MXPA04009412A - Metodos neuroprotectores, composiciones y metodos para seleccion de los mismos. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere en general a metodos para proteger a una celula del sistema nervioso central de mamifero del dano, y a metodos para tratar o para mejorar enfermedades neurodegenerativas; la invencion se refiere adicionalmente a la seleccion de agentes neuroprotectores que pueden ayudar solos, con combinacion con otros agentes neuroprotectores, para proteger a las celulas del sistema nervioso central del dano atribuido a los compuestos neurotoxicos, radicales libres, o enfermedades neurodegenerativas; la invencion se refiere adicionalmente a composiciones farmaceuticas que comprenden la L-ergotioneina o compuestos recientemente identificados y vehiculos farmaceuticamente aceptables para la administracion a un mamifero que necesite de neuroproteccion.

Description

METODOS NEUROPROTECTORES. COMPOSICIONES Y METODOS PARA SELECCION DE LOS MISMOS REFERENCIA RECIPROCA A LAS SOLICITUDES RELACIONADAS La presente solicitud reclama prioridad a la solicitud provisional de los Estados Unidos número de serie 60/367,845 presentada el 28 de marzo del 2002, la descripción de la cual se incorpora en la presente invención como referencia en su totalidad. Los solicitantes reclaman el beneficio de la presente solicitud bajo 35 U.S. C. §119(e).

CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere en general a métodos neuroprotectores, y más específicamente a métodos para prevención del daño a las células del sistema nervioso central y a métodos para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas. Además, la invención provee métodos de selección para compuestos capaces de actuar como neuroprotectores, y para composiciones farmacéuticas útiles para tratar enfermedades neurodegenerativas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION La degeneración neuronal como un resultado de la enfermedad de Alzheimer, esclerosis múltiple, evento cerebrovascular, lesión cerebral traumática, lesiones de la médula espinal, y otros trastornos del sistema nervioso central es un enorme problema médico y de salud pública en virtud tanto de su alta incidencia y de la frecuencia de secuelas a largo plazo. Los estudios animales y ensayos clínicos han mostrado que los aminoácidos transmisores (especialmente glutamato), el estrés oxidativo y las reacciones inflamatorias contribuyen en gran medida a la muerte celular en estas condiciones. Después de la lesión o después del ataque isquémico, las neuronas dañadas liberan cantidades masivas del neu retransmisor glutamato, el cual es excitotóxico para las neuronas que lo rodean (Choi et al , (1988), Neuron 1 : 623-634; Rothman et al., (1984), J. Neurosci. 4: 1884-1891 ; Choi y Rothman, (1990), Ann. Rev. Neurosci. 13: 171-182; David et al., (1988), Exp. Eye Res. 46: 657-662; Drejer et al., (1985), J. Neurosci. 45: 145-151. Véase también la Patente de E.U.A. No. 5,135,956 y la Patente de E.U.A. No. 5,395,822, incorporadas en la presente invención como referencias en su totalidad. Varios estudios han mostrado la participación del glutamato en la patofisiología de la enfermedad de Huntington (HD) (Coyle y Schwarz, (1976), Nature 263: 244-246, enfermedad de Alzheimer (AD) (Maragos et al, (1987), TINS 10: 65-68, epilepsia (Nadler et al, (1978), Nature 271 : 676-677, latirismo (Spencer et al, (1986), Lancet 239: 1066-1067, esclerosis amiotrófica lateral (ALS) y clemencia Parkinsoniana de Guam (Calne et al, (1986), Lancet 2: 1067-1070) así como en la neuropatología asociada con el evento cerebrovascular, isquemia y reperfusión (Dykens et al, (1987), J. Neurochem. 49: 1222-1228). Por lo tanto, la lesión a las neuronas se puede ocasionar por sobre-estimulación de los receptores por aminoácidos excitadores incluyendo glutamato y aspartato (Lipton et al. (1994) New Engl. J. Med. 330: 613-621 ). De hecho, se sugiere que el subtipo N-metil-D-aspartato (NMDA) del receptor de glutamato tiene muchas funciones importantes en la función cerebral normal, incluyendo la transmisión sináptica, el aprendizaje y la memoria, y en el desarrollo neuronal (Lipston et al. (1994) anteriormente mencionado; Meldrum et al. (1990) Trends Pharm. Sci. 11 : 379-387). No obstante, la sobre-estimulación del subtipo NMDA del receptor de glutamato lleva a una liberación incrementada del radical libre y a la muerte de la célula neuronal, lo cual se puede modular mediante antioxidantes (Herin et al. (2001 ) J. Neurochem. 78: 1307-1314; Rossato et al. (2002) Neurosci. Lett. 318: 137-140). Adicionalmente, la inflamación y el estrés oxidativo son componentes clave de la patología de muchas condiciones neurodegenerativas crónicas, incluyendo la enfermedad de Alzheimer (AD). La enfermedad de Alzheimer (AD) se caracteriza por la acumulación de marañas neurofibrilares y placas seniles, y una degeneración progresiva extendida de neuronas en el cerebro. Las placas seniles son ricas en proteína precursora de amiloide (APP) que está codificada por el gen APP localizado en el cromosoma 21. Una hipótesis comúnmente aceptada que subyace a la patogénesis de la AD es que la escisión proteolítica anormal de la APP lleva a una acumulación extracelular excesiva del péptido beta-amiloide (?ß) que se ha mostrado que es tóxico a las neuronas (Selkoe et al., (1996), J. Biol. Chem. 271 : 487-498; Quinn et al., (2001 ), Exp. Neurol. 168: 203-212; Mattson et al., (1997), Alzheimer"s Dis. Rev. 12: 1 -14; Fakuyama et al., (1994), Brain Res. 667: 269-272). La enfermedad de Parkinson (PD) es un trastorno neurodegenerativo progresivo caracterizado por una disfunción del movimiento que consiste de aquinesia, rigidez, estremecimiento y anormalidades de la postura. Esta enfermedad ha sido asociada con la pérdida de integridad y funcionalidad neuronal dopaminérgica nigro-estriatal como se ha evidenciado por la pérdida substancial de neuronas dopaminérgicas en los pars compacta de la substantia nigra (SNpc) (Pakkenberg et al. (1991 ) J. Neurol. Neurosurg. Psychiat. 54: 30-33), y una disminución en el contenido, de transportadores sinápticos y vesiculares de dopamina en el striatum (véase, por ejemplo, Guttman et al. (1997) Neurology 48: 1578-1583). Los mecanismos precisos para la pérdida de neuronas dopaminérgicas pueden incluir un papel para las mutaciones en la ct-sinucleína (Golbe (1999) Movement Discord 14: 6-9), MAO-B (Mellick et al. (1999) Movement Discord 14: 219-224) y CYP2D6 (Sabbagh et al. (1999) Movement Discord 14: 230-236) en una sub-población de PD familiar, factores ambientales en casos esporádicos de PD (Gorell et al. (1998) Neurology 50: 1346-1350), y estrés oxidativo en los casos más comunes de PD idiopática (véase, por ejemplo, Olanow et al. (1999) Ann. Rev. Neurosci. 22: 123-144). Las marcas distintivas de la participación del estrés oxidativo incluyen la deportación de hierro (véase, por ejemplo, Sofic et al. ( 991 ) J. Neurochem. 56: 978-982), peroxidación de lípidos (Dexter et al. (1989) J. Neurochem. 52: 381-389), oxidación de proteínas (Alam et al. (1997) J. Neurochem. 69: 1326-1329), daño al ADN (véase, por ejemplo, Alam et al. (1997) J. Neurochem. 69: 1 196-1203), niveles disminuidos de glutationa (GSH) (véase, por ejemplo, Sian et al. (1994) Ann. Neurol. 36: 356-361 ), niveles incrementados de superóxido dismutasa (véase, por ejemplo, Yoritaka et al. (1997) J. Neurol. Sci. 148: 181-186) y bajos niveles asociados de antioxidantes tales como la vitamina C y la vitamina E, (de Rijk et al. (1997) Arch. Neurol. 54: 762-765) arguyendo fuertemente para la profilaxis del antioxidante en los trastornos neurodegenerativos. La L-ergotioneína (2-mercaptohistidina trimetilbetaína) ("ergotioneína") (fórmula 1) es un aminoácido que contiene azufre formado mediante la hercinina a partir de la histidina, metionina y cisteína en los microorganismos. La L-Ergotioneína no se biosintetiza en los animales, y por lo tanto solamente se obtiene a partir de fuentes de la dieta. Las concentraciones en sangre de la ergotioneína en casi todas las especies investigadas están cerca del intervalo milimolar (Cuadro 1 ). Se estima que la concentración de L-ergotioneína en el hombre está en el intervalo de 46 µ? a 183 µ?.

Fórmula 1. Estructura de la L-ergotioneína CUADRO 1 Concentración sanguínea de la L-ergotioneína en diversos animales BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La L-ergotioneína (EGT) es un radioprotector, antimutagénico, y elimina los singuletes de oxígeno, ácido hipocloroso, (HOC1), radicales hidroxilo, y radicales peroxilo (Hartman (1990) Meth. Enzymol. 259: 310-318; Akanmu et al. (1991 ) Arch. Biochem. Biophys. 288: 10-16). La L-ergotioneína inhibe la nitración dependiente de peroxinitrito del aminoácido tirosina y del ADN, y confiere homeostasis celular en las células neuronales probadas con la mezcla de N-acetil cisteína/peróxido de hidrógeno (Aruoma et al. (1999) Fd. Chem. Toxicol. 37: 1043- 053). La L-ergotioneína también inhibe la formación de xantina e hipoxantina, lo cual puede tener muchas implicaciones para las condiciones inflamatorias tales como la gota, una condición caracterizada por la sobreproducción de ácido úrico (el producto de oxidación de la xantina) (Aruoma et al. (1999), Food Chem. Toxicology 37: 1043-1053). No obstante, los mecanismos moleculares que subyacen a los efectos quimioprotectores del EGT permanecen en gran medida sin resolver. Un aspecto de la presente invención se dirige a los efectos neuroprotectores de la L-ergotioneína después de la administración a las células neuronales para prevenir los efectos del daño del agonista de glutamato N-metil-D-aspartato. Además, la presente invención se basa en parte en los resultados de los estudios presentados a continuación los cuales establecen que la inyección del agonista de glutamato N-metil-D-aspartato (NMDA) dentro del cuerpo vitreo del ojo de la rata produce diversos cambios morfológicos en la retina. El más evidente fue una reducción dramática en la densidad y el tamaño de las neuronas acompañado por una disminución en la proteína del precursor amiloide (APP) e inmunorreactividad de la proteína ácida fibrilar de la glia (GFAP). No obstante, en animales tratados con L-ergotioneína, la pérdida celular se redujo significativamente. Por lo tanto, los resultados establecen que la L-ergotioneína posee la capacidad de proteger a las células neuronales del daño. La evidencia adicional de los efectos neuroprotectores de la L-ergotioneína se muestra en la presente invención, en donde los efectos neuroprotectores de la L-ergotioneína están documentados en el modelo de enfermedad de Parkinson (PD) por lesión con 6-hidroxidopamina (6-OHDA). Como se muestra en el ejemplo a continuación, el número de células positivas a tirosina hidroxilasa (células TH+) en la substantia nigra y el contenido de dopamina estriatal en las ratas tratadas con el vehículo disminuyeron significativamente. El tratamiento de las ratas con L-ergotioneína antes de la lesión con 6-OHDA redujo marcadamente la pérdida tanto de células TH+ como del contenido de dopamina estriatal. Estos datos apoyan la capacidad de la L-ergotioneína para atravesar la barrera hematoencefálica y proveer protección significativa de la integridad y funcionalidad estriato-nigral. Por consiguiente, en un primer aspecto, la invención describe un método para proteger una célula del sistema nervioso central de mamífero (CNS) del daño, que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de L-ergotioneína a un mamífero que necesita de la misma. En una modalidad más específica, la célula del SNC de mamífero es una célula neuronal e incluye células del ganglio y células no del ganglio incluyendo todas las poblaciones neuronales bioquímicamente definidas tales como las neuronas colinérgicas, dopaminérgicas y GABA(ácido ?-aminobutírico)érgicas. En una modalidad más específica, las células dopaminérgicas son células positivas a tirosina hidroxilasa (TH+) de la substantia nigra. En una modalidad, el sujeto es un mamífero; en una modalidad específica, el mamífero es un sujeto humano. En una modalidad adicionalmente específica, la L-ergotioneína protege en contra del daño neuronal que se produce a partir de la (i) exposición a un compuesto neurotóxico, tal como el glutamato o un análogo del glutamato; otros compuestos neurotóxicos pueden incluir ciertos compuestos anti-cáncer. (ii) exposición a uno o más radicales libres y oxidantes tales como, por ejemplo, singuletes de oxígeno, radicales hidroxilo, radicales peroxilo, peroxinitrito, peróxido de hidrógeno, oxido nítrico, ácido hipocloroso (y otros ácidos hipohalurosos) y/o metaloenzimas. En incluso una modalidad adicional, la L-ergotioneína puede proteger en contra del daño neuronal ocasionado por el uso de radioterapia para el tratamiento de ciertos cánceres, incluyendo ciertos tumores cerebrales, en donde la radioterapia resulta en daño a las células y la liberación de radicales libres y antioxidantes. En otra modalidad, la L-ergotioneína puede proteger en contra del daño neuronal ocasionado por la presencia de un enfermedad neurodegenerativa, tal como por ejemplo, la enfermedad en Alzheimer, esclerosis múltiple, síndrome de Down, esclerosis amiotrófica lateral, enfermedad de Parkinson, lesión traumática al tejido neuronal tal como al cerebro o a la médula espinal, degeneración macular, VIH/SIDA y otras neuropatías ópticas y retinopatías. El método de la invención es útil con cualquier mamífero de interés. En una modalidad preferida, el mamífero es un ser humano. Una modalidad adicional podría ser para uso veterinario en el tratamiento de animales domésticos o animales domésticos que ha sufrido una lesión traumática. En modalidades adicionales, la L-ergotioneína se administra como un suplemento de la dieta en una cantidad efectiva para proveer protección a partir de compuestos neurotóxicos. En modalidades más específicas, el suplemento de dieta está en la forma de una cápsula oral o tableta. En incluso una modalidad adicional, la L-ergotioneína se puede ministrar sublingualmente o bucalmente. En una modalidad adicional, la L-ergotioneína se administra directamente al sitio de la lesión en una cantidad efectiva para inhibir el daño atribuido a la liberación de radicales libres y antioxidantes a partir de las células lesionadas y del tejido dañado. En el caso de una lesión traumática, tal como una lesión cerebral o de la médula espinal, la L-ergotioneína se puede administrar intratecalmente, intraventricularmente o intracranealmente. En un segundo aspecto relacionado, la invención describe un método para proteger a una célula neural de mamífero de la neurodegeneración, que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de L-ergotioneína a un mamífero que necesita de la misma. Una modalidad específica incluye un método para proteger a una célula neural de mamífero de la neurodegeneración mediante la administración de una composición farmacéutica que comprende L-ergotioneína y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Dichas composiciones farmacéuticas se pueden diseñar para administración oral, administración intravenosa, administración intramuscular, administración subcutánea, administración intratecal o administración ¡ntraventricular. Ciertas modalidades pueden incluir moléculas vehículo específicas que ayudan a que la L-ergotioneína atraviese la barrera hematoencefálica. En los experimentos descritos a continuación, se utilizó un ensayo retinal como un modelo animal ¡n vivo para determinar la capacidad neuroprotectora de la L-ergotioneína. El modelo retinal-vitreal es útil para la evaluación de la neurotoxicidad y para identificar compuestos capaces de proteger a las células neuronales del daño. Los compuestos identificados por los métodos de selección de la invención son útiles para proteger a las células de las condiciones y agentes neurodegenerativos, por ejemplo, incluyendo su uso para tratamiento y mejoría de la neurodegeneración que acompaña a las condiciones de enfermedad tales como la enfermedad de Alzheimer, esclerosis múltiple, síndrome de Down, esclerosis amiotrófica lateral, enfermedad de Parkinson, lesión traumática incluyendo lesión cerebral y lesión de la médula espinal, degeneración macular, VIH/SIDA y neuropatías ópticas y retinopatías. La corroboración de los efectos neuroprotectores de la L-ergotioneína también se demostraron en el modelo animal con 6-OHDA de la enfermedad de Parkinson, que se describe a continuación. Por consiguiente, en un tercer aspecto, la invención describe un método de selección para identificar compuestos capaces de proteger a las células del sistema nervioso central del daño, que comprende (a) la exposición (tratamiento) de las neuronas de la retina a los agentes neurotóxicos con y sin tratamiento con los compuestos prueba; y (b) determinar el efecto de los compuestos prueba sobre las poblaciones de neuronas de la retina, en donde los compuestos prueba capaces de incrementar la integridad neuronal se identifican como agentes neuroprotectores. Una modalidad adicional incluye un método de selección para identificar compuestos capaces de proteger a las células del sistema nervioso central (CNS) del daño, que comprende (a) tratar neuronas dopaminérgicas con 6-OHDA in vitro o in vivo con y sin tratamiento con un compuesto prueba; y (b) determinar el efecto del compuesto prueba sobre la población de neuronas dopaminérgicas, en donde un compuesto prueba capaz de incrementar la supervivencia celular se identifica como un agente neuroprotector. Es un objetivo adicional de la presente invención el proveer un método para proteger a las células del SNC de la degeneración y de la muerte celular como un resultado de la exposición a sustancias neurotóxicas, condiciones que dan lugar a las sustancias neurotóxicas, y condiciones de enfermedad las cuales ocasionan la neurodegeneración, mediante la provisión de una cantidad neuroprotectora de la L-ergotioneína sola, o en combinación con uno o más de otros agentes que ayudan a la protección de las células neuronales, o agentes que ayudan en la proliferación celular y la regeneración tisular. Estos otros agentes pueden ser moléculas orgánicas sintéticas pequeñas, péptidos, polipéptidos, ácidos nucleicos, polinucleótidos, nucleótidos antisentido, anticuerpos policlonales o monoclonales, u otros de dichos agentes que actúan para proteger a las células del sistema nervioso del daño. En algunas modalidades de la invención, la composición puede comprender adicionalmente al menos un eliminador de ROS. Los eliminadores de ROS adecuados incluyen a la coenzima Q, vitamina E, vitamina C, piruvato, melatonina, niacinamida, N-acetilcisteína, GSH, y nitronas. Los otros agentes así descritos pueden ser factores de crecimiento para las células neuronales y/o para el tejido neuronal. Estos pueden ser agentes que son ligandos para receptores particulares de las células nerviosas que, después de la unión, estimulan la regeneración tisular o la proliferación celular. El uso de terapia combinada mediante los métodos de la presente invención será impuesta por la condición neuronal específica y los factores causantes que llevan a dicha condición. Además, la L-ergotioneína se puede administrar junto con un segundo agente que se sabe que mejora la remiel inización y/o regeneración de neuronas. Los métodos para establecer las titulaciones de dosis específicas de la ergotioneína y de un segundo agente se conocen por aquellos expertos en la técnica. En incluso otro aspecto de la invención se provee un método para prevenir la muerte celular asociada con el daño agudo o crónico al tejido neuronal, el método comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un cóctel de antioxidantes para el cual al menos un miembro del cóctel es la L-ergotioneína. Otros objetivos y ventajas serán evidentes a partir de una revisión de la resultante descripción detallada tomada en conjunción con los siguientes dibujos ilustrativos.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS Las figuras 1A y 1 B son fotomicrografías que muestran la inmunorreactividad a APP en las retinas derecha (fig. 1A) e izquierda (fig. 1B) de un animal que recibió una inyección unilateral de NMDA al ojo izquierdo. Nótese que se observó una reducción en la inmunotinción de APP en la capa de células ganglionares en la retina inyectada con NMDA. GCL: capa de células ganglionares; INL: capa nuclear interna; ONL: capa nuclear externa. Escala de la barra: 100 µ?t?. Las figuras 2A y 2B son fotomicrografías que muestran la inmunorreactividad a GFAP en las retinas derecha a (fig. 2A) e izquierda (fig. 2B) de una rata que recibió inyecciones unilaterales de NMDA al ojo izquierdo. Las secciones retínales fueron contrateñidas ligeramente con violeta de cresilo. Nótese que se observó una reducción de la inmunotinción a GFAP en los astrocitos (flecha), los cuales están localizados principalmente sobre la superficie vitreal de la retina en la retina inyectada con NMDA. Las abreviaturas son las mismas que en la leyenda a las figuras 1A y 1 B. Escala de la barra: 100 µ?t?. Las figuras 3A a 3C son fotomicrografías que muestran células en la capa de células ganglionares de la retina en montajes totales de retinas teñidas con violeta de cresilo a partir de animales que recibieron inyecciones unilaterales intravitreales de solución con NMDA a los ojos izquierdos, e inyecciones intraperitoneales de L-ergotioneína (fig. 3A, 3B) o PBS (fig. 3C). Las figs. 3A y 3B son las retinas derecha (fig. 3A) e izquierda (fig. 3B) a partir de un animal tratado con L-ergotioneína y la fig. 3C es la retina izquierda a partir de una rata tratada con PBS. Nótese una pérdida significativa de neuronas en la capa de células ganglionares de la retina en la fig. 3B y en la fig. 3C, y que la retina está menos saludable en la fig. 3C en comparación con la fig. 3B. Escala de la barra: 100 µ??. La figura 4 es una gráfica que muestra el efecto del tratamiento con NMDA y su protección mediante L-ergotioneína. Las neuronas contadas se dividieron en dos grupos con cuerpos celulares más pequeños de 6 µ??, o iguales a o mayores de 6 µp? en diámetro. La gran mayoría de neuronas mayores de 76 µ?t? son células ganglionares de la retina. Las neuronas con cuerpos celulares más pequeños son principalmente células no ganglionares o células amácrinas desplazadas (* = p < 0.001 en comparación con el tratamiento con PBS). Figuras 5A y 5B. Efecto protector de la EGT sobre la citotoxicidad inducida por ?ß25-35 en células PC12. 5A. Las células PC12 se trataron con las cantidades indicadas de ?ß25-35 en la ausencia (círculos cerrados) o presencia (círculos abiertos) de EGT 1 mM por 36 horas a 37°C. Las células viables se determinaron utilizando el ensayo de reducción con MTT. La EGT se añadió al medio 30 minutos antes del tratamiento con ?ß25-35. 5B. Determinación de la viabilidad de las células PC12 por la liberación de la LDH después del tratamiento con 25 µ? de ?ß25-35 en la ausencia o presencia de las concentraciones indicadas de la EGT. Los valores son medias + S. D. (n=3). Hubo una diferencia significativa entre los grupos (*p < 0.05, **p < 0.01 ). Figuras 6A a 6D. Efecto protector de la EGT sobre la apoptosis inducida por ?ß25-35- Figs. 6A y 6B. Efecto de la L-ergotioneína sobre el marcado mediante corte terminal de la dUTP mediado por la deoxinucleotidil transferasa terminal (TUNEL), a, sin tratamiento, b, células PC12 expuestas a 25 µ? de ?ß25-35 por 36 horas; c, ?ß25-35 (25 M) + EGT (0.5 mM); d, ?ß25-35 (25 µ?) + EGT(1 mM). Hubo una diferencia significativa entre los grupos (*p < 0.05, **p < 0. 01 ). Figs. 6C y 6D. Efecto de la EGT sobre el potencial de la membrana mitocodrial. Se evaluó una ???t? con la fluorescencia TMRE como se describe en los materiales y métodos a continuación, a, sin tratamiento; b, células PC12 expuestas a 25 µ? de ?ß25-35 por 36 horas; c, ?ß2&.35 (25 µ?) + EGT (0.5 mM); d, ?ß25-35 (25 M) + EGT (1 mM).

Figuras 7 A a 7D. Efecto de la EGT sobre la ruta de señalización apoptótica inducida por ?ß25-35· Las células PC12 fueron incubadas con 25 M de ?ß25-35 por 36 horas en la presencia o ausencia de concentraciones indicadas de EGT y se cosecharon para análisis de Western blot. Figs. 7A y 7B: La escisión inducida por ?ß25-35 atenuada por EGT de la PARP como se determinó mediante el uso del anticuerpo anti-PARP. Los niveles de actina se midieron para la confirmación de las cantidades iguales de carga de la proteína. Figs. 7C y 7D: Efecto de la EGT sobre los niveles de Bax y Bcl-X¡_. Hubo una diferencia significativa entre los grupos (*p < 0.05, **p < 0.01 ). Figuras 8A a 8C. Efecto de la EGT sobre la formación de peroxinitrito y peroxidación de lípidos inducida por ?ß25-35. Fig. 8A: Micrografías confocales representativas de la fluorescencia derivada por DHR en las células PC 12 expuestas a ?ß25-35 solo o en combinación con EGT. Las condiciones de iluminación y de adquisición de la imagen se proporcionan en los materiales y métodos. Fig. 8B: análisis cuantitativo de la intensidad de fluorescencia por DHR después del tratamiento con ?ß25.35 en la ausencia o presencia de EGT. Fig. 8C. Efecto de la EGT sobre la peroxidación de lípidos en las células PC12. Las células PC12 se expusieron a 25 µ? de ?ß25-35 por 36 horas en la presencia o ausencia de las concentraciones indicadas de EGT. La peroxidación de lípidos se determinó mediante la medición de los niveles de malondialdehído (MDA) formado. La cantidad promedio de MDA en células control no tratadas fue de 2.01 nmoles/mg de proteína. Hubo una diferencia significativa entre los grupos (*p < 0.05, **p < 0.01).

Figuras 9A y 9B. Efecto de la EGT sobre la muerte celular inducida por el compuesto liberador del NO, SNP (fig. 9A) y mediante el SIN-1 que genera el peroxinitrito. (fig. 9B) La EGT ejerció una protección dependiente de la concentración de la muerte celular mediada por SIN-1 pero no de la muerte celular ocasionada por SNP. Las células viables se determinaron utilizando el ensayo de reducción mediante MTT. Los valores son las medias ± S. D. (n=3). Hubo una diferencia significativa entre los grupos (*p < 0.05, **p < 0.01 ). Figuras 10A y 10B. Fig. 10A. El efecto inhibidor de la EGT sobre la actividad de unión del ADN de NF-?? inducido por ?ß25-35. Los extractos nucleares preparados a partir de células PC12 tratadas con ?ß25-35 por 1 hora en la ausencia o presencia de concentraciones variables de EGT se sometieron a EMSA. Línea 1 , control con DMSO; línea 2, AP25-35 (25 µ?) solo; línea 3, ?ß25-35 (25 µ?) + EGT (0.5 mM); línea 4, ?ß25-35 (25 µ?) + EGT (1 mM). Fig. 10B. El efecto inhibidor de la EGT sobre la translocación nuclear de p65 inducida por ?ß25-35· Las células PC12 tratadas con ?ß25-35 por 1 hora se fijaron con 10% de solución neutra de formalina con pH regulado, luego se incubaron con el anticuerpo anti-p65 para inmunocitoquímica como se describe en materiales y métodos. Figura 1 1. Un mecanismo molecular propuesto para el efecto protector de la EGT en contra de la muerte celular nitrosativa inducida por ?ß.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Antes de que se describan los presentes métodos y composiciones, debe entenderse que esta invención no se limita a los métodos particulares, composiciones, y condiciones experimentales descritas, puesto que dichos métodos y compuestos pueden variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en la presente invención es solamente para el propósito de la descripción de modalidades particulares, y no se pretende que sea limitante, puesto que el alcance de la presente invención se limitará solamente por las reivindicaciones anexas. Como se utiliza en esta especificación y en las reivindicaciones anexas, las formas singulares "un", "una", y "el/la" incluyen referencias plurales a menos que el contexto claramente lo estipule de otra manera. Así por ejemplo, las referencias a "un ensayo de selección" incluyen uno p más ensayos, la referencia a "la formulación" o "el método" incluye una o más formulaciones, métodos, y/o pasos del tipo descrito en la presente invención y/o los cuales serán evidentes a aquéllas personas expertas en la técnica después de la lectura de esta descripción y así sucesivamente. A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente invención tienen el mismo significado como se entiende comúnmente por un experto en la técnica al cual pertenece esta invención. Aunque cualesquiera métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en la presente invención pueden ser utilizados en la práctica o evaluación de la presente invención, los métodos y materiales preferidos se describen a continuación. Todas las publicaciones mencionadas en la presente invención se incorporan en la presente invención como referencia para revelar y describir los métodos y/o materiales en conexión con los cuales se citan las publicaciones.

Definiciones Un "anticuerpo" es una inmunoglobulina, incluyendo anticuerpos y fragmentos de los mismos, tales como Fab o F(ab')2 que se unen a un epítope específico. El término abarca, entre otros, anticuerpos policlonales, monoclonales, y quiméricos, los últimos mencionados se describen con mayor detalle en las Patentes de E.U.A. Nos. 4,816,397 y 4,816,567. El término también abarca anticuerpos humanos y/o humanizados. Una preparación de anticuerpo es reactiva para un antígeno particular cuando al menos una porción de las moléculas de inmunoglobulina individuales en la preparación reconocen (por ejemplo, se unen) al antígeno. Una preparación anticuerpo es no-reactiva para un antígeno cuando la unión de las moléculas individuales de inmunoglobulina en la preparación al antígeno no se detecta mediante los métodos comúnmente utilizados. El término "substancialmente puro", cuando se refiere a un polipéptido, significa un polipéptido que está al menos 60%, en peso, libre de las proteínas y de las moléculas orgánicas que se presentan naturalmente con las cuales está naturalmente asociado. Una composición substancialmente pura de L-ergotioneína es de al menos 75%, más preferiblemente de al menos 90%, y más preferiblemente de al menos 99%, en peso, de L-ergotioneína. La L-ergotioneíha se puede obtener, por ejemplo, mediante síntesis química o mediante aislamiento a partir de fuentes naturales. La pureza se puede medir mediante cualquier método apropiado, por ejemplo, cromatografía en columna, electroforesis de gel de poliacrilamida, análisis CLAR, y métodos quirales. La pureza quiral es importante y se puede ensayar mediante métodos conocidos, incluyendo cromatografía quiral o rotación óptica. "Tratamiento" se refiere a la administración de la medicina o a la realización de los procedimientos médicos con respecto a un paciente, para cualquier profilaxis (prevención) o para curar la dolencia o enfermedad en el lugar en donde e paciente está afligido. Una "cantidad terapéuticamente efectiva" o "cantidad eficaz" es una cantidad de un reactivo suficiente para lograr el efecto de tratamiento deseado. Una "cantidad neuroprotectora efectiva" es una cantidad de L-ergotioneína que es suficiente para proteger en contra de la pérdida neuronal. Las cantidades efectivas para este uso dependerán de la severidad de la condición, el estado general del paciente, la ruta de administración, y otros factores conocidos por aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, las dosis de L-ergotioneína o de otros compuestos identificados por los métodos de la presente invención, que protegen en contra de la muerte de célula neuronal, pueden tener un intervalo de 10 mg a 10 gramos diariamente, dependiendo de la severidad de la enfermedad y de los tipos específicos de tratamiento, y de si el compuesto se administra en combinación con otro compuesto utilizado para promover la proliferación celular o la regeneración tisular, la supervivencia celular o el exocrecimiento de procesos neuronales. El término "efectos tópicos" significa que el "factor neurotrófico" de la presente invención tiene efectos selectivos sobre los elementos neuronales específicos que contribuyen a la supervivencia, crecimiento, maduración y regeneración de neuronas presentes en el tejido nervioso. " ucosal" se refiere a los tejidos en el cuerpo que secretan moco; por lo tanto abarcando la cavidad oral (nariz, garganta, y boca), e tracto digestivo (incluyendo los intestinos), así como el recto y la vagina. "Transmucosal" se refiere al paso de materiales al otro lado o a través de las membranas mucosales. "Sublingual" se refiere al área bajo la lengua. "Administración sublingual" se refiere a la administración sistémica de fármacos o de otros agentes a través de las membranas mucosales que revisten el piso de la boca. "Bucal" se refiere al área de las mejillas en la boca. "Administración bucal" se refiere a la administración de fármacos o de otros agentes a través de las membranas mucosales que revisten las mejillas (mucosa bucal).

ASPECTOS GENERALES DE LA INVENCION El hallazgo de medios para proteger a las células neuronales de los efectos de sustancias tóxicas es de evidente importancia médica. Se sabe que muchas sustancias presentes en el medio ambiente que rodea a la célula pueden influir sobre la muerte celular o supervivencia. En particular, la muerte celular se puede atribuir a la presencia de sustancias tales como glutamato, complemento, factor de necrosis tu moral-a interferón gama u otras citocinas, así como a especies reactivas de oxígeno (ROS) o a especies reactivas de nitrógeno (RNS). Estos compuestos tóxicos, así como otros, han sido asociados con una gran variedad de condiciones en las cuales las células mueren y dicha muerte celular ocasiona consecuencias clínicas severas. Tal es el caso de muchas condiciones que afectan al sistema nervioso. Por lo tanto, Es un asunto de gran importancia el identificar los compuestos terapéuticos o combinaciones de los mismos que podrían prevenir dicha muerte celular y los cuales se podrían aplicar en un procedimiento clínico. Además, la identificación de agentes que actúan como neuroprotectores en una variedad de situaciones en donde dicha actividad neuroprotectora es deseable, tal como en lesiones nerviosas agudas o crónicas, por ejemplo, lesión cerebral traumática o lesión de la médula espinal, o en otras enfermedades o condiciones que afectan al sistema nervioso central es de la mayor importancia. Además, la identificación de agentes que actúan como neuroprotectores, y los cuales muestran una eficiencia incrementada cuando se combinan con otros agentes que mejoran o que promueven la división celular, supervivencia celular y exocrecimiento de procesos neuronales encontrará un uso importante en muchas aplicaciones clínicas, que se extienden desde el tratamiento de trastornos degenerativos crónicos hasta la lesión aguda. Por ejemplo, el tratamiento de pacientes con esclerosis múltiple durante una recaída aguda podría reducir de manera imaginable la destrucción de oligodendrocitos que ocurre en las lesiones de estos pacientes. Incluso adicionalmente, el uso de los agentes de la presente invención podría ser extremadamente benéfico cuando se utilizan solos o en combinación con uno o más regímenes de tratamiento adicionales en condiciones tales como el evento cerebrovascular o la enfermedad de Alzheimer o la enfermedad de Parkinson en donde la muerte de la célula neuronal en progreso lleva a la pérdida adicional de la función en pacientes que tienen estos trastornos. Además, se reconoce generalmente que muchos procesos de enfermedad se atribuyen a la presencia de niveles elevados de radicales libres y de especies reactivas de oxígeno (ROS) y especies reactivas de nitrógeno (RNS), tales como superóxido, peróxido de hidrógeno, singuletes de oxígeno, peroxinitrito, radicales hidroxilo, ácido hipocloroso (y otros ácidos hipohalu rosos) y oxido nítrico. En el ojo, la catarata, la degeneración macular y el daño degenerativo retinal se atribuyen a ROS. Entre otros órganos y sus enfermedades relacionadas con ROS se incluyen: cáncer de pulmón inducido por productos de combustión de tabaco y asbestos; envejecimiento acelerado y sus manifestaciones, incluyendo daño a la piel; aterosclerosis; isquemia y lesión por reperfusión, enfermedades del sistema nervioso tales como la enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, distrofia muscular, esclerosis múltiple; enfermedades del pulmón incluyendo enfisema y disfasia broncopulmonar; enfermedades por sobrecarga de hierro tales como hemocromatosis y talasemia; pancreatitis; enfermedades renales incluyendo el síndrome nefrótico autoinmune y nefrotoxicidad inducida por un metal pesado; y lesiones por radiación. Ciertos fármacos anti-neoplásticos tales como la adriamicina y la bleomicina inducen daño oxidativo severo, especialmente al corazón, limitando la exposición del paciente al fármaco. Los metales Redox activos tales como el hierro inducen el daño oxidativo a los tejidos; los químicos industriales y etanol, mediante exposición y su consumo, inducen una serie de lesiones relacionadas con el daño oxidativo, tales como cardiopatías y daño hepático. Los contaminantes industriales transportados por el aire y los contaminantes basados en petroquímicos, tales como el ozono, oxidó nítrico, partículas radioactivas, e hidrocarburos halogenados, inducen el daño oxidativo a los pulmones, tracto gastrointestinal, y otros órganos. El envenenamiento por radiación a partir de fuentes industriales, incluyendo fugas a partir de reactores nucleares y la exposición a las armas nucleares, son otras fuentes de radiación y de daño por radicales. Otras rutas de exposición pueden presentarse por vivir o trabajar en proximidad a fuentes de radiación electromagnética, tales como plantas de energía eléctrica y líneas de energía de alto voltaje, máquinas de rayos X, aceleradores de partículas, antenas de radares, antenas de radio, y los similares, así como el uso de productos electrónicos y artefactos los cuales emiten radiación electromagnética tales como teléfonos celulares, y monitores de televisión y de cómputo. La presente invención provee métodos para proteger específicamente a las células neuronales del cuerpo de mamíferos del daño atribuido a sustancias neurotóxicas mediante la aplicación o administración de una composición que comprende L-ergotioneína y un vehículo adecuado. Las sustancias neurotóxicas pueden ser agentes tales como el glutamato o análogos del glutamato, o pueden ser agentes anticáncer u otros agentes útiles para tratar condiciones diferentes a los trastornos del sistema nervioso. La L-ergotioneína puede proteger en contra del daño neuronal que resulta de la exposición a citocinas tales como, por ejemplo, factor de necrosis tumoral alfa o interferón gama, o uno o más radicales libres y antioxidantes tales como, por ejemplo, singuletes de oxígeno, radicales hidroxilo, radicales peroxilo, peroxinitrito, peróxido de hidrógeno, oxido nítrico, ácido hipocloroso (y otros ácidos hipohalurosos) y/o metaloenzimas. Otros efectos neurotóxicos para los cuales la L-ergotioneína puede ser benéfica pueden resultar a partir de la.terapia con radiación o la liberación de radicales libres a partir de células después de una lesión al tejido neural, tal como un trauma cerebral, un evento cerebrovascular, o una lesión a la médula espinal. En otra modalidad, la L-rrgotioneína puede proteger en contra del daño neural ocasionado por la presencia de una enfermedad neurodegenerativa, tal como por ejemplo, enfermedad de Alzheimer, esclerosis múltiple, síndrome de Down, esclerosis amiotrófica lateral, enfermedad de Parkinson, degeneración macular, VIH/SIDA y neuropatías ópticas y retinopatías. La naturaleza multifuncional de la L-ergotioneína la hace un candidato para investigación de su uso terapéutico en condiciones tales como en la enfermedad de Parkinson (PD). Un aspecto de la presente invención se basa en parte en el descubrimiento de las propiedades neuroprotectoras observadas para la L-ergotioneína en el modelo de PD en rata con lesión unilateral por 6-hidroxidopamina (6-OHDA). La integridad, por ejemplo, número de cuerpos de células dopaminérgicas en la substantia nigra se estimó mediante la inmunotinción para tirosina hidroxilasa (TH) y la funcionalidad de los niveles de dopamina estriatal estimados mediante CLAR del sistema dopaminérgico nigro-estriatal fueron investigados. La TH es la enzima limitante de velocidad en la síntesis de la dopamina. Además, las mismas propiedades multifuncionales de la L-ergotioneína que la hacen un candidato para uso en la enfermedad de Parkinson también la hacen aplicable para uso en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer. Como se mencionó previamente, la enfermedad de Alzheimer (AD) es un trastorno neurodegenerativo crónico y está caracterizado por la acumulación de marañas neurofíbrilares y placas seniles, y una degeneración progresiva extendida de neuronas en el cerebro. Las placas seniles son ricas en la proteína del precursor amiloide (APP) que se codifica por el gen APP localizado en el cromosoma 21. Una hipótesis comúnmente aceptada que subyace a la patogénesis de la AD es que la escisión proteolitica anormal de la APP lleva a un exceso en la acumulación extracelular del péptido beta-amiloide (?ß) que se ha mostrado que es tóxico a las neuronas (Selkoe et al., (1996), J. Biol. Chem. 271 : 487-498; Quinn et al., (2001), Exp. Neurol. 168: 203-212; Mattson et al., (1997), Alzheimer's Dis. Rev. 12: 1-14; Fakuyama et al., (1994), Brain Res. 667: 269-272). La inyección de neurotoxinas, por ejemplo, los péptidos agregados ß-amiloide, dentro del cuerpo vitreo de ratas producen degeneración severa en las neuronas de la retina. Estos efectos se pueden mejorar hasta cierto grado mediante el co-tratamiento con una inyección particular del antioxidante vitamina ? (Jen et al. (1998) N ature 392: 140-141). Esto sugiere que el estrés oxidativo in vivo desempeña un papel en la causa de la degeneración de neuronas en la retina. La retina de mamíferos es una parte integral del sistema nervioso central pero se encuentra localizada periféricamente y por lo tanto es altamente accesible de manera experimental. La retina tiene una estructura organizada con poblaciones de la gira y poblaciones neuronales bioquímicamente y estructuralmente definidas. Además, éste es un sistema cerrado y provee una manera ideal de evaluar la efectividad de compuestos químicos específicos que se sabe que son neuroprotectores o neurotóxicos. Como se muestra en la presente solicitud, la inyección de péptidos agregados de ß-amiloide, ?ß25-35 (?ß) dentro del cuerpo vitreo de ratas produce la degeneración severa de neuronas en la retina. Además, se presentan datos en la presente solicitud los cuales apoyan los efectos benéficos de la L-ergotioneína y sugieren su potencial para uso como única terapia establecida en la enfermedad de Alzheimer, o es potencial para uso en combinación con otros agentes o regímenes en la atenuación de la progresión de la enfermedad de Alzheimer. El método de la invención es útil con cualquier mamífero de interés. En una modalidad particular, el mamífero es un ser humano. Una modalidad adicional podría ser para uso veterinario en el tratamiento de animales domésticos y animales no domésticos que han padecido de una lesión traumática. En modalidades adicionales, la L-ergotioneína se administra como un suplemento dietético en una cantidad efectiva para proveer protección a partir de compuestos neurotóxicos. En modalidades más específicas, el suplemento dietético está en la forma de una cápsula oral o tableta o una suspensión líquida. Otras modalidades incluyen la administración de la L-ergotioneína en una forma adecuada para administración sublingual o bucal. Modalidades adicionales incluyen la administración de la L-ergotioneína en una forma de supositorio. Incluso otras modalidades incluyen las formulaciones de la L-ergotioneína adecuada para administración intratecal, intraventricular o intracraneal. La modalidad específica utilizada se impone por la condición del paciente a ser tratado. En ciertas condiciones, tal como después de un evento cerebrovascular, la capacidad del paciente para ingerir está comprometida, por lo tanto existe la necesidad de administrar la L-ergotioneína u otros compuestos activos identificados por los métodos de la presente invención mediante una ruta que no implique la ingesta. En una modalidad adicional, la L-ergotioneína se administra directamente al sitio de la lesión en una cantidad efectiva para inhibir el daño atribuido a la liberación de radicales libres y antioxidantes a partir de células lesionadas y tejido dañado. En el caso de una lesión traumática, tal como una lesión cerebral o una lesión aguda o crónica de la médula espinal, la L-ergotioneína se puede administrar intratecalmente, intracranealmente o intraventricularmente. En un segundo aspecto relacionado, la invención describe un método para proteger a una célula neuronal de mamífero de la neurodegeneración, que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de L-ergotioneína a un mamífero que necesite de la misma. Una modalidad específica incluye un método para proteger a una célula neural de mamífero de la neurodegeneración mediante la administración de una composición farmacéutica que comprende L-ergotioneina y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Dichas composiciones farmacéuticas se pueden diseñar para administración oral, administración intravenosa, administración intramuscular, administración subcutánea, administración intratecal o administración intraventricular. Ciertas modalidades pueden incluir moléculas vehículo específicas que ayudan en el paso de la ergotioneína a través de la barrera ematoencefálica. Es un objetivo adicional de la presente invención el proveer un método para proteger a las células del SNC a partir de la degeneración y de la muerte celular como resultado de la exposición a sustancias neurotóxicas, condiciones las cuales dan lugar a sustancias neurotóxicas, y condiciones de enfermedad las cuales ocasionan la neurodegeneración, mediante la administración de una cantidad neuroprotectora de L-ergotioneína sola, o en combinación con uno o más de otros agentes que ayudan en la protección de las células neuronales, o agentes que ayudan en la proliferación celular y regeneración tisular. Estos otros agentes pueden ser compuestos orgánicos sintéticos pequeños, proteínas, péptidos, polipéptidos, ácidos nucleicos, polinucleótidos, oligonucleótidos antisentido, anticuerpos policlonales o monoclonales, u otros de dichos agentes que actúan en la protección de células del sistema nervioso a partir del daño o que promueven la supervivencia de la célula y/o que promueven la regeneración tisular y/o la remielinación. En algunas modalidades de la invención, la composición puede comprender adicionalmente al menos un eliminador de ROS. Los eliminadores de ROS adecuados incluyen a la coenzima Q, vitamina E, vitamina C, piruvato, melatonina, niacinamida, N-acetilcisteína, GSH, y nitronas. Los otros agentes así descritos pueden ser factores de crecimiento para células y/o tejido neuronal. Estos pueden ser agentes que son ligandos para receptores particulares en células nerviosas que, después de la unión, estimulan la regeneración tisular o la proliferación celular. El uso de terapia combinada por los métodos de la presente invención será impuesta por la condición neuronal específica y los factores causales que llevan a dicha condición. Además, la L-ergotioneína se puede administrar junto con un segundo agente que se sabe que mejora la remielinización y/o regeneración de las neuronas. Los métodos para establecer las titulaciones de dosis específicas de la L-ergotioneína y de un segundo agente se conocen por aquellos expertos en la técnica. En incluso otro aspecto de la invención se provee un método para prevenir la muerte celular asociada con lesión aguda o crónica del tejido neuronal, el método comprendiendo la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un cóctel de antioxidantes para el cual al menos un miembro del cóctel es L-ergotioneína. El segundo antioxidante puede ser, por ejemplo, vitamina C o vitamina E. Las proteínas útiles en terapia de combinación con la L-ergotioneína pueden ser factores neurotróficos. Los factores neurotróficos son una clase de moléculas que han sido inicialmente identificadas como participantes en el desarrollo de los sistemas nerviosos de vertebrados al facilitar la interacción de las neuronas con sus células blanco. Se ha observado que la competencia entre neuronas por dichas células blanco toma lugar y que solamente sobrevivirán aquellas neuronas que logran dicha interacción (Leibrock et al., 1989, Nature, 341 :149; Hohn et al., 1990, Nature, 344: 339). Por consiguiente, dichos factores neurotróficos promueven la supervivencia y la actividad funcional de las células nerviosas o de las células de la glia. También existe evidencia que sugiere que los factores neurotróficos serán útiles como tratamientos para prevenir la muerte de células nerviosas o de células de la glia o malformaciones que resultan a partir de las condiciones enumeradas anteriormente (Appel, 1981 , Ann. Neurology, 10: 499; Patentes de E.U.A. Nos. 4,699,875 y 4,701 ,407 a Appel; Patente de E.U.A. No. 4,923,696 a Appel et al.). El mejor caracterizado de dichos factores neurotróficos es el factor de crecimiento nervioso (NGF). Se ha demostrado que el NGF es un factor neurotrófico para las células nerviosas colinérgicas del cerebro anterior que mueren durante la enfermedad de Alzheimer y con el envejecimiento. Generalmente la pérdida de estas células nerviosas se considera responsable : de muchas de las deficiencias cognitivas asociadas con la enfermedad de Alzheimer y con la edad avanzada. Los experimentos en animales demostraron que el NGF previene la muerte de las células nerviosas colinérgicas del cerebro anterior después de lesión traumática y que el NGF puede revertir las pérdidas cognitivas que ocurren con la edad (Hefti & Weiner, 1986, Ann. Neurology, 20: 275; Fischer et al., 1987, Nature, 329: 65). Estos resultados sugieren la utilidad clínica potencial en humanos de este factor neurotrófico en el tratamiento de pérdidas cognitivas que se producen por la muerte de células nerviosas colinérgicas del cerebro anterior por enfermedad, lesión o envejecimiento. Otros factores neurotróficos han sido aislados y caracterizados, entre ellos el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) (Leibrock et al., anteriormente mencionado.); una variante denominada factor neurotrófico derivado del hipocampo (HDNF) (Ernfors et al., 1990, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 87: 5454); neurotrofina-3 (NT-3) (Hohn et al., anteriormente mencionado.; Maisonpierre et al., 1990, Science, 247: 1446; Rosenthal et al., 1990, Neuron, 4: 767); y el factor neurotrófico ciliar (CNTF) (Kishimoto, T., Taga, T., y Akira, S. Cell, 76: 252-262, 1994; Stahl, N. y Yancopoulos, G. D., Cell 74: 587- 590, 1994). Todos los precedentes se incorporan en la presente invención como referencias. Otros agentes que pueden ser utilizados en conjunción con la L-ergotioneína o con los agentes novedosos identificados por los métodos de la presente invención pueden ser ligandos que estimulan la proliferación y la supervivencia celular. Por ejemplo, estos ligandos pueden incluir aquellos que se unen a y que activan a las proteínas cinasas del receptor y a receptores asociados con las tirosina cinasas (van der Geer, P., Hunter, T. y Lindberg, R. A., Ann. Rev. Cell Biol. 10: 251-337, 1994). Estos pueden ser ligandos agonistas para ¡ntegrinas (Chothis, C. y Jonnes, E. Y., Ann. Rev. Biochem. 66: 823-862, 997). Dichas moléculas pueden incluir a la laminina, la cual se sabe en la técnica que promueve el exocrecimiento de neuritas (Bates, C. A. y Meyer, R. L, Dev. Biol. 181 : 91-101 , 1997). Otras moléculas se pueden derivar a partir de la superfamilia de inmunoglobulinas (Walsh, F. S. y Doherty, P. Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 13: 425- 456, 1997). También es posible desarrollar moléculas que actúan como imitadores del receptor que exhiben las mismas propiedades que el ligando agonista nativo. Todo lo anterior puede ser adecuado para uso en conjunción con la L-ergot¡oneína o con los agentes neuroprotectores novedosos identificados por los métodos de la presente invención. Los experimentos presentados a continuación muestran que la L-ergotioneína en la dieta fue efectiva para proteger a las neuronas de la retina, y que el efecto neuroprotector fue más pronunciado para la población de células ganglionares en comparación con la población de células no ganglionares. Hubo una ligera reducción en la densidad celular y/o en la degeneración de la población neuronal total en la retina no inyectada, sugiriendo un efecto no específico y sistémico de inyección unilateral de los compuestos químicos neurotóxicos. No obstante, los experimentos demuestran que la inyección intraperitoneal de la ergotioneína protegió a las neuronas de la degeneración inducida experimentalmente o de la pérdida debido a la toxicidad por NMDA, por lo tanto también demostró su capacidad para atravesar la barrera hematoencefálica. Además, se muestra que el sistema retinal en los mamíferos es un modelo experimental in vivo útil para estudiar factores que afectan el desarrollo, función, o supervivencia neuronales.

Composiciones farmacéuticas y métodos de administración La presente invención también provee composiciones farmacéuticas utilizadas en el método de la invención. Dichas composiciones comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de la L-ergotioneína, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una modalidad particular, el término "farmacéuticamente aceptable" significa que está aprobada por una agencia reguladora del gobierno federal o un gobierno estatal o que está listada en la Pharmacopeia de los Estados Unidos o en otra pharmacopeia generalmente reconocida para uso en animales, y más particularmente en humanos. El término "vehículo" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente, o vehículo con el cual se administra el agente terapéutico. Dichos vehículos farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluyendo aquellos de origen de petróleo, de origen animal, de origen vegetal o sintéticos, tales como el aceite de cacahuate, el aceite de soya, el aceite mineral, el aceite de ajonjolí y los similares. El agua es un vehículo preferido cuando la composición farmacéutica se administra intravenosamente. Las soluciones salinas y las soluciones acuosas de dextrosa y de glicerol también se pueden emplear como vehículos líquidos, particularmente para soluciones inyectables. Dichos excipientes farmacéuticos incluyen el almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche descremada deshidratada, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y los similares. La composición, si se desea, también puede contener cantidades menores de agentes humectantes o emulsificantes, o agentes reguladores del pH. Estas composiciones pueden tomar la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, tabletas, pildoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación sostenida y las similares. La composición se puede formular como un supositorio, con aglutinantes y vehículos tradicionales tales como triglicéridos. La formulación oral puede incluir vehículos estándares tales como grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio, etcétera. Los ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences" por E. W. Martin. Dichas composiciones contendrán una cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto, preferiblemente en forma pura, junto con una cantidad adecuada del vehículo de manera que se provea la forma para la administración adecuada al sujeto. La formulación de convenir al modo de administración. Los compuestos de la invención se pueden formular como formas neutras o sales. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen aquellas formadas con grupos amino libres tales como aquellos derivados a partir del ácido clorhídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etcétera, y aquellos formados con grupos carboxilo libres tales como aquellos derivados a partir del sodio, potasio, amonio, calcio, hidróxidos férricos, isopropilamina, trietilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína, etcétera. La administración de la L-ergotioneína en el sitio de la lesión, las células blanco, tejidos, u órganos, pueden ser por medio de administración oral como una pildora o cápsula o una formulación líquida o suspensión. Esta se puede administrar mediante la ruta transmucosal, sublingual, nasal, rectal o transdermal. La administración parenteral también puede ser mediante inyección intravenosa, o intraarterial, intramuscular, intradermal, subcutánea, ¡ntraperitoneal, ¡ntraventricular, intratecal y administración intracraneal. Por ejemplo, la composición de la presente invención puede ser infusionada directamente dentro de un tejido u órgano que ha tenido un infarto, tal como el cerebro o el corazón después de un evento cerebrovascular o ataque cardiaco, con el objeto de proteger a las mitocondrias en las células de la región isquémica, aquellas que se encuentran por fuera de la zona inmediata al infarto las cuales no fueron eliminadas durante el cese de flujo sanguíneo pero que llevaron a cabo un daño extensivo mediado por ROS cuando el flujo sanguíneo se restableció. Debido la naturaleza de las enfermedades o condiciones neurológicas para las cuales la presente invención ha sido considerada, la ruta de administración también puede implicar la administración mediante supositorios. Esto es especialmente cierto en condiciones tales como un evento cerebrovascular debido al cual la capacidad del paciente para ingerir está comprometida. La L-ergotioneína se puede proveer como una formulación en liposoma. La administración de liposomas ha sido utilizada como un sistema de administración farmacéutica para otros compuestos para una variedad de aplicaciones. Véase, por ejemplo Langer (1990) Science 249: 1527-1533; Treat et al. (1989) en Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cáncer, Lopez-Berestein y Fidler (eds. ), Liss: New York, pp. 353-365 (1989). Muchas formulaciones adecuadas de liposomas se conocen por aquellos expertos en la técnica, y se pueden emplear para los propósitos de la presente invención. Por ejemplo, véase: Patente de E.U.A. No. 5,190,762.

En un aspecto adicional, los liposomas con L-ergotioneína pueden atravesar la barrera hematoencefálica, lo cual podría permitir la administración intravenosa u oral. Están disponibles muchas estrategias para atravesar la barrera hematoencefálica, incluyendo pero no limitadas a, incrementar la naturaleza hidrófoba de una molécula; introducir la molécula como un conjugado a un vehículo, tal como transferrina, dirigido a un receptor en la barrera hematoencefálica; y los similares. En otra modalidad, la molécula se puede administrar intracranealmente o, más preferiblemente, intraventricularmente. En incluso otra modalidad, la L-ergotioneína se puede administrar en un liposoma dirigido hacia la barrera hematoencefálica. : También se contempla la administración transdermal de la L-ergotioneína, ya sea como una formulación en liposoma o como L-ergotioneína libre. Se conocen en la técnica diversos y numerosos métodos para la administración transdermal de un fármaco, por ejemplo, mediante un parche transdermal. Se puede apreciar fácilmente que una ruta transdermal de administración se puede mejorar mediante el uso de un potenciador de la penetración dermal. Las formulaciones orales de liberación controlada pueden ser deseables cuando se practica el método neuroprotector de la invención. El fármaco se puede incorporar dentro de una matriz inerte la cual permite la liberación mediante ya sea difusión o mecanismos de lixiviación, por ejemplo, gomas. Las matrices de degeneración lenta también se pueden incorporar dentro de la formulación. Algunos revestimientos entéricos también tienen un efecto de liberación retrasada. Otra forma de una liberación controlada de este terapéutico es mediante un método basado en el sistema terapéutico de Oros (Alza Corp.), por ejemplo el fármaco se encierra en una membrana semipermeable la cual permite que entre el agua y presiona al fármaco hacia fuera a través de un pequeño orificio particular debido a los efectos osmóticos. La administración pulmonar de la L-ergotioneína también se puede utilizar para tratamiento. Se contemplan para uso en la práctica de esta invención un amplio intervalo de dispositivos mecánicos diseñados para la administración pulmonar de productos terapéuticos, incluyendo pero no limitadas a nebulizadores, inhaladores de dosis medida, e inhaladores en polvo, todos los cuales son familiares a aquellos expertos en la técnica. Con respecto a la construcción del dispositivo para administración, cualquier forma de aerosolización conocida en la técnica, incluyendo pero no limitada a botellas para aspersión, nebulización, atomización o bomba para aerosolización de una formulación líquida, y aerosolización de una formulación de polvo en seco, se puede utilizar en la práctica de la invención. La administración oftálmica y nasal de la L-ergotioneína se puede utilizar en el método de la invención. La administración nasal permite el paso de una composición farmacéutica de la presente invención a la corriente sanguínea directamente después de administrar el producto terapéutico a la nariz, sin la necesidad de depositación del producto en el pulmón. Las formulaciones para administración nasal incluyen aquellas con dextrano o ciclodextrinas. Para la administración nasal, un dispositivo útil es una botella dura, pequeña a la cual se le une un aspersor de dosis medida. En una modalidad, la dosis medida se administra mediante la contención de la composición farmacéutica de la presente invención dentro de una cámara de volumen definido, dicha cámara tiene una abertura dimensionada para aerosolizar y una formulación en aerosol mediante la formación de una aspersión cuando se comprime un líquido en la cámara. La cámara se comprime para administrar la composición farmacéutica de la presente invención. En una modalidad específica, la cámara es un arreglo en pistón. Dichos dispositivos están disponibles comercialmente. Las composiciones y formulaciones de la presente invención son adecuadas para la administración transmucosal de la L-ergotioneína. En particular, las composiciones y formulaciones son particularmente adecuadas para administración sublingual, bucal o rectal de agentes que son sensibles a la degradación mediante proteasas presentes en los fluidos gástricos o en otros fluidos corporales que tienen actividad enzimática mejorada. Además, los sistemas de administración transmucosal se pueden utilizar para agentes que tienen una baja biodisponibilidad oral. Las composiciones de la presente invención comprenden a la L-ergotioneína disuelta o dispersa en un vehículo que comprende un solvente, un hidrogel opcional, y un agente que mejora el transporte a través de la membrana mucosal. El solvente puede ser un alcohol no tóxico conocido en la técnica como sea útil en dichas formulaciones de la presente invención y puede incluir, pero no se limita a etanol, isopropanol, estearil alcohol, propilenglicol, polietilenglicol, y otros solventes que tienen características de disolución similares. Otros de dichos solventes conocidos en la técnica se pueden encontrar en The Handbook of Pharmaceutical Excipiente, publicado por The American Pharmaceutical Association y The Pharmaceutical Society of Great Britain (1986) y en the Handbook of Water-Soluble Gums and Resins, editado por R. L. Davidson, McGraw-Hill Book Co., New York, NY (1980). Se puede utilizar cualquier preparación transmucosal adecuada para la administración de los componentes de la presente invención o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos. Particularmente, la mezcla es cualquier preparación que se puede utilizar en las cavidades oral, nasal, o rectal que puede ser formulada utilizando técnicas convencionales bien conocidas en la técnica. Las preparaciones preferidas son aquellas que se pueden utilizar en las cavidades oral, nasal o rectales. Por ejemplo, la preparación puede ser una tableta bucal, una tableta sublingual, y la preparación similar que disuelve o desintegra, administrando al fármaco dentro de la boca del paciente. Un aerosol o gotas se pueden utilizar para administrar el fármaco a la cavidad nasal. Un supositorio se puede utilizar para administrar la mezcla a la mucosa rectal. La preparación puede o no administrar el fármaco en una forma de liberación sostenida. Una modalidad específica para administrar los componentes de la presente invención es una preparación mucoadhesiva. Una preparación mucoadhesiva es una preparación la cual después del contacto con las membranas mucosas intactas se adhiere a dicha membrana mucosa por un periodo de tiempo suficiente para inducir el efecto terapéutico o nutricional deseado. La preparación puede ser una composición semisólida como se describe por ejemplo, en WO 96/09829. Esta puede ser una tableta, un polvo, un gel o una película que comprende una matriz mucoadhesiva como se describe por ejemplo, en WO 96/30013. La mezcla se puede preparar como un jarabe que se adhiere a la membrana de la mucosa. Los mucoadhesivos adecuados incluyen aquellos bien conocidos en la técnica tales como ácidos poliacrílicos, preferiblemente que tienen el peso molecular entre aproximadamente 450,000 a aproximadamente 4,000, 000, por ejemplo, Carbopol™ 934P; carboximetilcelulosa de sodio (NaCMC), hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC), o por ejemplo, Methocel. TM. K100, e hidroxipropilcelulosa. La administración de los componentes de la presente invención también se puede lograr utilizando una venda, parche, dispositivo y cualquier dispositivo similar que contiene los componentes de la presente invención y que se adhiere a una superficie mucosal. Los parches transmucosales adecuados se describen por ejemplo en WO 93/23011 , y en la Patente de E.U.A. No. 5,122,127, ambos se incorporan en la presente invención como referencias. El parche se diseña para administrar la mezcla en proporción al tamaño de la interfase fármaco/mucosa. Por consiguiente, las relaciones de administración se pueden ajustar mediante la alteración del tamaño del área de contacto. El parche que puede convenir más para la administración de los componentes de la presente invención puede comprender un refuerzo, dicho refuerzo actúa como una barrera para la pérdida de los componentes de la presente invención a partir del parche. El refuerzo puede ser cualquiera de los materiales convencionales utilizados en dichos parches incluyendo, pero no limitados a, polietileno, copolímero de etil-vinil acetato, poliuretano y los similares. En el parche que se elabora de una matriz que no es por sí misma un mucoadhesivo, la matriz que contiene a los componentes de la presente invención se puede acoplar con un componente mucoadhesivo (tal como un mucoadhesivo descrito anteriormente) de manera que el parche se puede retener sobre la superficie mucosal. Dichos parches se pueden preparar mediante los métodos bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. Las preparaciones que se utilizan de conformidad con la invención pueden contener otros ingredientes, tales como llenadores, lubricantes, desintegrantes, vehículos solubilizantes, saborizantes, colorantes y los similares. En algunos casos puede ser deseable incorporar un mejorador para penetración de la membrana mucosa dentro de la preparación. Los mejoradores de penetración adecuados incluyen agentes tensioactivos aniónicos (por ejemplo lauril sulfato de sodio, dodecil sulfato de sodio), agentes tensioactivos catiónicos (por ejemplo cloruro de palmitoil DL carnitina, cloruro de cetilpiridinio), agentes tensioactivos no iónicos (por ejemplo polisorbato 80, polioxietilen 9-lauril éter, monolaurato de glicerilo, polioxialquilenos, polioxietilen 20 cetil éter), lípidos (por ejemplo ácido oléico), sales biliares (por ejemplo glicocolato de sodio, taurocolato de sodio), y compuestos relacionados.

La administración de los compuestos de la presente invención puede ser sola, o en combinación con otros compuestos efectivos para tratar las diversas condiciones médicas contempladas por la presente invención. También, las composiciones y formulaciones de la presente invención, se pueden administrar con una variedad de analgésicos, anestésicos, o ansiolíticos para incrementar el confort del paciente durante el tratamiento. Las composiciones de la invención descritas aquí pueden estar en la forma de un líquido. El líquido puede ser administrado como una aspersión, una pasta, un gel, o una gota de líquido. La consistencia deseada se logra mediante la adición de uno o más hidrogeles, sustancias que absorben el agua para crear materiales con viscosidades diversas. Los hidrogeles que son adecuados para uso se conocen bien en la técnica. Véase, por ejemplo, Handbook of Pharmaceutical Excipiente, publicado por The American Pharmaceutical Association y The Pharmaceutical Society of Great Britain (1986) y en the Handbook of Water-Soluble Gums and Resins, editado por R. L. Davidson, McGraw-Hill Book Co., New York, NY (1980). Los hidrogeles adecuados para uso en las composiciones incluyen, pero no se limitan a, hidroxipropil celulosa, hidroxipropil metil celulosa, carboximetilcelulosa de sodio y ácido poliacrílico. Los hidrogeles preferidos son éteres de celulosa tales como hidroxialquilcelulosa. La concentración de la hidroxicelulosa utilizada en la composición depende del grado de viscosidad particular utilizado y de la viscosidad deseada en el producto final. Se conocen en la técnica numerosos hidrogeles diferentes y los expertos en la técnica pueden averiguar fácilmente el hidrogel más apropiado adecuado para uso en la presente invención. Los agentes mejoradores del transporte mucosal útiles con la presente invención facilitan el transporte de los agentes en la invención reclamada a través de la membrana mucosal y dentro del torrente sanguíneo del paciente. Los agentes mejoradores del transporte mucosal también se conocen en la técnica, como se menciona en la Patente de E.U.A. número 5,284,657, incorporada en la presente invención como referencia. Estos agentes se pueden seleccionar a partir del grupo de aceites esenciales o volátiles, o partir de ácidos inorgánicos u orgánicos no tóxicos, farmacéuticamente aceptables. Los aceites esenciales o volátiles pueden incluir aceite de menta, aceite de menta verde, mentol, aceite de eucalipto, aceite de canela, aceite de jengibre, aceite de hinojo, aceite de eneldo, y los similares. Los ácidos inorgánicos u orgánicos adecuados útiles para la presente invención incluyen pero no se limitan a ácido clorhídrico, ácido fosfórico, ácidos monocarboxílicos o dicarboxílicos aromáticos y alifáticos tales como ácido acético, ácido cítrico, ácido láctico, ácido oléico, ácido linoléico, ácido palmítico, ácido benzoico, ácido salicílico, y otros ácidos que tienen características similares. El término ácido "aromático" significa cualquier ácido que tiene un sistema de anillo de 6 miembros característico del benceno, mientras que el término ácido "alifático" se refiere a cualquier ácido que tiene una estructura base de hidrocarburo saturado o ¡nsaturado de cadena recta o cadena ramificada.

Otros mejoradores del transporte adecuados incluyen agentes tensioactivos aniónicos (por ejemplo lauril sulfato de sodio, dodecil sulfato de sodio), agentes tensioactivos catiónicos (por ejemplo cloruro de palmitoil DL carnitina, cloruro de cetilpiridinio), agentes tensioactivos no iónicos (por ejemplo polisorbato 80, polioxietilen 9-lauril éter, monolaurato de glicerilo, polioxialquilenos, polioxietilen 20 cetil éter), lípidos (por ejemplo ácido oléico), sales biliares (por ejemplo glicolato de sodio, taurocolato de sodio), y compuestos relacionados. Cuando las composiciones y formulaciones de la presente invención se van a administrar a la mucosa oral, el pH preferido debe estar en el intervalo de pH 3 a aproximadamente pH 7, con cualesquiera ajustes necesarios elaborados utilizando sistemas reguladores de pH no tóxicos, farmacéuticamente aceptables generalmente conocidos en la técnica. La administración tópica, se utilizó una solución de la L-ergotioneína en agua, solución acuosa con pH regulado u otro vehículo farmacéuticamente aceptable, o en una loción o crema de hidrogel, que comprende una emulsión de una fase acuosa e hidrófoba, a una concentración de entre 50 µ? y 5 mM. Una concentración preferida es de aproximadamente 1 mM. A ésta se le puede añadir ácido ascórbico o sus sales, u otros ingredientes, o una combinación de éstos, para hacer una formulación cosméticamente aceptable. Los metales se deben mantener en un mínimo. Estos se pueden formular preferiblemente mediante encapsulación dentro de un liposoma para administración oral, parenteral, o, preferiblemente, para administración tópica. La invención provee métodos para tratamiento que comprenden la administración a un sujeto de una cantidad neuroprotectoramente efectiva de la L-ergotioneína. En una modalidad, el compuesto está sustancialmente puro (por ejemplo, sustancialmente libre de sustancias que limitan su efecto o que producen efectos laterales no deseados). Preferiblemente el sujeto es un animal, incluyendo pero no limitado a animales tales como vacas, cerdos, caballos, gallinas, gatos, perros, etcétera, y preferiblemente es un mamífero, y más preferiblemente un humano. En una modalidad específica, un mamífero no humano es el sujeto. En otra modalidad específica, un mamífero humano es el sujeto. La cantidad de L-ergotioneína que es óptima en la protección de células neuronales a partir del daño se puede determinar mediante técnicas clínicas estándares basadas en la presente descripción. Además, los ensayos in vitro se pueden emplear de manera opcional para ayudar a identificar intervalos de dosis óptimas. La dosis precisa a ser empleada en la formulación también dependerá de la ruta de administración, y la severidad de la enfermedad o trastorno, y se debe decidir de conformidad con el juicio del practicante y de cada circunstancia del sujeto. Las dosis efectivas se pueden extrapolar a partir de curvas dosis-respuesta derivadas de sistemas de prueba in vitro o de modelos animales.

Grupo de tratamiento Un sujeto en el cual la administración de L-ergotioneína es un régimen terapéutico efectivo para la neuroprotección preferiblemente es un humano, pero puede ser cualquier animal. Por lo tanto, como se puede apreciar fácilmente por un experto en la técnica, los métodos y composiciones farmacéuticas de la presente invención son particularmente adecuadas para la administración a cualquier animal, particularmente un mamífero, e incluyen, pero de ninguna forma se limitan a, animales domésticos, tales como sujetos felinos con caninos, animales de granja, tales como pero no limitados a sujetos bovinos, equinos, caprinos, ovinos, y porcinos, animales salvajes (ya sea que se encuentren en su medio silvestre o en un parque zoológico), animales para investigación, tales como ratones, ratas, conejos, cabras, ovejas, cerdos, perros, gatos, etcétera, especies de aves, tales como pollos, pavos, aves canoras, etcétera, por ejemplo, para uso médico veterinario. Cuando sea posible la protección a las células neuronales del daño a partir de sustancias o condiciones neurotóxicas se debe considerar antes de la exposición a dichas sustancias y condiciones neurotóxicas. La exposición a sustancias y condiciones neurotóxicas se puede considerar en la presencia de enfermedades y de trastornos que se sabe que producen la neurodegeneración, por ejemplo, en la presencia de la enfermedad de Alzheimer. Además, la exposición a las neurotoxinas, contaminantes, radiaciones tales como radiación solar, electromagnética o nuclear, y a compuestos farmacéuticos que se sabe que generan especies reactivas de oxígeno y otros radicales, se reconocen como potencialmente dañinas a las células del SNC. El método neuroprotector de la invención puede ser utilizado antes de la exposición a sustancias o condiciones neurotóxicas para reducir o prevenir el daño neuronal. Además, la administración de la L-ergotioneína se puede dar en cualquier momento o después de la lesión o exposición a la sustancia neurotóxica, sola, o en combinación con otros agentes que se sabe que son neuroprotectores o que se sabe que son benéficos para estimular la reparación, o la regeneración del tejido neural, o que ayuden en la proliferación de la célula neuronal, o que son benéficos a la remielinización.

Selección de agentes neuroprotectores En un tercer aspecto, la invención describe un método de selección para identificar compuestos capaces de proteger a las células del sistema nervioso central del daño, que comprende (a) la exposición (tratamiento) de neuronas retínales a los agentes neurotóxicos con y sin tratamiento con los compuestos pruebas; y (b) determinar el efecto de los compuestos prueba sobre las poblaciones de neuronas retínales, en donde los compuestos prueba capaces de incrementar la integridad neuronal o de preservar el número de células neuronales se identifican como agentes neuroprotectores. Una modalidad adicional incluye un método de selección para identificar compuestos capaces de proteger a las células del sistema nervioso central (SNC) del daño, que comprende (a) tratar a las neuronas dopaminérgicas con 6-OHDA in vitro o in vivo con y sin tratamiento con un compuesto prueba; y (b) determinar el efecto del compuesto prueba sobre la población de neuronas dopaminérgicas, en donde se identifica un compuesto prueba capaz de incrementar la supervivencia celular como un agente neuroprotector. Incluso una modalidad adicional sería la selección de compuestos novedosos capaces de proteger a las células del sistema nervioso central del daño utilizando los métodos descritos anteriormente y utilizando la L-ergotioneína como un estándar o control positivo para la eficiencia en el ensayo.

Efectos neuroprotectores específicos de la L-ergotioneína Invección intravitreal de N DA y neuroprotección por la L-eraotioneína De conformidad con este aspecto de la invención, las ratas inyectadas intravitrealmente con NMDA sin la administración de la L-ergotioneína, demostraron una reducción aparente en la inmunotinción para la proteína precursora amiloide (APP) en las células ganglionares (Figuras 1A y 1 B). De manera similar, también se detectó una reducción en la inmunorreactividad de la proteína ácida fibrilar de la glia (GFAP) en los astrocitos que se localizaron principalmente en la superficie vitreal de la retina en las retinas inyectadas con NMDA (Figuras 2A y 2B). En las secciones histológicas teñidas con violeta de cresilo, el tejido retinal obtenido a partir de ratas inyectadas con NMDA por 24 horas parecieron estar menos saludables, degenerativas o necróticas, en comparación con las retinas normales o no inyectadas (Figuras 3A - 3C). En las retinas normales, la densidad total de la célula promedio es de 6394 células/mm2. De éstas, 61 % son células no ganglionares y 39% se consideran células ganglionares con base en sus diámetros de los cuerpos celulares. Estas figuras mencionadas están de acuerdo con los estudios previos, véase por ejemplo, Perry (1981) anteriormente mencionado, que muestran que más de la mitad de la población total de neuronas en la capa de células ganglionares son células amácrinas desplazadas con cuerpos celulares pequeños en comparación con las células ganglionares. En animales que recibieron la inyección intravitreal de NMDA y que fueron tratados con PBS, hubo una reducción del 58% en los números totales de células en la retina. Esta reducción fue evidente particularmente en células más grandes con una pérdida del 81% de células ganglionares y una reducción del 43% en células no ganglionares. En contraste, hubo una pérdida de solamente 15% de las células ganglionares y 8% de las células no ganglionares en las retinas no inyectadas (Figuras 3A-3C y 4). En los animales tratados con L-ergotioneína, hubo una pérdida del 44% de células ganglionares y 31 % de células pequeñas o no ganglionares. Los ojos control inyectados a partir de estos animales mostraron una pérdida del 7% y 4% de estas poblaciones (Figura 4). La NMDA es excitotóxica a las neuronas. Con el objeto de averiguar que la inyección intravitreal de la NMDA de hecho lleva a una pérdida y no a una atrofia de neuronas en la retina, se llevaron a cabo conteos celulares y mediciones de tamaño en retinas montadas en completo 6 semanas después de la inyección de la NMDA, en un punto de tiempo mayor que el reportado en los estudios anteriores (Laabich et al. (2000) Mol. Brain Res. 85: 32-40), y los resultados están de conformidad con los estudios previos que muestran un efecto neurotóxico de la NMDA sobre las neuronas de la retina (Kido et al. (2000) Brain Res. 884: 59-67; Laabich et al. (2000) anteriormente mencionado). La presente invención provee evidencia de un efecto in vivo de la NMDA en la producción de degeneración significativa y pérdida tanto de poblaciones celulares ganglionares como de poblaciones de células amácrinas desplazadas en la capa de células del ganglio. El efecto citotóxico de la NMDA parece ser más severo en las poblaciones de células ganglionares que se sabe que son principalmente glutamatérgicas (Fletcher et al. (2000) J. Comp. Neurol. 420: 98-1 12). Esto es consistente con las observaciones de los inventores con respecto a una reducción de la APP en las células ganglionares. El hecho de que hubo una reducción en las células amácrinas desplazadas las cuales son principalmente no glutamatérgicas sugiere que los efectos citotóxicos de la NMDA pueden no ser específicos o no estar limitados a las poblaciones de células de la capa ganglionar. Esto puede estar en armonía con la sugerencia de que una subpoblación de células amácrinas/células amácrinas desplazadas puede expresar receptores de la NMDA, y por lo tanto puede ser vulnerable a la excitotoxicidad (Fletcher et al. (2000) anteriormente mencionado). No obstante, la reducción de la inmunorreactividad de la GFAP en los astrocitos después de la inyección de la NMDA implica que también puede existir un efecto detrimental indirecto del tratamiento con NMDA sobre las neuronas no glutamatérgicas o neuronas que no expresan receptores de la NMDA vía la disfunción de la célula de la glia. De hecho, se sabe que las células retínales de la glia desempeñan un papel importante en la función normal y en la supervivencia de las neuronas de la retina. La disfunción de estas células también puede ser un factor precipitante de la degeneración neuronal en las retinas probadas por ataques de una naturaleza diferente, por ejemplo, péptidos citotóxicos ß-amiloides (Jen et al. (1998) anteriormente mencionado; Aruoma et al. (1999) anteriormente mencionado). La reducción observada de las poblaciones de células pequeñas con diámetros de los cuerpos celulares menores de 6 µ?? además de una reducción de las células ganglionares más grandes 6 semanas después de la inyección intravitreal de la NMDA indica que existe una pérdida real de la población neuronal en la capa de células ganglionares más que en las células más grandes. Esta pérdida debe ser más probablemente permanente y elimina la posibilidad de cambios degenerativos reversibles como se indica por el encogimiento de los cuerpos celulares.

Efectos de la L-erqotioneína sobre la citotoxicidad ?ß de las células P12 El péptido beta-amiloide es el componente principal de las placas seniles y se considera que tiene un papel causal en el desarrollo y progresión de la enfermedad Alzheimer (AD). En la presente solicitud, se muestra que los resultados que demuestran un efecto positivo de la L-ergotioneína sobre la prevención de la muerte celular oxidativa inducida por ?ß. Las células del feocromocitoma (PC12) de rata se utilizaron para evaluar los efectos de la L-ergotioneína sobre la protección de la muerte celular después de la exposición a ?ß. Las células PC12 son un modelo bien definido in vitro para estudios de la muerte de la célula neuronal y de la diferenciación (Fujita et al. (1989), Environ. Health Perspect. 80:127-142; Leclerc et al. (1995), Neurosci. Lett. 201 : 103-106). Estas células retienen características fenotípicas de células adrenales cromafines y de neuronas simpáticas (Green et al. (1976), Proc. Nati. Acad. Sci. USA 73: 2424-2428). Las células tratadas con ?ß llevaron a cabo muerte apoptótica como se determinó mediante marcado del extremo terminal in situ (tinción TUNEL), potencial de membrana mitocodrial disminuido (???t?), una relación incrementada de Bax proapoptótica a BCI-XL antiapoptótica y la escisión de poli(ADP-ribosa)polimerasa. El tratamiento con L-ergotioneína atenuó la apoptosis inducida por ?ß y la peroxidación de lípidos en las células PC12. Se compararon los efectos de la L-ergotioneína sobre la citotoxicidad inducida por la niprida sódica donante de óxido nítrico (SNP) y el clorhidrato de 3-morfolinosidnonimina generador de peroxinitrito (SIN-1 ). La L-ergotioneína exhibió una protección dependiente de concentración de la muerte celular dependiente de SIN-1 pero no de aquella mediada por SNP, sugiriendo que es un potente eliminador de peroxinitrito. Las transfección de células PC 12 con bcl-2 amplificó el rescate dependiente de L-ergotioneína de estas células a partir de la muerte apoptótica inducida por ?ß. Estos resultados, se muestran en el ejemplo 2 a continuación, sugiriendo que la L-ergotioneína puede modular la muerte oxidativa y/o nitrosativa de la célula neuronal ocasionada por ?ß y también puede tener potencial preventivo o terapéutico en contra de ?ß.

Modelo de la lesión por 6-hidroxidopamina (OHDA) y efectos de la L-ergotioneína Mucha atención se ha enfocado sobre la caracterización in vitro de antioxidantes derivados a partir de plantas. Para las consideraciones in vivo, se deben considerar las cuestiones de biodisponibilidad y el destino de los metabolitos de los componentes antioxidantes. Por lo tanto, para el desarrollo de estrategias terapéuticas para prevenir la pérdida neuronal progresiva basada en la actividad antioxidante, el antioxidante debe ser capaz de atravesar la barrera hematoencefálica y de presentarse en la región cerebral respectiva para la neuroprotección. El ejemplo 3 a continuación reporta el primer estudio para proveer evidencia de que la L-ergotioneína reduce la pérdida de células TH+ después de una lesión con 6-OHDA en el modelo de rata con lesión por 6- OHDA. El modelo de rata con lesión por 6-OHDA satisface el valor de la construcción de la enfermedad de Parkinson en tanto que comparte características bioquímicas similares y la pérdida de células TH+ es progresiva y dependiente de la dosis (Perese et al. (1989) Brain Res. 494: 285-293). El mecanismo preciso de la pérdida neuronal debido a 6-OHDA aún no está aclarado, pero hay sugerencias de que el estrés oxidativo dependiente de 6-OHDA dentro de las neuronas puede ocasionar la muerte celular (Ferber et al. (2001a) Neuroreport 12: 1155-1159 y Ferber et al. (2001 b) J. Neurochem. 78: 509-514, ambas publicaciones se incorporan específicamente en la presente invención como referencias en su totalidad). La muerte neuronal inducida por 6-OHDA puede implicar la activación de cinasas c-Jun N-terminales (JNK) y proteínas cinasas reguladas por señales extracelulares (ERK) (Dluzen (2000) J. Neurocytol. 29: 387-399, Choi et al. (1999) J. Neuroscience 57: 86-94, y Kulich et al. (2001) J. Neurochem. 77: 1058-1066, cada una de dichas publicaciones se incorpora en la presente invención específicamente como referencia en su totalidad). La disminución vista en este estudio con respecto al número de células ??+ después de 8 µg de 6-OHDA fue consistente y comparable con los estudios anteriores de los inventores (Datla et al. (2001), Neuroreport 12: 3871). El pre-tratamiento con L-ergotioneína protegió la pérdida de células TH+.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos se emplean para proveer a aquéllos expertos en la técnica con una descripción y descripción completa de cómo realizar y utilizar los métodos y composiciones de la invención, y no se pretende que limiten el alcance de lo que los inventores consideran como la invención. Se han realizado esfuerzos para asegurar la precisión con respecto a los números utilizados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etcétera) pero se deben considerar ciertos errores experimentales y desviaciones. A menos que se indique de otra manera, partes son partes en peso, peso molecular es peso molecular promedio, temperatura es en grados centígrados, y la presión es la presión atmosférica o está cerca de la presión atmosférica.

EJEMPLO 1 Evaluación del efecto de la L-ergotioneína en el modelo retina! con NMDA Materiales v métodos La L-ergotioneína se obtuvo a partir de Oxis Health Products, Portland Oregon, EUA. La NMDA y otros compuestos bioquímicos fueron de la mayor pureza disponible y se obtuvieron a partir de Sigma Aldrich Chemical Company, RU. Ratas Sprague-Dawley adultas jóvenes fueron utilizadas en los presentes experimentos. Los animales fueron abastecidos por Harían, Inglaterra y se mantuvieron en la Comparative Biology Unit en Charing Cross Hospital Campus, Imperial College. Los procedimientos animales utilizados estuvieron de conformidad con las regulaciones de la Home Office, Ll (. Los animales se dividieron en cuatro grupos. El primer grupo consistió de 6 ratas normales que no recibieron el tratamiento. 9 animales adicionales fueron anestesiados con Hypnorm™ (0.02 mg de citrato de fentanilo y 0.54 mg de fluanisona/100 g de peso corporal) e Hypnovel™ (0.27 mg de midazolam/100 g de peso corporal) antes de que recibieran inyecciones intravitreales unilaterales de 5 µ? de NMDA 4 mM al cuerpo vitreo de los ojos izquierdos, con los ojos derechos no inyectados que sirvieron como controles. Seis de los animales experimentales inyectados con NMDA recibieron una inyección intraperitoneal adicional de la L-ergotioneína 0.2 mi de 70 mg/ml (n=3), o solución salina con pH regulado con fosfato (PBS) como vehículo control por 24 horas y 30 minutos antes de la inyección de NMDA. La inyección intraperitoneal adicional de la L-ergotioneína, o del PBS se llevó a cabo a puntos de tiempo de 1 hora, 24 horas, 48 horas y 72 horas, y se realizaron 3 inyecciones por semana por otras tres semanas. Seis semanas después de la inyección de NMDA, todos los animales se anestesiaron profundamente de nuevo y se perfundieron con solución salina fisiológica seguido por paraformaldehído al 4% en regulador de pH con fosfato (pH 7.4). Los globos oculares fueron recolectados en el mismo fijador y se post-fijaron por otra media hora antes de que las retinas fueran disecadas en PBS. Para cada retina, se realizaron cuatro cortes radiales antes de que las retinas se montaran en plano sobre portaobjetos cubiertos con gelatina, y se secaron al aire lentamente en una cámara húmeda por 2-3 días. Los montajes totales de retinas se tiñeron con violeta de cresilo y se cubrieron por deslizamiento. El análisis se llevó a cabo bajo un microscopio Wild equipado con una cámara transparente con tubo para dibujo. Se contó el número de neuronas retínales en la capa de células ganglionares de la retina y se midieron los tamaños celulares a una amplificación de 300X y en un área de 150 X 150 µ?t? en las partes central, intermedia y periférica de los cuatro cuadrantes retínales. Las neuronas contadas se dividieron en dos grupos con cuerpos celulares menores de 6 µ?t?, o ¡guales a mayores de 6 µ? en diámetro. La mayoría de las neuronas más grandes son células ganglionares de la retina mientras que los cuerpos celulares más pequeños son principalmente células no ganglionares o células amácrinas desplazadas (Perry (1981 ) Neuroscience 6: 931-944). Los números de células se contaron en un total de 12 campos de retinas individuales y se analizaron estadísticamente. El dato se expresa como media ± S.E.M. las diferencias entre los valores se compararon mediante análisis de varianza de un sentido (ANOVA). En una serie separada de experimentos, los globos oculares obtenidos a partir de 3 ratas normales y de 3 ratas 24 horas después de la inyección intravitreal de NMDA se disecaron después de la perfusión con paraformaldehído al 4%, se críoprotegieron en sacarosa al 30% y se contaron en un criostato a un grosor de 20 µ?p. Se recolectaron las secciones alternadas sobre portaobjetos revestidos con gelatina y se tiñeron con violeta de cresilo para revelar la citoarquitectura de la retina o se hicieron reaccionar inmunocitoquímicamente para la proteína precursora amiloide (APP) (Sigma-Aldrich, RU 1 :800) y se visualizaron utilizando el método del complejo de Avidina-biotina (Vector Laboratories, RU).

Resultados Hubo una reducción del 58% en los números de células totales en la retina de animales que recibieron la inyección intravitreal de NMDA seguido por el tratamiento con solución salina con pH regulado con fosfato (grupo control con PBS). Esta reducción fue particularmente evidente en las células más grandes con una pérdida del 81 % de las células ganglionares y una reducción del 43% en las células no ganglionares. En contraste, hubo una pérdida de solamente el 15% de células ganglionares y del 8% de células no ganglionares en las retinas no inyectadas (Figuras 3A-3C y 4). En los animales tratados con la L- ergotioneína, hubo una pérdida del 44% de las células ganglionares y del 31 % de las células pequeñas o no ganglionares. Los ojos control no inyectados a partir de estos animales mostraron una pérdida del 7% y del 4% de estas poblaciones (Figura 4). Estos resultados demuestran un efecto neuroprotector significativo de la L-ergotioneína.

EJEMPLO 2 Evaluación del efecto de la L-erqotioneína sobre la citotoxicidad y la muerte celular apoptótica inducida por ß-amiloide en células PC12 A. Efecto de la L-erqotíoneína sobre la citotoxicidad ß-amiloide de las células PC12 Materiales El MTT [bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difen¡ltetrazolio] y la niprida sódica (SNP) se obtuvieron a partir de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, EUA). El péptido beta-amiloide (?ß25-35) se obtuvo partir de Bachem Inc. (Torrance, CA, EUA). El ?ß25-35 se disolvió en agua destilada deionizada a una concentración de 1 mM y se almacenó a -20°C hasta que se utilizó. Las soluciones de almacenamiento se diluyeron hasta las concentraciones deseadas inmediatamente antes del uso y se añadieron al medio de cultivo sin el procedimiento de envejecimiento. Los inventores notaron que tanto las prestaciones frescas como viejas del Ap25-35 tenían efectos citotóxicos similares en las células PC12. El medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), suero bovino fetal, suero de caballo, mezcla nutriente de Ham F-12 y el suplemento N-2 se proveyeron a partir de Gibco BRL (Grand Island, NY, EUA). El clorhidrato de 3-Morfolinosidnonimina (SIN-1 ) fue un producto de Biomol Research Lab, Inc. (Plymouth Meeting, PA, EUA). El etil éster de tetrametilrodamina (TMRE) y la dihidrorodamina (DHR) 123 se obtuvieron a partir de Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR, EUA) y Fluka Chemie GmnH (Buchs, Suiza), respectivamente. La EGT sintética se obtuvo partir de OXIS International (Portland, Oregon, EUA).

Cultivo celular Las células PC12 se mantuvieron en DMEM suplementado con 10% del suero de caballo inactivado mediante calor y 5% de suero de bovino fetal a 37°C en una atmósfera húmeda de 10% de CÜ2 90% de aire. Todas las células se cultivaron en platos de cultivo revestidos con poli-D-lisina. El medio se cambió cada tercer día, y las células se sembraron a una densidad apropiada de conformidad con cada escala experimental. Después de 24 horas de subcultivo, las células se cambiaron a medio N-2 definido libre de suero para el tratamiento. Para la determinación de la viabilidad celular, las células PC 12 se sembraron inicialmente a una densidad de 4 x 104 células/300 µ? en placas de 48 pozos, y la viabilidad celular se determinó mediante la reducción convencional del MTT y el ensayo de liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) como se describe a continuación.

Ensayo de reducción del colorante MTT El ensayo con MTT es una medición sensible del estado metabólico normal de las células, particularmente de la mitocodrial, la cual refleja los cambios redox celulares tempranos. Después de la incubación, las células se trataron con la solución de MTT (concentración final, 1 mg/ml) por 2 horas. Los cristales azul oscuro del formazán que se formaron en células intactas se disolvieron en DMSO, y se midió la absorbancia a 570 nm con un lector de microplacas. Los resultados se expresan como el porcentaje (%) de la reducción del MTT, asumiendo que la absorbancia de las células control fue de 100%.

Ensayo de liberación de la LDH Este ensayo mide la lixiviación de la enzima citoplásmica soluble LDH dentro del medio extracelular debido a la lisis celular. Las células PC12 se sembraron a la misma densidad que para el ensayo de MTT descrito anteriormente. La cantidad de lactato se midió mediante el monitoreo de la oxidación del ácido L-láctico mediante la NAD+ en la presencia de LDH hacia piruvato. El medio de cultivo se transfirió a una placa de 96 pozos y se incubó con 1 mg/ml de ß-???+ en solución con sustrato de piruvato a 37°C por 30 minutos. Después de la incubación adicional a temperatura ambiente por 20 minutos con un reactivo de color (2,4-dinitrqfenilhidrazina), la reacción se detuvo mediante la adición de NaOH 0.4 N. los cambios en la absorbancia se determinaron a 450 nm utilizando un lector de microplacas espectrofotométrico.

Resultados La citotoxicidad de ?ß se evaluó inicialmente mediante el MTT convencional al determinar el porcentaje (%) de reducción del MTT después de la incubación de las células PC12 por 36 horas con concentraciones en incremento de ?ß25-35· El ?ß25-35 disminuyó la viabilidad celular dependiente de concentración, y su efecto citotóxico se inhibió mediante EGT 1 mM (Figura 5A). Con el objeto de correlacionar la actividad reductora del MTT con la muerte celular y con la protección subsecuente por EGT, el daño celular se evaluó cuantitativamente mediante la cantidad de LDH liberada hacia el medio en la presencia y ausencia de EGT. El efecto citoprotector de la EGT se verificó por su capacidad de reducir la LDH liberada en las células PC12 tratadas con ?ß25-33 (Figura 5B).

B. Efecto de la L-erqotioneína sobre la apoptosis inducidas por ß-amiloide en células PC12 Procedimiento mediante corte terminal de la dUTP mediado por la deoxinucleotidil transferasa terminal (TUNEL) El equipo de detección de muerte in situ disponible comercialmente (producto de Boehringer Mannheim, anheim, Alemania) se utilizó para detectar la fragmentación del ADN. Las células PC12 (5 x105 células/ 1.5 mi en una cámara de deslizamiento) se fijaron por 30 minutos en una solución neutra con pH regulado con formalina al 10% a temperatura ambiente. La peroxidasa endógena se inactivo mediante la incubación con 0.3% (v/v) de peróxido de hidrógeno en metanol por 30 minutos a temperatura ambiente y se incubó adicionalmente en una solución para permeabilización (citrato de sodio al 0.1 % y Tritón X-100 al 0.1 %) por 2 minutos a 4°C. Las células se marcaron mediante incubación con la mezcla de reacción TUNEL por 60 minutos a 37°C seguido por el marcado con anticuerpo anti-cabra anti-fluoresceína conjugado con peroxidasa (fragmento Fab) por 30 minutos adicionales. Después de teñir con diaminobenzidina por 10 minutos, las células se enjuagaron con solución salina con pH regulado un fosfato (PBS) y se montaron con glicerol al 50%.

Medición del potencial de membrana mitocodrial (????) Para medir el potencial de membrana mitocodrial (??p?), se utilizó la sonda lipófila catiónica TMRE. Después del tratamiento con ?ß25-35 (25 µ?) por 24 horas en la presencia o ausencia de la EGT, las células (1x104 células/1 mi en una cámara de 4 pozos) se enjuagaron con PBS, y se cargó la TMRE (150 nM). Después de 30 minutos de incubación a 37°C, las células sé examinaron bajo un microscopio confocal (LEICA TCS SP). La TMRE exhibió una acumulación dependiente del potencial en la mitocondria, el cual se detectó mediante la excitación por fluorescencia a 488 nm y la emisión a 590 nm.

Análisis de Western blot Después del tratamiento, las células (1x107 células/7 mi en un plato de 100 0) se contaron y se lavaron con PBS. Después de la centrifugación, se llevó a cabo la lisis celular a 4°C mediante agitación vigorosa por 15 minutos en regulador de pH RIPA (NaCI 150 mM, NP-40 al 1 %, deoxicolato de sodio al 0.5%, SDS al 0.1 %, Tris-HCI 50 mM (pH 7.4), glicerofosfato 50 mM, NaF 20 mM, EGTA 20 mM, DTT 1 mM, Na3V04 1 mM e inhibidores de proteasas). Después de la centrifugación a 15,000 rpm por 15 minutos, el sobrenadante se separó y se almacenó a -70°C hasta que se utilizó. La concentración de proteína se determinó mediante el uso del equipo para ensayo de proteína con ácido bicincrínico (BCA) (Pierce, Rockford, IL, EUA). Después de la adición del regulador de pH para carga de la muestra, las muestras de proteína se sometieron a electroforesis en un gel de SDS al 12.5% -poliacrilamida. Las proteínas se transfirieron a blots de difluoruro de polivinilideno a 300 mA por 3 horas. Los blots se bloquearon por 1 hora a temperatura ambiente en regulador de pH para bloqueo recientemente preparado (Tween-20 al 0.1 % en solución salina regulador de pH de Tris, pH 7.4 que contenía 5% de leche descremada deshidratada). Las diluciones (1 : 1000) de los anticuerpos anti-poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP), anti-Bcl-XL y anti-Bax se realizaron en PBS con 3% de leche descremada deshidratada. Después de tres lavados con PBST (PBS y Tween-20 al 0.1 %), los blots se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano en PBS con 3% de leche descremada deshidratada por 1 hora a temperatura ambiente. Los blots se lavaron de nuevo tres veces en regulador de pH PBST, y las proteínas transferidas se incubaron con solución de sustrato de ECL (Amersham Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ, EUA) por 1 minuto de conformidad con las instrucciones del fabricante y se visualizaron con una película de rayos X.

Resultados Las células PC12 tratadas con 25 µ? de ?ß llevaron a cabo apoptosis como se determinó mediante el marcado del extremo terminal positivo (TUNEL) que detecta la fragmentación del ADN in situ. En este análisis histoquímico, la aparición de núcleos intensamente teñidos es indicativa de la incorporación terminal de dUTP marcado dentro del extremo 3' del ADN fragmentado derivado a partir de los núcleos apoptóticos. La EGT, a 0.5 m o a 1 mM, disminuyó la proporción de células positivas a TUNEL (figuras 6A y 6B). Además de la fragmentación del ADN nuclear, más recientemente, la mitocondria se ha reconocido como un paso clave en la apoptosis. La mitocondria lleva a cabo cambios principales en la integridad de la membrana antes de que sean manifiestos los signos clásicos de muerte celular. Estos cambios incluyen tanto a las membranas mitocondriales internas como externas, llevando la desaparición del potencial de transmembrana y/o a cambios en la permeabilidad los cuales liberan las proteínas intermembranales solubles a través de la membrana externa. Cuando las células PC12 se expusieron al ?ß25-35 (25 µ?), el potencial transmembranal de la mitocondria (???t?) se redujo rápidamente, como se muestra por la disminución en la fluorescencia roja utilizando el colorante sensible al voltage TMRE (figuras 6C y 6D). La desaparición del ???? inducida por ?ß25-35 se bloqueó significativamente por el tratamiento con la EGT (figuras 6C y 6D). La muerte de la célula apoptótica inducida por ?ß25-35 se verificó mediante la determinación de la escisión de la PARP. La PARP es una proteína nuclear de 116 kDa la cual se escinde específicamente mediante caspasa-3 activa en un fragmento apoptótico de 85 kDa. El tratamiento con 25 µ de ?ß25-35 ocasiona la escisión de la PARP, la cual se inhibió mediante la EGT (figuras 7A y 7B). También se examinó la expresión de las proteínas de la familia Bcl-2. La relación de Bax pro-apoptótico y el Bcl-2 anti-apoptótico se consideró como una reostato molecular que determina la supervivencia/muerte celular. Puesto que Bcl-2 fue escasamente detectable en las células PC12, los inventores midieron alternativamente los niveles de BCI-XL que es estructuralmente y funcionalmente análogo al Bcl-2. Como se ilustra las figuras 7C y 7D, el tratamiento con ?ß llevó a la expresión incrementada del Bax pro-apoptótico con una disminución concomitante en el nivel de proteína BCI-XL anti-apoptótica. El tratamiento con la EGT redujo sustancialmente la relación de Bax a BCI-XL.

C. Efecto de la L-erqotioneína sobre el daño nitrosativo inducido por ß-amiloide en células PC 2 Medición de la formación intracelular de peroxinitrito Para monitorear la formación intracelular de peroxinitrito, se utilizó la sonda fluorescente DHR123. La DHR123 es lipófila y se difunde fácilmente a través de las membranas celulares. Después de la oxidación del DHR hacia la rodamina fluorescente, uno de los dos grupos amino covalentes se tautomeriza a una rodamina atrapada efectivamente ¡mino cargada dentro de las células. La DHR no se oxida mediante óxido nítrico (NO) pero el peroxinitrito se oxida efectivamente. Después del tratamiento con ?ß25-35 (25 uM) por 36 horas en la presencia o ausencia de la L-ergotioneína, las células (1 x 104 células/1 mi en una cámara de 4 pozos) se enjuagaron con solución salina A, y se cargó con 10 uM de DHR en solución salina A que contenía 5% de suero bovino fetal. Después de 20 minutos de incubación a 37°C, las células se examinaron bajo un microscopio confocal equipado con un láser de argón (488 nm; 200 mW). Para cuantificar la generación de peroxinitrito en respuesta al ?ß25-35, la producción total de peroxinitrito (basal + incremento) se dividió por la generación basal de peroxinitrito. Los cambios en la intensidad de fluorescencia se expresan como un porcentaje del control Evaluación de la peroxidación de lípidos El grado de peroxidación de lípidos en las células PC12 tratadas con ?ß25-35 se evaluó utilizando el equipo de ensayo colorimétrico comercialmente disponible BIOXYTECH LPO-586 (OXIS Research, Portland, OR). Después de la exposición a 50 uM de ?ß25-35 en la presencia o ausencia de la L-ergotioneína a 37°C por 24 horas, las células PC12 se cosecharon y se homogeneizaron en regulador de pH Tris-HCI 20 mM (pH 7.4), que contenía 0.5 mM de hidroxitolueno butilado para prevenir la oxidación de la muestra. Después de la centrifugación, 3.25 volúmenes del reactivo R1 diluido (10.3 mM de N-metil-2-fenilindol en acetonitrilo) se añadió el sobrenadante, seguido por mezclado suave en un vórtex. Después de la adición de 0.75 mi de HCI al 37% (v/v), las mezclas se incubaron a 45°C por 60 minutos. Después de enfriar y de centrifugar, la absorbancia del sobrenadante claro se leyó a 590 nm. La concentración de proteína se determinó utilizando el equipo para ensayo de proteína BCA.

Resultados El efecto de la L-ergotioneína sobre la generación de peroxinitrito intracelular inducida por ?ß se midió utilizando el colorante DHR, el cual se oxida rápidamente mediante el peroxinitrito hacia la rodamina fluorescente. Las células PC12 tratados con 25 uM de ? 25-35 exhibieron una fluorescencia intensa después de la tinción con DHR, y la formación de peroxinitrito intracelular resultante del tratamiento con ?ß25-35 se redujo significativamente cuando la L-ergotioneína estuvo presente en el medio (figuras 8A y 8B). El ?ß25-35 puede ocasionar daño nitrosativo a través de la generación de especies reactivas de nitrógeno (RNS) y la modulación de las señales sensibles a redox que resulta en la alteración de la bicapa de fosfolípidos de las células neuronales. Las células PC12 tratadas con ?ß25-35 llevaron a cabo peroxidación de su bicapa lipídica que produjo niveles incrementados de peróxidos de lípidos (figura 8C). El pretratamiento con la L-ergotioneína por 30 minutos produjo la inhibición dependiente de la concentración de la peroxidación de lípidos. (Figura 8C). Además, la L-ergotioneína protege selectivamente en contra de la citotoxicidad inducida por los compuestos SIN-1 que liberan peroxinitrito (figura 9B), aunque no puede atenuar la muerte celular mediada por la SNP donante de NO (figura 9A), indicando que la L-ergotioneína es un eliminador efectivo del peroxinitrito.

D. Evaluación de los efectos de la L-erqotioneína sobre la activación del NF-KB inducida por ß-amiloide Preparación de los extractos nucleares Para explorar los mecanismos moleculares que subyacen al efecto protector de la L-ergotioneína en contra de la muerte celular nitrosativa inducida por ?ß25-35, se evaluó la activación del NF-KB mediante EMSA utilizando un oligonucleótido que contiene un elemento de unión consenso KB. Después del tratamiento con 25 uM de ?ß25-35 por 1 hora en la ausencia o presencia de la L-ergotioneína, las células PC12 (1 X 107 células/7 mi en un plato de 100 0) se lavaron con PBS, se centrifugaron, y se resuspendieron en regulador de pH A isotónico enfriado con hielo [HEPES 10 mM, pH 7.9, MgCI2 1.5 mM, KCI 10 mM, ditiotreitol (DTT) 0.5 mM y fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 0.2 mM]. Después de la incubación en un baño con hielo por 10 minutos, las células se centrifugaron de nuevo y se resuspendieron en regulador de pH C enfriado con hielo que contenía HEPES 20 mM (pH 7.9), glicerol al 20%, NaCI 420 mM, MgCI2 1 .5 mM, EDTA 0.2 mM, DTT 0.5 mM y PMSF 0.2 mM seguido por incubación a 0°C por 20 minutos. Después de mezclado en el vórtex, la suspensión resultante se centrifugó, y el sobrenadante se almacenó a -70°C para el siguiente ensayo para unión del ADN de NF-??. La concentración de proteína se determinó mediante el uso del equipo de ensayo para proteína BCA.

Ensayo de cambio de movilidad electroforética (EMSA) para determinar la actividad de unión del ADN NF-KB El oligonucleótido sintético de cadena doble que contenía el dominio de unión a NF-?? se marcó con [?-32?] ATP utilizando T4 polinucleótido cinasa y se separó a partir del [?-32?] ATP no incorporado mediante filtración en gel utilizando una columna nick spin (Phamacia Biotech, Bjorkgatan, Suecia). Antes de la adición del oligonucleótido radio-marcado (100,000 cpm), se mantuvieron en hielo 10 µg del extracto nuclear por 15 minutos en regulador para cambio de unión en ge! [glicerol al 4%, EDTA 1 mM, DTT 1 mM, NaCI 100 mM, Tris-HCI 10 mM, (pH 7.5) y 0.1 mg/ml de ADN de esperma de salmón sonicado]. Los complejos ADN-proteína se resolvieron mediante un gel no desnaturalizante de poliacrilamida al 6% a 200 V por 2 horas seguido por autorradiografía.

Inmunocitoquímica de p65 Para la inmunocitoquímica, las células PC12 (105 células/800 µ? en un portaobjetos de cámara) fijaron por 30 minutos en 10% de solución de formalina neutra con pH regulado a temperatura ambiente. Las células se bloquearon por 1 hora a temperatura ambiente en regulador de pH para bloqueo recientemente preparado (5.5% suero de cabra normal en TBST). Las diluciones (1 : 100) del anticuerpo primario anti-nitrotirosina se realizaron en TBS con 3% de BSA. Después de tres lavados con TBST, las células se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados a FITC en TBS con 3% de BSA por 1 hora a temperatura ambiente. Las células se lavaron de nuevo tres veces en regulador de pH TBST y se incubaron con yoduro de propidio por 10 minutos para la tinción de los núcleos. Las células se enjuagaron con TBS y se examinaron bajo un microscopio confocal.

Análisis estadístico Los datos se expresaron como medias ± SD, y se llevó a cabo un análisis estadístico para comprensión simple mediante la prueba t de Student. El criterio para la importancia estadística fue de P < 0.05.

Resultados El tratamiento de las células PC12 con ?ß25-35 ocasionó un incremento transitorio en la unión del ADN de NF-??, lo cual se inhibió mediante el pretratamiento con EGT (figura 10A). Para verificar adicionalmente el efecto inhibidor del EGT sobre la activación de NF-KB inducida por ?ß25-35. los inventores midieron la translocación nuclear de p65, una subunidad funcionalmente activa de NF-?? en las células PC12, mediante inmunocitoquímica utilizando anticuerpo anti-p65 y yoduro de propidio (figura 10B). Para evaluar los efectos neuroprotectores de la L-ergot¡oneína sobre el daño inducido por ß-amiloide en las células PC12, se observaron los siguientes resultados. La muerte apoptótica inducida por ?ß vía el estrés nitrosativo en las células PC12 se suprimió mediante el tratamiento con L-ergotioneína. La citotoxicidad inducida por ?ß mediante el ensayo de reducción convencional por MTT se utilizó en esta evaluación. El ?ß ocasionó una disminución en la reducción de MTT en las células PC12, lo cual se restableció parcialmente en la presencia de EGT. El efecto protector de la L-ergotioneína sobre la citotoxicidad inducida por ?ß25-35 se confirmó utilizando el ensayo de liberación de LDH. Además, la formación de peroxinitrito intracelular inducida por ?ß se atenuó mediante la L-ergotioneína, como se revela por la distribución reducida del colorante fluorescente DHR en las células pretratadas con este compuesto. Además, la EGT exhibió una protección dependiente de concentración de la muerte celular dependiente de SIN-1 pero no de la citotoxicidad mediada por SNP, sugiriendo que la L-ergotioneína es un eliminador potente del peroxinitrito. SIN-1 solamente genera peroxinitrito a través de una liberación secuencial de superóxido y de óxido nítrico y su reacción limitada por difusión. Por lo tanto, una forma por medio de la cual la L-ergotioneína exhibe sus efectos neuroprotectores puede ser por medio de sus efectos inhibidores de la producción de peroxinitrito. Además, el tratamiento con ?ß25-35 ocasionó la alteración del potencial de membrana mitocondrial, la relación disminuida Bc\X antiapoptótico- Bax proapoptótico, y la escisión de la PARP. El pretratamiento de las células con la L-ergotioneína atenuó estos cambios bioquímicos asociados con la apoptosis inducida por ?ß. Un tratamiento con ?ß25-35 también ocasiona la activación de NF- B en las células PC12, lo cual se puede atenuar mediante el pretratamiento con L-ergotioneína. Un mecanismo propuesto para los efectos neuroprotectores de la L-ergotioneína se muestra en la figura 1 1.

EJEMPLO 3 Evaluación de los efectos neuroprotectores de la L-ergotioneína en el modelo 6 -OH DA Ratas macho Sprague-Dawley con pesos iniciales de 225.L25 g, fueron alojados en grupos de 3 con libre acceso a la comida y al agua, bajo condiciones de temperatura controlada (21 °C ± 1 °C) y con un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas (luz encendida a las 07.00 horas). Todos los procedimientos científicos se llevaron a cabo con la aprobación de the Home Office, R.U. A las ratas se les administró, mediante cebadura, 70 mg/kg de ergotioneína o de un vehículo (agua destilada estéril) diariamente por 4 días (n=6 por grupo). Al 4to día,1 hora después de la administración de la L-ergotioneína o del vehículo, las ratas fueron anestesiadas con Immobilon® para animal pequeño (0.04 ml/rata, i. m.), y 6-OHDA(5 µg disueltos en 4 µ? de 0.1 % de ácido ascórbico/solución salina) que se inyectó en el haz del cerebro anterior medio (coordenadas estereotácticas: 2.2 mm anterior, +1.5 lateral a partir de la bregma y -7.9 ventral a la dura con barras en el oído de 5 mm por debajo de las barras de los incisivos (Datla et al. (2001 ) Neuroreport 12: 3871 , cuya referencia se incorpora específicamente en la presente invención como referencia en su totalidad). Una semana después de las lesiones con 6-OHDA, las ratas fueron sacrificadas mediante dislocación cervical y los cerebros fueron disecados inmediatamente. Una sección coronal se realizó en el nivel del hipotálamo y el cerebro anterior, y se separaron partes del cerebro posterior. El cerebro posterior se fijó por 7 días en paraformaldehído al 4%, luego se crio-protegió con 30% de solución de sacarosa por 2-3 días y se utilizó para inmunotinción para tirosina hidroxilasa (TH) como se describió por Datla et al. (2001 ) anteriormente mencionado. Brevemente, la TH se ¡nmunotiñó mediante incubación de las secciones coronales fijas de 20 µ?t? que flotaban libres con anticuerpo anti-TH policlonal de conejo (1 : 3000, Chemicon, R.U.) seguido por el anti-lgG de conejo biotinilado y el complejo avidina/biotina (Vector Lab, R.U.). El complejo inmune de la TH se visualizó entonces mediante diaminobenzidinA (DAB) y H202. Las imágenes de células positivas a TH (células TH+) se capturaron mediante una cámara digital Xillix CCD y se contaron automáticamente (Image Proplus, Datacell, R.U.). El número de células TH+ en la substantia nigra en el lado control se comparó con el lado lesionado al considerar el promedio de células en 5 niveles diferentes (Datla et al. (2001 ) anteriormente mencionado). A partir del cerebro anterior, los striata lesionados y controles fueron disecados y se ensayaron para DA y sus metabolitos, DOPAC y HVA, mediante detección CLAR-electroquímica (Datla et al. (2001 ) anteriormente mencionado).

Resultados Después de 28 días de administración oral de la L-ergotioneína, y de la inyección de 6-hidroxidopamina (6-OHDA), se evaluaron la integridad y funcionalidad de las rutas dopaminérgicas nigro-estriatales en el modelo de PD con lesión por 6-OHDA. El número de células dopaminérgicas en la substantia nigra se determinó mediante la inmunotinción para tirosina hidroxilasa y se midieron los niveles de dopamina en el striatum por CLAR. Se comparó el número de células TH+ en el lado control del cerebro de ambos grupos tratados con vehículo y con L-ergotioneína. Los efectos generales de la lesión del tratamiento con la L-ergotioneína sobre las células TH+ fueron analizados mediante ANOVA con lesiones dentro de un factor sujeto y el tratamiento con la L-ergotioneína como entre un factor sujeto. Se presentaron efectos significativos de las lesiones (Datos < 0. 001) y de la L-ergotioneína por la lesión (Datos p < 0.01 ). La comparación de los grupos individuales mediante la prueba t de Student mostró que la lesión significativamente se redujo en las células TH+ (p < 0.005; prueba t de Student aparejada) tanto en los grupos tratados con vehículo vehículo como en los grupos tratados con L- ergotioneína. No obstante, la reducción en el número de células TH+ en el grupo tratado con vehículo fue significativamente superior (reducción del 63%) en el grupo tratado con la L-ergotioneína (reducción del 46%) (p < 0.0005; prueba t de Student no aparejada). Por lo tanto, se demostró que la L-ergotioneína mejora significativamente (aproximadamente en un 20%) en términos de neuroprotección sobre los controles.

Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES 1. - El uso de la L-ergotioneína para preparar una composición farmacéutica para proteger a una célula del sistema nervioso central de mamífero (SNC) del daño, en un mamífero. 2. - El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde la célula del SNC es una célula neuronal. 3. - El uso como se reclama en la reivindicación 2, en donde la célula neuronal es una célula ganglionar o una célula no ganglionar. 4. - El uso como se reclama en la reivindicación 2, en donde la célula neuronal es una o más de una neurona colinérgica, una neurona dopaminérgica y una neurona GABAérgica. 5. - El uso como se reclama en la reivindicación 2, en donde la célula neuronal es una neurona dopaminérgica. 6. - El uso como se reclama en la reivindicación 5, en donde las neuronas dopaminérgicas son células positivas a tirosina hidroxilasa (TH+) de la substantia nigra. 7. - El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde el daño resulta de la exposición a un oxidante. 8. - El uso como se reclama en la reivindicación 7, en donde el oxidante se selecciona a partir del grupo que consiste de singuletes de oxígeno, peróxido de hidrógeno, óxido nítrico, ácido hipocloroso, radicales hidroxilo, radicales peroxilo, y metaloenzimas. 9.- El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde el daño resulta de la exposición a una citocina. 10.- El uso como se reclama en la reivindicación 9, en donde la citocina es el factor de necrosis tumoral-a (TNF-a) o un interferón gama. 11 . - El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde el daño resulta de exposición de un compuesto neurotoxico. 12. - El uso como se reclama en la reivindicación 11 , en donde el compuesto neurotoxico se selecciona a partir del grupo que consiste de glutamato, un análogo del glutamato, y un compuesto anticáncer. 13. - El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde el daño resulta de la presencia de una enfermedad neurodegenerativa. 14. - El uso como se reclama en la reivindicación 13, en donde la enfermedad neurodegenerativa se selecciona a partir del grupo que consiste de enfermedad de Alzheimer, esclerosis múltiple, síndrome de Down, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Parkinson, lesión cerebral traumática, lesión aguda o crónica de la médula espinal, degeneración macular, VIH/SIDA, neuropatías ópticas y retinopatías. 15.- El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde mamífero es un ser humano. 16.- El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde la composición farmacéutica es administrable como un suplemento dietético. 17. - El uso como se reclama en la reivindicación 16, en donde el suplemento dietético está en la forma de una cápsula oral, tableta, o suspensión. 18. - El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde la composición farmacéutica es administrable en combinación con un segundo oxidante. 19 - El uso como se reclama en la reivindicación 18, en donde el segundo antioxidante es vitamina C o vitamina E. 20. - El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde la composición farmacéutica es administrable en combinación con agentes ayudan a la protección de las células neuronales, o agentes que ayudan en la proliferación celular y/o regeneración tisular y/o remielinización. 21. - El uso como se reclama en la reivindicación 20, en donde dichos agentes que ayudan en la protección de las células neuronales, o agentes que ayudan en la proliferación celular y/o regeneración tisular y/o remielinización se selecciona a partir del grupo que consiste de compuestos orgánicos pequeños sintéticos, proteínas, péptidos, polipéptidos, ácidos nucleicos, polinucleótidos, oligonucleótidos antisentido, y anticuerpos. 22. - El uso como se reclama en la reivindicación 20, en donde dicho agente es un eliminador de ROS seleccionado a partir del grupo que consiste de coenzima Q, vitamina E, vitamina C, piruvato, melatonina, niacinamida, N-acetilcisteína, GSH, y nitronas. 23. - El uso como se reclama en la reivindicación 20, en donde dicho agente se selecciona a partir del grupo que consiste de factores neurotóficos, ligandos que se unen a una proteína cinasa activa del receptor, ligandos agonistas para receptores de integrina, imitadores del receptor, miembros de la superfamilia de inmunoglobulinas y anticuerpos para remielinización. 24.- El uso de L-ergotioneína para preparar una composición farmacéutica para tratar o mejorar el daño a una célula del sistema nervioso central (SNC) de un mamífero a partir de una enfermedad neurodegenerativa, en un mamífero. 25.- El uso como se reclama en la reivindicación 24, en donde la administración de la L-ergotioneína es crónica. 26. - El uso como se reclama en la reivindicación 24, en donde la enfermedad neurodegenerativa se selecciona a partir del grupo que consiste de enfermedad de Alzheimer, esclerosis múltiple, síndrome de Down, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Parkinson, lesión cerebral traumática, lesión aguda o crónica de la médula espinal, degeneración macular, VIH/SIDA, neuropatías ópticas y retinopatías. 27. - El uso como se reclama en la reivindicación 24, en donde la célula del SNC es una célula neuronal. 28.- El uso como se reclama en la reivindicación 27, en donde la célula neuronal es una célula ganglionar y una célula no ganglionar. 29.- El uso como se reclama en la reivindicación 27, en donde la célula neuronal es una o más de una neurona colinérgica, una neurona dopaminérgica y una neurona GABAérgica. 30. - El uso como se reclama en la reivindicación 27, en donde la célula neuronal es una neurona dopaminérgica. 31 . - El uso como se reclama en la reivindicación 30, en donde las neuronas dopaminérgicas son células positivas a tirosina hidroxilasa (TH+) de la substantia nigra. 32. - Un método de selección para identificar compuestos capaces de proteger a las células del sistema nervioso central (SNC) del daño, que comprende (a) tratar a las neuronas de la retina con un agente neurotóxico con y sin tratamiento con un compuesto prueba; y (b) determinar el efecto del compuesto prueba sobre la población de neuronas de la retina, en donde un compuesto prueba capaz de incrementar la supervivencia celular se identifica como un agente neuroprotector. 33. - Un método de selección para identificar compuestos capaces de proteger a las células del sistema nervioso central (SNC) del daño, que comprende (a) tratar a las neuronas dopaminérgicas con 6-OHDA con y sin tratamiento con un compuesto prueba; y (b) determinar el efecto del compuesto prueba sobre la población de neuronas dopaminérgicas, en donde al menos un compuesto prueba capaz de incrementar la supervivencia celular se identifica como un agente neuroprotector. 34. - El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde el medicamento es adaptado para administración oral o para inyección intravitreal, intramuscular, intraperitoneal, intratecal, intraventricular o intracraneal. 35. - Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de la L- ergotioneína y un vehículo farmacéuticamente aceptable. 36. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 35, caracterizada además porque comprende adicionalmente una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente que ayuda en la protección de las células neuronales, o un agente que ayudan en la proliferación celular y/o regeneración tisular y/o remielinización. 37. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 36, caracterizada además porque el agente se selecciona a partir del grupo que consiste de compuestos orgánicos sintéticos pequeños, proteínas, péptidos, polipéptidos, ácidos nucleicos, polinucleótidos, oligonucleótidos antisentido, y anticuerpos. 38. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 37, caracterizada además porque el agente es una especie eliminadora reactiva de oxígeno (ROS) o una especie eliminadora reactiva de nitrógeno (RNS). 39. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 38, caracterizada además porque el eliminador ROS se selecciona a partir del grupo que consiste de coenzima Q, vitamina E, vitamina C, piruvato, melatonina, niacinamida, N-acetilcisteína, GSH, y nitronas. 40.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 37, caracterizada además porque el agente se selecciona a partir del grupo que consiste de factores neurotoficos, ligandos que se unen a una proteína cinasa activa del receptor, ligandos agonistas para receptores de integrina, imitadores del receptor, miembros de la superfamilia de inmunoglobulinas y anticuerpos para remiellnización.