MXPA02011271A

MXPA02011271A - Fertilizacion de oocitos envejecidos.

Info

Publication number: MXPA02011271A
Application number: MXPA02011271A
Authority: MX
Inventors: Blume Thorstern
Original assignee: Schering Ag
Priority date: 2000-05-18
Filing date: 2001-05-09
Publication date: 2003-04-25
Also published as: WO2001088098A2; EP1285058A2; US20040224878A1; WO2001088098A3; CA2404822A1; AU2001263924A1; JP2003533222A

Abstract

La presente invencion se refiere al uso de FF-MAS y/o analogos de MAS para la fertilizacion de oocitos envejecidos.

Description

FERTILIZACIÓN DE OOCITOS ENVEJECIDOS DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención se refiere al uso de sustancias que activan la meiosis para la fertilización de oocitos envejecidos. El potencial de reproducción de una población se define por su fecundidad. La fecundidad describe las concepciones mensuales que ocurren naturalmente entre las parejas sexualmente activas. Ocurre poco cambio en la fecundidad hasta que las mujeres llegan a la mitad de los treinta, donde las tasas empiezan a descender. Las tasas se reducen por 50% en las mujeres que sobrepasan la edad de 37, y por tanto como 95% a la edad de 45 (1) . En comparación con el total de la población, las mujeres mayores de 40 años representan menos del 1% de todas las mujeres que dan a luz, y solamente ocurren 0.01% de los partos en mujeres de 47 años y mayores (2) . Sin embargo va en aumento el número de mujeres mayores que en el mundo occidental tratan de quedar preñadas (3). Las razones fundamentales del progresivo aumento de esta tendencia incluyen casamientos tardíos y segundos, la dedicación a metas educativas o vocacionales, así como también la reproducción retardada que resulta de una contracepción efectiva . Antes del nacimiento se forma en el ovario una provisión fija de oocitos, y después de esto se reduce progresivamente. El número de oocitos no ovulados declina a una tasa constante hasta la edad de aproximadamente 37, después de lo cual el proceso se acelera de 2 a 3 veces. Por lo tanto existe un estado de "menopausia reproductiva" aproximadamente 10 años antes de que la cesación de la menstruación indique el comienzo de la "menopausia endocrina" (4) . La declinación en el número de oocitos se debe a la atresia y se incrementa a mas del doble después de la edad de 37, agotando por último el depósito de gametos (5). La reducción del número de oocitos con la edad se acelera adicionalmente por un aumento de los oocitos restantes a las etapas de crecimiento, lo cual ocurre regularmente antes de la ovulación. Esta cohorte incrementada de oocitos en crecimiento degenerará mas rápidamente después de la selección de un oocito dominante (6). En los oocitos restantes de las mujeres mayores que pueden tener el potencial de ser fertilizados in vivo o in vitro se observa frecuentemente un ciclo celular miótico alterado con aberraciones de huso y citoesqueléticas así como una función deficiente de la mitocondria (7) . Estas alteraciones del ciclo celular miótico pueden conducir a divisiones precoces o retardadas de los cromosomas. La perdida de la capacidad de separar fielmente los cromosomas con la edad se asocia con un porcentaje mas alto de aneuploidia en los oocitos de mamíferos (7, 8) . Al final la consecuencia es una decreciente tasa de fertilización, una reducción en el desarrollo previo al implante del embrión, y una reducción en la implantación del embrión, lo que cumulativamente resulta en una reducción dramática del potencial de embarazo. La necesidad de la intervención terapéutica debido al incremento de la infertilidad va en aumento en las mujeres mayores de 37 años. Es obvio que las hormonas esteroides sexuales no son adecuadas para influir de manera positiva en el envejecimiento de los oocitos, y las gonadotropinas mas bien se asocian al envejecimiento precoz del oocito (7). Por consiguiente se requieren compuestos que incrementan el potencial de embarazo de las mujeres mayores . La presente invención proporciona el uso de sustancias que activan la meiosis en un medio de cultivo para la fertilización in vitro de oocitos envejecidos. Las sustancias que activan la meiosis son FF-MAS (fluido folicular esterol activador de la meiosis) o análogos de MAS (esterol activador de la meiosis). FF-MAS es 4,4-dimetil-5a-colesta-8, 14, 24-trien-3ß-ol . Su síntesis se describe en el documento WO99/52930. Los análogos de MAS y su síntesis se describen, por ejemplo, en los documentos 96/00235, WO 96/27658, WO97/00884, W098/28323, W098/52965 y W098/55498. Los análogos de MAS tienen un porcentaje de colapso de la vesícula germinal (GVB por sus siglas en inglés) que es significativamente mas alto que el control sin FF-MAS cuando se ensaya en un análisis descrito en el ejemplo 1. Los análogos de MAS preferidos son aquellos que tienen un porcentaje de GVB de al menos 30%, preferiblemente de al menos 50%. El esterol FF-MAS del fluido folicular humano se identificó recientemente como un compuesto que induce la maduración nuclear (miótica) y citoplásmica en el ratón (6, 7, 9). Ahora se descubrió sorprendentemente que los compuestos que activan la meiosis tienen un efecto significativo en los oocitos envejecidos. Los occitos envejecidos son oocitos de mujeres que son mayores de 35 años, preferiblemente mayores de 37 años. Cuando se adicionan compuestos activadores de la meiosis a un medio de cultivo que después se usa para la fertilización in vitro (IVF por sus siglas en inglés) se observa una tasa de fertilización mas alta. El procedimiento IVF se lleva a cabo de manera conocida. Mas detalles sobre la remoción de los oocitos de los folículos en el ovario, el cultivo de los oocitos aislados, el medio de cultivo que se debe usar, la fertilización con esperma y la transferencia del embrión al tubo de Falopio se puede encontrar en la literatura, por ejemplo, en la especificación de patente US No. 5,693,534 que con esto se incorpora mediante referencia. Otro objeto de la presente invención es el uso de compuestos que conducen a un incremento de la concentración de FF-MAS en el oocito en un medio de cultivo para la fertilización in vitro de oocitos envejecidos. La síntesis de FF-MAS a partir de lanosterol se cataliza mediante citocromo P450 lanosterol 14alfa-demetilasa . El FF-MAS se convierte a T-MAS por la actividad de la esterol?14-reductasa (?14R) . Existen drogas tales como AY9944 que actúan como inhibidores competitivos de ?14R (11) . Recientemente se pudo demostrar en el complejo cumulo-oocito (COC por sus siglas en inglés) del ratón que la adición de AY9944 al medio de cultivo tiene la capacidad de inducir la acumulación de FF-MAS (12) . Mediante el incremento de la concentración endógena de FF-MAS estos compuestos tienen el mismo efecto que el FF-MAS mismo. La producción endógena de MAS en el oocito intacto contenido en el cúmulo también se mejora mediante factores de crecimiento tales como el factor de crecimiento epidérmico (EGF por sus siglas en inglés) (14). Se ha demostrado que los factores de crecimiento mejoran la maduración del oocito en un número de especies como las de la vaca, el cerdo, el ratón y la rata y la humana (13) .

Recientemente se ha demostrado que la adición de EGF - en ' concentraciones alrededor de aquellas que se observan in vivo - al medio de cultivo de oocitos humanos durante la causa del tratamiento IVF resulta en tasas de implantación significativamente mejoradas del oocito recuperado (14). Estos factores de crecimiento se pueden usar en un medio de cultivo para la fertilización in vitro de oocitos envejecidos . En una modalidad adicional, la invención proporciona el uso de sustancias que activan la meiosis para la preparación de un medicamento para ser usado en la fertilización de oocitos envejecidos. Una mujer que requiere de este tipo de tratamiento puede ser tratada con el medicamento mediante administración intravenosa, subcutánea, oral, intranasal, transdérmica, intrauterina, intracervical o intravaginal. Usualmente no se deberán administrar a la mujer por día mas de 1000 mg, preferiblemente no mas de 100 mg y en algunos casos preferidos no mas de 10 mg de FF-MAS y/o uno o varios análogos de MAS. El tratamiento puede ser tanto continuo como también intermitente. El medicamento puede comprender además excipientes farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica, como son soportes, diluyentes, mejoradores de la absorción, preservativos, reguladores, agentes para ajustar la presión osmótica, agentes de desintegración de tabletas y otros ingredientes que se usan convencionalmente en la técnica. La invención proporciona además un método para incrementar la tasa de maduración y fertilización de oocitos envejecidos, método éste que comprende administrar a un oocito viejo una sustancia que activa la meiosis. Ejemplos La presente invención se ilustrará en detalle en los siguientes ejemplos. Ejemplo 1: Método usado para seleccionar compuestos de MAS Los oocitos se obtuvieron de ratones hembra inmaduros (híbridos Fl C57BI/6J x DBA/2J, de la empresa Bomholtgaard, Dinamarca) con peso de 13-16 gramos que se mantuvieron bajo iluminación y temperatura controladas. Los ratones recibieron una inyección intra-peritoneal de 0.2 ml de gonadotropinas (Gonal F, de Serono, Solna, Suecia, con contenido de 20 unidades inyectables de FSH, alternativamente Puregon, de Organon, S ords, Irlanda con contenido de 20 unidades inyectables de FSH) , y 48 horas mas tarde los animales se sacrificaron mediante dislocación cervical . Los ovarios fueron sacados por disección y los oocitos se aislaron en medio Hx (ver a continuación) debajo de un microscopio estéreo mediante la ruptura manual de los folículos usando un par de agujas de tamaño 27. Los oocitos esféricos, desnudos (NO según sus siglas en inglés) que mostraban una vesícula germinal (GV por sus siglas en inglés) intacta se colocaron en medio esencial a-mínimo (a-MEM sin ribonucleósidos, de Gibco BRL, No. de Cat. 22561) complementado con 3 mM de hipoxantina (de Sigma, No. de Cat. H-9377), 8 mg/ml de albúmina de suero humano (HSA, del State Serum Institute, Dinamarca), 0.23 mM de piruvato (de Sigma, No. de Cat. S-8636) , 2 mM de glutamina (de Flow, No. de Cat. 16-801), 100 unidades inyectables/ml de penicilina y 100 µg/ml de estreptomicina (de Flow, No. de Cat. 16-700) . Este medio se designó como medio Hx. Los oocitos se enjuagaron tres veces en el medio Hx y se cultivaron en charolas múltiples de 4 pocilios (de Nuncion, Dinamarca) en los que cada pocilio contenía 0.4 ml de medio Hx y 35-45 oocitos. Un control (es decir, 35-45 oocitos cultivados en medio Hx sin la adición del compuesto de prueba) se corrió siempre simultáneamente con los cultivos de prueba, los cuales se hicieron con diferentes concentraciones de los compuestos a ser ensayados. Los cultivos se efectuaron a 37°C y 100% de humedad con 5% de C02 en aire. El tiempo de cultivo fue de 22-24 horas. Al final del período de cultivo se contó el número de oocitos con vesícula germinal (GV) o colapso de la vesícula germinal (GVB) , y aquellos con cuerpo polar (PB por sus siglas en inglés) usando un microscopio estéreo o un microscopio invertido con equipo de contraste de interferencia diferencial. El porcentaje de oocitos con GVB por número total de oocitos y el porcentaje de oocitos con PB por número total de oocitos se calculó en los cultivos de prueba y se comparó con el cultivo de control. % de GVB = ( (número de GVB + número de PB) /número total de oocitos) xlOO Ejemplo 2: efecto de las sustancias que activan la meiosis en los oocitos envejecidos El ratón CBA/Ca proporciona un modelo de sistema para los estudios del efecto de los oocitos en la edad materna (7). Este modelo se caracteriza por su depósito relativamente limitado de folículos con un bajo número de oocitos envejecidos en la hembra adulta sexualmente madura, similar al humano. Todos los estudios siguientes se llevaron a cabo en los ratones CBA/Ca. Los animales se mantuvieron bajo iluminación y temperatura controladas. Recolección y cultivo de oocitos Se investigaron los oocitos de ratones CBA/Ca jóvenes (5-6 semanas de edad) y viejos (35-38 semanas de edad) en la etapa diestra del ciclo. Los oocitos esféricos, desnudos (NO según sus siglas en inglés) que mostraban una vesícula germinal (GV por sus siglas en inglés) intacta se colocaron en medio esencial a-mínimo ( -MEM sin ribonucleósidos, de Gibco BRL, No. de Cat. 22561) complementado con 3 mM de hipoxantina (de Sigma, No. de Cat. H-9377), 8 mg/ml de albúmina de suero humano (HSA, del State Serum Institute, Dinamarca), 0.23 mM de piruvato (de Sigma, No. de Cat. S-8636) , 2 mM de glutamina (de Flow, No. de Cat. 16-801), 100 unidades inyectables/ml de penicilina y 100 µg/ml de estreptomicina (de Flow, No. de Cat. 16-700). Este medio se designó como medio Hx. Los oocitos se enjuagaron tres veces en medio Hx y se cultivaron en charolas múltiples de 4 pocilios (de Nuncion, Dinamarca) en que cada pocilio contenía o bien (a) medio exento de hipoxatina (Hx) , (b) 10 µm de FF-MAS en medio exento de Hx, (c) medio Hx ó (d) 10 µm de FF-MAS en medio Hx. Los cultivos se llevaron a cabo a 37°C y 100% de humedad con 5% de C02 en aire. El tiempo de cultivo fue de 22 horas. Evaluación de los oocitos (a) Al término del período de cultivo se analizó el progreso del ciclo celular mediante conteo de número de oocitos con vesícula germinal (GV) o colapso de la vesícula germinal (GVB) y aquellos con cuerpo polar (PB) mediante el uso de - un microscopio estéreo o un microscopio invertido con equipo de contraste de interferencia diferencial. Se calculó el porcentaje de oocitos con GV, GVBD y PB por número total de oocitos, respectivamente, en los 4 grupos de tratamiento de oocitos jóvenes y envejecidos, respectivamente . (b) Al final del experimento se llevó a cabo el análisis citogenético con todos los oocitos usando la técnica modificada de extensión y formación de franjas según Eichenlaub-Ritter & Betzendahl (15). Esta técnica arrojó preparaciones muy claras de cromosomas. Se contó el número de cromosomas en cada oocito. Los oocitos con un número de 20 cromosomas se definieron como oocitos euploides. Los oocitos con un número superior o inferior a 20 cromosomas se definieron como oocitos aneuploides. Los oocitos aneuploides con mas de 20 cromosomas se definieron como hiperploides, aquellos con un número inferior a 20 cromosomas como hipoploides. Resultados (a) los oocitos envejecidos tratados con FF-MAS + Hx tienen mayor éxito en madurar a la metafase II que los oocitos jóvenes (figura 1) (b) el FF-MAS reduce la tasa de aberración numérica, por ejemplo la hiperploidia en oocitos envejecidos de la metafase II (figura 2) cuando se administra solo o en combinación con Hx. Descripción de las figuras La figura 1 muestra el progreso del ciclo celular de oocitos jóvenes y envejecidos La figura 2 muestra la tasa (%) de hiperploidia de oocitos jóvenes y envejecidos. Referencias 1. National Center for Health Statistics (1993), Mon Vital Stap Rep 32 (9) 2. Office of Population Censuses and Surveys (1991). Birth Statistics 1990 Series Fm No. 19. HM Stationery Office. London. 3. Ventura SJ et al. (1994) Mon Vital Staf Rep 43: 1-88 4. Sauer MV (1994) en: Treatment of the postmenopausal woman: Basic and clinical aspects. Lobo RA (ed) , Raven Press, New York, pp. 35-46 5. Faddy MJRG et al. (1192) Hum Reprod 7: 1342-1346 6. Gosden RG (1997) Hum Reprod 12:1 7. Eichenlaub-Ritter (1998) Maturitas 30: 143-169 8. Plachot MA et al. (1988) Hum Reprod 3:627-635 9. Hegele-Hartung et al. (1999) Biol Reprod 10. Hegele-Hartung et al. (1998) Hum Reprod 13:98 11. Mercer (1993) Prog Lipid Res 32:357-416 12. Leonardsen et al. (2000) J Reprod Fértil 118: 171-179 13. Goud et al. (1998) Hum Reprod 13: 1638-1644 14. Byskov et al. (1999) J Exp Zool 285:237-242 15. Eichenlaub-Ritter y Betzendahl (1995) Mutagenesis 10: 477-486

Claims

REIVINDICACIONES 1. Uso de sustancias que activan la meiosis en un medio de cultivo para la fertilización in vitro de oocitos envejecidos.
2. Uso según la reivindicación 1, caracterizado en que la sustancia que activa la meiosis es FF-MAS.
3. Uso según la reivindicación 1, caracterizado en que la sustancia que activa la meiosis es un análogo de MAS.
4. Uso de compuestos que conducen a un incremento de la concentración de FF-MAS en el oocito en un medio de cultivo para la fertilización in vitro de oocitos envejecidos .
5. Uso según la reivindicación 4, caracterizado en que los compuestos que conducen a un incremento en la concentración de FF-MAS en el oocito es un inhibidor de la reductasa ?14.
6. Uso según la reivindicación 4, caracterizado en que los compuestos que conducen a un incremento en la concentración de FF-MAS en el oocito es una hormona de crecimiento.
7. Uso según la reivindicación 4, caracterizado en que los compuestos que conducen a un incremento en la concentración de FF-MAS en el oocito es EGF.
8. Uso de sustancias que activan la meiosis para la preparación de un medicamento para ser usado en la fertilización de oocitos envejecidos.
9. Uso de los compuestos que conducen a un incremento en la concentración de FF-MAS en el oocito para la preparación de un medicamento para ser usado en la fertilización de oocitos envejecidos.
10. Método para incrementar la tasa de maduración y fertilización de oocitos envejecidos, caracterizado en que comprende administrar a un oocito una sustancia que activa la meiosis. f c, 2O0 RESUMEN La presente invención se refiere al uso de FF-MAS y/o análogos de MAS para la fertilización de oocitos envejecidos .