MXPA03009059A - Secuencias de nucleotidos reguladoras de alcohol oxidasa 1 para expresion de genes heterologos en levadura. - Google Patents

Abstract

Se proporcionan polinucleotidos que comprenden regiones reguladoras del promotor de alcohol oxidasa (1) de levadura. Se describen polinucleotidos aislados, polinucleotidos recombinantes, vectores, cartuchos de expresion y celulas transformadas conteniendo las regiones reguladoras. Tambien se proporcionan proteinas producidas por las celulas transformadas.

Description

SECUENCIAS DE NUCLEOTIDO REGULADORAS DE ALCOHOL OXIDASA 1 PARA EXPRESION DE GENES HETEROLOGOS EN LEVADURA CAMPO DE LA INVENCION La presente invención generalmente está dirigida a polinucleótidos aislados que comprenden secuencias de nucleótido reguladoras, vectores y cartuchos de expresión que contienen dichas secuencias reguladoras, y células huésped que comprenden los vectores y/o cartuchos de expresión. En particular, la invención se refiere a secuencias de nucleótido reguladoras corriente arriba 5' dentro de la región de promotor del gen de alcohol oxidasa 1, vectores y cartuchos de expresión que contienen dichas secuencias reguladoras, y células huésped que comprenden los vectores y/o cartuchos de expresión.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION La levadura metilotrófica es capaz de utilizar metanol como su única fuente de energía. La levadura metilotrófica comprende dos grupos, los asporogénicos consistiendo de las especies Candida y Torulopsis, y los ascomicetos que contienen las especies Hansenula y Pichia. Estas levaduras poseen una trayectoria de utilización de metanol conservado. En el primer paso de esta trayectoria, la enzima de alcohol oxidasa cataliza la oxidación del metanol a formaldehído. Concomitantemente, esta reacción también genera peróxido de hidrógeno, una sustancia que es altamente tóxica para la mayoría de los organelos celulares. Con el fin de evitar la toxicidad del peróxido de hidrógeno, el metabolismo del metanol es altamente formado en compartimentos en organelos especializados, llamados peroxisomas, que secuestran este subproducto tóxico de resto de la célula. El alcohol oxidasa tiene una baja afinidad para su substrato, oxígeno. La división de alcohol oxidasa en la peroxisoma, por lo tanto, sirve como el papel adicional de concentrar la enzima y el substrato, por lo tanto compensando, por lo menos en parte, su baja afinidad de oxígeno. La regulación del metabolismo de metanol en levadura generalmente ocurre en el nivel de transcripción, e incluye control de la síntesis y activación de las enzimas correspondientes, así como su degradación. La síntesis de metanol metabolizando enzimas se induce a través de metanol, formaldehído y formeato, y se reprime mediante ambos glucosa y etanol. Como se mencionó anteriormente, una enzima clave en la oxidación de metanol es alcohol oxidasa, la cual también está controlada en ambos, positivamente y negativamente en su nivel de transcripción. Varios genes codificando alcohol oxidasa de Pichia pastoris (AOX1 Y AOX2), Candida boidinii S2 (AOD1), y metanol oxidasa de Hansenula polymorpha (MOX1) están bien caracterizados. La inducción de metanol ocasiona la rápida síntesis de novo de alcohol oxidasa, que va acompañada por un incremento correspondiente en el ARN de alcohol oxidasa. Por ejemplo, en células P. pastoris desarrolladas en metanol, AOX rápidamente se acumula hasta en un 30% del total de proteína soluble. Las levaduras han sido extensivamente empleadas para la producción de proteínas heterólogas y ofrece varias ventajas sobre los sistemas de expresión procarióticos. Por ejemplo, algunas proteínas eucarióticas que son producidas en células procarióticas son ya sea inestables o carecen de actividad biológica. Por consiguiente, en estos casos, las levaduras ofrecen ventajas sobre sus contrapartes procarióticas que incluyen un ambiente intracelular que es más conductivo para corregir doblamiento de las proteínas eucarióticas. Adicionalmente, las levaduras a diferencia de los huéspedes procarióticos, tiene la habilidad de glicosilar proteínas, lo cual es importante tanto para la estabilidad y actividad biológica de la proteína. Saccharomyces cerevisiae fue la primera, y permanece como el sistema de expre'sión eucariótico más comúnmente empleado debido a que su genoma y fisiología ha sido extensivamente caracterizado. Esto no es siempre el sistema de expresión óptimo, sin embargo, para la producción a gran escala de proteínas heterólogas debido a la pérdida de plásmido durante la escalada, hiperglicosilacion, y bajas producciones de proteína. Recientemente, los sistemas de expresión de levadura metilotrófica ha sido desarrollados y ofrecen varias ventajas sobre sus contrapartes, S. cerevisiae. Por ejemplo, los sistemas de expresión de levadura metilotróf ica logran densidades de célula muy altas en un medio definido simple, tiene promotores de inducción fuertes, y la disponibilidad de los métodos, en ciertas cepas, y vectores de expresión que facilitan las manipulaciones genéticas. En particular, la levadura metilotrófica, P. pastoris, ha sido extensamente utilizada para la producción de proteínas heterólogas a escala industrial. P. pastoris es un sistema de expresión particularmente adecuado para la producción de proteínas a escala industrial debido de la presencia de un promotor único, AOX1, utilizado para dirigir la expresión de gen. El promotor AOX1, como se manifestó anteriormente, se deriva de gen alcohol oxidasa 1 regulado con metanol y es uno de los promotores más eficientes y herméticamente regulados, conocidos. Por ejemplo, como se delineó anteriormente, las células P. pastoris desarrolladas en metanol, AOX rápidamente acumula hasta un 30% del total de la proteína soluble. Además del gen AOX1, P. pastoris también aloja un segundo gen AOX funcional, AOX2. AOX2 codifica una proteína que comparte aproximadamente el 97% de homología, y tiene la misma actividad específica que su contraparte AOX1. Sin embargo, las regiones reguladoras corriente arriba 5' de AOX1 y AOX2 no tienen regiones importantes de homología, a pesar del hecho de que ambos genes son reprimidos durante el crecimiento en glucosa, desreprimidos durante la limitación de carbono, e inducidos a través de crecimiento en metanol como la única fuente de carbono. Además, la inducción de A0X2 es responsable solamente del 15% de la actividad de alcohol oxidasa total en cultivos de célula de crecimiento en metanol. Debido a la acumulación limitada de AOX2 con relación a AOX1, el promotor de AOX1 es más ventajoso para emplearse en un sistema de expresión para la producción de proteína a gran escala. Aunque la expresión a alto nivel de proteínas heterólogas ha sido logrado empleando el promotor AOX1 de P. pastoris, se sabe muy poco acerca de los mecanismos moleculares involucrados en la inducción en metanol, ya sea en P. pastoris o levaduras metilotróficas en general. La región de promotor para AOX1 ha sido identificada (SEC ID NO: 1), sin embargo, las secuencias reguladoras dentro de esta región no han sido extensamente caracterizadas. Ver Stroman y otros, patente de E.U.A. No. 4,855,231. Además, la región de promotor para el gen AOX2 también ha sido identificada (SEC ID NO: 2), y consiste -de tres elementos reguladores de acción de cis que han sido caracterizados (uno positivo y los otros dos negativos)- Ver Cregg, patente de E.U.A. No. 5,032,516. El elemento de acción en cis positivo, el sitio activador corriente arriba AOX2, es requerido para una respuesta de inducción transcripcional a través de metanol. Los dos elementos de acción cis negativos son responsables de la represión del promotor AOX2. Sin embargo, como se mencionó anteriormente, las regiones reguladoras corriente arriba 5' de AOX1 y AOX2 no tienen regiones importantes de homología, y por lo tanto, la caracterización extensiva de la regulación de AOX2 proporciona un pequeño entendimiento dentro del mecanismo a través del cual el promotor AOX1 es regulado. En aún un intento adicional para caracterizar las regiones reguladoras del promotor AOX1, su secuencia se compara con las regiones reguladoras corriente arriba 5' de un gen de alcohol oxidasa, ZZA (SEC ID NO: 3), aislado de una cepa P. pastorls no caracterizada. Ver Kumasi y otros, patente de E.U.A. No. 5,641,661. Esta cepa también contiene dos copias de los genes AOX. La secuencia de aminoácido deducida de ZZA reveló que 14 de los primeros 16 aminoácidos son idénticos a aquellos de los genes AOX1 y AOX2. Sin embargo, similar a las regiones reguladoras 5' de AOX1 y AOX2, las regiones reguladoras corriente arriba 5' de ZZA y AOX1 comparten solamente el 66% de homología. Los dos promotores, de esta manera, pueden ser' regulados a través de mecanismos completamente distintos. Las secuencias de nucleótido altamente conservadas, (TTGNNNGCTTCCAANNNTGGT) (SEC ID NO: 4) y CCNCTTTTTG (SEC ID NO: 5) se han encontrado en las regiones de flanqueo 5' de genes de alcohol oxidasa, metanol oxidasa, y dihidroxiacetona sintasa en P. pastoris, H. polymorpha polymorpha y C. boidini S2. Ver Kumagi y otros, patente de E.U.A. No. 5,641,661. Se postuló que estas regiones conservadas se involucraron en la unión de factores de acción trans específicos de metanol. Sin embargo, en un estudio caracterizando el promotor AOX2, estas secuencias no se involucraron en la regulación transcripcional del gen AOX2 ya que la eliminación de estas regiones no impactó la regulación del promotor ?0?2 (Ohi, y otros, (1994) Mol. Gen Genet. 243:489-99). De esta manera, aunque estas regiones pueden estar altamente conservadas a io largo de las levaduras metilotróficas,- su impacto en la regulación transcripcional de los genes AOX permanece como completamente elucidado. Por consiguiente, existe una necesidad de identificar promotores y otras secuencias de nucleótido reguladoras para la expresión controlada y/o expresión de alto nivel de proteínas heterólogas en levadura. En particular, existe una necesidad para proporcionar nuevos promotores AOX1 y secuencias de nucleótido reguladoras para la expresión controlada y/o expresión a alto nivel de proteínas heterólogas en levadura.

COMPENDIO DE LA INVENCION Entre los varios aspectos de la invención por consiguiente se proporciona un polinucleótido aislado que comprende una región reguladora conteniendo una secuencia de nucleótido menor de aproximadamente 1000 nucleótidos de longitud seleccionada del grupo que consiste de: (a) SEC ID NO: 16, un fragmento de la SEC ID NO: 16, el complemento de la. SEC ID NO: 16, o un fragmento del complemento de la SEC ID NO: 16; (b) un polinucleótido que hibridiza al polinucleótido de (a) bajo condiciones de alta severidad; y (c) un polinucleotido con por lo menos 80% de homología de secuencia al polinucleotido de (a). Otro aspecto proporciona un polinucleotido aislado que comprende una región reguladora conteniendo una secuencia de nucleótido menor de aproximadamente 1000 nucleótidos de longitud seleccionada del grupo que consiste de: (a) SEC ID NO: 17, un fragmento de la SEC ID NO: 17, el complemento de SEC ID NO: 17, o un fragmento del complemento de SEC ID NO: 17; (b) un polinucleotido que hibridiza al polinucleotido de (a) bajo condicion.es de alta severidad; y (c) un polinucleotido con por lo menos 80% de homología de secuencia al polinucleotido de (a). En aún otro aspecto se proporciona un polinucleotido aislado que comprende una región reguladora conteniendo una secuencia de nucleótido menor de aproximadamente 1000 nucleótidos de larga seleccionada del grupo que consiste de: (a) SEC ID NO: 18, un fragmento de la SEC ID NO: 18, el complemento de SEC ID NO: 18, o un fragmento del complemento de SEC ID NO: 18; (b) un polinucleotido que hibridiza al polinucleotido de (a) bajo condiciones de alta severidad; y (c) un polinucleotido con por lo menos 80% de homología de secuencia al polinucleotido de (a). En aún otro aspecto de la invención se proporciona un polinucleótido aislado comprendiendo una región reguladora conteniendo la secuencia de nucleótido menor de aproximadamente 1000 nucleotidos de longitud seleccionada del grupo que consiste de: (a) SEC ID NO: 19, un fragmento de la SEC ID NO: 19, el complemento de SEC ID NO: 19, o un fragmento del complemento de SEC ID NO: 19; (b) un polinucleótido que hibridiza al polinucleótido de (a) bajo condiciones de alta severidad; y (c) un polinucleótido con por lo menos 80% de homología de secuencia al polinucleótido de (a). En aún otro aspecto adicional de la invención se proporciona un polinucleótido aislado que comprende una región reguladora conteniendo una secuencia de nucleótido menor de aproximadamente 1000 nucleotidos de larga seleccionada del grupo que consiste de: (a) SEC ID NO: 20, un fragmento de la SEC ID NO: 20, el complemento de SEC ID NO: 20, o un fragmento del complemento de SÉC ID NO: 20; (b) un polinucleótido que hibridiza al polinucleótido de (a) bajo condiciones de alta severidad; y (c) un polinucleótido con por lo menos 80% de homología de secuencia al polinucleótido de (a). Un aspecto adicional de la invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende una región reguladora conteniendo una secuencia de nucleótido menor de aproximadamente 1000 nucleotidos de larga seleccionada del grupo que consiste de: (a) SEC ID NO: 21, un fragmento de la SEC ID NO: 21, el complemento de SEC ID NO: 21, o un fragmento del complemento de SEC ID NO: 21; (b) un polinucleótido que hibridiza al polinucleótido de (a) bajo condiciones de alta severidad; y (c) un polinucleótido con por lo menos 80% de homología de secuencia al polinucleótido de (a). Aún otro aspecto de la invención proporciona un vector recombinante comprendiendo el polinucleótido de SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 18, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 20 y SEC ID NO: 21. También se proporcionan células huésped comprendiendo el vector recombinante. Un aspecto adicional proporciona un cartucho de expresión comprendiendo el polinucleótido de SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 18, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 20 y SEC ID NO: 21.

También se proporcionan células huésped comprendiendo el vector recombinante: BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS Estas y otras características, aspectos y ventajas de la presente invención se entenderán mejor con respecto a la siguiente descripción, reivindicaciones anexas, y figuras que la acompañan, en donde: La Figura 1 describe la construcción del vector de expresión, pAL2, y el vector de mutagénesis pMM110. El vector PAL2 se construyó insertando el fragmento Eco RlISma de pSAOH5 en el vector sin promotor plB1. El vector pMMI101 se construyó insertando el fragmento Eco R\/Bam Hl de pSAOH5 en Eco R\/Bam. La Figura 2 describe un análisis de eliminación del promotor AOX1. Los plásmidos se insertaron en el sitio GS115 his4. Los integrandos de copia individuales se identificaron a través del ensayo Southern utilizando el gen HIS4 como una sonda. Las células se desarrollaron en condiciones MM (inducido) y MME (reprimido). La actividad ß-Gal de la fusión AOX1 -lacZ se midió y reportó como un porcentaje de la actividad de células de crecimiento en metanol conteniendo pAL2. La caja TATA se indica a través del cuadro negro, y +1 ATG se indica a través del triángulo negro de cabeza. La Figura 3 describe los resultados del ensayo de desplazamiento en gel para el fragmento A (SEC ID NO: 16). El carril 1, sin proteína agregada; los carriles 2-5, seis mg de proteína de células de crecimiento MM; el carril 6, seis mg de proteína dé células de crecimiento MME; el carril 3, 30 dobleces de ADN específicos fríos (fragmento A (SEC ID NO: 16)); carril 4, treinta dobleces del fragmento C frío (SEC ID NO: 18); carril 5, treinta dobleces de ADN de L. monocytogeneses. La Figura 4 describe los . resultados del ensayo de desplazamiento de gel para el fragmento C (SEC ID NO: 18). El carril 1, sin proteína agregada; los carriles 2-5, proteína de células de crecimiento MM; los carriles 7-9, proteína de células de crecimiento MME; el carril 3 y 7, 30 dobleces del competidor específico frío (fragmento C (SEC ID NO: 18)); carril 4 y 6, treinta dobleces del competidor no específico frío (fragmento A (SEC ID NO: 16); carriles' 5 y 9, treinta dobleces no específicos fríos de ADN de L. monocytogeneses. La Figura 5 describe los resultados del ensayo de desplazamiento de gel para el fragmento F (SEC ID NO: 21). El carril 1, sin proteína agregada; carril 2, seis mg de proteína de células de crecimiento MM; carril .3, doce mg de proteína de células de crecimiento MM; carril 4, seis mg de proteína de células de crecimiento MME; carril 5, doce mg de proteína de células de crecimiento MME. La Figura 6 describe las secuencias de consenso ' de promotores regulados por metanol de levadura metilotrófica. La ocurrencia de la secuencia de consenso de núcleo TTCCAA (A) (Kumagi y otros, .1993) y GATAG (B) (Ohi y otros, 1994) en el promotor AOX1. La alineación C de MOX UAS2 con el promotor AOX1 (Godecke y otros, 1994). Se proporcionan números menores con relación al codón +1 ATG, +/- define la cepa más/menos. Las letras del fragmento que contienen la secuencia también se dan en la columna derecha.

ABREVIATURAS Y DEFINICIONES Para facilitar el entendimiento de la invención, se definen continuación un número de términos y abreviaturas como se utilizan aquí: Como se utiliza aquí "polinucleótido aislado" significa un polinucleótido que está libre de una o ambas secuencias de nucleótido que flanquean el polinucleótido es el genoma de existencia natural del organismo a partir del cual el polinucleótido se deriva. El término incluye, por ejemplo, un polinucleótido o fragmento del mismo que está incorporado en un vector o cartucho de expresión; en un plásmido o virus de replicación autónomo; en un ADN genómico de un procariote o eucariote; o que existe como una molécula separada independiente de otros polinucleótidos. También incluye un polinucleótido quimérico recombinante que es parte de un polinucleótido híbrido, por ejemplo, uno que codifica una secuencia de polipéptido. Como se utiliza aquí "polinucleótido" y "oligonucleótido" se utilizan de manera intercambiable y se refieren a una forma polimérica (2 o más monómeros) de nucleótidos de cualquier longitud, ya sea ribonucleótidos o desoxiribon ucleótidos. Aunque los nucleótidos usualmente se unen a través de enlaces de fosfodiéster, el término también incluye nucleótidos poliméricos conteniendo enlaces de estructura de cadena de amida neutra compuestos de unidades de aminoetil glicina. Este término se refiere solamente a la estructura primaria de la molécula. De esta manera, este término incluye ADN y ARN de estructura de cadena doble e individual. También se incluyen tipos conocidos de modificaciones, por ejemplo, etiquetas, mutilación, "tapas", substitución de uno o más de los nucleótidos de existencia natural con un análogo, modificaciones de internucleótido tales como, por ejemplo, aquellos con enlaces no cargados (por ejemplo, metil fosfonatos, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc). Aquellos que contienen porciones pendientes, tales como, por ejemplo, proteínas (incluyendo por ejemplo, nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos de señal, poli-L-lisina, etc.), aquellos con intercaladotes (por ejemplo, acridina, psoralen, etc.), aquellos que contienen quelatadores (por ejemplo, metales, metales radioactivos, boro, metales oxidantes, etc.), aquellos que contienen alquiladores, aquellos con enlaces modificados (por ejemplo, ácidos nucleicos anoméricos alfa, etc.), así como formas no modificadas del polinucleótido. Los polinucleótidos incluyen tanto cepas sentido como antisehtido. Como se utiliza aquí, "secuencia" significa el orden lineal en el que los monómeros ocurren en un polímero, por ejemplo, el orden de los aminoácidos en un polipéptido o el orden de los nucleótidos en un polinucleótido. Como se utiliza aquí, los términos "complementario" o "complementariedad" se refiere a la formación en pared de bases, purinas y pirimidinas, que se asocian a través de la unión a hidrógeno en el acido nucleico de estructura de cadena doble. Los siguientes pares de bases son complementarios: guanina y citosina; adenina y timina; y adenina y uracilo. Los términos como se utilizan aquí incluyen complementariedad completa o parcial.

Como se utiliza aquí, el término "hibridación" se refiere a un proceso en donde una estructura de cadena de acido nucleico se une con una estructura de cadena complementaria de la formación de pares de base. Las condiciones empleadas en la hibridación de dos ácidos nucleicos no idénticos, pero muy similares, complementarios varían con el grado de complementariedad de las dos estructuras de cadena y la longitud de las estructuras de cadena.. De esta manera, el término contempla hibridación parcial así como completa. Dichas técnicas y condiciones son bien conocidas por los practicantes en este campo. Como se utiliza aquí, "cartucho de expresión" significa un módulo genético que comprende un gen y las regiones reguladoras necesarias para su expresión, las cuales pueden estar incorporadas en un vector. Como se utiliza aquí, "secuencia de secreción" o "péptido de señal" o "secuencia de señal" significa una secuencia que dirige proteínas de secreción o de membrana recién sintetizadas a y a través de membranas del retículo endoplásmico, o de el citoplasma al periplasma a través de la membrana interna de la bacteria, o de la matriz de mitocondrias dentro del espacio interior, o del estroma de los cloroplastos dentro del tilacoide. La fusión de dicha secuencia a un gen que se va a expresar en un huésped heterólogo asegura la secreción de la proteína recombinante de la célula huésped. Como es utiliza aquí, "operablemente enlazado" significa cualquier enlace, sin considerar la orientación o distancia, entre una secuencia reguladora y secuencia de codificación, en donde el enlace permite que la secuencia reguladora controle la expresión de la secuencia de codificación. Como se utiliza aquí, "secuencia de codificación heteróloga" significa cualquier secuencia de codificación diferente de una que ¦ codifica naturalmente la proteína de alcohol oxidasa 1, o cualquier homologa de la proteína de alcohol oxidasa 1. Como se utiliza aquí, "secuencia reguladora" o "región reguladora" como se utiliza en referencia a un gen específico se refiere a las secuencias de codificación o no codificación de nucleótido dentro del gen que son necesarias o suficientes para proporcionar la expresión regulada de la región de codificación de un gen. De esta manera, el término abarca las secuencias promotoras, sitios de unión de proteína reguladora, secuencias de activador corriente arriba, y similares. Los nucleótidos específicos dentro de una región reguladora pueden servir múltiples funciones. Por ejemplo, un nucleótido específico puede ser parte de un promotor y participar en la unión de una proteína activadora transcripcional. Como se utiliza aquí, "región de codificación" se refiere a esa porción de un gen que no codificad para una proteína. El término "región de no codificación" se refiere a esa porción de un gen que no es una región de codificación.

DESCRIPCION DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS Los solicitantes han identificado secuencias de nucleótido reguladoras que son parte de la región de no codificación del gen de alcohol oxidasa 1 ("AOX1"). El gen AOX1 codifica la enzima de alcohol oxidasa 1, que cataliza la oxidación de metanol a formaldehído (como se manifiesta con más detalle más adelante). El promotor AOX1, es un promotor ¡nducible, y es principalmente inducido por metanol y consumo de carbono, y reprimido en respuesta a glucosa y etanol. Aunque el promotor AOX1 ha sido identificado (SEC ID NO: 1), los solicitantes antes descubrieron, secuencias de nucleótidos reguladoras 5', dentro de la región de promotor no habían sido caracterizadas. Las regiones reguladoras descubiertas por los solicitantes, se establecen aquí, pueden ser empleadas para incrementar la expresión de los genes de interés en una variedad de células. Con el fin de identificar las regiones reguladoras de la presente invención, los solicitantes dividieron el promotor AOX1 de pares de base 1052 (SEC ID NO: 1) en seis fragmentos, A (SEC ID NO: 16), b (SEC ID NO: 18), C (SEC ID NO: 18), D (SEC ID NO: 19), E (SEC ID NO: 20), y F (SEC ID NO: 21). A través de series de eliminaciones sistemáticas comprendiendo tanto eliminaciones secuenciales como mutaciones de caída, junto con ensayos de desplazamiento en gel, las regiones del elemento del promotor AOX1 (SEC ID NO: 1) involucradas en la regulación e interacciones de proteína ADN se identificaron (como se establece con mayor detalle en el ejemplo de la sección siguiente). Con base en este análisis de eliminación, como se describe en ia Figura 2, los fragmentos A (SEC ID NO: 16), B (SEC ID NO: 17), C (SEC ID NO: 18), E (SEC ID NO: 20) y F (SEC ID NO: 21) contienen sitios reguladores positivos, mientras que el fragmento D (SEC ID NO: 19) contiene un sitio regulador negativo. Además, con base en los ensayos de desplazamiento en gei, como se describe en la Figura 3 y Figura 4, se cree que los fragmentos A (SEC ID NO: 16), y C (SEC ID NO: 18) contienen secuencias para diferentes proteínas de unión a ADN. Se debe observar que, los nucleótidos específicos dentro de una región reguladora pueden servir múltiples funciones. Por ejemplo, un nucleótido específico pues ser parte de un promotor y participar en la unión de una proteína activadora transcripcional. De esta manera, mientras los solicitantes creen que A (SEC ID NO: 16), B (SEC ID NO: 17), C (SEC ID NO: 18), E (SEC ID NO: 20) y F (SEC ID NO: 21) contienen sitios reguladores positivos, y el fragmento D (SEC ID NO: 19) contiene un sitio regulador negativo, además de la función manifestada, cada una de estas regiones reguladoras puede servir múltiples funciones reguladoras. La presente invención, por lo tanto, abarca un polinucieótido aislado que comprende una región reguladora conteniendo SEC ID NO: 16, un fragmento de SEC ID NO: 16, el complemento de SEC ID NO: 16 o un fragmento del complemento de SEC ID NO: 16. En una modalidad, el polinucieótido (o fragmento, o el complemento ya sea del polinucleótido o del fragmento) tiene una longitud menor que aproximadamente 1000 nucleotidos, en otra modalidad el polinucleótido está entre 4 nucleotidos a aproximadamente 750 nucleotidos de largo. Más preferiblemente, sin embargo, el polinucleótido está entre aproximadamente 250 nucleotidos a aproximadamente 750 nucleotidos de largo. Los fragmentos pueden ser empleados como sondas para SEC ID NO: 16 o secuencias relacionadas. También se incluyen los polinucleótidos aislados que hibridizan a SEC ID NO: 16, o el complemento de SEC ID NO: 16 bajo condiciones de alta severidad. En una modalidad esos polinucleótido tienen una longitud menor que aproximadamente 1000 nucleotidos, en otra modalidad estos polinucleótido están entre aproximadamente 4 nucleotidos a aproximadamente 750 nucleotidos de longitud. Dichos polinucleótidos pueden ser utilizados como sondas de SEC ID NO: 16 o secuencias relacionadas. Aún otra modalidad provee un polinucleótido aislado que comprende una región reguladora conteniendo SEC ID NO: 17, un fragmento de SEC ID NO: 17, el complemento de SEC ID NO: 17, o un fragmento del complemento de SEC ID NO: 17. En una modalidad el polinucleótido (o fragmento, o el complemento ya sea del polinucleótido o del fragmento) tiene una longitud menor que aproximadamente 1000 nucleotidos, en otra modalidad el polinucleótido está entre 4 nucleotidos a aproximadamente 750 nucleotidos de longitud. Más preferiblemente, sin embargo, el polinucleótido está entre aproximadamente 250 nucleotidos a aproximadamente 750 .nucleótidos de longitud. Los fragmentos pueden ser empleados como sondas para SEC ID NO: 17 o secuencias relacionadas. También se incluyen los polinucleótidos aislados que hibridizan a SEC ID NO: 17, o el complemento de SEC ID NO: 17 bajo condiciones de alta severidad. En una modalidad esos polinucleotido tienen una longitud menor que aproximadamente 1000 nucleótidos, en otra modalidad estos polinucleotido están entre aproximadamente 4 nucleótidos a aproximadamente 750 nucleótidos de longitud. Dichos polinucleótidos pueden ser utilizados como sondas de SEC ID NO: 17 o secuencias relacionadas. Aún otra modalidad la invención abarca un polinucleotido aislado que comprende una región reguladora conteniendo SEC ID NO: 18, un fragmento de SEC ID NO: 18, el complemento de SEC ID NO: 18, o un fragmento del complemento de SEC ID NO: 18. En una modalidad el polinucleotido (o fragmento, o el complemento ya sea del polinucleotido o del fragmento) tiene una longitud menor que aproximadamente 1000 nucleótidos, en otra modalidad el polinucleotido está entre 4 nucleótidos a aproximadamente 750 nucleótidos de longitud. Más preferiblemente, sin embargo, el polinucleotido está entre aproximadamente 250 nucleótidos a aproximadamente 750 nucleótidos de longitud. Los fragmentos pueden ser empleados como sondas para SEC ID NO: 18 o secuencias relacionadas. También se incluyen los polinucleótidos aislados que hibridizan a SEC ID NO: 18, o el complemento de SEC ID NO: 18 bajo condiciones de alta severidad. En una modalidad esos polinucleótido tienen una longitud menor que aproximadamente 1000 nucleótidos, en otra modalidad estos polinucleótido están entre aproximadamente 4 nucleótidos a aproximadamente 750 nucleótidos de longitud. Dichos polinucleótidos pueden ser utilizados como sondas de SEC ID NO: 18 o secuencias relacionadas. Una modalidad adicional de la invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende una región reguladora conteniendo SEC ID NO: 19, un fragmento de SEC ID NO: 19, el complemento de SEC ID NO: 19, o un fragmento del complemento de SEC ID NO: 19. En una modalidad el polinucleótido (o fragmento, o el complemento ya sea del polinucleótido o del fragmento) tiene una longitud menor que aproximadamente 1000 nucleótidos, en otra modalidad el polinucleótido está entre 4 nucleótidos a aproximadamente 750 nucleótidos de longitud. Más preferiblemente, sin embargo, el polinucleótido está entre aproximadamente 250 nucleótidos a aproximadamente 750 nucleótidos de longitud. Los fragmentos pueden ser empleados como sondas para SEC ID NO: 19 o secuencias relacionadas. También se incluyen los polinucleótidos aislados que hibridizan a SEC ID NO: 19, o el complemento de SEC ID NO: 19 bajo condiciones de alta severidad. En una modalidad esos polinucleótido tienen una longitud menor que aproximadamente 1000 nucleótidos, en otra modalidad estos polinucleótido están entre aproximadamente 4 nucleótidos a aproximadamente 750 nucleótidos de longitud. Dichos polinucleótidos pueden ser utilizados como sondas de SEC ID NO: 19 o secuencias relacionadas.

En aún otra modalidad, la invención abarca un polinucleótido aislado que comprende una región reguladora conteniendo SEC ID NO: 20, un fragmento de SEC ID NO: 20, el complemento de SEC ID NO: 20, o un fragmento del complemento de SEC ID NO: 20. En una modalidad el polinucleótido (o fragmento, o el complemento ya sea del polinucleótido o del fragmento) tiene una longitud menor que aproximadamente 1000 nucleótidos, en otra modalidad el polinucleótido está entre 4 nucleótidos a aproximadamente 750 nucleótidos de longitud. Más preferiblemente, sin embargo, el polinucleótido está entre aproximadamente 250 nucleótidos a aproximadamente 750 nucleótidos de longitud. Los fragmentos pueden ser empleados como sondas para SEC ID NO: 20 o secuencias relacionadas. También se incluyen los polinucleótidos aislados que hibridizan a SEC ID NO: 20, o el complemento de SEC ID NO: 20 bajo condiciones de alta severidad. En una modalidad esos polinucleótido tienen una longitud menor que aproximadamente 1000 nucleótidos, en otra modalidad estos polinucleótido están entre aproximadamente 4 nucleótidos a aproximadamente 750 nucleótidos de longitud. Dichos polinucleótidos pueden ser utilizados como sondas de SEC ID NO: 20 o secuencias relacionadas. Una modalidad adicional de la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende una región reguladora conteniendo SEC ID NO: 21, un fragmento de SEC ID NO: 21, el complemento de SEC ID NO: 21, o un fragmento del complemento de SEC ID NO: 21. En una modalidad el polinucleótido (o fragmento, o el complemento ya sea del polinucleótido o del fragmento) tiene una longitud menor que aproximadamente 1000 nucleótidos, en otra modalidad el polinucleótido está entre 4 nucleótidos a aproximadamente 750 nucleótidos de longitud. Más preferiblemente, sin embargo, el polinucleótido está entre aproximadamente 250 nucleótidos a aproximadamente 750 nucleótidos de longitud. Los fragmentos pueden ser empleados como sondas para SEC ID NO: 21 o secuencias relacionadas. También se incluyen los polinucleótidos aislados que hibridizan a SEC ID NO: 21, o el complemento de SEC ID NO: 21 bajo condiciones de alta severidad. En una modalidad esos polinucleótido tienen una longitud menor que aproximadamente 1000 nucleótidos, en otra modalidad estos polinucleótido están entre aproximadamente 4 nucleótidos a aproximadamente 750 nucleótidos de longitud. Dichos polinucleótidos pueden ser utilizados como sondas de SEC ID NO: 21 o secuencias relacionadas. Como es bien conocido en la técnica, la severidad está relacionada con la Tm del híbrido formado. La Tm (temperatura de fusión) de un híbrido de acido nucleico es la temperatura a la cual el 50% de las bases son pares de bases. Por ejemplo, si uno de patrones en un híbrido es un oligonucleótido corto de aproximadamente 20 bases, 50% de los dúplex típicamente son de estructura de cadena separada en la Tm. En este caso, la Tm refleja un equilibrio independiente del tiempo que depende de la concentración de oligonucleótido. En contraste, si ambas estructuras de cadena son más largas, la Tm corresponde a una situación en la cual las estructuras de cadena con mantenidas juntas en la estructura posiblemente conteniendo dúplex alternativos y regiones desnaturalizadas. En este caso, la Tm refleja un equilibrio intermolecular que es independiente del tiempo y concentración de polinucleótido. Como también es bien conocido en la técnica, Tm es dependiente de la composición del polinucleótido (por ejemplo, longitud, tipo de dúplex, composición de base, y extensión de la formación de pares de base precisos) y la composición del solvente (por ejemplo, concentración de sal y la presencia de desnaturalizadotes tales como formamida). Una ecuación para el cálculo de Tm puede ser encontrada en Sambrook y otros, (Molecular Cloning, 2a. edición, Cold Spring Harbor Press, 1989) y es: Tm = 81.5°C - 16.6(log10[Na+]) = 0.41 (% G + C) - 0.63 (% formamida) - 600/L). En donde L es la longitud del híbrido en los pares de base, la concentración de Na+ está en la escala de 0.01M a 0.4M y el contenido de G + C está en la escala de 30% a 75%. Las ecuaciones para ARN involucrando híbridos pueden encontrarse en la misma referencia. Las ecuaciones alternativas pueden encontrarse en Davis y otros, Basic Methods in Molecular Biology, 2a. edición, Appleton and Lange, Sec 6-8. Los métodos para la hibridación y lavado son bien conocidos en la técnica y pueden encontrarse en referencias estándares en biología molecular tales como aquellas citadas aquí. En general, las hibridaciones son usualmente llevadas a cabo en soluciones de alta resistencia iónica (6X SSC o 6X SSPE) a una temperatura de 20-25°C por debajo de Tm. Las condiciones de lavado de alta severidad por lo general se determinan empíricamente en experimentos preliminares, pero usualmente involucran una combinación de sal y temperatura que es de aproximadamente 12-20°C por debajo de Tm. Un ejemplo de condiciones de alta severidad es 1X SSC a 60°C. Otro ejemplo de condiciones de lavado de alta severidad es 0.1X SSPE, 0.1% SDS a 42°C (Meinkoth y Wahl, Anal. Biochem, 138:267-284, 1984). Un ejemplo de condiciones de lavado aún más severas es 0.1X SSPE, 0.1% SDS a 50-65°C. En una modalidad preferida, el lavado de alta severidad se lleva a cabo bajo condiciones de 1X SSC y 60°C. En otra modalidad la presente invención proporciona una secuencia de poiinucleótido aislado con por lo menos un 80%, más preferiblemente 90%, aún más preferiblemente 95%, aún más de preferencia 97%, y aún más preferentemente 99% de homología de secuencia a SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 18, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 20 o SEC ID NO: 21 o el complemento de SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 18, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 20 o SEC ID NO: 21. "Homología", como se entiende en la técnica, es una relación entre dos o más secuencias de polipéptido o dos o más secuencias de poiinucleótido. En la técnica, "homología" también significa el grado de relevancia entre secuencias de polipéptido o poiinucleótido, según determinado por la comparación entre cadenas de dichas secuencias. La "Homología" puede ser fácilmente calculada a través de métodos conocidos, pero no se limita a, aquellos descritos en Computacional Molecular Biology, Lesk, A. M. ed., Oxford University Press, New York (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte I, Griffin, A.M. y Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer, Gribskov, . y Devereux, J., eds., Stockton Press, New York (1991); y Carrillo, H., y Lipman, D., SIA J. Applied Math, 48:1073 (1988). Los métodos para determinar homología se diseñan para dar la mayor coincidencia entre las secuencias probadas. Además, los métodos para determinar la homología se codifican en programas públicamente disponibles. Los programas de computadora que pueden ser utilizados para determinar identidad/homología entre dos secuencias incluyen, pero no se limitan a, GCG (Devereux, J., y otros, Nucleic Acids Research 12(1):387 (1984); juego de de cinco programas BLAST, tres diseñados para investigaciones de secuencias de nucleótido (BLASTN, BLASTX, y TBLASTX) y dos diseñados para investigaciones de secuencia de proteína (BLASTP y TBLASTIN) (Coulson, Trends in Biotechnology, 12: 76-80 (1994); Birren y otros, Genome Analysis, 7/543-559 (1997). El programa BLAST X está públicamente disponible de NCBI y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul, S., y otros, NCBI NLM NIH, Bethesda, MD 20894; Altschul, S., y otros, J. Mol. Biol., 215: 403-410 (1990)). El algoritmo de Smith Waterman bien conocido también puede ser utilizad para, determinar la homología. El polinucleótido aislado que comprende la región reguladora de la presente invención, sin estar unido por ninguna limitación, puede comprender cualquier combinación de SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 18, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 20 o SEC ID NO: 21. Adicionalmente, la región reguladora puede comprender cualquier combinación de el complemento de SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 18, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 20 o SEC ID NO: 21 o un fragmento del complemento de cualquiera de estas secuencias. La región reguladora, también puede comprender cualquier combinación de polinucleótidos aislados que hibridizan bajo condiciones de alta severidad a SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 18, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 20 o SEC ID NO: 21 o que hibridizan bajo condiciones de alta severidad al complemento de SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 18, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 20 o SEC ID NO: 21. Además, la región reguladora, puede comprender cualquier combinación de polinucleótidos aislados con por lo menos 80% de homología de secuencia a SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 18, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 20 o SEC ID NO: 21 o el complemento de SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 18, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 20 o SEC ID NO: 21. Por consiguiente, por ejemplo, en una modalidad de la presente invención, la región reguladora comprende SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 18, de 1 a aproximadamente 3 copias de SEC ID NO: 20, y SEC ID NO: 21. En aún otra modalidad, la región reguladora comprende SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 18, SEC ID NO: 20 o SEC ID NO: 21. Los polinucleótidos comprenden regiones reguladoras de la presente invención pueden ser aislados a través de cualquier método generalmente conocido en la técnica para aislar regiones no codificadas de secuencias de acido nucleico. Uno de dichos métodos comprende la utilización de hibridación de una sonda de una colección genómica para detectar secuencias de nucleótidos compartidas y se detalla en, por ejemplo, Sambrook y otros, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a. edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989), y Ausubel y otros, Short Protocole in Molecular Biology, 3a. edición, John Wiley & Sons (1995). También se incluyen los vectores que comprenden las secuencias reguladoras de polinucleótido aislado de la invención o el complemento de las mismas, como se establece en detalle más adelante. Cualquier vector adecuado para la propagación en levadura puede ser empleado tal como, por ejemplo, pIBI (Sears y otros, (1998) Levadura 14: 783-90), series de vectores pPICZ (comercialmente disponible a través de Invitrogen, Carlsbad, California), y pPIC9K (comercialmente disponible a través de Invitrogen, Carlsbad, California). El vector también puede ser ya sea un vector de clonación o un vector de expresión. Un vector de clonación es una molécula de ADN autoreplicante que sirve para mantener un segmento de ADN en una célula huésped. El tipo más común de vectores de clonación son los plásmidos bacterianos. Un vector de expresión es un vector de clonación diseñado de tal manera que una secuencia insertada en un sitio particular será transcrita en ARNm y además puede ser traducida en una proteína. Tanto los vectores de clonación como los vectores de expresión usualmente contienen secuencias de nucleótidos que permiten que los vectores repliquen en una o más células huésped. En los vectores de clonación, esta secuencia es generalmente una que habilita al vector para replicar independientemente de los cromosomas de la célula huésped, y también incluye ya sea orígenes de replicación o secuencias de replicación autónomas. Varios orígenes bacterianos y de levadura de replicación son bien conocidos por aquellos con experiencia en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, el origen de plásmido pBR322, y el origen de plásmido 2µ. Ausubel y otros, ed., Short Protocols in Molecular Biology, 3a. edición, Wiley & Sons, 1995. El polinucleótido aislado que comprende secuencias reguladoras de la presente invención puede ser insertado en el vector a través de una variedad de métodos. En aún otra modalidad, el polinucleótido aislado comprende regiones reguladoras operablemente enlazadas a una región de codificación heteróloga puede ser insertado en el vector. En el método más común, la secuencia se inserta en un sitio(s) de endonucleasa de restricción apropiado utilizando procedimientos comúnmente conocidos por aquellos con experiencia en la técnica y detallados en, por ejemplo, Sambrook y otros, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a. edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989) y Ausubel y otros, Short Protocols in Molecular Biology, 3a. edición, John Wiley & Sons (1995). Los vectores de expresión y clonación pueden y usualmente contienen un gen de selección o marcador de selección. Típicamente, este gen codifica un proteína necesaria para la supervivencia o crecimiento de la célula huésped transformada con el vector. Ejemplos de marcadores de selección adecuados incluyen, HIS4, ARG4, ble, y kan (Cregg y otros, (2000) Mol. Biotech. 16: 23-52). El marcador de selección puede tener su propio promotor por lo que la expresión del marcador ocurre independiente de la construcción del polinucieótido. El promotor de marcador puede ser ya sea un promotor constitutivo o uno inducible. En una modalidad adicional, el vector de la presente invención también típicamente incluirá una secuencia que es homologa con la secuencia del huésped a un lugar de gen particular, por ejemplo una porción del gen His4 o gen AOX (ambos genes de levadura), para habilitar al vector insertarse en cromosomas de huésped a través de recombinación homologa. Preferiblemente, la secuencia homologa empleada en la invención estará a aproximadamente 200 nucleótidos en longitud y tiene homología para ADN genómico de levadura. Los solicitantes han encontrado que dicha integración es deseable, particularmente cuando el huésped es P. pastoris, debido a que los vectores no tienden a integrarse para ser inestables.

Más particularmente, en otra modalidad se proporciona un polinucleótido recombinante que comprende cualquiera de ias regiones reguladoras anteriores de la invención operablemente enlazadas a un región de codificación heteróloga. Dichos polinucleótidos recombinantes son comúnmente empleados en vectores de clonación o expresión (como se detalló anteriormente), aunque otros usos son posibles. La región de codificación heteróloga puede codificar cualquier proteína de interés adecuada para expresión en la célula huésped, tales como enzimas, hormonas, proteínas reguladoras, proteínas estructurales o antígenos (para uso en la inducción de una respuesta inmune). Los polinucleótidos aislados de la presente invención pueden ser parte de un cartucho de expresión que mínimamente comprende, operablemente enlazado en la dirección 5' a 3', un polinucleótido comprendiendo una región reguladora de la presente invención, una región de codificación heteróloga y una secuencia de señal de terminación transcripcional funcional en la célula huésped. El cartucho de expresión puede comprender cualquiera de las regiones de polinucleótido aislado de la invención, como se discutió previamente. Adicionalmente, la región de codificación heteróloga puede codificar cualquier proteína de interés adecuada para la expresión en la célula huésped, tales como enzimas, hormonas, proteínas reguladoras, proteínas estructurales, o antígenos (para uso en la inducción de una respuesta inmune). En una modalidad adicional, el cartucho de expresión también puede comprender una secuencia de activación operablemente enlazada, región de codificación del péptido de tránsito o secreción capaz de dirigir el transporte de la región de codificación del péptido producido a la ubicación deseada. El cartucho de expresión también puede comprender una secuencia de nucleótido codificando un marcador seleccionable y/o porción de purificación. Varios métodos han sido divisados para la adición de dichas porciones de purificación de afinidad para las proteínas. Ejemplos representativos pueden encontrarse en las patente de E.U.A. Nos. 4,703,004, 4,782,137, 4,845,341, 5,935,824, y 5,594,115. Cualquier método conocido en la técnica para la adición de las secuencias de nucleótido codificando porciones de purificación pueden ser utilizados, por ejemplo aquellos contenidos en Innis y otros, PCR Protocols, Academic Press, (1990), y Sambrook y otros, Molecular Cloning, 2a. edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). En aún otra modalidad, el cartucho de expresión puede comprender una secuencia que es homologa con la secuencia del huésped en un sitio del gen particular para habilitar al cartucho la inserción dentro de los cromosomas del huésped a través de recombinación homologa. Abarcadas dentro de la presente invención están las células huésped transformadas con cualquiera de las construcciones descritas aquí comprendiendo las secuencias reguladoras de polinucleótido de la invención. La célula huésped es preferiblemente una célula de levadura. La levadura es el huésped preferido cuando las secuencias reguladoras de la invención son empleadas. Como se manifestó anteriormente, las regiones reguladoras de la invención son reprimibles en respuesta a la represión de las fuentes de carbono (por ejemplo, glucosa, etanol, fructuosa, galactosa, sacarosa y glicerol) e inducibles en respuesta a fuentes de carbono con reprimidas (por ejemplo, sorbital, manitol, trehalosa, y alanina) cuando se somete la levadura transformada a la falta de carbono. Por consiguiente, la expresión de gen puede ser estrictamente regulada con base en el medio seleccionado par el crecimiento de las células. Aún más preferiblemente, sin embargo, el huésped será una célula de levadura metilotrófica. Aún más preferiblemente, la célula de levadura metilotrófica se selecciona del grupo que consiste de Hansenula, Candida, Torulopsis y Pichia. Aún más preferiblemente, la célula de levadura es de P. pastoris. El uso de la levadura metilotrófica proporciona medios adicionales para controlar la expresión de gen cuando se emplean las regiones reguladoras de la invención. La levadura metilotrófica, según opuesto a la levadura en general, es capaz de crecer en metanol como el carbono solo y fuente de energía. Además, como se delineó anteriormente, el metanol es un inductor fuerte de las secuencias reguladoras de la invención. Por ejemplo, las células P. pastoris desarrolladas en metano, AOX fácilmente acumula hasta un 30% de la proteína soluble total. De esta manera, el uso de levadura metilotrófica como células huésped en la presente invención proporciona un mecanismo a ambos la expresión de gen de control probable y al mismo tiempo, logra una gran escala de expresión. La introducción de la construcción en la célula huésped puede ser lograda a través de cualquier método conocido en la técnica. La presente invención también incluye métodos para la producción de proteínas a partir de las células huésped transformadas antes mencionadas con cualquiera de las construcciones caracterizadas aquí, conteniendo las regiones reguladoras de polinucleótido de la presente invención, operablemente enlazadas a un gen que codifica la proteína deseada. La proteínas pueden ser expresadas en cualesquiera células huésped adecuadas previamente identificadas. Las células huésped con genéticamente transformadas para producir la proteína de interés introduciendo un vector de expresión conteniendo la secuencia de ácido nucleico de interés. Las características de los vectores de clonación adecuados y los métodos para su introducción en las células huésped has sido previamente discutidos. Los métodos para dicha producción de proteínas son conocidos por aquellos con experiencia en la técnica. (Davis y otros, Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Sciencie Publishing (1986); Ausubel y otros, Short Protocols in Molecular Biology^ 2a. edición, Ed., John Wiley & Sons, (1992). Las células huésped son desarrolladas bajo condiciones apropiadas a una densidad de célula adecuada para optimizar la expresión de la proteína. Si la proteína se acumula en la célula huésped, las células son cosechadas a través, de por ejemplo, centrifugación o filtración. Las células entonces son interrumpidas a través de medios físicos o químicos para liberar la proteína dentro del extracto de célula a partir del cual la proteína puede ser purificada. Si las células huésped secretan la proteína en el medio, las células y el medio se separan y el medio se retiene para la purificación de la proteína. Grandes cantidades de proteína pueden ser obtenidas a partir células que llevan copias amplificadas de la secuencia de interés. En este método, la secuencia está contenida en un vector que lleva un marcador seleccionable y transfectado dentro de la célula huésped o el marcador seleccionable es co-transfectado dentro de la célula huésped junto con la secuencia de interés. Las líneas de células huésped entonces son seleccionadas en donde el número de copias de la secuencia ha sido amplificado. Un número de marcadores seleccionables adecuados serán fácilmente aparentes para aquellos con experiencia en la técnica. Por ejemplo, el gen sh ble es ampliamente utilizado como un marcador para co-amplificación. El producto de gen sh ble confiere resistencia al fármaco Zeocin en ambos E. coli y levadura. Las proteínas recuperadas pueden ser purificadas a través de una variedad de métodos comúnmente utilizados, incluyendo, pero no limitándose a, precipitación de sulfato de amonio, precipitación inmune, precipitación de etanol o acetona, extracción de ácido, cromatografía de intercambio de ión, cromatografía de exclusión de tamaño, cromatografía de afinidad, cromatografía de líquido de alto desarrollo, electroforesis y ultra filtración. Si se requiere, los sistemas de redoblamiento de proteína pueden ser utilizados para completar la configuración de la proteína. El polinucleótido que codifica las secuencias reguladoras de la invención, como se describió con detalle anteriormente, pueden ser empleadas para incrementar la expresión de los genes de interés en una variedad de células huésped. Sin embargo, los solicitantes descubrieron, además de la expresión de gen incrementada, pueden también se empleados para un número de otras funciones. Por ejemplo, las secuencias reguladoras de la invención pueden ser empleadas en una configuración de investigación para caracterizar de manera adicional la función del promotor y para estudiar la biogénesis de peroxisoma. La descripción detallada establecida anteriormente ser proporciona para ayudar a aquellos con experiencia en la técnica en la práctica de la presente invención. Aunque, esta descripción detallada no debe ser construida para limitar excesivamente la presente invención como las modificaciones y variaciones en las modalidades discutidas aquí pueden ser hechas por aquellos con experiencia en la técnica sin apartarse del espíritu y alcance del descubrimiento de la presente invención. Todas las publicaciones, patentes, solicitudes de patente y otras referencias citadas en esta aplicación se incorporan aquí por referencia en su totalidad como si cada publicación individual, patente, solicitud de patente u otra referencia fuera específicamente e individualmente indicada par ser incorporada por referencia. Sin elaboración adicional, se cree que uno con experiencia en la técnica, utilizando la descripción precedente, utiliza la presente invención en su extensión más completa. Las siguientes modalidades preferidas especificas son, por lo tanto, para ser construidas meramente ilustrativas, y no imitativas del remanente de la descripción en cualquier manera en absoluto.

EJEMPLO Materiales y Métodos Estructuras de cadena y plásmidos. El plásmido pSAOH5 (Tschopp y otros, (1987) Nucleic Acids Res. 15: 3859-76) y la estructuras de cadena P. pastoris GS115 (Tschopp y otros, (1987) Nucleic Acids Res. 15: 3859-76) (his4) fueron el generoso regalo de J. M. Cregg, Keck Gradúate Institute, Claremont, CA. El vector de menos expresión del promotor p I B 1 se proporcionó a través de B. S. Glick (University of Chicago, Chicago, IL). Las cepas E. coli JM109 [endAI, recAI, gyrfk96, thi, hsdRM (rk"' mk+), re/A1, supE A, 1", D(/ac"proAB), [F\ rraD36, proA+B\ /aclqZDM15] y ES1301 mutS (LacZ53, mufS201: :Tn5, thyA36, r a~5, meíB1, deoC, IN (rrnD-rrnE), pALTER® II in Vitro Mutagenesis System (Promega, Madison, Wl). El medio, condiciones de crecimiento y análisis enzimático. Las levaduras se desarrollaron en mínimo medio de glicerol (MGY: 1.34% de base de nitrógeno de levadura sin aminoácidos, 1% de glicerol, 4x10"5 % de biotina) y células transformadas se seleccionaron en placas de Dextrosa Mínima (MD) (1.34% de base de nitrógeno de levadura sin aminoácidos (YNB), 2% de glucosa, 4 x 10"5% de biotina y 1.5% agar). Si se requiere 0.0004% de histidina se agregó al medio. Las células se desarrollaron en Metanol Mínimo (MM, 1.34% YNB, 4 x 10"5% de biotina, 0.5% de metanol) y Metanol-Etanol Mínimo (MME, 1.34% Y B, 4 x 10'5% de biotina, 0.5% de metanol y 0.5% de etanol) hasta que la densidad óptica (600 nm) alcanzó 1.5-2.0 a 30°C. La actividad ß-Gal se ensayó utilizando ONPG (o-Nitrofenil B-D-glactopiranosida) según reportado por el ensayo de Miller, J. H. de ß-galactosidasa, en Miller. J.H. (ed), Experiments in Molecular Genetic, Cold Spring Harbor Laboratory, pp. 352-3558 (1972) incorporando la modificación propuesta por Guarente y Ptashne, Fusión de Escherichia coli lacZ al gen c citrocromo de Saccharamoyces cerevisiae. Proc. Nati. Acaó. Se/. U S A 78, 2199-203 (1981). Las células se permeabilizaron con cloroformo y dodecil sulfato de sodio (SDS) y los resultados se reportaron en unidades Miller.

Técnicas de ADN Generales. Las enzimas de restricción e iniciadores fueron de New England Biolabs Inc. (Beverly, MA), la Mutagénesis Dirigida al Sitio (SDM) se llevó a cabo con el Sistema Altered Sites® in Vitro Mutagénesis System de Promega (Madison, Wl) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Los iniciadores se compraron en Sigma/Genosys (The Woodlands, TX). Los protocolos para el sistema se siguieron como se describió en e manual técnico. Todas las otras manipulaciones de ADN se describieron previamente (Sambrook y otros (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual). Un fragmento HIS4 de 1.5 Kb de pAL2 se utilizó para el análisis Southern para seleccionar transformantes de copia individual.

Construcciones de plásmido. El plásmido pSAOH5 se utilizó primero como el plásmido padre para caracterizar la regulación del gen LacZ bajo el control de promotor AOX1 de P. pastoris. pAL2, un plásmido de integración, se construyó debido a la inestabilidad del plásmido pSAOH5 en P. pastoris. El fragmento Eco R\-Nru de 3.6 kb de pSAOH5 se insertó en la región Eco Rl-Sma / de plB1, el promotor menos el vector de expresión Pichia, y el plásmido padre pAL2 se obtuvieron. El fragmento Eco R\/Nru I de pSAOH5 contenido en la región no traducida 5' y los primeros 15 aminoácidos de AOX1 se fusionaron al gen /acZ en el codón nueve. El plásmido de mutagénesis, pMMI101, se construyó insertando un par de base 1120 Eco R\-Bam Hl de pSAOH5 en pALTER-1 (Figura 1). Los plásmidos conteniendo los derivados de eliminación 5' del promotor AOX1 se construyeron utilizando el sistema Altered Sites® II in vigro Mutagénesis System para insertar los sitios Eco Rl en varias posiciones a lo largo del elemento promotor. Los iniciadores utilizados para obtener los derivados de eliminación 5' del promotor AOX1 son como siguen: AOXRI32 5'-ACGCAGGAATTCCTCCACTC-3' (SEC ID NO: 22) AoxRr285 5'-GGCGAGGAATTCATGTTTGT-3' (SEC ID NO: 23) AoxRr424 5'-GTCTTGGAATTCCTAATATGAC-3' (SEC ID NO: 24) AoxRI551 5'-GGTATTGAATTCACGAATGCTC-3' (SEC ID NO: 25) AOXRI699 5'-CTTCCAGGAATTCTGGTGGG-3' (SEC ID NO: 26) Los plásmidos mutantes (pMMM 32-pM I669) se digirieron con Eco R\/Sma I, y los fragmentos se intercambiaron con el promotor AOX1 nativo en pAL2. La construcción de las series pALD que removieron las secuencias de promotor interno AOX1 fueron como sigue: series p.m. de los plásmidos, pMMI132, pMMI285, pMMI424, y pMMI551 las cuales llevaron los sitios Eco Rl mutantes y eliminaron los fragmentos del promotor AOX1 5' corriente arriba, A (SEC ID NO: 16), Ab (SEC ID NO: 16 y SEC ID NO: 17, respectivamente), ABC (SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 17 y SEC ID NO: 18, respectivamente) ABCD (SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 17 y SEC ID NO: 19, respectivamente), respectivamente. Estos fragmentos se insertaron en los plásmidos de expresión llevando los derivados de eliminación secuenciales del promotor AOX1, pAL285, pAL424, pAL551, pAL669, y los plásmidos se nombraron pALD 1 , pALD2, pALD3, y pALD4, respectivamente. Consecuentemente cada plásmido pALD carece de los fragmentos de promotor B (SEC ID NO: 17), C (SEC ID NO: 18), D (SEC ID NO: 19), y E (SEC ID NO: 20) respectivamente.

Con el fin de purificar las regiones de los fragmentos (B (SEC ID NO: 17), C (SEC ID NO: 18), D (SEC ID NO: 19), y E (SEC ID NO: 20)) para en ensayo de desplazamiento de banda, se hizo una segunda ronda de mutagénesis dirigida al sitio. Los iniciadores pMMI132, pMMl285, pMMI424, p I551 y AOXRI285, AoxRl424, AoXRI551 y AOXRI669 se utilizaron para reacciones SDM (mutagénesis dirigida al sitio) para dejar caer el fragmento B (SEC ID NO: 17), C (SEC ID NO: 18), D (SEC ID NO: 19), y E (SEC ID NO: 20), respectivamente. Por ejemplo, para purificar el fragmento B (SEC ID NO: 17), el ADN de estructura de cadena individual p I132 y el iniciador AOX1285 se utilizaron para insertar un tercer sitio EcoRI en el promotor AOX1. Después de la mutagénesis dirigida al sitio, cada uno de los fragmentos A (SEC ID NO: 17), B (SEC ID NO: 17), C (SEC ID NO: 18), D (SEC ID NO: 19), E (SEC ID NO: 20) y F (SEC ID NO: 21) se purificaron con gel con un equipo Gene Clean II Kit (Bio101 , Inc. Vista, CA). Antes de la transformación, la eliminación y los plásmidos quiméricos c fueron digeridos con Stu I, el cual corta los vectores una vez dentro de las secuencias HIS4 para dirigir el evento de integración en el sitio his4 de la cepa GS115 huésped. Los transformantes se seleccionaron en medio MD el cual carece de histidina. Una copia individual de los plásmidos de las cepas transformadas de cepas transformadas se determinó a través de ensayo de tinción Southern. Por lo menos tres transformantes de copia individual se seleccionaron, se indujeron en medio M , y actividad ß-Gal se monitoreó en las cepas. Un cepa representativa se utilizó para estudios adicionales. Por lo menos tres experimentos de inducción independientes en medio MM y MME se hicieron para estimar la actividad de ß-Gal.

Sondas de ADN para ensayos de desplazamiento en qel. La segunda ronda SDM (mutagénesis dirigida al sitio) se hizo para purificar plásmidos pMMI132, pMMI285, pMMI424, pMMI551 para liberar fragmentos B (SEC ID NO: 17), C (SEC ID NO: 18), D (SEC ID NO: 19) y E (SEC ID NO: 20), respectivamente. El fragmento Eco Rl de pMMI132 y el fragmento Eco- RI/Sma de pMMI669 se utilizaron como fragmentos A (SEC ID NO: 16), y F (SEC ID NO: 21), respectivamente. Cada fragmento se purificó a partir de gel de azarosa y se terminó marcando con polimerasa de ADN utilizando dATP etiqueta infrarroja (Li-Cor Inc, Lincoln, NE).

Preparación de extractos de célula de levadura. Se desarrollaron levaduras en 25 mi de medio MM o MME a 30°C a 1.5 OD (600 nm). Las células se centrifugaron a 2,000 X g a temperatura ambiente, se lavaron dos veces con 1M de sorbitol y se suspendieron en 500 mi de regulador de pH C [20 mM de HEPES pH 8.0, 0.2 mM de EDTA, 0,5 mM de dítiotretiol (DTT), 0.05 mM de PMSF (fluoruro de fenilmetilsulfonilo), 0.42 NaCI, 1.5 mM de MgCI2, y 25% de glicerol]. Las células se rompieron con perlas de vidrio (0.45-0.5 mm de diámetro) en una batidora de perlas (Biospec Products) (7 x 30 seg).

Después de la centrifugación a 19,000 x g durante 15 minutos a 4°C, el sobrenadante se utilizó para los ensayos de retraso en gel. La proteína total de los extractos de célula se estimó a través del ensayo BCA (Pierce) utilizando BSA como una proteína estándar. Ensayo de retraso en gel. La mezclas de reacción de unión contuvieron 20 mM de Tris-HCI (pH 7.5), 100 mM de NaCI, 1 mM de DTT, 2 mg de poli (dl-dC)-poli (dl-dC) (desoxinosina-desoxicitosina), 0.05% de Nonidet-40, 10% de glicerol y ADN marcado en el extremo en un volumen de 20 mi. Las mezclas de reacción de unión incluyeron 6 mg de extracto de proteína. Después de 20 minutos de incubación a temperatura ambiente, las mezclas se cargaron en un gel de poliacrilamida precolado no desnaturalizado al 6% (Novex, Carlsbad, CA). La electroforesis se llevó a cabo a 10 v/cm de gel , durante 90 minutos en TBE (45 mM de Tris/borato, 1mM de EDTA). Los geles se secaron y se exploraron con un escáner de eje Y prototipo utilizando el software BaselmagIR v.4.0 (Li-Cor, Lincoln, NE).

Resultados Regulación de los derivados de eliminación del promotor AOX1.

Los plásmidos llevando las eliminaciones secuenciales (series pAL) y mutaciones de caída (series pDAL) se integraron en el sitio his4 del cromosoma de la cepa P. pastoris GS115 y los transformantes de copia individual se clasificaron a través de análisis de tinción Southern (los resultados no se muestran). Por lo menos tres transformantes de copia individual se clasificaron a través de expresión ß-gal en medio MM, y una cepa representativa se utilizó para experimentos de inducción adicionales. Cada transformante se cultivó en medio MGY (medio glicerol mínimo) durante la noche. El cultivo se utilizó para inocular el medio MM y MMe, con células que se desarrollaron a una densidad óptica de 1.5-2.0 (600 nM) antes de la cosecha. La actividad de la fusión AOX1-lacZ se midió y se reportó como porcentaje de la actividad de células desarrolladas en metanol conteniendo pAL2. Cada uno de los derivados de eliminación del promotor AOX1 disminuyó la actividad ß-Gal en medio MM comparado con el promotor nativo (Figura 2). La pérdida de fragmento D (SEC ID NO: 19) (-518/-396) (pAL551) resultó en aproximadamente un incremento de dos dobleces de la actividad de ß-Gal, con relación a pAL424, mientras la pérdida del fragmento E (SEC ID NO: 20) (-390/-239) tuvo el efecto más severo en la expresión. Las eliminaciones secuenciales no siempre reflejan la actividad de promotor relativa ya que el efecto acumulativo de las secuencias de acción cis es desechado. Por lo tanto, una series de derivados del promotor AOX1 se construyeron con eliminaciones internas (pALDs) para determinar el efecto exclusivo de cada fragmento. Solamente la pérdida de secuencias B (SEC ID NO: 17) y E (SEC ID NO: 20) tuvieron un efecto importante en la expresión de lacZ, sugiriendo que los elementos positivos están localizados dentro de estos intervalos de eliminación. El efecto más significativo sobre la actividad ß-Gal se observó a través de la eliminación del fragmento E (SEC ID NO: 20) (-390/-239) en donde el promotor AOX1 perdió 84% de actividad.

Aunque los derivados de eliminación del promotor AOX1 tuvieron un efecto significativo sobre la actividad del promotor de células desarrolladas en metano!, los plásmidos de eliminación y caída no formaron pares de represión inducida por etanol del promotor AOX1 (Figura 2).

Ensayos de Retraso en Gel. La cepa GS115 (pAL2) se utilizó para obtener extractos de proteína total desarrollados en condiciones reprimidas (MME) o inducidas (MM). Los fragmentos A, B, C, D, E y F (SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 18, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 20, y SEC ID NO: 21, respectivamente) se probaron en ensayos de desplazamiento en gel. El fragmento A (SEC ID NO: 16) dio como resultado la formación del complejo de proteína ADN específico cuando las células se desarrollaron bajo condiciones inducidas (metanol) (Figura 3, carril 2). Sin embargo, los extractos de proteína de célula desarrollados en etanol no revelaron ningún complejo de proteína ADN (Figura 3, carril 6). La especificidad se probó a través de la adición del competidor no marcado y ADN no específico no marcado (Carriles 3 y 5). Se utilizaron 2 mg de poli dl«dC poli dl«dC y 500-bp del producto de gen Listeria moncytogenes como ADNs no específicos. La adición del competidor (fragmento A no marcado) dio como resultado la pérdida de la señal (carril 3). Además, la adición del fragmento C no marcado (SEC ID NO". 18) (carril 4) no compitió con el fragmento A (SEC ID NO: 16) implicando que la unión de ADN para el fragmento C (SEC ID NO: 18) es específica y la unión de proteína al fragmento A (SEC ID NO: 16) no forma un complejo con el fragmento C (SEC ID NO: 18). El ensayo de desplazamiento en gel utilizando el fragmento C (SEC ID NO: 18) y la proteína total extraída de las células de levadura bajo condiciones inducidas y no inducidas reveló la formación de complejos de proteína ADN específicos. En este caso el fragmento A (SEC ID NO: 16) y el ADN no específico (ADN de L. monocytoenes) no compitió para la proteína (Figura 4, carriles 4, 8 y carriles 5, 9, respectivamente). La extracción de células desarrolladas en etanol/metanol forman un complejo con el fragmento C (SEC ID NO: 18), pero la intensidad de la señal fue más débil que aquella observada con células desarrolladas en metanol utilizando la misma cantidad de extracto de célula total (6 mg de proteína total). Los ensayos de desplazamiento en gel utilizando los fragmentos B (SEC ID NO: 17), D (SEC ID NO: 19), E (SEC ID NO: 20), y F (SEC ID NO: 21) no revelaron ningún complejo de proteína de ADN, aunque las condiciones del experimento de intercambio de gel diferentes se probaron (resultados no mostrados). Los resultados del intercambio en gel del fragmento F (SEC ID NO: 21) se muestran en la Figura 5. Adicionalmente, la Figura 6 describe las secuencias de consenso de promotores regulados en metanol de levadura metilotrófica.

En vista de la descripción detallada de la invención y los ejemplos presentados anteriormente, se puede apreciar que varios aspectos de la invención se lograron. Se entiende que la presente invención ha sido descrita en detalle a manera de ilustración y ejemplo con el fin de poner al corriente a otros con experiencia en la técnica con la invención, sus principios, y su aplicación práctica. Las formulaciones y procesos particulares de la presente invención no están limitados a las descripciones de las modalidades específicas presentadas, sino que las descripciones y ejemplos deben ser vistos en términos de las reivindicaciones que siguen y sus equivalentes. Mientras algunos de los ejemplos y descripciones anteriores incluyen algunas conclusiones acerca de la manera que la invención puede funcionar, los inventores no pretenden estar unidos a través de esas conclusiones y funciones, pero las establecen solamente como explicaciones posibles. Se debe entender además que las modalidades específicas de la presente invención establecidas no pretenden ser exhaustivas o [imitantes de la invención, y que muchas alternativas, modificaciones y variaciones serán aparentes para aquellos con experiencia en la técnica en luz de los ejemplos anteriores y la descripción detallada. Por consiguiente, esta invención pretende abarcar todas dichas alternativas, modificaciones y variaciones que caen dentro del espíritu y alcance de las siguientes reivindicaciones.

REIVINDICACIONES 1. Un polinucleótido aislado que comprende una región reguladora que contiene una secuencia de nucleótido menor de aproximadamente 1000 nucleótidos en longitud seleccionada del grupo que consiste de: (a) SEC ID NO: 16, un fragmento de la SEC ID NO: 16, el complemento de la SEC ID NO: 16, o un fragmento del complemento de la SEC ID NO: 16; (b) un polinucleótido que hibridiza al polinucleótido de (a) bajo condiciones de alta severidad; y (c) un polinucleótido con por lo menos 80% de homología de secuencia al polinucleótido de (a). 2. Un polinucleótido aislado que comprende una región reguladora que contiene una secuencia de nucleótido menor de aproximadamente 1000 nucleótidos en longitud seleccionada del grupo que consiste de: (a) SEC ID NO: 17, un fragmento de la SEC ID NO: 17, el complemento de la SEC ID NO: 17, o un fragmento del complemento de la SEC ID NO: 17; (b) un polinucleótido que hibridiza al polinucleótido de (a) bajo condiciones de alta severidad; y (c) un polinucleótido con por lo menos 80% de homología de secuencia al polinucleótido de (a). 3. Un polinucleótido aislado que comprende una región

Claims (1)

1. reguladora que contiene una secuencia de nucleótido menor de aproximadamente 1000 nucleótidos en longitud seleccionada del grupo que consiste de: (a) SEC ID NO: 18, un fragmento de la SEC ID NO: 18, el complemento de la SEC ID NO: 18, o un fragmento del complemento de la SEC ID NO: 18; (b) un polinucleótido que hibridiza al polinucieótido de (a) bajo condiciones de alta severidad; y (c) un polinucleótido con por lo menos 80% de homología de secuencia al polinucleótido de (a). 4. Un polinucleótido aislado que comprende una región reguladora que contiene una secuencia de nucleótido menor de aproximadamente 1000 nucleótidos en longitud seleccionada del grupo que consiste de: (a) SEC ID NO: 19, un fragmento de la SEC ID NO: 19, el complemento de la SEC ID NO: 19, o un fragmento del complemento de la SEC ID NO: 19; (b) un polinucleótido que hibridiza al polinucleótido de (a) bajo condiciones de alta severidad; y (c) un polinucleótido con por lo menos 80% de homología de secuencia al polinucleótido de (a). 5. Un polinucleótido aislado que comprende una región reguladora que contiene una secuencia de nucleótido menor de aproximadamente 1000 nucleótidos en longitud seleccionada del grupo que consiste de: (a) SEC ID NO: 20, un fragmento de la SEC ID NO: 20, eí complemento de la SEC ID NO: 20, o un fragmento del complemento de la SEC ID NO: 20; (b) un polinucleótido que hibridiza al polinucleótido de (a) bajo condiciones de alta severidad; y (c) un polinucleótido con por lo menos 80% de homología de secuencia al polinucleótido de (a). 6. Un polinucleótido aislado que comprende una región reguladora que contiene una secuencia de nucleótido menor de aproximadamente 1000 nucleótidos en longitud seleccionada del grupo que consiste de: (a) SEC ID NO: 21, un fragmento de la SEC ID NO: 21, el complemento de la SEC ID NO: 21, o un fragmento del complemento de la SEC ID NO: 21; (b) un polinucleótido que hibridiza al polinucleótido de (a) bajo condiciones de alta severidad; y (c) un polinucleótido con por lo menos 80% de homología de secuencia al polinucleótido de (a). 7. Un vector recombinante que comprende el polinucleótido aislado de cualquiera de las reivindicaciones 1-6 operablemente enlazado a una región de codificación heteróloga. 8. Un cartucho de expresión que comprende operablemente enlazado en el orden 5' a 3' el polinucleótido aislado de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, una región de codificación heteróloga y una secuencia de terminación. 9. Una célula huésped que comprende el vector de acuerdo con la reivindicación 7. 10. La célula huésped de acuerdo con la reivindicación 9, en donde la célula huésped es una célula de levadura. 11. La célula de levadura de acuerdo con la reivindicación 10, en donde la célula de levadura es una célula de levadura metilotrófica. 12. La célula de levadura metilotrófica de acuerdo con la reivindicación 11, en donde la célula de levadura se selecciona del grupo de género que consiste de Hansenula, Candida, Torulopsis, y P i chía. 13. La célula de levadura de acuerdo con la reivindicación 12, en donde la célula de levadura es de Pichia pasíoris. 14. Una célula huésped que comprende el cartucho de expresión de acuerdo con la reivindicación 8. 15. La célula huésped de acuerdo con la reivindicación 14, en donde la célula huésped es una célula de levadura. 16. La célula huésped de acuerdo con la reivindicación 15, en donde la célula de levadura es una célula de levadura metilotrófica. 17. La célula huésped de acuerdo con la reivindicación 16, en donde la célula de levadura metilotrófica se selecciona del grupo del género que consiste de de Hansenula, Candida, Torulopsis, y Pichia. 18. La célula de levadura de acuerdo con la reivindicación 17, en donde la célula de levadura es de Pichia pastoris. 19. La célula huésped de acuerdo con la reivindicación 9, en donde la célula huésped expresa una proteína codificada por el vector. 20. La célula huésped de acuerdo con la reivindicación 14, en donde la célula huésped expresa una proteína codificada por el cartucho de expresión. 21. Un método para la producción de una proteína que comprende el desarrollo de células huésped de acuerdo con la reivindicación 19 bajo condiciones en donde las células huésped expresan la proteína codificada por el vector y aislar la proteína expresada. 22. Un método para la producción de una proteína que comprende el desarrollo de células huésped de acuerdo con la reivindicación 20 bajo condiciones en donde las células huésped expresan la proteína codificada por el vector y aislar la proteína expresada.