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MXPA05002209A - Remedio. - Google Patents

Remedio.

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Publication number
MXPA05002209A
MXPA05002209A MXPA05002209A MXPA05002209A MXPA05002209A MX PA05002209 A MXPA05002209 A MX PA05002209A MX PA05002209 A MXPA05002209 A MX PA05002209A MX PA05002209 A MXPA05002209 A MX PA05002209A MX PA05002209 A MXPA05002209 A MX PA05002209A
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MX
Mexico
Prior art keywords
macrophages
plga
cells
remedy
macrophage
Prior art date
Application number
MXPA05002209A
Other languages
English (en)
Inventor
Gen-Ichiro Soma
Original Assignee
Terada Hiroshi
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Terada Hiroshi filed Critical Terada Hiroshi
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Abstract

Se pretende proporcionar un remedio para enfermedades causada por macrofagos con disfuncion o mediadas por macrofagos. Especialmente el remedio que activa la capacidad fagocitica de los macrofagos debido a la fagocitosis vigorosa. Como resultado, los macrofagos con disfuncion se normalizan, los macrofagos infectados con el patogeno se exterminan o el patogeno en los macrofagos infectados se exterminan.

Description

REMEDIO CAMPO DE LA INVENCIÓN " "'. La presente invención se refiere a un remedio para normalizar los macrófagos con disfunción al aprovechar la capacidad fagocitica de los macrófagos, o efectivo para diversos patógenos infecciosos. El remedio de conformidad con la invención se dirige a todas las substancias dadas en una base terapéutica y/o de diagnóstico y ensambles de las mismas y una formulación de las mismas es una me,zcla médica de un medicamento (incluyendo un portador de medicamento en algunos casos) y el portador de medicamento. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN 1. Macrófago Primero, un macrófago, que juega una función central en una acción de un remedio de acuerdo con la invención se revisa. > ., Se describen en detalle la morfología y funciones del macrófago, por ejemplo en "Seimei o sasaeru Macrophage (Macrophage hich Supports Life) " con el autor de Kiyoshi Takahashi (Bunkodo, 2001) y el antecedente relacionado a la invención es como sigue. El macrófago es una célula que configura un sistema de fagocitos mononucleares (MPS, por sus siglas en inglés) . Un monocito en la sangre se deriva de una célula madre hematopoyética en la médula ósea, divide/hace REF: 162291 diferente en la médula ósea para fluir dentro de la sangre, y se asienta en diversos tejidos para diferenciar una célula monocitica denominada por diversos nombres'. 'Esta célula se refiere como un histiocito en tejido conectivo, célula Kupper en el hígado y un macrófago alveolar en el pulmón, un macrófago en el ganglio linfático y en el bazo, un macrófago torácico/macrófago peritoneal en una cavidad corporal, un osteoclasto en el hueso, célula de Langerhans en la piel, una célula de microglia en el tejido de.' 'los nervios, una microglia en el cerebro y una célula de tipo A en la membrana sinovial y tiene naturalezas específicas de tejido. 1.- Características Generales (1) Es una célula mononuclear con un diámetro con alrededor de 15 hasta 20 µ??, es abundante en el citoplasma y se adhiere fácilmente a una superficie de vidrio y plástico. Se mueve con la pseudopodia y tiene una fuerte fagocitosis de substancias externas. > ., (2) Tiene una célula de defensa del hospedero (3) Tiene una capacidad eliminadora de substancias externas y una competencia inmunológica (4) Presenta información de antígenos a un linfocito T para establecer inmunidad. (5) Se activa por el interferón para volverse un efector en una inmunidad mediada por células (6) Es más resiste a los rayos X que un linfocito. 2. - Importancia fisiológica de un linfocito (1) Capacidad fagocltica La fagocitosis es una de las funciones ' mejor conocidas del macrófago. Esta función se puede creer que es una de las funciones más básicas que ha estado comprendida ya que los organismos fueron organismos de una sola célula sencilla en el proceso de evolución desde el comienzo de la vida. Por lo tanto, una de las características del macrófago es que su existencia tiene transversalmente especies de universalidad. Parece que esta característica proporciona una de las mayores ventajas para la investigación en las funciones de macrófago. Esto es, si un remedio para las enfermedades de mamíferos se desarrolla/investiga, los macrófagos de otros diferentes a mamíferos pueden ser funcionalmente útiles como materiales de investigación. Esto se debe a un aspecto de que el macrófago es una célula filogenéticamente conservada. (2) Función de defensa del hospedero Un segundo aspecto importante en cuanto a las funciones del macrófago es una acción de defensa del hospedero. Esta acción se refiere como una acción de defensa de hospedero no específica, pero la investigación reciente ha demostrado que la acción de defensa del hospedero del macrófago también es específica. Originalmente el término, no especificidad, ha sido una palabra que corresponde a una especificidad del antígeno y una memoria inmunológica caracterizada por la célula T y en la actualidad, no se ha probado que el macrófago tenga la especificidad del antígeno o la memoria inmunológica en una sentido preciso. Asi, hO es exactamente erróneo que la acción de defensa del hospedero del macrófago sea no específica. Sin embargo, por ejemplo, la respuesta de los macrofagos es cualitativamente diferente dependiendo de los tipos de patógeno, y una parte de estas respuestas cualitativamente diferentes corresponde a una diferencia de los receptores en la superficie celular ' del macrófago, el cual reconoce a los patógenos. Así, desde ¾el punto de vista del lado de la respuesta celular a la estimulación de una substancia externa (ambiente) , se puede decir que la acción de los macrofagos es especifica. Actualmente, se vuelve común entender la acción de defensa del hospedero con base en los macrofagos como un sistema inmune innato y la acción de defensa del hospedero con base en las células T como un> .vsistema inmune adquirido. Adicionalmente , al considerar la universalidad filogenética, es algo común que el sistema inmune innato también es un sistema de defensa del hospedero filogenéticamente altamente conservado . (3) Sistema inmune innato El sistema inmune innato con base a los macrofagos juega un papel central en una sistema de defensa del hospedero que son el sistema de eliminación y discriminación de substancias externas no solamente en las especies que no tienen el sistema inmune adquirido, sino también en las especies que comprenden el sistema inmune adquirido. Aún 'en organismos que comprenden el sistema inmune adquirido, la función del sistema inmune innato cubre la discriminación y eliminación de las substancias externas casi en todos los casos, y en el caso en donde es insuficiente, se recluta el sistema inmune adquirido. Aún en este caso, la presentación del antígeno por el macrófago es esencial para el reconocimiento específico de la substancia externa y cuando se elimina la substancia externa, aquellos que juegan papeles centrales en el sistema de eliminación son los macrofagos y similares que son las células que configuran el sistema inumne innato (4) Eliminación de las substancias externas Por otro lado, ' las substancias externas endógenas se eliminan por las células T citotóxicas características del sistema de inmune adquirido (por 'ejemplo la eliminación de células infectadas con el virus) , pero las otras células T presentadas con el antígeno por los macrofagos son esenciales para la proliferación y maduración de estas células T citotóxicas. Esto es, con objeto de que el sistema inmune adquirido sirva significativamente, el sistema inmune innato debe servir completamente y adecuadamente hasta el final . (5) Falla de la función Por lo tanto, la falla de la función de la fagocitosis o la presentación del antigeno de los macrófagos se puede convertir principalmente en la causa potencial de inmunodeficiencia. Para ponerlo concretamente, . lo siguiente se sabe como la falla de la función y enfermedades relacionadas con los aspectos establecidos en el 1.1 anterior (características generales de los macrófagos). Esto es: 1) Deficiencia de adhesión de leucocitos, síndrome de Chediac-Higashi y similares se sabe como una anormalidad de la función fagocítica como una anormalidád de la fagocitosis de la substancia externa. En ambos casos ,1a anormalidad se observa en la función fagocítica y en el último, el transporte de una enzima lisosomal a una cavidad hueca fagocítica es anormal, así se reduce la capacidad de la desinfección y la capacidad fagocítica se facilita notablemente . 2) En cuanto a la enfermedad como la anormalidad de la defensa del hospedero, se incluye >l,a candidiasis mucocutánea crónica. En los macrófagos en los pacientes con esta enfermedad, se reduce la capacidad de migración y la capacidad de desinfección de candida también se reduce. 3) En cuanto a la enfermedad como la anormalidad de la capacidad de eliminación de substancias externas y la competencia inmunologica se puede incluir en el síndrome de Wískott-Aldrich. Los macrófagos del paciente muestran una anormalidad inmunologica complicada tal como una anormalidad de la migración y un defecto de una acción citotóxica dependiente de anticuerpos. 4) -En cuanto a la disfunción para "la .capacidad de presentación de información del antigeno el complejo principal de histocompatibilidad ( HC) de clase II de deficiencia de antígenos en donde se provoca una inmunodeficiencia severa se conoce independientemente de las células normales T y B . 5) En cuanto a la disfunción en el, .'aspecto de que el macrófago se activa por un interferón para , convertirse en el efector de la inmunidad mediada por células, se conoce una deficiencia del receptor de interferón en donde un niño con un receptor de interferón deficiente no puede defenderse de una infección tubercular que se vuelve fatal . Además un mamífero con deficiencia en el sistema inmune adquirido puede existir y vivir pero un animal con deficiencia de macrófagos no puede existir. ?, se está demostrando que las substancias fisiológicamente activas referidas colectivamente como citocinas que efectúan la señalización intercelular juegan papeles importantes en el sistema de defensa del hospedero con base en la eliminación y discriminación de una substancia externa. Los macrófagos producen y secretan una amplia variedad de citocinas. De esta manera, las funciones del macrófago son esenciales para la homeostasis individual también con respecto a la discriminación y eliminación de una substancia externa. 6) Características anatómicas Las características anatómicas del' ' macrófago son diferentes dependiendo de los macrofagos específicos de tejidos que residen en diversos tejidos y tienen caracteres inherentes. Esto es obvio cuando se observa en el tejido de la mucosa que es un punto de contacto entre un individuo y un ambiente. Los macrofagos específicos son residentes en las capas submucosas del órgano respiratorio,.' 'órgano digestivo y órgano genitourinario respectivamente. .Estos macrofagos específicos de tejidos responden biológicamente a ambientes internos y externos específicos de tejidos. Esto sugiere que los macrofagos juegan un papel importante para la homeostasis de órganos además de la discriminación y eliminación de una substancia externa. 'Existen muchos aspectos desconocidos en la importancia fisiológica de los macrofagos específicos de tejidos. En la reflexión, se >cpnsidera una existencia importante de los macrofagos específicos de tejidos desde un nuevo punto de vista, su relación con varias patologías se puede ahora llevar a la atención. 7) Relación con la patología Debido a que si se piensa de la importancia fisiológica que el macrófago juega un papel central en el sistema inmune, se sugiere fuertemente que la disfunción del macrófago específico de tejidos se involucra en la inducción de patologías específicas de tejidos. De hecho, en muchas enfermedades incurables tales como la enfermedad de Crohn que es una de las enfermedades intestinales inflamatorias, una enfermedad autoinmune adicional tal como la reumatoide y enfermedades de la vejez tales como la osteoporosis, se involucra de alguna manera la disfunción de los macrofagos . En infecciones crónicas en bacterias con ayuno ácido tales como las gérmenes de la tuberculosis, además de los problemas de las bacterias con ayuno ácido per se,, se pueden pensar que la disfunción de los macrofagos alveolares está presente en el contexto de la patología. Al considerarlo de esta manera, se puede decir que el desarrollo de un remedio que incrementa la capacidad fagocítica del macrófago como una célula objetivo e incrementa consecuentemente una concentración del remedio en el macrófago es un asunto extremadamente importante y razonable para suministrar una terapia novedosa de enfermedades incurables qué.v incluyen enfermedades infecciosas tales como la tuberculosis para la cual no hay una terapia efectiva. II.- Disfunción de macrofagos y enfermedades (1) Macrófago como vehículo patógeno infeccioso De acuerdo con la ???, la tuberculosis, SIDA, paludismo y similares son enfermedades crónicas incurables que se deben considerar por ser las más importantes a escala mundial . Por ejemplo, se describe que 800 millones o más pacientes con tuberculosis se presentan anualmente y 300 millones mueren. Es una tarea urgente desarrollar un remedio (medicamento/formulación) efectivo en resp'uesta a estas enfermedades, y su importante social es extremadamente grande . Por otro lado, con respecto a la defensa de la infección y eliminación de un patógeno, una de las células que juega el papel más importante in vivo es el macrófago . De hecho, los macrófagos se distribuyen en todos los órganos. Estos macrófagos son diferentes en morfología y funciones dependiendo de los órganos en donde existen los macrófagos, pero son comunes en el aspecto de que llevan a cabo la defensa de la infección/eliminación del patógeno. Por otro lado, los patógenos infecciosos han adquirido diversos medios para evitar el ataque de los macrófagos en el proceso de evolución. Además los patógenos infecciosos se ocultan a menudo en los macrófagos -para hacer al macrófago un hospedero . Es un asunto común que el patógeno que ha tenido éxito en ser un parásito en el macrófago provoca de esta manera crónicamente una enfermedad infecciosa y repetida, y no es inusual que resulte en una consecuencia fatal . Esto es en esta caso, el macrófago que debe principalmente lograr la defensa de la infección/eliminación de una patógeno sirve como un vehículo de patógeno infecciosos en reversa. (2) Patógenos en los macrófagos Un ejemplo típico de los mismos se puede observar en la tuberculosis. Esto es, el patógeno (Mycobacteriun tuberculosis o Mycobacterium Boris) forma "fagocitos por el macrófago en el alveolo pulmonar que es una trayectoria infecciosa en una etapa temprana y se presenta establemente en una fagosoma formado por ese momento. Esto es, el patógeno puede vivir al hacer el macrófago que debe digerir principalmente como un refugio. Además, muchos patógenos de causa tales como Mycobacterium leprae que es el patógeno que provoca la lepra, Mycobacterium avium que es el patógeno que provoca la micobacteriosis atípica, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatis o Chlamydia psittaci que son patógenos que provocan una clamidiosis de enfermedades incurables cuya terapia radical no se ha establecido y se teme la propagación, son comunes en el aspecto de que el macrófago se vuelve vehículo infecciosos del patógeno . > ., Para los gérmenes de tuberculosis, virus del SIDA y similares, se dan diversos esfuerzos para su prevención. Sin embargo, una vez que se ha establecido la infección no hay una terapia efectiva. Aún si está presente un compuesto que tenga una acción de desinfección directa contra el patógeno infecciosos en general, no es fácil lograr una concentración en el macrófago con el patógeno, que sea suficiente para exterminar el patógeno específico (exterminio en la invención, significa que todo o parte de los patógenos se exterminan hasta desvanecerse) , al administrar simplemente una remedio adecuado. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN De esta manera, aún si se pueden exterminar los patógenos extracelulares por la administración de un remedio efectivo, los macrofagos como los vehículos de patógenos están todavía vivos como fuentes de patógenos y continúan suministrando los patógenos. Lo anterior .'es una razón por lo cual actualmente no hay una terapia radical para el patógeno que se hace parásito en el macrófago. La invención hace a este punto un asunto. De manera inversa, si es posible eliminar los macrofagos infectados con los patógenos como los vehículos del patógeno o exterminar los patógenos en los macrofagos infectados con los patógenos, se pueden tratar radicalmente muchas enfermedades infecciosas, incurables, crónicas, antes descritas. Por lo tanto, es un objetivo de la invención proporcionar un remedio para una enfermedad provocada con base en la disfunción del macrófago o al hacer una macrófago un vehículo. Como resultado de un estudio intensivo, los inventores actuales han guiado a una idea notablemente novedosa en donde es un objetivo eliminar los macrofagos infectados con patógenos como vehículos de patógenos, exterminar los patógenos en los macrofagos infectados con los patógenos, y actuar sobre los macrófagos cuya función se ha vuelto anormal debido a una enfermedad, y han finalizado la invención. Un remedio de la invención se caracteriza .por facilitar una actividad fagocítica de macrófagos y exterminar los patógenos en los macrófagos. También, el remedio de la invención se caracteriza por facilitar la actividad fagocitica de macrófagos y que conduce a los macrófagos a la muerte celular. También el remedio de la invención.' se caracteriza por facilitar la actividad fagocitica de macrófagos y actuar sobre los macrófagos en un estado disfuncional . También, es deseable que el remedio de la invención sea para cualquiera de la micobacteriosis , SIDA, clamidiosis o toxoplasmosis . Esto permite tratar efectivamente las enfermedades en donde los macrófagos retienen los patógenos.
También es deseable que el remedio de la invención sea para enfermedad de Crohn, r^umatoide, síndrome de inmunodeficiencia o cáncer. Esto permite tratar efectivamente las enfermedades en donde los macrófagos están en un estado disfuncional . El SIDA se incluye en el síndrome de inmunodeficiencia . También, es deseable que los macrófagos anteriores sean aquellos que están residentes en los tejidos de la mucosa. Esto permite tratar efectivamente la enfermedad sitios tales como el órgano respiratorio, órgano digestivo y órgano genitourinario en donde los patógenos provocan una infección primaria . También es deseable que los macrófagos 'anteriores sean aquellos que están residentes en cualquiera de la cavidad peritoneal, omento mayor, puntos lechosos, alveolo pulmonar, estroma palomar, hígado, área de la vena portal, bazo, médula ósea, timo, tracto digestivo, amígdalas palatinas, glándula adrenal, pituitaria, estroma de tiroides, islotes de Langerhans, glándula paratiroides , , glándula pineal, testículos, ovarios, oviducto, útero, s placenta, piel, meninges, substancia cerebral y plexo coroide, o que los macrófagos anteriores sean microglia, células precursoras de microglia, células de glia, células precursoras de células de glia, células precursoras de los macrófagos residentes anteriores, células ' análogas de los macrófagos residentes anteriores, o células precursoras de la células análogas de los macrófagos residentes . Esto permite tratar efectivamente las enfermedades provocadas en diversos órganos y tejidos en el cuerpo. También, el remedio de la invención se caracteriza porque contiene PLGA (copolímero de poli (ácido láctico/ácido glicólico) y en respuesta a la tuberculosis. También es deseable que contenga rifampicina. Esto permite proporcionar el remedio para exterminar gérmenes de la tuberculosis. También es deseable que contenga PLGA con un peso molecular de 1,500 hasta 150,000. Esto permite proporcionar una formulación de partículas finas que es biodegradable y forma fagocitos por los macrófagps. También, es deseable que contenga PLGA con un peso molecular de 1,500 hasta 75,000. Esto permite proporcionar una formulación de partículas finas es fagocitada por los macrófagos y libera fácilmente un medicamento en los macrófagos . También, es deseable que contenga además al menos uno de PVA (alcohol polivinílico) PEG (poliet.ilenglicol , ) , PEO (óxido de polietileno) , azúcar, proteína, péptido, fosfolípidos o colesterol . Esto permite proporcionar una formulación de partículas finas que es fagocitada activamente dependiendo de los tipos de macrófagos. También es deseable que contenga además al menos uno de PVA, PEG, PEO, azúcar, proteína, péptido, fosfolípido o colesterol y sea una formulación de.( partículas finas en donde los diámetros mayores de partículas están de 1 hasta 6 µt?. Esto permite aprovechar efectivamente una función fagocítica del macrófago para incorporarla en los macrófagos. También es deseable facilitar la actividad fagocítica al formar fagocitos . La descripción actual incluye los contenidos descritos en la especificación y/o figuras de la solicitud de patente japonesa No. 2002-247871 que es la base de la prioridad de la solicitud actual. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1 es una vista que ilustra por' comparación una concentración de fármaco en un macrófago de un remedio de la invención con aquel de un remedio convencional . La figura 2 es una vista que muestra una distribución de diámetro de partícula de una formulación de partículas finas en una modalidad de un modo de la invención. La figura 3 es una vista que ilustrá en comparación las cantidades incorporadas en células R8383 gue son diferentes por la administración de rifampicina de acuerdo con la invención y al administrarla usando una solución convencionalmente usada. La figura 4 es una vista (No. 1) que ilustra una capacidad de retención de rifampicina de partículas finas de RFP-PLGA esto es, que las cantidades de rifampicina liberadas son diferentes dependiendo de las composiciones de partículas finas de PLGA. Los valores experimentales tienen una incertidumbre de 5%. La figura 5 es una vista (No. 2) que ilustra una capacidad de retención de rifampicina de partículas finas de RFP-PLGA esto es, que las cantidades de rifampicina liberadas son diferentes dependiendo de las composiciones de las partículas finas de PLGA. Los valores experimentales tienen una incertidumbre de 5%.
La figura 6 es una vista que ilustra que los gérmenes de la tuberculosis en los macrófagos se pueden exterminar por fagocitosis de partículas RFP-PLAG por los macrófagos que han fagocitado en los gérmenes de tuberculosis. Se evalúo la viabilidad al clasificarlos como sigue: 1:5 % o menos, 2:5 hasta 25%, 3:25 hasta 50%, 4:50 hasta 75% y 5:75% o más. Una cantidad de rifampicina administrada es ???µ??/mg en una administración sencilla (indicada por RFP en la figura) o 5µg/mL (valor estimado) en la administración por RFP-PLAG (indicado por RFP-PLAG en la figura) . La figura 7 es una vista que ilustra que el efecto citotóxico de los macrófagos alveolares NR8383 en un estado difuncional por un co-cultivo con células de cáncer de pulmón Sato en las células de cáncer de pulmón Sato se mejora al activar una capacidad fagocítica de NR8383 usando lipopolisacáridos . Los cuadrados abiertos indican el efecto citotóxico de NR8383 sin tratamiento con lipopolisacárido en las células de pulmón Sato, y los cuadrados sólidos indican el efecto citotóxico de NR8383 tratado con lipopolisacárido (1 g/mL) en las células de cáncer de pulmón Sato (co-cultivadas por 4 horas) . El efecto citotóxico (%) se evaluó al calcular cantidades del lactato deshidrogenasa liberada en medios . DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN De aquí en adelante, los modos de la invención de la modalidad adecuada se describen en detalle con referencia a las figuras anexas. Sin embargo, el alcance técnico de la invención no se limita por estos modos de la' modalidad. Una de las funciones comprendidas en los macrófagos enteros y específicos para los macrófagos incluye la fagocitosis. La fagocitosis es una función en la cual un sólido con un tamaño de aproximadamente ?µ?t? o más se incorpora activamente en una célula de macrofago. Por otro lado, si un sólido." que se elabora artificialmente se fagocita activamente con fagocitos, es posible acumular el sólido en el macrofago a una concentración que no puede usualmente alcanzarse. Tal sólido se puede suministrar generalmente como una partícula, pero para fagocitar activamente, es necesario optimizar un diámetro de partícula, propiedad de la superficie de partícula (que tenga una carga, que tenga una cierta estructura flexible) ventajosa para la fagocitosis. Por ejemplo es posible preparar la partícula que es fácilmente fagocitada por el macrofago usando una material en donde se mezcle el polilactato y el polietilenglicol como un substrato . Así, si un medicamento que actúa con patógenos infecciosos o macrófagos infectados con los patógenos se mezcla para preparar la partícula junto la fagocitosis de la partícula, también se incorpora activamente el medicamento en el macrófago . Una parte esencial de la invención está en el aspecto de que las enfermedades debidas a la disfunció'n' .del macrófago (1.2.(5), (7), II. (1), micobacteriosis, SIDA, clamidiosis, toxoplasmosis , cáncer y similares) se tratan al aprovechar la función fagocitica que tienen los macrofagos. Así, se alcanza el objetivo anterior al preparar una formulación en la cual un medicamento efectivo par ellos está contenido en partículas finas (un portador del medicamento) que puede ser fagocitado por los macrofagos. Típicamente, para la formulación que es una mezcla médica del portador de medicamento y el medicamento, es necesario diseñar con objeto de evitar la fagocitosis por los macrofagos. Sin embargo, la invención tiene novedad en el aspecto de aprovechar activamente la actividad fagocitica del macrófago con base en una idea que invierte completamente las creencias convencionales . - .v Como se mencionó anteriormente, como una de las funciones de defensa del hospedero de los macrofagos está la fagocitosis. La fagocitosis es una función inherente que se observa característicamente en los macrofagos, y es posible incorporar partículas con un tamaño que no se puede incorporar por células diferentes a los macrofagos. Los microorganismos patológicos tales como las bacterias son fagocitadas por los macrofagos y se descomponen en los macrófagos . Por lo tanto, algo de importancia biológica de la función fagocítica de los macrófagos es obstaculizar a los microorganismos patológicos. Adicionalment , ' los macrófagos se activan por la fagocitosis y pueden oponerse a los microorganismos patológicos en algunos casos. Esto es un fenómeno conocido como activación de macrófagos por fagocitosis y permite a los macrófagos dañar aún células de cáncer. Por lo tanto, si los macrófagos pueden activarse por la fagocitosis para mejorar la actividad .' fagocítica, se hace posible exterminar los microorganismos , patológicos más intensivamente . Con objeto de que las partículas formen fagocitos, se cree que es necesario que comprendan las siguientes naturalezas (propiedad de fagocitos) . Esto es : Un diámetro de partícula es de 1 hasta 6 µ??. Tal partícula se refiere como una partícula fina. Una superficie de partícula se humedece con un medio (fluido corporal alrededor de los macrófagos in vivo) de macrófagos, pero la partícula no se disuelve inmediatamente y está presente como la partícula como un periodo determinado.
La partícula es sólida en un rango de temperatura de 20 hasta 45°C. Una gravedad específica de la partícula es mayor que aquella del medio (fluido corporal alrededor de los macrófagos in vivo) de macróf ogs . La partícula tiene una capa superficial a través de la cual son. permeables el agua y los iones. '" Por otro lado, considerando que la partícula se administra in vivo, se requiere que la superficie de la partícula tenga una capa macromolecular con una elevada histocompatibilidad. Es necesario retener una forma de partícula hasta que se incorpore en el macrófago mientras se metaboliza por la descomposición en componentes no tóxicos par el cuerpo in vivo (degradabilidad in, vivo) después de incorporarse en el macrófago o cuando no se incorpore) . Como una macromolécula que cumple las 2 condiciones anteriores y se puede moldear fácilmente en una partícula, el copolímero poli (ácido láctico/ácido glicólico) (de aquí en adelante referido como "PLGA") o ácido poliláctico (de aquí en adelante referido como "PL" ) es un candidato . El PL es más hidrofóbico y requiere un tiempo mayor hasta que se descompone más que el PLGA. Por otro lado, PLGA cambia la velocidad de descomposición dependiendo de la relación de monómeros . Entre mayor es el peso molecular, mayor el tiempo que toma hasta que se descompone. Cuando el peso molecular de PLGA es de 1,000 o menor, existe la posibilidad de que esté presente como un líquido en el intervalo de temperatura de 20 hasta 45 °C. Por lo tanto, el peso molecular de PLGA que está presente como un sólido en el rango de temperatura de 20 hasta 45 °C es deseablemente 1,500 o más. Adicionalmente , para la liberación de un medicamento en la partícula de PLGA de la partícula, en el" caso de PLGA con un peso molecular de alrededor de 20,000, se libera el medicamento en un orden de casi cero. Esto es, se retiene siempre de manera constante una cantidad liberada. Sin embargo en el caso de que la partícula PLGA con un peso molecular de alrededor de 44,000 o 75,000, una liberación de tipo pulso en donde el medicamento se .libera después de un periodo de tiempo constante más que una liberación de orden cero se ha observado. Adicionalmente, el periodo de tiempo en donde el tipo de pulso de liberación de medicamento se observa se retraza en la formulación PLGA con un peso molecular grande. Esto es, un patrón de la liberación de medicamento de las partículas PLGA depende del peso molecular de PLGA. Adicionalmente, se predice que la velocidad de descomposición de PLGA relacionada con la liberación de medicamento no solamente se retraza junto con los incrementos de peso molecular de PLGA, sino también la relación es más rápida in vivo de manera tal que en el macrófago que in vitro, y así parece que es posible usar efectivamente aquellos que tienen un intervalo de peso molecular de hasta. 150, 000. A partir de los puntos anteriores, parece que una formulación de partículas finas con diámetro de partículas de 1 a 6 µta hechos de PLGA en donde un peso molecular es de 1, 500 a 150,000 y una relación de monómero de ácido láctico/ácido glicólico es 50:50 a 75:25 (rango aceptable) y una formulación de partículas finas con diámetro de partículas de 1 a 6 µt? hechas de PLGA en donde un peso molecular es de 5,000 a 75,000 y una relación de monómeros/ácido láctico/ácido glicólico de 50:50 a 75:25 (rango adecuado) forma fagocitos fácilmente por los macrofagos y son óptimas para el objeto de que el medicamento se libere mientras se mantiene una persistencia constante a partir de la formulación de partículas finas que incluye internamente al medicamento en los macrofagos . Disposición de un remedio novedoso que permite el exterminio específico de macrofagos que conservan patógenos infecciosos . Al aprovechar activamente la actividad fagocítica específica de los macrofagos que conservan diversos patógenos infecciosos incluyendo los gérmenes de la tuberculosis, con objeto de exterminar los patógenos en los macrofagos o los macrofagos per se que conservan los patógenos son efectivos los siguientes remedios : (1) un remedio que facilita la actividad fagocítica de los macrofagos (2) Un remedio que tiene un efecto exterminador directo en los patógenos infecciosos en los macrofagos (3) Un remedio que actúa sobre los macrófagos. Para el remedio de (1) , aquellos que tienen la naturaleza que cubre las 2 condiciones árítes mencionadas (propiedad fagocítica y degradación in vivo) son adecuados pero preferiblemente, es deseable tener la naturaleza capaz de ser fagocitada selectivamente por los macrófagos que retienen/no retienen los patógenos infecciosos.
Convencionalmente se ha sabido que una substancia que activa la vida fagocítica de los macrófagos está presente (materia que se conoce en el arte) . Un esfuerzo ppr desarrollar un remedio que actúa sobre los patógenos en los macrófagos al aprovechar activamente esta naturaleza no se lleva acabo en absoluto (materia novedosa) . En los tipos de (2) y (3) , no solamente diversos medicamentos que directamente actúan sobre los patógenos se pretenden, sino también los genes per se tales como el ADN o AN que tiene una acción para modificar las funciones fisiológicas de los 'macrófagos que retienen/no retienen los patógenos se pueden usar como los medicamentos. No se ha llevado acabo en absoluto un esfuerzo por desarrollar un remedio efectivo para eliminar los patógenos infecciosos al combinar (1) , (2) y (3) y el remedio de la invención es un nuevo tipo de remedio efectivo para el tratamiento de patógenos infecciosos (materia novedosa) . Por ejemplo, en Antimicrobial Agents and Chemotherapy (Vol. 42, No. 10:2682-2689, 1998), una acción antituberculosa de partículas que contienen rifampicina en PLGA se describe . Sin embargo, en este informe no se describe en absoluto la facilitación de la actividad fagocítica por "las .partículas de PLGA. Además, ya que en las partículas de PLGA que contiene rifampicina, no se mejora la eficacia del fármaco como una fármaco antituberculoso en comparación con la rifampicina solamente, es evidente que se tienen características diferentes de aquellas de las partículas de la invención. Adicionalmente, como se muestra en FIG. A' y FIG 5, el peso molecular de PLGA es importante para liberar la formulación de rifampicina. Sin embargo, en el informe anterior el peso molecular del PLGA usado durante de la preparación de PLGA no se describen. Se presume que probablemente debido a que el uso de PLGA que tiene un peso molecular diferente de aquel de las partículas de la' invención, no condujo a tener la función de un fármaco antituberculoso. Cuando se preparan las partículas de PLGA que tienen . a actividad de fármaco antituberculoso, se debe evaluar el uso de aquellas que son adecuadas con respecto al peso molecular de PLGA, la relación de monómero y los diámetros de las partículas preparadas, la incorporación de las partículas por fagocitosis de los macrófagos y la actividad antituberculosa en los macrófagos . Al tomar en conjunto los aspecto anteriores en las partículas de PLGA antes descritas, se observa una cierta similitud de los materiales debido a la relación de monómero de PLGA y los diámetros de las partículas caen en el rango adecuado de la invención, pero las características correctas para las partículas no se describen y no se observa ' una acción del fármaco antituberculoso. Por lo tanto es difícil alcanzar un ejemplo previo que niegue la novedad y la etapa inventiva de la invención. Adicionalmente , en Pharmaceutical Research (Vol . 17 No. 8:955-961, 2000), se describe un método para la preparación de partículas que contienen rifampicina hecho usando PLGA con un peso molecular de 82,500. Este método para la preparación de las partículas es diferente de aquel de la invención. Un efecto exterminador del germen de la tuberculosis de la partículas de PLGA que contienen rifampicina usando PLGA con un peso molecular de 82, 500 se describe en Pharmaceutical Research (Vol. 18 No. 9: 1315-1319, 2001). Esto muestra que la actividad antituberculosa de las partículas de PLGA que contienen rifampicina es inferior al efecto de la rifampicina solamente in vitro y que no se puede decir que hay un efecto de tratamiento obvio en experimentos con animales. Con objeto de que las partículas de PLGA que contienen rifampicina produzca la acción antituberculosa, las partículas deben tener una degradación adecuada y una elevada proporción de rifampicina incluida internamente. Sin embargo, en el artículo antes mencionado tales características para las cuales depende la actividad no se han examinado y la actividad antituberculosa se ha investigado. Se sabe que la degradabilidad y la tasa internamente incluida se reduce en las partículas con PLGA con peso molecular' grande y así parece que la debido uso de PLGA con un peso molecular alto de 82,500, no obtiene una acción antituberculosa. Como en el anterior, una investigación similar a aquella presentada en la invención se ha efectuado, pero el intento por exterminar los patógenos parásitos intracelulares a través de intentar aprovechar la actividad fagocítica del .macrófago y lograr y esta activación nunca se ha efectuado. También, el PLGA que contiene rifampicina se ha preparado pero no se ha efectuado investigación adecuada para los métodos de preparación y la propiedad del material para el propósito de permitir lograr el objetivo de la invención. Adicionalmente, en Pharmaceutical Research (Vol . 18, No. 10: 1405-1410, 2001), existe una descripción de que supone que las partículas de PLGA que contienen rifampicina' ., se incorporan en los macrófagos . Sin embargo, también en este caso no se han incorporado activamente las partículas por los macrófagos o no se ha hecho ninguna formación en donde se pretenda la activación y de hecho no se ha examinado la relación fagocítica de las partículas de PLGA que contiene rifampicina. Incidentalmente, la concentración de rifampicina en los macrófagos in vitro usando las partículas de PLGA que contienen rifampicina descritas en este informe es de solamente 0.45 µ9/10e células. En caso de usar partículas finas de PLGA que contiene rifampicina, no se solamente se activa la . fagocitosis si no también la concentración de rifampicina en los macrófagos alcanza 6 µg/l06 células que es 13 veces o mas. De lo anterior si se pretenden inducir la fagocitosis en los macrófagos y exterminar los microorganismos patológicos en los macrófagos, es evidente que es difícil lograr esto solamente contener el fármaco en las microesferas . Además en algunos informes previos no se ha examinado si las partículas de PLGA que contienen rifampicina exterminan los gérmenes de tuberculosis intracelular usando los macrófagos alveolares que son la células objetivo de los gérmenes de la tuberculosis . Como es evidente en referencia al antes mencionado "macróf go que apoya la vida" , los macrófagos son altamente específicos del tejido y así es un hecho bien conocido que el resultado obtenido usando los macrófagos presentes en la sangre' 'no puede aplicarse a los macrófagos específicos de tejido por ejemplo, los macrófagos alveolares. Esto es como una novedad de la invención, la novedad del concepto es algo común. Los ejemplos que apoyan este concepto incluyen los aspectos de que los macrófagos alveolares se usan y se induce la actividad fagocítica de las células, y se retiene realmente la concentración elevada de medicamento en los macrófagos alveolares y las partículas de PLGA que contiene rifampicina se producen y suministran en donde el exterminio de los gérmenes de tuberculosis en los macrofagos alveolares por la formulación es' obviamente más excelente que por la rifampicina sola. Por otro lado es ampliamente conocido que la producción de substancias antibacterianas no especificas por ejemplo, peróxido de hidrógeno o radicales de oxígeno de los macrofagos se mejora por la fagocitosis de las partículas por los macrofagos. Por ejemplo, en el Eüropean Journal of Pharmaceutical Sciences (Vol . 15, pp . 197-207, 2000), se describe que la producción de peróxido de hidrógeno a partir de macrofagos cultivados cuyos caracteres se asemejan a aquellos de monocitos en la sangre se mejora al formar fagocitos de las partículas de PLGA. Sin embargo, no se describe que la fagocitosis de PLGA por los macrofagos mejore la actividad fagocítica. Además, ya que la activación de los macrofagos se extremadamente diversa, la mejora de la producción de peróxido de hidrógeno por la fagocitosis no se combina directamente con la mejora de la fagocitosis. Cuando se efectúa el tratamiento actual de la enfermedad infecciosa, es efectiva una formulación en la cual un medicamento de tipo 2 ó 3 está contenido en un remedio del tipo 1. Esto es, con objeto de que el remedio de tipo 2 ó 3 actúe efectivamente en los macrofagos, el remedio de tipo 1 facilita la actividad fagocítica de los macrofagos para mejorar la función que lleva el remedio de tipo 2 ó 3 en los macrófagos . Esto es, como se muestra en la figura 1 el remedio pretendido por la invención el procesó' de fagocitosis es llevado a cabo por los macrófagos, facilita la actividad fagocítica al ser fagocitada, y así la concentración del remedio de los macrófagos se vuelve notablemente más alta en comparación al caso de administración solamente del remedio. Esto es, en comparación al fármaco incorporado en los macrófagos en una solución convencional." de fármacos en un lado correcto, las partículas finas que .incluyen fármacos internos de conformidad con la invención en un lado izquierdo se incorporan activamente dentro del macrófago para incrementar la concentración de fármaco en los macrófagos . De esta manera, "la facilitación de la actividad fagocítica de los macrófagos" descrita en las reivindicaciones significa que la concentración del remedio en los macrófagos se vuelve notablemente más alta en comparación con el caso de administrar solamente el remedio, debido a que el remedio mejora la capacidad fagocítica de los macrófagos.
Ejemplo de aplicación específico: Tuberculosis La tuberculosis se establece como un ejemplo con respecto a la efectividad del remedio presentado en la invención. Los gérmenes de tuberculosis invaden desde el tracto respiratorio hasta los alvéolos pulmonares por gota, y son fagocitados por los macrofagos alveolares. Típicamente, los patógenos fagocitados se destinan a descomponerse por un ataque de la proteasa en las células. Si'ri '. embargo, los gérmenes de tuberculosis evitan el ataque de la proteasa y están vivos en los macrofagos. Estos gérmenes de la tuberculosis en los macrofagos migran fuera de los macrofagos y suministran persistentemente los gérmenes de tuberculosis en un cuerpo hospedero. En la actualidad como fármacos antituberculosos, los medicamentos tales.' como el Isoniazid, rifampicina, sulfato de estreptomicina y etambutol se usan. Todos los medicamentos son efectivos para los gérmenes de tuberculosis fuera de los macrofagos pero no muestran ningún efecto en los gérmenes de tuberculosis en los macrofagos alveolares . Esto se debe principalmente a que una concentración de medicamento suficiente para exterminar los gérmenes de tuberculosis no se obtiene en los macrofagos alveolares . « ., Asi, si la concentración del medicamento suficiente para exterminar los gérmenes de tuberculosis se obtiene en los macrofagos alveolares al aprovechar la fagocitosis de los macrofagos alveolares también es posible exterminar los gérmenes de tuberculosis en los macrofagos alveolares. En este caso se utiliza la fagocitosis con objeto de incrementar selectivamente la concentración de medicamento de los macrofagos.
A. Remedio que mejora la capacidad fagocítica de los macrófagos . Al usar PLGA como un ejemplo, un " método para la producción de un remedio que mejora la capacidad fagocítica de macrófagos y efectos de los mismos como se describe. I. Mejora de la capacidad fagocítica de macrófagos por una formulación de partículas finas de PLGA (en esta sección, una partícula fina de PLGA per se es un ingrediente medicinal . ) 1. Método para la preparación de partículas finas de PLGA (a) Materiales (1) PLGA (copolímero. poli (ácido láctico/ácido glicólico) , relación de monómero: 75:25, peso molecular: 20,000 (Wako Puré Chemical Industries Ltd., PLGA-7520) (2) PVA de grado de polimerización (alcohol de polivinilo) : 500 > ., (b) Preparación de una fórmula de partículas finas PLGA (1) Se disuelven 500 mg de PLGA en 1.5 mL de cloruro de metileno (2) Se disuelve el PVA en agua para volverse 0.3% (w/v) . (3) Cuando se agregan 8 mL de la solución acuosa de PVA a 2 esta solución de (1) y agitan por 3 minutos, se forma una emulsión de aceite en agua (tipo a/a) . (4) (3) se agrega en 200 mL en una solución acuosa de PVA de (2) y se agita a temperatura ambiente a 520 rpm por 3 horas . (5.) .Se precipita una formulación de partículas finas por centrifugación (3,000 rpm, 15 minutos), se separan y se lavan además dos veces de 10 mL de agua destilada usando una centrifuga . (6) Se seca bajo presión reducida en un desecador por 24 horas . (7) Una distribución del diámetro -de partícula de la formulación de partícula una resultante se muestra en la figura 2. Como es evidente de esta figura la formulación preparada de partículas finas tiene un pico de diámetro de alrededor de 2 µt? y tiene una distribución entre 1 a 10 µt?. Esta partícula es un sólido a temperaturas ambientes. Un rendimiento calculado a partir de PLGA(500 mg) usado para la preparación y un peso completo de formulación recuperada fue de alrededor del 90%. (8) Otros ejemplos Características (peso molecular y composición) de las partículas finas de PLGA adicionalmente hechas se muestran correctivamente a continuación. 1. PLGA-5005 (PLGA, peso molecular: 5,000: ácido glicólico/ácido láctico: 50:50) 2. PLGA-5010 (PLGA, peso molecular: 10,000: ácido glicólico/ácido láctico: 50:50) 3. PLGA-5020 (PLGA, peso molecular: 20,000: ácido glicólico/ácido láctico: 50:50) 4. . PLGA-7505 (PLGA, peso molecular:-' .5,000: ácido glicólico/ácido láctico: 75:25) 5. PLGA-7510 (PLGA, peso molecular: 10,000: ácido glicólico/ácido láctico: 75:25) El método para la preparación de la formulación de partículas finas de PLGA es igual que 1. (b) (1) hasta (6) excepto el tipo de PLGA. · ¦ Un diámetro de partícula promedio de la formulación de partículas finas resultantes fue de alrededor de 2 µp? aun cuando se puede usar cualquier PLGA. Un rendimiento calculado a partir de PLG (500 mg) usado para la preparación y un peso completo de la formulación recuperada fue de alrededor de 90%. 2. Efecto de mejora en la fagocitosis de macrófagos alveolares al formar fagocitos de partículas finas de PLGA. (1) Se preparan células de macrófago alveolar (células NR8383) a 1 x 10e células/mL en un medio (Ham-F-12K, suero de becerro fetal al 15%) , agregado en un placa de 24 pozos, y 0.04, 0.4 o 4 µg de formulación de partícula fina de PLGA-7520 se agrega a esto que luego se cultiva en un incubador de gas de bióxido de carbono (37°C) . (2) Una hora después de cultivo el medio se remueve, se agrega 0.1 mL de solución salina que contiene solución amortiguadora de tripsina/fosfato al 0.25% (de aquí en adelante PBS) , se deja a temperatura ambiente durante 25 minutos, . luego se remueve el sobrenadante -de cultivo, y se realiza un lavado. (3) Se agrega a esto 0.1 mL del medio y se mezcla con 0.1 mL de Percoll al 80% (Pharmacia) para preparar una solución de Percoll al 40%. Esto se cubre en 0.1 mL de Percoll al 70% colocado en 1.5 mL de un tubo de muestra y se centrifuga (8, 000 rpm, 10 minutos). · · (4) Después de la centrifugación las células presentes en la interfaz se colectan, y después de lavar las células con PBS, se agrega 1 mL del medio. Se agregan partículas de Látex de poliestireno (FITC-PSLP) con un diámetro de partícula de 0.2 µp? etiquetadas con un isotiocianato de fluoresceina (FITC) a 1 x 107, y se cultiva la mezcla durante 1 hora. El etiquetado con FITC fluorescente es para facilitar la realización de un análisis cuantitativo. (5) Después del cultivo la centrifugación (700 rpm, 5 minutos) se realiza, luego se agrega un 1 mL de PBS a los macrófagos en una capa precipitada y se repita dos veces la centrifugació . (6) Después de remover el PBS, se agrega 0.1 mL de formalina/PBS al 10% a las células, se fijan durante 5 minutos, luego se agrega 1 mL de agua destilada, se remueve el sobrenadante, se agrega de nuevo 1 mL de agua destilada, y se remueve el sobrenadante. Después de remover el sobrenadante, se agrega un 1 mL de agua destilada para suspender las células, y se toma 0.02 mL de -la suspensión, se extiende en un porta objetos y se seca. (7) Bajo un microscopio fluorescente, se fotografían múltiples campos visuales, y un numero de células NR8383 que se les incorporado FITC-PSLP por 100 células se mide. (8) Un cambio de las cantidades de FITC-PSPL que forma fagocitos en dos macrófagos por la formulación de partícula fina PLGA es como se muestra en la Tabla 1. Una adición de cantidad baja de la formulación de partícula fina PLGA no afecta remarcablemente la capacidad fagocítica de los macrófagos, pero es evidente que la adición de 0.4 ^g/mL) activa de manera importante la capacidad fagocítica. Tabla 1 Efecto aumentado de la formulación de partícula fina PLGA en la capacidad fagocítica de los macrófagos.
Cantidad de formulación de 'Velocidad de absorción de partícula fina de PLGA {µ?/??·) FITC-PSLP (%) 0 11.6 0.004 8.8 0.04 12.3 0.4 20.2 II . Aumento de la capacidad fagocítica de macrófagos por lipopolisacáridos 1. Método para preparar lipopolisacárido (a) Material (1) Pantoea agglomerans que pertenece a la bacteria gram negativa, género Pantoea (b) Preparación de lipopolisacárido (1) Se agrega Pantoea agglomerans a 7 litros de caldo (10 g/L de triptona, 5 g/L de extracto de' levadura, 10 g/L de NaCl , 1 g/L de glucosa, pH 7.5), cultivado con agitación a 35°C durante 24 horas, y alrededor de 70 g de cuerpo bacterial húmedo se colecta. (2) Se suspende 70 g del cuerpo bacterial 500 mL de agua destilada, 500 mL de fenol caliente al 90%, se agita 65 hasta 70°C durante 20 minutos, se enfría, y luego se colecta una capa acuosa. La capa acuosa colectada se dializa durante la noche para eliminar el fenol, y una solución interna de la diálisis se ultra filtra para concentrar por una membrana de corte de peso molecular 200, 000 bajo gas de nitrógeno a dos atmósferas. (3) Se disuelve el crudo resultante de polisacárido congelado/secado en agua destilada, se aplica en una cromatografía de intercambio de anión (Suministrada de Pharmacia, de flujo rápido de sefarosa Q) , se pasa una solución de muestra a través de una columna usando solución amortiguadora que contiene 10 mM de Tris-HCl (pH 7.5) y 10 mM de NaCl, y se eluye una fracción activada de Limulus de 200 hasta 400 de mM de NaCl/lOmMTris-HCl · -(pH 7.5). Por ultrafiltración esta solución se eluye, se desala, se concentra y se seca por congelado bajo las mismas condiciones como arriba, es posible proporcionar alrededor de 300 mg de lipopolisacárido purificado desde alrededor de 70 g del cuerpo bacterial húmedo. 2. Efecto de mejoramiento en la fagocitosis de macrofago alveolar por lipolisacárido . (1) Se preparan células de macrofago alveolar (NR8383) a 1 x 10s células/mL en un medio (Ham F-12K, suero de becerro fetal al 15%), y se agrega una placa de 24 pozos. El lipopolisacárido se agrega a esto para hacer 1 µg/mL, y el cultivo se realiza .en un incubador de gas de bióxido de carbono (37°C) . (2) Después de cultivar bajo 1 hora, las células se transfieren a un tubo de muestra de 1.5 mL, y el medio se elimina por centrifugación (2,000 rpm, 5 minutos). Posteriormente, se agrega 0.1 mL de tripsina/PBS al 0.25%, el tubo se deja a temperatura ambiente durante 5 minutos, luego, se elimina el sobrenadante de cultivo por centrifugación (2,000 rpm, 5 minutos), y se realiza un lavado con PBS . (3) A esto se le agrega 0.1 mL del medio, y se mezcla con 0.1 mL de Percoll al 60% para preparar una solución de • Percoll al 30%, luego se centrifuga (8,000 rpm, 10 minutos) . (4) Después de la centrifugación las células presentes en la superficie de liquido se colecta, y s¾ 'lavan dos veces con PBS . Posteriormente se agrega 1 mL del medio, FITC-PSLP con un diámetro de partícula 2.0 µp? a 1 x 107 se agrega, y luego se cultiva durante 1 hora. (5) Después del cultivo se remueve el sobrenadante, se agrega 0.1 mL de tripsina/PBS al 0.25%, y la mezcla se deja a temperatura ambiente durante 5 minutos.' 'Posteriormente, se agrega 1 mL del medio y luego se realiza la centrifugación (700 rpm, 5 minutos) . (6) Se agrega 1 mL de PBS a los macrófagos en una capa precipitada, se realiza la centrifugación (700 rpm 5 minutos), y se remueve el sobrenadante. Nuevamente, se agrega 1 mL de PBS, se realiza la centrifugación (700 rpm 5 minutos) y se remueve el sobrenadante. (7) Después de remover el sobrenadante, se agrega 0.1 mL de formalina/PBS al 10% a las células, se fija por 5 minutos, luego se agrega 1 mL de agua destilada, se remueve el sobrenadante se agregan nuevamente 1 mL de agua destilada, y se remueve el sobrenadante. (8) Después de remover el sobrenadante, se agrega 0.1 mL de agua destilada para suspender las células 0.02 mL de la suspensión se toma se expanden un porta objetos, y se seca. (9) Bajo un microscopio fluorescente, se fotografían múltiples campos visuales, y se mide el número de células NR8383 que incorporan FITC-PSLP por 500 células. (10) El incremento de la cantidad de FITC-PSLP que forma fagocitos de los macrofagos por el polisacárido es como se muestra en la Tabla 2.· Es evidente que la capacidad fagocitica de los macrofagos se activa por el polisacárido.
Tabla 2. Activación de la capacidad fagocitica del macrófago por micropolisacárido .
B. Remedio que actúa sobre los patógenos en macrofagos. Migración efectiva de rifampicina (fármaco antituberculosis) en macrofagos por medio de la fagocitación de la formación de partícula fina RF(P-PLGA. 1. Preparación de la formulación de la partícula fina de PLGA que incluye internamente rifampicina. (a) Materiales (1) relación de monómero PLGA [ (copolímero poli (ácido láctico/ácido glicólico) , : 75:25 o 50:50 peso molecular: ,000, 10,000, o 20,000 (Wako Puré Chemical Industries Ltd., PLGA-5005, 5010, 5020, 7505, 7510, 7520. (2) Rifampicina (3) PVA de grado polimerización (alcohol de polivinilo) : 500. (b) Preparación de una fórmula de partículas " finas RFP-PLGA (1) Se disuelven PLGA (500 mg) y rifampicina (0, 50, 100 o 200 mg) en 1.5 mL de cloruro de metileno (2) Se disuelve el PVA en agua para volverse 0.3% (p/v) . (3) Cuando se agregan 8 mL de la solución acuosa de PVA a 2 esta solución de (1) y agitan por 3 minutos, se forma una emulsión de aceite en agua (tipo a/a) . .' ' (4) Se agrega el (3) en 200 mL en una solución acuosa de PVA de (2) y se agita a temperatura ambiente a 520 rpm por 3 horas . (5) Se precipita una formulación de partículas finas por centrifugación (3,000 rpm, 15 minutos), se separan y se lavan además dos veces dé 10 mL de agua destilada usando una centrifuga . (6) Se seca bajo presión redudda en un desecador por 24 horas . (7) Las partículas finas PLGA producidas (peso molecular y composición) se muestran correctamente abajo. 1. RFP-5005 (PLGA, peso molecular: 5,000: ácido glicólico/ácido láctico: 50:50) 2. RFP-5010 (PLGA, peso molecular: 10,000: ácido glicólico/ácido láctico: 50:50) 3. RFP-5020 (PLGA, peso molecular: 20,000: ácido glicólico/ácido láctico: 50:50) 4.- . RFP-7505 (PLGA, peso molecular":" 5,000: ácido glicólico/ácido láctico: 75:25) 5. RFP-7510 (PLGA, peso molecular: 10,000: ácido glicólico/ácido láctico: 75:25) 6. RFP-7520 (PLGA, peso molecular: 20,000: ácido glicólico/ácido láctico: 75:25). La distribución de tamaño de, .* 'partícula y las características de todas las formulaciones ( de partícula fina resultantes fueron las mismas como aquellas de las formulaciones de partícula fina de PLGA solamente (A.I. 1. (b) (7) ) . (8) La formación de partícula fina de 4 mg fueron 0, 50, 100 o 200 mg de rifámpicina está contenida en 500 mg de PLGA se disuelve en 1 mL de cloruro de metileno,. y posteriormente se mide una absorbancxa a 475 nm pc-r, un espectrofotometro. (9) Las cantidades de rif mpicina recuperada en la formación de partícula fina de RFP-PLGA (partícula fina PLGA-7520 se hace de PLGA de peso molecular de 20,000 y ácido láctico/ácido glicólico de 75/25) se muestran en la Tabla 3. Como es evidente de este resultado se encuentra que la rifámpicina se ha formulado eficientemente.
Tabla 3 Cantidades de rifampicina incluidas internamente en la formación de partícula fina RFP-PLGA 2. Otro método para preparar la formación de partícula fina RFP-PLGA (método de emulsificación de membrana, conocido en el arte) . Usando un método de emulsificación de membrana, se prepara la formación 'de partícula fina RFP-PLAG 7510. El método de emulsificación de membrana es un método de emulsificación en donde uno (fase 'de dispersión) de 2 tipos de líquidos que no se mezclan juntos se presionan para dispersarse en otro líquido (fase continua) a través de una membrana de vidrio poroso. Al usar este método, es posible obtener una emulsión con diámetro de partículas uniforme, (a) Materiales (1) PLGA [copolímero de poli (ácido láctico/ácido glicólico) ] relación de monómero: 75:25, peso molecular: 10,000, Wako Puré Chemical Industries Ltd., PLGA 7510. (2) Rifampicina (3) PVA grado polimerización (alcohol polivinílico) : 500 (b) Preparación de partícula fina RFP-PLGA ' ' . (1) Se disuelven 500 mg de PLGA y 100 mg de rifampicina en 10 mL cloruro de metileno. (2) Se disuelve PVA en agua para hacerse al 0.3% (p/v) . (3) Cuando la solución de (1) se dispersa en 100 mL de solución acuosa de PVA de (2) a través de una membrana SPG (Ise Chemicals Corporation, tamaño de poro estrecho: 0.49 µp? se forma una emulsión aceite en agua (tipo a/a) . (4) se agrega (3) en 200 mL solución acuosa de PVA de (2) , y se agita a temperatura ambiente a 520 rpm durante 3 horas . (5) la formulación de partícula fina se precipita por centrifugación (3,000 rpm, 15 minutos), se separa, y se lava además 2 veces al agregar 10 mL de agua destilada usando un centrífugo. i (6) El secado bajo presión reducida en un desecador durante 24 horas (7) Un diámetro de partícula promedio de la formulación de partícula fina resultante es 1.98 m. Un rendimiento de PLGA calculado a partir de PLGA (500 mg) usado para la preparación y un peso completo de la preparación recuperada fue de alrededor de 90%. El rendimiento de rifampicina fue de alrededor de 75%. Esta partícula es un sólido a temperatura ambiente . 3.- otros ejemplos por el método de emulsificación de membrana. " ' ' . Las partículas finas RFP-PLGA (peso molecular y composición) diferente a la formulación de partícula fina RFP-PLGA 7510 se muestran colectivamente abajo. 1. - RFP-PLGA 5005 (peso molecular de PLGA: 5,000; ácido láctico/ácido glicólico 50:50) . 2. - RFP-PLGA 5010 (peso molecular de.' PLGA: 10, 000; ácido láctico/ácido glicólico 50:50) . 3. - RFP-PLGA 5020 (peso molecular de PLGA: 20,000; ácido láctico/ácido glicólico 50:50) . 4. - RFP-PLGA 7505 (peso molecular de PLGA: 5,000; ácido láctico/ácido glicólico 75:25) . 5.- RFP-PLGA 7520 (peso molecular de PLGA: 20,000; ácido láctico/ácido glicólico 75:25) . El método para preparar estas > formulaciones de partícula fina RFP-PLAG es el mismo como el método de emulsificación de membrana anterior excepto en los tipos de PLGA. Los diámetros de partícula promedio de las formulaciones de partícula fina resultantes son 2.20 µt? en PLGA 5005, 2.66 µt? en PLGA 5010, 2.29 µp? en PLGA 5020, 2.00 µt? en PLGA 7505 y 1.85 µta en PLGA 7520. todos los rendimientos de PLGA calculado del PLGA (500mg) usados para la preparación y un peso completo de la formulación recuperada fueron de alrededor de 90%. Los rendimientos de rifampicina fueron de alrededor de 87% en PLFA 5005, alrededor de 78% en PLGA 5010, alrededor de 67% en PLGA 5020, alrededor del" 91%. en PLGA 7505 y alrededor del 58% en PLGA 7520. 4.- Liberación de rifampicina de partículas finas RFP-PLGA. (1) Con respecto a las partículas finas RFP-PLGA (50 mg) preparadas por el método de emulsificación de membrana, se dispersaron en 5 mL de solución amortiguadora de fosfato de pH 7.4 (resistencia iónica: 0.154 M) ' 'mantenido a 37°C (temperatura) . (2) Los sobrenadantes se colectaron durante el tiempo por la centrifugación, y se agrega 5 mL de la solución amortiguadora de fosfato a pH 7.4 (resistencia iónica: 0.154 M) al resto de las partículas finas. (3) La concentración eluida en el sobrenadante se mide.
La medición se realiza usando un espectrofotómetro a una longitud de onda de 475 nm. > ? (4) Las velocidades de liberación de rifampicina con respecto a las partículas finas RFP-PLGA en el sobrenadante se muestran en la figura 4 y la figura 5. De los datos del presente experimento, se muestra que las velocidades de liberación de rifampicina de PLGA con pesos moleculares de 5,000 y 10,000, esto es PLGA 5005, PLGA 5010, PLGA 7505 y PLGA 7510 fueron rápidas. De estos resultados, se muestra que las composiciones de PLGA en las cuales el peso molecular es 5,000 hasta 10,000 y la relación de ácido láctico a ácido glicólico es 50:50 o 75:25, son excelentes en la migración del fármaco en los macrófagos por medio de la 'f gocitosis . 5. - Incremento selectivo de concentración de rifampicina intracelular por fagocitosis de la formulación de partícula fina (PLGA-7520) (1) La formulación de partícula fina RFP-PLGA preparada se dispersa nuevamente en PBS, la centrifugación (400 rpm, 5 minutos) se realiza para eliminar las partículas grandes y la formulación de partícula fina (alrededor, de 30% en peso) preparada en tamaños de alrededor de 1 hasta 3 µt por observación de microscopio se usan para los siguientes experimentos . (2) Se colocan células NR8383 cultivadas a 5 x 105 células/0.9 mL en un medio en una placa de 24 posos, 0.12 mg/ 0.1 mL de cada formulación de partícula fina RFP-PLGA se agrega a esto, y se cultiva durante .,12 horas. (3) Después del cultivo, el medio se retira, 0.1 mL de 0.25% tripsina/PBS se agrega, luego se deja a temperatura ambiente durante 5 minutos posteriormente se retira el sobrenadante de cultivo y se efectúa el lavado. (4) 0.1 mL del medio se agrega al mismo, y se mezcla con 0.1 mL de 80% Percoll para preparara una solución 40% Percoll. Esta se deposita sobre 0.1 mL de 70% Percoll colocado en un 1.5 mL de un tubo de muestra y se centrifuga (8,000 rpm, 10 minutos). (5) Después de la centrifugación, las células presentes en una interfaz se recolectan, se lavan, con PBS y posteriormente la rifampicina colocada en las células se extrae con cloruro de metileno. (6) Se determina una cantidad de rifampicina a partir de una absorbancia de 475 nm. (7) Como un control, una solución de dimetilsulfóxido (DMSO) de rifampicina a la misma cantidad como aquella contenida de 0.12 mg de la formulación de partículas finas RFP-PLGA se prepara, esto se agrega a una placa de 24 posos a la cual se agrega 1 mL de medio y se agregan a ello las células NR8383. (8) Las células se cultivan durante 12 horas posteriormente se recolectan las células (5 x 105 células) y se extra la rifampicina en las células con cloruro de metileno. > (9) Se muestran en la figura 3 las cantidades de absorción de rifampicina por los macrófagos . Se muestra que la rifampicina alrededor de 19 veces se incorpora en la cantidad de adhesión de 40 (/¿g/5 x 105 células/pozo/mL) de rifampicina en el caso de la formulación de partículas finas actuales RFP-PLGA comparada con el medio convencional que contiene rifampicina. C. El medicamento (A + B) que mejora la capacidad fagocítica de los macrófagos y actúa sobre los patógenos en los macrófagos . El efecto de mejora en la actividad fágocítica de los macrófagos por medio de la fogocitación de la formulación de partículas finas de RFP-PLGA que son fagocitados 1. - Preparación de la formulación de partículas finas de RFP-PLGA (a) Materiales (1) El PLGA [copolimero de poli (ácido láctico/ácido glicólico)] relación de monómero : 75:25 o 50:50, peso, molecular: 5,000, ,000 o 20,000, ako Puré Chemical Industries Ltd., PLGA-5005, 5010, 5020, 7505, 7510, 7520. (2) Rifampicina (3) PVA (alcohol polivinílico) Grado de polimerización: 500 (b) Preparación de una formulación de partícula fina RFP-PLGA (1) PLGA 500 mg y 100 mg de rifampicina se disuelven en 1.5 mL en cloruro de metileno. (2) El PVA se disuelve en agua para convertirse en 0.3% (p/v) . (3) Cuando se agregan 8 mL de la solución acuosa de PVA de (2) a una solución de (1) y se agitan por 3 minutos, se forma una emulsión de tipo aceite en agua (4) Se agrega (3) en 200 mL de una solución acuosa de PVA de (2) , y se agita a temperatura ambiente a 520 rpm por 3 horas . (5) Se precipita una formulación de partícula fina por centrifugación (3, 000 rpra, 15 minutos), se separa, y se lava además 2 veces al agregar 10 mL de agua destilada usando una centrifuga. (6) Secado bajo presión reducida en un desecador por 24 horas (7) La distribución de tamaño de partícula y las características de las formulaciones de' partículas finas resultantes fueron iguales como aquellas de. las formulaciones de partículas finas de PLGA solo (A. I. 1. (a) (7)) . (8) La formulación de partículas finas se dispersa nuevamente en PBS se efectúa la centrifugación (400 rpm, 5 minutos) para eliminar una formulación grande de partículas finas y la formulación de partículas finas preparada en tamaños de alrededor de 1 a 3 µt? se usa para los siguientes experimentos > .( 2.- Mejora de la actividad fagocítica de macrofagos por medio de la fogocitación de la formulación de partículas finas de RFP-PLGA (PLGA- 7520) . (1) Se preparan células de macrofagos alveolares (NR8383) a 1 x 106 células/mL en un medio (Ham F-12K, suero de becerro fetal al 15%) , se agrega a una placa de 24 posos y se agregan a ello 0.012, 0.12 o 1.2 /g de de una formulación de partícula fina de PLGA que luego se cultiva en un incubador de gas de bióxido de carbono (37°C) (2) una hora después del cultivo, se transfieren las células- a 1.5 de un tubo de muestra se retirá el. medio, 0.1 mL de 0.25% tripsina/PBS se agrega, y se deja una mezcla a temperatura ambiente durante 5 minutos, luego se elimina el sobrenadante de cultivo y se efectúa el lavado. (3) A ello se agregan 0.1 mL de medio y 0.1 mL de 90% Percoll para hacer 45% Percoll, y posteriormente la centrifugación (8,000 rpm, 10 minutos) se.efectúa. (4) Después de la centrifugación, las células presentes en la superficie líquida se recolectan, y se lavan 2 veces con PBS . Posteriormente 1 mL del mismo medio como el que se uso en (1) se agrega, FITC-PSLP con un diámetro de partícula de 2.0 µt? a 1 x O7 se agrega que luego se cultiva por una hora. (5) Después del' cultivo, se elimina el sobrenadante, se agregan 0.1 mL de tripsina/PBS a 0.25% y se deja una mezcla a temperatura ambiente durante 5 minutos. Posteriormente, se agrega 1 mL del medio y luego se efectúa la centrifugación (700rpm, 5 minutos) . (6) Se agrega 1 mL de PBS a los macrófagos en una capa precipitada se efectúa la centrifugación (700 rpm, 5 minutos) y se retira el sobrenadante. Nuevamente se agrega 1 mL de PBS se efectúa la centrifugación (700 rpm, 5 minutos) y se retira el sobrenadante . (7) Después de retirar el sobrenadante, se agrega 0.1 mL de formalina/PBS al 10% a las células se fija por 5 minutos luego se agrega 1 mL de agua destilada y luego se efectúa la centrifugación (700 rpm, 5 minutos), se agrega 'dé. nuevo 1 mL de agua destilada y se retira el sobrenadante. A ello se agrega 0.1 mL de agua destilada para suspender las células, se toma 0.02 mL de la suspensión, se distribuye en un portaobjetos y se seca. (8) Bajo un microscopio fluorescente, se hacen fotografías de campos visuales múltiples y el número dé macrófagos (células NR8383) que se ha incorpora a FITC-PSLP por 500 células se mide . (9) El incremento de las cantidades de FITC-PSLP que son fagocitadas por los macrófagos debido a la fagocitosis de la formulación de partícula fina de RFP-PLGA es como se muestra en la tabla 4. Es evidente que la capacidad fagocítica de los macrófagos se activa por la formulación de partículas finas de RFP-PLGA. Tabla 4. Efecto de la mejora en la fagocitosis de FITC-PSLP por células NR8383 que fagocitan de la formulación de partículas finas de RFP-PLGA.
Cantidad de formulación de partícula Relación de absorción de fina de RFP-PLGA (µ?/mL) FITC-PSLP (%) 0 31 0.012 45 0.12 47 De los resultados anteriores, (1) se ha demostrado que la formulación de partículas finas de PLGA y el lipopolisacárido activan la capacidad fágocítica de los macrófagos . También se ha demostrado (2) que la migración de la rifampicina en los macrófagos que se incrementa notablemente al incluir notablemente en la comulación de partículas finas de PLGA, y (3) que la capacidad fágocítica de los macrófagos se activa aún cuando la rifampicina esta contenida en la formulación de partículas 'finas de PLGA. Por lo tanto, la formulación partículas de PLGA que contiene rifampicina activa la capacidad fágocítica de los macrófagos que resultan en una concentración aumentada en la rifampicina en los macrófagos, y así hace posible lograr el objetivo de la invención para afectar eficientemente contra los patógenos retenidos en los macrófagos. Los resultados anteriores indican un ejemplo del remedio novedoso en donde el remedio que actúa sobre los patógenos en IQS macrófagos se incorpora efectivamente en los macrófagos al "facilitar la actividad fágocítica de los macrófagos" que es un concepto básico de la invención. 3. - Efecto exterminador en gérmenes de tuberculosis en macrófagos al fagocitar en la formulación de partícula fina RFP-PLGA (a) Método de medición de la viabilidad de los gérmenes de tuberculosis (12 mg/mL) en macrófagos (1) Se disolvió una vacuna seca de BCG en solución salina (12 mg (mL) , se agitó y posteriormente se transfirió el medio KRD (3 hasta 4 mL) a un matraz de cultivo T-25, luego se agregaron a ello 40/¿L de una suspensión BCG y se cultivaron en un incubador seco a 37 °C (2) En el experimento, se colocaron, una solución bacteriana y perlas de vidrio a una relación de 1:4 en un tubo de muestra que luego se agitó por 1 minuto por un mezclador de vórtices. Posteriormente se' disperso en cuerpo bacteriano por sonicación durante 5 minutos usando un lavado ultrasónico . (3) Las células NR8383 a una concentración de 1 x 10s células/mL se colocaron en una placa de 6 posos (volumen total 5 mL) . Se agregaron los gérmenes de tuberculosis (BCG) a 10 por células (multiplicidad de infección OI)=10) a un medio de cultivo de células. (4) Después de infectar a 37 "den un incubador de gas de bióxido de carbono durante 4 horas, se efectúo la centrifugación a 2,000 rpm durante 5 minutos (SCTI5B) y luego se retiró el sobrenadante. Al usar un medio libre de suero, similarmente se repitió la centrifugación 2 veces para eliminar las bacterias presentes fuera de las células. (5) Las células NR8383 a una concentración de 1 x 10s células/mL se sembraron en un placa de 24 pozos. (6) Las partículas finas respectivas RFP-PLGA a 10 por célula se agregaron al medio de cultivo de células 8383. (7) Después de fagocitar a 37°C en el incubador de gas de bióxido de carbono durante 4 horas 'las partículas presentes fuera de las células se eliminaron usando tripsina al 25%. (8) Se agregó 80% Percoll para hacer una solución de células 40% Percoll y se agregó adicionalmente 70% Percoll para hacer un gradiente de densidad. Después de la centrifugación (SORVALL Biofuge Fresco) .a 10,000 rpm durante 5 minutos, las células a una interfaz entre.40% y 70% Percoll se recolectaron para separar las células de RFP-PLGA. (9) Al usar PBS, similarmente se repitió la centrifugación 2 veces para eliminar Percoll. (10) Se midieron las relaciones de bacterias vivas y bacterias muertas Usando un método de tinción para el diacetato de fluoresceína (FDA) /bromuro de etidio (EB) . Se disolvió el FDA en acetona a una concentración de 5 mg/mL, y se diluyeron 20µ11 del mismo con 1 mL de PBS en uso. Se disolvió EB en PBS a una concentración de 20/xg/mL y se diluyeron 50/üL del mismo con 1 mL de PBS en uso. Se mezclaron cantidades iguales de FDA y EB diluido y se usaron para tinción. Se colocó esta solución mezclada (1 µ??) en un portaobjetos de vidrio, se colocó sobre el una solución bacteriana de 1 µ?? la cual luego se dejo a temperatura ambiente durante 2 minutos y se observó bajo un microscopio fluorescente. En las bacterias vivas, se descompone el FDA por una actividad de esterasa derivada de las bacterias para emitir fluorescencia con un color verde. Por otro lado en las bacterias muertas no hay actividad de esteraza por lo tanto no se observa la tinción con FDA y se tiñen las bacterias con EB para emitir fluorescencia con un color naranja, (b) Efecto exterminador de la formulación de partículas finas de FP-PLGA incorporada en los macrofagos por fagocitosis sobre gérmenes de tuberculosis . ..' (1) Con objeto de examinar un efecto exterminador en los gérmenes de tuberculosis en los macrofagos de partículas finas de RFP-PLGA, las partículas finas de RFP-PLGA se administraron a los macrofagos (macrofagos infectados con gérmenes de tuberculosis) que habían previamente fagocitado los gérmenes de tuberculosis y los macrofagos fagocitaron las partículas finas. (2) Los resultados de examinar como los efectos exterminadores de RFP-PLGA que migran en los macrofagos por la fagocitosis se muestran contra los gérmenes de tuberculosis en los macrofagos se muestran en la figura 6. Es evidente que la concentración intracelular de rifampicina es significativamente mayor en la dosis de partículas finas de RFP-PLGA que contienen rifampicina de alrededor de vigésima parte (MOI=10, una cantidad estimada de rifampicina es 5 g/mL, y así la rifampicina en la formulación de partículas finas corresponde a una vigésima parte de la cantidad en el caso de administrar solamente la rifampicina) que en la dosis de rifampicina sola (100 µg/mL) . La administración de las partículas finas de RFP-PLGA a los macrofagos alveolares infectados con gérmenes de tuberculosis exterminaron los gérmenes de tuberculosis en las células a una eficiencia de 20 veces o más comparado con la administración de rifampicina sola. Esto es, al administrar el fármaco por medio de la fagocitosis de las partículas, se mejora un coeficiente de tratamiento por 20 veces o más independientemente del efecto antituberculoso del fármaco per se. Disposición del remedio que facilita la actividad fagocítica de macrofagos y actúa sobre los macrofagos sobre un estado disfuncional . Se sabe que diversos macrofagos típicamente se infiltran en los tejidos de cáncer. Esto se basa en el hecho de que debido a que las células de cáncer, son substancias externas para un cuerpo viviente, se acumulan los macrofagos para el propósito de eliminación de las células de cáncer. Si los macrofagos trabajan normalmente, las células de cáncer se lesionan y desvanecen. Sin embargo, si los macrofagos funcionan anormalmente, no se pueden lesionar las células de cáncer, crecen y resultan en la formación de una masa de tumor. Como ya se describió al activar los macrofagos se hace posible también lesionar las células de cáncer. Por lo tanto, al facilitar la actividad fagocítica de los macrófagos es posible hacer que los macrófagos con disfunción adquieran en efecto . citotóxico en las células de cáncer, y traten efectivamente el cáncer. Por otro lado, como se muestra en la tabla 2, la fagocitosis por los macrófagos alveolares de mejora por 166% por el tratamiento con lipopolisacárido (1 /zg/mL) y se activan los macrófagos alveolares por el lipopolisacárido. Así parece que los macrófagos alveolares cuya capacidad fagocítica sea activado por el lipopolisacárido, producen el efecto citotóxico en las células de cáncer de pulmón. Por lo tanto, aquí un ejemplo del efecto citotóxico en la célula de cáncer de pulmón en los macrófagos alveolares activados por el lipopolisacárido se muestra. Ejemplo de aplicación específico: cáncer de pulmón. El efecto citotóxico en las células de cáncer de pulmón al activar los macrófagos alveolares se muestra como el ejemplo de aplicación. 1.- Activación de los macrófagos alveolares por lipopolisacáridos y co-cultivo de los macrófagos alveolares con células de cáncer de pulmón de Sato. (1) Las células NR8383 a una concentración de 1 x 106 células/mL se colocan en una placa de 24 posos (volumen total: 1.5 mL) . Como el control se agregaron suero de becerro fetal al 5%, 150/xL de medio F-12K y 150 \LL de 10 /¿g/mL de lipopolisacárido . (2) Se dejaron las células en un incubador de gas de bióxido de carbono a 37 °C por 24 horas. " · (3) Se prepararon las células de cáncer de pulmón Sato a una concentración de 1 x 105 células/mL y 50µ1 de poso se agrego en una placa de 96 posos. (4) Las células N 8383 tratadas en la sección 1 se prepararon a concentraciones de 5 x 105, 1 x 105, 5 x 104, y 1 x 104 células/mL y se agregaron 50µ1 por poso a la placa de 96 posos (volumen total: ???µ?) . (5) Se dejaron las células en el incubador de gas de bióxido de carbono por 4 horas . 2. Efecto citotóxico de macrof gos co-cultivados con células de cáncer de pulmón de Sato en células de cáncer de pulmón. (1) El efecto citotóxico de los macrofagos activados por polisacáridos descrito en 1 y co-cultivados con células de cáncer de pulmón Sato en células de cáncer de pulmón, se evalúan de las cantidades de lactato deshidrogenasa liberada de las células en el medio. Por lo tanto, la placa se centrifuga a 1, 000 rpm durante 5 minutos, y 50 µ? del sobrenadante se transfieren a otra placa de 96 pozos. (2) Posteriormente, 50 µ? de una solución de substrato enlazada a un kit (ensayo de citotoxicidad no radioactivo CytoTox 96 Promega cat . G1780) para medir las cantidades de lactato deshidrogenasa se agrega. Como un control positivo, el liquido de dilución de la enzima de lactato deshidrogenasa (liquido de dilución de 5000 veces, 50 µ?) enlazado al kit se usa. · _ " (3) La placa se protege de la luz con papel aluminio, y se deja durante temperatura ambiente durante 30 minutos. (4) La reacción se detiene al agregar 50 µ? de un liquido de detención. (5) Se mide absorbancia a 495 nm usando un lector de microplacas (Modelo 550, Bio-Rad) . , .' (6) La citotoxicidad (%) se calcula e cada una de la absorbancia . (7) El efecto citotóxico de NR8383 en células de cáncer de pulmón Sato se muestra en la figura 7. Se muestra que la fagocitosis por NR8383 tratadas con lipopolisacárido se facilita en comparación NR8383 sin tratamiento con polisacárido y en consecuencia, el efecto citotóxico en el cáncer de pulmón Sato se aumenta dependiendo de las relaciones celulares. Provisión de remedio que facilita la actividad fagocitica de macrófagos y lleva a macrofagos que mantiene el patógeno para muerte celular. El remedio en la presente modalidad se caracteriza porque los macrófagos que mantienen los patógenos llevan a la muerte celular al facilitar la actividad fagocítica de los macrófagos.
Como se muestra en la Tabla 2 el lipopolisacárido bien conocido como una activador macrófago facilita la actividad fagocítica de los macrófagos . También, el iiitérferón ? que es una citocina representativa de los factores que activan el macrófago inducen la actividad fagocítica. Esto es la facilitación de actividad fagocítica de los macrófagos es uno de los indicadores de la activación de los macrófagos. Puede decirse que la facilitación de la actividad fagocítica por la fagocitosis es la facilitación de la activación de macrófago que es la facilitación de fagocitosis por la estimulación que es la fagocitosis. También se conoce que el cambio de una estructura de membrana se induce en el macrófago y que el factor de necrosis de tumor enlazado a la membrana (TNF) se induce en el macrófago. Por lo tanto, junto con la activación de macrófago por la. estimulación que es la fagocitosis, se induce la TNF enlazada a la membrana. El SIDA se presenta debido . a la destrucción de las células T por la infección con el virus del SIDA que resulta en la inmunodeficiencia . El virus del SIDA infecta no sólo a las células T sino también a los macrófagos. Esta infección inicia con la adhesión del virus a la proteína CD4 comúnmente expresada en membrana de células T y macrófago. El macrófago infectado con el virus del SIDA no lleva a la muerte celular, pero produce el virus SIDA persistentemente, y se vuelve el vehículo patógeno infeccioso como se describe en detalle en II. (2). Por lo tanto, los macrófagos infectados con el virus del SIDA pueden llevarse a la muerte celular, - se realiza la exterminación de los vehículos patógenos infecciosos. Como un ejemplo capaz de realizar esta posibilidad se muestra el TNF enlazado a la membrana que puede actuar sobre las células de macrófago infectadas con el virus del SIDA (VIH) para llevar específicamente a las células a la muerte celular. Ejemplo de aplicación específico: La inducción de la muerte de las células infectadas con VIH por células que expresan TNF enlazado a la membrana. Como un ejemplo donde el TNF induce la muerte celular en células infectadas con patógenos, el efecto de TNF en células MOLT-4 infectadas con VIH se muestra. 1. Producción de células que expresan TNF enlazado a la membrana. (1) Con objeto de expresar establemente el TNF enlazado a la membrana de conformidad con reportes previos (Journal of Virology, Vol . 63, pp. 2504-2509, 1989), un plásmido de expresión (pMT2 PG/Hu-proTNF) para TNF enlazado a la membrana de murino y humano se hace . (2) Luego, este plásmido se mezcla con un plásmido para la selección de transformantes en los cuales un gen resistente a la neomicina se incorpora a una relación de 10:1, y se introduce en células de fibroblasto (células NIH3T3) derivadas de embriones de murino . (3) Las células NIH3T3 anteriores transformadas se cultivan- en presencia de 800 µg/mL de ñ omicina que es marcador de selección en el incubador de gas de bióxido de carbono a 37°C durante alrededor de 2 semanas. (4) Después del cultivo, un clon del TNF incorporado en las células se adquiere. (5) Se confirma que el clon adquirido expresa el TNF enlazado a la membrana por un inmunoensayo de enzima. 2. Preparación de células MOLT-4 infectadas con VIH. (1) Para células infectadas con VIH, se infectan células MOLT-4 en el medio (RPMI1640, agregando suero de becerro al 10%, penicilina (100 U/mL) , estreptomicina (100 µg/mL) en el incubador de gas de bióxido de carbono a 37°C de conformidad con el reporte previo (Journal of Virology, Vol . 63, pp. 2504-2509, 1989) usando células infectadas con VIH (cepa HTLV-IIIB) . Cuando la infección con el virus del SIDA se establece en células MOLT-4, las células MOLT-4 exhiben características para producir persistentemente el virus del SIDA. Por lo tanto con respecto a la producción del virus del SIDA, la célula MOLT-4 es un modelo del macrófago infectado con el virus del SIDA. (2) En esta condición de infección 90% o más de las células MOLT-4 infectadas con el VIH se vuelven positivas al anticuerpo de VIH. (3) Por lo tanto por las células infectadas con VIH, se introduce el VIH en casi todas las células MOLT-4, ? las células MOLT-4 infectadas con VIH se preparan.-3. Inducción de muerte celular de células infectadas con VIH por células que expresan TNF enlazado a la membrana. (1) Las células NIH3T3 donde el plásmido de TNP se ha introducido se cultivan semiconfluentemente en una placa de cultivo de 24 pozos . (2) Luego, una cierta cantidad -de células MOLT-4 infectadas con VIH se agregan y se mezcla/cultiva en el incubador de gas de bióxido de carbono a 37° C durante 3 días. (3) Con objeto de examinar el efecto del TNF enlazado a la membrana expresada en las células infectadas con VIH la viabilidad de las células infectadas con VIH se mide por un método de exclusión de pigmento azul de triptano. (4) Como resultado, se observa que la muerte celular se introduce en el 40% de las células MOLT-4 infectadas con VIH al mezclar el cultivo con las células que expresan TNF enlazado a la membrana. Como es evidente en el ejemplo anterior, es evidente que el TNF enlazado a la membrana induce la muerte celular específicamente en células infectados con el virus del SIDA (VIH) . De este fenómeno puede observarse que los macrófagos llevan a la disfunción al mantener los patógenos activados por fagocitosis de los patógenos y consecuentemente induce TNF enlazado a la membrana que lleva a los macrófagos infectados con los patógenos a la muerte celular. Las .enfermedades debidas a la retención' de .patógenos por macrófagos incluyen micobacteriosis, SIDA, clamidiosis o toxoplasmosis y similares . La micobacteriosis incluye tuberculosis cuyo patógeno que la causa es Mycobacterium tuberculosis o Mycobacterium bovis, lepra cuyo patógeno que la causa es Mycobacterium leprae, o micobacteriosis atípica cuyo patógeno que la causa es Mycobacterium avium y similares, o similares. Como patógenos . causantes de la clamidiosis, están Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatis, Chlamydia psittaci y similares. La presente invención puede aplicarse efectivamente a todos estos. El efecto exterminador de las partículas finas RFP-PLGA en los gérmenes de tuberculosis en los macrófagos mostrado en la presente modalidad no se realiza salvo que la rifampicina se libere de las partículas finas RFP PLGA incorporadas en los fagosomas por fagocitosis y al menos dos pasajes por medio de estructuras de membrana de circular de celular son posibles donde la rifampicina permea la membrana de la fagosoma y además permea la membrana de fagosoma del fagosoma que contiene los gérmenes de tuberculosis. Las estrategias de sobre vivencia de los patógenos causantes mostrados arriba en los macrófagos diversas. En la micobacteriosis completa, Legionella y Toxoplasma, los patógenos que la causan están vivos en los macrófagos al sobrevivir en los fagosomas . Listeria y Chlamydia tiene las características que los patógenos que la causan se evacúan de los ?agosomas. Este aspecto de existencia intracelular de los patógenos causantes se presumen que se compara más fácilmente al caso en donde los patógenos causantes existen en los fagosomas debido a la eficacia de los fármacos debido a que la eficacia del fármaco puede anticiparse cuando el fármaco perraea la membrana del fagosoma una vez desde la perspectiva .' de la entrega del fármaco. El SIDA es similar a Listeria y similar en aspecto a la eficacia del fármaco que puede anticiparse si el fármaco se entrega a los patógenos causantes presentes en la célula. De lo anterior la invención es un tratamiento prometedor para los patógenos causantes arriba. Medicinas para ' varias enfermedades a las cuales la invención puede aplicarse efectivamente se citan abajo. 1) Micobacteriosis : rifampicina, isoniazid, etambutol, pirazinamida, azitromicina, canamicina, sulfato de estreptomicina, enviomicina, etioniamida, cicloserina, levofloxacina, diafenilsulfona . 2) SIDA: azidotimidina, didesoxiinosina 3) Clamidiosis : clorohidrato de minociclina, clorohidrato de doxiciclina, claritromicina, esparfloxacina, rositromicina, levofloxacina. 4) Toxoplasmosis : pirimetamina, sulfamonometoxina, acetilspiramicina. 5) Malaria: fosfato de cloroquina, sulfato de quinina, sulfadoxina, mefloquina. ' 6) Cáncer: 5-fluorouracil, adriamicina, cisplatina, etoposida, mitomicina, vincristina, taxol, campotecina, vinblastina, ciclofosfamida, bleomicina. 7) Enfermedad de Crohn: salazosulfapiridina, glucocorticoide . 8) Reumatoide: tiomalato de oro ,sodio, penicilamina, bucilamina, glucocorticoide. Todas la publicaciones patentes y solicitudes de patente se incorporan en la presente para referencia en su totalidad.
Aplicación Industrial . De conformidad con la invención es posible proporcionar un remedio que puede tratar efectivamente una enfermedad causada por macrófagos con disfunción o macrófagos como vehículos . Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (18)

  1. REIVINDICACIONES
  2. Habiéndose descrito la invención corad' .antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones . 1. Un remedio caracterizado porque la actividad fagocítica de macrófagos es inducida, y todo o parte de los patógenos presentes en los macrófagos se exterminan hasta desaparecer. , .' 2. Un remedio caracterizado porque la actividad fagocítica de macrófagos es inducida y los macrófagos que retienen a los patógenos se llevan a la muerte celular.
  3. 3. Un remedio caracterizado porque la actividad fagocítica de macrófagos es inducida y se hace actuar sobre los macrófagos en un estado disfuncional .
  4. 4. El remedio de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque es para! micobacteriosis , SIDA, clamidosis o toxoplasmosxs.
  5. 5. El remedio de conformidad con la reivindicación 2 ó 3, caracterizado porque es para enfermedad de Crohn, reumatoide, cáncer o síndrome de inmunodeficiencia .
  6. 6. El remedio de conformidad de cualesquiera de las reivindicaciones 1 hasta 4, caracterizado porque los macrófagos residen en el tejido mucosal.
  7. 7. El remedio de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 hasta 4, caracterizado porque los macrofagos son residentes en cualesquiera de la cavidad peritoneal, omento mayor, punto lechoso, alvéolo pulmonar, estroma pulmonar, hígado, área de vena portal, bazo, médula ósea, timo, tracto digestivo, amígdalas palatinas, glándula adrenal, y pituitaria, estroma tiroide, islote de Langerhans, glándula paratíroide, glándula pineal, testículos, ovarios, oviducto, útero, placenta, piel, meninges, sustancia cerebral y plexo coroidal , o los macrofagos anteriores son microglia, células precursoras de microglia, células ( de glia, células precursoras de célula de glia, células precursoras de los macrofagos residentes anteriores, células análogas de los macrofagos residentes anteriores, o células análogas de macrofagos residentes anteriores .
  8. 8. El remedio dé conformidad con la reivindicación 1, 2 3 ó 6, caracterizado porque comprende PLGA [copolímero de poli (ácido láctico/ácido glicólico) ] y es para la tuberculosis .
  9. 9. El remedio de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque comprende además rifampicina.
  10. 10. El remedio de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 hasta 9, caracterizado porque comprende PLGA donde el peso molecular es 1,500 hasta 150,000.
  11. 11. El remedio de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 hasta 9, caracterizado porque comprende PLGA donde el peso molecular es 1,500 hasta 75,000.
  12. 12. El remedio de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 hasta 11, caracterizado " porque comprende además al menos uno de PVA (alcohol polivinilo) , PEG (polietilenglicol) , PEO, (óxido de polietileno) , azúcar, proteína, péptido, fosfolípido o colesterol.
  13. 13. El remedio de conformidad con la reivindicación 8 ó 9, caracterizado porque comprende además al menos uno de PVA, PEG, PEO, azúcar, proteína, péptidó,' fosfolípido, o colesterol, y es una formulación de partículas finas, en donde los mayores diámetros de partículas son 1 hasta 6 µt?.
  14. 14. El remedio de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a la 3, caracterizado porque la actividad fagocítica de los macrófagos se facilita por medio de la fagocitosis.
  15. 15. El remedio de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende 'PLGA en donde el peso molecular es de 5,000 hasta 20,000 y es para la tuberculosis.
  16. 16. El remedio de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque se fabrica por un método de emulsificación de membrana.
  17. 17. El remedio de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque comprende un lipopolisacárido de Pantoea agglomerans y es para el SIDA.
  18. 18. El remedio de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque comprende un lipopolisacárido de Pantoea agglomerans y tiene un efecto citotóxico en células de cáncer de pulmón.
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