MXPA04012062A

MXPA04012062A - Proceso para producir carotenoides.

Info

Publication number: MXPA04012062A
Application number: MXPA04012062A
Authority: MX
Inventors: Masuda Setsuko
Original assignee: Dsm Ip Assets Bv
Priority date: 2002-06-21
Filing date: 2003-04-10
Publication date: 2005-03-07
Also published as: US20050260700A1; JP4486883B2; CN1662658A; US7687246B2; CA2487144C; EP1516060A1; CN1304593C; WO2004001057A1; CA2487144A1; NO20050331L; AU2003226798A1; JP2005529619A; NO334735B1

Abstract

La presente invencion se refiere a un proceso biologico para producir carotenoides utilizando un microorganismo que sea capaz de producir carotenoides y que pertenecen al genero Xanthophyllomyces (Phaffia) en presencia de un inhibidor par la biosintesis de esteroles de pirofosfato de farnesilo.

Description

PROCESO PARA PRODUCIR CAROTENOIDES DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un proceso biológico para producir carotenoides utilizando un microorganismo que es capaz de producir carotenoides y que pertenecen al género Xanthophyllomyces (Phaffia) en presencia de un inhibidor para la biosíntesis de esteróles de pirofosfato de famesilo (de aquí en adelante referido como FPP) . Se ha descrito más de 600 diferentes carotenoides a partir de organismos carotenogénicos encontrados entre bacterias, levaduras, hongos y plantas. Actualmente sólo dos de ellos, beta-caroteno y astaxantina son producidos comercialmente en microorganismos y empleados en los alimentos y en la industria alimenticia. Estos carotenoides son industrialmente importantes como pigmentos naturales y como substancias funcionales para la salud humana con sus propiedades antioxidantes potentes. Además, a partir de un prospecto comercial, existe una demanda incrementada de astaxantina como un reactivo colorante especialmente en la industria de la crianza de peces, tal como crianza de salmón, debido a que la astaxantina imparte una coloración característica de color naranja/rojo al pescado lo que atrae la atención del consumidor. otros carotenoides, por ejemplo, licopeno, zeaxantina, REF: 160252 cantaxantina, y beta-criptoxantina, también son industrialícente importantes como pigmentos naturales y como antioxidantes. El licopeno es mostrado en experimentos realizados in vitro para enfriar eficientemente oxígeno en su estado más simple. El licopeno inhibe la peroxidación de lípidos, y los niveles de suero de este carotenoide se relaciona inversamente con el riesgo de cáncer en el páncreas y cérvix. El color rojo de frutas y vegetales tal como tomates, toronjas de color rosado, la cáscara de uvas rojas, sandía y guayabas rosadas es debido al licopeno. Otras fuentes de dietas incluyen la papaya y los chabacanos. La zeaxantina es un carotenoide de color amarillo, que es un derivado hidroxi oxidado de beta-caroteno. La zeaxantina es abundante en la espinaca y en el cereal y en muchas otras especies de plantas. Esto es un antioxidante fuerte y se encuentra también en la retina. Se cree ampliamente que la zeaxantina actúa como filtro y protector del ojo de la luz azul dañina y que protege contra la degeneración macular relacionada con la edad. La cantaxantina es un carotenoide de color rojo, que se encuentra en muchas plantas y animales. Se utiliza para la pigmentación de yemas de huevo, aves para asar, y truchas criadas, y se utiliza en alimentos y cosméticos que requieren un color más naranja-rojo. La cantaxantina también funciona como un extintor de oxígeno en su estado más simple y como un desactivador de radicales libres. La beta-criptoxantina es un carotenoide de color amarillo que se encuentra en las naranjas, mangos, papayas, calabazas y muchos otros frutos. La beta-criptoxantina es reconocida también como un antioxidante fuerte útil para la prevención de cáncer. Entre los microorganismos que son capaces de producir cantidades notables de carotenoides, Phaffia rhodozyma es una de las especies carotenogénicas muy bien conocidas. Esta clase de levadura produce astaxantina y es uno de los pocos microorganismos que son actualmente utilizados para proporcionar astaxantina en los alimentos y en la industria alimenticia. En un estudio taxonómico reciente, se reveló un ciclo sexual de Phaffia rhodozyma y su estado telemórfico se diseño bajo el nombre de Xanthphyllomyces dendrorhous [Golubev, Yeast 11:101-110 (1995)]. En la presente descripción, se utilizó el nombre ampliamente reconocido, Phaffia rhodozyma. Se han conducido diversos estudios para incrementar el nivel de producción de carotenoides mediante microorganismos incluyendo, por ejemplo, construcción de microorganismos recombinantes que fueron realizados genéticamente para obtener la capacidad de producir una cantidad notable de diversos carotenoides utilizando especies de huéspedes apropiados tales como Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae o Candida utilis [Misawa et al., J. Bacteriol. 172:6704 (1990); Yamano et al., Biosci. Biotech. Biochem. 58:1112 (1994); Miura et al., Biotechnol. Bioeng. 58:306 (1998)], mejoramiento de la especie para obtener hiper-productores , por ejemplo, de astaxantina a partir de Phaffia rhodozyma (Johnson et al., Critical Reviews in Biotechnology 11:297-326 (1991]), y mejoramiento del proceso para optimizar el proceso de fermentación, por ejemplo, de producción de astaxantina mediante Phaffia rhodozyma (US 5,972,642). Se describió en la US 5,356,809 que la adición de antimicina u otro inhibidor de la cadena respiratoria principal a células Phaffia rhodozyma se intensifica la producción de astaxantina. Pero esto no es un método muy eficiente o conveniente. Evidentemente, existe todavía una necesidad de un método simple e eficiente para aumentar los rendimientos de producción de carotenoides . Una modalidad de la presente invención es un proceso biológico para producir carotenoides que comprende cultivar un microorganismo que sea capaz de producir carotenoides en presencia de un inhibidor para la biosíntesis de esteróles de FPP, en un medio acuoso nutriente bajo condiciones aeróbicas. Es más preferible utilizar microorganismos altamente carotenogénicos, por ejemplo, aquellos que pertenecen al género Xanthophyllomyces (Phaffia) . De esta forma, un ejemplo preferible de los microorganismos de la presente invención es un microorganismo que pertenece al género Xanthophyllomyces (Phaffia) . Una especie preferible de Xanthophyllomyces (Phaffia) de la presente invención puede obtenerse a partir de la American Type Culture Collection, 10801 University Blvd. , Manassas, VA 20110-2209, U.S.A. como Xanthophyllomyces (Phaffia) ATCC96594 (re-depositados bajo el No. de acceso ATCC 74438 el 8 de Abril de 1998 de acuerdo con el Tratado de Budapest) . La presente invención se relaciona particularmente con un proceso biológico para producir carotenoides que comprende cultivar un microorganismos que sea capaz de producir carotenoides y que pertenecen al género Xanthophyllomyces (Phaffia) en presencia de un inhibidor para la biosíntesis de esteróles de FPP, y un substrato para producir carotenoides en un medio acuoso nutriente bajo condiciones aerobicas, y aislar los carotenoides resultantes de las células del microorganismo o del caldo cultivado. Especialmente, será más preferible, para el proceso biológico de la presente invención, inhibir la primera reacción del trayecto del esterol, que se cataliza por escualeno sintasa. Los inhibidores de escualeno sintasa (también referidos en la técnica como escualeno sintetasa) son reportados como niveles inferiores de esterol celular. La escualeno sintasa es una enzima que cataliza la primera etapa registrada de biosíntesis de esterol. Dos moléculas de FPP son condensadas para formar escualeno. De esta forma, una modalidad adicional de la presente invención es un proceso biológico para producir carotenoides que comprenden cultivar un microorganismo que sea capaz de producir carotenoides en presencia de un inhibidor de escualeno sintasa. Se han reportado diversas clases de inhibidores de escualeno sintasa [Biller et al., Current Pharmaceutical Design 2:1-40 (1996)]. Se han reportado aproximadamente tres grupos de inhibidores de escualeno sintasa, inhibidores de escualeno sintasa basados en ión de amonio, FPP miméticos que contienen fósforo, e inhibidores basados en carboxilato. Son preferibles cualesquiera clases de inhibidores de escualeno sintasa de la presente invención. Uno de los ejemplos preferibles de tales inhibidores de escualeno sintasa es un inhibidor de escualeno sintasa basado en ión de amonio. Además, uno de los ejemplos preferibles del inhibidor de escualeno sintasa basado en ión de amonio es un inhibidor de escualeno sintasa tipo fenoxipropilamina [Bro n et al., Journal of Medicinal Chemistry 38:4157-4160 (1995)]. Se ha conocido un gran número de inhibidores de escualeno sintasa tipo fenoxipropilamina incluyendo, por ejemplo, [3- (3-alil-bifenil-4-iloxi) -propil] isopropil-amina, N-isopropil-3- (4-acetamido-2-alilfenoxi)propilamina, N-metil-N-isopropil-3- (4-acetamida-2-alilfenoxi) propilamina, N-ciclopentil-3- (4-acetamida-2-alil-fenoxi)propilamina, N-ciclobutil-3 - (4-acetamida-2-alilfenoxi) -propilamina, N-isopropil-3- (2-alil-4- butiraraidofenoxi) ropil-amina, N-isopropil-3- (4-acetamido-2-clorofenoxi) ropilamina, N-isopropil-3- (4-acetamido-2-propilfenoxi) propilamina, y N-isopropil-3- (4-acetamido-2-alilfenoxi) -1-metilpropilamina, o sus sales biológicamente aceptables (Brown et al., supra) . El inhibidor de escualeno sintasa preferible utilizado en los presentes Ejemplos es [3- (3-alil-bifenil-4-iloxi) -propil] -isopropil-amina, N-isopropil-3- (4-acetamido-2-alilfenoxi) propilamina y N-metil-N-isopropil-3- (4-acetamida-2-alilfenoxi) propilamina . Los carotenoides son normalmente producidos al cultivar un microorganismo carotenogénico en un medio que comprende macro- y micro-nutrientes adecuados para las células, tales como molasas, sacarosa o glucosa como una fuente de carbohidratos para el desarrollo celular y también como un substrato para producir carotenoides, y fuentes de nitrógeno tales como licor de maíz macerado, extracto de levadura, sulfato de diamonio, fosfato de amonio, hidróxido de amonio o urea, fuentes de fósforo tales como fosfato de amonio y ácido fosfórico y micro-nutrientes o sales minerales agregados tales como sulfato de magnesio, sulfato de zinc y biotina o destiobiotina . Las condiciones preferibles para la cultivación son un intervalo de pH de 4 a 8 y un intervalo de temperatura de 15 a 26°C durante 24 a 500 horas. Las condiciones más preferibles para la cultivación son un intervalo de pH de 5 a 7 y un intervalo de temperatura de 18 a 22°C durante 48 a 350 horas.

En la cultivación, aeración y agitación normalmente se dan resultados favorables para la producción de carotenoides. En la presente invención, se agrega al medio el inhibidor para la biosíntesis de esterol de FPP. Adecuadamente, la concentración del inhibidor es variado en base a las especies del inhibidor y microorganismo utilizados para la producción de carotenoides, por ejemplo en un intervalo de concentración que da menos del 50% de reducción del crecimiento celular en las condiciones que producen carotenoides. Una concentración más preferible del inhibidor puede estar en el intervalo de concentración que da menos del 30% de reducción del desarrollo celular. En la presente invención, puede agregarse el inhibidor para la biosíntesis de esterol de FPP al medio en cualquier período de la cultivación. Los carotenoides producidos al cultivar un microorganismo carotenogénico utilizando métodos de la presente invención, pueden aislarse ya sea del medio, en el caso de que sean secretado en el medio, o de las células del microorganismo y, si es necesario, separarse de otros carotenoides que pueden estar presentes en caso de ser deseado un carotenoide específico, por métodos conocidos en la técnica [por ejemplo, Carotenoides Vol . IA: Aislamiento y Análisis (Carotenoids Vol IA: Isolation and Analysis) , Britton et al. , Birkh user Verlag, Basel (1995)] . Pueden utilizarse carotenoides producidos de acuerdo con la presente invención en un proceso para la preparación de alimentos o productos de alimentación. Una persona experta en la técnica es familiar con tales procesos. Tales alimentos o productos de alimentación compuestos pueden además comprender aditivos o componentes utilizados generalmente para tal propósito y conocido en el estado de la técnica. Los siguientes Ejemplos ilustran además la presente invención, pero estos no son limitantes de ese modo de alcance de la invención. El inhibidor de la escualeno sintasa utilizado en los Ejemplos es [3- (3-alil-bifenil-4-iloxi) -propil] -isopropil-amina, una de las series de inhibidores tipo fenoxipropilamina . Se sintetizó este compuesto de acuerdo con los métodos descritos por Brown et al. (supra) : Se preparó 3-alil-bifenil-4-ol a partir de bifenil-4-ol (código de producto H7751, Sigma, USA) mediante la reacción con bromuro de alilo y carbonato de potasio en butan-2-ona, y nueva disposición térmica. Se hizo reaccionar 3-alil-bifenil-4-ol con 1,3-dibromopropano y carbonato de potasio en butan-2-ona, y la reacción subsiguiente con isopropilamina en 2 -propanol dio [3-(3-alil-bifenil-4-iloxi) -propil] -isopropil -amina.

Ejemplo 1: Efecto de adición del inhibidor de escualeno sintasa en el desarrollo celular de Phaffla. rhodozyma. Se inoculó Phaffia rhodozyma ATCC96594 en un medio YPD (DIFCO, Detroit, U.S. A., 10 mL en tubo) y se cultivó por agitación a 20 °C durante 2 días. Se inoculó 0.5 mL del cultivo en un medio YPD fresco (10 mL en tubo) que contenia 30 g/L de glucosa y 0, 0.2, 0.5, 1.0, 2.0, 5.0, 10.0 y 20.0 ug/mL, respectivamente, de [3- (3-alil-bifenil-4-il-oxi) -propil] -isopropil-amina, y se cultivó por agitación a 20°C durante 5 días . Se retiró ocasionalmente una alícuota del cultivo durante la cultivación, y se midió la densidad óptica a 660 nm utilizando un fotómetro de UV-1200 (Shimadzu Corp., Kyoto, Japón) para análisis del desarrollo celular. Los resultados se muestran en la Tabla 1. Tabla 1 No se afectó el desarrollo celular cuando la concentración del inhibidor de escualeno sintasa no fue mayor de 2.0 g/mL. Se observó aproximadamente 23% de inhibición del desarrollo celular en el Día 2 por 5.0 /xg/mL del inhibidor.

Ejemplo 2: Efecto de adición del inhibidor de escualeno sintasa en la producción de astaxantina por Phaffia rhodozyma Se inoculó Phaffia rhodozyma ATCC96594 en un medio YPD como en el Ejemplo 1 y se cultivó por agitación a 20°C durante 2 días . Se inocularon 2.5 mL del cultivo en un medio YPD fresco (50 mL en matraz) que contenía 22 g/L de glucosa y 0, 0.5, 1.0, 2.0 y 5.0 g/mL, respectivamente, de [3- (3-alil-bifenil-4-iloxi) -propil] -isopropil-amina, y se cultivó por agitación a 20°C durante 7 días. Se agregó al cultivo en el Día 2 de la cultivación 50 g/L de glucosa. También se probó la adición del inhibidor en el medio de la cultivación. Se retiró una alícuota del cultivo en el Día 4 y en el Día 7 de la cultivación, y se midieron la densidad óptica a 660 nm (utilizando el mismo método descrito en el Ejemplo 1) y el contenido de astaxantina en el cultivo. Para análisis del contenido de astaxantina, el caldo retirado se mezcló con una mezcla disolvente (alcohol etílico, hexano y acetato de etilo) y se extrajeron carotenoides de las células de Phaffia rhodozyma por agitación vigorosa con bolas de vidrio. Después de la extracción, las células separadas y las bolas de vidrio se eliminaron por centrifugación y el sobrenadante resultante se analizó por CLAR para el contenido de astaxantina. Se utilizaron las condiciones de CLAR como sigue : Columna de CLAR: Chrompack Lichrosorb si-60 (4.6 mm, 250 mm) Temperatura: temperatura ambiente Eluyente: acetona/hexano (18/82) agregar 1 ml/L de agua al eluyente Volumen de inyección: 10 µ? Velocidad de flujo: 2.0 ml/minuto Detección: UV a 450 nm Se obtuvo una muestra de referencia de astaxantina de Hoffmann La-Roche (Basel, Suiza) . Los resultados se muestran en la Tabla 2. Tabla 2 Valores relativos calculados como el contenido de astaxantina del Día 7 sin inhibidor para ser 100. ** Se inició la cultivación sin inhibidor, y se agregó en el Día 7 de la cultivación 5.0 /xg/mL de inhibidor. Se mejoró la producción de astaxantina en todas las condiciones probadas. Se obtuvo el mejor resultado cuando se agregó el inhibidor en el Día 2 de la cultivación, pero la adición del inhibidor a partir del comienzo de la cultivación también fue efectiva en la producción de astaxantina. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES
Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un proceso biológico para producir carotenoides, caracterizado porgue comprende cultivar un microorganismo que sea capaz de producir carotenoides en presencia de un inhibidor para la biosíntesis de esteróles de pirofosfato de farnesilo, en un medio acuoso nutriente bajo condiciones aeróbicas . 2. Un proceso biológico para producir carotenoides, caracterizado porque comprende cultivar un microorganismo que sea capaz de producir carotenoides y que pertenecen al género Xanthophylloyces [Phaffia) en presencia de un inhibidor para la biosíntesis de esteróles de pirofosfato de farnesilo, un substrato para producir carotenoides en un medio acuoso nutriente bajo condiciones aeróbicas, y aislar los carotenoides resultantes de las células del microorganismo o del caldo cultivado.
3. El proceso de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el microorganismo es Xanthophyllomyces dendrorhous (Phaffia rhodozyma) ATCC96594.
4. El proceso de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque el inhibidor para la biosíntesis de esteróles de pirofosfato de farnesilo se selecciona del grupo que consiste de inhibidores de escualeno sintasa.
5. El proceso de conformidad con la reivindicación 4 , caracterizado porque el inhibidor de escualeno sintasa se selecciona del grupo que consiste de inhibidores de escualeno sintasa basado en ion de amonio.
6. El proceso de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el inhibidor de escualeno sintasa basado en ion de amonio se selecciona del grupo que consiste de inhibidores de escualeno sintasa tipo fenoxipropilamina .
7. El proceso de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el inhibidor de escualeno sintasa tipo fenoxipropilamina se selecciona de [3- (3-alil-bifenil-4-iloxi) -propil] isopropil-amina, N-isopropil-3 - (4-acetamido-2-alilfenoxi) propilamina, N-metil-N-isopropil-3- (4-acetamida-2-alilfenoxi) propilamina, N-ciclopentil-3 - (4-acetamida-2-alil-fenoxi) propilamina, N-ciclobutil-3- (4-acetamida-2-alilfenoxi) -propilamina, N-isopropil-3- (2-alil-4-butiramidofenoxi)propil-amina, N-isopropil-3- (4-acetamido-2-clorofenoxi) propilamina, N-isopropil-3- (4-acetamido-2-propilfenoxi)propilamina, y N-isopropil-3- (4-acetamido-2 -alilfenoxi) -1-metilpropilamina, y sus sales biológicamente aceptables.
8. El proceso de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el inhibidor de escualeno sintasa tipo fenoxipropilamina es [3- (3-alil-bifenil-4-iloxi) -propil] - isopropil-amina, o una sal biológicamente aceptable del mismo, N-isopropil-3- (4-acetamido-2-alilfenoxi) propilamina o N-metil-N-isopropil-3- (4-acetamida-2-alilfenoxi) propi1amina .
9. El proceso de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque la concentración del inhibidor está dentro del intervalo que da menos del 50% de reducción del crecimiento celular bajo las condiciones que producen carotenoides .
10. El proceso de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la concentración del inhibidor está dentro del intervalo que da menos del 30% de reducción del crecimiento celular bajo las condiciones que producen carotenoides .
11. El proceso de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque se lleva a cabo la cultivación a un pH en el intervalo de 4 a 8 y a una temperatura en el intervalo de 15 a 26°C, durante 24 a 500 horas.
12. El proceso de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque se lleva a cabo la cultivación a un pH en el intervalo de 5 a 7 y a una temperatura en el intervalo de 18 a 22 °C, durante 48 a 350 horas.