MXPA04008890A

MXPA04008890A - Mutantes de la proteina p4 de haemophilus influenzae no tipicable con actividad enzimatica reducida.

Info

Publication number: MXPA04008890A
Application number: MXPA04008890A
Authority: MX
Inventors: J Reilly Thomas
Original assignee: Wyeth Corp
Priority date: 2002-03-15
Filing date: 2003-03-13
Publication date: 2005-10-18
Also published as: US7666626B2; KR100981471B1; CA2479118A1; JP2005532789A; EP1490395A4; AU2003218162B2; BR0308441A; US20090148465A1; NZ535754A; IL163988A0; AU2003218162A1; KR20050016307A; CN100593544C; EP1490395A1; CN1653084A; US7615229B2; US20050249746A1; WO2003078453A1

Abstract

Una proteina variante P4 que tiene una actividad enzimatica reducida y que induce un anticuerpo para la proteina P4 natural y/o tiene una buena actividad bactericida contra H. Influenzas no tipificable (NTHi) es util como un componente activo en una composicion inmunogenica para humanos. Tambien se proporcionan metodos de uso de esas proteinas, y composiciones que las contienen en combinacion, con antigenos adicionales.

Description

MOTANTES DE LA PROTEINA P4 DE HAEMOPHILUS INFLUENZAE NO TIPIFICABLE CON ACTIVIDAD ENZIMATICA REDUCIDA CAMPO DE LA INVENCION Esta invención se relaciona de manera general, con los campos de las composiciones inmunogénicas , y de manera más particular, con composiciones inmunogénicas contra la otitis media. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El Haemophilus influenzae no tipificable (NTHi, por sus siglas en inglés) causa enfermedades en humanos, incluyendo la neumonía, otitis media, sinusitis, y traqueobronquitis febril aguda en adultos. Esta bacteria también es un agente etiológico frecuente de la otitis media en niños e infantes. Debido a que la infección con NTHi confiere únicamente inmunidad específica a la cepa, los humanos pueden ser infectados repetidamente. En efecto, la mayoría de las enfermedades crónicas causadas por esta bacteria son la otitis repetida en niños, lo que da como resultado tratamientos que incluyen la exposición repetida a antibióticos o cirugía para insertar tubos de drenaje en el oído . Ninguna de las composiciones inmunogénicas disponibles para tratar cepas de H. influenzae tipificables (que se caracterizan por una cápsula conocida) son útiles en Ref . :158402 el tratamiento del NTHi . De este modo, se ha llevado a cabo investigación considerable para encontrar un componente que sea útil para prevenir la infección causada por NTHi. En investigaciones de componentes candidatos para prevenir la ocurrencia de la otitis media en humanos, la lipoproteína bacteriana llamada Proteína 4 (P4; anteriormente referida como "proteína e de la membrana externa") de NTHi ha sido identificada como un componente deseable debido a su capacidad para producir anticuerpos bactericidas contra las bacterias en humanos. Se ha encontrado que la P4 produce anticuerpos bactericidas los cuales actúan en sinergia con anticuerpos contra otras proteínas de la membrana externa del NTHi. Debido a esto, la proteína puede ser usada en conjunto con otras proteínas de la membrana externa para inducir una respuesta bactericida más potente. El gen hel que codifica para P4 está conservado antigénicamente dentro y entre cepas de H. influenzae . Véase, por ejemplo, las Patentes Estadounidenses Nos. 5,780,601; 5,955,580 y 5,601,831 y las Patentes Europeas Nos. EP 0 606 921 y EP 0 462 210, entre otras, las cuales se incorporan aquí como referencia. Las secuencias del gen hel (SEQ ID NO: 1) y la preproteína codificada, de 274 aminoácidos (SEQ ID NO: 2) se encuentran disponibles de una base de datos NCBI , No. de Acceso M68502 e identificada en Green, B.A., et al, 1991 Infect. Immun., 59 (9) : 3191-3198. La P4 madura de NTHi es una proteína lipidada de 254 aminoácidos de longitud (SEQ ID NO: 3) , codificada por los nucleótidos 209-970 de la SEQ ID NO: 1. La preproteína P4 no procesada de 274 aminoácidos tiene un péptido señal de 20 aminoácidos que especifica un sitio para la acilación de ácido graso (SEQ ID NO: 2, aminoácidos 1-20) , y es codificada por los nucleótidos 149-970 de la SEQ ID NO: 1, con los nucleótidos 149-208 codificando la señal o el péptido líder. Se piensa que la función de la proteína P4 en Haemophilus era originalmente el transporte de hemina (Reidl, J., y J.J. Mekalanos. 1996 J. Exp. Med. , 183:621-629.5). Sin embargo, posteriormente se descubrió que la proteína P4 es una enzima de la membrana externa, es decir, ácido fosfatasa bacteriana (Reilly, T. J. et al, 1999 J. Bacteriol . , 181:6797-805). Trabajo más reciente en el área ha mostrado diferentes opiniones por laboratorios sobre la verdadera función de la proteína P4 (Kemmer, G. et al, 2001 J. Bacteriol., 183:3974-3981; Reidl, J. et al, 2000 Mol. Microbiol., 35:1573-81; Reilly, T. , y A. Smith, 1999 Prot . Exp. Purif., 17:401-409; Reilly, T. J. et al, 1999. J.

Bacteriol., 181:6797-805; y Reilly, T. J. et al, 2001 FEBS Lett . , 494 : 19-23) . La identificación de P4 como una proteína enzimática ha creado una preocupación potencial por su uso como un componente de una composición inmunogénica para humanos. Esta proteína es enzimáticamente activa y su sustrato in vivo no está completamente definido. Aunque la P4 natural no tiene efectos dañinos conocidos cuando es administrada a humanos, generalmente se acepta que las proteínas no enzimáticamente activas o aquellas con actividad reducida son preferidas como proteínas enzimáticamente activas para usarse en composiciones inmunogénicas a ser usadas en humanos. Una proteína enzimáticamente activa no es preferida para ser usada como un componente inmunogénicó debido a que su actividad enzimática puede causar una reacción inesperada, indeseable, en el humano inmunizado, además de la inducción de anticuerpos. Los fragmentos de proteína P4 o secuencias de P4 "imitantes" variantes descritas de manera general por los documentos y patentes mencionadas anteriormente no se caracterizan en términos de la propiedad más importante para una composición inmunogénica, es decir la inmunogenicidad . No se proporciona información sobre los efectos de la mutación sobre la inmunogenicidad. Además, no se proporcionan indicaciones de que los cambios que efectúan la actividad enzimática tengan algún efecto sobre el potencial inmunogénicó. De este modo, nada en la técnica anterior proporciona ninguna dirección para la selección de mutantes de la proteína P4 para producir un componente para una composición inmunogénica.

Sigue existiendo la necesidad en la técnica de composiciones terapéuticas y profilácticas que comprendan proteínas variantes de P4 de NTHi , que tengan actividad enzimática reducida y que sean inmunológicamenté equivalentes a la proteína natural, para usarse de manera segura en composiciones inmunogénicas en humanos. SUMARIO DE LA INVENCIÓN En un aspecto, la invención proporciona una proteína variante de P4 (imitante) que tiene actividad enzimática reducida en comparación con la proteína P4 natural y que induce un anticuerpo para la proteína P4 natural y/o que tiene actividad bactericida contra NTHi. Esta proteína variante es útil para inducir una respuesta inmune protectora contra NTHi en un humano inmunizado. En otro aspecto, la invención proporciona una composición inmunogénica que comprende una proteína variante de P4 de NTHi como se describe aquí, un vehículo farmacéuticamente aceptable, opcionalmente , un adyuvante. Esta composición puede contener proteínas o péptidos antigénicos adicionales y es útil para inducir una respuesta inmune protectora contra NTHi . En un aspecto adicional más, la invención proporciona moléculas nucleotídicas aisladas o recombinantes que comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica para una variante de P4 de la invención. La invención también duplica vectores como plásmidos, virus recombinantes , etc., que contienen esas moléculas bajo el control regulador de secuencias que dirigen la expresión de la variante en una célula anfitriona. Todavía otro aspecto más de la invención proporciona una célula anfitriona que comprende un vector que contiene una molécula nucleotídica como se describe aquí. Inclusive otro aspecto más de esta invención incluye métodos para inducir una respuesta inmune en un humano contra NTHi administrando la proteína variante o composiciones que la contienen. Aún otro aspecto más de la invención implica métodos para la expresión recombinante en una proteína variante de P4 por células anfitrionas transformadas, transfectadas o transducidas con un vector que contiene esas moléculas . Otro aspecto de esta invención incluye el uso de una proteína variante de P4 como portadora de otro antígeno, donde el otro antígeno puede ser una proteína, polipéptido, péptido, polisacárido, oligosacárido, sacárido, lipopolisacárido, lipooligosacárido, o liposacárido . La proteína P4 variante tiene actividad enzimática reducida en comparación con la proteína P4 natural, pero no necesariamente induce un anticuerpo para la proteína P4 natural o tiene actividad bactericida contra NTHi, con la condición de que la proteína portadora de la variante de P4 no tiene una fenilalanina en la posición del aminoácido 122 de la SEQ ID NO: 3. Esos y otros aspectos de la invención serán evidentes a un experto en la técnica tras la lectura de la siguiente descripción detallada de la invención. DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La presente invención satisface las necesidades de la técnica proporcionando una proteína variante de P4 no enzimáticamente activa que induce un anticuerpo para la proteína P4 natural y/o tiene actividad bactericida contra NTHi . Las composiciones que contienen las proteínas variantes de P4, moléculas de ácido nucleico que codifican para ellas, y métodos de uso de esas proteínas y moléculas de ácido nucleico proporcionan medios novedosos para inducir inmunidad al NTHi en humanos . A. Proteínas P4 Variantes de esta Invención Las proteínas P4 variantes son definidas como proteínas P4 mutantes que tienen niveles muy bajos de actividad enzimática de P4 o actividad enzimática de P4 no detectable. Cuando se usan como componentes en composiciones inmunogénicas , esas proteínas P4 variantes retienen propiedades inmunológicas deseables de la proteína P4 natural. Esas propiedades incluyen la producción de anticuerpos reactivos por ELISA contra P4 natural y/o anticuerpos bactericidas contra NTHi . Cuando se usan, proteínas portadoras, las proteínas P4 variantes no necesitan retener las propiedades inmunológicas de la proteína P4 natural . Debido a que la correlación clínica de protección contra NTHi no es conocida, sustituir una P4 mutante por la P4 natural en una composición inmunogénica puede ser exitosa únicamente si la mutante produce títulos de ELISA y/o títulos bactericidas equivalentes a aquéllos producidos por la lipoproteína P4 recombinante natural (rLP4) . Esas proteínas P4 variantes son componentes deseables de composiciones inmunogénicas útiles para la profilaxis de la infección por NTHi. Como se usan aquí, los términos "proteína P4 variante" o "proteína P4 mutante" se refieren a una proteína o lipoproteína que contiene mutaciones específicas en aminoácidos residuales que eliminan sustancialmente la actividad enzimática de P4 natural, y permiten una retención de la capacidad de la proteína para inducir una respuesta inmune a NTHi en un humano . "Respuesta inmune" o "inmunidad" como términos usados de manera intercambiable aquí, significan la inducción de una respuesta humoral (es decir, células B y/o celular (es decir células T) . De manera adecuada, una respuesta inmune humoral puede ser evaluada midiendo los anticuerpos específicos del antígeno de P4 presentes en suero de animales inmunizados en respuesta a la introducción de las variantes de proteína P4 de esta invención en un anfitrión. En una modalidad ejemplar más adelante, la respuesta inmune evaluada por el ensayo inmunosorbente ligado a enzimas (ELISA, por sus siglas en inglés) de suero de animales inmunizados. Puede ser empleado un ensayo de linfocitos T citotóxicos (CTL) para medir la respuesta de las células T de linfocitos aislados del bazo de animales inmunizados. Preferiblemente la proteína P4 variante de esta invención es una lipoproteína , es decir, que contiene una cisteína modificada en su amino-terminal , en la cual un glicerol acilado graso está ligado por medio de un tioéter y un ácido graso esta ligado a su grupo amino terminal. En una modalidad de una proteína variante de P4 de esta invención, el péptido líder es el péptido líder de P4 natural de H. influenzae, es decir, los aminoácidos 1 a 20 de la SEQ ID NO: 2. Sin embargo, pueden ser fusionados otros péptidos que especifiquen un sitio para la acilación grasa en una célula bacteriana a la proteína variante de P4 en lugar de la secuencia natural para proporcionar una lipoproteína. Los ejemplos de otros péptidos líder incluyen aquéllos de la proteína P6 de H. influenzae, la proteína OspA de Borrelia burgdorferi y aquellos de péptidos de señal lipidíeos de bacterias gram positivas. En todavía una modalidad más de esta invención, donde la proteína variante de P4 es usada como una proteína portadora, esta puede estar preferiblemente no lipidada, es decir, expresada sin un péptido líder. Por ejemplo, esta carece del péptido líder de los aminoácidos 1-20 de la SEQ ID NO: 2 o está fusionada a un péptido líder que carece de un sitio de acilación grasa. A través de esta especificación, la identificación del aminoácido residual en el cual se localizan mutaciones específicas es aquel número de residuo correspondiente a la secuencia de aminoácidos lipidada, madura, procesada, de P4 natural, es decir, la SEQ ID NO: 3. Esta invención está dirigida a una proteína variante de P4 de NTHi que tiene actividad enzimática reducida en comparación con la proteína P4 natural y que induce un anticuerpo para la proteína p4 natural y/o que tiene actividad bactericida contra NTHi, donde la proteína variante de P4 tiene una mutación seleccionada del grupo que consiste de: (a) una mutación en el aminoácido residual 39 de la SEQ ID NO: 3, el cual es una glutamina en la proteína P4 natural ; (b) una mutación en el aminoácido residual 48 de la SEQ ID NO: 3, el cual es una fenilalanina en la proteína P4 natural ; (c) una mutación en el aminoácido residual 64 de la SEQ ID NO: 3, el cual es un ácido aspártico en la proteína P4 natural; (d) una mutación en el aminoácido residual 161 de la SEQ ID NO : 3, el cual es una lisina en la proteína P4 natural ; (e) una mutación en el aminoácido residual 218 de la SEQ ID NO: 3, el cual es una asparagina en la proteína P4 natural ; (f) mutaciones en los aminoácidos residuales 35 y 37 de la SEQ ID NO: 3, los cuales son alanina en la proteína P4 natural, donde las mutaciones no son ácido glutámico, glutamina o treonina; (g) mutaciones en los aminoácidos residuales 64 y 66 de la SEQ ID NO: 3, los cuales son ácido aspártico en la proteína P4 natural; y (h) combinaciones de una o más de las mutaciones de (a) -(g). Específicamente, una primera modalidad de una proteína variante de P4 específica de esta invención es una proteína que contiene una mutación en los aminoácidos residuales 39 de la SEQ ID NO: 3, los cuales son una glutamina en la proteína P4 natural. En una modalidad, La proteína variante de P4 contiene un ácido glutámico en la posición del aminoácido 39 de la SEQ ID NO: 3. De manera alternativa, la proteína variante de P4 contiene un ácido aspártico o asparagina en la posición del aminoácido 39 de la SEQ ID NO: 3.

-Una segunda modalidad de una proteína variante P4 de esta invención contiene mutación en un ácido residual número 48, el cual es una fenilalanina en la proteína P4 natural. De manera deseable, ese aminoácido residual en la proteína variante de P4 es una cisteína. La sustitución de un residuo de Cys por el residuo de Phe en la posición 48 es un cambio no conservativo que podría esperarse perturbara la estructura de la proteína. Sin embargo, esta proteína variante de P4 tiene propiedades antigénicas e inmunogénicas deseables. Esta proteína variante de P4 también carece de la capacidad de complementar mutaciones de hemA en E. coli . Véase, Reilly, T. J. et al, 2001 FEBS Lett . 494:19-23, incorporada aquí como referencia en su totalidad. De manera alternativa, la proteína variante P4 contiene una serina. u otros aminoácidos que tienen grupos polares sin cargar, como la glicina, treonina, tirosina, asparagina y glutamina, en la posición del aminoácido 48 de la SEQ ID NO: 3. Una tercera modalidad de una proteína variante P4 de esta invención contiene una mutación del aminoácido en la posición 64 de la SEQ ID NO: 3, el cual es ácido aspártico en la proteína P4 natural. En una modalidad, la proteína variante de P4 contiene una asparagina o ácido glutámico en el residuo 64. De manera alternativa la proteína variante de P4 contiene alanina en la posición del aminoácido 64 de la SEQ ID NO: 3.

Una cuarta modalidad de una proteína variante de P4 de esta invención contiene una mutación en el aminoácido residual de la posición 161 de la SEQ ID NO: 3, el cual es lisina en la proteína P4 natural. En una modalidad, la proteína variante de P4 contiene un arginina en el residuo 161. Una quinta modalidad de una proteína variante de P4 de esta invención contiene una mutación en el aminoácido residual de la posición 218 de la SEQ ID NO: 3, el cual es asparagina en la proteína P4 natural. En una modalidad, la proteína variante de P4 contiene una glutamina en el residuo 218. De manera alternativa, la proteína variante de P4 contiene un ácido aspártico o ácido glutámico en la posición del aminoácido 218 de la SEQ ID NO: 3. Una sexta modalidad de una proteína variante de P4 de esta invención contiene mutaciones en los aminoácidos residuales de las posiciones 35 y 37 de la SEQ ID NO : 3, los cuales son alanina en la proteína P4 natural. En una modalidad, la proteína variante de P4 contiene una asparagina en los residuos 35 y 37. La proteína variante de P4 no contiene un ácido glutámico, glutamina o treonina en las posiciones de los aminoácidos 35 y 37 de la SEQ ID NO: 3. Una séptima modalidad de una proteína variante de P4 de esta invención contiene mutaciones en los aminoácidos residuales de las posiciones 64 y 66 de la SEQ ID NO: 3, los cuales son ácido aspártico en la proteína P4 natural. En una modalidad, la proteína variante de P4 contiene una alanina en los residuos 64 y 66. De manera alternativa, la proteína variante de P4 contiene asparagina o ácido glutámico en las posiciones de los aminoácidos 64 y 66 de la SEQ ID NO: 3. Los inventores determinaron que la eliminación o reducción de la actividad enzimática en proteínas variantes de P4 sigue un patrón no obvio si la inmunogenicidad contra la P4 natural es preservada. Varias mutaciones en la secuencia de P4 elimina o reduce la actividad enzimática, pero también vuelven a las proteínas mutantes incapaces de producir títulos de ELISA altos o títulos bactericidas altos. Los inventores observaron que una falta de correlaciones de la actividad enzimática e inmunogenicidad, entre los títulos de ELISA altos y los títulos bactericidas altos y entre una capacidad de predicción de los efectos de cambios conservados sobre la estructura antigénica en una variedad de proteínas variantes de P4 que fueron investigadas e identificadas más adelante en los ejemplos. Por ejemplo, se hicieron intentos iniciales por eliminar la actividad enzimática en la proteína P4 en los motivos de DD conocidos (dos residuos de ácido aspártico adyacentes o cercanos) comunes a fosfatasas ácidas bacterianas (Thaller, M.C. et al, 1998. Prot . Sci . , 7:1647-52), es decir, los aminoácidos residuales 64 y 66 de la SEQ ID NO: 3 y las posiciones de los aminoácidos 184 y 185 de la SEQ ID NO: 3. Cuando las proteínas variantes de P4 que contienen un mutante doble de dos alaninas en lugar de dos ácidos aspárticos en las posiciones 64 y 66 o un doble mutante de dos alaninas en lugar de los dos ácidos aspárticos en las posiciones 184 y 185 fueron evaluados por su actividad enzimática, ambos fueron enzimáticamente inactivos. Sin embargo, cuando esas proteínas fueron usadas para inmunizar ratones, los antisueros producidos mostraron títulos de ELISA bajos contra la P4 natural. Se demostró que esto se debió a un cambio en los epítopes reconocidos por los anticuerpos, puesto que los antisueros tuvieron títulos altos, contra las proteínas homologas. En contraste, cuando la actividad bactericida de esos antisueros fue evaluada, los antisueros a ambas proteínas mutantes mostraron niveles altos de actividad bactericida para D54A, mutante de D66A y niveles bajos de actividad bactericida para el D184A, mutante de D185A. De este modo, el D64A, mutante de D66A es un componente útil para incluirse en una composición inmunogénica, mientras que el D184, mutante de D185A no. Otro mutante propuesto contenía una sustitución del residuo de Asp en la posición 64 con un residuo de Glu altamente conservativo, dando como resultado una variante de P4 (D64E) que produjo títulos de ELISA altos contra la P4 natural, aún cuando tuvo títulos bactericidas bajos contra NTHi . Otras proteínas P4 mutantes propuestas aunque no satisfacen los criterios- para las proteínas variantes de P4 útiles como componentes de una composición inmunogénica de esta invención se muestra en los siguientes ejemplos. Otras proteínas variantes de P4 útiles en esta invención incluyen una lipoproteína de 254 aminoácidos, madura, de longitud completa, con una o más de las mutaciones específicas proporcionadas anteriormente, o un polipéptido o un fragmento de la misma que contenga los residuos imitantes descritos anteriormente y proteína, polipéptido o fragmentó el cual retenga la actividad enzimática reducida, actividades de ELI-SA y/o bactericida (BC) de la variante de P4 de longitud completa de la cual se derivó. Los fragmentos inmunológicamente activos, enzimáticamente inactivos de esas proteínas variantes de P4 comúnmente contendrán al menos aproximadamente 25 aminoácidos contiguos de las proteínas variantes de P4 que contiene el sitio de mutagénesis anotado anteriormente. De manera más típica el fragmento de proteína variante de P4 contiene al menos aproximadamente 100 aminoácidos contiguos. Otro fragmento de una proteína variante de P4 contiene al menos aproximadamente 150 aminoácidos contiguos. Otra modalidad más de una proteína variante de P4 contiene al menos aproximadamente 200 aminoácidos contiguos de longitud. El fragmento de proteína variante de P4 es útil en los métodos descritos más adelante si induce una respuesta inmune protectora contra NTHi en el sujeto. Los fragmentos incluyen truncaciones de la región carboxi-terminal de la proteína P4. Por ejemplo, una proteína variante de P4 truncada aproximadamente en el residuo 200 (es decir, que contiene 1-200 aminoácidos de la SEQ ID NO: 3) es un fragmento deseable. De manera similar, proteínas variantes de P4 truncadas en aproximadamente los residuos 210, 221 ó 232 son fragmentos deseables. Pueden ser seleccionados otros fragmentos más de las variantes de P4 no enzimáticamente activas, inmunológicamente activas. Los fragmentos anteriores también pueden contener uno o más de las mutaciones específicas descritas anteriormente. Otras proteínas variantes de P4 adecuadas pueden incluir aquellas en las cuales uno o más de los aminoácidos residuales incluye un grupo sustituido. Una proteína variante de P4 adecuada más es una en la cual el polipéptido está fusionado con otro compuesto, como un compuesto para incrementar la vida media del polipéptido (por ejemplo, polietilen glicol) . Otra proteína variante de P4 adecuada es una en la cual son fusionados aminoácidos adicionales al polipéptido, como una secuencia líder o secretora, o una secuencia que sea empleada para mejorar la inmunogenicidad de la proteína variante de P4. Otra modificación más de la proteína variante de P4 incluye la supresión mencionada anteriormente de la secuencia señal o líder en el N terminal de P4 , es decir, codificada por los nucleótidos 148-208 de la SEQ ID NO: 1 y/o la supresión de otras regiones que no afecten la inmunogenicidad . De manera similar, una modificación de las proteínas variantes de P4 descritas aquí incluye reemplazar la secuencia señal o líder con otra secuencia señal o líder. Véase, por ejemplo, la Patente Estadounidense No. 5,780,601, incorporada aquí como referencia. Otro ejemplo más de proteínas variantes de P4 adecuadas son aquellas en las cuales pueden ser incluidos aminoácidos opcionales (por ejemplo, -Gly-Ser-) u otros aminoácidos o separadores de compuestos químicos de los extremos de los péptidos para el propósito de ligar las proteínas juntas o a un portador. Por ejemplo, las proteínas variantes de P4 útiles pueden incluir una o más de las proteínas variantes de P4 descritas anteriormente acopladas a una proteína portadora. De manera alternativa, una proteína variante de P4 útil puede estar presente en una proteína de fusión que contenga proteínas variantes de P4 múltiples, opcionalmente acopladas a una proteína portadora. Para esas modalidades, la proteína portadora, es de manera deseable, una proteína u otra molécula que pueda mejorar la inmunogenicidad de la proteína variante de P4 seleccionada. Ese portador puede ser una molécula grande que también tenga un efecto adyuvante. Los portadores proteicos convencionales ejemplares incluyen, sin limitación, proteína DnaK de E.coli, galactocinasa (galK, la cual cataliza el primer paso del metabolismo de la galactosa en bacterias) , ubiquitina, factor acoplante a, ß-galactosidasa, y proteína NS-1 de la influenza. Los toxoides (es decir, la secuencia que codifica para la toxina natural, con modificaciones suficientes para eliminar su actividad toxica) , como el toxoide de la difteria y toxoide del tétanos, sus toxinas respectivas, y cualesquier formas mutantes de esas proteínas, como CRM197 (una forma no tóxica de la toxina de la difteria, véase la Patente Estadounidense No. 5,614,382), también pueden ser empleados como portadoras. Otros portadores incluyen la exotoxina A de Pseudo onas, toxina lábil al calor de E.coli y partículas rotavirales (incluyendo partículas de rotavirus y VP6) . De manera alternativa, puede ser usado un fragmento o epítope de la proteína portadora u otra proteína inmunogénica . Por ejemplo, puede ser acoplado un hapteno a un epítope de célula T de una toxina bacteriana. Véase la Patente Estadounidense No. 5,785,973. De manera similar puede ser usada una variedad de proteínas de choque térmico bacterianas, por ejemplo, hsp-70 micobacteriana . La glutation-S-transíerasa (GST) es otro portador útil. Un experto en la técnica puede seleccionar fácilmente un portador apropiado para ser usado en este contexto. Las proteínas de fusión pueden ser formadas por técnicas estándar acoplando materiales proteinaseos . Las fusiones pueden ser expresadas a partir de constructos de genes fusionados preparados por las técnicas de ADN recombinante como se describe más adelante. Otras proteínas variantes de P4 adecuadas descritas aquí pueden diferir de las proteínas o péptidos variantes de P4 ejemplificados específicamente por modificaciones que no revivan la actividad enzimática, y no disminuyan la inmunogenicidad, o por combinaciones de esos atributos. Por ejemplo, pueden hacerse cambios de aminoácidos conservativos, los cuales, aunque alteran la secuencia primaria de la proteína variante de P4 , normalmente no alteran su función. Al hacer esos cambios, puede ser considerado el índice hidropático de los aminoácidos. La importancia del índice hidropático del aminoácido para conferir función biológica e interactiva sobre un polipéptido es comprendido, de manera general en la técnica (Kyte & Doolittle, 1982) . Se sabe que ciertos aminoácidos pueden ser sustituidos por otros aminoácidos que tengan un índice o puntaje hidropático similar y aún resultar en un polipéptido con actividad biológica similar. A cada aminoácido le ha sido asignado un índice hidropático sobre la base de su hidrofobicidad y características de carga. Aquellos índices son: isoleucina (+4.5); valina (+4.2); leucina (+3.8); fenilalanina (+2.8); cisteína/cistina (+2.5); metionina (+1.9); alanina (+1.8); glicina (-0.4); treonina (-0.7); serina (-0.8); triptófano (-0.9); tirosina (-1.3), prolina (-1.6); histidina (-3.2); glutamato (-3.5); glutamina (-3.5); aspartato (-3.5); asparagina (-3.5); lisina (-3.9); y arginina (-4.5). Se cree que el carácter hidropático relativo del aminoácido residual determina la estructura secundaria y terciaria del polipéptido resultante, lo cual a su vez define la interacción del polipéptido con otras moléculas, como enzimas, sustratos, receptores, anticuerpos, antígenos, y similares. Se sabe en la técnica que un aminoácido puede ser sustituido por otro aminoácido que tenga un índice hidropático similar y obtener además un polipéptido funcionalmente equivalente. En esos cambios, la sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos estén dentro de +/-2 es preferida, aquellas con +/-1 son particularmente preferidos, y aquellos con +/-0.5 son, de manera particular, aún más preferidos . La sustitución de aminoácidos similares también puede hacerse sobre la base de la hidrofilicidad, particularmente donde se pretenda que el polipéptido o péptido biológicamente funcional equivalente creado por ésta se use en modalidades inmunológicas . La. Patente Estadounidense No. 4,554,101, incorporada aquí como referencia, establece que la hidrofilicidad promedio local mayor de un polipéptido, como la gobernada por la hidrofilicidad de sus aminoácidos adyacentes, se correlaciona con su inmunogenicidad y antigenicidad, es decir con una propiedad biológica del polipeptido. Como se describe con detalle en la Patente Estadounidense No. 4,554,101, han sido asignados los siguientes valores de hidrofilicidad a los aminoácidos residuales: arginina (+3.0); lisina (+3.0); aspartato (3.0+1); glutamato (+3.0+1); serina (+0.3); asparagina (+0.2); glutamina (+0.2); glicina (0); prolina (-0.5+1); treonina (-0.4); alanina (-0.5); histidina (+0.5); cisteína (-1.0); metionina (-1.3); valina (-1.5); leucina (-1.8); isoleucina (-1.8); tirosina (-2.3); fenilalanina (-2.5); triptófano (-3.4). Debe comprenderse que un aminoácido puede ser sustituido por otro que tenga un valor de hidrofilicidad similar y aún obtener un polipéptido biológicamente equivalente, y en particular, un polipéptido inmunológicamente equivalente. En esos cambios, la sustitución de aminoácidos de aquellos valores de hidrofilicidad están dentro de +2 son los preferidos; aquellos con +1 son particularmente preferidos; y aquellos con +0.5 son, de manera particular aún más preferidos. Como se expuso anteriormente, las sustituciones de aminoácidos generalmente se basan en la similitud relativa de los sustituyentes de la cadena lateral de aminoácidos, por ejemplo, su hidrofobicidad, hidrofilicidad, carga, tamaño y similares. Las sustituciones ejemplares que toman varias de las características anteriores en consideración son bien conocidas por aquellos expertos en la técnica e incluyen: arginina y lisina; glutamato y aspartato; serina y treonina; glutamina y asparagina; y valina, leucina e isoleucina. Además, las modificaciones, las cuales normalmente no alteran la secuencia primaria de la proteína variante de P4 , incluyen la derivación química in vivo o in vitro de polipéptidos , por ejemplo, acetilación, metilación o carboxilación. También incluidas como proteínas variantes de P4 de esta invención se encuentran aquellas proteínas modificadas por glicosilación, por ejemplo, aquellas producidas modificando los patrones de glicosilación y un polipéptido durante su síntesis y procesamiento o en pasos de procesamiento adicionales; o exponiendo el polipéptido a enzimas que afecten la glicosilación, como enzimas glicosilantes o desglicosilantes de mamífero. También abarcadas como proteínas variantes de P4 se encuentran las secuencias mutantes identificadas anteriormente, las cuales tienen aminoácidos residuales fosforilados por ejemplo fosfotirosina, fosfoserina, o fosfotreonina . También incluidas como proteínas variantes de P4 se encuentran las secuencias anteriores que han sido modificadas usando técnicas de biología molecular comunes para mejorar su resistencia a la degradación proteolítica o para optimizar las propiedades de solubilidad. Entre esas proteínas variantes- de P4 están incluidas aquellas que contienen residuos diferentes a aquellos L-aminoácidos naturales, por ejemplo, D-aminoácidos o aminoácidos sintéticos no naturales. Entre otras modificaciones conocidas que pueden estar presentes en proteínas variantes de P4 de la presente invención se encuentran, sin limitación, la acilación, ADP-ribosilación, amidación, unión covalente de flavina, unión covalente de una entidad hem, unión covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, unión covalente de un lípido o derivado de lípido, unión covalente de fosfotidilinositol , reticulación, ciclización, formación de enlaces disulfuro, demetilación, formación de reticulaciones covalentes, formación de cistina, formación de piroglutamato, formilación, gamma-carboxilación, formación de anclaje de GPI, hidroxilación, yodación, metilación, miristoilació'n, oxidación, procesamiento proteolítico, fenilación, racemización, selenoilación, sulfación, adición de aminoácidos mediada por ARN de transferencia a proteínas como la arginilacion y ubiquitinación. B. Moléculas de Acido Nucleico que Codifican para Proteínas Variantes de P4 Otro aspecto de esta invención incluye moléculas de ácido nucleico aisladas, sintéticas o recombinantes y secuencias que codifican para las proteínas variantes de P4 descritas anteriormente que tienen las mutaciones dirigidas al sitia especificadas o fragmentos de proteínas P4 (fragmentos los cuales pueden contener además una o más de aquellas mutaciones) . Una molécula nucleotídica aislada que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína variante de P4 puede estar preferiblemente bajo el control de secuencias reguladoras que dirigen la expresión de la variante P4 en una célula anfitriona. Como se describe aquí, esas moléculas de ácido nucleico pueden ser usadas para expresar la proteína variante de P4 in vitro o para permitir la expresión de la proteína variante de P4 in vivo en un humano . Como se usa aquí, el término "molécula o secuencia nucleotídica aislada" se refiere a un segmento o fragmento de ácido nucleico el cual está libre de contaminación con otros componentes biológicos que pueden estar asociados con la molécula o secuencia en su ambiente natural. Por ejemplo una modalidad de una molécula o secuencia nucleotídica aislada de esta invención es una secuencia separada de las secuencias que flanquean a ésta en un estado natural, por ejemplo, un fragmento de ADN que ha sido removido de las secuencias que normalmente están adyacentes al fragmento, como las secuencias adyacentes al fragmento en el genoma el cual se encuentra en la naturaleza. Además, las secuencias y moléculas nucleot ídicas de esta invención han sido alteradas para codificar una proteína variante de P4 de esta invención. De este modo, el término "molécula o secuencia de ácido nucleico aislada" también se aplica a secuencias o moléculas de ácido nucleico que han sido sustancialmente purificadas de otros componentes que acompañan naturalmente al ácido nucleico que no se somete a mutación, por ejemplo, A N o ADN o proteínas, en la célula. Una molécula o secuencia nucleotídica aislada de esta invención también abarca secuencias y moléculas que han sido preparadas por otros métodos convencionales, como métodos recombinantes , métodos sintéticos, por ejemplo, mutagénesis, o combinaciones de esos métodos. Las secuencias o moléculas nucleotídicas de esta invención no se limitará únicamente a las secuencias nucleotídicas específicas presentadas aquí, sino que incluirán cualesquiera y todas las secuencias nucleotídicas que compartan homología (es decir, que tengan identidad de secuencia) con las secuencias nucleotídicas presentadas aquí. Los términos "homología sustancial" o "similitud sustancial", cuando se refieren a un ácido nucleico o fragmento del mismo, indica que, cuando son alineados de manera óptima con las inserciones o supresiones nucleótidas apropiadas con otro ácido nucleico (o su hebra complementaria) , existe una identidad de la secuencia nucleotídica de al menos aproximadamente 70% de las bases nucleotídicas, de acuerdo a lo medido por cualquier algoritmo bien conocido de identidad de secuencia, como el Fasta, un programa en GCG Versión 6.1. El término "homólogo" como se usa aquí, se refiere a la similitud de secuencia entre dos moléculas poliméricas, por ejemplo, entre dos moléculas de ácido nucleico, por ejemplo, dos moléculas de ADN o dos moléculas de A N, o entre dos moléculas polipeptídicas . Cuando una posición de un nucleótido o aminoácido en ambas de las dos moléculas está ocupada por el mismo nucleótido o aminoácido monomérico, por ejemplo, si una posición en cada una de las dos moléculas de ADN ocupada por adenina, entonces ellos son homólogos en esa posición. La homología entre dos secuencias es una función directa del número de similitudes o posiciones homologas, por ejemplo si la mitad (por ejemplo, cinco posiciones en un polímero de diez subunidades de longitud) de las posiciones en dos secuencias compuestas son homologas entonces las dos secuencias son 50% homologas. Si 90% de las posiciones, por ejemplo 9 de 10, son iguales u homologas, las dos secuencias comparten una homología del 90%. A manera de ejemplo, las secuencias de ADN 3'ATTGCC5' y 3 ' TATGCG5 ' comparten una homología del 50%. El término "sustancialmente homólogo" como se usa aquí, significa ADN o ARN el cual es aproximadamente 70% homólogo, de manera más preferible aproximadamente 80% homólogo y de manera más preferible aproximadamente 90% homólogo con el ácido nucleico deseado.

La invención también está dirigida a una molécula nucleotídica aislada que comprende una secuencia de ácido nucleico que es al menos 70%, 80% o 90% homologa con una secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína variante de P4 de NTHi que tiene actividad enzimática reducida en comparación con la proteína P4 natural y que induce un anticuerpo para la proteína P4 natural y/o tiene actividad bactericida contra NTHi, donde la proteína variante de P4 tiene una mutación seleccionada del grupo que consiste de: (a) una mutación en el aminoácido residual 39 de la SEQ ID NO: 3, el cual es una glutamina en la proteína P4 natural; (b) una mutación en el aminoácido residual 48 de la SEQ ID NO: 3, el cual es una fenilalanina en la proteína P4 natural; (c) una mutación en el aminoácido residual 64 de la SEQ ID NO: 3, el cual es un ácido aspártico en la proteína P4 natural; (d) una mutación en el aminoácido residual 161 de la SEQ ID NO: 3, el cual es una lisina en la proteína P4 natural; (e) una mutación en el aminoácido residual 218 de la SEQ ID NO: 3, el cual es una asparagina en la proteína P4 natural; (f) mutaciones en los aminoácidos residuales 35 y 37 de la SEQ ID NO: 3, los cuales son alanina en la proteína P4 natural, donde las mutaciones no son ácido glutámico, glutamina o treonina; (g) mutaciones en los aminoácidos residuales 64 y 66 de la SEQ ID NO: 3, los cuales son ácido aspártico en la proteína P4 natural; y (h) combinaciones de una o más de las mutaciones (a) - (g) , donde la secuencia de ácido nucleico codifica para al menos una de las mutaciones de (a) - (g) . Además, debido a la degeneración en el código genético, cualquier codón de tres nucleótidos que codifique para un aminoácido residual mutante de P4 , descrito aquí está dentro del alcance de la invención. Donde, como se discute aquí, las proteínas variantes de P4 y/o secuencias de ADN que codifican para las mismas, u otras secuencias útiles en las moléculas o composiciones de ácido nucleico descritas aquí son definidas por su por ciento de homología o identidades con secuencias identificadas, los algoritmos usados para calcular el por ciento de homología o por ciento de identidad incluyen los siguientes: el algoritmo de Smith-Waterman (J. F. Collins et al., 1988, Comput . Appl . Biosci . , 4:67-72; J. F. Collins et al, Molecular Sequence Comparison and Alignment, (M. J. Bishop et al, eds . ) In Practical Approach Series: Nucleic Acid and Protein Seqúense Análisis XVIII, IRL Press: Oxford, Inglaterra, RU (1987) pp. 417) , y los programas BLAST y FASTA (E. G . Shpaer et al, 1996, Genotnics, 38:179-191). Esas referencias se incorporan aquí como referencia. Describir los ADN como si estuvieran "ligados operativamente" como se usa aquí, significa que un ADN de una sola hebra o de doble hebra comprende cada uno de los dos ADN y que los dos ADN están arreglados dentro del ADN de tal manera que al menos una de las secuencias de ADN es capaz de ejercer un efecto fisiológico mediante el cual se caracteriza sobre el otro. Preferiblemente, para usarse en la producción de una proteína variante de P4 en esta invención o administrar este para la producción in vivo en una célula, cada secuencia que codifica para una proteína variante de P4 y las secuencias reguladoras necesarias están presentes en un vector recombinante viral o no viral separado (incluyendo métodos no virales para la liberación de una molécula de ácido nucleico en una célula) . De manera alternativa, dos o más de esas secuencias de ácido nucleico que codifican para copias duplicadas de una proteína variante de P4 o que codifican para proteínas variantes de P4 diferentes múltiples de esta invención pueden estar contenidas en un transcripto policistrónico, es decir, una sola molécula diseñada para expresar productos genéticos múltiples. El término "vector" como se usa aquí, significa una molécula de ADN derivada de especies virales o no virales, por ejemplo bacterianas, que han sido diseñadas para codificar una secuencia de ácido nucleico exógena o heteróloga. De este modo, el término incluye plásmidos bacterianos convencionales. Esos plásmidos o vectores pueden incluir secuencias plasmídicas de virus o fagos. Esos vectores incluyen vectores cromosomales, episomales y derivados de virus, por ejemplo, vectores derivados de plásmidos bacterianos, bacteriófagos, episomas de levadura, elementos cromosomales de levadura, y virus. Los vectores también pueden ser derivados de combinaciones de los mismos, como aquellos derivados de plásmidos y elementos genéticos de bacteriófagos, cósmidos y fagémidos. El término también incluye virus no replicantes que transfieran un gen de una célula a otra. El término también incluirá compuestos no plasmídicos y no virales que faciliten la transferencia de ácido nucleico en células, como, por ejemplo, compuestos de polilisina y similares. Las moléculas de ácido nucleico de la invención incluyen vectores no virales o métodos para liberar la secuencia que codifica para la proteína variante de P4 en una célula anfitriona de acuerdo a esta invención. Una variedad de vectores no virales son conocidos en la técnica y pueden incluir, sin limitación, plásmidos, vectores bacterianos, vectores de bacteriófagos, ADN desnudo y ADN condensado con lípidos o polímeros catiónicos. Los ejemplos de vectores bacterianos incluyen, pero no se limitan a, secuencias derivadas de bacilo de Calmette Guérin (BCG) , Sal onella, Shigella, E.coli, y histeria, entre otros. Los vectores plasmídicos adecuados incluyen, por ejemplo, -pBR322, pBR325, pACYC177, pACYC184, pUC8 , pUC9, pUC18, pUC19, pLG339, pR290, pK37, pKClOl, pAC105, pVA51, pKH47, pUBUO, pMB9 , pBR325, Col El, pSClOl, pBR313, pML21, RSF2124, pCRl, RP4 , pBAD18, y pBR328. Los ejemplos de vectores de expresión de Escherichia coli inducibles adecuados incluyen al pTrc (Amann et al., 1988 Gene, 69:301-315) , los vectores de expresión de arabinosa (por ejemplo, pBAD18, Guzman et al., 1995 J. Bacteriol . , 177:4121-4130), y pETIId (Studier et al., 1990 ethods in Enzymology, 185:60-89) . La expresión del gen objetivo del vector pTrc depende de la transcripción del ARN polimerasa anfitrión de un promotor de fusión trp-lac híbrido. La expresión el gen objetivo del vector pETIId depende de la transcripción de un promotor de fusión T7 gn 10-lac mediada por una ARN polimerasa viral coexpresada T7 gn I. Esta polimerasa viral es suministrada por las cepas anfitrionas BL21 (DE3) o HMS I 74 (DE3) de un profago residente que alberga un gen de T7 gn 1 bajo el control transcripcional del promotor lacUV5. El sistema pBAD depende del promotor de arabinosa inducible que es regulado por el gen araC . El promotor es inducido en presencia de arabinosa. Un vector ejemplar es un vector de bacteriófago de una sola o dos hebras. Por ejemplo, un vector de clonación adecuado incluye, pero no se limita a los vectores como el sistema de vector del bacteriófago ?, ?9^1, gt ???e^?, Charon 4>- ?gt-WES-?B Charon 28, Charon 4A, Xgt-l- BC, gt-l-??, M13mp7, M13mp8, o M13mp 9, entre otros. En otra modalidad, el vector de expresión es un vector de expresión de levadura. Los ejemplos de vectores para la expresión en una levadura como S . cerevisiae incluye pYepSec I (Baldari, et al., 1987), pMFa (Kurjan and Herskowitz, 1982), pJRY88 (Schultz et al., 1987), y pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA) . De manera alternativa, son usados vectores de expresión de Baculovirus. Los vectores de Baculovirus disponibles para la expresión de proteínas en células de insecto cultivadas (por ejemplo, Sf 9 o Sf 21) incluyen la serie del pAc (Smith et al., 1983) y la serie del pVL (Lucklow and Summers, 1989) . En incluso otra modalidad más, es usado un vector de expresión de mamífero para la expresión en células de mamífero. Los ejemplos de vectores de expresión de mamífero incluyen al pCDM8 (Seed, 1987) y el pMT2PC (Kaufman et al., 1987) . Cuando se usan en células de mamífero, las funciones de control del vector de expresión son con frecuencia proporcionadas por elementos reguladores virales. Un tipo de vector recombinante es un vector viral de AR o ADN de una o dos hebras, recombinante. Una variedad de sistemas de vectores virales son conocidos en la técnica. Los ejemplos de esos vectores incluyen, sin limitación, vectores adenovirales recombinantes , vectores basados en el virus del herpes simple (HSV) , vectores virales adenoasociados (AAV) , vectores adenovirales/AAV híbridos, retrovirus o lentivirus recombinantes, vectores de la viruela recombinantes, vectores de vaccinia virus recombinantes, vectores de SV-40, virus de insectos como los Baculovirus, y similares que son construidos para portar o expresar una composición de ácido nucleico seleccionada de interés. Los vectores de Retrovirus que pueden ser empleados incluyen aquellos descritos en la EP 0 415 731; Publicaciones de Patente Internacionales Nos. WO 90/07936; WO 94/03622; WO 93/25698; y WO 93/25234; Patente Estadounidense No. 5,219,740; Publicaciones de Patente Internacionales No. WO 93/11230 y WO 93/10218; Vile y Hart ; 1993 Cáncer Res. 53:3860-3864; Vile y Hart, 1993 Cáncer Res 53:962-967; Ram et al., 1993 Cáncer Res 53:83-88; Takamiya et al., 1992 J. Neurosci. Res. 33:493-503; Baba et al., 1993 J. Neurosurg. 79:729-735; Patente Estadounidense No. 4,777,127; Patente Británica No. 2,200,651; y EP 0 345 242. Los ejemplos de retrovirus recombinantes adecuados incluyen aquellos descritos en la Publicación de Patente Internacional No. WO 91/02805. Los vectores basados en Alfavirus también pueden ser usados como la molécula de ácido nucleico que codifica para la proteína variante de P4. Esos vectores pueden ser construidos a partir de una amplia variedad de alfavirus, incluyendo, por ejemplo, vectores del virus de Sindbis, virus forestal de Semliki (ATCC VR-67; ATCC V -1247) , virus de Ross River (ATCC VR-373; ATCC VR-1246) y virus de la encefalitis equina Venezolana (ATCC VR-923; ATCC VR-1250; ATCC VR 1249; ATCC VR-532) . Los ejemplos representativos de esos sistemas de vectores incluyen aquellos descritos en las Patentes Estadounidenses Nos. 5,091,309; 5,217,879; y 5,185,440; y las Publicaciones de Patentes Internacionales Nos. WO 92/10578; WO 94/21792; WO 95/27069; WO 95/27044; y WO 95/07994. Los ejemplos de vectores adenovirales incluyen aquellos descritos por Berkner, 1988 Biotechniques 6:616-627; Rosenfeld et al., 1991 Science 252:431-434; Publicación de Patente Internacional No. WO 93/19191; Kolls et al., 1994 PNAS 91:215-219; Kass-Eisler et al., 1993 PNAS 90:11498-11502; Guzman et al., 1993 Circulation 88: 2838-2848; Guzman et al., 1993 Cir. Res. 73:1202-1207; Zabner et al., 1993 Cell 75:207-216: Li et al., 1993 Hum. Gene Ther . 4:403-409; Cailaud et al., 1993 Eur. J. Neurosci. 5:1287-1291; Vincent et al., 1993 Nat . Genet. 5:130-134, Jaffe et . al, 1992 Nat . Genet. 1:372-378; and Levrero et al., 1991 Gene 101:195-202. Los vectores adenovirales ejemplares incluyen aquellos descritos en las Publicaciones de Patentes Internacionales Nos. WO 94/12649; WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 y WO 95/00655. Otros vectores adenovirales incluyen aquellos derivados de adenovirus de chimpancé, como aquellos descritos en la Patente Estadounidense No. 6,083,716. Otro vector viral se basa en un parvovirus como un virus adenoasociado (AAV). Los ejemplos representativos incluyen los vectores de AAV descritos en la Publicación de Patente Internacional No. O 93/09239, Samulski et al., 1989 J. Virol. 63:3822-3828; Mendelson et al., 1988 Virol . 166:154-165; y Flotte et al., 1993 PNAS 90:10613-10617. Otros vectores de AAV particularmente deseables incluyen aquellos basados en AAV1; véase, la Publicación de Patente Internacional No. WO 00/28061, publicada en Mayo 18, 2000. Otros vectores de AAV deseables incluyen aquellos los cuales están pseudotipificados, es decir, que contienen minigen compuesto de AAV 5' ITRS, un transgen, y AAV3 ' ITRS empaquetados en una cápsula de un serotipo de AAV heterólogo a los AAV ITR. Los métodos para producir esos vectores de AAV pseudotipificados son descritos con detalle en la Publicación de Patente Internacional No. WO 01/83692. En una modalidad en la cual la molécula de ácido nucleico de la invención es "ADN desnudo" , este puede ser combinado con polímeros, incluyendo polímeros tradicionales y polímeros no tradicionales como polímeros que contengan ciclodextrina y polímeros no . condensantes , interactivos, entre otros. El ADN "desnudo" y el ADN condensado con lípidos catiónicos o polímeros son proporcionados típicamente a la célula usando métodos químicos. En la técnica son conocidos numerosos métodos químicos para la liberación en la célula e incluyen el uso de lípidos, polímeros o proteínas para complejarse con el ADN, condensando opcionalmente el mismo en partículas, y liberándolo a las células. Otro método químico no viral incluye usar cationes para condensar ADN, el cual es entonces colocado en un liposoma y usado de acuerdo a la presente invención. Véase, C. Henry, 2001, Chemical and Engineering News, 79 (48) : 35-41. La molécula de ácido nucleico es introducida directamente en las células como ADN "desnudo" (Patente Estadounidense Número 5, 580,859) o formulada en composiciones con agentes, lo cual facilita la inmunización, como la bupivicaina y otros anestésicos locales (Patente Estadounidense Número 6,127,170). Todos los componentes de los vectores virales y no virales anteriores pueden ser seleccionados fácilmente de entre materiales conocidos en la técnica y disponibles de la industria farmacéutica. La selección de los componentes del vector y las secuencias reguladoras no son consideradas una limitación en esta invención. Cada secuencia de ácido nucleico que codifique para una proteína variante de P4 de acuerdo a -esta invención está preferiblemente bajo el control de secuencias reguladoras que dirigen la replicación y generación del producto de cada secuencia de ácido nucleico en una . - célula de mamífero. El término "secuencia promotora/reguladora" significa una secuencia de ADN requerida para la expresión de un ácido nucleico ligado operativamente a la secuencia promotora/reguladora. En algunos casos, la secuencia promotora/reguladora puede funcionar en una forma específica del tejido. Por ejemplo, una secuencia promotora/reguladora únicamente es capaz de dirigir la expresión en una célula de un tipo de tejido particular. En algunos casos, esta secuencia puede ser una secuencia promotora central y en otros casos, esta secuencia también puede incluir una secuencia mejoradora y otros elementos reguladores que sean requeridos para la expresión en una forma específica del tejido. Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico que codifica para una proteína variante de P4 de esta invención y/o el vector recombinante comprende además secuencias reguladoras. Por ejemplo, esas secuencias reguladoras comprenden un promotor que dirige la expresión de la proteína variante de P . Preferiblemente la secuencia promotora/reguladora está colocada en el extremo 5' de la secuencia codificadora, de modo que dirige la expresión de la proteína variante de P4 en una célula. Los promotores adecuados pueden se seleccionados fácilmente de entre promotores constitutivos, promotores inducibles, promotores específicos de un tejido y otros. Los ejemplos de promotores constitutivos que no son específicos en actividad y empleados en las moléculas de ácido nucleico que codifican para la proteína variante de P4 de esta invención incluyen, sin limitación, el promotor del virus del sarcoma de J?ous (RSV) , el promotor de LTR retroviral (opcionalmente con el mejorador de RSV) , el promotor de citomegalovirus (CMV) (opcionalmente con el mejorador de CMV) (véase, por ejemplo, Boshart et al, Cell, 41:521-530 (1985)), el promotor de SV40, el promotor de dihidrofolato reductasa, el promotor de ß-actina, el promotor de fosfoglicerol cinasa (PGK) , y el promotor de EFl (Invitrogen) . Los promotores inducibles que son regulados por compuestos suministrados exógenamente, incluyen, sin limitación, el promotor de arabinosa, el promotor de metalotionina (MT) de oveja inducible por zinc, el promotor del virus del tumor mamario de ratón (MMTV) inducible por dexametasona (Dex) , el sistema promotor de polimerasa T7 (WO 98/10088); el promotor de insecto de ecdisona (No et al, 1996 Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 93:3346-3351), el sistema reprimible por tetraciclina (Gossen et al, 1992 Proc. Nati. Acad. Sci, USA, 89:5547-5551), el sistema reducible por tetraciclina (Gossen et al, 1995 Science, 268:1766-1769, véase también Harvey et al, 1998 Curr. Opin. Chem. Biol . , 2/512-518), el sistema inducible por RU486 (Wang et al, 1997 Nat. Biotech., 15:239-243 y Wang et al, 1997 Gene Ther. , 4:432-441) y el sistema inducible por rapamicina (Magari et al, 1997 J. Clin. Invest . , 100:2865-2872). Otros tipos de promotores inducibles que pueden ser útiles en este contexto son aquellos regulados por un estado fisiológico específico, por ejemplo, temperatura o fase aguda o en células replicantes únicamente. Los promotores específicos en tejido incluyen los promotores de genes que codifican para ß-actina esquelética, cadena ligera de miosina 2A, distrofina, creatina cinasa muscular, así como promotores musculares sintéticos con actividades mayores que los promotores naturales (véase Li et al., 1999 Nat . Biotech., 17:241-245). Se conocen ejemplos de promotores que son específicos para tejidos, para hígado (albúmina, Mi atake et al. 1997 J. Virol . , 71:5124-32; promotor del núcleo del virus de la hepatitis B, Sandig et al., 1996 Gene Ther. , 3:1002-9; alfa-fetoproteína (AFP) , Arbuthnot et al., 1996 Hum. Gene Ther., 7:1503-14), hueso (osteocalcina, Stein et al., 1997 Mol. Biol . Rep., 24:185-196; sialoproteína ósea, Chen et al., 1996 J. Bone Miner. Res., 11:654-64), linfocitos (CD2, Hansal et al., 1988 J. Immunol . , 161:1063-8; cadena pesada de inmunoglobulina ; cadena a del receptor de célula T) , neuronales (promotor de enolasa neuroespecífica (NSE) , Andersen et al. 1993 Cell. Mol. Neurobiol . , 13:503-15; gen de la cadena ligera del neurofilamento, Piccioli et al., 1991 Proc. Nati. Acad. Sci . USA, 88:5611-5; el gen vgf específico de la neurona, Piccioli et al., 1995 Neuron, 15:373-84); entre otros. Véase, por ejemplo, la Publicación de Patente Internacional No. WO00/55335 para listas adicionales de promotores útiles conocidos en este contexto. Las secuencias reguladoras adicionales para la inclusión en una secuencia de ácido nucleico, molécula o vector de esta invención incluyen, sin limitación, una secuencia mejoradora, una secuencia de poliadenilación, una secuencia donadora de empalme y una secuencia receptora de empalme, un sitio para el inicio y finalización de la transcripción colocado al inicio y fin, respectivamente, del péptido a ser traducido, un sitio de unión ribosomal para la traducción en la región transcrita, una marca de epítope, una secuencia de localización nuclear, un elemento de IRES, un elemento de Goldberg-Hogness "TATA", un sitio de escisión de enzima de restricción, un marcador seleccionable y similares. Las secuencias mej oradoras incluyen, por ejemplo, la repetición en secuencia de 72 bp de ADN de SV40 o las repeticiones terminales largas retrovirales o LTR, etc. y se emplean para incrementar la eficiencia de la transcripción. La selección de promotores y otros elementos de vector comunes es convencional y muchas de esas secuencias están disponibles para diseñar las moléculas nucleotídicas y vectores útiles en esta invención. Véase, por ejemplo, Sambrook et al, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, (1989) y referencias citadas ahí, por ejemplo, las páginas 3.18-3.26 y 16.17-16.27 y Ausubel et al., Current Protocols en Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (1989) . Un experto en la técnica seleccionará fácilmente de entre esas secuencias reguladoras conocidas para preparar moléculas de esta invención. La selección de esas secuencias reguladoras no es una limitación de esta invención. C. Métodos para Producir las Proteínas Variantes de P4 y Moléculas Nucleotídicas de esta Invención La preparación o síntesis de las secuencias nucleotídicas y las proteínas variantes de P4 , así como las composiciones que contienen las moléculas nucleotídicas o proteína variante P4 de esta invención descrita en la presente está también dentro de la capacidad de una persona que tenga experiencia en la técnica usando el material disponible. Los métodos de síntesis no son una limitación de esta invención, los ejemplos siguientes detallan las modalidades preferidas hasta ahora para la síntesis de secuencias que codifican para las proteínas variantes de P4 de esta invención. Las proteínas variantes de P4 y moléculas y secuencias nucleotídicas de esta invención pueden ser producidas por métodos de síntesis química, métodos de ingeniería genética recombinante, mutagénesis dirigida al sitio, entre otros, y combinaciones de esos métodos.

Por ejemplo, las secuencias nucleotídicas/proteínas variantes de P4 de la invención pueden ser preparadas convencionalmente recurriendo a técnicas de síntesis química conocidas, por ejemplo, síntesis química en fase sólida, como de acuerdo a lo descrito por Merrifield, 1963 J. Amer. Chem. Soc, 85:2149-2154; J. Stuart y J. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Company, Rockford IL (1984) ; Matteucci et al., 1981 J. Am. Chem. Soc, 103:3185; Al arado-Urbina et al., 1980 Science, 214:270; y Sinha, N. D. et al., 1984 Nucí. Acids Res. 13:4539, entre otras. Véase, también, por ejemplo, PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2nd Ed. , T. E. Creighton, . H. Freeraan and Company, New York, 1993; Wold, F., "Posttranslational Protein Modifications : Perspectives and Prospects", páginas 1-12 en POSTTRANSLATIONAL COVALENT ODIFICATION OF PROTEINS, B.C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, 1983; Seifter et al., 1990 Meth. Enzymol . , 182:626-646, y Rattan et al., 1992 Ann. N. Y. Acad. Sci., 663:48-62. De manera alternativa, las composiciones de esta invención pueden ser construidas de manera recombinante usando técnicas de biología molecular convencionales, mutagénesis dirigida al sitio, ingeniería genética o reacción en cadena de la polimerasa, como, clonando y expresando una molécula nucleotídica que codifica para una proteína variante de P4 con otros inmunógenos y proteínas portadoras opcionales dentro de un microorganismo anfitrión, etc. utilizando la información proporcionada aquí (Véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2da Edición., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989) ; Ausubel et al. Current Protocols en Molecular Biology, John iley & Sons, New York (1997) ) . Las secuencias que codifican para las proteínas variantes de P4 y los inmunógenos opcionales pueden ser preparadas sintéticamente (W.P.C. Steramer et al, Gene, 164:49 (1995)). De manera alternativa, el ADN que codifica para la proteína P4 natural puede ser aislado de Haemophilus influenzae como se describe en la Patente Estadounidense No. 5,780,601, incorporada aquí como referencia, y someterse a mutación. En general, las técnicas de ADN recombinante implican obtener por síntesis o aislamiento la secuencia de ADN que codifique para la proteína variante de P4 como se describió anteriormente, e introducir esta en un sistema de expresión de vector/célula anfitriona apropiado donde es expresada. Cualquiera de los métodos descritos para la inserción de ADN en un vector de expresión pueden ser usados para ligar un promotor u otros elementos de control reguladora en sitios específicos dentro del vector recombinante seleccionado. Las proteínas variantes de P4 recombinantes de la invención pueden ser producidas como una proteína lipidada o no lipidada usando la secuencia codificadora líder de P4 o la secuencia no líder (o una secuencia líder que no especifique la acetilación de ácido graso como se discutió anteriormente), respectivamente. Puede ser usada una variedad de sistemas célula anfitriona-vector para expresar las proteínas variantes P4 de esta invención. Los sistemas para la clonación y expresión de las proteínas variantes de P4 y otras composiciones de esta invención usando las moléculas de ácido nucleico sintéticas incluyen el uso de varios microorganismos y células que son bien conocidos en la tecnología recombinante . La célula anfitriona puede ser seleccionada de cualquier organismo biológico, incluyendo células procarióticas (por ejemplo, bacterias) y células eucarióticas , incluyendo células de mamífero, células de insecto y células de levadura. Preferiblemente, las células empleadas en diferentes métodos y composiciones de esta invención son células de bacteria. Las células de bacteria adecuadas incluyen, por ejemplo, varias cepas de E. coli, Bacillus y Strepto yces . Células de levadura como Saccharomyces y Pichia, y células de insecto como las células Sf9 y Sf21 son también células anfitrionas útiles para propósitos de producción. Células de mamífero como las células de ovario de hámster Chino (CHO) , IH3T3, PER C6, NSO, VERO o COS también son células anfitrionas adecuadas. El vector puede ser seleccionado de uno de los vectores virales o vectores no virales descritos anteriormente pero debe ser compatible con la célula anfitriona usada. El vector de ADN recombinante puede ser introducido en células anfitrionas apropiadas (bacterias, virus, levaduras, células de mamífero o similares) por transformación, transducción o transfección (dependiendo del sistema vector/célula anfitriona) . Los sistemas anfitrión-vector incluyen pero no se limitan a bacterias transformadas con ADN de bacteriófago, ADN de plásmido o ADN de cósmido; microorganismos como levaduras que contengan vectores de levadura; sistemas de célula de mamífero infectados con virus (por ejemplo, vaccínia virus, adenovirus, etc.); y sistemas de células de insecto infectados con virus (por ejemplo, baculovirus) . La selección de otras células anfitrionas y métodos adecuados para la transformación, cultivo, amplificación, selección y producción y purificación de producto puede ser efectuada por un experto en la técnica con referencias técnicas conocidas. Véase, por ejemplo, Gething and Sambrook, 1981 Nature, 293:620-625, entre otras. Típicamente, la célula anfitriona es mantenida bajo condiciones de cultivo durante un periodo de tiempo suficiente para la expresión. Las condiciones de cultivo son bien conocidas en la técnica e incluyen la composición iónica y concentración, temperatura, pH y similares. Típicamente, las células transfectadas son mantenidas bajo condiciones de cultivo en el medio de cultivo. Los medios adecuados para varios tipos de células son bien conocidos en la técnica. En una modalidad preferida, la temperatura es de aproximadamente 20°C hasta aproximadamente 50°C, de manera más preferible de aproximadamente 30°C hasta aproximadamente 40°C y de manera aún más preferible de aproximadamente 37°C. El pH es, de manera preferible, de aproximadamente un valor de 6.0 a un valor de aproximadamente 8.0, de manera más preferible de aproximadamente de un valor de aproximadamente 6.8 hasta un valor de aproximadamente 7.8, y de manera más preferible aproximadamente 7.4. La osmolalidad es, de manera preferible, de aproximadamente 200 miliosmoles por litro (mosm/L) hasta aproximadamente 400 mosm/L y de manera más preferible de aproximadamente 290 mosm/L hasta aproximadamente 310 mosm/L. Otras condiciones biológicas necesarias para las transfección y expresión de una proteína codificada son bien conocidas en la técnica. La proteína variante P4 recombinante es recuperada o recolectada de las células anfitrionas o membranas de las mismas o del medio en el cual sean cultivadas esas células. La recuperación comprende aislar y purificar la proteína variante de P4 recombinante. Las técnicas de aislamiento y purificación para polipéptidos son bien conocidas en la técnica e incluyen procedimientos como la precipitación, filtración, cromatografía, electroforesis y similares.

..Cuando son producidas por medios recombinantes convencionales, las proteínas variantes de P4 de esta invención pueden ser aisladas y purificadas de la célula o medio de la misma por métodos convencionales, incluyendo la cromatografía (por ejemplo, de intercambio iónico, afinidad, y cromatografía en columna de tamaño) , centrifugación, solubilidad diferencial, o por cualesquier otras técnicas estándar para la purificación de proteínas. Existen varias técnicas para la purificación de proteínas heteróloga de células procarióticas . Véanse, las Patentes Estadounidenses Nos. 4,518,526; 4,599,197 y 4,734,362. La preparación purificada producida sin embargo deberá estar sustancialmente libre de toxinas del anfitrión, las cuales pueden ser peligrosas para los humanos. En particular, cuando sea expresada en células anfitrionas de bacterias negativas como E.coli, el péptido o proteína purificada deberá estar sustancialmente libre de contaminación con endotoxina. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual., 2d Edición, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989) . Las proteínas variantes de P4 usadas en los métodos y composiciones de la invención no se limitan a productos de ninguno de los procesos ejemplares específicos listados aquí. En efecto, la proteína puede ser preparada por los métodos en los textos citados inmediatamente arriba por métodos de los textos citados en cualquier otra parte en esta especificación. Está dentro de la experiencia en la técnica aislar y producir de manera recombinante o sintética composiciones de proteína para ese uso. La composición resultante puede ser formulada en una composición inmunogénica con cualquier número de inmunógenos opcionales y seleccionada por su eficacia por ensayos in vivo, como el ensayo BC descrito en los ejemplos más adelante. De manera alternativa, las proteínas y/o moléculas nucleotídicas preparadas como se describió anteriormente pueden ser útiles en ensayos de diagnóstico. D. Composiciones Inmunogenicas de esta Invención Las proteínas variantes de P4 de esta invención y las moléculas de ácido nucleico que las codifican pueden ser usadas en una variedad de composiciones inmunogénicas, para inducir una respuesta inmune protectora contra H. influenzae no tipificable. Esas composiciones inmunogénicas pueden ser usadas para prevenir o reducir la susceptibilidad a la otitis media aguda y otras enfermedades causadas por NTHi . Las composiciones inmunogénicas son útiles para inmunizar generalmente niños o adultos contra la otitis media o pueden ser útiles para niños en riesgo de contraer otitis media (por ejemplo, los niños con una historia de infecciones de oídos) . Esas proteínas de P4 variantes de NTHi también son adecuadas para incluirse en composiciones inmunogénicas contra varias cepas tipificables de H. influenzae como H. influenzae tipo b, debido a que el gen hel que codifica para la proteína P4 está antigénicamente conservado dentro de y entre las cepas de H. influenzae. Esas composiciones inmunogénicas pueden ser formuladas como vacunas univalentes y muítivalentes . Esas composiciones contienen además de una molécula de ácido nucleico que codifica para una proteína variante de P4 o la proteína en sí, otro antígeno o molécula nucleotídica que exprese ese otro antígeno. Esos antígenos adicionales para usarse en composiciones inmunogénicas de esta invención incluyen epítopes de célula B o T de otros antígenos. Entre esos "otros antígenos" para la coadministración con una proteína variante de P4 de esta invención están incluidos, sin limitación, otros antígenos de H. influenzae como otras proteínas de la membrana externa de H. influenzae (o péptidos o proteínas que tienen epítopes de los mismos) . Esas otras proteínas membranales de H. influenzae incluyen la liproproteína de membrana externa asociada con péptidoglicano (PAL) de 15000 daltons y la liproproteína de Haemophilus PCP de 15,000 daltons (Deich, R.A. et al. 1988 J. Bacteriol . 170 (2) :489-498) . El "otro" antígeno también puede incluir componentes capsulares de oligo- o polisacárido de H. influenzae, como componentes de poliribosilribitolfosfato (PRP) , o lipopolisacárido, lipooligosacárido o liposacárido de H. influenzae u otros microorganismos. "Otros" antígenos adicionales que pueden ser incluidos en las composiciones inmunogénicas de esta invención incluyen antígenos de otros organismos (por ejemplo, encapsulados o no encapsulados , bacterias, virus, hongos y parásitos) . Por ejemplo, antígenos de otros microorganismos implicados en la otitis media, como Streptococcus pneumonaie (incluyendo, pero sin limitarse, a uno o más polipéptidos de Streptococcus pneumonaie conocidos, conjugados de lipopolisacárido-proteína y conjugados de polisacárido-proteína, incluyendo, pero sin limitarse a, la vacuna de polisacárido capsular neumocócica 23-valente actualmente disponible y la vacuna de conjugado de polisacárido-proteína neumocócica 7-valente) , Streptococcus pyogenes grupo A, Staphylococcus aureus, virus sincitial respiratorio y Moraxella catarrhalis (incluyendo pero sin limitarse a, las proteínas UspAl, UspA2 , Bl, C/D, E y 74 kDa) pueden ser incluidos en las composiciones inmunogénicas de esta invención. 1. Uso de Proteínas Variantes de P4 en Composiciones Inmunogénicas Las proteínas variantes de P4 son formuladas, de manera deseable, en composiciones inmunogénicas para la inducción de una respuesta inmune protectora. De este modo, en una modalidad, una composición inmunogénica de esta invención contiene una o más de las proteínas variantes de P4 descritas anteriormente, en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Esa formulación comprende la proteína variante de P4 combinada con un vehículo farmacéuticamente aceptable, como agua estéril o solución salina isotónica estéril. Como se usa aquí, el término "vehículo farmacéuticamente aceptable" pretende incluir cualesquiera y todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifungales , agentes isotónicos y retardantes de la absorción, y similares, compatibles con la administración a humanos. El vehículo apropiado será evidente para aquellos expertos en la técnica y dependerá en gran parte de la ruta de administración. Las formulaciones incluyen, pero no se limitan a, suspensiones, soluciones, emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, pastas y formulaciones de liberación sostenida implantables o biodegradables . Esas formulaciones pueden comprender además uno o más ingredientes adicionales incluyendo, pero sin limitarse a, agentes suspensores, estabilizantes o dispersantes. En una modalidad de una formulación para administración parenteral, el ingrediente activo es proporcionado en forma seca (es decir, en polvo o granular) para su reconstitución con un vehículo adecuado (por ejemplo, agua libre de pirógenos estéril) antes de la administración parenteral de la composición reconstituida. Otras formulaciones administrables parenteralmente que son útiles, incluyen, aquellas, las cuales comprenden el ingrediente activo en forma microcristalina , en una preparación liposomal, o como un componente de un sistema polimérico biodegradable . Las composiciones para la liberación sostenida o implantación pueden comprender materiales poliméricos o hidrofóbicos farmacéuticamente aceptables como una emulsión, una resina de intercambio iónico, un polímero poco soluble, o una sal poco soluble. Incluso otros componentes adicionales que pueden estar presentes en las composiciones inmunogénicas de proteína de esta invención son adyuvantes, preserva ivos, estabilizadores químicos y otras proteínas antigénicas. Típicamente, los estabilizadores, adyuvantes y preservativos son optimizados para determinar la mejor formulación para la eficacia del objetivo humano o animal. Los preservativos ejemplares adecuados incluyen al clorobutanol , sorbato de potasio, ácido sórbico, dióxido de azufre, galato de propilo, parabenos, etil vainillina, glicerina, fenol, y paraclorofenol . Los ingredientes estabilizantes adecuados que pueden ser usados incluyen, por ejemplo, casamino ácidos, sucrosa, gelatina, rojo de fenol, N-Z amina, difosfato monopotásico, lactosa, hidrolizado de lactoalbúmina , y leche deshidratada . Se usa un adyuvante convencional para mejorar una respuesta inmune. Esos adyuvantes, incluyen, entre otros, MPLMR (monofosforil lípido A 3 -O-desacilado; Corixa, Hamilton, MT) , el cual es descrito en la Patente Estadounidense No. 4,912,094, la cual se incorpora aquí como referencia. También adecuados para usarse como adyuvantes son los compuestos de glucosaminfosfato de aminoalquilo (AGP) , o derivados o análogos de los mismos, los cuales se encuentran disponibles de Corixa (Hamilton, MT) , y que son descritos en la Patente Estadounidense No. 6,113,918, la cual se incorpora aquí como referencia. Uno . de esos AGP es el 2-[(R)-3-Tetradecanoiloxitetradecanoilamino] etil 2 -Desoxi -4 -O- fosfono-3-0- [ (R) -3-tetradecanoioxitetradecanoil] -2- [ (R) -3-tetradecanoioxitetradecanoilamino] -b-D-glucopiranosido, el cual también es conocido como 529 (anteriormente conocido como RC529) . Este adyuvante 529 es formulado como una forma acuosa o como una emulsión estable. Otros adyuvantes incluyen aceite mineral y emulsiones acuosas, sales de aluminio (alumbre) , como el hidróxido de aluminio, fosfasto de aluminio, etc., Amphigen, Avridine, L12l/escualeno , D-láctido-poliláctido/glicósido, polioles plurónicos, dipéptido muramilo, Bordetella muerta, saponinas, como la Quil A o Stimulon1 QS-21 (Antigenics, Framingham, MA) , descritas en la Patente Estadounidense No. 5,057,540, la cual se incorpora aquí como referencia, y partículas generadas a partir de las mismas como ISCOMS (complejos inmunoestimulantes) , Mycobacterium tuberculosis, lipopolisacáridos bacterianos, polinucleótidos sintéticos como oligonucleótidos que contienen un motivo de CpG (Patente Estadounidense No. 6,207,646, la cual se incorpora aquí como referencia) , toxina del cólera (en una forma natural o mutante, por ejemplo, donde el ácido glutámico en la posición del aminoácido 29 está reemplazado por otro aminoácido, preferiblemente una histidina, de acuerdo con la Publicación de Patente Internacional No. WO 00/18434, incorporada aquí como referencia) , una toxina pertussis (PT) , o una toxina termolábil (LT) de E.coli, particularmente LT-K63, LT-R72, CT-S109, PT-K9/G129; véase, por ejemplo, las Publicaciones de Patente Internacionales Nos. WO 93/13302 y WO 92/19265, incorporadas aquí como referencia. Varias citocinas y linfocinas son adecuadas para usarse como adyuvantes. Uno de esos adyuvantes es el factor estimulante de la colonia de Los granulocitos-macrófagos (GM-CSF) , que tiene una secuencia nucleotídica como se describe en la Patente Estadounidense No. 5,078,996, la cual se incorpora aquí como referencia. Un plásmido que contiene ADNc de GM-CSF ha sido transformado en E.coli y ha sido depositado con la American Type Culture Collection (ATCC) , 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, con el Número de Acceso 39900. La citocina interleucina-12 (IL-12) es otro adyuvante que es descrito en la Patente Estadounidense No. 5,723,127, la cual se incorpora aquí como referencia. Se ha demostrado que otras citocinas o linfocinas tienen actividad inmunomoduladora, incluyendo, pero sin limitarse a, las interleucinas 1-alfa, 1-beta, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 13, 14, 15, 16, 17 y 18, los interferones alfa, beta y gamma, factor estimulante de la colonia de granulocitos, y los factores de necrosis tumoral alfa y beta, y son adecuados para usarse como adyuvantes . Otros adyuvantes adecuados incluyen, pero no se limitan a: sustancias tensoactivas (por ejemplo, hexadecilamina, octadecilamina, esteres de octadecil aminoácidos, lisolecitina, bromuro de dimetil-dioctadecilamonio) , metoxihexadecilglicerol , y polioles plurónicos; poliaminas, por ejemplo, pirano, sulfato de dextrano, poli IC, carbopol , péptidos, por ejemplo, dipéptido muramilo, dimetilglicina, tuftsina; emulsiones oleosas; y geles minerales, por ejemplo, fosfato de aluminio, etc y complejos estimulantes inmunes. El inmunógeno también puede ser incorporado en liposomas, o conjugado con liposacáridos , lipopolisacáridos y/u otros polímeros para usarse en una formulación de vacuna. Como se describió anteriormente, un componente inmunogénico adicional puede incluir uno o más antígenos adicionales opcionales, como se describió anteriormente. Para la administración combinada con epítopes y otras proteínas de la membrana externa, la proteína variante de P4 puede estar presente por separado en mezcla con los otros antígenos o puede estar presente como un conjugado o como una proteína de fusión que comprenda determinantes de proteína de la membrana externa múltiples o determinantes antigénicos múltiples con otros antígenos de H. influenzae o que no sean de H. Influenzae. Por ejemplo, la PAL y PCP de H. Influenzae o cualesquier proteínas, péptidos o epítopes derivados de ellas, pueden ser administrados como una mezcla o como un conjugado o fusión de una proteína variante de P4 de esta invención. En la formulación de las composiciones inmunogénicas con la proteína variante de P4 en esta invención, solas o en las diferentes combinaciones descritas, el inmunógeno es ajustado a una concentración apropiada y formulado con cualquier adyuvante adecuado. En algunas modalidades preferidas, la composición inmunogénica de proteína de la invención es preparada para administrarse a sujetos humanos en forma de, por ejemplo, líquidos, polvos, aerosoles, tabletas, cápsulas, tabletas con recubrimiento entérico o cápsulas, o supositorios. 2. Composiciones Inmunogénicas que Contienen Moléculas de Ácido Nucleico Otra modalidad de una composición inmunogénica de esta invención comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para una proteína variante de P4 de esta invención y un vehículo farmacéu icamente aceptable. Las secuencias de ácido nucleico que codifican para una proteína variante de P4 para usarse en la composición inmunogenica contra NTHi pueden estar presentes en un vehículo farmacéuticamente adecuado o fisiológicamente aceptable, como solución salina isotónica o solución isotónica de sales. El vehículo apropiado será evidente para aquellos expertos en la técnica y dependerá en gran parte de la ruta de administración. De manera alternativa, las composiciones inmunogénicas compuestas de moléculas polinucleotídicas contienen, de manera deseable, agentes facilitadores polinucleótidicos opcionales o "coagentes", como un anestésico local como un péptido, un lípido, incluyendo lípidos catiónicos, un liposoma o partícula lipídica, un policatión como la polilisina, un policatión tridimensional, ramificado, como un dendrímero, un carbohidrato, un anfifilo catiónico, un detergente, un tensoactivo de bencilamonio, u otro compuesto que facilite la transferencia de polinucleótido a células. Los ejemplos no exclusivos de esos agentes facilitadores o coagentes útiles en esta invención se describen en las Patentes Estadounidenses Nos. 5,593,972; 5,703,055; 5,739,118; 5,837,533; Publicación de Patente Internacional No. WO 96/10038, publicada en Abril 4, 1996, y Solicitud de Patente Internacional No. WO 94/16737, publicada en Agosto 8, 1994, las cuales se incorporan aquí como referencia.

.De manera más preferible, el anestésico local está presente en una cantidad que forma uno o más complejos con las moléculas de ácido nucleico. Cuando el anestésico local es mezclado con moléculas de ácido nucleico o plásmidos de esta invención, forman una variedad de complejos o partículas pequeñas que empaquetan el ADN y son homogéneas. De este modo, en una modalidad de las composiciones inmunogénicas de esta invención, los complejos se forman mostrando el anestésico local y al menos un plásmido de esta invención. Un solo complejo resultante de esta mezcla puede contener una variedad de combinaciones de los diferentes plásmidos. De manera alternativa, en otra modalidad de las composiciones de esta invención, el anestésico local puede ser mezclado previamente por cada plásmido por separado, y entonces las mezclas separadas combinadas en una sola composición para asegurar que esté presente la relación deseada de los plásmidos en una sola composición inmunogénica, si todos los plásmidos van a ser administrados en una administración de un solo bolo. De manera alternativa, el anestésico local y cada plásmido pueden ser mezclados por separado y administrados por separado para obtener la relación deseada. Donde, aquí posteriormente, el término "complejo" o "uno o más complejos" o "complejos" se usa para definir esta modalidad de la composición inmunogénica, debe comprenderse que el término abarca uno o más complejos con cada complejo conteniendo una mezcla de plásmidos que codifican para la proteína variante de P4, o una mezcla de complejos formados discretamente, donde cada complejo contiene únicamente un tipo de plásmido, o uno o una mezcla de complejos donde cada complejo contiene un ADN policis ronico. Preferiblemente, los complejos son de entre aproximadamente 50 hasta aproximadamente 150 nm de diámetro. Cuando el agente facilitador usado es un anestésico local, preferiblemente bupivacaina, se prefiere una cantidad de aproximadamente 0.1 por ciento en peso hasta aproximadamente 1.0 por ciento en peso sobre la base del peso total de la composición polinucleotídica. Véase, también, la Publicación de Patente Internacional No. O 99/21591, la cual se incorpora aquí como referencia, y que enseña la incorporación de tensoactivos de bencilamonio como coagentes, preferiblemente administrados en la cantidad de 0.001-0.03% en peso. De acuerdo a la presente invención, la cantidad de anestésico local está presente en una relación de moléculas de ácido nucleico de 0.01-2.5% p/v de anestésico local a 1-10 µg/ml de ácido nucleico. Otros de esos intervalos es de 0.05-1.25% p/v de anestésico local a 100 µg/ml a 1 ml/ml de ácido nucleico. En este procedimiento de inmunización polinucleotídica, las proteínas P4 variantes de la invención son expresadas sobre una base transitoria in vivo; y no es insertado o integrado material genético en los cromosomas del anfitrión. Este procedimiento debe distinguirse de la terapia genética, donde la meta es insertar o integrar el material genético de interés en el cromosoma. Se usa un ensayo para confirmar que los polinucleótidos administrados por la inmunización dan lugar a un fenotipo transformado del anfitrión (Patente Estadounidense No. 6,168,918). Las composiciones inmunogénicas también pueden comprender otros aditivos adecuados para el modo de administración seleccionado de la composición. La composición de la invención también puede implicar polinucleótidos liofilizados , los cuales pueden ser usados con otros excipientes farmacéuticamente aceptables para desarrollar formas de dosificación en polvo, líquidas o en suspensión. Véase, por ejemplo Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Vol . 2, 19a edición, (1995), por ejemplo, Capítulo 95 aerosoles; y la Publicación de Patente Internacional No. WO 99/45966; las enseñanzas de la cual se incorporan aquí como referencia. La ruta de administración para esas composiciones pueden ser combinadas, si se desea, o aj ustadas . Opcionalmente, como se describió anteriormente, esas composiciones inmunogénicas que contienen moléculas de ácido nucleico pueden incluir secuencias de ácido nucleico que codifiquen para uno o más de los antígenos "adicionales" anotados anteriormente. Por ejemplo, las moléculas nucleotídicas individuales que codifican para antígenos individuales pueden ser mezcladas con la molécula nucleotídica que contenga la secuencia que codifica para la proteína variante de P4. De manera alternativa, la secuencia que codifica para la proteína variante de P4 puede ser fusionada a la secuencia de ADN que codifique para uno o más de otros antígenos de H. influenzae o antígenos de otras bacterias, virus, parásitos u hongos parta crear antígenos multivalentes (que comparten una estructura peptídica común) fusionados genéticamente. Esas composiciones inmunogénicas que contienen moléculas de ácido nucleico pueden contener aditivos adecuados para la administración vía cualquier ruta de administración convencional. En algunas modalidades preferidas, la composición inmunogénica de la invención es preparada para la administración a sujetos humanos en forma de, por ejemplo, líquidos, polvos, aerosoles, tabletas, cápsulas, tabletas con recubrimiento entérico o cápsulas o supositorios. 3. Composiciones Inmunogénicas que Contienen Virus Recombinantes En un aspecto adicional más de esta invención, las composiciones inmunogénicas pueden contener un virus recombinante que sea capaz de expresar la proteína variante de P4 (o cualquier inmunógeno adicional) . Los virus no patógenos adecuados que pueden ser modificados para llevar la molécula de ácido nucleico de esta invención a las células del anfitrión incluyen poxvirus, como vaccinia, adenovirus, virus adenoasociados , virus de la viruela del canario, retrovirus y similares. Preferiblemente, para la administración, el virus es un virus no replicante, como un adenovirus desprovisto de El, típicamente aquellos usados en terapia genética. Véase, como un ejemplo, la replicación recombinante de adenovirus defectuoso descrito en la Patente Estadounidense No. 5,698,202, entre otros. Comúnmente se usan numerosos de esos virus no patógenos para terapia genética humana y como portadores de otros agentes para vacunas, y son conocidos y seleccionables para un experto en la técnica. Preferiblemente, el virus no replicante que contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína variante de P4 de esta invención es suspendido en una solución biológicamente compatible o un vehículo de liberación armacéuticamente aceptable. Un vehículo adecuado es solución salina estéril. Pueden ser empleadas para este propósito otras soluciones para inyección estériles isotónicas acuosas y no acuosas y suspensiones estériles acuosas y no acuosas por ser vehículos farmacéuticamente aceptables y bien conocidos por aquellos expertos en la técnica.

. Opcionalmente, este tipo de composición inmunogénica de la invención puede ser formulada de modo que contenga otros componentes, incluyendo, por ejemplo adyuvantes, estabilizantes, ajustadores de pH, preservativos como se mencionó anteriormente. Esos componentes son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica de las vacunas. Incluso una modalidad adicional adecuada para una composición inmunogénica de acuerdo a esta invención es el uso de composiciones inmunogénicas inactivadas, por ejemplo, grandes cantidades de virus recombinantes que expresen las proteínas variantes de P4 deseadas se hacen crecer en cultivo para proporcionar la cantidad necesaria . de antígenos relevantes e inactivados por medios convencionales. Una mezcla de virus inactivados que exprese los diferentes epítopes puede ser usada para la formulación de composiciones inmunogénicas "multivalentes" , como se describe en la Patente Estadounidense No. 5,780,601, incorporada aquí como referencia. Esta composición inmunogénica también deberá contener un adyuvante adecuado, como se describió anteriormente, para mejorar la respuesta inmunológica a los antígenos. 4. Composiciones Inmunogénicas que Contienen Bacterias Comensales En otro aspecto más de la presente invención, las moléculas de ácido nucleico sintéticas de esta invención que codifican para la proteína variante de P4 (incluyendo cualquier proteína de fusión y/o antígeno adicional) pueden ser incorporadas en un microorganismo no patógeno. El microorganismo resultante, cuado se administra a un anfitrión humano, expresa y multiplica las composiciones expresadas de esta invención in vivo para inducir la formación de un anticuerpo específico. Por ejemplo, puede ser empleada una bacteria comensal no patógena para abortar las moléculas que codifican para la proteína variante de P4 de esta invención y para ser útil para la administración a un paciente puede ser preparada mediante el uso de la metodología convencional y seleccionada de entre microorganismos no patógenos conocidos. Entre las bacterias comensales que pueden ser útiles para la liberación exógena de la molécula de ácido nucleico de esta invención al paciente in vivo, se incluyen, sin limitación, varias cepas de Streptococcus, por ejemplo, S. gordonii , o E.coli, Bacillus, Streptomyces, y Saccharomyces . Las composiciones inmunogénicas de la presente invención, como se describió anteriormente, no son limitadas por la selección de los portadores, o adyuvantes u otros ingredientes convencionales, fisiológicamente aceptables, útiles en preparaciones farmacéuticas de los tipos descritos anteriormente. La preparación de esas composiciones farmacéuticamente aceptables, de los componentes descritos anteriormente, que tienen pH, isotonicidad, estabilidad y otras características convencionales apropiadas está dentro del conocimiento de la técnica.

-E. Métodos de Uso Las composiciones inmunogénicas descritas anteriormente pueden ser empleadas en un método para inducir una respuesta inmune en un humano contra H. influenzae no tipificable. En una modalidad de este método, es administrada a un paciente una cantidad efectiva de una composición inmunogénica de proteína variante de P4 como se describió anteriormente. La cantidad de proteína P4 , molécula de ácido nucleico que expresa la variante de P4 , o el virus recombinante que expresa la variante de P4 en la composición es aquella cantidad efectiva para producir una respuesta inmune contra NTHi . Preferiblemente, la respuesta inmune es protectora contra la infección de NTHi . Las rutas de administración para las composiciones inmunogénicas incluyen, sin limitación, la administración parenteral, administración intraperitoneal , administración intravenosa, administración intramuscular, administración subcutánea, administración intradérmica, administración oral, administración tópica, administración intranasal, administración intrapulmonar, administración rectal, administración vaginal, y similares. Todas esas rutas son adecuadas para la administración de esas composiciones. La ruta de administración apropiada es seleccionada dependiendo de la naturaleza de la composición inmunogénica usada, y una evaluación de la edad, peso, sexo y salud general del paciente y los antígenos presentes en la composición inmunogénica, y factores similares por el médico que preste la atención. En general, la selección de la "cantidad efectiva" o dosis apropiada para las composiciones inmunogénicas de la presente invención también se basará en la composición inmunogénica particular empleada, así como la condición física del sujeto, incluyendo, de manera más especial, la salud general y peso del sujeto inmunizado. Esa selección y ajuste hacia arriba o hacia abajo de la dosis efectiva está dentro de los conocimientos de la técnica. La cantidad de componente activa requerida para inducir una respuesta inmune, preferiblemente una respuesta protectora, que producir un efecto exógeno en el paciente sin efectos laterales adversos significativos varía dependiendo de la composición farmacéutica empleada y la presencia opcional de un adyuvante (para las composiciones que contiene proteína) . En una modalidad, para las composiciones que contienen componentes proteicos, por ejemplo, proteína variante de P4 o proteínas de fusión como se describió anteriormente, cada dosis comprenderá entre aproximadamente 1 µg hasta aproximadamente 20 mg de los inmunógenos de proteína por mL de solución estéril. También pueden ser contemplados otros intervalos de dosis por un experto en la técnica. Las dosis iniciales pueden ser seguidas, opcionalmente , por refuerzos repetidos, donde sea deseable.

En otra modalidad, las cantidades de moléculas nucleotídicas en las composiciones de ADN y vector pueden ser seleccionadas y ajustadas por un experto en la técnica. En una modalidad, cada dosis comprenderá entre aproximadamente 50 g hasta aproximadamente 1 mg del ácido nucleico que codifique para el inmunógeno, por ejemplo, plásmido de ADN, por mL de una solución estéril . Para virus recombinantes , preferiblemente de replicación defectuosa, que contiene las moléculas de ácido nucleico que codifican para las proteínas variantes de P4 de esta invención, la "cantidad efectiva" es una cantidad de virus recombinante que es efectiva en una ruta de administración para transfectar las células deseadas del sujeto y proporcionar niveles suficientes de expresión del gen seleccionado para proporcionar un beneficio, es dec r, inmunidad protectora. Los niveles de inmunidad pueden ser verificados para determinar la necesidad, si la hay, de refuerzos. Sin embargo, debe comprenderse que un experto en la técnica puede alterar esas dosis dependiendo de la identidad del virus recombinante y el enmascaramiento de los inmunógenos (es decir, la presencia de proteínas variantes de P4 adicionales u "otros antígenos" que el virus recombinante esté proporcionando al anfitrión) . Las cantidades de bacterias comensales que contienen una secuencia de ácido nucleico que expresa para una proteína variante de P4 a ser proporcionada al paciente generalmente fluctuarán entre aproximadamente 103 hasta aproximadamente 1012 células/kg. Esas dosis pueden ser alteradas por un experto en la técnica dependiendo del bacteria que esté siendo usada y las proteínas variantes de P4 adicionales u "otros antígenos" que estén siendo proporcionados al anfitrión por la bacteria viva. F. Uso de Variantes de P4 como Proteínas Portadoras Además de su utilidad como un inmunógeno primario, la proteína variante de P4 puede ser usada como una proteína portadora para conferir o mejorar la inmunogenicidad de otro antígeno, donde los otros antígenos pueden ser una proteina como un polipéptido, péptido, polisacárido , oligosacárido, sacárido, lipopolisacárido, lipooligosacárido o liposacárido . La proteína P4 variante tiene actividad enzimática reducida en comparación con la proteina P4 natural, pero no necesariamente induce un anticuerpo para la proteína P4 natural o tiene actividad bactericida contra NTHi, con la condición de que la proteína portadora de variante de P4 no tiene una fenilalanina en la posición del aminoácido 122 de la SEQ ID NO: 3. Por ejemplo, la proteína variante de P4 es conjugada químicamente por medios convencionales a un polisacárido o lipopolisacárido o expresada como una proteína de fusión con otra proteína. G. Ensayos de Diagnóstico Las proteínas variantes de P4 y moléculas de ácido nucleico de esta invención, asociadas opcionalmente con marcas detectables o con componentes capaces de detectar la formación del complejo inmune o hibridaciones de ADN, también pueden ser usadas como antígenos en ensayos para la detección de H. influenzae no tipificable en varios tejidos y fluidos corporales, por ejemplo sangre, fluido espinal, esputo, etc. Esos ensayos y formatos de ensayo son convencionales y tendrán los mismos formatos descritos para el uso de reactivos de P4 natural, como se describe en la Patente Estadounidense No. 5,780,601. Por ejemplo, las proteínas variantes de P4 de esta invención pueden ser empleadas como reactivos en radioinmunoensayos, ensayos de ELISA, ensayos de "emparedado", reacciones de precipitina, reacciones de precipitina por difusión en gel, ensayos de inmunodifusión, ensayos de aglutinación, inmunoensayos fluorescentes, inmunoensayos con proteína A y ensayos de inmunoelectroforesis . La proteína variante de P4 de esta invención está asociada opcionalmente con una marca detectable . Las moléculas de ácido nucleico que codifican para una proteína variante de P4 de esta invención o cualesquier secuencias nucleotídicas que se hibriden con ésta pueden también ser usadas como sondas en ensayos de hibridación de ácido nucleico para la detección de H. influenzae no tipificable, en varios tejidos o fluidos corporales de pacientes. Los ensayos de hibridación adecuados incluyen, sin limitación, electroinmunotransferencia Southern, electroinmunotransferencia Northern, y electroinmunotransferencia de colonias, entre otras. La rigurosidad de la hibridación puede variar dependiendo de los requerimientos del ensayo. Las marcas detectables adecuadas incluyen, sin limitación, una proteína o molécula química pequeña que es capaz, actuando sola o en concierto con otras moléculas o proteínas, de proporcionar una señal, que es detectable directa o indirectamente. Por ejemplo, una marca detectable puede ser una marca fluorescente, una marca luminiscente, una marca radioactiva o una marca quimioluminiscente . Una marca también puede ser una enzima que interactúe con un sustrato para producir una señal detectable. Véase, por ejemplo, Handbook of Fluorescente Probes and Research Chemicals, 6ca Edición, R.P. Haugland, Molecular Probes, Inc., Eugene, OR (1996); Patente Estadounidense No. 4,542,104 y Patente Estadounidense No. 5,272,257. Otras marcas más incluyen las proteínas fluorescentes verdes y las proteínas fluorescentes azules. Las marcas adecuadas para las moléculas de ácido nucleico pueden ser secuencias de ADN que codifiquen para un gen lux, beta-lactamasa, una enzima galactosidasa, por ejemplo, beta-galactosidasa (LacZ) , fosfatasa alcalina, timidina cinasa, proteína fluorescente verde (GFP) , cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) , una enzima luciferasa, o una enzima gluconasa. Cualquier número de sistemas marcadores adicionales, y empleado de manera convencional, pueden ser adaptados - para asociarse con las proteínas variantes de P4 y/o secuencias de ácido nucleico que codifiquen para las proteínas variantes de P4 de esta invención. Un experto en la técnica comprende que la selección y/o implementación de un sistema de marcas implica solo experimentación de rutina. EJEMPLOS Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar la producción y actividad de proteínas variantes de P4 representativas de esta invención. Los ejemplos presentados aquí muestran la construcción de películas nucleotídicas aisladas que codifican para proteínas variantes de P4, la expresión recombinante en células anfitrionas, y la purificación de las mismas. Las proteínas purificadas fueron analizadas por su actividad enzimática en un ensayo colorimétrico sensible. Las proteínas también fueron usadas para inmunizar ratones Swiss-Webster, junto con rLP4 natural y los antisueros resultantes fueron analizados para determinar los anticuerpos IgG totales contra rLP4 natural y la actividad bactericida contra NTHi . Esos ejemplos demuestran que la determinación de cuales mutantes de P4 carecen de actividad enzimática, retiene a la vez inmunogenicidad natural y la producción de anticuerpos funcionales no es un caso trivial . Tres de las proteínas P4 mutantes construidas como se describe más adelante poseen las propiedades inmunogénicas deseadas, es decir, producir títulos de ELISA altos contra P4 natural y niveles altos de anticuerpos bactericidas contra NTHi. Un experto en la técnica apreciará que aunque se exponen reactivos y condiciones específicas en los siguientes ejemplos, esos reactivos y condiciones no son una limitación en la presente invención. EJEMPLO 1: MUTAGENESIS DIRIGIDA AL SITIO DEL GEN DE P4 Las ácido fosfatasa bacterianas han sido bien estudiadas durante años, y han sido divididas en clases múltiples basándose en su especificidad en sustrato, ubicación celular, etc. (Thaller, M. C. et al, 1998. Prot . Sci., 7:1647-52.9). Las regiones con aminoácidos altamente conservados entre múltiples ácido fosfatasa bacterianas han sido identificadas como áreas probables para la mutagénesis dirigida al sitio para eliminar o reducir la actividad enzimática, y haciendo cambios conservativos, manteniendo la estructura terciaria. La mutagénesis dirigida al sitio se efectuó en P4 natural antes de que fueran usados cebadores sintéticos para introducir sitios de BsmBl y las mutaciones deseadas como se describe más adelante. La digestión con BsmBl y la religación dio como resultado la secuencia de P4 mutante deseada con la pérdida concomitante del sitio de BsmBl. Esas proteínas mutantes lipidadas fueron expresadas en células anfitrionas E. coli BLR, y purificadas por una ligera modificación del procedimiento estándar usado para purificar rLP4 natural lipidada. Específicamente, se construyó un mutante dirigido a un doble sitio de ácido aspártico sobre la base de la información de que dos residuos de ácido aspártico en la proteína P4 natural fueron críticos para la actividad de la ácido fosfatasa. Se construyó un rautante designado P4-351 en el cual los aminoácidos residuales en las posiciones Asp64 y Asp66 de la SEQ ID NO: 3 fueron cambiados a Ala64 y Ala66. Se construyó otro mutante designado como P4-D184A, D185A en el cual la Aspl84 y la Aspl85 naturales de la SEQ ID NO: 3 fueron sometidas a mutación a la Alal84 y Alal85. En otros mutantes, la mutagénesis dirigida al sitio de los aminoácidos residuales 35 y 37 de la SEQ ID NO: 3 dio como resultado cuatro proteína, cambiando el residuo ácido alanina a cualquiera de ácido glutámico (A35G, A37G) , treonina (A35T, A37T) , asparagina (A35D, A37D) , o glutamina (A35Q, A37Q) . Esos mutantes fueron construidos para determinar si cambios en otra región diferente a la de Asp a Ala darían como resultado una perturbación menos conformacional de la molécula de proteína y de este modo mejor inmunogenicidad contra la P4 natural. Adicionalmente , se hicieron las siguientes mutaciones únicas en la proteína P4 para generar proteínas variantes de P4 N218Q, K161R, D64E, Y122F, D64N, D64E y Q39E. Además, el residuo de Phe en la posición 48 fue cambiado a un residuo de Cys. Este residuo fue seleccionado para la mutagénesis sobre la base de su posición en un dominio de unión de hemina putativo. Esta variedad de proteínas variantes expresadas se produjo como se identifica en la Tabla 1.

Tabla 1. Las proteínas y mutaciones de la variante de P4 mu ante Todos los mutantes dirigidos al sitio con la excepción de F48C y D64A, D66A fueron derivados del plásmido pLP339, un vector de expresión de pBAD18Cam que contiene el gen de P4 de H. influenzae no tipificable (NTHi) natural (Green, B. A., et al 1991 Infect. Immun., 59; 3191-3198 ) bajo control del promotor de arabinosa. Las proteínas mutantes D64A, D66A, y F48C derivadas de pHel3 plasmídico (Reilly et al, 1999, citado anteriormente) La mayoría de las proteínas mutantes dirigidas al sitio fueron construidas usando el equipo de mutagénesis QuickChange (Stratagene) de acuerdo a las directrices del fabricante. Los cebadores usados para construir las mutaciones de P4 se listan en la Tabla 2 más adelante. Los cebadores oligonucleotídicos usados aquí, (con la excepción de los usados por Reilly et al, 1999, citados anteriormente) , fueron sintetizados sobre un sintetizador oligonucleotídico de PerSeptive Biosystems (Applied Biosystems, Foster City, CA9 usando la química de la ß-cianoetilfosforamidita . Tabla 2. Cebadores usados para la mutagénesis dirigida al sitio del gen hel. Mutación Secuencia (5' a 3' ) SEQ ID NOS F48C GCAAAAGTTGCATGCGATCACGCAAAAG 4 CTTTTGCGTGATCGCATGCAACTTTTGC 5 D64A & GCGGTTGTGGCTGCTTTAGCTGAAACTATGTTAG 6 D66A CTAACATAGTTTCAGCTAAGCAGCCACAACCGC 7 K161R GCGCGTCTCTTGCATTTTATTTGAAAAAAGACAAATCAGCT 8 AGAGCGGCTC GCGCGTCTCGTGCAGATTCTTCCACGCCATTGAAACC 9 Tabla 2. (continuación) Se usó una clonación consútil de BsmBI para generar varios de los mutantes de P . Se amplificaron secciones del gen de P4 por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (ciclador térmico PE 2400, Applied Biosystems, Foster City, CA) del plásmido pLP339. Primero, se apareó un cebador que contenia un sitio de BsmBI y la mutación deseada con el cebador de vector apropiado y se usó para amplificar una sección del gen de P . Adicionalmente, se apareó el segundo cebador que contiene un sitio de BsmBI con un cebador de vector apropiado y se usó para amplificar la sección restante del gen de P4. Cada sección de P4 fue ligada y clonada a pCR2.1-T0P0 (Invitrogen) . Los transformantes fueron separados por PCR por la presencia de un inserto y confirmados por análisis de secuencia. Las clonas correctas fueron digeridas por restricción con BsmBI y SacI o Sphl (enzimas de restricción suministradas por New England Biolabs) y los insertos fueron purificados sobre geles de agarosa de bajo punto de fusión. Los fragmentos purificados en gel fueron ligados de manera inconsútil juntos en los sitios de BsmBI. Los genes de P4 mutantes que fueron clonados en pCR2.1-TOPO fueron subclonados en pBAD18Cam (Invitrogen) por la expresión de la proteína P4 mutante usando los sitios Sacl-Sphl, con la excepción del gen F48C. La secuencia de F48C fue subclonada en pBAD18Cam usando los sitios de Nhel-Sacl. EJEMPLO 2: EXPRESION DE PROTEINAS P4 MUTANTES RECOMBINADAS LIPIDADAS. Los plásmidos que contienen esas proteínas P4 mutantes fueron transformados en E. coli cepa de BLR y todas las proteínas P4 mutantes fueron expresadas de manera recombinante allí. Los clones fueron confirmados secuenciando el gen de P4. Cultivos nocturnos BLR que contenían los plásmidos apropiados se hicieron crecer en medio Hy-Soya amortiguado con NaP04 que contenía 0.05% de glucosa y 30 µg/ml de cloranfenicol a 37°C con aereación. Se inocularon matraces que contenían el mismo medio menos la glucosa con una dilución de 1:20 del cultivo nocturno y se incubaron a 37°C con aireación hasta que la D06oo alcanzó aproximadamente 2.0. Las bacterias fueron entonces inducidas con arabinosa 0.5% y se continuó la incubación durante 3 horas. Las células bacterianas fueron cosechadas por centrifugación a 10,000 x g, 4°C durante 30 minutos, y los sedimentos celulares fueron lavados IX con PBS . Las células fueron resedimentadas y almacenadas congeladas a -20 °C. La expresión de proteína P4 fue expresada por análisis SDS-PAGE de todos los lisados celulares al 12%. EJEMPLO 3: PURIFICACION DE P4 RECOMBINADA LIPIDADA Y MOTANTES . Las proteínas mutantes de P4 fueron entonces purificadas como sigue: Las células E.coli fueron suspendidas en amortiguador hipotónico (HEPES-NaOH lOmM, pH 7.4, Na2EDTA lmM) y lisadas bajo presión alta (aproximadamente 1265.58 kgf/cm2 (18,000 psi)) haciendo pasar la suspensión celular a través de un microfluidizador . Las membranas fueron obtenidas después de una ultracentrifugacion durante 1 hr a 300,000xg a 10°C en un rotor Beckman 45Ti. Las proteínas de la membrana interna y externa fueron solubilizadas de manera diferencial por extracciones secuenciales con Tritón X-100 1% (p/v) en HEPES-NaOH lOmM, pH 7.4, MgCl2 1 nnM y Zwittergent 3-12 al 1% (p/v) en Tris-HC1 50 mM, pH 8, Na2EDTA 5mM, respectivamente. Los extractos de Zwittergent 3-12 solubilizaron la rLP4 o proteínas mutantes. Las proteínas de interés fueron purificadas por fraccionación sobre columnas de intercambio iónico en cascada (DEAE y SP-sefarose) . La proteína rLP4 eluye de SP-sefarose en un gradiente de sal de 0-0.2M como dos picos designados Forma 1 y Forma 2. La forma 2 es convertida a la Forma 1 congelando lentamente un amortiguador de fosfato de Na 10 m , pH 7.1, NaCl 150 mM, Zwittergent 3-12 al 1%, seguido por diálisis en amortiguador de Tris-EDTA-Zwittergent 3-12, pH 8.

La Forma 1 convertida es purificada adicionalmente sobre una columna de SP-sefarose. Los mutantes de rLP4 fueron purificados por el mismo método que la proteína natural, excepto que la mutación redujo el pl de la proteína. En esos casos, después de la extracción el amortiguador fue cambiado a HePES-NaOH lOmM, pH 7.4, Na2EDTA lmM, Zwittergent 3-12 al 1% (p/v) antes del paso de columnas en cascada. Este amortiguador también fue usado para al elusión de la columna de SP-Sefaróse. La mayoría de los mutantes de rLP4 eluyeron en un solo pico de proteína. La proteína fue ensayada usando el ensayo de ácido bicincronínico de acuerdo a las directrices del fabricante (Pierce) . EJEMPLO 4: ENSAYO PARA LA ACTIVIDAD DE FOSFATASA Las proteínas mutantes de P4 purificadas fueron entonces examinadas para determinar la actividad enzimática en un ensayo en fase fluida sensible. La actividad de fosfomonoesterasa de rLP4 fue medida en comparación con la rLP4 natural por ensayos esencialmente colorimétricos de acuerdo a lo descrito por Reilly et al. 1999 citado anteriormente. La adición de Tritón X100 al 1% (p/v) al amortiguador de ensayo logró la actividad de rLP . La cantidad en n ol de p-nitrofenol producido fue determinada comparando la absorbancia a 410 nm, con la de la curva estándar de p-nitrofenol. Una unidad de actividad enzimática fue definida como la cantidad de actividad requerida para convertir 1 µp??? de sustrato a producto por minuto a 37 °C. La actividad especifica fue definida como el número de unidades de enzima por 1 mg de proteina. Los resultados también se expresaron como por ciento de la actividad natural. Los resultados se muestran en la Tabla 3. Tabla 3. Actividad Especifica de Mutantes de rLP4 (ensayo de pNPP) Tabla 3. (continuación) Mutante Unidad/mg % en pesoa rLP4-K161R 0.26 0.4 rLP4-natural 70 100 rLP4-D64E 0.05 0.07 rLP4-D64N 0.13 0.2 rLP4-Y122F 66 94 rLP4-Q39E 2.3 3.3 rLP4-F48C NDC ND rLP4-F48S 0.05 0.07 a/ Porcentaje de actividad comparado con rLP natural. b/ Por debajo del limite de detección. c Sin datos. Cada cambio hecho en los residuos específicos de P4 seleccionados por conservación entre fosfatasas ácidas bacterianas eliminó casi completamente la actividad enzimática de P4 con al excepción de la mutación Y122F. De los mutantes restantes probados, únicamente el mutante Q39E retiene > 1% de actividad natural (3.3%), mientras que los mutantes dobles no tienen actividad detectable. Esos resultados indican que la carga y estructura terciaria dentro de las áreas de P4 conservadas entre fosfatasas ácidas de bacterias son críticas para la función enzimática. Cambios aún conservativos como cambiar residuos Asp a residuos de Glu, eliminaron casi completamente la actividad enzimática cuando los cambios se hicieron en los residuos de Asp conservados. Con la excepción de los mutantes Y122F y Q39E, la invención no detectó mutantes con actividad enzimática solo parcialmente reducida. Virtualmente todas las mutaciones removieron casi completamente la actividad. La mutación que cambia F48 a un residuo de cisteina o serina también redujo la actividad enzimática. EJEMPLO 5: PRODUCCIÓN DE ANTISUERO CONTRA PROTEÍNAS MUTANTES DE RLP4 LIPIDADAS Las proteínas P4 mutantes fueron entonces ensayadas por su reactividad con anticuerpos monoclonales (AcM) y la capacidad de producir antisuero biológicamente activo, de alto título, contra P4 natural. A. Procedimientos de Inmunización Se inmunizaron subcutáneamente ratonas Webster Suizas (6-8 semanas de edad) con 15 µ9 de proteína P4 natural o mutante mezclada con 100 µ9 de adyuvante MPLm en solución salina o PBS . La composición también contenía timerosal al 0.01% como preserva ivo. Las dos inmunizaciones fueron efectuadas con una separación de 4 semanas, y el último sangrado se condujo a la sexta semana. En la semana cero y a la sexta semana los sueros fueron analizados individualmente como acumulados por ensayo de ELISA, acumulados de actividad bactericida.

JB. Ensayo Inmunosolvente Ligado a Enzimas (ELISA) Los anticuerpos anti-P4 (natural y mutante) fueron medidos como sigue. Se recubrieron placas con 1 µg/ml de P4 natural o 12 µg/ml de P4 mutante dividida en PBS . Después de una incubación de 90 minutos/37°C, las placas fueron almacenadas a 4°C hasta el siguiente día. Las placas recubiertas con P4 mutante, fueron bloqueadas con leche descremada. Después de lavar, se agregó una alícuota de 100 µ? de suero, diluida en serie hasta una concentración final de 1:50 a 1:5,467,500 en PBS/Tween 20 al 0.5%, a cada pozo y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente. Las placas fueron lavadas y se les agregaron 100 µ? de anticuerpo secundario (anti-IgG de ratón de cabra conjugado con fosfatasa alcalina, diluido a 1:5,000 en PBS/Tween 20 al 0.05%) y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de lavar, el anticuerpo unido fue detectado por el sustrato pNPP (fosfato de p-nitrofenol) diluido en dietanolamina a 1 mg/ml . Después de 1 hora, el color amarillo fue leído a 405 nm con una referencia de 650 nm. Cada reacción fue llevada a cabo por duplicado, y los resultados fueron promediados. El título de anti-P4 de un suero fue calculado como la dilución del suero que da una absorbancia del 0.1 sobre una curva de 4 parámetros.

C. ELISA de Células Completas Se hizo crecer NTHi cepa P860295 sobre placas de agar de chocolate durante 6 horas y se cosecharon en PBS . La suspensión celular fue diluida a una D.O. de 0.2 determinada a 620 nm y se dis ribuyeron 75 µ? en placas de polisorb NUNC . Las placas fueron secadas a 37°C durante la noche y mantenidas a temperatura ambiente hasta su uso. Ellas fueron bloqueadas con PBS/leche descremada al 5% y lavadas antes de la adición de 100 µ? de suero diluido (diluido en serie hasta una concentración final de 1:36,450 ó 1,093,500 en PBS/Tween 20 al 0.1%/leche descremada al 5%) . Después de una incubación a 1 hora/37°C, las placas fueron lavadas e incubadas otra hora a 37 °C con 100 µ? de anticuerpo secundario (anti IgG de ratón de cabra conjugado con fosfatasa alcalina, diluido a 1:5,000 en PBS/Tween 20 al 0.1%/leche descremada al 5%). Las placas fueron lavadas nuevamente y los anticuerpos unidos fueron detectados por el sustrato pNPP (fosfato de p-nitrofenol ) diluido en dietanolamina 1 mg/ml . Una hora después, el color amarillo fue leído a 405 nm con una referencia de 650 nm. Cada reacción fue llevada a cabo por duplicado, y los resultados fueron promediados. El título anticélula completa de un suero fue calculado como la dilución del suero que una absorbancia de 0.1 sobre una curva de 4 parámetros.

. La Tabla 4 ilustra los resultados del ELISA para mutantes de P4 enzimáticamente activos: P4-D184A, D185A y P4-D64A, D66A, los cuales contenían mutaciones no conservativas. Los datos de ELISA demostraron que esos sitios estaban implicados en la actividad enzimática y eran importantes para la respuesta inmune. Los anticuerpos producidos contra esas proteínas mutantes mostraron que las proteínas P4 mutantes produjeron títulos de ¦ anticuerpos significativamente más bajos contra rLP4 natural que cualquier P4 nativa o rLP4 natural. Tabla 4. Títulos de ELISA de GMT de Suero Dirigidos Contra Mutantes de P4 Iniciales .

La Tabla 5 reporta los resultados del ensayo de ELISA para la proteína mutante de P : (A35G, A37G) , (A35T, A37T) , (A35D, A37D) , o (A35Q, A37Q) . Como se estableció anteriormente, los genes mutantes que codifican para esas proteínas fueron insertados en el vector de expresión de arabinosa usado para rLP4 (pBADl 8cam) , expresado en E. coli BLR, purificados y usados para inmunizar ratones. Los ratones fueron inmunizados con 5 µg de proteína P4 apropiada + MPL a la semana 0 y 4. Los animales fueron sangrados a la 6 semana. Los datos en la Tabla 5 son de los sangrados acumulados de 5 ratones a las 6 semanas . Se determinaron los títulos de anticuerpo por ELISA contra cada una de las proteínas P4 mutantes homologas P4 y P4 natural por cada antisuero. En la tabla, ND significa sin datos. Cada una de las proteínas mutantes produjo buenos niveles de anticuerpos dirigidos contra sí mismo (la proteína homóloga) . Ninguna de las proteínas produjo niveles comparables de anticuerpos contra rLP4 natural . Esos resultados desechan la posibilidad de que las proteínas P4 mutantes no sean buenos inmunógenos . Sus títulos contra la proteína homóloga están dentro del intervalo normal esperado para una P4 lipidada en este modelo.

Tabla 5. Respuesta por ELISA a ratones mutantes de rLP4 contra proteínas mutantes rLP4.

D . Ensayos bactericidas El Ensayo de Anticuerpo Bactericida es una medida funcional para los anticuerpos contra NTHi y se efectuó de acuerdo a lo descrito anteriormente por Green et al. 1991, citado anteriormente. De manera breve, NTHi cepa P860295 se hizo crecer a 37°C durante la noche en caldo BHI-XV. El cultivo nocturno fue diluido a una densidad óptica de 30 Kletts en caldo de BHI-XV, de acuerdo a lo medido en un fotómetro Klett-Sumerson a 660 nm. El cultivo fue incubado a 37°C hasta una fase semi-log y se diluyó 1:15, 000 en PCM (aproximadamente 1-2?105 ufp/mL) . Sueros anti-P4 de ratón fueron calentados a 55°C durante 30 minutos para remover la actividad de complemento. Esos sueros fueron entonces diluidos en serie en solución salina amortiguada con fosfato que contenía CaCl2 0.15 MM y MgCl2 (PCM) 0.5 mM. El complemento humano proporcionado por la Universidad de Rochester fue adsorbido contra NTHi P860295 (Green, B.A. et al, 1990 Infect . Immun., 58:3272-3278) . En una placa microtituladora de 96 pozos, 30 µ? de PCM, 5 µ? de antisuero de ratón diluido, 10 µ? de NTHi diluido, y 5 µ? de complemento humano adsorbido fueron combinados e incubados a 37 °c durante 30 minutos. Las reacciones fueron detenidas mediante la adición de 200 µ? de PCM. Cincuenta µ? de cada pozo fueron cultivados sobre agar de BHI-XV por duplicado y se incubaron durante la noche a 37°C. Fueron contadas las colonias para determinar los títulos bactericidas (el recíproco de la dilución más alta de antisuero capaz de matar al menos 50% de las bacterias en comparación con controles de ensayo que no contenían anticuerpos) . La Tabla 6 demuestra los títulos de BC del antisuero producido contra P4-D184A, D185A y P4-D64A, D66A. Esos títulos fueron determinados y mostraron ser equivalentes a aquéllos producidos por rLP4, dentro del error del ensayo (Tabla 6 más adelante) . No hubo correlación entre los títulos BC y los títulos de ELISA para esos mutantes.

Tabla 6. Actividad Bactericida de los Antisueros Contra P4 Mutantes y Natural Sueros a/ Sangrado Título de BC contra NTHi P860295 Anti P4 nativa Post-2 160 Anti-rLP4 natural Post-2° >320 Anti-rLP4-D184A, Post-2° 80 D185A Anti-rLP4-D64A, D66A Post-2° >320 Acumulado preinmune Preinmune <20 Anti Célula Completa Post-3 >320 P860295 Acumulado preinmune Preinmune <20 a Acumulados de suero de 10 ratones La Tabla 7 reporta los resultados del ensayo de BC para suero de ratones inmunizados con proteínas mutantes dobles: (A35G, A37G) , (A35T, A37T) , (A35D, A37D) , o (A35Q, A37Q) . Los títulos de anticuerpo bactericida no se correlacionaron con los títulos de ELISA contra P4 natural. Por ejemplo, la rLP4 A35N, mutante A37N no produjo títulos de ELISA altos contra rLP4 natural, pero predijo buenos títulos de anticuerpo bactericida contra NTHi. De este modo, ninguno de esos mutantes fueron considerados inmunogénicos o componentes de vacuna buenos. De manera interesante, el suero anti-rLP4 no reacciona muy fuertemente contra la mayoría de los mutantes, lo cual parece indicar que el sitio enzimáticamente activo también es inmunodominante .

Tabla 7. Títulos de ELISA y BC de Sueros de Anti-rLP4 y Anti- P4 Mutante La Tabla 8 reporta los resultados del ensayo de BC para las proteínas lipidadas con las mutaciones únicas: N218Q, K161R, D64E, Y122F, D64N, D64E, F48C y Q39E, que se purificaron de células E. coli BLR, y se examinaron por su actividad enzimática. Cuando las proteínas fueron usadas para inmunizar ratones, tres mutantes parecieron tener una combinación de títulos de ELISA altos y títulos de BC altos, junto con actividad enzimática no detectable. Esas fueron las mutaciones F48C, N218Q y Q39E (Tablas 7 y 8) . Esas proteínas P4 mutantes tuvieron títulos de ELISA contra P4 naturales equivalentes a los de P4 natural, pero también tuvi títulos bactericidas altos contra NTHi . Tabla 8. Títulos de ELISA y BC de Proteínas P4 Mutantes Mutante Título de IgC Título de BC contra P860295 rLP4-D64N 1, 921, 553* 20 rLP4-N218Q 1, 75, 833** 200 rLP4Y122F 1, 106, 822* 40 rLP4D64E 988, 016* 20 rLP4-Q39E 770, 83* 320 rLP4-F48C 687, 742** 240 rLP4 197, 160** 160 rLP4-K161R 186, 394** 60 rLP4-D64A, D66A 60, 358** 30 rLP4-D184A, D185A 33, 185** 30 rLP4-A35Qr A37Q 14, 331** 50 rLP4-A35N, A37N 7, 121** 200 rLP4-A35E, A37E 4, 322** 30 * de sueros acumulados de 10 ratones ** GMT de sueros individuales de 10 ratones EJEMPLO 6 : MUTANTES DE TRUNCACION DE P4 Se construyeron cuatro proteínas variantes de P4 truncadas en varios puntos en el C-terminal de la secuencia natural . - Los mutantes de. truncación fueron generados por PCR del gen hel en pLP339. De manera breve, se sintetizó un cebador homólogo al extremo del cebador 5' del gen hel y el sitio de unión ribosomal con un sitio de Sphl en su extremo 5' . Se sintetizaron cebadores 3' que cambiaron el residuo después del punto de truncación designado a un codón de alto, pero fueron homólogos al gen hel los extremos 3' de los cebadores. El extremo 5' del segundo cebador también contenía un sitio Sacl. Los productos de la PCR fueron clonados en pCR2.1-TOP0 (Invitrogen) y dirigidos con Sphl-Sacl. Los fragmentos de gen hel fueron purificados y ligados en pBAD18Cam digerido con las mismas enzimas. Se identificaron las clonas positivas y se probaron por su expresión. Todos los plásmido recombinantes expresaron proteínas P4 truncadas que fueron lipidadas en E. coli BLR. Específicamente, las proteínas variantes de P4 truncadas en el residuo 200 (es decir, que contienen los aminoácidos 1-200 de la SEQ ID NO: 3), 210, 221 y 232 fueron generadas. Cada fragmento fue ensayado por su actividad fosfatasa usando el protocolo expuesto en el Ejemplo 4. Los cuatro fragmentos no tuvieron actividad enzimática detectable. A continuación, se inmunizaron ratones Swiss Webster siguiendo el protocolo del Ejemplo 5A, excepto que se administraron 5 g de proteína P4 truncada mezclados con 25 µg de MPL1 . La Tabla 9 ilustra los resultados de un ELISA para los cuatros fragmentos de P4 truncada comparados con rLP4 natural, donde se siguió el protocolo del Ejemplo 5. La leyenda "rLP4-232" indica que la P4 recombinante fue truncada en el aminoácido 232 de la SEQ ID NO: 3, y así sucesivamente. Los datos de ELISA demostraron que los cuatro mutantes de truncación produjeron niveles de título útiles. Tabla 9. Títulos de ELISA de Anti-rP4 de Mutantes de Truncación P4 en Ratones Webster Suizos A continuación, se condujeron dos ensayos bactericidas siguiendo el protocolo del Ejemplo 5D. En el primer ensayo, la proteína P4 truncada en el aminoácido 210 fue comparada con rLP4 natural y varias variantes P4 descritas anteriormente, donde cada formulación incluyó 15 pg de proteína P4 mezclados con 100 iq de MPLm, excepto por el último grupo, en el cual únicamente se incluyeron 5 µ$ de proteínas rLP4 del estudio anterior como un control positivo. Los datos del ensayo bactericida en la Tabla 10 indican que la proteína P4 truncada del aminoácido 210 produjo títulos de anticuerpo bactericida que fueron estadísticamente significativos del fondo. En este experimento, los títulos de BC50 de 80 o mayores fueron considerados significativamente diferentes del fondo (<20) . El Complemento usado fue UR8-96 humano absorbido.

Tabla 10. Actividad Bactericida de Antisueros Contra Mutantes , P4 de Truncacion y Natural .

En el segundo ensayo, las proteínas P4 truncadas en los aminoácidos 200, 210, 221 y 232 fueron comparados con rLP4 natural y varias variantes de P4 descritas anteriormente, donde cada formulación incluyó 25 µg de proteína P4 mezclados con 25 µg de MPLMR (una cantidad subóptima) , excepto por el último grupo, en el cual se incluyeron 5 g de proteína rLP4 más 100 µg de MPLMR de un estudio anterior como control positivo. Los datos del ensayo bactericida en la Tabla 11 indicaron que la proteína P4 truncada en los aminoácidos 221 y 232 produjo títulos de anticuerpo bactericida que fueron estadísticamente significativos del fondo, aún con la dosis baja de MPLMR. En este experimento, los títulos BC5o de 80 o más altos fueron considerados significativamente diferentes a los de la semana 0. El complemento usado fue UR8-97 humano adsorbido. Tabla 11. Actividad Bactericida de Antisueros Contra Mutantes , P4 Truncación y Natural En resumen, los resultados de las mutaciones de P4 propuestas indican que la separación del titulo de ELISA de la actividad bactericida pueden significar que los sitios requeridos para la actividad bactericida son distintos a los de áreas esenciales para la actividad enzimática. Todas las publicaciones citadas en esta especificación se incorporan aquí como referencia. Aunque la invención ha sido descrita con referencia a una modalidad particularmente preferida, se apreciará que pueden hacerse modificaciones sin apartarse del espíritu de la invención, se pretende que esas modificaciones caigan dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.

..Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones . 1. Una proteína variante de P4 de Haemophilus influenzae no tipificable (NTHi) que tiene actividad enzimática reducida en comparación con la proteína P4 natural y que incluye un anticuerpo para la proteína P4 natural y/o que tiene actividad bactericida contra NTHi, caracterizada porque la proteína variante de P4 tiene una mutación seleccionada del grupo que consiste de: (a) una mutación en el aminoácido residual 39 de la SEQ ID NO: 3, el cual es una glutamina en la proteína P4 natural ; (b) una mutación en el aminoácido residual 48 de la SEQ ID NO: 3, el cual es una fenilalanina en la proteína P4 natural ; (c) una mutación en el aminoácido residual 64 de la SEQ ID NO: 3, el cual es un ácido aspártico en la proteína P4 natural; (d) una mutación en el aminoácido residual 161 de la SEQ ID NO: 3, el cual es una lisina en la proteína P4 natural ; (e) una mutación en el aminoácido residual 218 de la SEQ ID NO: 3, el cual es una asparagina en la proteína P4 natural ; (f) mutaciones en los aminoácidos residuales 35 y 37 de la SEQ ID NO: 3, los cuales son alanina en la proteína P4 natural; donde las mutaciones no son ácido glutámico, glutamina o treonina; (g) mutaciones en los aminoácidos residuales 64 y 66 de la SEQ ID NO: 3, los cuales son ácido aspártico en la proteína P4 natural; y (h) combinaciones de una o más de las mutaciones (a) - (g) . 2. La proteína variante de P4 de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la proteína variante de P4 tiene una mutación seleccionada del grupo que consiste de: (a) un ácido glutámico, ácido aspártico, o asparagina en el aminoácido residual 38 de la SEQ ID NO: 3 ; (b) una cisteina, serina u otros aminoácidos que tengan grupo polares sin cambiar en el aminoácido residual 48 de la SEQ ID NO: 3 ; (c) una asparagina, ácido glutámico o alanina en el aminoácido residual 64 de la SEQ ID NO: 3; (d) una arginina en el aminoácido residual 161 de la SEQ ID NO: 3; (e) una glutamina, ácido aspártico, o ácido glutámico en el aminoácido residual 218 de la SEQ ID NO: 3; (f) una asparagina en los aminoácidos residuales 35 y 37 de la SEQ ID NO: 3 ; (g) una alanina, asparagina o ácido glutámico, en los aminoácidos residuales 64 y 66 de la SEQ ID NO: 3; y (h) combinaciones de una o más de las mutaciones (a) - (g) . 3. La proteína variante de P4 de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque la proteína variante está lipidada. 4. La proteína variante de P4 de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque comprende además un péptido señal fusionado a la N-terminal de la proteína variante de P4. 5. La proteína variante de P4 de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque el péptido señal es de 1-20 aminoácidos de la SEQ ID NO: 2. 6. La proteína variante de P4 de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque la proteína variante no está lipidada. 7. La proteína variante de P4 de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque la proteína variante está fusionada en marco con una proteína portadora. 8. La proteína variante de P4 de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque la proteína portadora seleccionada del grupo que consiste de proteína DnaK de E.coli, una proteína GST, una proteína de choque térmico microbacteriana 70, un toxoide de la difteria, un toxoide del tétanos, una galactosidasa , una ubiquitina, un factor de apareamiento , una ß -galactosidasa, y una proteína NS-1 de la influenza. 9. Una composición inmunogenica, caracterizada porque comprende la proteína variante de P4 de conformidad con la reivindicación 1 y un vehículo farmacéuticamente aceptable . 10. La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque comprende además un adyuvante . 11. La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque comprende además un antígeno adicional de H. influenzae o un microorganismo diferente de H. influenzae . 12. Una composición inmunogénica, caracterizada porque comprende la proteína variante de P4 de conformidad con la reivindicación 2 y un vehículo farmacéuticamente aceptable. 13. La composición inmunogénica de conformidad con al reivindicación 12, caracterizada porque comprende además un adyuvante . 1 . La composición inmunogénica de conformidad con al reivindicación 12, caracterizada porque comprende además un antígeno adicional de H. influenzae o un microorganismo diferente de H. influenzae . 15. Una proteína variante de P4 de Haemophilus influenzae no tipificable (NTHi) que tiene actividad enzimática reducida en comparación con la proteína P4 natural y que induce un anticuerpo para la proteína P4 natural y/o tiene actividad bactericida contra NTHi, caracterizada porque la proteína variante de P4 es un fragmento que tiene una truncación en la región carboxi- terminal de la proteína P4 natural. 16. La proteína variante de P4 de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque la proteína variante de P4 es truncada para contener los aminoácidos 1-200, 1-210, 1-221, ó 1-232 de la SEQ ID NO: 3. 17. La proteína variante de P4 de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque comprende además una o más mutaciones seleccionadas del grupo que consiste de: (a) una mutación en el aminoácido residual 39 de la SEQ ID NO: 3; el cual es una glutamina en la proteína P4 natural; (b) una mutación en el aminoácido residual 48 de la SEQ ID NO: 3; el cual es una fenilalanina en la proteína P4 natural ; (c) una mutación en el aminoácido residual 64 de la SEQ ID NO: 3; el cual es un ácido aspártico en la proteína P4 natural ; (d) una mutación en el aminoácido residual 161 de la SEQ ID NO: 3; el cual es una lisina en la proteína P4 natural ; (e) una mutación en el aminoácido residual 218 de la SEQ ID NO: 3; el cual es una asparagina en la proteína P4 natural ; (f) mutaciones en los aminoácidos residuales 35 y 37 de la SEQ ID NO: 3, los cuales son alanina en la proteína P4 natural, donde las mutaciones no son ácido glutámico, glutamina o treonina; (g) mutaciones en los aminoácidos residuales 64 y 66 de la SEQ ID NO: 3, los cuales son ácido aspártico en la proteína P4 natural; y (h) combinaciones de una o más de las mutaciones de (a) - (g) . 18. La proteína variante de P4 de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque comprende una o más de las mutaciones seleccionadas del grupo que consiste de (a) un ácido glutámico, ácido aspártico o asparagina en el aminoácido residual 39 de la SEQ ID NO: 3; (b) una cisteina, serina u otros aminoácidos que tengan grupo polares sin cambiar en el aminoácido residual 48 de la SEQ ID NO: 3; (c) una asparagina, ácido glutámico o alanina en el aminoácido residual 64 de la SEQ ID NO: 3 ; (d) una arginina en el aminoácido residual 161 de la SEQ ID NO: 3; (e) una glutamina, ácido aspártico o ácido glutámico en el aminoácido residual 218 de la SEQ ID NO: 3; (f) una asparagina en los aminoácidos residuales 35 y 37 de la SEQ ID NO: 3; (g) una alanina, asparagina o ácido glutámico, ácido aspártico, o asparagina los aminoácidos residuales 64 y 66 de la SEQ ID NO: 3; y (h) combinaciones de una o más de las mutaciones (a) - (g) . 19. Una composición inmunogenica, caracterizada porque comprende la proteína variante de P4 de conformidad con la reivindicación 15 y un vehículo farmacéuticamente aceptable . 20. La composición inmunogenica de conformidad con al reivindicación 19, caracterizada porque comprende además un adyuvante . 21. La composición inmunogénica de conformidad con al reivindicación 19, caracterizada porque comprende además un antígeno adicional de H. influenzae o un microorganismo diferente de H. influenzae . 22. Una composición inmunogénica, caracterizada porque comprende la proteína variante de P4 de conformidad con la reivindicación 16 y un vehículo farmacéu icamente aceptable . 23. La composición inmunogénica de conformidad con al reivindicación 22, caracterizada porque comprende además un adyuvante . 24. La composición inmunogénica de conformidad con al reivindicación 22, caracterizada porque comprende además un antígeno adicional de H. influenzae o un microorganismo diferente de H. influenzae . 25. Una molécula nucleotídica aislada caracterizada porque comprende una secuencia de ácido nucleico que es al menos 70% homologa a una secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína variante de P4 de NTHi que tiene actividad enzimática reducida en comparación con la proteína P4 natural y que induce un anticuerpo para la proteína P4 natural y/o que tiene una actividad bactericida contra NTHi, donde la proteína variante de P4 tiene una mutación seleccionada del grupo que consiste de : (a) una mutación en el aminoácido residual 39 de la SEQ ID NO: 3; el cual es una glutamina en la proteína P4 natural ; (b) una mutación en el aminoácido residual 48 de la SEQ ID NO: 3; el cual es una fenilalanina en la proteína P4 natural; (c) una mutación en el aminoácido residual 64 de la SEQ ID NO: 3; el cual es un ácido aspártico en la proteína P4 natural ; (d) una mutación en el aminoácido residual 161 de la SEQ ID NO: 3; el cual es una lisina en la proteína P4 natural ; (e) una mutación en el aminoácido residual 218 de la SEQ ID NO: 3; el cual es una asparagina en la proteína P4 natural ; (f) mutaciones en los aminoácidos residuales 35 y 37 de la SEQ ID NO: 3, los cuales son alanina en la proteína P4 natural, donde las mutaciones no son ácido glutámico, glutamina o treonina; (g) mutaciones en los aminoácidos residuales 64 y 66 de la SEQ ID NO: 3, los cuales son ácido aspártico en la proteína P4 natural; y (h) combinaciones de una o más de las mutaciones de (a) - (g) , donde la secuencia de ácido nucleico codifica al menos una de las mutaciones de (a) - (g) . 26. La molécula nucleotídica aislada de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada porque la secuencia de ácido nucleico es al menos 80% homologa a la secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína variante P4 de NTHi . 27. La molécula nucleotídica aislada de secuencias reguladoras que regula la expresión de la variante de P4 en una célula anfitriona. 33. Una molécula nucleotídica aislada caracterizada porque comprende una secuencia de ácido nucleico que es al menos 70% homologa a una secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína variante de P4 de NTHi que tiene actividad enzimá ica reducida en comparación con la proteína P4 natural y que induce un anticuerpo para la proteína P4 natural y/o que tiene una actividad bactericida contra NTHi, donde la proteína variante de P4 es un fragmento que tiene una truncación en la región carboxi -terminal de la proteína natural. 34. La molécula nucleotídica aislada de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada porque la secuencia de ácido nucleico es al menos 70% homologa a la secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína variante P4 de NTHi . 35. La molécula nucleotídica aislada de conformidad con la reivindicación 34, caracterizada porque la secuencia de ácido nucleico es al menos 80% homologa a la secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína variante P4 de NTHi . 36. La molécula nucleotídica aislada de conformidad con la reivindicación 35, caracterizada porque la secuencia de ácido nucleico es al menos 90% homologa a la secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína variante P4 de NTHi . 37. La molécula nucleotídica aislada de conformidad con la reivindicación 36, caracterizada porque la molécula de ácido nucleico codifica además para un fragmento de proteína P4 truncada que tiene una mutación seleccionada del grupo que consiste de: (a) una mutación en el aminoácido residual 39 de la SEQ ID NO: 3; el cual es una glutamina en la proteína P4 natural ; (b) una mutación en el aminoácido residual 48 de la SEQ ID NO: 3; el cual es una fenilalanina en la proteína P4 natural ; (c) una mutación en el aminoácido residual 64 de la SEQ ID NO: 3; el cual es un ácido aspártico en la proteína P4 natural ; (d) una mutación en el aminoácido residual 161 de la SEQ ID NO: 3; el cual es una lisina en la proteína P4 natural ; (e) una mutación en el aminoácido residual 218 de la SEQ ID NO: 3; el cual es una asparagina en la proteína P4 natural ; (f) mutaciones en los aminoácidos residuales 35 y 37 de la SEQ ID NO: 3, los cuales son alanina en la proteína P4 natural, donde las mutaciones no son ácido glutámico, glutamina o treonina; (g) mutaciones en los aminoácidos residuales 64 y 66 de la SEQ ID NO: 3, los cuales son ácido aspártico en la proteína P4 natural; y (h) combinaciones de una o más de las mutaciones de (a) - (g) , donde la secuencia de ácido nucleico codifica al menos una de las mutaciones de (a) - (g) . 38. La molécula nucleotídica aislada de conformidad con la reivindicación 37, caracterizada porque la molécula de ácido nucleico codifica además para un fragmento de proteína P4 truncada que tiene una mutación seleccionada del grupo que consiste de: (a) un ácido glutámico, ácido aspártico o asparagina en el aminoácido residual 39 de la SEQ ID NO: 3 ; (b) una cisteina, serina u otro aminoácido el cual tiene grupos polares no cargados en el aminoácido residual 48 de la SEQ ID NO: 3 ; (c) una asparagina, ácido glutámico o alanina en el aminoácido residual 64 de la SEQ ID NO: 3 ; (d) una arginina en el aminoácido residual 161 de la SEQ ID NO: 3 ; (e) una glutamina, ácido aspártico o ácido glutámico en el aminoácido residual 218 de la SEQ ID NO: 3; (f) una asparagina en los aminoácidos residuales 35 y 37 de la SEQ ID NO: 3; (g) una alanina, asparagina o ácido glutámico en los aminoácidos residuales 64 y 66 de la SEQ ID NO: 3; y (h) combinaciones de una o más de las mutaciones de (a) - (g) , donde la secuencia de ácido nucleico codifica al menos una de las mutaciones de (a) - (g) . 39. La molécula nucleotídica aislada de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada porque la molécula es un vector plasmídico. 40. Una célula anfitriona, caracterizada porque es transformada, transfectada o transducida con el vector plasmídico de conformidad con la reivindicación 39. 41. La molécula nucleotídica aislada de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque la molécula es un vector plasmídico. 42. Una célula anfitriona, caracterizada porque es transformada, transfectada o transducida con el vector plasmídico de conformidad con la reivindicación 41. 43. La molécula nucleotídica aislada de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada porque la molécula es un vector plasmídico. 44. Una célula anfitriona, caracterizada porque es transformada, transfectada o transducida con el vector plasmídico de conformidad con la reivindicación 43. 45. Una composición inmunogénica, caracterizada porque comprende una molécula nucleotídica de conformidad con la reivindicación 25 y un vehículo farmacéuticamente aceptable . 46. Una composición inmunogénica , caracterizada porque comprende una molécula nucleotídica de conformidad con la reivindicación 29 y un vehículo farmacéuticamente aceptable . 47. Una composición inmunogénica, caracterizada porque comprende una molécula nucleotídica de conformidad con la reivindicación 33 y un vehículo farmacéuticamente aceptable. 48. Un método para producir una proteína variante de P4 , caracterizado porque comprende cultivar la célula anfitriona de conformidad con la reivindicación 40, bajo condiciones adecuadas para producir la proteína variante de P4 y recuperar la proteína variante de P4 del cultivo. 49. Un método para producir una proteína variante de P4 , caracterizado porque comprende cultivar la célula anfitriona de conformidad con la reivindicación 42, bajo condiciones adecuadas para producir la proteína variante de P4 y recuperar la proteína variante de P4 del cultivo. 50. Un método para producir una proteína variante de P , caracterizado porque comprende cultivar la célula anfitriona de conformidad con la reivindicación 44, bajo condiciones adecuadas para producir la proteína variante de P4 y recuperar la proteína variante de P4 del cultivo. 51. La proteína variante de P4 de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque sirve como proteína portadora para otro antígeno. 52. La proteína variante de P4 de conformidad con la reivindicación 51, caracterizada porque está conjugada químicamente con un polisacárido, oligosacárido, sacárido, lipopolisacárido, lipooligosacárido o liposacárido . 53. La proteína variante de P4 de conformidad con la reivindicación 51, caracterizada porque está fusionada a una proteína, polipéptido o péptido. 54. La proteína variante de P4 de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque sirve como proteína portadora para otro antígeno. 55. La proteína variante de P4 de conformidad con la reivindicación 54, caracterizada porque está conjugada químicamente con un polisacárido, oligosacárido, sacárido, lipopolisacárido, lipooligosacárido o liposacárido. 56. La proteína variante de P4 de conformidad con la reivindicación 54, caracterizada porque está fusionada a una proteína, polipéptido o péptido.