MXPA05002292A

MXPA05002292A - Prevencion de tratamiento de tejido epitelial o perdida de pelo.

Info

Publication number: MXPA05002292A
Application number: MXPA05002292A
Authority: MX
Inventors: Laure Poquet
Original assignee: Nestle Sa
Priority date: 2002-08-27
Filing date: 2003-08-27
Publication date: 2006-05-22
Also published as: BR0313808A; CN1780603A; CA2496453A1; AU2003266313A1; EP1539095A1; US20060104901A1; AU2003266313B2; JP2006511462A; WO2004019900A1

Abstract

La presente invencion pertenece a un metodo para prevenir y/o tratar tejido epitelial danado, como el efectuado por reacciones inflamatorias, envejecimiento y/o para prevenir y/o tratar la perdida de pelo. En particular, la presente invencion se relaciona con sustancias y/o composiciones que modifican y en particular boquean la funcion CDid endogeno. De acuerdo a otro aspecto la presente invencion proporciona un metodo para seleccionar compuestos adecuados para usarse en el metodo y la composicion de la presente invencion,.

Description

PREVENCION DE TRATAMIENTO DE TEJIDO EPITELIAL O PERDIDA DE PELO CAMPO DE LA INVENCION La presente invención pertenece a un método para prevenir y/o tratar tejido epitelial dañado, como el afectado por reacciones inflamatorias, enve ecimiento o cáncer y/o para prevenir y/o tratar la pérdida de pelo. En particular, la presente invención se relaciona con sustancias y/o composiciones que modifican, en particular boquean la función CDj.d endógeno. De acuerdo a otro aspecto la presente invención también proporciona un método para seleccionar compuestos adecuados para usarse en el método y la composición de la presente invención.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION El tejido epitelial mas prominente en los seres vivos es la piel, y representa el órgano más grande en el organismo. El sistema del integumento de la piel, el cual comprende la epidermis, dermis y el estrato cómico, se correlaciona con aquellos de los órganos internos e interactúa concurrentemente con los alrededores. Siendo la interconexión entre el ambiente y el organismo en sí, la piel es influenciada fuertemente por factores externos y también parámetros variables del sistema interno del organismo. Los mecanismos reguladores de la piel necesitan, por lo tanto, estar siempre activos para inducir los cambios sistémicos necesarios para mantener los eventos patológicos relacionados con la morfología y actividades del integumento de la piel. Una gran cantidad de procesos aseguran el consumo adecuado de una afluencia creciente de sustancia energéticas y plásticas de acuerdo a las necesidades de la piel se vuelven garantízadores de la estabilidad morfológica y funcional de las estructuras de la piel. De este modo, el estado de los integumentos determina la realización de los procesos metabólicos necesarios para la viabilidad y actividad de las células de la piel que conduce a la presencia de las peculiaridades de la piel sana, como la función de barrera, la elasticidad, propiedades de turgor, humedad, pigmentación, etc. Durante el tiempo de vida de un ser viviente aparecen diferentes signos, característicos del envejecimiento, sobre la piel, con los signos clínicos principales siendo al aparición de líneas finas y arrugas profundas las cuales se incrementan o se acentúan con la edad. Además, la complexión de la piel se modifica generalmente y pueden existir irritaciones difusas y ocasionalmente telangiectasias en ciertas áreas. Esos signos de enve ecimiento son promovidos aún por la exposición de la piel a influencias exógenas, como por ejemplo radiación UV, contaminantes, radicales libres o sustancias químicas . La exposición moderada a la UV generalmente produce los efectos bien conocidos de enrojecimiento de la piel con una reacción inflamatoria acompañante conocida como eritema. Este fenómeno, con frecuencia referido "quemadura solar" es doloroso y comúnmente da como resultado el desprendimiento posterior de la piel . Además, la exposición excesiva de la UV a la piel también puede conducir a la aparición de varios trastornos, como carcinogénesis, siendo los tumores más comunes el carcinoma de células básales (BCC) , seguido por carcinoma de células escamosas (SCC) , y más raramente melanoma maligno. Además de los daños a nivel de ADN, la inmunosupresión causada por la exposición a la UV parece contribuir a la promoción de cáncer no melanómico y melanoma. Actualmente se reconoce que la inmunosupresión fotoinducida permite que las células tumorales activadas evadan el reconocimiento y rechazo por mecanismos inmunológicos normales, para permanecer latentes durante periodos prolongados y para proliferarse eventualmente en un tumor. Este concepto ocurre con el descubrimiento de que pacientes inmunocomprómetidos , ya sea genéticamente (xeroderma pigmentosa) o farmacológicamente, como por ejemplo receptores de trasplantes de órganos, tienen una mayor incidencia de cáncer de piel en comparación con personas con un sistema inmune que funciona adecuadamente. En la técnica han sido propuestos varios medios para evitar los efectos destructivos de factores ambientales sobre células epiteliales, en particular las células epiteliales de la piel . Con respecto a la protección a la radiación solar, se han vuelto disponibles los "bloqueadores solares" o "protectores solares" , los cuales son aplicados a la piel antes de exponerse al sol. Típicamente, las composiciones protectoras solares contienen agentes químicos, como ciertas benzofenonas, dibencilmetanos o para-aminobenzoatos sustituidos, es decir, compuestos que absorben la radiación ultravioleta, de modo que ésta no pueda penetrar la piel. Sin embargo, algunos de los compuestos usados para este propósito ha mostrado carecer de suficiente fotoestabilidad y pueden aún volverse tóxicos durante una aplicación prolongada. Además, ellos deben permanecer continuamente sobre la superficie de la piel al momento de la exposición para ser efectivos. Sin embargo, los protectores solares son desprendidos o lavados fácilmente por la sudoración o nadando y también pueden perder penetración hacia la piel . Otros medios para prevenir el deterioro o envejecimiento de la piel, respectivamente, es proporcionar compuestos depuradores de radicales libres . A este respecto la EP 0 761 214 proporciona extintores de oxígeno libre que comprenden derivados de anilina y derivados de difurfuril amina, los cuales se reporta reducen el esfuerzo oxidativo a la piel . Aún, todos esos medios y métodos no son suficientemente capaces para proteger la piel del creciente desafio a nuestro ambiente. A esto contribuye un incremento de la contaminación atmosférica y también el comportamiento social de acuerdo al cual el bronceado solar esta asociado con la salud, belleza y estatus. Como consecuencia muchas personas exponen sus piel a la radiación solar para adquirir un bronceado a pesar de que son bien conocidas lo resultados negativos que acompañan a ese comportamiento. Este problema se vuelve aún más prominente con el adelgazamiento de la capa de ozono que cubre la tierra que da como resultado una exposición más fuerte de los seres vivientes a la radiación UV. Por consecuencia existe la necesidad en la técnica de proporcionar una mejor protección de la piel a factores ambientales, como el esfuerzo o tensión de radiación solar. En consecuencia, un objetivo de la presente invención es obviar las desventajas de la técnica anterior y proporcionar medios para proteger la piel contra las influencias desfavorables encontradas en el ambiente, en particular contra el esfuerzo o tensión oxidativa o química d o radiación solar. Este problema ha sido resuelto proporcionando una sustancia, que es capaz de modificar, esencialmente, en particular bloquear la función del CD¿d de endógeno en las células epiteliales.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Figura 1A. Los ratones silvestres exhiben daño a la piel (quemaduras) después de la exposición a una sola dosis (86mJ/m2) de radiación UVB. Figura IB. Los ratones silvestres exhiben daño a la piel (quemaduras) después de la exposición a una sola dosis (86mJ/m2) de radiación UVB. (acercamiento) . Figura 1C. Ratones alterados con CDld no muestran signos obvios de daño a la piel después de la exposición a una sola dosis (86mJ/m2) de radiación UVB. Figura ID. Ratones alterados con CDld no muestran signos obvios de daño a la piel después de la exposición a una sola dosis (86mj/m2) de radiación UVB. (acercamiento) . Figura 2. Diferencia en el grado de daño en la piel inducido por UVB entre ratones silvestres (derecha) y ratones alterados con CDld (izquierda) expuestos a dos dosis (86mJ/m2) de radiación UVB. Figura 2A. piel dorsal dañada (lesiones) de ratones silvestres expuestos a dos dosis (86mJ/m2) de radiación UVB. (acercamiento) . Figura 2B . Piel dorsal no dañada de ratones alterados con CDld expuestos a dos dosis (86mJ/m2) de radiación UVB. (acercamiento) . Figura 3. Los ratones alterados con CDld exhiben incremento de la apoptosis epidérmica en su epidermis dorsal en comparación con los ratones silvestres, de acuerdo a lo medido por el TUNEL. El ratón silvestre (A) y alterado (B) no expuesta a radiación UV. Piel de ratón silvestre (C) y alterado con CDld (D) 48 horas después de una sola exposición (86mJ/m2) de radiación UV-B. Las figuras 4a y b son gráficas que indican la cantidad aproximada de CDld en diferentes tejidos en ratones y humanos . La figura 5 muestra que la proteína CDld es expresada en la epidermis de la piel de ratón 72 horas después de la exposición a una sola dosis (430mJ/cm2) a radiación UVB. La figura 6 muestra que la trascripción del gen de CDld en la piel de murina es regulada después de la radiación de UVB; La figura 7 muestra que la trascripción del gen de CDld en la piel de murina es regulada después de la radiación de luz solar simulada; La figura 8 muestra que la trascripción del gen de CDld queratinocitos humanos inmortalizados (DK7) es regulada después de la radiación de UV solar; La figura 9 muestra que los niveles de ARNm de COX-22 y TFN-alfa son desregulados en piel de ratón alterado con CDld irradiada con UVB. Las figuras 10 a y b muestran que los niveles de proteína IL-6 y MlPl-alfa de ratón 48 horas después de la radiación de UVB disminuyen significativamente en ratones alterados con CDld. La figura 11 muestra que la hidrocortisona suprime la trascripción de CDld en células expuestas a un esfuerzo químico; y La figura 12 muestra que la CDld es expresada en folículos de cabello humanos .

DESCRIPCION DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS DE LA INVENCION La presente invención se basa esencialmente en el descubrimiento de que la CDld, una proteína transmembranal expresada por un número de células diferentes, en particular células epiteliales, modula una variedad de diferentes respuestas de la célula al esfuerzo. Como se volverá evidente a partir de la siguiente descripción detallada de las modalidades preferidas, modificar esencialmente, bloqueando específicamen e la función de la CDld endógena en células que contienen esa molécula de la membrana permite evitar que los efectos dañinos del esfuerzo o tensión incluyendo el daño a la piel inducido por radiación ultravioleta, por ejemplo como resultado de quemaduras, hiperplasia epidérmica , acumulación de p53 mutante, inflamación, supresión inmune y envejecimiento de la piel . De manera aún más sorprendente es el descubrimiento de que cuando se bloquea esencialmente la función de CDld en células epiteliales, la inducción de cáncer de células epiteliales en las células, es decir, carcinoma de células básales, carcinoma de células básales, carcinoma de células escamosas, melanoma maligno, cáncer de colon, mama, hígado, próstata, riñon, páncreas, etc, puede ser prevenida. Además se ha encontrado, de manera sorprendente, que modificar, en particular bloquear la función de CDld tiene influencia sobre el crecimiento y/o desarrollo de pelo. La CDld como tal es un tipo de proteína similar al HC transmembranal de la clase 1, tipo 1, que no se asocia covalentemente con la p2-microglobulina . La molécula de CDia es reconocida por un receptor de células T de las células T asesinas naturales (NKT) los cuales juegan un papel importante en las reacciones moduladoras y efectoras inmunes . Se ha demostrado que las CDld puede presentar lípidos a las células NKT para su activación, noción la cual es apoyada por la estructura cristalina de la CDld que tiene dos ranuras altamente hidrofóbicas , necesarias para presentar moléculas hidrofóbicas como lípidos al sistema inmune . En los estudios que condujeron a la presente invención se ha notado de manera sorprendente, la trascripción del gen CDld en piel de ratón en respuesta a tensión externa, como radiación UV, descubrimiento el cual ha sido confirmado en queratinocitos humanos. Además se ha notado que la CDXd de la piel media con daño/inflamación a la piel inducido por UV induciendo la trascripción del gen de COX-2 y TNF-a y también inhibiendo la apoptosis inducida por UV. Sin desear ser limitados por ninguna teoría actualmente se asume que una de las tareas endógenas de la CDid en organismos vivientes es controlar directamente la homeostasis de células epiteliales normales. La homeostasis de la piel normal depende de un equilibrio crítico y finamente sintonizado entre la diferenciación epidérmica, apoptosis, proliferación y anti-apoptosis de las células epidérmicas. En la piel, esos procesos son regulados vía lípidos, en particular por medio de ceramidas y glicosilceramidas (esfingolípidos) . Aunque las capas de células nucleadas generan un glucosilceramidas (GlcCer) , las proporciones de GlcCer a Cer disminuyen al final de la diferenciación epidérmica, con el contenido de Cer alcanzando un pico en el estrato córneo que actúa como constituyentes celulares de la barrera de permeabilidad epidérmica. Además de sus propiedades estructurales, las ceramidas están asociadas con la inhibición de la proliferación celular, inducción de la diferenciación celular y muerte celular programada. En contraste, el GlcCer induce la proliferación celular e inhibe la muerte celular programada . Sobre la base de esos descubrimientos en la presente invención, la CDm parece ser uno de los receptores vía los cuales lípidos mencionados anteriormente pueden efectuar todas sus tareas biológicas. Específicamente, la CDid parece regular negativamente la apoptosis. En consecuencia, hay células bajo una situación de tensión, por ejemplo, cuando se exponen a radiación UV, la CDld soporta una existencia continua de las células sometidas a tensión, aún cuando el material genético sea dañado y/o haya mutado, células dañadas las cuales contribuirán a procesos inflamatorios inducidos y eventualmente contribuirán al fenómeno de envejecimiento o desarrollo eventual de tumores . Con el bloqueo y/o modificación de la función de CDld endógeno, la apoptosis de la célula bajo tensión puede ser promovida, en lugar de su sobrevivencia y propagación, con el efecto de que las células que han sido dañadas en cierto grado, particularmente a nivel del ADN, no tienen la oportunidad de proliferar y según el caso diseminarse en el cuerpo. Las células una vez muertas entonces serán extinguidas por procesos naturales en el cuerpo y serán reemplazadas por células epiteliales "sanas" . De igual modo, por medio del bloqueo o modificación también se previene o altera de manera sustancial la interacción de la célula CDld con NKT cuando el fenómeno de supresión inmune durante la exposición a radiación UV será reducido esencialmente o detenido del todo. También, se supone que esta condición ayuda al sistema inmune del organismo a erradicar partículas dañadas, a través de la exposición UV. La sustancia capaz de modificar y/o bloquear la actividad de la molécula transmembranal con CDld puede ser cualquier sustancia que interfiera con la función biológica endógena de la CDad, en particular prevenga o reduzca la asociación de la CDld con lípidos endógenos o exógenos . Las sustancias pueden ser obtenidas por un proceso que comprende los pasos de (a) exponer células epiteliales a una sustancia de interés, (b) someter las células epiteliales a una situación de tensión, (c) determinar el efecto de la tensión a las células epiteliales seleccionando uno o más de los siguientes ensayos: (i) hiperplasia epitelial (H&E) , (ii) proliferación epitelial (BrUd, PCNA) , (ili) apoptosis epitelial, (iv) acumulación de mutación de p53, (v) evaluación cuantitativa y cualitativa de lipidos epiteliales, (vi) patrones de coagrupamiento de receptores de la superficie celular apoptó icos y no apoptóticos, (vii) producción de citocinas pro-inflamatorias , (viii) producción de citocinas inmuno moduladoras, (ix) marcadores de la inflamación, (x) actividad anti apoptópica de factor de trascripción, (xi) marcadores del envejecimien o, y (d) comparación de los resultados por un control. Ese control puede ser, por ejemplo, un ensayo donde las células hayan sido sometidas a la misma situación de tensión, donde, sin embargo, no ha sido agregada la sustancia a ser investigada (control negativo) . De igual modo un control también puede ser, incluida una sustancia de efecto positivo conocida en el ensayo y determinar la diferencia en el efecto logrado por la sustancia investigada y la sustancia conocida (control positivo) . Se considera que una sustancia es activa en el contexto de esta solicitud, en el caso de que prevenga los efectos negativos de tensión como se detallaron a cualquiera de los ensayos anteriores . Se apreciará que la actividad de la CDld puede ser bloqueada y/o modificada por sustancias que actúan a nivel genético o a nivel de la proteína.

Las sustancias que actúan a nivel genético son compuestos que tienen la influencia en particular sobre la prevención o trascripción mediante la reducción del gen de CDld, como los poli nucleótidos anti sentido para al menos una parte del gen de CDld o el AR m de CDld. Los términos oligonucleótido y poli nucleótido, los cuales son usados de manera intercambiable aquí, incluyen oligómeros/polímeros naturales de monómeros o enlaces naturales o modificados, incluyendo desoxirribonucleosidos , ribonucleosidos, formas alpha-anoméricas de los mismos, ácidos poliamido nucleótidos, y similares, capaces de unirse específicamente al ácido nucleico objetivo por medio de un patrón regular de interacciones monómero-a-monómero, como el apareo de bases del tipo de Watson-Crick, apareo de bases del tipo de Hoogsteen o Hoogsteen inverso, o similares. Usualmente los monómeros son ligados por enlaces fosfodiester o análogos de los mismos para formar oligonucleótidos que fluctúan en tamaño de unas cuantas unidades monoméricas, por ejemplo 3-5, o varios cientos o aún miles de unidades monoméricas. Los oligo-/poli nucleótidos (anti-) sentido también pueden contener grupos o entidades pendientes, para mejorar la especificidad, resistencia a la nucleasa, liberación u otra propiedad relacionada con la eficacia, como por ejemplo entidades de colesterol, intercaladores dúplex como la acridina, poli-L-lisina, "coronación de un extremo" con uno o más grupos de enlaces resistentes a la nucleasa como el fósforotioato y similares. El oligonucleótido correspondiente puede ser usado para bloquear la trascripción, procesamiento del ARN y/o traducción del ARNm. En consecuencia el oligonucleótido puede comprender exones, pero también secuencias de intrones del gen ob etivo CDid. La secuencia nucleotídica del gen ARNm o CDid humana puede ser obtenido de NCBI (Números de acceso: ??002532 y NM__001766, respectivamente) . Sobre la base de este conocimiento y destreza general, el experto puede seleccionar al menos una porción de región codificadora del gen de CDm y diseñar un poli nucleótido anti-sentido apropiado, que prevenga la trascripción y/o traducción del gen CDid. De igual modo, también en parte de la región no codificadora del gen de CDlta puede servir como agente para prevenir la trascripción o reducir el número de transcripciones, respectivamente, del gen de CDid. Aquí, partes particulares de la región promotora pueden servir como molde para preparar un poli nucleótido anti sentido, pero de igual modo que las regiones de transición de los intrones y exones y viceversa. De acuerdo a una modalidad preferida esa sustancia puede ser una ADN o un ARNc (ARN-interferencia) .

Además, aparte de que el gen de CDid sea el objetivo, también la actividad de un número de moléculas reguladoras que controlan la homeostasis epitelial, en las ceramidas y/o glucosilceramidas , puede ser modificada de modo que ejerzan el efecto deseado sobre la molécula de CDid. Hasta este punto, el número de transcriptos de glucosilceramida sintasa puede ser reducido diseñando un poli nucleotido anti sentido a al menos una parte del gen de glucosilceramida sintasa o ARNm de glucosilceramida sintasa, de modo que eventualmente la señal a la célula epitelial para proliferar se desactiva. La secuencia nucleotídica del gen de la glucosilceramida sintasa es descrita en Ichikawa et al., PNAS 93 (1996), 4638-4643, documento el cual se incorpora aquí a manera de referencia. De igual modo, las regiones no codificadoras pueden servir como un molde para el poli nucleotido antisentido, como una reacción promotora y/o transiciones de los intrones a los exones y viceversa. De acuerdo a una modalidad preferida esa sustancia puede ser un ADN o un ARNc (ARN de interferencia) . Además de reducir la señal de proliferación también la señal conduce las células epiteliales a la apoptosis vía la molécula de CDid puede ser mejorada. A este respecto el número de transcriptos correspondientes puede incrementarse, lo cual puede ser efectuado proporcionando un mayor número de poli nucleótidos de acuerdo a una secuencia comprendida por esfingomielinasa o gen de ceramida sintasa y/o ARNm de esfingomielinasa o cintaza ceramida . Además del nivel genético, la actividad biológica de la molécula de CDm puede también ser modificada, en particular bloqueada al nivel de la proteina, en particular por cualquier sustancia que se una al receptor de CDld sobre o en células epiteliales y bloqueando la funcionalidad biológica endógena de la misma. De acuerdo a una modalidad preferida la sustancia capaz de modificar, en particular bloquear la función biológica de CDld es un polipéptido o un péptido, en particular péptidos hidrofóbicos, de manera más preferible un anticuerpo, o una parte del mismo, que se une al receptor de CDxa y bloquea su función biológica, como la interacción con NKT. Como partes de los mismos, en particular se contemplaron minianticuerpos que carecen de partes Fc. De acuerdo a una modalidad alternativa la sustancia capaz de bloquear la función biológica de CDi¿ también puede ser un receptor de COld soluble, que es, aquella parte del polipéptido que carece de la región, que ancla el polipéptido a la membrana. El receptor de CDid soluble eliminará los ligandos in vivo que promuevan la sobrevivencia de las células sometidas a tensión, promoviendo de este modo la apoptosis. Además, la unión de células asesinas naturales a CDid in vivo se reducirá, previniendo de este modo la activación de las células T y en consecuencia reacciones inflamatorias y/o inmunosupresoras . De acuerdo a una modalidad preferida la sustancia capaz de bloquear y/o modificar la función biológica de CDad es un lípido derivado de una planta, microbio o animal, incluyendo un fosfolípido, gangliósido, esfingolípido, glicoesfingolipido, fosfato de fosfatidilinositol , esterol, polifenol, glicérido o ácido graso. Esos lípidos pueden tener influencias sobre la función de OX¿ por la unión directa en la molécula de CDXd o indirectamente por la influencia de la expresión del gen CDXd. De acuerdo a una modalidad alternativa la sustancia capaz de bloquear y/o modificar la función biológica de CDid es una ceramida, como la ceramida 8 o la fosfocolina de espingosina o un ligando de un receptor perteneciente a la superfamilia de TNF, en particular CD95/APO-l/Fas , que induce apoptosis, interfiriendo de este modo con la función antiapoptótica de la CDid. En otra modalidad la sustancia objetivo es un compuesto orgánico obtenido por síntesis química. Está bien establecido que la glicosilación de la ceramida, vía la glucosilceramida sintasa, y la acumulación posterior de glucosilceramidas permite el escape celular de la muerte celular programada inducida por tensión, confiriendo resistencia de células cancerosas de una variedad de cánceres incluyendo el de mama, piel, colon y carcinomas epiteloides, agentes anticáncer citotóxicos. Puesto que la CO ¿ puede unirse a la glicosilceramida y ser sobreexpresada por las mismas células cancerosas resistentes a fármacos múltiples (por ejemplo carcinoma de células escamosas) , se contempló que la actividad antiapoptótica de la COi¿ regula la resistencia de las células cancerosas a fármacos citotóxicos, posiblemente a nivel de la unión de proteína-glucosilceramid . De este modo, en principio las sustancias de la presente invención que bloquean y/o modifican la función del endógeno de CDid hacen disminuir fuertemente la resistencia a fármacos múltiples de una variedad de cánceres incluyendo los cánceres de piel, intestino y mama. En principio, las sustancias de la presente invención también pueden tener influencia sobre el tránsito bidireccional de CDm a y desde la membrana. Las sustancias pueden ser incluidas en cualquier composición adecuada para administrar la sustancia a un individuo, en particular una composición alimenticia, una composición cosmética o una composición farmacéutica. Las composiciones farmacéuticas que contienen al menos una de las sustancias capaces de bloquear o modificar la molécula de la superficie de CDld de acuerdo a la invención pueden ser administradas para tratamientos profilácticos y/o terapéuticos. En aplicaciones terapéuticas , las composiciones son administradas a un paciente que ya padece de una enfermedad, como se describe aquí más adelante, una cantidad suficiente para curar o al menos contrarrestar parcialmente los síntomas de la enfermedad y sus complicaciones. Una cantidad adecuada para lograr esto es definida como "una dosis terapéuticamente efectiva" . Las cantidades efectivas para este dependerán de la severidad de la enfermedad y el peso y estado general del paciente. En aplicaciones profilácticas, las composiciones que contienen al menos una de las sustancias capaces de bloquear o modificar la molécula de la superficie de CDld de acuerdo a la invención son administradas a un paciente susceptible a o de otro modo en riesgo de una enfermedad particular. Esa cantidad es definida como una "dosis profiláctica efectiva" . En este uso, las cantidades precisas dependen nuevamente del estado de salud y peso del paciente . Los compuestos de la invención son administrados preferiblemente con un vehículo farmacéuticamente aceptable, difiriendo la naturaleza del vehículo con el modo de administración, para rutas parenteral, intravenosa, oral y tópica (incluyendo la oftálica) . La formulación deseada puede ser producida usando una variedad de excipientes incluyendo, por ejemplo, grados f rmacéuticos de manitol , lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarin celulosa sódica, carbonato de magnesio. Esta composición puede ser una tableta, una cápsula, una pildora, una solución, una suspensión, un jarabe, un suplemento oral seco, un suplemento oral húmedo, alimentación por un tubo seco, alimentación por un tubo húmedo, etc. Para controlar la liberación de fármaco, también pueden ser usadas formulaciones de liberación sostenida . El tipo de vehículo/excipiente y la cantidad del mismo dependerán de la naturaleza de la sustancia y el modo de liberación y/o administración del fármaco contemplado. Por ejemplo, para formulaciones que contienen oligonucleótidos antisentido débilmente solubles, pueden ser empleadas microemulsiones , por ejemplo usando un tensoactivo no iónico como el Tween 80 en una cantidad aproximada de 0.04-0.05% (p/v) , para incrementar la solubilidad. Otros componentes pueden incluir antioxidantes, como el ácido ascórbico, polímeros hidrofílieos, como, monosacáridos , disacáridos y otros carbohidratos incluyendo la celulosa o sus derivados, dextrinas, agentes quelantes, como el EDTA, y componentes similares bien conocidos por aquellos en las ciencias farmacéuticas. Esos diferentes componentes utilizados proporcionan una variedad de funciones, incluyendo la regulación de la concentración del fármaco, regulación de la solubilidad, estabilización química, regulación de la viscosidad, aumento de absorción, regulación del pH, y similares. Por ejemplo, en formulaciones solubles en agua la composición farmacéutica preferiblemente incluye un amortiguador como un amortiguador de fosfato, u otras sales de ácido orgánico, preferiblemente a un pH de entre aproximadamente 7 y 8. Se apreciará que el experto en la técnica, sobre la base de su conocimiento selecciona los componentes y la forma galénica apropiada para dirigir el compuesto activo al te ido de interés, por ejemplo colon, estómago, piel, riñon o hígado, tomando en cuenta la ruta de administración, la cual puede ser por vía de una inyección, aplicación tópica, administración intranasal, administración por sistema de liberación sostenida implantados o transdérmicos y similares. La sustancia objetivo también puede ser formulada en un producto cosmético, como lociones, champús, cremas, protectores solares, cremas para después de asolearse, bloqueadores solares, cremas antienvejecimiento, ungüentos, y/o líquidos antipérdida del pelo. Esto prueba en particular, ser ventajoso para bloquear esencialmente la función de CDld en la piel y para prevenir el efecto adverso de la radiación solar, fotoenvej ecimiento y exposición de la piel a radicales libres. De este modo, por ejemplo proporcionando un protector solar que contenga además de un agente común, una sustancia que absorba luz UV como se define aquí, puede ser proporcionada una protección contra el sol, la cual excede con mucho cualquier cosa conocida hasta ahora. Esta característica se basa en particular en el hecho de que la sustancia objetivo penetrará la piel y ejercerá su efecto después de haber alcanzado las moléculas objetivo. Puesto que este efecto durará durante un rato, la protección al sol estará aún presente en el caso de que el protector solar haya sido desprendido o lavado, por ejemplo, durante la práctica de un deporte, etc. Además, aparte de los protectores solares las sustancias objetivo pueden ser incluidas en cremas de día comunes, lociones, etc. para prevenir los efectos negativos del ambiente diario, incluyendo la contaminación, tensión oxidativa, etc. Se apreciará que los productos cosméticos de la presente contendrán una mezcla de diferentes ingredientes conocidos por el experto en la técnica, que aseguran una penetración rápida de la sustancia objetivo en la piel y previenen la degradación del mismo durante su almacenamiento . Otra composición altamente importante de acuerdo a la presente invención es el material alimenticio. En nuestra sociedad actual se consume una gran cantidad de alimento, como salsas, carne salada o asada, etc., que contiene preservativos, ingredientes o sustancias que son dañinas para el intestino. Por ejemplo la carne asada contiene compuestos alifáticos y aromáticos que se sabe son carcinogénicos . También los preservativos, que matan los microorganismos contenidos en material alimenticio (por ejemplo salsa) manipulando su ADN, ejercerán un efecto similar a las células del intestino. En efecto, el número de cánceres intestinales está incrementando constantemente en nuestra sociedad, lo cual puede ser atribuido al menos en parte al tipo de alimento consumido por los humanos. En consecuencia, la presente invención proporciona una composición alimenticia que previene la aparición/desarrollo de esos trastornos intestinales, como la composición seleccionada del grupo que consiste de leche, productos de leche fermentada, como por ejemplo yogurt, requesón, queso, productos fermentados basados en leche, helados, polvos a base de leche, fórmulas infantiles, productos de cereal y productos fermentados basados en cereal, agua mineral, chocolate o alimento para mascotas que contienen al menos una sustancia capaz de bloquear y/o modificar esencialmente la función de CDid. Puesto que el compuesto objetivo es para ser contenido en un material alimenticio en cantidades que no afectan el sabor original del mismo, el consumidor no notará ningún cambio en el producto, pero experimentará los efectos benéficos del mismo, es decir un efecto protector o aún curativo. Una vez que el material alimenticio ha sido ingerido las sustancias objetivo ayudarán a las células objetivo, las cuales pueden ser las células epiteliales del intestino, es decir del estómago o del intestino, y se unirán al receptor de CDia y ejercerán su actividad. Como consecuencia, las células, que ya han sido dañadas preferiblemente pasarán a la apoptosis en lugar de ser mantenidas en forma dañada. Puesto que las células epiteliales que contienen CDia han sido encontradas en un número de órganos, como el hígado, intestino delgado, colon, el riñon, la próstata, el útero, el páncreas, mama, piel y conjuntiva, la elección de la composición como se detalló anteriormente, en gran medida dependerá del te ido objetivo. Como será comprendido, para la piel un producto cosmético puede ser la composición de elección, mientras que en el caso de proporcionar la sustancia objetivo directamente al intestino o el colon, el producto alimenticio puede ser la primera elección. Sin embargo, un producto alimenticio también puede ser adecuado para proporcionar la sustancia o sustancias objetivo a otros órganos, como el riñon o el hígado, la cual dependerá de la estabilidad de la sustancia en el cuerpo y su capacidad de ser absorbida por el cuerpo en el intestino. Puesto que el alimento es un material ingerido diariamente como producto ofrece una gran variedad de diferentes posibilidades. Además, en el caso de que la sustancia objetivo sea propensa a la degradación en el intestino puede ser seleccionada una composición farmacéutica, proporcionando por ejemplo la encapsulación y otras formas galénicas para proporcionar la sustancia objetivo al tejido objetivo/a las células objetivo. Se comprenderá que el concepto de la presente invención puede ser aplicado de igual modo como una terapia adyuvante que ayude a los medicamentos actualmente usados . A este respecto la composición farmacéutica de la presente invención puede ser administrada junto con, por ejemplo, citostática para prevenir el escape del tratamiento del tumor tratado, el cual algunas veces ocurre en tratamientos a largo plazo de ciertos tumores o para ayudar a tratar células cancerosas residuales no capturadas con el régimen farmacéutico. Puesto que la sustancia de la presente invención pueden ser administradas fácilmente junto con material alimenticio puede ser aplicado un alimento clínico especial que contenga una alta cantidad de las sustancias objetivo. También el melanoma puede ser tratado directamente con un medicamento de anticuerpo contra el melanoma junto con una composición farmacéutica o un producto cosmético como se describe aquí . Estará claro que tras la lectura de la presente especificación junto con las reivindicaciones anexas el experto contemplará una variedad de diferentes alternativas para las modalidades específicas mencionadas aquí . En principio, las sustancias de acuerdo a la presente invención pueden ser usadas para el tratamiento y/o prevención de daños en tejidos epiteliales como, por ejemplo en la piel, intestino, ojo, pulmón, hígado, próstata, riñon y/o en el útero, los cuales son producidos por una situación de tensión, por ejemplo por medio de una tensión química, biológica o física, por ejemplo por exposición a oxidantes o carcinógenos, exposición a bacterias, virus, hongos, lípidos derivados de células circundantes y/o microbios, o exposición a irradiación UV. De igual modo, las sustancias pueden ser usadas para prevenir y/o tratar la pérdida del pelo. En consecuencia, las sustancias y/o composiciones de acuerdo a la presente invención pueden ser utilizadas para tratar y/o prevenir daños de la piel, en particular daños actínicos y por envejecimiento de la piel, resequedad, queratosis actínica, pigmentación irregular (que comprende notablemente moteado, pecas, hipomelanosis gutiforme e hiperpigmentación persistente) , arrugas (que comprenden notablemente líneas superficiales finas y surcos profundos) , pseudocicatrices esteladas, elastosis, inelasticidad, telangiectasia, fugas venosas, púrpura, comedones, hiperplacia cebacea, acrocordon, angiogema cereza, queratosis ceborréica, lentigo, carcinoma de células básales y carcinoma de células escamosas, quemaduras y/o ampulación de la piel, formación de cataratas, hiperplasia epidérmica, inflamación, supresión inmune y cáncer, por ejemplo, melanoma y cánceres no melanomatosos de la piel. Para arribar a sustancias adicionales que tengan las características anteriores la presente invención también proporciona un método para seleccionar o separar esas sustancias. En este método son usadas células epiteliales que pueden estar en forma de un cultivo primario, es decir derivadas directamente de un individuo o en forma de una línea celular. Para llevar a cabo el método se prefiere particularmente un cultivo celular, puesto que este permite el suministro continuo de células epiteliales durante los experimentos. Debe tenerse cuidado en que el cultivo celular de células epiteliales usado exhiba los mismos rasgos fenotípicos que las células de un cultivo primario o células epiteliales obtenidas directamente de una muestra de tejido. Se comprenderá que el experto en la técnica seleccionará el material inicial dependiendo del ensayo. En consecuencia, si se va a llevar a cabo una primera ronda de ensayos un diseño de cultivo celular parece ser lo más apropiado, mientras que en el caso de rondas adicionales, es decir evaluación de la actividad de candidatos potenciales, el tejido o aún el modelo animal parece ser lo más apropiado. Las células epiteliales son expuestas a una sustancia de interés durante un periodo de tiempo suficiente para asegurar un contacto de la sustancia con las células. En un siguiente paso las células epiteliales son expuestas a una situación de tensión, la cual puede ser efectuada por ejemplo irradiando las células con diferentes dosis de luz UV, o agregando peróxido de hidrógeno o compuestos químicos tóxicos al cultivo celular. Sin embargo, el tipo de tensión es crítico en tanto las células sean desafiadas para iniciar procesos, normalmente iniciados bajo situaciones de tensión, como por ejemplo la producción de citocinas proinflamatorias por ejemplo IF -a, TNF-a, IL-1, IL-6, IL-8, apoptosis, metabolismo de lípidos alterado, incremento en la producción de p53 , señalización celular alterada como resultado de patrones alterados del coagrupamiento del receptor de la superficie celular, activación de NF-??, la activación de API, muestra hiperproliferación (anti-apoptosis) , función de barrera alterada, etc. Se comprenderá que también puede ser probada más de una sustancia al mismo tiempo, es decir, un cóctel de una o más sustancias, que pueda probar ser benéfico para la segunda o rondas adicionales de ensayo. En un siguiente paso el efecto de la tensión sobre las células epiteliales es determinado evaluando una o más de las siguientes características, por ejemplo: proliferación epitelial (PCNA: Ouhtit et al., American Journal of Pathology

[2000], 156: 201-207; BrUd: Lu Y-P et al., Cáncer Research

[1999], 59: 4591-4602); apoptosis epitelial (Túnel Assay; modification of protocol outlined by Ouhtit et al., American Journal of Pathology

[2000], 156: 201-207); acumulación de mutación de p53 (Allele-specific polymerase Chain reaction [AS-PCR] and single-strand conformation polymorphism [SSCP] , Ananthaswamy et . al., Nature Medicine

[1997], 3: 510-514); producción de citocinas proinflamatorias o inmunomoduladoras (por ejemplo, TNF-OC, PGE-2, IL-1, IL-6, IL-8, IL-4, IL-10, Factor Activador de las Plaquetas, ?T?ß) ; marcadores de la inflamación (por ejemplo COX-2, iNos) ; y actividad antiapoptótica del factor de trascripción (incluyendo AP-1, NFkappaB) por RT-PCR en tiempo real TaqMan, ELISA, e Immunohistoquxmica; evaluación cualitativa y cuantitativa de fosfolípidos , glicosfingolípidos y esfingolipidos (Espectrometría de Masas en Serie con Rocío de Electrones) ; análisis de patrones de coagrupación de moléculas receptoras de la superficie celular epitelial incluyendo receptores de citocina (por ejemplo IL-6) , moléculas de la superfamilia de receptores de TNF (por ejemplo CD95/APO-l/Fas) y receptores reguladores del crecimiento (por ejemplo EGF, insulina) por análisis de transferencia electrónica de resonancia por fluorescencia (FRET) ; marcadores del envejecimiento, por ejemplo elastasas, colagenasas, metaloproteinasas, gelatinasa, estromelisinas , telomerasa . Los resultados obtenidos son entonces comparados con un control, el cual puede ser simplemente un ensayo, donde el mismo tipo de células son expuestas a las mismas condiciones de tensión con la condición de que, ningún compuesto a ser evaluado por su capacidad para bloguear CDid es proporcionado. Como para el modelo animal un control positivo es representado por un animal CDld"/-, donde la actividad de CDid está ausente del todo . Los siguientes ejemplos ilustran la invención con mayor detalle sin restringir la misma a esto.

Ejemplo 1 Generación de un ratón con CDid imitante La CDid de ratón es codificada por dos genes Y CDld2, que comparten un alto grado de identidad de secuencia nucleotidica (Bradbury et al., EMBO J., 7 (1988), 3081-3086) . El producto del gen de CD1(JI es reconocido por todos los anticuerpos anti-CDj. que han sido descritos, mientras que la expresión superficial del producto de CDid2 aún no ha sido demostrada. Además, el dominio a2 predicho del producto del gen de CD^ carece de un enlace disulfuro intradominio que se encuentra en el dominio a2 de todas las moléculas de MHC clase I clásicas y no clásicas publicadas (Bradbury, supra) . Se enseña que este enlace disulfuro es crítico para el doblez de la ranura de unión de antígeno. De este modo, el gen de CDid2 no puede codificar para una molécula presentadora de antígeno funcional, y todas las porciones previamente atribuidas a la CDi de ratón pueden ser efectuadas por el producto del gen de CDaai. Por esta razón, se decidió introducir una mutación dirigida en el gen de CDacj, dejando a la vez la CD1(i2 intacta. El gen de CD1(j fue aislado de una biblioteca de fago cepa 129/Sv con una sonda generada por la reacción en cadena de la polimerasa. El constructo objetivo fue preparado usando un fragmento de Apal de 2.8 kb que contenía la región 5' del gen de CDKI, un fragmento de BamHI-Notl de 3.2 kb que contenía la región 3' del gen de CDid (el sitio de Notl en este fragmento proviene del vector pBluescript en el cual el ADN del fago fue subclonado inicialmente) , un gen de resistencia a la neomicina (neo) , y el plásmido pBluescript (Stratagene) . Este constructo fue diseñado para suprimir un fragmento de aproximadamente 200 pb de un exón que codifica para el dominio oc2 de CDldl. La línea celular TL1 no diferenciada embriónica (ES) derivada de la cepa 129/Sv fue transf'ectada con el vector director linealizado con Notl . Las colonias resistentes a G418 fueron seleccionadas y aisladas de acuerdo a lo descrito en Van Kaer et al . , Cell 71 (1992), 1205-1214. El ADN genómico de las clonas individuales fue digerido con' EcoRI e hibridado con una sonda de Clal-EcoRI de 2.3 kb del extremo 5' del gen de CDldl. La recombinación fue confirmada por digestión con Kpnl e hibridación con una sonda de BamHI.EcoRI de 700 bp del extremo 3' del gen CDldl. Los ratones quiméricos fueron apareados con ratones C57BL/S para evaluar la transmisión de la línea germinal, los ratones mutantes heterocigoticos fueron entrecruzados para obtener mutantes homocigóticos (C57BL/6xl29/Sv) F2. Los ratones fueron tipificados por su estado de CDldl por electroinmunotransferencia Southern genómica con la sonda 5'. Los ratones mutantes estaban sanos y crecieron normalmente . Debido a que las células ES y la cepa de ratón usada para generar animales mutantes difieren en su estado TL (la 129/Sv es una cepa TL+ y la C57BL/6 es una cepa TL-) todos los ratones usados en este estudio fueron genotipificados por TL. Para tipificar los ratones por su estado de TL, se digirió el ADN de la cola con BglII y se híbrido con una sonda específica de TL que detecta un polimorfismo entre las cepas 129/Sv (TL+) y C57BL/6 (TL- ) (Pontarotti et al., Proc . Nati. Acad. Sci . USA 83 (1986), 1782-1786) . Esta sonda fue generada por la reacción en cadena de la polimerasa usando un conjunto de cebadores diseñados sobre la base de secuencias publicadas (Pontarotti, supra) . 5 ' -TATACAGAGCTCCGTAGGAC-3 ' ; y 5 ' -AGTTGTCTGCAGCCACGAAC-3 ' . Los ratones con CDidl mutante y silvestres fueron alojados en una instalación para animales con una barrera libre de patógenos específica, acreditada por la Asociación Estadounidense para la Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio (AAALAC) . Los animales fueron usados entre las 12-16 semanas de edad, al inicio de los experimentos. Ellos fueron alojados en jaulas protegidas con filtros con un ciclo controlado de luz-oscuridad de 12 h, y provistas con alimento para ratón de formula abierta NIH tratada en autoclave y agua ad líbidum. El Comité para el Cuidado y Uso de Animales institucionales aprobó todos los procedimientos. Con cada experimento todos los ratones fueron apareados por edad y sexo . Se subrayó que pueden ser usados otros antecedentes genéticos para crear un ratón mutante CDlt} como el antecedente genético Balb/C.

Ejemplo 2 Irradiación de ratones con UV Se usó un banco de cinco lámparas solares Philips TL-40W/12 (Philips, Holanda) para irradiar los ratones. Esas lámparas emiten un espectro de 270 a 400 nm; 54% de la irradiación estuvo dentro del intervalo de UVB (280-315 nm) del espectro solar, con el 45% estando en la región de la UVA (315-400 nm) y menos del 1% en el intervalo de la UV-C (240-280 nm) . La irradiación de los cinco bulbos dio 10 W/m2, de acuerdo a lo medido por un radiómetro de investigación UVB PMA. El pelo dorsal de los ratones fue removido con pinzas eléctricas y los ratones fueron colocados en una caja de plexiglás separados en compartimientos individuales por divisores de Plexiglás y cubiertas con una tapa de alambre la cual hizo disminuir la dosis incidente en un 14%. Por cada irradiación de UV, la caja fue colocada cada vez en la misma posición bajo las lámparas para compensar la distribución no uniforme de energía a todo lo largo de los bulbos . Los ratones fueron expuestos una vez o dos veces a una dosis incidente de 86 mJ/cm2 de UVB de las cinco lámparas solares Philips TL-40W/12. Los ratones fueron expuestos a una segunda dosis de radiación UVB 96h después de la primeraa exposición. Todos los ratones fueron analizados por signos de daños a la piel 24, 48, 72 y 96 h después de su última exposición a la UVB. Visualmente, se observó una diferencia clara en el grado de daño a la piel entre los ratones silvestres y con CDld alterada después de la irradiación con UVB de sus dorsos afeitados. Aunque se exhibió un daño a la piel grave significativo (quemaduras, lesiones de la piel) por los ratones silvestres irradiados con UV, no se detectaron signos obvios de daño a la piel en ratones con CDld alterada irradiados con UV.

Ejemplo 3 Medición de la apoptosis en la epidermis La muerte celular apoptótica fue detectada usando el sistema de TUNEL Pluorométrico DeadEnd™ (Promega) el cual mide el ADN fragmentado de células apoptóticas incorporando catalíticamente fluores-12-dUTP en los extremos de ADN 3- "OH usando la enzima Terminal Desoxinucleotidil Transferasa (DTD) . La TdT forma una cola polimérica usando el principio del ensayo de TUNEL. Brevemente, se despara inizaron cortes de tejido incluidos en parafina fijados con formalina sobre porta objetos dos veces en xileno fresco durante 5 min. a temperatura ambiente. Ellos fueron lavados en etanol al 100% durante 5 min. y entonces rehidratados secuencialmente sumergiendo los cortes a través de lavados de etanol graduados (100%, 95%, 85%, 70%, 50%) durante 3 minutos. Posteriormente los cortes fueron sumergidos en NaCl a 0.85% durante 5 min., lavados en PBS y entonces fijados en paraformaldehído al 4% durante 15 minutos seguidos por dos lavados en PBS. Después de remover el fluido residual de los cortes con agua de la llave, cada corte de tejido fue cubierto con 20µg/mL de proteinasa K (Sigma) durante 8-10 minutos a temperatura ambiente. Después del tratamiento con proteinasa K que, los cortes de te ido fueron enjuagados en PBS y entonces fijados por inmersión en paraformaldehído al 4% durante 5 min. esto fue seguido por un lavado en PBS, remoción del fluido residual con agua de la llave e incubación de los cortes en amortiguador de equilibrio (Promega) durante 5-10 min. Después del equilibrio, los cortes fueron incubados en una cámara humidificada con la enzima TdT durante 1 h a 37°C. Los cortes fueron humedecidos en un amortiguador de interrupción (SSC; Promega) durante 15 minutos para terminar las reacciones y entonces enjuagar en tres cambios de PBS. Después de enjuagar, los cortes fueron teñidos con solución de yoduro de propidio recién diluida a 1 µg/ml en PBS durante 15 min. en la oscuridad. Ellos fueron entonces lavados 3 veces en agua desionizada durante 5 min. , y posteriormente, el exceso de fluido retirado del área que rodea las células. Los cortes fueron examinados inmediatamente bajo un microscopio de fluorescencia. A las 2, 6, 24, 48, 72 y 96h después de la exposición a la UV (aguda/crónica) se llevo a cabo un ensayo de TUNEL (modificación de protocolo expuesto por Outhit el et., American Journal Pathology

[2000], 156:201-207), de piel tomada de ratones CDid~/_ y silvestres. Los resultados revelaron que las células epidérmicas dentro de la piel de los ratones CDid_/" experimentaron un alto grado de apoptosis en comparación con los ratones silvestres. En contraste, en la piel silvestre las células epidérmicas experimentaron una apoptosis menos significativa.

Ejemplo 4 Medición de la Hiperplasia Epidérmica Se fijaron biopsias de piel dorsal durante la noche en paraformaldehído al 4% y se incluyeron en parafina. Los cortes fueron teñidos con hematoxilina y eosina (H&E) y se observaron por microscopía simple. Después de la exposición a la UVB los ratones Cdxd"/" exhibieron una hiperplasia epidérmica significativamente reducida después del último tratamiento con UVB comparados con los ratones silvestres irradiados con UVB.

Ejemplo 5 Perfilamiento genético Para dilucidar la función de CDlá se ha efectuado un ensayo de perfilamiento genético que compara la expresión del gen de ratón silvestre y con CDid alterada. Se extrajo tejido de piel de 5 ratones silvestres y con CDia alterado individuales y se extrajo por separado con el equipo de Trizol (Invitrogen AG, Basilea, Suiza) y entonces mini equipos Qiagen RNeasy (Basilea Suiza) de acuerdo a las instrucciones del fabricante con tratamiento con DNasa I llamado para retirar cualquier contaminación de ??? genómico. Las muestras de ARN fueron cuantificadas por DO y entonces analizadas vía electroforesis dinámica en gel con el Agilent Byoanalyser para ARNr de 28S y 18S intacto (Todas las relaciones de 28/18 estuvieron entre 1.6 y 2.0) . Se juzgó que las muestras de estudio tenían cantidades suficientes de AR de alta calidad para la hibridación a GeneChips . Como otra medida de control de calidad, antes de la hibridación con Affymetrix GeneChips (Affymetrix, Inc., Santa Clara, CA) , se confirmó que todas las muestras tienen señales fuertes para genes preseleccionados, usando los microcircuitos integrados de prueba Affymetrix (Las relaciones de microcircuitos integrados de prueba 5'/3" fueron de menos de 3.0). Para la piel, 10 µ? de ARN total fueron el material inicial para todas las muestras de ratones individuales . En general , el ARN total fue convertido a ARNc biotinilado, hibridado en el cartucho del arreglo de la sonda Affymetrix, teñido y entonces cuantificado . La síntesis de la primera y segunda hebras de ADNc se efectúo usando un Sistema de elección SuperScript (Invitrogen AG, Basilea, Suiza) , de acuerdo a las instrucciones del fabricante, pero usando un cebador de oligo-dT que contenia un sitio de unión de ARN polimerasa T7. El ARNc marcado fue preparado con el equipo de marcación de Transcript de ARN (Enzo Biochem Inc., NY) . Se usaron CTP y UTP biotinilados junto con NTPs no marcados en la reacción y los nucleótidos no incorporados fueron removidos con columnas de Nucleospin (Macherey-Nagel , Duren, Alemania) . El ADNc (20µ ) fue fragmentado a 94 °C y durante 35 min. en un amortiguador que contenía Tris-acetato 200 mM pH 8.1, KOAc 500 mM, MgOAc 150 mM. Antes de la hibridación, el ARNc fragmentado en mezcla de hibridación (Amortiguador que contenía MES 100 mM, NaCl 1M, EDTA 20mM, Tween 20 al 0.01%, BSA 0.5 ng/µ?, esperma de arenque 0.1 ng/µ? y controles Affymetrix) , fue calentado a 95 °C durante 5 min. , enfriado a 45 °C y cargado sobre un cartucho de arreglo de sonda Affymetrix. El arreglo de la sonda fue incubado durante 16h a 45 °C a rotación constante (60rpm) , entonces expuesto al protocolo de lavado y tinción Affymetrix. Este protocolo incluyó: • un lavado con amortiguador no estricto (6X SSPE, Tween 20 al 0.01%, 0.005% antiespumante) • un lavado con amortiguador estricto (MES 100 mM, NaCl 0.1M, tween 20 al 0.01%) • Primera tinción con conjugado de estreptavidina-ficoeritrina O.Olmg/ml (Sondas Moleculares) en amortiguador con un contenido de MES 100 mM, 1M NaCl, Tween 20 al 0.05%, 4 Mg/ml de BSA. • un lavado con amortiguador no estricto (6X SSPE, Tween 20 al 0.01%, 0,005% antiespumante) • Segunda tinción con 3 pg/ml de anti-estreptavidina biotinilado + 0.2 mg/ml de IgG en un amortiguador que contiene MES lOOmM, NaCl 1M, Tween 20 al 0.05%, 4 mg/ml de BSA. • Tercera tinción con conjugado de estreptavidina-ficoeritrina O.Olmg/ml (Sondas Moleculares) en un amortiguador que contiene MES lOOmM, NaCl 1M, Tween 20 al 0.05%, 4 mg/ml de BSA. • un lavado con amortiguador no estricto (6X SSPE, Tween 20 al 0.01%, 0,005% antiespumante) Se desarrolló un método matemático y se aplicó a los datos de GeneChip sin tratar para la selección de genes regulados de manera diferencial. Este método más allá de establecer un simple corte en el cambio de piel considerando la desviación estándar (SD) en el contexto de la expresión absoluta, o intensidad de la diferencia absoluta (ADI) . El método incluyó los siguientes pasos: (A) el procesamiento de datos por el programa Affymetrix "MAS5" comercialmente disponible (Santa Clara, CA, USA) y rescalamiento, (B) transformación logarítmica de la distribución normal de los datos reinstalados, (C) prueba de análisis de variación (ANOVA) de hipótesis múltiples (una por gen) , (D) la determinación de la media robusta dentro de la SD de la condición (ecuación 1) , dentro de grupos de 200 genes y ordenados por medio de niveles ADI, medio para determinar el límite SD de significancia entre la condición, a saber, la función REGExpress (ecuación 2 de Genome Biology 2001 2(12): preprint0009.1-0009.31) ; y (E) la clasificación posterior de los genes por el valor de p del REGExpress y ANOVA, para ayudar a enfocar el efecto de la importancia. La selección se hace por el valor de p resultante de la prueba de ANOVA de hipótesis múltiples (una por gen) y/o con el valor de p resultante del REGExpress . Los arreglos de sondas fueron explorados a 488 nm usando un láser de Argón-ión (producido por Affymetrix por Agilent) . Las lecturas de exploración cuantitativa fueron exploradas con los Programas y Sistemas de Programación de Análisis de Expresión de Genes Affymetrix. Los descubrimientos se resumen en las tablas I y III más adelante. El incremento ( +) o decremento (-) es estadísticamente significativo en relación al incremento o disminución del doblez de un gen expresado en ratones con CDld alterado en comparación con el mismo gen expresado en ratones silvestres. Se vuelve claramente evidente que el bloqueo de CDld regula los genes que controlan el desarrollo de los folículos del pelo y desregula genes implicados en el desarrollo de inflamaciones y cáncer.

Tabla I Genes que regulan el desarrollo de folículos del pelo Nombre del Incremento/ Peso CDld-/- Función biológica gen disminución medio Media del pliegue mu- +27.0 0.922 4.251 Proteína que se une a cristalino la tiroides que regula el desarrollo de los folículos del pelo Homólogo +2.763 3.810 4.826 Desarrollo de parchado 2 folículos del pelo Tabla II Genes que regulan la inflamación Nombre del Incremento/ Peso CDld-/- Función biológica Asociación gen disminución medio Media con del pliegue Enfermedad Cinasa +1.743 3.630 4.186 Molécula de activada por señalización de TGF beta la p38-MAPCinasa y vías de la proteína Cinasa activadas por Tensión (SAPK) Rel- -0.735 7.350 7.043 Antiapoptótica, Trastornos A (NfKappaB) inducción de inflamacitocinas torios inflamatorias Citocromo -0.738 6.829 6.525 Generación de beta superóxido Inhibidor -0.357 3.906 2.875 Inhibidor de Trastornos del serina proteasa. inflamaactivador de Regula la torios plasminógeno fibrolisis ÍPAI-I) Tabla II (continuación) Nombre del Incremento/ Peso CDld-/- Función biológica Asociación gen disminución medio Media con del pliegue Enfermedad MRP1 -0.202 3.943 2.344 Protelna Respuestas reguladora inflamatodependiente de rias agudas Ca++ en y crónicas respuestas como por inflamatorias ej emplo Psoriasis Proteasa de -0.661 6.427 6.014 Proteólisis y Inflamación mastocitos peptidolisis . P-Selectina -0.685 6.439 6.060 Adhesión celular inflamación TFII-1 +1.373 5.707 6.024 Factor de transcripción que regula la actividad de c- Fos Interleucina -0.268 1.882 0.565 Citocina: inflamación -6 multifuncional Tabla III Genes que regulan el crecimiento/desarrollo del cáncer: Nombre del Incremento/ Peso CDld-/- Función Asociación gen disminución medio Media biológica con del pliegue Enfermedad v-Rel -0.735 7.350 7.043 TransformaCáncer (NfKappaB) ciones oncogénicas de células Inhibidor -0.357 3.906 2.875 Inhibidor de Tumores activador de serina metastáticos plasminógeno proteasa (PAI-1) P-Selectina -0.685 6.439 6.060 Adherencia Facilita la metástasis tumoral Catepsina S -0.697 7.545 7.184 Cisteina Enfermedad proteasa maligna Proliferina -0.234 1.870 0.419 Regula la Fibrosarcomas angiogénesis de ratón Interleucina-6 -0.268 1.882 0.565 Secretada por carcinomas de células básales y melanomas malignos Tabla III (continuación) Ejemplo 6 Evaluación de la respuesta inflamatoria inducida por una sola administración tópica de ???. Se disolvió forbol-12-miristato-13-acetato (TPA) proporcionado por Sigma Aldrich (L'Isle d'Abeau Chesnes BP701, 38297 Saint Quentin Fallavier, Francia) en acetona a una dosis de 0.01% (P/V) y se aplicaron 20 µ? de la solución tópicamente sobre la cara interna de la oreja derecha de ratones CDid_ " o ratones silvestres para inducir una respuesta inflamatoria aguda. Los animales se mantuvieron en jaulas individuales con una dieta de croquetas estándar en una sala de animales con un ciclo de luz-oscuridad de 12 horas.

Las instalaciones proporcionaron aire filtrado, temperatura de 22+/-2°C y una humedad relativa del 55 +/-10%. La respuesta inflamatoria se cuantificó a las 6 horas, 24 horas y 48 horas después de la aplicación midiendo el edema de la oreja usando un micrómetro (>>oditest>> proporcionado por roeplin Gmbh, Postfach 1255 D36372 Schlüchlern Alemania) . El edema se calculó como sigue: (edema= espesor de la oreja del grupo tratado-espesor de la oreja del grupo con acetona) . El valor medio del grupo CDld-/" se comparó con el valor medio del grupo silvestre usando la prueba t de Student .

Ejemplo 7 Evaluación de la respuesta inflamatoria inducida por una sola administración tópica de ácido araquidónico. Se disolvió ácido araquidónico (ácido 5-8-11-eicosatetraenoico) proporcionado por Sigma Aldrich (L'Isle d'Abeau Chesnes BP701, 38297 Saint Quentin Fallavier, Francia) en acetona a la concentración de 140 nM y 25 µ? de la solución se aplicaron tópicamente sobre la cara interna de la oreja derecha del ratón CDid_/" o ratones silvestres para inducir una respuesta inflamatoria aguda. Los animales son mantenidos en jaulas individuales con una dieta de croquetas estándar en una sala de animales con un ciclo de luz-oscuridad de 12 horas. Las instalaciones proporcionan un aire filtrado con una temperatura de 22 +/-°C y una humedad relativa de 55+/-10%. La respuesta inflamatoria se cuantificó a las 1 horas, 2 horas y 4 horas después de la aplicación midiendo el edema de la oreja usando un micrómetro (>>oditest>> proporcionado por Kroeplin Gmbh, Postfach 1255 D36372 Schlüchlern Alemania) . El edema se calculó como sigue: (edema= espesor de la oreja del grupo tratado-espesor de la oreja del grupo con acetona) . El valor medio del grupo CDld"/" se comparó con el valor medio del grupo silvestre usando la prueba t de Student .

Ej emplo 8 Evaluación de la reacción de DTH (hipersensibilidad del tipo retrasada) inducida por oxazolona . Oxazolona (4-etoximetilen-2 -fenil -oxazol-5-ona) proporcionada por Sigma Aldrich (L'Isle d'Abeau Chesnes BP701, 38297 Saint Quentin Fallavier, Francia) en acetona a una concentración del 1% (P/V) y se aplicaron 50 µ? de la solución una vez al día durante 4 días sobre la piel abdominal de ratones CD1(i afeitados o ratones silvestres afeitados . 4 días después los animales son desafiados por una sola administración (20 µ?) sobre la cara interna de la oreja derecha con oxazolona disuelta en acetona a una dosis de 0.3%. La respuesta posterior al desafío se cuantificó a las 24 y 48 horas después de la aplicación midiendo el edema de la oreja usando un micrómetro (>>oditest>> proporcionado por roeplin Gmbh, Postfach 1255 D36372 Schlüchlern Alemania) . El edema se calculó como sigue: (edema= espesor de la oreja del grupo tratado-espesor de la oreja del grupo con acetona) . El valor medio del grupo CDa<i~/'~ se comparó con el valor medio del grupo silvestre usando la prueba t de Student .

Ejemplo 9 Evaluación de daños a la piel inducidos por irradiación de UV usando un simulador solar. Se usó un simulador solar (Oriel 81050) equipado con un filtro de UVC para irradiar a los ratones CDia" _ o ratones silvestres. Irradiación: dosis de UVB + UVA a ser precisada Efecto sobre la epidermis: conteos de SBC, medición de la hiperplasia epidérmica Efecto sobre la dermis: Expresión de MMP1 y MMP3 con métodos inmunohistoquímicos Ejemplo 10 Regulación de la trascripción del gen de CDid por irradiación con UV y el papel de la CDid en la regulación de la trascripción del gen de COX-2 y TNF-a inducida por UV RATONES Se obtuvieron ratones sin alterar 129/C57BL/6 y con CDld alterada 129/C57BL/6 sin procrear, machos, libres de patógenos, específicos de L. Van Kaer, Centro Médico de la Universidad de Vanderbilt (Nashville, TN, EUA) . Los animales fueron mantenidos en instalaciones de acuerdo con las regulaciones y estándares Suizos actuales. Ellos fueron alojados en jaulas protegidas con filtros, y la iluminación ambiental fue controlada para proporcionar ciclos de 12 horas de luz/12 horas de oscuridad. Se proporcionó alimento para ratón de fórmula abierta, tratado en autoclave y agua ad libidum. Todos los procedimientos con los animales fueron revisados y aprobados por el Comité para el cuidado y Uso de Animales Institucionales. Dentro de cada experimento todos los ratones fueron apareados por edad y sexo. Los ratones fueron de 16 semanas al inicio de cada experimento . FUENTE DE LUZ UV La fuente de UVB fue un banco de cinco lámparas solares Philips TL-40W/12 (Philips, Holanda) . Esas lámparas emiten un espectro de 270 a 400 nm; 54% de la irradiación estuvo dentro del intervalo de la UVB (280-315 nm) del espectro solar, 45% en la región de la UVA (315-400 nm) y menos del l¾ en el intervalo de la UV-G (240-280 nm) . La irradiación de los cinco bulbos promedió 10 W/m2, de acuerdo a lo medido por un radiómetro de investigación UVB P A. La luz solar simulada (UVA + UVB) fue producida por un simulador solar de UV exon de 1000W (Solar Light Company, PA, EUA) equipado con un filtro de atenuación atmosférica WG-320 (lmm de espesor) , un filtro de* bloqueo de paso de banda visible/infrarrojo (UG-5; espesor de 5 mm) , y un espejo dicroico para reducir aún más la energía visible e inf arroj a .

IRRADIACION DE RATONES CON UV El pelo dorsal de los ratones fue retirado con pinzas eléctricas. Los ratones expuestos a la radiación UVB fueron colocados en una caja de Plexiglass separada en compartimientos individuales por divisores de Plexiglass y cubiertas con una tapa de alambre la cual hizo disminuir la dosis incidente en un 14%. Por cada irradiación con UVB, la caja fue colocada cada vez en la misma posición bajo la lámpara para compensar la distribución no uniforme de energía a todo lo largo de los bulbos. Para que los ratones fueran expuestos a la radiación solar UV (UVA + UVB) los ratones fueron anestesiados para inmovilizarlos antes de ser expuestos al haz del simulador solar. Los ratones fueron expuestos una vez a una dosis incidente de 86,215 ó 430 mj/cm2 UVB de cinco lámparas solares Philips TL-40W/12. Los ratones expuestos a la luz solar (UVA + UVB) fueron expuestos una vez a una dosis incidente de 1680 (1 min) , 16, 800 (10 min) o 33,600 mJ/cm2 (20 min) de radiación solar .

IRRADIACION CON UV DE CULTIVOS CELULARES DE QUERATINOCITOS Los cultivos confluentes de queratinocitos crecidos en placas estériles de 6 pozos (Corning, Holanda) fueron sometidos a una sola dosis (5700 mJ/c ) de irradiación UV solar. El tratamiento fue efectuado sin capas de plástico después de haber removido el medio y reemplazado este con HBSS estéril. Los cultivos control no fueron irradiados. Después de la exposición a la UV, el HBSS fue removido y el medio colocado nuevamente sobre los cultivos. Las células fueron incubadas a 37°C con C02 al 5% a varios puntos en el tiempo después de haber cosechado ARN. INMUNOTINCION DE TEJIDO DE RATON Se fijaron biopsias de piel de ratón silvestre en formalina antes de ser incluidas en parafina. Se hicieron cortes transversales (de 5 µt? de espesor) de tejidos incluida parafina, desparafinizados por calentamiento suave, deshidratados y rehidratados usando el siguiente procedimiento: 2 veces durante 3 min en Xilol, 3 min en Etanol al 100%, 3 min en Etanol al 95%, 3 min en Etanol al 80% y 3 min en PBS IX. También se incluyó piel fresca en Tissue-Tek (4583, Sakura Finetek, Torrance, EUA) y se congeló en nitrógeno líquido. Los cortes fueron entonces rehidratados en PBS IX durante unos cuantos minutos . Los cortes fueron teñidos usando Acm primario 1H1 anti-CDld de ratón y se desarrollaron usando el equipo Histostain-plus para ratón (ZYMED Laboratories Inc., San Francisco, EUA).

EXTRACCION DEL ARN TOTAL DE PIEL 0 LISADOS CELULARES Los cultivos tratados y control de queratinocitos humanos crecidos en placas de 6 pozos fueron colocados sobre hielo y lavados dos veces con PBS IX a 4°C. El lisado celular fue obtenido desprendiendo las células en 350 µ? de amortiguador de lisis RLT (74104, Qiagen AG, Basilea, Suiza) suplementado con 1% de ß-mercaptoetanol y agitándolo en vortex brevemente. Se usaron columnas QIAshredder (79656, Qiagen AG, Basilea, Suiza) para homogeneizar los extractos celulares por centrifugación a 13,000xg durante 2 min. Entonces se preparó ARN total usando equipos AR easy (74104, Qiagen AG, Basilea, Suiza) de acuerdo a los protocolos del fabricante. La contaminación de ADN genómica fue removida con digestión con DNasa en la columna usando el equipo DNasa libre de RNasa (79254, Qiagen AG, Basilea, Suiza) . Las muestras de piel de 1cm x lem fueron cortadas en pequeñas piezas y homogeneizadas en 1 mi de reactivo TRIZOL (15595-026, Invitrogen AG, Basilea, Suiza) usando un omogeneizador de rotor del estator (Polytron, Kinematica, Luzern, Suiza) . El sobrenadante obtenido después de la centrifugación a 12,000xg fue recuperado en un tubo nuevo e incubado durante 5 min a temperatura ambiente . Se agregaron 0.2 mi de cloroformo al tubo, el cual fue vigorosamente agitado durante 15 segundos e incubado a temperatura ambiente durante 2-3 min. Las muestras fueron centrifugadas en 12, 000xg durante 15 min a 4°C. La fase acuosa superior fue transferida a un tubo nuevo y el ARN total precipitado usando 0.5 mi de alcohol isopropílico durante 10 min a temperatura ambiente . El sedimento de ARN obtenido por centrifugación a 12000xg durante 10 min a 4°C fue lavado con 1 mi de EtOH al 75% seguido por centrifugación a 7500xg durante 5 min a 4°C. El sedimento de ARN fue finalmente secado a temperatura ambiente y disuelto en 40 µ? de agua libre de RNasa incubando las mezclas de 10 min a 55-60°C. La posible contaminación con ADN fue removida con digestión de DNasa sobre la columna usando el equipo de RNasa libre de DNasa.

RT-PCR SEMICUANTITATIVA A. trascripción inversa - reacción en cadena de la polimerasa y reacción de PCR Se transcribieron de manera inversa 5 µg de ARN total cebando con oligo-dT para la primera hebra de ADNc usando el Sistema de Síntesis de la Primera Hebra Superscript por RT-PCR (11904-018, Invitrogen AG, Basilea, Suiza) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. La PCR y el ADNc se efectuaron para detectar la expresión específica de un solo gen (una sola PCR) o genes múltiples (PCR para genes múltiples) . Para una sola PCR, se agregaron 48 µ? de mezcla maestra de PCR que contenía 5 µ? de amortiguador de PCR, 3µ1 de MgCl2 25mM, 1 µ? de dNTP lOmM, 0.5 µ? de oligonucleótidos sentido y antisentido 50 µ?, DMSO 3 µ?, 34.5 µ? de agua y 0.5 µ? de ADN polimerasa de Taq 5"?/µ1 a 2 µ? de ADNc. Todos los reactivos fueron comprados de Invitrogen (15558-026 y 18427-013, Basilea, Suiza) . El número de ciclos y la temperatura de recocido aplicada para amplificar las muestras de ADNc fueron específicas para cada gen probado, un ciclo consistió de 30s a 94°C, 30s a x°C y 30s a 72°C, siendo cada amplificación precedida por 2 min a 94 °C y terminada a los tres minutos a 72 °C. Se usó el equipo MP-70211 (Maxim Biotechnologies , San Francisco, EUA) para la PCR para genes múltiples de los genes implicados en la apoptosis e inflamación, de acuerdo a las instrucciones. Antes de usar cada equipo, se determinó la condición para efectuar cebadores hacia atrás y hacia delante múltiples al mismo tiempo para detectar genes múltiples. Las condiciones parta usar el equipo MP-70211 que contenía los cebadores para detectar genes de T F- y COX-2, fueron las siguientes: 96°C durante 1 min y 60°C durante 4 min (2x ciclos) ; 94°C durante 1 min y 60°C durante 2 min (29x ciclos) ; 70°C durante 10 min (lx ciclo) y lavado a 25°C. La secuencia de ADN de los cebadores usados hacia delante y hacia atrás con el equipo de MPCR para detectar genes múltiples bajo un conjunto de condiciones apuntadas y de este modo no descritas en este reporte. Secuencias de Cebadores y Números de Ciclos de Amplificación Humano : Gen Cebador Secuencia (5' -3' ) Temp. de No. de Tamaño del recocido ciclos producto GAPDH sentido AAT CCC ATC ACC ATC TTC CA 52 16 558 antisentido GCT ATC ATA TTT GGC AGG TT CDld sentido GCT CAA CCA GGA CAA GTG GAC GAG 66 27 452 antisentido AGG MC AGC AAG CAC GCC AGG ACT GAPDH sentido TTC ACC ACC ATG GAG AAG GC 60 22 236 antisentido GGC ATG GAC TGT GGT CAT GA CDld.1 sentido ACG TCC TGG CAG ACA GTC CCA GG 60 24 706 antisentido TTA ATG TTG AAA AGA GCG TAC TGG C B. Cuantificación Relativa de los niveles de A Nm La amplificación de los genes fue analizada cargando ??µ? de los productos de la PCR sobre un gel de agua al 3% el cual fue ensayado en un amortiguador de un IXTAE que contenia 2% de Bromuro de Etidio a 150V durante 30 min. Los productos de la PCR fueron visualizados como bandas fluorescentes bajo la luz UV. Los geles fueron explorados usando una cámara Kodak DC 120 y la intensidad de la fluorescencia de las bandas fue cuantificada usando los programas y sistemas de programación Scion Image ß 4.02 Win (Scion Corporation, Maryland, USA) .

Aunque los estudios de proteínas CDld en el sistema murino sugieren una expresión difundida y consecutiva sobre muchos tipos de células hematopoyeticas asi como células epiteliales intestinales, y hepatocitos, no es conocido si esta molécula es expresada por células de piel de ratón normales y/o expuestas a la UV especialmente queratinocitos . Para resolver esta cuestión, la piel de ratón de ratones silvestres no irradiados e irradiados con UVB o fijada en formalina, cortada y teñida usando Acm anti-CDld de ratón (1H1) para detectar la proteína CDld. La detección de la proteína CDld en piel no irradiada normal fue negativo (no se muestran los datos) . Sin embargo, la proteína CDld fue detectada (color marrón) en la epidermis y dermis de la piel de ratón irradiada con UVB (Figura 5) . La tinción se originó en gran medida en las capas más diferenciadas de la piel (estrato granuloso y estrato córneo) el nivel celular se localizó en el citoplasma y la membrana nuclear. De este modo, daño/quemaduras de la piel de ratón inducida por UVB puede ser arreglado directamente a un nivel de los queratinocitos del ratón en lugar de las células presentadoras de antágenos (local o sistémicamente) .

LA TRANSCRIPCION DEL GEN DE CD1D ES REGULADA POR LA RADIACION DE UV Habiendo demostrado que el daño a la piel inducido por UVB es regulado por la CDid y que la proteína CDid es expresada por las células de la epidermis de ratón (queratinocitos) , a continuación fue importante establecer si la expresión de CDld en la piel es regulada por la radiación de UV. Cualquier indicación de que la expresión de CDld sea regulada por la radiación de UV sugerirla que la modulación de los niveles de CDld en la piel son un factor critico responsable para regular el daño inducido a la piel por UVB. Para resolver esta cuestión, el dorso afeitado de ratones silvestres fue expuesto a una sola dosis (86mJ/cm2) de radiación UVB y a varios tiempos después de la radiación (6, 24, 48, 72 y 96h) , la piel irradiada fue escindida, el AR extraído y purificado, y determinados los niveles de ARN de CDid por RT-PCR semi cuantitativa. Como un control, se escindió piel de ratón no irradiada normal y se extrajo el ARN, se purificó y se determinaron los niveles de ARNm de CDld por RT-PCR semicuantitativa . Como se muestra en la figura 6, el nivel de ARNm de CDld en piel de ratón completa disminuyó rápidamente a las 6 h después de que la exposición a la UVB se redujo significativamente 24 h después de la irradiación en comparación con los niveles detectados en piel no irradiada normal. En contraste, 48, 72 y 96 horas después de la exposición a la UVB a los niveles de ARNm de CDld se elevaron por encima de los niveles detectados en piel control no irradiado normal. Para validar mejor nuestros estudios sobre el efecto de la radiación UVB sobre la trascripción del gen de CDld sobre la piel, expusimos el dorso afeitado de ratones silvestres a varias dosis de irradiación UV solar (UVB+UVA) -1680 mJ/cm2 (1 minuto) , 16,800 mJ/cm2 (10 minutos) o 33,600 mJ/cm2 (20 minutos) de UV solar. A las 6 y 72 h después de la radiación la piel irradiada fue escindida, el ARN extraído y purificado, y los niveles de ARNm de CDld determinados por RT-PCR semicuantitativa (Figura 7) . Como con la exposición a la UVB observamos una disminución e incremento similar en los niveles de ARNm de CDld a las 6 y 72 h después de la irradiación de UV solar, respectivamente, sin importar las dosis de UV, sugiriendo que la respuesta de la trascripción del gen de CDld en la piel a la radiación UV es sumamente importante a la respuesta de la piel a los efectos dañinos de la exposición a la UV.

TRANSCRIPCION DEL GEN DE CD1D DE LOS QUE ATINOCITOS HUMANOS ES REGULADA POR LA RADIACION DE UV SOLAR En un intento por resolver si la trascripción del gen de CDld humano es regulada por la radiación UV investigamos si los queratinocitos humanos cultivados exhiben un perfil cinético de trascripción de gen similar en respuesta a la radiación UV. A diferentes puntos en el tiempo después de la exposición de cultivos de queratinocitos DK7 por triplicado a una sola dosis de radiación UV solar debe 5700mJ/cm2 , las células fueron cosechadas para el ARN y el RT-PCR semicuantitativa efectuada para determinar el nivel relativo de ARNm de CDid (Figura 8) . De acuerdo a lo observado con piel de ratón irradiada con UVB (UVB solar) los niveles de ARNm de CDld disminuyeron a 6 h después de la irradiación en comparación con los controles no irradiados normales. El análisis de los niveles de ARNm de CDld 10 h después de la irradiación revelaron que esos niveles tuvieron una disminución adicional en comparación con los niveles detectados en cultivos celulares no irradiados normales. Entre 16 y 48 h después de la exposición al UV, los niveles de ARNm de CDld se incrementaron proporcionalmente; también se observó un patrón en la piel de piel silvestre completa irradiada con UV sugiriendo que la trascripción del gen de CDXd inducida por UV en piel de ratón fue probablemente regulada al nivel de los queratinocitos . La trascripción del gen de CDld en queratinocitos humanos responde a la radiación de UV y parece ser regulada en una forma similar a la CDid de la piel de ratón implicando que a) la CDld de la piel juega un papel crítico en la regulación de las respuestas de la piel a la radiación UV y b) la modulación de los niveles de CDld en la piel es un factor critico responsable de la regulación de la inflamación/daño a la piel inducido por UV.

LA TRANSCRIPCION GENETICA DE GENES CLAVE QUE REGULAN LA INFLAMACION DE LA PIEL DISMINUYE EN PIEL DE RATON CON CD1D ALTERADA E IRRADIADA CON UVB Para validar aún más la CDld como una molécula critica responsable de la regulación de la inflamación/daño a la piel inducido por UVB investigamos a continuación si la trascripción del gen de COX-2 y TNF-a (genes clave responsables de regular la inflamación/daño a la piel inducida por UVB) es desregulada en piel de ratón con CDld alterado irradiados con UVB. Se encontró que los niveles de ARN de COX-2 y TNF-a con CDld alterada fueron divididos a las 48 y 72 horas después de la irradiación con UV (Figura 9) . Puesto que el daño/inflamación de la piel inducida por UV en ratones silvestres fue observada a las 48 y 72 h después de la exposición a la UV, estos datos demuestran que la inflamación/daño a la piel inducido por UVB media a la CDld de la piel induciendo la trascripción del gen de Ejemplo 11 La síntesis de citocinas inflamatorias impide irradiadas con UV de ratones con CDld alterada disminuye en comparación con los ratones de control silvestres.

Radiación de ratones con UV Los ratones fueron expuestos una vez a una dosis incidente de 200 mJ/cm2 de radiación UVB. En la siembra de 3 meses de edad de ratones 129/C57BL/6WT y 129/C57BL/6 CDld KO estuvieron implicadas en este estudio (n=4) .

Cuantificación de Citocina . Se cosecharon biopsias de piel de 8 mm a las Oh, 24h, 48h, 72h, 96h y 168h después de la irradiación y se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido. Se cuantificaron IL-6 y MlPl-alpha en homogeneizados de piel usando métodos de ELISA clásicos. En ratones WT de la radiación con ratones UV-B induce un alta regulación de la síntesis de citocinas inflamatorias, 48 h después de la irradiación, mientras que en ratones con CDld de KO la síntesis y proteína IL-6 y MlPl-alpha se reduce significativamente. Esto demuestra un papel mayor para la CDld en inflamación cutánea por UVB. Ejemplo 12 La hidrocortisona desregula la trascripción del gen de CDid inducida por esfuerzo químico. Se hicieron crecer queratinocitos primarios humanos en KGM completo antes de ser expuestos a 300 µ? de H202 como factor de tensión. 48 horas después de la siembre, el medio KGM fue reemplazado por KGM sin hidrocortisona y los cultivos fueron tratados con 300 µp? de H202. El AR total fue extraído en un tiempo diferente después del tratamiento y el ARNm de CDid cuantificado por PCR en Tiempo Real . Para los Ensayos de Taq Man, Applied Biosystems recomienda usar de 10 a 100 ng de cantidad de ARN inicial por pozo. En consecuencia, la síntesis de la primera hebra de ADN fue efectuada en un volumen de 20 µ? usando 1 µ de ARNc total y 150 µg de hexámeros aleatorios siguiendo las recomendaciones del fabricante (Sistema de Síntesis de la Primera Hebra SuperscriptMR par el RT-PCR, 11904-018, Invitrogen) . Se usó 1 µ? de muestras de ADNc resultante para la amplificación por PCR en Tiempo Real. Los conjuntos de cebadores y sondas usados para la detección de ADNc de CDld fueron proporcionados por Applied Biosystems como Ensayos sobre Pedido (respectivamente Hs00174321_ml y Hs00166289_ml) . Los cebadores y sondas para el depósito del gen inicial GAPDH fueron proporcionados como PDARS (4310884E, Applied Biosystems) . Todas las muestras de ADNc fueron probadas por triplicado. Las mezclas de reacción de PCR fueron preparadas sobre hielo en tubos de microcentrífuga . Para una réplica, se produjo una premezcla de 24 µ? usando 1.25 µ? de 20X de mezcla de Objetivo o Control, 10.25 µ? de agua y 12.5 µ? de 2X TaqMan Universal Master Mix, y se agregó a 1 µ? de ADNc . Las mezclas de reacción de PCR fueron centrifugadas suave y rápidamente antes de ser divididas en alícuotas a razón de 25 µ? por pozo de una placa de 96 pozos. La placa fue sellada, centrifugada a 2000 rpm durante 30 segundos y colocada en un Sistema de Detección de Secuencia 5700 para el ciclo térmico y análisis de fluorescencia usando el siguiente programa de PCR: - 2 min a 50°C -10 min a 95°C - 40 ciclos de 15 seg a 95°C y 1 min a 60°C. ¦ Los resultados fueron analizados usando los programas y sistemas de programación GeneAmp® 5700 SDS . Se obtuvieron gráficas de amplificación que muestran la amplificación del ADNc de interés en función del número de ciclos . Los cambios en el doblez de la expresión de gen obtenidos en la condición de prueba en comparación con la condición control fueron determinados por el método Ct comparativo usando la siguiente fórmula: Cambios de doblez = 2-AAct=2-(Act "^-?" control) Como se muestra en la Figura 11, la modulación de la expresión del gen CDid es observada con el tiempo cuando las células son expuestas a ¾02. En presencia de Hidrocortisona, el patrón de expresión del gen CDid obtenido después del desafio H202 difirió en esa trascripción de CDid suprimiendo la hidrocortisona. De ese modo, la Hidrocortisona es capaz de desregular la expresión de CDld en células sometidas a tensión .

Ejemplo 13 Los niveles de fosfolipido son desregulados en la piel y el intestino de ratones con CDid alterado en comparación con la piel natural. Ratones: Ratones hembra de la misma raza C57BL/6 CDld-/- y C57BL/6 silvestres con una edad promedio de 5 meses fueron sacrificados y los tejidos respectivos extirpados. Las piezas de tejido cutáneo/intestinal de cada ratón fueron congeladas rápidamente usando nitrógeno liquido. Ellas fueron entonces analizadas para determinar el contenido de lipido. La familia principal de lipidos regulados por CDid en la piel fueron fosfolipidos .

*Los valores son desde el punto de vista estadístico significativamente diferentes del control silvestre [p<0.05) .

Esfingomielina Esta es un componente ubiquitoso de las membranas de células de animales, donde es por mucho el esfingolípido más abundante. En realidad, puede comprender hasta el 50% de los lipidos en ciertos tejidos, aunque usualmente es menos abundante que la fosfatidilcolina . Por ejemplo, constituye aproximadamente el 10% de los lipidos del cerebro. Esta es el único lípido más abundante en los eritrocitos de la mayoría de los animales rumiantes, donde reemplaza a la fosfatidilcolina totalmente. En este caso, se sabe que existe una fosfolipasa A altamente activa que degrada los glicerofosfolípidos , pero no la esfingomielina . Al igual que la fosfatidilcolina, la esfingomielina tiende a ser más abundante en la membrana plasmática, y especialmente en la capa externa de las células. Ahora, se sabe que la esfingomielina (y otros esfingolípidos) y colesterol pueden localizarse juntos en subdominios específicos ("montones" o estructuras relacionadas llamadas "caveolas") de membranas. Puesto que los esfingolípidos contienen cadenas de acilo largas, muy saturadas, se empaquetan más fuertemente juntas, dando de este modo a los esfingolípidos temperaturas de fusión mucho más altas que los glicerofosfolípidos de la membrana. Este fuerte empaquetamiento de las cadenas de acilo es esencial para la organización de los montones de lípidos, puesto que se cree que la facilidad de empaquetamiento diferencial de esfingolípidos y fosfolípidos conduce a separación de fases en la membrana, dando lugar a montones ricos en esfingolípidos (fase "líquido ordenada") rodeados por dominios ricos en glicerofosfolípidos (fase "líquido desordenada") . Se cree que las interacciones entre las proteínas celulares específicas y los lípidos en esos montones son importantes en los mecanismos de señalización que implican un papel importante de la esfingomielina en la regulación de la regulación celular.

La esfingomielina es un lipido clave en los procesos de transducción de señales implicados en la apoptosis La esfingomielina también sirve como un precursor para ceramidas, bases de c :adena larga y esfingosin-1-fosfato, como parte del Mciclo de la esfingomielina", y muchos otros esfingolipidos importantes, (véase la figura más adelante) . Algunos de esos tienen funciones como mensajeros intracelulares , y otros son constituyentes esenciales de la membrana.

Esfingomielina Galactosilceramida Glucosilceramida Ceramlda Esfingosina Esfingosin-1 -fosfato (sobrerregula la transcripción del gen de CD1d).

Lisofosfatidilcolina - un fosofolípido que es proinflamatorio - elevado en lesión de psoriasis - la inyección intracutánea induce inflamación de la piel - formada por la acción de la fosfolipasa A21a cual es el paso limitante de la velocidad en la producción de ácido aracadónico. (enlace con la regulación de COX-2 por CDld) . Para el intestino grueso se obtuvieron los siguientes resultados: Intestino Grueso nMoles por gramo de Te ido Clase de Saturación Familia de ácido CDld-/-* Silvestre lípido graso Cardiolipina Saturada Acido Esteárico 405+89 950±442 Total 405 950 Insaturada Acido Vaccénico 74+21 167+45 Acido Oleico 216±42 377 86 Acido oc 23+9 43+9 Linolénico DHA 164+92 5961278 Intestino Grueso nMoles por gramo de Tejido Clase de Saturación Familia de ácido CDld-/-* Silvestre lipido graso Acido Linoléico 781+210 2066+727 DGLA 36±12 60±16 Total 1294 3309 Cardiolipina 1699 4259 total Lisofosfati- Saturada Acido Miristico 78±41 27+5 dilcolina Acido Araquidico 7±3 3±0.5 Total 85 30 Insaturada Acido Eicosenóico 9±5 3+2 Acido Erúcico 234±143 17±36 Acido 153±98 30±61 Eicosadienóico DGLA 11±5 4+1 Acido 12±8 2±3 Docosadienoico Total 419 56 Intestino Grueso nMoles por gramo de Tej ido Clase de Saturación Familia de ácido CDld-/-* Silvestre lipido graso Lisofosfatidilcolina total 504 86 Acidos Saturada Acido 31+10 17+5 grasos Pentadecanoico Libres Total 31 17 Insaturada Acido Nervónico 9+5 2+4 Total 9 2 Acidos Grasos Libres Totales 40 19 Ester de Insaturada Acido 5±3 1±3 colesterol Eicosapentaenoico Acido 9±27 13±8 Palmitelaidico Total 54 14 Díglicérido Insaturada Acido Eicosenoico 11±8 33±16 Total 11 33 Fosfatidil- Insaturada Acido Linoléico 2551+2321 6398+2862 colina Total 2551 6398 Fosfatidilse Insaturada Acido Linoléico 501+105 1102±338 riña Total 501 1102 *Todos los valores fueron significativamente iferentes desde el punto de vista estadístico de grupos ilvestres (p<0.05).

Para el intestino delgado se obtuvieron los iguientes resultados : Intestino grueso nMoles por gramo de Tej ido Clase de Saturación Familia de ácido CDld-/-* Silvestre lípido graso Cardiolipina Insaturada Acido eicosenóico 12+7 21±3 DHA 1781124 4801121 Total 190 501 Fosfatidil Saturada Acido Behénico 13+10 27+10 colina Total 13 27 Insaturada Acido de Mead 7±4 15±4 Acido 2±3 7±3 Eicosatetraenoico DGLA 154196 310+115 Acido 5+4 10+3 Docosadienoico Total 168 342 Fosfatidilcolina Total 181 369 *Todos los valores fueron significativamente diferentes desde el punto de vista estadístico de grupos silvestres (p<0.05) . Estos datos anteriores soportan el papel de CDid en la regulación del metabolismo de fosfolípidos que controla los procesos inflamatorios.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Una sustancia capaz de bloquear o modificar la función de CDid endógena, seleccionada del grupo que consiste de, un poli nucleótido antisentido a una secuencia comprendida por el gen de CDld y/o el ARNm de CDid; un polinucléotido antisentido a una secuencia comprendida por el gen de la glucosilceramida sintasa y/o el ARNm de la glucosilceramida sintasa; un poli nucleótido sentido a la secuencia comprendida por el gen de la esfingomielinasa o la ceramida sintasa y/o el ARNm de la esfingomielinasa o ceramida sintasa; un polipéptido o péptido, el cual no es un anticuerpo, que se une a CDid y que bloquea o modifica esencialmente la función de CDid; y un lípido, el cual es un esterol, ácido graso, glicérido o fosfato de fosfatidilinositol . 2. La sustancia según la reivindicación 1, la cual es un compuesto que reduce la trascripción y/o traducción del gen de CDid. 3. La sustancia según la reivindicación 1 y 2, la cual se deriva de plantas, microbios o animales o ingredientes de té verde o carotenoide. 4. La sustancia según la reivindicación 1, la cual es un ligando de un receptor perteneciente a la superfamilia de TNF, en particular CD95/APO-l/Fas . 5. La sustancia según cualquiera de las reivindicaciones precedentes para la preparación de un vehículo para la prevención y/o tratamiento de los efectos dañinos de la tensión o esfuerzo a células epiteliales y/o pérdida del pelo. 6. Una composición, caracterizada porque contiene al menos una sustancia según cualquiera de las reivindicaciones precedentes. 7. La composición según la reivindicación 6, la cual es una composición alimenticia, una composición cosmética o una composición farmacéutica. 8. La composición según la reivindicación 7, la cual es leche, yogurt, requesón, queso, leches fermentadas, productos basados en leches fermentadas, helados, polvos a base de leche, fórmulas infantiles, productos de cereal, productos basados en cereal fermentado, agua mineral, chocolate o alimento para mascotas, o lociones, champús, cremas, protectores solares, cremas para después de asolearse, cremas antienvejecimiento y/o ungüentos o tabletas, líquidos, suplementos orales secos, suplementos orales húmedos, alimentación por tubo seco o alimentación por tubo húmedo o un fármaco anticáncer. 9. El uso de una sustancia según las reivindicaciones 1 a 5 o una composición según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8 para la prevención y/o tratamiento de daños en tejidos epiteliales producidos por una situación de tensión y/o para la prevención y/o tratamiento de la pérdida del pelo. 10. El uso de una sustancia o de una composición según la reivindicación 9 para prevenir y/o el tratamiento de daños en tejidos epiteliales para una situación de tensión, donde el lípido es un fitoquímico, especialmente un polifenol natural o sintético, una ginkgolida o vitamina . 11. El uso según la reivindicación 9, donde la situación de tensión es una tensión química, una tensión biológica o una tensión física. 12. El uso según las reivindicaciones 11, donde la tensión química es ejercida por la exposición a oxidantes o carcinógenos, o donde la tensión biológica es ejercida por la exposición a bacterias, virus, hongos, lípidos derivados de células circundantes y/o microbios, o donde la tensión física es ejercida por exposición a la irradiación UV. 13. El uso según una de las reivindicaciones 9 a 12, donde el daño es la quemadura y/o ampulación de la piel, formación de cataratas, hiperplasia epidérmica, cáncer, inflamación, supresión inmune, envejecimiento de la piel . 14. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, donde las células epiteliales son derivadas de la piel, intestino, ojo, pulmón, próstata, hígado, mama, riñon y/o el útero. 15. El uso según la reivindicación 14, donde el cáncer es cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de próstata, cáncer de hígado, cáncer pancreático, cáncer de riñon, cánceres de piel no melamínicos o melamínicos . 16. El método para identificar sustancias que bloquean o modifican al CDld el cual comprende los pasos de: (a) exponer células epiteliales a una sustancia de interés, (b) someter las células epiteliales a una situación de tensión, (c) determinar el efecto de la tensión a las células epiteliales seleccionando uno o más de los siguientes ensayos: (i) hiperplasia epitelial (H&E) , (ii) proliferación epitelial (BrUd, PCNA) , (iii) apoptosis epitelial, (iv) acumulación de mutación de p53, (v) evaluación cuantitativa y cualitativa de lípidos epiteliales, (vi) patrones de coagrupamiento de receptores de la superficie celular apoptóticos y no apoptóticos, (vii) producción de citocinas proinflamatorias , (viii) producción de citocinas inmuno moduladoras, (ix) marcadores de la inflamación, (x) factor de trascripción anti apoptótica, (xi) marcadores del envejecimiento, (d) comparación de los resultados por un control. 17. El método según la reivindicación 16, donde la situación de tensión es una tensión química, una tensión biológica o una tensión física. 18. El método según la reivindicación 17, donde la tensión química es ejercida por una exposición a oxidantes o carcinógenos, o donde la tensión biológica es ejercida por la exposición a bacterias, virus, hongos, lípidos derivados de células circundantes y/o microbios, o donde la tensión física es ejercida tras la exposición a irradiación UV. 19. El método según las reivindicaciones 16 a 18, donde las citocinas proinflamatorias son seleccionadas del grupo que consiste de IL-1, TNF-cc, PGE-2, IL-6-, IFN-? o IL-8. 20. El método según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, donde las citocinas inmunomoduladoras son seleccionadas del grupo que consiste de PAF, IL-10, IL-4 o TGD-ß . 21. El método según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, donde los lípidos son seleccionados del grupo que consiste de fosfolípidos , esfingolípidos y glicoesfingolípidos . 22. El método según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, donde los marcadores de la inflamación incluyen Cox-2 e iNos . 23. El método según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, donde los factores de trascripción antiapoptóticos incluyen AP-1 y NfkappaB. 2 . El método según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, donde los marcadores del envejecimiento incluyen elastasas, colagenasas, metaloproteinasas , gelatinasas, estromelisinas , telomerasas . 25. El uso de una sustancia según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o una composición según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8 para hacer disminuir la resistencia de los cánceres a fármacos múltiples . 25. El uso según la reivindicación 25, donde el cáncer es cáncer de piel, intestino o mama. 27. El uso de células que expresan y/o sobreexpresan CDm en un ensayo para seleccionar sustancias que modifiquen y/o bloqueen la función de CDia- 28. El uso de animales CDld_ ~ como un modelo de prueba para determinar la actividad de sustancias que tienen influencia sobre los daños en tejidos epiteliales producidos por una situación de tensión y/o pérdida de pelo . 29. EL uso de una sustancia según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en terapia genética.