MXPA04007041A - Cuerpos de inclusion de fosfolipidos y uso de los mismos en tratamientos medicos. - Google Patents

Abstract

Composiciones sinteticas y semi-sinteticas que presentan actividad biologica y uso de las mismas en el tratamiento y/o la profilaxis de diversos trastornos en pacientes mamiferos. Mas particularmente, la preparacion y el uso de cuerpos de inclusion sinteticos y semi-sinteticos que, despues de su introduccion en el cuerpo de un paciente, producen efectos beneficos anti-inflamatorios, protectores de organos e inmunoreguladores. La invencion tambien se relaciona con tratamientos y composiciones para aliviar enfermedades inflamatorias y autoinmunes y los sintomas de las mismas.

Description

ES, FI, FR, GB, GR, HU, 1E, IT, LU, MC, NL, PT, SE, SI, For Mo-letter codes and othcr abbreviations, refir lo ihe "Guid- ST T OA-PI- arenrfBFrBJrCFrGe ei eMreArGN^ — anee-N< es- ^ode&and-Abbrexiaiionlappearing.aLthe.b_egin- OQ, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG), ning of each regular issue of ihe PCT Gazette. Published: — with inlernalional search report CUERPOS DE INCLUSIÓN DE FOSFOLÍPIDOS Y USO DE LOS MISMOS EN TRATAMIENTOS MÉDICOS ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Campo de la invención Esta invención se relaciona con composiciones sintéticas y semi-sintéticas que poseen actividad biológica y con los usos de las mismas en el tratamiento y/o la profilaxis de diversos trastornos en pacientes mamíferos. Más particularmente se relaciona con preparaciones y usos de cuerpos de inclusión sintéticos y semi-sintéticos , que después de su introducción en el cuerpo de un paciente, produce efectos benéficos anti-inflamatorios, protectores de .órganos e inmunoreguladores . La invención ' también se relaciona con tratamientos y composiciones para aliviar enfermedades inflamatorias y autoinmunes y los síntomas de las mismas . ¦ " Antecedentes de la invención Las células presentadoras de antígenos (APC) profesionales, inclusive células dendríticas (DO y macrófagos (Mph) , son tipos celulares que capturan y procesan de forma activa los antígenos (Ags) , eliminan los desechos celulares y los organismos infecciosos y las células moribundas, incluyendo los residuos de las células moribundas. Durante este proceso, las APC pueden estimular la producción de respuestas dominadas ya sea por citoquinas pro- inflamatorias Thl (IL-12, IL-1, INF-?, TNF- , etc.); o por citoquinas Th2/Th3 reguladoras/anti-inflamatorias (tal como IL-10, TGF-ß, IL-4 etc.); dependiendo de la naturaleza del antígeno (Ag) o de los residuos celulares hallados y del nivel de maduración/activación de las APC. Las APC eliminan los desechos celulares, algunos de los cuales derivan de las membranas de las células del cuerpo, algunos de infecciones bacterianas y parasitarias y de organismos comensales, tal como las bacterias intestinales. En tanto parte de estos desechos celulares iniciarán un respuesta pro-inflamatoria, parte iniciará una respuesta protectora y anti- inflamatoria . Un sistema inmunológico que funciona normalmente puede distinguir entre los antígenos de organismos invasores extraños (no propios) y tejidos o desechos derivados de material "propio" , montando una respuesta inmune solamente por aquellos antígenos que son extraños. Cuando el sistema inmunológico de un paciente no puede discriminar entre materiales propios y no propios, surgen los trastornos autoinmunes .

Sumario de la invención Esta invención está dirigida al descubrimiento que los cuerpos de inclusión, tal como liposomas, perlas o . 5 partículas similares, que comprenden que comprenden ciertos grupos químicos reactivos tal como grupos de fosfolípidos aniónicos, distintos de serina-fosfato y glicerol-fosfato causarán, . después de su administración a un paciente mamífero, un efecto anti-inflamatorio y por ello se pueden 10 usar en el tratamiento de numerosas enfermedades . Estos : cuerpos de inclusión pueden comprender además como j componente menor sobre la superficie de los. mismos un *:' constituyente inactivo y/o un constituyente que sea activo j¾ pero a través de un mecanismo diferente. 15 En una realización preferida, la. invención está dirigida a una composición de un material capaz de producir una respuesta anti-inflamatoria in vivo en un mamífero, donde dicha composición comprende cuerpos de inclusión í aceptables para uso farmacéutico de un tamaño que comprende f * 20 entre 20 nanómetros (rim) y 500 micrómetros (µp?) aproximadamente, que comprende una pluralidad de grupos químicos reactivos (de aquí en adelante denominados "grupos promotores de respuestas anti-inflanatorias" ) distintos de serina-fosfato y glicerol-fosfato, que interactúan con 25 receptores sobre las células del .sistema inmune de mamíferos alterando el perfil de las citoquinas del sistema inmune que favorecen una anti-inflamación . Los grupos promotores de respuestas anti-inflamatorias incluyen los grupos activos de ciertos fosfolípidos aniónicos y de otros fosfolípidos, distintos de serina-fosfato y glicerol-fosfato, ciertos péptidos y miméticos sintéticos de los mismos, proteínas adaptadoras, lípidos, lipoproteínas y semejantes, que se describirán más específicamente más adelante. Se cree que los cuerpos de inclusión interactúan con el sistema inmune de un mamífero a través de dichos grupos, después de la administración de los mismos, produciéndose una respuesta anti- inflamatoria in vivo en dicho mamífero. Preferentemente, los cuerpos de inclusión están esencialmente libres de entidades no lipídicas farmacéuticamente activas. Preferentemente los grupos constituyen un 60% - 100% de los grupos activos sobre la superficie de los cuerpos de inclusión. En algunas indicaciones, los cuerpos de inclusión también pueden transportar como componente menor sobre su superficie un constituyente inactivo (tal como colina-fosfato) o un constituyente que es activo a través de otro mecanismo, tal como serina-fosfato . En otra realización, esta invención está dirigida cuerpos de inclusión tridimensionales sintéticos, semi-sintéticos o naturales, también denominados cuerpos de inclusión aceptables para uso farmacéutico, que han sido trroi±irf"icados para comprender, como componente principal, al menos un ligando promotor de respuestas anti-inflamatorias, donde dicho ligando es un fosfolípido aniónico distinto de PG o PS, donde PG y PS son como se definirán más adelante.

En aún otra realización, esta invención está dirigida a cuerpos de inclusión tridimensionales sintéticos, semi-sintéticos o naturales, denominados también cuerpos de inclusión aceptables para uso farmacéutico en este documento, que tienen tamaños que varían en un rango entre 20 nm y 50 micrómetros y que poseen grupos promotores de respuestas anti-inflamatorias distintos de glicerol-fosfato y serina-fosfato, sobre la superficie de los mismos. En otro aspecto, la invención está dirigida a un método para el tratamiento de un trastorno mediado por el funcionamiento de las células T que comprende la administración a un paciente mamífero de una cantidad eficaz de cuerpos de inclusión aceptables para uso farmacéutico que transportan una cantidad eficaz de grupos promotores de respuestas anti-inflamatorias, para inhibir y/o reducir el avance del trastorno mediado por el funcionamiento de células T. Esta invención está dirigida además a un método para el tratamiento de un trastorno inflamatorio que comprende la administración a un paciente de una cantidad eficaz de cuerpos de inclusión aceptables para uso farmacéutico que tra¾s rtran una cantidad eficaz de grupos promotores de respuestas anti-inflamatorias para inhibir y/o reducir el avance de dicho trastorno inflamatorio. Aún otra realización de esta invención es un método para el tratamiento de un trastorno de la función endotelial que comprende la administración a un paciente mamífero de una cantidad eficaz de cuerpos de inclusión aceptables para uso farmacéutico que transportan una cantidad eficaz de grupos promotores de respuestas antiinflamatorias para inhibir y/o reducir el avance de dicho trastorno de la función endotelial. Otra realización es un método para el tratamiento de un trastorno inmunológico caracterizado por una expresión inadecuada de citoquinas que comprende la administración a un paciente mamífero de una cantidad eficaz de cuerpos de inclusión aceptables para uso farmacéutico que transportan una cantidad eficaz de grupos promotores de respuestas anti-inflamatorias para inhibir y/o reducir el avance de dicho trastorno inmunológico. La invención está dirigida además a un proceso para el tratamiento o la profilaxis de un trastorno cardíaco en mamíferos, cuya presencia o susceptibilidad a la misma es detectable mediante observación de un intervalo prolongado de QT-c en el electrocardiograma del paciente, donde dicho proceso comprende la administración a un paciente mamífero que padece del mismo o que es susceptible al mismo de una composición farmacéutica que comprende cuerpos de inclusión biocompatibles sintéticos, semi-sintéticos o naturales aceptables para uso farmacéutico, también denominados cuerpos de inclusión aceptables para uso farmacéutico en este documento, y un vehículo aceptable para uso farmacéutico, donde al menos una porción de dichos cuerpos de inclusión tiene un tamaño que se encuentra en el rango entre 20 nm y 500 µp? aproximadamente, y donde las superficies de dichos cuerpos de inclusión han sido modificadas para transportar, como componente principal, al menos un grupo promotor de respuestas anti- inflamatorias , donde dicho grupo es un grupo anti - inflamatorio distinto de glicerol-fosfato y serina- fosfato . Otra realización de la invención es una composición farmacéutica, en una forma de dosificación unitaria, para su administración a un paciente mamífero, que comprende cuerpos de inclusión aceptables para uso farmacéutico y un vehículo aceptable para uso farmacéutico, donde al menos una porción de los cuerpos de inclusión tienen un tamaño en el rango entre 20 nm y 500 µ?? aproximadamente y donde la superficie de dichos cuerpos de inclusión comprenden grupos promotores de respuestas anti-inflamatorias, donde dicha dosificación unitaria comprende entre 500 y 2,5 x 1Q9 cuerpos de inclusión aproximadamente, donde dicho grupo es ürr~grupo promotor de respuestas anti- inflamatorias distinto de glicerol-fosfato y serina- fosfato . Una realización adicional de esta invención es una composición farmacéutica que comprende cuerpos de inclusión biocompatibles sintéticos, semi-sintéticos o naturales aceptables para uso farmacéutico (también denominados cuerpos de inclusión aceptables para uso farmacéutico en este documento) y un vehículo aceptable para uso farmacéutico, donde al menos una porción de dichos cuerpos de inclusión tiene un tamaño entre 20 nm y 500 µp? aproximadamente y donde las superficies de dichos cuerpos de inclusión han sido modificadas para comprender, como componente principal , al menos un grupo promotor de respuestas anti -inflamatorias, donde dicho grupo es un grupo promotor de respuestas anti -inflamatorias distinto de glicerol-fosfato y serina-fosfato . Optativamente, los cuerpos de inclusión descriptos previamente pueden comprender además un constituyente que es un grupo tensioactivo inactivo y/o un constituyente que es un grupo tensioactivo que es activo mediante otro mecanismo, por ejemplo fosfatidilserina . (Véase, por ejemplo Fadok et al.. Publicación Internacional WO 01/66785) . En otra realización, esta invención está dirigida a cuerpos de inclusión aceptables para uso farmacéutico liofilizados o secados por congelamiento que transportan grupos de ligandos promotores de respuestas antiinflamatorias como grupos de unión y conjuntos de elementos [kits] que comprenden cuerpos de inclusión liofilizados o secados por congelamiento que comprenden grupos promotores de respuestas anti-inflamatorias, o grupos que se pueden convertir a su vez en grupos promotores de respuestas antiinflamatorias, y un vehículo aceptable para uso farmacéutico, donde dicho grupo es un grupo promotor de respuestas anti-inflamatorias distinto de glicerol- fosfato y serina-fosfato . En otro aspecto, esta invención está dirigida a un método para el tratamiento de un trastorno mediado por el funcionamiento de células T que comprende la administración a un paciente mamífero que padece o que tiene riesgo de padecer un trastorno mediado por el funcionamiento de células T, una cantidad eficaz de una composición que comprende cuerpos de inclusión aceptables para uso farmacéutico que son de un tamaño entre 20 nm aproximadamente y 500 µ?? aproximadamente, que comprenden sobre la superficie de los mismos una pluralidad de grupos promotores de respuestas an i-inflamatorias distintos de glicerol-fosfato o serina-fosfato o grupos que se pueden convertir en dichos grupos promotores de respuestas ani-j-inflamatorias, de modo que después de su administración, se inhibe y/o reduce el avance de dicho trastorno mediado por el funcionamiento de células T. Aún otra realización de esta invención está dirigida a un método para el tratamiento de un trastorno de la función endotelial que comprende la administración a un paciente mamífero, que padece o que tiene riesgo de padecer un trastorno de la función endotelial, de una cantidad eficaz de una composición que comprende cuerpos de inclusión aceptables para uso farmacéutico que son de un tamaño entre 20 nm aproximadamente y 500 µ?? aproximadamente, que comprenden sobre la superficie de los mismos una pluralidad de grupos promotores de respuestas ant i - inflamatorias distintos de glicerol-fosfato o serina-fosfato, o grupos que se pueden convertir a su vez en dichos grupos promotores de respuestas anti-inflamatorias , de manera que luego de su administración, se inhibe y/o reduce el avance de dicho trastorno mediada por una función endotelial. Otra realización de esta invención está dirigida a un método para el tratamiento de un trastorno inmunológico en un paciente mamífero que padece o que tiene riesgo de padecer un trastorno inmunológico, que comprende la administración a dicho paciente mamífero de una cantidad eficaz de una composición que comprende cuerpos de inclusión aceptables_jpara uso farmacéutico que son de un tamaño entre 20 nm aproximadamente y 500 µp? aproximadamente, que comprenden sobre la superficie de los mismos una pluralidad de grupos promotores de respuestas anti-inflamatorias distintos de glicerol-fosfato o serina-fosfato, o grupos que se pueden convertir a su vez en dichos grupos promotores de respuestas anti- inflamatorias , de modo tal que luego de su administración, se inhibe y/o reduce el avance de dicho trastorno inmunológico. Otra realización de esta invención está dirigida a un método para el tratamiento en un paciente mamífero que padece o que tiene riesgo de padecer de un trastorno inflamatorio que comprende la administración a dicho paciente mamífero de una cantidad eficaz de una composición que comprende cuerpos de inclusión aceptables para uso farmacéutico que son de un tamaño entre 20 nm aproximadamente y 500 µp? aproximadamente, que comprenden sobre la superficie de los mismos una pluralidad de grupos promotores de respuestas anti-inflamatorias distintos de glicerol-fosfato o serina- fosfato, o grupos que se pueden convertir a su vez en dichos grupos promotores de respuestas anti-inflamatorias, de modo tal que luego de su administración, se inhibe y/o reduce el avance de dicho trastorno inflamatorio.

Descripción breve de las figuras La Figura 1 que se adjunta es una presentación gráfica de barras de los resultados obtenidos en el Ejemplo 1 que se describirá más adelante. La Figura 2 es una presentación gráfica de barras de los resultados obtenidos de acuerdo con el Ejemplo 2 que se describirá más adelante. La Figura 3 muestra de manera similar los resultados obtenidos de acuerdo con el Ejemplo 3 que se describirá más adelante . La Figura 4 muestra de manera similar los resultados obtenidos de acuerdo con el Ejemplo 4 que se describirá más adelante . La Figura 5 muestra de manera similar los resultados obtenidos de acuerdo con el Ejemplo 5 que se describirá más adelante .

Descripción de las realizaciones preferidas De acuerdo con la presente invención, se administran a pacientes cuerpos de inclusión aceptables para uso farmacéutico que transportan grupos de ligandos promotores de respuestas anti-inflamatorias sobre la superficie de los mismos. Sin tener en cuenta una teoría particular, se cree que estos cuerpos de inclusión interactúan con el sistema iramnte del paciente obteniéndose con ello efectos benéficos, tal como inhibición de las citoquinas pro-inflamatorias in vivo y/o promoción de citoquinas anti-inflamatorias. Las células que reaccionan pueden ser células inmunes, tal como células presentadoras de antígenos profesionales o no profesionales, células endoteliales , células reguladoras, tal como células NK-T y otras . Estos cuerpos de inclusión aceptables para uso farmacéutico incluyen cuerpos de inclusión sintéticos, semi-sintéticos y naturales cuyos contornos son típicamente, pero no exclusivamente, esféricas, cilindricas, elipsoides, incluyendo esféricas achatadas y alargadas, serpenteadas, reniformes, etc., y tamaños entre 20 nm aproximadamente y 500 µt? aproximadamente de diámetro, preferentemente medido por el eje mayor. Los cuerpos de inclusión aceptables para uso farmacéutico poseen uno o varios grupos promotores de respuestas anti-inflamatorias de características predeterminadas sobre la superficie exterior de una manera tal que, en una realización, pueden interactuar con el o los receptores apropiados, distinto de la interacción exclusiva con el receptor PS o el receptor PG, sobre las células presentadoras de antígenos in vivo.. La estructura de estos grupos puede ser alterada mediante síntesis y puede incluir todo, parte o una versión modificada del grupo promotor de respuestas anti-inflamatorias original. Tal como se usa aquí, el término "PG" pretende abarcar los fosfolípidos que transportan un grupo glicerol-fosfato con un amplio rango de al menos una cadena de ácido graso, siempre que la entidad PG resultante pueda participar como un componente estructural de un liposoma. Preferentemente, dichos compuestos PG se pueden representar con la siguiente Fórmula I : donde R y R1 se seleccionan independientemente entre cadenas hidrocarbonadas de C!-C24, saturadas o insaturadas, de cadena lineal o que contienen una cantidad limitada de ramificaciones, donde al menos una cadena tiene entre 10 y 24 átomos de carbono. Esencialmente, las cadenas de lípidos R y R1 forman el componente estructural de los liposomas, en lugar del componente activo. Por consiguiente, se pueden variar para que incluyan dos o una de dichas cadenas de lípidos, ya sean iguales o diferentes, siempre que cumplan con dicha función estructural. Preferentemente, las cadenas de ti ictos^ pueden ser de ?0 a 24 átomos de carbono de longitud aproximadamente, saturados, monoinsaturados o poliinsaturados, de cadena lineal o con una cantidad limitada de ramificaciones. Como ejemplos de cadenas de lípidos saturados que son de utilidad se puede mencionar laurato (C12) , miristato (C14) , palmitato (C16) , estearato (C18) , araquidato (C20) , behenato (C22) y lignocerato (C24) para la PG en la presente invención. El palmitoleato (C16) y oleato (C18) son ejemplos de cadenas de lípidos monoinsaturados adecuadas. El linoleato (C18) , linolenato (C18) y ariquidonato (C20) son ejemplos de cadenas de lípidos poliinsaturados adecuados para su uso en PG en los liposomas de la presente invención. Los fosfolípidos con una sola de dichas cadenas de lípidos, que también son de utilidad en la presente invención, se conocen como lisofosfolípidos . La presente invención también abarca el uso de liposomas en los cuales el componente activo es la forma dimérica de PG, es decir, cardiolipina, pero también hay otros dímeros de la Fórmula I que son adecuados . Preferentemente, dichos dímeros no están entrecruzados sintéticamente con un agente de entrecruzamiento de síntesis, tal como maleimida sino que en realidad están entrecruzados por eliminación de una unidad de glicerol como describió Lehninger, Biocheznis ry, pág. 525 (1970) y como se muestra en la siguiente reacción: PG cariUoliptn HOC¾ (OH) CH2OH donde cada R y R1 son, independientemente, como se definieron previamente. Tal como se utiliza aquí, el término MPS" pretende abarcar fosfatidilserina y análogos/derivados de los mismos, siempre que dichos análogos/derivados aumenten o estimulen la actividad del receptor de fosfatidilserina . En una realización preferida estos grupos promotores cardiolipina de respuestas anti-inflamatorias son fosfolípidos aniónicos distintos de glicerol-fosfato o serina- fosfato . En una realización más preferida el fosfolípido aniónico es fosfatidilinositol . El inositol, hexahidroxiciclohexano, constituye el enlace químico con el grupo fosfato en el PI del fosfatidilinositol a través de uno de sus grupos hidroxilo. Existen diversos estereoisómeros de inositol, relacionados con la disposición de los grupos hidroxilo con relación al núcleo. Todas dichas formas estereoisoméricas de PI están comprendidas dentro de los términos fosfatidilinositol y PI tal como se utilizan aquí. Los análogos de fosfatidilinositol con grupos activos modificados, que también interactúan con los receptores PI sobre las células presentadoras de antígenos, o que de otra manera dan como resultado una reacción anti -inflamatoria en el cuerpo receptor, están contemplados dentro del alcance del término fosfatidilinositol . Estos incluyen, por ejemplo, compuestos en los cuales se han derivatizado uno o varios de los grupos hidroxilo y/o el grupo fosfato, o que se encuentran en la forma de una sal . Muchos de dichos compuestos forman grupos hidroxilo libres in vivo, en el momento o después de su administración. El fosfatidilinositol (PI) natural es un fosfolípido natural menor de las membranas celulares . Desde un punto de vista químico, contiene un grupo fosfoinositol , un grupo glicerol y un par de cadenas de ácidos grasos de Ci8-C2o similares pero diferentes, de modo que se pueden representar con la siguiente fórmula química II: donde R2 representa ariquidonato (C2o, 5, 8, 11, 14) y R3 representa estearato (Cis, saturado) . En tanto el compuesto PI natural anterior constituye el constituyente activo más preferido de los liposomas usados en la presente invención, las variaciones en la naturaleza y cantidad de cadenas de lípidos también están dentro del alcance de la misma. En esencia, las cadenas de lípidos forman el componente estructural de los liposomas, en lugar del componente activo. Por consiguiente, es posible variarlas para que incluyan dos o una de dichas cadenas de lípidos, ya sean iguales o diferente, siempre que cumplan con la función estructural. Preferentemente, las cadenas de lípidos pueden ser de 10 a 24 átomos de carbono de longitud aproximadamente, saturados, monoinsaturados o poliinsaturados , de cadena lineal o con una cantidad limitada de ramificaciones. Como ejemplos de cadenas de lípidos saturados que son de utilidad se puede mencionar laurato (C12) , miristato (C14) , palmitato (C16) , estearato (C18) , araquidato (C20) , behenato (C22) y lignocerato (C24) para el PI en la presente invención. El palmitoleato (C16) y oleato (C18) son ejemplos de cadenas de lípidos monoinsaturados adecuadas. El linoleato (C18) , linolenato (C18) y ariquidonato (C20) son ejemplos de cadenas de lípidos poliinsaturados adecuados para su uso en el PI en los liposomas de la presente invención. La configuración estérea de la cadena de lípidos no es importante y todos los estereoisómeros están comprendidos en la presente definición. Los fosfolípidos de una sola cadena de lípidos, también de utilidad en la presente invención, se conocen como lisofosfolípidos . Todas dichas variaciones están incluidas en las definiciones de PI . La presente invención también se puede considerar, desde otro aspecto, como el uso de un receptor sobre las células del sistema inmune de mamíferos, por ejemplo macrófagos, que se unen específicamente al grupo fosfato-inositol. La invención abarca cuerpos de inclusión que comprenden ligandos y grupos que se unirán a dicho receptor y que en consecuencia producirán una respuesta anti-inflamatoria. Por consiguiente, la presente invención se puede definir como cuerpos de inclusión que comprenden ligandos o grupos activos de los mismos que compiten por la unión o captación de los cuerpos de inclusión descriptos aquí por las células presentadoras de antígenos que expresan fosfato-inositol . El especialista en el arte puede determinar fácilmente si un cuerpo de inclusión particular es tal, que competirá, llevando a cabo experimentos d ~ prueba muy simples. Por ejemplo, los cuerpos de inclusión se pueden evaluar con una línea de células monocíticas fácilmente disponibles, tal como células U937. En un primer experimento, las células U937 se incuban solamente con liposomas PI marcados con fluorescencia y en otros experimentos las células U937 se incuban en presencia de liposomas PI marcados con fluorescencia y diferentes cantidades de compuesto de prueba. Si la captación de los liposoTuat PI marcados con fluorescencia en los otros experimen os está reducida en comparación con la del primer experimento, entonces el compuesto de prueba está compitiendo por el receptor específico y constituye un compuesto dentro del alcance de la presente invención. También se encuentra dentro del alcance de la presente invención el uso de cuerpos de inclusión que contienen una mezcla de los fosfolípidos mencionados previamente que presentan grupos químicamente activos, donde esta mezcla comprende al menos un 10% r preferentemente al menos un 50% y más preferentemente un 60-90% de los fosfolípidos activos mencionados previamente, tal como PI. En lugar que el constituyente menor sea un constituyente inactivo, también puede ser activo pero a través de otro mecanismo. Los ejemplos de "porciones tridimensionales de los cuerpos de inclusión" o "cuerpos de inclusión aceptables para uso farmacéutico" incluyen las e rtdHdes biocompatibles sintéticas, semi-sintéticas o naturales, tal como liposomas, perlas sólidas, perlas huecas, perlas rellenas, partículas, gránulos y microesferas de materiales biocompatibles, naturales o sintéticos, tal como polietilenglicol, polivinilpirrolidona, poliestireno , poli (metilmetacrilato) , etc., polisacáridos tal como almidón hidroxietilado, hidroxietilcelulosa, agarosa y semejantes, utilizados comúnmente en la industria farmacéutica. Las perlas pueden ser sólidas o huecas o pueden estar rellenas de un material biocompatible . El término "biocompatible" se refiere a sustancias que, en la cantidad empleada, no son tóxicas o presentan perfiles de toxicidad aceptables de modo que su uso in vivo sea aceptable. Dichos cuerpos de inclusión pueden incluir liposomas formados por lípidos, uno de los cuales es, por ejemplo, fosfatidilinositol (PI) . Como alternativa, los cuerpos de inclusión aceptables para uso farmacéutico pueden ser perlas sólidas, perlas huecas, perlas rellenas, partículas, gránulos y microesferas de materiales biocompatibles, que comprenden uno o varios materiales biocompatibles tal como polietilenglicol, poli (metilmetacrilato) , polivinilpirrolidona, poliestireno y un amplio rango de otros materiales naturales, semi-sintéticos y sintéticos, con grupos promotores de respuestas anti- inflamatorias distintos de gliceroJT-fo"srf¾üa~ o serina-fosfato unidos a los mismos. Como se indicó previamente, los análogos de fosfatidilglicerol con grupos activos modificados, que también interactúan con los receptores de PI sobre las células presentadoras de antígenos, a través de la misma vía receptora que PI o que de otra manera dan como resultado una reacción anti- inflamatoria en el cuerpo receptor, están contemplados dentro del alcance del término fosfatidilglicerol . Estos incluyen, por ejemplo, compuestos en los cuales se han derivatizado uno o varios de los grupos hidroxilo y/o el grupo fosfato, o que se encuentran en la forma de una sal. Muchos de dichos compuestos forman grupos hidroxilo libres in vivo, en el momento o después de su administración y, por lo tanto comprenden grupos convertibles en PI . Las composiciones preferidas de material son liposomas, que pueden consistir de diversos lípidos. Sin embargo, se prefiere que ninguno de los lípidos sea de carga positiva. Los liposomas, o vesículas de lípidos, son sacos sellados, en el rango de micrones o sub-micrones , cuyas paredes consisten de anfifilos adecuados. Habitualmente contienen un medio acuoso. En general, los liposomas están compuestos de fosfatidilcolina (PC) , diestearoílfosfatidilcolina, fosfatidilinositol , ácido fosfatídico, ácido lisofosfatídico, lisofosfatidilinositol , lecitina, cefalina, cerebrósidos incluyendo esfingomielina y esfingosina. Dichos liposomas se preparan y tratan de manera tal que los grupos polares activos están sobre el lado exterior del cuerpo liposómico. Por consiguiente, en una realización preferida de esta invención, se proveen cuerpos de inclusión sintéticos o se i-sintéticos o naturales, que pueden exponer o que pueden ser tratado o inducidos para exponer, sobre la superficie de las mismas, los grupos activos promotores de respuestas anti-inflamatorias derivados de uno o varios ligandos de fosfolípidos . Estos fosfolípidos pueden ser fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilinositol , ácido fosfatídico, ácido lisofosfatídico, lisofosfatidilinositol , lisofosfa idiIcol ina, lisofosfatidiletanolamina , esfingosilfosforilcolina, esfingosina-l-fosfato, ceramidas, esfingomielina y combinaciones de dos o más de los mismos. Algunos son activos y se cree que otros, por ejemplo, la fosfatidilcolina, son inactivos en la mayoría de las aplicaciones, pero le proporcionan estructura al liposoma.

Los liposomas, o vesículas de lípidos, son sacos sellados, en el rango de micrones o submicrones, cuyas paredes (de una sola capa o de múltiples capas) comprenden anfifilos adecuados. Habitualmente contienen un medio acuoso, aunque para la presente invención el contenido- interior no es importante y en general es inactivo. Por consiguiente, en una realización preferida, los liposomas, así como otros cuerpos de inclusión aceptables para uso farmacéutico, están esencialmente libres de entidades no lipídicas farmacéuticamente activas (por ejemplo <1%) y más preferentemente están libres de entidades no lipídicas aceptables para uso farmacéutico. Dichos liposomas se preparan y tratan de manera tal que los grupos activos se presentan hacia el exterior sobre el cuerpo del liposoma. Los fosfolípidos de las realizaciones preferidas de esta invención sirven entonces como ligandos y como componentes estructurales del propio liposoma. Así, una realización preferida de esta invención provee cuerpos de inclusión liposomales que exponen o que pueden ser tratados o inducidos para exponer, sobre las superficies de los mismos, uno o varios grupos, preferentemente inositol-fosfato, que actuarán como grupos de unión. Los fosfolípidos que no son PS ni PG activos deberían comprender entre un 10% - 100% del liposoma, siendo el equilibrio un constituyente inactivo, por ejemplo fosfatidilcolina, o un constituyente que actúa a través de un mecanismo diferente, por ejemplo fosfatidilserina o mezclas de los mismos. Se prefieren los constituyentes inactivos, tal como PC. Al menos un 10% en peso de dicho liposoma est~á~ compuesto de uno o varios de los fosfolípidos que no son PS/PG y que poseen grupos promotores de respuestas anti-inflamatorias activos, preferentemente al menos un 50%, más preferentemente entre un 60-100% y con mayor preferencia entre un 70-90%, siendo la realización más preferida de aproximadamente un 75% en peso de fosfolípidos activos. Los fosfolípidos preferidos para su uso en la presente invención son fosfatidilinositol y ácido fosfatídico, optativamente con una porción menor (hasta menos que un 50% en peso) de otro constituyente inactivo y/o un constituyente activo pero con otro mecanismo, es decir serina-fosfato . El fosfolípido activo más preferido para usar en la presente invención es fosfatidilinositol (PI) , con mayor preferencia aún un liposoma constituido hasta por un 70-90% de PI aproximadamen e, llevándose al equilibrio con fosfolípidos inactivos. También se pueden usar mezclas de liposomas constituidos por los diferentes fosfolípidos mencionados anteriormente que poseen grupos químicamente activos y mezclas de dichos liposomas con liposomas de constituidos por liposomas de fosfolípidos inactivos y/o que actúan por medio de un mecanismo diferente, siempre que la cantidad total de fosfolípidos activos permanezca por encima de un mínimo de aproximadamente un 10% y preferentemente por encima de un 60% en la mezcla total. Con respecto a los cuerpos de inclusión no liposomales que se pueden utilizar en la presente invención, pueden incluir perlas biocompatibles sólidas o huecas del tamaño apropiado. Los cuerpos de inclusión sintéticos o semi-sintéticos biocompatibles no liposomales se pueden seleccionar entre polietilenglicol, poli (metilmetacrilato) , polivinilpirrolidona, poliestireno y un amplio rango de otros materiales naturales, semi-sintéticos y sintéticos. Dichos materiales incluyen polímeros biodegradables , tal como los que fueron descriptos por Dunn, et al., Patente de EE.UU. N°: 4.938.763, cuyo contenido se incorpora por completo en este documento a modo de referencia. Los polímeros biodegradables están descriptos en el arte e incluyen, por ejemplo, polímeros de cadena lineal tal como poliláctidos , poliglicólidos , policaprolactonas , polianhídridos, poliamidas, poliuretanos , poliesteramidas, poliortoésteres , polidioxanonas , poliacetales , policetales, policarbonatos, poliortocarbonatos , polifosfazenos , polihidroxibutiratos , polihidroxivaleratos , oxalatos de polialquileno, succinatos de polialquileno, ácido poli (málico) , ácidos poli(amino) , polivinilpirrolidona, polietilenglicol, polihidroxicelulosa, quitina, quitosan y copolímeros, terpolímeros y combinaciones de los mismos.

Otros polímeros biodegradables incluyen, por ejemplo, gelatina, colágeno, etc. ~ Los polímeros biodegradables están descriptos en el arte e incluyen, por ejemplo, polímeros de cadena lineal 5 tal como poliláctidos , poliglicólidos , policaprolactonas , polianhídridos, poliamidas, poliuretanos , poliesteramidas , poliortoésteres , polidioxanonas , poliacetales , policetales, policarbonatos, poliortocarbonatos , polifosfazenos , poli idroxibutiratos , polihidroxivaleratos , oxaiatos de 10 polialquileno, succinatos de polialquileno , ácido poli (nálico) , ácidos poli (amino) , polivinilpirrolidona, polietilenglicol , polihidroxicelulosa , quitina, quitosan y copolímeros, terpolimeros y combinaciones de los mismos. Otros polímeros biodegradables incluyen, per ejemplo, 15 gelatina, colágeno, etc. Las sustancias adecuadas para la derivatización para un.r el o les fosfcarpidos . o porciones de los mismos, con grupos o grupos de unión, a los cuerpos de inclusión tridimensionales se encuentran disponibles comercialmente 20 por ejemplo de Poliseiences Inc. , 400 Valley Road, Warrington?, PA 18976. o de Sigma Aldrich Fine Chemicals. Los métodos para «u derivatización son conocidos en el ar e. Lus ejemplos específicos preferidos de dichos métodos se describen en la Solicitud de Patente Internacional I-!- P T/CAtV2"/ 139b , Vrisogeii Ireíand Limited, cuyo coiii.en.ido se incorpora en este documento a modo de referencia. Se contempla que el paciente puede ser un mamífero, incluyendo, por ejemplo, seres humanos y animales domésticos tal como vacas, caballos, cerdos, perros, gatos y semejantes. Los fosfolípidos son moléculas anfifíiicas (es decir, son anfifilos) .· lo que significa que el compuesto comprende moléculas que poseen un grupo polar soluble en agua unido a una cadena hidroca.rconada insoluble en agua. Los anfifilos que c nsti uyen . la,r, capas de la matriz tienen regiones polares y apolares ef iiiidas . Los anfifilos pueden incluir, además de los fosfc' .'pidos -rrue proveen ios grt-.pos a tiva en el proceso de la invención, otros, lípidos naturs'its Usados solos con el fcsfolípido que transpcrr.an al gr .po o en mezclas ccn otros. Los anfifilos que constituyen la o las capas de los liposomas pueden ser compuestos sintéticos que confieren estructura, inertes, tal como alquiléteres de polioxietileno, alqu iésteres de polioxietileno y diéstsres de sacarosa. Los métodos para preparar liposomas del apiño apropiado^ son conocidos en el arte y no formar, ?ea-te de esta invención. Se pueden consultar numerosos libros de texto ártículos er. la literatura sobre este tema, por ejemplo, la revisión "Liposomes as Pharmaceutical Dosage Forms", de Yechezkel Barenhol z y Daan J A. Chrommelin, y la literatura citada en la misma, por ejemplo New, R. C. "Liposomes: A Practical Approach" , IRL Press de OxfOrd- University Press (1990) . El diámetro de los liposomas, así como de los demás 5 cuerpos de inclusión aceptables para uso farmacéutico, de la realización preferida de esta invención comprende entre 20 nm aproximadamente y 500 µt? aproximadamente, más preferentemente entre 20 nm aproximadamente y 1000 nm aproximadamente, con preferencia entre 50 nm 10 aproximadamente y 500 nm aproximadamente y con mayor preferencia entre 80 nm aproximadamente y 120 nm aproximadamente (preferentemente se mide por el eje mayor) .

Los cuerpos de inclusión aceptables para uso farmacéutico se pueden suspender en un vehículo aceptable 15 para uso farmacéutico, tal como solución salina estéril fisiológica, agua estéril, agua libre de pirógenos, solución salina isotónica y soluciones amortiguadoras de fosfato, así como otras sustancias compatibles no tóxicas usadas en las formulaciones farmacéuticas. Preferentemente, 20 los cuerpos de inclusión aceptables para uso farmacéutico están conformados en una suspensión líquida en un líquido biocompatible , tal como solución amortiguadora salina, y se administran al paciente por cualquier ruta apropiada que lo introduzca en el sistema inmune, tal como por vía intra- ^5^_jarter.ial , intravenosa o, más preferentemente, intramuscular o subcutánea . Se contempla que los cuerpos dé inclusión acrepLables- para uso farmacéutico se pueden secar por congelamiento o liofilizar para que puedan ser resuspendidas posteriormente para su administración. Esta invención también está dirigida a un conjunto de elementos que comprende cuerpos de inclusión liofilizados o secados por congelamiento que transportan grupos promotores de respuestas antiinflamatorias y un vehículo aceptable para uso farmacéutico, tal como solución fisiológica salina estéril, agua estéril, agua libre de pirógenos, solución salina isotónica y soluciones amor iguadoras de fosfato, así como otras sustancias no tóxicas compatibles usadas en las formulaciones farmacéuticas. Una manera preferida de administrar los cuerpos de inclusión aceptables para uso farmacéutico al paciente es una serie de inyecciones, administrados diariamente, varias veces por semana, semanalmente o mensualmente al paciente, sobre un período que varía en un rango entre una semana a varios meses. La frecuencia y duración del desarrollo de la administración varía de un paciente a otro y según la afección en tratamiento, su severidad y si el tratamiento será profiláctico, terapéutico o curativo. El diseño y la optimización de los mismos son habilidades propias del profesional a cargo. Se prefiere la inyección intramuscular, en especial la vía del músculo glúteo. Un las indicaciones de la invención, comprende la inyección, en el músculo glúteo, de una cantidad apropiada de cuerpos de inclusión el día 1, otra inyección el día 2, otra inyección el día 14 y luego inyecciones de "refuerzo" a intervalos mensuales, si fuera apropiado. Se postula que, en muchas realizaciones de la presente invención, los cuerpos de inclusión aceptables para uso farmacéutico que comprenden grupos promotores de respuestas anti- inflamatorias sobre la superficie de los mismos están actuando como modificadores del sistema inmune del paciente, de manera similar a la de una vacuna. Por consiguiente se utilizan en las cantidades y con los métodos de administración suficientes como para proveer una concentración localizada de los cuerpos de inclusión en el sitio de la introducción. Las cantidades de dichos cuerpos de inclusión que son apropiadas para una modificación del sistema inmune posiblemente no se correlacionen directamente con el tamaño corporal del receptor y por ello se pueden distinguir claramente de las dosificaciones de fármacos, que están diseñados para proveer niveles terapéuticos de sustancias activas en el torrente sanguíneo y los tejidos del paciente. Entonces, las dosificaciones de fármacos serán probablemente mucho mayores que las dosificaciones que modifican el sistema inmune. Ea correlación entré el peso de ros—lipoyomas—y- 1-a-cantidad de liposomas deriva del hecho, aceptado por los especialistas en el arte de formulaciones liposomales, que una vesícula de dos capas de 100 nm de diámetro contiene 81.230 moléculas de lípido por vesícula, distribuidas aproximadamente 50:50 entre las dos capas (véase Richard Harrigan - 1992 Universidad de British Columbia, Tesis PhD "Transmembrane pH gradients in liposomes (microform) : drug-vesicle interactions and protón flux", publicado por National Library of Canadá, Ottawa, Canadá (1993) ; N° Orden de University Microfilms UMI00406756; N° Canadiana 942042220, ISBN 0315796936) . A partir de esto es posible calcular, por ejemplo, que una dosis de 5 x 108 vesículas, en el orden de la dosis usada en los ejemplos específicos in vivo más adelante en este documento, es equivalente a 4,06 x 1013 moléculas de lípido. Usando el número de Avogadro para la cantidad de moléculas de lípido en una molécula gramo (mol), 6,023 x 1023, se puede determinar que esto representa 6,74 x 10"11 moles que, con un peso molecular de 857 para PI equivale aproximadamente a 5.78 x 10"8 g o 57.8 ng de PI para dicha dosificación. La cantidad de cuerpos de inclusión aceptables para uso farmacéutico que será administrada varía según la naturaleza del trastorno de mamífero que se pretende tratar y según la identidad y las características del paciente. Es impo tante—que—Zta—cantidad—efica-z—efe—eu rpes—d —in iws-i^Br-aceptables para uso farmacéutico no sea tóxica para el paciente y no debe ser tan grande como para superar al sistema inmune. Cuando se utiliza una administración intra-arterial, intravenosa, subcutánea o intramuscular de una suspensión líquido de cuerpos de inclusión aceptables para uso farmacéutico, se prefiere administra, para cada dosis, entre 0,1-50 mi aproximadamente de líquido, que contiene una cantidad de cuerpos de inclusión equivalentes en general a 10% - 1000% de la cantidad de leucocitos habitualmente presentes en un volumen equivalente de sangre completa. En general, la cantidad de cuerpos de inclusión administrada por vez a un paciente humano se encuentra en el rango entre aproximadamente 500 y aproximadamente 2,5 x 109 (<250 ng de cuerpos de inclusión, en el caso de liposomas, prorrateada para las diferencias de densidad en otras realizaciones de cuerpos de inclusión) , más preferentemente entre aproximadamente 1.000 y aproximadamente 1.500.000.000, con preferencia entre 10.000 y 100.000.000 aproximadamente y con mayor preferencia entre aproximadamente 200.000 y aproximadamente 2.000.000. Dado que los cuerpos de inclusión aceptables para uso farmacéutico actúan, en el proceso de la invención, como modificadores del sistema inmune, en la naturaleza de una vacuna, la cantidad de dichos cuerpos de inclusión aiinrtñisTraaa eñ éT~ sitio de inyección para cada administración puede constituir una cuantificación más significativa que la cantidad o el peso de cuerpos de inclusión por unidad de peso corporal del paciente. Por el mismo motivo, ahora se considera que las cantidades eficaces o la cantidad de cuerpos de inclusión para animales pequeños no se traducen directamente en cantidades eficaces para mamíferos más grandes (es decir, de más de 5 kg) sobre una base de relación de pesos . La presente invención está indicada para su uso en la profilaxis y/o el tratamiento de una amplia variedad de trastornos en mamíferos en los cuales están comprometidos el funcionamiento de células T, la inflamación, la disfunción endotelial y la expresión inadecuada de citoquinas. Los pacientes que padecen o están sospechados de padecer dichos trastornos pueden ser seleccionados para el tratamiento. El término "tratamiento" se refiere a una reducción de los síntomas, tal como, por ejemplo, una disminución en la severidad o en la cantidad de síntomas de la enfermedad particular o una limitación del avance progresivo de los síntomas. Con respecto a los trastornos debidos a la función de las células T (mediados por células T) , estos incluyen úlceras y heridas y trastornos autoinmunológicos incluyendo, por ejemplo, diabetes, escleroderma, psoriasis ^Ttrr rs reumatoidea. La invención está indicada para su uso con reacciones alérgicas inflamatorias, trastornos por reacciones en transplantes de órganos y células e infecciones microbianas que originan reacciones inflamatorias. También está indicado para su uso en la profilaxis contra el estrés oxidativo y/o las lesiones de reperfusión isquémica, ingesta de venenos, exposición a sustancias químicas tóxicas, lesiones por radiación y exposición a sustancias irritantes transportadas por aire y por agua, etc., causantes de una inflamación perjudicial. También está indicado para los trastornos inflamatorios, alérgicos y mediados por células T de órganos internos, tal como riñon, hígado, corazón, etc. Con respecto a los trastornos que involucran una expresión inapropiada de citoquinas para la cual está indicada la presente invención, incluyen enfermedades neurodegenerativas. Las enfermedades neurodegenerativas, incluyendo el síndrome de Down, el mal de Alzheimer y el mal de Parkinson, están asociadas con niveles incrementados de ciertas citoquinas, incluyendo la interleuquina-?ß (IL-1(S) (véase Griffin WST et al. (1989); Mogi M. et al. (1996)). También se ha demostrado que la IL-?ß inhibe la potenciación a largo plazo en el hipocampo (Murray, C. A. et al. (1998)) . La potenciación a largo plazo en el Iripocampo es una forma de plasticidad sináptica y se considera en general que es un modelo apropiado para la memoria y el aprendizaje (Bliss, T.V.P. et al. (1993)). Entonces, actualmente se cree que una expresión inapropiada de citoquinas en el cerebro está comprometida en el desarrollo y el avance de las enfermedades neurodegenerativas y los trastornos neuroinflamatorios . Por consiguiente, la invención está indicada para el tratamiento y la profilaxis de una amplia variedad de trastornos neuroinflamatorios , neurodegenerativos y otros trastornos neurológicos en mamíferos, incluyendo síndrome de Down, mal de Alzheimer, mal de Parkinson, demencia senil, depresión, enfermedad de Huntingdon, neuropatías periféricas, síndrome de Guillain Barr, enfermedades de la médula espinal, enfermedades neuropáticas de las articulaciones, enfermedad desmielinizante inflamatoria crónica, neuropatías incluyendo mononeuropatía, polineuropatía, neuropatía sensorial simétrica distal, trastornos de la unión neuromuscular, miastenias y esclerosis amiotrófica lateral (ALS) . El tratamiento y la profilaxis de estas enfermedades neurodegenerativas representan una realización particularmente preferida de la invención, siendo especialmente preferido el tratamiento del mal de Alzheimer, mal de Parkinson y ALS.

Con respecto a los trastornos que comprenden una drsf ñcicin endbtelial, la presente invención está indicada para el tratamiento y la profilaxis de una amplia variedad de dichos trastornos en mamíferos incluyendo, por ejemplo, enfermedades cardiovasculares, tal como ateroesclerosis, enfermedad oclusiva arterial periférica o arterial, -insuficiencia cardíaca congestiva, enfermedad cerebrovascular (apoplejía), infarto de miocardio, angina, hipertensión, etc., trastornos vasoespásticos tal como enfermedad de Raynaud, síndrome cardíaco X, migraña, etc., y las lesiones que se producen como resultado de una isquemia (lesión isquémica o lesión por reperfusión-isquémica) . En resumen, puede ser prácticamente cualquier trastorno cuya patología comprenda el funcionamiento inapropiado del endotelio. Otras indicaciones para las composiciones y los procesos de la presente invención incluyen el tratamiento de pacientes para acelerar la velocidad de cicatrización de heridas y úlceras y el tratamiento de pacientes antes de una intervención quirúrgica, con el fin de acelerar la velocidad de recuperación de la cirugía, inclusive la velocidad de cicatrización de las lesiones e incisiones quirúrgicas . Con respecto a los "trastornos cardíacos", la presente invención está indicada para el tratamiento y la profilaxis de una amplia variedad de dichos trastornos en mamíferos incluyendo cualquiera y tortera ros—trastornos— eiae-iesades-con el corazón e incluyen, por ejemplo, arritmias ventriculares (taquicardia o fibrilación ventricular) y muerte súbita por una enfermedad del corazón. La susceptibilidad de los pacientes a los trastornos cardíacos, tal como arritmias y muerte súbita cardíaca a menudo está indicada por intervalos QT-c prolongados en el ritmo de latidos del corazón. Se considera que la administración de las composiciones acordes con las realizaciones preferidas de la invención reduce los intervalos QT-c en pacientes mamíferos, lo cual sería indicativo de una susceptibilidad reducida a arritmias y muerte cardíaca súbita. La invención se describirá a continuación, a efectos ilustrativos, en los siguientes ejemplos no limitantes. EJEMPLOS En los ejemplos que se describirán más adelante, las siguientes abreviaturas tienen el significado que se detalla a continuación. Si no está definida una abreviatura, tiene el significado aceptado en general. µ = mierolitro µ? = micromolar CHS = hipersensibilidad de contacto DNFB = 2 , 4-dinitrofluorobenceno DHS = hipersensibilidad de tipo tardía EtOH = etanol g = gramo Hs = horas IM = intramuscular g = kilogramo LPS = lipopolisacárido mg = miligramo mi = mililitro mM = milimolar ms = milisegundo ng = nanogramo nra = Nanómetro nM = Nanomolar PBS = solución amortiguadora fosfato sal,i.na pg = Picogramo Ej emplo 1 Se prepararon liposomas con un diámetro promedio de 100 ± 20 nm de acuerdo con los métodos estándar conocidos en el arte y la composición de los mismos era: POPS 100% (l-palmitoíl-2-oleoíl-sn- glicero-3- [fosfato-serina] , denominado fosfatidilserina o PS en los ejemplos y a menos que se indique lo contrario) POPA 100% (l-palmitoíl-2-oleoí.l-sn - glicero-3-fosfato, denominado ácido fosfatídico o PA en los ejemplos y a menos que se indique lo contrario) control, sin liposomas.

Se diluyó una suspensión madre de cada composición de liposomas, que contenía 4,8 x 1014 liposomas por mi, con PBS para obtener una suspensión inyectable que contenía 6 x 106 liposomas por mi . Las suspensiones liposomales se inyectaron en ratones hembra BALB/c (Jackson Laboratories) de 6-8 semanas y con un peso de 19-23 g, con el fin de determinar el efecto sobre la hinchazón de oreja en el modelo CHS en muri os . Se utilizaron las pruebas para el modelo CHS para las reacciones inflamatorias mediadas por Thl . Los animales fueron asignados a 3 grupos, con 5 animales en cada uno. Los grupos A y B recibieron aproximadamente 3 x 105 de los liposomas identificados previamente (es decir, PS 100% y PA 100%, respectivamente) , en un volumen de 50 µ? aproximadamente. El grupo C era un grupo control,—que no recibió liposomao. Protocolo Se llevaron a cabo los siguientes experimentos: TABLA 1 Los días 1-6, los ratones de los grupos A y B recibieron inyecciones de las respectivas preparaciones de liposomas. Los liposomas se inyectaron en un volumen de 50 µ? por inyección intramuscular (IM) , es decir aproximadamente 300.000 liposomas por inyección, con una administración total durante todo el período de prueba de aproximadamente 1.800.000 liposomas. A los ratones del grupo control (grupo C) no se les administraron liposomas, pero fueron sensibilizados, estimulados y evaluados de la misma manera que los grupos A y B, como se describirá a continuación .

Sensibilización Si día T~, después de la inyección de liposomas correspondiente a ese día, los ratones fueron anestesiados con 0,2 mi de pentobarbital sódico 5 mg/ml mediante inyección intraperitoneal (IP) . Se roció la piel del abdomen de los ratones con EtOH 70%. Luego se utilizó una hoja de escalpelo para eliminar aproximadamente un parche de pelo de una pulgada de diámetro del abdomen. El área rasurada se pintó luego con 25 µ? de 2,4-dinitrofluorobenceno (DNFB) 0,5% en una mezcla 4:1 de acetona : aceite de oliva usando una punta de pipeta. Estímulo El día 6 después de la inyección de liposomas, los ratones fueron estimulados con DNFB de la siguiente manera: se esparcieron 10 µ? de DNFB 0,2% sobre la superficie dorsal de la oreja derecha con una punta de pipeta y esparciendo 10 µ? de vehículo sobre la oreja izquierda también con una punta de pipeta. Resultados El día 7, 24 horas después del estímulo, cada animal fue anestesiado con halotano y se midió el espesor de la oreja (en µp?) usando un micrómetro accionado por resorte Peacock. El incremento de hinchazón de oreja se usó como una medida de la respuesta CHS. Los datos obtenidos se expresaron como la diferencia entre el espesor de la oreja derecha tratada menos el espesor de la oreja izquierda tratad —con— ehículo .—ÍJOS—experi-me txis—se— e ^t-ierOR—tres-veces, con animales diferentes pero de características similares. El grado de significación de los datos se determinó con la prueba de t de Student de dos colas . Se consideró significativo un valor P <0,05. Los resultados se muestran gráficamente en la FIG. 1, que es un gráfico de barras de hinchazón de oreja expresada en µt?. Se utilizó el valor medio de los experimentos -respectivos para generar el gráfico. En la FIG. 1 se muestra que se logró una reducción significativa (xl(T2 mm) en la hinchazón de oreja con la inyección de los liposomas acordes con la presente invención. La reducción lograda con los liposomas con PA 100% es sustancialmente equivalente a la obtenida con los liposomas con PS 100%, descriptos previamente como antiinflamatorios . Ejemplo 2 Se prepararon y evaluaron liposomas que consistían esencialmente de 75% de L- -fosfatidilinositol (denominado fosfatidilinositol o PI en los ejemplos a menos que se indique lo contrario) y 25% de l-palmito£l-2-oleoíl-sn-glicero-3-fosfocolina o POPC (denominado fosfatidilcolina o PC en los ejemplos a menos que se indique lo contrario) en el modelo CHS en ratones descripto previamente. Se sensibilizaron dos grupos de diez ratones el día 1. Un gruT5~^retri~ic> inyecciones los días T~, 2~¡ 3~; W, ? y~6~cutv liposomas de 75% de PI : 25% de PC, a razón de 600.000 vesículas en 50 µ? de suspensión por cada inyección. El día 6 después de la inyección de liposomas, los ratones fueron estimulados con DNFB esparcido sobre la oreja izquierda como se describió en el Ejemplo 1. El segundo grupo control recibió 50 µ? de PBS de acuerdo con el mismo programa y se estimuló de manera similar. Las mediciones del espesor de las orejas se efectuaron el día 7. Los resultados, en la forma de un gráfico de barras, se muestran en la FIG. 2. Los datos representaban los cambios en el espesor medio de la oreja (xlO-2 mm) +/- el error estándar de la media (EEM) . Se observó una supresión significativa de CHS en los ratones que habían recibido inyecciones de PI, en comparación con el grupo control PBS (p< 0,01) . Ejemplo 3 Se compararon liposomas de la formulación PI 75% y PC 25% y con un diámetro promedio de 100 + 20 nm de acuerdo con métodos estándar. Se sensibilizaron, inyectaron y estimularon cinco grupos (A-E) de 10 ratones de acuerdo con el procedimiento y el programa que se describió en el Ejemplo 1. Se administraron las siguientes cantidades de liposomas en una suspensión de 50 µ? : Grupo A 6 x 10 Grupo B 6 x 10 Grupo C 6 x 107 Grupo D 6 x 10s Grupo E 6 x 105 Grupo F 6 x 104 Los resultados, junto con un grupo control PBS, se muestran como la Hinchazón Neta de Oreja (x 10"2 mra) +/-EEM en la forma de un gráfico de barras en la FIG. 3. Se observó una reducción significativa dependiente de la dosis en la hinchazón de oreja, en comparación con el grupo control, con el Grupo C (6 x 107) , donde p = 0,05, con el Grupo D (6 x 106) , donde p = 0,01 y más significativamente con el Grupo E, donde p<0,001. No se observaron diferencias significativas entre los demás grupos y el control. (Grado de significación estadística calculado con la prueba t de Student apareada) . Ej emplo 4 Se diluyó una suspensión madre de liposomas de 75% de PI con un tamaño de 100 + 20 nm que contenía 4,8 x 1014 liposomas por mi para obtener una suspensión inyectable que contenía 6 x 106 liposomas por mi. Las suspensiones liposomales se usaron como inyecciones para ratones, con el fin de determinar el efecto sobre la hinchazón de oreja en el modelo DHS de murinos . Al igual que en el Ejemplo 1, se n—ra-torres—hembra—BALB/c—fJaefeson—Lateeratoríes-)—de-6-8 semanas y con un peso de 19-23 g. Los animales fueron asignados a 2 grupos, de 10 animales en cada uno. Un grupo recibió la inyección de liposomas. El otro era el grupo control que recibió inyecciones de PBS . Cada animal de prueba recibió inyecciones de 50 µ? de suspensión que contenía 6 x 105 liposomas . Protocolo Los ratones fueron sensibilizados el día 1, estimulados el día 6, estimulados por segunda vez el día 12 y recibieron inyecciones los días 13, 14, 15, 16, 17 y 18 de los liposomas de 75% de PI como se indicará más adelante. El día 18, después de la inyección de liposomas, se estimularon a los ratones. Los liposomas fueron inyectados en 50 µ? de volumen vía inyección I , es decir 600.000 liposomas por inyección, para una administración total sobre todo el período de prueba de 3.600.000 liposomas. La sensibilización y la estimulación se llevaron a cabo como se describió en el Ejemplo 1. El espesor de oreja se midió el día 19. Resultados Los resultados se muestran en la forma de un gráfico de barras en la FIG. 4 adjunta. Los resultados se expresan como hinchazón neta de oreja (x 1CT2 mm) . Muestran que 1iposomas de 75¾T de Pl son efectivas ñ el modelo DHS et~ día 19, 24 horas después de la tercera inyección que se aplicó después del tercer estímulo. Ej emplo 5 La línea U937 es una línea celular de leucemia monocítica que se puede diferenciar en macrófagos con la administración de ésteres de forbol . El tratamiento con LPS, un componente de la pared celular de bacterias Gram negativas, estimula una respuesta inflamatoria en las células U937, con subsiguiente sensibilización de la expresión de numerosas moléculas inflamatorias, incluyendo TNFoc. Este modelo provee un sistema experimental para evaluar las terapias anti-inflamatorias . Los macrófagos se pueden cultivar en un medio de cultivo en presencia de una composición sospechada de ser anti-inflamatoria y luego se puede medir la expresión de TNFa. Se prepararon 1iposomas con un tamaño de 100 ± 20 nm de acuerdo con los métodos estándar conocidos en el arte y tenían una composición de fosfatidilinositol 75% (PI), fosfatidilcolina 25% (PC) . La concentración de la composición madre de liposomas era de aproximadamente 39,5 mM de lípidos y se diluyó hasta obtener las siguientes concentraciones finales en el ensayo: fosfatidilinositol (PI) 100 µ? PI 39,8 µ? PI 10 µ?- PI 3,98 µ? PI 1 µ? Las células U937 se cultivaron mediante crecimiento en medio RP I (GIBCO BRL) suplementado con suero fetal bovino (FCS) 10% y penicilina/estreptomicina 1% y luego se cultivaron a 37 °C en una atmósfera que contenía C02 5%. Se sembraron concentraciones de 5 x 105 células en las cavidades de placas de 6 cavidades a razón de 2 mi por cavidad y luego se diferenciaron en macrófagos mediante tratamiento con acetato miristato de forbol (PMA) 150 nM durante 2-3 días. Después se sustituyó el medio celular por medio completo una vez que las células U937 se habían diferenciado en macrófagos. Las células se cultivaron durante otras 24 hs antes de la adición de los liposomas con el fin de reducir la sensibilización de genes/proteínas inducida por PMA. A continuación las células se incubaron con: Solución amortiguadora de fosfato salina (PBS) , como control negativo LPS 10 ng/ml, como control positivo LPS 10 ng/ml + PI 100 µ? LPS 10 ng/ml + PI 39,8 µ? LPS 10 ng/ml + PI 10 µ? LPS 10 ng/ml + PI 3,98 µ? LPS 10 ng/ml + PI 1 µ? Las células se incubaron como se describió previamente a 37 °C en C02 5%. Después de 18 hs, se recolectaron los sobrenadantes de cada tratamiento y fueron evaluados por su contenido de TNF-a usando el conjunto de elementos del ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas estándar (ELISA) Quantikine (R&D systems, Minneapolis , EE.UU.) . En la FIG. 5 se muestra la cantidad de TNF-a secretada en picogramos por mi. Los resultados demuestran que las células U937 diferenciadas en macrófagos expresan niveles muy bajos de TNF-a bajo condiciones normales. Sin embargo, una vez que eran expuestas a LPS, secretaban grandes cantidades de TNF-a hacia el medio circundante, lo cual es indicativo de estrés celular. La incubación de las células con liposomas PI disminuye la secreción de TNF-a de una manera dependiente de la dosis e inducida por LPS. Ejemplo 6 El metabolismo de los esfingolípidos ha demostrado ser un proceso dinámico y los metabolitos de esfingolípidos , incluyendo ceramidas, esfingosina y esfingosina-l-fosfato, son reconocidos actualmente como mensajeros que cumplen funciones esenciales en el crecimiento, la sobrevida y muerte de las células ( olesnick, J. Clin. Invest. 110: 3-8 (2002)). Los liposomas que consisten esencialmente de 75% de esfingomielina y 25% de se preparan de acuerdo con métodos estándar (véase, atragadda, et al., Cellular and Molecular Biology Letters 5: 483-493 (2000)) y se evaluaron con el modelo CHS de murinos. La metodología usada fue la que se describió en el Ejemplo 1 y el tamaño correspondía a los liposomas usados en los ejemplos anteriores, es decir 100 ± 20 nm.

Claims (15)

51 NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiéndose descrito la ±nv¾rrc±ón—como—anfceeede—se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes REIVINDICACIONES ;

1. Una composición de materia, caracterizada porque comprende cuerpos de inclusión que presentan una pluralidad de grupos químicos reactivos que tienen la capacidad para interactuar con los receptores presentes sobre las células del sistema inmune de mamíferos para alterar el perfil de citoquinas del sistema inmune en favor de una antiinflamación, donde dichos cuerpos de inclusión presentan un tamaño de aproximadamente 20-1000 nm, con la condición que cuando dichos grupos son todos del mismo tipo, dichos grupos no son serina- fosfato o glicerol-fosfato .

2. La composición de la cláusula 1, caracterizada porque los cuerpos de inclusión comprenden grupos químicos reactivos seleccionados del grupo formado por fosfato-inositol, fosfato-etanolamina, ácido fosfatídico, ácido lisofosfatídico, lisofosf tidilinositol , lisofosfato-etanolamina, esfingosina-l-fosfato , ceramidas, esfingomielina o combinaciones de los mismos.

3. La composición acorde con la cláusula 2, caracterizada porque dichos grupos químicos reactivos son grupos de 52 fosfato-inositol

4. La composición acorde con la cláusula 2, caracterizada porque dichos cuerpos de inclusión son liposomas.

5. La composición acorde con la cláusula 4, caracterizada porque dicha composición está esencialmente libre de entidades no lipídicas aceptables para uso farmacéutico.

6. La composición acorde con la cláusula 5, caracteri ada porque dicha composición está libre de entidades no lipídicas aceptables para uso farmacéutico.

7. La composición acorde con la cláusula 5 ó 6, caracterizada porque los liposomas comprenden fosfolípidos o glicofosfolípidos seleccionados del grupo formado por fos£atidilinositol , fosfat idilcolina, fosfatid letanolamina , ácido fosfatídico, diestearoílfosfatidilcolina , dipalmitoílfosfatidilcolina, ácido lisofosfatídico, lisofosfatidilinositol , lisofosfatidilcolina, lisofosfatidile anolamina, esfingosilfosforilcol ina, esfingosina-l-fosfato, ceramidas, esfingomielina o combinaciones de los mismos.

8. La composición acorde con la cláusula 7, caracterizada porque los liposomas comprenden fosfatidilinositol .

9. La composición acorde con la cláusula 8, caracterizada porque los liposomas emprenden entre 60 y 100% de fcsfatidilinositol .

10. La composición acorde con la cláusula 9, caracterizada 53 porque los liposomas comprenden entre 60-90% de fosfatidilinositol .

11. La composición acorde con la cláusula 9 o cláusula 10, caracterizada porque el resto del liposoma es fosfatidilcolina.

12. La composición acorde con la cláusula 11, caracterizada porque los liposomas tienen un tamaño que comprende entre aproximadamente 80 nm y aproximadamente 120 nm.

13. La composición acorde con cualquiera de las cláusulas 4 a 12, caracterizada porque dicha composición comprende entre aproximadamente 10.000 y 2.500.000.000 de dichos liposomas por unidad de administración.

14. Un método para tratar los trastornos mediados por el funcionamiento de las células T, trastornos inflamatorios, trastornos de la función endotelial, un trastorno autoinmune caracterizado por una expresión inadecuada de citoquinas, un trastorno cardíaco o un trastorno neurológico neuroinflamatorio, caracterizada porque comprende la administración a un paciente de una cantidad eficaz de una composición farmacéutica acorde con cualquiera de las cláusulas 1-13.

15. El método acorde con la cláusula 14, caracterizada porque la cantidad administrada de dichos cuerpos de inclusión comprende menos que 30 mg por kg de peso corporal 54 del paciente. TS~. El trtétudo suorÜB con ta: riráusrla í4 é 15 , caracterizada porque la cantidad administrada de dichos cuerpos de comprende entre a roximadamente 500 y aproximadamente 2,5 x 109 cuerpos de inclusión. 17. El método acorde con la cláusula 14, la cláusula 15 o la cláusula 16, caracterizada porque los cuerpos de inclusión están esencialmente libres de entidades no lipídicas aceptables para uso farmacéutico. 18. El método de la cláusula 17, caracterizada porque los cuerpos de inclusión están libres de entidades no lipídicas aceptables para uso farmacéutico. 19. El uso en la fabricación de un medicamento de una cantidad eficaz de una composición farmacéutica acorde con cualquiera de las cláusulas 1-13, caracterizada porque es para su administración a un mamífero en el tratamiento de un trastorno mediado por el funcionamiento de células T, un trastorno inflamatorio, un trastorno de la función endotelial, un trastorno autoinmune caracterizado por una expresión inadecuado de citoquinas, un trastorno cardíaco o un trastorno neurológico neuroinflamatorio. 20. El uso en el tratamiento de un trastorno mediado por el funcionamiento de células T, un trastorno inflamatorio, un trastorno de la función endotelial, un trastorno autoinmune caracterizado por una expresión inadecuada de 55 citoquinas, un trastorno cardíaco o un trastorno neurológico neuroiñtlamatorio", ca' axr H xzada— orque es par-a. la administración a un mamífero de una cantidad eficaz de una composición farmacéutica acorde con cualquiera de las cláusulas 1-13.