PRODUCCIÓN DE DERIVADOS DE QUERATINA SOLUBLES
CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiera a un procedimiento para la preparación de derivados de queratina de fuentes animales tales como, lana, pelo, cuernos, pezuñas, plumas y escamas por medio de un procedimiento adecuado económica y ambientalmente y para una serie de productos derivados de queratina producidos de ese modo. Algunos de los derivados de queratina son solubles y se pueden usar en la producción de una variedad de materiales de biopolímero. ANTECEDENTES DE LA INVENCION Queratinas son de una clase de proteínas estructurales ampliamente representada en estructuras biologías, especialmente en tejidos epiteliales de vertebrados superiores. Las queratinas se pueden dividir en dos clases principales, las queratinas suaves (que ocurren en piel y otros pocos tejidos) y las queratinas duras, que forman el material de las uñas, garras, pelo, cuerno, plumas y escamas . La dureza e insolubilidad de las queratinas duras, que les permiten llevar a cabo un rol estructural fundamental en muchos sistemas biológicos, son también características deseable en muchos de los materiales industríales y de consumo actualmente derivados de polímeros sintéticos. Ref. No.: 152988 Además de poseer propiedades físicas excelentes, la queratina, como una proteína, es un material con un alto grado de funcionalidad química y, consecuentemente, exhibe muchas propiedades que los materiales sintéticos no pueden lograr. La queratina es, por lo tanto, muy adecuada para el desarrollo de productos con aplicaciones de mercado altamente especializado de alto valor. La queratina es también un polímero ambientalmente aceptable producido de un recurso sostenible y por lo tanto tiene beneficios ambientales sobre los materiales sintéticos. Siguiendo la tendencia global de desarrollar materiales de recursos renovables producidos en un procedimiento sostenible, una variedad de materiales se han producido de la queratina, más comúnmente en forma de películas de queratina. En el centro de una nueva industria que produce materiales de biopolímeros de queratina es esencial tener un procedimiento para extraer la queratina de su fuente que sea económicamente viable, sostenible desde una perspectiva ambiental y que produzca un producto estable y versátil . Los métodos usados hasta la fecha para la extracción de queratina que mantienen la integridad de las proteínas individuales se han designado para el propósito de análisis de proteína y caracterización y en consecuencia no son viables en una escala industrial, desde un punto de vista económico y ambiental . Los métodos usados hasta la fecha para la disolución económica de la queratina han degradado signifi ativamente los efectos en la proteína, y en consecuencia la proteína disuelta retiene pocas de las propiedades fisicoquímicas que llevan a la conveniencia de la queratina como un biopolímero, tal como la capacidad para reconstituirse en materiales resistentes. Es un objeto de esta invención llevar de alguna manera a superar las desventajas con los procedimientos conocidos o por lo menos proporcionar al publico una opción útil. En por lo menos una modalidad de la invención se esfuerza por proporcionar procedimientos económica y ambientalmente adecuados para la disolución de las proteínas de queratina que mantengan la integridad estructural y funcionalidad química de las proteínas durante el procedimiento de disolución y que lleve a un producto de derivado de queratina estable y versátil para el desarrollo de materiales de biopolímero. SUMARIO DE LA INVENCION De acuerdo con un primer aspecto la invención proporciona un procedimiento de disolución para producir una variedad de derivados de queratina solubles, estables de alto peso molecular, el peso molecular que es similar a o más grande que el de las proteínas expresadas originalmente en la fuente de queratina, con daño pequeño o sin daño a la integridad estructural de las proteínas constituyentes. La disolución ocurre en un procedimiento de dos etapas. De acuerdo con un primer aspecto la invención proporciona un procedimiento para la preparación de derivados de queratina de alto peso molecular, el procedimiento que incluye una primer etapa de paso de digestión de S-sulfonar una fuente de queratina mediante sulfitólisis oxidante seguido por una segunda etapa de paso de extracción usando lavado controlado con agua con lo cual se obtiene un derivado de queratina altamente S-sulfonada. La conversión de la queratina altamente S-sulfonada de un estado sólido a solución es sin el uso de agentes caotrópicos, mediante lavado gradual, controlado de la queratina sulfonada con agua para lavar los reactivos químicos residuales del procedimiento de extracción y alterar la fuerza iónica de la solución de extracción. La primer etapa incluye sulfitólisis oxidante para convertir grupos de cistina presentes en la proteína de S-sulfocisteína, al usar concentraciones industrialmente aceptables de reactivos económicos para el propósito de sulfonación (por ejemplo, sulfito de sodio) y oxidación (por ejemplo, hidróxido de cupraamonio) . De acuerdo con otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para la separación del producto de queratina gelatinosa de una solución de queratina S-sulfonada producida por los procedimientos anteriores, en donde la solución del derivado de queratina S-sulfonada se trata por el uso de un sistema de filtración de alimentación por gravedad suave seguido por la separación. De preferencia la separación es centrífuga. De acuerdo con otro aspecto de la invención, una corriente líquida que permanece después de que se remueve la queratina gelatinosa se procesa al pasarse sobre lana desengrasada, con lo cual se remueven los químicos residuales de la solución y se prepara la lana para procedimientos de extracción de proteína subsecuentes . Siguiendo con la conversión de grupos de cistina, la segunda etapa del procedimiento es uno en el cual el derivado de queratina altamente S-sulfonada se trae de un estado sólido o gelatinoso a solución mediante dilución extensiva con agua. La velocidad y extensión de la disolución se puede controlar por medio del uso de calor, agentes tensioactivos, agitación suave y cortado u homogenización vigorosa. Al controlar la velocidad de disolución, se pueden aislar soluciones de reacción, por ejemplo, si un oxidante de cobre se usa una solución de reacción rica en cobre se produce pero ésta contiene poca o no disuelta proteína, o son ricas en proteína pero contienen un poco o nada de cobre. De acuerdo con otro aspecto de la invención, una corriente líquida que resulta de la segunda etapa del procedimiento, que contiene químicos residuales tales como sulfato de cobre y sulfito, así como derivados de queratina S-sulfonada, se procesa usando uno cualquiera o más de una variedad de métodos que permitan el reciclado de reactivos de la solución y el aislamiento separado de Proteína (s) de Filamento Intermedio de Queratina S-sulfonada purificada (SIFP) y Proteína (s) de Azufre Alto de Queratina S-sulfonada (SHSP) . Esto se logra a través del uso de agentes quelantes, tal como ácido etilendiaminotetracético, o resinas de intercambio de iones quelantes, tal como aquellos que contienen el grupo funcional iminodiacético, y el uso de precipitación isoeléctrica para separar tipos de proteínas. Se püede usar ultra- filtración en varias etapas en el procedimiento para mejorar la eficiencia de la remoción de reactivo o separación de proteína. Se pueden reducir adicionalmente impurezas metálicas en los productos de proteínas mediante el lavado de los derivado (s) de proteína siguiendo precipitación con ácidos diluidos, agua o agentes quelantes. Una vez separados, los productos de proteína se pueden secar mediante una variedad de métodos tales como lecho de fluido, aspersión o liofilización. Otro aspecto de la invención es el procesamiento adicional de la queratina residual no disuelta por el procedimiento de sulfitolisis de dos etapas, a través del uso de otros reactivos, tales como peróxido de hidrógeno, sulfuro de sodio o enzimas proteolíticos , para producir péptidos de quera i a . Otro aspecto de la invención es la provisión de un método para recuperación de gran escala de proteínas de una fuente natural, que incluye someter la fuente de proteína natural a un tratamiento suficiente para hacer por lo menos algo del soluble en agua de proteína y subsecuentemente separar las proteína (s) soluble (s) en agua. Otro aspecto de la invención es la provisión de una instalación para recuperación de gran escala de proteínas de una fuente natural, un recipiente de tratamiento para contener y someter una gran cantidad de la fuente de proteína natural a un tratamiento suficiente para hacer por lo menos algo de la(s) proteína (s) contenidas en la alimentación, soluble en agua, y un aparato de separación para subsecuentemente separar la(s) proteína (s) soluble (s) en agua . Otro aspecto de la invención es un método de solubilización selectiva de una proteína que tiene una pluralidad de enlaces de disulfuro de una mezcla de proteínas que incluye someter la mezcla de proteínas a sulfitólisis oxidante para producir una fracción de proteína S-sulfonada soluble. La sulfitólisis oxidante se efectúa de preferencia en ausencia de agentes caotrópicos con daño pequeño o sin daño a la integridad estructural de la proteína.
Otro aspecto de la invención es un método para obtener una proteína purificada de una fuente de proteína impura con daño pequeño o sin daño a la integridad estructural de la proteína que incluye someter la fuente de proteína a un tratamiento suficiente para hacer por lo menos algo de soluble en agua de proteína y subsecuentemente separar las proteína(s) soluble (s) en agua en ausencia de agentes caotrópicos. DESCRIPCIÓN DE LOS EJEMPLOS PREFERIDOS DE LA INVENCIÓN La combinación de los aspectos que hacen el procedimiento como un todo son resumidos en forma diagramática en la Figura 1 anexa. Este método de procedimiento es para la preparación de derivados de queratina altamente sulfonados y que se pueden aplicar a cualquier fuente de queratina, tales como lana animal, pelo, cuernos, pezuñas, plumas o escamas. Mientras que la aplicación del método a diferentes fuentes de queratina pueden dar queratinas solubles con diferente estructura y propiedades, la etapa fundamental del procedimiento de disolución, en el cual la cistina se convierte a s-sulfocisteína, aplica igualmente bien a todos los materiales que contienen queratina. El procedimiento se puede considerar que ocurre en dos etapas . Etapa uno, que incluye la conversión de cistina a
i S-sulfocisteína, ocurre a través de un procedimiento de sulfitólis s oxidante. Esto se puede lograr mediante el uso de un agente sulfonante, tal como sulfito de sodio o metabisulfito de sodio, que corta asimétricamente la cistina a cisteína y S-sulfocisteína y un oxidante, que convierte la cistelna producida en sulfonación a cistina. Mediante sulfonación adicional de la cistina completa se logra la conversión de toda la cistina a S-sulfocisteína . Los oxidantes que se pueden usar incluyen tetrationato de sodio, yodobenzoato y hidróxido de cupraamonio. En una modalidad preferida de esta invención, el reactivo sulfonante usado es sulfito de sodio en la escala de concentración de 0.02M a 0.2M y el oxidantes usado es hidróxido de cupraamonio en la escala de concentración de 0.02M a 0.08M, generado por la combinación de sulfato de cobre y amoníaco . La primer etapa del procedimiento para solubilizar la queratina es el remojo, durante un tiempo de residencia tal como 24 horas, de la fuente de queratina en una solución o secuencia de soluciones que conviertan la cistina en S-sulfocisteína, con una relación alcohol a lana (volumen : peso) en la escala de 5:1 a 50:1. En otra modalidad de la invención, el agente sulfonante usado es metabisulfito de sodio en la escala de concentración de 0.1M a 0.5M, mantenida a pH ácido. En esta modalidad la lana se remueve de la solución que contiene raetabisulfito de sodio antes de ser añadida a una solución que contiene un complejo de cupraamonio en la escala de concentración de 0.02M a 0.08M: Trabajo previo que se refiere al uso del procedimiento de sulfitolisis oxidante ha requerido el uso de grandes concentraciones de agentes caotrópicos, tal como urea o clorhidrato de guanidinio, para hinchar la fuente de queratina y facilitar la disolución de la queratina. Este procedimiento es tanto caro como impráctico en una escala industrial. El trabajo previo que se refiere al uso de sulfitolisis oxidante usando cobre como el oxidante se ha llevado a cabo bajo condiciones de temperatura y pH que son perjudiciales para la integridad de la proteína causando altos índices de conversión de cistina a lantionina. La etapa dos del procedimiento incluye la conversión de queratina altamente sulfonada de un estado sólido en solución sin el uso de agentes caotrópicos y bajo condiciones de temperatura y pH que mantiene la integridad estructural de la proteína, mediante lavado controlado, gradual de la queratina sulfonada con agua para enjuagar los reactivos químicos residuales del procedimiento de extracción y alterar la fuerza iónica de la solución de extracción. Esta combinación de efectos resulta en la conversión de la queratina altamente sulfonada del estado sólido a la solución acuosa. En el procedimiento preferido el volumen de reacción se reemplaza cada 12 a 48 horas, ya sea en un procedimiento por lotes o sobre una base continua. La velocidad y extensión de la disolución se puede controlar mediante el uso de agentes tensioactivos , la acción de calentamiento, agitación y homogenización de la queratina sulfonada. Una característica de la invención es usar estos factores para controlar la velocidad de extracción. La queratina altamente S-sulfonada puede, por lo tanto, ser conservada en el estado sólido y separada de la solución de extracción que contiene la mayor parte de los químicos usados para el procedimiento de sulfonación. El procedimiento preferido usa un agente tensioactivo no-iónico, tal como Tritón X 100 en la escala de 0.1% a 5% por peso, y una temperatura mantenida en la escala de 15°C a 50°C. Una ventaja de la invención cuando se usa un oxidante con base en cobre es la reutilización de esta solución de extracción rica en cobre para procedimientos de extracción subsecuentes, reduciendo significativamente ambos el costo y el impacto ambiental del procedimiento. La reutilización de la solución rica en cobre es posible debido, en parte, a la regeneración de las especies de cobre activas a través de la oxidación aérea. Un método en el cual la solución rica en cobre se puede reutilizar eficientemente es al pasar la solución sobre la lana. La lana une cobre de la solución y si esta lana' se usa después para procedimientos de extracción subsecuentes, se reduce la demanda de cobre en estas extracciones subsecuentes. De esta manera, un "filtro de lana" se puede usar como una etapa clave en el procesamiento de la solución de extracción rica en cobre, reduciendo la necesidad subsecuente de tratamiento del efluente y también la necesidad de que se añada cobre a los procedimientos subsecuentes. En un procedimiento típico la corriente de líquido de la etapa 1 contenida aproximadamente 1800 - 1500 (partes por millón) ppm de cobre, y después de pasar sobre el filtro de lana esto se redujo a aproximadamente 400 - 300 ppm. La primer etapa del procedimiento, y la recuperación de reactivos para uso en el procedimiento son indicados en la Figura 1 anexa. Después de la S-sulfonación y homogenización del material de queratina se convierte en una masa fibrosa gelatinosa hinchada. Una ventaja adicional de la invención es la separación de los derivados de queratina altamente S-sulfonada en el estado sólido de soluciones que contienen ya sea químicos usados en el procedimiento de extracción o la proteína de queratina en la solución. Esta separación se logra efectivamente mediante el uso de una filtración suave basada en gravedad a través de una pantalla de malla fina, seguido por separación centrífuga del filtrado de partículas finas . Las soluciones de derivados de queratina altamente S-sulfonada se pueden purificar con respecto a iones metálicos, específicamente los iones de cobre usados como parte del procedimiento de extracción, a través del uso de medios de intercambio de ión, en particular aquellos que contienen funcionalidad acida iminodiacética conocida por poseer una alta afinidad para iones metálicos divalentes. Estos medios de intercambio de ión pueden estar presentes en forma de una columna de resina empacada, sobre la cual la solución de proteína se pasa, o ésta puede alternativamente formar parte de una célula electroquímica, en el cual el cobre se recupera de los medios de intercambio de ión a través del uso de un voltaje aplicado y un sistema que contiene membranas permeables. Una vez que los derivados de queratina altamente S-sulfonada están en la solución las proteínas particulares por ejemplo, la proteína de filamento intermedio de queratina S-sulfonada se puede rápidamente aislar mediante precipitación isoeléctrica, alrededor de pH 4 o debajo, usando ácidos tales como ácido sulfúrico, ácido clorhídrico, ácido cítrico o ácido acético, con el procedimiento preferido usando ácido sulfúrico. Una ventaja de la invención es la minimización de la unión de cobre y otras impurezas metálicas a la proteína antes de la precipitación isoeléctrica a través del uso de medios de intercambio de ión como se describió, o mediante la adición de un agente guelantes, tal como un ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) , a la solución de proteína. En el ejemplo preferido se añade EDTA (0.2 ) a la corriente de líquido de la etapa 2 a una velocidad de 25 mi por litro, o a una velocidad adecuada para secuestrar todos los iones de cobre presentes en la solución como se indicó por análisis de la solución. Las impurezas metálicas se pueden reducir adicionalmente mediante el lavado de la proteína, una vez aislada por la precipitación, con una solución de ácido diluida, o solución de un agente quelante tal como EDTA, o agua . Siguiendo precipitación y lavando la proteína separada se puede aislar en un estado seco estable usando métodos de secado que incluyen flujos de aire a alrededor de temperatura ambiente, por ejemplo con el uso de un secador de lecho fluido. Como alternativa, el producto se puede secar al usar un secador de congelación. El producto de proteína seca que contiene grupos de cistina en forma de un ácido S-sulfónico y consecuentemente la proteína es solamente soluble en presencia de una base, tal como hidróxido de sodio o hidróxido de amonio. Estos procedimientos son representados como secado en la Figura 1 anexa. Los derivados de queratina altamente soluble que permanecen en la solución siguiendo precipitación isoeléctrica, que en el caso de la lana son principalmente las proteínas de matriz de azufre alto desde dentro de la fibra de lana, se puede aislar en una forma estable de solución a través de un procedimiento de ultrafiltración, para remover especies no-proteináceas tal como cobre o EDTA residual, seguido por secado por aspersión. Una característica de la invención es el uso de una combinación de precipitación isoeléctrica y ultrafiltración seguida por secado por aspersión para separar queratinas altamente S-sulfonada de acuerdo con sus propiedades en la solución. En el caso de queratina de lana, esto separa efectivamente la clase de proteína de filamento intermedio de azufre bajo de la clase de proteína de matriz de azufre alto y proporciona dos corrientes de producto con propiedades químicas diferentes. Una característica de la invención es la preparación de una forma soluble de agua estable del derivado de queratina altamente S-sulfonado, al disolver la forma de ácido S-sulfónico de queratina en presencia de base y al secar por aspersión la solución resultante . Una característica de la invención es la combinación de componentes de ingeniería para permitir la solubilización de - la queratina y el aislamiento de la queratina S-sulfonada de la solución en un procedimiento continuo, semi-continuo o por lotes. Esta combinación de los componentes de ingeniería y operaciones de unidad se detalla en la Figura 1. Una ventaja de la invención es la recuperación y reutilización de cobre de las mezclas de reacción y corrientes efluentes del procedimiento. El cobre se puede recuperar al usar métodos electroquímicos, que incluyen el uso de membranas permeables selectivas para separar iones de cobre de EDTA previo a deposición electroquímica. Como alternativa, agentes de enlace inmovilizados, en forma de resinas de intercambio de ión específico cobre, se puede usar para remover cobre de la corriente efluente . El cobre removido al usar estos métodos se puede reutilizar, con lo cual se minimiza el impacto ambiental del procedimiento. El uso de medios de intercambio de ión y/o agentes quelantes se representa como purificación en la Figura 1 anexa. Otra ventaja de la invención es el procesamiento adicional de la queratina residual que permanece en el estado sólido siguiendo el procedimiento de extracción. Esta queratina funcionalizada es altamente S-sulfonada, por lo tanto los enlaces de disulfuro presentes en la queratina nativa que la hacen resistentes a ataque químico y enzimatico han sido cortados y la queratina es digestible fácilmente usando otros métodos de extracción. Por ejemplo, una solución rica en péptidos de queratina se puede preparar a través de la acción sobre esta queratina residual de soluciones alcalinas de un oxidante fuerte tal como peróxido de hidrógeno, en la escala de concentración de 10 - 100 mi de 50% de peróxido de hidrogeno por kg de residuo de queratina bajo condiciones alcalinas. El residuo de queratina contiene aproximadamente 5% de sólidos. Como alternativa, las soluciones de reductantes fuertes tal como sulfuro de sodio en la escala de concentración de 0.5% - 15% añadida al residuo de queratina se puede usar para preparar una solución rica en péptidos de que queratina. Alternativamente, enzimas proteoliticas, tal como aquellas de los grupos de subtilisina, papaína o tripsina, se pueden emplear como niveles en la escala de 0.1 mg - 20 mg de enzima por gramo de residuo de queratina a temperatura y condiciones de pH adecuados para la enzima específica para digerir fácilmente la queratina residual y preparar una solución rica en péptidos de queratina. Todos estos métodos resultan en la formación de una solución rica en péptidos de queratina que puede ser procesada en una forma similar a la corriente líquida resultante de la etapa 2 descrita arriba, que es a través del uso de un medio de intercambio de ión, ajuste de pH y secado (mostrado como purificación y secado en la Figura 1), para producir sólidos de péptido de queratina. La digestión del residuo de queratina de esta manera minimiza el desperdicio de queratina producido por el procedimiento de manera global, y asegura la utilidad máxima de la proteína de queratina presente en la fuente de queratina. Los dos productos de proteína intacta del procedimiento son proteína de filamento intermedia de queratina S-sulfonada y proteína de azufre alto de queratina S-sulfonada. La proteína de filamento intermedio de queratina S-sulfonada típicamente producida por el procedimiento se analizó usando análisis de electroforesis de gel de poliacrilamida de dodecilsulfato (SDS-PAGE) usando un procedimiento de reducción / alquilación, que indicó una distribución de peso molecular predominantemente en la escala de 30-60 kD (proteínas de filamento intermedias) , con un componente pequeño de proteína de masa lOkD (proteínas de tiros'ina alta de glicina alta) . La composición de aminoácido de este producto se da en la Tabla 1 y es típica para proteínas de filamento intermedio de queratina de lana. La proteína de azufre alto de queratina S-sulfonada se analizó usando SDS-PAGE después de un procedimiento de reducción / alquilación, que indicó un peso molecular predominantemente en la escala de 15-20 kD. La composición de aminoácido de este producto se da en la Tabla 1 y es típica para proteínas de azufre alto de queratina de lana.
Tabla 1 : composición de aminoácido de proteína filamento intermedia de gueratina S-sulfonada (SIFP) , proteína de azufre alto de queratina S-sulfonada (SHSP) , proteína de filamento intermedio (IFP) y proteína de azufre alto (HSP) (las últimas dos cortesía de Gillespie and Marshall, Variability in the proteins of wool and hair, Proc. Sixth Int. Wool Text. Res. Conf. , Pretoria, 2, 67-77, 1980). Todos los residuos expresados como % de mol. S-sulfocisteína, cistina y cisteína son medidos como cisteína S-carboximetil seguido por la reducción y alquilación. Un ejemplo del procedimiento se muestra en forma diagramática en la Figura 1 anexa. La ultrafiltración se considera como siendo un componente posible en cada etapa de purificación. Los componentes clave son ilustrados por los siguientes ejemplos de un procedimiento de extracción de proteína. EJEMPLOS EJEMPLO 1, ETAPA 1, DIGESTIÓN La etapa de digestión para el procedimiento incluye el uso de sulfitólisis oxidante para convertir cistina a S-sulfocisteína dentro de la fuente de queratina. EJEMPLO la, ETAPA 1, DIGESTIÓN Para extraer la queratina de 10 kg de lana, primeramente se mezclaron 2 kg de pentahidrato de sulfato de cobre usando un mezclador de esfuerzo cortante alto con ocho litros de amoníaco concentrado. Esta mezcla se diluyó a 200L con agua y fueron añadidos 10 kg de lana. Se añadieron aproximadamente 15L de ácido sulfúrico (2M) a la mezcla agitada hasta que se logró un pH de 9.4. Se añadió sulfito de sodio anhidro (5.04 kg) y la solución se mezcló hasta que haya ocurrido la disolución completa de todos los reactivos y el pH estabilizado a 9.5. La concentración final del complejo de amoníaco cúprico fue 0.04M. El sulfito de sodio tuvo una concentración final de 0.2M. La temperatura de la solución de digestión se mantuvo a 20°C. Después de 24 horas de agitación suave la masa gelatinosa fibrosa de lana suavizada se filtró. El filtrado se pasó a través de un filtro de lana fresca, que disminuyó el nivel de cobre en la solución de 1725 ppm a 130 ppm y se purificó adicionalmente usando resina de intercambio de ión Purolite S930 IDA, la cual bajo condiciones acidas redujo adicionalmente el nivel de cobre a 12ppm. Se añadió agua fresca a la lana suavizada y la mezcla se agitó. EJEMPLO Ib, ETAPA 1, DIGESTIÓN CON EL USO DE AGENTE TENSIOACTIVO En una variación del ejemplo la, la solución de digestión se preparó con la adición de 1% de un agente tensioactivo no-iónico Tritón X 100. La adición de este agente tensioactivo resultó en un retraso en la liberación de la proteína soluble de la fibra, permitiendo una separación más efectiva de la proteína de los reactivos residuales tal como sales de cobre en la solución de extracción.
EJEMPLO 1c, ETAPA 1, DIGESTIÓN En una variación del ejemplo la, la etapa de digestión ocurre en dos partes. En la primer parte la lana se pre-trata con metabisulfito de sodio en una concentración de 0.2M, a pH 4.2. Seguido por la remoción de la lana de esta solución, y sin intentar remover el sulfito residual de la lana, la lana fue sumergida en una solución de hidróxido de cupraamonio, en la concentración y pH descritos en el ejemplo la durante 24 horas adicionales a 20°C. EJEMPLO 2, ETAPA 2, EXTRACCIÓN EJEMPLO 2a, ETAPA 2, EXTRACCIÓN POR LOTES Después de la finalización de la etapa 1, descrita en los ejemplos 1, la mezcla se agitó durante un periodo de 16 horas, después de ser homogeneizada . Siguiendo una agitación de 4 horas adicionales los sólidos y la solución se separaron usando un procedimiento de filtración de dos-etapas que incluye una pantalla de cable acuñado seguido por un tanque de sedimentación y un centrifugador de disco giratorio. Las fases sólidas se regresaron al recipiente de reacción y se añadió agua para dar una relación fina de alcohol a lana de 20:1 con base en los sólidos de lana originales. Después de 24 horas de agitación u homogenización continua la mezcla se separó mediante la repetición del procedimiento de filtración de dos etapas. Las fases sólidas se regresaron al recipiente de extracción y se diluyeron adicionalmente. Este ciclo se repitió 7 a 12 veces. Las fases líquidas, que contenían proteínas solubles, fueron procesadas adicionalmente como se detalla abajo en el ejemplo 3. EJEMPLO 2b, ETAPA 2, EXTRACCIÓN CONTINUA Siguiendo la finalización de la etapa 1, la mezcla se procesó como se describió en el ejemplo 2a, excepto que el procedimiento de filtración de dos etapas ocurrió sobre un procedimiento continuo y se añadieron los sólidos y agua fresca al tanque de reacción en una velocidad equivalente al volumen del tanque siendo reemplazado en 24 horas. Este procedimiento fue continuado durante 120 horas. EJEMPLO 3. PROCESAMIENTO DE LAS SOLUCIONES DE PROTEÍNA La ultrafiltración se puede usar en varios puntos durante el procesamiento de las soluciones de proteínas, para concentrar soluciones y hacer los procedimientos de secado e intercambio de ion más eficientes. La ultrafiltración puede ser usada previa a cualquier etapa de procesamiento explicada en los siguientes ejemplos. EJEMPLO 3a. PROCESAMIENTO DE SOLUCIONES DE PROTEÍNA USANDO EDTA La solución producida como un resultado de la etapa 2, como se describió en el Ejemplo 2, fue procesada adicionalmente para queratinas solubles purificadas. Se añadió EDTA (0.2M) a la fase líquida a una velocidad de 25 mi por litro, o en una velocidad adecuada para secuestrar todos los iones de cobre presentes en la solución como se indico por análisis de la solución. Siguiendo a 1 hora de mezclado, el pH del filtrado se redujo a 3.5 usando ácido sulfúrico. El precipitado de proteína se aisló usando una pantalla y se lavó secuencialmente con ácido sulfúrico diluido y agua. La proteína, proteína de filamento intermedio de queratina S-sulfonada, se secó por una de tres rutas, liofilización, secado en lecho de fluido o secado por aspersión seguido por la disolución con hidróxido de sodio diluido. El filtrado siguiendo el procedimiento de precipitación de proteína fue procesado adicionalmente usando ultrafiltración, para separar los componentes de proteína de los reactivos residuales. El material retenido se secó por aspersión para aislar proteína soluble adicional, proteína de azufre alto de queratina S-sulfonada. La material permeado se procesó adicionalmente para recuperar cobre y EDTA de la corriente efluente usando medios de intercambio de ión. EJEMPLO 3b. PROCESAMIENTO DE SOLUCION DE PROTEÍNA USANDO MEDIOS DE INTERCAMBIO DE IÓN La solución producida como un resultado de la etapa
2, como se describió en el Ejemplo 2, fue procesada adicionalmente para queratinas solubles purificadas aisladas. La fase líquida se pasó sobre resina de intercambio de ión, tal como la resina quelante de resina de intercambio de ión Purolite S930 IDA que contiene el grupo funcional de ácido iminodiacético, para remover iones de cobre de la solución. Siguiendo al intercambio de ion el pH del filtrado se redujo a 3.5 usando ácido sulfúrico y se procesó adicionalmente de una forma idéntica a la descrita para el Ejemplo 3a. EJEMPLO 3c. PROCESAMIENTO DE SOLUCIÓN DE PROTEÍNA USANDO AJUSTE DE pH PREVIO AL INTERCAMBIO DE ION La solución producida como un resultado de la etapa 2 , como se describió en el Ej emplo 2 , fue procesada adicionalmente para queratinas solubles purificadas aisladas. El pH de la fase líquida se redujo a 3.5 usando ácido sulfúrico. El precipitado de proteína se aisló usando una pantalla, se volvió a disolver usando hidróxido de sodio diluido y se purificó adicionalmente con ya sea la adición de EDTA o al pasar sobre una columna de intercambio de ión. Siguiendo a la purificación adicional, el pH de la solución se redujo a 3.5 usando ácido sulfúrico y la proteína se aisló como se describió en los ejemplos anteriores. El filtrado de la etapa inicial de reducción, el cual aún contiene cantidades significantes de proteína soluble y otros reactivos, se purificó al pasar sobre medio de intercambio de ión y se secó por aspersión para aislar proteína soluble adicional, proteína de azufre alto de queratina S-sulfonada. EJEMPLO 4. DISOLUCIÓN DE RESIDUOS DE LA ETAPA 2 La corriente sólida aislada como un resultado de la etapa 2 puede ser procesada adicionalmente para "producir péptidos de gueratina por una variedad de métodos. El nivel alto de sulfonación del residuo lo hace fácilmente dócil a digestión química y enzimática, como los enlaces de disulfuro presentes en la fuente de queratina original resistentes a ataque químico y enzimático han sido en gran parte cortados. EJEMPLO 4a DISOLUCIÓN DE RESIDUOS USANDO SULFURO DE SODIO Se añade solución de sulfuro de sodio (5% por peso) a un volumen igual de la corriente sólida de la etapa 2 del procedimiento, la cual comprende aproximadamente 5% de sólidos. La mezcla se agita durante 12 horas después de tal tiempo los sólidos son removidos mediante filtración y centrifugación y se añade ácido sulfúrico a la solución de proteína para disminuir el pH a la escala de 2 a 3.5. El precipitado se recolecta sobre una pantalla y se lava a fondo con agua. EJEMPLO 4b DISOLUCIÓN DE RESIDUOS USANDO PERÓXIDO DE HIDRÓGENO Se añade peróxido de hidrógeno (50%) a la corriente sólida de la etapa 2 en un nivel de 25-30 mi por kg de residuo de queratina (residuo de queratina contiene aproximadamente 5% de sólidos) . Esto se mezcla y se añade hidróxido de sodio IM para obtener el pH en la escala de 10 a 13. La mezcla se agita suavemente durante 24 horas y la proteína y sólidos se separan mediante procedimiento de filtración de dos etapas como se describió en el Ejemplo 2 y la proteína se aisla mediante acidificación como se describió en el Ejemplo 4a. Como alternativa, la solución de proteína se pasa sobre una resina de intercambio de ión, después se acidifica y el sólido precipitado se recolecta. La solución acidificada puede entonces ser pasada a través de una columna de intercambio de ión previo a liofilización o secado por aspersión para recolectar un producto adicional rico en proteína . EJEMPLO 4c DISOLUCIÓN DE RESIDUOS USANDO ENZIMAS PROTEOLÍTICAS Una preparación de enzima de subtilisina industrial (una solución que contiene 2.5% de enzima activa) se añadió a la corriente sólida de la etapa 2 en la cantidad de 10 mg de enzima activa por grama de residuo de queratina. El pH se mantuvo en 9.5 con la adición de hidróxido de sodio y la reacción se calentó a 60°C durante 2 horas. La solución de proteína resultante se aisló de los sólidos y se procesó como se describió en el ejemplo 4a o se pasó a través de resina de intercambio de ión previo a y/o seguido por acidificación como se describió en el ejemplo 4b. De este modo por la invención se proporciona un método para la producción de derivados de gueratina solubles que es tanto económico como ambientalmente aceptable. Se han descrito ejemplos particulares de la invención y se prevé que mejoras y modificaciones pueden tomar lugar sin alejarse del alcance de las reivindicaciones anexas . Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a al práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.