COMPOSICIÓN VACUNAL CONTRA LAS ALERGIAS, MÉTODO PARA SU OBTENCIÓN Y EMPLEO EN EL TRATAMIENTO DE LAS MISMAS. Sector Técnico La presente invención se relaciona con el campo de la Inmunología, específicamente con la rama de la Inmunoalergia y en particular con el empleo de adyuvantes o portadores para modular la respuesta ¡nmunológica hacia los alérgenos, con el objetivo de inducir cambios que reduzcan o prevengan el efecto patogénico de dicha respuesta hacia esos compuestos. Técnica Anterior Las alergias son una patología muy frecuente, sobre todo en los países industrializados. En la alergia intervienen una serie de mecanismos inmunopatológicos, el más común de ellos es la denominada hipersensibilidad de tipo-I o anafiláctica. La fisiopatogenia de la misma está basada en la producción incrementada de IgE, un anticuerpo citotrópico, que se produce frente a sustancias denominadas alérgenos, tras un primer contacto que se conoce como sensibilización. La IgE se une a los mastocitos tisulares y basófilos sanguíneos logrando así prolongar su vida media de horas en sangre a meses en los tejidos. En contactos posteriores con el alérgeno se produce el reconocimiento de los mismos y el entrecruzamiento de las IgE de superficie, la transmisión de señales hacia el citoplasma y la degranulación celular y liberación de los mediadores de las alergias entre los que se encuentran la histamina, la serotonina y las kininas. Las enfermedades alérgicas más comunes son la rinitis, el asma, y la dermatitis atópica. El asma alérgica es una enfermedad inflamatoria crónica. La inmunopatogénesis de! asma es compleja y en ella participan, además de los mecanismos IgE dependientes (causantes de la respuesta anafiláctica inmediata tipo I), los linfocitos Th2, los cuales- inducen y mantienen la respuesta inflamatoria mediante el reclutamiento y activación de otras células y en particular a través de la producción de IL-5, la cual es responsable del reclutamiento y activación de los eosinófilos. La eosinofília juega un papel importante en el surgimiento de la hiperreactividad bronquial, la cual es una característica esencial del asma. Los alérgenos más comunes son el polen, los ácaros, el polvo de las casas, el moho, las drogas, los alimentos y los pelos de los animales. En particular los 2
alérgenos domésticos y en primer lugar los ácaros, son causantes de alergias respiratorias y asma. Las manifestaciones clínicas son tratadas fundamentalmente con antihistamínicos, simpaticomiméticos, cromoglicato de sodio y esteroides. Estos tratamientos son generalmente inadecuados, pues tratan los signos y síntomas y no su etiopatogenia, por lo que en la actualidad se va en busca de otros procedimientos más efectivos entre los que se encuentran la Inmunoterapia o vacunas terapéuticas. Tradicionalmente la terapia de hiposensibilización o inmunoterapia con extractos alergénicos ha sido ampliamente utilizada en el tratamiento de las enfermedades alérgicas. En este tipo de tratamiento los pacientes son hiposensibilizados mediante la administración por vía subcutánea de los alérgenos específicos. Se comienza con la inyección de una pequeña dosis de dicho alérgeno y si no ocurren reacciones alérgicas, se va aumentando la misma con una frecuencia semanal. Las dosis se continúan incrementando gradualmente hasta alcanzar una dosis de mantenimiento mensual o bimensual. Este tratamiento se puede prolongar varios años (WHO Position Paper. Allergen Immunotherapy: Therapeutic Vaccines against Allerglc Diseases. Geneva, January 1998). A pesar de considerarse un método relativamente eficaz en ciertas alergias, la inmunoterapia ha sido cuestionada debido a su falta de seguridad, pues se expone al paciente a reacciones anafílácticas que eventualmente puede incluso causar su muerte. También el elevado número de inyecciones a administrar, que pueden alcanzar hasta unas 100 ó 200 en un tratamiento de 3 años, constituye un serio inconveniente en su aplicación práctica, lo cual causa frecuentemente el abandono prematuro del mismo sin lograr la eficacia esperada. Cada vez se conoce más sobre los mecanismos de inducción de los altos niveles de IgE en los alérgicos. Estos son inducidos a través de mecanismos inmunológicos propios de la respuesta de tipo Th2 y en particular por una sobreproducción dé IL-4. Las células Th2 están involucradas patológicamente no sólo a través de su papel regulatorio (la IL-4 induce el cambio de clase hacia IgE en los linfocitos B, mediado por una señal de contacto provista por las Th) sino también que participan también de modo más directo en la fase efectora de la respuesta alérgica tardía y en la inflamación crónica asmática.
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La exposición a alérgenos ambientales, además de la predisposición genética propia del individuo, constituye el fenómeno desencadenante de la sensibilización alérgica, en primer lugar y de las reacciones alérgicas posteriores en los individuos previamente sensibilizados. El mecanismo inmunológico responsable de la mejoría clínica de los pacientes durante la inmunoíerapia con extractos alergénicos no está aún totalmente dilucidado. Sin embargo, se conoce que se producen cambios inmunológicos vinculados con la disminución a largo plazo de los anticuerpos IgE específicos al alérgeno, la disminución de la secreción de IL-4 e IL-5 y el incremento de anticuerpos IgG e IFN-y. Estos cambios indican una disminución del patrón de respuesta Th2 como posible consecuencia de la inducción de un patrón Th1 concurrente no patogénico (WHO Position Paper. Allergen Immunotherapy: Therapeutic Vaccines Against Allergic Diseases. Geneva, January 1998) Los patrones Th1/Th2 de respuesta inmunológica se distinguen primeramente por el patrón típico de cltoquinas que secretan las células Th, fundamentalmente, IFN-? e IL-2 por las Th1 e IL-4 e IL-5 por las Th2 ( ossman, T. R., Cherwinski, H., Bond, M. W., Giedlin, M. A, and R. L. Coffman. 1986. Two types of murine heiper T cells clone. I. Definition according to profiles of lymphokine activities and secreted proteins. J. Immunol. 136:2348-2357). Por otra parte, también es posible valorar el tipo de respuesta inducida determinando los perfiles de clases y subclases de inmunogiobuünas séricas que estos inducen. Así en los murinos, el patrón Th1 induce preferentemente anticuerpos de la subclase lgG2a (dependiente de IFN-?), mientras que el Th2 induce IgE y subclase lgG1 (dependientes de IL-4). En los humanos el Th1 cursa con anticuerpos lgG1/lgG3 y el TH2 con IgE. Aunque la aparición y desarrollo de las alergias está relacionada con factores de tipo ambiental, el papel básico en la propensión del individuo a desarrollar una respuesta Th2/lgE hacia antígenos ambientales, es de orden genético (Holgate ST. Genetic and environmantal interaction in allergy and Asthma. J Allergy Clin Immunol 1999; 104:1 139-1 146). Esto se traduce en que, la descendencia de padres alérgicos lo serán también con una mayor frecuencia que los hijos de padres no alérgicos. Esta frecuencia se ha estimado en 75, 50 y 25% si ambos parentales, la madre o el padre son alérgicos, respectivamente, lo que significa que existe una alta probabilidad de predecir el comportamiento de un individuo 4
dentro de la población y por tanto de ésta, si se tiene un sistema de detección a nivel parental. También es conocido que el afianzamiento del patrón patológico Th2 ocurre en los primeros 6-24 meses de vida del niño y que factores ambientales como la exposición a infecciones bacterianas pueden influir de forma positiva en la enfermedad induciendo un patrón Th1 , que contraregula el Th2 alérgico (Holt PG, Programing of Allergen Specific Th-memory during Childhood. Proceedings XVH International Congress of Allergology and Clinical Immunology. Sydney 2000. Allergy Clin Immunol International Suppl. 1 , 2000 pp 83-85). Estos hallazgos dejan entrever la posibilidad de diseñar vacunas anti-alérgicas profilácticas, que prevengan el afianzamiento del patrón Th2 hacia los alérgenos, en la temprana infancia. Estas vacunas podrían estar basadas en el empleo de adyuvantes Th1 que fueran efectivos durante la lactancia. Se han intentado varias formas de mejorar la inmunoterapia con alérgenos, tratando de reducir sus aspectos negativos, preservando o ampliando sus beneficios. En particular, se conoce que existen varios métodos para modificar los alérgenos de modo que se reduzca su alergenicidad (es decir, su afinidad por los anticuerpos IgE) y su capacidad para inducir IgE tras la inmunización, así como incrementar su inmunogenicidad (es decir, su capacidad para inducir una respuesta eventualmente terapéutica o protectora). Entre ellos se encuentran métodos físicos por adsorción o inclusión de los alérgenos para crear un efecto de depósito (adyuvantes) o métodos químicos que modifican las moléculas alergénicas mediante enlaces covalentes con otros compuestos o entre ellas mismas. Como agentes físicos se han empleado la tirosina (Patente No. GB 1 ,377,074), el éster de tirosina (Patente No. US 4,428,932); los liposomas (Solicitud de patente WO 89/10753); el monofosforil lípido A (MLA) y el MLA 3 desacilado (Patente No. US. 5,762,943); la saponina (Patente No. US. 4,432,969) y los tradicionales hidróxido de aluminio y fosfato de calcio. Entre los agentes químicos que se han empleado para la polimerización de los alérgenos está el formaldehído (Marsch DG et al. Studies on aliergoids from natura!ly occurring allergens. III. Preparation of Ragweed pollen aliergoids by aldehyde modification. J. Allergy Clin, immunol. 1981;68:449-59); Alginato (Corrado OJ et al. Allergy 1989;44:108-5) y glutaraldehído (Patente No. GB 5
1,282,163). También se han empleado mPEG (Dreborg et al. Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 1990;6:315-65) y conjugaciones a polisacáridos (Solicitud de patente europea No. EP 008 3497 A2). Estas soluciones logran, en algunos casos (por Ej. los alérgenos polimerizados con glutaraldehido y adyuvados con Alúmina, Grammer et al, Modified forms of allergen immunotherapy, J Allergy Clin Immunol 1985;44: 08-15), incrementar los títulos de anticuerpos IgG dirigidos contra los alérgenos en modelos animales. Sin embargo, el incremento de esta clase de anticuerpos no implica necesariamente una mejoría clínica del paciente, sobre todo si va acompañada de un incremento paralelo de los anticuerpos IgE. De hecho, algunas de las subclases de la IgG (lgG1 en los ratones e lgG4 en humanos) están implicadas también en diferentes formas de la reacción alérgica, por ser capaces de fijarse, aunque transitoriamente, a los mastocitos. Por otra parte, las evidencias clínicas en humanos indican que el incremento de los anticuerpos IgG no está directamente correlacionado con la mejoría clínica del paciente, sugiriendo que el mismo juega solamente un papel secundario en el mecanismo regulatorio inducido por el tratamiento (Rak S. Lowhagen O, Venge P. The effect of immunotherapy on bronchial hyperresponsiveness and eosinophil cationic protein in pollen-allergic patients. J Allergy Clin Immunol 1988; 82:470-80 y Jutel M, Müller U, Fricker M, Rihs S, Pichler W, Dahinden C. lnfluence of bee venom immunotherapy on degranulation and leukotriene generation in human blood basophils. Clin Exp Immunol 1996;12:1112-18). El empleo de alérgenos modificados químicamente (alergoides) aunque tiene algunas ventajas en cuanto a reducción de las reacciones secundarias durante el tratamiento, en comparación con los extractos alergénicos tradicionales, no producen una significativamente mejoría clínica (Bousquet et al. J. Allergy Clin. Immunol. 1989;84:546-56 y Grammer et al al. J Allergy Clin Immunology 1985;76:397-401 ). Otro de los inconvenientes de los alergoides empleados hasta el momento en la clínica (modificados por glutaraldehido o formaldehído), es la imposibilidad práctica de lograr una composición estandarizada de los productos, ya que los mismos se obtienen mediante reacciones "químicas a partir de los extractos alergénicos, los cuales constituyen mezclas heterogéneas de polipéptidos y otras biomoléculas. En estas reacciones se obtienen 6
inevitablemente especies moleculares con diferentes grados de polimerización o modificación química, las cuales pueden constituir subproductos no deseables, difíciles de eliminar. El empleo de hidróxido de aluminio sólo ha logrado reducir el número de inyecciones necesarias para lograr el mismo efecto que con los alérgenos no adyuvados, lo cual se debe a su efecto de depósito y liberación lenta. Sin embargo, este adyuvante propicia la producción de IgE, tanto en animales como en humanos provocando un típico patrón Th2, lo cual podría eventualmente reforzar la respuesta alérgica patogénica durante su administración. El fosfato de calcio o la tirosina se han empleado también como adsorbentes para crear depósitos y producir la liberación lenta de los alérgenos, sin embargo no han mostrado ventajas de consideración con respecto a los extractos acuosos o adyuvados con Alúmina, en cuanto a mejorar la eficacia o la seguridad del tratamiento (Altintas DU ef al. Comparison bet een the use of adsorbed and aqueous immunotherapy material in Dermatophagoides pteronyssinus sensitive asthmatic patients. Allergologie et Immunopathologie 1999; 27(6):309-317). Ninguna de las soluciones existentes en la actualidad, enumeradas anteriormente, logra inducir una modulación inmunológica completamente efectiva (expresada en inhibición o reducción del patrón Th2 o inducción del Th1 ) ya sea en animales o en humanos, ni eficacia clínica en estos últimos, empleando un número reducido de inyecciones. El empleo de liposomas que contienen alérgenos ha sido descrito en la solicitud de patente WO 89/10753. Los liposomas, además de cre'ar un depósito y reducir la alergenicidad del producto, se cree que influyan en los mecanismos de presentación de los antígenos al sistema inmune, debido a su naturaleza lipídica y particulada (WHO Position Paper. Allergen Immunotherapy: Therapeutic Vaccines against Allergic Diseases. Geneva, January 1998). Sin embargo, este enfoque no ha podido extenderse a la práctica clínica debido a la inestabilidad característica de estos preparados, así como a inconvenientes relacionados con la tecnología para la inclusión de forma consistente de los alérgenos dentro de los liposomas. La falta de estabilidad de la formulación de los liposomas durante su conservación o durante su administración al paciente tiene implicaciones serias en la seguridad del producto, ya que la eventual liberación de los alérgenos de los liposomas 7
puede provocar reacciones anafilácticas severas, de la misma forma que ocurren con los alérgenos en estado acuoso. Tampoco en ese caso se han logrado evidencias de la inducción de una respuesta inmunológica que afecte el balance Th1/Th2 y que induzca un patrón no patológico o protectogénico. Las estrategias más recientes que se conocen intentan emplear formulaciones de alérgenos con adyuvantes inductores de respuesta Th1, tales como el monofosforü lípido A (MLA) (Patente US. 5,762,943), proteínas de shock térmico ("Heat Shock Proteins", HSP, siglas en inglés), también conocidas como proteínas de estrés de micobacterias, lo cual es descrito en la patente W09823735. En el caso del MLA, el cual constituye una variante detoxificada de LPS, se ha demostrado que reduce los niveles de IgE específica, incrementando la IgG en experimentos en ratones, sin embargo no se ha demostrado que reduzca de modo efectivo el componente celular Th2 de la respuesta alérgica, de modo que su uso estaría limitado estrictamente a las enfermedades alérgicas para las cuales el mecanismo de hipersensibilidad tipo 1 sea el principal, lo cual excluiría el asma. Otro de los inconvenientes, es que aunque se logra atenuar el efecto tóxico de los LPS, no se elimina por completo la toxicidad {Baldrick P et al. Vaccine 20, 2002 737-743), io cual podría limitar su uso en niños de pequeña edad. En el caso de las HSP, no se han provisto evidencias experimentales de que las mezclas o conjugados de dicha proteínas con los alérgenos produzcan un efecto de desviación de la respuesta Th2 específica a los alérgenos, ya sea en modelos animales o en humanos. El empleo de proteoliposomas derivados de la membrana externa de bacterias Gram-negativas se ha descrito para la preparación de vacunas profilácticas contra enfermedades infecciosas por Ruegg CL y cois. (Preparation of proteosome-based vaccines. J lmmunologicai ethods 1990;135:101-9); Lowell y cois. (Proteosome-Lipopeptide Vaccines: Enhancement of Immunity for Malaria CS Peptides. Science 1988;240:800-2); también en la Pat. No. US No. 5,597,572. En esta última, el núcleo fundamental es el proteoliposoma o vesículas de membrana extema (VME) derivados de Neissería meningitidis serogrupo B, cuya estructura particulada, sus trazas de lipooligosacáridos (LPS) incorporadas en las VME, el polisacárido C, su composición lipídica característica y su adsorción en alúmina, están relacionadas con su inmunogenicidad y probada protectogenicidad en humanos.
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A pesar de contener LPS, dicha formulación vacunal no provoca efectos tóxicos en humanos ni animales, lo cual es atribuido a la peculiar estructura y composición de las V E. Por otra parte se logra retener el efecto inmunomodulador y adyuvante de los LPS. La vacuna basada en este proteoliposoma ha sido aplicada en más de 50 millones de dosis y ha demostrado ser segura, no reactogénica y eficaz para proteger contra N. meningitidis serogupos B y C. Es además, aplicada durante la lactancia de forma segura y eficaz, donde convierte la T-independencia del Polisacárido C en un antígeno T-dependiente. Esta vacuna induce un patrón preferencial Th1 caracterizado por la inducción en humanos y animales de linfoproliferación; anticuerpos lgG anti-VME; subclases lgG1 en humanos e lgG2a en ratones; IFNy, IL-2 e IL-12 a nivel de ARNm y proteínas, y la no inducción de IgE anti-VME ni incrementos en la IgE total, ni tampoco de la IL-4, IL-5 a nivel de ARNm ni proteico (Infect Immun. 2001 , 69(72001 ):4502-4508). La respuesta inducida por la vacuna, como es característico de la inmunidad adaptativa, es específica a los antígenos bacterianos que componen el producto, y por consiguiente, no hay evidencias de que induzca respuesta alguna contra los alérgenos conocidos. Divulgación de la Invención El objetivo técnico de la presente invención es obtener una preparación farmacéutica de uso terapéutico o profiláctico empleando proteoliposomas bacterianos, en lo adelante denominados proteoliposomas, la cual al ser aplicada en un paciente que padece de alergias, es capaz de transformar la respuesta alérgica (Th2) inducida por el alérgeno, hacia una respuesta celular Th1. La invención también incluye el esquema de inmunización con dicha composición vacunal. Es también un objetivo de la presente invención proveer una composición farmacéutica capaz de prevenir la aparición y desarrollo de la enfermedad alérgica en niños con antecedentes familiares atópicos. Esta composición puede contener uno o varios alérgenos los cuales se pueden acoplar o administrar conjuntamente con un proteoliposoma, induciéndose una respuesta inmunológica terapéutica o protectora en el individuo alérgico, al o a los alérgenos en cuestión. Esta respuesta se caracteriza por una menor producción de anticuerpos IgE con respecto a la ¡nmunoterapia tradicional, la no inducción de IL-5, así como ia inducción de anticuerpos de subclase lgG1 (en humanos) e 9
lgG2a (en murinos) y las citocinas IFNy e IL-2 (en ambos), correspondientes a una respuesta Th1 , elementos que evidencian la transformación de la respuesta Th2 alergénica hacia una celular, Th1. Es otro objetivo de esta invención proveer el método para acoplar dicho (s) alérgeno (s) con el proteoliposoma y otros adyuvantes, así como proveer una composición farmacéutica apropiada para su administración por vía parenteral. La novedad de la invención radica primeramente en el uso de proteoliposomas derivados de proteínas de la membrana externa de bacterias Gram-negativas y más particularmente de Neisseria meningitidis B, los cuales pueden estar solos o unidos a un polisacárido; para ser posteriormente acoplados de forma no covalente o covalente con una o varias proteínas alergénicas y de esa forma ser administrados a los individuos alérgicos. Es particularmente novedoso que la composición farmacéutica de la presente invención induce una modulación de la respuesta inmune específica a los alérgenos incluidos en la misma, hacia un patrón Th1 no patogénico y protector, empleando solamente 2 inyecciones. Otro aspecto novedoso es su aplicación profiláctica en descendientes de parentales alérgicos o en individuos atópicos diagnosticados tempranamente.
Es también novedoso el procedimiento empleado para el acople no-covalente de los componentes de la formulación y particularmente del proteoliposoma y de los alérgenos, así como el empleo de alérgenos purificados con ese propósito. En la presente Invención se emplean proteoliposomas o VME purificadas a partir del cultivo de bacteria Gram-negativas en particular de N. meningitidis B según se describe en la Patente No. US 5,597,572. En la presente invención se emplean alérgenos preferentemente de naturaleza proteica o glicoproteica aunque también es posible emplear alérgenos polisacarídicos. Los mismos son obtenidos a partir de fuentes alergénicas naturales por métodos de extracción y purificación conocidos en el arte o de forma recombinante expresados en microorganismos o células superiores. Alternativamente se pueden emplear polipéptidos obtenidos por síntesis química cuya secuencia de aminoácidos se corresponde con los alérgenos nativos. Particularmente, se emplean alérgenos respiratorios y en primer lugar de ácaros del polvo doméstico de la familias Piroglyphidae o Glyciphagidae, especialmente 10
de los géneros Dermatophagoides o Blomia y específicamente de las especies Dermatophagoides siboney, Dermatophagoides pteronyssinus o Dermatophagoides farínae.. Los alérgenos purificados de dichas especies de ácaros se obtienen a partir de cualquier extracto alergénico comercial, el cual es sometido primeramente a liofiüzación o concentración por ultrafiltración hasta una concentración de proteínas de 10 a 100 mg/mL y a continuación a precipitación salina en solución de sulfato de amonio 50 - 100%. El precipitado es fraccionado mediante cromatografía de tamizaje molecular empleando como matrices Sephacryl S-100, Sephacryl S-200 o Sephacryl S-300 o Superdex 75, colectándose el pico que corresponde a los pesos moleculares 10-60 kDa. Esta fracción contiene fundamentalmente los Alérgenos mayores del Grupo 1 (glicoproteínas de 25 kDa: Der s 1 , Der p 1 ) y Grupo 2 (proteínas de 15 kDa: Der s 2, Der p 2). Alternativamente, puede ser empleado un procedimiento de purificación independiente para cada uno de los alérgenos por separado, basado en la cromatografía de afinidad con anticuerpos monocldnales anti-Grupo 1 y anti-Grupo 2, acoplados a una resina, con la posterior formulación de ambos componentes importantes en un solo preparado o la unión a los Proteoliposomas por separado. La unión de ambos componentes básicos (alérgeno y proteoliposoma) se realiza por métodos covalentes o no covalentes, teniendo en cuenta las propiedades de cada alérgeno en particular. En el caso de la unión no covalente, los alérgenos de ácaros, se incorporan en concentraciones de alérgeno de 0,1 a 1 µg por cada 10 µg de proteoliposoma. Esta incorporación se realiza mediante agitación durante 30 a 90 minutos a 60 a 600 rpm, aprovechando las interacciones de tipo hidrofóbico o lipofílico entre ambos componentes. La mezcla obtenida puede ser administrada directamente en solución acuosa o adsorbida en alúmina. En el caso del empleo de alúmina, el alérgeno se adsorbe a la misma antes del proteoliposoma o preferentemente posterior a éste. La alúmina se emplea de 10 a 25 veces la cantidad de proteoliposoma, manteniéndose la proporción entre éste y el alérgeno. La adsorción a la alúmina se realiza mediante agitación lenta entre 60 a 600 rpm y pH de 6 a 8. La efectividad de la adsorción de cada alérgeno a la Alúmina puede determinarse empleando métodos ELISA específicos a los mismos, como por ejemplo los ELISA 11
para Der s 1 (Sewer et al. Int Aren Allergy Immunol 2000;123:242-248) o para Grupo 2 del género Dermatophagoides (Heymann PW, Chapman MD et al J Allergy Clin Immunol 1989;83:1055 -1067.) La unión del proteoliposoma y el alérgeno también puede realizarse de forma covalente a través de la unión de un espaciador al proteoliposoma por los grupos aminos libres presentes en éste y a continuación la unión del grupo maleimido a los grupos sulfi idrilo libres presentes en el alérgeno. Tales grupos existen en los alérgenos mayores de los acaras del polvo (grupo 1 y 2), pero pueden ser también inducidos en otros alérgenos mediante la reducción de los puentes disulfuro o incluidos mediante la derivatización de las proteínas por métodos conocidos. Los conjugados obtenidos se purifican posteriormente mediante diálisis o ultrafiltración y por último mediante cromatografía de exclusión molecular (Sephacryl S-300 ó Superdex 200) para eliminar los reactivos de conjugación, así como los alérgenos no unidos al proteoliposoma. Las moléculas alergénlcas deben constituir entre el 1 y el 10% de la masa total del conjugado con el objetivo de lograr la respuesta inmunogénica adecuada. El conjugado se administra por vía inyectable en un excipiente acuoso apropiado o también adsorbido en gel de Hidróxido de Aluminio u otro adyuvante de depósito. La presente invención también comprende la conjugación por el método antes descrito, de residuos lipofílicos a los alérgenos, tales como ácidos grasos bipolares de 16 a 20 carbonos, para facilitar su incorporación no covalente al proteoliposoma. Alternativamente, la composición vacunal incluye otros antígenos que no afecten al patrón celular inducido y sí potencien la respuesta deseada contra el alérgeno, lo cual permite la obtención de una vacuna polivalente. Los polisacáridos pueden ser uno de estos antígenos y particularmente el polisacárido C de N. meningitidis. Estos se adicionan de forma no covalente en concentraciones de 0.5 - 4 veces con respecto al proteoliposoma. La presente invención también comprende el empleo de alérgenos de naturaleza polisacarídica, tales como los determinantes polisacarídicos con reactividad cruzada ("Cross-reactive Carbohydrate Determinants", CCD, siglas en inglés) (Aalberse, RC. Crossreactivity of lgE antibodies to allergens. Allergy 56 (6), 2001, pp478-490), encontrados en algunos pólenes y alimentos vegetales. En ese caso 12
los mismos se añaden a la formulación al igual que el polisacárido C de N. rneningitídis. De forma inesperada, la administración de esta composición por vía parenteral en solo dos dosis, produce no solo una respuesta de tipo Th1 específica a los antígenos del proteoliposoma como ya se conocía con anterioridad, sino también una respuesta similar de tipo Th1 dirigida contra los alérgenos incluidos en la formulación. Sorprendentemente también esta respuesta Th1 se impone, a pesar del empleo en la formulación de Hidróxido de Aluminio preservándose, sin embargo, el efecto de depósito del mismo. Esta respuesta se caracteriza por un patrón de citoquinas compuesto preferentemente por IFN-?, con ausencia de respuesta de IL-5, también por una inducción de anticuerpos de la subclase lgG2a y una reducción de los anticuerpos IgE e lgG1 en ratones, específicos al alérgeno. La administración de dicha composición no afecta una respuesta preexistente contra los antígenos bacterianos, inducida por una inmunización anterior. La solución propuesta tiene las siguientes ventajas: El efecto inmunológico logrado por este preparado permite contrarrestar la respuesta alérgica tanto de tipo anafiláctico (reducción de IgE e lgG1 ) como la inflamatoria tardía y crónica (reducción de IL-5), lo cual la hace efectiva también en el tratamiento del asma. El efecto terapéutico se debe a la presentación de los alérgenos al sistema inmune en un contexto no alergénico y se alcanza en un número reducido de inyecciones y en un menor tiempo con respecto a la inmunoterapia tradicional con extractos alergénicos. Tal efecto se emplea ventajosamente no solo en el tratamiento de los pacientes alérgicos, sino también permite prevenir el agravamiento de la enfermedad en individuos con un estado alérgico incipiente o prevenir el desarrollo de nuevas alergias a alérgenos diferentes. El efecto inmunológico de los proteoliposomas como adyuvante ¡nmunomodulador es eficaz y seguro en edades tempranas durante la lactancia, lo cual posibilita la administración de ia formulación vacunal en esa edad con fines profilácticos, antes de la aparición y desarrollo de la enfermedad, en niños con antecedentes familiares alérgicos y por lo tanto con alta probabilidad de serlo también.
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La adsorción de los componentes activos de la formulación en un adyuvante de depósito, particularmente en gel de hidróxido de Aluminio, permite la reducción de la alergenlcidad del preparado (o sea la capacidad de unión de IgE) en más de 10 veces con relación a una dosis similar de alérgeno en estado acuoso, lo cual implica una reducción considerable de los riesgos de reacciones anafilácticas severas durante su administración. También la adsorción al gel de hidróxido de Aluminio contribuye a prolongar la estabilidad del preparado durante su conservación, al disminuir la cinética de las reacciones químicas que puedan eventualmente causar degradación de los componentes activos. El empleo de alérgenos purificados y particularmente de los alérgenos purificados de ácaros del género Derrnatophagoides, incluyendo alérgenos de los grupos 1 y 2, permite estandarizar la composición de los productos, determinando y ajustando de forma precisa su contenido en la formulación y su incorporación al proteoliposoma o al gel de hidróxido de aluminio. También en el caso del acople covalente, es posible separar fácilmente los productos no deseados (tales como los polímeros alérgeno-alérgeno) de los productos activos (conjugados proteoliposoma-alergeno) gracias a la gran diferencia de masa existente entre ambos componentes, lo cual se realiza empleando métodos de cromatografía de exclusión molecular, disponibles comercialmente. La tecnología es aplicable a alérgenos de diferente naturaleza, siendo posible emplear varios alérgenos en una misma formulación. La ausencia de toxicidad de la formulación a pesar de contener pequeñas cantidades de LPS, los cuales retienen su efecto inmunogénico, es otra de las ventajas de la solución propuesta que lo hacen apropiado para su administración segura a humanos y en particular a niños en edad temprana. Los proteollposomas también convierten a antígenos T-independientes, tales como carbohidratos, en antígenos T-dependientes. Esta propiedad se aplica también de forma ventajosa a los alérgenos de naturaleza polisacarídica, tales como los CCD. La presente invención será descrita a través de los siguientes ejemplos específicos. Ejemplo 1. Obtención y purificación de alérgenos de ácaros.
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Estos preparados se obtienen a partir del cultivo completo de los ácaros, el cual contiene ácaros muertos, exhuvias, heces, así como ingredientes no alergénicos de bajo peso molecular provenientes del medio de cultivo. Los alérgenos son extraídos en solución de bicarbonato de amonio o bicarbonato de sodio o solución salina o solución salina tamponada con fosfato, a un pH cercano al fisiológico. El extracto crudo es clarificado mediante centrifugación y filtración y los componentes de bajo peso molecular son removidos mediante cromatografía de tamizaje molecular (Sephadex G-25) o diafiltración (límite de corte 5-10 kD) o ambos. Este preparado es entonces concentrado mediante ultrafiltración y liofilizado para garantizar su estabilidad. Para lograr un producto con un mayor grado de pureza, el extracto liofilizado es resuspendido en solución acuosa y sometido a precipitación salina en solución de sulfato de amonio 50 - 100%. El precipitado es fraccionado mediante cromatografía de tamizaje molecular empleando Superdex 75, colectándose el pico intermedio que corresponde a los pesos moleculares 10-60 kDa. Esta fracción contiene fundamentalmente los Alérgenos mayores del Grupo 1 (25 kDa) y Grupo 2 ( 15 kDa). Por último, la fracción colectada es liofilizada de nuevo para ser reconstituida en una concentración apropiada para su conjugación o mezcla con el proteoliposoma
Ejemplo 2. Obtención del proteoliposoma. Para la obtención del proteoliposoma se realiza un cultivo de N. meningftidis B y la · biomasa colectada mediante centrifugación se somete a un proceso de extracción con detergente, enzimas y ultrasonido. El debris celular es removido mediante centrifugación y el sobrenadante es sometido entonces a digestión con nucleasas para eliminar los ácidos nucleicos. El extracto es recuperado mediante ultracentrifugación, resuspendido en solución con detergente y purificado del resto de los componentes de bajo y mediano peso molecular mediante cromatografía de exclusión molecular. El proteoliposoma así obtenidos contienen menos del 0% de ácidos nucleicos y alrededor de 10% de LPS insertados en su estructura; pero nunca libres. Opcionalmente, se añade polisacárido capsular de N. meningitidis serogrupo C producido según Gold y Gotschllch (Gold et al., 1969-1970, WHO Bull. 45: 279-282 and Gotschlich et al., 1969, J. Exp. Med. 129: 1349-1365) de 0.5 a 4 veces el contenido de proteoliposoma. También opcionalmente se puede 15
añadir alúmina al polisacárido-proteoliposoma, como un adyuvante adicional en una proporción de 10 a 25 veces la cantidad de Proteoliposoma. El pH final es 7,0 ± 0,4, la adsorción al gel de alúmina del proteoliposoma-polisacárido es mayor del 80% y un contenido de LPS menor del 6% es garantizado. El LPS presente está insertado en el proteoliposoma, por lo que se logra una adecuada presentación al sistema inmune y reduce la posibilidad de inducir reacciones indeseables. Se puede adicionar thiomersal como preservativo a una concentración entre 0.005-0.02%. El producto final es sometido a un conjunto de controles biológicos y físico-químicos. Ejemplo 3. Determinación de la alergenicidad (unión de IgE humana) de la formulación adsorbida en hidróxido de.Aiuminio. La actividad alergénica, expresada como la capacidad de unión de anticuerpos IgE humanos, se determinó mediante ELISA de inhibición de IgE el cual determina la habilidad de la muestra en solución de inhibir la unión de la IgE humana al alérgeno fijado a una fase sólida. La formulación muestra es alérgeno de D. siboney purificado según el Ej. 1 , mezclado con los proteoiiposomas según el Ej. 2 y adsorbidos en gel de hidróxido de Aluminio. La concentración de alérgeno mayor Der s 1 , inicial es de 4 ?/?t y la actividad alergénica 400 UB/mL (UB: Unidades Biológicas según la definición délas Guías Nórdicas para el Registro de Productos alergénicos, 2da Edición. 10 000 UB equivalen a 10 mg/mL de Histamina HCI en la prueba de punción cutánea) El ELISA se realiza de acuerdo al siguiente procedimiento. Se recubren microplacas de poliestireno con el Extracto Alergénico de Referencia. Se bloquean los sitios de unión inespecífica de la placa con PBS-BSA 1%. A continuación se realiza la inhibición de la IgE sérica del pool de sueros, mediante la incubación del suero con cantidades crecientes del alérgeno muestra y la Referencia, en paralelo. La IgE no-inhibida por los alérgenos en solución, se une al alérgeno fijado a la placa. Después de efectuar el procedimiento de lavado de los anticuerpos unidos inespecíficamente, se realiza la detección de la IgE unida al alérgeno, mediante un conjugado anti-IgE-Peroxidasa. El revelado se realiza mediante la adición de un sustrato cromogénico. La intensidad del color producto de la reacción enzimática es cuantificada mediante un lector de placas ELISA. La interpretación de los resultados del ensayo se realiza mediante el método estadístico de las rectas 16
paralelas. Se construyen curvas de Inhibición para la Referencia y las muestras por separado. Se lleva a cabo una regresión lineal de los valores de Absorbancia vs Inhibición, comprobándose el paralelismo de cada muestra con la Referencia. Por último, se calcula la potencia relativa como el antilogaritmo de la distancia horizontal entre las rectas paralelas. En el análisis de la muestra dada se obtuvieron los siguientes resultados: Actividad alergénica: 21.2 UB/mL (IC95% 13.6 - 32.4). Corresponde a un 5.3% de la actividad del alérgeno en estado acuoso inicial. Ejemplo 4. Determinación del esquema y dosis menos inductoras de IgE tota!. Para la determinación del esquema de inmunización (espaciamiento entre dosis) y la concentración de alérgeno, ratones Balb/c fueron tratados por vía intramuscular con dos inmunizaciones en las semanas: 0 y 2 (esquema corto) ó 0 y 4 (esquema largo) con Alérgeno (Al) + Alúmina (A) en concentraciones de 1 ó 5 g ratón de alérgeno. En el esquema corto los animales fueron sangrados en la semana 0, 2 y 5, y en el largo en la semanas 0, 4 y 7. El nivel de IgE total en las mezclas de sueros fue determinado por ELISA. Como puede observarse en la FIg. 1 el esquema corto induce una respuesta de IgE total significativamente menor que el esquema largo. Por otro lado, la menor concentración, 1 g de alérgeno, no indujo respuesta de IgE total en ninguno de los esquemas. Por ello, los siguientes experimentos fueron realizados con el esquema corto y con concentraciones de alrededor de 1 µ3?t&???. Para aún precisar más la dosis, ratones Balb/c fueron tratados por vía intramuscular con dos inmunizaciones en la semana 0 y 2 y fueron sangrados en la semana 0 y 4. El grupo l recibió proteoliposoma + polisacárido de N. meningitidis del serogrupo C + AI(OH)3. Los grupos II, til y IV recibieron AI(OH)3 + alérgeno con una concentración de alérgeno de 0,5; 1 ,25 ó 2,5 µg ratón/dosis1 respectivamente. El nivel de IgE total en los mezclas de sueros fueron determinados por ELISA. Como puede observarse en la Fig. 2, la IgE total no se elevó significativamente en ninguno de los grupos evaluados. Ejemplo 5. Ausencia de efecto de la incorporación del alérgeno sobre la respuesta anti proteoliposoma y modulación de la respuesta de subclases de IgG anti-alergeno.
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Para la determinación de la ausencia de efecto del alérgeno sobre la respuesta hacia el adyuvante, ratones Balb/c fueron tratados por vía intramuscular con- dos inmunizaciones en la semana 0 y 2. El grupo I recibió proteoliposoma + polisacárido de N. meningitidis del serogrupo C + Al (OH)3 (Va). Los grupos II, 111 y IV recibieron 0,5; 1 ,25 y 2,5 µg de Alérgeno + Va por ratón. El sangramiento se realizó a los 0, 15 y 35 días después de la primera dosis de inmunización y se determinó la respuesta de IgG y subclases anti-proteoliposoma y anti-alergeno en las mezclas de los sueros por ELISA. En la Flg. 3 se muestra los elevados títulos de IgG anti-proteoliposoma detectados y sorprendentemente la no afectación de la incorporación del alérgeno en esta respuesta ni en las subclases de IgG anti-Proteoliposoma estimuladas (Fig. 4). Los altos títulos de lgG2a son la expresión de la preferencial respuesta Th1 Inducida por este adyuvante. En la Fig. 5 aparecen las subclases de IgG estimuladas, donde se puede observar el incremento de respuesta igG2a anti-Alérgeno en las concentraciones menores de alérgeno y preferencialmente en 1 ,25 y 0,5 µg. La inducción de respuesta de lgG2a frente al alérgeno refleja que el adyuvante fue capaz de modular la respuesta Th2 hacia una Th1. Ejemplo 6. Producción de IFNy y no IL-5 por células de bazo de ratones inmunizados y desafiados in vitro con proteoliposoma o alérgeno y su correlación con la IgG y las subclases de IgG anti-alergeno inducidas por los adyuvantes: proteoliposoma + polisacárido C + Al(OH)3 en comparación con el Al(OH)3. Para la determinación de la respuesta de citocinas Th1 (IFN-?) y Th2 (IL-5) se inmunizaron ratones Balb/c con dos dosis en las semanas 0 y 2. El grupo l recibió proteoliposoma + polisacárido de N. meningitidis serogrupo C + AI(OH)3 (Va). Los grupos II, III y IV recibieron 0,5; 1 ,25 y 2,5 µg de Alérgeno + Va por ratón. El grupo V recibió una dosis inicial con Va y otra de 0,5 de Alérgeno + Va. Los animales fueron sacrificados 7 días después de la última dosis, se procesó su bazo por técnicas rutinarias y las células fueron enfrentadas a proteoliposoma o alérgeno. A las 72 horas, los sobrenadantes fueron extraídos y procesados por ELISA para la determinación de IFN-? e IL-5. El proteoliposoma indujo la producción de IFN-? en todos los grupos, en 18
correspondencia con el patrón Th1 inducido por este adyuvante. No obstante, con 0,5 de alérgeno, sorprendentemente, la producción de IFN-? se vio potenciada tanto en dos dosis como cuando se empleó una dosis previa de Va y una sola con Alérgeno (Fig. 6). Sorprendentemente, el alérgeno también indujo respuesta de lFN-? en todas las concentraciones empleadas, aunque inesperadamente, ésta fue superior en la concentración de 0,5 tanto con dos dosis como con una dosis y una previa de Va (Fig. 7). No se detectó respuesta de IL-5 frente al proteoliposoma ni al alérgeno. Estos resultados reflejan la modulación por el adyuvante del patrón Th2 inducido por los alérgenos hacia un patrón Th1. Para determinar la IgG y las subclases de IgG anti-alergeno se evaluó un grupo en paralelo inmunizado en Iguales condiciones a las referidas anteriormente; pero con tres grupos adicionales que contenían AI(OH)3 y el alérgeno en las mismas tres concentraciones (0,5; 1 ,25 y 2,5). El sangramiento se realizó a los 0, 15 y 35 días después de la inmunización. Las respuestas séricas fueron evaluadas por ELISA. La respuesta de IgG anti-alergeno fue significativamente superior cuando se empleó Va como adyuvante que con Al(OH)3 y sorpresivamente las diferencias entre las respuestas de los dos adyuvantes también fue superior con las concentraciones menores de 0,5 y 1,25 g. No obstante, la mayor respuesta de IgG anti-alergeno fue con la mayor concentración con ambos adyuvantes (Fig. 8). La subclase de IgG anti-alergeno predominante fue lgG1 en todas las combinaciones y adyuvantes. No obstante, se estimuló la lgG2a en todos las combinaciones con Va y fueron ligeramente positivas con AI(OH)3 sólo con las dos concentraciones mayores (2,5 y 1 ,25 µ?). Por el contrario, sorpresivamente, también la mayor diferencia de las lgG2a anti-alergeno, entre los dos adyuvantes fue encontrada con la menor concentración (0,5 µ9), donde es negativa con el adyuvante AI(OH)3 y positiva con Va (Fig. 9). Ejemplo 7. Determinación de la inducción de IgE anti-Alergeno, su funcionabilidad y modulación en el preparado vacuna!. Para la determinación de la respuesta de IgE anti-alergeno, se inmunizaron ratones Balb/c con dos dosis en las semanas 0 y 2. El grupo I recibió AL(OH)3. El grupo II recibió proteoliposoma + polisacárido C + Al(OH)3 (Va). Los grupos III y IV recibieron 1 y 5 µg de alérgeno + AL(OH)3, respectivamente. Los grupos V y VI 19
recibieron 0,5; 1 ,25 y 2,5 µ9 de alérgeno + Va. Los animales fueron sangrados a 0, 15 y 35 días de inmunizados. La respuesta de IgE se evaluó en ratas Wistar machos por el método de anafilaxia cutánea pasiva (PCA) cualitativa y semicuantitativa. Las respuestas fueron expresadas en tiempo y dilución de suero que resultó positiva y en densidades de las manchas. Los sueros fueron evaluados antes To, después de 1ra, T15 y 14 días después de 2da dosis, T35. Como puede observarse las ultimas diluciones positivas del preparado vacunal (grupos V a VII) son inferiores al de los grupos en alúmina (grupos III y IV). De igual forma ocurre en las densidades ópticas. Esto aboga hacia una reducción importante en la respuesta de IgE antialergeno inducida. No se observo respuesta en los controles negativos (I y 11). En los dos primeros grupos controles negativos, las respuestas fueron negativas. En el grupo III, se observó respuesta a los 35 días, con una intensidad de 10660 y detectable hasta una dilución de 1 :16. El grupo IV fue positivo desde la primera dosis (15 días) con una intensidad de 9345 y detectable hasta la dilución de 1:8. A los 35 días se observó una potente respuesta con 39843 de intensidad y detectable hasta la dilución de 1:32. Por el contrario, sorprendentemente con nuestro preparado vacunal Va, las respuestas de IgE anti-alergeno fueron muy inferiores, sólo detectables al día 35, con intensidades bajas y detectables siempre a menores diluciones. Es de señalar que con la menor concentración, 0,5 µg de alérgeno sólo se detectó una ligera respuesta en el suero puro (1:1), es decir, desaparecía la respuesta cuando el suero era diluido 1 :2 (Fig. 10 y Tabla 1). En la Tabla 1 se muestra la Intensidad de las manchas de las reacciones y última dilución del suero donde la anafilaxia cutánea pasiva fue positiva. Estos resultados de menor inducción de IgE anti-alergeno con el adyuvante Va que con AL(OH)3 y en las menores concentraciones de alérgeno, están en correspondencia con los resultados de los Ejemplos anteriores donde se encuentra menor IgE total, inducción de IFNy y subclase lgG2a con este adyuvante.
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Tabla 1
Leyenda: Al, AI(OH)3; P, Proteoliposoma; PC, Polisacárido C de N. meníngitidis serogrupo C; A, Alérgeno y *d¡as después de 1ra dosis. Ejemplo No. 8. Unión covalente del alérgeno al Proteoliposoma. La unión covalente mediante conjugación química puede realizarse por alguno de los métodos conocidos, como por ejemplo los descritos en la patente US 4,695,694 y en las solicitudes de patente USSN 362,179; 555,558; 555,974; 555,966 y 555,339. Los métodos preferidos emplean reactivos homobifuncionales como Glutaraldehído o Anhídrido Succínico logrando la unión a través de los grupos aminos libres, tanto del alérgeno como del proteoliposoma (en particular los grupos aminos de las Lisinas). También se emplean reactivos heterobifuncionales, preferiblemente Esteres de N-Hidroxisuccinimída-Maleimida (tales como MBS, MPS, SMPB, GMBS, EMCS). La reacción en este caso se realiza primero a través de la unión del espaciador al Proteoliposoma por los grupos aminos libres presentes en éste, y a continuación la unión del grupo Maleimido a los grupos Sulfidrilo libres presentes en el alérgeno. En el presente ejemplo se expone la conjugación del alérgeno purificado de Dérmatophagoides siboney al proteoliposoma empleando el método de Glutaraldehído y la respuesta inmunológica obtenida en ratones con el preparado. Conjugación: Las proteínas alergénlcas purificadas según el Ejemplo 1 se mezclaron a una concentración de 20 pg/mL con 200 pg/mL de Proteoliposoma en solución Salina Tamponada con Fosfato pH 7.0 (PBS); se adicionó igual volumen de Glutaraldehído al 0.4%; se agitó durante 1 hora y se detuvo la reacción con 0.25 mol/L de Glicina (concentración final). Seguidamente, se ajustó 21
el pH a 7.0 - 7.8. El Glutaraldehído no enlazado se eliminó mediante gel-filtración en una columna de Sephadex G25. Para lograr un mayor grado de purificación del conjugado Alergeno-Proteoliposoma y eliminar el Alérgeno libre, se pasó el preparado por una columna cromatográfica con Sephacryl S-300 con la adición previa de detergente Deoxicolato de Sodio hasta una concentración final de 1 %, colectando el primer pico correspondiente al volumen de exclusión de la matriz. Posteriormente se eliminó el detergente por diálisis empleando PBS. El preparado obtenido fue concentrado 10 veces por Ultrafiltración (Amicon, USA) con una membrana de 10 000 KD como valor de corte. Se determinó el contenido de Der s 1 en el conjugado empleando un ELISA sándwich con anticuerpos monoc!onales específicos a dicho alérgeno y se ajustó la concentración, mediante dilución con PBS hasta un valor apropiado para el proceso de adyuvacion: 10 pg/mL. Por último el preparado se esterilizó mediante filtración por membrana de 0.2pm. Adyuvacion: Se mezclaron cantidades iguales de Hidróxido de Aluminio a 1.2 mg/mL y la solución de Alérgeno estéril a 10 pg/mL de Der s 1 , ambos en solución PBS a un pH de 7.0. Se agitó la mezcla ligeramente durante 30 min a 200 rpm. Se comprobó la adsorción de las proteínas al gel de Aluminio monitoreando la absorbancia a 280 nm del sobrenadante de la suspensión, resultando ser superior al 90 %. Inmunización: Se inmunizaron 3 grupos de ratones Balb/C con 7 ratones en cada grupo, con dos dosis de cada preparado respectivamente: Alérgeno en solución de PBS ("Ds"), Conjugado de Alérgeno Proteoliposoma en PBS ("PLS-Ds") y Conjugado adsorbido en Hidróxido de Aluminio ("[PLS-Ds]Alum"). La dosis empleada fue de 5 pg/mL de alérgeno Der s 1 , por vía intraperitoneal. Las inmunizaciones se realizaron en la semanas 0 y 4. A los ratones se les extrajo sangre al inicio del experimento y en las semanas 4 y 8. Resultados: Se determinaron los anticuerpos séricos de las clases IgE (total) e IgG (específicos al alérgeno). También las subclases lgG1 , lgG2a e lgG2b. Dichas determinaciones fueron realizadas mediante ELISA. Por último se determinó la respuesta IgE específica hacia el alérgeno, empleando el método de Anafilaxia Cutánea Pasiva (PCA) en ratas. En la Fig. 11 se observan los resultados obtenidos en cuanto a anticuerpos. Se aprecia que en general las variantes que contienen conjugados inducen una respuesta IgG significativamente mayor que el 22
alérgeno solo, lo cual es también válido para todas las subclases"lgG1 , lgG2a e lgG2b. Sin embargo, la respuesta IgE total fue menor para la variante que contiene al conjugado no adyuvado en Hidróxido de Aluminio. También los resultados del PCA (IgE específica) demostraron que esa variante no indujo respuesta detectable (mayor que el Control Negativo), mientras que el alérgeno libre y el conjugado adyuvado en Aluminio si inducían respuestas detectables a las diluciones 1 :1 y 1 :10, respectivamente. Ejemplo 9. Formulación de varios alérgenos La formulación de diferentes alérgenos en un mismo preparado vacunal puede ser llevado a cabo tanto de forma no covalente, mediante mezcla o adsorción en el gel de Hidróxido de Aluminio, como de forma covalente, según el Ejemplo 8. En ese caso cada alérgeno se conjuga por separado al proteoliposoma y se formulan en conjunto mediante mezcla o adsorción en Hidróxido de Aluminio. En el presente ejemplo se expone la preparación de una formulación no covalente de tres alérgenos de diferentes especies de ácaros, comunes en regiones tropicales: Dermatophagoides pteronyssinus, Dermmatophagoides siboney y Blomia troplcalis. Los alérgenos de dichos ácaros se preparan por separado según el Ejemplo . En el caso de Blomia se emplea el extracto alergénico completo, liofilizado, sin fraccionar. El contenido de alérgenos principales Der p 1 , Der s 1 y Blo t 5 se determina empleando ensayos ELISA con anticuerpos monoclonaies específicos. La actividad Alergénica total se determina mediante ELISA de inhibición de IgE humana, según se describe en el Ejemplo 3. Los alérgenos liofilizados se resuspenden en PBS pH 7.0 a una concentración de 20 pg/mL de Der p 1 y Der s1 y a 10 pg/ml de Blo t 5 y se esterilizan mediante filtración por membrana de 0.2 pm. La actividad Alergénica de los mismos es de 4000 UB/mL. Se añadió Proteoliposoma a cada alérgeno por separado hasta una concentración final de 200 pg/mL y se homogeneizó durante 30 min con agitación lenta a 150 rpm. Por último se mezclaron cantidades iguales de Hidróxido de -Aluminio a 2 mg/mL y las soluciones de Alérgenos con Proteoliposoma por separado, en solución PBS a un pH de 7.0. Se agitó la mezcla lentamente durante 60 min a 150 rpm. Se comprobó la adsorción de las proteínas al gel de Aluminio monitoreando la absorbancia a 280 nm del sobrenadante de la suspensión. Por último se mezclaron los tres 23
preparados de alérgenos individuales en una sola suspensión, con agitación lenta durante 10 minutos. La adsorción de los alérgenos y del proteoliposoma se demostró mediante análisis del sobrenadante de la suspensión con ELISA para Der p 1, Der s 1 y Blo t 5 (INDOO Biotech, UK) y el método de Lowry para la determinación de proteínas. La actividad Alergénica residual (no adsorbida) se determinó según el Ejemplo 3. Se obtuvo más del 90 % de adsorción de los alérgenos en el gel y reducción de la actividad Alergénica a menos del 20 %. Se administraron dos dosis de 0.5 mL (3.33 pg de Der s 1 y Der p 1 y 1.17 pg de Blo t 5) del preparado a ratones Balb/c con un intervalo de tres semanas por vía intraperitoneal. Pasadas 7 semanas del inicio de la inmunización se determinaron los niveles de anticuerpos IgG inducidos, mediante ELISA. Se encontró la existencia de anticuerpos dirigidos contra los tres alérgenos en una proporción de alrededor de 2:2:1 , respectivamente a D. pteronyssinus, D. slboney y Blomia tropicalis. Los niveles de anticuerpos IgG observados fueron como promedio 80 % superiores a los obtenidos mediante la inmunización con la mezcla de los tres alérgenos en solución PBS. Breve Descripción de las Figuras: Figura 1 : La Figura 1 muestra que el esquema de corto (0-14 días) es menos inductor de IgE total que esquema largo (0-28 días). Sangramiento 0, 15 y 35 en esquema corto y 0, 28 y 35 días después de la inmunización en esquema, largo. Va, Proteoliposoma + Polisacárido de Nelsseria meningitidis serogrupo C + Al (OH)3; A, alérgeno; Al, Al (OH)3; 1 y 5, ^ig de A/ratón. Como puede observarse la respuesta de IgE es significativamente superior (p<0.5) en el grupo inmunizado con 5 de esquema largo que el de esquema corto aunque necesita dos dosis. De hecho la respuesta secundaria en el grupo con igual concentración del esquema corto, tiende a disminuir. Figura 2: Se observa que la concentración de alérgeno es menos inductora de IgE total. Sangramiento 0, 15 y 35 días después de la inmunización. Va, Proteoliposoma + Polisacárido de Neisseria meningitidis serogrupo C + Al (OH)3; A, alérgeno; Al, Al (OH)3; 0,5; 1,25 y 2,5, ^ig de A/ratón. Como puede observarse la inducción de IgE total por la concentración de 0.5 g de alérgeno esta a nivel del control con solo adyuvante (Va). Las otras dos concentraciones incrementan los niveles de IgE total.
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Figura 3: Muestra como la Inclusión del Alérgeno no afecta la respuesta de IgG anti-proteoliposoma (PLS). Sangramiento 0, 15 y 35 días después de la inmunización. Va, Proteoliposoma + Polisacárido de Neisseria meningitidis serogrupo C + Al (OH)3; A, alérgeno; Al, Al (OH)3; 0,5; ,25 y 2,5, µg de A/ratón. El preparado vacunal no afecta la respuesta de IgG anti-proteoliposoma, ni tras la primera ni segunda dosis en comparación con el adyuvante solo . Figura 4: Se observa que las subclases de IgG anti-proteoliposoma (PLS) no son afectadas por inclusión de alérgeno. Sangramiento 0, 15 y 35 días después de la inmunización. Va, Proteoliposoma + Polisacárido de Neisseria meningitidis serogrupo C + Al (OH)3; A, alérgeno; Al, Al (OH)3; 0,5; 1 ,25 y 2,5, µg de A/ratón. El preparado vacunal mantiene igual patrón de respuesta anti PLS a nivel de subclases que el adyuvante solo (Va) Figura 5: Muestra lgG2a anti-alergeno inducida por bajas concentraciones de alérgeno. Sangramiento 0, 15 y 35 días después de la inmunización. Va, Proteoliposoma (P) + Polisacárido de Neisseria meningitidis serogrupo C + Al (OH)3; A, alérgeno; Al, Al (OH)3; 0,5; 1 ,25 y 2,5, de A/ratón. Fig.A, con polisacárido y Fig.B sin polisacárido. Las dos concentraciones menores de alérgeno inducen respuesta de lgG2a antialergeno. Figura 6: Es referida a la determinación del IFNy contra el proteoliposoma (PLS). Las células de bazo fueron tomadas 7 días después de dos dosis (0 y 2 semanas) de inmunización, respectivamente. Va, Proteoliposoma + Polisacárido de Neisseria meningitidis serogrupo C + Al (OH)3; A, alérgeno; Al, Al (OH)3; 0,5; 1 ,25 y 2,5, \x,g de A/ratón; 1Va+Va-A0,5, dosis previa de Va. La inclusión de la menor concentración de alérgeno incrementa la respuesta de IFNy contra el PLS con respecto ai control (Va). Figura 7: Muestra la producción de IFNy contra el alérgeno y no afectación de una dosis previa del adyuvante. Las células de bazo fueron tomadas 7 días después de dos dosis de inmunización a los 0 y 2 semanas, respectivamente. Va, Proteoliposoma (P) + Polisacárido de Neisseria meningitidis serogrupo C + AI (OH)3; A, alérgeno; Al, Al (OH)3; 0,5; 1,25 y 2,5, µg de A/ratón; 1Va+Va-A0,5, dosis previa de Va. Fig.A, con polisacárido y Fig.B sin polisacárido. La respuesta de IFNy antialergeno se indujo por todas las concentraciones, pero fue muy 25
superior en la menor concentración. La aplicación previa del adyuvante no afectó esta respuesta. Figura 8: Se observa como las menores dosis de Alérgenos inducen mayores diferencias de IgG anti-alergeno al comparar preparado vacunal con el adjuvante Alúmina. Los sueros fueron tomados 14 días después de la segunda dosis. Estas fueron aplicadas a los o y 21 días. Va, Proteoliposoma + Polisacárido de Neisseria meningltidis serogrupo C + Al (OH)3; A, alérgeno; Al, Al (OH)3; 0,5; 1,25 y 2,5, g de A/ratón. Como puede observarse las menores dosis (0.5 y 1.125) inducen mayores incrementos en las respuesta de IgG antialergeno que la mayor dosis. Figura 9: Se refiere a la inducción de lgG2a antialergeno. Los sueros fueron tomados 14 días después de la segunda dosis. Estas fueron aplicadas a los o y 21 días. Va, Proteoliposoma + Polisacárido de Neisseria meningitidis serogrupo C + Al (OH)3; A, alérgeno; Al, Al (OH)3; 0,5; 1 ,25 y 2,5, µg de A/ratón. Como puede observarse todos los preparados vacunales inducen respuesta de lgG2a antialergeno. Esta no se induce por la concentración de 0.5 µg en alúmina y si con el adyuvante. Figura 10: Muestra la reducción de la IgE anti-alergeno en el preparado vacunal (Grupo V a VII) en comparación con controles positivos (Grupos III y IV) evaluados por anafilaxia cutánea pasiva. A, Alérgeno; Va, VA-MENGOC-BC® y Al, AL(OH)3. Los sueros fueron evaluados antes To, después de 1ra, T15 y 14 días después de 2da dosis, T35. Las respuesta en los grupos vacunales (V-VII) son menores que en los grupos inmunizados con alérgeno en alúmina (III y IV). No se observo respuesta en los controles negativos (I y II). Leyenda: -, ausente; +, presente; A, Alérgeno; Va, Proteoliposoma + polisacárido C de N. meningitidis + Alúmina (Al). Figura 11: Respuesta de anticuerpos hacia las formulaciones de alérgenos unidos covalentemente (conjugados) al Proteoliposoma. Los ratones fueron inmunizados con 2 dosis de 5 pg de Der s 1 , en diferentes variantes: Ds (alérgeno libre); Ds-PLS (conjugado con Proteoliposoma); [Ds-PLS]Alum (Conjugado adyuvado en Hidróxido de Aluminio. La respuesta fue evaluada en la semana 8 después de la primera inmunización. Las barras verticales indican la desviación estándar.