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MXPA04004324A - Anticuerpos monoclonales humanos para celulas dendriticas. - Google Patents

Anticuerpos monoclonales humanos para celulas dendriticas.

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Publication number
MXPA04004324A
MXPA04004324A MXPA04004324A MXPA04004324A MXPA04004324A MX PA04004324 A MXPA04004324 A MX PA04004324A MX PA04004324 A MXPA04004324 A MX PA04004324A MX PA04004324 A MXPA04004324 A MX PA04004324A MX PA04004324 A MXPA04004324 A MX PA04004324A
Authority
MX
Mexico
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human
cells
dendritic cells
antibody
antigen
Prior art date
Application number
MXPA04004324A
Other languages
English (en)
Inventor
Treml John
Original Assignee
Celldex Therapeutics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Celldex Therapeutics Inc filed Critical Celldex Therapeutics Inc
Publication of MXPA04004324A publication Critical patent/MXPA04004324A/es

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Abstract

Se divulgan anticuerpos monoclonales humanos aislados y porciones de enlace con antigeno de los mismos los cuales se unen especificamente a celulas dendriticas. Se divulgan tambien moleculas bi-especificas, inmunotoxinas y conjugados con antigeno que incluyen los anticuerpos o porciones de anticuerpos. Los anticuerpos humanos pueden ser producidos en un animal transgenico no humano, por ejemplo, un raton transgenico, que puede producir multiples isotipos de anticuerpos monoclonales humanos mediante el sometimiento a recombinacion V-D-J y cambio de isotipo. Se divulgan tambien composiciones farmaceuticas que comprenden los anticuerpos humanos, animales transgenicos no humanos e hibridomas que producen los anticuerpos humanos, asi como metodos terapeuticos y de diagnostico para utilizar los anticuerpos humanos.

Description

ANTICUERPOS MONOCLONALES HUMANOS PARA CÉLULAS DENDRÍTICAS ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las células dendriticas son células especializadas del sistema inmune con la capacidad única para iniciar respuestas primarias y secundarias de linfocitos T y B. Caracterizadas como células profesionales de presentación de antigeno (APCs) , las células dendriticas expresan MHC y moléculas co-estimuladoras esenciales en el cebado de linfocitos naives. Esta propiedad única de las células dendriticas, que se conocen también " como ."adyuvantes de la naturaleza", ha llevado a un gran interés por su posible función con relación a enfermedades autoinmunes asi como su potencial de explotación en la inmunoterapia de varias enfermedades. Avances recientes en el cultivo de células dendriticas han incrementado en gran medida nuestra comprensión de este tipo complejo de células. Existen varios tipos de células dendriticas que se distinguen por su linaje, localización en tejidos, fenotipo y función. El tipo de células dendriticas que se asocia de. manera más prominente con los linfocitos T para el inicio de respuestas inmunes es de origen de médula ósea. Las células dendriticas derivadas de la médula ósea pueden ser segregadas además en 1) células dendriticas timicas, que son de origen linfoide y parecen participar específicamente en la deleción de linfocitos T en proceso de maduración, 2) células de Langerhans, que son de linaje míeloide y tienen una función APC especializada en la piel, y 3) células dendriticas derivadas de linaje mieloide encontradas particularmente en la sangre, el bazo y nodos linfáticos . Las características de las células dendriticas derivadas de linaje mieloide (incluyendo células de Langerhans) son las siguientes: 1) capacidad de absorción de antígeno, y procesamiento para presentación, 2) capacidad de migración selectiva en tejidos, y 3) capacidad de estimulación directa de linfocitos T (tanto nai es como cebados) . A pesar de los avances recientes en la caracterización de las células dendriticas, se sabe muy poco sobre los receptores específicos para células dendriticas- o moléculas. Existen numerosas moléculas asociadas con células dendriticas que son compartidas con otras células mieloides y no mieloides, sin embargo, -reactivos muy limitados están disponibles los cuales son específicos para células dendriticas. Reactivos, en particular anticuerpos, que reaccionan específica o preferentemente con las células dendriticas tienen un gran potencial como agentes de ¦ enfoque para inducir respuestas inmunes potentes a antígenos de enfermedades infecciosas o tumores. Estos agentes de enfoque específico para células podrían también ser manipulados para suministrar toxinas con , el objeto de eliminar APCs potentes (por ejemplo, células dendriticas) en médula ósea y transplantes de órgano u otros padecimientos autoinmunes . Por consiguiente, agentes de enlaces específicos para células dendríticas serían de gran valor terapéutico y de diagnóstico. COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La presente invención ofrece anticuerpos monoclonales humanos aislados que se unen a células de presentación de antígeno (APCs) , particularmente células dendríticas humanas, así como conjugados de vacuna, moléculas bi-específicas, inmunotoxinas y composiciones terapéuticas que contienen tales anticuerpos. Por consiguiente, los anticuerpos y composiciones de la invención pueden emplearse en varias terapias dirigidas a células dendríticas, por ejemplo, para incrementar la presentación de antígeno o para tratar enfermedades mediadas por APC. v En ciertas modalidades, los anticuerpos humanos, se caracterizan por un enlace de alta afinidad con células dendríticas, y por su capacidad para afectar el crecimiento de células dendríticas y/o función mediante el direccionamiento de moléculas o células con funciones definidas (por ejemplo, célula tumoral, bacteria, virus, célula efectora) hacia células dendríticas. Por consiguiente, los anticuerpos monoclonales humanos de la presente invención pueden emplearse como agentes de diagnóstico o agentes terapéuticos in vivo e in vitro.
En otras modalidades, los anticuerpos humanos se caracterizan por enlace con epitopos novedosos particulares (por ejemplo, receptores) en células dendriticas. Por ejemplo, anticuerpos específicos de la presente invención incluyen anticuerpo monoclonal humano "Bll que comprende las secuencias de aminoácidos de cadena pesada y de cadena ligera mostradas en SEQ ID Nos.: 2 y 4, respectivamente, que se unen al receptor de mañosa de macrófago de ser humano (se conocen también aquí como "antígeno humano Bll") que tiene un peso molecular aproximado de 180 kD según lo medido por SDS-PAGE y que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: " 7. Otro anticuerpo específico de la pr.esente invención es el anticuerpo monoclonal humano E21 que se. une al antígeno E21 de células dendriticas humanas que tiene un peso molecular aproximado de 36-40 kD según lo medido por SDS-PAGE. Anticuerpos humanos aislados de la presente invención abarcan varios isotipos de anticuerpo, por ejemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgAl, IgA2, IgAsec, IgD, e IgE. Típicamente, incluyen isotipos de IgGl (por ejemplo, IgGlK) e IgM. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos de longitud completa (por ejemplo, un anticuerpo para IgGl ó IgG ) , o bien pueden incluir solamente una porci-ón. de enlace con antígeno (por ejemplo, un Fab, F(ab')2r Fv o bien un fragmento Fv de cadena simple) . En una modalidad, los anticuerpos humanos son anticuerpos humanos recombinantes . En otra modalidad, los anticuerpos humanos son producidos por un hibridoma que incluye una célula B obtenida a partir de un animal no humano transgénico, por ejemplo, un ratón transgénico, que tiene un genoma que comprende un transgen de cadena pesada de ser humano y un transgen de cadena ligera de ser humano fusionados con una célula inmortalizada. Anticuerpos humanos particulares de la invención incluyen los anticuerpos producidos por hibridomas conocidos aquí como A3, A5, A23, A24, A33, B9, Bll, B33, B47, C8, CIO, C20r C28, C29, C30, C35, El, E8, E10, E18, E20, E21, E24, 10F7, 28-6, 24-3, 25-14, 17-6, 19-2 y 19-4. En otra modalidad, . anticuerpos humanos de la presente invención son caracterizados por un enlace especifico con células dendriticas humanas y presentan una o varias de las propiedades siguientes: a) la capacidad de unirse al receptor de mañosa presente en células dendriticas humanas con una constante de asociación de equilibrio de enlace (ka) de por lo menos aproximadamente 10' M~l ; b) la capacidad de opsonizar células dendriticas humanas; c) la capacidad de ser internalizados después de enlace con células dendriticas humanas; y d) la capacidad de bloquear el enlace con el receptor para mañosa en células dendriticas humanas. Por consiguiente, los anticuerpos humanos aislados de la presente invención se unen típicamente a células dendríticas con una constante de asociación de equilibrio de enlace (Ka) de por lo menos aproximadamente 107 M*1, preferente aproximadamente 108 M"1, con mayor preferencia, aproximadamente 109 M"1, y con preferencia todavía mayor aproximadamente 1010 a 1011 M"1 o más. En otro aspecto, la invención ofrece moléculas de ácido nucleico que codifican los anticuerpos o porciones de enlace con antígeno de la invención. Por consiguiente, vectores de expresión recombinantes que incluyen los ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos de la invención así como células huéspedes transfectadas con tales vectores, se encuentran también dentro del marco · de la presente invención así como métodos para elaborar los anticuerpos de la invención mediante el cultivo de estas células huéspedes. En otro aspecto, la invención ofrece células B aisladas a partir de un animal no humano transgénico, por ejemplo, un ratón transgénico, que pueden expresar varios isotipos (por ejemplo, IgG, IgA y/o IgM) de anticuerpos monoclonales humanos que se unen específicamente a células dendríticas. Preferentemente, las 'células. B aisladas se obtienen a partir de un animal no humano transgénico, por ejemplo, un ratón transgénico, que- ha sido inmunizado con una preparación purificada o enriquecida de células dendríticas. Preferentemente, el animal no humano transgénico, por ejemplo, un ratón transgénico, tiene un genoma que comprende un cransgen de cadena pesada de ser humano y un transgen de cadena ligera de ser humano. Las células B aisladas son después inmortalizadas para proporcionar una fuente (por ejemplo, un hibridoma) de anticuerpos monoclonales humanos para células dendriticas. Por consiguiente, la presente invención ofrece también un hibridoma capaz de producir anticuerpos monoclonales humanos que se unen específicamente a células dendriticas. En una modalidad, el hibridoma incluye una célula B obtenida a partir de un animal no humano transgénico, por ejemplo, un ratón transgénico que tiene un genoma que comprende un transgen de cadena pesada de ser humano y" un transgen de cadena ligera de ser humano, fusionados sobre una célula inmortalizada. El animal no humano transgénico puede ser inmunizado con una preparación purificada o enriquecida de células dendriticas para generar hibridomas que producen anticuerpos. Hibridomas particulares de la invención incluyen los designados aquí como A3, A5, A23, A24, A33, B9, Bll, B33, B47, C8, CIO, C20,'C28, C29, C30, C35, El, E8, E10, E18, E20, E21, E24, 10F7, 28-6, 24-3,.25-14, 17-6, 19-2 y 19-4. En otro aspecto, la invención ofrece un animal no humano transgénico, por ejemplo, un ratón transgénico (se conoce aquí también como "HuMab") , que expresa anticuerpos monoclonales humanos que se unen específicamente a células dendriticas. En una modalidad particular, el animal no humano transgénico, es un ratón transgénico que tiene un genoma que comprende un transgen de cadena pesada de ser humano y un transgen de cadena ligera de ser humano. El animal no humano ' transgénico puede estar inmunizado con una preparación purificada o enriquecida de células dendriticas. Preferentemente, el animal no humano transgénico, por ejemplo, el ratón transgénico, puede producir múltiples isotipos de anticuerpos monoclonales humanos para células dendriticas (por ejemplo, IgG, IgA y/o IgM) mediante recombinación V-D-J y cambio de isotipos. El cambio de isotipos puede ocurrir, por ejemplo, mediante cambio clásico b no clásico de isotipo. En otra modalidad, la presente invención ofrece métodos para producir anticuerpos monoclonales humanos que reaccionan en forma específica con células dendriticas. En una modalidad, el método incluye la inmunización de un animal no humano transgénico, por ejemplo, un ratón transgénico, que tiene un genoma que comprende un transgen de cadena pesada de ser humano y un transgen de cadena ligera de ser humano, con una preparación purificada o enriquecida de células dendriticas. Las células B (por ejemplo, células B esplénicas) del animal se obtienen después y se fusiona con células de mieloma para formar células de hibridoma inmortales que secretan anticuerpos monoclonales humanos contra células dendriticas.
Anticuerpos monoclonales humanos anti-células dendriticas aislados de la invención, o bien porciones de enlace con antigeno de los mismos, pueden derivarse, o enlazarse, con otra molécula funcional, por ejemplo, otro péptido o proteína (por ejemplo, otro anticuerpo, fragmento de anticuerpo, un ligando tumoral o un antígeno), formando un conjugado molecular (inmunoconjugado) . Por ejemplo, un anticuerpo o porción de enlace con antígéno de la presente invención puede estar enlazado funcionalmente (por ejemplo, por acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otro tipo) con uno o varios antígenos, por ejemplo, antígeno tumoral, autoantígeno o antígeno patogénico, para formar un conjugado de vacuna para incrementar las respuestas inmunes mediadas por células dendriticas. Anticuerpos anti-células dendriticas humanos de la invención pueden también estar unidos a otros agentes terapéuticos tales como fármacos citotóxicos, toxinas enzimáticamente activas, radioisotipos, y pequeñas - moléculas, por ejemplo, compuestos inmunomoduladores ' (por ejemplo, anti-inflamatorios ) y fármacos anti-cáncer. Conjugados particulares de vacuna de la presente invención incluyen los que consisten de un anticuerpo monoclonal anticélulas dendriticas humana o un fragmento del mismo, conjugado con un antígeno específico para melanoma o un antígeno específico para cáncer de próstata. Incluyen, por ejemplo, conjugados moleculares .compuestos de anticuerpos anti-células dendríticas humanas, por ejemplo, anticuerpo Bll, enlazado a Pmell7, GplOO, Antigeno Especifico para Próstata (PSA) y antigeno de membrana especifico para próstata (PSMA) . En una modalidad particular descrita en el ejemplo 6, el conjugado consiste de un anticuerpo humano Bll enlazado (fusionado genéticamente) con Pmell7, por ejemplo, el conjugado MMV4 codificado por la secuencia de ácido nucleico mostrada en SEQ ID NO: 8. La presente invención ofrece también composiciones terapéuticas que contienen tales conjugados moleculares. Por consiguiente, en otra modalidad, la presente invención ofrece un método para dirigir un antigeno (por ejemplo, un antigeno tumoral, por ejemplo, un antigeno asociado con melanoma o bien un antigeno asociado con próstata, un antigeno microbiano o un antigeno viral) hacia una célula dendrítica (por ejemplo, de tal manera que la célula dendrítica internalice, procese y presente el antígeno en su superficie a otras células inmunes para inducir o incrementar una respuesta inmune contra el antígeno) . Esto puede lograrse mediante. la puesta en contacto de la célula dendrítica ya sea in vi tro o in vivo con un conjugado de vacuna de la invención, por ejemplo, un conjugado que contiene Pmell7 GP100, PSMA. o bien PSA según lo descrito arriba. Alternativamente, el anticuerpo anti-célula dendrítica puede expresarse en la superficie de células blanco no deseadas, por ejemplo, células tumorales de tal manera que las células sean dirigidas hacia células dendríticas. En otra modalidad, la presente invención ofrece un método para inducir o mejorar una respuesta inmune contra un antigeno (por ejemplo, un antígeno de células tumorales, un antígeno microbiano, o un antigeno viral) en un sujeto mediante la administración al sujeto de un conjugado de vacuna de la invención en una cantidad suficiente para inducir o mejorar la respuesta inmune. Tales respuestas inmunes incluyen por ejemplo, las respuestas mediadas por células T que se unen con el antigeno presentado por la célula dendrxtica como componente de un complejo MHC-I ó MHC-II. Por consiguiente, la invención ofrece además un método para inmunizar un sujeto mediante la administración al sujeto de una cantidad' efectiva de un conjugado de vacuna de conformidad con lo descrito arriba. La presente invención ofrece además moléculas bi-especxficas y multi-especificas que comprenden por lo menos un anticuerpo humano de células anti-dendríticas de la invención (o bien fragmentos de las mismas) y una segunda especificidad de enlace para un antígeno en una célula blanco o un patógeno. Una célula blanco es una célula cuya eliminación sería benéfica para el huésped, por ejemplo, una célula tumoral, un patógeno microbiano o un virus o célula infectada por virus.
Antigenos blancos adecuados incluyen, por ejemplo, antígenos asociados con tumores, antigenos patogénicos, autoantigenos y receptores para Fe (por e emplo, FcyR ó FcaR) . Moléculas multi-especificas de la invención incluyen también moléculas tri-especificas, tetra-especificas, y ¦ multi-especificas. En una modalidad, una molécula multi-especifica incluye una porción anti-factor de realce (EF) , por ejemplo, una molécula que se une a una proteina de superficie involucrada en actividad citotóxica. En otro aspecto, la presente invención ofrece composiciones, por e emplo, composiciones farmacéuticas y de diagnóstico que comprenden un vehículo farmacéuticamente aceptable y por lo menos un anticuerpo monoclonal humano " de la ' invención, o una porción de enlace con antígeno del mismo, que se une a células dendríticas. En una modalidad, la composición comprende una combinación de los anticuerpos humanos o porciones de enlace con antígeno de los mismos, preferentemente cada uno de los cuales se une a un epítopo distinto. Así, la combinación ofrece múltiples terapias adecuadas para proporcionar el máximo beneficio terapéutico. Composiciones, por ejemplo, composiciones farmacéuticas que comprenden una combinación de por lo menos un anticuerpo monoclonal humano de la invención, o una molécula bi-específica, molécula multi-especifica, conjugado de vacuna o inmunotoxina que incluye por lo menos un anticuerpo monoclonal humano de la invención, junto con uno o varios otros . agentes ' terapéuticos (por ejemplo, agentes citotóxicos o citocinas) están también dentro del alcance de la presente invención. En otro aspecto, la invención ofrece un método para inhibir la proliferación y/o diferenciación de células dendriticas mediante la inhibición del crecimiento y/o mediante la inducción de la fagocitosis y/o muerte de células dendriticas por células efectoras humanas, por ejemplo, células poli-morfonucleares humanas (PMNs) , monocitos y macrófagos, utilizando un anticuerpo, o una porción de enlace con antigeno del mismo (o bien un anticuerpo bi-especifico o multi-específico) de la invención. En una modalidad, el método comprende la puesta en contacto de una célula dendritica ya* sea in vítro o in vivo con un anticuerpo monoclonal humano o con una combinación de anticuerpos monoclonales humanos de la invención, o una porción de enlace con- antigeno del mismo, en presencia de una célula efectora humana. El método puede emplearse en cultivo, por ejemplo, in vitro o ex vivo (por ejemplo cultivos que comprenden células dendriticas y células efectoras) . Por' ejemplo, una muestra que contiene células dendriticas y células efectoras puede cultivarse in vitro y combinarse con un anticuerpo de la presente invención, o bien una porción de enlace con antigeno del mismo (o bien una molécula bi-especifica o muíti-especifica de la invención) . Alternativamente, el método puede llevarse a cabo en un sujeto, por ejemplo, como parte de un protocolo in vivo (por ejemplo, terapéutico o profiláctico) . Para métodos ín vivo, el anticuerpo o porción de enlace con antigeno del mismo (o bien una molécula bi-especifica o multi-específica de . la invención) , puede administrarse a un sujeto humano que padece de una enfermedad mediada por célula dendritica. Estas enfermedades incluyen, por ejemplo, enfermedad auto-inmune, enfermedad inflamatoria, asi como enfermedad de injerto vs huésped. Enfermedades auto-inmunes ejemplares que pueden ser tratadas (por ejemplo mejorar) o prevenir empleando los métodos y composiciones de la invención incluyen, sin limitarse a estos ejemplos, artritis reumatoide, esclerosis múltiple, diabetes mellitus, miastenia grave, anemia perniciosa, enfermedad de Addison, lupus eritematoso, síndrome de Reiter, y enfermedad de Graves. En una modalidad, el sujeto puede ser tratado adicionalmente con un agente que modula, por ejemplo, realza o inhibe la expresión o actividad de receptor Fe, por ejemplo, un receptor Fcy o un receptor Fea, por ejemplo mediante el tratamiento del sujeto, con una citocina. Citocinas preferidas para su administración durante el tratamiento con la molécula bi-especifica y multi-especifica incluyen factor de estimulación de. colonias de granulocitos (G-CSF) Factor de estimulación de colonias de granulocitos de macrófagos (GM-CSF) , interferon-? (IFN-?) y factor de necrosis tumoral (TNF) .- Composiciones aisladas de anticuerpos monoclonales humanos de la invención pueden también administrarse en combinación con otras terapias conocidas, por ejemplo, una terapia antiinflamatoria o terapias inmuno-supresoras, o citotoxinas . En otro aspecto, la presente invención ofrece un método para detectar la presencia in vitro o in vivo de células dendriticas en una muestra, por ejemplo, para diagnosticar una enfermedad relacionada con una célula dendritica. En una modalidad, esto se logra mediante la puesta en contacto de una muestra a probar, junto con una muestra de control, con un anticuerpo monoclonal humano de la invención o una porción de enlace con antígeno del mismo (o bien una molécula bi-especifica o multi-específica) , bajo condiciones que permiten la formación de un complejo entre el anticuerpo y una célula dendritica. La formación de complejo es detectada entonces, por ejemplo, empleando ELISA en ambas muestra, y cualquier diferencia estadísticamente significativa en la formación de complejos entre las muestras es una indicación de la presencia de células dendriticas en la prueba de muestra. Otras características y ventajas de la presente invención serán aparentes a partir de la siguiente descripción detallada y de las reivindicaciones.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura muestra la reactividad de anticuerpos monoclonales humanos Bll, C20 y E21 con células dendriticas y lineas de células hematopoyéticas U937, : CEM, THP-1 y L540, de conformidad con lo evaluado por citometria de flujo. El enlace fue medido por intensidad de fluorescencia media. La Figura 2 muestra, un enlace dependiente de la dosis de anticuerpos monoclonales humanos Bll, C20 y E21 con células dendriticas, de conformidad con lo evaluado por citometria de flujo. El enlace fue" medido por intensidad de fluorescencia media. La Figura 3 muestra la reactividad dependiente de la dosis de anticuerpo monoclonal humano Bll con células dendriticas derivada de células madre CD34+, de conformidad con lo evaluado por citometria de flujo. El enlace fue medido por intensidad de fluorescencia media. La Figura 4 muestra el enlace de anticuerpo monoclonal humano Bll con células dendriticas y macrófagos, de conformidad con' lo evaluado por citometria de flujo. La Figura 5 muestra el enlace de anticuerpo monoclonal humano Bll con THP-1 inducido a diferenciarse en un fenotipo de célula dendritica, de conformidad con lo evaluado por citometria de flujo. La Figura 6 muestra el enlace de anticuerpo monoclonal humano Bll con células dendriticas de macaco, de conformidad con lo evaluado por citometria de flujo. El enlace fue medido por intensidad de fluorescencia media. La Figura 7 muestra el porcentaje de internalización de anticuerpo monoclonal humano Bll por células dendriticas con el paso del tiempo a una temperatura de 37°C. La Figura 8 muestra una presentación incrementada de antigeno a través de anticuerpo Bll en comparación con antigeno solo, según lo medido por estimulación de células T especificas para toxoide de tétanos. La Figura 9 muestra el constructo Bll ScFv que fue creado mediante el enlace de los dominios VL (SEQ ID NO: 1 y 2) y VH SEQ ID NO: 3 y 4) de anticuerpo monoclonal humano Bll. La Figura 10 · muestra una comparación de enlace entre anticuerpo monoclonal entero Bll y fragmentos F(ab')2 de Bll con células dendriticas, de conformidad con lo medido por análisis FACS . La Figura 11 muestra el porcentaje de internalización FITC-dextrano por células dendriticas. La Figura 12 muestra que la conjugación de .antigeno con Bll incrementa la presentación de' antigeno, puesto que se requieren de cantidades 10 a 100 veces menores de toxoide de tétanos conjugado con anticuerpo Bll para lograr el mismo nivel de estimulación de células T que con toxoide ^de tétanos solo. La Figura 13 muestra la secuencia de nucleótidos y aminoácidos correspondientes de las cadenas ligeras variables (VL) y pesadas variables (VL) de anticuerpo Bll. La Figura 14 muestra un mapa de plásmido MMV4 (SEQ ID NO: 8) que codifica una proteina de fusión (conjugado molecular) que contiene anticuerpo Bll unido a antigeno Pmel-17. La Figura 15 muestra el enlace del conjugado molecular Bll - Pmel-17 con células dendriticas, de conformidad con lo evaluado por citometria de flujo. El enlace fue detectado con • IgG anti-humana de cabra (especifico para Fe) . La Figura 16 muestra el enlacen del conjugado molecular Bll - Pmel-17 con células dendriticas, de conformidad con lo evaluado por citometria de flujo. El enlace fue .detectado con sueros anti-Pmel-17 de conejo- seguido por IgG de anti-cone o de cabra. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención ofrece terapias novedosas basadas en anticuerpos para modular una respuesta inmune contra un anticuerpo, y para tratar y diagnosticar enfermedades, incluyendo enfermedades mediadas por células dendriticas. Las terapias de la presente invención emplean anticuerpos monoclonales humanos aislados, o bien porciones de enlace con antigeno de los mismos que se unen a un epitopo presente en células de presentación de antigeno (APC) . Particularmente células dendriticas y células relacionadas. Mientras los anticuerpos humanos pueden ser producidos empleando varias técnicas conocidas, la presente invención ejemplifica por vez primera su "generación en un'animal transgénico no humano, por ejemplo, un ratón transgénico, que puede producir múltiples isotipos de anticuerpos monoclonales humanos para células dendríticas (por ejemplo, IgC, IgA y/o IgE) mediante el hecho de ser sometido a "recombinación V-D-J y cambio de isotipos. Por consiguiente, varios aspectos de la presente invención incluyen anticuerpos humanos, fragmentos de anticuerpos, miméticos de anticuerpos, moléculas bi-especificas y multi-especificas, conjugados de vacuna, inmunotoxinas asi como composiciones farmacéuticas de los mismos y animales transgénicos no humanos, y células B- e hibridomas para elaborar tales . anticuerpos monoclonales. Métodos . para utilizar los anticuerpos de la invención para detectar una célula' dendritica o un tipo de célula relacionada que ofrece un antigeno de célula dendritica, o bien para inhibir el crecimiento, diferenciación y/o actividad de una célula dendritica, ya sea in vitro o in vivo, están también abarcados por la presente invención. Para que la presente, invención pueda ser más fácilmente comprendida, ciertos términos se definen primero. Definiciones adicionales se presentan a lo largo de la descripción detallada. El término "célula dendritica" como se emplea aqui, incluye células dendriticas maduras e inmaduras y células progenitoras mieloides relacionadas que pueden diferenciarse en células dendriticas, o células de presentación de antigeno relacionadas (por ejemplo monocitos y macrófagos) en la medida en que expresan antígenos en común con células dendriticas. Como se emplea aqui, el término "relacionado" incluye una célula derivada de una célula progenitora común o linaje celular. En una modalidad preferida, la unión de un anticuerpo de la invención con una célula dendritica inhibe el crecimiento de células dendriticas. En otra modalidad preferida, la unión de un anticuerpo de la presente invención con células dendriticas media un efecto sobre el crecimiento de células dendriticas y/o función mediante el hecho de dirigir moléculas o. células con funciones definidas (por ejemplo células tumorales, células efectoras, patógenos microbianos) hacia células dendriticas. En una modalidad adicional, la unión de un anticuerpo de la invención con una célula dendritica resulta en la internalización del anticuerpo con la célula dendritica. Como se emplea aqui, el término "anticuerpo" se refiere a una glucoproteina que comprende por lo menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro. Cada cadena pesada consiste de una región variable de cadena pesada (abreviada a continuación como HCVR o VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada consiste de tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera consiste de una región variable de cadena ligera (abreviada a continuación como LCVR ó VL). y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera consiste de un dominio CL. Las regiones VH y VL pueden estar sub-divididas adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, que se conocen como regiones determinantes de complementaríedad (CDR), intercaladas con regiones más conservadas que se conocen como regiones de estructura (FR) . Cada VH y VL consiste de tres CDRs y cuatro FRs, colocadas desde el amino-terminal hasta el carboxi-terminal en el orden siguiente: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras contienen un dominio de enlace que interactúa con ún antigeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar el enlace de la inmunoglobulina con tejidos huéspedes o factores e incluyen varias células del sistema inmune (por ejemplo células efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema de complemento clásico. El término ."porción de enlace con antigeno" de un anticuerpo (o simplemente "porción de anticuerpo"), como se emplea aquí, se refiere a uno o varios fragmentos de un anticuerpo que conserva la capacidad de unirse específicamente con un antigeno (por ejemplo un antigeno en una célula dendritica) . Se ha mostrado que la función de enlace con antigeno de un anticuerpo puede llevarse a cabo a través de fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Ejemplos de fragmentos de enlace abarcados dentro del término "porción de enlace con antigenos" de un anticuerpo incluyendo (i) un fragmento Fab, o fragmento monovalente que consiste de los dominios VLr VH, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab')¿ un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados por un puente disuifuro en la región de bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste de los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste de los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward y colaboradores, (1989) Nature, 341:544-546), que consiste de un dominio VH; y (vi) una región determinante de compleméntariedad aislada (CDR) . Además, 'aún cuando los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, están codificados por genes separados, pueden estar unidos, empleando métodos recombinantes, a través de un enlazador sintético que permite que se formen como una sola cadena de proteina en donde las regiones VL y VH se aparean para formar moléculas monovalentes (se conocen como Fv de cadena simple · (scFv) ; véase, por ejemplo, Bird y colaboradores (1988) Science 242:423-426; y Huston y colaboradores (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:5879-5883) . Dichos anticuerpos de cadena . simple se contemplan también dentro del término "porción de enlace con antigeno" de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpo se obtienen utilizando técnicas convencionales conocidas por parte de las personas con conocimientos en la materia y los fragmentos son tamizados para determinar su utilidad de la misma manera que los anticuerpos intactos. El término "molécula bi-específica" se contempla de tal manera que incluya cualquier agente, por ejemplo una proteina, un péptido o complejo de proteina o péptido, que tiene dos especificidades de enlace diferentes que se unen o interactúan, por ejemplo, con (a) una célula dendritica y (b) un receptor Fe en la- superficie de una célula efectora. En otra modalidad, una molécula bi-especifica de la presente invención tiene dos especificidades de enlace diferentes que se unen o interactúan con (a) una célula dendritica, (b) un antigeno en una célula blanco (por ejemplo una célula' tumoral) . El término ,molécula multi-especifica" o "molécula hetero-específica" se contempla para que incluya cualquier agente, por ejemplo, una proteína, péptido o complejo de proteína o péptido, que tiene más de dos especificidades de enlace diferentes que se unen o interactúan con, por ejemplo, (a) una célula dendritica, (b) un receptor Fe en la superficie de una célula efectora, y (c) por lo menos otro componente. Por consiguiente, la invención incluye, sin limitarse a estos ejemplos, moléculas bi-específicas , tri-específicas, tetra-específicas y multi-específicas, que son dirigidas a antígenos de superficie celular, como por ejemplo antígeno de célula dendritica, o a receptores Fe en células efectoras, o un antígeno en una célula blanco (por ejemplo, una célula tumoral). El término "anticuerpos bi-especificos" incluye además diacuerpos. Los diacuerpos son anticuerpos bi-especificos bivalentes en donde los dominios -VH y VL están expresados en una sola cadena de polipéptidos, pero utilizando un enlazador que es demasiado corto como para permitir su apareamiento entre los dos dominios , en la misma cadena, obligando por consiguiente los dominios a aparearse con dominios complementarios de otra cadena y creando dos sitios de enlace con antigeno (véase, por ejemplo, Holliger, P., y colaboradores (1993) Proc. Nati. Acad. Sel. USA 90:6444-6448; Poljak, R.J. y colaboradores (1994) Structure 2:1121-1123) . Como se emplea aquí, el término "hetero-anticuerpo" se refiere a dos o más anticuerpos,' fragmentos de enlace con anticuerpos (por ejemplo, Fab) , derivados de los mismos o bien región de enlace con antigeno unidos entre ellos, por lo menos dos de los cuales tiene especificidades diferentes. Estas especificidades diferentes incluyen una especificidad de enlace para una célula dendrítica, una especificidad de enlace para un receptor Fe en una célula efectora, o un antigeno o epitopo en una -célula blanco, por ejemplo, una célula tumoral. El término "anticuerpo humano" como se emplea aquí, se contempla para que incluye anticuerpos que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de linea germinal de ser humano. Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por secuencias humanas de inmunoglobulina de linea germinal (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o especifica para sitio in vitro o bien mutación- somática in vivo). Sin embargo, el término "anticuerpo humano" como se emplea aguí no pretende incluir anticuerpos en los cuales secuencias de CDR derivadas de la linea germinal de otra especie de mamífero como por ejemplo ratón, han sido injertadas en secuencias de estructura de ser humano. Los términos "anticuerpo monoclonal"' o "composición de anticuerpo monoclonal" como se emplean aquí se refieren a una preparación de moléculas de anticuerpo de composición molecular simple. Una composición de anticuerpo monoclonal presenta una especificidad de enlace simple y afinidad para un .. epítopo particular. Por consiguiente, el término "anticuerpo monoclonal humano"' se refiere a anticuerpos que presentan una sola especificidad de enlace que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias humanas de inmunoglobulina de linea germinal. En una modalidad, los ' anticuerpos monoclonales humanos son producidos por un hibridoma que incluye una célula B obtenida a partir de un animal no humano transgénico, por ejemplo, un ratón transgénico, que tiene un genoma que comprende un , transgen " de cadena pesada de ser · humano y un. transgen de cadena ligera, fusionada sobre una célula inmortalizada. El término "anticuerpo humano recombinante" como se emplea aqui incluye todos los anticuerpos humanos, expresados., creados o aislados por medios recombinantes, por ejemplo anticuerpos aislados a partir de un animal (por ejemplo, un ratón) que es . transgénico para genes de inmunoglobulina de ser humano (se describe con mayores detalles en la sección I, abajo) ; anticuerpos expresados utilizando un vector de expresión recombinante transfectado en una' célula "huésped, anticuerpos aislados a partir de una biblioteca de anticuerpos humanos de combinación, recombinante, o bien anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por otros medios que incluyen el empalme de secuencias de. genes de inmunoglobulina humana con otra secuencia de ADN. Tales anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de linea germinal humana. En ciertas modalidades, sin embargo, tales anticuerpos humanos recombinantes son sometidos a mutagénesis in vitro (o bien, cuando se utiliza un animal transgénico - para secuencias de Ig de ser humano, mutagénesis somática in vivo) y por consiguiente las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, si bien son derivadas de secuencias VH y VL de línea germinal de ser humano y relacionadas con dichas secuencias, no pueden . existir naturalmente dentro del repertorio de línea germinal de anticuerpo de ser humano in vivo. Como se emplea aquí, un "anticuerpo heteróiogo" se define con relación al organismo no humano transgénico que produce dicho anticuerpo. Este término se refiere a un anticuerpo que tiene una secuencia de aminoácidos o una secuencia de ácido nucleico de codificación que correspondiente a lo encontrado 'en un organismo que no consiste del animal no humano transgénico, y generalmente de una especie otra que el animal no humano transgénico. Como se .emplea aquí, un "anticuerpo hetero-híbrido" se refiere a un anticuerpo que tiene unas cadenas ligeras y pesadas de orígenes de organismos diferentes. Por ejemplo, un anticuerpo que tiene una cadena pesada humana asociada con una cadena ligera de murino es un anticuerpo hetero-híbrido. Ejemplos de anticuerpos hetero-híbridos incluyen anticuerpos quiméricos y humanizados comentados supra. Un "anticuerpo aislado" como se emplea aquí se refiere a un anticuerpo sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen especificidades antigénicas diferentes (por ejemplo un anticuerpo aislado que se une específicamente a células dendríticas y células de presentación de antígeno derivadas de mieloide relacionadas (por ejemplo, monocitos y macrófagos) , y está sustancialmente libre de anticuerpos que se unen específicamente a tipos de- células otros que células dendríticas ) . Un anticuerpo aislado que se une específicamente a una célula dendrítica puede sin embargo tener una reactividad cruzada con otras células, por ejemplo, tipos de células que expresan un anticuerpo relacionado con el antígeno correspondiente en una célula dendrítica. Además, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o químicos. En una modalidad de la presente invención, una combinación de anticuerpos monoclonales "aislados" que tienen especificidades diferentes se combinan en una composición bien definida. Como 'se emplean aquí, los términos "enlace específico" y "se enlaza específicamente con" se refieren a la especificidad de enlace de anticuerpo con un antígeno predeterminado o tipo de célula predeterminada. Un anticuerpo que' "se une específicamente con" o "es específico para" un antígeno particular o. tipo de célula, se une con el antígeno o con el tipo de . célula con selectividad, en comparación con otros antígenos y otros tipos de células. Mientras que el anticuerpo de la. invención se une específicamente con un epítopo blanco particular (por ejemplo, presente en la superficie de una célula dendrítica) , anticuerpos específicos de la invención, en ciertas modalidades, pueden presentar una cierta reactividad cruzada con otras APCs. En otras modalidades, los anticuerpos específicos reaccionan solamente con células ' dendriticas . Típicamente, el anticuerpo se une con una afinidad de por lo menos aproximadamente 1 x 107 M_1 y se une al antigeno predeterminado con una afinidad que es por lo menos dos veces mayor que su afinidad para enlazarse con un antigeno no especifico (por ejemplo BSA, caseína) otro que el antigeno predeterminado o un antigeno relacionado en forma estrecha. Las expresiones "un anticuerpo que reconoce un antigeno" y "un anticuerpo especifico para un antigeno" se utilizan aquí de manera intercambiable con el término "un anticuerpo que se une específicamente con un antígeno". Como se emplea aquí, el término "alta .afinidad" para un anticuerpo IgG se refiere a una afinidad de enlace de por lo menos aproximadamente 107 -M"1, preferentemente por lo menos aproximadamente 109 ?G1, más preferentemente por lo menos aproximadamente 1010 M"1, 10 1 M"1, 1012 M"1 o más, por ejemplo, hasta 1013 M_1 o mayor. Sin embargo, un enlace de "alta afinidad" puede variar para otros isotipos de anticuerpo. Por ejemplo, un enlace de "alta afinidad" para un isotipo de IgM se refiere a una afinidad de enlace de por lo menos aproximadamente 1 x 10' "1. El término "?aa30?" , como se emplea aquí, tiene el propósito de referirse a la asociación constante de una interacción anticuerpo-antígeno particular. ' El término " di3" como se emplea aquí, se refiere a la constante de disociación de una reacción anticuerpo-antigeno particular. Como se emplea aquí, el término "isotipo" se refiere a la clase de anticuerpo (por ejemplo, IgM ó IgCl) codificada por genes de región constante de cadena pesada. Como se emplea aquí, el término "cambio de isotipo" se refiere al fenómeno a través del cual la clase o isotipo de un anticuerpo cambia de una clase Ig a otra clase Ig. Como se emplea aquí, la expresión "isotipo no cambiado" se refiere a la clase de isotipo de cadena pesada que es producida cuando no ha ocurrido ningún cambio de isotipo; el gen CH que codifica el isotipo no cambiado es típicamente el primer gen CH inmediatamente corriente abajo a partir del gen VDJ funcionalmente reacomodado. El cambio de isotipo ha sido clasificado como cambio de isotipo clásico o cambio de isotipo no clásico. Ocurre un cambio de isotipo clásico mediante eventos de recombinación que involucran por lo menos una región de secuencia de cambio en el transgen. Un cambio de isotipo no clásico puede ocurrir, por ejemplo, mediante recombinación homologa entre au de ser humano y ?u de ser-humano (deleción asociada con d) . Mecanismos alternativos de cambio no clásico, como por ejemplo recombinación inter-transgen y/o inter-cromosómica, entre otros mecanismos, pueden ocurrir y efectuar un cambio de isotipo. Como se emplea aquí, el término "secuencia de cambios" se refiere a la secuencia ADN responsables de recombinación de cambio. Una secuencia "donadora de cambios", típicamente una región de cambio ? estará 5' . (es decir corriente arriba) de la región de constructo a borrar durante la recombinación de cambio. La región "aceptadora de cambios" estará entre la región de constructo . a . borrar y la región constante de reemplazo (por ejemplo, ?, e, etc.) puesto que no hay ningún sitio específico en donde ocurre siempre la recombinación, la secuencia génica final típicamente no será predecible a partir del constructo. Como se utiliza aquí, la expresión "patrón de glicosilación" se define como el patrón de unidades de carbohidrato covalenteiaente unidas a una proteína, más 'específicamente a una proteína de tipo inmunoglobulina. Un patrón de glicosilación " de un anticuerpo heterólogo puede ser caracterizado como sustancialmente similar a patrones de glicosilación que ocurre naturalmente en anticuerpos producidos por la especie del animal transgénico no humano, cuando una persona con experiencia ordinaria en la materia podría reconocer el patrón de glicosilación del anticuerpo heterólogo como más similar a dicho patrón de glicosilación en la especie del animal transgénico no humano que a la especie a base de la cual los genes CH del transgen fueron derivados. El término "que ocurre naturalmente" como se emplea aquí cuando se aplica a un objeto se refiere al hecho que un objeto puede encontrarse en la naturaleza. Por ejemplo, un polipéptido o secuencia de polinucleótidos presente en un organismo (incluyendo virus) que puede aislarse de una fuente de la naturaleza y que no ha sido intencionalmente modificada por el hombre en el laboratorio se califica como ocurriendo en la naturaleza. El término "reacomodado" como se emplea aquí se refiere a una configuración de locus de inmunoglobulina de' cadena pesada o de cadena ligera en donde un segmento V se coloca ' inmediatamente adyacente a un segmento D-J ó J en una conformación que codifica esencialmente un dominio VH ó VL completo respectivamente. Un . locus de' gen dé inmunoglobulina reacomodado puede ser identificado por comparación con ADN de línea germinal; un locus reacomodado tendrá por lo menos un elemento de homología heptámero/nonámero. El término "no reacomodado" o bien "configuración de línea germinal" como se emplea aquí con referencia a un segmento V se refiere a la configuración en donde, el segmento V no es recombinado para que sea inmediatamente adyacente a un segmento D ó J. El término "molécula de ácido nucleico" como se emplea aquí, se contempla para que incluya moléculas de ADN y moléculas de ARN. Una molécula de ácido nucleico puede ser de cadena simple o de cadena doble, pero preferentemente es ADN de cadena doble. El término "molécula . de ácido nucleico aislada" como se emplea aquí con referencia a ácidos nucleicos que codifican anticuerpos o porciones de anticuerpos (por ejemplo VH, VL, CDR3) que se unen con células dendriticas se refiere a una molécula de ácido nucleico en la cual las secuencias de nucleótidos que codifican el anticuerpo o porción de anticuerpo están libres de otras secuencias de nucleótidos que codifican anticuerpos o porciones de anticuerpos que se unen con células otras que células dendriticas, dichas otras secuencias pueden flanquear naturalmente el ácido nucleico en el ADN genómico humano. Para ácidos nucleicos, el término "homología sustancial" indica que dos ácidos nucleicos, o secuencias designadas de los mismos, cuando están óptimamente alineados y comparados, son idénticos, con inserciones o deleciones apropiadas de nucleótidos, en por lo menos aproximadamente el 80% de los nucleótidos, habxtualmente por lo menos aproximadamente 90% a 95%, y más preferentemente por lo menos aproximadamente 98% a 99.5% de los nucleótidos. Alternativamente, existe una homología- sustancial cuando los segmentos se hibridan bajo condiciones selectivas de hibridación con el complemento de la cadena. La identidad porcentual entre dos secuencias depende del número de posiciones idénticas compartidas por las ' secuencias (es decir, ' % de homología = # de posiciones idénticas/# total de posiciones x 100) , tomando en cuenta el número de espacios y la longitud de cada espacio, cuya introducción es requerida para alineación óptima de las dos secuencias. La comparación de secuencias y determinación de porcentaje de identidad entre dos secuencias pueden lograrse utilizando un algoritmo matemático, de conformidad con lo descrito en los ejemplos no limitativos presentados abajo. El porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos puede ser determinado utilizando el programa GAP en el paquete de programática GCG (disponible en http://www.gcg.com), utilizando una matriz NWSgapdna . CMP y un peso de espacio de 40, 50, 60, 70 u 80 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 ó 6. El .porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos puede también determinarse utilizando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller {Comput. Áppl. Biosci., 4:11-17 (1988)) que ha sido incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0) empleando una tabla de residuos de pesos PAM120,. una penalidad por longitud de espacio de 12 y una penalidad de espacio de 4. Además, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos puede determinarse empleando el algoritmo de Neddleman y Wunsch (J. Mol. Biol. (48): 444-453 (1970)) que ha sido incorporado en el programa GAP en el paquete de programática GCG (disponible en http://www.gcg.como) utilizando ya sea una matriz Blossum 62 o una matriz PAM250, y un peso de espacio de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ó 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 ó 6. Las secuencias de ácido nucleico y proteina de la presente invención pueden utilizarse además- como una "secuencia de búsqueda" para efectuar una búsqueda contra base de datos públicas por ejemplo, para identificar secuencias relacionadas. Tales búsquedas pueden efectuarse empleando los programas NBLAST y XBLAST (versión 2.0) de Altschul y colaboradores (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. Búsquedas de nucleótidos BLAST pueden efectuarse con el programa NBLAST, resultado = 100, longitud de palabra = 12 para obtener secuencias de nucleótidos homologas a las moléculas de ácido nucleico de la invención. Las búsquedas de proteina BLAST pueden efectuarse con el programa XBLAST, resultado = 50, longitud de palabra = 3 para obtener secuencias de aminoácidos homologas con las moléculas de proteina de la invención. Para obtener alineaciones con espacios para propósitos de comparación, Gapped BLAST puede utilizarse de conformidad con lo descrito en Altschul y colaboradores, (1997) Nucleic Acids Res. 25 (17 ): 3389-3402. Cuando se utiliza BLAST y Gapped BLAST, los parámetros por omisión de los programas respectivos (por ejemplo, XBLAST y NBLAST) pueden emplearse. Véase http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Los- ácidos nucleicos pueden estar presentes' en células enteras, en lisado celular o bien en forma parcialmente purificada o sustancialmente pura. Un ácido nucleico es "aislado" o bien "tornado sustancialmente puro" cuando es purificado con relación a otros componentes celulares u otros contaminantes, por ejemplo, otros ácidos nucleicos celulares o proteínas, por técnicas estándares, incluyendo tratamiento alcalino/SDS, formación de bandas de CsCl, cromatografía en columna, electroforesis en gel de agarosa y otros bien conocidos en la técnica. Véase, F. Ausubel, y colaboradores, Current Protocols in Molecular Biology [Protocolos actuales en biología molecular] , Greene Publishing and Wiley Interscience, Nueva York (1987) . Las composiciones de ácido nucleico de la presente invención, si bien se encuentran frecuentemente en la secuencia nativa (excepto en el caso de sitios de restricción modificados y similares) , proveniente ya sea de ADNc, genómico o mezclas pueden ser mutadas, de conformidad con técnicas estándares para proporcionar secuencias de genes. Para secuencias codificadoras, estas mutaciones pueden afectar la secuencia de aminoácidos según lo deseado. En particular, secuencias de ADN sustancialmente homologas o derivadas de V, D, J nativo, constante, cambios y otras secuencias de este tipo descritas aquí se contemplan (en donde el término "derivado" indica que una secuencia es idéntica o modificada a partir de otras secuencias.
El término "enlazado operativamente" o "enlazada en forma operativa" tiene el propósito de significar qué moléculas están funcionalmente acopladas entre ellas y que el cambio de actividad o estado de una molécula · es afectado por la actividad o estado de otra molécula. Un ácido nucleico está "enlazado operativamente" cuando se- encuentra en relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor o realzador esta unido operativamente a una secuencia codificadora si afecta la transcripción de la secuencia. Con relación a secuencias reguladoras de transcripción, el término "enlazado operativamente" significa que las secuencias de ADN que se están enlazando están contiguas . y, en caso necesario, para unir dos regiones codificadoras de proteina, contiguas y en cuadro de lectura. En el caso de secuencias de cambio ,- el término "enlazadas operativamente" indica que las secuencias pueden efectuar recombinación de cambio. Típicamente, dos polipéptidos operativamente enlazados están unidos de manera covalente a través de enlaces- péptido. El término "vector", como se emplea aquí, se refiere a una molécula de ácido nucleico que puede transportar otro ácido nucleico al cual está unida. Un tipo de vector es un "plásmido", " lo que se refiere a un bucle de ADN de cadena doble circular en donde segmentos de ADN adicionales pueden estar ligados. Otro tipo' de vectores es un vector viral, en donde segmentos de ADN adicionales pueden estar unidos en el genoma viral. Algunos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula huésped en la cual están introducidas (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen bacteriano de replicación .y vectores de mamíferos episomales) . Otros vectores, por ejemplo vectores de mamífero no episomales, pueden estar integrados en el genoma de una célula huésped al introducirse en la célula .huésped y por consiguiente son replicados junto con el genoma huésped. Además, algunos vectores . pueden dirigir la expresión de genes a los - cuales están operativamente unidos. Tales vectores se conocen a continuación como "vectores de expresión recombinantes" o bien, simplemente "vectores de expresión". En general, los vectores de expresión de utilidad en técnicas de ADN recombinante se encuentran frecuentemente en forma de plásmidos. En la presente especificación, los términos "plásmidos" y "vector" pueden utilizarse de manera intercambiable puesto que el plásmido es la forma más comúnmente utilizada de vector. Sin embargo, la invención se contempla para incluir tales otras formas de vectores de expresión, por ejemplo vectores virales (por ejemplo, retrovirus, adenovirus y virus adenoasociados defectuosos en cuanto a replicación) que desempeñan funciones equivalentes. El término "célula huésped recombinante (o bien simplemente "célula huésped"), como se utiliza aquí, se contempla para referirse a una célula en la cual un vector de expresión recombinante ha sido introducido.- Se entenderá que tales términos se contemplan para referirse no solamente a las células sujeto particular sino a -la progenie de dicha célula. Puesto que ciertas modificaciones pueden ocurrir en generaciones subsecuentes debido ya sea a influencias de mutaciones o bien influencias ambientales, dicha progenie de' hecho puede no ser idéntica a la célula de origen, pero sigue incluyéndose dentro del alcance del término "célula huésped" como se utiliza aqui. Varios · aspectos de la invención se describen con detalles adicionales en sub-secciones siguientes. I . Producción 'de anticuerpos humanos para células dendríticas Mientras métodos particularmente preferidos para generar anticuerpos monoclonales humanos (mAbs) de la presente invenció se describen con detalles aqui, varias otras técnicas, incluyendo metodología de anticuerpo monoclonal convencional, por ejemplo, la técnica estándar de hibridación de células somáticas de Kohler y Milstein, Nature 256:495 (1975) puede también utilizarse. Aún cuando se prefiere procedimientos de hibridación de- células somáticas, otras técnicas para producir anticuerpos monoclonales pueden emplearse, por ejemplo transformación viral u oncogénica de llnfocitos B. El sistema de animal preferido para la preparación de hibridomas es el sistema de murino. La producción de hibridoma en sistemas de murino es un procedimiento bien establecido. Protocolos y técnicas de inmunización para aislar esplenocitos inmunizados para fusión son bien conocidos en la técnica. Los socios de fusión (por ejemplo, células de mieloma de murino) y procedimientos de fusión se conocen también de manera precisa. En una modalidad preferida, anticuerpos monoclonales humanos que son dirigidos contra las células dendriticas son generados empleando ratones transgénicos que llevan partes del sistema inmune humano en lugar del sistema de ratón. Estos ratones transgénicos conocidos aquí como ratones "HuMAb", contienen un miniloci de gen' de inmunoglobulina de ser humano que codifica las secuencias de inmunoglobulina de cadena pesada de ser humano no reacomodada (µ y ?) y cadena ligera , juntas con mutaciones dirigidas que desactivan los loci de cadena µ y endógenas (Lonberg, N. y colaboradores (1994) Nature 368 (6474): 856-859). Por consiguiente, los ratones presentan una expresión reducida de IgM de ratón o ? y en respuesta a la inmunización, los transgenes de cadena pesada y de cadena ligera humanos introducidos son sometidos a cambio de clase y mutación somática para generar IgG monoclonal humana de alta afinidad (Lonberg, N. y colaboradores (1994), supra, reseñado en Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. y Huszar, D. (1995) Intern, Rev. Immunol. Vol. 13: 65-93, y Harding, F. Y Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536-546). La preparación de ratones HuMab se describe con detalles en la Sección II abajo y en Taylor, L. y colaboradores (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. y colaboradores (1993) International Immunology 5:647-656; Tuaillon y colaboradores (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:3720-3724; Choi y . colaboradores (1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. y colaboradores (1993) EMBO J.12 : 821-830 ; Tuaillon y colaboradores (1994) J. Immunol. 152:2912-2920; Lonberg y colaboradores (1994) Nature 368(6474); 856-859; Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101;' Taylor, L. y colaboradores (1994) International Immunology 6: 579-591; Lonberg, N. Y Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13: 65-93; Harding, F. y Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. ' Acad. Sci. 764:536-546; Fishwild, D. y colaboradores (1996) Nature Biotechnology 14:845-851, cuyos contenidos se incorporan aquí por referencia en su totalidad. Véase también las patentes norteamericanas Nos. 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299; y 5,770,429, todas de Lonberg ' y Kay, y GenPharm International; Patente norteamericana No. 5,545,807 a Surani y colaboradores; Publicaciones internacionales Nos. O 98/24884, publicada el 11 de Junio de 1998; WO 94/25585, publicada el dia 10 de noviembre de 1994; WO 93/1227, publicada el dia 24 de junio de 1993; WO 92/22645 publicada el dia 23 de diciembre de 1992; WO 92/03918 publicada el dia 19 de marzo de 1992, cuyas divulgaciones se incorporan aquí por referencia en su totalidad. Inmunizaciones con EuMab Para generar anticuerpos monoclonales totalmente humanos para células dendriticas, ratones HuMab pueden ser inmunizados con una preparación purificada o enriquecida de células dendriticas de conformidad con lo descrito por Lonberg, N. y colaboradores (1994) Wature 368 (6474): 856-859; Fishwild, D. y colaboradores (1996) .Nature Biotechnology 14:845-851 y WO 98/24884. Preferentemente, .los ratones tendrán de 6 a 16 semanas de edad al momento de la primera inmunización. Por ejemplo,, una preparación purificada o enriquecida de células dendriticas (1-10 millones de células) puede emplearse para inmunizar los ratones HuMab en forma peritoneal. En el caso en el cual las inmunizaciones utilizan una preparación purificada o enriquecida de células dendriticas no resulta en anticuerpos, los , ratones pueden también ser inmunizados con un lisado de células dendriticas para promover respuestas inmunes. La experiencia acumulada con varios antigenos ha mostrado que los ratones , transgénieos HuMAb responden mejor cuando estén inicialmente inmunizados de manera intraperitoneal (IP) con antigeno en adyuvante completo de Freund, seguido cada dos semanas por inmunizaciones IP (hasta un total de 6) con antigeno en adyuvante incompleto de Freund. La respuesta inmune puede ser monitoreada en el transcurso del protocolo de inmunización, con muestras plasmáticas obteniéndose por sangrados retro-orbitales. El plasma puede ser tamizado, por ejemplo, por ELISA o citometria de flujo (de conformidad con lo descrito abajo), y ratones con títulos suficientes de inmunoglobulina humana anti-células dendríticas pueden utilizarse para fusiones. Los ratones pueden recibir refuerzos intravenosos ' con antígeno tres días antes del sacrificio y remoción del bazo. Se espera que se pueda necesitar de 2 a 3 fusiones para cada antígeno. ¦ Varios ratones serán inmunizados para cada antígeno. Por ejemplo, un total de doce ratones HuMAb de las cepas HC07 y HC012 pueden ser inmunizados. Generación de hibridomas ¦ que producen anticuerpos monoclonales humanos para células dendrítlcas Los esplenocitos de ratón pueden ser aislados y fusionados con PEG con una línea de células de mieloma de ratón con base en protocolos estándares. Los hibridomas resultantes son después tamizados para la producción de anticuerpos específicos para antígenos. Por ejemplo, suspensiones de células individuales de linfocitos esplénicos de ratones inmunizados son fusionados a una sexta parte del número de células de mieloma de ratón no secretorias P3X63-Ag8.653 (ATCC, CRL 1580) con PEG al 50%. Las células son colocadas en placas aproximadamente 2 x 10a en placa de microtitulación de fondo plano, seguido por una incubación de dos semanas en medio selectivo que contiene suero fetal de clon al 20%, medio acondicionado "653" al 18%, 5% de origen (IGEN) , L-glutamina 4 mM, L~glutamina 1 ¦ mM, piruvato de sodio 1 M, HEPES 5 mM, 2-mercaptoetanol 0.055 mM, 50 unidades/ml de penicilina, 50 mg/ml de estreptomicina, 50 mg/ml de gentamicina y IX HAT (Sigma; se agrega HAT 24 horas después de la fusión). Después - de dos semanas, las células son cultivadas en medio, en donde HAT es reémplazado por HT. Pozos individuales son después tamizados por ELISA para determinar la presencia de anticuerpos IgM e IgG monoclonales anti-células dendriticas de ser humano. Una vez que ocurre un crecimiento extenso de hibridomas, se observa el medio habitualmente después de 10-14 . días. Los hibridomas secretorios de anticuerpos son colocados otra vez en placas, tamizados otra vez y si siguen positivos para IgG de ser humano, anticuerpos monoclonales anti-células dendriticas, pueden ser subclonados por lo menos dos veces mediante dilución limitante. Los subclones estables son después cultivados in vi tro para generar pequeñas cantidades de anticuerpos en medio de cultivo tisular para caracterización.
Caracterización de enlace de anticuerpos monoclonales humanos con células dendritícas Para caracterizar el enlace de anticuerpos para células dendritícas monoclonales de ser humano de la presente invención, hibridomas pueden ser tamizados, por ejemplo, para reactividad positiva con células dendritícas por citometría de flujo, En resumen, células dendritícas son cosechadas y lavadas, después agregadas a placas de 96 pozos e incubadas con diluciones de sobrenadantes de hibridoma (o bien anticuerpos monoclonales en PBS que contiene Tween 80 al 0.1% y suero de ratón al 20*) a una temperatura de 4o C duranté 1 hora. Las placas son después lavadas, e incubadas adicionalmente con anticuerpos secundarios (por ejemplo, IgG anti-humano marcada con PE ó FITC) durante 1 hora a una temperatura de 4° C. Después del lavado, las células son fijadas con paraformaldehído al 1% y analizadas. Las muestras pueden ser analizadas por instrumento FACScan utilizando propiedades de difusión luminosa y lateral hacia compuertas en células individuales, ün ensayo alternativo que utiliza microscopía de fluorescencia puede emplearse (además o en lugar de) el ensayo de citometría de flujo. Las células pueden ser teñidas exactamente de conformidad con lo descrito arriba y examinadas por microscopía de fluorescencia. Este método permite la visualización de células individuales pero puede presentar una sensibilidad disminuida dependiendo de la densidad del antigeno . Hibridomas que se unen con alta avidez a células dendriticas serán subclonados y caracterizados adicionalmente . Un clon de cada hibridoma, que- conserva la reactividad de las células de origen (por citometría de flujo) , puede ser seleccionado para formar un banco de células de -5-10 frascos almacenados a una temperatura de -140° C y para purificación de anticuerpo. Para purificar anticuerpos anti-células dendriticas de ser humano, hibridomas seleccionados pueden ser cultivados en frascos de centrifugación de 2 litros para purificación de anticuerpos · monoclonales. Los sobrenadantes pueden ser filtrados y concentrados antes de cromatografía por afinidad' con Proteína 1-Sepharose (Pharmacia, Piscata ay, NJ) . IgG eluida puede - ser revisada por electroforesis en gel y cromatografía de líquido de alto desempeño para asegurar la pureza. La solución amortiguadora puede ser cambiada en PBS y la concentración puede ser determinada por OD 30 utilizando un coeficiente de extinción de 1.43. Los anticuerpos monoclonales pueden ser divididos en alícuotas y almacenados a -80° C Para determinar si los anticuerpos monoclonales anti-células dendriticas de ser humano seleccionados se unen a epítopos únicos, cada anticuerpo puede ser biotinilado empleando reactivos comercialmente disponibles (Pierce, Rockford, IL) .
Estudios de competencia utilizando anticuerpos monoclonales no marcados y anticuerpos monoclonales biotinilados pueden efectuarse empleando citometría de flujo de conformidad con lo descrito, arriba. La unión de anticuerpos monoclonales biotinilados puede detectarse con una sonda de strep-avidin-fosfatasa alcalina. Para determinar el isotipo de anticuerpos purificados, se pueden efectuar ELISAs de isotipo. Pozos de placas de microtitulación pueden ser revestidos con 10 µg/ml de Ig anti-humana durante la noche a una temperatura de 4 o C. Después del bloqueo con BSA al 5%, las placas reaccionan con 10 µg/ml de anticuerpos monoclonales o controles de isotipo purificado, a temperatura ambiente durante 2 horas. Después se pueden someter los pozos a reacción con sondas conjugadas con fosfatasa alcalina especifica para IgM de ser humano o para IgGl de ser humano. Después del lavado, las placas son reveladas con sustrato de pNPP (1 mg/ml) y analizadas a OD de 405-650. IgGs humanas anti-células dendriticas pueden ser probadas adicionalmente para reactividad con células dendriticas por análisis Western blot. En resumen, extractos de células provenientes de células dendriticas pueden prepararse y someterse a electroforesis en. gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de " sodio (SDS) . Después de electroforesis, los antigenos separados serán transferidos a membranas de microcelulosa, bloqueados con suero de ratón a 20%, y sondeados con los anticuerpos raonoclonales a probar. La unión de IgG humana puede detectarse empleando fosfatasa alcalina anti-IgG humana y revelado con tabletas de sustrato BCIP/NBT (Sigma Chem. Co., Louis, MO) . Actividades fagocíticas y de muerte celular de anticuerpos monoclonales humanos para células dendriticas Además de la unión específica con células "dendriticas, los anticuerpos anti-células dendriticas monoclonales de ser humano pueden ser probados para determinar - su capacidad para mediar la fagocitosis y la muerte de células dendriticas. La prueba de la actividad de anticuerpos monoclonales in vitro puede proporcionar un tamizado inicial antes de probar los modelos in vivo. En resumen, células polimorfonucleares (PM ) , u otras células efectoras, provenientes de donadores sanos pueden ser purificados por centrifugación de densidad Ficoll Hypaque, seguido por lisis de de eritrocitos contaminantes. Las células polimorfonucleares lavadas pueden ser suspendidas en RPMI suplementado con suero de becerro fetal desactivado térmicamente al 10% y mezclados con células dendriticas marcadas con Cr en varias proporciones entre células efectoras y células dendriticas (células efectoras: células dendriticas). IgGs anti-células dendriticas de ser humano' purificadas pueden entonces agregarse en varias concentraciones. Una IgG humana irrelevante puede ser utilizada como control negativo. Los ensayos pueden efectuarse durante 0-120 minutos a una temperatura de 37° C. Muestras pueden ser ensayadas para determinar la citólisis mediante la medición de la liberación de 51Cr en el sobrenadante de cultivo. Anticuerpos monoclonales antir células dendriticas pueden también ser probados en combinaciones entre ellos para determinar si la citólisis es incrementada con múltiples anticuerpos monoclonales . Los anticuerpos monoclonales humanos que se unen a células dendriticas pueden también ser probados en un modelo in vivo (por ejemplo, en ratones) para determinar su eficacia en la mediación de la' fagocitosis y la muerte de células dendriticas. Estos anticuerpos pueden ser Seleccionados, por ejemplo, con base en los criterios siguientes, que no pretenden ser exclusivos: 1. ) enlace con células dendriticas vivas; 2. ) alta afinidad de enlace con células dendriticas; 3. ) enlace con un epitopo único en células dendriticas (para eliminar la posibilidad que anticuerpos monoclonales con actividades complementarias cuando se utilizan en combinación pudieran competir para enlace con el mismo epitopo) ; 4. ) opsonización de .células dendriticas; 5. ) mediación de la inhibición del crecimiento, fagocitosis y/o muerte de células dendriticas en presencia de células efectoras humanas; - 6.) internalización después de unión con células , dendríticas ; 7. ) enlace con células dendriticas in si tu (por ejemplo, en tejidos humanos); ¦ 8. ) activación de células dendriticas (por ejemplo, inducen la liberación de citosina, expresión de moléculas de superficie inmunomoduladoras (por ejemplo, CD80(B7.1). , CD86(B7.2), CD40, y CD54 ( ICAM) ) ; 9. ) enlace con el receptor para mañosa de ser humano en células dendriticas; y 10. ) enlace con antigeno para células ' dendriticas conservado entre primates. Los anticuerpos monoclonales humanos preferidos de la invención cumplen uno o varios, y preferentemente todos estos criterios. En una modalidad particular, los anticuerpos monoclonales humanos se utilizan en combinación, por ejemplo, como composición farmacéutica que comprende dos o más anticuerpos monoclonales anti-células · dendriticas o fragmentos de las mismas. . Por ejemplo, anticuerpos monoclonales anti-células dendriticas ' de ser humano que tienen actividades diferentes pero complementarias pueden combinarse en una sola terapia para lograr un efecto terapéutico o de diagnóstico deseado. Una ilustración de esto seria una composición que contiene un anticuerpo monoclonal humano anti-células dendrlticas rápidamente internalizado por células dendriticas, combinado con otro . anticuerpo monoclonal humano anti-células dendriticas que inducen actividades de células de presentación de antigeno de células dendriticas, por ejemplo, liberación de citocinas inmunoestimuladoras . II . Producción de animales . no humanos transgénicos que generan anticuerpos ¦ monoclónales humanos anti-células dendriticas En otro aspecto, la invención ofrece animales no humanos transgénicos, por .ejemplo, ratones transgénicos que pueden expresar anticuerpos monoclonales humanos que se unen específicamente a células dendriticas, preferentemente con alta afinidad. En una modalidad preferida, los animales no humanos transgénicos, por ejemplo, los ratones transgénicos (ratones HuMab) , tienen un genoma que comprende un transgen de cadena pesada de ser humano y un transgen de cadena ligera. En una modalidad,- los animales no humanos transgénicos, por ejemplo, los ratones transgénicos, han sido inmunizados con una preparación purificada o enriquecida de células dendriticas y/o un lisado de células dendriticas. Preferentemente, los animales no humanos transgénicos, por ejemplo, los ratones transgénicos, pueden producir múltiples isotipos de anticuerpos monoclonales humanos para células dendriticas ¦ (por ejemplo, IgG, IgA y/o IgE) mediante el hecho de ser sometidos a recombinación V-D-J y cambio de isotipo.
El cambio de isotipo puede ocurrir, por ejemplo, por cambio de isotipo clásico o no clásico. El diseño de un animal no humano no transgénico que responda a estimulación por antigenos foráneos con un repertorio de anticuerpos heterólogos requiere que los transgenes de inmunoglobulina ~ heterólogos contenidos en el - animal transgénico funcionen correctamente en la vía de desarrollo de células B. En una modalidad preferida, una función correcta de un transgen de cadena pesada heterólogo incluye cambio de isotipo. Por consiguiente, los transgenes de la invención están construidos para producir cambio de isotipo y uno o varios de los siguientes: (1) expresión específica para' tipo celular y de alto nivel, (2) reacomodo de gen funcional, (3) activación y respuesta 'a expresión alélica (4) expresión de un repertorio primario suficiente,' (5) transducción de señales, (6) hipermutación somática, y (7) dominación del locus de anticuerpo de transgen durante la respuesta inmune. No todos los criterios anteriores deben cumplirse, por ejemplo, en las modalidades en las cuales los loci de inmunoglobulina endógena del animal transgénico están funcionalmente desorganizados, el transgen no tiene que' activar la exclusión alélica. Además, en las modalidades en las cuales el transgen comprende un gen de inmunoglobulina de cadena pesada' y/o de cadena ligera funcionalmente reacomodado, el segundo criterio de reacomodo de gen funcional no es necesario, por lo menos para el transgen ya reacomodado . Para antecedentes de la inmunología molecular, véase, por .ejemplo, Fundamental Immunology [Inmunología Fundamental], segunda edición (1989) Paul William E-. , ed. Raven Press, N.Y., que se incorpora aquí por referencia. En ciertas modalidades, los animales no humanos transgénicos utilizados para generar los anticuerpos monoclonales humanos de la invención contienen transgenes de cadena pesada y de cadena ligera de inmunoglobulina heteróloga reacomodados, no reacomodados o una combinación de reacomodados y no reacomodados en la línea germinal del animal transgénico. Cada uno de los transgenes de cadena pesada comprende por lo menos un gen CH- Además, el transgen de cadena pesada puede contener secuencias de cambio de isotipo funcionales que pueden soportar el cambio de isotipo de un transgen heterólogo que codifica múltiples genes CH en las células B del animal transgénico. Tales secuencias de cambio pueden ser las secuencias que ocurren naturalmente en el locus de inmunoglobulina de línea germinal a partir de la especie que sirve como la fuente de los genes CH de transgen, o bien tales secuencias de cambio pueden ser derivadas de las secuencias que ocurren en la especie que debe recibir el constructo de transgen (el animal transgénico) . Por ejemplo, un constructo de transgen de ser humano que es utilizado para producir un ratón transgénico puede producir una frecuencia más alta de eventos de cambio de isotipo e incorpora secuencias de cambios similares a las secuencias que ocurren naturalmente en el locus de cadena pesada de ratón, puesto que probablemente las secuencias de cambio de ratón son optimizadas ' para funcionar cón el sistema de enzima recombinasa de cambio de ratón, mientras que las secuencias de cambio de ser humano no lo son. Secuencias de cambio pueden ser aisladas y clonadas por métodos de clonación convencionales o bien pueden ser sintetizadas de novo a partir de oligonucleótidos sintéticos que se empalman diseñados con base en la información de secuencia publicada con relación a secuencias ¦ de región de cambio de inmunoglobulina (Mills y colaboradores, Nucí. Acids . Res. 15:7305-7316 (1991); Sideras y colaboradores, Intl. Immunol . 1:631-642 (19.89), que se incorporan aqui por referencia) . Para cada uno de los animales t'ransgénicos antes mencionados, transgenes de inmunoglobulina de cadena pesada y de cadena ligera heterólogos reacomodádos funcionalmente se encuentran en una fracción significativa de las células B del animal transgénico (por lo menos 10 por ciento) . Los 'transgenes utilizados para generar los animales transgénicos de la invención incluyen un transgen de cadena pesada que comprende ADN que codifica por lo menos un segmento de gen variable, un segmento de gen de diversidad, o bien un segmento de gen de enlace y por lo menos un segmento de gen de región constante. El transgen de cadena ligera de inmunoglobulina comprende ADN que . codifica por lo menos un segmento de gen variable, un segmento de gen de unión y por lo menos un segmento de gen de región constante. Los segmentos de gen que codifican los segmentos de gen de cadena ligera y de cadena pesada son heterólogos para el animal no humano transgénico en la medida en que se derivan de ADN que codifica segmentos de gen de cadena pesada y de cadena ligera de inmunoglobulina o corresponden- a ADN que codifica segmentos de gen de cadena pesada y de cadena ligera de inmunoglobulina de una especie que no consiste del animal no humano transgénico. En un aspecto de la invención, el transgen se construye de tal manera que los segmentos de gen individuales no estén reacomodados , es decir, no estén reacomodados para codificar una cadena ligera o pesada de inmunoglobulina funcional. Tales transgenes no reacomodados soportan la recombinación de los segmentos de gen V, D y J (reacomodo funcional) y soportan preferentemente la incorporación de la totalidad o una parte de un segmento de gen de región D en la cadena pesada de inmunoglobulina reacomodada resultante dentro del animal no humano transgénico cuando están expuestos a células dendriticas. En una modalidad alterna, los transgenes comprenden un "minilocus" no reacomodado. Tales - transgenes comprenden típicamente una porción sustancial de los segmentos C, D y J asi como un subgrupo de los segmentos de gen V. En tales constructos de transgen, las varias secuencias reguladoras, por ejemplo, promotores, realzadores, regiones de cambio de clase, secuencias donadoras de empalme y aceptadoras de empalme para procesamiento de ARN, señales recombinantes y similares, comprenden secuencias correspondientes derivadas del ADN heterólogo. Tales secuencias reguladoras pueden estar incorporadas en el transgen de la misma especie o de una especie relacionada del animal no humano utilizado en la invención. Por ejemplo, segmentos de gen de inmunoglobulina de ser humano pueden combinarse en un transgen con una secuencia realzadora de inmunoglobulina de roedor para su uso en un ratón transgénico. Alternativamente, secuencias' reguladoras sintéticas pueden estar incorporadas en el transgen, en donde dichas secuencias reguladoras sintéticas no son homologas con una secuencia de ADN funcional de la cual se sabe que ocurre naturalmente en los genomas de mamíferos. Secuencias reguladoras sintéticas son diseñadas de conformidad con las reglas de consenso, por ejemplo, las que especifican las secuencias permisibles de un sitio aceptador de empalmes o un motivo de promotor/realzador. Por ejemplo, un minilocus comprende una porción de locus de inmunoglobulina genómica que tiene por lo menos una deleción interna (es decir, no una terminal de la porción) de una porción de ADN no esencial (por ejemplo, secuencia de intervención; intron o porción del mismo) en comparación con el locus de Ig de linea germinal que ocurre naturalmente. En una modalidad preferida de la invención, el animal transgénico utilizado para generar anticuerpos humanos para células dendriticas contiene por lo menos una, típicamente 2-10, y a veces 25-50 o más copias del transgen descrito en el ejemplo 12 del documento WO 98/24884 (por ejemplo, pHCl ó pHC2) usado con un animal que contiene una sola copia de un transgen de cadena ligera descrito en- los ejemplos 5,6,8 ó 14 del documento WO 98/24884, y las crías cruzadas con el animal que presenta una deleción de JH en el ejemplo 10 del documento WO 98/24884, cuyos contenidos se . incorporan expresamente por referencia. Los animales son cruzados hasta homocigosidad para cada" uno de estos tres rasgos. .Tales animales tienen el genotipo' siguiente: una sola copia (por grupo aploide de cromosomas) de un minilocus no reacomodado de cadena pesada de ser humano (descrito en el ejemplo 12 de WO 98/24884), una sola- copia (por grupo .aploide cromosomas) de constructo de cadena ligera K de ser humano reacomodado (descrito en el ejemplo 14 de WO 98/24884 ) , y una deleción en cada locus de cadena pesada, de ratón- endógeno que remueve la totalidad de los segmentos de JH funcionales (descrito ,en el ejemplo 10 de WO 98/24884). Tales animales son criados con ratones- homocigóticos para la ' deleción de los segmentos JH (ejemplos 10 de WO 98/24884) para producir crías que son homocigóticas paira la deleción de JH y homocigóticos para los constructos de cadena ligera y pesada de ser humano. Los animales resultantes reciben inyecciones de anticuerpos y se utilizan para la producción de anticuerpos monoclonales humanos contra estos antigenos. Células B aisladas de un animal de este tipo son monoespecificas con relación a las cadenas ' pesadas y ligeras se ser humano puesto que contienen solamente una copia de cada gen. Además, serán monoespecificos con relación a cadenas pesadas de ser humano o de ratón puesto que ambas copias de gen de cadena pesada de ratón endógenas no son funcionales en virtud de la deleción que abarca la región JH introducido de conformidad con lo descrito en el ejemplo 9 y en el ejemplo 12 del documento WO 98/24884. Además, una fracción sustancial de las células B será monoespecífica con relación a las cadenas ligeras de ser humano o de ratón debido a la expresión de la copia única del gen de cadena ligera kappa de ser humano reacomodado que excluye alélica e iso ípicamente el reacomodo de los genes de cadena kappa y lambda de ratón endógenos en una fracción significativa de células B. - - . El ratón transgénico de la modalidad preferida presentará una producción de inmunoglobulina con un repertorio significativo,' idealmente sustancialmente similar a lo observado en el caso de un ratón nativo. Así, por ejemplo, en modalidades en donde los genes de Ig endógenos han sido desactivados, los niveles totales de inmunoglobulina estarán dentro de un rango de aproximadamente 0.1 a 10 mg/ml de suero, preferentemente de 0.5 a 5 mg/ml, idealmente por lo menos aproximadamente 1.0 mg/ml. Cuando un transgen capaz de efectuar un cambio a IgG a partir de IgM ha sido introducido en el ratón transgénico, la proporción en ratón adulto entre IgG sérica y IgM sérica es preferentemente de aproximadamente 10:1. La proporción entre IgG y IgM será mucho menor en el caso del ratón inmaduro. En general, más que aproximadamente el 10%, preferentemente de 40 a 80% de las células B de bazo y nodo linfático expresan exclusivamente proteina IgG humana. El repertorio se acercará idealmente a lo observado en un ratón no transgénico, habitualmente por lo menos aproximadamente 10% tan alto, preferentemente 25 a 50% o más. En general, por lo menos aproximadamente mil inmunoglobulinas diferentes (idealmente IgG), preferentemente lO4 a 10b o más, serán producidas, según primariamente el número de regiones V, J y D diferentes introducidos en el genoma de ratón. Estas inmunoglobulinas reconocerán típicamente aproximadamente la mitad o más de proteínas altamente antigénicas, por ejemplo, proteínas de células dendríticas. Típicamente, las inmunoglobulinas presentarán una afinidad por antígenos pre-seleccionados de por lo menos aproximadamente 10'M-1, preferentemente por lo menos aproximadamente 10°M_1, con mayor preferencia por lo menos aproximadamente ÍO^M"1, 10nK'L, 1012M" ', o más, por ejemplo, hasta 1013M"L o más. En algunas modalidades, puede ser preferible generar ratones con repertorios predeterminados para limitar la selección de genes V representados en la respuesta de anticuerpo a un tipo de antigeno predeterminado. Un transgen de cadena pesada que tiene un repertorio predeterminado puede comprender, por ejemplo, genes VH de ser humano que se utilizan preferentemente en respuestas de anticuerpo al tipo de antigeno predeterminado en seres humanos. Alternativamente, algunos genes de VH pueden ser excluidos de un repertorio definido por varias razones, por ejemplo, tienen una baja probabilidad de' codificar regiones V de alta afinidad para el antigeno predeterminado; tienen una baja propensión a someterse a mutación somática y a afinamiento por afinidad; "o bien son inmunogénicos para cierto.s seres humanos) . Asi, antes del reacomodo de un transgen que contiene varios segmentos de gen de cadena pesada o de cadena ligera, tales segmentos de gen pueden ser fácilmente identificados, por ejemplo, por hibridación o secuenciamiento de ADN como siendo parte de una especie de organismo otro que el' animal transgénico. - - Los ratones transgénicos de la presente invención pueden ser inmunizados con una preparación purificada o enriquecida de células dendriticas y/o lisado de células dendriticas de conformidad con lo descrito previamente. Los ratones producirán células B que son sometidas a cambio de clase a través de recombinación de cambio intra-transgen (cambio cis) y expresan inmunoglobulinas que reaccionan con células dendriticas. Las inmunoglobulinas pueden ser anticuerpos de secuencias de ser humano, en donde los polipéptidos de cadena pesada y de cadena ligera están codificados por secuencias de transgen de ser humano, que pueden incluir secuencias derivadas por mutación somática y unión recombinatoria de región V asi como secuencias codificadas por linea germinal; estas inmunoglobulinas de secuencias humanas pueden ser referidas como siendo sustancialmente idénticas a una secuencia de polipéptido codificada por un segmento de gen VL ó VH . de ser humano y JL ó segmento de Jt, de ser humano, aún cuando otras "secuencias no de linea germinal pueden estar presentes como resultado de una mutación somática y uniones de recombinación V-J y V-D-J diferenciales. Con relación a tales anticuerpos de secuencias humanas, las regiones variables de cada cadena son típicamente codificadas por segmentos de gen V, J de línea germinal de ser humano y en el caso de cadenas pesadas, D; frecuentemente por lo menos el 85% de las regiones variables esta codificado por secuencias de línea germinal de ser humano presentes en el transgen; f ecuentemente 90 ó 95 por ciento o más de las secuencias de región variable esta . codificado por secuencias de línea germinal de ser humano presentes en un transgen. Sin embargo, puesto que secuencias no de linea germinales están introducidas por mutación somática . y unión VJ y VDJ, los anticuerpos de secuencia de ser humano tendrán frecuentemente algunas secuencias de región variable (y menos frecuentemente secuencias de región constante) que no son codificadas por segmentos de gen V, D ó J de ser humano como se encuentra en el (los) transgen (es) de ser humano en la linea germinal de los ratones. Típicamente/ tales secuencias no de linea germinal (o bien posiciones de nucleótidos individuales) se agruparan en o cerca de CDRs, o bien en regiones en las cuales se sabe que se agrupan las mutaciones somáticas. Los anticuerpos de secuencias de ser humano se unen con el antigeno predeterminado pueden resultar de cambio de isotipo de tal manera que los anticuerpos humanos que comprenden una cadena ? de secuencia de ser humano (por ejemplo, ??, y2a, ?2?, ó ?3) y una cadena ligera de secuencia de ser humano (por ejemplo, . K) se produzcan. Tales anticuerpos de secuencias de ser humano con cambio de isotipo contienen frecuentemente una o varias mutaciones somáticas, típicamente en la región variable y frecuentemente en o dentro de aproximadamente 10 residuos · de una CDR) como resultado de maduración por afinidad y selección de células B por antígeno, particularmente después de un reto con antígeno secundario (o subsecuente) . Estos anticuerpos de secuencia de ser humano de alta afinidad pueden tener afinidades de enlace de por lo menos 1 x 10 NT1, típicamente por lo menos 5 x 109 M"1, frecuentemente más que 1 x 1010 M-1, y a veces 5 x 1010 M_i a 1 x 1011 M"1 o más. Otro aspecto de la invención se refiere a las células B, por ejemplo, células de ratones que pueden utilizarse para generar hibridomas que expresan anticuerpos monoclonales humanos que se unen con alta afinidad (por ejemplo, más que 2 x 109 M"1) con células dendríticas. Así, en otra modalidad de la invención, estos hibridomas se utilizan para generar una composición que comprende una inmunoglobulina que tiene una constante de afinidad (Ka) de por lo menos 2 x 1QJ' M-1 en cuanto a enlace con células dendríticas, en donde dicha inmunoglobulina comprende:' una cadena ligera de secuencia de ser humano que consiste de (1) una región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de polipéptidos sustancialmente idéntica a una secuencia de polipéptidos codificada por un segmento de gen de V-' de ser humano y un segmento JL de ser humano, y (2) una región constante de cadena ligera que tiene una secuencia de polipéptidos sustancialmente ¦ idéntica a una secuencia de polipéptidos codificada por un segmento de gen de CL de ser humano ; y una cadena pesada de secuencia de ser humano que consiste de (1) una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de polipéptidos sustancialmente idéntica a una secuencia de polipéptidos codificada por un segmento de gen VH de ser humano, opcionalmente una región D, y un segmento JH de ser humano, y (2) una región constante que tiene una secuencia de polipéptidos sustancialmente idéntica a una secuencia de polipéptidos codificada por un segmento de gen CH de ser humano. El desarrollo de anticuerpos monoclonales humanos de alta afinidad contra células dendriticas es facilitada por un método para expandir el repertorio de segmentos de gen de región variable de ser humano en un ratón transgénico que tiene un genoma que comprende un transgen de inmunoglobulina de ser humano integrado, dicho método comprende la introducción en el genoma de un transgen de gen V que comprende segmentos de gen de región V no presentes en dicho transgen de inmunoglobulina de ser humano integrado. Frecuentemente, el transgen de región V es un cromosoma artificial de levadura que comprende una porción de un conjunto de segmentos de gen de VH ó VL (VK) de ser humano, como pueden ocurrir naturalmente en un genoma humano o como pueden empalmarse juntos separadamente por métodos recombinantes , que pueden incluir segmentos de gen V fuera de orden u omitidos. Frecuentemente, por lo menos cinco o más segmentos de gen V funcionales están contenidos en YAC. En esta variación, es posible elaborar un ratón transgénico producido por el método de expansión de repertorio de V, en donde el ratón expresa una cadena de inmunoglobulina que comprende una secuencia de región variable codificada por un segmento de gen de región V presente en el transgen de región y una región C codificada en el transgen Ig de ser humano. Por medio de métodos de expansión de repertorio V, ratones transgénicos que tienen por lo menos 5 genes V distintos pueden ser generados, asi como ratones que contienen por lo menos aproximadamente 24 genes V o más. Algunos segmentos de gen V pueden ser no funcionales (por ejemplo, pseudogenes y similares) ; estos segmentos pueden ser conservados o bien pueden ser borrados selectivamente por métodos recombinantes disponibles a la persona con conocimiento en la materia, si se deseá. Una vez que la linea germinal de ratón ha sido manipulada para que contenga un YAC funcional que tiene un repertorio de segmento V expandido, sustancialmente no presente en el transgen de Ig de ser humano que contiene los segmentos de gen J y C, el rasgo puede ser propagado y cruzado en otros fondos genéticos, incluyendo fondos en los cuales el YAC funcional que tiene un repertorio de segmento V expandido es cruzado en una linea germinal de ratón que tiené un transgen de Ig de ser humano diferente. Múltiples YACs funcionales que tienen un repertorio de segmentó V expandidos pueden ser cruzados en una linea germinal para funcionar con un transgen de Ig de ser humano (o bien múltiples transgenes de. Ig de ser humano). Aún cuando . nos referimos aquí a transgenes de YAC, dichos transgenes cuando están integrados en el genoma pueden no tener sustancialmente secuencias de levadura, tales como secuencias requeridas para replicación autónoma en levadura; tales secuencias pueden opcionalmente ser removidas por manipulación genética (por ejemplo, digestión de restricción y electroforesis en gel de campo pulsado u otro método adecuado) después que la replicación en levadura ya no es necesaria (es decir, antes de la introducción en una célula de ES de ratón o procigoto de . ratón) . Métodos para propagar el rasgo de le expresión de in unoglobulina de secuencia humana incluyen- cruzar un ratón transgénico que tiene el (los) transgen(es) de Ig de ser humano y opcionalmente también que tienen un YAC funcional con un repertorio de segmentos V ampliado. Tanto segmentos de gen de VH como VL pueden estar presentes en YAC. El ratón transgénico puede ser cruzado en cualquier fondo deseado por una persona con conocimientos en la materia incluyendo fondos que tienen otros transgenes, " incluyendo transgenes de Ig de ser humano y/o transgenes que codifican otras proteínas de linfocitos de ser humano. La invención ofrece también una inmunoglobulina de secuencia humana de alta afinidad producida por un ratón transgénico que tiene un transgen de YAC de repertorio de región V expandido. Aún cuando lo anterior describe una modalidad preferida del animal transgénico de la invención, otras modalidades se contemplan las cuales han sido clasificadas en cuanto a categorías: I. . Animales transgénicos que contienen transgenes de inmunoglobulina de cadena pesada no reacomodados y de cadena ligera reacomodado; II. Animales transgénicos que contienen transgenes de inmunoglobulina de cadena, pesada reacomodados y de cadena ligera no reacomodados; III. Animales transgénicos que contienen transgenes de inmunoglobulina de cadena pesada reacomodados y de cadena ligera no reacomodados; y IV. Animales transgénicos que contienen transgenes de' inmunoglobulina de cadena pesada ¦ reacomodados y de cadena" ligera reacomodados. Entre estas categorías de animales transgénicos, el orden de preferencia preferido es el siguiente II > I > III > IV cuando los genes de cadena ligera endógenos (o bien por lo menos el gen K) han sido noqueados por recombin'ación homologa (u otro método) y I > II > III > IV cuando los genes de cadena ligera endógenos no han sido noqueados y deben ser dominados- por la exclusión alélica. III. Moléculas' bi-especificas/multi-especificas que se unen a células dendriticas En ótra modalidad de la invención, los anticuerpos monoclonales humanos, para células dendríticas o porción de enlace con antígeno de los mismos pueden ser derivados o enlazados a otra molécula funcional, por ejemplo, otro péptido, proteina u otro agente de enlace (por ejemplo, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo u otro ligando) para generar una molécula - bi-especifica o multi-específica que se une tanto 'a células dendríticas como a uno o varios otros sitios de enlace o epítopos blanco. Por ejemplo, los anticuerpos humanos de la presente invención o fragmentos de los mismos pueden estar funcionalmente enlazados (por ejemplo, por acoplamiento químico, fusión genética, asociación no . covalente o de otra manera) a uno o varios otros anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, péptidos (por ejemplo, ligando, por ejemplo, ligando tumoral) o miméticos de enlace que se unen a un patógeno o a una célula otra que una célula dendrítica, por ejemplo, una célula tumoral, de tal manera que el patógeno o célula sea enfocado a las células dendríticas. Por consiguiente, la presente invención incluye moléculas bi-específicas y multi-específicas que comprenden por lo menos una primera especificidad de enlace para células dendríticas y una segunda especificidad de enlace para un segundo epítopo blanco . En una modalidad preferida de la invención, el segundo epítopo ' blanco es un antígeno en una célula blanco, por ejemplo, un antígeno de célula tumoral, un antígeno es' microbiano, un antigeno viral o un autoantigeno . Estas moléculas bi-especificas y multi-especificas enfocan células dendriticas . hacia células blanco de tal manera que las células dendriticas pueden modular - una respuesta inmune contra dicha célula blanco o antigeno de célula blanco. En otra modalidad de la invención, el segundo epitopo blanco es un receptor Fe, por ejemplo,' FcyRI de ser. humano (CD64) o bien un receptor Fea de ser humano (CD89). Por consiguiente, la" invención incluye moléculas bi-especificas y multi-específicas capaces de unirse tanto con células efectoras que expresan FcyR, Fc R ó FcsR (por ejemplo, monocitos, macrófagos o células polimorfonucleares (PM s)), y con células dendriticas. Estas moléculas bi-especificas y multi-específicas enfocan células dendriticas hacia células efectoras y, como los anticuerpos monoclonales humanos de la invención, pueden activar actividades de células efectoras mediadas por receptor Fe, tales como fagocitosis de células dendriticas, citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC) , liberación de citocinas, o generación de anión superóxido. Moléculas bi-especificas y multi-especificas de la invención pueden incluir además una tercera especificidad de enlace, además de una especificidad de enlace anti-Fc o un antigeno anti-células blanco y una especificidad, de enlace anti-células dendriticas. En una modalidad, la tercera especificidad de enlace es una porción anti-factor de incremento (EF) , por ejemplo, una molécula que se une a una proteína de ' superficie involucrada en una actividad citotóxica e incrementa' por consiguiente la respuesta inmune contra la célula blanco. La "porción anti-factor de incremento" puede ser un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo funcional o un ligando que se une con una molécula dada, por ejemplo, un antígeno o un receptor, y por consiguiente resulta en un incremento del efecto de los determinantes de- enlace para el receptor Fc, antígeno de célula blanco o célula dendrítica. La "porción anti-factor de incremento" puede unirse a un receptor Fc, antígeno de célula blanco o bien célula dendrítica. Alternativamente la porción de anti-factor de incremento puede unirse a una entidad diferente de la entidad a la cual se unen la primera y segunda especificidades de enlace. Por ejemplo, la porción anti-factor de incremento puede unirse a una célula T citotóxica (por ejemplo, a través de CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, ICAM-1) o bien otra célula inmune que resulta en una respuesta inmune incrementada contra la célula blanco. En "una modalidad, las moléculas bi-específicas y multi-específicas de la invención comprenden como especificidad de enlace por lo menos un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo del mismo, que incluye, por ejemplo, un Fab, Fab", F(ab')_-/ Fv o un Fv de cadena simple. El anticuerpo puede también ser un dímero de cadena ligera o de cadena pesada o bien cualquier fragmento mínimo del mismo, por ejemplo, un Fv o un constructo de cadena simple de conformidad con lo descrito en Ladner y colaboradores, Patente Norteamericana No. 4,946,778, expedida el día 7 de Agosto de 1990, cuyos contenidos se incorporan expresamente por referencia. En otra modalidad, moléculas bi-especificas y multi-específicas de la invención comprenden una especificidad de enlace para un antígeno en una célula blanco, por ejemplo, un antígeno de célula tumoral, un antígeno microbiano, un antígeno viral o un autoantígeno, y una segunda especificidad de enlace para células dendriticas. En otra modalidad, moléculas bi-éspecíficas y multi-específicas de la presente - invención comprenden una especificidad de enlace para un Fc R, o un FcyR presentes en la superficie de una célula efectora y una segunda especificidad de enlace para células dendríticas. La especificidad de enlace para un receptor Fe puede proporcionarse, por ejemplo, por otro anticuerpo monoclonal, por ejemplo, otro anticuerpo humano. Por ejemplo, el anticuerpo puede unirse a un receptor ' Fcy, preferentemente en un sitio no bloqueado por inmunoglobulina G (IgG) de ser humano. Como se utiliza aquí, el término "receptor para IgG" se refiere a cualquiera de los ocho genes de cadena ? localizados en el cromosoma 1. Estos genes codifican un total de 12 isoformas de receptores solubles o transmembrana agrupadas en cuatro clases de receptor Fcy: FcyRI (CD64), Fcy RIKCD32), y FcyRIII (CD16) . En una modalidad preferida, el receptor Fcy tiene una alta afinidad humana por FcyRI . El FcyRI de ser humano es una molécula de- 72 kDa que muestra alta afinidad para IgG monomérica (108 - 109 M"1) . La producción y caracterización de dichos anticuerpos monoclonales anti- FcyR son descritos por Fanger y colaboradores en la solicitud PCT O 88/00052 y en la Patente Norteamericana No. 4,954,617, cuyas enseñanzas se incorporan aqui totalmente por referencia. Estos anticuerpos se unen a un epitopo de FcyRI, FcyRII, ó FcyRIII a un sitio distinto del sitio de enlace de Fcy del receptor y, por consiguiente, su enlace no es sustancialmente bloqueado por niveles fisiológicos .de IgG. Anticuerpos anti- FcyRI específicos útiles en esta invención son mAb 22, inAb 32, mAb 44, mAb 62 y mAb 197. El hibridoma que produce mAb 32 esta disponible en la American Type Culture Collection, ATCC Número de acceso HB9469. Fragmentos F-(ab')2 de mAb 22 a anti- FcyRI mAb 22 pueden obtenerse en Medarex, Inc. (Annandale, N.J.). En otras modalidades, el anticuerpo anti-receptor Fcy es una forma humanizada -de anticuerpo monoclonal 22 (H22) . La producción y caracterización de anticuerpo H22 se describen en Graziano, R.F. y colaboradores (1995) . J. Immunol 155 (10)): 4996-5002 y PCT/US93/10384. La línea de células que 'producen anticuerpos H22 fue depositada en la American Type Culture Collection el 4 de Noviembre de 1992 bajo la designación HA022CL1 y tiene un número de acceso CRL 11177. En otra modalidad particular, la especificidad de enlace para un receptor Fe se proporciona a través de un antigeno que se une a un receptor para IgA de ser humano, por ejemplo, un receptor Fea (CD89)). El término- "receptor · ara IgA" incluye el producto génico de un a-gen (FcaRI) localizado en el cromosoma 19. Se sabe que este gen codifica varias isoformas de transmembrana alternativamente empalmadas de 55 a 110 kDa. FcaRI (CD89) es expresado constitutivamente en monocitos/macrófagos, granulocitos · eosinofilicos y neutrofilicos , pero no en poblaciones de células no efectoras. FcaRI tiene una afinidad media (« 5 x 107 M"1) tanto para IgAl como parea IgA2, que se incrementa al estar expuesto a citocinas tales como G-CSF ó GM-CSF (Morton, H.C. y colaboradores (1996) Critical Reviews in Immunology [Reseñas Criticas en Inmunología] .16:423-440). Cuatro anticuerpos monoclonales específicos para FcaRI, identificados como A3, A59, A62 y A77, que se unen con FcaRI fuera del dominio - de enlace con ligando de IgA,, han sido descritos, (Monteiro, " R. C. y colaboradores, 1992, J. Immunol. 148:1764). FcaRI y FcyRI son receptores . de activadores preferidos para su uso en la invención puesto que (1)· son expresados primariamente en células efectoras inmunes, por ejemplo, monocitos, PMNs, macrófagos y células dendríticas; (2) son expresados en niveles elevados (por . ejemplo, 5,000-100,000 por célula); (3) son mediadores de actividades citotóxicas (por ejemplo, ADCC; fagocitosis); (4) median una presentación incrementada de antígenos incluyendo autoantígenos enfocados hacia ellos. En todas las modalidades, moléculas bi-específicas y multi-específicas. de la presente invención comprenden por lo menos una especificidad de enlace que reconoce, por ejemplo, enlace con células dendríticas. Un "anticuerpo específico para célula efectora" como se emplea aquí se - refiere a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo funcional que se une con el receptor Fe de las células efectoras. Los anticuerpos preferidos para su uso en la presente invención se unen con el receptor Fe de células efectoras en un sitio que no esta unido por inmunoglobulina endógena. Como se emplea aquí, el término "célula efectora" se refiere a una célula inmune que participa en la fase efectora de una respuesta inmune, a diferencia de las fases de reconocimiento y de activación de una respuesta inmune. Ejemplos de células inmunes incluyen una célula · de origen mieloide o linfoide, por ejemplo, linfocitos (por ejemplo, células B y células T que incluyen células B citoliticas (CTLs)), células asesinas, células asesinas naturales, macrófagos r monocitos, eosinófilos, neutrófilos, células polimorfonucleares, granulocitos, mastocitosr y basófilos. Algunas células efectoras expresan receptores Fe específicos y llevan a cabo funciones inmunes específicas. En modalidades preferidas, una célula efectora puede inducir una citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC), por ejemplo, un neutrófilo capaz de inducir ADCC. Por ejemplo, monocitos, macrófagos, que expresan FcR participan en la muerte específica de células blanco y la presentación de antxgenos a otros componentes del sistema inmune, o bien unión con células que presentan antxgenos. En. otras modalidades, una célula efectora puede someter un antígeno blanco, células blanco o microorganismo a fagocitosis. La expresión de un FcR particular en una célula efectora puede ser regulada por factores humorales tales como citocinas. Por ejemplo, la expresión de FcyRI es regulada de manera ascendente por interferon-? (IFN-?) . Esta expresión incrementada mejora la actividad citotóxica de células que llevan FcyRI contra blancos. Una célula efectora puede someter un antígeno blanco o una célula blanco a fagocitosis o lisis. La expresión "célula blanco" se refiere a cualquier célula indeseable en un sujeto (por ejemplo, un se humano o un animal) que puede ser enfocada por una composición (por ' ejemplo, un anticuerpo monoclonal humano, una molécula bi-especifica o multi-especifica ) de la invención. En una modalidad, la célula blanco es una célula dendritica. En otras modalidades, una célula blanco incluye una célula tumoral, un patógeno microbiano, un virus, o una célula infectada por virus. Mientras se prefieren anticuerpos monoclonales humanos, otros anticuerpos que pueden emplearse en las moléculas bi-especificas o multi-especificas de la invención son anticuerpos monoclonales humanizados, quiméricos y de murino . Anticuerpos monoclonales ratón-humano quiméricos (es decir, anticuerpos . quiméricos) pueden producirse a través de técnicas de ADN recombinante conocidas. Por ejemplo, un gen que codifica la región' constante Fe de una molécula de anticuerpo monoclonal de murino (o de otra especie) es digerido con enzimas de restricción para remover la región codificadora de Fe de murino, y se sustituye la porción equivalente de un gen que codifica una región constante Fe de ser humano. Véase Robinson y colaboradores, Publicación de Patente Internacional PCT/US86/02269; Akira. y colaboradores Solicitud de Patente Europea 184,187; Taniguchi, . , Solicitud de Patente Europea 171,496; Morrison y colaboradores, Solicitud de Patente Europea 173,494; Neuberger y colaboradores, Solicitud de Patente Internacional O 86/01533; Cabilly y colaboradores, Patente Norteamericana No. 4,816,567; Cabilly y colaboradores Solicitud de Patente Europea 125,023; Better y colaboradores (1988 Science 240:1041-1043); Liu y colaboradores, (1987) PNAS 84:3439-3443; Liu y colaboradores, 1987, J. Immunol . 139:3521-3526; Sun y colaboradores (1987) PNAS 84:214-218; Nishimura y colaboradores 1987, Canc. Res. 47:999-1005; Wood y colaboradores (1985)^ Nature 314:446-449; y Shaw y colaboradores, 1988, J. Nati. Cáncer Inst. 80:1553-1559). El anticuerpo quimérico puede ser humanizado adicionalmente mediante el hecho de reemplazar secuencias de la región variable Fv que no participan directamente en enlace con antigeno con secuencias equivalentes de regiones variables Fv de ser humano. Reseñas generales de anticuerpos quiméricos humanizados son proporcionados por Morrison, S.L'. 1985, Science 229:1202-1207 y por Oi y colaboradores, 1986, BioTechniques ' 4:214. Estos métodos incluyen el hecho de aislar, manipular y expresar las secuencias de ácido nucleico que codifican la totalidad o una parte de regiones variables Fv de inmunoglobulina de por lo menos una de una cadena pesada o cadena ligera. Fuentes de tales ácidos nucleicos son bien conocidas por parte de las personas con conocimientos en la materia, y se pueden obtener, por ejemplo, a partir de 7E3, un hibridoma que produce anticuerpo anti-GPIIbUIj . El ADN recombinante que codifica el anticuerpo quimérico, o un fragmento del mismo, puede ser clonado en un vector de expresión' apropiado. Anticuerpos humanizados adecuados pueden ser producidos alternativamente por sustitución de CDR, Patente Norteamericana No. 5,225,539; Jones y colaboradores, 1986 Nature 321:552-525; Verhoeyan y colaboradores, 1988 Science 239:1534; y Beidler y colaboradores, 1988 J. Immunol . 141:4053-4060. Todas las CDRs de un anticuerpo humano particular pueden ser reemplazadas con por lo menos una porción de una CDR no humana o bien solamente algunas, de las CDRs pueden ser reemplazadas con CDRs no humanas. ' Es solamente necesario reemplazar el número de CDRs que se requiere para enlace del anticuerpo humanizado al receptor Fe. Un anticuerpo puede ser humanizado por cualquier método que puede reemplazar por lo menos una parte de una CDR de un anticuerpo humano con una .CDR derivada de un anticuerpo no humano. Winter describe un método que puede ser utilizado para preparar los anticuerpos humanizados de la presente invención (Solicitud de Patente del Reino Unido GB 2188638A, presentada el dia 26 de Marzo de 1987), cuyos contenidos se incorporan expresamente por referencia. Las CDRs de ser humano pueden ser reemplazadas por CDRs no humanas utilizando mutagénesis dirigidas por sitio de oligonucleótidos de conformidad con lo descrito .en la Solicitud Internacional WO 94/10332 titulada, Humanized Antibodies to Fe Receptors for Immunoglobulín G on Human Mononuclear Phagocytes. Asi mismo dentro del alcance de la presente invención se encuentran anticuerpos quiméricos y humanizados en los cuales aminoácidos específicos han sido ¦ sustituidos, borrados o agregados. En particular, los anticuerpos- humanizados preferidos tienen sustituciones de aminoácidos en la región de estructura para mejorar el enlace con el antigeno. Por ejemplo, en un anticuerpo humanizado que tiene CDRs de ratón, aminoácidos localizados en la región de estructura de ser humano pueden ser reemplazados por los aminoácidos localizados en las posiciones correspondientes en el anticuerpo de ratón. Tales sustituciones son conocidas por mejorar el enlace de anticuerpos humanizados con el antigeno en algunos casos. Anticuerpos en los cuales aminoácidos han sido agregados, borrados o sustituidos se conocen aquí como anticuerpos modificados o anticuerpos alterados. El término anticuerpo modificado se contempla también para incluir anticuerpos tales como anticuerpos monoclonales, anticuerpos quiméricos y anticuerpos humanizados que han sido modificados, por ejemplo mediante deleción, adición o sustitución de partes del . anticuerpo. Por ejemplo, un anticuerpo puede ser modificado mediante deleción de la región constante y su reemplazo por una región constante con el propósito de incrementar la vida media, por ejemplo, vida media sérica, ' estabilidad o afinidad del anticuerpo. Cualquier modificación esta dentro del alcance de la presente invención en la medida en que la molécula bi-especifica y multi-especifica tiene por lo menos una región de enlace con antigeno especifica - para un FcR y activo por lo menos una función efectora. Moléculas bi-específicas y multi-específicas de la presente invención pueden elaborarse empleando varias técnicas conocidas incluyendo, sin limitarse a estos ejemplos, técnicas, químicas (véase por ejemplo, D.M. Kranz y colaboradores (1981) Proc. Nati. Acad. Sci . Estados Unidos de América 78:5807), técnicas de "polidoma" (véase, Patente Norteamericana No. 4,474,893, de Reading) y técnicas de ADN recombinante . En particular, moléculas bi-especificas y ' multi-especificas de la presente invención pueden prepararse mediante la combinación de las especificidades de enlaces constituyentes, por ejemplo, la especificidades de enlace anti-FcR y anticélulas dendriticas empleando métodos conocidos en la técnica y descritos en los ejemplos proporcionados aquí. Por ejemplo, cada especificidad de enlace de la molécula bi-especifica y multi-especifica puede ser generada separadamente y después conjugada entre ellas. Cuando las especificidades de enlace son proteínas o péptidos, varios agentes de acoplamiento o reticulación pueden emplearse para conjugación covalente. Ejemplos de agentes de reticulación incluyen proteina A, carbodiimida, N-succinimidil-S-acetil-tioacetato (SATA) , 5 , 5 ' -ditiobis (ácido 2-nitrobenzoico ) (DTNB) , o-fenilendimaleimida (oPDM) , N-succinimidil-3- (2-piridiltio) propionato (SPDP) , y 4-(N-maleiiaidometil) ciclohexan-l-carboxilato de sulfosuccinimidilo (sulfo-SMCC) (véase, por ejemplo, Karpovsky y colaboradores (1984) J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA y colaboradores (1985) Proc. Nati. Acad. Sci. Estados Unidos de .América 82:8-648). Otros métodos incluyen los descritos por Paulus (Behring Ins. Mitt. (1985) No. 78, 118-132); Brennan y colaboradores (Science (1985)229:81-83), Y Glennie y colaboradores (J. Immunol . (1987) 139:2367-2375). Agentes de conjugación preferidos son SATA y sulfo-SMCC, ambos disponibles en Pierce Co. (Rockford, IL) . Cuando las especificidades de enlace son 'anticuerpos (por ejemplo, los anticuerpos humanizados), pueden ser conjugadas con enlaces sulfhidrilo en las regiones de bisagra C-terminales de las dos cadenas pesadas. En una modalidad particularmente preferida, la región de bisagra es modificada de tal manera que contenga un número impar de residuos sulfhidrilo, preferentemente uno antes de la .conjugación . Alternativamente, ambas especificidades de enlace pueden ser codificadas en el mismo vector y expresadas y ensambladas en la misma célula huésped. Este método es especialmente útil cuando la molécula bi-especifica y multi-especifica es una proteina de fusión mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F.(ab')2 ó ligando x Fab. Una molécula bi-específica y multi-especifica de la presente invención, por ejemplo, una molécula bi-especifica puede ser una molécula de cadena simple, por ejemplo, un anticuerpo biespecifico de cadena simple, una molécula bi-especifica de cadena simple que comprende un anticuerpo de cadena simple y u determinante de enlace, o una molécula bi-especifica de cadena simple que comprende dos determinantes de enlace; Moléculas bi-especificas y multi-especificas pueden también ser moléculas de cadena simple o bien pueden comprender por lo menos dos moléculas de cadena simple. Métodos para preparar moléculas bi-especificas y multi-específicas se describen, por ejemplo, en la Patente Norteamericana No. 5,260,203; Patente Norteamericana No.. 5, 455, 030; Patente Norteamericana No.,- 4, 881, 175; Patente' Norteamericana No. 5,132,405; Patente Norteamericana No. 5,091,513; Patente Norteamericana No. 5,476,786; Patente Norteamericana No. 5,013,653; Patente. Norteamericana No. 5,258,498; y Patente Norteamericana No. 5,482,858. En enlace de las moléculas bi-especificas y multi-especificas sobre sus blancos específicos puede ser confirmado por ensayo inmunoabsorbente enlazado a enzima (ELISA) , un radioinmunoensayo (RIA) , análisis FACS, un bioensayo (por ejemplo, inhibición de crecimiento), o bien un ensayo Western Blot. Cada uno de estos ensayos detecta generalmente la presencia de complejos proteína-anticuerpo de interés particular mediante el empleo de un reactivo etiquetado (por ejemplo, un anticuerpo) especifico para el complejo de interés. Por ejemplo, los complejos FcR-anticuerpo pueden ser detectados, utilizando por ejemplo un fragmento de anticuerpo o anticuerpo enlazado a enzima gue . reconoce y se une específicamente a los - complejos anticuerpo-FcR. Alternativamente, los complejos pueden ser detectados empleando cualquier variedad de otros inmunoensayos . Por ejemplo, el anticuerpo puede ser marcado radioactivamente utilizado en un radioinmunoensayo (RIA) (véase, por ejemplo, Weintraub, B, Principies of Radioimmunoassays [Principios de Radioinmunoensayo] , Séptimo Curso de Capacitación en Materia de Técnicas de Ensayo con Radioligandos, The Endocrine Society, Marzo 1986, que se incorpora aquí por referencia). El isótopo radioactivo puede ser detectado por medios tales como el uso de un contador de rayos gamma o un contador de centello o bien mediante autoradiografía. IV. Conjugados de anticuerpo vacuna /inmunotoxinas En otro aspecto, la presente invención ofrece varios conjugados terapéuticos que incluyen uno o varios anticuerpos anti-células dendríticas de ser humano (o fragmentos de los mismos) unidos a un segundo agente. Agentes particulares que pueden estar unidos a los anticuerpos incluyen, sin limitarse a- estos ejemplos, antígeno (formando de esta manera una vacuna) radioisótopos, citotoxinas (formando de esta manera una inmunotoxinas) y otros fármacos. Una citotoxina o agente citotóxico incluye cualquier agente perjudicial para las células (por ejemplo, las mata) . Ejemplos incluyen taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetinar mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorubicina, daunorubicina, dihidroxi antracin diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-des idrotestosterona, glucocorticoides, procaina, tetracaina, lidocaina, propanoiol, y puromicina asi como análogos u homólogos de los mismos. Agentes terapéuticos incluyen, sin limitarse a estos ejemplos, antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tiogúanina, citarabina, 5-fluoroacril decarbazina) , agentes de alquilación (por ejemplo, mecloretamina, tioepa clorambucilo , melfalan, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU) , ciclotosfamida, busulfan, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C, y cisdiclorodiamina palatina (II) (DDP) cisplatina) , antraciclina (por ejemplo, daunorubicina (antes daunomicina) y doxorubicina) , antibióticos (por ejemplo, dactinomicina (antes actinomicina) , bleomicina, mitramicina, y antramicina (AMC) ) , asi como agentes anti-mitóticos (por ejemplo, vincristina y vinblastina) . Un anticuerpo de la presente invención puede también estar conjugado con un radioisótopo, por ejemplo, yodo radioactivo, para generar radiofarmacéuticos citotóxicos para el tratamiento de un padecimiento relacionado ' con células dendriticas, por ejemplo un padecimiento autoinmüne o inflamatorio o bien una enfermedad de injerto versus huésped. Por consiguiente, los conjugados de anticuerpo de la presente invención pueden ser utilizados para modificar una respuesta biológica dada y la porción farmacológica no se limita a los agentes terapéuticos' químicos clásicos. Por ejemplo, la porción farmacológica puede ser una proteina o un polipéptido que posee una actividad biológica- deseada. Tales proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa o fragmentos de la misma, por ejemplo, abrina, ricina, A, exotoxina de pseudomonas, o bien toxina de difteria; una proteína, por ejemplo, factor de necrosis tumoral o interferon; o bien modificadores de la respuesta biológica, por ejemplo, linfocinas, interleucina-1 ("IL-1") , interleucina-2 ¦ ("IL-2") , interleucina-6 ("IL-6"), factor estimulador . "de colonias de macrófagos granulocitos ("GM-CSF") , factor de estimulación de colonias de granulocitos ("G-CSF"), u otros factores de crecimiento. Técnicas para conjugar tales porciones terapéuticas con anticuerpos son bien conocidas, véase, por ejemplo, Arnon y colaborador.es,- "Monoclonal ' Antibodies For Immunotargeting Of Drugs I Cáncer Therapy" [Anticuerpos Monoclonales para el Inmunoenfoque de Fármacos en Terapia contra el Cáncer] , Reisfeld y colaboradores (eds.), páginas 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom y colaboradores, "Antibodies For Drug Delivery" [Anticuerpos para. Administración de Fármacos] , en Controlled Drug Delivery [Administración Controlada de Fármacos] (segunda, edición), Robinson y colaboradores, (eds.), páginas 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cáncer Therapy: A Review" [Vehículos de Anticuerpo de Agentes Citotóxicos en Terapia contra el Cáncer: Una Reseña] , in Monoclonal Antibodies '84; Biological And Clinical Applications, [Anticuerpos Monoclonales '84: Aplicaciones Biológicas y Clínicas] Pinchera y colaboradores (eds.), páginas 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective of The Therapeutic Use OF Radiolábeled. Antibody In Cáncer Therapy" [Análisis,. Resultados y Perspectivas Futuras del Uso Terapéutico de Anticuerpos Radiomarcado en Terapia contra el Cáncer] , en Monoclonal Antibodies For Cáncer Detection And Therapy [Anticuerpos Monoclonales para Detección y Terapia del Cáncer], Baidwin y colaboradores (eds.), páginas 303-16 (Academic Press 1985), y Thorpe y colaboradores "The Preparation And Cytotoxic Properties OF- Antibody-Toxin Conjugates" [La Preparación y Propiedades Citotóxicas de Conjugados Anticuerpo-Toxina], Immunol. Rev. 62:119-58 (1982) . Anticuerpos anti-células dendríticas de ser humano de la invención (y fragmentos de los mismos) pueden también estar unidos a uno o varios antígenos, por ejemplo antígeno viral o tumoral para formar un conjugado de vacuna. Esto permite el enfoque de una amplia gama de antigenos hacia células dendriticas con el objeto de mejorar el procesamiento, presentación y finalmente la .respuesta inmune contra el antigeno o los antigenos. Conjugados de vacuna anticuerpo-antigeno de la presente invención pueden elaborarse genética o químicamente. De cualquier manera, la porción de anticuerpo del conjugado puede consistir del anticuerpo entero o de una parte del anticuerpo, por ejemplo, el fragmento Fab o un Fv de cadena simple. Además, más que un antígeno puede agregarse a un constructo de anticuerpo simple. Conjugados anticuerpo-antígeno anti-dendríticos construidos' de manera genética (por ejemplo, los conjugados expresados como una' proteína de fusión recombinante simple) pueden elaborarse mediante el enlace del antígeno de elección con un anticuerpo en varias ubicaciones. Conjugados particulares genéticamente producidos (constructos de fusión) de la presente invención incluyen, por ejemplo, el constructo conocido aquí como MV4 que se muestra en la figura 14. El constructo de fusión' MMV4 comprende anticuerpo Bll anticélulas dendriticas de ser humano fusionado con Pmell7, un antígeno asociado con tumores. La secuencia de nucleótidos que codifica MMV4 se muestra en SEQ ID NO: 8. Como se presenta en el constructo de fusión genética MMV4 , el antigeno (por ejemplo,.. Pell7) puede ser fusionado sobre el extremo del dominio C¾ de la cadena pesada de anticuerpo de ser humano. El antigeno puede también estar fusionado en la región articulada de la cadena pesada de anticuerpo en constructos Fab-fusiónr o en secuencias ' con las cadenas ligera y pesada variables " (VH y VL) en constructos de fusión de cadena simple (constructos ScFv) . Alternativamente, el antigeno puede estar fusionado - con la cadena ligera dé antigeno en lugar de la cadena pesada de antigeno. Conjugados - anticuerpo-antigeno construidos químicamente pueden también elaborarse empleando varios reactivos de reticulación bien conocidos y fácilmente conseguibles . Estos reactivos de reticulación pueden ser compuestos homofuncionales o heterofunciónales, por ejemplo, SPDP, SATA, SMCC, DTNB, que forman enlaces covalentes con diferentes cadenas laterales de aminoácidos o carbohidratos reactivos en el anticuerpo anti-dendrítico y antígeno seleccionado. Cualquier antígeno que puede estar clonado y expresado o purificado puede seleccionarse para su uso en los conjugados de la cuna anticuerpo-antígeno de la presente invención. Técnicas para obtener tales anticuerpos son bien conocidas. Por ejemplo, antígenos as-ociados con tumor -pueden ser purificados directamente de células cancerosas e identificados por técnicas fisioguímicas tales como espectrometría de masa en tándem. Alternativamente, clones de 39 células T específicas para tumores pueden ser probados contra células negativas para antígenos que han adquirido antígeno por medio de. transfección con clones de ADN de plásmido para aislar la expresión de clon del antígeno. Péptidos sintéticos pueden ser construidos entonces para identificar con precisión el sitio antigénico o el epítopo. Una ventaja significativa de los conjugados anticuerpo-antígeno de la presente invención es su capacidad para provocar rápidamente respuestas inmunes fuertes a partir de vacunas con el ob eto de mejorar de esta manera la eficacia de la vacunación. Por consiguiente, antígenos para enfermedades infecciosas y antígenos tumorales contra los cuales las respuestas inmunes son protectoras o terapéuticas pueden conjugarse con anticuerpos anti-células dendríticas de ser humano de la invención, por ejemplo el anticuerpo Bll, para formar vacunas muy eficaces. Ejemplos de antígenos de enfermedad infecciosa incluyen, sin limitarse a estos ejemplos, proteínas virales, proteínas bacterianas y carbohidratos, proteínas fúngales y carbohidratos. Conjugados anticuerpo-antígeno de la presente invención pueden también, utilizarse para mejorar la eficacia de vacunación contra organismos infecciosos y sus toxinas que pueden encontrarse durante viajes o bien en guerra biológica. Ejemplos de tales antígenos incluyen, por ejemplo, antígenos de ántrax, toxinas de botulismo, antígenos contra malaria, encefalitis equina y antigenos Y. pestis. Otros antigenos adecuados para su uso en los conjugados de anticuerpo-antigeno de la presente invención incluyen antigenos asociados con tumores para la prevención o tratamiento de cánceres. Ejemplos de antigenos asociados con tumores incluyen,- sin limitarse a estos ejemplos, HER2/neu, CEA, gplOO, MARTI, TRP-2, melan-A, NY-ESO-1 MN (gp250), idiotipo para. MAGE-1, MAGE-3, tirosinasa, telomerasa, y antigenos MÜC-1. Antigenos asociados a tumores incluyen también los antigenos de grupo, sanguíneo, por ejemplo, Le", Le°, LeX, LeY, H-2, B-l, B-2. En otra modalidad preferida, más que un antigeno es fusionado sobre un constructo de anticuerpo anti-dendrítico¦. Por ejemplo un ntígeno MAGE puede combinarse con otros antígenos, como por ejemplo melanina A, tirosinasa, y gplÓO junto con adyuvantes, por ejemplo GM-CSF o IL-12 y fusionarse con un constructo de anticuerpo anti-dendrítico como por ejemplo Bll. Otros antígenos adecuados incluyen antígenos virales para prevención o tratamiento de enfermedades virales. Ejemplos de antígenos virales incluyen, .sin limitarse a estos ejemplos, VIH-1 gag, VIH-1 env, VIH-1 nef, HBV core, FAS, HSV-1, HSV-2, pl7, ORF2 y ORF3. En otra modalidad preferida, el antígeno seleccionado es un antígeno específico para melanoma que incluye, sin limitarse a estos ejemplos, gplOO o Pmell7. En otra modalidad preferida, el antígeno seleccionado es un antigeno de cáncer especifico para la próstata, por ejemplo, PSMA. En otra modalidad, el antigeno seleccionado es un antígeno bacteriano que incluye, sin limitarse a estos ejemplos, Toxoplasma gondii o Treponema pallidum. Los conjugados de anticuerpo-antigeno bacteriano de la invención pueden utilizarse en el tratamiento o la prevención de varias enfermedades bacterianas, como por ejemplo ántrax, botulismo, tétanos, clamidia, cólera, difteria, enfermedad de Lyme, sífilis y tuberculosis. En otro aspecto, anticuerpos humanos específicos para células dendríticas pueden ser utilizados para enfocar directamente células enteras, por ejemplo, una célula tumoral, una célula efectora o. un. patógeno microbiano, hacía células dendríticas. Anticuerpos anti-células dendríticas o fragmentos de unión con antígeno de los mismos pueden ser expresados directamente en la superficie de una célula, por ejemplo, por transfección o transducción de una célula con un vector que contiene secuencias de ácido nucleico que codifican un . anticuerpo específico para células dendríticas humano de la invención, o un fragmento de enlace con antígeno del mismo. Esto puede efectuarse, por ejemplo, mediante la transfección. de la célula blanco con un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión que contiene un dominio de membrana y un anticuerpo humano anti-células, o un fragmento de enlace con antígeno del mismo. Métodos para generar tales ácidos nucleicos, proteínas de fusión y células que expresan tales proteínas de fusión se describen, por ejemplo, en la solicitud de patente norteamericana No. de Serie 09/203,958 que se incorpora aquí en su. totalidad por referencia. Alternativamente, anticuerpos anti-células dendríticas, o fragmentos de enlace con antígeno de los mismos pueden unirse a una célula o un patógeno a través del uso de enlazadores químicos, marcadores de lípidos, u otros métodos relacionados (deKruif, J. y colaboradores (2000) Nat. Med. 6:223-227; Nizard, P. y colaboradores (1998) FEBS Lett. .433:83-88) . Células con anticuerpos anti-células dendríticas anclados en la superficie, o fragmentos de enlace con antígeno de los mismos pueden emplearse para inducir respuestas inmunes específicas' contra la células, por ejemplo, una célula tumoral o un patógeno microbiano. V. Composiciones farmacéuticas En otro aspecto, la presente invención of ece composiciones farmacéuticas, por ejemplo, composiciones farmacéuticas que contienen un anticuerpo monoclonal humano o una combinación de anticuerpos monoclonales humanos, o porción (es) de enlace con antígeno de los mismos, de la presente invención, formuladas juntas con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Tales composiciones pueden incluir además otros reactivos terapéuticos, por ejemplo, otros anticuerpos, citotoxinas o' fármacos (por ejemplo inmunosupresores ) y pueden administrase solas o bien en combinación con otras terapias, por ejemplo radiación. En una modalidad, anticuerpos monoclonales humanos anticélulas dendriticas que tienen actividades complementarias se utilizan en combinación, por ejemplo, como una composición farmacéutica, . que comprende dos o . más anticuerpos monoclonales humanos anti—células dendriticas. Por ejemplo, un anticuerpo monoclonal humano que media de manera altamente efectiva la muerte de células dendriticas en presencia de células efectoras puede combinarse con otro anticuerpo monoclonal humano que inhibe el - crecimiento de células dendriticas. En otra modalidad, un anticuerpo monoclonal humano rápidamente internalizado por . células dendriticas puede combinarse con otro -anticuerpo monoclonal humano que induce actividades de células de presentación de antígeno de células dendriticas, por ejemplo, liberación de citocinas inmunoestimuladoras . En otra modalidad, la composición comprende una molécula o una combinación de_ moléculas bi-específicas o multi-específicas de la invención, por ejemplo, que contienen por lo menos una especificidad de enlace para un receptor Fe y por lo menos una especificidad de enlace para células dendriticas ) . En otra modalidad, la composición comprende por lo menos una especificidad de enlace para células dendriticas • funcionalmente enlazadas a otra entidad molecular, por ejemplo, una citotoxina o un antlgeno, por ejemplo, un antlgeno en una célula blanco. Como se emplea aquí, la expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye todos y cada uno de los solventes, medios de dispersiónj revestimientos, agentes anti-bacterianos y anti-fungales, agentes isotónicos y de retardo de absorción y similares fisiológicamente compatibles. Preferentemente, el vehículo es adecuado para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, espinal o epidérmica (por ejemplo por inyección o infusión). Según la vía de administración, el compuesto- activo, es decir, anticuerpo, molécula* -bi-específica y multi-específica, puede estar revestido en un material para proteger el compuesto contra la acción de ácidos y otras condiciones naturales que pueden desactivar el compuesto. Una wsal farmacéuticamente aceptable" se refiere a una sal que conserva la actividad biológica deseada del compuesto de origen y no proporciona ningún efecto toxicológico indeseable (véase, por ejemplo, Berge, S.M., y colaboradores (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19). Ejemplos de tales sales incluyen sales de adición de ácido, y sales de adición de bases. Las sales de adición de ácidos incluyen las sales derivadas, de ácidos .inorgánicos no tóxico, por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico, ácido bromhídrico, ácido hidroyódico, ácido fosforoso y similares, asi como de ácidos orgánicos no tóxicos . tales como ácidos monocarboxílieos y dicarboxilicos alifáticos, ácidos alcanoicos sustituidos con fenilo, ácidos hidroxialcanoicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfónicos, alifáticos y aromáticos y similares. Sales, de adición de bases incluyen las sales derivadas de metales alcalinos térreos, por ejemplo sodio, potasio, magnesio, calcio y similares asi como a partir de aminas orgánicas no tóxicas, como por ejemplo N, N' -dibencil-etilendiamina, N-metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilendiamina, procaina y similares. Una composición de la presente invención puede ser administrada por varios métodos conocidos en la técnica. Como lo observará una persona con conocimientos en la materia, la vía y/o modo de administración variará según los resultados deseados. Los compuestos activos pueden ser preparados con vehículos que protegerán el compuesto contra una liberación rápida, como por ejemplo una . formulación de liberación controlada, incluyendo implantes, parches transdérmicos y sistemas de administración microencapsulados. Polímeros biocompatibles biodegradables pueden utilizarse, por ejemplo etileno acetato de vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico., "colágena, poliortoésteres , y ácido poliláctico. Muchos métodos para la preparación de tales formulaciones están patentados o generalmente conocidos por parte de las personas con conocimientos en la materia. Véase, por ejemplo, Sustained and Controlled Reléase Delivary Systems [Sistemas de administración de fármaco con liberación sostenida y controlada], J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1978. Para administrar un compuesto de la invención a través de ciertas vías de administración, puede ser necesario revestir el compuesto con un material para prevenir su desactivación o bien co-administrar el compuesto con un material para prevenir su desactivación. Por ejemplo, el compuesto puede ser administrado a un sujeto en un vehículo apropiado, por ejemplo, liposomas" o un diluyente. Diluyentes farmacéuticamente aceptables- incluyen soluciones' salinas y soluciones amortiguadas acuosas. Liposomas incluyen emulsiones CGF de agua en aceite en agua, así como liposomas convencionales . (Strejan y colaboradores (1984). J. Neuroimmunol . 7:27). Vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones y dispersiones acuosas estériles así como polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. El uso de tales medios ya gentes para sustancias farmacéuticamente' activas se conoce en la técnica. Excepto en la medida en que un medio o agente convencional es incompatible con el compuesto activo, se contempla su uso en las composiciones farmacéuticas de la invención. Compuestos activos suplementarios pueden también incorporarse en las composiciones. Las composiciones terapéuticas típicamente deben ser estériles y estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición puede ser formulada como solución, microemulsión, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para alta concentración de fármaco. El vehículo puede ser un solvente o un medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etano, poliol (por ejemplo glicerol, propilenglicol así como polietilenglicol líquido, y similares) y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada puede ser mantenida, por ejemplo mediante el uso de un revestimiento, por ejemplo lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño requerido de partícula en el caso de dispersión y mediante el uso de surfactantes . En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro de, sodio en - la composición. Una absorción prolongada de las composiciones inyectables puede proporcionarse mediante la inclusión en la composición de un agente que retarda la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina. Soluciones inyectables estériles pueden ser preparadas mediante la incorporación del compuesto en la cantidad requerida en un solvente apropiado con uno de los ingredientes mencionados arriba o con una combinación de estos ingredientes, según lo requerido, . seguido por esterilización por . micr.ofiltración. En general, las dispersiones se preparan mediante la incorporación del compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los demás ingredientes requeridos entre los indicados arriba. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son secado en vacío y liofilización que proporcionan un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional de una solución previamente filtrada en forma estéril del mismo. Regímenes de dosificación se ajustan para' proporcionar la respuesta deseada óptima (por ejemplo una respuesta terapéutica) . Por ejemplo, un bolo único puede ser administrado, varias dosis divididas pueden ser administradas durante un lapso de tiempo o bien la dosis puede ser reducida o incrementada proporcionalmente según lo indicado por las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente provechoso formular composiciones parenterales en forma de unidad de dosificació para facilitar administración y uniformidad de la dosificación. La expresión "forma unitaria de dosificación", como se emplea aquí se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo que se calcula para producir el efecto terapéutico deseado en -asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La especificación para las formas unitarias de dosificación de la invención son impuestas por (a) las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico a lograr, y (b) las limitaciones inherentes a la técnica de formación de Compuestos de dicho compuesto activo- para el tratamiento de sensibilidad en individuos, y dependen directamente de (a) las características únicas- del compuesto activo y el efecto terapéutico particular a lograr, y (b) las limitaciones inherentes a la técnica de formar compuestos con tal compuesto activo para el. tratamiento de ' sensibilidad en individuos. Ejemplos, de de antioxidantes farmacéuticamen e aceptables incluyen: (1) antioxidantes solubles en agua, por ejemplo ácido ascórbico, hidrocloruro de cisteína, bisulfato de sodio, metabisulfito de sodio, sulfito de sodio y similares; (2) antioxidantes solubles en aceite, por ejemplo palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado (BHA) , hidroxitolueno butilado (BHT) , lecitina, galato de propilo, alfa-tocoferol y similares; y (3) agentes de quelación - de metal, como por ejemplo ácido cítrico, ácido etilendiamintetraacético (EDTA) , sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico y similares. Para las composiciones terapéuticas, formulaciones de la presente invención incluyen, las adecuadas para administración oral, nasal, tópica (incluyendo bucal y sublingual), rectal, vaginal y/o -parenteral . Las formulaciones pueden estar presentadas convenientemente en forma de dosificación unitaria y pueden prepararse a través de cualquier método conocido en la técnica de la farmacia. La cantidad de ingrediente . activo que puede combinarse con un material vehículo para producir una forma de dosificación individual variará según el sujeto que se está tratando, y según el modo particular de administración. La cantidad de ingrediente activo que puede combinarse con un material vehículo para producir una forma de dosificación simple será generalmente la cantidad de la composición que produce un- efecto terapéutico. En general, entre cien por ciento, esta cantidad está dentro de un rango de aproximadamente 0.01 por ciento a aproximadamente noventa y nueve por ciento de ingrediente activo, preferentemente de aproximadamente 0.1 por ciento a aproximadamente 70 por ciento, con mayor preferencia aproximadamente 1 por ciento a aproximadamente 30 por ciento. Formulaciones de la presente invención que son adecuadas para administración vaginal incluyen también pesariós, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o formulaciones de roclo que contienen tales vehículos conocidos en la técnica por ser apropiados. Formas de dosificación para la administración tópica o transdérmica de composiciones de la invención incluyen polvos, roclos, ungüentos, pastas, . cremas, lociones, geles, soluciones, parches e inhalantes. El compuesto activo puede mezclarse bajo condiciones estériles con un vehículo farmacéutica aceptables y con cualquier conservador, amortiguador o impelente que pueda requerirse. Las expresiones "administración parenteral" y "administrado de forma parenteral" cuando se utilizan aquí se refieren a modos . de administración otros que la administración entérica y tópica, habitualmente por inyección, e incluyen, sin limitación, administración intravenosa, intramuscular, intraarterial , intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardiaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, . intraarticular, subcapsular, subaracnoide, intraespinal; epidural, así como inyección e infusión intraesternal . Ejemplos de · vehículos acuosos y no acuosos adecuados que pueden emplearse en las composiciones farmacéuticas de la presente invención incluyen alcohol, etanol, polioles (por ejemplo glicerol, propilenglicol, polietilenglicol y similares) , así como mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, tales como aceite de oliva, y ásteres orgánicos inyectables, como por ejemplo oleato de etilo. Se puede mantener una fluidez apropiada, por ejemplo, a través del uso de materiales de revestimiento, tales como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño requerido de partículas en caso de dispersiones, y mediante el uso de surfactantes . Estas composiciones pueden contener también adyuvantes tales como conservadores, agentes humectantes, agentes emulsificantes y agentes de dispersión. La prevención de la presencia de microorganismos puede asegurarse tanto por procedimientos de esterilización, supra, como por la inclusión de varios agentes antibacterianos y antifungales, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, ácido fenolsórbico, y similares. Puede también ser deseable incluir agentes isotónicos tales como azúcares, cloruro de sodio y similares en las composiciones. Además, una absorción prolongada de la forma farmacéutica- inyectable puede proporcionarse mediante la inclusión de agentes que retardan la absorción tales como monoestearato de aluminio y gelatina. Cuando los compuestos de la presente invención se administran co o agentes f rmacéuticos, a seres humanos y animales, pueden administrarse solos o bien como una composición farmacéutica que contiene, por ejemplo, de 0.01 a 99.5% (con mayor preferencia de 0.1 a 90¾) de ingrediente activo en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Independientemente de la vía de administración seleccionada, los compuestos de la' presente invención, que pueden utilizarse en una forma hidratada adecuada, y/o las composiciones farmacéuticas de la presente invención se formulan en formas de dosificación farmacéuticamente aceptables a través de métodos convencionales conocidos por parte de las personas con conocimientos en la materia.' Niveles reales de dosificación de los ingredientes activos en las composiciones farmacéuticas de conformidad con la presente invención- pueden variar con el objeto de obtener una cantidad de ingrediente activo que es eficaz para lograr la respuesta terapéutica deseada para un paciente particular, para una composición especifica y para un modo de administración . particular, sin presentar toxicidad para el paciente. El nivel de dosificación que se selecciona dependerá de varios factores farmacocinéticos, incluyendo la actividad de las composiciones particulares de la presente invención que sé emplea, o bien el éster, sal o amida de las mismas, la vía de administración, el tiempo de administración, la velocidad de expresión del compuesto particular empleado, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales utilizados en combinación con las composiciones particulares empleadas, - la edad, sexo, peso, condición general de salud asi como historia médica previa del paciente que se está tratando asi como factores bien conocidos en la medicina. Un médico o veterinario que tiene una habilidad ordinaria en la técnica puede determinar fácilmente y prescribir la cantidad efectiva de la composición farmacéutica requerida. Por ejemplo, el médico o el veterinario podría empezar con dosis de los compuestos de . la invención empleados en la composición farmacéutica en niveles inferiores a los niveles requeridos para lograr el efecto terapéutico deseado e incrementar gradualmente la dosificación hasta lograr dicho efecto deseado. En general, una dosis diaria adecuada de composición de la presente invención será la cantidad del compuesto que es la dosis más baja efectiva para producir un efecto terapéutico. Dicha dosis efectiva dependerá generalmente de los factores descritos arriba- Se prefiere que la administración sea intravenosa, intramuscular, intraperitoneal o subcutánea, preferentemente administración próxima al sitio del blanco. En caso deseado, la' dosis diaria efectiva de una composición terapéutica puede administrarse en forma de 2, 3, 4, 5, 6 o más subdosis administradas separadamente a intervalos apropiados durante el dia, opcionalmente en formas de dosificación unitarias. Mientras es posible que un compuesto de la presente invención sea administrado solo, es preferible administrar el compuesto en forma de una formulación farmacéutica (composición) . Las composiciones terapéuticas pueden ser administradas con dispositivos médicos conocidos en la técnica. Por ejemplo, en una modalidad preferida, una composición farmacéutica de la presente invención puede ser administrada con un dispositivo de inyección hipodérmico sin agujas, como por ejemplo los dispositivos divulgados en las patentes norteamericanas Nos. 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4/790,824; o bien 4,596,556. Ejemplos de implantes y módulos bien conocidos útiles dentro del marco de la presente invención incluyen: patente norteamericana No. "4,487,603, que divulga una bomba de micro-infusión implantable para surtir medicación a un régimen controlado; patente norteamericana No. 4,486,194 que divulga un dispositivo terapéutico para administrar fármacos a través de la piel; patente norteamericana No. 4,447,233, que divulga una bomba de infusión de medicación para suministrar una medicación a un régimen de infusión preciso; patente norteamericana No, 4,447,224, que divulga un aparato para infusión implantable de flujo variable para administración continua de fármaco;' patente norteamericana No. 4,439,196, que divulga un sistema de administración de fármaco osmótico que tiene compartimientos de cámaras múltiples, y la patente norteamericana No. 4,475,196, que divulga un sistema osmótico de administración de fármacos. Estas patentes se incorporan aqui por referencia. Muchos otros implantes, sistemas de administración, y módulos de este tipo son conocidos por parte de las personas con conocimientos en la materia. En ciertas modalidades, los anticuerpos monoclonales humanos de la invención puede ser formulados para asegurar un distribución apropiada in vivo. Por ejemplo, la barrera hematoencefálica (BBB) excluye muchos compuestos altamente hidrofilicos . Para asegurar que los compuestos terapéuticos de la invención atraviesan la barrera hematoencefálica (si se desea) pueden ser formulados por ejemplo en liposomas. Para métodos de fabricación de liposomas, véase, por ejemplo patentes norteamericanas Nos. 4,522,811; 5,374,548; y 5,399,331. Los liposomas pueden comprender una o- varias porciones selectivamente transportadas en células u órganos específicos, incrementando así la administración enfocada de fármaco (véase, por ejemplo V.V. Ranade (1989), J. Clin. Pharmacol. 29:685). Porciones de enfoque ejemplares incluyen folato o biotina (véase, por ejemplo, patente norteamericana 5,416,016 de Low y colaboradores); manósidos (Umezawa y colaboradores, · (1988) Biochem. · Biophys . Res. Commun. 153:1038); anticuerpos (P.G. Bloeman y colaboradores (1995) FEB5 Lett. 357:140; M. Owais y colaboradores (1995) Anti icrob. Ageúts Chemother. 39:180); receptores de proteína A de surfactante (Briscoe y colaboradores (1995) Am. J. Physiol. 1233:134), diferentes especies de los cuales pueden comprender las formulaciones de la invención, así como componentes de las moléculas inventadas; pl20 (Schreier y colaboradores (1984) J. Biol. Che . 269:9090); véase también K. Keinanen; M.L. Laukkanen · (1994) FEBS Lett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273. En una modalidad de la invención, los compuestos terapéuticos de la invención son formulados en liposomas; en una modalidad más preferida, los liposomas incluyen una porción de enfoque. En una modalidad más preferida, los compuestos terapéuticos en los liposomas son administrados por inyección de bolo a un sitio próximo al tumor o infección. La composición puede estar fluida en la medida en que existe una capacidad fácil de manejo con jeringa. Debe presentar estabilidad bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe estar protegida contra la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. Una "dosificación terapéuticamente efectiva" modula preferentemente el crecimiento de células dendriticas y/o actividad en por lo menos aproximadamente 20%, con mayor preferencia por lo menos aproximadamente 40¾, con preferencia aún mayor en por lo menos aproximadamente 60 a-, y de manera todavía más preferible en por lo menos aproximadamente 80-', con relación a sujetos no tratados. La capacidad de un compuesto para modular el crecimiento de células dendriticas y/o actividad puede evaluarse en un sistema de modelo animal predictivo de la eficacia en presentación de antígeno y/o inmunomodulación. Alternativamente, esta propiedad de una composición puede ser evaluada" mediante el examen de la capacidad del compuesto para modular la estimulación de células inmunes por células dendriticas, como por ejemplo en ensayos in vítro descritos aquí y conocidos por parte de la persona con conocimientos en la materia. En una modalidad, una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto terapéutico puede inhibir el crecimiento de células dendriticas y/o la actividad de células dendriticas, o bien puede mejorar de otra forma síntomas como por ejemplo, síntomas de autoinmunidad en un sujeto. En otra modalidad,' una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto terapéutico puede incrementar el procesamiento y presentación de antigenos por células dendriticas, y por consiguiente incrementar respuestas inmunes contra un inmunógeno o antigeno blanco. Una personas con conocimientos ordinarios en la materia podrá determinar tales cantidades con base en factores tales como el tamaño del sujeto, la severidad de los síntomas' del sujeto, la actividad inmune en el sujeto, y la composición particular o vía de administración seleccionada. La composición debe estar estéril y fluida en la medida en que la composición se administra a través de una jeringa. Además de agua, · el vehículo puede ser una solución salina amortiguada isotónica, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol líquido, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada puede ser mantenida, por ejemplo, a través del uso de revestimiento como por ejemplo lecitina, mediante el mantenimiento de tamaño requerido de partículas en el caso de dispersión y mediante el uso de surfactantes . En muchos casos, es preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azucares, polialcoholes tales como manitol o ' sorbitol, y cloruro de sodio en la composición. La absorción de 'largo plazo de las composiciones inyectables, puede proporcionarse mediante la inclusión en la composición de un agente que retarda la absorción como por ejemplo, monoestearato de aluminio o gelatina. Cuando el compuesto activo es adecuadamente protegido, de conformidad con lo descrito arriba, el compuesto puede ser administrado oralmente, por ejemplo, con un diluyente inerte o un vehículo comestible asimilable. VI. Usos y Métodos de la Invención Las composiciones (por ejemplo, anticuerpos monoclonaies humanos para células dendríticas y derivados/conjugados de los mismos) de la presente invención de la presente invención tienen utilidad para propósitos de diagnóstico y terapéuticos in vitro e in vivo. - Por ejemplo, estas moléculas pueden ser administradas a células en cultivo, por ejemplo, in vivo ex. vivo, o en un sujeto, por ejemplo, in vivo, para tratar, prevenir o diagnosticar varios padecimiento. Como se emplea aquí, el término "sujeto" incluye seres humanos y animales no humanos. El término "animales no humanos" dentro del marco de la presente invención incluye todos los vertebrados, por ejemplo, mamíferos y no mamíferos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, vacas, pollos, anfibios, reptiles, etc. ¦ . ¦ En una modalidad particular, los anticuerpos humanos y derivados de los mismos se utilizan in vivo para tratar, prevenir, o diagnosticar varias enfermedades relacionadas con células dendriticas o mediadas por células dendriticas. En una modalidad, animales humanos preferidos incluyen un paciente humano que tiene una ¦ enfermedad relacionada a células dendriticas o mediada por células dendriticas. Por ejemplo los métodos y composiciones de la presente invención pueden emplearse para tratar un sujeto con un padecimiento autoinmune, del sistema inmune o inflamatorio, por ejemplo, un padecimiento caracterizado por una actividad aberrante o-no justificada del sistema inmune asociada con inmunomodulación por células dendriticas. Padecimientos autoinmunes , del sistema inmune, e inflamatorios que pueden beneficiarse del tratamiento con las células anti-dendriticas humanas de . la presente invención incluyen artritis reumatoide, esclerosis múltiple, diabetes mellitus, miastenia grave, anemia perniciosa, enfermedad de Addison, lupus eritematoso , síndrome de eiter, y enfermedad de Graves. Por ejemplo, un sujeto que padece de un padecimiento autoinmune puede beneficiarse de la inhibición de las presentación mediada por células dendriticas de un auto-antigeno. -Otros ejemplos de enfermedades que pueden ser tratadas utilizando los anticuerpos anti-células dendriticas de ser humano de la invención incluyen rechazo de trasplante asi como enfermedad de injerto versus huésped. Rechazo de Transplante En años recientes ha habido una mejora considerable de la eficiencia de las técnicas quirúrgicas para transplantar tejidos y órganos tales como piel, riñon, hígado, corazón, pulmón, páncreas y médula ósea. Tal vez el problema principal es la falta de agentes satisfactorios para inducir la tolerancia del sistema inmune en el receptor para el aloinjerto u órgano transplantado. Cuando células u órganos alogenéicos son transplantados' en un huésped (es decir, el donador y . el receptor son individuos diferentes de la misma especie), es probable que- el sistema inmune , del receptor desarrolle una respuesta inmune contra an ígenos foráneos en el transplante (enfermedad de un huésped versus injerto), lo que provoca la . destrucción del tejido transplantado. Células CD8+, células CD4+ y monocitos están todos involucrados en el rechazo de tejidos de transplante. Los agentes terapéuticos de la presente invención son útiles para inhibir las respuestas inmunes inducidas por .aloantígenos mediados por células dendriticas en el receptor evitando así que estas células participen en la destrucción del tejido u órgano transplantado . Enfermedad de Injerto Versus Huésped Un uso relacionado para agentes terapéuticos de la presente invención es en la modulación de la respuesta inmune involucrada en la enfermedad de "injerto versüs huésped" (GVHD) . GVHD es una enfermedad potencialmente fatal que ocurre cuando células inmunológicamente competentes son transferidas a un receptor alogenéico. En. esta situación, las células inmunocompetentes del donador pueden atacar tejidos en el receptor. Tejidos de la piel, epitelios intestinales e hígado son blancos frecuentes y pueden ser destruidos durante el transcurso · de GVHD. La enfermedad presenta un problema especialmente severo cuando tejido inmune se está transplantando, como por ejemplo el transplante de médula ósea; pero se ha reportado también GVHD menos severo en otros casos, incluyendo transplantes de corazón y de higado. Los agentes terapéuticos de la presente invención se utilizan para inhibir la actividad de células de presentación de antigeno de huésped, por ejemplo, células dendriticas. En otra modalidad, los métodos y composiciones de la invención pueden utilizarse para modular una respuesta inmune en un sujeto en contra de un antigeno. Los anticuerpos anticélulas dendriticas de ser humano de la presente invención pueden utilizarse para enfocar un antigeno hacia una célula dendritica y por consiguiente modular una presentación de antigeno y procesamiento de tal manera que se induzca una respuesta inmune con relación al antigeno. El antigeno puede ser un antlgeno tumoral, o bien un antigeno proveniente de un patógeno, por ejemplo, un patógeno microbiano. El patógeno puede ser un virus (por ejemplo, VIH) , una bacteria, un hongo, o un parásito. El antigeno puede ser también componente de un depósito amiloide en un paciente, como por ejemplo un paciente que padece de enfermedad de Alzheimer y el antigeno es péptido ?ß. Por e emplo, un complejo molecular que comprende por lo menos una especificidad de enlace por un componente en la superficie de una célula dendritica enlazada a un antigeno, en donde la unión del complejo con la célula dendritica media la internalización del complejo molecular, puede administrarse a u sujeto con el objeto de inducir o incrementar una respuesta inmune contra el antigeno. La respuesta inmune generada contra el antigeno incluye anticuerpos que se unen al antigeno y células T que se unen al antigeno como componente de un complejo MHC-I o MHC-II. Por consiguiente, los anticuerpos anti-células dendriticas de ser humano de la presente invención pueden también utilizarse para mediar la inmunización enfocada a células dendriticas de un sujeto. Por ejemplo, un sujeto puede ser inmunizado con un complejo molecular que comprende por lo menos una especificidad de . enlace para un componente en la superficie de una célula dendritica enlazado a un antigeno, en donde la unión del complejo con la célula dendritica media la internalización del complejo molecular y, por ejemplo, incrementa el procesamiento y la presentación del antigeno. En otro . aspecto, anticuerpos humanos específicos para células dendríticas pueden- ser utilizados para enfocar directamente células enteras, por ejemplo, una célula tumoral, una célula efectora o un patógeno microbacteriano, hacia células dendríticas. Anticuerpos anti-células dendríticas o bien fragmentos de unión con antígeno' de los mismos pueden ser expresados directamente en la superficie de una célula, por ejemplo, por transfección o traducción de una célula con un vector que contiene, secuencias de ácido nucleico que codifican un anticuerpo específico para células dendríticas de ser humano de la invención. Alternativamente, anticuerpos anti-células dendríticas, o bien fragmentos de enlace con antígeno de los mismos, pueden estar unidos a una célula o- a un patógeno a través del uso de enlazadores químicos, o marcadores de lípidos, u otros métodos relacionados. Células con anticuerpos anti-células dendríticas anclados en superficie, o bien fragmentos de enlace con. antígeno de los mismos pueden utilizarse para inducir respuestas inmunes específicas contra la célula, por ejemplo, una célula tumoral o un patógeno microbiano. Así, los anticuerpos de. la invención pueden ser utilizados para estimular la respuesta inmune a patógenos, toxinas y auto-antígenos . Ejemplos de patógenos para los cuales este enfoque terapéutico puede ser' particularmente útil, incluyen patógenos para los cuales actualmente no hay vacuna eficaz, o bien patógenos para los cuales vacunas convencionales no son totalmente eficaces. Estos incluyen, sin limitarse a estos ejemplos, VIH, Hepatitis (A, B y C) , Influenza, Herpes, Giardia, Malaria, Leishmania, Staphylococcus Aureus, Pseudomonas aeruginosa . Las composiciones (por ejemplo, . anticuerpos humanos, moléculas .multi-especificas y bi-específicas) de la invención pueden probarse inicialmente para actividad de enlace asociada con uso terapéutico o de diagnóstico in vitro. Por ejemplo, composiciones de la invención pueden probarse " utilizando los ensayos citométricos de flujo y de internalización descritos en los ejemplos abajo. Además, la actividad de . estas moléculas para activar por lo menos una actividad de células efectoras mediadas por efectores, incluyendo citólisis'de células dendriticas puede ensayarse. Protocolos para ensayar la fagocitosis mediada por células efectoras y la citólisis se conocen en la técnica. Las composiciones (por ejemplo, anticuerpos humanos, moléculas multi-especificas y bi-especificas ) de la invención tienen utilidad adicional en terapia y diagnóstico de enfermedades mediadas por células dendriticas o enfermedades relacionadas con células dendriticas. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales humanos, las. moléculas muíti- especificas" y bi-especificas pueden ser utilizadas como por ejemplo para provocar in vivo o in vi tro una o varias de las actividades biológicas siguientes: opsonizar una célula dendritica; mediar la fagocitosis o citólisis de una célula dendritica en presencia de células efectoras humanas; inhibir el crecimiento de una célula dendritica; a internalizar por una célula dendritica; o bien para enfocar un antigeno hacia una célula dendritica. Métodos de administración de las composiciones (por ejemplo, anticuerpos humanos, moléculas muíti-especificas y bi- especificas) de la invención son conocidos en la técnica. ¦ Dosificaciones adecuadas de las moléculas utilizadas dependerán de . la edad y peso del sujeto y del. fármaco particular utilizado. Las moléculas pueden estar acopladas a radionúclidos, como por ejemplo Vi, 9QY, 10Rh, etc., de conformidad con . lo descrito en Goldenberg,. D.M. y colaboradores (1981) Cáncer Res. 41:4354-4360, y en EP 0365 997. Las composiciones (por ejemplo, anticuerpos humanos, moléculas multi-especificas y bi-específicas) de la invención pueden también estar acopladas a agentes inmunomoduladores.
Células efectoras especificas para blanco, por ejemplo, células efectoras enlazadas- a composiciones (por ejemplo, anticuerpos humanos, moléculas bi-especificas y multi- especificas) de la invención pueden también . utilizarse como agentes terapéuticos. Células" efectoras para enfocar pueden ser leucocitos humanos tales como macrófagos, neutrófilos o monocitos. Otras células incluyen eosinófilos, células asesinas naturales o bien otras células que llevan receptores para IgG o IgA. Si se desea, las células eféctoras pueden obtenerse a partir del sujeto a tratar. Las células eféctoras específicas para blanco pueden administrarse en forma de una suspensión de células en una solución fisiológicamente aceptable. El número de células administradas puede ser del orden de 10"-109 pero variará según el propósito terapéutico. En una modalidad, la cantidad será suficiente para obtener su localización por ejemplo, en una célula dendrítica, y para provocar la muerte de la célula, por ejemplo, por fagocitosis. En otra modalidad, células dendríticas específicas para blanco, por ejemplo, células dendríticas enlazadas a composiciones de la invención pueden utilizarse como agentes terapéuticos para la localización en una célula blanco, por ejemplo, una célula tumoral, patógeno microbiano, virus o bien célula infectada por virus, o bien para enfocar un antígeno, y para efectuar una respuesta inmune contra la célula blanco o un antígeno blanco, mediante por ejemplo, procesamiento y presentación- de antígeno. Las vías de administración pueden variar también. Una terapia con células eféctoras específicas para blanco o células dendríticas específicas para blanco puede efectuarse en combinación con otras técnicas para remover células enfocadas. Por ejemplo, una terapia anti-células dendriticas utilizando las composiciones (por ejemplo, anticuerpos humanos, moléculas multi-especificas y bi-especificas) de la invención y/o células efectoras equipadas con estas composiciones puede utilizarse en combinación con quimioterapia o terapia inmunomoduladoras , por ejemplo, terapia anti-inflamatoria o inmunosupresora. Además, se puede ' utilizar una inmunoterapia de combinación para dirigir dos poblaciones efectoras citotóxicas distintas, por ejemplo, hacia células dendriticas. Por ejemplo, anticuerpos anticélulas dendriticas enlazados a anti-Fc-gammaRI o anti-CD3 pueden utilizarse -en combinación con agentes de enlace específicos para receptor para IgG o IgA. En otra modalidad, células dendriticas enfocadas con, por ejemplo, anticuerpos humanos, moléculas multi-especificas y bi-especificas de la invención, pueden utilizarse en combinación con una terapia inmunomoduladora, por ejemplo, inmunoestimulación para incrementar una respuesta inmune contra una célula blanco o un antigeno blanco. Una terapia enfocada a células dendriticas puede combinarse con otras formas -de inmunoterapia como por ejemplo tratamiento con 'citocinas (por ejemplo, interferones, TNF , GM-CSF, G-CSF, 11-2) . Moléculas bi-especificas y multi-especificas de la invención pueden también utilizarse para modular actividades de células de drí icas , por ejemplo, procesamiento y presentación .de antígeno asi como para modular el nivel de un antigeno correspondiente en una célula dendrítica, como- por ejemplo mediante el hecho de tapar y eliminar receptores en la superficie de la célula. Las composiciones (por ejemplo, anticuerpos humanos y moléculas multi-especificas y bi-específicas) de la presente invención que tienen sitios de enlace, de complemento, tales como porciones de IgGl, -2, o -3 o de IgM que se unen con complemento pueden también utilizarse en presencia de complemento. En una modalidad, el tratamiento ex vivo de una población' de células que comprende células blanco con un agente de- enlace de la invención y células . efectoras apropiadas puede suplementarse mediante la adición de complemento o suero que contiene complemento. La fagocitosis de células blanco' revestidas con un agente de enlace de la presente invención puede mejorarse mediante la unión de proteínas de complemento. En otra modalidad, células blanco revestidas con las composiciones (por ejemplo, anticuerpos humanos, moléculas multi-especificas y bi-específicas) de la invención pueden también ser lisadas por complemento. Las composiciones (por ejemplo, anticuerpos humanos, moléculas multi-especificas y bi-específicas) de la invención pueden también administrarse junto con complemento. Por consiguiente, dentro del marco de la presente invención se encuentran composiciones que comprenden anticuerpos humanos, moléculas muíti-especificas o bi-especificas y suero o complemento. Estas composiciones son provechosas en la medida en que el complemento se localiza en una cercanía estrecha de los anticuerpos humanos, moléculas multi-específicas y bi-especificas. Alternativamente, los anticuerpos humanos, moléculas multi-específicas y bi-específicas de la invención y el complemento o suero pueden administrarse de forma separada. En otras modalidades, el sujeto puede ser tratado adicionalmente con un agente que modula, por ejemplo, incrementa o -inhibe la actividad de células inmunes y/o la expresión o actividad de receptores Fea o Fcy, mediante por ejemplo, el tratamiento del sujeto con una citocina. Las citocinas preferidas para su administración durante el tratamiento con la molécula multi-específica incluyen factor de estimulación de colonias de granulocitos (G-CSSF) , factor de estimulación de colonias de macrófagos-granulocito (GM-CSF) , interferon-? /IFN-y) , y factor de necrosis tumoral (TNFc . Las composiciones - (por ejemplo, anticuerpos humanos, moléculas multi-específicas y bi -específicas) de la invención pueden también utilizarse para enfocar, por ejemplo, células dendríticas, por ejemplo, para marcar dichas células. Para dicho- uso, el agente de enlace puede estar enlazado a una molécula que puede ser detectada. Así, la invención ofrece métodos para localizar " células dendríticas ex vivo o in vitro.. La etiqueta detectable puede ser, por ejemplo, un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima, o un co-factor de enzima. En una modalidad, la invención ofrece métodos para detectar la presencia de células dendríticas o un antígeno de células dendríticas en una muestra, o bien la medición de la cantidad de células dendríticas o un antígeno de células dendríticas, que comprende la puesta en contacto de la muestra, y una muestra de control, con un anticuerpo monoclonal humano, o una porción de enlace con antígeno del mismo que se une específicamente con células dendríticas o un antígeno para células dendríticas, bajo condiciones que permiten la formación de un complejo entre el anticuerpo o porción del mismo y células dendríticas o -antígeno para células dendríticas. La formación de un complejo es detectada entonces,, en donde una formación de complejo diferente entre la muestra en comparación con la muestra de control es una indicación de la presencia de células dendríticas- o de antígeno para células dendríticas en la muestra. En otra modalidad, la invención ofrece un método para detectar la presencia o cuantificar la cantidad de células dendrítica in vivo o in vitro. El. método comprende (i) la administración a un sujeto de una composición (por ejemplo, una molécula multi-especifica o bi-especifica) de la invención o un fragmento de la misma, conjugada con un marcador detectable; ' (ii) exponer al sujeto a un medio para detectar dicho . marcador detectable con el objeto de identificar áreas que contienen células dendriticas. También dentro del . marco de la. presente - invención se encuentran kits que comprenden las composiciones (por ejemplo anticuerpos humanos, moléculas multi-especificas y bi-especificas) de la invención e instrucciones para su uso. El kit puede contener además por lo' menos un reactivo adicional, como por ejemplo, citocina o complemento, o bien uno o varios anticuerpos humanos adicionales de la invención (por ejemplo, un anticuerpo humano que tiene una actividad complementaria que se une a un epitopo en células dendriticas distintas del primer anticuerpo humano) . La presente invención se ilustra adicionalmente a través de los ejemplos siguientes que no deben considerarse como limitativos. El contenido de todas las figuras, y de todas las referencias, patentes y solicitudes de patente publicadas citadas en esta solicitud se incorporan expresamente aquí por referencia. . EJEMPLOS Ejemplo 1 Producción de Anticuerpos Monoclonales Humanos Contra Células Dendriticas Anticuerpos monoclonales humanos, anti-células dendriticas fueron, generadas mediante la inmunización de la cepa HC07 de ratones HuMAb con' preparaciones de células dendriticas. Ratones HC07 HuMAb fueron generadas de conformidad con lo descrito en la Patente Norteamericana No. 5,770,429 y 5,545,806, cuyas divulgaciones enteras se incorporan aquí por referencia. En particular, ratones HC07 fueron inmunizados cuatro veces con inyecciones intraperitoneales de células dendriticas humanas emulsificadas en Adyuvante de Freund. En resumen, células dendriticas 'fueron preparadas de la siguiente manera. Células mononucleares de sangre periférica humana (PBMCs) fueron . obtenidas por centrifugación por gradiente de densidades .a partir ' de" sangre entera o bien preparaciones de aféresis plaquetaria Leukopal . Monocitos fueron aislados por adherencia en frascos de cultivos celulares durante dos horas, y. después diferencias en células dendriticas por incubación con 2 ng/ml GM-CSF y 10 ng/ml IL-4 en medio libre de suero de macrófago (Gibco) durante 5 a 9 días. Las células para inmunizaciones fueron utilizadas frescas o bien almacenadas congeladas a una temperatura de -80 °C. Los ratones fueron inmunizados cada 2-3 semanas. Finalmente, se llevó a cabo una inyección intravenosa de · células dendriticas en solución salina amortiguada con fosfato (PBS) antes de la esplenectomia . Los bazos de los ratones que respondieron fueron cosechados y dispersados en células individuales.
Para generar hibridomas que producen anticuerpos anti-células dendriticas, esplenocitos de ratones con plasma que contiene anticuerpos . anti-células dendriticas fueron fusionados con células de mieloma P3X63-Ag8.653 (depositadas ante ATCC bajo la designación ATCC CRL 1580 r células de mieloma de ratón no secretorias) y PEG. Los hibridomas fueron seleccionados por crecimiento en medio que contenia HAT. Después del crecimiento de hibridomas (aproximadamente 10-14 días) cada pozo que contenía hibridomas fue tamizado para la producción de IgG de ser humano utilizando un ensayo ELISA para IgG anti-humana . Hibridomas positivos fueron tamizados y seleccionados con base en .las 'propiedades siguientes: (1)' producción de anticuerpos IgG de ser humano, y (2) unión con células dendriticas. Los hibridomas que secretan IgG humano fueron probados para reactividad con varios tipos de células sanguíneas por citometría de flujo. Células dendriticas fueron preparadas a partir de células mononucleares adherentes por cultivo durante 5-7 días en medio complementado con GM-CSF e IL- . Granulocitos (PMN) , monocitos y linfocitos fueron obtenidos de sangre entera heparinizada . Las células fueron incubadas con sobrenadantes de hibridoma a partir de clones positivos para IgG a una temperatura de 4°C. El enlace fue detectado con sonda de IgG (Fe) antihumana de cabra marcada con FITC.
La fluorescencia asociada con células fue determinada por análisis utilizando un instrumento FACScalibur. Varios hibridomas que fueron tamizados produjeron anticuerpos igGl de ser humano que demostraron reactividad con células dendriticas de conformidad con lo ensayado por citometria de flujo, (por ejemplo, A3,.A5, A23, A24, A33, B9, Bll, B33, B47, C8, CIO, C20, C28, C29, C30, C35, El, E8, E10, E18, E20,_ E21, E24, 10F7, 28-6, 24-3, 25-14, 17-6, 19-2 y 19-4), como se muestra en la Tabla 1 abajo. Algunos de los anticuerpos humanos' demostraron una reactividad muy alta y preferencial con células dendriticas en comparación con otros tipos de células sanguíneas. TABLA 1 Anticuerpos Monoclonales Humanos con Reactividad hacia Células Dendriticas MAb Linfocitos Monocitos PM s Células de Ser Dendriticas Humano A3 . +/-· A5 +/- +/- A23 + +/- A24 ++ ++ A33 +/- +/- B9 +++ +++ Bll +/- +++ B33 +/- +/- B47 +/- +/- +/- C8 +/- +/- CIO +/- +/- + C20 +/- +/- ++ 5 C28 +/- +/- C29 +/- +/- ++ C30 +/- . C35 +/- ++ El +/- + 0 E8 + + ++ E10 + + +++ E18 + + ++ E20 ++ +7- +++ E21 +/- ++ +/- +++ 5- E24 +/- +/- 10F7 +/- ++ 28-6 + ++ 24-3 + ++ 25-14 + ++ 0 17-6 + + ' .19-2 +· 19-4 - + Claves : no se detectó enlace enlace débil/equivoco enlace baj o/significat ++ enlace alto +++ enlace extremadamente alto Ejemplo 2 Caracterización de Anticuerpos Monoclonales Humanos Contra Células Dendri icas I . Especificidad 'de enlace de anticuerpos humanos anticélulas dendríticas purificados con células dendríticas Varios hibridomas que secretan anticuerpos IgG de ser humano con especificidad para células dendríticas fueron succionados .y expandidos para purificación. Anticuerpos monoclonales fueron aislados a partir de sobrenadantes y cultivos de hibridoma fueron efectuados en frascos de centrifugación en un incubador humidificado que contenia C02 al 5%. Anticuerpos fueron purificados por cromatografía en una columna de Protein A-agarose de conformidad con las especificaciones del fabricante (Pierce, Rockford IL) . Los anticuerpos humanos purificados fueron después probados para determinar la reactividad con células dendríticas y líneas de células que presentan varios otros tipos de células hematopoyéticas utilizando citometría de flujo. En resumen, células dendríticas fueron preparadas a partir de células mononucleares adherentes por cultivo durante 5-7 días en medio complementado con GM-CSF e IL-4, de conformidad con lo descrito arriba. Las líneas de células U937, CEM, THP-1 y L540 fueron cultivadas en medio complementado con suero fetal bovino al 10%. Las células fueron cosechadas, lavadas e incubadas con concentraciones de saturación de anticuerpos monoclonales humanos Bll, C20, E21 o un control de isotipo (IgGl de ser humano) a una temperatura de 4°C con agitación durante \1 hora. El -enlace con anticuerpo fue detectado mediante incubación adicional con una sonda de IgG (Fe) antihumana de cabra marcado con FITC durante 1 hora a 4°C. Las células fueron lavadas, fijadas con paraformaldehido al 1% y la fluorescencia asociada con células fue analizada utilizando un instrumento FACScalibur (Beckton Dickinson) con un software CellQuest . Como se muestra en - la Figura 1, el anticuerpo monoclonal humano Bll se une exclusivamente con. células dendri icas. El anticuerpo monoclonal C20 se une específicamente con células dendríticas , y demostró también un bajo nivel de reactividad con las líneas, de células de tipo monocito U-937 y THP-l, y con, la linea de células de linfoma de Hodgkin L540. De manera similar, el anticuerpo monoclonal humano E21 se une preferentemente con células dendríticas, pero reaccionó también a un nivel bajo -con células L540 y células THP-1. Estos datos demuestran que los anticuerpos monoclonales humanos Bll, C20 y E21 reconocen diferentes antígenos, y que se unen preferentemente con células dendríticas en comparación con otras células de linaje hematopoyético . II. Enlace dependiente de dosis de anticuerpos humanos purificados anti-células dendríticas con células dendríticas La reactividad .dependiente de la dosis de anticuerpos monoclonales humanos purificados anti-células dendriticas Bll, C20, y E21 con células dendriticas fue examinada por citometria de flujo. Células dendriticas fueron preparadas a partir de células mononucleares adherentes de conformidad con lo descrito arriba. Las células fueron cosechadas e incubadas con varias concentraciones de los anticuerpos monoclonales Bll, C20, E21 o un control de isotipo a 4°C. Se detectó unión con anticuerpo con una sonda de IgG (Fe) , antihumana de cabra marcada con FITC, y la fluorescencia asociada con células fue determinada empleando un instrumento FACScalibur con software CellQuest.. ' Cada anticuerpo monoclonal demostró un enlace dependiente de la dosis con células dendriticas en comparación con un anticuerpo IgG de control con isotipo equiparable, como se muestra en la Figura 2. Estos datos demuestran que los anticuerpos, monoclonales humanos purificados Bll, C20 y E2 se unen de manera dependiente de la concentración con las células dendriticas. Las intensidades variables de enlace entre los anticuerpos anti-células dendriticas indican que reconocen moléculas únicas o epitopos en las células dendriticas. III . Enlace de Anticuerpo Humano Bll con células dendriticas derivadas de células madres CD34+ Debido a su disponibilidad, células dendriticas diferenciadas de monocitos de sangre circulante son el tipo más comúnmente utilizado de células dendriticas tanto para propósito de investigación como para aplicaciones clínicas. Sin embargo, células dendriticas derivadas de células madres progenitoras pueden también utilizarse y pueden representar con mayor precisión células dendriticas - en tejidos humanos. Por consiguiente, en el estudio siguiente, células dendriticas diferenciadas a partir de células progenitoras CD34+ fueron evaluadas para determinar' su reactividad con el anticuerpo monoclonal humano Bll por citometría de flujo. Un anticuerpo monoclonal purificado Bll fue dializado extensamente contra un amortiguador de carbonato de sodio 0.3' M pH 0.5 para marcado con isotiocianato de fluorescencia (FITC) . Una solución madre de FITC fue preparada mediante la disolución de 1 mg de 'FITC sólido en 1 mi. de DMSO. Una solución madre de FITC fue agregada gota a gota con mezclado constante en una cantidad para proporcionar 50 \ig de FITC por mg de proteina de anticuerpo. Después de la adición de FITC, la solución fue incubada en oscuridad durante 1-3 horas a temperatura ambiente. Anticuerpo marcado con FITC fue aislado por filtración en gel en una columna de Sephadex G-10 equilibrada en PBS . Células progenitoras CD34+ y medios de diferenciación de células dendriticas fueron obtenidos de Poetic Technologies, Inc.' (Gaithersburg, MD) . Las células fueron diferenciadas de conformidad con las instrucciones del fabricante. Las células dendríticas fueron cosechadas e incubadas con varias concentraciones de Bll-FITC en un anticuerpo de control de isotipo (IgG humana-FITC) a 4°C. La fluorescencia asociada a célula fue determinada por análisis empleando un instrumento FACScalibur con un software CellQuest. Los resultados se. muestran en la Figura 3 y demuestran que el anticuerpo monoclonal humano Bll- se une a células dendriticas diferenciadas a partir de células madres CD34+ en forma dependiente de la dosis. Por consiguiente, el antigeno blanco de Bll es expresado en células dendriticas derivadas de monocitos y de células madres .progenitoras . IV. Enlace de anticuerpo humano Bll con macrófagos y células dendriticas La capacidad del anticuerpo monoclonal anti-células dendriticas humano Bll para unirse con macrófagos en comparación con células dendríticas fue evaluada por citometría de flujo. Células dendríticas fueron preparadas a partir de células mononucleares adherentes de conformidad con lo descrito arriba. Macrófagos fueron a partir de células mononucleares adherentes mediante cultivo durante 5-7 días con M-CSF. Las células fueron cosechadas e incubadas con 10 ug/ml de anticuerpo monoclonal Bll ¦ o un anticuerpo de control de isotipo a una temperatura' de 4°C. Se detectó enlace con anticuerpo humano con' una sonda de IgG(Fc) anti-humana de cabra marcada con FITC. La fluorescencia asociada con célula fue determinada por - análisis empleando un instrumento FACScalibur con un software CellQuest. Los resultados se muestran en la Figura 4 y demuestran que el anticuerpo humano Bll se une a macrófagos en menor medida que las células _ dendriticas . Asi, el antigeno blanco de Bll es expresado también en macrófagos, aún cuando el. nivel de expresión es inferior que el nivel observado en células dendriticas. La reactividad del anticuerpo monoclonal Bll con macrófagos no es sorprendente debido a la similitud entre células dendriticas y macrófagos. Puesto que estos dos tipos de células comparten propiedades estructurales asi como propiedades funcionales, incluyendo la capacidad de estimular respuestas de linfocitos T y B, la reactividad cruzada de anticuerpo Bll con macrófagos será benéfica para enfocar células de presentación de antigeno. V. Inducción de anticuerpo humano Bll para enfocar antigeno en células THP-1 Se probó un anticuerpo monoclonal humano Bll utilizando citómetria de flujo para enlace con células THP—1, una linea de células de tipo monocito derivada de una leucemia monocitica humana, antes y después de la inducción de las células a diferenciarse hacia un fenotipo de células dendríticas. En resumen, células THP-1 fueron cultivadas en medio de cultivo estándar o en medio suplementado con GM-CSF e IL-4. Las células fueron incubadas con 10 ug/ml de anticuerpo monoclonal Bll-FITC o un anticuerpo de control de isotipo (IgG humana-FITC) a una temperatura de 4°C. La fluorescencia asociada con células fue determinada por ¦ análisis empleando un instrumento FACScalibur con un software CellQuest. Los resultados se muestran en la Figura 5. Estos datos demuestran que, bajo condiciones normales de cultivo, células THP-1 no expresan el antigeno blanco de Bll. Sin embargo, cuando células THP-1 son impulsadas hacia un fenotipo de células dendriticas o cultivo en medio que contiene GM-CSF e IL-4, la expresión del antigeno blanco de Bll es inducida en ' forma concomitante. Por consiguiente, estos resultados confirman adicionalmente la especificidad del anticuerpo humano, Bll para un antigeno blanco (Bll) asociado específicamente con células dendriticas. VI . Enlace de anticuerpo Bll con células dendriticas de macaco El modelo de animal (mono) de machaques cynomolgus puede proporcionar , información relevante en cuanto a la aplicación clínica de. anticuerpos, a condición que el antígeno blanco sea conservado entre primates. Por consiguiente, la reactividad cruzada de anticuerpo- monoclonal humano Bll con células dendríticas de mono cynomolgus fue evaluada por citometría de flujo. Sangre . fresca de mono cynomolgus fue · obtenida de Sierra Biomedicals, y células dendríticas fueron preparadas a partir de células mononucleares adherentes por cultivo con GM-CSF e IL-4. Células dendríticas fueron incubadas con 10 pg/ml anticuerpo monoclonal de Bll-FITC o un anticuerpo de control de isotipo (IgG humana-FITC) a una temperatura de 4°C. La fluorescencia asociada con células fue determinada por análisis empleando un instrumento FACScalibur. Como se muestra en la Figura 6, un anticuerpo monoclonal humano Bll se une con células dendríticas derivadas de macacos cynomolgus, lo que sugiere que él antígeno blanco de Bll es conservado en primates. VII. Enlace de anticuerpo humano Bll con células dendríticas en tejido humano La reactividad de anticuerpo monoclonal humano Bll con células dendríticas provenientes de tejidos humanos fue evaluada por inmunohistoquímica. Estos experimentos fueron también diseñados para evaluar cualquier reactividad cruzada potencial de anticuerpo Bll con otras células o antígenos de tejidos humanos. Crio-secciones de tejidos humanos fueron obtenidos a través de autopsia o biopsia quirúrgica e integrados en medio Tissue-Tek O.C.T. y almacenadas congeladas a una temperatura • inferior a -70°C. Los tejidos fueron seccionados a 5 mm, fijados durante 10 minutos con acetona, y secados durante la noche. Las placas fueron fijadas con formalina amortiguada neutral al 10% durante 10 segundos antes de la tinción. Se empleó la técnica de inmunoperoxidasa indirecta. Las secciones fueron teñidas primero con el anticuerpo Bll-FITC o bien isotipo correspondiente-FITC diluido en PBS que contenia IgG agregada térmicamente para bloquear el enlace dependiente de Fe. Anticuerpos primarios fueron detectados utilizando un anticuerpo anti-FITC de conejo seguido por un reactivo anticonejo marcado con peroxidasa. Cada placa fue leida por un patólogo certificado y el enlace fue evaluado según las claves siguientes: ± (equivoco), 1+ (débil, 2+ (moderado), 3+ (fuerte, 4+ (intenso), Neg. (negativo). Los resultados mostrados en la Tabla 2 abajo indican una tinción clara de células dendrxticas y algunos macrófagos en todos los tejidos examinados. No se observó ninguna tinción especifica con el anticuerpo de control de isotipo. Estos datos demuestran que el anticuerpo monoclonal humano Bll se une a células dendrxticas en tejidos humanos, asi como macrófagos en tejidos humanos aún cuando en menor medida. El enlace mínimo de Bll con células mononucleares en el bazo y células progenitoras de la médula ósea puede representar el enlace con células dendríticas inmaduras. El anticuerpo humano Bll no reaccionó de manera cruzada con otros tipos de células o tejidos en las muestras probadas, demostrando adicionalmente la especificidad de este anticuerpo para células dendriticas, y, en menor medida, macrófagos . TABLA 2 Inmunohistoquimica de Enlace de Anticuerpo Monoclonal Humano Bll con Tejidos Humanos Anticuerpo Tejido y reactividad Bll-FITC Piel: Células dendriticas dérmicas 3+, todos los (2 µT/ML) Demás elementos negativos. Bll-FITC Amígdalas: Células dendriticas intersticiales y/o (2 µT/ML) subepiteliales 2+, todos los demás elementos negativos Bll-FITC Hígado: Células dendriticas intersticiales 2+, (2 ]iG/M ) Células Kupffer 2+, todos los elementos negativos. Bll-FITC Mama: Células dendriticas dérmicas ( subcutáneas/in- (2 G/ML) tersticiales 3-4+, todos los elementos negativos. Bll-FITC Bazo: Células dendriticas intersticiales 3-4+, (2 G/ML) Células reticulotendoteliales que recubren las cuerdas de Billoroth 2+, células mononucleares ocasionales en zona marginal 2+, células mononucleares escasas a ocasionales en PALS/fo- liculos 2+, otros elementos negativos. Bll-FITC Riñon: Células dendriticas intersticiales 3-4+, (2 G/ML) todos los elementos negativos. Bll-FITC Nodo linfático: Células dendriticas capsulares (2 uG/ML) 3-4+, células dendriticas subcapsulares/macrófagos 3+, células dendríticas foliculares 2-3+, células dendriticas paracorticales 2-3+, células dendríticas de célula medular/macrófagos 1-2+, otros elementos negativos. Bll-FITC Cerebro: Células dendriticas meningicas/peritelea-(2 pG/ML) les 3-4+, todos los demás elementos negativos. Bll-FITC Testículos: Células dendríticas intersticiales (2 ]iG/ML) 3-4+, todos los demás elementos negativos. Bll-FITC Páncreas: Células dendríticas intersticiales 3-4+, (2 pG/ML) todos los demás elementos negativos. Bll-FITC Corazón: Células dendríticas intersticiales 3-4+, (2 pG/ML) todos los demás elementos negativos. Bll-FITC Intestino delgado: Células dendríticas intersti-(2 uG/ML) cíales 3-4+, células dendríticas de lámina propia/macrófagos 2-3+, células dendríticas de parche Peyers/macrófagos 2-3+, otros elementos negativos. Bll-FITC Médula Ósea: Células dendríticas intersticiales (2 µ?/ML) 3-4+, progenitores Hematopoyéticos 2+, otros elementos negativos. Bll-FITC Pulmón: Células dendríticas intersticiales 3-4+, (2 pG/ML) macrófagos Alveolares 3-4+, otros elementos negativos . IgG-FITC Todos los tejidos probados: todos los elementos (2 pg/ml) fueron negativos.
Estudios de reactividad cruzada en tejidos fueron efectuados en Pathology Associates International, Frederick, MD estudio # IM598. VIII. Enlace de fragmentos Fv de cadena simple (ScFv) de anticuerpo humano Bll con células dendriticas. La reactividad de un fragmento Fv de cadena simple de anticuerpo monoclonal humano Bll con células dendriticas de tejidos humanos fue evaluada por citometria de flujo. El ScFv de Bll fue construido mediante el enlace de los dominios VL (SEQ ID NO: 1 y 2) y VH (SEQ ID NO: 2 y 4) de anticuerpo monoclonal humano Bll como se muestra en la Figura 9. Secuencias EGF fueron incorporadas con el objeto de detectar el enlace de scFv con células dendriticas empleando anticuerpos anti-EFG. Células dendriticas fueron incubadas con ScFv de Bll durante una hora a una temperatura de 4°C, después lavadas antes de incubación con sonda anti-EFG-FITC durante 1 hora a una temperatura de 4°C. Las muestras fueron analizadas utilizando análisis FACS. Los resultados del análisis FACS demostraron que el fragmento ScFv de Bll de anticuerpo monoclonal de ser humano enlazado a células dendriticas humanas. Por consiguiente, el ScFv puede utilizarse como vacuna o bien como inmunotoxina mediante enlace de ScFv con un antigeno seleccionado o toxina seleccionada, respectivamente. IX. Enlace de fragmentos F(ab')2 de anticuerpo humano Bll con células dendrlticas humanas La reactividad de fragmentos F(ab')2 de anticuerpo monoclonal humano . Bll con células dendrlticas de .tejidos humanos fue evaluada por citometria de flujo. Estos experimentos fueron también diseñados para evaluar si la porción Fe de anticuerpo humano de Bll participa de manera significativa en la unión de Bll con células dendrlticas. Fragmentos F(ab')2 fueron preparados por digestión de mAb de Bll purificadas con pepsina bajo condiciones estándares. Los fragmentos F(ab')2 fueron purificados por cromatografía de proteína L. Células dendrlticas, preparadas frescas a partir de monocitos humanos por cultivo en GM-CSF e IL-4, fueron incubadas con anticuerpo entero o fragmentos de anticuerpo F(ab')2 durante 1 hora a uña temperatura de 4°C. Las células fueron lavadas antes de incubación con una sonda de IgG-F(ab')2~PE anti-humano durante 1 hora a una temperatura de 4°C. Las células fueron lavadas otra vez antes de análisis utilizando un instrumento FACScalibur y un software CellQuest. Como se muestra en la Figura 10, los resultados del análisis FACS demostraron que el anticuerpo monoclonal humano Bll entero y fragmentos F(ab')"2 de Bll se unían a~ células dendrlticas con características cinéticas similares, lo que indica que Fe del anticuerpo monoclonal entero no contribuye significativamente a la unión de Bll con células dendrlticas.
Ejemplo 3 Caracterización de Antigeno Blanco de Bll I . Inmunoprecipitación del antlgeno blanco de anticuerpo monoclonal humano Bll a partir de células dendrlticas Se utilizó el anticuerpo monoclonal humano Bll para inmunoprecipitar su antigeno blanco correspondiente a partir de células dendrlticas. En resumen, Usados celulares de células dendrlticas fueron preparados e incubados con anticuerpo monoclonal Bll o un anticuerpo IgG de control de isotipo a una temperatura de 4°C. Complejos anticuerpo-antigeno fueron capturados con IgG antihumana-agarosa, y separados por electroforesis en gel de poliacrilamida SDS. Una banda correspondiente a un peso molecular de aproximadamente 180 kilodaltones fue evidente en los inmunoprecipitados de anticuerpo Bll a partir de dos preparaciones diferentes de lisados de células dendrlticas, pero no en la muestra de control. Por consiguiente, estos estudios de inmunoprecipitación mostraron que el anticuerpo monoclonal humano Bll reconoce un antigeno blanco en células dendrlticas con un peso molecular aproximado de 180 kilodaltones, de conformidad con lo analizado por SDS-PAGE.
II . Secuenciamiento N-terminal del antígeno blanco del anticuerpo monoclonal humano Bll a partir de células dendrlticas Después de la inmunoprecipitación de conformidad con lo descrito arriba, el antígeno blanco de Bll fue sometido a secuenciamiento de aminoácidos N-terminales para determinar su homología con proteínas conocidas. Lisados de células fueron preparados a partir de células dendríticas y se permitió su incubación con anticuerpo monoclonal Bll a una temperatura de 4°C. Complejos anticuerpp-antígeno fueron capturados con IgG antihumana-agarosa, y separados por SDS electroforesis en gel de poliacrilamida. Proteínas provenientes del gel fueron transferidas a nitrocelulosa y la banda correspondiente al antígeno blanco del anticuerpo monoclonal Bll fue eluida para secuenciamiento de aminoácidos N-terminales. El secuenciamiento de aminoácidos N-terminales y búsqueda en base de datos se llevaron a cabo en Midwest Analytical, Inc. (St. Louis, MO) . El secuenciamiento de los 15 residuos de aminoácidos N-terminales del antígeno blanco del anticuerpo monoclonal Bll reveló una homología de secuencia de proteínas con el receptor de mañosa de macrófago de ser humano, de la siguiente manera: DDXXQFLIXXEDXKR (SEQ ID NO: 5) antígeno de Bll LDTRQFLIYNEDHKR (SEQ ID NO: 6) receptor de mañosa de macrófago Una búsqueda computarizada de la base de datos de proteína ser humano no identificó otras proteínas como teniendo una homología significativa con antígeno Bll. En un estudio adicional, lisados de células dendríticas son depurados de proteínas con enlace no específico por incubación durante la noche con agarosa cargada con IgG de anti-ratón. La agarosa fue removida por centrifugación y el sobrenadante depurado fue recuperado e incubado durante la noche con IgG antihumana-agarosa previamente cargada con anticuerpo Bll. La agarosa fue lavada con PBS y hervida con reducción de amortiguador de carga. Finalmente, la agarosa fue sometida a centrifugación y el sobrenadante fue cargado en un gel. El anticuerpo Bll inmunoprecipitó una proteína de aproximadamente 150-180 kD. Esta proteína fue absorbida en una membrana PVDF y enviada a Midwest Analytical, Inc. para microsecuenciamiento . Los resultados del microsecuenciamiento N-terminal del antígeno blanco de anticuerpo monoclonal . Bll reveló la siguiente secuencia de proteína: LLDTR QFLIY LEDTK RCVDA (SEQ ID NO: 7). Esta secuencia corresponde otra vez a la secuencia del receptor de mañosa de macrófago de ser. humano (No. de Acceso GenBank NPJ302429) con una identidad de 100% sobre 20 aminoácidos de conformidad con lo determinado utilizando el algoritmo BLAST en el sitio web de National Center for Biotechnology information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Estos datos indican que la molécula blanco en células dendríticas reconocida por el anticuerpo monoclonal humano Bll es el receptor ce mañosa de macrófago . III. Bll inhibe la absorción de FITC-dextrano por células dendriticas El siguiente experimento fue diseñado para probar si el anticuerpo Bll bloqueaba el receptor de ma osa y por consiguiente podía utilizarse, por ejemplo, para prevenir o inhibir la interacción de patógenos con el receptor de mañosa (por ejemplo, infección celular) . Células dendriticas fueron incubadas con FITC-Dextrano (500 ]íg/ml) y o bien IgG humano de control de isotipo o bien Bll HuMAb (25 µg/ml) durante 30 minutos a temperaturas indicadas en la Figura 11. Se sabe que las moléculas de dextrano son internalizadas específicamente por células dendriticas a través del receptor de mañosa (F. Sallusto y colaboradores, J. Exp. · Med. .1995, 185:389-400) . La absorción de dextrano marcado con FITC fue determinada por análisis FACS (es decir, intensidad de fluorescencia de las muestras de células dendriticas utilizando un instrumento FACScalibur) . El porcentaje de absorción de dextrano marcado con FITC fue establecido en 100% a 37 °C y 0¾ a 4°C. Como se muestra en la Figura 11, el anticuerpo Bll bloqueó la absorción de FITC-dextrano en 61.5% bajo estas condiciones. E.stos resultados sugieren que el anticuerpo monoclonal humano puede ser utilizado para bloquear la interacción de patógenos con el receptor para mañosa.
Ejemplo 4 Actividad de anticuerpos humanos anti-células dendriticas I . Internalización de anticuerpo monoclonal humano Bll por células dendriticas La magnitud con la cual el anticuerpo humano Bll es internalizado después de unión con células dendriticas fue evaluada por citometria de flujo. Células dendriticas fueron preparadas a partir de células mononucleares adherentes de conformidad con lo descrito arriba. Las células fueron incubadas con una concentración de saturación de anticuerpo monoclonal Bll-FITC a una temperatura de 4°C durante 1 hora para permitir un enlace superficial máximo del anticuerpo, lavadas con PBS frió para remover anticuerpo en exceso y después incubadas a una temperatura de 37 °C durante varios periodos de tiempo para permitir la internalización. del anticuerpo. Las muestras fueron después lavadas con PBS frió para detener la reacción, lavadas otra vez con PBA al 0.1%, pH 2.5 para remover el anticuerpo unido en superficie de las células. La fluorescencia restante es el anticuerpo Bll-FTIC que ha sido internalizado. Células de control fueron inmediatamente lavadas con PBA al 0.1%,- pH 2.5 y mantenidas a una temperatura de 4°C para representar la internalización mínima, o bien lavadas solamente con PBA al 0.1%, pH 7 para representar la carga máxima de anticuerpo Bll-FITC. La internalización porcentual de anticuerpo fue calculada a través de la fórmula siguiente: ·¾ de internalización = (intensidad de fluorescencia media de la muestra - intensidad de fluorescencia media de control a 4°C lavado con ácido) /( intensidad de fluorescencia media de control a 4°C lavado con PBS - intensidad de fluorescencia media de control a 4°C lavado con ácido) Los resultados, mostrados en la Figura 7, demuestran que el anticuerpo monoclonal humano Bll es internalizado de forma eficiente después de enlace con células dendriticas. Esta propiedad inesperada de anticuerpos monoclonales humanos Bll arrti-céluias dendriticas indica que el anticuerpo puede ser utilizado para suministrar agentes tales como antigenos y toxinas, en forma intracelular a células dendriticas. II . Internalización de Bll-FITC por células dendriticas Se utilizó también visualización microscópica para confirmar que el anticuerpo Bll es internalizado después de enlace con células dendriticas. Células dendriticas fueron generadas por incubación de monocitos con GM-CSF (10 ng/ml) y IL-13 (50 ng/ml) bajo condiciones no adherentes durante 7 días. Estas células fueron combinadas con mAb Bll-FITC (1 µg) en presencia de IgG humano (600 ]ig) y mAb IV.3 anti-CD32 (10 ]ig) para bloquear la absorción no específica e incubadas a una temperatura de 37 °C. Células de control fueron incubadas en hielo durante todo el procedimiento. Después de 15 y 60 minutos a una temperatura de 37 °C, células dendriticas fueron colocadas en hielo y teñidas con anti-CDllc-PE (1 µg) . La internalización de mAb Bll fue examinada mediante microscopía confocal utilizando un microscopio confocal de exploración láser BioRad MRC1024. Células fueron exploradas para determinar la fluorescencia utilizando la línea de 488 mu a partir de un láser Kr/Ar de 15 mW y dos fotodetectores (522/35 nm dicroico para fluorescencia FITC y 605/32 nm dicroico para fluorescencia de PE). Un objetivo con abertura numérica 1.4 NA 63X Plan-APO (Cari Zeiss, Inc. Thornwood, NY) fue utilizado en combinación con un ajuste de iris de 2.1 lo que permitió la detección de secciones ópticas de la imagen de fluorescencia que fueron aproximadamente de 1.0 um de espesor. Imágenes representativas fueron seleccionadas a partir de las placas a través del centro de las células después de seccionar la célula entera. Los resultados confirmaron que mAb de Bll fue rápidamente internalizado por células dendriticas después de enlace con el receptor para mañosa, lo que sugiere otra vez que este anticuerpo puede suministrar eficientemente antígenos o toxinas en células de presentación de antígeno. De manera consistente con los datos FACS, la internalización fue evidente dentro de 15 minutos y casi completa dentro de una hora. III. Presentación mejorada de antlgenos por células dendriticas después de administración de antigeno enfocada con anticuerpo monoclonal humano Bll Con el objeto de determinar si el anticuerpo monoclonal humano Bll puede utilizarse para incrementar el procesamiento y presentación de antigenos por células dendriticas, el anticuerpo fue conjugado con el antigeno de toxoide de tétanos (TT) utilizando el reactivo de reticulación química SMCC. Células dendriticas fueron preparadas a partir de células mononucleares adherentes de conformidad con lo descrito arriba, a excepción que las céluia's fueron cultivas en recipientes de Teflon. Células dendriticas fueron cosechadas y colocadas en placas otra vez en placas de microtitulación de 96 pozos a razón de 5,000 células por pozo en medio libre de suero de macrófago con suero fetal de becerro al 10%. Se agregó anticuerpo monoclonal Bll conjugado con toxoide de tétanos o toxoide de tétanos solo en varias concentraciones a las células dendriticas. Células T especificas para toxoide de tétanos autólogas generadas por incubación de células mononucleares con toxoides de tétanos seguido por IL-2 fueron agregadas a cada pozo que contenía células dendriticas a razón de 50,000 células por pozo. Las células fueron cultivadas juntas durante 7 días a una temperatura de 37°C y ensayadas para determinar el número de células vivas utilizando un ensayo basado en MTT de conformidad con las instrucciones del fabricante (Promega, Madison, WI). La capacidad de inducir las células dendriticas para que estimulen específicamente linfocitos T específicos para toxoides de tétanos fue comparada después de exposición de células a toxoide de tétanos o bien anticuerpo Bll-toxoide de tétanos. Los resultados (Figura 8) mostraron que la conjugación de toxoide de tétanos como antígeno modelo con Bll llevó a una presentación significativamente más eficiente de antígeno de conformidad con lo medido por proliferación de células T específicas para antígeno. En otro experimento, ¾-timadina fue utilizada como la lectura para la proliferación de células T después de carga de células dendriticas ya sea con Bll conjugado con toxoide de tétanos (TT) o bien con toxoide de tétanos mezclado con anticuerpo Bll (control no conjugado) . Como control adicional, un anticuerpo de bloqueo para FcyRII (CD32) , mAb IV-3, se agregó a unos pozos que contenían el conjugado Bll-TT para determinar si este receptor Fe contribuía a incrementar el procesamiento y presentación de antígeno por Bll-TT. Al día siguiente, las células fueron combinadas con células T específicas para toxoide de tétanos previamente establecidas, recientemente descongeladas, durante cuatro días. Las células fueron co-incubadas con 3H-timadina a una temperatura de 37 °C durante el día final. La cantidad de ¾ incorporado a las células T fue ensayada. Como en el caso del experimento previo, los resultados (Figura 12) demostraron que la conjugación de toxoide de tétanos como antígeno modelo a Bll lleva a una presentación de antígeno significativamente más eficiente de conformidad con lo medido por proliferación de células T específicas para antígeno. La adición de cantidades en exceso de mAb no alteró significativamente la presentación incrementada de antígenos por conjugado Bll-TT, lo que muestra que la interacción de Bll-TT con FCYRII no se requiere para esta actividad. Globalmente, los resultados de estos estudios, mostrados en las Figuras 8 y 12, indican que cantidades inferiores en 10 a 100 veces de toxoide de tétanos conjugado con anticuerpo Bll se requieren para lograr el nivel de estimulación de células T en comparación con el toxoide de tétanos solo. Además, el grado absoluto de estimulación de células T de conformidad con lo mostrado en- la Figura 8 fue dos veces mayor cuando se enfocó el toxoide de tétanos a células dendríticas con anticuerpo Bll. Así, los datos demuestran que un antígeno puede ser conjugado con anticuerpo monoclonal humano Bll y que el antígeno enfocado · a anticuerpo es procesado y presentado de manera más eficiente que . el anticuerpo no enfocado, provocando respuestas mejoradas por parte de células T específicas para antígeno.
Ejemplo 5 Caracterización de anticuerpo monoclonal humano E21 contra células dendriticas I . Análisis de peso molecular de antígeno de anticuerpo humano E21 Lisados de células dendriticas fueron preparados a partir de células dendriticas humanas cultivadas. En resumen, células dendriticas fueron lavadas y resuspendidas en Tritón X-100 que contenía amortiguador de lisis a 4°C. El lisado no fraccionado fue cargado en un gel de SDS-poliacrilamida al 4-15% y después las proteínas fueron transferidas a nitrocelulosa . El blot fue incubado con 10 ug/ml de E21 seguido por sonda de IgG anti-humana-fosfatasa alcalina y visualizado utilizando peroxidasa de rábano agrio. El resultado de este experimento demostró que el antígeno de anticuerpo monoclonal humano E21 tenía un peso molecular aproximadamente de 36-40 kilodaltones . II . Enlace de anticuerpo humano E21 con células dendriticas humanas dérmicas y epidérmicas Como se muestra en la Figura 1, el anticuerpo monoclonal humano Ab E21 se une preferentemente con células dendriticas. Este experimento fue diseñado para probar la reactividad del anticuerpo humano E21 con células dendriticas dérmicas y epidérmicas por análisis de inmunohistoquímica de piel congelada con E21. Secciones congeladas de piel humana fueron teñidas con FITC-E21 o control FITC-huIgG y detectadas empleando sonda anti-FITC de conejo. Los resultados del análisis de inmunohistoquimica demuestran que el anticuerpo humano E21 reacciona tanto con células dendriticas dérmicas/macrófagos como con células dendriticas epidérmicas (células de Langerhan) en secciones de piel humana . III . Enlace de anticuerpo humano E21 con células dendriticas de macaco El modelo de animal (mono) de macacos cynomolgus puede proporcionar una información relevante en cuando a la aplicación clínica de anticuerpos, a condición que el antigeno blanco sea conservado entre' primates. Por consiguiente, la reactividad cruzada de anticuerpo monoclonal humano E21 con células dendriticas de mono cynomolgus fue evaluada por citometria de flujo. Monocitos de cynomolgus fueron diferenciados en células dendriticas con tratamiento GM-CSF e IL-4 y probados para enlace con E21 por citometria de flujo. Las células dendriticas fueron incubadas con E21 durante 1 hora a 4°C y después lavadas antes de incubación con sonda IgG-FITC antihumana durante 1 hora a una temperatura de 4°C. Las muestras fueron analizadas utilizando un instrumento FACScalibur. Ejemplo 6 Producción y caracterización de conjugado de vacuna Bll-Pmel-17 I . Expresión recombinante de conjugado molecular Bll-Pmel-17 Como se muestra en la Figura 14, un plásmido fue construido que contenia la secuencia codificadora de Pmel-17 (antigeno de melanoma) fusionada (en el dominio C¾ de la cadena pesada, con el anticuerpo Bll. El constructo de plásmido resultante, conocido como (SEQ ID NO: 8), fue transferida entonces en células CHO utilizando un protocolo estandarizado (Qiagen Inc, Valencia, CA) . Células transfectadas fueron seleccionadas en medio que contenia el antibiótico G418. La expresión fue amplificada adicionalmente mediante cultivo de células en concentraciones cada vez mayores de metatrexato. Después de la amplificación, las células fueron- clonadas por dilución limitante, y lineas clonables estables fueron utilizadas para generar bancos de células para estudios adicionales. Para confirmar la expresión del constructo Bll-Pmel-17, se llevó a cabo un análisis Western blot de proteina en SDS-Page bajo condiciones reductoras. Las proteínas fueron sondeadas con suero anti-Pmel de conejo o bien por IgG anti- umana de cabra. El análisis del constructo de fusión entero fue también efectuado bajo condiciones no reductoras. Los constructos de fusión se inmunoprecipitaron en el peso molecular apropiado. Así, los resultados confirmaron que las células CHO transformadas expresaban específicamente el conjugado molecular Bll-Pmel-17 de conformidad con lo evidenciado por el tamaño apropiado y composición del producto de fusión. II . Análisis de enlace de conjugado molecular Bll-Pmel-17 La capacidad del conjugado molecular Bll-Pmel-17 para unirse a células dendriticas fue evaluada por citometria de flujo. Células dendriticas fueron preparadas a partir de células mononucleares adherentes de conformidad con lo descrito arriba. Macrófagos fueron preparados a partir de células mononucleares adherentes mediante cultivo durante 5-7 días con M-CSF. Las células fueron cosechadas e incubadas con 10 pg/ml de anticuerpo monoclonal Bll o un anticuerpo de control de isotipo a 4°C. El enlace de anticuerpo humano fue detectado con una sonda de IgG(Fc) anti-humana de cabra marcada con FITC. La fluorescencia asociada con la célula fue determinada mediante análisis utilizando un instrumento FACScalibur con software CellQuest. Células dendriticas fueron incubadas a 4°C con 20 ug/ml del conjugado molecular Bll-Pmel-17 o un control negativo. El enlace con el receptor para mañosa por la porción Bll del conjugado fue detectado con IgG (especifico para Fe) antihumana de cabra conjugada con ficoeritrina (Figura 15). Se detectó un enlace indirecto (a través de Bll) con el receptor para mañosa por parte de la porción de antigeno (Pmel-17) del conjugado con sueros anti-Pmel-17 de conejo, seguido por IgG anti-conejo de cabra conjugada con ficoeritrina. Los resultados que se muestran en las Figuras 15-16, respectivamente, demuestran que el conjugado molecular Bll-Pmel-17 se une a células dendriticas y . enfoca efectivamente el antigeno Pmel-17 hacia tales células. Conclusión Los ejemplos antes mencionados demuestran la generación de anticuerpos monoclonales humanos que reaccionan específicamente con alta afinidad con células dendriticas. En particular, un anticuerpo monoclonal · humano Bll reconoce específicamente el receptor para mañosa de macrófago de ser humano en células dendríticas. Además, el anticuerpo monoclonal humano Bll es internalizado eficientemente por células dendríticas e incremento el procesamiento y presentación de antígeno por células dendríticas. El anticuerpo monoclonal humano E21 se une a un antígeno diferente que Bll en células dendríticas humanas. El anticuerpo E21 reacciona también de manera cruzada con células dendríticas derivadas de macacos cynomolgus (mono) , lo que sugiere que el antígeno E21 se conserva en primates y por consiguiente ofrece un modelo de animal relevante para desarrollos adicionales del anticuerpo. Estos resultados soportan la conclusión que los anticuerpos monoclonales totalmente humanos de la presente invención, incluyendo fragmentos, conjugados y moléculas bi-específicas de los mismos pueden utilizarse para el diagnóstico y tratamiento de padecimientos relacionados con células dendriticas . Equivalentes Las personas con conocimientos en la materia reconocerán o bien podrán determina utilizando solamente experimentos de rutina muchos equivalentes de las modalidades especificas de la invención descrita aquí. Tales equivalentes se contemplan dentro del marco de las reivindicaciones siguientes.
LISTADO DE SECUENCIAS <110> Medarex, Inc. et al. <120> ANTICUERPOS ONOCLONALES HUMANOS PARA CÉLULAS DENDRÍTICAS <130> MXI-166CPPC <150> U3SN 10/035,637 <151> 2001-11-07 <150> USSN 09/851,614 <151> 2001-05-08 <150> USSN 60/203,126 <151> 2000-05-08 <150> USSN 60/230,739 <151> 2000-09-07 <160> 9 <170> FastSEQ for Windows Versión 4.0 <210> 1 <211> 321 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS ' <222> (1) ... (321) <400> 1 gac ate cag atg acc cag tct cea tcc tea ctg tct gca tct gta gga 48 Asp lie Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 gac aga gtc acc ate act tgt cgg gcg agt cag ggt att age agg tgg 96 Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly lie Ser Arg Trp 20 25 30 tta gee tgg tat cag cag aaa cea gag aaa gee ect aag tcc ctg ate 144 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu lie 35 40 45 tat gct gca tcc agt ttg caá agt ggg gtc cea tea agg ttc age ggc 192 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 · 55 60 agt gga tct ggg acá gat ttc act etc acc ate age ggc ctg cag ect 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Gly Leu Gln Pro 65 70 75 80 gaa gat ttt gca act tat tac tgc caá cag tat aat agt tac cct cgg 288 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg 85 90 95 acg ttc ggc caá ggg acc aag gtg gaa ate aaa 321 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 <210> 2 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Asp lie Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly lie Ser Arg Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu lie 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Gly Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 <210> 3 <211> 348 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1) ... (348) <400> 3 gag gtg cag ctg gtg cag cct gga gca gag gtg aaa aag ecc ggg gag 48 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly.Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 tet ctg agg ate tec tgt aag ggt tet gga gac agt ttt acc acc tac '^6 Ser Leu Arg lie Ser Cys Lys Gly Ser Gly Asp Ser Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 tgg ate ggc tgg gtg ecc cag atg ecc ggg aaa ggc ctg gag tgg atg 144 Trp lie Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 ggg ate ate tat cct ggt gac tet gat acc ata tac age ceg tec ttc 192 Gly lie lie Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr lie Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 caá ggc cag gtc acc ate tea gcc gac aag tec ate age acc gcc tac 240 Glu Gly Gln Val Thr lie Ser Ala Asp Lys Ser lie Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 ctg cag tgg age age ctg aag gcc tcg gac acc gcc atg tat tac tgt 288 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 acg aga ggg gac cgg ggc gtt gac tac tgg ggc cag gga acc ctg gtc 336 Thr Arg Gly Asp Arq Gly Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 acc gtc tec tea 348 Thr Val Ser Ser 115 <210> 4 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Glu Val Gln Leu Val Glr. Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg lie Ser Cys Lys Gly Ser Gly Asp Ser Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Trp lie Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly lie lie Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr lie Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr lie Ser Ala Asp Lys Ser lie Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Gly Asp Arg Gly Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 5 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANT <222> (1) ... (15) <223> Xaa = cualquier aminoácido <400> 5 Asp Asp Xaa Xaa Gln Phe Leu lie Xaa Xaa Glu Asp Xaa Lys Arg 1 10 15 <210> 6 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Leu Asp Thr Arg Gln Phe Leu lie Tyr Asn Glu Asp His Lys Arg 1 5 10 15 <210> 7 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Leu Leu Asp Thr Arg Gln Phe Leu He Tyr Leu Glu Asp Thr Lys Arg 1 5 10 15 Cys Val Asp Ala 20 <210> 8 <211> 23770 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (16489) ... (17094) <400> 8 cgatgtacgg gccagatata cgcgttgaca ttgattattg actagttatt aatagtaatc 60 aattacgggg gctacatgcc cggtctatat gcgcaactgt aactaataac tgatcaataa 120 ttatcattag ttaatgcccc tcattagttc atagcccata tatggagttc cgcgttacat 180 aacttacggt aaatggcccg cctggctgac agtaatcaag tatcgggtat atacctcaag 240 gcgcaatgta ttgaatgcca tttaccgggc ggaccgactg cgcccaacga cccccgccca 300 ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt gcgggttgct 360 gggggcgggt aactgcagtt attactgcat acaagggtat cattgcggtt atccctgaaa 420 ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt 480 gtatcatatg ggtaactgca gttacccacc tcataaatgc catttgacgg gtgaaccgtc 540 atgtag'ttca catagtatac ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc 600 ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct ggttcatgcg ggggataact gcagttactg 660 ccatttaccg ggcggaccgt aatacgggtc atgtactgga tatgggactt tcctacttgg 720 cagtacatct acgtattagt catcgctatt accatggtga tgcggttttg ataccctgaa 780 aggatgaacc gtcatgtaga tgcataatca gtagcgataa tggtaccact acgccaaaac 840 gcagtacatc aatgggcgtg gatagcggtt .tgactcacgg ggatttccaa gtctccaccc 900 cattgacgtc cgtcatgtag ttacccgcac ctatcgccaa actgagtgcc cctaaaggtt 960 cagaggtggg gtaactgcag aatgggagtt tgttttggca ccaaaatcaa cgggactttc 1020 caaaatgtcg taacaactcc gccccattga ttaccctcaa acaaaaccgt ggttttagtt 1080 gccctgaaag gttttacagc attgttgagg cggggtaact cgcaaatggg cggtaggcgt 1140 gtacggtggg aggtctatat aagcagagct ctctggctaa ctagagaacc gcgtttaccc 1200 gccatccgca catgccaccc tccagatata ttcgtctcga gagaccgatt gatctcttgg 1260 cactgcttac tggcttatcg aaattaatac gactcactat agggagaccc aagctgatcc 1320 actagtaacg gtgacgaatg accgaatagc tttaattatg ctgagtgata tccctctggg 1380 ttcgactagg tgatcattgc gccgccagtg tgctggaatt agcttgccgc caccatggga 1440 tggagctgta tcatcctgtt cctcgtggcc cggcggtcac acgaccttaa tcgaacggcg 1500 gtggtaccct acctcgacat agtaggacaa ggagcaccgg acagcaaccg gtgtccactc 1560 cgacatccag atgacccagt ctccatcctc actgtctgca tctgtaggag tgtcgttggc 1620 cacaggtgag gctgtaggtc tactgggtca gaggtaggag tgacagacgt agacatcctc 1680 acagagtcac catcacttgt cgggcgagtc agggtattag caggtggtta gcctggtatc 1740 agcagaaacc tgtctcagtg gtagtgaaca gcccgctcag tcccataatc gtccaccaat 1800 cggaccatag tcgtctttgg agagaaagcc cctaagtccc tgatctatgc tgcatccagt 1860 ttgcaaagtg gggtcccatc aaggttcagc tctctttcgg ggantcaggg. áctagatacg 1S20 acgtaggtca aacgtttcac cccagggtag ttccaagtcg ggcagtggat ctgggacaga 1980 tttcactctc accatcagcg gcctgcagcc tgaagatttt gcaacttatt ccgtcaccta 2040 gaccctgtct aaagtgagag tggtagtcgc cggacgtcgg acttctaaaa cgttgaataa 2100 actgcoaaca gtataatagt taccctcgga cgttcggcca agggaccaag gtggaaatca 2160 aacgtacggt tgacggttgt catattatca atgggagcct gcaagccggt tccctggttc 2220 cacctttagt ttgcatgcca ggcggcgcca tctgtcttca tcttcccgcc atctgatgag 2280 cagttgaaat ctggaactgc ctctgttgtg ccgccgcggt agacagaagt agaagggcgg 2340 tagactactc gtcaacttta gaccttgacg gagacaacac tgcctgctga ataacttcta 2400 tcccagagag gccaaagtac agtggaaggt ggataacgcc ctccaatcgg .acggacgact 2460 tattgaagat agggtctctc cggtttcatg tcaccttcca cctattgcgg gaggttagcc 2520 gtaactccca ggagagLgtc acagagcagg ácagcaagga cagcacctac agcctcagca 2580 gcaccctgac cattgagggt cctctcacag tgtctcgtcc tgtcgttcct gtcgtggatg 2640 tcggagtcgt cgtgggactg gctgagcaaa gcagactacg agaaacacaa agtcta'cgcc 2700 tgcgaagtca cccatcaggg cctgagctcg cgactcgttt cgtctgatgc tctttgtgtt 2760 tcagatgcgg acgcttcagt gggtagtccc ggactcgagc cccgtcacaa agagcttcaa 2820 caggggagag tgttagggat ccactagtcc agtgtggtgg aattctgcag gggcagtgtt 2880 tctcgaagtt gtcccctctc acaatcccta ggtgatcagg tcacaccacc ttaagacgtc 2940 atatccagca cagtggcggc; cggccgctcg actattctat agtgtcacct aaatgctaga 3000 gctcgctgat tataggtcgt gtcaccgccg gccggcgagc tgataagata tcacagtgga 3060 tttacgatct cgagcgacta cagcctcgac tgtgccttct agttgccagc catctgttgt 3120 Utgcccctcc cccgtgcctt ccttgaccct gtcggagctg acacggaaga tcaacggtcg 3180 gtagacaaca aacggggagg gggcacggaa ggaactggga ggaaggtgcc actcccactg 3240 tcctttccta ataaaatgag gaaattgcat cgcattgtct gagtaggtgt ccttccacgg 3300 tgagggtgac aggaaaggat tattttactc ctttaacgta gcgtaacaga ctcatccaca 3360 cattctattc tggggggtgg ggtggggcag gacagcaagg gggaggattg ggaagacaat 3420 agcaggcatg gtaagataag accccccacc ccaccccgtc ctgtcgttcc ccctcctaac 3480 ccttctgtta tcgtccgtac ctggggatgc ggtgggctct atggcttctg aggcggaaag 3540 aaccagctgg ggctctaggg ggtatcccca gacccctacg ccacccgaga taccgaagac 3600 tccgcctttc ttggtcgacc ccgagatccc ccataggggt cgcgccctgt agcggcgcat 3660 taagcgcggc gggtgtggtg gttacgcgca gcgtgaccgc tacacttgcc gcgcgggaca 3720 tcgccgcgta attcgcgccg cccacaccac caatgcgcgt cgcactggcg atgtgaacgg 3780 agcgccctag cgcccgctcc tttcgctttc ttcccttcct ttctcgccac gttcgccggc 3840 tttccccgtc tcgcgggatc gcgggcgagg aaagcgaaag aagggaagga aagagcggtg 3900 caagcggccg aaaggggcag aagctctaaa tcgggggctc cctttagggt tccgatttag -3960 tgctttacgg cacctcgacc ccaaaaaact ttcgagattt agcccccgag ggaaatccca 4020 aggctaaatc acgaaatgcc gtggagctgg ggttttttga tgattagggt gatggttcac 4080 gtagtgggcc atcgccctga tagacggttt ttcgcccttt gacgttggag actaatccca 4140 ctaccaagtg catcacccgg tagcgggact atctgccaaa aagcgggaaa ctgcaacctc 4200 tccacgttct ttaatagtgg actcttgttc caaactggaa caacactcaa ccctatctcg 4260 gtctattctt aggtgcaaga aattatcacc tgagaacaag gtttgacctt gttgtgagtt 4320 gggatagagc cagataagaa ttgatttata agggattttg ccgatttcgg cctattggtt 4380 aaaaaatgag ctgatttaac aaaaatttaa- aactaaatat tccctaaaac ggctaaagcc 4440 ggataaccaa ttttttactc gactaaattg tttttaaatt cgcgaattaa ttctgtggaa 4500 tgtgtgtcag ttagggtgtg gaaagtcccc aggctcccca gcaggcagaa gcgcttaatt 4560 aagacacctt acacacagtc aatcccacac ctttcagggg tccgaggggt cgtccgtctt 4620 gtatgcaaag catgcatctc aattagtcag caaccaggtg tggaaagtcc ccaggctccc 4680 cagcaggcag catacgtttc gtacgtagag ttaatcagtc gttggtccac acctttcagg 4740 ggtccgaggg gtcgtccgtc aagtatgcaa agcatgcatc tcaattagtc agcaaccata 4800 gtcccgcccc taactccgcc catcccgccc ttcatacgtt tcgtacgtag agttaatcag 4860 tcgttggtat cagggcgggg attgaggcgg gtagggcggg ctaactccgc ccagttccgc 4920 ccattctccg ccccatggct gactaatttt ttttatttat gcagaggccg gattgaggcg 4980 ggtcaaggcg ggtaagaggc ggggtaccga ctgattaaaa aaaataaata cgtctccggc 5040 aggccgcctc tgcctctgag ctattccaga agtagtgagg aggctttttt ggaggcctag 5100 gcttttgcaa tccggcggag acggagactc gataaggtct tcatcactcc tccgaaaaaa 5160 cctccggatc cgaaaacgtt aaagctcccg ggagcttgta tatccatttt cggatctgat 5220 caagagacag gatgaggatc gtttcgcatg tttcgagggc cctcgaacat ataggtaaaa 5280 gcctagacta gttctctgtc ctactcctag caaagcgtac attgaacaag atggattgca 5340 cgcaggttct ccggccgctt gggtggagag gctattcggc tatgactggg . taacttgttc 5400 • tacctaacgt gcgtccaaga ggccggcgaa cccacctctc cgataagccg atactgaccc 5460 cacaacagac aatcggctgc tctgatgccg ccgtgttccg gctgtcagcg caggggcgcc 5520 •cggttctttt gtgttgtctg ttagccgacg agactacggc ggcacaaggc cgacagtcgc 5580 gtccccgcgg gccaagaaaa tgtcaagacc gacctgtccg gtgccctgaa tgaactgcag 5640 i;.gacgaggcag cgcggctatc gtggctggcc acagttctgg ctggacaggc cacgggactt 5700 .acttgacgtc ctgctccgtc gcgccgatag caccgaccgg acgacgggcg ttccttgcgc 5760 ¦ agctgtgctc gacgttgtca ctgaagcggg aagggactgg ctgctattgg tgctgcccgc 5820 aaggaacgcg tcgacacgag ctgcaacagt gacttcgccc ttccctgacc gacgataacc 5880 gcgaagtgcc ggggcaggat ctcctgtcat ctcaccttgc tcctgccgag aaagtatcca 5940 tcatggctga cgcttcacgg ccccgtccta gaggacagta gagtggaacg aggacggctc 6000 tttcataggt agtaccgact tgcaatgcgg cggctgcata cgcttgatcc ggctacctgc 6060 ;ccattcgaccT~accaagcgaa acatcgcatc acgttacgcc gccgacgtat gcgaactagg 6120 !ccgatggacg ggtaagctgg tggttcgctt tgtagcgtag gagcgagcac gtactcggat 6180 ggaagccggt cttgtcgatc aggatgatct ggacgaagag c'atcaggggc ctcgctcgtg 6240 catgagccta ccttcggcca gaacagctag tcctactaga cctgcttctc gtagtccccg 6300 tcgcgccagc cgaactgttc gccaggctca aggcgcgcat gcccgacggc gaggatctcg 6360 tcgtgaccca agcgcggtcg gcttgacaag cggtccgagt tccgcgcgta cgggctgccg 6420 ctcctagagc agcactgggt tggcgatgcc tgcttgccga atatcatggt ggaaaatggc 6480 cgcttttctg gattcatcga..ctgtggccgg accgctacgg acgaacggct tatagtacca 6540 ccttttaccg gcgaaaagac ctaagtagct gacaccggcc ctgggtgtgg cggaccgcta 6600 tcaggacata gcgttggcta cccgtgatat tgctgaagag cttggcggcg gacccacacc 6660 gcctggcgat agtcctgtat cgcaaccgat gggcactata acgacttctc gaaccgccgc 6720 aatgggctga ccgcttcctc gtgctttacg gtatcgccgc tcccgattcg cagcgcatcg 6780 ccttctatcg ttacccgact ggcgaaggag cacgaaatgc catagcggcg agggctaagc 6840 gtcgcgtagc ggaagatagc ccttcttgac gagttcttct gagcgggact ctggggttcg 6900 aaatgaccga ccaagcgacg cccaacctgc ggaagaactg ctcaagaaga ctcgccctga 6960 gaccccaagc tttactggct ggttcgctgc gggttggacg catcacgaga tttcgattcc 7020 accgccgcct tctatgaaag gttgggcttc ggaatcgttt tccgggacgc gtagtgctct 7080 aaagctaagg tggcggcgga agatactttc caacccgaag ccttagcaaa aggccctgcg 7140 cggctggatg atcctccagc gcggggatct catgctggag ttcttcgccc accccaactt 7200 gtttattgca gccgacctac taggaggtcg cgcccctaga gtacgacctc aagaagcggg 7260 tggggttgaa caaataacgt gcttataatg gttacaaata aagcaatagc atcacaaatt 7320 tcacaaataa agcatttttt tcacctggtt cgaatattac caatgtttat ttcgttatcg 7380 tagtgtttaa agtgtttatt tcgtaaaaaa agtggaccaa ctttccgcct cagaagccat 7440 agagcccacc gcatccccag catgcctgct attgtcttcc caatcctccc gaaaggcgga 7500 gtcttcggta tctcgggtgg cgtaggggtc gtacggacga taacagaagg gttaggaggg 7560 ccttgctgtc ctgccccacc ccacccccca gaatagaatg acacctactc agacaatgcg 7620 atgcaatttc ggaacgacag gacggggtgg ggtggggggt cttatcttac tgtggatgag 7680 tctgttacgc tacgttaaag ctcattttat taggaaagga cagtgggagt ggcaccttcc 7740 agggtcaagg aaggcacggg ggaggggcaa gagtaaaata atcctttcct gtcaccctca 7800 ccgtggaagg tcccagttcc ttccgtgccc cctccccgtt acaacagatg gctggcaact 7860 agaaggcaca gtcgaggctg atcagcgagc tctagcattt aggtgacact tgttgtctac 7920 cgaccgttga tcttccgtgt cagctccgac tagtcgctcg agatcgtaaa tccactgtga 7980 atagaatagg gccctctagg atccgcggcc gcttatcatg tgagaagaat cccaggcaca 8040 ggcatgataa tatcttatcc cgggagatcc taggcgccgg cgaatagtac actcttctta 8100 gggtccgtgt ccgtactatt gctgggtgct gaccactgcc aggctgttgg tatcagccag 8160 agacacattg aggcagtatg tccccgagcc cgacccacga ctggtgacgg tccgacaacc 8220 atagtcggtc tctgtgtaac tccgtcatac aggggctcgg acccttcagt atctggtgca 8280 gaaccagctg gcaggctggg ctgggtagca caggctggca cagccgctgg tgggaagtca 8340 tagaccacgt cttggtcgac cgtccgaccc gacccatcgt gtccgaccgt gtcggcgacc 8400 gcagggggct ggcaccctgg cgatgagatc tccatgcagg cttccttggg cagcccgcct 8460 tggcaggaca cgtcccccga ccgtgggacc gctactctag aggtacgtcc gaaggaaccc 8520 gtcgggcgga accgtcctgt cagtcagctc aaatgcatcc ccctcaccgg acggcacagc 8580 ctgcaggatc tcggcacttt caataccctg gtcagtcgag tttacgtagg gggagtggcc 8640 tgccgtgtcg gacgtcctag agccgtgaaa gttatgggac gacaatgtcc agggtgacgg 8700 aaaaggaacc atatcgatac agaacacaat ccagggggac ttgtctcttc ctgttacagg 8760 tcccactgcc ttttccttgg tatagctatg tcttgtgtta ggtccccctg aacagagaag 8820 accagcctta aggtggctgt accatccagc agggggccca gggaacctgt aatactttcc 8880 gtagacatga tggtcggaat tccaccgaca tggtaggtcg tcccccgggt cccttggaca 8940 ttatgaaagg catctgtact ttgagctggc atctggacct tcaggctcag ggataggtag 9000 ctctctagct gtggtctcca cccactctgt aactcgaccg tagacctgga agtccgagtc 9060 cctatccatc gagagatcga caccagaggt gggtgagaca agttgttacc tgtgcagctg 9120 tggttccaga aagcaccaca attgatacct ctgcaggtgt catacctgta tcaacaatgg 9180 acacgtcgac accaaggtct ttcgtggtgt taactatgga gacgtccaca gtatggacat 9240 gcctctggag ttgacatctc tgccagtgtg gtacccatga cctctgaaac tggcaccttc 9300 tcaggtgtca cggagacctc aactgtagag acggtcacac catgggtact 'ggagactttg 9360 accgtggaag agtccacagt tacctgtgct ctctgcagtt ggcatctgca caggtgcagt 9420 gcttatgact tcagtggttg gcacctgcac atggacacga gagacgtcaa ecgtagacgt 9480 gtccacgtca cgaatactga agtcaccaac cgtggacgtg agatgtggtt ccagagggct 9540 ctgcagttgg cgcctgacca ggtgtagtac ccacaacttc tgtagtaggc tctacaccaa 9600 ggtctcccga gacgtcaacc gcggactggt ccacatcatg ggtgttgaag- acatcatccg 966Q acttggccag ctgtggtgtc aggggcctct gcagttggcc tgtgcccatc tgtggtgcct 9720 ggaactgggg ügaaccggtc gacaccacaa tccccggaga cgtcaaccgg acacgggtag 9780 acaccacgga ccttgacccc aggagccaca ggaggtgaga ggaatggcag cctgcaggac 9840 cacctgggca gtgactgggc caggctccag tcctcggtgt cctccactct ccttaccgtc 9900 ggacgtcctg gtggacccgt cactgacccg gtccgaggtc gtaagtatga gtgaccacaa 9960 gtgcccgaga gatcagggt. ccactactgt ctccaaagtc ccaggtgtag cattcatact 10020 cactggtgtt cacgggctc- ctagtcccaa ggtgatgaca gaggtttcag ggtccacatc 10080 gagaggtcag cttcagccag atagccactg gggtcatgga gctggagggc aaaggtcaga 10140 ggctgatttc ctctccagtc gaagtcggtc tatcggtgac cccagtacct cgacctcccg 10200 tttccagtct ccgactaaag tcaggaagtg cttgttccct ccatccaagg cccgcaactg 10260 ggacacgctc acggagaaag gcacctggtc agtccttcac gaacaaggga ggtaggttcc 10320 gggcgttgac cctgtgcgag tgcctctttc cgtggaccag agtaatggtg aaggctgagc 10380 tggaatgagc aagaggcaca tagctccggg atccccggcg atggtagaca tcattaccac 10440 ttccgactcg accttactcg ttctccgtgt atcgaggccc taggggccgc taccatctgt 10500 gtcacttcca ^ggtctgtc- gcccagcatt gccctgcctg tcocaatgct cagcccagac 10560 actgggcccc cagtgaagc; accacacaca cgggtcgtaa cgggacggac agggttacga 10620 gtcgggtctg tgacccgggg ctagaacttg ccagtattgg ccccaggtct tccagacata 10680 aacaaagctt ctcttctgag accaagagcc gatcttgaac ggtcataacc ggggtccaga 10740 aggtctgtat ttgtttcgaa gagaagactc tggttctcgg agatgggcaa -ggtccaccat 10800 cagggaagat gcaggcatcg tcagtttcct ggggatacac tggctgtcct tctacccgtt 10860 ccaggtggta gtcccrtcta cgtccgtagc agtcaaagga cccctatgtg accgacagga 10920 ccccacacct ggctcccat" gatgatggta ttgttgaccc agataacctg cccatctggc 10980 :aatacctttt ggggtgtgga ccgagggtaa ctactaccat aacaactggg tctattggac 11040 gggtagaccg ttatggaaaa ggcttccagg gaagttcaag gcaatagaga aggaggcatt 11100 tgcaccaatc agtgtaggcc catcattact ccgaaggtcc cttcaagttc cgttatctct 11160 tcctccgtaa acgtggttag tcacatccgg gtagtaatga gaccttgagg gacacttgac 11220 cacctctcca gcagtcaagt ctctgggctt ctgtccactc tggatacagc ctggaactcc 11280 ctgtgaactg gtggsgaggt cgtcagttca gagacccgaa gacaggtgag acctatgtcg 11340 tgcctgttcc aggccttggz tctgagttgc cttgagacac caagccagtc ctggtttctg 11400 ggtactttgc acggacaagg tccgaaacca agactcaacg gaactctgtg gttcggtcag 11460 gaccaaagac ccatgaaacg tcgagccttt acccggagac agggagaggc tcttctgcgt 11520 gtagtggttg tgcagagccr catgcatcac agctcggaaa tgggcctctg tccctctccg 1-1580 agaagacgca catcaccaac acgtctcgg'á gtacgtagtg ggagcatgag aagacgttcc 11640 cctgctgcca cctgctcttg tccacggtga gcttgctgta gaggaagaag cctcgtactc 11700 ttctgcaagg ggaccacggc ggacgagaac aggtgccact cgaacgacat ctccttcttc 11760 gagccgtcgg agtccagcac gggaggcgtg gtcttgtagt tgttctccgg ctgcccattg 11820 ctctcccact ctcggcagc tcaggtcgtg ccctccgcac cagaacatca acaagaggcc 11880 gacgggtaac gagagggt a ccacggcgat gtcgctggga tagaagcctt tgaccaggca 11940 ggtcaggctg acctggttcc tggtcagctc ggtgccgcta cagcgaccct atcttcggaa 12000 actggtccgt ccag.ccgac tggaccaaga accagtcgag atcccgggat gggggcaggg 12060 tgtacacctg -ggt- tcgg ggctgccctt tggctttgga gatggttttc tagggcccta 12120 cccccgtccc acatj-ggás accaagagcc ccgacgggaa accgaaacct ctaccaaaag 12180 tcgatggggg ctggnagggc tttgttggag accttgcact tgtactcctt gccattcagc 12240 cagtcctggt agctscccc gaccctcccg aaacaacctc tggaacgtga acatgaggaa 12300 cggtaagtcg gtcargaccs gcaggacggt gaggacgctg accacacggt acgtgctgtt 12360 gtactgctcc tcccgcggc- ttgtcttggc cgtcctgcca ctcctgcgac tggtgtgcca 12420 tgcacgacaa catgacgagg agggcgccga aacagaaccg attatgcacc tccacgccgt 12480 ccacgtacca gttgaactcg acctcagggt cttcgtggct cacgtccacc taatacgtgg 12540 aggtgcggca ggtgcatgc caacttgaac tggagtccca gaagcaccga gtgcaggtgg 12600 accacgcatg cgacctcacg ggtccgggag atcatgaggg tgtccttggg ttttgggggg .12660 aagaggaaga tggtgcgtac actggagtcc ccaggccctc tagtactccc acaggaaccc 12720 aaaacccccc ttctccttct ctgacggtcc ccccaggagt tcaggtgctg ggcacggtgg 12780 gcatgtgtga gttttgtcac aagatttggg gactgccagg ggggtcctca agtccacgac 12840 ccgtgccacc cgtacacaot caaaacagtg ttctaaaccc ctcaactttc ttgtccacct 12900 tggtgttgct gggcrtgtga ttcacgttgc agatgtaggt ctgggtgccc gagttgaaag 12960 aacaggtgga accacaacga cccgaacact aagtgcaacg tctacatcca gacccacggg 13020 aagctgctgg agggcacggt csccacgctg ctgagggagt agagtcctga ggactgtagg 13080 acagccggga ttcgacgacc tcccgtgccá gtggtgcgac gactccctca tctcaggact 13140 cctgacatcc tgtcggccct acgtgtgcac gccgctggtc agggcgcctg agttccacga 13200 caccgtcacc ggctcgggca agtagtcctt tccacacgtg cggcgaccag tcccgcggac 13260 tcaaggtgct gtggcagtgg ccgagcccct tcatcaggaa gaccaggcag cccagggccg 13320 ctgtgccccc agaggtgctc ttggaggagg gtgccagggg gaagaccgat ctggtccgtc 13380 gggtcccggc gacacggggg tctccacgag aacctcctcc cacggtcccc cttctggcta 13440 gggcccttgg tgctagctga ggagacggtg accagggttc cctggcccca gtagtcaacg 13500 ccccggtccc cccgggaacc acgatcgact cctctgccac tggtcccaag ggaccggggt 13560 catcagttgc ggggccaggg ctctcgtaca gtaatacatg gcggtgtccg aggccttcag 13620 gctgctccac tgcaggtagg cggtgctgat gagagcatgt cattatgtac cgccacaggc 13680 tccggaagtc cgacgaggtg acgtccatcc gccacgacta ggacttgtcg gctgagatgg 13740 tgacctggcc ttggaaggac gggctgtata tggtatcaga gtcaccagga cctgaacagc 13800 cgactctacc actggaccgg aaccttcctg cccgacatat accatagtct cagtggtcct 13860 tagatgatcc ccatccactc caggcctttc ccgggcatct ggcgcaccca gccgatccag 13920 taggtggtaa atctactagg ggtaggtgag gtccggaaag ggcccgtaga ccgcgtgggt 13980 cggctaggtc atccaccatt aactgtctcc agaaccctta caggagatcc tcagagactc 14040 cccgggcttt ttcacctctg ctccagactg ttgacagagg tcttgggaat gtcctctagg 14100 agtctctgag gggcccgaaa aagtggagac gaggtctgac caccagctgc acctcagagt 14160 ggacaccggt tgctgtggcc acgaggaaca ggatgataca gctccatccc gtggtcgacg 14220 tggagtctca cctgtggcca acgacaccgg tgctccttgt cctactatgt cgaggtaggg 14280 atggtggcgg caagcttggg tctccctata gtgagtcgta ttaátttcga taagccagta 14340 agcagtgggt taccaccgcc gttcgaaccc agagggatat cactcagcat aattaaagct 14400 attcggtcat tcgtcaccca tctctagtta gccagagagc tctgcttata tagacctccc "14460 accgtacacg cctaccgccc atttgcgtca agagatcaat cggtctctcg agacgaatat 14520 atctggaggg tggcatgtgc ggatggcggg taaacgcagt atggggcgga gttgttacga 14580 cattttggaa agtcccgttg attttggtgc caaaacaaac tcccattgac taccccgcct 14640 caacaatgdt gtaaaacctt tcagggcaac taaaaccacg gttttgtttg agggtaactg 14700 gtcaatgggg tggagacttg gaaatccccg tgagtcaaac cgctatccac gcccattgat 14760 gtactgccaa cagttacccc acctctgaac ctttaggggc actcagtttg gcgataggtg 14820 cgggtaacta catgacggtt aaccgcatca ccatggtaat agcgatgact aatacgtaga 14880 tgtactgcca agtaggaaag tcccataagg ttggcgtagt ggtaccatta tcgctactga 14940 ttatgcatct acatgacggt tcatcctttc agggtattcc tcatgtactg ggcataatgc 15000 caggcgggcc atttaccgtc attgacgtca atagggggcg tacttggcat agtacatgac 15060 ccgtattacg gtccgcccgg taaatggcag taactgcagt tatcccccgc atgaaccgta 15120 atgatacact tgatgtactg ccaagtgggc agtttaccgt aaatactcca cccattgacg 15180 tcaatggaaa tactatgtga actacatgac ggttcacccg tcaaatggca tttatgaggt 15240 gggtaactgc agttaccttt gtccctattg' gcgttactat gggaaca~ac grcattattg 15300 acgtcaatgg gcgggggtcg ttgggcggtc cagggataac cgcaatgata cccttgtatg 15360 cagtaataac tgcagttacc cgcccccagc aacccgccag agccaggcgg gccatttacc 15420 gtaagttatg taacgcggaa ctccatatat gggctatgaa ctaatgaccc tcggtccgcc 15480 cggtaaatgg cattcaatac attgcgcctt gaggtata a cccgatactt gattactggg 15540 cgtaattgat tactattaat aactagtcaa taatcaatgt caacgcgrat atctggcccg 15600 tacatcgcat gcattaacta atgataatta ttgatcag-t at agttaca gttgcgcata 15660 tagaccgggc atgtagcgta tctagttgtg gtt gtccaa ac~catc=at gtatcttatc 15720 atgtctgtat accgtcgacc tctagctaga agatcaacac caaacagg t tgagtagtta 15780 catagaatag tacagacata tugcagctgg aga cgatct gc tggcgta atcatggtca 15840 tagctgtttc ctgtgtgaaa ctgttatccg ctcacaattc cacacaacat cgaaccgcat 15900 tagtaccagt atcgacaaag gacacacttt aacaataggc gagtgtcaag grgtgttgta 15960 acgagccgga agcataaaqt guaaagcctg ggctgcctaa tgagtgagct aactcacatt 15020 aattgcgttg tgctcggcct tcgtatttca catttcggac cccacggatt actcactcga 16080 ttgagtgtaa ttaacgcaac cgctcactgc ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc 16140 agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg gcgagtgacg ggcgaaaggt cagccctttg 16200 gacagcacgg tcgacgtaat tacttagccg gttgcgcgcc ggagaggcgg tttgcgtatt 16260 gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgt cg cctctccgcc 16320 aaacgcataa cccgcgagaa ggcgaaggag cgagtgactg agcgacg ga gccagcaagc 16380 gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaara cggttatcca cagaatcagg 16440 ggataacgca cgacgccgct cgccatagtc gagtgagttt ccgccatt atg cea ata 16497 Met Pro lie ggt gtc tta gtc ecc tat tgc gtg gaa aga acá tgt gag caá aag gee Gly Val Leu Val Pro Tyr Cys Val Glu Arg Thr Cys Glu Gln Lys Ala 5 10 15 age aaa agg cea gga acc gta aaa agg ceg cgt tgc tgg cgt ttt ect Ser Lys Arg Pro Gly Thr Val Lys Arg Pro Arg Cys Trp Arg Phe Pro 20 25 30 35 ttc ttg tac act cgt ttt ceg gtc gtt ttc cgg tec ttg gca ttt ttc Phe Leu Ty Thr Arg Phe Pro Val Val Phe Arg Ser Leu Ala Phe Phe 40 45 50 cgg cgc aac gac cgc aaa ate cat agg etc cgc ecc ect gac gag cat 16689 Arg Arg Asn Asp Arg Lys lie His Arg Leu Arg Pro Pro Asp Glu His 55 60 65 cae aaa aat cga cgc tea agt cag agg tgg cga aac ceg acá ggt ate 16737 His Lys Asn Arg Arg Ser Ser Gln Arg Trp Arg Asn Pro Thr Gly lie 70 75 80 cga ggc ggg ggg act gct cgt agt gtt ttt age tgc gag ttc agt etc 16785 Arg Gly Gly Gly Thr Ala Arg Ser Val Phe Ser Cys Glu Phe' Ser Leu 85 90 95 cae cgc ttt ggg ctg agg act ata aag ata cea ggc gtt tec ecc tgg 16833 His Arg Phe Gly Leu Arg Thr lie Lys lie Pro Gly Val Ser Pro Trp 100 105 110 115 aag etc ect cgt gcg etc tec tgt tec gac ect gee gtc ctg ata ttt 16881 Lys Leu Pro Arg Ala Leu Ser Cys Ser Asp Pro Ala Val Leu lie Phe 120 125 130 cta tgg tec gca aag ggg gac ctt cga ggg age acg cga gag gac aag 16929 Leu Trp Ser Ala Lys Gly Asp Leu Arg Gly Ser Thr Arg Glu Asp Lys 140 145 gct ggg acg gee tta ceg gat acc tgt ceg ect ttc tec ctt cgg gaa 16977 Ala Gly Thr Ala Leu Pro Asp Thr Cys Pro Pro Phe Ser Leu Arg Glu 150 155 160 gcg tgg cgc ttt etc ata gct cae gct gta ggt gaa tgg ect atg gac 17025 Ala Trp Arg Phe Leu lie Ala His Ala Val Gly Glu Trp Pro Met Asp 165 170 175 agg cgg aaa gag gga age ect teg cae cgc gaa aga gta teg agt gcg 17073 Arg Arg Lys Glu Gly Ser Pro Ser His Arg Glu Arg Val Ser Ser Ala 180 185 190 195 acá tcc aat ctc agt tcg gtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg 17124 Thr Ser ñsn Leu Ser Ser Val 200 cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgtaga gtcaagccac atccagcaag cgaggttcga 17134 cccgacacac gtgcttgggg ggcaagtcgg gctggcctgc gccttatccg gtaactatcg 17244 tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagacg cggaataggc 17304 cattgatagc agaactcagg ttgggccatt ctgtgctgaa tagcggtgac cgtcgtgcca 17364 ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt 17424 ggcctacggt gaccattgtc ctaatcgtct cgctccatac atccgccacg atgtctcaag 17484 aacttcacca ccggatacta cggctacact agaagaacag tatttggtat ctgcgctctg 17544 ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagtgat gccgatgtga tcttcttgtc ataaaccata 17604 gacgcgagac gacttcggtc aatggaagcc tttttcagtt ggtagctctt gatccggcaa 17664 acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagtcaa- ccatcgagaa 17724 ctaggccgtt tgtttggtgg cgaccatcgc caccaaaaaa acaaacgttc gtcgtcatta 17784 cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc 17844 agtggataat gcgcgtcttt ttttcctaga gttcttctag gaaactagaa aagatgcccc 17904 agactgcgag tcacctacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa 17964 aggatcttca cctagatcct tttaaatgct tttgagtgca attccctaaa accagtactc 18024 taatagtttt tcctagaagt ggatctagga aaatttttaa aaatgaagtt ttaaatcaat 18084 ctaaagtata tatgagtaaa cttggtct'ga cagttaccaa tgcttaaatt tttacttcaa 18144 aatttagtta gatttcatat atactcattt gaaccagact gtcaatggtt acgaatatca 18204 gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg 18264 tcgtgttagt cactccgtgg atagagtcgc tagacagata aagcaagtag gtatcaacgg 18324 actgaggggc agcacaagat aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct 18384 gcaatgatac cgcgagaccc acgctctcta ttgatgctat gccctcccga atggtagacc 18444 ggggtcacga cgttactatg gcgctctggg tgcgagaccg gctccagatt tatcagcaat 18504 aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaacttggc cgaggtctaa 18564 atagtcgtta tttggtcggt cggccttccc ggctcgcgtc ttcaccagga cgttgattat 18624 ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta 18684 atagttaata ggcggaggta ggtcagataa ttaacaacgg cccttcgatc tcattcatca 18744 agcggtcaat tatcaatgcg caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc Í8804 tcgtcgtttg gtatggcttc attcagacgc gttgcaacaa cggtaacgat gtccgtagca 18864 ccacagtgcg agcagcaaac cataccgaag taagtcctcc ggttcccaac gatcaaggcg 18924 agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcgagg ccaagggttg 18984 ctagttccgc tcaatgtact agggggtaca acacgttttt tcgccaatcg aggaagggtc 19044 ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc actcatggtt atggcagcac 19104 tgcataccag gaggctagca acagtcttca ttcaaccggc gtcacaatag tgagtaccaa 19164 taccgtcgtg acgtatattc tcttactgtc atgccatccg taagatgctt ttctgtgact 19224 ggtgagtact caaccaagtc attctgtaag agaatgacag tacggtaggc attctacgaa 19284 aagacactga ccactcatga gttggttcag taagacagaa tagtgtatgc ggcgaccgag 19344 ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca catagctctt atcacatacg 19404 ccgctggctc aacgagaacg ggccgcagtt atgccctatt atggcgcggt gtatcgagaa 19464 ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac 19524 cgctgttctt gaaattttca cgagtagtaa ccttttgcaa gaagccccgc ttttgagagt 19584 tcctagaatg gcgacatgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct 19644 tcagcatctt ttactttcac cagcgtactc" taggtcaagc tacattgggt gagcacgtgg 19704 gttgactaga agtcgtagaa aatgaaagtg gtcgcattct gggtgagcaa aaacaggaag 19764 gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa tgttgaaaga cccactcgtt 19824 tttgtccttc cgttttacgg cgttttttcc cttattcccg ctgtgccttt acaactatac 19884 tcatactctt cctttttcaa tattattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg 19944 gatacatatg agtatgagaa ggaaaaagtt ataataactt cgtaaatagt cccaataaca 20004 gagtactcgc ctatgttatt tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc 20064 acatttcccc gaaaagtgcc acctgaataa acttacataa atctttttat ttgtttatcc 20124 ccaaggcgcg tgtaaagggg cttttcacgg tggactcgtc gacggatcgg gactagagca 20184 ttgggggggg ggacagctca gggctgcgat ttcgcgccaa acttgagcag ctgcctagcc 20244 ctgatctcgt aacccccccc cctgtcgagt cccgacgcta aagcgcggtt tgaactcggc 20304 aatcctagcg tgaaggctgg taggatttta tccccgctgc catcatggtt cgaccattga 20364 actgcagccg ttaggatcgc acttccgacc atcctaaaat aggggcgacg gtagtaccaa 20424 gctggtaact tgacgttcgt cgccgtgtcc caaaatatgg ggattggcaa gaacggagac 20484 ctaccctggc ctccgctcag gaacgaagca gcggcacagg gttttatacc cctaaccgtt 20544 cttgcctctg gatgggaccg gaggcgagtc cttgctgttc aagtacttcc aaagaatgac 20604 cacaacctct tcagtggaag gtaaacagaa tctggtgatt atgggtcaag ttcatgaagg 20664 tttcttactg gtgttggaga agtcaccttc catttgtctt agaccactaa tacccaagga 20724 aaacctggtt ctccattcct gagaagaatc gacctttaaa ggacagaatt aatatagttc 20784 tcagtatcct tttggaccaa gaggtaagga ctcttcttag ctggaaattt cctgtcttaa 20844 ttatatcaag agtcatgaga actcaaagaa ccaccacgag gagctcattt tcttgccaaa 20904 agtttggatg atgccttaag acttatctct tgagtttctt ggtggtgctc ctcgagtaaa 20964 agaacggttt tcaaacctac tacggaattc tgaatatgaa caaccggaat tggcaagtaa 21024 agtagacatg gtttggatag tcggaggcag ttctgtttac caggaaactt gttggcctta 21084 accgttcatt tcatctgtac caaacctatc agcctccgtc aagacaaatg gtccttgcca 21144 tgaatcaacc aggccacctc agactctttg tgacaaggat catgcaggaa tttgaaagtg 21204 acacgtcggt acttagttgg tccggtggag tctgagaaac actgttccta gtacgtcctt 21264 aaactttcac tgtgcatttt cccagaaatt gatttgggga aatataaact tctcccagaa 21324 tacccaggcg tcctctctga ggtccaaaaa gggtctttaa ctaaacccct ttatatttga 21384 agagggtctt atgggtccgc aggagagact ccaggtggag gaaaaaggca tcaagtataa 21444 gtttgaagtc tacgagaaga aagactaaca ggaagatgct ttcaagcctc ctttttccgt 21504 agttcatatt caaacttcag atgctcttct ttctgattgt ccttctacga aagttcttct 21564 ctgctcccct cctaaagcta tgcattttta taagaccatg ggacttttgc tggctttaga 21624 tctttgaaga gacgagggga ggatttcgat acgtaaaaat attctqgtac cctgaaaacg 21684 accgaaatct agaaactgaa ggaaccttac ttctgtggtg tgacataatt ggacaaacta 21744 cctacagaga tttaaagctc taaggtactt ccttggaatg aagacaccac actgtattaa 21804 cctgtttgat ggatgtctct aaatttcgag attccaaaat ataaaatttt taagtgtata 21864 atgtgttaaa ctactgattc taattgtttg tgtattttag attccattta tattttaaaa 21924 attcacatat tacacaattt gatgactaag attaacaaac acataaaatc taaggtacct 21984 atggaactga tgaatgggag cagtggtgga atgcctttaa tgaggaaaac ctgttttgct 22044 cagaagtgga taccttgact acttaccctc gtcaccacct tacggaaatt actccttttg 22104 gacaaaacga gtcttcaaat gccatctagt gatgatgagg ctactgctga ctctcaacat 22164 tctactcctc caaaaaagaa gagaaattta cggtagatca ctactactcc gatgacgact 22224 gagagttgta agatgaggag gttttttctt ctctttggta gaagacccca aggactttcc 22284 ttcagaattg ctaagttttt tgagtcatgc tgtgtttagt aatagaccat cttctggggt 22344 tcctgaaagg aagtcttaac gattcaaaaa actcagtacg acacaaatca ttatctactc 22404 ttgcttgctt tgctatttac accacaaagg aaaaagctgc actgctatac aagaaaatta 22464 tggaaatgag aacgaacgaa acgataaatg tggtgtttcc tttttcgacg tgacgatatg 22524 ttcttttaat acctttaata ttctgtaacc tttataagta ggcataacag ttataatcat 22584 aacatactgt tttttcttac tccacattat aagacattgg aaatattcat ccgtattgtc 22644 aatattagta ttgtatgaca aaaaagaatg aggtgtcagg catagagtgt ctgctattaa 22704 taactatgct caaaaattgt gtacctttag ctttttaatt tgtaaagtcc gtatctcaca 22764 gacgataatt attgatacga gtttttaaca catggaaatc gaaaaattaa acatttgggg 22824 ttaataagga atatttgatg tatagtgcct tgactagaga tcataatcag ccataccaca 22884 tttgtacccc aattattcct tataaactac atatcacgga actgatctct agtattagtc 22944 ggtatggtgt aaacatgagg ttttacttgc tttaaaaaac ctcccacacc tccccctgaa 23004 cctgaaacat aaaatgaatg caattgctcc aaaatgaacg aaattttttg gagggtgtgg 23064 agggggactt ggactttgta ttttacttac gttaacttgt tgttaacttg tttattgcag 23124 cttataatgg ttacaaataa agcaatagca tcacaaattt cacaaaaaca acaattgaac 23184 aaataacgtc gaatattacc aatgtttatt tcgttatcgt agtgtttaaa gtgttttaaa 23244 gcattttttt cactgcattc tagttgtggt ttgtccaaac tcatcaatgt atcttatcat 23304 gtctggattt cgtaaaaaaa gtgacgtaag atcaacacca aacaggtttg agtagttaca 23364 tagaatagta cagaccatct cccgatcccc tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg 23424 atgccgcata gttaagccag tatctgtaga gggctagggg ataccacgtg agagtcatgt 23484 tagacgagac tacggcgtat caattcggtc atagacctcc ctgcttgtgt gttggaggtc 23544 gctgagtagt gcgcgagcaa aatttaagct acaacaaggc aaggctgagg gacgaacaca 23604 caacctccag cgactcatca cgcgctcgtt ttaaattcga tgttgttccg ttccgatgac 23664 cgacaattgc atgaagaatc tgcttagggt taggcgtttt gcgctgcttc gactggctgt 23724 taacgtactt cttagacgaa tcccaatccg caaaacgcga cgaagc 2377C <210> 9 <211> 202 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Met Pro lie Gly Val Leu Val Pro Tyr Cys Val Glu Arg Thr Cys Glu 1 5 10 15 Gln Lys Ala Ser Lys Arg Pro Gly Thr Val Lys Arg Pro Arg Cys Trp 20 25 30 Arg Phe Pro Phe Leu Tyr Thr Arg Phe Pro Val Val Phe Arg Ser Leu 35 40 45 Ala Phe Phe Arg Arg Asn Asp Arg Lys lie His Arg Leu Arg Pro Pro 50 55 60 Asp Glu His His Lys Asn Arg Arg Ser Ser Gln Arg Trp Airg Asn Pro 65 70 75 80 Thr Gly lie Arg Gly Gly Gly Thr Ala Arg Ser Val Phe Ser Cys Glu 85 90 95 Phe Ser Leu His Arg Phe Gly Leu Arg Thr lie Lys lie Pro Gly Val 100 105 110 . Ser Pro Trp Lys Leu Pro Arg Ala Leu Ser Cys Ser Asp Pro Ala Val 115 120 •125 Leu lie Phe Leu Trp Ser Ala Lys Gly Asp Leu Arg Gly Ser Thr Arg 130 135 140 Glu Asp Lys Ala Gly Thr Ala Leu Pro Asp Thr Cys Pro Pro Phe Ser 145 150 155 160 Leu Arg Glu Ala Trp Arg ?he Leu lie Ala His Ala Val Gly Glu Trp 165 170 175 Pro Met Asp Arg Are Lvs 31u Gly Ser Pro Ser His Arg Glu Arg Val 180 185 190 Ser Ser Ala Thr Ser Asr. Leu Ser Ser Val 195 200

Claims (1)

  1. R E I V I N D I C A C I O N E S Un conjugado molecular que comprende un anticuerpo monoclonal humano que se une a células dendriticas enlazadas a un antigeno asociado con melanoma. El conjugado molecular de conformidad con la reivindicación 1, en donde el antigeno asociado con melanoma se selecciona dentro del grupo que consiste de Gp 100 y Pmel-17. Un conjugado molecular que comprende un anticuerpo monoclonal humano que se une a células dendriticas enlazadas a un antigeno asociado con próstata. El conjugado molecular de conformidad con la reivindicación 3, en donde el antigeno asociado con próstata se selecciona dentro del grupo que consiste de PSA y PSMA. El conjugado molecular de conformidad con cualquiera dé las reivindicaciones anteriores, en -donde el anticuerpo comprende un fragmento o un anticuerpo de cadena simple. El conjugado molecular de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde .las células dendriticas son células dendriticas humanas. El conjugado molecular de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el anticuerpo comprende una región variable seleccionada dentro del grupo que consiste de una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2, una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 4, y modificaciones conservadoras de estas secuencias. El conjugado molecular de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el anticuerpo comprende una región variable seleccionada dentro del grupo que consiste de una región variable de cadena pesada codificada por la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 1, una región variable de cadena ligera codificada por la secuencia de nucleótidos mostradas . en SEQ ID NO: 3, y modificaciones conservadoras de estas secuencias. El conjugado molecular de conformidad con cualquiera dé las reivindicaciones anteriores, codificado por la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 8. El conjugado molecular de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 9. Una composición que comprende un conjugado molecular de cualquiera de las reivindicaciones precedentes y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La composición de conformidad con la reivindicación 11, que comprende además un adyuvante. 13. Un método para enfocar un antigeno hacia una célula dendritica, dicho método comprende la puesta en contacto de la célula con un conjugado molecular de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores . 14. Un método para inducir o incrementar una respuesta inmune contra un antigeno en un sujeto, dicho método comprende la administración al sujeto de un conjugado molecular de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores. 15. El método de conformidad con la reivindicación 14, en donde la respuesta inmune comprende la presentación del antigeno como componente de un conjugado MHC-I o MHC-II. 16. Un método para inmunizar un sujeto, dicho método comprende la administración al sujeto de un conjugado molecular de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores. 17. El método de conformidad con la reivindicación 16, en donde el conjugado molecular se administra en una cantidad suficiente para inducir la liberación de citocinas por células dendriticas.
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