MXPA04007562A - Preparacion liofilizada que comprende inmunocitocinas. - Google Patents

Abstract

La invencion se refiere a una preparacion farmaceutica liofilizada que comprende una inmunocitocinas. La preparacion tiene una mayor vida en estante, incluso a temperaturas elevadas y, luego de la reconstitucion, puede ser administrada como un medicamento por via parenteral.

Description

PREPARACION LIOFILIZADA QUE COMPRENDE INMÜNOCITOCINAS DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención se refiere a una preparación farmacéutica liofilizada estable que comprende inmunocitoquinas y a la obtención de la preparación farmacéutica liofilizada. Las inmunocitoquinas son conjugados que se componen de anticuerpos y citoquinas, donde los extremos con terminación carboxilo de las dos cadenas pesadas de inmunoglobulina de los anticuerpos están unidos con los extremos de terminación N de una citoquina. Los anticuerpos son ciertas glucoproteinas de acción protectora presentes en la sangre, las secreciones linfáticas y corporales como consecuencia de una inmunización por antigenos y participan en una reacción de antigeno-anticuerpo. Los anticuerpos pertenecen a las inmunoglobulinas (Ig) y pueden subdividirse en cinco clases: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, algunas de las cuales pueden subdividirse, a su vez, en otras subclases (isotipos), por ejemplo, en IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgA2. Las inmunocitoquinas incluyen todos los anticuerpos de IgG. Abarcan los anticuerpos monoclonales, los anticuerpos policlonales y los anticuerpos multiespecificos como, por ejemplo, los anticuerpos biespecificos . REF: 157056 Las citocinas son polipéptidos que son excretados por vía endrocrina o paracrina, es decir, en la sangre o el tejido circundante, por las células y, luego de unirse a los receptores específicos, ejercen influencia sobre las funciones (usualmente división y crecimiento, pero también, por ejemplo, locomoción) de otras células. En algunos casos, las células productoras de citocinas son, en sí mismas, el objeto de esta regulación (mencionadas entonces como células autocrinas) . Las citocinas regulan, entre otros, la compleja interacción de las células del sistema inmune. Los ejemplos de las citocinas son linfocinas, monocinas y las hormonas polipeptídicas convencionales. Las citocinas incluyen las hormonas de crecimiento como la hormona de crecimiento humano, la hormona de crecimiento de N-metionilo humano y la hormona de crecimiento bovino, hormona paratiroidea, tiroxina, insulina, proinsulina, relaxina, prorelaxina, hormonas . de glucoproteínas como hormona folículo-estimulante (FSH) , tirotropina (TSH) y lutropina (LH) , factor de crecimiento hepático, factor de crecimiento de fibroblastos, prolactina, lactógeno de placenta, péptido asociado a gonadotrofinas de ratón, inhibina, activina, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) , integrina, trombopoyetina (TPO) , factores de crecimiento nervioso como NGF1S, factor de crecimiento de plaquetas, factores de crecimiento y transformación (TGFs) , como TGFa y TGF , eritropoyetina (EPO) , interferones como IFNa, 1FNÍÍ e IFNy, factores de crecimiento hematopoyético como M-CSF, GM-CSF y G-CSF, interleucinas (ILs) como IL-1, IL-la, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8 , IL-9, IL-10, IL-11, IL-12 y factores de necrosis tumoral (TNFs) como TNFa y TNFS. Tal como los anticuerpos y las citocinas antes mencionados, las inmunocitocinas son ingredientes activos peptídicos y, en consecuencia, no pueden ser absorbidos por el intestino. Para aplicación terapéutica, deben administrarse en general por vía parenteral en forma de solución . Un problema en la formulación de las soluciones que contienen ingredientes activos peptídicos es su tendencia hacia la agregación y hacia la formación de multímeros de proteínas. Sin embargo, la gravedad de este problema depende de las propiedades fisicoquímicas de los ingredientes activos particulares en cuestión. Mientras que las proteínas que tienen un carácter hidrofílico poseen una tendencia relativamente baja por la formación de agregados en solución acuosa, las proteínas que tienen un carácter hidrofóbico poseen una mayor tendencia hacia la agregación. Los anticuerpos consisten en dos láminas plegadas antiparalelas que están dispuestas de una manera tipo sándwich entre sí (dominios conservados) . Los aminoácidos hidrofóbicos e hidrofílicos se alternan en las láminas plegadas con las cadenas laterales hidrofóbicas de las dos láminas plegadas dirigiéndolas en cada caso hacia la otra y luego apuntando hacia el interior de la estructura sándwich, y apuntando los aminoácidos hidrofílieos en cada caso hacia afuera (J. Klein, Immunologie [Inmunología], Verlag Chemie, Weinheim, 1991) . Los aminoácidos hidrofílicos que apuntan hacia afuera dan como resultado la solubilización de los anticuerpos en solución acuosa y previenen, de esta manera, una interacción entre los diferentes anticuerpos. Los anticuerpos tienen así sólo una baja hidrofobicidad de superficie y tendencia a la agregación. Debido a las propiedades antes mencionadas, en comparación pueden formularse fácilmente las soluciones de anticuerpos de una manera estable. Un ejemplo de un producto comercialmente disponible es Rituxan°, una formulación acuosa que comprende el anticuerpo monoclonal rituximab, un buffer inorgánico y polisorbato. La eliminación del agua por liofilización permite que la estabilidad de las soluciones acuosas de anticuerpos, las cuales ya son relativamente estables en sí, sea incrementada posteriormente. Antes de ser administrados, los liofilizados obtenidos deben ser reconstituidos adicionando agua a la solución acuosa. Un ejemplo de un producto de este tipo es Remicade° que, además del anticuerpo monoclonal infliximab, un buffer inorgánico y un polisorbato, comprende adicionalmente un azúcar como un agente de protección de congelamiento o un formador de estructuras . La WO 98/22136 A2 revela una preparación liofilizada que comprende un anticuerpo, un azúcar o un aminoazúcar, un aminoácido y un agente tensioactivo . A pesar de que la preparación se reivindica para anticuerpos en general, sólo se revelan preparaciones que comprenden anticuerpos monoclonales dirigidos contra el virus de la hepatitis B (AK HBV) y, en cada caso, una preparación que comprende un anticuerpo contra la L-selectina (anti-L-selectina) y un anticuerpo contra el receptor del factor de crecimiento nervioso anti-L (anti-L-NGFR) , como ejemplos de trabajo. Las citocinas no contienen dominios conservados que podrían causar una buena hidrosolubilidad como los anticuerpos. En consecuencia, tienen una mayor tendencia hacia la agregación en solución acuosa. Esto se aplica en particular a las citocinas que contienen un haz de cuatro a-hélices como una característica estructural común (las llamadas citocinas de 4 haces de a-hélices) y tienen una pronunciada hidrofobicidad debido a su característica estructural . Las interacciones hidrofóbicas que acompañan la hidrofobicidad son a menudo, a su vez, la causa/el mecanismo de agregación (Hora, M.S. y Chen, B., (1999), Biopharm. Ind. Perspect . , 217-248) . Las citocinas que contienen un haz de cuatro a-hélices como una característica estructural común son varias interleucinas , en particular IL-2, IL-3 , IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-11 e IL-12, interferones , en particular IFN e IFNy, factores de crecimiento hematopoyético como M-CSF, GM-CSF, G-CSF, eritropoyetina (EPO) y factor de célula madre (SCF) . Las citocinas que se describen explícitamente como hidrofóbicas en la bibliografía son, por ejemplo, IL-2 (Robb R.J. et al. (1983) PNAS 80:5990-4; US 5,580,856), IL-4 (Sharma S. et al. (1987) 235:1489-92), IL-5 (Takatsu K. et al. (1985) JI 134:382-9), G-CSF (US 5,104,65). La fuerte tendencia de las citocinas, en particular las citocinas de un haz de 4 -hélices, requiere de medidas particulares para su estabilización. Por ejemplo, el producto Proleukin®, un liofilizado que comprende el ingrediente activo interleucinas-2 , contiene como adyuvante un azúcar, un buffer inorgánico y un detergente aniónico (laurilsulfato sódico) . Los detergentes aniónicos, en particular si el medicamento está destinado a ser administrado por vía parenteral , son, sin embargo, extremadamente inseguros desde un punto de vista toxicológico . Otro ejemplo que indica las dificultades particulares en la estabilización de las formulaciones con contenido de citocinas son los productos del mercado que comprenden el interferón ß (Avonex^, Betaferon® y Rebif®) . Todos estos productos son estabilizados por la albúmina, que se clasifica del mismo modo como extremadamente crítica desde un punto de vista toxicológico, en particular con respecto a las reacciones inmunes no deseadas. Debido a las diferencias antes mencionadas entre las citocinas y los anticuerpos, las inmunocitocinas que se componen de un anticuerpo y dos citocinas también difieren significativamente en sus propiedades fisicoquímicas de aquéllas de los anticuerpos. En particular, las inmunocitocinas que contienen una citocina que contiene haces de cuatro a-hélices tienen una fuerte tendencia a la formación de aglomerados en solución acuosa debido a la pronunciada hidrofobicidad asociada y son difíciles de estabilizar . El objeto de la presente invención consistió en proveer una preparación estabilizada para las inmunocitocinas. La preparación no debería comprender adyuvantes toxicológicamente inaceptables, debería ser estable durante un período prolongado en condiciones elevadas de estrés como elevada temperatura y humedad atmosférica, y debería poderse reconstituir con un solvente acuoso para obtener una solución lista para usar con un alto contenido de ingrediente activo. Sorprendentemente, resultó posible proveer una preparación que satisface estos requerimientos, liofilizando una solución acuosa amortiguada que, además de la inmunocitocina , comprende un azúcar o un aminoazúcar, un aminoácido y un agente tensioactivo . En consecuencia, la presente invención se refiere a una preparación liofilizada estable que comprende una inmunoc toc na , un azúcar o un aminoazúcar, un aminoácido y un agente tensioactivo. La preparación comprende, de preferencia, una inmunocitocina que contiene, como constituyente de citocina, citocinas seleccionadas del grupo integrado por el grupo de citocinas que tienen, como característica estructural común, un haz de cuatro a-hélices, en particular una interleucina , de preferencia, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-11 y/o IL-12, un interferón, de preferencia IFNE y/o IFNy, y/o un factor de crecimiento hematopoyético , de preferencia, M-CSF, GM-CSF, G-CSF, EPO o SCF. La composición comprende, de preferencia particular, una inmunocitocinas que contiene interleucinas-2 (IL-2). La preparación de acuerdo con la invención tiene buena tolerancia fisiológica, puede prepararse fácilmente, puede eliminarse de manera precisa y es estable en ensayos, frente a los productos de descomposición y los agregados durante el almacenamiento e incluso luego de repetidos procesos de congelamiento y descongelamiento. Es estable cuando se almacena durante un período de al menos tres meses hasta un período de dos años a temperatura de refrigerador (2-8°C) y a temperatura ambiente (23-27°C, 60% de humedad relativa ambiente (HRA) ) . Sorprendentemente, la preparación de acuerdo con la invención también es estable en almacenamiento durante dicho período a temperaturas elevadas y mayores niveles de humedad ambiente, por ejemplo, a una temperatura de 40° C y 75% de HRA. La preparación liofilizada puede reconstituirse de manera simple para obtener una solución sin partículas lista para usar por adición de un solvente acuoso, por ejemplo, agua para fines inyectables o una solución acuosa isotónica. La solución reconstituida es estable durante un período de aproximadamente 5 días, pero de preferencia particular, cuando se aplica dentro de las 24 horas. La reconstitución de la preparación de acuerdo con la invención con solventes acuosos permite ventajosamente la preparación de soluciones con contenido de inmunocitocinas con un pH de 5 a 8 , de preferencia, con un pH de 5,6 a 7,4, de preferencia particular, con un pH de 6-7, y una osmolalidad de 250 a 350 mOsmol/kg. La preparación reconstituida puede administrarse directamente por vía intravenosa, intraarterial y también subcutánea sin dolor. Además, la preparación también puede agregarse a soluciones para infusión como, por ejemplo, solución de glucosa, solución salina isotónica o solución de Ringer que también pueden comprender otros ingredientes activos, permitiendo de esta manera la administración de cantidades relativamente grandes de ingrediente activo. De acuerdo con una realización preferida de la invención, la preparación farmacéutica liofilizada consiste esencialmente en una inmunocitocinas, un azúcar o un aminoazúcar, un aminoácido, un buffer y un agente tensioactivo . La preparación de acuerdo con la invención permite la preparación de soluciones de inmunocitocinas que coinciden en su concentración con los requerimientos clínicos. Se da preferencia a las soluciones de inmunocitocinas que tengan una concentración de inmunocitocinas de aproximadamente 0,1 a 25 mg/ml , de preferencia particular, de 1 a 10 mg/ml , de preferencia muy particular, de 1 a 5 mg/ml. El azúcar usado en la preparación de acuerdo con la invención puede ser un mono, di o trisacárido. Estos azúcares pueden usarse ya sea solos o mezclados con alcoholes de azúcar (por ejemplo, manitol) . Los ejemplos de monosacáridos que pueden ser mencionados son glucosa, mañosa, galactosa, fructosa y sorbosa, los ejemplos de los disacáridos que pueden ser mencionados son sacarosa, lactosa, maltosa y trehalosa, y el ejemplo de un trisacárido que puede ser mencionado es la rafinosa. Se otorga preferencia a la sacarosa, la lactosa, la maltosa y la trehalosa, de preferencia particular, a la sacarosa y la maltosa. También es posible la presencia de aminoazúcares , es decir, los monosacáridos que contienen un grupo amino primario, secundario o terciario o un grupo amino acilado (- NH-CO-R) en lugar de un grupo hidroxilo. A los fines de la invención, se concede particular preferencia en este caso a la glucosamina, la N-metilglucosamina, la galactosamina y el ácido neuramínico . El azúcar/aminoazúcar está presente en la preparación de acuerdo con la invención en una cantidad tal que exista en la solución resultante luego de la reconstitución con el volumen de solvente propuesto en una concentración de aproximadamente 1 a 200 mg/ml. El azúcar está presente, de preferencia, en la solución reconstituida en una concentración de aproximadamente 15 a 30 mg/ml. Los aminoácidos apropiados usados de acuerdo con la invención son aminoácidos básicos, acídicos o neutros, por ejemplo, arginina, histidina, ornitina, lisina, glicina, entre otros. Los aminoácidos se usan, de preferencia, en forma de sus sales inorgánicas (ventajosamente en forma de las sales de ácido clorhídrico, es decir, como clorhidratos de aminoácidos) . En el caso donde se usan aminoácidos libres, el pH deseado se regula con la adición de una sustancia amortiguadora apropiada de tolerancia fisiológica como, por ejemplo, un ácido orgánico o inorgánico como ácido cítrico o ácido fosfórico, ácido sulfúrico, ácido acético, ácido fórmico o sales de los mismos. Se da preferencia a los citratos y los fosfatos, con los cuales se obtienen los liofilizados particularmente estables.

Los aminoácidos preferidos son arginina, lisina y ornitina. Además, también es posible usar aminoácidos acídicos como, por ejemplo, ácido glutámico y ácido aspártico, o aminoácidos neutros como, por ejemplo, isoleucina, leucina y alanina, o aminoácidos aromáticos como, por ejemplo, fenilalanina, tirosina o triptófano. El contenido de aminoácidos en la preparación de acuerdo con la invención oscila entre 1 y 200 mmol/1, de preferencia, entre 40 y 100 mmol/1, de preferencia particular, 40-80 mmol/1 (en cada caso, en base a la solución reconstituida) . Los agentes tensioactivos que pueden usarse son todos los agentes tensioactivos usados usualmente en las preparaciones farmacéuticas, de preferencia, agentes tensioactivos no iónicos, en particular polisorbatos y polímeros de polioxietileno-polioxipropileno . Se da particular preferencia a los ésteres de ácidos grasos de polioxietilensorbitano , en particular monolaurato de polioxietilen (20 ) sorbitano y monooleato de polioxietilen (20 ) sorbitano . De acuerdo con la invención, la preparación comprende del 0,001 al 1% en peso, de preferencia, del 0,005 al 0,5% en peso y de preferencia particular, del 0,01 al 0,15% en peso (en cada caso, en base a la solución reconstituida) . Si la preparación de acuerdo con la invención comprende buffers, éstos pueden ser en principio cualquier sustancia de tolerancia fisiológica que es apropiada para regular el pH deseado. La cantidad de sustancia amortiguadora se selecciona de modo tal que, luego de reconstituir la preparación liofilizada, por ejemplo, con agua para inyectables, la solución acuosa resultante tiene una concentración del buffer de 5 mmol/1 a 50 mmol/1, de preferencia, de 10 a 20 mmol/1. Los buffers de preferencia son los buffers de citrato o de fosfato. Los buffers de fosfato apropiados son soluciones de sales mono y/o disódicas y potásicas de ácido fosfórico, como fosfato ácido de disodio o fosfato diácido de potasio, así como mezclas de las sales de sodio y potasio como, por ejemplo, mezclas de fosfato ácido de disodio y fosfato diácido de potasio. Si la solución reconstituida ya no es isotónica por las propiedades osmóticas de la inmunocitocinas y por los adyuvantes usados para la estabilización, también pueden estar presentes un agente isotónico, de preferencia, una sal de tolerancia fisiológica como, por ejemplo, cloruro de sodio o cloruro de potasio, o un poliol o un azúcar de tolerancia fisiológica como, por ejemplo, glucosa, glicerol o manitol, en una cantidad necesaria para establecer la isotonicidad. Además, los liofil izados de acuerdo con la invención pueden comprender otros adyuvantes de tolerancia fisiológica como, por ejemplo, antioxidantes como ácido ascórbico o glutatión, conservantes como fenol, m-cresol, metil o propilparabeno , clorobutanol , tiomersal o cloruro de benzalconio, u otros estabilizantes, formadores de estructuras y solubilizantes como polietilenglicoles (PEG) ,por ejemplo, PEG 3000, 3350, 4000 ó 6000, o ciclodextrinas , por ejemplo, hidroxipropil-6-ciclodextrin , sulfobutiletil-S-ciclodextrina o ?-ciclodextrina , o dextranos .

La preparación de acuerdo con la invención puede obtenerse elaborando una preparación acuosa que comprende una inmunocitocina como ingrediente activo y un azúcar o un aminoazúcar, un aminoácido y un agente tensioactivo y, si se desea, otros adyuvantes farmacéuticos, y posteriormente liofilizando la solución. La preparación acuosa puede prepararse adicionando dichos adyuvantes a una solución que comprende una inmunocitocinas . A tal fin, se agregan ventajosamente volúmenes definidos de soluciones madre que comprenden los otros adyuvantes mencionados en una concentración definida a una solución que posee una concentración definida de una inmunocitocinas, tal como se obtuvo de su preparación, y la mezcla se diluye, si se desea, hasta la concentración precalculada con agua. De modo alternativo, los adyuvantes también pueden agregarse como sustancias sólidas a la solución de partida que comprende la inmunocitocinas. Si la inmunocitocinas tiene forma de sólido, por ejemplo, de un liofilizado, la preparación de acuerdo con la invención puede prepararse disolviendo, en primer lugar, la respectiva inmunocitoquina en agua o una solución acuosa que comprende uno o varios de los otros adyuvantes, y posteriormente agregando las cantidades requeridas en cada caso de soluciones madre que comprenden los otros adyuvantes, los otros adyuvantes en forma sólida y/o agua. La inmunocitocina también pueden disolverse directamente en una solución que comprende todos los otros adyuvantes . Pueden haberse agregado ventajosamente uno o varios de los adyuvantes presentes en la preparación de la invención durante o al final del proceso para preparar la inmunocitoquina particular. Esto puede llevarse a cabo, de preferencia, en la etapa final de la purificación efectuada luego de su preparación, disolviendo la inmunocitoquina directamente en una solución acuosa que comprende uno, más de uno o todos los otros adyuvantes o reacondicionándola por métodos apropiados como filtración por flujo tangencial. A fin de obtener la preparación, deben agregarse solamente los otros ingredientes activos respectivos en una pequeña cantidad en cada caso y/o no agregarse del todo. Se prefiere en especial que el ingrediente respectivo se disuelva directamente en una solución acuosa que comprende todos los otros adyuvantes en la etapa final de la purificación llevada a cabo luego de su preparación, dando como resultado directamente la solución que debe liofilizarse .

La solución que comprende la respectiva inmunocitocinas y los adyuvantes se reguló hasta un pH de 5 a 8 , se filtró en forma estéril y se liofilizó. La preparación liofilizada obtenida puede reconstituirse por adición de un solvente acuoso para obtener una preparación acuosa que puede administrarse en forma directa, en particular, por vía parenteral . La presente invención también se refiere, a una preparación de inmunocitocinas farmacéutica acuosa que puede obtenerse por reconstitución del liofilizado de acuerdo con la invención con un solvente acuoso . La preparación farmacéutica acuosa reconstituida tiene, de preferencia, un pH de 5 - 8 , en particular un pH de 5,6 -7,4 y de preferencia particular, un pH de 6,0 - 7,0. Los ejemplos comentan la invención sin estar restringida a ellos . Ejemplo 1 (lote 8020) Liofilizado de la solución acuosa que comprende: 0,7 mg/ml de EMD 273066 (huKS-IL2) 5 mmol/1 de ácido cítrico 100 mmol/1 de HCl de arginina 1,5% en peso de sacarosa 0,01% en peso de monooleato de polioxietilen (20) sorbitano (Tween 80) La preparación se llevó a cabo mezclando volúmenes definidos de soluciones acuosas que comprenden los respectivos adyuvantes en concentraciones definidas. Se usaron las siguientes soluciones : Solución A (solución con ingrediente activo) que comprende: 5 mmol/1 de ácido cítrico 100 mmol/1 de HCl de arginina 0,01% en peso de monooleato de polioxietilen (20) sorbitano (Tween 80) NaOH c . s . hasta pH 7,0 Solución B (solución con adyuvante) : 1,744% en peso de sacarosa 5 mmol/1 de ácido cítrico 100 mmol/1 de HCl de arginina 0,01% en peso de monooleato de polioxietilen (20) sorbitano (Tween 80) NaOH es. hasta pH 7 , 0 A fin de producir la preparación de acuerdo con la invención, se combinaron entre sí 100 mi de la solución A y 614 mi de la solución B. La solución preparada se filtró en forma estéril antes de envasar. Se envasó cada frasco-ampolla de 6 mi con 4 mi de solución. Los frascos-ampolla se cerraron posteriormente con tapones y se liofilizaron . Tras liofilizar, los frascos-ampolla se sellaron con una tapa de seguridad.

Ejemplo 2 (lote 8021) Liofilizado de la solución acuosa que comprende: 0,7 mg/ml de EMD 273066 (huKS-IL2) 5 mmol/1 de ácido cítrico 100 mmol/1 de HCl de arginina 1,5% en peso de maltosa 0,01% en peso de monooleato de polioxietilen (20) sorbitano (Tween 80) La preparación se llevó a cabo mezclando volúmenes definidos de soluciones acuosas que comprenden los respectivos adyuvantes en concentraciones definidas. Se usaron las siguientes soluciones: Solución A (solución con ingrediente activo) que comprende: 5 mg/ml de EMD 273066 5 mmol/1 de ácido cítrico 100 mmol/1 de HCl de arginina 0,01% en peso de monooleato de polioxietilen (20) sorbitano (Tween 80) NaOH c.s. hasta pH 7,0 Solución B (solución con adyuvante) : 1,744% en peso de maltosa 5 mmol/1 de ácido cítrico 100 mmol/1 de HCl de arginina 0,01% en peso de monooleato de polioxietilen (20 ) sorbitano (Tween 80) NaOH es. hasta pH 7 , 0 A fin de producir la preparación de acuerdo con la invención, se combinaron entre sí 100 mi de la solución A y 614 mi de la solución B. La solución preparada se filtró en forma estéril antes de envasar. Se envasó cada frasco-ampolla de 6 mi con 4 mi de solución. Los frascos-ampolla se cerraron posteriormente con tapones y se liofilizaron . Tras liofilizar, los frascos-ampolla se sellaron con tapa de seguridad. Ejemplo 3 (lote 8431) Liofilizado de la solución acuosa que comprende: 1 mg/ml de EMD 273066 (huKS-IL2) 5 mmol/1 de ácido cítrico 100 mmol/1 de HCl de arginina 1,5% en peso de sacarosa 0,01% en peso de monooleato de polioxietilen (20) sorbitano (Tween 80) La preparación se llevó a cabo mezclando volúmenes definidos de soluciones acuosas que comprenden los respectivos adyuvantes en concentraciones definidas. Se usaron las siguientes soluciones: Solución A (solución con ingrediente activo) que comprende: 1,45 mg/ml de EMD 273066 1,5% en peso de sacarosa 5 mmol/1 de ácido cítrico NaOH es. hasta pH 7,0 Solución B (solución con adyuvante) : 1,5% en peso de sacarosa 5 mmol/1 de ácido cítrico 287 mmol/1 de HCl de arginina 0,0283% en peso de monooleato de polioxietilen (20) sorbitano (Tween 80) NaOH es. hasta pH 7,0 A fin de producir la preparación de acuerdo con la invención, se combinaron entre sí 46,9 mi de la solución A y 25,1 mi de la solución B. La solución preparada se filtró en forma estéril antes de envasar. Se envasó cada frasco-ampolla de 6 mi con 2 mi de solución. Los frascos-ampolla se cerraron posteriormente con tapones y se liofilizaron. Tras liofilizar, los frascos-ampolla se sellaron con tapas de seguridad. Ejemplo 4 (lote 8591) Liofilizado de la solución acuosa que comprende: 4 mg/ml de EMD 273066 (huKS-IL2) 12,5 mmol/1 de ácido cítrico 80 mmol/1 de HCl de arginina 1,8% en peso de sacarosa 0,008% en peso de monooleato de polioxietilen (20) sorbitano (Tween 80) La preparación se llevó a cabo mezclando volúmenes definidos de soluciones acuosas que comprenden los respectivos adyuvantes en concentraciones definidas. Se usaron las siguientes soluciones: Solución A (solución con ingrediente activo) que comprende: 5 mg/ml de EMD 273066 5 mmol/1 de ácido cítrico 100 mmol/1 de HCl de arginina 0,01% en peso de monooleato de polioxietilen (20) sorbitano (Tween 80) NaOH es. hasta pH 6,0 Solución B (solución con adyuvante) : 8,7% en peso de sacarosa 41 mmol/1 de ácido cítrico NaOH c.s. hasta pH 6,0 A fin de producir la preparación de acuerdo con la invención, se combinaron entre sí 4 mi de la solución A y 15,5 mi de la solución B. La solución preparada se filtró en forma estéril antes de envasar. Se envasaron los frascos-ampolla de 2 mi con 1 mi de solución. Los frascos-ampolla se cerraron posteriormente con tapones y se liofilizaro . Tras liofilizar, los frascos-ampolla se sellaron con tapas de seguridad. Ejemplo 5 (formulación comparativa 1 con manitol en lugar de sacarosa, lote 8008) Liofilizado de la solución acuosa que comprende: 0,7 mg/ml de EMD 273066 (huKS-IL2) 5 mmol/1 de ácido cítrico 100 mmol/1 de HCl de arginina 4% en peso de manitol 0,01% en peso de monooleato de polioxietilen (20) sorbitano (Tween 80), se llevó hasta pH 7,0 con NaOH La preparación se llevó a cabo por liofilización directa de la solución con ingrediente activo que tiene la composición anteriormente mencionada. La solución preparada se filtró usando un filtro estéril antes de envasar. Se envasó cada frasco-ampolla de 6 mi con 4 mi de solución. Los frascos-ampolla se cerraron posteriormente con tapones y se liofilizaron . Tras liofilizar, los frascos-ampolla se sellaron con tapas de seguridad. Ejemplo 6 (preparación comparativa 2, lote 8434, corresponde a la composición del lote 8431 sin la adición de arginina) Liofilizado de la solución- acuosa que comprende: 1 mg/ml de EMD 273066 (huKS-IL2) 5 mmol/1 de ácido cítrico 1,5% en peso de sacarosa 0,01% en peso de monooleato de polioxietilen (20) sorbitano (Tween 80) La preparación se llevó a cabo mezclando volúmenes definidos de soluciones acuosas que comprenden los respectivos adyuvantes en concentraciones definidas. Se usaron las siguientes soluciones: Solución A (solución con ingrediente activo) que comprende: 1,45 mg/ml de EMD 273066 1,5% en peso de sacarosa 5 mmol/1 de ácido cítrico NaOH c.s. hasta pH 7,0 Solución B (solución con adyuvante) : 1,5% en peso de sacarosa 5 mmol/1 de ácido cítrico 0,0283% en peso de monooleato de polioxietilen (20) sorbitano (Tween 80) NaOH c.s. hasta pH 7,0 A fin de producir la preparación de acuerdo con la invención, se combinaron entre sí 46,9 mi de la solución A y 25,1 mi de la solución B. La solución preparada se filtró en forma estéril antes de envasar. Se envasó cada frasco-ampolla de 6 mi con 2 mi de solución. Los frascos-ampolla se cerraron posteriormente con tapones y se liofilizaron . Tras liofilizar, los frascos-ampolla se sellaron con tapas de seguridad. Ejemplo 7 (preparación comparativa 3, lote 8430, corresponde a la composición del lote 8431 sin la adición de Tween 80) Liofilizado de la solución acuosa que comprende: 1 mg/ml de EMD 273066 (huKS-IL2) 5 mmol/1 de ácido cítrico 100 mmol/1 de HCl de arginina 1,5% en peso de sacarosa La preparación se llevó a cabo mezclando volúmenes definidos de soluciones acuosas que comprenden los respectivos adyuvantes en concentraciones definidas. Se usaron las siguientes soluciones: Solución A (solución con ingrediente activo) que comprende: 1,45 mg/ml de EMD 273066 1,5% en peso de sacarosa 5 mmol/1 de ácido cítrico NaOH c.s. hasta pH 7,0 Solución B (solución con adyuvante) : 1,5% en peso de sacarosa 5 mmol/1 de ácido cítrico 287 mmol/1 de HCl de arginina NaOH c.s. hasta pH 7 , 0 A fin de producir la preparación de acuerdo con la invención, se combinaron entre sí 46,9 mi de la solución A y 25,1 mi de la solución B. La solución preparada se filtró en forma estéril antes de envasar. Se envasó cada f asco-ampolla de 6 mi con 2 mi de solución. Los frascos-ampolla se cerraron posteriormente con tapones y se liofilizaron. Tras liofilizar, los frascos-ampolla se sellaron con tapas de seguridad.

Ejemplo 8 (preparación comparativa 4, lote 8429, corresponde a la composición del lote 8431 sin la adición de Tween 80 y sin la adición de arginina) Liofilizado de la solución acuosa que comprende: 1 mg/ml de EMD 273066 (huKS-IL2) 5 mmol/1 de ácido cítrico 1,5% en peso de sacarosa La preparación se llevó a cabo mezclando volúmenes definidos de soluciones acuosas que comprenden los respectivos adyuvantes en concentraciones definidas. Se usaron las siguientes soluciones: Solución A (solución con ingrediente activo) que comprende: 1,45 mg/ml de EMD 273066 1,5% en peso de sacarosa 5 mmol/1 de ácido cítrico NaOH c.s. hasta pH 7,0 Solución B (solución con adyuvante) : 1,5% en peso de sacarosa 5 mmol/1 de ácido cítrico NaOH c.s. hasta pH 7,0 A fin de producir la preparación de acuerdo con la invención, se combinaron entre sí 46,9 mi de la solución A y 25,1 mi de la solución B. La solución preparada se filtró en forma estéril antes de envasar. Se envasaron frascos-ampolla de 6 mi con 2 mi de solución. Los frascos-ampolla se cerraron posteriormente con tapones y se liofilizaron. Tras liofilizar, los frascos- ampolla se sellaron con tapas de seguridad. Investigaciones de la estabilidad de las preparaciones La estabilidad de las preparaciones de la invención se evaluó en estudios de estabilidad. Para tal fin, los liofilizados preparados se almacenaron a varias temperaturas durante ciertos períodos y se investigaron usando métodos analíticos apropiados. Las condiciones ambientales de 40° C con una humedad relativa ambiente (HRA) del 75% se seleccionaron como condición de estrés a fin de obtener rápidamente diferencias de estabilidad en las diferentes formulaciones. Las posibles inestabilidades son evidentes en las inmunocitocinas principalmente debido a la formación de agregados y la formación de productos de degradación. Los productos de degradación y los agregados solubles se determinan, de preferencia, mediante cromatografía por exclusión de tamaño (HPLC-SEC) , mientras que las inspecciones visuales y las mediciones de la turbidez sirven para la detección de agregados visibles. El ensayo de ELISA usado asimismo para evaluar las preparaciones sirve para probar la integridad y capacidad de unión al receptor. La fotometría UV, con una longitud de onda 280 nm, también sirve para determinar el contenido.

Métodos de ensayo analíticos : Aspecto Las formulaciones preparadas se investigaron visualmente con la ayuda con una fuente de luz fría para partículas y para detectar la presencia de una posible turbidez. Concentración de proteínas: A280nm Se usó absorción de las soluciones de proteínas resultantes a una longitud de onda de 280 nm para determinar la concentración de las preparaciones obtenidas. El coeficiente de extinción de 1,41 para el ingrediente activo huKS-lL2 (EMD 273066) se determinó mediante análisis cuantitativo de aminoácidos. Para la medición real, las soluciones de proteínas se diluyeron por triplicado hasta que la absorción de las soluciones de ensayo estaba entre 0,1 y 1,0 (correspondiente a una concentración de proteína de 0,5 mg/ml ) unidades de absorción. La absorción de las soluciones de ensayo con contenido de ingrediente activo se midió contra una solución de referencia correspondiente que no contenía ingrediente activo. Pureza: cromatografía por exclusión de tamaño, SEC-HPLC La cromatografía por exclusión de tamaño (SEC) es un método analítico con el cual se puede determinar la pureza y la proporción de monómero/agregado de las preparaciones obtenidas. Los componentes de las soluciones de ensayo se separan sobre la base de su tamaño molecular por medio de una columna de HPLC porosa especial. Las moléculas relativamente grandes eluyen junto con el volumen de exclusión, mientras que las moléculas relativamente pequeñas penetran en los poros de la fase estacionaria de forma variable y son retenidas en mayor o menor grado. Las moléculas relativamente pequeñas como los productos de degradación de huKS-IL2, aparecen en consecuencia con tiempos de retención posteriores a los monómeros de huKS-IL2 y, en particular, a los agregados de huKS-IL2, los cuales son los primeros en ser eluidos de la columna. Concentración e integridad de la molécula de ingrediente activo: KSA-ELISA En este método analítico (ELISA, ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas) , se cubren placas de microtitulación con el antígeno específico para huKS-IL2 (antígeno EPCA o KSA) . Las moléculas de huKS-IL2 en la solución de ensayo a ser determinada se unen con el antígeno por medio de su componente de anticuerpo y así se unen a la placa de microtitulación. Luego de la adición del antisuero biotinilado anti-IL2, los anticuerpos anti-IL2 reaccionan con las porciones de IL2 de las moléculas de huKS-IL2 unidas. Las moléculas de anti-IL2 excedentes se eliminan lavando la placa de microtitulación. El conjugado de estreptavidina-peroxidasa agregado se une por medio de la biotina y oxida la forma leuco del colorante tetrametilbencidina (TMB) adicionada en una etapa posterior para obtener un color azul . La reacción de oxidación se detiene luego de un tiempo definido por el agregado de ácido fosfórico. Se produce una coloración amarilla de la solución, la cual puede ser cuantificada a una longitud de onda de 450 nm. La concentración de las soluciones de ensayo de proteínas es, en este caso, proporcional a la absorción determinada a esta longitud de onda . Resultados : Los resultados en las tablas 1 y 2 (lotes 8020 y 8021) confirman claramente la cantidad y la estabilidad de las preparaciones obtenidas. Las condiciones ambientales de 40° C con una humedad relativa ambiente (HRA) del 75% se seleccionaron como condición de estrés a fin de obtener rápidamente diferencias en la estabilidad en las distintas formulaciones. Sorprendentemente, las preparaciones antes mencionadas son estables incluso a altas temperaturas de almacenamiento y una humedad relativa ambiente elevada (40° C/75% de HRA) durante un período de > 6 meses. Luego de 4 semanas bajo la correspondiente condición de estrés ya se observaron agregados en la formulación comparativa 1 correspondiente (tabla 3, lote 8008, ejemplo 5) , en la cual se usó el azúcar alcohólico manitol como formador de estructuras en lugar de los disacáridos (sacarosa o maltosa) . Después de 26 semanas a temperatura ambiente (25° C, 60% de HRA) , los agregados visibles habían permeado de acuerdo con los correspondientes patrones ambientales. La formulación comparativa 1 sólo puede ser almacenada con enfriamiento, contrariamente a la preparación de la invención. La formulación de ejemplo 4 (lote 8591) es otro ejemplo de la excelente estabilidad de la preparación de acuerdo con la invención y también muestra que la formulación puede ser aplicada, además, para incrementar las concentraciones de proteína (véase la tabla 4) . Esta formulación se almacenó a una temperatura de 40° C (75% de HRA) durante un período de 14 semanas. En otra serie de experimentos, se probó si todos los adyuvantes en las preparaciones de la invención son en realidad necesarios para la estabilización. El lote experimental 8431 comprendía en este caso todos los constituyentes de la formulación de acuerdo con la invención, mientras que las formulaciones comparativas carecían de componentes individuales: formulación de acuerdo con el ejemplo 3 (lote 8431) : todos los componentes están presentes formulación comparativa 2 (ejemplo 6, lote 8434) : sin la adición de arginina formulación comparativa 3 (ejemplo 7, lote 8430) : sin la adición de Tween 80 - formulación comparativa 4 (ejemplo 8, lote 8429) : sin la adición de Tween 80 y arginina El resultado indicado en la figura 1 confirma claramente que la adición del aminoácido es absolutamente necesaria para estabilizar la preparación de acuerdo con la invención. Según esta figura, a pesar de que la adición de Tween 80 no parece ser necesaria, no se corresponde completamente con los hechos. Se agrega Tween 80 en una etapa temprana de la purificación de las proteínas durante la preparación de soluciones de ingrediente activo a fin de prevenir la formación, en particular, de agregados visibles. La concentración de Tween 80 usada en este caso es la concentración crítica para la formación de micelas (la CMC para Tween 80 es del 0,001%) . En el caso de la serie de experimentos, se intentó eliminar tanto la arginina como el Tween por medio del llamado método de filtración por flujo tangencial. En éste, se efectuó un intercambio de buffer por medio de filtración por diálisis a través de una membrana de 50 kD. Sin embargo, las micelas de Tween 80 superan, en algunos casos, el límite de exclusión de la membrana y, en consecuencia, no se eliminan por completo. La adición de Tween 80 a la preparación de la invención es absolutamente necesaria para la redisolución de los liofilizados y para la estabilidad de la solución obtenida luego de la reconstitución, tal como fue confirmado en otro estudio. Partiendo de una solución de EMD 273066 (huKS-IL2) como ingrediente activo que comprende Tween 80, el adyuvante Tween 80 se separó en este caso mediante cromatografía por afinidad a través de una columna de proteína A. Se agregó Tween 80 en cantidades elevadas a la solución sin Tween 80 obtenida. Las preparaciones obtenidas se sometieron a estrés durante un período de 21 días a una temperatura de 25° C en frascos-ampolla de 2 mi con la ayuda de un agitador de laboratorio. Se chequearon visualmente las formulaciones estresadas a diario y se analizaron fotométricamente en cuanto a su contenido proteico en momentos determinados. El resultado de este estudio se indica en la figura 2. En el caso de las preparaciones sin adición de Tween 80, se observó una ligera turbidez luego de aproximadamente un día, incrementadamente visible con el curso del tiempo. Luego de un período de 21 días, también se notó una caída considerable en el contenido, tal como se indica en la figura 2.

Tabla 1: Estabilidad de la preparación 8020 de acuerdo on el ejemplo 1 I Ejemplo 1 I Tiempo de DetermiHPLC- KSA- Aspecto del Turbidez por almacenanación de SEC ELISA liofilizado fotometría miento proteínas luego de A550 ( semanas ) diluir en 4,0 mi de agua bidestilada [semanas] [mg/ral] [%] [mg/ml] [disuelto] Solución 0, 798 96, 83 0,870 - 0, 0036 de partida Liofiliza- 0, 849 96, 68 0,857 solución 0, 0033 do luego clara de la ligeramente preparaopalescente ción CONGELADOR Almacenamiento a -20° C 4 96, 72 solución 0, 0019 clara incolora 8 - 96, 89 - - - 13 9 , 02 solución clara incolora 26 0, 808 97, 38 0, 685 solución 0, 0021 clara incolora Tiempo de DetermiHPLC- KSA- Aspecto del Turbidez por almacenanación de SEC ELISA liofilizado fotometría miento proteínas luego de A550 (semanas) diluir en 4,0 mi de agua bidestilada REFRIGERADOR Almacenamiento a 2-8° C 4 96, 70 solución clara 0, 0015 incolora 8 - 97, 01 - - 13 97, 01 solución clara incolora 26 0, 806 97, 25 0, 735 solución clara 0, 0011 incolora Almacenamiento a 25° C/60% de HRA 4 96, 66 solución clara 0, 0011 incolora 8 - 97, 06 0, 757 - - 13 96, 93 solución clara incolora 26 0,809 9.7, 23 0, 720 solución clara 0, 0017 incolora Almacenamiento a 40° C/75% de HRA 4 96, 62 solución clara 0, 0013 incolora 8 - 97, 00 0, 827 - - 13 96, 99 solución clara incolora 26 0, 816 97, 19 0, 775 solución clara 0, 0007 incolora Tabla 2: Estabilidad de la preparación 8021 según el ejemplo 2 Ejemplo 2 Tiempo de DetermiHPLC- KSA- Aspecto del Turbidez por almacenanación de SEC ELISA liofilizado fotometría miento proteínas luego de A550 (semanas) diluir en 4,0 mi de agua bidestilada 13 97, 07 solución clara incolora 26 - - - - - Almacenamiento a 25° C/60% de HRA 4 97, 27 solución clara 0, 0015 incolora 8 - 97, 14 0, 753 - - 13 96, 96 solución clara incolora 26 - - - - - Almacenamiento a 40° C/75% de HRA 4 97, 17 solución clara 0, 0013 incolora 8 - 97, 21 0, 820 - - 13 96, 91 solución clara incolora 26 Tabla 3: Estabilidad de la preparación comparativa 1 (lote 8008 según el ejemplo 5) I Lote: 008008 I Tiempo de DetermiHPLC- KSA- Aspecto del Turbidez por almacenanación de SEC ELISA liofilizado fotometría miento proteínas luego de A550 ( semanas ) diluir en 4,0 mi de agua bidestilada [semanas] [mg/ml] [%] [mg/ml] [disuelto] Liofiliza- 0, 763 94, 79 0, 667 solución clara 0, 0033 do luego de la preparación CONGELADOR Almacenamiento a -20° ( 4 - - - - - 8 - - - - - 21 - 96, 63 - solución clara 0 , 0035 incolora 26 0, 766 96, 16 solución clara 0, 0040 incolora REFRIGERADOR Almacenamiento a 2-8° C 4 - - - solución clara - incolora 8 - - - - - 21 96, 42 solución clara 0, 0037 incolora Tabla 4: Estabilidad de la preparación según el ejemplo 4 (lote 8591) Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (16)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Preparación farmacéutica liofilizada de inmunocitocinas , caracterizada porque comprende una inmunocitocinas , un azúcar o un aminoazúcar, un aminoácido y un agente tensioactivo .

2. Preparación farmacéutica liofilizada de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la inmunocitocinas presente es una inmunocitocinas que contiene, como constituyente de citocinas, citocinas seleccionadas del grupo integrado por citocinas que tienen como característica estructural común un haz de cuatro a-hélices.

3. Preparación farmacéutica liofilizada de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque la inmunocitocinas contiene, como constituyente de citocinas, una interleucinas , un interferón y/o un factor de crecimiento hematopoyético .

4. Preparación farmacéutica liofilizada de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque la inmunocitocinas contiene, como constituyente de citocinas, interleucinas-2 (IL-2) .

5. Preparación farmacéutica liofilizada de conformidad con una o varias de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque consiste esencialmente en una inmunocitocinas, un azúcar o un aminoazúcar, un aminoácido, un buffer y un agente tensioactivo .

6. Preparación farmacéutica liofilizada de conformidad con una o varias de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque el azúcar es un mono, di o trisacárido, de preferencia, sacarosa, lactosa, maltosa o trehalosa.

7. Preparación farmacéutica liofilizada de conformidad con una o varias de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque el aminoazúcar es glucosamina, N-metil-glucosamina , galactosamina o ácido neuramínico.

8. Preparación farmacéutica liofilizada de conformidad con una o varias de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada porque el aminoácido es un aminoácido básico, acídico o neutro, de preferencia, arginina, lisina u ornitina.

9. Preparación farmacéutica liofilizada de a conformidad con una o varias de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizada porque el agente tensioactivo es un agente tensioactivo no iónico.

10. Preparación farmacéutica liofilizada de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque el agente tensioactivo es un polisorbato o un polímero de polioxietileno-polioxipropileno .

11. Preparación farmacéutica liofilizada de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque el agente tensioactivo es el éster de ácidos grasos polioxietilensorbitano, monooleato de polioxietilen(20) sorbitano o monolaurato de polioxie ilen (20) sorbitano.

12. Preparación farmacéutica liofilizada de conformidad con una o varias de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizada porque también está presente un agente isotónico en una cantidad necesaria para establecer la isotonicidad.

13. Preparación farmacéutica acuosa de inmunocitocinas , caracterizada porque puede obtenerse por reconstitución del liofilizado de conformidad con una o varias de las reivindicaciones 1 a 12 con un solvente acuoso.

14. Preparación farmacéutica acuosa de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque la solución tiene un pH de 5 - 8, de preferencia, de 5,6 - 7,4.

15. Preparación farmacéutica acuosa de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque la solución tiene un pH de 6 - 7.

16. Proceso para obtener una preparación farmacéutica liofilizada de conformidad con una o varias de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque se produce una preparación acuosa que comprende una inmunocitocinas, un azúcar o un aminoazúcar, un aminoácido, un agente tensioactivo y, si se desea, otros adyuvantes farmacéuticos, y la solución se liofiliza subsiguientemente.