquiera de las reivindicaciones 54-56, caracterizado porque el método comprende transformar una célula ñospedadora con el fragmento de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 48 o con el vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 49-53.