MXPA04007694A

MXPA04007694A - Factor inhibidor de citosina purificada.

Info

Publication number: MXPA04007694A
Application number: MXPA04007694A
Authority: MX
Inventors: Xing Ruye
Original assignee: Arkion Life Sciences Llc
Priority date: 2002-02-11
Filing date: 2003-02-11
Publication date: 2004-11-10
Also published as: BR0307691A; WO2003068152A3; AU2003216227A1; US7083809B2; EP1487465A4; WO2003068152A2; US20030152641A1; EP1487465A2; CN1279972C; HK1080749A1; CN1642562A; KR20040105710A; CA2474360A1

Abstract

La presente invencion se refiere a una composicion que comprende un Factor Inhibidor de Citosina (FIC) que tiene ciertas caracteristicas, que incluye la habilidad para inhibir la transcripcion del ARN del factor alfa de necrosis de tumor (TNF-a), interleucina-1-beta (IL-1b) e interleucina-2 (IL-2) de las citosinas proinflamatorias. Tambien se describe un metodo para purificar sustancialmente el Factor Inhibidor de Citosina y un metodo para modular el sistema inmune de un animal usando tal composicion.

Description

FACTOR INHIBIDOR DE CITOSINA PURIFICADA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere de manera general, a un factor y método biológico para modular el sistema inmune. La invención se refiere específicamente, a un factor de inhibición de citosina substancialmente purificada, métodos para su purificación, y métodos para su uso en la modulación del sistema inmune, particularmente dirigido a reducción de inflamación. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Factores biológicos, tales como coenzimas, cofactores, vitaminas y otros, juegan papeles importantes en los procesos de conversión biológica. Son producidos usualmente en cantidades pequeñas en una célula completa (1 x lCf5 - 1 x 1CT6) . Determinar la existencia de, y posteriormente, aislar y purificar tales factores biológicos a partir de células normales, sin embargo, es un proyecto difícil. Se han desarrollado huevos hiperinmunizados y han mostrado contener anticuerpos sobre-producidos y, como se expone en la Patente Estadounidense Número 6,420,337, ciertos factores biológicos . La determinación de exactamente que factores biológicos existen en un huevo es difícil de lo que parece ser hecho más fácil con el proceso de hiperinmunización . La hiperinmunización se realiza por EF . : 157649 inyección de antígenos bacterianos polivalentes en el animal objetivo. Se ha encontrado que la cantidad de factores biológicos encontrados en huevos a partir de esos animales hiperinmunizados se incrementa, pero por no más de un orden de magnitud. Por lo tanto, este pequeño título de factores biológicos en el huevo hiperinmunizado hace su localización y, posteriormente, la purificación de factores biológicos, difícil. Como tal, existe una necesidad de un proceso eficiente para reconocer, aislar, purificar o de otro modo, producir tales factores biológicos. Citosinas El sistema inmune normal está bajo un balance en el cual las células proinflamatorias y anti -inflamatorias y moléculas, son cuidadosamente reguladas para promover las defensas normales inmunes hospedadoras , sin la destrucción de tejidos del huésped. Una vez que éste equilibrio regulador cuidadoso es perturbado, la estimulación y activación no específica puede conducir a cantidades incrementadas de moléculas inflamatorias e inmunológicas destructivas potentes que son producidas y liberadas. Así, el exceso de producción de citosinas proinflamatorias o producción de citosinas en el contexto biológico erróneo, están asociados con la mortalidad y patología en un amplio rango de enfermedades, tales como malaria, sepsis, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria del intestino, cáncer y SIDA, entre otras.

Las citosinas son polipéptidos pluripotentes que actúan en maneras autocrinas/parácrinas enlazándose a receptores celulares específicos. Su secreción es importante en la determinación de la duración e intensidad de una respuesta inmune. Por ejemplo, en ratones, subconjuntos diferentes de clones secretados CD4+ T auxiliadoras (Th) , clásicamente han sido descritos como citosinas Thl y Th2. Las células Thl producen interleucina-2 (IL-2) e interferon-? (IFN-?) y facilitan la respuesta inmune celular. Las células Th2 producen IL-4, IL-5, IL-6 e IL-10 y soportan la activación de células que secretan inmunoglobul ina . Durante el proceso de inflamación, las citosinas tales como IL-?ß, IL-2, IL-6 y factor-a de necrosis del tumor (TNF-a) , son liberados en el sitio de inflamación. Estas citosinas tienen efectos pleyotrópicos y median un amplio rango de síntomas asociados con la inflamación. Una citosina clave, el TNF- , también conocido como cachectina, es una proteína de 17 KiloDaltons compuesta de 157 aminoácidos y producida principalmente por monocitos y macrófagos activados. El TNF-a ha mostrado poseer actividad tumoricida, así como también una variedad de efectos fisiológicos con más sistemas de órganos principales. En el sistema nervioso central, el TNF-a está involucrado en fiebre, anorexia, y alteraciones en la liberación de la hormona pituitaria. En el sistema cardiovascular, los TNF-a juegan un papel en choque, angustia respiratoria aguda y síndrome de pérdida capilar (procoagulación) . El TNF-a es instrumental en el proceso de necrosis tubular aguda y nefritis en el riñon e isquemia, colitis y necrosis hepática en el sistema gastrointestinal . Es también una citosina clave involucrada en el proceso de inflamación. Las condiciones inflamatorias se desarrollan por procesos patogénicos múltiples, en los cuales algunas moléculas claves están involucradas. Por ejemplo, el TNF-a, IL-?ß, interleucina-2 (IL-2) y prostaglandina E2 (PGE2) son principales contribuidores en el desarrollo de la inflamación. La inflamación puede resultar en estados de enfermedad, tales como artritis reumatoide, artritis séptica y osteoartritis juvenil. El TNF-a es producido principalmente por células T en respuesta a estímulos inflamatorios. El TNF-a es un mediador endocrino paracrino potente de funciones inmunes e inflamatorias, y modula las funciones celulares endoteliales . Por ejemplo, el TNF-a puede ser detectado en altas concentraciones en suero y fluido sinovial de pacientes con artritis reumatoide activa, y se sospecha que tiene un papel primario en la patogénesis de artritis reumatoide. La IL-?ß está involucrada en una amplia variedad de trayectorias biológicas, y es una molécula notablemente potente, capaz de inducir sus efectos accionando tan pocos como uno o dos receptores por célula. Como un agente de señalización, la IL-?ß es efectiva a concentraciones muy bajas, aún en el rango femtomolar. La IL-?ß fue notada primero por inducir fiebre, aumentando respuestas de linfocitos y estimulando la respuesta de fase aguda. La inducción de una reacción inflamatoria en respuesta a la infección es ampliamente atribuida a la señalización por IL-?ß. Otra citosina derivada de células T, IL-2, induce crecimiento, diferenciación y activación funcional en una variedad de células. Por ejemplo, la IL-2 promueve el crecimiento y diferenciación de células T y B, secreción de inmunoglobulina por células B, crecimiento y actividad de células NK y la producción de otras citosinas. La IL-2 también juega una función importante en los numerosos procesos inflamatorios asociados con el crecimiento y proliferación de células inmunes. Prostaglandina E2 (PGE2) La prostaglandina E2 (PGE2) , es una "prostaglandina primaria" ¦ encontrada por todas las muchas células en el cuerpo. Es el metabolito de araquidonato predominante y juega un papel importante en la regulación de los potenciales osmóticos vasculares, así como también en condiciones generales del organismo pertenecientes a la temperatura corporal, dolor, inmunosupresión e inflamación. La PGE2 es un constituyente principal en la trayectoria inflamatoria de estados de enfermedad inflamatoria crónica. Una variedad de enzimas son responsables de la producción de PGE2, y varias de las misma enzimas producen otras prostaglandinas , tromboxanos y mediadores inflamatorios. Por ejemplo, la PGE2 es producida por formas tanto expresadas constitutivamente como inducibles de citooxigenasa , COX-1 y COX-2, respectivamente. La COX-2 es dramáticamente sobre-regulada cuando las células se exponen a ciertos mitógenos (por ejemplo LPS) o citosinas (IL-1) , proporcionando una conexión entre la señalización de citosina y la producción de PGE2. Puesto que el TNF-a, IL-?ß, IL-2 y PGE2 son los moduladores inflamatorios clave, juegan papeles críticos en el proceso de desarrollo de la inflamación. Análogos de lipopolisacáridos (LPS) Un amplio rango de análogos de lipopolisacáridos (LPS) interfieren con la expresión de citosina in vitro e in vivo. Por ejemplo, nanopartículas lípidas sólidas (NLS) incubadas con macrófagos peritoneales murinos, causan un decremento dependiente de la concentración en la producción de IL-6. Sin embargo, el TNF-a e IL-12 no son suprimidos. El análogo SDZ MRL 953 del lípido A sintético, protege contra el choque endotóxico e infección bacteriana, como se muestra por un estudio en el cual, 20 pacientes con cáncer se trataron intravenosamente con dosis escalonadas de SDZ MRL 953, seguido por una aplicación intravenosa de endotoxina. El pretratamiento con el análogo del lípido A, marcadamente reduce la liberación de TNF-a, IL-?ß, IL-8, IL-6 y G-CSF, sugiriendo que el pretratamiento con SDZ MRL 953 en pacientes en riesgo, puede ayudar a prevenir complicaciones de sepsis gram-negativa . La producción inducida por LPS de TNF-a, puede ser inhibida en macrófagos y en monocitos humanos y células monoblásticas U937. Un análogo del lípido A monosacarídico , DY-9973, inhibe la expresión inducida por LPS de TNF-a y RNAm de IL-?ß en células U937. Por el contrario, el DY-9973 no inhibe la producción de TNF-a inducida por IL-?ß en células U937. Así, los análogos del lípido A monosacarídico tales como DY-9973, pueden inhibir la activación inducida por LPS de macrófagos, y reducir la toxicidad letal de LPS. Además, una tolerancia de endotoxina temprana se induce por un derivado LPS no tóxico, lípido A monofosforilo (MPL) , contra la infección de LPS. Además de análogos lipidos, los anticuerpos contra LPS funcionan como neutralizadores para proteger contra la infección por LPS. El anticuerpo monoclonal al lípido A, suprime la habilidad del lípido A y LPS de varias bacterias gram-negativas, para inducir TNF-a (36-67%) e IL-1 (30-98%) en macrófagos murinos perifonéales. Estos MAb también inhiben el TNF-a inducido por lipidos A en ratones (87%) .

Los análogos de LPS también sobrerregulan la expresión de citosina. Un análogo de lípido A diferente (DT-5461a) , induce el TNF-cc, IL-?ß, IL-6 y GM-CSF en macrófagos murinos . Además, el DT-5461a mejora la producción de varias citosinas en las células a través de un mejoramiento transcripcional . Huevos hiperinmunizados Varios géneros de las clases de Aves, tales como pollos (gallus domesticus) , pavos y patos, producen anticuerpos en la sangre y huevos contra inmunógenos que causan enfermedades aviares, así como también contra otros inmunógenos. Por ejemplo, LeBacq-Verheyden et al. (Immunology 27:683 (974)) y Leslie, G.A., et al. (J. ed.130:1337 (1969) ) , tienen cuantitativamente inmunoglobulinas analizadas de los pollos. Polson et al. ( Immunological Communications 9:495-514 (1980)), inmuniza gallinas contra varias proteínas y mezclas naturales de proteínas y detecta anticuerpos IgY en las yemas de los huevos. Fertel et al. (Biochemical and Biophysical Research Communications 102:1028:1033 (1981)), inmuniza gallinas contra prostaglandinas y detecta anticuerpos en la yema del huevo. Jensenius et al. (Journal of Immunological Methods 46:63-68 (1981)), proporciona un método de aislamiento de IgG de la yema del huevo, usado en inmunodiagnósticos . Polson et al. (Immunological Communications 9:475-493 (1980)), describe anticuerpos aislados a partir de la yema de gallinas que fueron inmunizadas con una variedad de virus de plantas. La Patente estadounidense No. 4,357,272 describe el aislamiento de anticuerpos a partir de yemas de huevos derivados de gallinas hiperinmuni zadas . La respuesta de anticuerpo fue provocada por inyecciones repetitivas de inmunogénos derivados de virus de plantas, IgG humano, antitoxina contra en tétanos, antitoxinas de serpiente y Serameba . La Patente estadounidense No. 4,550,019, describe el aislamiento a partir de yemas de huevo de anticuerpos originados en la gallina por hiperinmunización con inmunogénos que tienen un peso molecular o de partícula de al menos 30,000. Los inmunogénos usados para hiperinmunizar los pollos se seleccionaron de entre virus de plantas, inmunoglobulinas humanas, toxinas contra el tétanos y venenos de serpiente. La Patente Estadounidense No. 4,748,018, describe un método de inmunización pasiva de un mamífero que comprende, administrar parenteralmente , un anticuerpo purificado obtenido a partir de huevos de un ave que ha sido inmunizada contra el antígeno correspondiente, y en donde el mamífero ha adquirido inmunidad a los huevos. La Patente estadounidense No. 5,772,999, describe un método para prevenir, contar o reducir trastornos gastrointestinales crónicos o lesiones gastrointestinales inducidas por Fármacos Anti-inflamatorios No-esteroidales (inducidos por FAINE) , en un sujeto, administrando huevo y/o leche hiperinmunizados o fracciones de los mismos al sujeto. La Patente Estadounidense No, 6,420,337, describe un factor biológico aislado a partir del huevo de un ave hiperinmunizada con una mezcla inmunogénica . El factor biológico ha sido purificado y secuenciado y ha sido determinado por activar ciertas citosinas pro-inflamatorias, por lo tanto, se refiere como un Factor de Activación de Citosina. La Solicitud de Patente Europea No. 99967649.7, describe una composición anti-inflamatoria obtenida también a partir del huevo de un ave hiperinmunizada con una mezcla inmunogénica. La composición anti-inflamatoria ha sido particularmente purificada a partir del huevo y se muestra por ser efectiva en el tratamiento y prevención de la inflamación . Se ha reportado que ácidos grasos insaturados, tales como ácidos grasos omega-3 y -6 (los cuales se pueden encontrar de forma natural en la yema del huevo) , juegan un papel importante en los procesos anti-inflamatorios . Recientemente, muchos investigadores se han enfocado en los efectos anti -inflamatorios del aceite de pescado enriquecido en ácido graso omega 3 y 6. Estos estudios muestran que verdaderamente, los ácidos grasos omega, son efectivos en la prevención de artritis. Los estudios, sin embargo, no muestran o presentan alguna evidencia del efecto de ácidos grasos omega en citosinas pro-inflamatorias o citosinas en general. Algunas características de los ácidos grasos omega son, que son parcialmente solubles en agua, tienen una máxima absorbencia a 210-230 nm y sus puntos de fusión son usualmente muy bajos (-49°C hasta 13.4°C), debido a que su estructura es aquella de un ácido graso de cadena larga. No se ha reportado en la literatura, que los fosfolípidos de la yema del huevo inhiben las citosinas pro-inflamatorias y/o síntesis de PGE2. Ni se ha reportado que la yema de huevo contiene cualesquiera análogos de polisacáridos conocidos (análogos de LPS) , que pueden funcionar como competidores para LPS para la inhibición de citosinas pro-inflamatorias y síntesis de PGE2. La clave para la presente invención está en el hallazgo de lo inventores, de un nuevo factor que se origina de manera natural en el huevo y tiene la habilidad para inhibir citosinas pro- inflamatorias , así como también la síntesis de PGE2. SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a una composición que comprende un Factor de Inhibición de Citosina substancialmente purificada, en donde el Factor de Inhibición de Citosina: tiene peso molecular de menos de 6,000 Da; está naturalmente presente en una fracción de lípidos de la yema del huevo de huevos de ave; tiene un máximo de absorbencia UV a una longitud de onda de 205 nm; es una sustancia no proteinácea ; tiene un punto de fusión de entre alrededor de 39°C hasta 42°C, e inhibe la transcripción de ARN del factor alfa de necrosis del tumor (TNF-oc) , interleucina-l-beta (IL-?ß) e interleucina-2 (IL-2) . La presente invención además, se refiere a un Factor de Inhibición de Citosina purificada, producido por un proceso que comprende: separar una fracción insoluble en agua (FIA) a partir de una fracción soluble en agua (FSA) de una yema del huevo; separar la fracción insoluble en agua en una fracción de lípido neutral y una fracción de lípido polar; purificar la fracción lipida polar en fracciones del Factor de Inhibición de Citosina por cromatografía líquida de alta resolución. Finalmente, la presente invención se refiere a un método para modular el sistema inmune de un animal, que comprende administrar al animal, una composición que comprende un Factor de Inhibición de Citosina. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La FIG. 1 es un cromatograma CLAR de extracto de etanol PL-100. La FIG. 2 es una imagen digitalizada que muestra el efecto de la estimulación de LPS de TNF- e IL-?ß en un ensayo in vitro.

La FIG. 3 es una imagen digital izada que muestra el efecto de lípidos de huevo hiperinmune en la inhibición de TNF-a e IL-ß estimulados por LPS en un ensayo in vitro. La FIG. 4 es una imagen digitalizada que muestra el efecto de extracto de acetona y extracto de etanol a partir de lípidos de huevo hiperinmune en IL-2 estimulado por LPS en un estudio in vitro. La FIG. 5 es una imagen digitalizada que muestra el efecto de fracciones purificadas por CLAR de extractos de etanol a partir de lípidos de huevo hiperinmune en TNF-a e IL-?ß estimulados por LPS en un ensayo in vitro. La FIG. 6 muestra los efectos de la yema de huevo hiperinmune y yema de huevo deslipinidatada en artritis inducida por colágeno en un estudio de modelo de rata con artritis de inducida por colágeno. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA I VENCIÓN La presente invención se refiere de manera general, a un nuevo Factor de Inhibición de Citosina (FIC) , a una composición que comprende un Factor de Inhibición de Citosina (FIC) y a un método para modular el sistema inmune usando la composición. La composición de la invención puede incluir composiciones que comprenden el FIC purificado, y/o una composición de la invención puede ser un producto alimenticio natural que contiene FIC, y preferiblemente, incluye un producto alimenticio natural o fracción del mismo, es cual es enriquecido por la presencia de FIC, tal como por procesos de selección o por producción de una fracción enriquecida. Tales productos alimenticios naturales incluyen productos de huevo hiperinmune, que incluyen fracciones de productos de huevo hiperinmune los cuales son enriquecidos por FIC. Los presentes inventores han descubierto que el nuevo FIC, inhibe la expresión del factor-a de necrosis de tumor (TNF-a) , interleucina-2 (IL-2) e interleucina- lp (IL-?ß) y regulan descendentemente la síntesis de prostaglandina E2 (PGE2) . Por lo tanto, el FIC de la presente invención puede ser usado para modular (es decir, regular) , el sistema inmune en general, modulando la expresión de estas citosinas y las células las cuales producen o son afectadas por estas citosinas. Además, debido a que el TNF-a, IL-?ß e IL-2 son típicamente considerados por ser citosinas proinflamatorias, el FIC de la presente invención es empleado para el tratamiento de condiciones en las cuales, es deseable la inhibición de una respuesta inmune y células las cuales responden a citosinas proinflamatorias, que incluyen, pero no se limitan a, artritis de manera general, y más específicamente, artritis reumatoide, artritis séptica y osteoartritis juvenil. Como puede esperarse, el FIC también es efectivo en el tratamiento y/o prevención de más condiciones inflamatorias o respuestas como muchas más condiciones o respuestas que involucran, en un punto u otro, TNF-a, IL-?ß y/o IL-2.

El FIC de la presente invención, es un componente que es producido y/o mejorado en productos de huevo hiperinmunizados . No se requiere la mezcla de inmunógeno preferido que se administra preferiblemente por inyección, a los animales que producen huevos para inducir una respuesta inmune y para producir el producto de huevo hiperinmune que contiene el Factor de Inhibición de Citosina de la presente invención, por contener inmunogenos específicos que son conocidos por modular el sistema inmune por citosinas de activación particular o por inducción de producción de un factor que induce citosinas particulares. Por lo tanto, es sorprendente hallar tal Factor de Inhibición de Citosina en un producto de huevo hiperinmune obtenido a partir de animales inmunizados contra una vacuna polivalente, la cual se espera sea efectiva en la modulación del sistema inmune cuando se administra a un sujeto. Se han determinado ciertas características con respecto a este Factor de Inhibición de Citosina (véase el Ejemplo 3) . Inicialmente , el Factor de Inhibición de Citosina (FIC) , se localiza en la porción de lípido de la yema del huevo de un huevo. Por lo tanto, debido a que está dispuesto en la fracción del lípido, el FIC no es proteináceo. Por medio del conocimiento básico de la porción de lípido de un huevo, el FIC se ha determinado ser de un tamaño de menos de 6000 Daltons. La absorbencia de este nuevo factor también ha sido estudiada y se ha determinado que la absorbencia de longitud de onda máxima del FIC está en 205 nm. El punto de fusión se ha encontrado caer dentro del intervalo de alrededor de 39°C hasta 42 °C. Finalmente, como se refiere anteriormente, y como se describe en mayor detalle a través de esta solicitud, el FIC inhibe ciertas citosinas. En particular, el FIC inhibe al menos las siguientes citosinas pro-inflamatorias: factor alfa de necrosis del tumor (TNF-a) , interleucina- 1-beta (IL-?ß) e interleucina-2 (IL-2) . Finalmente, el FIC substancialmente purificado de la presente invención, también inhibe la biosíntesis de prostagíandina E2 (PGE2) - Antes de la presente invención, no se conocía que la hiperinmunización de animales que producen huevo habría de resultar en la producción del nuevo Factor de Inhibición de Citosina de la presente invención, el cual habría de tener las características anteriores y ser capaz de regular la producción de citosina y la diferenciación de células del sistema inmune en un animal. Para el conocimiento de los inventores presentes, antes de la presente invención, el Factor de Inhibición de Citosina (FIC) descrito aquí nunca ha sido identificado, purificado o caracterizado. Definiciones Las siguientes definiciones aplican a través de la solicitud, a menos que se especifique de otro modo: El término "hiperinmunización", significa exposición a uno o más inmunógenos (por ejemplo, antígenos) , de manera tal que se eleva una respuesta inmune y se mantiene por arriba del estado natural no expuesto. El término "inmunógeno" , significa una sustancia que es capaz de inducir un anticuerpo humoral y/o una respuesta inmune mediada por la célula, en lugar de tolerancia inmunológica . El término significa la habilidad para estimular una respuesta inmune, así como también reaccionar con los productos de, por ejemplo, anticuerpos. El término "inmunogenos derivados combinatoriales" , se refiere a un proceso para generar diversidad molecular entre inmunogenos por medio de síntesis combinatorial . El término "inmunogenos de bioingeniería" , se refiere a inmunogenos los cuales son obtenidos a través del proceso de tecnologías de clonación de genes y manipulación genética o síntesis química. El término "vacuna genética" , se refiere a una vacuna de ácido nucleico la cual es producida de manera general, por tecnologías recombinantes y las cuales pueden provocar una respuesta inmune. Los términos "huevo" o "producto de huevo" , cada uno significa cualquier huevo completo (consumo, hiperinmunizado o de otra forma) , o cualquier producto o fracción derivada de este. Los términos "huevo de consumo" o "producto de huevo de consumo", cada uno significa un huevo completo, o cualquier producto o fracción derivada de este, obtenido a partir de animales que producen huevo, los cuales no se mantienen en un estado hiperinmune . Los términos "huevo hiperinmune" o "producto de huevo hiperinmune", cada uno significa huevo completo o cualquier producto o fracción derivada de este, obtenido de un huevo . El término "Factor de Inhibición de Citosina" o "FIC" , se usa de manera general para referirse al factor biológico de la presente invención en cualquier etapa de pureza (por ejemplo, que se incluye como un componente de huevo, como una fracción de lípido sustancialmente purificada de un huevo, o como una fracción de lípido altamente purificada de un huevo) , y que tiene las características bioquímicas, físicas, estructurales y/o funcionales (por ejemplo, actividad biológica) , descritas aquí por el Factor de Inhibición de Citosina. El término "Factor de Inhibición de Citosina Sustancialmente Purificada" , significa un Factor de Inhibición de Citosina que ha sido purificado en al menos el nivel mostrado en el Ejemplo 2. El término "niveles supranormales" , significa niveles en exceso de aquellos encontrados en huevos de animales que producen huevos no mantenidos en un estado hiperinmune.

Los términos "huevo unmunoregulatorio" o "producto de huevo inmunoregulatorio" , significan huevo o fracciones de huevos que contienen el Factor de Activación de Citosina descrito aquí. El término "respuesta inmune", se refiere de manera general, a una respuesta celular inmune o mediada por la célula (es decir, una respuesta inmune mediada por células del sistema inmune que incluye linfocitos T, linfocitos B y macrófagos) y/o una respuesta inmune humoral (es decir, respuesta inmune mediada por anticuerpos) . El término "animal" , se refiere a cualquier especie del reino Animal. Animales preferidos para inmunizar de conformidad con la presente invención incluyen, cualesquiera de los animales de la clase Vertebrado, Aves, que incluyen, sin limitación, pollos, pavos y patos. Animales preferidos para tratar de conformidad con la presente invención incluyen, cualquier animal de la clase Vertebrado, Aves y Mamíferos, que incluye, sin limitación, primates, roedores, ganado y animales domésticos. El ganado incluye mamíferos para ser consumidos o que producen productos útiles (por ejemplo, ovejas para producción de lana). Mamíferos preferidos a proteger de una enfermedad o condición incluyen humanos, perros, gatos, ratones, ratas, ovejas, ganado vacuno, caballos y cerdos, con humanos es particularmente pre erido .

El término "animal objetivo", se refiere a un animal que se le administra la mezcla inmunogénica . El término "animal sujeto", se refiere al animal al cual se administra una composición que contiene el FIC de la presente invención, que incluye composiciones que contienen FIC purificado, o un huevo enriquecido con FIC o producto de huevo producido por el animal objetivo. Un animal sujeto puede también ser referido como un paciente. La frase "biológicamente activo" o "actividad biológica", con referencia a un FIC de la presente invención, se refiere a cualquier actividad funcional de un FIC, y típicamente, una actividad funcional de un FIC que se origina de manera natural. En particular, la referencia a la actividad biológica de un FIC preferiblemente se refiere a la capacidad de un FIC para regular descendentemente (inhibir, reducir, disminuir, suprimir) , la expresión de una citosina la cual incluye el factor-a de necrosis de tumor (TNF-a) , interleucina- ?ß (IL-?ß) , y/o interleucina-2 (IL-2). Se nota que el FIC que se origina de manera natural como se describe en detalle aquí, puede regular descendentemente la expresión de cada uno de TNF-a, IL-?ß e IL-2. La actividad biológica del FIC puede también incluir la habilidad para regular descendentemente (inhibir, disminuir, suprimir) , la expresión de prostaglandina E2. La actividad biológica del FIC puede también incluir, pero no se limita a, la habilidad del FIC para enlazarse a un receptor, una proteína, ADN, una porción de carbohidrato o una porción de lípido, lo cual resulta en o contribuye a una de las actividades biológicas identificadas anteriormente . El término "absorción de longitud de onda máxima" , se refiere a la absorción de radiación electromagnética en las regiones UV y visibles de un compuesto que refleja diferentes habilidades a longitudes de onda individuales. La absorción de radiación es causada por substracción de energía a partir de la radiación de haces cuando los electrones en órbitas de baja energía se excitan en orbitales de energía superior. La absorción depende de la longitud de onda de la radiación y la estructura del compuesto. La longitud de onda más alta absorbida es la máxima absorción de longitud de onda del compuesto de prueba. El término "modular" o derivados de tal término, significa cambiar, regular o variar de un estado a otro, e incluye un incremento o decremento observable o medible en cualquier característica medible y/o un cambio de una característica a otra, característica diferente. La frase "portador farmacéuticamente aceptable", se refiere a excipientes farmacéuticamente aceptables, formulaciones y/o vehículos de suministro farmacéuticamente aceptables, los cuales son adecuados para uso en administración de una composición de la presente invención, a un sitio in vi ro, ex vivo o in vivo adecuado. Los portadores farmacéuticamente aceptables pueden permitir composiciones de la presente invención para ser producidas/proporcionadas en cualquier forma para uso, que incluye, pero no se limita a, un líquido, un aerosol, una cápsula, una tableta, una pildora, un polvo, un gel y un gránulo. Algunos portadores farmacéuticamente aceptables incluyen células, membranas, formulaciones lípidas (que incluyen líquidos que, después de la administración a un paciente, forman un sólido o un gel in situ) , formulaciones de anticuerpo, productos alimenticios (por ejemplo, cualquier producto o preparación comestible) y virus recombinantes . Los portadores preferidos también son biodegradables (es decir, bioerosionables) . Un "excipiente farmacéuticamente aceptable" , incluye excipientes o formulaciones que transportan o ayudan a transportar, pero no específicamente dirigido de una composición a una célula (también referido aquí como portadores sin objetivo) . Ejemplos de excipientes farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a agua, salina amortiguada de fosfato, solución Ringer, solución de dextrosa, soluciones que contienen suero, solución Hank, otras soluciones acuosas fisiológicamente balanceadas, aceites, ésteres y glicoles. Portadores acuosos pueden contener sustancias auxiliares adecuadas requeridas para aproximar las condiciones fisiológicas del recipiente, por ejemplo, mejorando la estabilidad e isotonicidad química. Sustancias auxiliares adecuadas incluyen, por ejemplo, acetato de sodio, cloruro de sodio, lactato de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio y otras sustancias usadas para producir amortiguador de fosfato, amortiguador Tris y amortiguador de bicarbonato. Sustancias auxiliares pueden también incluir preservativos, tales como timerosal, -u o-cresol, formalina y alcohol bencílico. Un "vehículo de liberación controlada", es un tipo de portador farmacéuticamente aceptable que es capaz de liberar una composición de la presente invención en una manera controlada en un paciente o cultivo. Una formulación de liberación controlada comprende un compuesto de la presente invención (por ejemplo, una composición del FIC, un anticuerpo o un mimético) , en un vehículo de liberación controlada. Vehículos de liberación controlada adecuados incluyen, pero no se limitan a, polímeros biocompatibles , otras matrices poliméricas, cápsulas, microcápsulas , micropartículas , preparaciones de bolo, bombas osmóticas, dispositivos de difusión, liposomas, lipoesferas y sistemas de suministro transdérmico . Un "vehículo de liberación farmacéuticamente aceptable" , es un portador farmacéuticamente aceptable el cual es capaz suministrar una composición de la presente invención a un sitio objetivo. Preferiblemente, el vehículo de liberación farmacéuticamente aceptable es capaz de ser objetivo (es decir, dirigir, suministrar selectivamente) la composición al sitio objetivo. Un "sitio objetivo", se refiere a un sitio en un paciente al cual uno desea suministrar una composición. Por ejemplo, un sitio objetivo puede ser cualquier célula o tejido el cual es objetivo por inyección o suministro directo usando vehículos de suministro que contienen lípidos naturales y artificiales (por ejemplo, liposomas), anticuerpos, vectores virales u otros vehículos de suministro, que incluyen ribozimas. Vehículos de suministro que contienen lípidos naturales, incluyen células y membranas celulares. Vehículos de suministro que contienen lípidos artificiales incluyen liposomas y micelios. El término "administrar", significa cualquier método para proporcionar a un sujeto con una sustancia (por ejemplo, introducir una sustancia en un sujeto) , que incluye administración in vivo o ex vivo. Métodos de administración in vivo incluyen, pero no se limitan a, administración intravenosa, administración intraperitoneal , administración intramuscular, administración intracoronaria, administración intraarterial (por ejemplo, en una arteria carótida) , administración subcutánea, suministro transdérmico, administración intratraqueal, administración subcutánea, administración intraarticular, administración intraventricular, inhalación (por ejemplo, aerosol) , intracerebral , nasal, oral, intraocular, administración pulmonar, impregnación de un catéter, por supositorio e inyección directa en un te ido. El término "beneficio terapéutico" , no se refiere necesariamente a una cura para una enfermedad o condición particular, sino más bien, preferiblemente abarca un resultado el cual puede incluir alivio de la enfermedad o condición, eliminación de la enfermedad o condición, reducción de un síntoma asociado con la enfermedad o condición, prevención o alivio de una enfermedad o condición secundaria que resulta de la incidencia de una enfermedad o condición primaria y/o prevención de la enfermedad o condición. El término "protección", con referencia a una enfermedad o condición, se refiere a reducir los síntomas de la enfermedad; reducir la incidencia de la enfermedad, y/o reducir la severidad de la enfermedad. Proteger un paciente o sujeto, puede referirse a la habilidad de una composición de la presente invención, cuando se administra a un paciente, para prevenir una enfermedad de que se origine y/o curar o aliviar los síntomas, signos o causas de la enfermedad. Como tal, proteger un paciente de una enfermedad incluye tanto prevenir la ocurrencia de enfermedad (tratamiento profiláctico) , como tratar un paciente que tiene una enfermedad (tratamiento terapéutico) . El término "prevención" , significa que el progreso de la enfermedad se reduce y/o elimina, o que el comienzo de la enfermedad se elimina (tratamiento profiláctico) .

El término "tratamiento" , significa que el comienzo de los síntomas (que incluye dolor) del trastorno y/o origen patogénico del trastorno se retarden, reduzcan o prevengan completamente, o, si se presentan, los síntomas sean disminuidos o completamente eliminados. Por ejemplo, la composición del FIC trata la artritis no solamente suprimiendo los síntomas del trastorno en humanos y otros mamíferos, sino también actuando como un agente profiláctico para contrarrestar la presencia del trastorno en el recipiente. El término "enfermedad" , se refiere a cualquier desviación de la salud normal de un mamífero, e incluye un estado cuando los síntomas de la enfermedad están presentes, así como también condiciones en las cuales una desviación (por ejemplo, infección, mutación genética, defecto genético, etc.) ha ocurrido, pero los síntomas no están aún manifestados. El término "un" o "una" entidad, se refiere a una o más de tales entidades. Como tal, los términos "un" (o "una") , "unos o más" y "al menos uno", pueden ser usados de manera intercambiable aquí . Los términos "que comprende", "que incluye" y "que tiene", pueden ser usados de manera intercambiable. Hiperinmunización Mientras se prefiere que la composición de la presente invención se purifique de huevos hiperinmunes , también se contempla que el Factor inhibitorio de citosina pueda ser purificado del huevo de consumo. Se describe en la Patente Estadounidense No. 5,772,999, incorporada aquí por referencia en su totalidad, una descripción detallada de un procedimiento preferido usado para llevar un animal que produce huevos a un estado intensificado de inmunidad a partir del cual el huevo hiperinmune resultante o producto del huevo puede ser administrado a un sujeto. Brevemente, lo siguiente es un ejemplo del procedimiento usado para llevar un animal que produce huevos a un estado de intensificación de inmunidad para uso en la purificación de FIC o para producción de un producto alimenticio enriquecido con FIC para administración a un sujeto. Se entiende que tal procedimiento puede ser modificado como se discutió anteriormente para seleccionar o clasificar la producción FIC incrementada. En general, el proceso de hiperinmunización incluye las etapas de: 1. Seleccionar uno o más antígenos. 2. Provocar una respuesta inmune en un animal que produce huevos por inmunización primaria. 3. Administrar vacunas de refuerzo de antígenos de una dosificación apropiada para inducir y mantener el estado hiperinmune . . Colectar y procesar los huevos para producir un producto de huevo hiperinmune a partir del animal que produce huevos mantenido en el estado hiperinmune.

Etapa 1 Se puede emplear cualquier antígeno o combinación de antígenos. Los antígenos pueden ser bacterianos, virales, protozoarios , fúngicos, celulares o cualquier otra sustancia en la cual el sistema inmune de un animal que produce huevos responderá. El punto crítico en esta etapa es que el (los) antígeno (s) deben ser capaces de inducir estados inmunes e hiperinmunes en el animal que produce huevos. Una vacuna preferida es una mezcla de antígenos bacterianos polivalentes, referidos como una vacuna PL-100. La bacteria incluida en la vacuna PL-100 está listada en la Tabla 1 de la Patente Estadounidense No. 5,772,999. Etapa 2 La vacuna puede ser ya sea una vacuna atenuada viva o muerta y puede ser administrada por cualquier método que provoca una respuesta inmune. Se prefiere que la inmunización se acompañe administrando los antígenos a través de una inyección intramuscular. El músculo preferido para inyección en un ave es el músculo del pecho. La dosificación es preferiblemente 0.5-5 miligramos del (las) vacunas de antígeno (s). Otros métodos de administración que pueden ser usados incluyen inyección intravenosa, inyección intraperitoneal , supositorio rectal, o administración oral. Cuando las técnicas de ADN se usan para el proceso de hiperinmunización, se requieren cantidades mucho menores, generalmente 1-100 microgramos. Se puede determinar si las vacunas han provocado una respuesta inmune en un animal que produce huevos a través de un número de métodos conocidos por aquellos que tienen habilidades en la técnica de inmunología. Ejemplos de estos incluyen ensayos inmunosorbentes ligados a la enzima (ELISA) ; pruebas para determinar la presencia de anticuerpos en la estimulación de antígenos, y pruebas designadas para evaluar la habilidad de las células inmunes de los hospedadores para responder al antígeno. En general, la aparición de anticuerpos de huevos después de la inmunización con la vacuna es indicativo de una respuesta inmune. La dosificación mínima del antígeno, necesaria para inducir una respuesta inmune, depende del procedimiento de vacunación usado, que incluye el tipo de antígeno (s) usados, así como también el tipo de animal que produce huevos usado como el hospedador. Etapa 3 El estado hiperinmune es preferiblemente inducido y mantenido por administraciones de refuerzo repetidas de una dosificación apropiada a intervalos de tiempo fijos. Los intervalos de tiempo fijos son preferiblemente intervalos preferiblemente de dos semanas durante un periodo de seis meses. Sin embargo, es esencial que las administraciones de refuerzo no conduzcan a una tolerancia inmune. Es posible usar otros procedimientos de mantenimiento de hiperinmunización o combinación de procedimientos, tales como por ejemplo, inyección intramuscular para inmunización primaria e inyección intravenosa para inyecciones de refuerzo. Procedimientos adicionales incluyen simultáneamente administrar antígeno microencapsulado y líquido, o inyección intramuscular para inmunización primaria, y dosificaciones de refuerzo por administración oral o administración parenteral por medio de microencapsulación . Varias combinaciones de hiperinmuni zación primaria son conocidas por aquellos expertos en la técnica. Etapa 4 Los huevos hiperinmunes pueden ser procesados por administración al sujeto o por purificación en una variedad de formas. Estas incluyen preparación de una composición que comprende el producto de huevo hiperinmune substancialmente por el mismo (por ejemplo, en cápsulas) , e incorporación del producto de huevo hiperinmune en alimentos para administración a un sujeto, o siguiendo el protocolo de purificación para el Factor Inhibidor de Citosina como se describe así mismo aquí. Purificación del Factor Inhibidor de Citosina El factor inhibidor de citosina de la presente invención, puede ser separado y substancialmente purificado del huevo usando extracción de solvente y tecnologías de CLAR de fase normal (Véase Ejemplos 1 y 2) . Estudios de expresión de citosina in vi tro, y datos de bioensayo han demostrado todos la purificación de un Factor Inhibidor de Citosina biológicamente activo. Preferiblemente, los lípidos de la yema son extraídos de huevos hiperinmunes usando extracción solvente.

Una fracción de fosfolípido es entonces separada de una fracción lípida neutral a través de métodos de extracción de solvente selectivo. La fracción de fosfolípidos contiene moduladores inmunes múltiples, e inhibe las moléculas proinflamatorias , tales como TNF-a, IL-?ß, IL-2 y PGE2 in vi tro. El Factor Inhibidor de citosina de la presente invención está dispuesto dentro de la fracción de fosfolípidos de la yema de huevo hiperinmune . Esta fracción de fosfolípido suprime el ARNm de citosina, como se muestra por análisis comparativo de la transcripción de ARNm en células que han sido tratadas con los lipopolisacáridos estimulantes de la citosina (LPS) , y esta actividad es atribuida a la acción del Factor Inhibidor de Citosina. Los monocitos producen TNFa mínimo e IL-?ß bajo condiciones de crecimiento normales. Sin embargo, la expresión del ARNm de citosina celular es inducida a niveles superiores por tratamiento con LPS . Como se presenta en los ejemplos abajo, las células se estimularon por LPS para mejorar la expresión de la citosina. La expresión mejorada de la citosina es entonces suprimida por la fracción de fosfolípidos de la yema hiperinmune. El LPS adicional se removió de las células y como un resultado, el ARNm de TNFa y IL-?ß son purgados de la células por la fracción de fosfolípidos de yema. Por lo tanto, esta fracción de fosfolípidos comprende al menos, un Factor Inhibidor de Citosina. Los resultados presentados abajo demuestran que la fracción de fosfolípidos de yema no reacciona con LPS y su efecto neutraliza la inducción de LPS por la expresión de citosina. La fracción de fosfolípidos de yema inhibe específicamente, la transcripción del ARNm de citosina. Como se expone específicamente en los ejemplos abajo, se examinaron cuatro moduladores pro- inflamatorios , TNF-oc, IL-?ß, IL-2, y PGE2, vía inducción de LPS de los moduladores pro- inflamatorios en monocitos (humano y de ratón) . Se midió la expresión de citosinas en el nivel de APJflrn, así como también la producción PGE2 al nivel de proteína. La fracción de fosfolípidos de yema inhibe la expresión de TNF-oc, IL-?ß, IL-2, y PGE2. Extracción de fracción de fosfolípidos de yema Preferiblemente, el Factor Inhibidor de Citosina de la presente invención, es substancialmente purificado de ya sea el huevo completo, yema de huevo o una fracción de lípido de la yema de huevo a partir de un ave hiperinmuni zada . En el proceso de purificación, la yema de huevo es eventualmente sometida a extracción de solvente. La extracción de solvente puede ser aplicada a la yema de huevo misma o a cualquier otra forma de la yema, tal como por ejemplo, yema de huevo secada por rocío. Pueden ser usados diferentes solventes para este propósito. Solventes no polares, tales como hexano, son empleados para remover lípidos neutrales en la yema o fracción lípida de la yema. Subsecuentemente, solventes polares tales como metanol y etanol, son empleados para extraer una fracción de fosfolípidos . Alternativamente, varios solventes son apropiados para los varios procedimientos de extracción, tal como acetona y cloroformo. Una variedad de solventes pueden ser seleccionados para la aplicación de purificación dependiendo de los requerimientos y optimización de los procesos, graduación, y regulaciones aplicables. Otra vía para aislamiento y purificación del Factor Inhibidor de Citosina de la presente invención, es a través de la extracción de fluido supercrítico (EFS) . La EFS remueve la fracción lípida neutral que contiene los lípidos neutrales tales como triglicéridos y colesterol de lípidos de la yema. Los lípidos neutrales comprenden aproximadamente 70% de los lípidos de la yema totales. Por ejemplo, la extracción de dióxido de carbono supercrítica puede ser un procedimiento efectivo para remover la mayoría del colesterol y grasas de~ la yema de huevo sin dañar la funcionalidad de la fracción de fosfolípidos . Los fosfolípidos no se remueven durante la EFS por dióxido de carbono, y el dióxido de carbono puede ser benéfico en el mantenimiento de las propiedades de emulsificación. Los fosfolípidos sin embargo, pueden ser extraídos por otros solventes tales como propano .

Administración En otras modalidades, la composición de la presente invención puede incluir FIC en forma purificada, recombinante , químicamente sintetizada, substancialmente purificada o cualquier otra enriquecida. Para propósitos de administración, el FIC en cualquier forma adecuada, puede ser administrado en combinación con cualquier portador adecuado farmacéuticamente aceptable. Los portadores adecuados farmacéuticamente aceptables de conformidad con la presente invención, incluyen excipientes farmacéuticamente aceptables, vehículos de liberación controlada, y vehículos de suministro farmacéuticamente aceptables como se describe anteriormente. La composición puede estar en cualquier forma adecuada para suministro, que incluye pero no se limita a, un líquido, un aerosol, una cápsula, una tableta, una pildora, un polvo, un gel y un gránulo. Las preparaciones del FIC que son particularmente adecuadas para administración parenteral incluyen soluciones acuosas estériles o no acuosas, suspensiones o emulsiones. Ejemplos de solventes no acuosos o vehículos son propilenglicol , polietilenglicol , aceites vegetales tales como aceite de oliva y esteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. En formas de dosificación sólidas, la proteína del FIC puede ser mezclada con al menos un diluyente inerte tal como sucrosa, lactosa o almidón. Tales formas de dosificación pueden comprender como su práctica normal, substancias adicionales distintas del diluyente inerte. En el caso de cápsulas, tabletas y pildoras, las formas de dosificación pueden también comprender agentes amortiguadores, polímeros sensibles al pH, o cualquiera de los otros encapsulantes de liberación lenta (es decir, vehículos de liberación controlada) , los cuales son típicamente usados como composiciones encapsulantes en el alimento e industria de fármacos o cualquier otras formulaciones de liberación controlada. Las tabletas y pildoras pueden ser preparados adicionalmente con un revestimiento entérico. Las formas de dosificación líquidas del factor inhibidor de citosina para administración oral incluyen emulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elixires farmacéuticamente aceptables que contienen diluyentes inertes comúnmente usados en la técnica farmacéutica. Además de diluyentes inertes, las composiciones pueden también incluir agentes humectantes, emulsificantes , y agentes de suspensión y endulzantes. En una modalidad, la composición está en la forma de un producto alimenticio. En esta modalidad, en un aspecto, el huevo inmunoregulador o cualquier fracción enriquecida con FIC del mismo, está integrada en un suplemento nutricional . Un método preferido para preparar el huevo o cualquier fracción del mismo, para ser incorporada en un suplemento nutricional, involucra secar el huevo en un polvo. Aunque varios métodos se conocen para secado de huevos, el secado por rocío es un método preferido. El proceso de huevos secados por rocío es bien conocido en la técnica. Tal polvo de huevo seco puede ser ingerido solo como polvo de huevo simple, o puede ser incorporado en bebidas en la forma de por ejemplo, polvos de proteínas, bebidas elaboradas en polvo, suplementos de proteínas y cualesquiera otros productos asociados a los atletas, nutricionales . Además, el polvo en huevo puede ser usado en mezclas de harina, barras de energía, dulces, galletas, etc. Otros ejemplos de procesamientos de huevo incluyen elaborar un omelet, hervir suave o duro el huevo, cocinar el huevo, o, si se desea, el huevo puede ser comido crudo o procesado como un huevo líquido. Las fracciones preferidas del producto de huevo inmunoregulatorio de la presente invención incluyen, pero no se limitan a: yema líquida de huevo, yema de huevo en polvo, y/o una fracción lípida de dicho producto de huevo hipermmunizado . Se puede suministrar una composición de la presente invención (es decir, administrada) , a un cultivo celular (tal como en un ensayo de citosina) o paciente por cualquier método adecuado. La selección de tal método variará con el tipo de compuesto a ser administrado o suministrado (es decir, fracción purificada, proteína, ácido nucleico, mimético), el modo de suministro (es decir, in vitro, in vivo, ex vivo) , y el objetivo a ser logrado por administración/suministro del compuesto o composición. De conformidad con la presente invención, un protocolo de administración efectivo (es decir, administración de una composición en una manera efectiva} , comprende parámetros de dosis adecuadas y modos de administración que resultan en suministro de una composición a un sitio deseado (es decir, a una célula deseada) y/o en regulación de una respuesta inmune en un sujeto. Preferiblemente, la composición de la presente invención es administrada a un sujeto animal por cualquier medio que modula el sistema inmune en el sujeto animal. Las rutas de administración incluyen rutas in vivo, in vitro y ex vivo. Las rutas in vivo incluyen pero no se limitan a, inyección oral, nasal, intratraqueal , inhalada, transdérmica , rectal, impregnación de un catéter, por supositorio, inyección directa en un tejido y rutas parentéricas . Las rutas parentéricas preferidas pueden incluir pero no se limitan a, rutas subcutáneas, intradérmicas, intravenosas, intramuscular e intraperitonial . En una modalidad de la presente invención, una composición que contiene una fracción del FIC, proteina, anticuerpo, mimético o molécula de ácido nucleico de la presente invención es administrado por una ruta parenteral . Las administraciones intravenosas, intraperitoneal , intradérmica, subcutánea e intramuscular, pueden ser realizadas usando métodos estándares en la técnica. El suministro en aerosol (inhalación) puede ser realizado usando métodos estándares en la técnica (véase por ejemplo, Stribling et al., Prot. Nati. Acad. Sci . USA 189:11277-11281, 1992, el cual es incorporado aquí por referencia en su totalidad) . En otra modalidad, una composición que comprende una fracción de FIC de la presente invención se administra oralmente. El suministro oral se puede realizar formando en complejos una composición terapéutica de la presente invención a un portador adecuado de soportar la degradación por enzimas digestivas en el intestino de un animal. Se nota que una fracción del FIC de la presente invención es particularmente resistente a las enzimas digestivas y por lo tanto, tal portador no puede ser crítico. Ejemplos de tales portadores incluyen cápsulas o tabletas de plástico, tales como aquellas conocidas en la técnica. Tales rutas pueden incluir el uso de portadores farmacéuticamente ~ aceptables como se describe anteriormente. Ex vivo se refiere a realizar parte de la etapa reguladora fuera del paciente, tal como transfectar una población de células removidas de un paciente con una molécula recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de conformidad con la presente invención, bajo condiciones de manera tal que la molécula recombinante es subsecuentemente expresada por la célula transfectada, y regresar las células al paciente. Rutas de administración in vi tro y ex vivo de una composición a un cultivo de las células hospedadoras pueden estar acompañadas por un método que incluye pero no se limita a, transfección, transformación, electroporación, microinyección, lipofección, adsorpción, fusión de protoplasto, uso de agentes que portan proteínas, uso de agentes que portan iones, uso de detergentes para permeabilización y simplemente mezclar (por ejemplo, combinando) un compuesto en cultivo con una célula obj etivo . En una modalidad, los huevos inmunoregulatorios o fracciones de los mismos, de la presente invención, son procesados para producir un producto de huevo hiperinmune el cual puede ser subsecuentemente administrado a un sujeto animal. En una modalidad, la administración ocurre alimentando directamente el huevo, o cualquier derivado del mismo a un sujeto animal. Es importante notar que el huevo es un ingrediente, alimenticio natural que no es tóxico y seguro. De manera similar, en otra modalidad, se prefiere que el Factor Inhibidor de Citosina substancialmente purificado se prepare (por ejemplo, formule) en una manera la cual puede ser subsecuentemente administrada a un animal. Cuando llega a modulación del sistema inmune, la composición de la presente invención es preferiblemente administrada al sujeto en una cantidad que es inmunológicamente efectiva inhibiendo la expresión de citosina (es decir, TNF-a, IL-?ß, IL-2 y/o PGE2) y preferiblemente, inhibición de citosina y modulación inmune. La duración e intensidad del tratamiento dependerá del sujeto y condición particular del sujeto y si está presente y, en este caso, el advenimiento de la condición en el sujeto. La composición es también proporcionada en cualquier cantidad que trata y/o previene la condición y los síntomas de la condición. Por ejemplo, en el caso de administración de huevos inmunoreguladores o productos producidos a partir de estos, cantidades diarias varían desde menos de uno a varios huevos hiperinmunes , completos (o productos de huevos hiperinmunes que contienen el equivalente de menos de uno a varios huevos hiperinmunes, completos), pueden ser administrados al sujeto dependiendo de la circunstancia particular de la condición. Las fracciones más potentes pueden ser separadas y concentradas por métodos descritos aquí así como también otros métodos conocidos en la técnica. Con respecto a la administración a un sujeto del huevo inmunoregulatorio o producto de huevo, se ha determinado que el intervalo de dosis preferido de huevo hiperinmune o producto de huevo a ser dado a un sujeto está entre 100 miligramos hasta 10 gramos por kilogramo de peso del sujeto. Con respecto al Factor Inhibidor de Citosina de la presente invención, que incluye FIC substancialmente purificado, FIC recombinante y/o FIC químicamente sintetizado, se ha determinado que el intervalo de dosis preferido de la composición substancialmente purificada está entre 1 nanogramo y 400 miligramos por kilogramo del peso del sujeto. En una modalidad preferida, el intervalo de dosis preferido está entre alrededor de 0.01 microgramos y alrededor de 100 miligramos por kilogramo del peso del sujeto. En otra modalidad, una proteína o anticuerpo es administrado en una cantidad que está entre alrededor de 0.1 :g y alrededor de 10 mg por kg de peso corporal del paciente, y más preferiblemente, entre alrededor de 0.1 :g y alrededor de 100 :g por kg de peso corporal del paciente. Será obvio para un experto en la técnica, que el número de dosis administradas a un paciente es dependiente de la meta de la administración (por ejemplo, la extensión de la condición inflamatoria y la respuesta de un paciente individual al tratamiento) . Por lo tanto, está dentro del ámbito de la presente invención que un número adecuado de dosis incluyen cualquier número requerido para regular una respuesta inmune en un animal, o para regular una enfermedad o condición la cual se espera sea tratada o prevenida por regulación descendente de citosinas proinflamatorias (TNF-a, IL-?ß, IL-2) y/o por regulación descendente de PGE2. Los parámetros de dosis in vivo efectivos, se pueden determinar usando métodos estándares en la técnica. Tales métodos incluyen por ejemplo, determinación de relaciones de supervivencia, efectos laterales (es decir, toxicidad) , determinación de efectos de respuesta inmune celular y humoral, y/o efectos en condiciones relacionadas a tales efectos de respuesta inmune. Es una modalidad de la presente invención, proporcionar un método para modular una respuesta inmune en un animal. Esta modalidad incluye las etapas de administrar a un animal una composición como se describe previamente aquí, que comprende un Factor Inhibidor de Citosina substancialmente purificado de la presente invención. En una modalidad preferida, la composición comprende un portador farmacéuticamente aceptable, también descrito previamente aquí. En esta modalidad, la composición de la presente invención puede ser usada como un estimulador local o sistémico del sistema inmune. Podría también prevenir y/o tratar la infección bacteriana localizada y sistémica y podría ser empleada como un agente anticancerígeno general. Podría también ser etiquetado con reactivos de suministro específicos como anticuerpos específicos de tejidos, de este modo para suministrar a través de la ruta intravenosa al sitio específico de la infección bacteriana o formación de tumor. Podría también ser mezclado con liposomas específicos o vehículos de suministro que son comercialmente disponibles, de manera que suministra a través de la membrana citoplásmica y nuclear de la célula y con ello facilita la inhibición de la expresión TNF-a( IL-?ß, y/o IL-6 al nivel de ARN. Los modos adecuados de administración, que incluyen rutas y dosis preferidas, se describen arriba. Preferiblemente, un animal es administrado de una composición de la presente invención en una dosis y por una ruta adecuada para regular una respuesta inmune incrementando la expresión de TNF-ct, IL-?ß, IL-2 y/o PGE2. Las propiedades ventajosas de esta invención se pueden observar por referencia a los siguientes ejemplos, los cuales ilustran la invención. Estos ejemplos se proporcionan para propósitos de ilustración y no están propuestos para limitar el ámbito de la presente invención. Ej emplos EJEMPLO 1 - Fraccionamiento de lípidos de yema PL-100 Se deslipidaron huevos PL-100 _ usando un amortiguador que se preparó disolviendo ácido glacial acético (0.44 mi), acetato de sodio (3.06 g) y cloruro de sodio (5.26 g) en agua ultrapura 1,300 mi. El amortiguador tiene un valor de pH de aproximadamente 5.0. El material de huevo (100 g de huevo secado por rocío o 200 mi de cáscara de huevo) se agregó al amortiguador y la mezcla de huevo fue además homogenizada mezclando a temperatura ambiente por 5 minutos a 24,000 rpm. La mezcla de huevo homogenizado se agitó a 4°C por 4 horas para permitir solubilidad máxima. Se agregó ácido caprílico (15 mi) a la mezcla de huevo y se homogenizó mezclando a temperatura ambiente por 3 minutos a 24,000 rpm.

La mezcla de huevo entonces se reposó a temperatura ambiente por 2 horas, permitiendo la separación de fase. El floculado y las espumas entonces se mezclaron con la fase acuosa y se centrifugaron a temperatura por 10 minutos a 2,190 x g. El sobrenadante se filtró usando papel filtro de porosidad de 40 micrones, y lo filtrado se liofilizó a sequedad. La pelotilla, la cual contiene lípidos y proteínas insolubles en agua, se colectó para extracción de lípidos adicionales. Esta fracción se refiere como la Fracción Insoluble en Agua (FIA) . Los lípidos de huevo pueden ser extraídos de ya sea la Fracción Insoluble en agua (FIA) del procedimiento de extracción acídico anterior, o de la yema líquida de huevo como la fuente de material. Para extracción de solvente de los lípidos del huevo, 800 gramos de ya sea yema líquida de huevo o la pelotilla de FIA con 1,000 mi de acetona en una botella sellada. Los lípidos neutrales tales como triglicéridos y colesterol, se extrajeron con acetona tres veces, por 3 minutos por mezclado violento o mezclando a 24,000 rpm. El extracto de acetona se filtró a través de papel filtro doblado Whatman de 40 micrones. Los residuos de partículas no disueltas en acetona/residuo del papel filtro de la extracción de acetona, se mezclaron además en 1,000 mi de metanol y los lípidos polares y se extrajo el Factor Inhibidor de Citosina tres veces a 3 minutos cada uno. Se removió el metanol por evaporación usando un evaporador giratorio bajo una presión reducida de 5 libras por pulgada cuadrada (PSI) a 50 °C. Cantidades rastro de metanol y agua en el extracto se removieron por liofilización . El extracto de metanol seco se almacenó a -20°C como una pasta amarilla. Para uso futuro, la fracción de extracto de metanol puede ser disuelta en metanol, etanol, cloruro de metileno y cloroformo y parcialmente disuelta en agua. Alternativamente, el etanol puede ser usado en lugar de metanol en la extracción de los lípidos del huevo de conformidad con el procedimiento anterior. Los componentes del huevo puede ser separados basados en la solubilidad en varios solventes. La yema de huevo contiene aproximadamente 62% de lípidos y 30% de proteína. De la porción lípida, los lípidos neutrales los cuales son principalmente trigliceroles , son una porción significante de los lípidos totales, que comprenden aproximadamente 65% de los lípidos totales. Los lípidos neutrales no son polares y altamente solubles en solventes de hidrocarburos, tales como hexano o benceno. Son sin embargo, casi insolubles en más solventes polares . Contrariamente, los fosfolípidos comprenden alrededor de 30% de los lípidos totales o 18% en masa de yema total. Los fosfolípidos son casi polares como un resultado de la molécula de colina o etanolamina esterificada a ácido fosfórico, y son por lo tanto, fácilmente extraídos por solventes polares tales como metanol y etanol.

El rendimiento del extracto fosfolípido en tanto yema líquida como polvo de yema seca, es alrededor de 10% en masa de yema por la extracción de solvente (Véase Tabla 1) . Algunos fosfolípidos fueron extraídos y descargados durante el proceso de extracción de acetona como la acetona tiene una polaridad moderada, y puede extraer una porción de fosfolípidos con los lípidos neutrales. El rendimiento de los fosfolípidos puede ser incrementado usando solventes no polares, tales como hexano, para extraer los lípidos neutrales. Tabla 1. Extracción de metanol de fosfolípidos de huevo Yema de huevo1 (%) de Rendimiento de fosfolípidos^ Huevo completo secado por rocío PL-100 3.3 Yema de huevo secado por rocío PL-100 8.0 Yema de huevo secada por rocío SPAFAS3 10.4 Cáscara de huevo completa PL-100 4.8 Yema huevo con cáscara PL-100 12.8 1 Huevo completo y yema de huevo contienen 34% y 51 % de masa seca, respectivamente. 2 Rendimientos de extracto de metanol de la cáscara de huevo e calcularon con masa seca en cáscara de huevo tot Huevo SPAFAS es huevo no inmune .

EJEMPLO 2 PURIFICACIÓN POR 2-CLAR El extracto fosfolípido o polar del procedimiento de extracción descrito en el Ejemplo 1, puede ser además purificado en fracciones del FIC usando CLAR de fase normal. El cromatograma de CLAR (véase Figura 1), mostró cinco fracciones de la fracción de fosfolípido. De las cinco fracciones, dos fracciones fueron especialmente efectivas inhibiendo la expresión TNF-a y IL-?ß in vitro. La separación por CLAR se realizó en una columna de CLAR de fase normal (25 x 2.12 cm Zorbax PRO 1/150 CN) en un sistema de CLAR Americhrome. Se usaron cuatro solventes para la separación: Solvente A fue 99.5% de heptano en .05% etanol ; el Solvente B fue de 94% de heptano en 6% de etanol; el Solvente C fue de 90% de heptano en 10% de etanol; y el Solvente D fue de 100% de etanol. Para la separación, aproximadamente 4.0-4.5 gramos del extracto de fosfolípidos se disolvió en 150 mi del Solvente A y se filtró a través de una membrana de porosidad de 0.2 µ?? para remover unos materiales no disueltos. Se obtuvo una solución amarillo clara. La solución amarillo clara entonces se separó usando CLAR. El gradiente de la etapa en la columna fue el Solvente A (0-2 minutos), Solvente B (2.01-18.0 minutos), y el Solvente C (18.01-30.0 minutos), Solvente D (30.01-40.0 minutos) y Solvente A (40.01-60.0 minutos). A partir de esto, se colectaron cinco fracciones como se muestra en la Figura 1. La longitud de onda de detección fue a 254 nm, y las fracciones 1 (Fl) y 5 (F5) mostraron la lectura de detección más alta. La separación de CIAR se condujo durante muchas inyecciones y la fracciones combinadas se colectaron. Los solventes se removieron por evaporación usando un evaporador giratorio. La separación de CLAR describe la pureza incrementada de los factores inhibitorios de la citosina (FIC) . Cada una de las fracciones tiene un color amarillo de intensidad variante. Como el cromatograma en la Figura 1 muestra, la mayoría de los materiales en la fracción de fosfolípidos se separaron en fracciones 1 (Fl) y 5 (F5) , mientras las fracciones 2-4 (F2, F3 y F4) fueron materiales más altamente purificados. EJEMPLO 3 - Caracterización del Factor Inhibidor de Citosina El Factor Inhibidor de Citosina (FIC) , substancialmente purificado al nivel expuesto en el Ejemplo 2 anterior, se caracterizó además para determinar las características específicas. Brevemente, los siguientes estudios básicos se corrieron y se determinaron las características asociadas. La longitud de onda máxima del Factor Inhibidor de Citosina substancialmente purificada, se midió por un espectrofotómetro equipado en un detector de acomodo de diodo de CLAR Shimadzu, y se determinó por ser 205 nm.

El punto de fusión del Factor Inhibidor de Citosina substancialmente purificada (FIC) , se midió por observación visional colocando FIC frío en un baño de agua caliente incrementado y se determinó por estar dentro del intervalo de 39°C-42°C. El peso molecular del FIC substancialmente purificado se estimó como los datos de estudio actual. Se sabe en la técnica, que la mayoría de los compuestos en la fracción de fosfolípidos de la yema de huevos son moléculas pequeñas (200-6,000 Daltons) . La solubilidad de la fracción de FIC substancialmente purificada, se midió agregando 100 mg de FIC en 1.0 mi de solvente a temperatura ambiente. La solubilidad se verificó por observación visional. Se determinó finalmente que el FIC no puede ser una proteína, debido a que las proteínas no son solubles en metanol , etanol y/o cloroformo. EJEMPLO 4 - INHIBICIÓN DE CITOSINA N VITRO Se realizó ensayo de inhibición de citosina con incubación de monocito humano, THP1, seguido por procedimiento de RCP-TI para medir la expresión del ARNm de citosina. El ensayo completo incluye cuatro etapas: inhibición de citosina, extracción de ARN, síntesis de ADNc y reacción de RCP. Inhibición de citosina in vitro: Para el ensayo de inhibición de citosina, células THP1 a una concentración de -1 x 105 células, se incubaron en 10 mL de medio RPMI 1640 con LPS (principalmente 0.2 µ9/??1), para inducir las citosinas en las células. Las células también se incubaron con fracciones de lípidos de yema (5 µ9 p?1) simultáneamente por 4 horas a 37 °C. Las células se cosecharon y mezclaron con 750 mi de Trizol (GIBCO BRL) . Extracción de ARN: Después de incubar la mezcla celular por 10 minutos a temperatura ambiente, se agregaron 250 µ? de cloroformo y la mezcla se sacudió vigorosamente por la mano por unos 20 segundos adicionales. La mezcla entonces se dejó a temperatura ambiente por 10 minutos y se centrifugó a 12,000 xg por 5 minutos. La capa acuosa clara superior se removió cuidadosamente en un tubo micro-centrífugo fresco, y se agregaron 500 µ? de alcohol isopropílico . La mezcla de ARN se centrifugó a 12,000 xg a temperatura ambiente después de incubar por 10 minutos a temperatura ambiente. El ARN que contiene la pelotilla se lavó con 1.0 mi de alcohol etílico frío al 70% y después se centrifugó a 12,000 xg por 5 minutos a temperatura ambiente. El ARN se disolvió en 40 µ? de agua destilada estéril (RNase libre) , se mezcló por vórtices uniformemente y se incubó a 65 °C, con las tapas abiertas para evaporar completamente el restante etanol al 70%. La cantidad de ARN se verificó cargando 1.0 µ? en gel de agarosa al 1% en amortiguador de corrida lxTBE con un ? ADN digerido con enzima Hind III como un ARN estándar. Finalmente, el ARN se tiñó usando 10 µ? de Tinta Dorada de Gel de ácido nucleico (Molecular Probes) en 100 mL de amortiguador lxTBE por 20 minutos y se visualizó el gel bajo UV. Síntesis de ADNc : Se agregaron muestras de ARN y 1.0 µ? de Cebador Oligo dT en un tubo de RCP . El ARN se incubó a 65°C por 10 minutos, seguido por 2 min de incubación a temperatura ambiente en una máquina de RCP . Los tubos de RCP se centrifugaron para rotar las muestras debajo en la parte inferior y se agregaron al tubo 8 µ? de la mezcla principal. La mezcla principal contiene 1.0 µ? de inhibidor R ase, 4 µ? de amortiguador 5 x TI, 1.0 µ? de 100 mM de d TPs, 1.0 µ? 80 mM de pirofosfato de sodio y 1.0 µ? de Transcriptasa inversa AMV. Los tubos se incubaron en una máquina de RCP a 42 °C por 1 hora, seguido por una incubación de 2 minutos a 95 °C. Después de rotar los tubos brevemente, se agregaron 1.0 µ? de EDTA 0.5 M, pH 8.0 y 20 µ? de fenol -cloroformo, y las muestras se mezclaron por vórtices después se rotar por 2-3 minutos. La capa acuosa superior se removió en un tubo nuevo (- 19 ul) , y se agregaron 20 µ? de acetato de amonio y 125 µ? de isopropanol. La muestra se agitó por vórtices por 10 segundos y se incubó en hielo seco/etanol viscoso (-20 °C) por 1 hora. Rotando los tubos a 12,000 x g por 10 minutos a temperatura ambiente, el sobrenadante se descargó y la pelotilla se lavó con 1 mi de alcohol etílico al 70%. La mezcla de ARN se rotó a 12,000 x g por 5 minutos a temperatura ambiente, y el etanol se removió.

Reacción en PCR : Se empleó inicialmente cebador GAPDH para asegurar que los niveles de ADNc sean iguales en todas las muestras. 100 µ? de mezcla de reacción de RCPTI contienen amortiguador 10 x RCP (Gibco BRL, sin MgCl2), 2.5 µ? de dNTP (Gibco BRL), 3.0 µ? de MgCl2, 2.0 mi de cebador fijo para cada citosina, 1.0 µ? de polimerasa de ADN Taq, y 63 µ? de agua estéril de RCP (Gibco BRL) . Se agregaron 1.0 µ? de ADNc y 4.0 µ? de agua destilada estéril en cada tubo de RCP. La reacción RCP se fijó como procedimiento estándar. Una vez que la PCR se terminó, se agregaron 50 µ? de cloroformo a cada tubo. Los vórtices con las tapas se cerraron herméticamente y se centrifugo a 12,000 x g por 1 minuto. La capa acuosa superior se transfirió en tubos etiquetados frescos. Posteriormente, 15 µ? de cada muestra se aplicó en 1.5% de gel de agarosa en amortiguador de corrida 1 x TBE, y el ADN de citosina se corrió en el gel con 100 bp de escala estándar como control. El gel de tiñó usando 10 µ? de Tinte Dorado de gel de ácido nucleico (Molecular Probes) en 10 mi de amortiguador 1 XTBE por 20 minutos y se revisó bajo detector UV. Resultados LPS estimula los monocitos humanos para producir TNFa y IL-lb (6) . Este resultado es constante a nuestro estudio. El LPS induce células THP1 para expresar ambas de las citosinas (Figura 2) . La inducción máxima para TNFa fue alrededor de 0.2 mg/ml de medio. Alta concentración de LPS mostró pobre inducción, así como también baja concentración en el medio de cultivo. El LPS fue capaz de inducir IL-lb a concentración muy baja (0.008 mg/ml) , indicando que el IL-lb fue una citosina más sensible para responder a la inducción de LPS. Usando el ensayo de inducción de LPS, se determinó que las expresiones de TNFa, IL-lb, y IL-2 en los monocitos humanos se inhibieron por la fracción de fosfolípidos de la yema. El TNFa celular y IL-lb mostraron completa inhibición cuando las células se incubaron con 0.2 mg/ml de LPS y fracción de fosfolípidos de la yema (Figura 3) . La inhibición de citosina también se determinó por un ensayo modificado para confirmar la inhibición específica por la fracción de fosfolípidos de la yema. En este ensayo, las células se incubaron con 0.2 mg/ml de LPS para inducir TNFa y IL-lb. Después de 2 horas de incubación, LPS en el medio se removió lavando las células. Las células fueron entonces incubadas con fracción de fosfolípidos de yema por más de dos horas. Consistentemente, ambas de TNFa y IL-lb fueron suprimidas completamente. Por el contrario, las células con LPS por 2 horas de incubación sin fracción de fosfolípidos de yema adicionales, posteriormente mostraron alta expresión de TNFa y IL-lb. EJEMPLO 5 INHIBICIÓN DE IL-2 También se encontró que el IL-2, otra citosina pro-inflamatoria, se inhibió por la fracción de lípido de la yema. El IL-2 se inhibió por tanto el extracto de acetona como el extracto de etanol , parcialmente (Figura 4) . Debido a la composición impura del lípido neutral, el extracto de acetona podría mezclarse con cierta porción de la fracción de fosfolípidos durante la extracción del solvente. Por la misma determinación, la fracción de fosfolípidos de la yema no muestra cualquiera de los efectos en las expresiones de IL-6, IL-12 y GFb en células. EJEMPLO 6 - INHIBICIÓN DE LA BIOSINTESIS DE PGE2 El efecto de las fracciones de lípidos en la yema en la inhibición de la biosíntesis de PGE2 en macrófagos de monocitos de ratón. Experimento Muchos tipos celulares son capaces de expresar tanto COX-1 como COX-2; otros expresan uno o el otro. Las células RAW 264.7 usadas en este ensayo expresan ambas isoformas de ciclooxigenasa (demostrada por ensayos de inmunofluorescencia en nuestro laboratorio) . El ensayo comienza con la inducción durante la noche de COX-2 a través de la estimulación (LPS) mitogénica de monocapas de células RAW 264.7. Las monocapas celulares fueron entonces expuestas a un artículo de prueba (por ejemplo, indometacina) por 30 minutos a 37 °C y después a una fuente exógena de ácido araquidonico proporcionada al sistema. El COX1 y COX2 (además de una sintetasa específica de PEGE2 ) , convierte el ácido araquidonico exógeno a PEG2. La prostaglandina E2 en el medio de cultivo entonces se cuantificó por un sistema EIA comercial . Cuando se recuperó menos del PGE2 del medio de cultivo que tiene un artículo de prueba que se recuperó del medio de cultivo solo, la condición fue inhibición etiquetada. El mecanismo particular por el cual la inhibición de la biosíntesis de PGE2 ocurre en este ensayo, no puede ser deducido y podría requerir estudio adicional. Procedimiento de ensayo: Células 5 x 106 en medio DMEM se sembraron e incubaron en un incubador de C02 al 5% a 37 °C durante la noche. A aproximadamente 24 horas de crecimiento de las células sembradas al día 1 (usualmente 90-100% de confluencia) , el medio de crecimiento fue asépticamente decantado y descargado. Se pipeteó uniformemente, 10 mi de PBSA estéril en matraces contra una superficie sin crecimiento, y las células se lavaron dos veces. Se agregó 10 mi de DMEM que contiene LPS (2ng/ml) a los matraces de prueba. Los matraces se colocaron en un incubador de C02 al 5% a 37 °C durante la noche por 16 horas. A 16 horas de exposición de LPS post - inicial , el medio de crecimiento se removió asépticamente (succión) y se descargó. Se pipeteó uniformemente 10 mi de PBSA estéril en matraces contra una superficie sin crecimiento, y las células se lavaron dos veces. Las células se incubaron en la presencia de 2 mi de PBSA, 2 mi de fármacos de control positivo o 2 mi de muestra de lípidos de yema (1.0 mg/ml) a 37°C. Después de 30 minutos de incubación, se agregó 222 µ? de 300 µ? de ácido araquidónico a cada matraz. Las células fueron incubadas por unos 15 minutos adicionales a 37 °C en la presencia de 30 µ? de ácido araquidónico. Después de 15 minutos de incubación, se agregaron 50 µ? de 1 mg/ml de indometacina a los contenidos del matraz para detener la reacción. Todos los fluidos de los matraces se colectaron en tubos de polipropileno apropiadamente etiquetados. Se ensayó la prostaglandina E2 con el kit ELISA comercial (Amersham RPN222) a temperatura ambiente siguiendo el protocolo estándar. Resultados La biosíntesis PGE2 en este modelo se inhibió por varios NSAID, tales como indometacina, aspirina e ibuprofeno (datos no mostrados) . Se ha reportado que los tres NSAID no son inhibidores selectivos a ambas enzimas de COX-1 y COX-2. Son considerados como fármacos no específicos y en muchos casos, causan efectos laterales en la aplicación clínica a pacientes tratados. En nuestro estudio, la biosíntesis de PEG2 en células, se inhibió por las fracciones de yema a niveles diferentes (Tabla 2) . En los materiales crudos, la yema mostró ser de inhibición más fuerte que el huevo completo en la biosíntesis PGE2. La potencia inhibidora de tanto la yema de huevo como el huevo completo sin embargo, fue relativa inferior (17% en promedio), comparada con fracciones lípidas. El extracto de acetona y extracto de metanol de lípidos de yema, inhiben la biosintesis PGE2 a 31% y 54%, respectivamente. Por el contrario, ambas de las fracciones enriquecidas con proteínas, proteínas solubles en agua (Filtrado) y proteínas insolubles en agua (Residuos), no mostraron inhibiciones en la biosintesis PGE2 en las células. Se sugiere que el inhibidor activo de la yema de huevo a la biosintesis de PGE2 está ubicado en la porción de fosfolipidos, y es posible que el componente activo sea una molécula insoluble en agua y no como peptídica. Esta molécula puede ser una molécula distinta que difiere del componente activo inhibiendo la expresión de las citosinas. Esto indica que la fracción de fosfolipidos de la yema tiene moduladores múltiples para suprimir diferentes moléculas pro-inflamatorias. Tabla 2 . Inhibición de la biosintesis de PGE2 in vitro por fracciones de huevo PL-100 Secado por rocío Fresco Fracción Huevo Yema de Huevo Yema de Media completo huevo completo huevo Huevo -3 30 21 17 inicial filtrado -5 -2 13 -6 0 Extracto 16 82 -19 43 31 de acetona Extracto 61 55 52 54 de MeOH Residuos -11 12 -21 0 -6 número representa % de inhibición biosintesis de PGE2 in vitro. 3. La concentración de la fracción de huevos en cultivos celulares de prueba fue de 1.0 tng/ml de medio. EJEMPLO 7 - MODELO DE ARTRITIS INDUCIDA POR COLÁGENO Determinación del efecto anti-inflamatorio de yema PL-100 en modelo de artritis inducida por colágeno en ratas. Experimento El método para inducir y evaluar la artritis inducida en colágeno en ratas, fue de conformidad con el protocolo desarrollado por Trentham, et al. 1977 (8). La yema PL-100 y la fracción deslipidada se alimentaron a ratas por 7 días previo a la iniciación de la artritis inducida por colágeno tipo II en ratas y por 16 días después de la inducción. Se obtuvieron un total de 20 ratas hembra Sprague-Dawley (VAF+) . Se probaron tres grupos de ratas (10 ratas por grupo) . Fueron de control (cebadura de agua) , 3.5 mi de una solución al 5% de yema de huevo, y 3.5 mi de fracción de yema deslipidada al 5%. Las ratas fueron dadas con cebaduras con muestras cada tercer día. Al segundo día, las soluciones fueron almacenadas hasta 4°C hasta su uso. Después de dos días, se descargaron las soluciones en exceso. Iniciando a 10 días después de la inmunización intradérmica y diariamente posteriormente hasta el día 21, las ratas fueron evaluadas clínicamente (ciegas) para determinar eritema en la pata de la rata (0-4+ ) y entumecimiento de pata (0-4+ ) . Al día 21, todas las ratas fueron sacrificadas y sangradas.

Resultados La yema de huevo hiperinmune suprime alrededor de 40% del eritema de la pata y el entumecimiento de la pata de ratas probadas en un modelo de artritis inducida por colágeno (Figura 6) . Comparando con la fracción de yema, la yema deslipidada así como también la muestra de control no mostraron efectos en la lesión creada. Aún a través de este experimento, falta un grupo de lípidos de yema en el estudio probado para mostrar el efecto específico en la inhibición de la inflamación, el resultado indirecto indica que la fracción de fosfolípidos de la yema contiene los componentes anti-inflamatorios . Aunque la invención es ilustrada y descrita aquí con referencia a las modalidades específicas, la invención no está propuesta para ser limitada a los detalles mostrados. Preferentemente, se pueden hacer varias modificaciones en los detalles dentro del ámbito e intervalo de equivalentes de las reivindicaciones y sin apartarse de la invención. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro a partir de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Composición que comprende un Factor Inhibidor de Citosina substancialmente purificado, caracterizada porque el Factor Inhibidor de Citosina: a) tiene peso molecular menor que 6,000 Da; b) está naturalmente presente en una fracción de lípido de yema de huevo de huevos de ave; c) tiene un máximo de absorbencia de longitud de onda a 205 nm; d) es una sustancia no proteinácea; e) tiene un punto de fusión de entre alrededor de 39°C hasta 42°C; e f) inhibe la transcripción de ARN del factor alfa de necrosis de tumor (TNF-cc) , interleucina- 1 - beta (IL-?ß) e interleucina-2 (IL-2) .
2. Composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el Factor Inhibidor de Citosina es soluble en un solvente seleccionado a partir del grupo que consiste de cloroformo, etanol y metanol .
3. Composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque 100 mg del Factor Inhibidor de Citosina es soluble en 1.0 mililitros de solvente.
4. Composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el Factor Inhibidor de Citosina es insoluble en un solvente seleccionado del grupo que consiste de acetona, DMSO, hexano, éter dietílico, aceite vegetal y agua.
5. Composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el Factor Inhibidor de Citosina inhibe la biosíntesis de prostaglandina E2 (PGE2) .
6. Composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el Factor Inhibidor de Citosina tiene un efecto anti-inflamatorio en tratamiento de la artritis.
7. Composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la composición comprende un portador farmacéuticamente aceptable.
8. Composición de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque el portador farmacéuticamente aceptable se selecciona del grupo que consiste de: agua, salina amortiguada de fosfato, solución Ringer, solución dextrosa, soluciones que contienen suero, solución Hank, otras soluciones acuosas fisiológicamente balanceadas, aceites, ésteres, glicoles, polímeros biocompatibles , matrices poliméricas, cápsulas, microcápsulas, micropartículas, preparaciones de bolo, bombas osmóticas, dispositivos de difusión, liposomas, lipoesferas, células y membranas celulares.
9. Composición de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque el portador farmacéuticamente aceptable es un producto de huevo hiperinmune el cual se selecciona para ser enriquecido por dicho Factor Inhibidor de Citosina.
10. Composición de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque el portador farmacéuticamente aceptable es un producto alimenticio producido con al menos una fracción de un producto de huevo hiperinmune, en donde dicha fracción comprende una cantidad enriquecida del Factor Inhibidor de Citosina como se compara con dicho producto de huevo hiperinmune.
11. Composición de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque el portador farmacéuticamente aceptable comprende una fracción de un producto de huevo hiperinmune que contiene una cantidad enriquecida del Factor Inhibidor de Citosina como se compara con el producto de huevo hiperinmune.
12. Composición . de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque la fracción se selecciona del grupo que consiste de: yema líquida de huevo, yema de huevo en polvo y una fracción insoluble en agua de dicho producto de huevo hiperinmune.
13. Composición de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque la composición está en una forma seleccionada del grupo que consiste de un líquido, un aerosol, una cápsula, una tableta, una pildora, un polvo, un gel y un gránulo.
14. Composición de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque el portador farmacéuticamente aceptable comprende una formulación de liberación controlada.
15. Factor Inhibidor de Citosina purificada, caracterizado porque es producido por un proceso que comprende: a) separar una fracción insoluble en agua (FIA) a partir de una fracción soluble en agua (FSA) de una yema de huevo; b) separar la fracción insoluble en agua en una fracción de lípido neutral y una fracción de lipido polar; c) purificar la fracción de lípido polar en fracciones del Factor Inhibidor de Citosina por cromatografía líquida de alta resolución.
16. Factor Inhibidor de Citosina purificada de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque en la etapa b) la fracción de lípido neutral se extrae usando un solvente orgánico, seleccionado del grupo que consiste de acetona y hexano .
17. Factor Inhibidor de Citosina purificada de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque en la etapa b) la fracción de lípido polar se extrae usando un solvente orgánico seleccionado del grupo que consiste de etanol , cloroformo y metanol .
18. Método para purificar un Factor Inhibidor de Citosina a partir de un huevo de ave, caracterizado porque el huevo comprende una yema y una clara, el método comprende: a) separar el huevo en una fracción insoluble en agua ( FIA) y una fracción soluble en agua (FSA) ; b) extraer una fracción de lipido polar de la fracción insoluble en agua y,- c) purificar la fracción de lipido polar en fracciones del Factor Inhibidor de Citosina por cromatografía líquida de alta resolución.
19. Método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque además comprende extraer una fracción de lipido neutral de la fracción insoluble en agua del huevo.
20. Método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la etapa b) se realiza por extracción de fluido supercrítico .
21. Método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque además comprende separar la yema de huevo de la clara de huevo, en donde la etapa a) , la yema de huevo se separa en la fracción insoluble en agua (FIA) y la fracción soluble en agua (FSA) .
22. Método para inhibir la expresión de Citosina en un animal, caracterizado porque comprende administrar la composición de la reivindicación 1 al animal .
23. Método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la citosina comprende una citosina proinf lamatoria seleccionada del grupos que consiste del factor alfa de necrosis de tumor (TNF-a) , interleucina- 1 -beta (IL-?ß) e interleucina-2 (IL-2) .
24. Método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la composición comprende un portador farmacéuticamente aceptable.
25. Método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el portador farmacéuticamente aceptable se selecciona del grupo que consiste de: agua, salina amortiguada de fosfato, solución Ringer, solución dextrosa, soluciones que contienen suero, solución Hank, otras soluciones acuosas fisiológicamente balanceadas, aceites, ésteres, glicoles, polímeros biocompatibles, matrices poliméricas, cápsulas, microcápsulas , micropartí culas , preparaciones de bolo, bomba osmótica, dispositivos de difusión, liposomas, lipoesferas, células y membranas celulares.
26. Método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la composición se administra por una ruta seleccionada del grupo que consiste de administración oral, administración intravenosa, administración intraperitoneal , administración intramuscular, administración subcutánea, suministro transdermal, administración intratecal, inhalación, impregnación de un catéter, por supositorio e inyección directa en un tejido.
27. Método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque dicha composición se administra a una dosis de alrededor de 1 nanogramo hasta alrededor de 400 miligramos del Factor Inhibidor de Citosina por kilogramo de peso corporal del animal .
28. Método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la administración de dicha composición inhibe la expresión del factor alfa de necrosis de tumor (TNF-ct) , interleucina- ?ß (IL-?ß) o interleucina-6 (IL-6) por células del animal.
29. Método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la administración de la composición regula descendentemente la síntesis de prostaglandina E2 (PGE2) por células del animal.
30. Método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el animal es un mamífero.
31. Método de modulación del sistema inmune de un animal, caracterizado porque comprende administrar al animal una composición que comprende un Factor Inhibidor de Citosina, en donde el Factor Inhibidor de Citosina: a) tiene un peso molecular menor que 6,000 Da; b) está naturalmente presente en una fracción de lapido de yema de huevo de huevos de ave; c) tiene un máximo de absorbancia de longitud de onda a 205 nm; d) es una sustancia no proteinácea ; e) tiene un punto de fusión de entre alrededor de 39°C hasta 42°C; e f) inhibe la transcripción de ARN del factor alfa de necrosis de tumor (TNF-a) , interleucina-1- beta (IL-?ß) e interleucina-2 (IL-2) .
32. Método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque la conposición se administra por una ruta seleccionada del grupo que consiste de administración oral, administración intravenosa, administración intraperitoneal, administración intramuscular, administración subcutánea, suministro transdermal, administración intratecal, inhalación, impregnación de un catéter, por supositorio e inyección directa en un tejido.
33. Método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque la composición comprende un producto alimenticio que contiene el Factor Inhibidor de Citosina.
34. Método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque la administración de la composición produce un resultado seleccionado del grupo que consiste de: reducción en síntomas de artritis, reducción de inflamación asociada con artritis y prevención de artritis.