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MXPA04007550A - Derivados de benzofurano citoprotectores. - Google Patents

Derivados de benzofurano citoprotectores.

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Publication number
MXPA04007550A
MXPA04007550A MXPA04007550A MXPA04007550A MXPA04007550A MX PA04007550 A MXPA04007550 A MX PA04007550A MX PA04007550 A MXPA04007550 A MX PA04007550A MX PA04007550 A MXPA04007550 A MX PA04007550A MX PA04007550 A MXPA04007550 A MX PA04007550A
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MX
Mexico
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dimethyl
hydroxy
benzofuran
optionally substituted
phenyl
Prior art date
Application number
MXPA04007550A
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English (en)
Inventor
Chen Jian
Original Assignee
Galileo Pharmaceuticals Inc
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Publication date
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Abstract

La presente invencion se refiere a compuestos citiprotectores, muchos de los cuales son derivados de benzofurano que son utiles en el tratamiento de ciertas condiciones isquemicas o inflamatorias, incluyendo pero sin estar limitado a apoplejia, infarto de miocardio, insuficiencia cardiaca congestiva, y trastornos de la piel caracterizados por inflamacion o dano oxidante. Los mismos tambien son utiles en la fabricacion de formulaciones farmaceuticas y cosmeticas para el tratamiento de tales condiciones.

Description

DERIVADOS DE BENZOFURANO CITOPROTECTORES Campo de la Invención La presente invención se refiere a ciertos compuestos que tienen actividad citoprotectora , y particularmente a una serie de derivados de benzofurano. La invención también está dirigida a formulaciones y métodos para el tratamiento de apoplejía, infarto de miocardio e insuficiencia cardiaca crónica, así como a otras condiciones relacionadas con la tensión oxidante, que son típicamente responsables de modulación de la enzima celular. La invención también está dirigida a un método de tratamiento de la inflamación por la reducción de la proteína C reactiva (CRP) (por sus siglas en inglés) . La invención también está dirigida a formulaciones cosméticas para el tratamiento de la inflamación de la piel y otros trastornos de la piel. Antecedentes de la Invención La presente invención está relacionada con compuestos citoprotectores , los cuales son derivados de benzofurano, dichos derivados incluyen estereoisómeros , mezclas de los estereoisómeros y sales de los mismos farmacéuticamente aceptables. Las composiciones de la invención son activas en ciertos modelos experimentales que predicen la eficacia, por ejemplo, en ciertas condiciones isquémicas o inflamatorias, incluyendo pero sin estar limitado a apoplejía, infarto de Ref .157548 miocardio, insuficiencia cardiaca congestiva, y trastornos de la piel caracterizados por la inflamación o daño oxidante. La invención está relacionada por lo tanto con el uso de los derivados citoprotectores en tales condiciones. Los alquil benzofuranos 2, 3-dihidro-5-oxi-4, 6, 7-trimetil-2-opcionalmente substituidos han sido descritos como productos farmacéuticos antioxidantes que tienen propiedades anti-isquémicas en US 5,114,966. Los derivados de hidroxaminas de 2 , 3-dihidrobenzofurano carboxi ácidos han sido descritos en US 5,480, 645. Los derivados de 2,3-dihidrofurano útiles en la prevención y tratamiento de la neovascularización han sido descritos en US 5,719,167 y US 5,798,356. Los 5-hidroxibenzofuranos han sido descritos para el tratamiento de una enfermedad proliferativa celular patológica en US 5, 674, 876. Un método de inhibición de la biosintesis de leucotrieno de mamífero con 6-hidroxibenzofuranos ha sido descrito en US 4,714,711. Aunque varios agentes han sido provistos hasta ahora para tales condiciones, sin embargo subsiste el deseo de proporcionar nuevas terapias para las condiciones caracterizadas por tensión oxidante, y particularmente, para proporcionar protección en el caso de isquemia cerebral, exposición a rayos ultravioleta o inflamación; son deseados especialmente los agentes que son efectivos aún si son administrados primero después de un período de tiempo significativo (por ejemplo, aproximadamente 5 o más horas) a continuación de un ataque isquémico u oxidante. Breve Descripción de la Invención La presente invención está relacionada con ciertos compuestos citoprotectores novedosos y relacionados que son particularmente activos en el restablecimiento o preservación de la integridad metabólica en las células competentes oxidantemente que han sido sometidas a privación de oxigeno. Tales compuestos, predominantemente derivados de benzofurano, son útiles en la fabricación de composiciones farmacéuticas para el tratamiento de un número de condiciones caracterizadas por la tensión oxidante, y particularmente, en la provisión de protección en el caso de isquemia cerebral, exposición a rayos ultravioleta, o inflamación, aún cuando se administre en un intervalo de tiempo significativo después de un ataque isquémico u oxidante. En particular, las composiciones de la presente invención son útiles en el tratamiento de apoplejía, como es demostrado por la provisión de neuroprotección en un modelo experimental estándar de isquemia cerebral focal. Las mismas también son útiles en el tratamiento de isquemia de miocardio (infarto de miocardio) , así como otras indicaciones caracterizadas por tensión oxidante y/o inflamación, incluyendo, pero sin estar limitado a, diabetes, enfermedad renal, síndrome pre-menstrual, asma, trastornos inflamatorios cardiopulmonares, insuficiencia cardiaca crónica, artritis reumatoide, fatiga muscular, claudicación intermitente, y para la preservación del tejido de aloinjerto para el trasplante. Particularmente con respecto a las condiciones dermatológicas, los compuestos, formulaciones y métodos de la presente invención son útiles en la regulación de la condición de la piel, la regulación de las señales de envejecimiento de la piel, y en el tratamiento de numerosas condiciones, incluyendo, pero sin estar limitado a la prevención y protección del tejido de la piel contra el daño relacionado con la edad o el daño que resulta de los ataques tales como radiación perjudicial (rayos UV) , tensión y fatiga. Estos compuestos, formulaciones y métodos de la presente invención también son útiles en el tratamiento por ejemplo de dermatitis por contacto, acné, irritación incluyendo irritación inducida por retinoides, hirsutismo, modulación del crecimiento del cabello, trastornos en la pigmentación, o psoriasis, y pueden ser utilizados como agentes bactericidas, antifungosos y antimicrobianos. Los compuestos de la presente invención también muestran actividad para reducir los niveles de CRP elevados asociados con numerosas enfermedades y trastornos, incluyendo pero sin estar limitado a, enfermedad cardiovascular, diabetes y enfermedades infecciosas. La presente invención se refiere a los compuestos representados por la fórmula I: Fórmula I en donde : R1 es: hidrógeno, alquilo opcionalmente substituido, alquenilo opcionalmente substituido, arilo opcionalmente substituido, (alcoxi opcionalmente substituido) carbonilo, o halógeno : R2 y R3 son seleccionados independientemente de alquilo opcionalmente substituido, alquenilo opcionalmente substituido o cicloalquilo opcionalmente substituido; R4 es: hidrógeno, arilo opcionalmente substituido, (alquilo opcionalmente substituido) carbonilo, (arilo opcionalmente substituido") carbonilo, (heterociclilo opcionalmente substituido) carbonilo, (heterociclilalquilo opcionalmente substituido) carbonilo, (alcoxi opcionalmente substituido) carbonilo, (alqueniloxi opcionalmente substituido) carbonilo, (amino opcionalmente substituido) carbonilo, carboxi, formilo, o hidroxialquilo (opcionalmente substituido) ; R5 es: hidrógeno, alquilo, alquenilo, (alcoxi opcionalmente substituido) carbonilo, carboxi, (amino opcionalmente substituido) carbonilo, o arilo opcionalmente substituido; siempre que uno de R4 o R5 es hidrógeno, y que cuando R4 es hidrógeno R5 no es hidrógeno, y cuando R5 es hidrógeno R4 no es hidrógeno; R es hidrógeno, alquilo, acilo, fosforilo, o polialcoxi; o R y R1 con los átomos a los cuales los mismos están fijados forman un anillo opcionalmente substituido; incluyendo los estereoísomeros simples, mezclas de estereoisómeros, y las sales de los mismos farmacéuticamente aceptables . Una modalidad preferida de esta invención se refiere a los compuestos de la Fórmula I en donde R2 y R3 son (Ci-C6) -alquilo, preferentemente metilo, y dentro de este subconjunto aquellos compuestos de la Fórmula I en donde R es hidrógeno. En otra modalidad, la invención se refiere a los compuestos de la Fórmula I en donde R2 y R3 son (Ci-Ce) -alquilo, preferentemente metilo, R es hidrógeno, R5 es hidrógeno, y R4 es arilo opcionalmente substituido, (alquilo opcionalmente substituido) carbonilo, (arilo opcionalmente substituido) carbonilo, (heterociclilo opcionalmente substituido) carbonilo, (heterociclilalquilo opcionalmente substituido) carbonilo, (alcoxi opcionalmente substituido) carbonilo, (alqueniloxi opcionalmente substituido) carbonilo, (amino opcionalmente substituido) carbonilo, carboxi, formilo, o hidroxialquilo (opcionalmente substituido) ; especialmente en donde el arilo es fenilo no substituido o fenilo substituido con uno o más substituyentes seleccionados de alquilo, alcoxi, hidroxi, (alcoxi opcionalmente substituido) carbonilo, nitro, halo, y ciano . En otra modalidad, la invención se refiere a compuestos de la Fórmula I en donde R2 y R3 son (d-C6) -alquilo, preferentemente metilo, R es hidrógeno, R4 es hidrógeno, y R5 es arilo opcionalmente substituido, preferentemente fenilo no substituido o fenilo substituido con uno o más substituyentes seleccionados de alquilo, alcoxi, hidroxi, (alcoxi opcionalmente substituido) carbonilo, nitro, halo, y ciano. En otra modalidad, "la invención se refiere a los compuestos de la Fórmula I en donde R y R1 forman un anillo, preferentemente R y R1 forman un anillo de furano substituido con un fenilo no substituido o con un fenilo substituido con uno o más substituyentes seleccionados de alquilo, alquenilo, hidroxi, alcoxi, nitro, ciano, carboxi, carboxiéster, haloalquilo, y halo. Ciertas modalidades de la invención proporcionan combinaciones novedosas y preferidas de los grupos substituyentes colgantes de las fórmulas de las diferentes invenciones . En otro aspecto, la invención se refiere a composiciones farmacéuticas y/o cosméticas que contienen una cantidad efectiva terapéuticamente de un compuesto de cualquiera de la Fórmula I, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, mezclada con al menos un excipiente aceptable farmacéuticamente. Son preferidas particularmente aquellas composiciones farmacéuticas o cosméticas en donde un compuesto de la Fórmula I es seleccionado de los Compuestos Preferidos. Otro aspecto de la presente invención se refiere a métodos de tratamiento para un mamífero que sufre de una condición caracterizada por la tensión oxidante, por la administración de una cantidad efectiva terapéuticamente de un compuesto representado por la Fórmula I que incluye los estereoisómeros únicos, las mezclas de estereoisómeros, y las sales aceptables farmacéuticamente de los mismos. En una modalidad, la invención se refiere a un método de tratamiento de una condición cardiovascular, cerebrovascular, neurológica, inflamatoria, autoinmune, y/o dermatológica. En otra modalidad la invención se refiere a una condición seleccionada de apoplejía, isquemia cerebral, infarto de miocardio, insuficiencia cardiaca crónica, isquemia retinal, disfunciones cognitivas post-quirúrgicas, neuropatía periférica, ' lesiones de la médula espinal, lesiones de la cabeza y trauma quirúrgico. En otra modalidad, la condición involucra componentes inflamatorios o autoinmunes. En otra modalidad, la invención se refiere a un método para el tratamiento de condiciones dermatológicas caracterizadas por la tensión oxidante que incluyen pero no están limitadas a la regulación de la condición de la piel, la regulación de las señales de envejecimiento de la piel, la dermatitis por contacto, acné, pigmentación de la piel, modulación del crecimiento del cabello, irritación incluyendo la irritación inducida por retinoides, psoriasis, daño relacionado con la edad y daño que resulta de la radiación perjudicial (rayos UV) , tensión o fatiga. En otra modalidad el compuesto de la Fórmula I o la composición del mismo, es administrada tópicamente. En otra modalidad, la condición es dermatológica, comprendiendo además un método de promoción de un producto por la dirección ' de un usuario a aplicar a la piel una composición farmacéutica o cosmética que incorpora el compuesto de la Fórmula I . En todavía otra modalidad, la invención se refiere a un método de tratamiento de la apoplejía y otras condiciones relacionadas con la tensión oxidante que son responsables de la modulación de la enzima celular tales como isquemia cerebral, infarto de miocardio, insuficiencia cardiaca crónica, y exposición a radiación UV en un mamífero, por la administración a un mamífero en la necesidad de tal tratamiento de una cantidad efectiva terapéuticamente de un compuesto de cualquiera de la Fórmula I, o una sal del mismo aceptable farmacéuticamente. En todavía otro aspecto, la invención se refiere a un método de reducción de los niveles de la proteína C reactiva (CRP( por sus siglas en inglés) asociada con la inflamación, incluyendo pero sin estar limitada a la condición inflamatoria cardiovascular, la condición inflamatoria respiratoria, sepsis, diabetes, fatiga muscular, lupus eritematoso sistémico (SLE) (por sus siglas en inglés) , enfermedad renal de la etapa final (ERSD) (por sus siglas en inglés), enfermedad periodontal, y condiciones inflamatorias de la piel . Se prefieren particularmente aquellos métodos de tratamiento y usos en la fabricación de composiciones farmacéuticas y/o cosméticas para los mismos, en donde un compuesto de la Fórmula I es seleccionado de los Compuestos Preferidos . Descripción Detallada de la Invención Definiciones Cuando se utilicen en la presente especificación, las siguientes palabras y frases están propuestas generalmente para que tengan los significados descritos posteriormente, excepto hasta el grado en que el contexto en el cual las mismas sean utilizadas lo indique de otra manera. El término "opcional" u "opcionalmente" significa que el evento o circunstancia descrita subsiguientemente puede ocurrir o no, y que la descripción incluye casos en donde el evento o circunstancia ocurre y los casos en los cuales no lo hace. Por ejemplo, "alquilo opcionalmente substituido" significa ya sea "alquilo" o "alquilo substituido", como se definen posteriormente. Se entenderá por aquellos expertos en el arte con respecto a cualquier grupo que contiene uno o más substituyentes que tales grupos no están propuestos para introducir alguna substitución o configuraciones de substitución que sean esféricamente imprácticas o sintéticamente no factibles. Ciertas abreviaturas de compuestos, reactivos, o parámetros de reacción son definidas como sigue: • "DCM" se refiere a diclorometano o cloruro de mefileno "t-Bu" se refiere a t-butilo "DCC" se refiere a 1 , 3-diciclohexilcarbodiimida "DIC" se refiere a N, N-diisopropilcarbodiimida "DIPEA" se refiere a diisopropil etilamina "DMAP" se refiere a 4-N, N-dimetilamino piridina "DMF" se refiere a ?,?-dimetil formamida "Eq." se refiere a equivalente "EDCI" se refiere a clorhidrato de 1 dimetilaminópropil) -3-etilcarbodiimida • "MeOH" se refiere a metanol • "THF" se refiere a tetrahidrofurano • "EtOAc" se refiere a acetato de etilo. El término "acilo" se refiere a los grupos -C (0) -H, -C (O) - (alquilo opcionalmente substituido), -C(0)- (cicloalquilo opcionalmente substituido), -C (0) - (alquenilo opcionalmente substituido), -C (0) - (cicloalquenilo opcionalmente substituido), -C(0)-(arilo opcionalmente substituido), -C (0) - (heteroarilo opcionalmente substituido) y -C (O) - (heterociclo opcionalmente substituido) . El término "alquenilo" se refiere a una cadena de hidrocarburos insaturada o poliinsaturada, ramificada o no ramificada, de mono-radicales, que tiene desde aproximadamente 2 hasta 20 átomos de carbono, más preferentemente de manera aproximada 2 hasta 10 átomos de carbono. Este término es. ejemplificado por grupos tales como etenilo, but-2-enilo, 3-metil-but-2-enilo (también referido como "prenilo"), octa-2 , 6-dienilo, 3, 7-dimetil-octa-2, 6-dienilo (también referido como "geranilo"), y semejantes. El término "alquenilo substituido" se refiere a un grupo alquenilo en el cual 1 o más (hasta aproximadamente 5, preferentemente hasta aproximadamente 3) átomos de hidrógeno son reemplazados por un substituyente, por ejemplo: hidroxi, alcoxi, carboxi, ciano, halógeno o nitro.
El término "alcoxi" se refiere a los grupos -O-alquilo, -O-alquenilo, -O-cicloalquilo, -O-cicloalquenilo, y -O-alquinilo . Los grupos alcoxi preferidos son -O-alquilo o -O-alquenilo e incluyen, a manera de ejemplo, metoxi, etoxi, n-propoxi, iso-propoxi, n-butoxi, terc-butoxi, sec-butoxi, n-pentoxi, n-hexoxi, 1, 2-dimetilbutoxi, 3, -dimetil-octa-2 , 6-dieniloxi y semejantes. El término "alcoxi substituido" se refiere a los grupos -0- (alquilo substituido), -0- (alquenilo substituido), -0- (cicloalquilo substituido), -0- (cicloalquenilo substituido), -0- ( alquinilo substituido) y -0- (alquileno opcionalmente substituido ) -alcoxi . Un grupo alcoxi substituido preferido es "polialcoxi" o -0- (alquileno substituido ) -alcoxi, e incluye grupos tales como los grupos -0CH20CH3, -0CH2CH20CH3, y (o PEG) tales como -0 (CH2CH20) XCH3 y -0 (CH2CH20) XH en donde x es un número entero de aproximadamente 2-20, preferentemente de manera aproximada 2-10, y aún más preferentemente de manera aproximada 2-5. El término "alquilo" se refiere a una cadena de hidrocarburos saturada, ramificada o no ramificada, de mono-radicales, que tiene preferentemente desde aproximadamente 1 hasta 20 átomos de carbono, más preferentemente de manera aproximada 1 hasta 10 átomos de carbono, y aún más preferentemente de manera aproximada 1 a 6 átomos de carbono. Este término es ejemplificado por los grupos tales como metilo, etilo, n-propilo, iso-propilo, n-butilo, iso-butilo, n-hexilo, n-decilo, tetradecilo, y semejantes. El término "alquilo substituido" se refiere a un grupo alquilo en el cual 1 o más (hasta aproximadamente 5, preferentemente hasta aproximadamente 3) átomos de hidrógeno son reemplazados por un substituyente seleccionado independientemente del grupo: =0, =S, acilo, aciloxi, alcoxi substituido opcionalmente, amino substituido opcionalmente, azido, carboxilo, (alcoxi opcionalmente substituido) carbonilo, (amino substituido opcionalmente) carbonilo, ciano, cicloalquilo opcionalmente substituido, cicloalquenilo opcionalmente substituido, heterociclilo, carboxi, halógeno, hidróxilo, nitro, ciano, sulfanilo, sulfinilo, y sulfonilo, o dos substituyentes con el carbono al cual los mismos están fijados pueden formar un anillo. Uno de los substituyentes opcionales preferidos para el alquilo es hidroxi, ejemplificado por grupos de hidroxialquilo, tales como 2-hidroxietilo, 3-hidroxipropilo, 3-hidroxibutilo, 4-hidroxibutilo, y semejantes; grupos de dihidroxialquilo (glicoles) , tales como 2, 3-dihidroxipropilo, 3, 4-dihidroxibutilo, 2, 4-dihidroxibutilo, y semejantes; y aquellos compuestos conocidos como polietilenglicoles, polipropilenglicoles y polibutilenglicoles, y semejantes. Un "alquilo substituido" preferido en donde los substituyentes forman un anillo es el 6-hidroxi-3-metil-[l, 3]oxazinan-6-ilo.
El término "amino" se refiere al grupo -NH2. El término "amino substituido" se refiere al grupo -NHR o -NRR en donde cada R es seleccionada independientemente del grupo de: alquilo opcionalmente substituido, cicloalquilo opcionalmente substituido, alquenilo opcionalmente substituido, cicloalquenilo opcionalmente substituido, alquinilo opcionalmente substituido, arilo opcionalmente substituido, heteroarilo opcionalmente substituido, heterociclilo opcionalmente substituido, acilo, alcoxi opcionalmente substituido, carboxi y alcoxicarbonilo, y en donde RR forma con el nitrógeno al cual los mismos están unidos una amina cíclica que incorpora opcionalmente uno o más heteroátomos adicionales seleccionados de O, N y S. El término "arilo" se refiere a un grupo de hidrocarburos cíclicos aromáticos desde 6 hasta 20 átomos de carbono que tiene un solo anillo (por ejemplo, fenilo) o anillos condensados múltiples (fusionados) (por ejemplo, naftilo o antrilo) . Los arilos preferidos incluyen fenilo, naftilo y semejantes. El término "arilo substituido" se refiere a un grupo arilo como se definió anteriormente, el cual a menos que esté restringido de otra manera por la definición del substituyente de arilo, está substituido con desde 1 hasta 5 substituyentes, y preferentemente 1 a 3 substituyentes, seleccionados independientemente del grupo que consiste de: =0, =S, acilo, aciloxi, alquenilo opcionalmente substituido, alcoxi opcionalmente substituido, alquilo opcionalmente substituido (tal como tri-halometilo) , alquinilo opcionalmente substituido, amino opcionalmente substituido, arilo opcionalmente substituido, ariloxi opcionalmente substituido, azido, carboxilo, (alcoxi opcionalmente substituido) carbonilo, (amino opcionalmente substituido) carbonilo, ciano, cicloalquilo opcionalmente substituido, cicloalquenilo opcionalmente substituido, halógeno, heteroarilo opcionalmente substituido, heteroariloxi opcionalmente substituido, heterociclilo opcionalmente substituido, heterociclooxi opcionalmente substituido, hidróxilo, nitro, sulfanilo, sulfinilo, y sulfonilo. Los substituyentes de arilo preferidos incluyen alquenilo opcionalmente substituido, alquilo, alcoxi, amino substituido, halo, hidroxi, alcoxicarbonilo, carboxi, ciano, nitro, fosforilo. El término "carbonilo" se refiere al di-radical "-C(=0)-", el cual también es ilustrado como "-C(O)-". El término " (alcoxi opcionalmente substituido) carbonilo" se refiere a los grupos: -C(0)0-(alquilo opcionalmente substituido), -C (0) 0- (cicloalquilo opcionalmente substituido), -C (0) 0- (alquenilo opcionalmente substituido), -C (O) O- (alquinilo opcionalmente substituido), -C (O) O- (arilo opcionalmente substituido), -C (O) 0- (heteroarilo opcionalmente substituido), y -C (O) O- (heterociclilo opcionalmente substituido) . Estas porciones también son referidas como esteres. El término "amino opcionalmente substituido) carbonilo" se refiere al grupo -C (O) -(amino opcionalmente substituido) . Esta porción también se refiere a una carboxamida primaria, secundaria o terciaria, y el "amino substituido" puede ser una amina cíclica. El término "carboxi" o "carboxilo" se refiere a la porción "-C(0)0H", la cual también es ilustrada como "-C0OH". El término "compuesto de la Fórmula I" está propuesto para abarcar los derivados de la invención como se describen, y/o las sales farmacéuticamente aceptables de tales compuestos. Además, los compuestos empleados en esta invención incluyen los isómeros estereoquímicos individuales (que surgen de la selección de grupos substituyentes) y mezclas de los isómeros. El término "cosméticos" incluye productos de maquillaje, bases para maquillaje, y productos para el cuidado de la piel. El término "maquillaje" se refiere a productos que dejan un color sobre la cara, incluyendo bases para maquillaje, negras y cafés, es decir, máscaras, encubridores, delineadores de ojos, colores para las cejas, sombras para los ojos, rubores, colores para los labios, y etcétera. El término "base para maquillaje" se refiere a productos liquido, cremas, espumas, tortas delgadas de masa fría, estuches de polvos, encubridores o productos semejantes que igualan completamente la coloración total de la piel. La base para maquillaje es fabricada típicamente para trabajar mejor sobre la piel humedecida y/o aceitada. El término "productos para el cuidado de la piel" se refiere a los productos utilizados para tratar o de otra manera para cuidar, humedecer, mejorar, o limpiar la piel. Los productos contemplados por la frase "productos para el cuidado de la piel" incluyen, pero no están limitados a, adhesivos, vendajes, pasta de dientes, humectadores oclusivos anhidros, antitranspirantes, desodorantes, detergentes en polvo para lavandería, suavizantes de tela, toallas, parches para suministro de fármacos oclusivos, esmalte para uñas, polvos, gasas, pañuelos desechables, estuches de maquillaje en emulsión sólida, acondicionadores del cabello anhidros, champús medicados, tratamientos para la calvicie y semej antes . El término "CRP" o "proteína C reactiva" se refiere a un marcador bioquímico de la inflamación. La presencia de niveles elevados de CRP se ha mostrado que va a estar asociada con varias condiciones inflamatorias tales como por ejemplo, enfermedades o trastornos cardiovasculares, incluyendo fibrilación atrial, angina inestable, enfermedad de las arterias coronarias, enfermedad de las arterias periféricas, vasculopatia de aloinjerto cardiaco (CAVD) ; mastitis; preclampsia, condiciones inflamatorias del intestino; apoplejía; infarto del tejido; lumbosciática; terapia de reemplazo de las hormonas de estrógeno/progestina (HRT) (por sus siglas en inglés) ; infección (bacteriana, viral y por protozoarios ) , meningitis bacteriana; trauma; cirugía; implantes biomateriales, fumar; obesidad, enfermedades neurodegenerativas tales como, Alzheimer, enfermedad infecciosa, tales como, por ejemplo, miocarditis, cardiomiopatía, endocarditis aguda, pericarditis; ateroesclerosis, Síndrome de Respuesta Inflamatoria Sistémica (SIRS) /sepsis, síndrome de tensión respiratoria del adulto (ARDS) ; asma; artritis reumatoide, osteoartritis , lupus eritematoso sistémico; Hiper-sensibilidad de las Vías Superiores (AHR) (por sus siglas en inglés) ; hiper-reactividad bronquial;. Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica (COPD) (por sus siglas en inglés) ; Insuficiencia Cardiaca Congestiva (CHF) (por sus siglas en inglés) ; complicaciones inflamatorias de la diabetes mellitus del tipo I y del tipo II; síndrome metabólico; enfermedad renal de la etapa final (ESRD) (por sus siglas en inglés) , síndrome premenstrual (PMS) o fatiga muscular o inflamación; síndrome de disfunción de órganos múltiples (MODS) (por sus siglas en inglés) ; hiper-sensibilidad de las vías superiores (AHR) (por sus siglas en inglés) ; hiper-reactividad bronquial; envejecimiento; reacciones alérgicas agudas; gingivitis y condiciones dérmicas. La CRP se ha reportado como un marcador para la inflamación sistémica Spanheimer (2001, Postgrad. Med. 109 (4) 26) y Ridkler et al (2000, N.E.J.M. 342 (12) 836-43) . El término "cicloalquilo" se refiere al radical saturado monovalente que consiste de uno o más anillos, que puede estar substituido opciónalmente con hidroxi, ciano, alquilo inferior, alcoxi inferior, tioalquilo, halo, haloalquilo, hidroxialquilo, nitro, alcoxicarbonilo, amino, alquilamino, dialquilamino, aminocarbonilo, carbonilamino, aminosulfonilo, sulfonilamino o sulfonilo, a menos que se indique de otra manera. Los ejemplos de radicales cicloalquilo incluyen pero no están limitados a, ciclopropilo, ciclopentilo, ciclohexilo, etc. El término "aceptable dermatológicamente", como se utiliza aquí, significa que las composiciones o componentes de los mismos asi descritos son adecuados para su uso en contacto con la piel humana sin toxicidad indebida, incompatibilidad, inestabilidad, respuesta alérgica, o semejantes . El término "halo" o "halógeno" se refiere a fluoro, cloro, bromo e yodo. El término "heteroarilo" se refiere a un grupo de hidrocarburo cíclico aromático que tiene aproximadamente 1 a 40 átomos de carbono (preferentemente desde aproximadamente 3 hasta 15) y aproximadamente 1 a 10 heteroátomos (preferentemente de manera aproximada 1 a 4 heteroátomos, seleccionados de nitrógeno, azufre, fósforo, y/u oxígeno) dentro de al menos un anillo. Tales grupos heteroarilo pueden tener un anillo único (por ejemplo, de piridilo o furilo) o anillos condensados múltiples (por ejemplo, de indolizinilo o benzotienilo) . Los heteroarilos preferidos incluyen piridilo, [2, 2 ' Jbipiridinilo, pirrolilo y furilo. Los términos "heterociclo" , "heterocíclico" y "heterociclilo" se refieren a un grupo de hidrocarburos cíclicos, no aromáticos, saturados o insaturados, de mono-radicales, que tiene aproximadamente 1 a 40 (preferentemente desde aproximadamente 3 hasta 15) átomos de carbono y aproximadamente 1 a 10 heteroátomos (preferentemente de manera aproximada 1 a 4 heteroátomos, seleccionados de nitrógeno, azufre, fósforo, y/u oxígeno) dentro del anillo. Tales grupos heterocíclicos pueden tener un anillo único o anillos condensados múltiples. Los grupos heterocíclicos preferidos incluyen morfolino, piperidinilo, 1 , 3-oxazinano, y semej antes . Los términos "heterociclo substituido", "heterocíclico substituido" y "heterocicliclo substituido" se refieren a un grupo heterociclilo como se definió anteriormente, el cual a menos que esté restringido de otra manera por la definición para el heterociclo, está substituido con desde 1 hasta 5 substituyentes, y preferentemente 1 a 3 substituyentes, seleccionados independientemente del grupo que consiste de: =0, =S, acilo, aciloxi, alquenilo substituido opcionalmente, alcoxi substituido opcionalmente, alquilo substituido opcionalmente (tal como tri-halometilo ) , alquinilo opcionalmente substituido, amino opcionalmente substituido, arilo opcionalmente substituido, ariloxi opcionalmente substituido, azido, carboxilo, (alcoxi opcionalmente substituido) carbonilo, (amino opcionalmente substituido) carbonilo, ciano, cicloalquilo opcionalmente substituido, cicloalquenilo opcionalmente substituido, halógeno, heteroarilo opcionalmente substituido, heteroariloxi opcionalmente substituido, heterociclilo opcionalmente substituido, ' heterociclooxi opcionalmente substituido, hidróxilo, nitro, sulfanilo, sulfinilo, y sulfonilo . El término "heterocicloalquilo" se refiere a la porción de "-alquileno-heterociclo" teniendo cada una el significado definido aquí. El término "heterocicloalquilo substituido" se refiere a la porción de "- (alquileno opcionalmente substituido) - (heterociclo opcionalmente substituido) " teniendo cada una el significado definido aquí. El término "inflamación", "condiciones inflamatorias", o "condiciones de inflamación" incluye pero no está limitado a fatiga muscular, osteoartritis, artritis reumatoide, síndrome o trastorno inflamatorio del intestino, inflamación de la piel, tal como dermatitis atópica, dermatitis por contacto, dermatitis alérgica, xerosis, eccema, rosácea, seborrea, psoriasis, ateroesclerosis, quemaduras térmicas o por radiación, acné, piel grasosa, arrugas, celulitis excesiva, tamaño de poro excesivo, envejecimiento intrínseco de la piel, foto-envejecimiento, daño por foto-exposición, daño perjudicial por rayos UV, anormalidades de queratinización, irritación incluyendo irritación inducida por retinoides, hirsutismo, alopecia, despigmentación, inflamación debida a heridas, marcas de cicatrices o de estiramientos, pérdida de elasticidad, atrofia de la piel y gingivitis. El término "isquemia" se refiere a una deficiencia de la sangre a un órgano o tejido debido a constricción funcional u obstrucción real de un vaso sanguíneo. La isquemia cerebral, también conocida como apoplejía, usualmente resulta de la interrupción o reducción de la sangre y oxígeno a los vasos sanguíneos del cerebro; más raramente esto puede ser el resultado de una hemorragia. Las señales de la apoplejía incluyen la parálisis, voz balbuceante confusión general, daño en el modo de andar, pérdida sensorial cortical sobre los talones, pies y piernas, e incontinencia urinaria, por nombrar solo algunas. Muchos tipos de enfermedades del corazón que incluyen arritmias cardiacas o enfermedades debidas a anormalidades estructurales cardiacas pueden producir embolias cerebrales. La fibrilación atrial de cualquier causa, incluyendo la enfermedad valvular reumática, puede conducir a que se produzcan embolias las cuales pueden migrar hacia las arterias del cerebro. La formación y migración de embolias puede ocurrir como resultado de la enfermedad cardiovascular arterioesclerótica e infarto de miocardio. La formación de embolias también es un riesgo definido para la cirugia cardiaca y el reemplazo de válvulas prostéticas. La cirugia de derivación del corazón y la angioplastía pueden conducir a la formación de microembolias las cuales pueden migrar hacia las arterias del cerebro y provocar una serie de oclusiones én numerosas arterias, conduciendo a daño mental. La embolia cerebral también es la principal complicación en el trasplante de corazones artificiales. Además, el riesgo total de apoplejía después de cualquier tipo de cirugía general es de 0.2 a 1 por ciento. Las vegetaciones de endocarditis bacteriana aguda y subaguda pueden ocasionar embolias las cuales pueden ocluir una arteria craneana principal. Las poblaciones en riesgo de isquemia incluyen pero no están limitadas a pacientes programados para cirugía de injerto de derivación de la arteria coronaria (CABG) (por sus siglas en inglés) , los pacientes en riesgo de complicaciones postoperatorias, los pacientes con hemorragia subaracnoidea (SAH) (por sus siglas en inglés) , los pacientes con una primera o segunda apoplejía isquémica, los pacientes con apoplejía isquémica aguda, los pacientes que padecen resucitación cardiopulmonar (CPR) (por sus siglas en inglés) , los pacientes con lobectomía temporal, los pacientes con resección del hemisferio dominante, los pacientes que reciben radiación profiláctica del cerebro, los pacientes con trauma cerrado de la cabeza con pérdida neurológica, los pacientes con demencia multi-infartos microvascular, los pacientes con MELAS homozigótica y heterozigótica (miopatía mitocondrial, encefalopatía, lactacidosis, apoplejía); los pacientes con enfermedad de parálisis suplanuclear progresiva o ateroesclerótica, los pacientes con enfermedad de Huntington sintomática y asintomática, los pacientes con asfixia neonatal, los pacientes con meningitis o encefalitis, los pacientes con neuropatía post-herpética, los pacientes con claudicación intermitente, los pacientes con lesión de la médula espinal, los pacientes con la enfermedad de Huntington, Esclerosis Lateral Amiotrófica (ALS) (por sus siglas en inglés) o ataxia de Friedreich, los pacientes con neuropatía diabética o los pacientes con una enfermedad asociada con un estado secundario hipercoagulable para una enfermedad sistémica, carcinoma, vasoconstricción (incluyendo vasoconstricción cerebral reversible, por ejemplo migraña, trauma, idiopatia) , o condiciones venosas (incluyendo deshidratación, embolia pulmonar, infección pericraneal, estados post-parto y post-operativo y cáncer del sistema) . El término "productos para el cuidado personal" se refiere a los productos adyuvantes de belleza cosmética y salud reconocidos generalmente como los que son formulados para embellecer y acicalar la piel y el cabello. Por ejemplo, los productos para el cuidado personal incluyen productos de filtración solar (por ejemplo, lociones, cremas para la piel, etc.), cosméticos, artículos de tocador, y productos farmacéuticos no vendidos comercialmente, propuestos para uso tópico . Cuando se utilice aquí, "portador aceptable farmacéuticamente" o "excipiente aceptable farmacéuticamente" incluye cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifungosos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción y semejantes. El uso de tales medios y agentes para las substancias activas farmacéuticamente es bien conocido en el arte. Excepto por lo que respecta a que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el ingrediente activo, su uso en las composiciones terapéuticas está contemplado. Los ingredientes activos suplementarios también pueden ser incorporados en las composiciones. El término "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a las sales las cuales retienen la efectividad biológica y las propiedades de los compuestos de esta invención y las cuales no sean indeseables biológicamente o de otra manera. En muchos casos, los compuestos de esta invención son capaces de formar sales ácidas y/o básicas en virtud de la presencia de grupos de amino y/o carboxilo o grupos semejantes a los mismos. Las sales de adición básica aceptables farmacéuticamente pueden ser preparadas a partir de bases orgánicas e inorgánicas. Las sales derivadas de bases inorgánicas, incluyen a manera de ejemplo solamente, sales de sodio, potasio, litio, amonio, calcio y magnesio. Las sales derivadas de las bases inorgánicas incluyen, pero no están limitadas a, sales de aminas primarias, secundarias y terciarias, tales como alquil aminas, dialquil aminas, trialquil aminas, alquil aminas substituidas, diaminas (alquilo substituidas), triaminas (alquilo substituidas), alquenil aminas, dialquenil aminas, trialquenil aminas, alquenil aminas substituidas, diaminas (alquenilo substituidas), triaminas (alquenilo substituidas), cicloalquil aminas, di ( cicloalquil ) aminas, tri (cicloalquil ) aminas, cicloalquil aminas substituidas, cicloalquil aminas disubstituidas, cicloalquil aminas trisubstituidas, cicloalquenil aminas, di (cicloalquenil ) aminas, tri (cicloalquenil ) aminas, cicloalquenil aminas substituidas, cicloalquenil aminas disubstituidas, cicloalquenil aminas trisubstituidas, aril aminas, diaril aminas, triaril aminas, heteroaril aminas, diheteroaril aminas, triheteroaril aminas, aminas heterocíclicas, aminas diheterocíclicas, aminas triheterocíclicas, di- y tri-aminas mezcladas en donde al menos dos de los substituyentes de la amina son diferentes y son seleccionados del grupo que consiste de alquilo, alquilo substituido, alquenilo, alquenilo substituido, cicloalquilo, cicloalquilo substituido, cicloalquenilo, cicloalquenilo substituido, arilo, heteroarilo, heterociclico, y semejantes. También están incluidas las aminas en donde los dos o tres substituyentes, junto con el nitrógeno del amino, forman un grupo heteroarilo o heterociclico. Las sales de adición ácida farmacéuticamente aceptables pueden ser preparadas a partir de ácidos orgánicos e inorgánicos. Las sales derivadas de ácidos inorgánicos incluyen ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico y semejantes. Las sales derivadas de los ácidos orgánicos incluyen ácido acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido málico, ácido malónico, ácido succínico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido cinámico, ácido mandélico. ácido metánosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido p-toluenosulfónico, ácido salicilico, y semejantes. El término "fosforilo" se refiere al grupo -P(0) (OR")2/ en donde R" es seleccionado independientemente de hidrógeno o alquilo y arilo, tal grupo también es referido algunas veces como "fosfono" o como un "fosfato" o "ácido fosfónico" . La "regulación de la condición de la piel" incluye regular profilácticamente y/o regular terapéuticamente la condición de la piel, incluyendo discontinuidades visibles y/o táctiles en la piel tales como, pero sin estar limitado a, la regulación de las discontinuidades visibles y/o táctiles en la textura de la piel, la reducción de la hiperpigmentación post-inflamatoria, la regulación de la decoloración no de melanina de la piel, la regulación de la humectación y las propiedades de barrera de la piel, la regulación de la diferenciación epidérmica de la piel, la regulación de la exfoliación de la piel, el engrosamiento de la piel para reducir la atrofia de la piel, la regulación de la elasticidad de la piel, la reducción de la piel grasosa, la regulación de la celulitis en la piel, la regulación del prurito en la piel, y la promoción del sanado de las heridas en la piel. Cuando se utilice aquí, la regulación profilácticamente de la condición de la piel incluye el retardo, la minimización y/o la prevención de discontinuidades visibles y/o táctiles en la piel. Cuando se utilice aquí, regular terapéuticamente la condición de la piel incluye la mejora, por ejemplo, reducción, minimización y/o borrado de las discontinuidades en la piel. La regulación de la condición de la piel involucra la mejora de la apariencia y/o el tacto de la piel. La regulación de la condición de la piel incluye la modulación del cabello del cuerpo/craneal, incluyendo el retardo y/o la prevención del crecimiento del cabello del cuerpo y/o de la cabeza. La regulación de la condición de la piel incluye la regulación de la irritación incluyendo la irritación inducida por retinoides. Cuando se utilice aquí, la regulación de la piel incluye el uso de los compuestos de la invención como agentes bactericidas, antifungosos y antimicrobianos. La "regulación de las señales de envejecimiento de la piel" incluyen la regulación profilácticamente y/o la regulación terapéuticamente de' una o más de tales señales (de manera semejante, la regulación de una señal dada de envejecimiento de la piel, por ejemplo, las líneas, las arrugas o los poros, incluye la regulación profilácticamente o la regulación terapéuticamente de esta señal) . Cuando se utilice aquí, la regulación profilácticamente de tales señales incluye el retardo, minimización y/o la prevención de las señales de envejecimiento de la piel. Cuando se utilice aquí, la regulación terapéuticamente de tales señales incluye la mejora, por ejemplo, la reducción, minimización y/o el borrado de las señales de envejecimiento de la piel. Las "señales de enve ecimiento de la piel" incluyen, pero no están limitadas a, todas las manifestaciones perceptibles visible y tácticamente, externas, asi como cualesquiera otros macro o micro efectos debidos al envejecimiento de la piel. Tales señales pueden ser inducidas o provocadas por factores intrínsecos o factores extrínsecos, por ejemplo, el envejecimiento cronológico y/o el daño del medio ambiente (por ejemplo, la luz solar, los rayos UV, el humo, él ozono, los contaminantes, la tensión, etc.). Estas señales pueden resultar de los procesos que incluyen, pero no están limitados a, el desarrollo de discontinuidades de textura tales como arrugas, incluyendo tanto arrugas superficiales como arrugas profundas gruesas, líneas de la piel, líneas de desagrado de la cara, líneas de expresión, protuberancias semejantes a las arrugas, dermatoheliosis , fotodaño, envejecimiento prematuro de la piel, hendeduras, protuberancias, cavidades o cicatrices, poros grandes (por ejemplo, asociados con las estructuras anexas tales como conductos de las glándulas sudoríferas, glándulas sebáceas, o folículos del cabello) , apariencia de la piel con "tacto de naranja", resequedad, escamosidad, piel con aspecto de hojuelas y/u otras formas de rugosidad o desuniformidades de la piel, manchas tales como el acné, barros, brotes de granos; problemas de exceso de grasa de la piel tales como sobre producción de sebo, piel con aspecto aceitoso, brillo facial, ruptura de la base de la piel, descamación (o exfoliación) anormal o diferenciación epidérmica anormal (por ejemplo, cambio anomal de la piel) tal como escamosidad, piel con aspecto de hojuelas, queratosis, hiperqueratinizacion; humectación (o hidratación) inadecuada de la piel tal como la provocada por el daño de la barrera de la piel, resequedad por el medio ambiente; pérdida de elasticidad de la piel (pérdida y/o inactivación de la elastina de la piel funcional) tal como elastosis, colgadura (incluyendo hinchazón en el área del ojo y las mejillas), pérdida de firmeza de la piel, pérdida de tensión de la piel, pérdida por retroceso de la piel de la deformación; decoloración de la piel por causa diferente de la melanina tales como círculos debajo de los ojos, ronchas (por ejemplo, coloración roja no uniforme debido, por ejemplo, a rosácea) , palidez (color pálido) , decoloración provocada por telangiectasia o vasos en forma de telaraña; regiones de la piel hiperpigmentadas (o pigmentadas no unifórmente) relacionadas con la melanina tales como manchas por la edad (manchas hepáticas, manchas cafés) y pecas; hiperpigmentación post-inflamatoria tal como aquella que ocurre a continuación de un evento inflamatorio (por ejemplo, como una lesión por acné, cabello que' crece hacia adentro, picadura o mordedura de insectos/arañas, raspaduras, cortadas, heridas, abrasión, y semejantes) atrofia tal como, pero sin estar limitada a, aquella asociada con el envejecimiento o uso de esteroides; otras alteraciones histológicas o microscópicas en los componentes de la piel tales como la substancia de la base de la piel (por ejemplo, ácido hialurónico, glicosaminoglicanos, etc.), ruptura del colágeno y alteraciones o anormalidades estructurales (por ejemplo, cambios en el stratum corneum, dermis, epidermis, el sistema vascular de la piel tal como telangiectasia o vasos en forma de telaraña) ; respuestas del tejido a ataques tales como comezón o prurito; y alteraciones a los tejidos que sirven de soporte (por ejemplo, grasa subcutánea, celulitis, músculos, trabéculas, septums, y semejantes), especialmente aquellos próximos a la piel. El término "cantidad efectiva terapéuticamente" se refiere a aquella cantidad de un compuesto de cualquiera de la Fórmula I que es suficiente para efectuar el tratamiento, como se define posteriormente, cuando es administrada a un mamífero que tenga la necesidad de tal tratamiento. La cantidad efectiva terapéuticamente variará dependiendo del sujeto y la condición de enfermedad que es tratada, el peso y edad del sujeto, la severidad de la condición de la enfermedad, el compuesto particular elegido, el régimen de dosificación que va a ser seguido, la sincronización de la administración, la manera de administración y semejantes, la totalidad de los cuales pueden ser determinadas fácilmente por una persona con experiencia ordinaria en el arte. El término "tratamiento" o "tratando" significa cualquier tratamiento de una enfermedad o trastorno en un mamífero, que incluye: • prevenir o proteger contra la enfermedad o trastorno, es decir, provocar que los síntomas clínicos no se desarrollen; • inhibir la enfermedad o trastorno, es decir, detener o suprimir el desarrollo de los síntomas clínicos, y/o • el alivio de la enfermedad o trastorno que está provocando la regresión de los síntomas clínicos. Se entenderá por aquellos expertos en el arte que en medicina humana, no siempre es posible distinguir entre "prevenir" y "suprimir" puesto que el último evento o eventos inductivos pueden ser desconocidos, estar latentes, o el paciente no es diagnosticado correctamente hasta muy después de la presentación del evento o eventos. Por lo tanto, cuando se utilice aquí el término "profilaxis" está propuesto como un elemento del "tratamiento" para abarcar tanto la "prevención" como la "supresión" como se definió aquí. El término "protección", como se utiliza aquí, se entiende que incluye la "profilaxis".
El término "aplicación tópica" , cuando se utiliza aquí, significa aplicar o dispersar las composiciones de la presente invención sobre la superficie de la piel .
Nomenclatura En general la nomenclatura utilizada en esta Solicitud está basada en Autonom™ v.2.1., un sistema computarizado del Beilstein Institute para la generación de nomenclatura sistemática de la IUPAC. Los compuestos de la presente invención son nombrados y numerados como se describe posteriormente.
Fórmula la La Fórmula la representa el compuesto de conformidad con la Fórmula I en donde R, R1 y R5 son hidrógeno, R2 y R3 son metilo, y R4 es p-nitro-fenilo, y puede ser nombrado como 6, 7-dimetil-2- (4-nitro-fenil ) -benzofuran-5-ol.
Fórmula Ib La Fórmula Ib representa el compuesto de conformidad con la Fórmula I en donde R, R1 y R4 son hidrógeno, R2 y R3 son metilo, y R5 es fenilo, y puede ser nombrado como 6, 7-dimetil-3-fenil-benzofuran-5-ol . Síntesis de ios Compuestos de la Invención Parámetros de la Reacción Sintética Los términos "solvente", "solvente orgánico inerte" o "solvente inerte" significan un solvente inerte bajo las condiciones de la reacción que son descritas en conjunción con la misma. Los solventes empleados en la síntesis de los compuestos de la invención incluyen, por ejemplo, metanol, acetona, agua, acetonitrilo, 1,4-dioxano, dimetilformamida ("DMF") (por sus siglas en inglés), benceno tolueno, xileno, tetrahidrofurano, ( "THF" ) (por sus siglas en inglés), cloroformo, cloruro de metileno (o diclorometano, ("DMC")) (por sus siglas en inglés) , éter dietílico, piridina y semejantes, así como las mezclas de los mismos. A menos que se especifique lo contrario, los solventes utilizados en las reacciones de la presente invención son solventes inertes. El término "c.s." significa agregar una cantidad suficiente para lograr una función establecida, por ejemplo, llevar una solución al volumen deseado (es decir, 100%) . A menos que se especifique lo contrario, las reacciones descritas aquí se llevan a cabo a presión atmosférica dentro de un intervalo de temperatura desde -10 °C hasta 110 °C (preferentemente desde 0 °C hasta 40 °C; más preferentemente a temperatura "ambiental" o de la "habitación", por ejemplo, 20 °C) . Además, a menos que se especifique de otra manera, los tiempos y las condiciones de reacción están propuestas para que sean aproximadas, por ejemplo, llevándose a cabo aproximadamente a la presión atmosférica dentro de un intervalo de temperatura de aproximadamente -10 °C hasta aproximadamente 110 °C (preferentemente desde aproximadamente 0 °C hasta aproximadamente 40 °C;. áún más preferentemente a aproximadamente la temperatura "ambiental" o de la "habitación", por ejemplo, a aproximadamente 20 °C) durante un periodo de aproximadamente 1 hasta aproximadamente 10 horas (preferentemente de manera aproximada 5 horas) . Los parámetros dados en los Ejemplos están propuestos para ser específicos, no aproximados. El aislamiento y purificación de los compuestos y compuestos intermedios descritos aquí pueden ser efectuados, si se desea, por cualquier procedimiento de separación o purificación adecuado tal como, por ejemplo, filtración, extracción, cristalización, cromatografía en columna, cromatografía de capa delgada o cromatografía de capa gruesa, o una combinación de estos procedimientos. Las ilustraciones específicas de los procedimientos de separación y aislamiento adecuadas pueden haber sido por la referencia a los ejemplos de aquí posteriormente. Sin embargo, también se pueden utilizar otros procedimientos de separación y aislamiento equivalentes, por supuesto. Materiales de Partida Los compuestos de partida, por ejemplo, la 2,3-dimetilhidroquinona, están disponibles comercialmente, por ejemplo de la Aldrich Chemical Company, Milwaukee, WI, o pueden ser preparados fácilmente por aquellos expertos en el arte utilizando la metodología empleada comúnmente. Esquema de Reacción 1 Con referencia al Esquema de Reacción 1, una hidroquinona 2 , 3-substituida de la Fórmula 101 es tratada con un equivalente de una etanona 2-halo- 1-substituida, preferentemente una etanona 2-bromo-l-substituida, aún más preferentemente una fenil etanona 2-bromo-l-substituida, en la presencia de una base tal como carbonato de sodio, carbonato de potasio o carbonato de cesio, en un solvente tal como acetona, THF, o DMF, para dar la etanona 2- (4-hidroxi-2 , 3-substituida-fenoxi ) -1-substituida de la Fórmula 102. El Compuesto de la Fórmula 102 puede ser tratado subsiguientemente con un ácido tal como ácido polifosfórico, ácido clorhídrico, o ácido sulfúrico en un solvente inerte tal como tolueno o xileno, para ciclización en un compuesto de benzofurano de la Fórmula 103. De manera semejante, el tratamiento de una hidroquinona 2 , 3-substituida de la Fórmula 102 con 2 o más equivalentes de una etanona 2-halo-l-substituida en la presencia de una base, seguido por ciclización en la presencia de un ácido, puede dar un compuesto de la Fórmula 105.
Esquema de Reacción 2 Con referencia al Esquema de Reacción 2, un compuesto de la Fórmula 201 en donde "Prot" es un grupo protector de hidroxi, preferentemente un grupo tetrahidropiranilo, cuando se hace reaccionar con una etanona 2-halo-l-substituida, preferentemente una etanona 2-bromo-l-substituida en la presencia de una base tal como carbonato de sodio, carbonato de potasio, o carbonato de cesio en un solvente tal como acetona,' THF, o DMF, seguido por ciclización en la presencia de un ácido como se describe en el esquema de reacción 1, puede dar un compuesto de la Fórmula 202. Compuestos Preferidos Las siguientes combinaciones y permutaciones de grupos substituyentes ( sub-agrupados, respectivamente, en orden creciente de preferencia) definen los compuestos que son preferidos como composiciones de materia y compuestos para su usó en los métodos y composiciones farmacéuticas y cosméticas de acuerdo con la invención. • los compuestos de cualquiera de la Fórmula I en donde R2 y R3 son alquilo opcionalmente substituido, particularmente aquellos en donde R2 y R3 son metilo • Preferentemente aquellos en donde R1 es hidrógeno o halógeno • Especialmente aquellos en donde R es hidrógeno . · Los compuestos de cualquiera de la Fórmula I en donde R1 es hidrógeno o halo • Preferentemente aquellos en donde R1 es hidrógeno • Los compuestos de cualquiera de la Fórmula I en donde R es hidrógeno, alquilo, acilo, fosforilo o polialcoxi, preferentemente hidrógeno, y R1 es hidrógeno 1. Particularmente ' aquellos en donde R2 y R3 son metilo • Especialmente aquellos de la Fórmula I en donde R5 es arilo opcionalmente substituido, en donde los substituyentes son elegidos de alquilo, alcoxi, hidroxi, (alcoxi opcionalmente substituido) carbonilo, nitro, halo, y ciano • Particularmente aquellos en donde R5 es fenilo opcionalmente substituido • Particularmente aquellos en donde R3 es fenilo opcionalmente substituido y R4 es hidrógeno • Especialmente aquellos de la Fórmula I en donde R4 es arilo opcionalmente substituido · Particularmente aquellos en donde R4 es fenilo opcionalmente substituido • Preferentemente aquellos en donde R4 es fenilo para-substituido, en donde los substituyentes son elegidos de alquilo, alcoxi, hidroxi, (alcoxi opcionalmente substituido) carbonilo, nitro, halo y ciano Preferentemente aquellos en donde R4 es 4-nitrofenilo, 4-cianofenilo y R5 es hidrógeno. • Especialmente aquellos de la Fórmula I en donde R4 es formilo, (alquilo opcionalmente substituido) carbonilo, (arilo opcionalmente substituido) carbonilo, (heterociclilo opcionalmente substituido) carbonilo, . (hete'rociclilalquilo opcionalmente substituido) carbonilo • Particularmente aquellos en donde R4 es (arilo opcionalmente substituido) carbonilo • Particularmente aquellos en donde R4 es (alquilo opcionalmente substituido) carbonilo • Particularmente aquellos en donde R4 es alquilcarbonilo opcionalmente substituido con halógeno, hidroxi o heterociclilo, especialmente substituido con morfolin-l-ilo • Particularmente aquellos en donde R4 es formilo Preferentemente aquellos en donde R4 es seleccionado de formilo, fenilcarbonilo, bromoacetilo, morfolin-l-il-acetilo, y acetilo; y R5 es hidrógeno • Especialmente aquellos en donde R4 es (alcoxi opcionalmente substituido) carbonilo, (alqueniloxi opcionalmente substituido) carbonilo, (amino opcionalmente substituido) carbonilo, carboxi, o hidroxi (opcionalmente substituido) alquilo; • Particularmente aquellos en donde R4 es (alcoxi opcionalmente substituido) carbonilo, preferentemente aquellos en donde el alcoxi es polialcoxi, o (alqueniloxi opcionalmente substituido) carbonilo, preferentemente aquellos en donde el alqueniloxi es geraniloxi. • Particularmente aquellos en donde R4 es (amino opcionalmente substituido) carbonilo, preferentemente aquellos en donde el amino está substituido con alquilo opcionalmente substituido, especialmente hidroxialquilo, o en donde el amino es una amina cíclica. Preferentemente aquellos en donde R4 es morfolin-l-il-carbonilo; bis- (2-hidroxi-etil) -amida, 2-hidroxi-etil-amida, ácido carboxílico; éster metílico del ácido carboxílico; éster 3, 7-dimetil-octa-2, 6-dienílico del ácido carboxílico; éster [2- (2-metoxi-etoxi) -etoxi]etílico; y R5 es hidrógeno. • Especialmente aquellos en donde R4 son hidroxi (opcionalmente substituido) alquilo • Particularmente en donde R4 es hidroximetilo, l-hidroxi-2-morfolinil-4-il etilo o 6-hidroxi-3-metil-[1, 3]oxazinan-6-ilo . • Los compuestos de cualquiera de la Fórmula I en donde R y R1 con los átomos a los cuales los mismos están fijados forman un anillo opcionalmente substituido · Especialmente aquellos en donde R y R1 con los átomos a los cuales los mismos están fijados forman un anillo de furano substituido con un anillo de fenilo no substituido o con un anillo de fenilo substituido, en donde uno o más substituyentes son seleccionados independientemente de alquilo, alquenilo, halo alquilo, hidroxi, alcoxi, carboxi, éster, haloalquilo, y halo. Los compuestos . preferidos para su uso en la invención incluyen los siguientes, asi como sus estereoisómeros, sales, y mezclas de los mismos (cuando sea apropiado) : (5-Hidroxi-3, 6, 7-trimetil-benzofuran-2-il ) -fenil-metanona; (5-Hidroxi-6, 7-dimetil-benzofuran-2-il) -morfolin-4-il-metanona; 1- (5-Hidroxi-6, 7-dimetil-benzofuran-2-il) -etanona; Ester 2- (2-bromo-acetil) -6, 7-dimetil-benzofuran-5-ílico del ácido acético; 2- ( l-Hidroxi-2-morfolin-4-il-etil) -6, 7-dimetil-benzofuran-5-ol; Ester 6, 7-dimetil-2- (2-morfolin-l-il-acetil ) -benzofuran-5 ilico del ácido acético; Ester 2- ( 6-hidroxi-3-metil-[l, 3]oxazinan-6-il) -6, 7-dimetil benzofuran-5-ilico del ácido acético; 1- (5-Hidroxi-6, 7-dimetil-benzofuran-2-il) -2-morfolin-4-il-etanona; 1- (4-Bromo-5-hidroxi-6, 7-dimetil-benzofuran-2-il) -etanona; 2-Hidroximetil-6, 7-dimetil-benzofuran-5-ol ; 6, 7-Dimetil-3-fenil-benzófuran-5-ol ; 6, 7-dimetil-2- (4-nitro-fenil) -benzofuran-5-ol ; 5-Hidroxi-6, -dimetil-benzofuran-2-carbaldehido; 4- (5-hidroxi-6, 7-dimetil-benzofuran-2-il) -benzonitrilo; Acido 5-hidroxi-6, 7-dimetil-benzofuran-2-carboxí lico; Ester metílico del ácido 5-hidroxi-6, 7-dimetil-benzofuran-2 carboxílico; Ester 3, 7-dimetil-octa-2, 6-dienílico del ácido 5-hidroxi-6, 7 dimetil-benzofuran-2-carboxílico ; Bis- (2-hidroxi-etil) -amida del ácido 5-hidroxi-6, 7-dimetil benzofuran-2-carboxílico ; Ester 2-[2- (2-metoxi-etoxi) -etoxi]-etílico del ácido 5 hidroxi-6, 7-dimetil-benzofuran-2-carboxílico; (2-Hidroxi-etil) -amida del ácido 5-hidroxi-6, -dimetil benzofuran-2-carboxílico; 3- (4-Metoxi-fenil) -6, 7-dimetil-benzofuran-5-ol ; 3- (4-Cloro-fenil) -6, 7-dimetil-benzofuran-5-ol ; 3- (4-Fluoro-fenil) -6, 7-dimetil-benzofuran-5-ol ; 4, 5-Dimetil-l, 8-difenil-benzo[l , 2-b; 4 , 3- ' ]difurano; 1, 8-Bis- (4-fluoro-fenil) -4, 5-dimetil-benzo[l , 2-b; 4, 3-b']difurano; y 1, 8-Bis- (4-metoxi-fenil) -4, 5-dimetil-benzo[l , 2-b; 4, 3-b ' ]difurano . Utilidad, Prueba y Administración Utilidad General Los compuestos, composiciones/formulaciones y métodos de la presente invención son útiles en el tratamiento de un número de trastornos, particularmente aquellos caracterizados por tensión oxidante y/o inflamación. En particular, los compuestos de la presente invención pueden ser utilizados en el . tratamiento de isquemia cerebral ("apoplejía"), isquemia de miocardio (infarto de miocardio y otras formas de enfermedad del corazón) , diabetes, enfermedad renal, síndrome pre-menstrual, asma, trastornos inflamatorios cardiopulmonares, insuficiencia cardiaca crónica, artritis reumatoide, fatiga muscular, claudicación intermitente y para la preservación del tejido de aloinjerto para trasplante. Los compuestos de la presente invención también han mostrado utilidad en la reducción de la proteína C reactiva (CRP) asociada con la inflamación y/o condiciones inflamatorias incluyendo enfermedades o trastornos cardiovasculares, tales como fibrilación atrial, angina inestable, enfermedad de las arterias coronarias, enfermedad de las arterias periféricas, vasculopatia de aloinjerto cardiaco (CAVD) , mastitis, preclampsia, condiciones inflamatorias del intestino, apoplejía, infarto del tejido, lumbosciática, terapia de reemplazo de las hormonas de estrógeno/progestina (HRT) , infección (bacteriana, viral y por protozoarios) , meningitis bacteriana, trauma, cirugía, implantes biomateriales, fumar, obesidad, enfermedades neurodegenerativas tales como Alzheimer, enfermedades infecciosas, tales como, por ejemplo miocarditis, cardiomiopatía, endocarditis aguda o pericarditis, ateroesclerosis, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS) /sepsis, síndrome de tensión respiratoria del adulto (ARSD) , asma, artritis reumatoide, osteoartritis, lupus eritematoso sistémico, hiper-sensibilidad de las vías superiores (AHR) , hiper-reactividad bronquial, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) , insuficiencia cardiaca congestiva (CHF) , complicaciones inflamatorias de la diabetes mellitus del tipo I y II, síndrome metabólico, enfermedad renal de la etapa final (ESRD) , síndrome pre-menstrual (PMS) o fatiga muscular o inflamación, síndrome de disfunción de órganos múltiples (MODS) , hiper-sensibilidad de las vías superiores (AHR) , hiper-reactividad bronquial, envejecimiento, reacciones alérgicas agudas, enfermedad periodontal, tales como gingivitis y condiciones dérmicas incluyendo condiciones inflamatorias de la piel. Los compuestos, formulaciones y métodos de la presente invención son útiles en el tratamiento de varias condiciones dermatológicas, incluyendo pero sin estar limitado a la prevención y protección del tejido de la piel contra el daño relacionado con la edad y el daño que resulta de los ataques tales como de la radiación ultravioleta (UV) perjudicial, tensión y fatiga. Tales compuestos, formulaciones y métodos son útiles de manera semejante en el cuidado del cabello y los tratamientos del cuero cabelludo, por ejemplo por la incorporación en champús medicados, acondicionadores anhidros del cabello y semejantes. Tales compuestos, formulaciones y métodos son útiles de manera semejante en la reducción del crecimiento del cabello. Por ejemplo, la exposición a la luz del sol puede plantear un número de riesgos para la piel. El riesgo a corto plazo principal de la exposición prolongada a la luz del sol es el eritema, es decir, las quemaduras solares, las cuales resultan principalmente de la radiación UVB que tiene una longitud de onda desde aproximadamente 290 nm hasta aproximadamente 320 nm. A largo plazo, sin embargo, tal exposición prolongada puede provocar frecuentemente que ocurran cambios malignos en la superficie de la piel. Los estudios epidemiológicos demuestran una relación fuerte entre la exposición a la luz del sol y el cáncer de la piel humana. Otro riesgo a largo plazo de la radiación ultravioleta es el envejecimiento prematuro de la piel, el cual es provocado principalmente por la radiación UVA que tiene una longitud de onda desde aproximadamente 320 nm hasta aproximadamente 400 nm. Esta condición está caracterizada por arrugas y cambios de pigmentación de la piel, en compañía de otros cambios físicos tales como fisuras, telangiectasis , dermatosis solares, equimosis, y pérdida de elasticidad. Los individuos, particularmente aquellos que tienen piel delgada que se quema fácilmente y se broncea pobremente, que han tenido un gran trato de exposición al sol de niños, pueden mostrar las siguientes alteraciones cutáneas grandes en la vida de adulto posterior: arrugas, piel con aspecto de cuero, amarillez, aflo amiento, enrojecimiento, resequedad, manchado (hiperpigmentación) y varios crecimientos premalignos (frecuentemente subclínicos) . Estos efectos acumulativos de la luz del sol son referidos frecuentemente como "fotoenvejecimiento" . Aunque la degradación anatómica de la piel es más avanzada en los ancianos, los efectos destructivos de la exposición excesiva a la luz del sol son fácilmente evidentes por la segunda década. Varias alteraciones microscópicas de la epidermis y la dermis ocurren décadas antes que estas lleguen a ser clínicamente visibles. Las arrugas, amarillez, piel con tacto de cuero y pérdida de elasticidad son cambios muy tardíos. Las composiciones de la presente invención son útiles para la regulación del crecimiento del cabello del cuerpo y/o de la cabeza, particularmente para la reducción del crecimiento del cabello. La composición debe ser aplicada al área del cuerpo en donde se desea inhibir el crecimiento del cabello. Típicamente, la composición puede ser aplicada a la cara, particularmente al área de la barba de la cara, es decir, la mejilla, cuello, labio superior, y la barbilla. La composición también puede ser aplicada a las piernas, brazos, torso y axilas. La composición es particularmente adecuada para el tratamiento del hirsutismo. En los seres humanos la composición debe ser aplicada una vez o dos veces al día, o aún más frecuentemente, durante al menos tres meses para lograr una reducción percibida en el crecimiento del cabello. Oras condiciones de la piel que pueden beneficiarse de los métodos de la presente invención incluyen, pero no están limitados a, salpullido por roce con pañal, una forma común de dermatitis de contacto e irritación que ocurre en los infantes, así como adultos, quienes usan pañales. La Patente U.S. No. 6,211,186, incorporada aquí para referencia, describe las etiologías y métodos posibles de tratamiento de esta condición. Se piensa generalmente que una o más enzimas fecales y lipolíticas, asi como amoníaco, bacterias, pH de la orina, sobrehidratación y Candida albicans pueden estar involucrados en el inicio de irritación de la piel e inflamación asociadas con el salpullido por el roce con el pañal. También es probable que las respuestas fisiológicas de la piel a los irritantes, tales como la producción de citocinas por los queratinocitos, contribuyan a la aparición resultante de eritema, pápulas, formación de escamas y ulceración características de la condición. Además, las composiciones y métodos de la presente invención pueden ser útiles en el tratamiento del acné, una condición de la piel caracterizada por un componente inflamatorio profundo, y la irritación que incluye la irritación inducida por retinoides. Las composiciones de la presente invención también son útiles para la regulación de la condición de la piel, incluyendo discontinuidades visibles y/o táctiles en la piel (especialmente en la superficie de la piel; tales discontinuidades son indeseables generalmente) . Tales discontinuidades pueden ser inducidas o provocadas por factores internos y/o externos, e incluyen las señales de envejecimiento de la piel descritas aquí. Las discontinuidades visibles incluyen trastornos de pigmentación. Las composiciones de la presente invención son útiles para la regulación de las señales de envejecimiento de la piel, especialmente discontinuidades visibles y/o táctiles en la textura de la piel asociadas con envejecimiento. Se va a entender que la presente invención no va a estar limitada a la regulación de las "señales de envejecimiento de la piel" que surgen debido a los mecanismos mencionados anteriormente asociados con el enve ecimiento de la piel, pero está propuesta para incluir la regulación de tales señales sin importar su mecanismo de origen.
Prueba Esta sección describe como las composiciones que incorporan las composiciones de la presente invención son seleccionadas, utilizando modelos de animal in vitro y/o in vivo, por ejemplo, y utilizados como intervenciones terapéuticas en tres indicaciones ejemplares, es decir, apoplejía, insuficiencia cardiaca crónica e infarto de miocardio . Los ataques o traumatismos al cerebro que alteran su suministro de la sangre, como en la isquemia, o su suministro de oxígeno, como en la hipoxia (oxígeno bajo) o anoxia (nada de oxígeno) , provocan rápidamente el desequilibrio neuronal que conduce a la muerte celular (Flynn, C.J., et al, 1989, en G. Siegel et al, (Eds) , Basic Neurochemistry, Raven Press, NY) . Las investigaciones en los mecanismos ' celulares y moleculares que conducen a daño neuronal e inflamación asociados con varios tipos de isquemia cerebral pueden ser llevados a cabo en sistemas de modelos in vitro, tales como cultivos celulares primarios, que retienen las características metabólicas de las neuronas in vivo. El uso de tales modelos a base de células ha conducido a avances en la identificación de mecanismos bioquímicos que conducen a la muerte neuronal en condiciones tales como la anoxia, hipoglicemia, excitotoxicidad, y exposición a especies de oxígeno reactivas. Las líneas celulares neuronales tales como la línea celular de feocromocitoma, PC12, también son modelos útiles para estudiar los efectos de la tensión oxidante sobre la estructura y función de las proteínas específicas de las neuronas que son expresadas en las líneas celulares. Como muchas líneas celulares neuronales no expresan todas las propiedades de las neuronas genuinas, los cultivos neuronales primarios son utilizados ampliamente ahora como modelos in vitro en los cuales se averiguan los procesos que ocurren en el cerebro intacto. Los modelos in vitro de la isquemia se aproximan a la privación de oxígeno y glucosa que minimizan las condiciones in vivo, por ejemplo, colocando cultivos neuronales en las cámaras anaeróbicas e hipóxicas grandes y el medio del cultivo de intercambio con el medio de la composición iónica definida y desoxigenada. La sobreestimulación tóxica de los receptores de glutamato neuronales, especialmente los receptores de N-metil-D-aspartato (NMDA) , contribuyen a lesiones neuronales hipóxicas-isquémicas (Choi, D.M., 1988, Neuron 1:623-634), la inducción isquémica de las especies de oxigeno reactivas (ROS) (por sus siglas en inglés) (Watson, B.D., et al, 1988, Ann NY Acad Sci., 59: 269-281), el influjo de calcio excesivo (Grotta, J.C., 1988, Stroke 19: 447-454), el incremento de ácido araquidónico (Siesjo, B.K., 1981, J. Cereb. Blood Flow Metab. 1: 155-186) y el daño del ADN (MacManus, J.P., et al, 1993, Neurosci. Lett., 164: 89-92), cada uno provocando una cascada de neurodegeneracion. Las células neuronales del hipocampo, embriónicas, primarias, son reconocidas ampliamente como útiles en los modelos de la función neuronal. El hipocampo es una fuente de población de neuronas relativamente homogénea con propiedades bien caracterizadas de. las neuronas típicas del sistema nervioso central (SNC) en general. Las neuronas piramidales, el tipo principal de célula en el hipocampo, se ha estimado que van a tener un conteo de 85% a 90% de la población neuronal total (Benker y Goslin, 1998, Culturing Nerve Cells, 2/a. edición. The MIT Press, Cambridge, Massachusetts) . El hipocampo también exhibe una capacidad notable para cambios dependientes de la actividad en la función sináptica, tales como la potenciación a largo plazo (Hawkins RD, Kandel ER, Siegelbaum ' SA. (1993) Learning to modulate transmitter reléase: themes and variations in synaptic plasticity [review], Ann. Rev. Neurosci. 16:625-665) . En experimentos llevados a cabo en apoyo de la presente invención de acuerdo con los métodos detallados en los Ejemplos, la anoxia/isquemia fue inducida en cultivos primarios de células neuronales del hipocampo, y los compuestos fueron probados para verificar su capacidad de prevenir la muerte de la célula. Los compuestos encontrados que tienen actividad en tales ensayos in vitro son probados entonces adicionalmente en uno o más modelos de animales de isquemia cerebral ( "apoplej ia" ) , tales como el modelo de oclusión de la arteria cerebral intermedia (MCAO) (por sus siglas en inglés) en ratas. Brevemente, los cultivos primarios de las neuronas del hipocampo son utilizados para probar los compuestos para verificar su actividad .en la protección neuronal. Los cultivos del hipocampo son preparados típicamente de ratas fetales de 18 a 19 días. En esta edad, la generación de neuronas piramidales, la cual empieza en la rata aproximadamente a E15, es esencialmente completa. El tejido del cerebro en esta etapa es relativamente fácil de disociar, las meninges son removidas fácilmente, y el número de células gliales todavía es relativamente modesto (Park LC, Carlingasan NY, Uchida K, Zhang H. Gibson GE. (200) Metabolic impairment elicits brain cell type-selective changes in oxidative stress and cell death in culture. J. Neurochem 74 (1) : 114-124) . Para evaluar la actividad de los compuestos de la presente invención, un compuesto de prueba es evaluado para verificar su capacidad para proteger a las células contra uno o más agentes de tensión más estándares, incluyendo hipoxia, como se detalla en los Ejemplos. En general, los agentes de los compuestos terapéuticos deseables son efectivos en este modelo a concentraciones menores que aproximadamente 1 mM y aún más preferentemente, menores que aproximadamente 100 um. Por efectivo, se entiende que tales compuestos protegen al menos 20%, preferentemente 30%, más preferentemente 40%, y aún más preferentemente 50% o más de las células probadas de la muerte inducida por agente de tensión. A manera de ejemplo, los compuestos que son efectivos en la provisión de la protección sobre una . concentración de un intervalo de aproximadamente 1 a 1000 µ? se podría esperar que proporcionaran neuroprotección in vivo. Puesto que los valores precisos pueden variar dependiendo de las condiciones especificas bajo las cuales el ensayo de la célula neuroprotectora es llevado a cabo, es el intento de la presente descripción la provisión del criterio precedente como la guía en la forma de una marca fija contra la cual comparar los compuestos probados subsiguientemente, en lugar de proporcionar concentraciones absolutas a las cuales los compuestos de la presente invención se considera que van a ser efectivos. Típicamente, los compuestos que se encuentra que van a ser neuroprotectores en tales sistemas in vitro son probados entonces adicionalmente en un modelo de animal in vivo de neuroprotección, tal como el modelo de oclusión de la arteria cerebral intermedia de la rata descrito posteriormente, u otros modelos apropiados tales como los que son bien conocidos en el arte. Los ataques isquémicos cerebrales son modelados en animales ocluyendo los vasos de, o dentro del, cráneo (Molinari, G.F., 1986, en H.J.M. Barnett, et al, (Eds.) Stroke: Pathophysiology, Diagnosis and Management, Vol. 1, Churchill Livinqstone, NY) . El modelo de oclusión de la arteria cerebral intermedia de la rata (MCAO) es una de las técnicas más utilizadas ampliamente para inducir la isquemia cerebral focal transitoria que se aproxima al daño isquémico cerebral en los seres humanos, por ejemplo, aquellos que padecen de una apoplejía. La arteria cerebral intermedia utilizada como el disparo isquémico en este modelo es el vaso más afectado en la apoplejía humana. El modelo también abarca un período de reperfusión, el cual ocurre típicamente en las víctimas de apoplejía humana. La MCAO que involucra una oclusión de dos horas se ha encontrado que comprende producir el tamaño máximo del infarto cortical que se puede obtener sin una mortalidad incrementada a las veinticuatro horas. Brevemente, el filamento de nailon es implantado en la arteria carótida derecha de la rata. Para efectuar la oclusión, la rata es anestesiada, y el filamento se hace avanzar hacia la arteria carótida interna 18-20 mm desde el punto de bifurcación de las arteria interna y externa y una sutura es ligada estrechamente alrededor del filamento durante un periodo de dos horas. Dos horas después de la oclusión, los animales son re-anestesiados, y el filamento es removido, para permitir la reperfusión durante el resto del experimento. Los fármacos de prueba pueden ser administrados cualquier tiempo durante este proceso - antes, durante, o después de la oclusión, y pueden ser administrados por uno o más de una variedad de medios, incluyendo pero sin estar limitado a la infusión intracerebroventricular (ICV), infusión intravenosa (IV), administración intraperitoneal (IP), asi como la administración enteral (por ejemplo, por cebadura) . Los animales son mantenidos normotérmicos durante el experimento, como se describe en los Ejemplos. A un tiempo pre-determinado a continuación de la oclusión y reperfusión, los animales son sacrificados y sus cerebros son removidos y procesados para la evaluación del daño como es medido por el volumen del infarto. En general, los compuestos se considera que tienen actividad en este modelo, si los mismos proporcionan una reducción significativa en el volumen del infarto total a una dosis que es menor que aproximadamente 10 mg/kg, preferentemente menor que 1 mg/kg, más preferentemente menor que 100 g/kg y aún más preferentemente menor que aproximadamente 1 g/kg, cuando se administra ICV o IV. Por reducción significativa del volumen de infarto total se entiende una reducción de al menos 20%, preferentemente de al menos 30%, más preferentemente de al menos 40%, y aún más preferentemente de aproximadamente 50%, comparado con los valores de control. La validación adicional de la eficacia en la neuroprotección puede ser evaluada en pruebas funcionales, tales como la prueba de la fuerza de sujeción o la prueba de Rotorod. Los animales tratados con los compuestos que muestran la neuroprotección mantienen sus valores de la fuerza de sujeción de pre-MCAO después de MCAO, cuando se comparan con los animales no tratados, quienes mostraron una reducción significativa en la' fuerza de sujeción, indicando una pérdida de función sensitivomotora . De manera semejante, los animales tratados con los compuestos que muestran neuroprotección también mantuvieron sus calificaciones de la actividad de Rototod pre-MCAO después de MCAO, cuando se comparan son los animales no tratados, quienes mostraron una reducción significativa en las calificaciones de Rotorod, indicando la pérdida de la función sensitivomotora a niveles del cerebro más elevados.
Dé manera semejante, los cultivos primarios de los miocitos pueden ser utilizados para compuestos de prueba in vitro para verificar su capacidad para proporcionar protección contra el daño del corazón, que resultan por ejemplo de la isquemia de miocardio o de insuficiencia congestiva del corazón. La preparación de miocardiocitos a partir de las ratas neonatales se describe en los Ejemplos. Tales células son utilizadas típicamente para estudiar los modelos moleculares de la isquemia de miocardio (Webster, KA, Discher, DJ & Bishopric, NH. 1995. J. Mol. Cell Cardiol. 27:453-458; Camilleri, L., Moins, N, Papón, J. Maublant, J. Bailly, P, de Riberolles, C & Veyre, A. 1997. Cell Biol. & Toxicol. 13:435-4^44, Bielawska, AE, Shapiro, JP, Jiang, L, Melkonyan, HS, Piot, C. Wolfe, CL, Tomei, LD, Hannun, YA & Umansky, SR. 1997. Am. J. Pathol. 151:1257-1263) y por lo tanto son aceptadas como indicativas de la actividad mioprotectora . Los ensayos de' agentes de tensión ejemplares para este propósito son provistos en los Ejemplos. Por ejemplo, los cardiomiocitos en el cultivo exhiben una actividad contráctil ("pulsante"); cada contracción de cardiomicito está asociada con una elevación en el calcio intracelular llamada "un valor transitorio del calcio". Estos valores transitorios del calcio pueden ser medidos utilizando Fluo-4, un tinte fluorescente el cual exhibe una incrementos de intensidad de fluorescencia grandes durante la aglutinación del calcio. Este ensayo está basado en las células y prueba la capacidad de las moléculas citoprotectoras potenciales para proteger contra el daño isquémico y permite que las células mantengan su función contráctil . La validación adicional de los compuestos puede ser llevada a cabo en un ensayo completo de los órganos, tales como el modelo de corazón aislado (Langendorff ) de la función cardiaca. De manera semejante, los compuestos pueden ser validados adicionalmente en modelos de la enfermedad de animales, adicionales (por ejemplo, diabetes, insuficiencia renal, asma, fatiga muscular, inflamación), tales como los que son bien conocidos en el arte. Esta sección describe como las composiciones que incorporan las composiciones de la presente invención son seleccionados, utilizando modelos de animales in vitro e in vivo y utilizados como intervenciones terapéuticas en indicaciones dermatológicas. Un número de ensayos de selección de células para los mediadores de la respuesta inflamatoria son bien conocidos en el arte. Tales mediadores incluyen pero no están limitados a las citocinas inflamatorias, interleucina- 1. beta , y el factor alfa de la necrosis del tumor (TNF.alfa) . Otras moléculas han sido reportadas para su uso como marcadores de la inflamación, incluyendo por ejemplo, la proteína C reactiva (CRP) , ciertas moléculas de adhesión, y proteínas tales como leucotrieno, tromboxano e isoprostano. La evaluación in vitro de la actividad antiinflamatoria puede ser determinada por los ensayos bien caracterizados tales como el ensayo de producción de selectina E (ELAM) o el ensayo de CRP e emplificado en el Ejemplo 9, y la evaluación in vivo puede ser determinada por el ensayo del edema de la pata inducida por carrageenina . El ensayo de ELAM mide la actividad de los compuestos de prueba en la reducción de la expresión de ELAM en las células endoteliales activadas. Brevemente, las células endoteliales son activadas agregando activadores conocidos tales como lipopolisacáridos, TNF, o IL-l.beta, solos o en alguna combinación. Las células activadas producen ELAM, la cual puede ser medida utilizando, por ejemplo, un ensayo de ELISA a base del anticuerpo monoclonal de E-selectina. En los estudios llevados a cabo en apoyo de la presente invención, se redujo la producción de ELAM. La evaluación in vivo de la actividad anti-inflamatoria como se describió en Ejemplo 10, puede ser determinada por un ensayo bien caracterizado. (Gabor, M. Mouse Ear Inflawmation Models and their Pharmacological Applications, 2000) . El Edema de la Pata Inducida por Carrageenina es un modelo de inflamación, el cual provoca la formación de edema dependiente del tiempo a continuación de la administración de carrageenina en la superficie interplantar de la pata de la rata. La aplicación de ácido araquidónico (AA) a las orejas de ratones produce vasodilatación inmediata y eritema, seguido por el desarrollo abrupto del edema, el cual es máximo en el intervalo de 40 a 60 minutos. El inicio del edema coincide con las extravasaciones de proteina y leucocitos. Después de una hora, el edema languidece rápidamente y las células inflamatorias dejan el tejido de modo que a las 6 horas, las orejas han regresado casi a la normalidad. Estos ensayos, respectivamente, miden una capacidad de los compuestos de prueba para tratar estos procesos de inflamación por medio de rutas de administración sistémicas y tópicas. La actividad citoprotectora para la piel puede ser evaluada en el cultivo celular utilizando el Modelo de Epidermis de la Piel (EPI-100) de la Mattek Corporation de Ashland, Mass., como se describe en el Ejemplo 7. Los cultivos celulares del prepucio neonatal son cultivados de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y son ensayados para verificar la viabilidad celular porcentual midiendo la cantidad de tinte de bromuro de 3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -2, 5-difeniltetrazolio (MTT) tomado por las células. La actividad con respecto a la inhibición del crecimiento del cabello se describe en el Ejemplo 8. Administración Los compuestos de la Fórmula I son administrados a una dosificación efectiva terapéuticamente, por ejemplo, una dosificación suficiente para proporcionar el tratamiento para los estados de enfermedad descritos previamente. La administración de los compuestos de la invención o las sales de los mismos farmacéuticamente aceptables puede ser por medio de los modos aceptados de administración para los agentes que sirven o que proporcionan utilidades semejantes. Aunque los niveles de dosificación humana todavía no han sido optimizados para los compuestos de la invención, generalmente, una dosis diaria es desde aproximadamente 0.01 hasta 2.0 mg/kg de peso corporal, preferentemente de manera aproximada 0.1 hasta 1.5 mg/kg de peso corporal, y aún más preferentemente de manera aproximada 0.3 hasta 1.0 mg/kg de peso corporal. Así, para la administración a una persona de 70 kg, el intervalo de dosificación podría ser de aproximadamente 0.7 hasta 140 mg por día, preferentemente de manera aproximada 7.0 .hasta' 105 mg por día, y aún más preferentemente de manera aproximada 21 hasta 70 mg por día. La cantidad del compuesto activo administrado dependerá, por supuesto, del sujeto y el estado de enfermedad que es tratada, la severidad de la aflicción, la manera y el programa de administración y el juicio del médico de prescripción. Las composiciones de la presente invención son adecuadas para proporcionar protección contra los efectos perjudiciales de la radiación ultravioleta, preferentemente en los productos de cuidado personal. Más preferentemente, las composiciones de la presente invención son adecuadas para su uso como filtros solares para proporcionar protección a la piel humana de los efectos perjudiciales de la radiación UV, los cuales incluyen, pero no están limitados a, quemaduras solares y envejecimiento prematuro de la piel. La presente invención por lo tanto también se refiere adicionalmente a métodos de protección de la piel humana de los efectos per udiciales de la radiación UV. Tales métodos involucran generalmente la atenuación o reducción de la cantidad de radiación UV que alcanza la superficie de la piel. En el caso de la presente invención, los métodos de tratamiento para los efectos perjudiciales de la radiación ultravioleta también incluyen la administración de una composición de la invención después que la exposición a la radiación ultravioleta ya ha sido llevada a cabo. Para proteger la piel de la radiación UV, una cantidad segura y efectiva (fotoprotectora) de la composición es aplicada típicamente a la piel. "Aplicación tópica" se refiere a la aplicación de las presentes composiciones por dispersión, rociado, etc, sobre la superficie de la piel. La cantidad exacta aplicada puede variar dependiendo del nivel de la protección de rayos UV deseada. Desde aproximadamente 0.5 mg de la composición por centímetro cuadrado de la piel hasta aproximadamente 25 mg de la composición por centímetro cuadrado de la piel son cuadrado de' la piel son aplicados típicamente. Los compuestos y métodos de la invención pueden ser empleados en cualquier aplicación del cuidado de la piel en donde es deseable la respuesta inflamatoria reducida. Por ejemplo, los compuestos y composiciones de la invención pueden ser incorporados en preparaciones contra el acné que se dejan puestas y luego se enjuagan completamente, leches y acondicionadores faciales, geles para ducha, limpiadores faciales formadores de espuma y no formadores de espuma, cosméticos, lociones para las manos y el cuerpo, humectantes que se dejan puestos, toallas limpiadoras y cosméticas, ungüentos para zumaque venenoso, varicela, o prurito, o semejantes. En general, para aplicaciones dérmicas, la administración tópica es preferida; sin embargo, la administración sistémica, como se describe aquí en otra parte, también es posible. Las composiciones dé la presente invención también pueden ser utilizadas en composiciones cosméticas. Las composiciones cosméticas de la presente invención son adecuadas idealmente para su uso en el tratamiento de la piel y los labios, especialmente en la forma de un lápiz para labios o bálsamo para los labios, para aplicar a los labios un color permanente o semi-permanente, idealmente con un brillo o acabado lustroso. Las composiciones cosméticas también pueden ser utilizadas en el tratamiento de la piel y/o los labios con un agente para el cuidado de la piel para la protección contra la exposición a condiciones ambientales adversas, incluyendo el viento y la lluvia, medios ambientes secos y/o calientes, contaminantes ambientales (por ejemplo, ozono, humo, y semejantes), o exposición a dosis excesivas de la luz del sol. Las composiciones también son útiles en la provisión de la protección del sol, humectación y/o acondicionamiento del cabello y de la piel, tacto mejorado de la piel, regulación de la textura de la piel, reducción de las línea finas y arrugas, reducción del brillo aceitoso sobre la piel o el cabello, iluminación de la piel y reducción del olor de la piel o el cabello. Las composiciones cosméticas pueden ser aplicadas de acuerdo con esto a la piel y/o los labios de la manera tradicional con o sin un sujetador o aplicador convencional para proporcionar una película decorativa y/o protectora a la misma . En el empleo de los compuestos de esta invención para el tratamiento de las condiciones anteriores, se puede utilizar cualquier modo farmacéuticamente aceptable de administración. Los compuestos de la fórmula I pueden ser administrados ya sea solos o en combinación con otros excipientes farmacéuticamente aceptables, incluyendo formas de dosificación sólidas, semi-sólidas, líquidas o en aerosol, tales como, por ejemplo, tabletas, cápsulas, polvos, líquidos, suspensiones, supositorios, aerosoles o semejantes. Los compuestos de la fórmula I también pueden ser administrados en formas de dosificación de liberación controlada o sostenida, incluyendo, inyecciones de depósito, bombas osmóticas, pildoras, parches transdérmicos (incluyendo electrotransporte) , y semejantes, para la administración prolongada del compuesto a una velocidad predeterminada, preferentemente en formas de dosificación unitaria adecuadas para la administración única de dosificaciones precisas. Las composiciones típicamente incluirán un portador o excipiente farmacéutico convencional y un compuesto de la fórmula I o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable. Además, estas composiciones pueden incluir otros agentes medicinales, agentes farmacéuticos, portadores, adyuvantes, y semejantes, incluyendo, pero sin estar limitado a anticoagulantes, disolvedores de coágulos sanguíneos, mejoradores de la permeabilidad y formulaciones de liberación lenta. En general, dependiendo del modo de administración propuesto, la composición aceptable farmacéuticamente contendrá aproximadamente 0.1% hasta 90%, preferentemente de manera aproximada 0.5% hasta 50%, en peso de un compuesto o sal de la fórmula I, el resto son excipientes farmacéuticos adecuados, portadores, etc. Una manera preferida de administración para las condiciones detalladas anteriormente es la oral, usando un régimen de dosificación diaria conveniente el cual puede ser ajustado de acuerdo con el grado de aflicción. Para tal administración oral, una composición no tóxica, farmacéuticamente aceptable, es formada por la incorporación de cualquiera de los excipientes empleados normalmente, tales como, por ejemplo, manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, talco, celulosa, croscarmelosa de sodio, glucosa, gelatina, sucrosa, carbonato de magnesio, y semejantes. Tales composiciones toman la forma de soluciones, suspensiones, tabletas, tabletas dispersables, pildoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación sostenida y semejantes. Preferentemente, las composiciones tomarán la forma de una pildora o tableta y por consiguiente la composición contendrá, en compañía del ingrediente activo, un diluyente tal como la lactosa, sucrosa, fosfato de dicalcio, o semejantes; un lubricante tal como estearato de magnesio o semejantes; y un aglutinante tal como almidón, goma de acacia, polivinilpirrolidina, gelatina, celulosa y derivados de los mismos, y semejantes. Las composiciones administrables farmacéuticamente, líquidas, pueden ser preparadas, por ejemplo, disolviendo, dispersando, etc., un compuesto activo como se definió anteriormente y adyuvantes farmacéuticos opcionales en un portador, tal como, por ejemplo, agua, solución salada, dextrosa acuosa, glicerol, glicoles, etanol, y semejantes, para formar por medio de esto una solución o suspensión. Si se desea, la composición farmacéutica que va a ser administrada también puede contener cantidades menores de substancias auxiliares no tóxicas tales como agentes humectantes, agentes emulsificantes , o agentes solubilizantes, agentes amortiguadores del pH y semejantes, por ejemplo, acetato de sodio, citrato de sodio, derivados de ciclodextrina, monolaurato de sorbitán, acetato de trietanolamina, oleato de trietanolamina, etc. Los métodos actuales de preparación de tales formas de dosificación ya son conocidos, o serán evidentes, para aquellos expertos en este arte; por ejemplo, véase Remington ' s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 15/a. edición, 1975. La composición o formulación que va a ser administrada, en cualquier caso, contendrá una cantidad del compuesto activo en una cantidad efectiva para aliviar los síntomas del sujeto que es tratado. Las formas de dosificación o las composiciones que contienen el ingrediente activo en el intervalo de 0.005% hasta 95% con el resto compuesto del portador no tóxico, pueden ser preparadas . Para administración oral, una composición no tóxica aceptable farmacéu icamente es formada por la incorporación de cualquiera de los excipientes empleados normalmente, tales como, por ejemplo, los grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, talco, derivados de celulosa, croscarmelosa de sodio, glucosa, sucrosa, carbonato de magnesio, sacarina de sodio, talco y semejantes. Tales composiciones toman la forma de soluciones, suspensiones, tabletas, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación sostenida, y semejantes. Tales composiciones pueden contener 0.01%-95% del ingrediente activo, preferentemente 0.1-50%. Para una forma de dosificación sólida, la solución o suspensión, por ejemplo en carbonato de propileno, aceites vegetales o triglicéridos, es encapsulada preferentemente en una cápsula de gelatina. Tales soluciones de diéster, y la preparación y encapsulación de las mismas, se describen en las patentes U.S. Nos. 4,328,245; 4,409,239; y 4,410,545. Para una forma de dosificación liquida, la solución, por ejemplo en un polietilenglicol, puede ser diluida con una cantidad suficiente de un' portador liquido aceptable farmacéuticamente, por ejemplo agua, que va a ser medida fácilmente para la administración. Alternativamente, las formulaciones orales liquidas o semi-liquidas pueden ser preparadas disolviendo o dispersando el compuesto activo o la sal en aceites vegetales, glicoles, triglicéridos, ésteres de propilenglicol (por ejemplo carbonato de propileno) y semejantes, y encapsulando estas soluciones o suspensiones en envolturas de cápsulas de gelatina suave o dura. Otras formulaciones útiles incluyen aquellas descritas en las patentes U.S. Nos. Re. 28,819 y 4,358,603. La formulación pueden ser administrada en una forma de dosificación unitaria única para el tratamiento continuo o en una forma de dosificación unitaria única ad libitum cuando el alivio de los síntomas sea requerido específicamente. Por ejemplo, la formulación puede ser administrada como un bolo o como una infusión intravenosa continua después del inicio de los síntomas de apoplejía, infarto de miocardio o insuficiencia cardiaca crónica. La administración parenteral está caracterizada generalmente por inyección, ya sea subcutánea, intramuscular o intravenosamente. Las substancias inyectables pueden ser preparadas en las formas convencionales, ya sea como soluciones o suspensiones líquidas, formas sólidas adecuadas para solución o suspensión ' en un líquido previo a la inyección, o como emulsiones. Los excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, solución salada, dextrosa, glicerol, etanol o semejantes. Además, si se desea, las composiciones farmacéuticas que van a ser administradas también pueden contener cantidades menores de substancias auxiliares no tóxicas tales como agentes humectantes o emulsificantes, agentes amortiguadores del pH, mejoradores de la solubilidad, y semejantes, tales como por ejemplo, acetato de sodio, monolaurato de sorbitan, oleato de trietanolamina, ciclodextrinas, etc. Un enfoque contemplado más recientemente para la administración parenteral emplea el implante de un sistema de liberación lenta o de liberación sostenida, de tal modo que un nivel constante de dosificación sea mantenido. Véase por ejemplo, la Patente U.S. No. 3,710,795. El porcentaje del compuesto activo contenido en tales composiciones parenterales es altamente dependiente de la naturaleza especifica del mismo, asi como de la actividad del compuesto y de las necesidades del sujeto. Sin embargo, los porcentajes del ingrediente activo de 0.01% hasta 10% en solución se pueden emplear, y serán más elevadas si la composición es un sólido el cual será diluido subsiguientemente hasta los porcentajes anteriores. Preferentemente la composición comprenderá 0.2-2% del agente activo en solución. Las soluciones . nasales del compuesto activo solas o en combinación con otros excipientes farmacéuticamente aceptables, también pueden ser administradas. Las formulaciones del compuesto activo o la sal también pueden ser administradas al tracto respiratorio como un aerosol o solución para un nebulizador, o como un polvo microfino para insuflación, solo o en combinación con un portador inerte tal como lactosa. En tal caso, las partículas de la formulación tienen diámetros de menos de 50 micrones, preferentemente de menos de 10 micrones. Las formulaciones dermatológicas de la presente invención comprenden típicamente un derivado citoprotector de cualquiera de la Fórmula I y opcionalmente, un solvente polar. Los solventes adecuados para su uso en las formulaciones de la presente invención incluyen cualquier solvente polar capaz de disolución del derivado citoprotector. Los solventes polares adecuados incluyen: agua, alcoholes (tales como etanol, alcohol propílico, alcohol isopropí lico, hexanol, y alcohol bencílico) ; polioles (tales como propilenglicol, polipropilenglicol, butilenglicol, hexilenglicol, maltitol, sorbitol, y glicerina) ; y pantenol disuelto en glicerina, aceites saborizantes y mezclas de los mismos. También se pueden utilizar mezclas de estos solventes. Los solventes polares ejemplares son alcoholes polihídricos y agua. Los ejemplos de los solventes preferidos incluyen glicerina, pantenol en glicerina, glicoles tales como propilenglicol y butilenglicol, polietilenglicoles, agua y mezclas de los mismos. Loa solventes polares preferidos adicionales para su uso son alcoholes, glicerina, pantenol, propilenglicol, butilenglicol, hexilenglicol y mezclas de los mismos. Típicamente, las formulaciones de la presente invención comprenderán desde aproximadamente 0.1% hasta aproximadamente 80%, preferentemente desde aproximadamente 0.5% hasta aproximadamente 60%, más preferentemente desde aproximadamente 1% hasta aproximadamente 30% y aún más preferentemente desde aproximadamente 3% hasta aproximadamente 18% del solvente polar. También se puede agregar un emoliente a las composiciones cosméticas/dermatológicas de la presente invención. El componente emoliente puede comprender grasas, aceites, alcoholes grasos, ácidos grasos y ésteres los cuales ayudan a la aplicación y adhesión, producen brillo y de manera más importante proporcionan la humectación oclusiva. Los emolientes adecuados para su uso son los derivados de ácido isosteárico, palmitato de isopropilo, aceite de lanolina, dimerato de diisopropilo, aceite de soya tratado con maleato, palmitato de octilo, isostearato de isopropilo, lactato de cetilo, ricinoleato de cetilo, acetato de tocoferilo, alcohol de lanolina acetilado, acetato de cetilo, fenil trimeticona, oleato de glicerilo, linoleato de tocoferilo, glicéridos del gérmen de trigo, propionato de araquidilo, lactato de miristilo, oleato de decilo, ricinoleato de propilenglicol , lanolato de isopropilo, tetraestearato de pentaeritritilo, dicaprilato/dicaprato de neopentilglicol, coco-glicéridos hidrogenados, isononanoato de isononilo, isononanoato de isotridecilo, miristato de miristilo, citrato de triisocetilo, alcohol cetilico, octil dodecanol, alcohol oleilico, pantenol, alcohol con lanolina, ácido linoléico, ácido linolénico, esteres de sucrosa de ácidos grasos, hidroxiestearato de octilo y mezclas de los mismos. Los ejemplos de otros emolientes adecuados pueden ser encontrados en la Referencia de Bench Cosmetic, pp. 1.19-1.22 (1996), incorporada aquí para referencia. Los emolientes adecuados incluyen emulsificadores emolientes polares (tales como ásteres de poliglicerol de cadena lineal o ramificada) y emolientes no polares. El componente emoliente típicamente comprende desde aproximadamente 1% hasta aproximadamente 90%, preferentemente desde aproximadamente 10% hasta aproximadamente 80%, más preferentemente desde aproximadamente 20% hasta aproximadamente 70%, y aún más preferentemente desde aproximadamente 40% hasta aproximadamente 60%, de la composición cosmética. Por "emoliente polar", como se utiliza aquí, se entiende cualquier emulsificante emoliente que tiene al menos una porción polar y en donde la solubilidad (a 30 grados Centígrados) del compuestos derivado citoprotector en el emoliente polar es mayor que aproximadamente 1.5%, preferentemente mayor que aproximadamente 2%, más preferentemente mayor que aproximadamente 3%. Los emolientes polares adecuados incluyen, pero no están limitados a, éster de poliol y éteres de poliol como ésteres de poliglicerol de cadena lineal o ramificada y éteres de poliglicerol. Los ejemplos no limitativos de tales emolientes incluyen diisoestearato de PG3, poligliceril-2-sesquiisostearato, poligliceril-5-diestearato, poligliceril-10-diestearato, poligliceril-10-diisoestearato, monoglicéridos acetilados, ásteres de glicerol, tricaprilato/caprato de glicerol, ricinoleato de glicerilo, isostearato de glicerilo, miristato de glicerilo, linoleato de glicerilo, polialquilenglicoles tales como PEG 600, monoglicéridos, 2-monolaurina, ésteres de sorbitan y mezclas de los mismos. Por "emoliente no polar", como se utiliza aquí, se entiende cualquier emulsificante emoliente que no posee momentos eléctricos permanentes. Los emolientes no polares adecuados incluyen, pero no están limitados a, ésteres e hidrocarburos de cadena lineal o ramificada. Los ejemplos no limitativos de tales emolientes incluyen isononanoato de isononilo, isostearato de isopropilo, hidroxiestearato de octilo, dimerato de diisopropilo, aceite de lanolina, palmitato de octilo, palmitato de isopropilo, parafinas, isoparafinas, lanolina acetilada, ésteres de ácido graso de sucrosa, miristato de isopropilo, estearato de isopropilo, aceites minerales, aceites de silicona, dimeticona, alantoina, isohexadecano, isododecano, petrolato, y mezclas de los mismos. La solubilidad del compuesto en emolientes polares o no polares es determinada de acuerdo con los métodos conocidos en el arte. Los aceites adecuados incluyen ésteres, triglicéridós, hidrocarburos y siliconas. Estos pueden ser un material único o una mezcla de uno o más materiales. Los mismos normalmente comprenden desde 0% hasta aproximadamente 100%, preferentemente desde aproximadamente 5% hasta aproximadamente 90%, y más preferentemente desde aproximadamente 70% hasta aproximadamente 90% del componente emoliente . Los aceites que actúan como emolientes también imparten viscosidad, adhesión, y propiedades de deslizamiento a las composiciones cosméticas tales como los lápices de labios. Los ejemplos de los aceites adecuados incluyen triglicéridós caprílicos; triglicérido cáprico; triglicérido isosteárico; triglicérido adipico; acetato de miristilo propilenglicol; lanolina; aceite de lanolina; polibuteno; palmitato de isopropilo; miristato de isopropilo; isostearato de isopropilo; sebacato de dietilo, adipato de diisopropilo; acetato de tocoferilo, linoleato de tocoferilo; estearato de hexadecilo; lactato de etilo; oleato de cetilo; ricinoleato de cetilo; alcohol oleico; alcohol hexadecilico; hidroxiestearato de octilo; octil dodecanol; aceite de gérmen de trigo; aceites vegetales hidrogenados; aceite de ricino; petrolato; lanolinas modificadas; hidrocarburos de cadena ramificada; alcoholes y ésteres; aceite de maíz; aceite de semilla de algodón; aceite de oliva, aceite de semilla de palma; aceite de colza, aceite de cártamo; aceite de jojoba; aceite de hierba del asno; aceite de aguacate; aceite mineral; mantequilla del árbol de shea, palmitato de octilo, aceite de soya tratado con maleato, trioctanoato de glicerol, dimerato de diisopropilo, y aceites de silicona volátiles y no volátiles incluyendo fenil trimeticona. Los aceites adecuados para su uso aquí son acetilglicéridos , octanoatos, y decanoatos de alcoholes y polialcoholes, tales como aquellos de glicol y glicerol, los ricinoleatos de alcoholes y polialcoholes tales como ricinolato de cetilo, diisoestearato de PG-3, éteres de poliglicerol, ésteres de poliglicerol, triglicéridos caprílicos, triglicéridos cápricos, triglicéridos isoesteáricos, triglicéridos adipicos, fenil trimeticona, aceite de lanolina, polibuteno, palmitato de isopropilo, isostearato de isopropilo, ricinoleato de cetilo, octil dodecanol, alcohol oleilico, aceites vegetales hidrogenados, aceite de ricino, lanolinas mo'dificadas , palmitato de octilo, aceite de lanolina, aceite de soya tratado con maleato, ricinoleato de cetilo, trioctanoato de glicerilo, dimerato de diisopropilo, derivados de lanolina sintética y alcoholes de cadena ramificada, ésteres de sucrosa de ácidos grasos, hidroxiestearato de octilo y mezclas de los mismos. Preferentemente, los aceites utilizados son seleccionados de tal modo que la mayoría (al menos aproximadamente 75%, preferentemente al menos aproximadamente 80% y todavía más preferentemente al menos aproximadamente 99%) de los tipos de aceites utilizados, tienen parámetros de solubilidad que no difieren en más de aproximadamente 1 hasta aproximadamente 0.1, preferentemente desde aproximadamente 0.8 hasta aproximadamente 0.1. Un agente tensioactivo también puede ser agregado a las composiciones de la invención, para conferir propiedades de aplicación o cosméticas, benéficas. Los agentes tensioactivos adecuados para su uso son aquellos que pueden formar emulsiones y/o estructuras de asociación. El emulsificador del agente tensioactivo puede ser desde 0 % hasta aproximadamente 20 % de la formulación, preferentemente desde 0% hasta aproximadamente 15% y aún más preferentemente desde aproximadamente 1% hasta aproximadamente 10%. Los ejemplos de los emulsificadores adecuados pueden ser encontrados en la patente U.S. No. 5,085,856 de Dunphy et al; y la patente U.S. No. 5, 668, 831 de EI-Nokaly et al. Los ejemplos de otros emulsificadores adecuados se pueden encontrar en Cosmetic Bench Reference, pp. 1.22, 1.24-1.26 (1996) , la totalidad de las cuales son incorporadas aquí para referencia . También son útiles aquí los agentes tensioactivos que forman estructuras de asociación, preferentemente cristales líquidos laminares o hexagonales, a temperatura ambiente cuando son mezclados con un solvente polar. La temperatura' ambiental/temperatura de la habitación como se utiliza aquí, significa típicamente de manera aproximada 20 °C. Generalmente la temperatura ambiental puede variar desde aproximadamente 18 °C hasta aproximadamente 27 °C, preferentemente desde aproximadamente 20 °C hasta aproximadamente 25 °C, dependiendo de variables tales como la localización geográfica, es decir regiones de temperatura contra subtropicales. Una persona con experiencia en el arte es capaz de determinar fácilmente si las estructuras de asociación se forman a las temperaturas ambientales. Los agentes tensioactivos adecuados para su uso tienen generalmente un punto de Krafft en o abajo de la temperatura ambiental a aproximadamente 20 °C o generalmente en o abajo de aproximadamente 18 °C hasta aproximadamente 27 °C, preferentemente en o abajo de aproximadamente 20 °C hasta aproximadamente 25 °C. La definición del punto de Krafft es bien conocida en el arte y una persona con experiencia ordinaria en el arte puede determinar fácilmente el punto de Krafft de un agente tensioactivo . En términos generales, el punto de Krafft es el punto de fusión de las cadenas de hidrocarburos de los agentes tensioactivos. También puede ser expresado como la temperatura a la cual la solubilidad de una asociación de coloide en agua se incrementa repentinamente a causa de que la concentración crítica de micelas es excedida y se forman micelas. En la preparación de una combinación de la muestra del agente tensioactivo y el solvente polar para demostrar la capacidad para formar estructuras de asociación, el agente tensioactivo necesita ser suficientemente soluble en el solvente polar de tal modo que una estructura de asociación pueda formarse a temperatura ambiente. Una persona con experiencia ordinaria en el arte es capaz de determinar interacciones compatibles. Cualquier agente tensioactivo que forma estructuras de asociación a temperatura ambiente y es adecuado para su uso en cosméticos es adecuado para su uso aquí. Los agentes tensioactivos adecuados para su uso en cosméticos no presentan problemas dermatológicos o toxicológicos . Los agentes tensioactivos aniónicos, agentes tensioactivos no iónicos, agentes tensioactivos catiónicos, agentes tensioactivos anfotéricos y ' mezclas de los mismos son adecuados para su uso. Preferentemente los agentes tensioactivos aniónicos, agentes tensioactivos no iónicos, agentes tensioactivos catiónicos, agentes tensioactivos anfotéricos y mezclas de los mismos que tienen un punto de Krafft en o abajo de aproximadamente la temperatura ambiental, son utilizados. Más preferentemente, los agentes agentes tensioactivos no iónicos, agentes tensioactivos catiónicos, agentes tensioactivos anfotéricos y mezclas de los mismos que tienen un punto de Krafft en o abajo de aproximadamente la temperatura ambiental, son utilizados. Los agentes tensioactivos pueden ser utilizados a niveles desde aproximadamente 4% hasta aproximadamente 97%, preferentemente desde aproximadamente 5% hasta aproximadamente 95%, más preferentemente desde aproximadamente 20% hasta aproximadamente 90% y todavía más preferentemente desde aproximadamente 30% hasta aproximadamente 70% de la estructura de asociación. Las composiciones cosméticas de esta invención pueden contener uno o más materiales, aquí referidos de manera simple o colectivamente como un "agente de solidificación", que son efectivos para solidificar los materiales de base líquida particulares que van a ser utilizados en una composición cosmética. (Cuando se utilice aquí, el término "solidificar" se refiere a la alteración física y/o química del material base líquido para formar un sólido o semi-sólido a condiciones ambientales, es decir para formar una composición final que tiene una estructura física estable y puede ser depositada sobre la piel durante condiciones normales de uso) . Como es apreciado por aquellos expertos en el arte, la selección del agente de solidificación adecuado para su uso en las composiciones cosméticas dependerá del tipo particular de composición deseada, es decir, de la base de gel o cera, de la reología deseada, del material base líquido utilizado y de otros materiales que van a ser utilizados en la composición. El agente de solidificación está presente preferentemente a una concentración desde aproximadamente 0 hasta aproximadamente 90%, más preferentemente desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 50%, aún más preferentemente desde aproximadamente 5% hasta aproximadamente 40%, todavía más preferentemente desde aproximadamente 3% hasta aproximadamente 20%. Las modalidades de barra cosmética de cera de esta invención contienen preferentemente desde aproximadamente 5% hasta aproximadamente 50% (en peso) de un agente de solidificación ceroso. Por el término "agente de solidificación ceroso" como se utiliza aquí, se entiende un material de solidificación que tiene características semejantes a la cera. Tales materiales cerosos también pueden servir como emolientes. Entre' los materiales cerosos útiles aquí están las ceras de punto de fusión elevado, es decir, que tienen un punto de fusión desde aproximadamente 65 °C hasta aproximadamente 125 °C, tales como la cera de abejas, espermaceti, carnauba, baya del alurel, candelilla, montano, ozoquerita, ceresina, parafina, ceras sintéticas tales como ceras de Fisher-Tropsch, cera microcristalina, y mezclas de los mismos. La ceresina, ozoquerita, cera blanca de abeja, ceras sintéticas, y mezclas de las mismas, están entre aquellas útiles aquí que son descritas en la patente U.S. No. 4,049,792, Elsnau, expedida el 20 de septiembre de 1977, incorporada aquí para referencia en su totalidad) . Las ceras de punto de fusión bajo, que tienen un punto de fusión desde aproximadamente 37 °C hasta aproximadamente 75 °C, son preferidas para su uso en las modalidades de la barra de cera de esta invención. Las modalidades de la barra de cera de esta invención, las cuales contienen aceites de silicona volátiles como un material base líquido, preferentemente contienen desde aproximadamente 10% hasta aproximadamente 35%, más preferentemente desde aproximadamente 10% hasta aproximadamente 20% (en peso) , de una cera de punto de fusión bajo. Tales materiales incluyen ácidos grasos, alcoholes grasos, ésteres de ácidos grasos y amidas de ácidos grasos, que tienen cadenas grasas desde aproximadamente 8 hasta aproximadamente 30 átomos de carbono, y mezclas de los mismos. Los materiales semejantes a las ceras, preferidos, incluyen alcohol cetílico, ácido palmítico, alcohol estearílico, behenamida, ésteres de sucrosa de ácidos grasos sebosos, ésteres mono y diácidos grasos de polietilenglicol, y mezclas de los mismos. El alcohol estearílico, alcohol cetílico, y mezclas de los mismos, son preferidos particularmente. Adicionalmente, los ácidos grasos, alcoholes grasos, y otros materiales semejantes a la cera útiles en esta invención también son bien conocidos en el arte.
Ejemplos Las siguientes preparaciones y ejemplos se dan para hacer posible que aquellos expertos en el arte entiendan y practiquen más claramente la presente invención. Los mismos no deben ser considerados como limitativos del alcance de la invención, sino solamente ilustrativos y representativos de los mismos. Métodos de Caracterización General Los espectros de Resonancia Magnética Nuclear (RMN) (por sus siglas en inglés) fueron registrados sobre un espectrómetro Bruker DTX 300 utilizando, en la mayoría de los casos, tetrametil silano (TMS) (por sus siglas en inglés) como la referencia interna. Los espectros de masa fueron obtenidos sobre un instrumento Agilent 1100 LC/MSD utilizando ya sea ionización de electrorrociado (modo positivo o negativo) (ESI) (por sus siglas en inglés) o ionización química a presión atmosférica (modo positivo o negativo) (APCI) (por sus siglas en inglés) . Ejemplo 1 Determinación de la Actividad Utilizando el Ensayo de Tensión de la Célula neuronal A. Aislamiento y Cultivo de las Células Neuronales del Hipocampo Primarias Materiales · Neurobasal/B27i : Medio Neurobasal (Life Technologies, Rockville, MD) con suplemento 1 x B27 (Life Technologies), 0.5 µ? de L-glutamina, 25 µ? de ácido L-glutámico, y 1 x Penicilina/Estreptomicina. • La solución Salada Básica de Hank (HBSS (por sus siglas en inglés) , libre de Ca/Mg) fue preparada preparando IX Hanks CMF (Gibco) suplementada con HEPES (10 mM, pH 7.3), bicarbonato de sodio (0.35%), IX Penicilina/Estreptomicina, y piruvato 1 mM. • Poli-D-lisina (Sigma, St . Louis, MO) , 50 µg/ml de solución filtrada a través de tubos filtrantes de 0.2 um. • Sigmacote (Sigma, St . Louis, MO) . • Recipientes de Cultivo de Plástico (T75 cm2) o placas de cultivo celular de 12 cavidades tratadas con Poli-D-Lisina (Sigma, St . Louis, MO) . Preparación de las Células Neuronales del Hipocampo Primario Un ratón hembra embarazado (E18-E19) fue eutanizado con C02 previo a la remoción del útero, el cual fue colocado entonces en una caja de petri de plástico, estéril. Los embriones fueron removidos del saco, y los cerebros embriónicos fueron removidos y sumergidos en Solución Salada Amortiguada fría (4 °C) (HBSS; libre de Ca/Mg; Life Technologies) en una caja de petri pequeña. Los hipocampos fueron removidos entonces de los cerebros bajo un microscopio de disección y se colocaron sobre una caja cubierta con parafina. Las meninges fueron retiradas y los hipocampos diseccionadós fueron colectados en una caja de petri pequeña en HBSS. Los hipocampos fueron transferidos a un tubo de centrífuga de 15 mi (normalmente 10-12 cerebros) llenado con HBSS. El tubo que contiene los cerebros fue centrifugado a 1000 rpm durante 2 minutos en una centrífuga de tabla de mesa. El sobrenadante fue removido, se agregaron 2 mi de HBSS a los hipocampos en el tubo, y la suspensión resultante fue triturada 2 veces cada una con pipetas de vidrio siliconizado de punta larga que tienen aberturas progresivamente más pequeñas, partiendo de una pipeta con una abertura de tamaño estándar (de aproximadamente 1.0 mm de diámetro), siguiendo con una que tiene una abertura de tamaño medio estándar (aproximadamente de 0.5 mm de diámetro), luego con una que tiene una abertura de aproximadamente la mitad de este tamaño (0.25 mm de diámetro) . La suspensión fue centrifugada entonces nuevamente a 1000 rpm durante 2 minutos en una centrífuga de tabla de mesa, el sobrenadante fue desechado, y se agregaron 2 mi de Neurobasal/B27i (con antibióticos) al tubo. El procedimiento de trituración descrito anteriormente fue repetido entonces sobre esta suspensión. La densidad de las células fue determinada sobre una alícuota pequeña de células utilizando procedimientos de conteo estándares y corrigiendo la viabilidad celular por exclusión del tinte de azul de tripano. Utilizando este procedimiento, el rendimiento esperado es de 3 x 103 x 6 x 105 células/cerebro. Las células fueron agregadas entonces a placas de 24 cavidades recubiertas con PDL, recipientes o cajas de MetTek en Neurobasal/B27I a una densidad de aproximadamente 1.5 x 106 células (recipiente T75) o aproximadamente 70,000 células/cavidad de una placa de 24 cavidades. Las células enchapadas fueron incubadas a 37 grados en una atmósfera de 5% de C02/95% de 02. El medio fue renovado después de 3-4 días reemplazando la mitad del mismo con medio Neurobasal/B27m fresco, que contiene 5 µ? de citosina arabinosida (AraC) . Siete a ocho días desde el cultivo inicial, el medio fue renovado nuevamente, removiendo una mitad del mismo y reemplazándolo con una cantidad igual del medio Neurobasal/B27m fresco (sin Ara-C) . B. Ensayo de la Muerte de las Células por Anoxia-Reoxigenación del Hipocampo. Este ensayo fue utilizado para inducir la isquemia por anoxia-reoxigenación en las células neuronales del hipocampo cultivadas. Los compuestos de prueba fueron agregados para evaluar la potencia y eficacia contra la lesión de las células neuronales inducidas por isquemia y la muerte celular. Materiales . • El Medio neurobasal, medio neurobasal NoG, suplemento B27 y Suplemento B27 menos AO fueron obtenidos de Invitrogen Life Technologies.
• El medio Neurobasal/B27 fue preparado 2X B27 menos el suplemento AO, 0.5 mM L-glutamina y 0.25X penicilina/estreptomicina . • El Cell Tracker Green fue obtenido de Molecular Probes y una solución 5 µ? fresca fue preparada de un material en almacenamiento 10 mM justo antes de su uso. • El LoG-Neurobasal contiene el medio NoG neurobasal más glucosa 1 mM, 0.5 mM L-glutamina, 0.25X Penicilina/Estreptomicina, y 10 mM Hepes (pH 7.4) . · las células neuronales del hipocampo primarias fueron preparadas de acuerdo con los métodos descritos anteriormente y fueron cultivadas en placas de 24 cavidades recubiertas con poli-D-lisina durante 10-11 días previo a su uso . El medio LoG-Neurobasal desoxigenado (100 mi) fue preparado por pre-equilibrio del medio en un recipiente T150 cm2 en una cámara hipóxica toda la noche. A continuación de la pre-incubación bajo condiciones hipóxicas, el medio LoG-Neurobasal fue burbujeado ligeramente con 100% N2 durante 30 minutos para desoxigenar completamente el medio. Unos 20 mi adicionales de LoG-Neurobasal fueron pre-equilibrados en un recipiente T75 cm2 y se incubaron en un incubador normal (5% C02) toda la noche. El medio reoxigenado fue preparado colocando el medio Neurobasal/B27 toda la noche en el incubador del cultivo (5% C02/95% 02) . -11 días después de la colocación en placas de las neuronas del hipocampo, el medio de cultivo existente (Neurobasal/M27m) fue removido de las células por aspiración. Las células fueron lavadas una vez con 600 µ?/cavidad (placas de cultivo de 24 cavidades) de glucosa libre de BSS. Las neuronas fueron rellenadas con LoG-Neurobasal desoxigenado (400 µ? por cavidad para cada cavidad de una placa de 24 cavidades) . Los compuestos de prueba fueron agregados directamente a cada cavidad (usualmente 3 concentraciones del compuesto más el control positivo, cada uno por triplicado) . La ' mayoría de los compuestos de prueba fueron disueltos en 100% de D SO; sin embargo, las concentraciones fueron ajustadas de tal modo que la concentración final de DMSO en el medio celular nunca excedió 0.5%. Las placas que contienen las células con los compuestos de prueba fueron colocados en una cámara hipóxica durante 4-5 horas con las cubiertas de la placa entreabiertas. Para el control de normoxia, el medio de LoG-Neurobasal normóxico pre-equilibrado fue agregado a cada cavidad de las células, y la placa fue reemplazada en el incubador de cultivo normal durante 4-5 horas. Después de 4-5 horas de hipoxia, el medio existente fue aspirado totalmente cuidadosamente, y se agregaron a cada cavidad 400 µ? del Neurobasal/B27 reoxigenado (pre-equilibrado) nuevo. Los mismos compuestos de prueba (en las mismas concentraciones) fueron agregados nuevamente en las cavidades correspondientes. Las placas fueron colocadas en el incubador del cultivo celular (5% C02/95% de 02) y se reoxigenaron durante 20-24 horas. Después de la reoxigenación durante 20-24 horas, las neuronas vivas fueron cuantificadas utilizando el método de fluorescencia verde del rastreador de células, descrito posteriormente. Para probar la viabilidad celular, el medio de cultivo existente fue aspirado de cada cavidad de las placas de 24 cavidades, y las neuronas fueron lavadas una vez con 1 mi de HBSS (pH 7.4, pre-calentado a 30-37 °C) . A cada cavidad se agregaron 500 µ? del tinte fluorescente para Cell Tracker Green disuelto en HBSS. Las placas fueron colocadas en la oscuridad a temperatura ambiente durante 15 minutos, luego se lavaron con 1 mi de HBSS. 500 µ? de HBSS fueron agregados entonces a cada cavidad, y las células fluorescentes fueron contadas utilizando un microscopio fluorescente. La viabilidad celular incrementada significativamente comparada con las células de control es indicativa de un compuesto protegido . Ciertos compuestos de la presente invención cuando se probaron como se describió anteriormente proporcionaron protección contra la muerte celular inducida por el agente de tensión en al menos aproximadamente 20% de las células probadas, a concentraciones que varían desde aproximadamente 1 hasta 1000 uM.
Ejemplo 2 Ensayo de Contractibilidad del Calcio del Miocito A. Aislamiento del Cultivo de los iocitos de Neonato Primario Materiales • La Solución de Disección del Corazón 10X (HDS) (por ¦ sus siglas en inglés) contiene los siguientes componentes (g/1) en agua del grado del tejido: NaCl 68; HEPES, 47.6; NaH2P04, 2; Glucosa, 10: KCl, 4; MgS04, 1, pH ajustado a 7.4. Previo a la esterilización del filtro de la solución diluida (1XHDS), se agregaron 10 mg de rojo de fenol a cada 500 mililitros del medio. • La transferrina y la insulina de bovino fueron obtenidas de Life Technologies, y se resuspendieron a una concentración de 4 mg/ml en el agua del grado de cultivo del tejido. • DMEM-F12 - DMEM7F12, polvo, 1:1 que contiene glutamina y clorhidrato de piridoxina fue comprado de Life Technologies. A un litro de un equivalente del polvo se agregaron 2.43 g del bicarbonato de sodio y 10 mi de la Penicilina/Estreptomicina 100X en 950 mi del agua del grado del cultivo del tejido con agitación. El pH fue ajustado a 7.2 con HC1 1 y el volumen fue ajustado a 1 litro. La solución fue esterilizada por filtración luego se agregaron 2.5 mi de Transferrina de 4 mg/ml, 250 µ? de insulina de 4 mg/ml y 30.7 mg de bromodesoxiuridina . • El DMEM-F12 también fue preparado al 4% de FBS para el pre-recubrimiento de las placas de cultivo del tejido y la suspensión inicial de la pelotilla del cardiomiocito . · La solución de colagenasa - 49 mg de colagenasa fueron resuspendidos en 120 mi de lx HDS. Preparación de los Cultivos del Miocito Neonatal Primario El recipiente de cultivo del tejido fue pre-recubierto con DMEM-F12-4%FBS por la incubación de 50 µ? por cavidad de una placa de 96 cavidades y 0.25 mi por placa de 12 cavidades a 37 °C. Las crias de rata de dos días de edad fueron removidas de sus madres y colocadas en un recipiente estéril. Las crias fueron sumergidas rápidamente en alcohol al 70%, luego decapitadas y el cuerpo fue colocado en una caja de cultivo del tejido, estéril, vacia. Se hizo una incisión empezando en el cuello y se progresa hacia el estómago, cortando a través del esternón. El corazón fue removido y colocado en cajas de cultivo del tejido gue contienen lx HDS. Los atrios fueron recortados, y los ventrículos restantes fueron colocados en una caja de cultivo del tejido separada que contiene lx HDS, en donde los mismos fueron seccionados en 3-4 piezas cada uno. Los ventrículos fueron transferidos entonces a un recipiente de vidrio de 250 mi estéril y el lx HDS fue removido. Veinte mililitros de la solución de colagenasa pre-calentada fueron agregados a los ventrículos, seguido por incubación a 37 °C con agitación. Después de 30 minutos, la solución de colagenasa fue removida y reemplazada con 20 mi de colagenasa precalentada fresca. La incubación fue continuada durante unos 30 minutos adicionales. Al final de la incubación, cualesquiera trozos del tejido se dejó que se asentaran previo a la remoción de la colagenasa (que contiene los cardiomiocitos aislados) desde las piezas de tejido alteradas. Los miocitos aislados fueron agregados a un tubo de Falcon de 50 mi que contiene 2 mi de Suero de Bovino Fetal (FBS) . Las piezas de tejido restantes fueron sometidas a una segunda digestión agregando 20 mi de colagenasa precalentada fresca y se incubaron como anteriormente durante 30 minutos. Esta segunda digestión fue entonces centrifugada a 1000 rpm durante 10 minutos (centrífuga de tabla de la mesa) . El sobrenadante resultante fue desechado, y la pelotilla de las células fue suspendida con 4 mi de FBS. La suspensión celular resultante fue colocada en el incubador a 37 °C. Esta etapa fue repetida varias veces adicionales para colectar el material adicional. Los gradientes de Percoll fueron preparados agregando 2.5 mi de lOx HDS a 22.5 mi de Percoll (Life Technologies) con mezclado (Percoll Stock) . La solución del Gradiente Superior (11 mi de Percoll Stock y 14 mi de lx HDS) y la solución del Gradiente Inferior (13 mi de Percoll Stock y 7 ral lx ' HDS) fueron preparadas. Cuatro mililitros de la solución del Gradiente Superior fueron transferidos hacia tubos de Falcon estériles de 6 x 15 mi. Tres mililitros de la solución del Gradiente Inferior fueron colocadas en cada tubo insertando una pipeta serológica en el fondo del tubo y agregando lentamente el líquido. Todas las digestiones (5) fueron agrupadas en un tubo de Falcon de 50 mi y se centrifugaron sobre una centrífuga de la tabla de la mesa a 1000 rpm durante 10 minutos. El sobrenadante fue desechado, y la pelotilla celular fue resuspendida en 12 mi de lx HDS. Dos mililitros de la suspensión celular fueron agregados a la parte superior de cada gradiente. Los tubos del gradiente fueron entonces centrifugados a 3000 rpm sin frenado en una centrífuga Beckman Allegra 6 (rotor GH 3.8A) . A continuación de la centrifugación, las células fueron segregadas en dos bandas agudas en las dos interfases.' La banda inferior de las dos bandas fue enriquecida de cardiomiocitos ; también existió una pelotilla de cardiomiocitos en el fondo del tubo. La banda superior fue enriquecida de fibroblastos y otros elementos diferentes de los cardiomiocitos. La porción superior del gradiente fue aspirada descendiendo hasta justo arriba de la capa de cardiomiocitos. La capa de cardiomiocitos fue removida entonces cuidadosamente en compañía de la pelotilla, y las dos fracciones fueron agrupadas en un tubo Falcon de 50 mi estéril, en compañía de las fracciones correspondientes del tubo de gradiente adicional; luego se agregó el lx HDS a un volumen total de aproximadamente 50 mi. El tubo fue centrifugado a 1000 rpm durante 7 minutos. El sobrenadante fue desechado y resuspendido en 25 mi lx HDS. Unos 25 mi adicionales de lx HDS fueron agregados y la etapa de centrifugación fue repetida. La pelotilla celular fue resuspendida cuidadosamente pero totalmente en 40-50 de DMEMF12-4% FBS . Una alícuota pequeña de la suspensión celular fue contada en un hemocitómetro . El medio de recubrimiento DMEM/ F12-FBS fue aspirado de los cajas de cultivo del tejido. Los cardiomiocitos fueron agregados a las cajas a una densidad en las placas de 7.5xl0 /cavidad por 96 cavidades en 200 µ? y 1.5 x 105/cavidad por 12 cavidades en 3 mi. Las células fueron incubadas a 37 °C con 5% de C02 toda la noche. El medio original fue removido, y DMEM/F12-5% FBS fresco fue agregado a cada cultivo, previo a la incubación a 37 °C con 5% de C02 durante unas 48 horas adicionales, antes del uso. Ensayo de Contractibilidad Materiales • el DMEM-Fl 2 : DMEM/ Fl2 , polvo, 1:1 completo, que contiene glutamina y clorhidrato de piridoxina fue comprado de Life Technologies (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) . Un polvo suficiente para preparar un litro de amortiguador y 2.43 g de bicarbonato de sodio fue mezclado en 950 mi del agua del grado de cultivo del tejido. El pH fue ajustado a 7.2 con HCl 1M y el agua restante fue agregada para componer 1 litro. A continuación de la esterilización por filtración, se agregaron 10 mi de 100X Penicilina/Estreptomicina, 2.5 mi de 4 mg/ml de Transferrina, 250 µ? de 4 mg/ml de insulina y 30.7 mg de bromodesoxiuridina, y la mezcla se incubó a 37 °C previo a su uso . · La Glucosa 1 m en DMEM se hizo a partir de DMEM sin L-glutamina, sin glucosa, sin piruvato de sodio, comprada de Life Technologies. • 20µ? de Fluo-4: El éster de AM permanente de la célula de Fluo-4 fue obtenido de Molecular Probes (Eugene, OR) como un polvo seco que va a ser almacenado a -20 °C. Este tinte fluorescente es sensible a la luz y debe hacerse recientemente a 1 mM en DMSO previo a su uso para prevenir la degradación por la luz. • La solución de CaCl2 10 mM se hizo fresca cada día en lx HBSS y se incubó a 37 °C previo a su uso. Los cardiomiocitos neonatales fueron aislados como se describió anteriormente. Los cardiomiocitos fueron colocados en placas en el formato de 96 cavidades (placas de fondo claro negro) a una densidad de 7.5 x 104 por cavidad y se hicieron crecer durante 2 días en la presencia de FBS al 5% previo a' su uso en el ensayo. La isquemia fisiológica fue simulada colocando los cardiomiocitos en una cámara anaeróbica (0% de 02, 85% de N2, 5% de C02 y 10% de H2) en DMEM que contiene glucosa 1 mM. Las células de control positivo son tratadas con DMEM-F12 que contiene Glucosa 25 mM, la cual protege contra la anoxia . Los compuestos de prueba se hicieron en DMEM-glucosa 1 mM en placas madres de 96 cavidades, profundas y se diluyeron apropiadamente para su uso en el ensayo. El medio fue removido de las células y lo reemplazó con 200 µ? ya sea de DMEM-F12 o DMEM 1 mM con o sin los compuestos de prueba. Las placas fueron colocadas entonces dentro del incubador a 37 °C en la cámara anaeróbica y se incubaron durante 16 horas. Las placas fueron removidas entonces y se reoxigenaron por la adición de DMEM-F12. El DMEM con o sin los compuestos de prueba es removido cuidadosamente de las células y reemplazado con DMEM-F12 pre-calentado que contiene 5% de FBS. Puesto que el tratamiento anóxico puede dañar y/o exterminar las células, provocar que las mismas se desalojen del fondo de las cavidad por la aspiración suave del medio es requerido en esta etapa. Las células fueron colocadas entonces en un incubador normal a 37 °C y se incubaron durante dos horas para permitir que las células se reoxigenaran .
Uña solución de trabajo de 20 um de Fluo-4 fue agregada a lxHBSS pre-calentado . Las células fueron cargadas con Fluo-4 removiendo primero el medio de las células y reemplazándolo con 100 µ? de Fluo-4 20 µ?. Las células de control no cargadas fueron tratadas en paralelo con lxHBSS solo. Todas las células fueron incubadas entonces a 37 °C durante 30 minutos. Antes que se hicieron las mediciones de fluorescencia, las células fueron lavadas en el medio libre del indicador (HBSS) para remover cualquier tinte que no esté asociado específicamente con la superficie celular. Las células fueron incubadas entonces durante 20 minutos adicionales a temperatura ambiente. La fluorescencia de Fluo-4 basal fue medida utilizando el par de filtros de excitación de 485 nm y de emisión de 538 nm sobre un fluorómetro de microplaca (Fluorskan™, Thermo Labsystems Oy, Helsinki, Finlandia) . Cada cavidad fue leída durante 160 ms para obtener una lectura de la línea base, luego se estimuló para que se reduzca por la adición de CaCl2 lOmM. A continuación de la incubación a 37 °C durante 30 minutos, una fluorescencia estimulada fue tomada después de 90 minutos. Los compuestos de la presente invención tales como ( 5-Hidroxi-3, 6, 7-trimetil-benzofuran-2-il ) -fenil-metanona; Ester 6, 7-dimetil-2- (2-morfolin-l-il-acetil ) -benzofuran-5-ílico del ácido acético; 2- (l-Hidroxí-2-morfolin-4-il-etil) -6, -dimetil-benzofuran-5-ol; Ester 2- (2-bromo-acetil) -6, 7-dimetil-benzofuran-5-í lico del ácido acético; 1- (5-Hidroxi-6, 7-dimetil-benzofuran-2-il ) -2-morfolin-4-il-etanona; 1- (4-Bromo-5-hidroxi-6, 7-dimetil-benzofuran-2-il ) -etanona; 1- (5-Hidroxi-6, 7-dimetil-benzofuran-2-il) -etanona; 4- (5-Hidroxi-6, 7-dimetil-benzofuran-2-il ) -benzonitrilo; 5-Hidroxi-6, 7-dimetil-benzofuran-2-carbaldehido; 2-Hidroximetil-6, -dimetil-benzofuran-5-ol; Ester metílico del ácido 5-hidroxi-6, 7-dimetil-benzofuran-2-carboxí lico; Acido 5-hidroxi-6, 7-dimetil-benzofuran-2-carboxílico; Bis- ( 2-hidroxi-etil ) -amida del ácido 5-hidroxi-6, 7-dimetil-benzofuran-2-carboxílico; Ester 2-[2- (2-metoxi-etoxi ) -etoxi]-etílico del ácido 5-hidroxi-6, 7-dimetil-benzofuran-2-carboxílico; Bis- (2-hidroxi-etil) -amida del ácido 5-hidroxi-6, 7-dimetil-benzofuran-2-carboxílico; cuando se prueban cono se describió anteriormente, muestran una protección de al menos 20% y la presencia de materiales transitorios de calcio en las cantidades indican la capacidad de protección contra el daño isquémico y permiten que las células mantengan su función contráctil.
Ejemplo 3 Modelo de Oclusión de la Arteria Cerebral Intermedia de la Rata (MCAO) de Isquemia Cerebral A. Preparación del Animal Ratas Wistar macho (Harían, IN) que pesan 300-350 g son utilizadas comúnmente en estos experimentos. A los animales se les permitió el acceso libre al agua y a una dieta de roedor comercial bajo las condiciones de laboratorio estándares. La temperatura ambiente es mantenida a 20-23 °C y la iluminación ambiental es sobre un ciclo de luz/oscuridad de 12/12 horas. Los animales son aclimatados al medio ambiente de laboratorio 5 a 7 días previo al estudio, y se mantuvieron en ayuno (con acceso libre al agua) toda la noche antes de la cirugía. B. Oclusión de la Arteria Cerebral Intermedia (MCAO) La anestesia es mantenida por inhalación de 3.0% de isoflurano (Aerrane, Front Dodge, IA) en 0.8% de oxígeno. El cuello del animal fue rasurado y esterilizado antes de la operación. Las temperaturas corporales fueron controladas y mantenidas a 37.5 °C +/- 1 grado por medio de dispositivos de calentamiento y enfriamiento externos. Para hacer bajar la temperatura del cuerpo, los animales fueron colocados en una cámara de enfriamiento, la cual utiliza hielo como el aire de circulación de enfriamiento. En todo el estudio la temperatura del cuerpo es registrada utilizando una emisor-receptor de la temperatura (BMDS Inc., Seaford, DL) implantado subcutáneamente en el tiempo de MCAO entre los omóplatos de la rata, que permite al usuario leer la temperatura del cuerpo por medio de un explorador de bolsillo (BMDS Inc., Seaford, DL) . La temperatura del cuerpo también puede ser tomada insertando la sonda de temperatura en el recto del animal. La temperatura del cuerpo es registrada cada hora durante 6 horas después de la oclusión, sin embargo, las temperaturas del cuerpo fueron tomadas más frecuentemente de modo que las mismas pudieran ser mantenidas a la temperatura normotérmica . Los animales fueron sometidos a dos horas de MCAO utilizando una técnica de filamento intraluminal modificado, como sigue: Una incisión de la linea media sobre la parte ventral del cuello se hace para exponer las arterias carótidas interna y externa. Las arterias carótidas comunes y la externa derecha son. ligadas por una sutura (seda 5/0, Carlisle Laboratories, Farmers Branch, TX) y la arteria interna derecha es ligada temporalmente utilizando una pinza microvascular (Fine Science Tool Inc., Foster City, CA) . Se hizo una incisión pequeña en la arteria carótida común. Un filamento de nailon, su punta redondeada por calentamiento, es preparada de una linea de pescar (Stren Fishing Lines, Wilmington, DE) y es insertada desde la arteria carótida común derecha. El filamento se hace avanzar hacia la arteria carótida interna 18-20 itim desde el punto de bifurcación de las arterias interna y externa y una sutura es ligada de manera ceñida alrededor del filamento. Dos horas después de la oclusión, los animales son re-anestesiados para permitir la reperfusión para el resto del experimento por la remoción del filamento. C. Administración del Fármaco Los compuestos de prueba pueden ser administrados por cualquiera de un número de rutas, tales como aquellas descritas posteriormente. Los compuestos pueden ser administrados antes, durante o después de la oclusión, como sea apropiado para el protocolo. a) Infusión intracerebroventricular (ICV) El animal anestesiado es colocado sobre un aparato estereotáxico (Harvard Apparatus, S. Natick, MA) . La anestesia es mantenida por inhalación de isoflurano al 3.0% (Aerrane, Front Dodge, IA). en 0.8% de oxigeno de principio a fin del procedimiento completo. El cuero cabelludo es afeitado y esterizado previo a la cirugía. Una incisión sagital de la línea media de aproximadamente 3 cm de longitud se hace ligeramente debajo de los ojos para exponer el cráneo. El cráneo es raspado con una espátula de extremo redondeado para remover el tejido conectivo periosteal. Un orificio de taladro es colocado 1.5 mm lateral, 1 mm posterior a la izquierda del bregma para marcar el ventrículo lateral izquierdo. Una cánula de infusión del cerebro (AZLET Co . , Palo Alto, CA) es insertada a 4 rtim de profundidad en el orificio. La profundidad deseada es ajustada fijando espaciadores a la cánula. La cánula fijada a un catéter silastic de 4 cm (Helix Medical Inc., Carpintería, CA) fijada en su lugar con cemento dental (Ketac-cement, Norristown, PA) . El catéter es ya sea fijado a una bomba osmótica cebada colocada subcutáneamente entre los omóplatos para infusión permanente o a una jeringa durante una infusión breve. b. Implante de Bomba Osmótica Intravenosa (IV) en la vena yugular La anestesia es mantenida por inhalación de isoflurano al 3.0% (Aerrane, Front Dodge, IA) en oxígeno al 0.8% de principio a fin del procedimiento completo. El cuello del animal será afeitado y esterilizado antes de la operación. Una incisión de la línea media se hace sobre la parte ventral del cuello para exponer la vena yugular. La vena es aislada y ligada con una sutura (seda 5/0, Carlisle Laboratories, Farmers Branch, TX) rostral con respecto al punto de la incisión y una pinza microvascular (Fine Science Tool Inc., Foster City, CA) cercana al corazón. Una incisión pequeña se hace entre dos ligaduras. Una catéter silastic de 2 cm (Helix Medical Inc.) fijado a un tubo PE-60 (Becton, Dickinson and Co. Sparks, MD) conectado a una bomba AZLET (AZLET CO. Palo Alto, CA) es introducido y se hace avanzar 2 mm en la' vena yugular hacia el corazón. La pinza microvascular es removida y el catéter es asegurado en su lugar con una sutura (seda 5/0, Carlisle Laboratories, Farmers Branch, TX) . La bomba es colocada en una cavidad hecha subcutáneamente entre los omóplatos, permitiendo al catéter alcanzar arriba del cuello hasta la vena yugular con suficiente holgura para permitir el movimiento libre del cuello y la cabeza. c. Infusión IV por medio de la vena femoral La anestesia es mantenida por la inhalación de isoflurano al 3.0% (Aerrane, Front Dodge, IA) en oxigeno al 0.8% de principio a fin del procedimiento completo. El sitio exterior de la vena femoral derecha es afeitado y esterilizado previo a la cirugía. Una incisión de 3 cm se hace en la región de la ingle derecha y la vena femoral es aislada. Se hace una incisión pequeña sobre la vena femoral ligada temporalmente con una pinza microvascular para introducir y hacer avanzar un catéter de polietileno (PE-50) (Becton Dickinson and Co. Sparks, MD) . El catéter es asegurado en su lugar con sutura (seda 5/0, Carlisle Laboratories, Farmers Branch, TX) . El otro extremo del catéter es fijado a una jeringa llena con la solución salada heparinizada para la inyección del bolo. Usando un hemóstato, se hace una cavidad subcutáneamente sobre la espalda del animal de modo que el catéter de PE pueda ser llevado hasta el punto de exteriorización en la nuca del cuello ya sea para una inyección del bolo o una inyección continua por una bomba osmótica. d) Inyección Intraperitoneal (IP) Una rata despierta es mantenida en una posición sujetada con la mano, estándar, una aguja 23 3/4G es inyectada en el cuarto derecho inferior del abdomen pasando el peritoneo, ligeramente descentrado de la linea media. Para evitar la inyección del órgano, el émbolo de la jeringa es jalado ligeramente hacia atrás. Si no se extrae fluido, el contenido de la jeringa es suministrado hacia la cavidad abdominal .
D. Evaluación del Comportamiento Una hora después de MCAO, el animal fue retenido suavemente por su cola y observado para la flexión de las patas delanteras. Luego el animal es colocado sobre el piso para ser observado en su ruta de caminado; solamente los animales que califican con 3 sobre el sistema de graduación de Bederson (Tabla 1) son incluidos en el estudio.
Tabla 1 Sistema de Graduación de Bederson para la Evaluación Neurológica E. Evaluación del Daño Isquémico Veinticuatro horas después de MCAO, o más tarde, en algunos experimentos, los animales fueron sacrificados por asfixia con C02 (hielo seco) . El cerebro fue removido rápidamente del cráneo, utilizando procedimientos estándares, se enjuaga en una solución salada enfriada, y se coloca sobre un rebanador del tejido del cerebro de la rata (ASI instrument, MI) . Siete tajadas de la corona de 2 mm de espesor son cortadas de cada cerebro utilizando navajas de afeitar. Las tajadas fueron sumergidas en solución salada al 0.9% que contiene cloruro de 2, 3, 5-trifeniltetrazolume al 1.0% (TTC) (Sigma Chemical Co., St . Louis, MO) y se incuba en un baño de agua a 37 °C durante 30 minutos. Después del teñido, cada tajada de 2 mm es fotografiada con una cámara TMC-7 (JH Technologies, Ca) la cual está conectada directamente a una PC de escritorio para capturar y guardar la imagen de cada tajada del cerebro. Esta imagen es utilizada para las mediciones de las regiones de interés utilizando un sistema de procesamiento de la imagen a base de computadora (Metamorph) . Para medir cada área, la región de interés es seleccionada utilizando una herramienta de selección sin el uso de las manos, el área es calculada automáticamente seleccionando el comando de medición. Las mediciones para las regiones primarias de interés son el hemisferio derecho, el hemisferio izquierdo, infartos totales, infartos subcorticales, penumbra total y penumbra subcortical. Después que todas las regiones de interés son medidas para todas las siete tajadas del cerebro, las mismas son clasificadas por el número de tajada y las regiones de interés correspondientes utilizando una estadística final llamada Excell macro . Este macro también calcula la penumbra cortical, el infarto cortical y el daño isquémico total para cada tajada; las áreas correspondientes de cada cerebro de la rata serán agregadas conjuntamente para producir una medición única para cada área. Puesto que el hemisferio ipsilateral es hinchado a continuación de MCAO, el volumen del edema es calculado y reportado como las diferencias volumétricas entre los hemisferios izquierdo y derecho de cada tajada del cerebro.
Utilizando el % de hinchamiento hemisférico todos los volúmenes serán corregidos para el edema. El volumen del daño es determinado utilizando los cálculos que se dan enseguida para cada cerebro de la rata.
F. Análisis Estadístico El tamaño de la muestra es elegido para lograr una probabilidad del 90% de resultados significativos. Las mediciones, las cuales representaron la misma región de interés en siete tajadas de cada cerebro de rata son agregadas conjuntamente para dar una medición única para el infarto total, infarto subcortical, infarto cortical, penumbra total, penumbra subcortical, penumbra cortical, daño isquémico total y edema en cada animal. Los datos del grupo son presentados como promedios ¦ +/- SEM. Las diferencias al nivel de p < 0.05 se consideran estadísticamente significativas. Entre los grupos se llevó a cabo una comparación de cada región de interés por la prueba y de Student no tomada por parejas (entre dos grupos) o una por medio de ANOVA seguido por comparaciones múltiples de Bonferroni después de esto o por la prueba de Dunnett no paramétrica (entre el control y los grupos tratados con el fármaco) . Los compuestos de la presente invención pueden ser probados como se describió anteriormente. Ejemplo 4 Modelo de Infarto de Miocardio: Ligación Coronaria Izquierda (Rata) Ratas Sprague-Dawley que pesan 250-320 g se permitió que tuvieran acceso libre al agua y la dieta de roedor comercial bajo condiciones de laboratorio estándares. Las temperaturas ambientes fueron mantenidas a 20-23 °C y la iluminación ambiental fue sobre un ciclo de luz/oscuridad de 12/12 horas. Los animales fueron aclimatados al medio ambiente de laboratorio 5 a 7 días previo al estudio y se sometieron a ayuno toda la noche previo a la cirugía. Procedimiento Quirúrgico para Estudios Agudos: Las ratas fueron anestesiadas con uretano (1.2-1.5 g/kg) . La temperatura del cuerpo del núcleo fue mantenida a 37 °C utilizando una mantilla de calentamiento. El área quirúrgica fue afeitada, y una incisión de la linea media ventral se hizo para exponer la tráquea y el área de la yugular. Se colocó un catéter (PE50) en la yugular para administración del compuesto y el mantenimiento de la anestesia. Se hizo una incisión en la tráquea y un catéter intravenoso modificado de calibre 14-16 fue insertado y sujetado en su lugar como un tubo endotraqueal . El animal se colocó en reclinación lateral derecha e inicialmente se colocó sobre un ventilador Harvard con un volumen tidal de 5-10 ml/kg. Se suministró 02 al 100% a los animales por el ventilador. Los electrodos de ECG fueron colocados para registrar un ECG de Plomo II estándar. El sitio quirúrgico fue limpiado con una torunda de alcohol, y se hizo una incisión en la piel sobre la caja torácica sobre el espacio intercostal 4/o.-5/o. Los músculos subyacentes fueron diseccionados con cuidado para evitar la vena torácica lateral, para exponer los músculos intercostales. La cavidad del pecho fue introducida a través del espacio intercostal 4/o.-5/o., y la incisión se expandió para permitir la visualización del corazón. El pericardio fue abierto para exponer el corazón. Una sutura de seda 6-0 con una aguja de guia se hizo pasar alrededor de la arteria coronaria izquierda cerca de su origen, la cual está en contacto con el margen izquierdo del cono pulmonar, a aproximadamente 1 mm desde la inserción del apéndice auricular izquierdo. Una pieza de tubería fue colocada sobre la sutura para formar un oclusor. La arteria coronaria fue ocluida durante 30 minutos por el deslizamiento del tubo hacia el corazón hasta que la resistencia es detectada y manteniéndola en su lugar con una abrazadera vascular. El ECG fue verificado para cambios S-T indicativos de la isquemia. Después de 30 minutos, el oclusor fue removido, dejando la sutura en su lugar. El ECG fue verificado durante los primeros 10 minutos de reperfusión. La rata fue transferida al ventilador de control de la presión para el resto del protocolo. Las ratas fueron ventiladas por un ventilador para el animal pequeño con una presión inspiradora máxima de 10-15 cm H20 y una velocidad respiratoria de 60-110 respiraciones/minuto. El corazón se dejó reperfusionar durante 90 minutos. Procedimiento quirúrgico durante 24 horas de estudio. Las ratas fueron anestesiadas con Cetamina/Xilazina IP (95 y 5 mg/kg) y se intubaron con un catéter intravenoso modificado de calibre 14-16. El nivel de anestesia fue verificado cada 15 minutos por pinchadura del talón. La temperatura del cuerpo del núcleo fue mantenida a 37 °C utilizando una mantilla de calentamiento. El área quirúrgica fue afeitada y limpiada. Una incisión de la línea media ventral se hizo para exponer la vena yugular. Un catéter (PE50) fue colocado en la yugular para administración del compuesto y mantenimiento de la anestesia. El animal fue colocado en reclinación lateral derecha e inicialmente se colocó sobre un ventilador con un volumen tidal de 5-10 ml/kg o un ventilador de presión controlada con una presión de inspiración máxima de 8-15 cm H20 y velocidad respiratoria de 60-110 respiraciones/minuto. Se suministró 02 al 100% a los animales por el ventilador. Los electrodos de ECG fueron colocados para registrar un ECG de Plomo II estándar. El sitio quirúrgico fue limpiado con una torunda quirúrgica y alcohol. Se hizo una incisión en la piel sobre la caja torácica sobre el espacio intercostal 4/o.-5/o. Los músculos subyacentes fueron diseccionados con cuidado para evitar la vena torácica lateral, para exponer los músculos intercostales. La cavidad del pecho fue introducida a través del espacio intercostal 4/o.-5/o., y la incisión se expandió para permitir la visualización del corazón. El pericardio fue abierto para exponer el corazón. Una sutura de seda 6-0 con una aguja de guia se hizo pasar alrededor de la arteria coronaria izquierda cérea de su origen, la cual está en contacto con el margen izquierdo del cono pulmonar, a a roximadamente 1 mm desde la inserción del apéndice auricular izquierdo. Una pieza de tubería fue colocada sobre la sutura para formar un oclusor. La arteria coronaria fue ocluida durante 30 minutos por el deslizamiento del tubo hacia el corazón hasta que la resistencia es detectada y manteniéndola en su lugar con una abrazadera vascular. El ECG fue verificado para cambios S-T indicativos de la isquemia.
Después de '30 minutos, el oclusor fue removido, dejando la sutura en su lugar. El ECG fue verificado durante los primeros 10 minutos de reperfusión. La incisión se cerró en tres capas. El catéter IV fue removido o colocado en un túnel bajo la piel y exteriorizado entre los omóplatos para permitir el retiro de sangre o terapia con fármacos adicional. Las ratas fueron ventiladas hasta que son capaces de ser ventiladas por si mismas. A las ratas se les retiraron los tubos y se recuperaron en una almohadilla de calentamiento. Una vez despiertas, las mismas fueron regresadas a su(s) jaula (s) . Los animales pueden recibir Buprenorfina (0.01-0.05 mg/kg SQ) para analgesia post-operativa. Después del tiempo de reperfusión designado (24 horas) los animales fueron anestesiados y los corazones removidos bajo anestesia profunda. Protocolos de Tratamiento Dieta : Los animales fueron' alimentados con una dieta acostumbrada previo a o después de la ligación coronaria. La extensión del tratamiento varia con el estudio. Las dosis fueron calculadas con base en el consumo promedio de 15 gramos de alimentación por día para una rata de 300 g. Los pesos de las ratas fueron verificados durante el estudio. La alimentación no consumida fue pesada para estimar las tasas de consumo . Tratamiento IV; Se hizo una incisión ventral para exponer la vena yugular. Un catéter (PE50) fue colocado en la vena yugular para la administración del compuesto. Los animales fueron dosificados por inyección del bolo y/o infusión continua. El tiempo y duración del tratamiento varia con el protocolo. Procesamiento del Tejido Después de reperfusión, cada animal recibió 200 unidades de heparina IV bajo anestesia general y el corazón fue removido y colocado en solución salada fría. Después de la remoción la arteria coronaria fue ligada con la sutura que ya está en su lugar. El corazón fue colocado sobre un aparato de reperfusión y el tinte de Azul de Evans fue infusionado para delinear el área en riesgo. Luego fue cortado el corazón en cinco tajadas transversales de 2 mm de espesor desde el vértice hasta la base. Las tajadas fueron incubadas en cloruro de trifeniltetrazolio al 1% (TTC) en solución salada al 0.9% durante 20 minutos a ' 37 °C. El tetrazolio reacciona con NADH en la presencia de enzimas de deshidrogenasa provocando que el tejido viable tiña un color rojo intenso que es distinguido fácilmente del tejido necrótico no teñido, pálido, infartado. Las tajadas fueron colocadas con el lado del vértice hacia abajo en la cubierta de una caja de petri pequeña para el procedimiento de teñido. El fondo de la caja fue colocado sobre las tajadas para mantenerlas planas. Las tajadas fueron fotografiadas en orden desde el vértice hasta la base, con el lado de la base hacia arriba. Las áreas del tejido infartado, el área en riesgo y el ventrículo izquierdo total fueron determinadas utilizando un sistema de análisis de la imagen computarizado . El área total para cada región fue agregada con ntamente para dar un total para el corazón completo. El tamaño del infarto fue expresado tanto como un porcentaje del ventrículo total como del área en riesgo. Análisis Estadístico El grupo de datos está representado como +/- SEM promedio. Las comparaciones entre los grupos de tratamiento se hicieron utilizando ANOVA con p < 0.05 considerada significativa. Las comparaciones después de esto se pueden hacer utilizando ya sea la prueba de Dunnett o la prueba de Tukey. Los compuestos de la presente invención pueden ser probados por este método. Ejemplo 5 Evaluaciones del Comportamiento Sensitivomotor A. Prueba de la Fuerza de Sujeción de las patas delanteras y traseras en las Ratas Los animales con infarto cerebral inducido por oclusión unilateral permanente o transitoria de la arteria cerebral intermedia (MCA) y las ratas operadas de manera simulada son probadas para verificar la fuerza de sujeción, un modelo estándar de función neuromuscular e integración sensitivomotora, utilizando un Medidor de la Fuerza de Sujeción, Computarizado, para las Ratas (Dual Stand Model, Columbus Instruments, OH) . Los animales son movidos hacia la habitación de prueba durante 30 minutos antes de la prueba. Previo a la prueba, cada medidor es calibrado con un conjunto de pesas conocidas y el aparato es ajustado para el tamaño del animal, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las mediciones de las patas delanteras son llevadas a cabo con el medidor en el modo máximo de tensión para fijar la lectura cuando el sujeto es retirado por jalado de la barra de sujeción. Las mediciones de las patas delanteras son llevadas a cabo con el medidor en el modo máximo de compresión para fijar la lectura cuando las patas traseras del sujeto son jaladas sobre la barra hacia el medidor. Cada animal es retenido manualmente por el investigador mientras que es jalado una vez que se han pasado las barras de sujeción, utilizando una técnica consistente, dejando las patas delanteras y traseras libres para sujetar las barras de sujeción. La prueba es llevada a cabo el día 2 post-operativo y se repite, de un modo al azar ciego, dos veces por semana durante un intervalo definido. Típicamente, tres lecturas sucesivas son tomadas para cada animal con un intervalo inter-ensayo suficientemente prolongado para registrar los datos y el cero de ambos medidores para el siguiente rastreo. B. prueba de Rota-Rod en Ratas Aparato : Molino de Rueda de Andar Rota-Rod para Ratas (7750 Accelerating Model, de UGO BASILE, COMERIO-ITALY) . Procedimiento : Los animales con infarto cerebral inducido por oclusión unilateral transitoria o permanente de la arteria cerebral intermedia (MCA) y las ratas operadas de manera simulada son probadas en este estudio, utilizando un Molino de Rueda de Andar Rota-Rod para Ratas (7750 Accelerating Model, de Ugo Basile, Comerio, Italia) . Los animales son movidos hacia la habitación de prueba 30 minutos antes de la prueba. Cada rata recibe 2-3 corridas de entrenamiento de 1-2 minutos a intervalos de 2-3 horas antes de la prueba. El cilindro sobre el aparato es dejado en movimiento antes de colocar a las ratas en su posición. El motor es ajustado a una velocidad seleccionada constante en el 7700 en el modo RESET, y las ratas son colocadas, una por una, en sus secciones . La prueba es llevada a cabo el día post-operativo 2 y es repetida, en un modo al azar ciego, dos veces por semana durante un intervalo definido. Típicamente, tres lecturas sucesivas son tomadas para cada animal con un intervalo inter-ensayo suficientemente prolongado para registrar los datos y el cero de ambos medidores para el siguiente rastreo.
Ejemplo 6 Modelo de Insuficiencia Cardiaca Congestiva Preparación experimental Las ratas de Sprague-Dawley macho de 225-275 g son anestesiadas con cetamina/xilazina (95 mg/kg y 5 mg/kg) y se intubaron con un catéter intravenoso modificado de calibre 14-16. La temperatura del cuerpo del centro es mantenida a 37 °C utilizando una mantilla de calentamiento. El área quirúrgica fue sujetada con pinzas y se limpió, y el animal es colocado en inclinación lateral derecha e inicialmente se colocó sobre un ventilador con una presión inspiradora máxima de 10-15 cm H20 y una velocidad respiratoria de 60-110 respiraciones/minuto. Se suministró 02 al 100% a los animales por el ventilador. Los electrodos de ECG fueron colocados para registrar un ECG de Plomo II estándar. Se hizo una incisión sobre la caja torácica sobre el espacio intercostal 4/o.-5/o. Los músculos subyacentes fueron diseccionados con cuidado para evitar la vena torácica lateral, para exponer los músculos intercostales. La cavidad del pecho fue introducida a través del espacio intercostal 4/o.-5/o., y la incisión se expandió para permitir la visualización del corazón. El pericardio fue abierto para exponer el corazón. Una sutura de seda 6-0 con una aguja de guia se hizo pasar alrededor de la arteria coronaria izquierda cerca de su origen, a aproximadamente 1 mm desde la inserción del apéndice auricular izquierdo. La arteria coronaria fue ocluida durante 30 minutos por el apriete de la sutura alrededor de la arteria. El ECG fue verificado para cambios S-T indicativos de la isquemia. Si el animal desarrolla fibrilación ventricular, se utiliza masaje cardiaco suave para convertir al animal a un ritmo normal. Los controles operados de manera simulada son sometidos al mismo procedimiento, pero la sutura no es apretada. La incisión es cerrada en tres capas. Los animales infectados o moribundos son eliminados del estudio. Cuatro semanas después de la cirugía, los animales son anestesiados, y un catéter es colocado en la arteria carótida derecha y se hace avanzar hacia el ventrículo izquierdo para mediciones hemodinámicas . Los trazos de la presión son registrados y analizados para verificar el ritmo cardiaco, la presión sistólica y diastólica ventricular izquierda, la presión ventricular izquierda desarrollada, y dP/dt máxima y mínima. Después que las mediciones son tomadas, 2 mi de sangre son removidos y colocados en tubos de suero y plasma. El corazón es removido y colocado sobre el aparato de Langendorff como sigue: Procedimiento de Langendorff Preparación del amortiguador: La solución amortiguadora de Krebs-Henseleit (KH) que contiene NaCl 118 mmol/1, KC1 4.7 mmol/1, MgSO<¡ 1.2 mmol/1, KHP0 1.2 mmol/1, Glucosa 11 mmol/1, NaHC03 25 irimol/1 y CaCl2 2.5 mmol/1 (Sigma) se hace fresca diariamente utilizando agua libre de pirógenos Nanopure. El animal recibe 200 unidades de heparina, el tórax es abierto y el corazón es escindido rápidamente y colocado en solución amortiguadora de KH enfriada con hielo. Después que la actividad contráctil del corazón se detuvo completamente, el corazón es recortado y la aorta ascendente liberada del tejido conectivo. El corazón es pesado rápidamente, luego la aorta es canalizada, y el corazón montado sobre un aparato de reperfusión de Langendorff sin recirculación (Radnoti Glass Technology, Inc., Monrovia, CA) . El corazón es perfusionado de un modo retrógrado por medio de la aorta con solución amortiguadora de KH oxigenada con 95% de 02 y 5 % de C02 para mantener el pH en7.4 a 37 °C. Para evaluar la función contráctil, un balón de látex es insertado en el ventrículo izquierdo a través del orificio mitral y conectado a un transductor de presión por una tubería de polietileno rígida. El balón es inflado con agua hasta una presión diastólica final del ventrículo izquierdo (VLEDP) de 1 a 10 mm Hg. El flujo es iniciado a 12 ml/min y ajustado durante los primeros 15 minutos de la línea base para obtener una presión de perfusión de entre 65 y 75 mmHg. Los parámetros de objetivo para la línea base son como sigue: Presión de perfusión 65-75 mmHg. LVEDP 10 mmHg.
El corazón se deja estabilizar durante 15 minutos. Después de este tiempo las mediciones funcionales son tomadas, después de lo cual una curva de volumen presión es generada a ustando el volumen en el balón en incrementos de 0.05 mi y registrando las presiones ventriculares . La presión sistólica ventricular izquierda (LVSP) (por sus siglas en inglés) , la presión diastólica extrema del ventrículo izquierdo (LVEDP) (por sus siglas en inglés) , la presión desarrollada en el ventrículo izquierdo (LVDP) (por sus siglas en inglés) , derivada primero de la elevación y la caída en la presión del ventrículo izquierdo (dp/dt max, dp/dt min) , la presión de reperfusión y el ritmo cardiaco son registrados automáticamente utilizando un sistema de adquisición de datos computarizado . Otras Mediciones Después de la remoción del corazón, los pulmones y el hígado son pesados. Los. pulmones y el hígado son pesados y secados toda la . noche para la determinación de las proporciones de humedad con respecto a sequedad. Después de complementar el procedimiento de Langendorff, el corazón es colocado en solución salada fría para detener los latidos, luego cortado en cinco tajadas transversales de 2 mm de espesor desde el vértice hasta la base. La tajada #3 será incubada en cloruro de trifeniltetrazolio al 1% (TTC) en solución salada al 0.9% durante 20 minutos a 37 °C. El tetrazolio se hace reaccionar con NADH en la presencia de enzimas de deshidrogenasa provocando que el tejido viable tiña un color rojo intenso y que es distinguido fácilmente del tejido necrótico no teñido-de color pálido, infartado. La tajada es colocada con el lado del vértice hacia abajo en la cubierta de una caja de petri pequeña para el procedimiento de teñido. El fondo de la caja es colocado sobre la tajada para mantenerla plana. La tajada es fotografiada entonces y las áreas del tejido infartado, el ventrículo izquierdo y derecho son determinadas utilizando un sistema de análisis de imagen computarizado . El tamaño del infarto es expresado como un porcentaje del ventrículo total. Las áreas totales del ventrículo izquierdo y derecho son medidas. Las secciones restantes son divididas en el ventrículo izquierdo y derecho y son congeladas para TBARS y ensayos de glutationa. Protocolo de Tratamiento Ningún tratamiento se da a los grupos de control y operados de manera simulada. Mediciones para el Estudio de CHF Se hacen mediciones in vivo de la frecuencia cardiaca (HR) , la presión sistólica ventricular izquierda (LVSP) , la presión diastólica extrema del ventrículo izquierdo (LVEDP) , dP/dt mínima y máxima, la presión sistólica ventricular derecha (RVSP) , la presión diastólica ventricular derecha (RVDP) , y la presión diastólica extrema del ventrículo derecho (RVEDP) , asi como el peso corporal total. Las mediciones ex vivo se hacen de HR, LVSP, LVEDP, dP/dt mínima y máxima, y la curva de volumen presión. También se miden ex vivo el peso del corazón, el tamaño del infarto, la Glutationa peroxidasa (GPX) (por sus siglas en inglés), catalasa, catalasa, substancias reactivas tiobarbitúricas (TBARS) (por sus siglas en inglés) ; la relación de glutationa (GSH/GSSG) , las relaciones del peso húmedo con respecto al seco del pulmón y del hígado, el isoprostano del suero y la interleucina-6 (IL-6).. Ciertos compuestos de la presente invención pueden ser probados por este método. Ejemplo 7 Ensayo de Protección de la Piel La actividad citoprotectora para la piel puede ser evaluada en el cultivo . celular utilizando el Modelo de la Piel Epiderm (EPI-100) de the Mattek Corporation de Ashland, Mass. Los cultivos celulares del prepucio neonatal son cultivados de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y son ensayados para verificar el porcentaje de viabilidad celular midiendo la cantidad de tinte de bromuro de 3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -2, 5-difeniltetrazolio (MTT) recibido por las células. Las células viables recibieron este tinte y lo convierten en cristales de formazina insolubles que radican en las mitócondrias de las células hasta que se extraen con alcohol. La cantidad de MTT convertido a cristales de formazina extraibles es directamente proporcional a la viabilidad del cultivo celular. El MTT es medido espectrofotométricamente . Las células son expuestas a luz UV a una velocidad de 1.5 Dosis de Eritema Mínimas (MED) por hora por centímetro cuadrado, para una dosis total de aproximadamente 31.5 mJ/cm2, desde un simulador solar (filtrado para dar longitudes de onda en la región de 290-400 nm) en la presencia del compuesto citoprotector o mezclas de los mismos para medir el efecto de los compuestos de prueba para proteger el cultivo celular de la generación de radicales libres que resultan de la luz ultravioleta. Los controles para este estudio son cultivos celulares sin el compuesto de prueba agregado (control positivo) . Todos los cultivos celulares también son comparados con cultivos que no están expuestos a la luz UV y no incluyen los agentes o mezclas citoprotectoras para determinar la viabilidad celular porcentual (control negativo) . Esta última medición se supone que va a ser igual a 100% de viabilidad. Los cultivos celulares tratados con los compuestos citoprotectores de la invención muestran una supervivencia más grande que lo que lo hacen los cultivos celulares de control positivo, cuando se prueban como se describió anteriormente . Ejemplo 8 Inhibición del Crecimiento del Cabello La reducción del crecimiento del cabello es demostrada cuando la frecuencia de remoción del cabello es reducida, o el sujeto percibe menos cabello sobre el sitio tratado, o cuantitativamente cuando el peso del cabello removido por afeitado (es decir, la masa del cabello) es reducida. Los hámsters Sirios Dorados intactos machos son considerados modelos aceptables para el crecimiento de la barba humana porque los mismos exhiben órganos laterales con forma de óvalo, uno en cada lado, cada uno de aproximadamente 8 mm, en un diámetro principal, los cuales crecen como cabello tosco y negro, grueso, semejante al cabello de la barba humana. Los órganos producen cabello en respuesta a los andrógenos en el hámster, Para evaluar la efectividad de un inhibidor particular en la reducción del crecimiento del cabello, los órganos laterales de cada uno de un grupo de hámsters son depilados aplicando un depilatorio químico a base de tioglicolato (Surgex) . A un órgano de cada animal se aplican 10 µ? del vehículo solo una vez al día, mientras que a los otros órganos de cada animal se aplica una cantidad igual del vehículo que contiene el inhibidor. Después de trece aplicaciones (una aplicación por día durante cinco días a la semana) los órganos laterales son afeitados y la cantidad de cabello recuperado (masa del cabello) de cada uno es pesada. La reducción porcentual del crecimiento del cabello es calculada restando el valor de la masa del cabello (mg) del lado tratado con el compuesto de prueba del valor de la masa del cabello del lado tratado con el vehículo; el valor delta obtenido es dividido entonces entre el valor de la masa del cabello del lado tratado con el vehículo, y el número resultante es multiplicado por 100. Los compuestos de esta invención pueden ser probados en este ensayo. Ejemplo 9 Ensayo de inflamación celular in vitro; A. Células Hep3B humanas - ensayo de CRP. La Línea Celular Hep3B es obtenida del American Type Culture Collection (ATCC Catálogo No. HB-8064) . La línea celular Hep3B se derivó del tejido del hígado de un macho Negro de 8 años de edad. Las células son epiteliales en su morfología y producen tumores en los ratones desnudos. Las células producen a-fetoproteína, antígeno superficial de hepatitis B, albúmina, a-2-macroglobulina, a-1-antitripsina, transíerrina, plasminógeno, complemento C3 y ß-lipoproteína (Knowles BB, et al, Science, 1980, 209:497-499) . Esta línea celular ha sido utilizada ampliamente para estudiar la citocina de los hepatocitos y la liberación de la proteina en fase aguda (por ejemplo, Damtew B, et al, 1993, J Immunol 150:4001-4007) . Las células HEP3B se hacen crecer en el Medio Esencial Mínimo (MEM; GIBCO) suplementado con 10% de suero de Bovino Fetal (FBS; Hyclone) , lx Penicilina/Estreptomicina (GIBCO, Cat # 15140-122) y aminoácidos no esenciales 0.1 mM (GIBCO, Catálogo No. 11140-050) . Las células son descongeladas y transferidas a un medio caliente de acuerdo con los métodos estándares conocidos en el arte. Las células son incubadas en los recipientes a 37 °C con C02 al 5% en un incubador con atmósfera de aire. El medio de crecimiento de HEP3B es cambiado cada 2 días hasta que las células alcanzan 70-80% de confluencia (aproximadamente 3-4 días) . Para el ensayo, las células son transferidas a placas de 96 cavidades, sembradas a 5000 células por cavidad en el medio de cultivo, y se dejan crecer durante 7 días en un incubador a 37 °C (aire suplementado con C02 al 5%) . El medio es reemplazado diariamente hasta el ensayo. Los compuestos de prueba son diluidos en "Stimulus Buffer" (medio MEM que contiene aminoácidos no esenciales 0.1 mM, IX penicilina/estreptomicina, 10% de FBS con 10 ng/ml de IL-?ß, 20 ng/ml de IL-6 y dexametasona 1 µ?. El medio es removido de las células y es reemplazado con 200 µ? de la dilución de prueba. Las células son regresadas al incubador durante tres días a 37 °C. El CRP ELISA es efectuado entonces sobre el sobrenadante de las células, como se describe posteriormente. Las placas EIA/RIA de Costar son recubiertas con CRP antihumano de conejo (DA O) diluido 1:4000 en amortiguador de carbonato (100 µ?/cavidad) durante 45 minutos a 37 °C. Las placas son lavadas entonces 5x con amortiguador de lavado de CRP (Tris-HCl 50 mM, NaCl 0.3M, Tween-20 0.5 MI, pH 8.0) utilizando un lavador de platos automático. Las placas pueden ser secadas, cubiertas y refrigeradas hasta su uso. El sobrenadante (100 µ?) es removido de cada cavidad de las placas de prueba y agregado a la cavidad correspondiente de una placa de ELISA pre-recubierta . 100 µ? de CRP anti-humano de conejo, conjugado con HRP (DAKO) diluido 1:500 (en amortiguador de lavado de CRP) es agregado a cada cavidad, seguido por incubación durante 30 minutos a 37 °C. Las placas son lavadas 5x con amortiguador de lavado de CRP utilizando la máquina lavadora de platos automática. Se agregan 200 µ? del Sistema de Substrato liquido de 3, 3 ' , 5, 5 ' -Tetrametil Bencidina (TMB) (Sigma, St. Louis, MO) a cada cavidad, seguido por incubación en la oscuridad durante 15 minutos a temperatura ambiente. Finalmente, se agregan 50 µ? de H2S0 1M a cada cavidad y la absorbancia a 450 nm es medida inmediatamente en un espectrofotómetro de microtitulación . La CRP medida como anteriormente es normalizada para el conteo de células por cavidad, utilizando un ensayo de viabilidad celular, tal como el Ensayo de Cell Tracker Green. Para hacer esto, el resto del medio es de las placas de prueba de la célula, las células son lavadas con 200 µ? de Solución de Sal Básica lx de Hanks pre-calentada (HBSS; GIBCO) , y se agregan 100 µ? de Cell Tracker Green (Molecular Probes, Eugene, OR) a cada cavidad. Las placas son incubadas entonces a 37 °C durante 30 minutos. Las células son lavadas entonces dos veces con lx HBSS precalentado . Las placas son incubadas entonces a 37 °C durante 30 minutos. Las células son lavadas entonces dos veces con lx HBSS precalentado. Las placas son leídas inmediatamente utilizando un fluorómetro Fluoroskan® con un par de filtros de 485 de excitación/538 de emisión. En un ensayo de CRP tal como el primero descrito aquí, los compuestos tales como: 6, 7-Dimetil-3-fenil-benzofuran-5-ol ; 1- (4-Bromo-5-hidroxi-6, 7-dimetil-benzofuran-2-il) -etanona; 1- (5-Hidroxi-6, 7-dimetil-benzofuran-2-il) -2-morfolin-4-il-etanona; Ester 2- ( 6-hidroxi-3-metil-[l, 3]oxazinan-6-il) -6, 7-dimetil-benzofuran-5-? lico del ácido acético; 1- ( 5-Hidroxi-6, 7-dimetil-benzofuran-2-il) -etanona; 3- (4-Metoxi-fenil) -6, 7-dimetil-benzofuran-5-ol ; 4, 5-Dimetil-l, 8-difenil-benzol[l, 2-b; 4, 3-b]difurano; y 1, 8-Bis- (4-fluoro-fenil) -4, 5-dimetil-benzo[l, 2-b; 4, 3-b]difurano; a una EC5o de entre aproximadamente 10 hasta aproximadamente 40 micromolar, fueron efectivos en la reducción de los niveles de CRP. B. Célula-ELAM La Molécula de Adhesión Endotelial-Leucocito (ELAM) , también conocida como E-selectina, es expresada sobre la superficie de las células endoteliales . En este ensayo, el lipopolisacárido (LPS) y el IL-?ß son utilizados para estimular la expresión de ELAM; los agentes de prueba son probados para verificar sus capacidades para reducir esta expresión, de acuerdo con los estudios que muestran esta reducción de la adhesión de los leucocitos a la superficie celular endotelial, están asociados con el daño celular reducido (por ejemplo, Takada, M., et al, Transplantation 64: 1520-25, 1997; Steinberg, J.B., et al, J. Heart Lung Trans . 13:306-313, 1994) . Las células endoteliales pueden ser seleccionadas de cualquiera de un número de fuentes y cultivadas de acuerdo con. los" métodos conocidos en el arte; incluyendo, por ejemplo, las células endoteliales de la arteria coronaria, las células endoteliales microvasculares del cerebro humano (HBMEC; Hess, D.C., et al, Neurosci . Lett. 213(1) : 37-40, 1996), o las células endoteliales del pulmón. Las células son cultivadas convenientemente en placas de 96 cavidades. Las células son estimuladas agregando una solución a cada cavidad que contiene 10 µg/ml de LPS y 100 pg/ml de IL-?ß durante 6 horas en la presencia del agente de prueba (las concentraciones especificas y el tiempo pueden ser ajustados dependiendo del tipo de célula) . El amortiguador de tratamiento es removido y reemplazado con Fixing Solution® pre-calentada (100 µ?/cavidad) durante 25 minutos a temperatura ambiente. Las células son lavadas entonces 3X, luego incubadas con Amortiguador de Bloqueo (PBS + 2% FBS) durante 25 minutos a temperatura ambiente. El Amortiguador de Bloqueo que contiene el Anticuerpo de E-Selectina Monoclonal (1:750, Sigma Catálogo #S-9555) es agregado a cada cavidad. Las placas son selladas y almacenadas a 4o toda la noche. Las placas son lavadas 4X con 160 µ? de Amortiguador de Bloqueo por cavidad. El anticuerpo-HRP secundario diluido 1:5000 en el Amortiguador de Bloqueo es agregado entonces (100 µ?/cavidad) , y las placas son incubadas a temperatura ambiente (protegidas de la luz) durante dos horas. Las placas son lavadas entonces 4X con Amortiguador de Bloqueo antes de la adición de 100 µ? de solución del Substrato de ABTS a temperatura ambiente (Zymed, Catálogo #00-2024) . Las cavidades se dejan desarrollar durante 35 minutos, antes de la medición a 402 nm en un Lector Fluoroskan® con el programa de agitación durante 10 segundos. Los resultados positivos son registrados como una reducción en la concentración de ELA en las cavidades probadas, cuando se compara con las cavidades de control. En un ensayo de ELAM, tal como uno descrito aquí, ciertos compuestos de la presente invención a EC50 en un intervalo de 10-1000 micromolar, y en particular en un intervalo de 200-600 micromolar, fueron capaces de reducir la expresión de ELAM. C. Interleucina-l .beta . Ensayo de Célula Microglial Materiales y Equipo A. materiales para la Preparación Celular y Experimento Linea celular microglial de ratón Medio de Glucosa con alto contenido de DMEM (Catálogo # 11965-092 de Gibco) FBS (Catálogo # SH30070.03 de Hyclone) Penicilina/Estreptomicina lOOx (Catálogo # 15140/122 de Gibco) LPS (Catálogo # L2537 de Sigma) - Interferona-gamma (Catálogo #14777 de Sigma) Cell Tracker Green (Molecular Probes Catálogo # C2925) Amortiguador HBSS (950 mi de agua libre de Pirógenos, 2.44 g/1 de MgCl2.6H20, 3.73 g/1 KC1, 59.58 g/1 Hepes, 58.44 g/1 de NaCl, 1.36 g/1 de KH2P04, 1.91 g/1 de CaC12.2H20 y pH a 4.5 con HC1) Placas de 96 cavidades estériles pre-recubiertas con poli-D-lisina (Catálogo # 3665 de Corning) Placa madre de cavidades profundas, de 96 cavidades, DyNA Block 1000 (catálogo # 40002-008 de VWR) B. Materiales para II-lbeta Elisa Conjunto IL-lbeta Dúo de Ratón (Catálogo # DY401 de R & D Systems) Solución del Substrato (Catálogo # DY 999 de R & D Systems) - Fracción V de Albúmina de Suero de Bovino (BSA V) (Catálogo # A4503 de Sigma) Placas de aglutinación elevada Costar EIA de 96 cavidades (Catálogo # 29442-302 de VWR) Sello de la Placa (Catálogo # 29442-310 de VWR) - PBS (Catálogo # 9240 de Irvine Scientific) Agua Grado de Cultivo Celular (Catálogo # 9312 de Irvine Scientific) Tween 20 (Catálogo # P 1379 de Sigma) Sucrosa (Catálogo # S7093 de Sigma) - Azida de Sodio (Catálogo # S 8032 de Sigma) H2S04 5N (Catálogo # JT 5691-2 de VWR) Preparación Experimental y. Procedimiento: Ratón IL-lbeta Elisa: Soluciones : Amortiguador de Lavado: PBS 1L +500 µ? de Tween 20 (final 0.05%) pH 7.2-7.4. Amortiguador de Bloqueo: 500 mi de PBS + 5 g de BSA V (1 %) + 25g de Sucrosa (5%) - 0.25g de Azida de Sodio (0.05%) . Diluyente del Reactivo: 500 mi de PBS + 5 g de BSA V (1 %) de pH 7.2 -7.4 y se esteriliza por filtración a través de 0.2 um. Solución de Detención: Hacer ácido sulfúrico 2N agregando 10 mi de H2S04 5N a 15 mi de H20 dd. Preparaciones del Conjunto Dúo: 1. El anticuerpo de captura IL-l.beta. fue reconstituido en 1 mi de PBS para dar una concentración final de 720 g/ml/ y la concentración de trabajo fue de 4 g/ml . Para el recubrimiento de una placa de 96 cavidades (a 100 µ?/cavidad) 56 µ? de la materia en almacenamiento de 720 µg/ml se diluyeron en 10 mi de PBS. 2. Los estándares de IL-l.beta. fueron reconstituidos en 0.5 mi del Diluyente del Reactivo (70 ng/ml) . Para un estándar elevado de 1 ng/ml (2 cavidades en 100 µ? cada uno + lo suficiente para la dilución en serie), 7.1 µ? del estándar de 70 ng/ml fueron diluidos en 0.5 mi del Diluyente del Reactivo . 3. El anticuerpo de . detección de IL-l.beta. fue reconstituido en 1 mi del Diluyente del Reactivo para dar una concentración final de 18 g/ml y la concentración de trabajo es de 100 ng/ml. Para una placa de 96 cavidades (a 100 µ?/cavidad) se diluyen 56 µ? del material en almacenamiento de 18 µg/ml en 10 mi del Diluyente del Reactivo. Procedimiento de IL-l.beta ELISA Preparación de la Placa: 1. La placa de aglutinación Hi de Costar EIA fue recubierta con el anticuerpo de captura a 4 µg/ml 56 µ? del material en almacenamiento de 720 µg/ml fueron tomados para una placa y agregados a 10 mi de PBS . Cada cavidad fue recubierta con 100 µ?, y la placa fue sellada e incubada toda la noche a temperatura ambiente. 2. Cada cavidad fue aspirada y lavada 3x con el Amortiguador de Lavado. Cada cavidad fue llenada hasta la parte superior, distribuida, y cualquier amortiguador restante fue removido invirtiendo la placa y transfiriéndola suavemente contra toallas de papel limpias. 3. Los sitios de aglutinación no específicos fueron bloqueados agregando 300 µ? del Amortiguador de bloqueo a cada cavidad, y después del sellado, incubación durante al menos 1 hora a temperatura ambiente. 4. Después del lavado, la placa estuvo lista ahora para las muestras . Procedimiento de Ensayo:. 5. 100 µ? ya sea del estándar o de la muestra fueron agregados en cada cavidad de la placa recubierta para la captura y pre-bloqueada . La placa fue sellada e incubada durante 2 horas a temperatura ambiente, seguido por lavado como en la etapa 2. 6. 100 µ? del anticuerpo de detección (100 ng/ml) fueron agregados a cada cavidad. Para una placa de 96 cavidades, 56 µ? del material en almacenamiento de 18 µg/ml fueron diluidos en 10 mi del Diluyente del Reactivo. 7. La placa fue sellada e incubada a temperatura ambiente durante 2 horas, seguido con lavado como en la etapa 2. 8. 100 µ? de la dilución de trabajo de Estreptavidina-HRP fueron agregados, y la placa fue sellada e incubada en la oscuridad durante 20 minutos a temperatura ambiente, seguido por lavado como en la Etapa 2. 9. La solución del Substrato fresca fue preparada mezclando el Reactivo de Color A (H202) y el Reactivo de Color B (Tetrametilbencidina) en una proporción 1:1. 100 µ? de esta mezcla de la Solución del Substrato fue agregada a cada cavidad y el placa fue incubada en la oscuridad durante 20 minutos a temperatura ambiente. 10. 50 µ? de la Solución de Detección fueron agregados a cada cavidad, el mezclado fue asegurado dando golpecitos ligeros suavemente. 11. Cada placa fue leída con 'el Spectramax una vez a 450 nm. Si la corrección de la longitud de onda está disponible, se ajusta a 540 ó 570 nm. Los compuestos de la presente invención pueden ser probados para verificar su capacidad para reducir la inflamación en este modelo. Ejemplo 10 Ensayo de inflamación celular in vivo Estos ensayos miden la capacidad de los compuestos de prueba para prevenir o reducir la inflamación secundaria a la oxazolona o ácido araquidónico . A. Acido araquidónico. Ratones CD-1 machos, albinos, de 7-9 semanas de edad fueron utilizados en esta prueba. Una solución de ácido araquidónico al 20% (p/v) en acetona es preparada. Veinte microlitros de la solución de ácido araquidónico es aplicada a la oreja izquierda dorsal del ratón. Inmediatamente después de esto, los compuestos de prueba (20 µ? en 70% de etanol/30% de propilenglicol ) son aplicados a la oreja izquierda. La oreja derecha no tratada sirvió como el control. Los ratones son sacrificados por inhalación de C02, una hora después del tratamiento. Las orejas izquierda y derecha son removidas y se toman de cada una biopsias con un punzón de 7 mm. Las biopsias del punzón son pesadas, y las diferencias calculadas. B. Oxazolona. Los ratones de CD-1 son inducidos aplicando oxazolona al 3% (Sigma) .(30' mg/ml preparada en aceite de maíz : acetona) al abdomen afeitado. Cinco días más tarde, los ratones son estimulados con oxazolona al 2% (20 mg/ml) en acetona sobre la oreja izquierda (la oreja derecha fue del control no tratado) . Una hora después de la estimulación, los compuestos de prueba son aplicados a la oreja izquierda en 70% de etanol/30% de propilenglicol. Los animales son sacrificados 24 horas más tarde y se remueven los punzones para la oreja de 7 mm. Los punzones para la oreja son colocados sobre un platillo de balanza, y la diferencia entre las orejas tratadas y no tratadas es determinada. La inhibición porcentual es calculada comparando los promedios de cada grupo con el grupo del vehículo. (La hidrocortisona sirve como un control positivo en esta prueba) . Los compuestos de la presente invención pueden ser probados para verificar su capacidad para reducir la inflamación en este modelo. Ejemplo 11 6, 7-Dimetil-3-fenil-benzofuran-5-ol Etapa 1 : Una mezcla de 2, 3-dimetil-l, 4-dihidroquinona (1.08 g, 7.826 mmol) , 2-bromoacetofenona (1.45 g, 7.29 mmol) , y carbonato de potasio (1.78 g, 12.90 mmol) en acetona (30 mi) se agita a temperatura ambiente durante 3 horas. La mezcla se vertió entonces en agua conduciendo a la formación de un precipitado. El precipitado fue lavado con agua y hexano, y se secó para dar una mezcla de productos mono y bis. La purificación en columna de gel de sílice eluyendo con EtOAc al 30% en hexano, 2- (4-hidroxi-2, 3-dimetil-fenoxi ) -1-fenil-etanona (0.65 g) y 2-[2, 3-dimetil-4- (2-oxo-2-fenil-etoxi) -fenoxi]-l-fenil-etanona (0.5 g) . Etapa 2: Una mezcla de 2- (4-hidroxi-2, 3-dimetil-fenoxi) -1-fenil-etanona (1.2 g, 4.70 mmol) y ácido polifosfórico (ca. 100 mg) en xileno (10 mi) fue agitada a 150 °C durante 5 horas. La mezcla se vierte en agua, se extrae con acetato de etilo, se lava y se seca para dar 6, 7-dimetil-3-fenil-benzofuran-5-ol (560 mg) como un sólido café claro. RMN lE (CDC13, 300 MHz) d: 7.71 (s, 1H) , 7.60-7.20 (m, 5H) , 7.06 (s, 1H) , 4.76 (s, 1H, OH), 2.47, 2.29 (2s, 6H) ppm. RMN 13C (CDC13 , 75 MHz) d: 150.43, 150.30, 141.15, 132.58, 129.00, 127.32, 123.48, 122.13, 121.31, 120.59, 102.25, 12.31, 11.95 ppm. EM (m/z) : 239 (M+H+) . De manera semejante, siguiendo el procedimiento descrito anteriormente pero reemplazando la bromoacetofenona con las bromoacetofenonas substituidas apropiadas, se obtuvieron los siguientes compuestos: • 3- (4-Fluoro-fenil) -6, 7-dimetil-benzofuran-5-ol; RMN lU (CDCI3, 300 MHz) d: 7.65 (m, 1H) , 7.50 (m, 2H) , 7.10-6.95 (m, 3H) , 4.90 (s, 1H, OH), 2.44, 2.31 (2s, 6H) ppm. RMN 13C (CDCI3, 75 MHz) d: 163.79, 160.53, 150.37, 150.30, 140.97, 128.90, 128.79, 128.56, 128.52, 123.44, 121.41, 121.24, 120.78, 116.06, 115.78, 102.04, 12.30, 11.96 ppm. RMN 19F (CDC13, 300 MHz , TFA como referencia) d: -115.31 ppm. EM (m/z) : 257 (M+H+) . • 3- (4-Metoxi-fenil) -6, 7-dimetil-benzofuran-5-ol; RMN H (CDCI3, 300 MHz) d: 7.64 (s, 1H) , 7.50 (dd, J = 2.1, 6.7 Hz, 2H, 2H) , 7.00 (m, 3H) , 4.83 (s, 1H, OH), 3.84 (s, 3H) , 2.46, 2.28 (2s, 6H) ppm. RMN 13C (CDC13, 75 MHz) d: 158.92, 150.33, 150.23, 140.52, 128.47, 125.02, 123.69, 121.70, 121.25, 120.49, 114.45, 102.20, 55.47, 12.30, 11.95 ppm. EM (m/z) : 269 (M+H+) . • 3- (4-Cloro-fenil) -6, 7-dimetil-benzofuran-5-ol) ; RMN H (CDCI3, 300 MHz) d: 7.72 (s, 1H) , 7.53 (d, J = 8.6 Hz, 2H) , 7.42 (d, J = 8.6 Hz, 2H) , 7.02 (s, 1H) , 4.86 (s, 1H, OH), 2.47, 2.30 (2s, 6H) ppm. RMN 13C (CDCI3, 75 MHz) d: 150.41, 141.25, 133.04, 131.06, 129.17, 128.49, 123.17, 121.45, 121.12, 120.79, 101.99, 12.30, 11.94 ppm. EM (m/z) : 273, 275 (M+H+) . . - Ejemplo 12 4, 5-Dimetil-l, 8-difenil-benzo[l , 2-b;4, 3-b ' ]difurano Una mezcla de 2-[2, 3-dimetil-4- (2-oxo-2-fenil-etoxi) -fenoxi]-l-fenil-etanona (480 mg, 1.28 mmol) sintetizada como se describió en el Ejemplo 11, un exceso de bromoacetofenona, y ácido polifosfórico (PPA, 100 mg) en xileno (10 mi) se agita a 150 °C durante 10 horas. La mezcla luego se vierte en agua, se extrae con EtOAc, la capa orgánica se lava con agua y salmuera, se seca sobre MgS04 y se concentra. El residuo fue purificado en columna de gel de sílice eluyendo con 10-20% de EtOAc en hexano para dar 190 mg de 4,5-dimetil-l,8-difenil-benzo[l,2-b;4,3-b']difurano (250 mg) . RMN _iH (CDC13, 300 MHz) d: 7.60 (s, 2H) , 7.05 (m, 4H) , 6.90 (m, 2H) , 6.85 (m, 4H) , 2.60 (s, 6H) ppm. RMN 13C (CDC13, 75 MHz) 5: 152.57, 141.48, 133.19, 128.42, 127.52, 126.87, 124.05, 117.40, 116.29, 11.80 ppm. EM (m/z) : 339 (M+H+) . De manera semejante, siguiendo el procedimiento del Ejemplo 12, se obtuvieron los siguientes compuestos: • 1, 8-Bis- (4-fluoro-fenil) -4, 5-dimetil-benzo[l , 2-b;4, 3-b'Jdifurano. RMN XH (CDC13, 300 MHz) d: 7.56 (s, 2H) , 7.05 (m, 4H) , 6.60 (m, 4H) , 2.60 (s, 6H) ppm. RMN 13H (CDC13, 75 MHz) d: 163.91, 160.66, 152.51, 141.44, 130.18, 129.16, 129.12, 122.77, 117.59, 116.27, 114.65, 114.36, 11.78 ppm. RMN 19F (CDCI3, 300 MHz, TFA como referencia) d: -116.57 ppm. EM (m/z) : 375 (MH+) . • 1, 8-Bis- (4-metoxi-fenil) -4, 5-dimetil-benzo[l , 2-b;4, 3-b*]difurano. RMN *? (CDC13, 300 MHz) d: 7.56 (s, 2H) , 6.95 (d, J = 8.7 ??,' 4H) , 6.90 (m, 2?) , 6.43 (d, J = 8.7 Hz, 4H) , 3.75 (s, 6H) , 2.60 (s, 6H) ppm. RM 13C (CDC13, 75 MHz) d: 158.49, 152.39, 141.07, 129.78, 125.51, 123.5, 117.24, 116.74, 112.98, 54.94, 11.78 ppm. EM (m/z) : 399 (M+H+) . Ejemplo 13 (5-Hidroxi-3, 6, 7-trimetil-benzofuran-2-il ) -fenil-metanona Etapa 1: A una suspensión de 2, 3-dimetil-l, 4-dihidroquinona (11.58 g) y trietilamina (25 mi) en diclorometano (100 mi) se agrega lentamente anhídrido acético (16 mi) . Luego la mezcla se agita a temperatura ambiente durante 2 horas hasta que el sólido fue disuelto. La mezcla se lava con agua, se seca sobre MgS04, y se concentra a sequedad para dar un sólido. El sólido se lava con exano y éter para dar 15.40 g del derivado de 1,4 diacetato del material de partida. Etapa 2: Una suspensión del diacetato de la Etapa 1 (5.08 g) en el complejo de ácido acético trifluoruro de boro (15 mi) se agita a 110 °C durante 1 hora. Después de enfriamiento, la mezcla se vierte en hielo, y la mezcla se extrae con diclorometano . La capa orgánica se lava con agua y se seca. Después de la evaporación, el residuo fue recristalizado a partir de EtOAc-hexano para dar 4.37 g de 1- (2-hidroxi-5-acetoxi-3, 4-dimetil-fenil ) -etanona. Etapa 3: La feniletanona de la Etapa 2 (500 mg) fue disuelta en MeOH (20 mi), y se agrega carbonato de potasio (1 eq.) seguido por agua (1 mi) . La mezcla se agita a temperatura ambiente durante 1 hora, y luego se vierte en agua. La solución se acidifica con HC1 y se forma un precipitado. El precipitado fue colectado y se secó con aire para dar aproximadamente 350 mg de 1- (2 , 5-dihidroxi-3, 4-dimetil-fenil) -etanona.
Etapa 4: La 1- (2, 5-dihidroxi-3, 4-dimetil-fenil ) -etanona de la Etapa 3 (275 mg) se disuelve en diclorometano (20 mi) y se agrega 3 , -dihidro-2H-pirano (0.2 mi) seguido por p-toluenosulfonato de piridinio (PPTS) (30 mg) . La mezcla se agita a temperatura ambiente durante 4 horas. La mezcla se seca sobre MgS04 y se purifica sobre una columna de gel de sílice eluyendo con EtOAc al 30% en hexano para dar 397 mg de l-[2-hidroxi-3, 4-dimetil-5- ( tetrahidro-piran-2-iloxi) -fenil]-etanona como un sólido amarillo.
Etapa 5 Una mezcla del éter de tetrahidropirano de la Etapa 4 (250 mg) , 2-bromo-l-fenil-etanona (250 mg) , y carbonato de potasio (300 mg) en DMF se agita a temperatura ambiente durante 3 horas. La mezcla se vierte en agua y se extrae con acetato de etilo, la capa orgánica se seca y se evapora. La purificación sobre una columna de gel de sílice eluyendo con EtOAc al 30% en hexano dio 260 mg de un sólido incoloro el cual fue disuelto entonces en DMF seguido por la adición de carbonato de cesio (2 eq.) . La mezcla se agita toda la noche a temperatura ambiente, luego se vierte en agua y se extrae con acetato de etilo, la capa orgánica se seca y se evapora. El producto crudo se disuelve en MeOH con HC1 diluido y se agita durante 1 hora. Luego se vierte en agua y se extrae con acetato de etilo, la capa orgánica se lava, se seca y se evapora. La purificación sobré una columna de gel de sílice eluyendo con EtOAc al 30% en hexano dio la ( 5-hidroxi-3, 6, 7-trimetil-benzofurano-2-il ) -fenil-metanona (187 mg) . RMN H (CDC13, con MeOH-d4, 300 MHz) 5: 8.10 (m, 2H) , 7.50 (m, 3H) , 6.88 (s, 1H) , 2.55, 2.43, 2.30 (3s, 9H) ppm. RMN 13C (CDC13, con MeOH-d4, 75 MHz) d: 186.58, 152.26, 149.41, 148.23, 138.47, 132.81, 130.08, 128.61, 128.38, 127.37, 126.55, 121.64, 101.68, 101.63, 12.72, 12.51, 10.53 ppm. EM: 281 (M+H+) .
Ejemplo 14 1- ( 5-Hidroxi-6, 7-dimetil-benzofuran-2-il ) -etanona Una mezcla de l-[6, 7-dimetil-5- ( tetrahidro-piran-2-iloxi) -benzofuran-2-il]-etanona (1.1 g) (preparada a partir del 2, 5-dihidroxi-3, 4-dimetil-benzaldehido siguiendo el procedimiento de las Etapas 3, 4 y 5 del Ejemplo 13) y HCl concentrado (10 gotas) en MeOH (20 mi) se agita a temperatura ambiente durante 2 horas. El agua se vierte en la mezcla y se deja precipitar toda la noche en el refrigerador. El precipitado fue colectado, lavado con hexano y secado para dar la 1- ( 5-hidroxi-6, 7-dimetil-benzofuran-2-il ) -etanona como un sólido café claro (490 mg) . RMN l (CDC13, 300 MHz) d: 7.38 (s, 1H) , 6.89 (s, 1H) , 4.88 (1H, OH), 2.60, 2.50, 2.31 (3s, 9H) ppm. RMN 13C (CDC13, 75 MHz) d: 192.76, 155.45, 155.13,. 153.72, 130.29, 127.27, 124.75, 117.44, 106.18, 29.30, 15.56, 15.28 ppm. EM (m/z) : 205 (M+H+) .
Ejemplo 15 -Bromo-5-hidroxi-6, 7-dimetil-benzofuran-2-il ) -etanona A una solución de l-[6, 7-dimetil-5- (tetrahidro-piran-2-iloxi) -benzof ran-2-il]-etanona (200 mg) en cloroformo (20 mi) se agrega bromo (120 mg) . Después de 1 hora, la solución se lava con agua y se seca sobre MgS04 y se concentra. El residuo se purifica por columna de gel de sílice eluyendo con hexano al 10% en DCM para dar la l-(3-bromo-5-hidroxi-6, 7-dimetil-benzofuran-2-il ) -etanona, como un sólido amarillo. RM t? (CDC13, 300 MHz) d: 7.38 (s, 1H) , 5.55 (s, 1H, OH), 2.60, 2.50, 2.31 (3s, 9H) ppm. EM (m/z) : 283, 285 (M+H+) . Ejemplo 16 2-Bromo-l- ( 5-acetoxi-6, 7-dimetil-benzofuran-2-il ) -etanona Lá 1- ( 5-acetoxi-6, 7-dimetil-benzofuran-2-il) -etanona (83 mg) (preparada a partir de la 1- ( 5-hidroxi-6, 7-dimetil-benzofuran-2-il) -etanona del Ejemplo 14 con acetanhidrido y piridina) , fue disuelta en cloroformo (10 mi) . El bromo (50 mg) fue agregado y la solución fue agitada a 70 °C durante 10 minutos. Cuando el color del bromo desapareció, la mezcla fue evaporada a sequedad. El residuo fue purificado en columna de gel de sílice eluyendo con EtOAc al 30% en hexano para dar 85 mg de 2-bromo-l- (5-acetoxi-6, 7-dimetil-benzofuran-2-il) -etanona como un sólido blanco. RMN XH (CDC13, 300 MHz) d: 7.58 (s, 1H) , 7.26 (s, 1H) , 4.43 (s, 2H) , 2.51, 2.37, 2.21 (3s, 9H) ppm. RMN 13C (CDC13, 75 MHz) d: 182.55, 170.13, 153.71, 150.74, 146.81, 131.21, 124.51, 122.92, 115.15, 113.28, 30.69, 21.27, 13.54, 12.80 ppm.
E emplo 17 Ester 6, 7-dimetil-2- (2-morfolin-4-il-acetil ) -benzofuran-5- ílico del ácido acético Una solución de 2-bromo-l- (5-acetoxi-6, 7-dimetil- (15 mg) , y "carbonato de potasio (25 mg) en acetona (10 mi) se agita a temperatura ambiente durante 30 minutos. Luego se evapora a sequedad, y el residuo se purifica por columna de gel de sílice eluyendo con MeOH al 5% en DCM para dar 43 mg del éster 6, 7-dimetil-2- (2-morfolin-4-il-acetil ) -benzofuran-5-ílico del ácido acético como un aceite. La conversión en la sal de HC1 dio un sólido amarillo. RMN *H (CDC13 300 MHz) d: 7.60 (s, 1H) , 7.20 (s, 1H) , 3.78 (s+t, 6H) , 2.64 (m, 4H) , 2.50 (s, 3H) , 2.40 (s, 3H) , 2.20 (s, 3H) ppm. RMN 13C (CD3OD, 75 MHz) (como la sal de HC1) d: 180.94, 170.31, 153.65, 150.33, 147.19, 131.94, 124.33, 122.34, 116.04, 113.59, 63.74, 60.89, 53.28, 19.64, 12.18, 12.22 ppm. E/M 332 (M+H+) . E emplo 18 1- ( 5-Hidroxi-6, 7-dimetil-benzofuran-2-il ) -2-morfolin-4-il- etanona Una solución del éster 6, 7-dimetil-2- (2-morfolin-4-il-acetil) -benzofuran-5-? lico del ácido acético (23 mg) , preparada como en el Ejemplo 17, en MeOH (10 mi) se agita mientras que se agrega bicarbonato de sodio (10 mg) . Luego la mezcla se agita a TA toda la noche, seguido por evaporación a sequedad. El residuo fue purificado por columna de gel de sílice, eluyendo con MeOH al 5% en diclorometano para dar 11 mg de la 1- (5-hidroxi-6, 7-dimetil-benzofuran-2-il) -2-morfolin-4-il-etanona como un aceite. La conversión en la sal de HC1 dio un sólido amarillo. RMN 2H (CD3OD, 300 MHz) d: 7.60 (s, 1H) , 7.20 (s, 1H), 3.78 (m, 6H) , 2.64 (m, 4H) , 2.50 (s, 3H) , 2.40 (s, 3H) ppm. RMN 13C (CDC13, 75 MHz) d: 187.98, 170.20, 153.31, 152.29, 146.58, 130.44, 124.53, 122.80, 114.36, 113.15, 64.69, 53.79, 21.28, 13.47, 12.86 ppm. E/M 290 (M+H+) . Ejemplo 19 2- ( l-hidroxi-2-morfolin-4-il-etil) -6, 7-dimetil-benzofuran-5- ol Una solución del éster 6, 7-dimetil-2- (2-morfolin-4-il-acetil) -benzofuran-5-?lico del ácido acético (35 mg) , preparada como en el Ejemplo 17, en MeOH (10 mi) se agita mientras que se agrega NaBH4 (40 mg) , y la mezcla se agita a temperatura ambiente durante unas 4 horas adicionales. La mezcla se vierte en agua, y se . extrae con acetato de etilo. La capa orgánica se seca sobre MgSOd y se evapora. El residuo se purifica en columna de gel de sílice eluyendo con MeOH al 5% en DCM para dar 21 mg del 2- (l-hidroxi-2-morfolin-4-il-etil ) -6, 7-dimetil-benzofuran-5-ol como un aceite. La conversión en la sal de HC1 dio un sólido amarillo. RMN LE (CD3OD, 300 MHz) d: 6.77 (s, 1H) , 6.67 (s, 1H) , 5.29 (dd, J = 10.4, 3.3 Hz, 1H) , 4.04 (m, 2H) , 3.85 (c, 2H) , 3.70-3.50 (m, 4H) , 3.30 (m, 2H) , 2.40 (s, 3H) , 2.20 (s, 3H) ppm. RMN 13C (CD3OD, 75 MHz) (como la sal de HCl) d: 154.72, 151.88, 149.40, 125.02, 121.67, 120.21, 104.51, 102.50, 63.77, 63.69, 61.70, 60.19, 53.82, 51.28, 11.24, 11.10 ppm. Ejemplo 20 2- (5-Hidroxi-6, 7-dimetil-benzofuran-2-il ) -4-metil-morfolin-2- ol Una mezcla de 2-bromo-l- (5-acetoxi-6, 7-dimetil-benzofuran-2-il ) -etanona (30 mg) , metilaminoetanol (7 mg) , y carbonato de potasio (20 mg) en acetona (10 mi) se agita a TA durante 1 hora. La mezcla se vierte en agua y se extrae con acetato de etilo. La capa orgánica se seca y se evapora seguido por purificación por cromatografía en columna de gel de sílice eluyendo con MeOH al 5% en DCM para dar 20 mg de 2- ( 5-hidroxi-6, 7-dimetil-benzofuran-2-il ) -4-metil-morfolin-2-ol como un aceite, y se convierte en la sal de HC1. La RMN mostró un equilibrio de la forma de hemicetal y cetona. RMN XH (CDC13, 300 MHz ) 6: 7.51, 7.26 (2s, combinado, 1H) , 7.06, 6.87 (2s, 1H combinado), 4.2-3.7 (m, 2H) , 3.2-2.8 (m, 4H) , 2.5-2.0 (m, 12 H) ppm. RMN 13C (CDC13, 75 MHz) 5: 189.26, 170.43, 170.18, 156.79, 152.53, 145.71, 125.79, 125.39, 124.46, 121.73, 113.88, 113.14, 111.52, 104.28, 92.48, 63.55, 62.62, 61.11, 59.68, 54.75, 46.37, 21.30, 13.48, 13.02, 12.90 ppm. E/M 320 (M+H+) . Ejemplo 21 Ester metílico del ácido 5-hidroxi-6, 7-dimetil-benzofuran-2- carboxílico Etapa 1 : El 2, 5-dihidroxi-3, 4-dimetil-benzaldehído (2.0 g) se disuelve en diclorometano (50 mi) y se agrega 3,4-dihidro-2H-pirano (1.5 g) seguido por adición del monohidrato del ácido p-toluenosulfónico (200 mg) . La solución se agita a temperatura ambiente durante 1 hora y se le reduce la temperatura agregando una solución de bicarbonato de sodio (1 mi) . Luego la solución de diclorometano se seca sobre MgS04 y se concentra. El residuo se purifica en columna de gel de sílice eluyendo con hexano y acetato de etilo (8:2) para dar 1.5 g del producto de 2-hidroxi-3 , -dimetil-5- (tetrahidro-piran-2-iloxi ) -benzaldehído . Etapa 2 Una mezcla de 2-hidroxi-3, 4-dimetil-5- (tetrahidro-piran-2-iloxi ) -benzaldehído (150 mg) de la Etapa 1, bromoacetato de metilo (180 mg) y carbonato de potasio (200 mg) en DMF (10 mi) se agita a temperatura ambiente durante 2 horas. Luego la solución se vierte en agua y se extrae con acetato de etilo. El acetato de etilo se lava con agua y salmuera, se seca sobre MgS0 y se concentra. El residuo se purifica en columna de gel d sílice eluyendo con hexano y acetato de etilo (9:1) para dar 100 mg del éster metílico del ácido [6-formil-2, 3-dimetil-4- (tetrahidro-piran-2-iloxi) -fenoxi]-acético, el cual se disuelve entonces en DMF (15 mi). A esta solución se agrega carbonato de cesio (200 mg) y la mezcla se agita a temperatura ambiente toda la noche. Luego la solución se vierte en agua y se extrae con acetato de etilo. La capa orgánica se lava con agua y salmuera, se seca sobre MgS0 y se concentra para dar el éster metílico del ácido 6, 7-dimetil-5- ( tetrahidro-piran-2-iloxi ) -benzofuran-2-carboxilico. El éter tetrahidropiranilico se disuelve en metanol, se agrega monohidrato del ácido p-toluenosulfónico (20 mg) , y la solución se agita a temperatura ambiente durante unos 30 minutos adicionales. Después de la adición de una cantidad pequeña de NaHC03, el metanol fue evaporado. El residuo se purifica por cromatografía en columna de gel de sílice, eluyendo con hexano y acetato de etilo (7:3) para dar 30 mg del éster metílico del ácido 5-hidroxi-6, 7-dimetil-benzofuran-2-carboxílico . RM XE (CDC13, 300 MHz) d: 7.39 (s, 1H) , 6.87 (s, 1H) , 4.75 (s, 1H) , 3.95 (s, 3H) , 2.50, 2.26 (2s, 6H) ppm. Ejemplo 22 Ester 2-[2- (2-metoxi-etoxi) -etoxi]-etílico del ácido 5- hidroxi-6, 7-dimetil-benzofuran-2-carboxílico Una mezcla del ácido (50 mg) , 2-[2- (2-metoxi-etoxi) -etoxi]-etanol (100 µ?) , DCC (120 mg) , DMA.P (50 mg) en DCM (20 mi) se agita a temperatura ambiente toda la noche. La mezcla fue vertida en agua y se extrae con acetato de etilo. La capa orgánica se' lava con agua y salmuera, se seca sobre MgS04 y se concentra. El residuo se purifica por cromatografía en columna de gel de sílice eluyendo con EtOAc al 40% en hexano para dar el éter tetrahidropiranílico del éster 2-[2-(2-metoxi-etoxi ) -etoxi]-etílico del ácido 5-hidroxi-6, 7-dimetil-benzofuran-2-carboxílico (40 mg) . Este compuesto intermedio es disuelto en MeOH, se agrega HC1 diluido, y la mezcla se agita durante 30 minutos. La mezcla se vierte en agua y se extrae con acetato de etilo. La capa orgánica se lava con agua y salmuera, se seca sobre MgS04 y se concentra. La purificación en columna de gel de sílice eluyendo con MeOH al 2% en DCM dio 30 mg del éster 2-[2- ( 2-metoxi-etoxi ) -etoxi]-etílico del ácido 5-hidroxi-6, 7-dimetil-benzofuran-2-carboxílico. RMN ?? (CDC13, 300 MHz) d: 7.27 (s, 1H) , 6.84 (s, 1H) , 6.30 (amp., 1H) , 4.50 (m, 2H) , 3.87 (m, 2H) , 3.71-3.50 (m, 8H) , 3.35 (s, 3H) , 2.42 (s, 3H) , 2.26 (s, 3H) ppm. RMN 13C (CDCls, 75 MHz) 8: 159,33, 150.91, 150.11, 143.97, 124.82, 123.33, 121.14, 102.70, 71.04, 70.23, 70.15, 70.11, 68.76, 63.74, 58.56, 11.86, 11.81 ppm. EM: 375.1 (M+H+) . De manera semejante, siguiendo el procedimiento descrito anteriormente pero reemplazando el 2-[2- (2-metoxi-etoxi ) -etoxi]-etanol con el alcohol apropiado, se prepararon los siguientes compuestos: El geraniol dio el éster 3, 7-dimetil-octa-2 , 6-dienílico del ácido 5-hidroxi-6, 7-dimetil-benzofuran-2- carboxilico; RMN ¾ (CDC13, 300 MHz) d: 7.54 (s, 1H) , 7.07 (s, 1H) , 5.48 (m, 1H) , 5.36 (s, 1H) , 5.09 (m, 1H) , 4.87 (m, 2H) , 2.49 (s, 3H) , 2.28 (s, 3H) , 2.08 (m, 4H) , 1.80, 1.60, 1.39 (3s, 9H) ppm. RMN 13C (CDCI3, 75 MHz) d: 159.67, 150.50, 150.28, 144.67, 142.55, 131.49, 124.38, 123.53, 123.27, 121.39, 117.48, 113.59, 102.87, 61.79, 39.14, 25.83, 25.26, 17.28, 16.19, 11.89, 11.94 ppm. EM: 343 (M+H+) . El 2-aminoetanol dio la (2-hidroxi-etil) -amida del ácido 5-hidroxi-6, 7-dimetil-benzofuran-2-carboxí lico; RMN XH (DMSO-d6, 300 MHz) 6: 9.3 (amp., 1H) , 8.42 (s, 1H) , 7.25 (s, 1H) , 6.83 (s, 1H) , 4.77 (amp., 1H) , 3.47 (m, 4H) , 2.37 (s, 3H) , 2.11 (s, 3H) ppm. RMN 13C (DMSO-d6, 75 MHz) 8: 158.90, 151.77, 148.24, 147.89, 123.98, 123.77, 120.63, 109.69, 102.62, 59.44, 12.20, 11.95 ppm. EM: 250 (M+H+) . El 2- (2-hidroxi-etilamino) -etanol dio la bis- (2-hidroxi-etil ) -amida del ácido 5-hidroxi-6, 7-dimetil-benzofuran-2-carboxilico, RMN ?. (CD3OD, 300 MHz) d: 7.26 (s, 1H) , 6.83 (1H), 3.90-3.70 (m, 8H) , 2.40 (s, 3H) , 2.23 (s, 3H) ppm. RMN 13C (CD3OD, 75 MHz) d: 161.71, 151.76, 148.60, 147.35, 123.77, 123.25, 119.93, 112.09, 101.73, 60.29, 58.78, 51.76, 50.27, 10.49, 10.43 ppm. EM: 294 (M+H+) . La morfolina dio la (5-hidroxi-6, 7-dimetil-benzofuran-2-il) -morfolin-4-il-metanona; RMN 2H (DMSO-d6-D20, 300 MHz) d: 7.22 (s, 1H) , 5.88 (1H), 3.65 (m, 8H) , 2.34 (s, 3H) , 2.15 (s, 3H) ppm. EM: 276 (M+H+) .
Ejemplo 23 2-Hidroximetil- 6, 7-dimetil-benzofuran-5-ol El éster metílico del ácido 5-hidroxi-6, 7-dimetil-benzofuran-2-carboxí lico (231 mg) preparado como en el Ejemplo 2, se disolvió en THF y se agregó hidruro de litio y aluminio (93 mg) . La mezcla se agita a temperatura ambiente durante 4 horas. Luego la solución se vierte en agua y se extrae con acetato de etilo. El acetato de etilo se lava con agua y salmuera, se seca sobre MgS04 y se concentra. La purificación en columna de gel de sílice eluyendo con EtOAc al 50% en hexano dio 89 mg del 2-hidroximetil-6, 7-dimetil-benzofuran-5-ol. RMN *H (CD3OD, 300 MHz) d: 6.75 (1H), 6.47 (s, 1H) , 4.61 (s, 2H) , 2.37 (s, 3H) , 2.20 (s, 3H) , ppm. RMN 13C (CD3OD, 75 MHz ) d: 155.87, 150.51, 148.68, 124.69, 119.93, 119.20, 103.01, 101.62, 56.32, 10.43, 10.29 ppm. EM: 175 (M-OH)÷.
Ejemplo 24 6, 7-Dimetil-2- (4-nitro-fenil) -benzofuran-5-ol Una mezcla del 2-hidroxi-3, 4-dimetil-5- (tetrahidro-piran-2-iloxi) -benzaldehído (200 mg) preparada como en el Ejemplo 21, bromuro de p-nitrobencilo (200 mg) y carbonato de potasio (220 mg) en DMF (10 mi) se agita toda la noche a temperatura ambiente. Luego la solución se vierte en agua y se extrae con acetato de etilo. El acetato de etilo se lava con agua y salmuera y se seca sobre MgS04 y se concentra. El residuo se purifica en columna de gel de sílice eluyendo con hexano : acetato de etilo (8:2) para dar 242 mg del éter tetrahidropiranílico del 6, 7-dimetil-2- (4-nitro-fenil) -benzofuran-5-ol . Una mezcla del éter (240 mg) y NaOMe (17 mg) en DMF (10 mi) se agita a 70 °C durante 2 horas. Luego la solución se vierte en agua y se extrae con acetato de etilo. La capa orgánica se lava con agua y salmuera, se seca sobre MgS04 y se concentra. El residuo se disuelve en MeOH y se agrega monohidrato del ácido p-toluenosulfónico (20 mg) y la solución se agita a temperatura ambiente durante 1.5 horas.
Después de la adición de una pequeña cantidad de NaHCCh, el metanol fue evaporado, y el residuo fue purificado por cromatografía en columna de gel de sílice eluyendo con hexano y acetato de etilo (7:3) para dar 170 mg del 6, 7-dimetil-2- (4-nitro-fenil) -benzofuran-5-ol . RMN 1H (CDCl3-DMSO-d6, 300 MHz) d: 9.16 (s, 1H) , 8.28 (d, J = 8.1 Hz, 2H) , 8.06 (d, J = 8.1 Hz, 2H) , 7.46 (s, 1H) , 6.87 (s, 1H) , 2.44, 2.18 (2s, 6H) ppm. RMN 13C (CDC13-DMSO-d6, 75 MHz) 8: 152.87, 152.57, 149.68, 147.15, 137.19, 126.16, 125.64, 125.07, 123.56, 120.66, 107.03, 103.13, 12.92, 12.84 ppm. De manera semejante, siguiendo el procedimiento descrito anteriormente, se preparó el siguiente compuesto: 4- (5-Hidroxi-6, 7-dimetil-benzofuran-2-il ) -benzonitrilo; RMN 2H (DMSO-ds, 300 MHz) d: 9.24 (s, 1H) , 8.00 (d, J = 8.0 Hz, 2H) , 7.90 (d, J = 8.0 Hz, 2H) , 7.47 (s, 1H) , 6.87 (s, 1H) , 2.41, 2.18 (2s, 6H) ppm. RMN 13C (DMSO-d6, 75 MHz) d: 152.92, 152.82, 149.36, 135.22, 133.75, 126.19, 125.50, 123.17, 120.75, 119.72, 110.80, 106.30, 103.10, 12.95, 12.84 ppm. Ejemplo 25 5-Hidroxi-6, 7-dimetil-benzofuran-2-carbaldehído Una mezcla de 2-hidroxi-3, -dimetil-5- (tetrahidro-piran-2-iloxi ) -benzaldehido (300 mg) , bromoacetaldehído dimetil acetal (300 mg) y carbonato de potasio (330 mg) en DMF (10 mi)' se agita a 140 °C durante 2 horas. Luego la solución se vierte en agua y se extrae con acetato de etilo. La capa orgánica se lava con agua y salmuera, se seca sobre MgS04 y se concentra. El residuo se purifica por cromatografía en columna de gel de sílice eluyendo con hexano : acetato de etilo (8:2) para dar 102 mg del éter tetrahidropiranílico del 5-hidroxi-6, 7-dimetil-benzofuran-2-carbaldehído . Una solución de este compuesto intermedio (100 mg) en ácido acético (15 mi) se somete a reflujo durante 2 horas. Luego se evapora el ácido acético y el residuo se purifica por cromatografía en columna de gel de sílice eluyendo con 30% de acetato de etilo en hexano para dar 70 mg de 5-hidroxi-6, 7-dimetil-benzofuran-2-carbaldehído . La purificación adicional . en "gel de sílice eluyendo con diclorometano y acetato de etilo (9:1) dio un producto puro (36 mg) . RMN 2H (DMSO-d6, 300 MHz ) ' d: 9.75 (s, 1H) , 9.55 (s, 1H) , 7.79 (s, 1H) , 7.00 (s, 1H) , 2.39 (s, 3H) , 2.20 (s, 3H) , ppm. RMN 13C (DMSO-d6, 75 MHz) d: 181.06, 181.02, 153.46, 152.89, 150.56, 128.00, 124.47, 121.72, 120.79, 104.14, 13.24, 12.84 ppm. Aunque la presente invención ha sido descrita con referencia a las modalidades específicas de la misma, se debe entender por aquellos expertos en el arte que se pueden hacer varios cambios y los equivalentes pueden ser substituidos sin apartarse del espíritu y alcance verdaderos de la invención. Además, se pueden hacer muchas modificaciones para adaptarse una situación particular, material, composición de materia, proceso, etapa o etapas de proceso, al objetivo, espíritu y alcance de la presente invención. La totalidad de tales modificaciones están propuestas para estar dentro del alcance de las reivindicaciones anexas al presente. Todas las patentes y publicaciones citadas anteriormente son incorporadas aquí para referencia. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (25)

  1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecedente se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones . 1. Un compuesto representado por la Fórmula I Fórmula I caracterizado porque: R1 es: hidrógeno, (Ci-C6) -alquilo opcionalmente substituido, (C2-Ci0) -alquenilo opcionalmente substituido, arilo opcionalmente substituido, (Ci-C6) - (alcoxi opcionalmente substituido) carbonilo, o halógeno: R2 y R3 son seleccionados independientemente de (Ci-C6)-alquilo opcionalmente substituido, (C2-Ci0) -alquenilo opcionalmente substituido o (C3-C8) -cicloalquilo opcionalmente substituido; R4 es: hidrógeno, arilo opcionalmente substituido, ( (C!-C6) -alquilo opcionalmente substituido) carbonilo, (arilo opcionalmente substituido) carbonilo, (heterociclilo opcionalmente substituido) carbonilo, (heterociclilalquilo opcionalmente substituido) carbonilo, ( (Ci-C6) -alcoxi opcionalmente substituido) carbonilo, ( (C2-Ci0) -alqueniloxi opcionalmente substituido) carbonilo, (amino opcionalmente substituido) carbonilo, carboxi, formilo, o hidroxi- ( (Ci-C6) -alquilo) (opcionalmente substituido) ; R5 es: hidrógeno, (Ci-C6) -alquilo, (C2-Ci0) -alquenilo, (alcoxi opcionalmente substituido) carbonilo, carboxi, (amino opcionalmente substituido) carbonilo, o arilo opcionalmente substituido; siempre que uno de R4 o R5 sea hidrógeno, y que cuando R4 es hidrógeno Rs no sea hidrógeno, y cuando R5 es hidrógeno R4 no sea hidrógeno; R es hidrógeno, (d-C6) -alquilo, (Ci-C6) -alquilcarbonilo, fosforilo, o polialcoxi; o R y R1 con los átomos a los cuales los mismos están fijados forman un anillo opcionalmente substituido; incluyendo los estereoisómeros solos, mezclas de estereoisómeros, y las sales de los mismos farmacéuticamente aceptables .
  2. 2. El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque R1 es hidrógeno o halógeno .
  3. 3. El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque R2 y R3 son (Ci-C6)-alquilo.
  4. 4 El compuesto de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque R1 es hidrógeno.
  5. 5. El compuesto de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque R es hidrógeno.
  6. 6. El compuesto de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque R5 es fenilo opcionalmente substituido, y en donde uno o más substituyentes son seleccionados independientemente de (Ci-C6) -alquilo, (Ci-C6) -alcoxi, hidroxi, carboxi, (Ci-Ce)-alcoxicarbonilo, nitro, halo, y ciano.
  7. 7. El compuesto de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque R4 es hidrógeno.
  8. 8. El compuesto de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque R4 es fenilo opcionalmente substituido, y en donde uno o más substituyentes son seleccionados independientemente de (Ci-C6) -alquilo, (Ci-C6) -alcoxi , hidroxi, carboxi, (Ci-C<¡) -alcoxicarbonilo, nitro, halo, y ciano.
  9. 9. El compuesto de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque R4 es 4-nitrofenilo o 4-cianofenilo, y R5 es hidrógeno.
  10. 10. El compuesto de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque R4 es formilo, fenilcarbonilo opcionalmente substituido, (Ci-Ce) -alquilcarbonilo opcionalmente substituido, o hidroxi ( (Ci-C6) -alquilo opcionalmente substituido) , en donde uno o más substituyentes son seleccionados independientemente de hidroxi, hidroxialquilo, halógeno, ciano, y heterociclilo .
  11. 11 . El compuesto de conformidad con la reivindicación 10 , caracterizado porque R4 es formilo, fenilcarbonilo, acetilo, bromoacetilo, morfolin-l-il-acetilo, hidroximetilo, l-hidroxi-2-morfolinil-4-il etilo, o 6-hidroxi-3-metil-[l , 3]oxazinan-6-ilo, y R5 es hidrógeno.
  12. 12 . El compuesto de conformidad con la reivindicación 5 , caracterizado porque R4 es ( Ci-C6 ) -alcoxicarbonilo, ( C2-Ci0 ) -alqueniloxicarbonilo, o aminocarbonilo substituido opcionalmente, en donde uno o más substituyentes son seleccionados independientemente de ( Ci~ C6 ) -alquilo e hidroxi- ( Ci-C6) -alquilo .
  13. 13. El compuesto de conformidad con la reivindicación 12 , caracterizado porque R4 es bis- ( 2-hidroxi-etil) -amida, 2-hidroxi-etil-amida, ácido carboxilico; éster metílico del ácido carboxilico; éster 3, 7-dimetil-octa- 2 , 6-dienílico del ácido carboxilico; éster [2- ( 2-metoxi-etoxi) -etoxi]etílico o morfolin-l-il-carbonilo; y R3 es hidrógeno.
  14. 14. El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque R y R1 con los átomos a los cuales los mismos están fijados forman un anillo opcionalmente substituido.
  15. 15 . El compuesto de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque R y R1 con los átomos a los cuales los mismos están fijados forman un anillo de furano substituido con un fenilo, el fenilo está substituido opcionalmente con uno o más substituyentes seleccionados independientemente de alquilo, alquenilo, hidroxi, alcoxi, nitro, ciano, carboxi, éster, haloalquilo, y halo.
  16. 16. El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque se selecciona del grupo de: · ( 5-Hidroxi-3 , 6, 7-trimetil-benzofuran-2-il ) -fenil-metanona; • (5-hidroxi-6, 7-dimetil-benzofuran-2-il ) -morfolin-4-il-metanona; • 1- ( 5-Hidroxi-6, 7-dimetil-benzofuran-2-il) -etanona; · Ester 2- (2-bromo-acetil ) -6, 7-dimetil-benzofurari-5-ílico del ácido acético; • 2- (l-Hidroxi-2-morfolin-4-il-etil) , 6, 7-dimetil-benzofuran-5-ol ; • Ester 6, 7-dimetil-2- (2-morfolin-l-il-acetil) -benzofuran-5-ilico del ácido acético; • Ester 2- ( 6-hidroxi-3-metil-[l, 3]oxazinan-6-il) -6, 7-dimetil-benzofuran-5-ilico del ácido acético; • 1- ( 5-Hidroxi-6, 7-dimetil-benzofuran-2-il) -2-morfolin-4-il-etanona; · 1- ( 4-Bromo-5-hidroxi-6, 7-dimetil-benzofuran-2-il ) -etanona; • 2-Hidroximetil-6, 7-dimetil-benzofuran-5-ol ; • 6, 7-Dimetil-3-fenil-benzofuran-5-ol ; • 6, 7-Dimetil-2- (4-nitro-fenil) -benzofuran-5-ol; · 5-Hidroxi-6, 7-dimetil-benzofuran-2-carbaldehído; • 4- (5-Hidroxi-6, 7-dimetil-benzofuran-2-il) -benzonitrilo; • Acido 5-hidroxi-6, 7-dimetil-benzofuran-2-carboxílico; • Ester metílico del ácido 5-hidroxi-6, 7-dimetil-benzofuran-2-carboxílico; · Ester 3, 7-dimetil-octa-2, 6-dienílico del ácido 5-hidroxi-6, 7-dimetil-benzofuran-2-carboxí lico; • Bis- (2-hidroxi-etil) -amida del ácido 5-hidroxi-6, 7-dimetil-benzofuran-2-carboxílico; • Ester 2-[2- (2-metoxi-etoxi ) -etoxi]-etílico del ácido 5-hidroxi-6, 7-dimetil-benzofuran-2-carboxílico; • (2-Hidroxi-etil) -amida del ácido 5-hidroxi-6, 7-dimetil-benzofuran-2-carboxílico.; • ( 5-Hidroxi-3, 6, 7-trimetil-benzofuran-2-il ) -fenil-metanona; · Ester 2- (2-bromo-acetil ) -6, 7-dimetil-benzofuran-5-ílico del ácido acético; • 2-Hidroximetil-6, 7-dimetil-benzofuran-5-ol ; • 6, 7-Dimetil-3-fenil-benzofuran-5-ol ; • 6, 7-Dimetil-2- (4-nitro-fenil) -benzofuran-5-ol; · 5-Hidroxi-6, 7-dimetil-benzofuran-2-carbaldehído; • Acido 5-hidroxi-6, 7-dimetil-benzofuran-2-carboxílico; • Ester metílico del ácido 5-hidroxi-6, 7-dimetil-benzofuran-2-carboxílico; • Bis- (2-hidroxi-etil) -amida del ácido 5-hidroxi-6, 7-dimetil-benzofuran-2-carboxílico ; • Ester 2-[2- (2-metoxi-etoxi) -etoxi]-etílico del ácido 5-hidroxi-6, 7-dimetil-benzofuran-2-carboxílico; • (2-Hidroxi-etil) -amida del ácido 5-hidroxi-6, 7-dimetil-benzofuran-2-carboxílico; · 3- (4-Metoxi-fenil) -6, 7-dimetil-benzofuran-5-ol; • 3- (4-Cloro-fenil) -6, 7-dimetil-benzofuran-5-ol ; • 3- (4-Fluoro-fenil) -6, 7-dimetil-benzofuran-5-ol ; • 4, 5-Dimetil-l, 8-difenil-benzo[l, 2-b;4, 3-b ' ]difurano; • 1, 8-Bis- (4-fluoro-fenil) -4, 5-dimetil-benzo[l, 2-b; 4, 3-b']difurano; y • 1, 8-Bis- (4-metoxi-fenil) -4, 5-dimetil-benzo[l , 2-b; , 3-b'jdifurano.
  17. 17. Una formulación farmacéutica o cosmética, caracterizada porque comprende un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, mezclado con al menos un excipiente aceptable.
  18. 18. Un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque se utiliza como un medicamento.
  19. 19. El uso de uno o más compuestos de conformidad con las reivindicaciones 1 a 16 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de una enfermedad distinguida por la tensión oxidante.
  20. 20. El uso de conformidad con la reivindicación 19, en donde la condición comprende apoplejía, isquemia cerebral, isquemia retinal, infarto de miocardio, insuficiente cardiaca crónica, disfunciones cognitivas post -quirúrgicas , neuropatía periférica, lesiones de la médula espinal, lesiones de la cabeza y trauma quirúrgico.
  21. 21. El uso de conformidad con la reivindicación 19, en donde la condición involucra componentes inflamatorios o autoinmunes .
  22. 22. El uso de conformidad con la reivindicación 19, en donde la condición es una condición dermatológica.
  23. 23. El uso de conformidad con la reivindicación 22, en donde la condición comprende la regulación de la condición de la piel, la regulación de las señales de enve ecimiento de la piel, la regulación de la modulación del crecimiento del cabello, y el tratamiento de dermatitis por contacto, pigmentación de la piel, irritación incluyendo irritación inducida por retinoides, acné, psoriasis, daño relacionado con la edad y daño que resulta de la radiación perjudicial (UV) , tensión o fatiga.
  24. 24. El uso de uno o más compuestos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 para la fabricación' de un medicamento para el tratamiento o prevención de una condición inflamatoria caracterizada por los niveles elevados de proteína C reactiva.
  25. 25. El uso de conformidad con la reivindicación 24, en donde la condición inflamatoria comprende la condición inflamatoria cardiovascular, condición inflamatoria respiratoria, sepsis, diabetes, fatiga muscular, lupus eritematoso sistémico (SLE) , enfermedad renal de la etapa final (ERSD) , enfermedad periodontal, y condiciones inflamatorias de la piel.
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