MXPA03003111A - Metodos para producir rendimientos altos de embriones de pino cotiledonarios de apariencia cigotica utilizando medios que incluyen un disacarido y glucosa. - Google Patents

Abstract

La presente invencion provee metodos para producir embriones de pino cotiledonarios; los metodos de la invencion incluyen en cada caso el paso de cultivar tejido de pino embriogenico en medio, o sobre el mismo, que comprende un disacarido y glucosa para producir embriones de pino cotiledonarios, en que el disacarido y la glucosa estan presentes en cada caso en el medio a una concentracion menor que 3 por ciento; la presente invencion provee tambien embriones de pino cotiledonarios preparados mediante un metodo de la invencion.

Description

METODOS PARA PRODUCIR RENDIMIENTOS ALTOS DE EMBRIONES DE PINO COTILEDONARIOS DE APARIENCIA CIGOTICA UTILIZANDO MEDIOS QUE INCLUYEN UN DISACÁRIDO Y GLUCOSA CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a métodos para producir embriones vegetales ¡n vitro y producir opcionalmente plantas a partir de los embriones vegetales.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Continúa creciendo la demanda de árboles de pino para hacer productos de madera. Una solución propuesta a este problema es identificar árboles individuales que posean características convenientes, tales como índice rápido de crecimiento, y producir numerosos clones, genéticamente idénticos, de los árboles superiores por clonación somática. Se pueden cultivar estos clones para producir boscajes, o bosques completos, de árboles de pino que posean características convenientes. Un método de clonar árboles de pino utiliza tratamiento In vitro de tejido de pino vivo aislado en que condiciones que promuevan la formación de embriones, y luego de plantas enteras, a partir del tejido tratado. Se puede cultivar el tejido de pino aislado en presencia de una o más auxinas y/o citocininas, para promover la formación y la multiplicación de tejido embriogénico que se cultive luego en condiciones que promuevan la formación de embriones de pino cotiledonarios. Se pueden germinar luego los embriones para producir árboles de pino. Algunos ejemplos de tejido embriogénico de pino son las masas suspensorias embrionarias (ESM) que se pueden formar, por cultivo de tejido in vitro, a partir de embriones de pino disecados de semillas de pino. La figura 1 muestra masas suspensorias embrionarias de pino en cultivo líquido. La figura 2 muestra un embrión de pino embrionario cotiledonario formado a partir de ESM (los cotiledones están visibles en la parte superior del embrión). Un problema persistente, sin embargo, es estimular la formación eficiente de embriones de pino cotiledonarios que son capaces de germinar con alta frecuencia para producir plantas de pino. Preferiblemente, los embriones de pino cotiledonarios, formados in vitro, son morfológica, anatómica y bioquímicamente similares, o idénticos, los embriones de pino cigóticos formados, in vivo, en semillas de pino. En particular, hay necesidad de métodos para producir, in vitro, mayores números de embriones de pino cotiledonarios de apariencia cigótica que los que se producen mediante los métodos de la técnica anterior. Preferiblemente, la frecuencia de germinación y ia calidad de los embriones de pino cotiledonarios producidos mediante los novedosos métodos deben ser más altas que la frecuencia de germinación y calidad de los embriones de pino cotiledonarios producidos mediante los métodos de la técnica anterior.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención provee métodos para producir embriones de pino cotiledonarios. Los métodos de la invención producen números más grandes de embriones de pino cotiledonarios de apariencia cigótica que los que se producen mediante los métodos de la técnica anterior. Adicionalmente, la frecuencia de germinación y la calidad de los embriones de pino cotiledonarios producidos mediante los métodos de la invención son más altas que la frecuencia de germinación y la calidad de los embriones de pino cotiledonarios producidos mediante los métodos de la técnica anterior. Los métodos de la invención incluyen en cada caso el paso de cultivar tejido de pinto embriogénico en un medio, o sobre el mismo,, incluyendo un disacárido y glucosa para producir embriones de ???? · cotiledonarios, en que el disacárido y la glucosa están presentes en cada caso en el medio a una concentración menor que 3 por ciento (es decir el disacárido está presente en el medio a una concentración menor que 3 por ciento y la glucosa está presente en el medio a una concentración menor que 3 por ciento). En algunas modalidades, el medio incluye glucosa (presenta a una concentración menor que 3 por ciento) y por lo menos 2 disacáridos, en que la concentración total de todos los disacáridos en el medio es menor que 3 por ciento. El medio puede incluir también una o más composiciones absorbentes. Los métodos de la invención pueden incluir además el paso de producir uno o más árboles de pino (por ejemplo una población de árboles de pino) a partir de los embriones de pino cotiledonarios preparados de acuerdo con la invención. En la práctica de algunas modalidades de la invención, se cultiva secuencialmente el tejido embriogénico sobre una serie por lo menos de dos medios, o en la misma, por lo menos uno de los cuales incluye un disacárido y glucosa que están presentes en cada caso en el medio a una concentración menor que 3 por ciento. El medio que incluye un disacárido y glucosa está adaptado para promover el desarrollo y la maduración de los embriones cotiledonarios a partir de tejido embriogénico. Así, en algunas modalidades, la presente invención provee métodos para producir embriones de pino cotiledonarios, incluyendo los métodos en cada caso los pasos de: (a) cultivar tejido de pino embriogénico (tal como masas suspensorias embrionarias de pino) sobre un medio de mantenimiento, o en el mismo; y (b) cultivar el tejido de pino embriogénico : tratado de acuerdo con el paso (a) sobre un medio de desarrollo que comprende un disacárido y glucosa para formar embriones de pino cotiledonarios, en que el disacárido y la glucosa están presentes en cada caso en el medio de desarrollo a una concentración menor que 3 por ciento. El medio de desarrollo puede incluir opcionalmente una composición absorbente. Los métodos de este aspecto de la invención pueden incluir opcionalmente el paso de cultivar tejido de pino sobre un medio de iniciación, o en el mismo, para producir tejido de pino embriogénico, el cual se cultiva luego sobre un medio de mantenimiento, o en el mismo, como se establece en el paso (a).

En otro aspecto, la presente invención provee embriones de pino cotiledonarios preparados de acuerdo con un método de la invención. Los métodos de la presente invención son útiles, por ejemplo para preparar embriones de pino cotiledonarios que pueden estar caracterizados además, por ejemplo por medios genéticos o bioquímicos, y/o se pueden germinar para producir pequeñas plantas de pino que se pueden cultivar formando árboles de pino maduros, si así se desea. Así, se pueden usar por ejemplo los métodos de la invención para producir clones de árboles de pino individuales que posean una o más características convenientes, tal como índice rápido de crecimiento o calidad mejorada de madera. Por ejemplo, se pueden usar los embriones de pino cotiledonarios de la invención para producir boscajes, o bosques, de árboles de pino que posean una o más características convenientes, tales como índice rápido de crecimiento o calidad mejorada de madera. Se pueden utilizar los árboles para producir productos de madera.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS La figura 1 muestra masas suspensorias embrionarias de pino en cultivo líquido. La figura 2 muestra un embrión de pino cotiledonario representativo que se prepara usando los métodos de la invención (los cotiledones están visibles en la parte superior del embrión).

DESCRIPCION DETALLADA DE LA MODALIDAD PREFERIDA A no ser que se defina específicamente en la presente, todos los términos usados en la presente tienen el mismo significado que tendría para un experto en la técnica de la presente invención. Como se usa en la presente, el término "embrión cotiledonario" significa un embrión que posee uno o más cotiledones. El término "disacárido" se refiere a carbohidratos que están compuestos de dos racimos de monosacárido. Algunos ejemplos representativos de disacáridos incluyen maltosa, sucrosa, lactosa, celobiosa, isomaltosa, gentiobiosa, laminarabiosa, quitobiosa, xilobiosa, inulobiosa, manobiosa, ácido hialobiourónico, condrosina y ácido celobiourónico. .. Como se usa en la presente, el término "tejido embriogénico" se refiere a cualquier tejido, derivado de una planta de la familia de las pináceas, que es capaz de producir uno o más embriones de pino cotiledonarios cuando se trata de acuerdo con los métodos de la invención. Así, el término "tejido embriogénico" incluye, por ejemplo, masas suspensorias embrionarias de pino. A no ser que se indique de otra manera, todos los valores de concentración que están expresados como porcentajes son porcentajes en peso por volumen. En un aspecto, la presente invención provee métodos para producir embriones de pino cotiledonarios. Los métodos de la invención incluyen en cada caso el paso de cultivar tejido de pino embriogénico en un medio, o sobre el mismo, que comprende un disacárido, una glucosa para producir embriones de pino cotiledonarios, en que el disacárido y la glucosa están presentes en cada caso en ei medio a una concentración menor que 3 por ciento. En algunas modalidades de los métodos de la presente invención, por lo menos el 50% (por ejemplo por lo menos el 60%, o por ejemplo por lo menos el 70%, o por ejemplo por lo menos el 80%, o por ejemplo por lo menos el 90%) de los embriones de pino cotiledonarios producidos son de apariencia cigótica (es decir poseen las mismas características morfológicas y propiedades fisiológicas que los embriones de pino cotiledonarios cigóticos en la misma etapa de desarrollo). Así, en algunas modalidades de los métodos de la invención, del 50% al 100% (por ejemplo del 600% al 90%, por ejemplo del 70% al 80%) de los embriones de pino cotiledonarios producidos son de apariencia cigótica. Típicamente, los embriones de pino cotiledonarios, preparados de acuerdo con la presente invención, poseen en cada caso una o más de las siguientes características: los embriones son más largos (típicamente de 0.5 mm a 1.0 mm) que los embriones que se tratan idénticamente, excepto que no están presentes en cada caso la glucosa y/o un disacárido en el medio de cultivo a una concentración menor que 3 por ciento; los embriones incluyen en cada caso de 8 a 12 cotiledones; y los embriones tratados de acuerdo con la presente invención se desarrollan más rápidamente que los embriones que se tratan idénticamente, excepto que no están presentes en cada caso la glucosa y/o un disacárido en el medio de cultivo a una concentración mayor que el 3 por ciento (por ejemplo, en algunas modalidades, los embriones preparados de acuerdo con la presente invención se desarrollan en el transcurso de nueve semanas). Se pueden usar los métodos de la invención para producir embriones cotiledonarios de cualquier miembro de la familia de las pináceas, tales como miembros del género Pinus, tal como el pino de incienso (Pinus taeda). Un ejemplo de tejido embriogénico útil en la práctica de la presente invención son las masas suspensorias embrionarias (ESM). Se preparan las ESM a partir de embriones precotiledonarios extraídos de la semilla de pino. Se esteriliza la semilla en la superficie típicamente antes de extraer los embriones precotiledonarios que se cultivan luego sobre un medio, o en el mismo, que permita la formación de ESM que incluye embriones en etapa temprana en el procedimiento de multiplicación por gemación y segmentación. El medio puede incluir, si se desea, hormonas que estimulen la multiplicación de los embriones en etapa temprana. Algunos ejemplos de hormonas que se pueden incluir en el medio son las auxinas (por ejemplo ácido 2,4-diclorofenoxi acético (2,4-D)) y las citocininas (por ejemplo 6- bencilaminopurina (BAP)). Se pueden utilizar auxinas, por ejemplo, a una concentración de 1 mg/l a 200 mg/l. Se pueden utilizar citocininas, por ejemplo a una concentración de 0.1 mg/l a 10 mg/l. Un ejemplo de un medio útil para cultivar embriones de pino precotiledonarios para inducir la formación de ESM en el medio BMi establecido en el ejemplo 1 de la presente. Los métodos de la invención incluyen en cada caso el paso de cultivar tejido de pino embriogénico en un medio, o sobre el mismo, que comprende un disacárido y glucosa para producir embriones de pino cotiledonarios, en que el disacárido y la glucosa están presentes en cada caso a una concentración menor que 3 por ciento (por ejemplo menor que 2.9%, por ejemplo menor que 2.8%, o por ejemplo menor que 2.7%, o por ejemplo menor que 2.6%). En algunas modalidades de los métodos de la invención, el disacárido y la glucosa están presentes en cada caso en el medio a una concentración de 1 % a 2.5%. En algunas modalidades de los métodos de la invención, el disacárido y la glucosa están presentes en cada caso en el medio a una concentración de 2% a 2.5%. En algunas modalidades de los métodos de la invención, el disacárido está presente en el medio a una concentración de 2.5% y la glucosa está presente en el medio a una . concentración de 1%. En algunas modalidades de los métodos de la invención, el método incluye glucosa y por lo menos dos disacáridos, en que la concentración de glucosa en el medio es menor que 3 por ciento y la concentración total de todos los disacáridos en el medio es de 1% a 2.5%. En algunas modalidades de los métodos de la invención, el medio incluye glucosa y por lo menos dos disacáridos, en que la glucosa está presente en el medio a una concentración menor que 3 por ciento y la concentración total de todos los disacáridos presentes en el medio es de 2% a 2.5%.

En algunas modalidades de los métodos de la invención, se cultiva el tejido de pino embriogénico en un medio, o sobre el mismo, que incluye un disacárido y glucosa, cada uno a una concentración menor que 3 por ciento, durante un período de seis semanas a doce semanas, por ejemplo de ocho semanas a doce semanas, o por ejemplo de nueve semanas a once semanas. En algunas modalidades de los métodos de la invención, se cultiva el tejido de pino embriogénico en un medio, o sobre el mismos, que incluye un disacárido y glucosa, cada uno a una concentración menor que 3 por ciento, a una temperatura de 20°C a 24°C, por ejemplo de 21 °C a 24°C. El medio que incluye un disacárido y glucosa puede incluir también nutrientes (por ejemplo sales) que alimenten el tejido vegetal incubado y uno o más agentes para ajustar la osmolalidad del medio dentro de un intervalo deseado. Por ejemplo, la osmolalidad del medio puede ser de. 250 mM/kg a 450 mM/kg, por ejemplo de 250 mM/kg a 350 mM/kg. Se puede ajustar también el pH promedio a un valor deseado. Por ejemplo, el pH del medio puede ser de 4.5 a 6.5, por ejemplo de 5.0 a 6.0. El medio que incluye un disacárido y glucosa puede ser un medio líquido o un medio sólido. Cuando se utiliza un medio líquido, se coloca típicamente el tejido embriogénico sobre un soporte absorbente (por ejemplo papel de filtro) que se remoja en el medio líquido. Cuando se utiliza un medio sólido, se puede colocar el tejido embriogénico sobre la superficie del medio y puede penetrar parcialmente la superficie del medio sólido. Así, los medios sólidos incluyen medios que se solidifican parcialmente y permiten que el tejido embriogénico penetre sustancialmente al cuerpo del medio e incluye también medios completamente solidificados que no permiten que el tejido embriogénico penetre al cuerpo del medio solidificado. Se pueden solidificar los medios líquidos completa o parcialmente mediante la adición de una cantidad apropiada de un gelificante, tal como agar o gelrita. Se ha observado que la inclusión de una composición absorbente en el medio, que incluye un disacárido y glucosa, promueve adicionalmente la producción de masas suspensorias embrionarias alto de embriones de pino cotiledonarios que tienen frecuencia de germinación y calidad mejoradas. La composición absorbente puede, ser cualquier composición que no sea tóxica al tejido embriogénico a las concentraciones utilizadas en la práctica de los presentes métodos y que sea capaz de absorber hormonas promotoras de crecimiento y compuestos tóxicos producidos por las células vegetales durante el desarrollo embriónico, que están presentes en el medio. Así, las hormonas absorbidas ya no están disponibles para promover el crecimiento del tejido embriogénico en el medio, o sobre el mismo, y las toxinas absorbidas no pueden afectar adversamente las células vegetales. En este contexto, el término "absorción" abarca cualquier interacción química o física entre la composición absorbente y una o más hormonas promotoras de crecimiento, y/o toxinas, en el medio, de manera que las hormonas promotoras de crecimiento, y/o toxinas, quedan unidas a la composición absorbente.

Así, en algunas modalidades de los métodos de la invención, se incuba el tejido embriogénico en un medio, o sobre el mismo, que incluye hormonas promotoras de crecimiento, tales como auxinas y/o citocininas, para promover la multiplicación del tejido embriogénico. Cuando se ha obtenido suficiente tejido embriogénico, se puede transferir el tejido embriogénico a un medio que no incluya hormonas promotoras de crecimiento, pero incluya un disacárido y glucosa y, opcionalmente, una o más composiciones absorbentes. Las composiciones absorbentes se unen a las hormonas promotoras de crecimiento presentes en el medio, de manera que se reduce el índice de multiplicación del tejido embriogénico, o se detiene enteramente la multiplicación, y el disacárido y la glucosa inducen la producción de embriones de pino cotiledonarios procedentes del tejido embriogénico. Algunos ejemplos no limitantes de composiciones absorbentes útiles incluyen carbón vegetal activado, poli(vinilpirrolidona) soluble, poli(vinilpirrolidona) insoluble, alúmina activada y gel de sílice. La composición absorbente puede estar presente en una cantidad, por ejemplo de 0.01 g/l a 5 g/l. En algunas modalidades, la composición está presente en una cantidad de 0.05 g/l a 1 g/l. En aquellas modalidades de los métodos de la invención en las cuales están presentes en el medio más de una composición absorbente (por ejemplo por lo menos dos composiciones absorbentes), los intervalos precedentes de concentración se refieren a la concentración total de composición absorbente en el medio.

En la práctica de algunas modalidades de la invención, se cultiva secuencialmente sobre una serie, o en la misma, por lo menos de dos medios, por lo menos uno de los cuales incluye un disacárido y glucosa que están presentes en cada caso en el medio a una concentración menor que 3 por ciento. El medio que incluye un disacárido y glucosa está adaptado para promover el desarrollo y la maduración de embriones cotiledonarios procedente de tejido embriogénico que se ha tratado con una o más hormonas del crecimiento. Los embriones de pino cotiledonarios han mejorado la frecuencia de germinación y la calidad. Por ejemplo, en la práctica de algunas modalidades de los métodos de la invención, se cultiva tejido de pino embriogénico (tal como ESM) sobre un medio de mantenimiento, o en el mismo, que está adaptado para promover la división celular y el crecimiento del tejido embriogénico. El medio de mantenimiento puede ser un medio sólido o un medio líquido que se pueda agitar para promover el crecimiento y la multiplicación del tejido embriogénico en el mismo. El medio de mantenimiento puede contener nutrientes que alimenten el tejido embriogénico y puede incluir hormonas, tales como una o más auxinas (por ejemplo 2,4-D) y/o citocininas (por ejemplo cinetina, BAP), que promuevan la división similar y el crecimiento del tejido embriogénico. Si se utiliza auxina, la concentración de auxina dentro del medio de mantenimiento puede ser, por ejemplo, de 0.1 mg/l a 10 mg/l (por ejemplo de 0.1 mg/l a 5 mg/l). si está presente más de una auxina en el medio, los intervalos precedentes de concentración se refieren a la concentración total de auxina en el medio. Si se utiliza citocinina, la concentración de citocinina dentro del medio de mantenimiento puede ser, por ejemplo, de 0.1 mg/l a 2 mg/l (por ejemplo de 0.1 mg/l a 1 mg/l). Si está presente más de una citocinina en el medio, los intervalos precedentes de concentración se refieren a la concentración total de citocinina en el medio. Es generalmente conveniente, aunque no esencial, incluir maltosa como la fuente de azúcar única o principal en el medio de mantenimiento. La maltosa puede estar presente a una concentración de 0.5 mg/l a 6 mg/l, por ejemplo de 1 mg/l a 3 mg/l. Se puede ajustar la osmolaridad del medio de mantenimiento a un valor que caiga dentro de un intervalo deseado, por ejemplo de 100 mM/kg a 250 mM/kg, o por ejemplo de 100 mM/kg a 200mM/kg. Se puede ajustar también el pH del medio de mantenimiento a un valor dentro de un intervalo deseado, por ejemplo de 4.5 a 6..5, o por ejemplo de 5.0 a 6.0. Se incuba típicamente el tejido embriogénico en un medio de mantenimiento, o sobre el mismo, a una temperatura en el intervalo de 20°C a 24°C, por ejemplo de 21 °C a 24°C. Un ejemplo de un medio de mantenimiento adecuado es el medio BM2 indicado en el ejemplo 1 de la presente. Se incuba el tejido embriogénico en el medio de mantenimiento, o sobre el mismo, hasta que sea multiplicado el tejido embriogénico en una cantidad deseada (según se determina, por ejemplo, mediante la masa del tejido embriogénico cultivado). Se puede transferir luego el tejido embriogénico a un medio de desarrollo adaptado para promover el desarrollo de embriones de pino cotiledonarios de alta calidad. El medio de desarrollo es típicamente un medio sólido, aunque el medio de desarrollo puede ser un medio líquido. El medio de desarrollo incluye un disacárido y glucosa los cuales están presentes en cada caso a una concentración menor que el 3% (por ejemplo menor que 2.9 por ciento, o menor que 2.8 por ciento, o menor que 2.7 por ciento, o menor que 2.6 por ciento). En algunas modalidades, el disacárido y la glucosa están presentes en cada caso en el medio de desarrollo a una concentración de uno por ciento a 2.5 por ciento. En algunas modalidades, el disacárido y la glucosa están presentes en cada caso en el medio de desarrollo a una concentración de 2 por ciento a 2.5 por ciento. El medio de desarrollo puede contener nutrientes (por ejemplo sales) que alimenten el tejido embriogénico. Los medios de desarrollo adecuados no incluyen típicamente hormonas promotoras de crecimiento, teles como auxinas y citocininas, pero pueden incluir la hormona ácido abscísico. Cuando se utiliza ácido abscísico en el medio de desarrollo, se utiliza típicamente a una concentración en el intervalo de 1 mg/l a 200 mg/l, por ejemplo de 1 mg/l a 100 mg/l. Se puede ajustar la osmolalidad del medio de desarrollo a un valor que caiga dentro de un intervalo deseado, por ejemplo de 250 mM/kg a 450 mM/kg, o por ejemplo de 250 mM/kg a 350 mM/kg. Se puede ajustar también el pH del medio de desarrollo a un valor dentro del intervalo deseado, por ejemplo de 4.5 a 6.5, o por ejemplo de 5.0 a 6.0. Se incuba típicamente el tejido embriogénico en el medio de desarrollo, o sobre el mismo, a una temperatura en el intervalo de 20°C a 24°C, por ejemplo de 21°C a 24°C. Un ejemplo de un medio de desarrollo adecuado es el medio BM3 establecido en el ejemplo 1 de la presente. En algunas modalidades de los métodos de la invención, se incuba el tejido embriogénico en el medio de desarrollo, o sobre el mismo, durante un período de seis semanas a doce semanas, por ejemplo de seis semanas a nueve semanas. Así, en algunas modalidades, la presente invención provee métodos para producir embriones de pino cotiledonarios, incluyendo los métodos en cada caso los pasos de: (a) cultivar tejido de pino embriogénico (tal como masas suspensorias embrionarias) sobre un medio de mantenimiento, o en el mismo; y (b) cultivar el tejido de pino embriogénico de acuerdo con el paso (a) sobre un medio de desarrollo, o en el mismo, que comprende un disacárido y glucosa para formar embriones de pino cotiledonarios, en que el disacárido y la glucosa están presentes en cada caso en el medio de desarrollo a una concentración menor del 3 por ciento. El medio de desarrollo puede incluir opcionalmente una composición absorbente. Los métodos de éste aspecto de la invención pueden incluir opcionalmente el paso de cultivar tejido de pino en un medio de iniciación, o sobre el mismo, para producir tejido de pino embriogénico, que se cultiva luego en un medio de mantenimiento, o sobre el mismo, como se establece en el paso (a). En otras modalidades, la presente invención provee métodos para producir embriones de pino cotiledonarios, incluyendo los métodos en cada caso los pasos de: (a) cultivar tejido de pino embriogénico (por ejemplo masas suspensorias embrionarias de pino) sobre medio sólido de mantenimiento; (b) cultivar el tejido de pino embriogénico tratado de acuerdo con el paso (a) el medio líquido de mantenimiento; y (c) cultivar el tejido de pino embriogénico tratado de acuerdo con el paso (b) sobre medio sólido de desarrollo que comprende un disacárido y glucosa, para formar embriones de pino cotiledonarios, en que el disacárido y la glucosa están presentes en cada caso en el medio de desarrollo a una concentración menor que 3 por ciento. El medio de desarrollo puede incluir opcionalmente una composición absorbente. Los métodos de este aspecto de la invención pueden incluir opcionalmente el paso de cultivar tejido de pino en un medio de iniciación para producir tejido de pino embriogénico, que se cultiva luego sobre un medio de mantenimiento como se establece en el paso (a). Se pueden germinar opcionalmente los embriones de pino cotiledonarios que se producen usando los métodos de la invención, para formar pequeñas plantas de pino que se pueden hacer crecer como árboles de pino, si se desea. Se pueden germinar los embriones de pino cotiledonarios sobre un medio sólido de germinación, tal como un medio BM5 establecido en el ejemplo 1 de la presente. Se pueden transferir las plantas germinadas al suelo para su crecimiento adicional. Por ejemplo, se pueden plantar las plantas germinas en el suelo en un invernadero y permitir que crezcan antes de transplantarlas a un sitio al aire libre. Típicamente, se iluminan los embriones de pino cotiledonarios para estimular la germinación.

Típicamente, se conducen en la obscuridad todos los pasos de los métodos de la invención, excepto la germinación. Se pueden usar los métodos de la invención, por ejemplo para producir clones de árboles individuales de pino que posean una o más características convenientes, tales como un índice rápido de crecimiento. Así, en un aspecto, la presente invención provee métodos para producir embriones de pino cotiledonarios, genéticamente idénticos. Los métodos de éste aspecto de la invención incluyen en cada caso el paso de cultivar tejido de pino embriogénico genéticamente idéntico en un medio, o sobre el mismo, que incluya un disacárido y glucosa para producir embriones de pino cotiledonarios genéticamente idénticos, en que el disacárido y la glucosa están presentes en cada caso en el medio a una concentración menor que 3 por ciento. En otro aspecto, la presente invención provee poblaciones de embriones de pino cotiledonarios de apariencia cigótica. en algunas modalidades, por lo menos 50% (por ejemplo por lo menos 60%, o por ejemplo por lo menos 70%, o por ejemplo por lo menos 80%, o por ejemplo por lo menos 90%) de los embriones de pino cotiledonarios en la población de los embriones de pino cotiledonarios son de apariencia cigótica. Así, en algunas modalidades de este aspecto de la invención, de 50% a 100% (por ejemplo de 60% a 80%, o por ejemplo de 70% a 80%) de los embriones de pino cotiledonarios en la población de embriones de pino cotiledonarios son de apariencia cigótica. Se pueden usar los métodos de la invención para conducir las poblaciones de embriones de pino cotiledonarios de apariencia cigótica de la invención. Así, en un aspecto, la presente invención provee poblaciones de embriones de pino cotiledonarios preparados mediante un método de la invención. Los siguientes ejemplos ilustran meramente el mejor modo ahora contemplado para practicar la invención, pero no se debe interpretar que limita la invención.

EJEMPLO 1 Este ejemplo muestra un método representativo de la invención para producir una población de pino de incienso (Pinus taeda), embriones cotiledonarios y la germinación de los embriones. Se extraen de la semilla las gametofitas hembra que contienen embriones cigóticos de cuatro a cinco semanas después de la fertilización. Se extraen las capas de semilla, pero no se disecan los embriones aún más de la gametofita circundante de manera diferente para escindir el extremo nucelar. Se almacenan los conos a 4°C hasta que se usan. Inmediatamente antes de la extracción de los embriones inmaduros, se esterilizan las semillas utilizando un lavado inicial y tratamiento con detergente, seguido por una esterilización de diez minutos en H2O2 al 15%. Se lavan perfectamente los explantes con agua destilada estéril después de cada tratamiento.

El cuadro 1 indica las composiciones de medios representativos, útiles para la embriogénesis de pinos de incienso. CUADRO 1 Etapa I — inducción Se colocan gametofitas estériles con embriones intactos sobre un medio sólido de cultivo BMi y se mantienen en un ambiente a 22°C-25°C con un fotoperíodo obscuro durante un tiempo de 3-5 semanas. La duración de tiempo depende del genotipo particular que se esté cultivando. A final de ese tiempo, se forma una masa mucilaginosa blanca en asociación con tejidos originales en cultivo. El examen microscópico revela típicamente numerosos embriones en etapa temprana, asociados con la masa. Estos están caracterizados generalmente por tener un suspensorio largo de pared delgada, asociado con una cabeza pequeña con citoplasma denso y núcleos grandes. La osmolalidad del medio de inducción puede ser en algunos casos tan alto como 170 mM/kg. Normalmente, es de aproximadamente 160 mM/kg o incluso más baja (por ejemplo 150 mM/kg).

Etapa II — mantenimiento y multiplicación Se colocan en primer lugar embriones en etapa temprana extraídos de las masas generadas en la etapa de inducción, sobre un medio gelificado de mantenimiento y multiplicación BM2. Este difiere del medio de inducción en el sentido de que se reducen las hormonas del crecimiento (tanto las auxinas como las citocininas) por lo menos en un orden completo de magnitud. Se eleva típicamente la osmolaridad de este medio de aquélla del medio de inducción a aproximadamente 180 mM/kg o más alta aumentado la concentración de mioinositol a 0.5% p/p. La temperatura y el fotoperíodo son nuevamente de 22°-25°C con 24 horas en la obscuridad. Se cultivan embriones durante 12-14 días sobre el medio sólido BM2 antes de transferirlos a un medio líquido para su subcultivo ulterior. Este medio líquido es de composición similar, pero carece de gelificante. Los embriones al final de la etapa de mantenimiento en sólido son típicamente similares en apariencia a aquellos de la etapa I. Después de 5 a 6 subcultivos semanales sobre el medio líquido de mantenimiento se forman embriones en etapa temprana avanzada. Estos se caracterizan por cabezas embrionarias suaves, que se estima que tienen típicamente mas de 100 células individuales, con suspensorios múltiples. El potencial osmótico de los medios de mantenimiento caen típicamente dentro del intervalo de aproximadamente 180-400 mM/kg para Pinus taeda. Muy típicamente, el potencial osmótico de los medios de mantenimiento está en el intervalo de aproximadamente 1.5 veces más alto que el de los medios de inducción o multiplicación.

Etapa III — desarrollo embriónico Se transfieren los embriones en etapa temprana avanzada del cultivo de la etapa II a un soporte de papel de filtro colocado sobre una almohadilla saturada con medio líquido de desarrollo. Este medio o bien carece enteramente de hormonas de crecimiento o las tiene presentes solamente a niveles muy bajos y tiene el mismo nivel más bajo de osmoticantes que en las etapas I y II. Hay presentes maltosa y glucosa. Se puede incluir ácido abscísico para facilitar el desarrollo ulterior. Se pueden incluir también una composición absorbente (tal como carbón vegetal activado, formas solubles e insolubles de poli(vinilpirrolidona), alúmina activada y gel de sílice), por ejemplo a una concentración de aproximadamente 0.5 g/1 o aproximadamente 0.25-2.5 g/l. Se puede elevar sustancialmente el potencial osmótico sobre aquél del medio de mantenimiento. Por ejemplo, la osmolalidad puede ser tan alta como 350 mM/kg o incluso más alta. Se lleva a cabo preferiblemente el desarrollo en oscuridad completa a una temperatura de 22°-25°C hasta que se han desarrollado embriones cotiledonarios alargados. El tiempo de desarrollo es típicamente de varias semanas, por ejemplo de 6 a 9 semanas. Se incuban luego los embriones a 4°C y hasta 10°C durante 3 a 4 semanas en un medio que no incluya PEG o ABA (por ejemplo medio BM7).

Etapa IV — secado Se levantan de la almohadilla los embriones que están todavía sobre el papel de filtro y se colocan en un recipiente cerrado sobre una solución saturada de K2S04, o agua, a una humedad relativa de 97%, durante un período de aproximadamente tres semanas.

Etapa V — germinación Se rehidratan los embriones cotiledonarios secados de la etapa IV colocándolos, mientras están todavía sobre el soporte de papel de filtro, durante aproximadamente 24 horas sobre una almohadilla saturada con medio líquido de germinación. Se colocan luego los embriones individualmente sobre medio de B 5 para germinación. Este es un medio basal que carece de hormonas de crecimiento el cual se ha modificado reduciendo la sucrosa, mioinositol y el nitrógeno orgánico. Se incuban los embriones sobre medio de BM5 durante aproximadamente 6-8 semanas en condiciones ambientales de 23°C-25°C y un fotoperíodo de 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad, hasta que las plántulas tengan radícula e hipocotíleo bien desarrollados y estructura cotiledonaria y epicotíleo verdes. Si se desea, se pueden corivertir los embriones cotiledonarios en semillas artificiales. Debido a la concentración reducida de carbohidratos, se reduce aún más el potencial osmótico del medio de germinación debajo de aquél del medio de desarrollo. Se encuentra normalmente debajo de aproximadamente 150 mM/Kg (por ejemplo aproximadamente 100 mM/Kg).

Etapa VI — conversión Se extraen las plántulas de la etapa V del medio de germinación y se plantan en un suelo que comprenda partes iguales de turba y perlita fina.

EJEMPLO 2 Este ejemplo muestra el efecto sobre el desarrollo embriónico y la frecuencia de germinación de cultivar embriones somáticos de pino de incienso sobre medio de desarrollo que incluya una combinación de 2.5% de maltosa y 1 % de glucosa. Se probaron tres genotipos de pino de incienso: genotipo A, genotipo B y genotipo C. Se hicieron crecer las masas suspensorias embrionarias (ESM) de cada genotipo en un matraz que contenía un litro de medio BM2. Se sedimentó cada matraz de ESM durante 15 minutos, se aspiró el medio y se transfirieron las células sedimentadas a una nueva vasija. Se añadió un volumen igual de medio BM6 a las células que se dejaron luego sedimentada durante 0 minutos. Se extrajo una mitad del medio de BMe y se transfirieron 1.5 mi de alícuotas de las células sedimentadas (una relación de las células con el ??ß de 1 :0.5) directamente a los medios de desarrollo BM3 (incluye glucosa y maltosa) y BM4 (incluye maltosa, pero no glucosa) y también los medios BM2, BM5, BM6 y BM7. Después de la incubación durante 4 semanas sobre los medios de desarrollo, se observó que el medio BM3 promovía el desarrollo más rápido que el medio BM4. Los otros medios no exhibieron diferencia del medio de control. Después de la incubación durante 12 horas sobre los medios de desarrollo, los embriones cultivados sobre el medio BM3 eran más grandes, más largos, y más como embriones cigóticos, que los embriones cultivados sobre el medio de BM4. Los embriones cultivados sobre el medio BM3 comenzaron a desarrollar cotiledones después de ocho semanas. Los embriones cultivados sobre medio BM3 tenían 8-10 cotiledones (el genotipo A produjo algunos embriones que tenían 14-16 cotiledones), en comparación con 4-6 cotiledones sobre embriones cultivados sobre medio B 4. Además, el cultivo de los embriones sobre un medio de desarrollo que incluía maltosa y glucosa (medio B 3) produjo embriones más grandes y de mejor calidad, con más cotiledones y domos visibles, que los otros medios. El cuadro 2 muestra el número de embriones de pino de incienso de apariencia cigótica sobre los medios BM4 y BM3.

CUADRO 2 Se seleccionaron los embriones de apariencia cigótica de las placas BM3 y BM4 y se transfirieron a una caja de Petri que contenía un papel de filtro sobre una almohadilla saturada con medio BM7 se sellaron las cajas de Petri con parapelícula y se almacenaron en frío. Después de 4 semanas, se transfirieron los papeles de filtro con embriones a puentes de malla en cajas magenta que contenían aproximadamente 00 mi de agua. Después de 3 semanas de secado en las cajas se transfirieron los papeles de filtro con embriones a cajas de Petri que contenían una almohadilla saturada con medio BM5 líquido. Después de 24 horas, se transfirieron los embriones a medio BM5 sólido en cajas de germinación. Se dejaron las cajas en la oscuridad durante una semana y se transfirieron luego al cuarto con luz. Los embriones conocidos sobre B 3 tuvieron una frecuencia de germinación que era casi el doble de la frecuencia de germinación de embriones producidos sobre B 4. Además, la calidad de los germinantes producidos del medio BM3 era mucho mejor que la calidad de los germinantes producidos del medio BM4. Por ejemplo, para los genotipos A y B, los germinantes bipolares del medio BM3 tenía hipocotíleos rectos y gruesos, y crecimiento vigoroso de epicotíleos. En contraste, los germinantes bipolares producidos del medio BM4 tuvieron hipocotíleos curvos, relativamente delgados. Aunque se ha ilustrado y descrito la modalidad preferida del invención, se apreciará que se pueden hacer varios cambios en la misma sin desviarse del espíritu y el alcance de la invención.

Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES 1.- Un método para producir embriones de pino cotiledonarios, caracterizado dicho método porque comprende el paso de cultivar tejido de pino embriogénico en medio, o sobre el mismo, que comprende un disacárido y glucosa para producir embriones de pino cotiledonarios, en que dicho disacárido y dicha glucosa están presentes en cada caso en el medio a una concentración menor que 3 por ciento. 2. - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque el tejido de pino embriogénico comprendé masas suspensorias embrionarias. 3. - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque por lo menos 60% de los embriones de pino cotiledonarios comprenden de 6 a 12 cotiledones. 4. - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque por lo menos 70% de los embriones de pino cotiledonarios comprenden de 6 a 12 cotiledones. 5.- El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque por lo menos 80% de los embriones de pino cotiledonarios comprenden de 6 a 12 cotiledones. 6. - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque por lo menos 90% de los embriones de pino cotiledonarios comprenden de 6 a 12 cotiledones. 7. - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque el disacárido y la glucosa están presentes en cada caso en el medio a una concentración de 1 por ciento a 2.5 por ciento. 8. - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque el disacárido y la glucosa están presentes en cada caso en el medio a una concentración de 2 por ciento a 2.5 por ciento. 9.- El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque el medio comprende por lo menos dos disacáridos, en que la concentración de los disacáridos en el medio, es de 1 por ciento a 2.5 por ciento. 10. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el medio comprende por lo menos dos disacáridos, en que la concentración de los disacáridos en el medio es de 2 por ciento a 2.5 por ciento. 11. - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque se cultiva el tejido de pino embriogénico en medio, o sobre el mismo, que comprende un disacárido y glucosa durante un período de seis semanas a doce semanas. 12. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque se cultiva el tejido de pino embriogénico en medio, o sobre el mismo, que comprende un disacárido y glucosa durante un período de ocho semanas a doce semanas. 13. - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque se cultiva el tejido de pino embriogénico en medio, o sobre el mismo, que comprende un disacárido y glucosa durante un período de nueve semanas a once semanas. 14. - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque la osmolalidad del medio que comprende un disacárido y glucosa es de 250 mM/kg a 450 mM/kg. 15.- El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque el pH del medio que comprende un disacárido y glucosa es de 4.5 a 6.5. 16. - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque el medio comprende adicionalmente una composición absorbente. 17. - El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque se selecciona la composición absorbente del grupo que consta de carbón vegetal activado, poli(vinilpirrolidona) soluble, poli(vinilpirrolidona) insoluble, alúmina activada y gel de sílice. 18.- El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque la composición absorbente es carbón vegetal activado. 19 - El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque la concentración de la composición absorbente es de 0.01 g/l a 5 g/l. 20.- El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque la concentración de la composición absorbente es de 0.05 g/l a 1 g/l. 21 - El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque el medio comprende por lo menos dos composiciones absorbentes, en que la concentración total . de las composiciones absorbentes en el medio es de 0.01 g/l a 5 g/l. 22 - El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque el medio comprende por lo menos dos composiciones absorbentes, en que la concentración total de las composiciones absorbentes en el medio es de 0.05 g/l a 1 g/l. 23.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque se producen los embriones de pino de incienso cotiledonarios a partir de tejido de pino embriogénico. 24.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el medio es un medio líquido. 25.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el medio es un medio sólido. 26.- Un método para producir embriones de pino cotiledonarios, caracterizado porque comprende los pasos de: (a) cultivar tejido de pino embriogénico en medio de mantenimiento, o sobre el mismo; y (b) cultivar el tejido de pino embriogénico tratado de acuerdo con el paso (a) en un medio de desarrollo que comprende glucosa y un disacárido, para formar embriones de pino cotiledonarios, en que el disacárido y la glucosa están presentes en cada caso en el medio de desarrollo a una concentración menor que 3 por ciento. 27. - El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado además porque el disacárido y la glucosa están presentes en cada caso en el medio de desarrollo a una concentración de 1 por ciento a 2.5 por ciento. 28. - El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado además porque el disacárido y la glucosa están presentes en cada caso en el medio de desarrollo a una concentración de 2 por ciento a 2.5 por ciento. 29 - Una población de embriones de pino cotiledonarios producidos mediante el método de la reivindicación , caracterizado además porque por lo menos 50% de los embriones son de apariencia cigótica. 30. - La población de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada además porque por lo menos 60% de los embriones son de apariencia cigótica. 31. - La población de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada además porque por lo menos 70% de los embriones son de apariencia cigótica. 32. - La población de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada además porque por lo menos 80% de los embriones son de apariencia cigótica. 33. - La población de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada además porque por lo menos 90% de los embriones son de apariencia cigótica.