MXPA02010989A

MXPA02010989A - Estructuras cristalinas de complejos de p-selectina, ep0105895-selectina, y usos de esta.

Info

Publication number: MXPA02010989A
Application number: MXPA02010989A
Authority: MX
Inventors: William S Somers
Original assignee: Genetics Inst
Priority date: 2000-05-19
Filing date: 2001-05-17
Publication date: 2003-03-10
Also published as: CA2407545A1; CN1430516A; US20040096894A1; AU2001261749A1; BR0110963A; EP1282425A4; WO2001089531A1; JP2004509069A; EP1282425A1

Abstract

La invencion EP0105854nt se refiere a estructuras tri-dimensionales y cristalinas de los dominios de la lectina y similares a EGF (LE) de la P-selectina, estructuras tri- dimensionales cristalinas y cristalinas de la P-selectina LE y E-selectina LE cada una formando complejos con SleX, asi como tambien a las estructuras tri-dimensionales y cristalinas de P-selectina LE que forma complejo con un peptido PSGL-1 funcional modificado tanto por la sulfatacion con la tirosina como con el SleX. La presente invencion tambien provee metodos para identificar agentes que activan o inhiben cada una de las estructuras antes mencionadas. Ademas, la presente invencion provee agentes identificados por tales metodos.

Description

ESTRUCTURAS CRISTALINAS DE COMPLEJOS DE P-SELECTINA, EP0105895-SELECTINA, Y USOS DE ÉSTA Campo de la Invención La presente invención se refiere a estructuras tri-dimensionales y cristalinas de dominios de la lectina y similares a la EPG de la P-selectina, las estructuras tridimensionales y cristalinas de la P-selectina LE y E-selectina LE cada una formando SLex, así como las estructuras cristalinas y tridimensionales de la P-selectina LE formando complejos con un péptido PSGL-1 funcional modificado tanto por la sulfatación con la tirosina como con el SLex. Estas estructuras son cruciales para el diseño y selección de agentes que interfieren con el enrrollamiento celular de los leucocitos en el proceso de inflamación. Antecedentes de la Invención Las selectinas son una familia de las glucoproteínas de superficie celular responsables de los eventos de adhesión temprana en el reclutamiento de leucocitos en los sitios de inflamación y su emigración hacia los tejidos linfáticos (evaluado en (Kansas, 1996) y (Vestweber and Blanks, 1999)). Como parte de una proceso de etapas múltiples (Springer, 1994), las selectinas promueven la adherencia inicial (atado o atrapado) y el enrollamiento subsiguiente de los leucocitos sobre las paredes de los vasos sanguíneos donde éstos se activan como una consecuencia de la exposición a las quimiocinas producidas localmente. La adhesión firme de los leucocitos mediada por las integrinas precede su extravasación en el tejido subyacente. La P-selectina (CD62P) y la E-selectina (CD62E) se inducen en la superficie del endotelio vascular en respuesta a los estímulos inflamatorios. La P-selectina, también se expresa por las plaquetas activadas, se trans-localiza en minutos en almacenamientos intracelulares a la superficie celular siguiendo la inducción por los mediadores inflamatorios. La E-selectina se regula transcripcionalmente y aparece dentro de unas pocas horas de activación del endotelio vascular. La L-selectina (CD62L) , y un tercer miembro de la familia de las selectinas se expresa constitutivamente en leucocitos. Además de su papel en la inflamación, la L-selectina media la adherencia o unión de los linfocitos a las vénulas endoteliales altamente especializadas en el curso de su migración desde la sangre a los tejidos linfoides . Las selectinas comparten un número de propiedades estructurales y funcionales. Estas consisten de un dominio de la lectina (Tipo C, (Drickamer, 1988)) dependiente del calcio N-terminal, altamente homologo, y un dominio similar al (EGF) factor de crecimiento epidérmico, números variables de unidades similares a las regulatorias complementarias, un dominio de transmembrana, y una región intracelular. Generalmente se acepta que la unión de la selectina se media predominantemente a través de las interacciones débiles de la proteína-carbohidrato entre el dominio de la lectina y los ligandos del glicano en las células fijas a éstas. Un número de estructuras diversas del glicano o glucano se han identificado como capaces de soportar y/o inhibir la unión de la selectina. Sin embargo, un epítope mostrado por el tetrasacárido de sialilo de Lewisx (Slex, NeuNAc2, 3Gall, 4[Fucl,3] GlcNAc) y las estructuras relacionadas parecen ser un componente de reconocimiento relevante común fisiológicamente común para las tres selectinas (Foxall et al., 1922). Los factores adicionales para el reconocimiento ha sugerido por el aislamiento de los contrarreceptores de la glucoproteína específicos de aparente alta afinidad (o avidez) no obstante de las diversas estructuras. Estas incluyen GlyCA -1 (Lasky Et al., 1992), MAdCAM-1 (Berg et al., 1993), CD34 (Baumheuter et al., 1993); ESL-1 (levinovitz et al., 1993) y PSGL-1 (Moore et al., 1992); (Sako et al., 1993). Sin embargo, hay solo evidencia limitada de que cualquiera de estas proteínas pesada o fuertemente glucosiladas son de hecho esenciales para aumentar las posibilidades que las capacidades de la glucosilación especifica de tejido o célula (por ejemplo, la capacidad de producir glicanos similares al Slex) , y no la expresión de las glucoproteínas específicas, que finalmente confieren la reactividad de la selectina. La excepción clara es PSGL-1, una glucoproteína homodimérica similar a la mucina expresada por virtualmente todos los subconjuntos de los leucocitos (evaluada en (Yang et al., 1999) y (McEver and Cummings, 1997)). Mientras que se anticipó que el reconocimiento de la P-selectina podría depender de las modificaciones similares a SLex de los glicanos dentro de la región similar de la mucina de PSGL-1, un epítope esencial de unión se localizó en la porción N-terminal, aniónica del pozo de la cadena principal del polipéptido fuera del dominio de la mucina (Pouyani and Seed, 1995; Sako et al., 1995; Wilkins et al., 1995). Numerosos estudios han demostrado que la unión mediada de la P-selectina y las respuestas inflamatorias in vivo puede disminuirse grandemente dirigiendo este polipéptido determinante dentro de PSGL-1. (MeEver and Cummings, 1997; Yang et al., 1999). Además, estudios recientes de ratones hechos genéticamente deficientes en PSGL-1 han descrito que muestran defectos significantes en el enrollamiento de los leucocitos, mediado por la P-selectina y el reclutamiento inflamatorio (Yang et al., 1999). Por lo tanto, la PSGL-1 representa el único ejemplo de un contrarreceptor de selectina para la cual tanto los compuesto del polipéptido y del glicano modificado por SLex se requieren para la unión fisiológicamente relevante. A la luz de su única función como mediadores de la adherencia y el enrollamiento celular bajo la influencia de los esfuerzos de corte encontrados dentro de la vasculatura, esfuerzos considerables se han dirigido hacia la caracterización de las bases moleculares y biofísicas subyacentes de las interacciones de la selectina. Las selectinas se asocian y disocian con sus ligandos con cinéticas de unión rápidas (Alón et al., 1997; Alón et al., 1995) y esta es la propiedad que es responsable en parte de su capacidad de mediar la unión transitoria y el fenómeno del enrollamiento celular. Otros factores incluyendo las propiedades mecánicas (Alón et al., 1995; Puri et al., 1998) y propiedades estructurales únicas (Chen et al., 1997) de las interacciones de la selectina también parecen estar involucradas, pero estas permanecen no completamente caracterizadas debido a una falta de estructuras moleculares de alta resolución de las selectinas que forman complejos con los ligandos fisiológicos. Esfuerzos significantes se han hecho para vencer esta limitación pero hoy día éstas permanecen incompletas. Una estructura cristalina de rayos X de un constructo de E-selectina que contiene los dominios de la lectina y de EGF (lec/EGF) se ha descrito previamente (Graves et al., 1994) y, combinada con los estudios de mutagénesis dirigidos al sitio (Kansas, 1996) , sugieren un sitio de unión a SLex putativo localizado en el dominio de la lectina. Se ha propuesto modelos para unir Slex con la estructura cristalina de la E-selectina (Graves et al., 1994; Kogan et al., 1995; Poppe et al., 1997) en base al anclaje molecular de las estructuras de solución libres y de enlace de Slex ((Poppe et al., 1997) y se toman aquí como referencias) usando la estructura cristalina de rayos X de la proteína de unión de la mañosa del suero de la rata homologa (MBP-A) enlazada a la oligomanosa (Weis et al., 1992) como una guía. Sin embargo, las estructuras de las E-selectina u otras selectinas, que forman complejos con los ligandos de los carbohidratos similares al SLex no se han determinado conforme a estas hipótesis. De hecho, antes de la presente invención, un cristal tal podría no obtenerse debido al efecto de bloqueo de altas concentraciones de calcio usado para formar los cristales de la selectina. Hoy día, las estructuras cristalinas de MBP-A mutadas para incluir los residuos de la E-selectina (el mutante K3) formando co-complejos con SLex y referidas a los glicanos (Ng y Weis, 1997) representan la única información directa de cómo las selectinas pueden unirse a sus ligandos. Colectivamente, estos modelos y las estructuras experimentalmente determinadas soportan una secuencia molecular recurrente de unión de SLex en la cual dos grupos de hidroxilo de la porción de Fue ligan el calcio de enlace del dominio de la lectina y las interacciones de unión adicionales son quizás mediadas por los grupos de hidroxilo de Gal y las proporciones de carboxilato de NeuNAc. Sin embargo, los modelos y las estructuras cristalinas del mutante MBP-A K3 / SLex difieren en la orientación de SLex dentro del sitio de unión y en la identidad de las contactos moleculares. Un entendimiento de las bases estructurales para la interacción de alta afinidad P-selectina / PSGL-1, también esta incompleta y complicada por la observación de reconocimiento basada en tanto los componentes de carbohidrato como del polipéptido. Los estudios de mutagénesis se han enfocado en el N-terminal del PSGL-1 y han demostrado que la P-selectina reconoce simultáneamente uno o más residuos sulfatados de tirosina dentro de una región aniónica del polipéptido PSGL-1 y el O-glicano que contiene SLex potencialmente localizado en esta región (Pouyani and Seed, 1995; Ramachandran et al., 1999; Sako et al., 1995; Wilkins et al., 1995). Mientras se anticipa que el sitio de unión SLex putativo es similar entre las selectinas y quizás éste involucrado en la unión del componente SLex de la PSGL-1 por la P-selectina, son desconocidas las bases de identidad y estructurales del dominio de la P-selectina que media la interacción con el polipéptido PSGL-1. La L-selectina también ha mostrado reconocer la PSGL-1 (Kansas, 1996; Vestweber and Blanks 1999) en el contexto de las interacciones neutrófilo -neutrófilo quizás importante para la amplificación del reclutamiento de los leucocitos en los sitios de inflamación. Esta interacción también se afecta por las mutaciones dentro del N-terminal del polipéptido de PSGL-1 (Ramachandran et al., 1999) lo que sugiere que la P- y L-selectina tienen requerimientos de unión o enlaces comunes. En contraste, la E-selectina que se une al PSGL-1 o a otros contrarreceptores que presentan la SLex no han demostrado requerir componentes del polipéptido. Breve Descripción de la Invención La presente invención provee un cristal de lectina y los dominios (LE) similares al EGF de la P-selectina ("P-selectina LE") , así como también las estructuras tridimensionales de la P-selectina LE cuando se derivan por los datos de difracción por rayos X del cristal de la P-selectina LE. Especialmente, las estructuras tri-dimensionales de la P-selectina LE se definen por las coordenadas estructurales en la Figura 2, ± una desviación de la raíz cuadrada del promedio del cuadrado de los átomos de estructura principal de amino ácidos de no más de 1.5Á. Las coordenadas estructurales de las estructuras tri-dimensionales de la P-selectina LE son útiles para un número de aplicaciones, incluyendo, pero no limitado a, la visualización, la identificación y la caracterización de diferentes sitios activos de la P-selectina LE, incluyendo el sitio que se une al SLex. Las estructuras del sitio activo entonces pueden usarse para diseñar agentes que interactúen con la P-selectina LE, así como también la P-selectina LE formando complejos con SLex, PSGL-1, u otras moléculas. La presente invención también provee una cristal de la P-selectina LE formando complejo con SLex, así como también las estructuras tri-dimensionales de la P-selectina LE y SLex cuando se derivan por los datos de difracción con rayos X del cristal de la P-selectina LE: SLex. Específicamente, se definen las estructuras tri-dimensionales de la P-selectina LE y SLex por las coordenadas estructurales mostrados en la Figura 3, ± una desviación de la raíz cuadrada del promedio de los cuadrados de los átomos de la estructura principal de amino ácidos de no más de 1.5Á. Las coordenadas estructurales de P-selectina LE y SLex son útiles para un número de aplicaciones, incluyendo, pero no limitado a, la visualización, la identificación y la caracterización de diferentes sitios activos del complejo de la P-selectina LE, SLex y la P-selectina LE : SLex, incluyendo el sitio que se une a SLex. Las estructuras del sitio activo entonces pueden usarse para diseñar agentes que interactúen con la P-selectina LE, SLex, así como también la P-selectina LE formando complejos con SLex, PSGL-1, u otras moléculas. La presente invención también provee un cristal de los dominios de la lectina y EGF (LE) de la E-selectina ("E-selectina LE") formando complejo con SLex, así como también las estructuras tri-dimensionales de la E-selectina LE y SLex como se derivan por los datos de difracción de los rayos X del cristal de E-selectina LE: SLex. Específicamente, se definen las estructuras tri-dimensionales de la E-selectina LE y SLex por las coordenadas estructurales mostradas en la Figura 4, ± una desviación del cuadrado del promedio de la raíz de los átomos de la cadena principal de amino ácidos de no más de 1.5Á. Las coordenadas estructurales de E-selectina LE y SLex son útiles para un número de aplicaciones, incluyendo, pero no limitado a, la visualización, la identificación y la caracterización de diferentes sitios activos de E-selectina LE, SLex y el complejo de la E-selectina LE : SLex, incluyendo el sitio que se une a SLex. Las estructuras del sitio activo entonces pueden usarse para diseñar agentes que interactúen con la E-selectina LE, SLex, así como también la E-selectina LE que forman complejos con SLex, PSGL-1, o moléculas relacionadas . Todavía más, la presente invención provee una estructura de cristal de la P-selectina LE formando complejo con el péptido de PSGL-1 funcional modificado por tanto la sulfatación de la tirosina como por el SLex, así como también las estructuras tri-dimensionales del péptido P-selectina LE y PSGL-1 cuando se deriva por los datos de difracción con rayos X del cristal del péptido P-selectina LE : PSGL-1. Específicamente, se definen las estructuras tri-dimensionales de la P-selectina LE y el péptido PSGL-1 por las coordenadas estructurales mostrados en la Figura 5, ± una desviación de la raíz cuadrada del promedio de los cuadrados de los átomos de la cadena principal de amino ácidos de no más de 1.5Á. Las coordenadas estructurales de P-selectina LE y el péptido PSGL-1 son útiles para un número de aplicaciones, incluyendo, pero no limitado a, la visualización, la identificación y la caracterización de diferentes sitios activos de P-selectina LE, el péptido PSGL-1 y el complejo de P-selectina LE : PSGL-1, incluyendo los sitios de unión de SLex y PSGL-1. Las estructuras del sitio activo entonces pueden usarse para diseñar agentes que interactúen con la E-selectina LE, PSGL-1, así como también la P-selectina LE formando complejos con SLex, PSGL-1, u otras moléculas. La presente invención también esta dirigida a una sitio activo de una proteína o péptido que se une a SLex, y preferentemente el sitio que se une a SLex de la P-selectina LE, que comprende las coordenadas estructurales relativas de los residuos de amino ácidos TYR48, GLU80, ASN82, GLU92, TYR94, PR098, SER99, ASN105, ASP106, GLU107 y el calcio de enlace de acuerdo a la Figura 3, ± una desviación de la raíz cuadrada del promedio de los cuadrados de los átomos de la cadena principal de amino ácidos de no más de 1.5Á. Alternativamente, puede incluirse el sitio activo, además de las coordenadas definidas arriba, las coordenadas estructurales relativas de los residuos de amino ácidos TYR44, SER46, SER47, ALA77, ASP78, ASN79, PR081, ASN83, ARG85, GLU88, CYS90, ILE93, LYS96, SER97, ALA100, TRP104, HIS108, LYS111 y LYS113 de acuerdo a la Figura 3, ± una desviación de la raíz cuadrada del promedio de los cuadrados de los átomos de la cadena principal de amino ácidos de no más de 1.5Á. El sito activo puede corresponder a la configuración de la P-selectina LE en su estado de asociación con un agente, preferentemente, SLex, o en su estado de no enlace.

La presente invención además esta dirigida a un sitio activo de una proteína o péptido que se une a SLex, y preferentemente el sitio que se une a SLex de la E-selectina LE, que comprende las coordenadas estructurales relativos de los residuos de amino ácidos TYR48, GLU80, ASN82, ASN83, GLU92, TYR94, ARG97, GLU98, ASN105, ASP106, GLU107 y el calcio de enlace de acuerdo a la Figura 4, ± una desviación de la raíz cuadrada del promedio de los cuadrados de los átomos de la cadena principal de amino ácidos de no más de 1.5Á. Alternativamente, puede incluirse el sitio activo, además de las coordenadas definidas arriba, las coordenadas estructurales relativas de los residuos de amino ácidos TYR44, SER46, PR045, SER47, ALA77, PR078, GLY79, PR081, GLU88, CYS90, LYS99, ASP100, TRP104, ARG108, LYSlll y LYS113 de acuerdo a la Figura 4, ± una desviación de la raíz cuadrada del promedio de los cuadrados de los átomos de la cadena principal de amino ácidos de no más de 1.5Á. El sito activo puede corresponder a la configuración de la E-selectina LE en su estado de asociación con un agente, preferentemente, SLex, o en su estado de no enlace. Todavía más, la presente invención también provee un sitio activo de la proteína o péptido que se une a PSGL-1, y preferentemente el sitio que se une a PSGL-1 de la P-selectina LE, que comprende las coordenadas estructurales relativas de los residuos de amino ácidos ALA9, TYR45, SER46, SER47, TYR48, GLU80, ASN82, LYS84, ARG85, GLU88, GLU92, TYR94, PR098, SER99, ASN105, ASP106, GLU107, HIS108, LEU110, LYS111, LYS112, LYS113, HIS114 y el estroncio de enlace de acuerdo a la Figura 5, ± una desviación de la raíz cuadrada del promedio de los cuadrados de los átomos de la cadena principal de amino ácidos de no más de 1.5Á. Alternativamente, puede incluirse el sitio activo, además de las coordenadas definidas arriba, las coordenadas estructurales relativas de los residuos de amino ácidos SER6, THR7, LYS8, TYR10, SERll, TYR44, TYR49, TRP50, ALA77, ASP78, ASN79, PR081, ASN83, ASN86, ASN87, CYS90, ILE93, ILE95, LYS96, SER97, ALA100, TRP104, y CYS109 de acuerdo a la Figura 5, ± una desviación de la raíz cuadrada de los promedios de los cuadrados de los átomos de la cadena principal de amino ácidos de no más de 1.5Á. El sitio que se une a PSGL-1 puede corresponder a la configuración de la P-selectina LE en su estado de asociación con un agente, preferentemente, PSGL-1 o un péptido de PSGL-1, o en su estado no enlazado. Además, la presente invención provee un método para identificar un agente que interactúa con la P-selectina LE, que comprende las etapas de; (a) generar un modelo tri- dimensional de la P-selectina LE usando las coordenadas estructurales relativas de acuerdo a las Figuras 2, 3 o 5, ± una desviación de la raíz cuadrada del promedio de los cuadrados de los átomos de la cadena principal de amino ácidos de no más de 1.5Á; y (b) emplear dichas estructuras tridimensionales para diseñar o seleccionar un agente. Además, la presente invención provee un método para identificar un activador o inhibidor de una molécula o un complejo molecular que comprende un sitio de unión de SLex, que comprende las etapas de: (a) generar un modelo tridimensional de dicha molécula o complejo molecular que comprende un sitio que se une a SLex usando (i) las coordenadas estructurales relativas de acuerdo a la Figura 3 de residuos TYR48, GLU80, ASN82, GLU92, TYR94, PR098, SER99, ASN105, ASP106, GLU107 y el calcio de enlace, ± una desviación de la raíz cuadrada del promedio de los cuadrados de los átomos de la cadena principal de amino ácidos de no más de 1.5Á, o (ii) las coordenadas estructurales relativas de acuerdo a la Figura 4 de los residuos de amino ácidos TYR48, GLU80, ASN82, GLU92, TYR94, ARG97, GLU98, ASN105, ASP106, GLU107 y el calcio de enlace, ± una desviación de la raíz cuadrada de los promedios de los cuadrados de los átomos de la cadena principal de amino ácidos de no más de 1.5Á, y (b) seleccionar o diseñar un candidato activador o inhibidor realizando el análisis de ajuste por computadora con el modelo tri-dimensional en la etapa (a) . En otra modalidad, las coordenadas estructurales relativas de acuerdo a la Figura 3 además comprenden los residuos de amino ácidos TYR44, SER46, SER47, ALA77, ASP78, ASN79, PR081, ASN83, ARG85, GLU88, CYS90, ILE93, LYS96, SER97, ALA100, TRP104, HIS108, LYS111 y LYS113, ± una desviación de la raíz cuadrada del promedio de los cuadrados de los átomos de la cadena principal de amino ácidos de no más de 1.5Á. En otra modalidad, las coordenadas estructurales relativas de acuerdo a la Figura 4 además comprenden los residuos de amino ácidos TYR44, SER45, PR046, SER47, ALA77, PR078, GLY79, PR081, GLU88, CYS90, LYS99, ASP100, TRP104, ARG108, LYS11 y LYS113, ± una desviación de la raíz cuadrada de los promedios de los cuadrados de los átomos de la cadena principal de amino ácidos de no más de 1.5A. La presente invención además de proveer un método para identificar un activador o inhibidor de una molécula o un complejo molecular que comprende un sitio que se une a PSGL-1, que comprende las etapas de: (a) generar un modelo tridimensional de dicha molécula o complejo molecular que comprende una sitio que se une a PSGL-1 usando las coordenadas estructurales relativas de acuerdo a la Figura 5 de residuos de amino ácidos ALA9, TYR45, SER46, SER47, TYR48, GLU80, ASN82, LYS84, ARG85, GLU88, GLU92, TYR94, PR098, SER99, ASN105, ASP106, GLU107, HIS108, LEU110, LYSlll, LYS112, LYS113, HIS114 y el estroncio de enlace, ± una desviación de la raíz cuadrada del promedio de los cuadrados de los átomos de la cadena principal de amino ácidos de no más de 1.5Á; y (b) seleccionar o diseñar un candidato o inhibidor realizando el análisis de ajuste por computadora con el modelo tri-dimensional generado en la etapa (a) . En otra modalidad, las coordenadas estructurales relativas de acuerdo a la Figura 5 además comprenden residuos de amino ácidos SER6, THR7, LYS8, TYR10, SER11, TYR44, TYR49, TRP50, ALA77, ASP78, ASN79, PR081, ASN83, ASN86, ASN87, CYS90, ILE93, ILE95, LYS96, SER97, ALA100, TRP104, y CYS109, ± una desviación de la raíz cuadrada del promedio de los cuadrados de los átomos de la cadena principal de amino ácidos de no más de 1.5Á. Además, la presente invención provee un método para identificar un agente que interactúe con SLex, que comprende las etapas de: (a) generar un modelo tri-dimensional de SLex usando las coordenadas estructurales relativas de acuerdo a las Figuras 3 o 4, ± una desviación de la raíz cuadrada del promedio de cuadrados de los átomos de la cadena principal de amino ácidos de no más de 1.5Á; y (b) emplear dicha estructura tri-dimensional para diseñar o seleccionar un agente que interactúe con SLex. Además todavía, la presente invención provee un método para identificar un agente que interactúe con PSGL-1, que comprende las etapas de: (a) generar un modelo tri-dimensional de PSGL-1 de un péptido de PSGL-1 usando las coordenadas estructurales relativas de acuerdo a la Figura 5, ± una desviación de la raíz cuadrada de los promedio de los cuadrados de los átomos de la cadena principal de amino ácidos de no más de 1.5Á; y (b) emplear dicha estructura tridimensional para diseñar o seleccionar un agente que interactúe con PSGL-1. La presente invención también provee agentes, activadores o inhibidores identificados usando los métodos antes mencionados. Las moléculas pequeñas u otros agentes que inhiben o de otra manera interfieren con el enrollamiento celular mediado por la selectina de los leucocitos en el tejido vascular puede ser útiles en el tratamiento de enfermedades que involucran las respuestas inflamatorias anormales como el asma o soriasis. Finalmente, la presente invención provee un método para obtener un complejo cristalizado de una molécula tipo E- selectina y un compuesto que coordina el calcio. El método comprende las etapas de: (a) poner en contacto una molécula de tipo E-selectina con un compuesto que coordina el calcio en presencia de los iones de calcio y del PEG para formar un complejo cristalizado de una molécula de tipo E-selectina y el compuesto que coordina el calcio; y (b) poner en contacto el complejo cristalizado en presencia de una concentración reducida de los iones de calcio, y las concentraciones suficientes de PEG y una sal iónica para obtener un complejo final cristalizado, que en frío, es adecuado para estructuras tri-dimensionales de la molécula de tipo E-selectina y el compuesto que coordina el calcio por la difracción con rayos X del complejo final cristalizado. Objetivos adicionales de la presente invención aparecerán en la descripción que sigue. Breve Descripción de las Figuras Las Figuras ÍA, IB y 1C representan la resolución y el análisis de afinidad de BIAcore de los péptidos de PSGL-1 19ek. La Fig. ÍA: El perfil de los péptidos de PSGL-1 19ek analizado mediante cromatografía de intercambio iónico. Ver el texto para la definición de las etiquetadas de la cima o los máximos. Insertar. La estructura del péptido SGP-3 PSGL-1 19ek principal. <Q denota la ciclización del residuo Gln N-terminal al piroglutamato y S03 representa la sulfatación de los residuos Tyr. La línea de encima en la secuencia del péptido numerada indica los residuos del origen de no PSGL-1 que se asocian con la región enlazadora de la enterocinasa. Las Figs. 1B-1 y 1B-2 : Sensorgramos de BIAcore representativo de P-LE en la fase de la solución para unirse a los constructos de PSGL-1 inmovilizados. El P-LE (en una concentración de 800 nM) se inyectó en la PSGLs (Fig. 1B-1) y SGP-3 (Fig. 1B-2) . Las señales de unión del P-Le inyectado de otras formas menos modificadas de SGP-3 (no mostrado) eran idénticas a estos resultados con respecto a las cinéticas de unión. El P-Le que se une a los PSGLs y SGP-3 se inhibió por la co-inyección con SGP-3 en la fase de la solución (línea punteada) pero no por un péptido sintético que no contiene la sulfatación o glucosilación de la no tirosina (línea punteada) , ambas en la concentración de 20 µM. Todas las curvas reflejan la unión especifica producida por la unión no especifica deducida de la unión total. Las Figs. 1C-1 - 1C-6: Las determinaciones de la afinidad de la unión de P-LE en la fase de la solución que reacciona con PSGLs inmovilizados y los péptidos 19ek purificados por el análisis de BIAcore. La primera hilera, de izquierda a derecha: PSGLs (Fig. 1C-1), SGP-3 (Fig. 1C-2) y SGP-2 (Fig. 1C-3) . Segunda hilera, de izquierda a derecha: SGP-1 (Fig. 1C-4), GP-1 (Fig. 1C-5) y SP-1 (Fig. 1C-6) . El P-LE en las concentraciones indicadas reaccionaron con los ligandos inmovilizados (para determinar la unión no especifica) en contra de las células de control que no contienen ligando (para determinar la unión no especifica) . Las respuestas de equilibrio (Req) en cada concentración de PLE se muestran. En cada concentración de P-LE probada, las señales de la unión especifica (cuadrados) se determinaron por las respuestas no especificas deducidas (triángulos) a partir de las señales de la unión total (diamantes) . Las desviaciones KDs y estándares (mostradas) se determinaron ajustando la línea de las curvas de unión especificas usando el conjunto de programas de BIAevaluación (BIAcore) y los productos son de los experimentos separados de tres a diez. Las determinaciones KD usando el ajuste lineal concertado bien con los valores determinado por el análisis de regresión lineal de gráficas de Scatchard (no mostrados) . La Figura 2 provee las coordenadas estructurales atómicas para la P-selectina LE cuando se deriva por la difracción con rayos X de un cristal de la P-selectina LE. "Tipo de átomo" se refiere a los átomos cuyas coordinadas se ha medido. "Residuo" se refiere al tipo o residuo del cual cada átomo de medición es una parte, por ejemplo, los amino ácidos, el co-factor, ligando o solvente. Las coordenadas "x, y, y z" indican las coordenadas cartesianas de cada localización del átomo medido en la célula unitaria (Á) . "Occ" indica el factor de ocupación. "B" indica el "valor de B" , que es una medida de cómo se mueve el átomo en la estructura atómica (A2) . "MOL" indica la identificación del segmento usado para identificar cada molécula en el cristal. Por "MOL", "MOLA", "MOLB", "MOLC" y "MOLD" se refiere a cada molécula de P-selectina LE, "SOLV" se refiere a las moléculas de agua, "MPDS" se refiere a las moléculas de MPD y "CALS" se refiere a los iones de calcio. Debido a las estructura desordenadas, se presentan a Lysl7 (MOLA), Lysl7 (MOLC) y Asn57 (MOLC) de la P-selectina como alaninas. La Figura 3 provee las coordenadas estructurales atómicas para la P-selectina LE y SLex cuando se derivan por la difracción con rayos X de un cristal de la P-selectina LE: SLex. Los encabezados de la Figura se anotan como en la Figura 2, excepto que por "MOL", "A", "B", "C", y "D" se refiere a cada molécula de P-selectina LE, y SLex, moléculas de MDP y los iones de calcio no se etiquetan por "MOL". Sin embargo, SLex, las moléculas de MDP y los iones de calcio se identifican por "Residuo". Debido a las estructuras desordenadas, se representan a Lysl7 (MOLA) , Lysl7 (MOLC) y Asn57 (MOLC) de P-selectina como alaninas.

La Figura 4 provee las coordenadas estructurales atómicas para la E-selectina LE y SLex cuando se derivan por difracción con rayos X de un cristal de P-selectina LE:SLex. Los encabezados de la Figura se anotan como en la Figura 2, excepto que por "MOL", "SOLV" se refiere a las molécula de agua, y E-selectina LE, SLex y calcio no se etiquetan con "MOL". Sin embargo, la E-selectina LE, SLex y el calcio se identifican como "Residuo". La Figura 5 provee las coordenadas estructurales atómicas para la P-selectina LE y el péptido de PSGL-1 cuando se derivan por difracción con rayos X de un cristal del péptido de P-selectina LE : PSGL-1. Los encabezados de la Figura se anotan como en la Figura 2, excepto que la Figura 5 no incluye un encabezado "MOL". Sin embargo, cada molécula de la P-selectina LE, del péptido PSGL-1, agua y MPD se identifican por "Residuo". Debido a las estructuras desordenadas, se representan a Asn57 (MOLA), Lys58 (MOLA) , Asn71 (MOLA), Arg22 (MOLB), Asn57 (MOLB), Lys58 (MOLB), Glu72 (MOLB) , Metl25 (MOLB) y Argl57 (MOLB) de la P-selectina como alaninas. Las Figuras 6A, 6B y 6C proveen las secuencias de amino ácidos de la P-selectina (Fig. 6A) , E-selectina (Fig. 6B) y PSGL-1 (Fig. 6C) . Los segmentos de las secuencias usadas para hacer los constructos en los cristales se subrayan.

Descripción Detallada de la Invención Como aquí se usó, los siguiente términos y frases deberán tener el significado descrito abajo: A menos que de otra manera se indique; "selectinas" son una familia de glucoproteínas de superficie celular responsables de los eventos de adhesión temprana en el reclutamiento de leucocitos dentro de los sitios de inflamación y su emigración dentro de los tejidos linfáticos, e incluyen la P-selectina, E-selectina y L-selectina, y los análogos de éstas que tienen actividad de selectina. La P-selectina preferentemente tiene la secuencia de amino ácidos descrita en la Figura 6A, incluyendo las substituciones conservativas. La E-selectina preferentemente tiene la secuencia de amino ácidos en la Figura 6B, incluyendo las substituciones conservativas. Una "molécula de tipo E-selectina" incluye la molécula de E-selectina entera así como también porciones de ésta, tales como la lectina y/o los dominios similares al factor de crecimiento epidérmico (EGF) , y preferentemente la "E-selectina LE" es como se define abajo. Los "dominios LE" representan la lectina y los dominios similares al factor de crecimiento epidérmico (EGF) de la selectina, y como aquí se usó, la "P-selectina LE" representa la lectina y los dominios similares a la EGF de la P-selectina, mientras "E-selectina LE" representa la lectina y los dominios similares a EGF de la E-selectina. Las secuencias de amino ácidos para la P-selectina LE y la E-selectina LE se muestran (subrayados) en las Figuras 6A, 6B, respectivamente, e incluyen las substituciones conservativas. "SLe " representa el tetrasacárido del sialilo de Lewisx (SLex, NeuNAc2,3Gall,4 [ [Fucl, 3] GlcNAc) , e incluye los "análogos de SLex" que tienen estructura y actividad similar como el SLex. Una "proteína o péptido que se une a SLex" es una proteína o péptido que se une a SLex y tiene un sitio que se une a SLex, e incluye pero no esta limitado a, P-selectina, E-selectina P-selectina LE y E-selectina LE. Una "molécula o un complejo molecular que comprende un sitio que se une a SLex" incluye (i) P-selectina, E-selectina, P-selectina LE, E-selectina LE, (ii) complejos de P-selectina, E-selectina, P-selectina LE o E-selectina LE con SLex, (iii) complejos de P-selectina, E-selectina, P-selectina LE o E-selectina LE con otras moléculas, y (iv) otras moléculas o complejos moleculares que tienen un sitio que se une a SLex. "PSGL-1" es una molécula que tienen actividad PSGL-1, e incluye un "péptido PSGL-1" como abajo se define. La secuencia de amino ácidos de PSGL-1 se describe en la Figura 6C, e incluye las substituciones conservativas de ésta. "Péptido PSGL-1" es un péptido modificado por la sulfatación con la tirosina y SLex, e incluye la estructura de péptido descrita en la Figura ÍA (denotada como SGP-3), incluyendo las substituciones conservativas de ésta. Una "proteína o péptido que se une a PSGL-1" es una proteína o péptido que se une a PSGL-1 y tiene un sitio que se une a PSGL-1, e incluye pero no esta limitado a P-selectina, E-selectina, P-selectina LE y E-selectina LE. Una "molécula o un complejo molecular que comprende un sitio que se une a PSGL-1" incluye (i) P-selectina, E-selectina, P-selectina LE, E-selectina LE, (ii) complejos de P-selectina, E-selectina, P-selectina LE, o E-selectina LE con PSGL-1 (iii) complejos P-selectina, E-selectina, P-selectina LE, o E-selectina LE con otras moléculas, y (iv) otras moléculas o complejos moleculares que tienen un sitio que se une a PSGL-1. A menos de que otra manera se indique, "proteína" o "molécula" debe incluir una proteína, dominio de proteína, polipéptido o péptido. Las "coordenadas estructurales" son las coordenadas cartesianas correspondientes a la relación espacial del átomo con los otros átomos en una molécula o complejo molecular. Las coordenadas estructurales puede obtenerse usando las técnicas de cristalografía con rayos X o las técnicas NMR, o puede derivarse usando el análisis de reemplazamiento molecular o de modelado de homología. Diferentes programas de un conjunto de programas (software) permiten la representación gráfica de un conjunto de coordenadas estructurales para obtener una representación tri-dimensional de una molécula o complejo molecular. Las coordenadas estructurales de la presente invención pueden modificarse de los conjuntos originales en la Figuras 2, 3, 4 o 5 mediante manipulación matemática, tales como por la inversión o adiciones o substracciones de enteros. Como tal, se reconoce que las coordenadas estructurales de la presente invención son relativas, y no están de una manera específicamente limitadas a las coordenadas x, y, z reales de las Figuras 2, 3, 4 o 5. Un "agente" deberá incluir una proteína, polipéptido péptido, ácido nucleico, incluyendo el ADN o ARN, molécula o compuesto o fármaco. La "desviación de la raíz cuadrada del promedio de los cuadrados" es la raíz cuadrada de promedio aritmético de los cuadrados de las desviaciones del promedio, y es una manera de expresar la desviación o variación de las coordenadas estructurales aquí descritas. La presente invención incluye todas las modalidades que comprende las substituciones conservativas de los residuos de amino ácidos anotados resultando en las mismas coordenadas estructurales dentro de la desviación de raíz promedio de cuadrados. Deberá ser obvio para un practicante experto que la numeración de los residuos de amino ácidos de P-selectina, E- selectina, P-selectina LE, E-selectina LE, PSGL-1 y el péptido de PSGL-1 puede ser diferente de la aquí descrita, y puede contener ciertas substituciones de amino ácidos conservativas que producen las mismas estructuras tri-dimensionales como aquellas aquí definidas en las Figuras 2, 3, 4 o 5. Los amino ácidos y substituciones conservativas correspondientes en otras isoformas o análogos son fácilmente identificados por la inspección visual de las secuencias de amino ácidos relevantes o usando los programas del conjunto de programas (software) de homología comercialmente disponibles (por ejemplo, MODELLAR, MSI, San Diego, CA) . Las "substituciones conservativas" son aquellas substituciones de amino ácidos que son funcionalmente equivalentes al residuo de amino ácidos substituido, ya sea por medio de tener una polaridad similar, arreglo amplio, o por pertenecer a la misma clase con el residuo substituido (por ejemplo, hidrofóbico, ácido o básico), e incluye las substituciones que tienen un efecto sin importancia sobre las estructuras tri-dimensionales de la P-selectina LE, E-selectina LE, el péptido PSGL-1, el complejo P-selectina LE : SLex, el complejo E-selectina LE : SLex, y el complejo proteína LE : péptido PSGL-1, con respecto al uso de dichas estructuras para la identificación y diseño de agentes que interactúan con P-selectina, E-selectina, P-selectina LE, E-selectina LE, SLex, PSGL-1, el péptido PSGL-1, el complejo P-selectina LE : SLex, el complejo E-selectina LE : SLex, el complejo P-selectina LE : péptido PSGL-1, así como también otras proteínas, péptidos, moléculas o complejos moleculares que comprenden un sitio que se une al PSGL-1 o SLex, para los análisis de reemplazo molecular y/o el modelado de homología.

Un "sitio activo" se refiere a una región de una molécula o complejo molecular que, como un resultado de su forma y cambio potencial, favorablemente interactúa o se asocia con otro agente (incluyendo, sin limitación, una proteína, polipéptido, péptido, ácido nucleico, incluyendo el ADN o ARN, molécula, compuesto o fármaco) vía diferentes fuerzas de unión covalente y/o no covalente. Como tal, un sitio activo de la presente invención puede incluir, por ejemplo, el sitio real de SLex o PSGL-1 que se une con P-selectina LE o E-selectina LE, así como también sitio de unión accesorio adyacente o próximo al sitio real de unión de SLex o PSGL-1 que no obstante pueden afectar la actividad de la P-selectina LE o E-selectina LE en la interacción o asociación con un agente en particular, ya sea por la interferencia directa con el sitio real de unión de PSGL-1 o SLex o por afectar indirectamente la conformación amplia o cambio potencial de P-selectina LE o E-selectina LE y por ello prevenir o reducir la unión de SLex o PSGL-1 con la P- selectina LE o E-selectina LE en el sitio real de unión de SLex o PSGL-1. Como aquí se usa, un "sitio activo" también incluye los residuos análogos de P-selectina LE y E-selectina LE que exhiben perturbaciones NMR observables en presencia de un ligando de unión, tal como SLex o PSGL-1. Mientras tales residuos exhiben perturbaciones NMR observables pueden no necesariamente estar en contacto directo con o inmediatamente próximo a los residuos que se unen al ligando, estos pueden ser cruciales los residuos de P-selectina LE y E-selectina LE para los protocolos de diseño del fármaco racional. La presente invención primero provee la P-selectina LE cristalizada. En una modalidad en particular, la P-selectina LE comprende los residuos de amino ácidos descritos en la Figura 6A (subrayado), incluyendo las substituciones conservativas. El cristal de la presente invención efectivamente difracta rayos X para la determinación de las coordenadas estructurales de la P-selectina LE, y se caracteriza por estar en forma de placa con un grupo espacial P2?, y que tienen parámetros celulares unitarios de a = 81.0Á, b = 60.8Á, c = 91.4 Á, y beta = 103.6°. Además, una unidad asimétrica cristalográfica de la P-selectina LE cristalizada contiene cuatro moléculas de P-selectina LE. La presente invención también provee un complejo cristalizado que comprende P-selectina LE y SLex. En una modalidad en particular, la secuencia de amino ácidos de la P-selectina LE se describe en la Figura 6A (subrayado), e incluye las substituciones conservativas. El complejo de cristal de la presente invención efectivamente difracta los rayos X para la determinación de las coordenadas estructurales del complejo de la P-selectina LE y SLex, y se caracteriza por estar en forma de placa con un grupo espacial P2?, y que tienen parámetros celulares unitarios de a = 81.1Á, b = 60.5Á, c = 91.4 A, y beta = 103.3°. Además, un complejo de la presente invención consiste de una molécula de un complejo de P-selectina LE : SLex en la unidad cristalina cristalográfica.

Además la presente invención provee un complejo cristalizado que comprende E-selectina LE y SLex. En una modalidad en particular, la secuencia de amino ácidos de la E-selectina LE se describe en la Figura 6B (subrayado), e incluye e incluye las substituciones conservativas. El complejo de cristal de la presente invención efectivamente difracta rayos X para la determinación de las coordenadas estructurales del complejo de la E-selectina LE y SLex, y se caracteriza por estar en forma de barra con un grupo espacial P2?2?2?, y que tienen parámetros celulares unitarios de a = 34.5Á y b = 72.4Á, c = 77.6 Á. Además, el complejo de la presente invención consiste de una molécula de una molécula del complejo de E-selectina LE : SLex en la unidad cristalina asimétrica . Además todavía la presente invención provee un complejo cristalizado que comprende P-selectina LE y péptido PSGL-1. El complejo de cristal de la presente invención efectivamente difracta rayos X para la determinación de las coordenadas estructurales del complejo de la P-selectina LE y el péptido PSGL-1, y se caracteriza por estar en forma bi-piramidal con un grupo espacial 1222, y que tienen parámetros celulares unitarios de a = 63.4Á y b = 96.8Á, c = 187.3 Á. Además, el complejo de la presente invención consiste de una molécula del complejo de PE-selectina LE : péptido PSGL-1 en la unidad cristalina cristalográfica. Una vez que el cristal o el complejo de cristal de la presente invención se hace crecer, los datos de difracción con rayos X puede recolectarse por una variedad de medios con el objetivo de obtener las coordenadas atómicas de la molécula o complejo molecular cristalizado. Con la ayuda de un conjunto de programas de computadora especialmente diseñado, tales datos cristalográficos pueden usarse para generar una estructura tri-dimensional de la molécula o complejo molecular. Diferentes métodos usados para generar y refinar la estructura tri-dimensional de una molécula o complejo molecular cristalizado son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica, e incluyen, sin ser una limitación, dispersión anómala de multi-longitud de onda (MAD) , reemplazo isomorfo múltiple, aplastamiento del solvente de espacio reciproco, reemplazo molecular, y reemplazo isomorfo simple con dispersión anómala (SIRAS) . Consecuentemente, la presente invención también provee la estructura tri-dimensional de P-selectina LE cuando se deriva por los datos de difracción con rayos X del cristal de P-selectina LE. Especialmente, la estructura tri-dimensional de la P-selectina LE se define por las coordenadas estructurales mostradas en la Figura 2, ± una desviación de raíz cuadrada del promedio de los cuadrados de los átomos de cadena principal de los amino ácidos de no más de 1.5Á, preferentemente no mayor de 1.0 Á, y más preferentemente no mayor de 0.5 Á. Las coordenadas estructurales de las estructuras tri-dimensionales de la P-selectina LE son útiles para un número de aplicaciones, pero no limitado a, la visualización, la identificación y la caracterización de diferentes sitios activos de la P-selectina LE, incluyendo el sitio que se une a SLex. Las estructuras del sitio activo entonces pueden usarse para diseñar agentes que interactúen con la P-selectina LE, así como también la P-selectina LE hecha complejo con SLex, PSGL-1, o moléculas relacionadas.

Además, la presente invención provee las estructuras tri-dimensionales de P-selectina LE y SLex cuando se derivan por los datos de difracción con rayos X del cristal P-selectina LE : SLex. Especialmente, se definen las estructuras tri-dimensionales de P-selectina LE y SLex por las coordenadas estructurales mostradas en la Figura 3, ± una desviación de la raíz cuadrada del promedio de los cuadrados de los átomos de cadena principal de los amino ácidos de no más de 1.5Á, preferentemente no mayor de 1.0 Á, y más preferentemente no mayor de 0.5 Á. Las coordenadas estructurales de la P-selectina LE y SLex son útiles para un número de aplicaciones, incluyendo, pero no limitado a, la visualización, la identificación y la caracterización de diferentes sitios activos de la P-selectina LE, SLex y el complejo P-selectina LE : SLex, incluyendo el sitio que se une al SLex. Las estructuras del sitio activo entonces pueden usarse para diseñar agentes que interactúen con la P-selectina LE, SLex, así como también la P-selectina LE hecha complejo con SLex, PSGL-1, o moléculas relacionadas. La presente invención además provee las estructuras tri-dimensionales de E-selectina LE y SLex cuando se derivan por los datos de difracción con rayos X del cristal E-selectina LE : SLex. Específicamente, se definen las estructuras tri-dimensionales de E-selectina LE y SLex por las coordenadas estructurales mostradas en la Figura 4, ± una desviación de raíz cuadrada del promedio de los cuadrados de los átomos de cadena principal de los amino ácidos de no más de 1.5Á, preferentemente no mayor de 1.0 Á, y más preferentemente no mayor de 0.5 A. Las coordenadas estructurales de la E-selectina LE y SLex son útiles para un número de aplicaciones, incluyendo, pero no limitado a, la visualización, la identificación y la caracterización de diferentes sitios activos de la E-selectina LE, SLex y el complejo E-selectina LE : SLex, incluyendo el sitio que se une al SLex. Las estructuras del sitio activo entonces pueden usarse para diseñar agentes que interactúen con la E-selectina LE, SLex, así como también la E-selectina LE hecha complejo con SLex, PSGL-1, o moléculas relacionadas. Todavía más, la presente invención además provee las estructuras tri-dimensionales de P-selectina LE y péptido de PSGL-1 cuando se derivan por los datos de difracción con rayos X del cristal P-selectina LE : proteína de PSGL-1. Especialmente, se definen las estructuras tri-dimensionales de P-selectina LE y péptido de PSGL-1 por las coordenadas estructurales mostradas en la Figura 5, ± una desviación de raíz promedio de cuadrados de los átomos de cadena principal de los ámino ácidos de no más de 1.5Á, preferentemente no mayor de 1.0 A, y más preferentemente no mayor de 0.5 A. Las coordenadas estructurales de la P-selectina LE y el péptido de PSGL-1 son útiles para un número de aplicaciones, incluyendo, pero no limitado a, la visualización, la identificación y la caracterización de diferentes sitios activos de la P-selectina LE, PSGL-1 y el complejo P-selectina LE : péptido de PSGL-1, incluyendo los sitios que se unen a PSGL-1 ( y SLex) . Las estructuras del sitio activo entonces pueden usarse para diseñar agentes que interactúen con la P-selectina LE, PSGL-1, así como también la P-selectina LE formando complejo con SLex, PSGL-1, o moléculas relacionadas. La presente invención también se dirige a un sitio activo de una proteína o péptido que se une a SLex, y preferentemente el sitio de que une a SLex de la P-selectina LE, que comprende las coordenadas estructurales relativas de los residuos de amino ácidos TYR48, GLU80, ASN82, GLU92, TYR94, PR098, SER99, ASN105, ASP106, GLU107 y el calcio de enlace de acuerdo a la Figura 3, ± una desviación de raíz cuadrada del promedio de los cuadrados de los átomos de cadena principal de los amino ácidos de no más de 1.5Á, preferentemente no mayor de 1.0 Á, y más preferentemente no mayor de 0.5 Á. Alternativamente, el sitio activo puede incluir, además a las coordenadas estructurales de arriba, las coordenadas estructurales relativas de los residuos de amino ácidos TYR44, SER46, SER47, ALA77, ASP78, ASN79, PR081, ASN83, ARG85, GLU88, CYS90, ILE93, LYS96, SER97, ALA100, TRP104, HIS108, LYS111 y LYS113 de acuerdo a la Figura 3, ± una desviación de raíz promedio de cuadrados de los átomos de cadena principal de los amino ácidos de no más de 1.5Á, preferentemente no mayor de 1.0 A, y más preferentemente no mayor de 0.5 Á. El sitio activo de SLex puede corresponder a la configuración de la P-selectina LE en su estado de asociación con un agente, preferentemente, SLex, o en su estado de no enlace. La presente invención además se dirige a un sitio activo de una proteína o péptido que se une a SLex, y preferentemente al sitio que se une a SLex de E-selectina LE, que comprende las coordenadas estructurales relativas de los residuos de amino ácidos TYR48, GLU80, ASN82, ASN83, GLU92, TYR94, ARG97, GLU98, ASN105, ASP106, GLU107 y el calcio de enlace de acuerdo a la Figura 4, ± una desviación de la raíz cuadrada del promedio de los cuadrados de los átomos de cadena principal de los amino ácidos de no más de 1.5Á, preferentemente no mayor de 1.0 Á, y más preferentemente no mayor de 0.5 Á. Alternativamente, el sitio activo puede incluir, además a las coordenadas estructurales de arriba, las coordenadas estructurales relativas de los residuos de amino ácidos TYR44, SER45, PR046, SER47, ALA77, PR078, GLY79, PR081, GLU88, CYS90, LYS99, ASP100, TPR104, ARG108, LYS111 y LYS113 de acuerdo a la Figura 4, ± una desviación de la raíz cuadrada del promedio de los cuadrados de los átomos de cadena principal de los amino ácidos de no más de 1.5Á, preferentemente no mayor de 1.0 A, y más preferentemente no mayor de 0.5 Á. El sitio activo de SLex puede corresponder a la configuración de la E-selectina LE en su estado de asociación con un agente, preferentemente, SLex, o en su estado de no enlace. Todavía más, la presente invención provee un sitio activo de una proteína o péptido que se une a PSGL-1, y preferentemente al sitio que se une a PSGL-1 de P-selectina LE, que comprende las coordenadas estructurales relativas de los residuos de amino ácidos ALA9, TYR45, SER46, SER47, TYR48, GLU80, ASN82, LYS84, ARG85, GLU88, GLU92, TYR94, PR098, SER99, ASN105, ASP106, GLU107, HIS108, LEU110, LYS111, LYS112, LYS113, HIS114, y el estroncio de enlace de acuerdo a la Figura 5, ± una desviación de la raíz cuadrada del promedio de los cuadrados de los átomos de cadena principal de los amino ácidos de no más de 1.5Á, preferentemente no mayor de 1.0 A, y más preferentemente no mayor de 0.5 Á. Alternativamente, el sitio activo puede incluir, además a las coordenadas estructurales de arriba, las coordenadas estructurales relativas de los residuos de amino ácidos SER6, THR7, LYS8, TYR10, SER11, TYR44, TYR49, TRP50, ALA77, ASP78, ASN79, PR081, ASN83, ASN86, ASN87, CYS90, ILE93, ILE95, LYS96, SER97, ALA100, TRP104, y CYS109 de acuerdo a la Figura 5, ± una desviación de la raíz cuadrada promedio de los cuadrados de los átomos de cadena principal de los amino ácidos de no más de 1.5Á, preferentemente no mayor de 1.0 Á, y más preferentemente no mayor de 0.5 Á. El sitio activo de PSGL-1 puede corresponder a la configuración de la P-selectina LE en su estado de asociación con un agente, y preferentemente, PSGL-1 o un péptido de PSGL-1, o en su estado de no enlace. También dentro de los confines de la presente invención el estroncio puede substituirse con calcio para propósitos de usar las coordenadas estructurales para el diseño del fármaco.

Otro aspecto de la presente invención se dirige a un método para identificar un agente que interactúe con una unión o sitio activo de la P-selectina LE. Especialmente, el método comprende las etapas de: (a) generar un modelo tri-dimensional de P-selectina LE usando las coordenadas estructurales relativas de acuerdo a la Figura 2, 3 o 5, ± una desviación de la raíz cuadrada del promedio de los cuadrados de los átomos de cadena principal de los amino ácidos de no más de 1.5Á, preferentemente no mayor de 1.0 A, y más preferentemente no mayor de 0.5 A; y (b) emplear dicha estructura tri-dimensional para diseñar o seleccionar un agente. El agente puede identificarse usando los análisis de acoplado por computadora utilizando diferentes programas de un conjunto de programas de computo que evalúan el "acoplado" o "ajuste" entre el sitio activo putativo y el agente identificado, por (a) generar un modelo tri-dimensional del sitio activo putativo de una molécula o complejo molecular usando el modelado de homología o las coordenadas estructurales atómicas del sitio activo, y (b) determinar el grado de asociación entre el sitio activo putativo y el agente identificado. Los modelos tri-dimensionales del sitio activo putativo pueden generarse usando cualquiera de un número de métodos conocidos en la técnica, e incluyen, pero no están limitados a, el modelado por homología así como también el análisis por computadora de los datos puro o en bruto generados usando los datos cristalográficos o espectroscópicos. Los programas de computadora usando para generar tales modelos tridimensionales y/o realizar los análisis de acoplado necesarios incluyen, pero no están limitados a: GRID (Oxford University, Oxford, UK) , MCSS (Molecular Simulations, San Diego, CA) , AUTODOCK (Scripps Research Institute, La Jolla, CA) , DOCK (University of California, San Diego, CA) , Flo99 (Thistlesoft , Morris Township, NJ) , Ludi (Molecular Simulations, San Diego, CA) , QUANTA (Molecular Simulations, San Diego, CA) , Insight (Molecular Simulations, San Diego, CA) , SYBYL (TRIPOS, Inc., St. Louis. MO) y LEAPFROG (TRIPOS, Inc., St . Louis, MO) . El efecto de un agente identificado por los análisis de acoplado por computadora en la actividad de la P-selectina LE puede además evaluarse poniendo en contacto el agente identificado con la P-selectina LE y midiendo el efecto del agente sobre la actividad de la P-selectina LE. Dependiendo de la acción del agente sobre el sitio activo de la P-selectina LE, el agente puede actuar ya sea con un inhibidor o activador de la actividad de la P-selectina LE. Por ejemplo, los ensayos enzimáticos pueden realizarse y los resultados analizarse para determinar sí el agente es un inhibidor de la P-selectina LE y SLex (por ejemplo, el agente puede reducir o prevenir la unión por afinidad entre la P-selectina LE y SLex) o un activador de la P-selectina LE y SLex (por ejemplo, el agente puede incrementar la unión por afinidad entre la P-selectina y SLex) . Pruebas adicionales pueden realizarse para evaluar la eficacia terapéutica potencial del agente identificado en condiciones asociadas con las selectinas como la inflamación.

La presente invención no está limitada a identificar loa agentes que interactúan con un sitio activo de la P-selectina LE, pero también se dirige a un método para identificar un activador o inhibidor de cualquier molécula o complejo molecular que comprende un sitio que se une a SLex o un sitio que se une a PSGL-1, incluyendo pero no se limita a P-selectina, E-selectina, E-selectina LE, complejo P-selectina LE : SLex, y el complejo E-selectina LE : SLex. En una modalidad, la presente invención provee un método ara identificar un activador o inhibidor de una molécula o complejo molecular que comprende un sitio que se une a SLex, que comprende las etapas de: (a) generar un modelo tri-dimensional de dicha molécula o complejo molecular que comprende un sitio que se une a SLex usando (i) las coordenadas estructurales relativas de acuerdo a la Figura 3 de los residuos de amino ácidos TYR48, GLU80, ASN82, GLU92, TYR94, PR098, SER99, ASN105, ASP106, GLU107 y el calcio de enlace, ± una desviación de la raíz cuadrada del promedio de los cuadrados de los átomos de la cadena principal de amino ácidos de no más de 1.5Á, preferentemente no mayor de 1.0 A, más preferentemente no mayor de 0.5 Á o (ii) las coordenadas estructurales relativas de acuerdo a la Figura 4 de residuos de amino ácidos TYR48, GLU80, ASN82, GLU92, TYR94, ARG97, GLU98, ASN105, ASP106, GLU107 y el calcio de enlace, ± una desviación de raíz promedio de cuadrados de los átomos de la cadena principal de amino ácidos de no más de 1.5Á, preferentemente no mayor de 1.0 Á, más preferentemente no mayor de 0.5 Á; y (b) seleccionar o diseñar un inhibidor o activador candidato realizando el análisis de acoplado por computadora con el modelo tri-dimensional generado en la etapa (a) . En otra modalidad, las coordenadas estructurales relativas de acuerdo a la Figura 3 además comprende los residuos de amino ácidos TYR44, SER46, SER47, ALA77, ASP78, ASN79, PR081, ASN83, ARG85, GLU88, CYS90, ILE93, LYS96, SER97, ALA100, TRP104, HIS108, LYS111 y LYS113, ± una desviación de la raíz cuadrada del promedio de los cuadrados de los átomos de la cadena principal de amino ácidos de no más de 1.5Á, preferentemente no mayor de 1.0 Á, más preferentemente no mayor de 0.5 Á. En una modalidad más, las coordenadas estructurales relativas de acuerdo a la Figura 4 además comprenden los residuos de amino ácidos TYR44, SER45, PR046, SER47, ALA77, PR078, GLY79, PR081, GLU88, CYS90, LYS99, ASPlOO, TRP104, ARG108, LYS111 y LYS113, ± una desviación de la raíz cuadrada del promedio de los cuadrados de los átomos de la cadena principal de amino ácidos de no más de 1.5Á, preferentemente no mayor de 1.0 Á, más preferentemente no mayor de 0.5 Á. Una vez que el activador o inhibidor candidato se obtiene o se sintetiza, el activador o inhibidor candidato puede ponerse en contacto con la molécula o complejo molecular, y puede determinarse el efecto del activador o inhibidor candidato tiene sobre dicha molécula o complejo molecular. Preferentemente, el activador o inhibidor candidato se pone en contacto con la molécula o complejo molecular en presencia de SLex (o una molécula o complejo molecular que comprende SLe ) con el objetivo de determinar el efecto que el activador o inhibidor candidato tiene sobre la unión de molécula o complejo molecular con SLex. En todavía otra modalidad, la presente invención provee un método para identificar un activador o inhibidor de una molécula o complejo molecular que comprende un sitio que se une a PSGL-1, que comprende (a) generar un modelo tridimensional de dicha molécula o complejo molecular que comprende un sitio que se une a PSGL-1 usando las coordenadas estructurales relativas de acuerdo a la Figura 5 de los residuos de amino ácidos ALA9, TYR45, SER46, SER47, TYR48, GLU80, ASN82, LYS84, ARG85, GLU88, GLU92, TYR94, PR098, SER99, ASN105, ASP106, GLU107, HIS108, LEU110, LYS111, LYS112, LYS113, HIS114 y el estroncio de enlace, ± una desviación de la raíz cuadrada del promedio de los cuadrados de los átomos de la cadena principal de amino ácidos de no más de 1.5Á, preferentemente no mayor de 1.0 A, más preferentemente no mayor de 0.5 Á; y (b) seleccionar o diseñar un activador o inhibidor candidato realizando el análisis de acoplado por computadora con el modelo tri-dimensional generado en la etapa (a) . En otra modalidad, las coordenadas estructurales relativas de acuerdo a la Figura 5 además comprende los residuos de amino ácidos SER6, THR7, LYS8, TYR10, SER11, TYR44, TYR49, TRP50, ALA77, ASP78, ASN79, PR081, ASN83, ASN86, ASN87, CYS90, ILE93, ILE95, LYS96, SER97, ALA100, TRP104, y CYS109, ± una desviación de la raíz cuadrada del promedio de los cuadrados de los átomos de la cadena principal de amino ácidos de no más de 1.5Á, preferentemente no mayor de 1.0 Á, más preferentemente no mayor de 0.5 A. Una vez que el activador o inhibidor candidato se obtiene o se sintetiza, el activador o inhibidor candidato puede ponerse en contacto con la molécula o complejo molecular, y puede determinarse el efecto del activador o inhibidor candidato tiene sobre dicha molécula o complejo molecular. Preferentemente, el activador o inhibidor candidato se pone en contacto con la molécula o complejo molecular en presencia de PSGL-1 o un péptido de PSGL-1 con el objetivo de determinar el efecto que el activador o inhibidor candidato tiene sobre la unión de molécula o complejo molecular con PSGL-1 o el péptido de PSGL-1. Aquí otra vez, también dentro de los confines de la presente invención el estroncio puede substituirse con calcio para los propósitos de usar las coordenadas estructurales para el diseño del fármaco. Además, las coordenadas estructurales de SLex descritas en las Figuras 3 o 4, y las coordenadas estructurales del péptido de PSGL-1 descritas en la Figura 5 pueden usarse para identificar o diseñar agentes que interactúen con SLex y PSGL-1, respectivamente. En este sentido, la presente invención provee un método para identificar un agente que interactúa con SLex, que comprende las etapas de: (a) generar un modelo tridimensional de SLex usando las coordenadas estructurales relativos de acuerdo a la Figura 3 o 4, ± una desviación de raíz promedio de cuadrados de los átomos de la cadena principal de amino ácidos de no más de 1.5Á, preferentemente no mayor de 1.0 Á, más preferentemente no mayor de 0.5 A; y (b) emplear dicha estructura tri-dimensional para diseñar o seleccionar un agente que interactúe con SLex. El agente identificado entonces puede sintetizarse u obtenerse, y entonces ponerse en contacto con SLex (o una molécula o complejo molecular que comprende SLex) para determinar el efecto que tiene el agente sobre la actividad de SLex.

Aún más, la presente invención provee un método para identificar un agente que interactúa con PSGL-1, que comprende (a) generar un modelo tri-dimensional del péptido de PSGL-1 usando las coordenadas estructurales relativos de acuerdo a la Figura 5, ± una desviación de raíz promedio de cuadrados de los átomos de la cadena principal de amino ácidos de no más de 1.5Á, preferentemente no mayor de 1.0 A, más preferentemente no mayor de 0.5 A; y (b) emplear dicha estructura tridimensional para diseñar o seleccionar un agente que interactúe con PSGL-1. El agente identificado entonces puede sintetizarse u obtenerse, y entonces ponerse en contacto con PSGL-1 o el péptido de PSGL-1 (o una molécula o complejo molecular que comprende PSGL-1 o el péptido de PSGL-1) para determinar el efecto que tiene el agente sobre la actividad de PSGL-1 o el péptido de PSGL-1. Diferentes análisis moleculares y técnicas de diseño de fármacos racionales además se divulgan en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,834,228, 5,939,528, y 5,865,116 así como también en la Solicitud de PCT No. PCT/US98/16879, publicada WO 99/09148, los contenidos se identificaron usando los métodos antes mencionados. Tales agentes, activadores o inhibidores pueden ser una proteína, polipéptido, péptido, ácido nucleico, incluyendo el ADN o ARN, molécula, compuesto, o fármaco. Las molécula pequeñas u otros agentes que inhiben u de otra manera interfieren con el enrollamiento celular mediado por la selectina de los leucocitos sobre el tejido vascular, pueden ser útiles en el tratamiento de enfermedades que involucran las respuestas inflamatorias anormales tales como el asma y la psoriasis. Además, la presente invención se dirige a un método para determinar la estructura tri-dimensional de una molécula o complejo molecular cuya estructura se conoce, que comprende las etapas de obtener cristales de la molécula o complejo molecular cuya estructura se conoce y generar los datos de difracción con rayos X a partir de la molécula o complejo molecular cristalizado. Los datos de difracción con rayos X a partir de la molécula o complejo molecular entonces se comparan con la estructura tri-dimensional conocida determinada por cualquiera de los cristales antes mencionados de la proteína. Entonces, la estructura tri-dimensional conocida determinada por los cristales de la presente invención se "conforma" usando el análisis de reemplazo molécula con los datos de difracción con rayos X de la molécula o complejo molecular cristalizado. Alternativamente, los datos espectroscópicos o el modelado por homología pueden usarse para generar una estructura tri-dimensional putativa para la molécula o complejo molecular, y la estructura putativa se refina mediante la confortación de la estructura tri-dimensional conocida determinada con cualquiera de los cristales de la presente invención. Finalmente, la presente invención provee un método para obtener un complejo cristalizado de una molécula de tipo E-selectina y un compuesto que se coordina con el calcio tal como el SLex. El método comprende las etapas de: (a) poner en contacto una molécula de tipo E-selectina critalizada con un compuesto que se coordina con el calcio en presencia de los iones de calcio y PEG para formar una complejo cristalizado de la molécula de tipo E-selectina y el compuesto que se coordina con el calcio; y poner en contacto el complejo cristalizado en presencia de una concentración reducida de iones de calcio, y concentraciones suficientes de PEG y una sal iónica para obtener un complejo final cristalizado, que luego del enfriamiento, es adecuado para elucidar o clarificar las estructuras tri-dimensionales de la molécula de tipo E-selectina y el compuesto que se coordina con el calcio mediante la difracción con rayos X del complejo final cristalizado. En el método, la "molécula de tipo E-selectina" puede ser la molécula de E-selectina así como también porciones de éstas, tales como la lectina y/o los dominios similares al factor de crecimiento epidérmico (EGF) , y preferentemente es la E-selectina LE. El compuesto que se coordina con el calcio preferentemente es SLex. En la etapa (a) , la molécula de tipo E-selectina cristalizada puede prepararse mediante los procedimientos conocidos en la técnica. Cuando la molécula de tipo E-selectina cristalizada es la E-selectina LE, la E-selectina Le cristalizada preferentemente se prepara como se describe en el Ejemplo 1 de abajo. La fuente de los iones de calcio en el método preferentemente es CaCl2, mientras el PEG preferentemente es PEG-1000 a PEG-20,000, y más preferentemente PEG-4000. La sal iónica puede ser un número de sales iónicas conocidas en la técnica, y preferentemente es NaCl. Un importante aspecto del método es la reducción de los iones de calcio en la etapa (b) , o el uso de una concentración de calcio efectiva que, previene o reduce el efecto del calcio en inhibir la unión del compuesto que se coordina con el calcio con la molécula de tipo E-selectina, por lo cual se permite la formación de una complejo final cristalino que es adecuado para elucidar o clarificar las estructuras tri-dimensionales de la molécula de tipo E-selectina y el compuesto que se coordina con el calcio mediante la difracción con rayos X del complejo final cristalizado. Es decir, la concentración del calcio deberá ser suficientemente baja para permitir que el compuesto que se coordina con el calcio se una a su sitio de unión en la molécula de tipo E-selectina. Por ejemplo, sí el compuesto que se coordina con el calcio es SLex, entonces se contempla que la concentración de los iones de calcio en la etapa (a) pueden variar de 20 mM a 300 mM, mientras la concentración de los iones de calcio en la etapa (b) es inferior (por ejemplo, en el rango de 100 µM a 20 mM) . En las etapas (a) y (b) , el PEG deberá estar en una concentración suficiente de calcio, y es preferentemente alrededor del 15% al 60% (peso / volumen) de PEG. La concentración de la sal iónica en la etapa (b) es alrededor de 10 mM a 500 mM. La acción de poner en contacto en la etapa (a) puede afectar por aproximadamente 10-20 horas, y preferentemente aproximadamente 15 horas cuando el compuesto que se coordina con el calcio es SLex. La acción de poner en contacto en la etapa (b) se afecta por aproximadamente 0.5-3 horas, y preferentemente por aproximadamente 1 hora. También dentro de los confines de la presente invención las etapas (a) y (b) pueden combinarse en cuyo caso la molécula de tipo E-selectina cristalizada se contacte con un compuesto que se coordina con el calcio en presencia de las concentraciones suficientes de iones de calcio, PEG y un sal iónica para formar un complejo cristalizado (de la molécula de tipo E-selectina y del compuesto que se coordina con el calcio) que es adecuado para elucidar o clarificar las estructuras tri-dimensionales de la molécula de tipo E-selectina del complejo cristalizado final. Sí las etapas (a) y (b) se combinan, entonces se contempla que las concentraciones de los iones de calcio, PEG y sal iónica son de aproximadamente 100 µM a 20 mM, 15% al 60% (peso / volumen) y 10 mM a 500 mM, respectivamente. La presente invención puede entenderse mejor haciendo referencia al siguiente Ejemplo no limitante. El siguiente Ejemplo se presenta con el objetivo de ilustrar más completamente las modalidades preferidas de la invención, y deberá interpretarse que limita el ámbito de la presente invención. Ejemplo 1 1. Procedimientos Experimentales Generación de los Constructos y la Preparación de la Proteina / Péptido. Los dominios de la lectina-EGF (LE) (153 amino ácidos) de P-selectina (P-LE) y E-selectina (E-LE) combinados con la región CH2-CH3 de IgG? vía una secuencia de incisión de la enterocinasa gue interviene (Asp-Asp-Asp-Asp-Lys ) se expresaron en las células CHO y se recuperaron del medio condicionado por cromatografía con sefarosa (Pharmacia) de la proteína A. Los dominios de la selectina LE monoméricos ser produjeron mediante la digestión de los constructos diméricos Fc con enterocinasa (LaVallie et al., 1993) y la enzima y los dominios residuales de Fc se removieron mediante cromatografía sobre columnas de inhibidor de tripsina de soya-agarosa (Sigma) y proteína A (Perseptive Biosystems). Los dominios de la E-selectina LE se desglucosilaron a 37°C por 48 horas en una proporción de 25 miliunidades de proteína N-glicanasa /mg y se purificaron mediante la cromatografía de intercambio iónico y de interacción hidrofóbica. Los dominios LE se produjeron en 10-30 mg/ml mediante concentración al vacío. Tanto P-LE como E-LE se determinaron como correctos mediante la espectrometría de masa (MS) , ser monoméricos mediante la filtración con gel HPLC, y ser funcionales mediante el análisis de la resonancia plasmon en la superficie (BIAcore) (ver abajo). Un constructo soluble (19ek.FC) que contiene los 19 amino ácidos N-terminales de la PSGL-1 fusionados con la región de Fc de IgGi vía un conectador de nueve amino ácidos que contiene la secuencia de escisión de la enterocinasa descrito antes (Gotees et al., 1997). El 19ek.Fc se purificó, se digirió con enterocinasa y los péptidos de PSGL-1 19ek monoméricos se recuperaron como arriba para los constructos LE. Los péptidos 19ek heterogéneos se purificaron en especies individuales mediante la cromatografía de intercambio iónico de SuperQ usando un gradiente de 0-500 mM de NaCl. Sus estructuras se determinaron mediante MS antes y después de las digestiones proteolíticas y glucosídicas, NMR, y los análisis de la composición (J. Rouse, D. Tsao, y R. Camphausen, datos no publicados) . Estudios de enlace del péptido P-LE / 19ek. La resonancia del plasmon en la superficie se realizó con instrumentos de BIAcore 2000 y 3000 a 25°C usando porciones pequeñas de sensor revestidos con estreptavidina (BIAcore) y un amortiguador de HBS-P (BIAcore; 10 mM de HEPES (pH 7.4), 150 mM de NaCl, y 0.005% de polisorbato 20 (v/v) se ajustó a 1 mM cada CaCl2 y MgCl2. Los péptidos 19ek y PSGLs, una versión modificada de fucosiltransferasa-VII del dominio extracelular dimérico completo de PSGL-1 (Croce et al., 1998), se biotinilaron en los residuos Lys con Sulfo-NHS-LC-Biotina (Pierce) . Siguiendo la biotinilación, los PSGLs reaccionaron con la P-selectina inmovilizada con el objetivo de aislar el material funcional (Sako, et al., 1995). Un péptido sintético (AnaSpec, Inc.), correspondiente a la porción del polipéptido de SGP-3 similarmente se biotiniló. Los reactivos biotinilados se revistieron sobre las porciones pequeñas del sensor usando el amortiguador HBS-P. Los P-LE y E-LE glucosilados, cuantificados por los coeficientes de extinción experimentalmente determinados (280 nm) , se inyectaron sobre el péptido 19ek, PSGLs y las superficies de control en 40 µL/min. La especificidad de unión se confirmó mediante los experimentos de control realizados en presencia de Mabs neutralizantes en la P- y E-selectina, 10 mM de EDTA, y péptidos 19ek solubles (R. Camphausen, datos no publicados). El P-Le y E-LE desglucosilados se enlazan comparablemente a las versiones glucosiladas, intactas. Cristalización y Recolección de Datos. Todos los datos de difracción se recolectaron para uso interno en generadores Rigaku RU200 trabajando a 5.0 KW, con espejos de enfoque de Yale/Molecular Structure Corp. y detectores del área de placas de imagen de RAXIS II o RAXIS IV excepto en donde se apuntó.

Los cristales formados en la placa de P-LE se hicieron crecer a 18 °C usando difusión con vapor de una solución que contiene 10 Mg/ml de proteína, 100 mM de Tris-HCl (pH 8.5), 150 mM NaCl, 12 mM CaCl2, 10% (v/v) 2,4 metil pentano diol (MPD) , y 10% (peso / volumen) PEG 6000. Estos cristales se transfirieron en 100 mM de Tris-HCl (pH 8.5), 75 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 10% (v/v) MPD, y 11% (peso / volumen) PEG 6000, entonces se transfirieron por dos horas al mismo amortiguador diluido por 5% (v/v) con MPD. Después de una segunda dilución al 5% con MPD el cristal se impregnó por 13 horas antes del enfriado instantáneo en propano líquido sosteniéndolo a la temperatura del nitrógeno líquido. El P-LE formando complejo con SLex (SLex-ß-0.metil, Toronto Research Chemicals) se obtuvo usando los mismos métodos pero con la adición de 8 mM de SLex a la solución final de impregnación. El grupo espacial de los cristales P-LE era P2? con los parámetros de célula a = 81.0 A, b = 60.8 Á, c = 91.4 Á, y beta = 103.6 Á. Los cristales de impregnación en SLex redujeron la resolución máxima a 3.4 A, incrementaron la mosaicidad a 1.5° y proporcionaron los parámetros de la célula a = 81.1 A, b = 60.5 Á, c = 91.4 Á y beta = 103.3°. Los datos de difracción se procesaron y escalaron con DENZO/SCALEPACK (HTL Research, Ine) proporcionando las estadísticas reportadas en la Tabla 1. Los cristales en forma de barra, grandes de E-LE se obtuvieron usando la difusión con vapor a 18° a partir de la solución que contiene 30 mg/ml de proteína, 100 mM de HEPES (pH 7.5), 10 mM de Tris-HCl, 200 mM de CaCl2 y 15% (peso / volumen) de PEG 4000. Los cristales tomaron varias semanas para crecer y fueron más reproducibles con el uso de macrosiembra . Para los complejos con cristales SLex, E-LE se transfirieron a una solución que contiene 100 mM de HEPES (pH 7.5), 200 mM CaCl2, 30% (peso / volumen) de PEG 4000, y 15 mM SLex por 15 horas a 25°C. Después de esta incubación inicial, los cristales se transfirieron en 100 mM de Tris-HCl (pH 7.4), 300 mM de NaCl, 2 mM de CaCl2, 30% (v/v) de PEG 4000, y 15 mM de SLex por una hora adicional antes del enfriado instantáneo como antes se describió. Los cristales E-LE / SLex al grupo espacial P2?2?2? con los parámetros de la célula a = 34.5 A, b = 72.4 A, y c = 77.6 Á. Los datos de difracción se procesaron como arriba. Los cristales grandes del complejo (SGP-3) del péptido P-LE / PSGL-1 19ek medidos hasta 0.5 x 0.5 x 0.3 mm se obtuvieron mediante repetir macrosembrado en las gotas de cristalización por difusión con vapor. Los cristales crecieron de 8 mg/ml P-LE, SGP-3 en un exceso molar de 2 veces, 10 mM de Tris-HCl, 100 mM de HEPES (pH 7.0), 150 mM de NaCl, 4 mM de CaCl2, 50 mM de SrCl2, 5% (peso / volumen) de PEG 6000, y 33% (v/v) de MPD. Se obtuvieron semillas de cristales pequeños tempranos de un amortiguador que contiene 50% de MPD pero no contiene SrCl2 o PEG 6000. Los cristales se transfirieron en lOOmM de HEPES con un pH 7.0, 10% de PEG 6000, 30% de MPD, lOOmM de NaCl, y 50 mM de SrCl2 por 15 horas antes del enfriamiento instantáneo. Se obtuvo un cristal derivado del mercurio añadiendo 0.5 mM de acetato de mercurio al amortiguador de impregnación final por 14 horas antes del enfriamiento instantáneo. Se encontró que el grupo espacial de los cristales del complejo era 1222 con los parámetros celulares de a = 63.4 Á, b = 96.8 Á, y c = 187.3 Á. Los cristales se presentaron en forma bipiramidal. Los datos de difracción originales se recolectaron en la estación X4A de Brookhaven National Labs usando RAXIS IV para registrar los datos de difracción. Los datos derivados del mercurio se recolectaron para uso interno. Todos los datos se redujeron como se describe arriba dando los estadísticos en la Tabla 1. Determinación y Refinamiento de la Estructura. Se encontró que los cristales de E-LE hechos complejos con SLex eran esencialmente isomorfos con aquellos reportados anteriormente (Graves, et al., 1994) con una sola copia de E-LE en la unidad asimétrica cristalográfica. Se usó el refinamiento del cuerpo rígido dentro del CNS (Brunger et al., 1998) para obtener fases iniciales que dieron una densidad del electrón clara para el SLex de enlace. Estos mapas además se mejoraron con el uso de BÚSTER (Bricogne, 1993) permitiendo que un modelo se enlace a SLex para ajustarse usando QUANTA (Molecular Simulations, Inc.). Todos los refinamientos adicionales se realizaron en CNS dando un modelo final con 86% de residuos en la región más favorecida de la gráfica de Ramachandran y que consiste de 1510 átomos totales, 186 moléculas de agua, un ion de calcio, y una copia de SLex. Se describen las estadísticas en la Tabla 1. La estructura de P-LE se resolvió con el reemplazo molecular usando el modelo publicado del constructo E- selectina lee/ EGF (código 1ESL de acceso PDB) . Se usó el programa AMORE (CCP4, 1994) para localizar todas las cuatro copias de P-LE. El modelo se construyó y se refino usando los métodos descritos arriba. Una copia de P-LE tiene una densidad del electrón inferior que las otras tres pero con el uso de la simetría no cristalográfica el refinamiento progresó de buena forma dando las estadísticas en la Tabla 1. En el termino del refinamiento la cuarta copia de P-LE tiene un factor-B promedio de 63.7 Á2 comparado con 44.2 Á para las otras tres copias. El modelo final consiste de cuatro copias de P-LE con el 81% de residuos en la mayoría de las regiones favorecidas de la gráfica de Ramachandran, 5418 átomos en total, 134 moléculas de agua, 2 moléculas de MPD y 4 iones de calcio. Los cristales de P-LE impregnados en SLex eran esencialmente isomorfos con la estructura P-LE arriba descrita. Después del refinamiento del cuerpo rígido en CNS la densidad era más clara para las tres molécula de SLex de enlace. El cuarto sitio de unión parcialmente se ocluyó mediante los contactos del cristal, de esta manera se explica la perdida de la resolución en la impregnación en SLex. Se usó QUANTA para modelar el SLex de enlace y para reparar los residuos de la proteína antes del refinamiento limitado en CNS. Esto da un modelo final con 71% de los residuos en las regiones más favorecidas de Ramachandran, 5455 átomos en total, 3 moléculas de SLex, 4 iones de calcio y 2 moléculas MPD. Todos los intentos para resolver la estructura de P-LE formando complejo con el péptido SGP-3 PSGL-1 19ek mediante el reemplazo molecular fallaron. Se localizó el sitio del átomo pesado con las técnicas Patterson refinadas en SHARP (de la Fourtelle and Bricogne, 1997). Estas fases dieron mapas pobres pero de calidad suficiente para permitir posicionar los dos dominios de la estructura P-LE y posicionar independientemente los dos dominios EGF. Estos mapas también indican la presencia de las moléculas de Slex de enlace en la misma posición como se encontró en el complejo P-LE / Slex y la densidad extra la cual podría no interpretarse. Se combinaron las fases del átomo pesado con las fases del modelo en BÚSTER dando mapas de entropía máxima claros que permiten el acoplado del polipéptido SGP-3 y las porciones de Slex en QUANTA. Se refino esta estructura como arriba se describe dando las estadísticas en la Tabla 1 y el 84% de los residuos en la mayoría de las regiones favorecidas de la gráfica de Ramachandran. El modelo final consiste de dos complejos de P-LE / SGP-3, 3263 átomos, 2 iones de estroncio, 224 molécula de agua, 2 iones de sodio, y 7 moléculas de MPD de enlace. 2. Resultados y Discusión Estructura Cristalina por rayos X de los Dominios de P-selectina lectina / EGF. Se generaron un constructo de la P-selectina que contiene los dominios de la lectina N-terminal y de EGF (denominado P-LE) . Mientras la estructura cristalina de E-selectina lee / EGF (Graves et al., 1994) indica que hay una interacción mínima entre los dominios de la lectina y EGF y el sitio que se une a Slex putativo se remueve bien de junción del dominio lectina- EGF, elegimos retener el dominio por los estudios que sugieren que este puede tener una papel funcional (Gibson et al., 1995; Kansas et al., 1994). Se fusionó el P-LE con la región Fc de IgGi vía la secuencia de incisión de la enterocinasa intermediaria. Este constructo, denominado P-LE.Fc, permite la fácil purificación del medio condicionado y la generación de los dominios de P-LE monoméricos permitiendo la digestión de la enterocinasa. El P-LE expresado en las células CHO contiene tres glicanos N-enlazados, que enzimáticamente se removieron antes de la cristalización. Se obtuvieron cristales de P-LE en el grupo espacial P2X, con 4 moléculas en la unidad asimétrica cristalográfica y se difractaron a una resolución de 2.4 A. Se resolvió la estructura mediante el reemplazo molecular usando las coordenadas estructurales del cristal de E-selectina lee / EGF como un modelo de búsqueda.

La estructura del cristal de P-LE adopta una conformación global esencialmente idéntica a la estructura de E-selectina lee / EGF. Esta es consistente con el 62% de la identidad de la secuencia entre las selectinas en estos dominios y resulta en una diferencia RMS de solo 0.7 A en sus cadena principal C. Los dominios de la lectina y EGF de P-LE interactúan vía una interferencia pequeña haciendo la similaridad con el constructo de E-selectina incluso más notable dado que esta relación también se mantiene. El movimiento de diferentes bucles en el dominio EGF junto con un pequeño movimiento del ángulo inter-dominio es responsable de muchas diferencias menores entre las dos estructuras. El ángulo de inter-dominio también varia ligeramente entre las diferentes copias de P-LE en el cristal y por lo tanto ese probablemente un efecto de las fuerzas de empaque del cristal.

El sitio que se une a Slex putativo, sugerido por al mutagénesis y los estudios de la estructura (Kansas, 1996), remarcadamente se conserva entre P-LE y la estructura de E-selectina / EGF. La característica común de este sitio, y probablemente la base de la dependencia del metal de la función de la selectina, es una ion de calcio coordinado con las cadenas laterales o secundarias de Glu8-80, Asn-82, Asn- 105, y Asp-106 y el carbonilo de la cadena principal de Asp- 106. Dos moléculas de agua también ligan el calcio P-LE, uno de los cuales se estabiliza mediante la cadena lateral o secundaria de Asn-83. La similaridad de los sitios que se unen es incluso más notable considerando que las ocho moléculas de agua de enlace en esta área de P-LE también se presentan (dentro de 0.8 Á) en la estructura de E-selectina lee / EGF (no mostrado) . Los sitios de unión sin embargo tienen diferencias en un área ampliamente definida por el cambio de Arg-97 en la E-selectina a Ser-97 en P-selectina. En la estructura de E-selectina lee / EGF, el Arg-97 se apila sobre Tyr-94 por lo cual presenta una superficie positivamente cargada en este región mientras en P-LE Tyr-94 no se obstruye por el residuo Ser-97 más pequeño y por lo cual tiene el potencial para mediar las interacciones hidrofóbicas. El Arg-97 en el constructo E-selectina lee / EGF hace un enlace con el hidrógeno con Asp-lOO, que es una residuo de la alanina en P-LE. Adyacente a esta región esta Lys-99 que, dentro de los puntos E-selectina lee / EGF, mantiene fuera el sitio de unión. El residuo equivalente en P-LE es un residuo de serina que enfrenta al sitio de unión. Las Estructuras Cristalina de los Dominios P- y E-selectina Lee / EGF hechos complejos con Slex. Pretendimos obtener la estructura cristalina de P-LE hecho complejo con Slex, que anticipamos podría obtenerse mediante el Slex de impregnación en los cristales de P-LE pre-formados. También deseamos entender las bases estructurales para la afinidad de unión de Slex 10 veces mayor descrita por la E-selectina relativa a la P-selectina (Poppe et al., 1997), que inesperadamente da la similaridad de ambos sitios que se unen a Slex putativos. Por lo tanto, producimos un constructo de E-selectina lectina / EGF (E-LE) que se expresó, purificó y se le aplicó la desglucosilación como a P-LE, E-LE, cristalizadas bajo condiciones similares a aquellas empleadas tempranamente para E-selectina lee / EGF (Graves et al., 1994) con una copia de E-LE en la unidad asimétrica cristalográfica. Los cristales de P-LE se impregnaron en una solución estabilizadora que contiene 8 mM de SLex y los datos cristalográficos se recolectaron ampliados a 3.4 A (Tabla 1). Ls estructura cristalina de P-LE / SLex tiene cuatro copias de P-LE en la unidad asimétrica, con un sitio que se une a SLex parcialmente ocluido mediante los contactos del cristal. Probablemente este contacto de cristal causa tal perdida dramática en la calidad de la difracción luego de la impregnación. A pesar de la baja resolución de los datos, la densidad de electrón clara podría extenderse lejos del calcio de enlace en tres copias de P-LE. Se usaron estos mapas para construir la estructura del complejo del enlace de Slex al P-LE aunque estos resultados se refinaron más tarde después de obtener un complejo de Slex de alta resolución con E-LE.

Fracasaron los intentos iniciales por impregnar Slex dentro de los cristales de E-LE en concentraciones de Slex de hasta 20 mM. Subsecuentemente determinamos que la alta concentración de calcio usado para la cristalización inhibe la E-selectina en los ensayos de unión de Slex (no mostrado) . Por lo tanto, se dedujo un protocolo de impregnación en donde se redujo la concentración de calcio a un nivel que facilite la unión de Slex y aún mantenga la difracción de alta resolución. Estas condiciones resultan en cristales que dan datos de difracción de resolución de 1.5 A y una densidad de electrón clara para el Slex de enlace (Tabla 1) . La estructura del complejo P-LE / Slex revela que las interacciones son de naturaleza casi electrostática completamente y el área de superficie total enterrada es pequeña (549 A2) cuando se compara con el tamaño de Slex. Dado que el complejo con P-LE es de baja resolución una descripción más detallada de las interacciones conservadas será descrita abajo para el complejo E-LE / Slex. Las interacciones de los hidroxilos Fue proveerán una gran cantidad de energía de unión. Los grupos 3- y 4-hidroxilo no solo coordinan el calcio de enlace sino también forman enlaces de hidrógeno con residuos que se coordinan por si mismos al calcio. Además, Glu-107 está solo 3.4 Á fuera del grupo 2-hidroxilo y puede formar un enlace débil de hidrógeno. El residuo de hidrógeno Slex Gal se enlaza con los residuos de la proteína usando el grupo 4-hidroxilo (con el grupo hidroxilo de Tyr-94) y el grupo 6-hidroxilo (con el grupo carboxilato de Glu-92). El residuo NeuNAc interactúa en la región donde las dos selectinas son muy diferentes, el sitio de Arg-99 (E-selectina) versus Ser-99 (P-selectina) . En P-LE, los grupos hidroxilos de Tyr-48 y Ser-99 forman enlaces de hidrógeno con la porción del carboxilato y el grupo 4-hidroxilo, respectivamente, de NeuNAc. Finalmente, parece que el C-4 del anillo de NeuNAc se empaca contra Pro-98. El posicionamiento de NeuNAc haría contactos desfavorables con Arg-99 en E-LE y así moverse hacia atrás (Figura 2A) para permitir mejores interacciones. El resto de Slex es esencialmente imposible entre E-LE y P-LE. La estructura de E-LE formando complejo con Slex confirma las interacciones vistas en la estructura de baja resolución de P-LE con diferentes contactos con el NeuNAc como un resultado de la diferencia de Ser-97 :Arg-97 (P-selectina : E-selectina) . Los grupos 3- y 4-hidroxilo Fue coordinan el calcio de enlace y forma una red compleja de enlaces de hidrógeno con residuos que también coordinan el calcio. El grupo 4-hidroxilo Fue reemplaza exactamente una molécula de agua ligada al calcio observada en la estructura no ligada, acepta un enlace con el hidrógeno a partir de Asn-82 y dona un enlace de hidrógeno a Glu-80. El grupo 3-hidroxilo Fue desplaza otra molécula de agua coordinada al calcio aunque su posición final es ahora más cercana un Á al Asn-105. Luego del enlace de Slex el ASN-83 gira su ángulo de torsión 2 a 59° de manera que pueda donar un enlace de hidrógeno a una molécula de agua de enlace que a su vez enlaza al hidrógeno a tanto el grupo 2-hidroxilo como a la cadena lateral o secundaria de Glu-107 (no mostrado) . Esta rotación también permitir a la cadena lateral o secundaria de Asn-83 coordinar el calcio. El reemplazo de Ser-97 en P-LE con el Arg-97 en E-LE permite la formación de un conjunto diferente de interacciones con NeuNAc y causa un movimiento del azúcar lejos de la cadena lateral o secundaria para aligerar los contactos cercanos que ocurrirían. El Arg-97 dona el hidrógeno que se enlaza al oxigeno glucosídico y al grupo carboxilato de NeuNAc. En un arreglo similar al P-LE, el grupo de carboxilato también acepta un enlace de hidrógeno de Tyr-48. Los contactos de la proteína observados de Slex al P-LE y E-LE son un acuerdo excelente con los estudios de mutagénesis dirigidos al sitio enfocados en los residuos de definición importantes para el reconocimiento de P- y E-selectina (Erbe et al., 1993; Erbe et al., 1992; Graves et al., 1994; Hollenbaugh et al., 1993; Ng y Weis, 1997). Muchas de estas mutaciones (por ejemplo, las substituciones de Tyr-48 y Tyr-94 en E- y P-selectina, y Arg-97 en E-selectina) pueden ahora interpretarse para directamente afectar las interacciones de enlace de hidrógeno con Slex. Otras mutaciones probablemente desestabilicen la función indirectamente alterando la orientación de los residuos de interacción. Es esta la explicación más reciente la cual probablemente explica la disrupción de la función asociada con las mutaciones de una elasticidad triple de Lys (residuos 111-113) encontrada en tanto E- y P-selectina. En las estructuras de P-LE y E-LE formando complejos con Slex, el Lys-113 no participa directamente en la unión. Sin embargo, estos residuos enlazan al hidrógeno (vía el grupo de amino de cadena lateral o secundaria) a la porción del carboxilato de Glu-92 que también enlaza al hidrógeno al grupo 6-hidroxilo del residuo Gal dentro de Slex. Así pues, algunas mutaciones en esta región de las selectinas pueden desestabilizar la unión de Slex por un mecanismo indirecto. Comparar las estructuras de E- y P-LE / Slex con las estructuras de los complejos de lectina / glicano relacionados revela importantes similaridades y diferencia. La examinación de la estructura cristalina de MBP-A enlazada a la oligomanosa (Weis et al., 1992) indica un arreglo similar de las interacciones de unión de calcio también involucran los grupos 3- y 4-hidroxilo del residuo de mañosa ligante. Sin embargo, el anillo de Fue en las estructuras P-LE / Slex se "levanta" con relación a la mañosa en el complejo MBP-A / oligomanosa. Esto resulta en el intercambio de las posiciones del anillo a fin de que los grupos 3- y 4-hidroxilo Fue de los complejos de selectina LE / Slex ocupen las posiciones del grupos 4- y 3-hidroxilo, respectivamente, de mañosa en el complejo MBP-A / oligomanosa. Aún cuando se usen diferentes grupos de hidroxilo y su relación con el anillo de azúcar difiere (ecuatorial-ecuatorial para los grupos 3- y 4-hidroxilo de la mañosa, respectivamente, versus ecuatorial-axial en Fue) , se mantienen los vectores a lo largo de los carbones del anillos de azúcar en los grupos de hidroxilo. Este posicionamiento preciso de los grupos hidroxilo parecen ser esenciales para la ligación simultanea de las interacciones del ion de calcio y del enlace de hidrógeno con la proteína. La estructura cristalina del mutante K3 de MBP-A en la cual los tres residuos de la selectina se han introducido (Ng and Weis, 1997) se une a Slex significantemente diferentemente a los que observamos aquí para los complejos selectina LE / Slex. Mientras esta estructura y las estructuras aquí presentadas muestran la ligación Fue al calcio de enlace, están involucrados diferentes grupos de hidroxilo. En el complejo mutante K3 / Slex, los grupos 2- y 3-hidroxilo Fue ligan al calcio y ocupan las posiciones del grupo 2- y 3-hidroxilo Fue, respectivamente, encontrados en los complejos selectina LE / Slex. Esto resulta en una rotación de 90° de la orientación Slex dentro de la cavidad de unión relativo a los complejos selectina LE / Slex y ofrece una interacción de enlace de hidrógeno entre el grupo Gal 4-hidroxilo y la cadena lateral o secundaria de Lys-111, que no observamos. Esto resalta la importación de Glu-92, Tyr-94, y Tyr-48 (y Arg-97 en la E-selectina) para la unión del ligando en los complejos E- y P-LE / Slex. Finalmente, los modelos de Slex en forma molecular caen dentro de la estructura cristalina de E-selectina lee / EGF (Graves et al., 1994; Kogan et al., 1995; Poppe et al., 1997) comparando favorablemente nuestros resultados en términos de la orientación general de Slex en la superficie de unión. Sin embargo todos en desacuerdo en variar los grados con las estructuras aquí mostradas con respecto a la identidad de los contactos moleculares. Con la suposición subyacente de que la ligación de Slex al calcio de enlace imita lo observado en el complejo MBP-A / oligomanosa y en el complejo mutante MBP-A K3 / Slex, todos lo modelos proponen que los grupos 2- y 3-hidroxilo Fue ligan el calcio de enlace. Esto está en contraste profundo con nuestras observaciones de los dos complejos de selectina LE / Slex separados en los cuales la ligación de Fue está mediada vía los grupos 3- y 4-hidroxilo. Otros contactos propuestos por la interacción de E-selectina / Slex son consistentes o inconsistentes con nuestros resultados variando los grados. El diseño de los miméticos de Slex pretendidos para los propósitos terapéuticos en base de estas consideraciones estructurales incorrectas pueden últimamente limitar el éxito de estos esfuerzos. Generación de un Péptido PSGL-1 Funcional para Cristalografía con Rayos X. Nuestro próximo intento por obtener una estructura cristalina de P-LE que forma complejo con PSGL-1 para elucidar o clarifica la base estructural del reconocimiento, pero se anticipa que las formas extracelulares fisiológicas o grandes de PSGL-1 podrían proveer también heterogéneos para los intentos de co-cristalización. Los estudios de mutagénesis y bioquímicos indican que la P-selectina, en contraste con la E-selectina, reconoce tanto los residuos de polipéptido como un O-glicano modificado por Slex dentro del N-término de PSGL-1 maduro. Los candidatos el determinante de PSGL-1 incluyen una porción de alargamiento aniónico de los amino ácidos que abarca (numerados desde el N-término del polipéptido maduro) Tyr-5, Tyr-7, y Tyr-10, uno o más de los cuales está sulfatado, y un O-glicano sialilado, fucosilado (presumiblemente similar al Slex) localizado en Thr-16 mediante métodos indirectos (Pouyani et al., 1995; Ramachandran et al., 1999; Sako et al., 1995; Wilkins et al., 1995) . La sulfatación por cualquiera de los tres residuos Tyr es capaz de soportar la unión de la P-selectina, sin embargo, el papel relativo de los sulfatos de la tirosina individuales se ha inferido por los estudios de enrollamiento (Ramachandran et al., 1999) y no por las determinaciones rigurosas de afinidad. Para explorar estas cuestiones estructurales y para producir una forma de PSGL-1 homogéneamente modificada adecuada para la cristalización con P-LE, expresamos un forma truncada de PSGL-1 en la línea de célula CHO previamente transfectada con fucosiltransferasa-VII y núcleo2 N-acetilglucosamina, enzimas de modificación esenciales para la generación de la PSGL-1 funcional en las células CHO (Kumar et al., 1996; Li et al., 1996). Utilizamos un constructo soluble de PSGL-1 (19ek.Fc, (Gotees et al., 1997)) que codifica los amino ácidos N-terminal de PSGL-1 fusionado al dominio de la cadena pesada de IgGi (19. Fc, (Sako et al., 1995)) en el cual introducimos una secuencia de escisión de enterocinasa que podría permitir o facilitar el aislamiento de los péptidos PSGL-1 monoméricos enseguida de la expresión y purificación. El 19.ek.Fuc revestido con micro-esferas de látex previamente demostró soportar el enrollamiento sobre las células CHO que expresan la P- y E-selectina (Gotees et al., 1997). El 19.ek.Fc se digirió con la enterocinasa con el objetivo de producir los péptidos de PSGL-1 monoméricos (denominados péptidos 19ek) . El análisis preliminar mediante MS sugirió que los péptidos 19. ek eran estructuralmente heterogéneos (no mostrados). Por lo tanto, la resolución de la mezcla se realizó mediante la HPLC de intercambio de aniones que separó la mezcla del péptido 19. ek en componentes homogéneos dominados por una especie principal que se extrae con solventes más tarde en el gradiente de sal (Figura 1) . La estructura del péptido 19. ek principal se determinó que era el sulfoglucopéptido (denominado SGP-3) como se muestra en la Figura ÍA. La porción de PSGL-1 de SGP-3 extensivamente, en forma de post-transducción se modifica e incluye los sulfatos en las tres posiciones de los residuos de la tirosina y un 0-glicano modificado por núcleo2 que contiene Slex en Thr-16 (Figura 1A, inset) . Importantemente, el glicano es idéntico a uno de los dos 0-glicanos que contienen Slex caracterizados por el PSGL-1 aislado de la línea celular mieloide o de la espina dorsal HL-60 (Wilkins et al., 1996). La especie menor de los péptidos 19. ek (Figura ÍA) son versiones menos modificadas de SGP-3. Se determinaron las estructuras de los péptidos 19. ek, PSG-1 y SGP-2 (Figura ÍA) que eran de formas de SGP-3 que contienen uno o dos sulfatos de tirosina, respectivamente. Los análisis preliminares por MS indican que toda permutación de la sulfatación de tirosina se presenta dentro de las especies hiposulfatadas pero estas no se cuantificaron. También están presentes dentro de la fuente del péptido 19. ek y se resuelven por cromatografía (Figura 1) las formas de SGP-3 que no contienen sulfatos de tirosina (glucopéptido-1, GP-1) o que no contienen carbohidrato (sulfopéptido-1, SP-1) . Se usó la resonancia plasmon en la superficie para determinar las afinidades de unión de P-LE para los péptidos 19ek individuales con el objetivo de seleccionar las especies funcionales principales para los intentos de cocristalización. Para la comparación, se evaluó una forma recombinante, soluble de PSGL-1 (PSGLs) que consiste del dominio extracelular, dimérico completo. Consistente con los estudios más recientes, P-LE se unieron a los PSGLs y los péptidos 19ek inmovilizados con cinéticas rápidas (Figura IB). La unión se determinó que era especifica basada en los experimentos de control realizados con EDTA y neutralizar los Mabs (no mostrado) y con el SGP-3 usado como un inhibidor soluble (Figura IB) . La interacción de afinidad más alta observada para los péptidos 19ek individuales era con las especies de SGP-3 totalmente modificadas con KD de 778 nM. Una afinidad esencialmente idéntica se obtuvo con PSGLs (Figura 1C) que sugiere que el péptido 19ek SGP-3 funcionalmente imita el constructo PSGL-1 extracelular de longitud completa y que la región N-terminal de PSGL-1 presente en el constructo más corto constituye la región de reconocimiento entera para P-LE. Las afinidades de unión de P-LE para las formas hiposulfatadas de SGP-3 eran ligeramente débiles (Figura 1C) exhibiendo un KD de 2.88 µM para las especies disulfatadas (SGP-2) y de 12.3 µM para las especies monosufatadas (SPG-1) . Las afinidades de unión de P-LE de versiones de SGP-3 que no contienen carbohidrato (SP-1) o sulfotirosinas (GP-1) eran aún débiles y se estimaron en 113 µM y 31.1 µM, respectivamente (Figura 1C) . La afinidad de P-LE para la versión sintética del péptido 19ek que no contienen carbohidrato o sulfación era considerablemente más baja que cualquiera de las especies modificadas y podría no determinarse en las concentraciones de la proteína aquí empleada. La afinidad de unión de P-LE de unirse a PSGLs y a SGP-3 aquí determinada compara razonablemente bien los valores previamente determinados para la unión de la P-selectina y un constructo de lectina-EGF solubles de la P-selectina similar a P-LE, a un PSGL-1 neutrifílico de longitud completa (KD de 322 nM y 422 nM, respectivamente) (Metha et al., 1998). Adicionalmente, la afinidad de unión de la P-selectina soluble con un glucosulfopéptido PSGL-1 modificado similarmente a SGP-3 recientemente se reportó que tiene unn KD de ~350 nM (Leppanen et al. , 1999) .

Estructura Cristalina con Rayos X de P-LE unido al Sulfoglucopéptido-3 PSGL-1. El P-LE se co-cristalizó con un exceso molar de dos veces de SGP-3. Se requirió repetir el macro-sembrado y el reemplazo de calcio con estroncio para dar grandes cristales del grupo espacial 1222 que se difractaron a 1.9 Á. Las fases se generaron usando los datos del mercurio para uso interno, revelando dos complejos de P-LE / SGP-3 en la unidad asimétrica cristalográfica. Se refino la estructura usando CNS con un factor de 20.4% (R libre, 23.5%) (Tabla 1). De los 29 amino ácidos dentro del polipéptido SGP-3, se observaron de seis residuos a 18, incluyendo el Tyr-7 sulfatado (Tys-7) y Tyr-10 sulfatado (Tys-10). Desordenados y ausentes de la estructura están los residuos del polipéptido de uno a cinco, que contienen la mayoría de las tirosinas sulfatadas N-terminales (Tys-5), y 19-29 residuos que contienen la región de conectador o enlazador de la enterocinasa. Todos menos un residuo se observó de O-glicano modificado por Slex en Thr-16. No se determinó la densidad del electrón para el NeuNAc (2, 3) ligado a la ramificación de Gal (1, 3) GalNAc (Figura ÍA, insertar) pero este residuo no parece requerirse para la unión (Leppanen et al., 1999). Dos vistas diferentes del complejo P-LE / SGP-3 provee una visión general estructural de la interacción de unión de la cual aspectos de la interacción fisiológica de P-selectina / PSGL-1 pueden inferirse. El SGP-3 se une con una estequiometría de 1:1 con el dominio de la P-LE lectina con una gran epítope que excluye 1641 Á del solvente e incluye el sitio que se une a SLex descrito por el complejo P-LE / SLex. A pesar del hecho que el SGP-3 está en desorden en la solución cuando se determinó por los estudios de transferencia NOE (D. Tsao, observaciones no publicadas) y probablemente extendida, se compactó la conformación de la unión mediante el plegado que produce una estructura similar a una horquilla. Mientras estos resultados no excluyen la posibilidad de que cada uno de los diferentes brazos de homodímero de PSGL-1, suministren un componente diferente de la interacción de unión, simultáneamente deben enlazarse a un solo dominio de la P-selectina lectina, estos sugieren que un solo brazo de PSGL-1 es capaz de proveer una conjunto completo de determinantes de unión. Además este tipo de interacción de unión permite la posibilidad de que los monómeros individuales del homodímero de PSGL-1 deban simultáneamente enlazar dos moléculas diferentes de P-selectina. La co-localización de las dos interacciones de unión paralelas puede ser un requerimiento fisiológico para la función de la P-selectina a la vista de la observación que un mutante de dimerización de PSGL-1 es incapaz de soportar la unión de la célula bajo la influencia del corte (Snapp et al., 1998). También inmediatamente es apreciable a partir del examinen del complejo P-LE / SLex que la unión de SGP-3 ocurre en una cara de P-LE esencialmente opuesta a la interfaz del dominio de la lectina : dominio de EGF. Esto provee evidencia directa que el dominio de EGF de la P-selectina no participa en la unión directa de PSGL-1, al menos con la porción N-terminal de la molécula, pero puede tener un papel indirecto en la función de la P-selectina (ver abaj o) . A pesar del hecho que el calcio se reemplazó por el estroncio, las interacciones vistas en el complejo de P-LE con SLex se reproducen en la estructura P-LE / SLex y son consistentes con una observación reciente, de tal manera que este metal puede efectivamente substituirse por el calcio (Asa et al., 1992). En el complejo hay un gran re-arreglo estructural de P-LE, que causa un cambio en la coordinación del ion metálico. En el complejo P-LE / SLex, el 2-hidroxilo de Fue hace un hidrógeno débil que se une con Glu-107 (distancia de 3.4 A) . Este no está presente en el complejo P-LE / SGP-3 pero se reemplaza con un hidrógeno que se une con Glu-88 que por si mismo también coordina el estroncio de enlace. En la estructura de P-LE, la cadena lateral o secundaria de Asn-83 está cerca pero no coordina el calcio de enlace y en la unión de E-LE, de la unión de SLex de SLex causa que ésta interactúe con el ion metalizo y el hidroxilo Fue. En el complejo P-LE / SGP-3, la posición de este residuo se ha reemplazado con la cadena lateral o secundaria de Glu-88. En este aspecto, la ligación metálica fielmente imita el MBP que forma complejo con la oligomanosa (Weis et al., 1992) y el mutante K3 de MBp que hace complejo con SLex (Ng and Weis, 1997) en el cual se observó el residuo Glu-193 correspondiente para ligar el calcio. Las interacciones entre el polipéptido SGP-3 y el P-LE son una combinación de los contactos hidrofobicos y electrostáticos. La mayoría del residuo N-terminal del péptido SGP-3 en contacto con la proteína es Tys-7 seguido de tres residuos en una conformación extendida. Los residuos Tys-10 a Leu-13 forman una tendencia, que cambia la dirección del polipéptido y los residuos remanentes hasta alcanzar el Pro-18 en una conformación extendida. El sulfato de Tys-7 hace una serie de enlaces de hidrógeno con los grupos de hidroxilo de cadena lateral o secundaria de Ser-46 y Ser-47, un nitrógeno de la cadena principal y vía una molécula de agua ordenada. Además, el His-114 de P-LE dona un hidrógeno que se une al oxígeno del sulfato remanente que completa la red de uniones de hidrógeno. El Tys-7 también hace un enlace de hidrógeno de la cadena principal con el nitrógeno de la amida de Lys-112 y las diferentes interacciones hidrofóbicas con las cadenas laterales o secundarias de Ser-47 y Lys-113. El residuo Leu-8 de SGP-3 empaca contra el Leu-13 que son ambos empacados en la superficie hidrofóbica de la proteína formada por las cadenas laterales o secundarias de His-108 y Lys-111. Estas interacciones deben ayudar a estabilizar la estructura terciaria compacta del péptido. Este anillo aromático de la cadena lateral o secundaria de Tys-10 yace en estos dos residuos de la leucina y coloca el sulfato en una posición donde este puede enlazar al hidrógeno con el Arg-85 y la amida de la cadena principal de Thr-16. Las interacciones entre Arg-85 y el polipéptido SGP-3 son posibles por un gran re-arreglo estructural de P-LE (ver abajo) y soporta los descubrimiento de un estudio de la mutagénesis dirigida al sitio anterior que se enfoca a este residuo dentro de la P-selectina (Bajorath et al., 1994). Cuando muta a Ala, el mutante de la P-selectina pierde la unión de alta afinidad a PSGL-1 que expresan las células que aún retienen la unión de baja afinidad (probablemente exclusivamente mediada por SLex) . Similarmente, un anticuerpo cuyo epítope se ha mapeado o correlacionado a los 76-83 residuos cercanos se han mostrado que eliminan la unión al PSGL-1 pero no a SLex (Hirose et al., 1998). En este complejo P-LE / SLex, la cadena lateral o secundaria de Phe-12 en SGP-3 no hace contacto con la proteína pero se empaca a sí misma en la otra copia del complejo relacionado por la simetría no-cristalográfica. Parece que probablemente en la solución ésta podría yacer en la superficie hidrofóbica por Leu-110 de cadena lateral o secundaria. Las interacciones restantes solo se han visto con Pro-14 de SGP-3, que se empaca contra el His-18 y acepta un enlace de hidrógeno de Arg-85. Comparado con tanto el P-LE no ligado como con el complejo P-LE / SLex, hay diferentes cambios dramáticos con la conformación de P-LE asociado con la unión de SGP-3. El cambio conformacional más significante es el movimiento de un bucle de residuos desde Asn-89 a Asp-89 que lleva a Arg-85 a hacer contacto con Tys-10 de SGP-3 y Glu-88 a una posición donde éste ahora liga el metal de enlace. Este movimiento a su vez parece afectar la posición de los residuos Arg-54 a Glu-74, que se mueven para afectar el espacio vacante por al bucle de Asn-83 a Asp-89. En el P-LE no que forma complejo, el Thr-65 se empaca contra la cadena lateral o secundaria de Trp-1 excluyendo a éste del solvente. debería esperarse que el movimiento de los bucles observado por el complejo P-LE / SGP-3 exponga el Trp-1 al solvente pero este residuo se rearregla para empacarse entre Tyr-118 del dominio de la lectina y el Glu-135 del dominio EGF. En conjunción con el movimiento de Trp-1 hay un movimiento de 52 grados del dominio de EGF relativo al dominio de la lectina y el vacío creado por el movimiento de la cadena lateral o secundaria del Trp-1 se llena por una molécula de MPD que se empaca contra la nueva posición de la cadena lateral o secundaria. Esto aumenta la pregunta que sí el movimiento del dominio de EGF es causado por la alta concentración de MPD usado para la cristalización o debido a la unión de SGP-3. Mientras el dominio de EGF no parece jugar un papel directo en la unión a PSGL-1, al menos en la región N-terminal de la molécula, el cambio en su relación con el dominio de la lectina es una interesante observación a la luz de las observaciones en que el dominio de EGF puede modular el reconocimiento del ligando (Gibson et al., 1995; Kansas et al., 1994). Alternativamente, estos estudios pueden indicar las interacciones de unión secundarias entre los dominios de EGF y CR y otras regiones del C-terminal del PSGL-1 al sitio de unión aquí evaluado. Estudios estructurales adicionales se garantizan para a su vez explorar la interacción potencial entre los dominios de la lectina y de EGF. El plegado interno del polipéptido SGP-3 que resulta en la colocación de Tys-10 cerca al O-glicano en Thr-16 sugiere que la relación de glicano modificado con SLex con los sulfatos de la tirosina dentro de la secuencia lineal de PSGL-1 puede no ser absoluta por arriba de un número mínimo de residuos intermediarios. La P-selectina puede soportar las conformaciones de unión múltiple del N-terminal de PSGL-1, solo uno de los cuales se muestra en este estudio. La estructura de P-LE / SGP-3 sugiere que Tys-7 y Tys-10 (y no Tys-5) de PSGL-1 son esenciales para la unión, un resultado consistente con un estudio de la mutagénesis que indica un papel preferencial para estos residuos de sulfato de la tirosina específicos en el enrollamiento mediado por la P-selectina. Sin embargo, la flexibilidad de N-terminal de PSGL-1 deberá permitir diferentes permutaciones de los sulfatos de tirosina, por ejemplo, Tys-5 y Tys-7 o Tys-5 y Tys-10, para unirse en un registro diferente a los residuos básicos dentro de la P-selectina. Esta hipótesis puede explicar porque la afinidad de P-LE para el SGP-3 trisulfatado es mayor que la SGP-2 disulfatado. Mientras es posible que aún tercer sitio de unión del sulfato de la tirosina no definido exista dentro de la P-selectina que explique esta observación. La flexibilidad del polipéptido de PSGL-1 puede permitir que cualquiera de los tres residuos del sulfato de tirosina se unan a los dos sitios aquí definidos. Esto puede explicar porqué las mutaciones de PSGL-1 que contienen solo residuos del sulfato de tirosina (incluyendo Tys-5) soportan la unión de la P-selectina (Ramachandran et al., 1999). También soporta esta flexibilidad potencial en la unión es la observación que la región N-terminal correspondiente de la PSGL-1 murina también es crucial para unirse a la P-selectina y aún contiene dos sulfatos de tirosina potenciales, solo dos y cuatro residuos removidos de un sitio de glucosilación potencial correspondiente a Thr-16. La P-selectina murina también contiene los residuos básicos en las posiciones 85 y 114, y en base a las observaciones para la interacción P-LE / SGP-3 humana, podría anticiparse para hacer interacciones iónicas similares con los sulfatos de tirosina dentro de PSGL-1 murina. Una consecuencia de esta interacción sería que pocos residuos intermediarios abarquen el sulfato de tirosina y los sitios que se unen a SLex. Similarmente, la flexibilidad de la región N-terminal de PSGL-1 podría también permitir el reconocimiento de otras estructuras del O-glicano adheridas a Thr-16. Se han descrito los epítopes de SLex y Lex dentro de un O-glicano de poli-N-acetillactosamina mayor para la PSGL-1 y P-selectina mieloides o de la espina dorsal que pueden acomodar esto de manera similar. Comentarios finales. Las estructuras cristalinas de P-LE y E-LE que forman complejo con SLex y del P-LE que forma complejo con el sulfoglucopéptido de PSGL-1 aquí mostradas contribuyen significativamente a nuestra comprensión de la base molecular del reconocimiento de la selectina. Las estructuras de P-LE y E-LE que forman complejo con SLex exhiben tanto interacciones comunes como diferentes, que explican su afinidad diferencial para este ligando compartido. La estructura del complejo P-LE / SGP-3 en particular ilustra como el reconocimiento diferencial de PSGL-1 por la E- y P-selectina se logró. Mientras que las secuencias primarias de los dominios de E- y P-selectina lectina son más del 50% idénticas, los residuos cruciales para la interacción P-LE / SGP-3 son únicos para la P-selectina y probablemente cuentan para la afinidad mayor de la interacción de la P-selectina / PSGL-1. Los residuos Arg-85 y His-114, importantes para las interacciones iónicas con los residuos del sulfato de tirosina dentro de SGP-3, son únicos para la P-selectina (los residuos correspondientes en la E-selectina humana no están cargados en Gln y Leu, respectivamente) . Interesantemente, se observó la tendencia en la carga diferencial en estas posiciones para la P-selectina y E-selectina en el ratón, rata, conejo y vaca que sugiere que una secuencia molecular recurrente de unión se conserva para las interacciones de la P-selectina con PSGL-1. Las observaciones estructurales aquí hechas también ofrecen entendimientos potenciales en la naturaleza de la interacción L-selectina / PSGL-1. También la L-selectina parece reconocer la región N-terminal de PSGL-1 basados en los estudios de neutralización Mab (Kansas, 1996) y de mutagénesis (Ramachandran et al., 1999). Mientras la afinidad de esta interacción aún no se ha determinado, se anticipa que ésta deberá ser de afinidad intermedia relativa a las interacciones de la P-selectina y E-selectina con PSGL-1. Esto predice la suposición de que el dominio de la L-selectina lectina altamente homologo adopta una conformación similar a la determinada para E- y P-selectina y que el reconocimiento del N terminal de PSGL-1 comparte propiedades con aquellas de la P-selectina. Al igual que la P-selectina, la L-selectina humana contiene un residuo básico en la posición 85 (un residuo Lys) que se anticipará para hacer una interacción iónica esencial con el Tyr sulfatado dentro del N-término de PSGL-1. Sin embargo, la L-selectina no contiene una residuo básico en la posición 114, que podría soportar una segunda interacción iónica con un sulfato de tirosina dentro de PSGL-1 y por consiguiente la afinidad de unión quizás comparable con la P-selectina. Las interacciones de la E- y P-selectina con SLex y el sulfoglucopéptido de PSGL-1 aquí mostrado, principalmente basado en una red de enlaces de hidrógeno y las interacciones iónicas seleccionadas, son fundamentales para las afinidades de unión y las cinéticas de unión rápida descritas para esta clase de moléculas de adhesión molecular. La reversibilidad rápida de las interacciones relativamente de bajas de afinidad de la selectina / contrarreceptor, produce una adhesión y un enrollamiento de los leucocitos, esencial para su activación subsecuente, la adhesión con firmeza y la extravasación dentro de los tejidos. En el contexto de la inflamación, el PSGL-1 parece jugar un papel central en los procesos mediados por la selectina, que median la adherencia inicial de los neutrófilos al endotelio vascular así como también en promover las interacciones neutrófilo-neutrófilo y neutrófilo-plaqueta probablemente importantes para la amplificación de la respuesta inflamatoria. El diseño racional de los antagonistas de moléculas pequeñas para el tratamiento de las condiciones inflamatorias en que las interacciones E- y P-selectina / SLex y P-selectina / PSGL-1 se demuestran deberán asistirse considerablemente por la información estructural aquí presentada . ro ro cn o Tabla 1. Recolección de Datos, planificación de Etapas y Estadísticos de Refinamiento 00 00 Tabla 1. Recolección de Datos, planificación de Etapas y Estadísticos de Refinamiento 00 TABLA 2 Contactos a 4Á de E-selectina SLex TYR48, GLU80, ASN82, ASN83, GLU92, TYR94, ARG97, GLU98, ASN105, ASP106, GLU107, el Calcio de Enlace. Contactos a 8Á de E-selectina SLex TYR44, SER45, PR046, SER47, TYR48, ALA77, PR078, GLY79, GLU80, PR081, ASN82, ASN83, GLU88, CYS90, GLU92, TYR94, ARG97, GLU98, LYS99, ASPlOO. TRP104, ASN105, ASP106, GLU107, ARG108, LYS111, LYS113, el Calcio de Enlace. Contactos a 4Á de P-selectina SLex TYR48, GLU80, ASN82, GLU92, TYR94, PR098, SER99, ASN105, ASP106, GLU107, el Calcio de Enlace. Contactos a 8Á de P-selectina SLex TYR44, SER46, SER47, TYR48, ALA77, ASP78, ASN79, GLU80, PR081, ASN82, ASN83, ARG85, GLU88, CYS90, GLU92, ILE93, TYR94, LYS96, SER97, PR098, SER99, ALA100, TRP104, ASN105, ASP106, GLU107, HIS108, LYS11, LYS113, el Calcio de Enlace.

Contactos a 4Á de P-selectina PSGL-1 ALA9, TYR45, SER46, SER47, TYR48, GLU80, ASN82, LYS84, ARG85, GLU88, GLU92, TYR94, PR098, SER99, ASN105, ASP106, GLU107, HIS108, LEUllO, LYS111, LYS112, LYS113, HIS114 y el Estroncio de Enlace. Contactos a 8Á de P-selectina PSGL-1 SER6, THR7, LYS8, ALA9, TYR10, SER11, TYR44, TYR45, SER46, SER47, TYR48, TYR49, TRP50, ALA77, ASP778, ASN79, GLU80, PR081, ASN82, ASN83, LYS84, ARG85, ASN86, ASN87, GLU88, CYS90, GLU92, ILE93, TYR94, ILE95, LYS96, SER97, PR098, SER99, ALAIOO, TRP104, ASN105, ASP106, GLU107, HIS108, CYS109, LEUllO, LYS11, LYS112, LYS113, HIS114, el Estroncio de Enlace. REFERENCIAS (1) Alón, R., Chen, S., Puri, K. D. , Finger, E. B., y Springer, T. A. (1997). La cinética de las uniones de la L-selectina y la mecánica del enrollamiento mediado por la selectina. J. Cell Biol.. 138, 1169-1180. (2) Alón, R., Hammer, D. A., y Springer, T. A. (1995) . Tiempo de vida de enlace del carbohidrato con la P-selectina y su respuesta en la fuerza de tensión en el flujo hidrodinámico. Natura 374, 539-542. (3) Asa, D., Gant, T., Oda, Y., y Brandley, B. K. , (1992). Evidencia de dos clases de sitios de unión del carbohidrato en las selectinas. Glucobiología 2, 395-399. (4) Bajorath, J. , Hollenbaugh, D. , king, G., Harte, W., Eustice, D. C, Darveau, R. P., y Aruffo, A. (1994). Los sitios de unión de CD62/P-selectina para la células mieloides y sulfatidas son translapantes . Bioquímica 33, 1332-1339. (5) Baumheuter, S., Singer, M. S., Henzel, W., Hemmerich, S., Renz, M., Rosen, S. D. , y Lasky, L. A. (1993). La unión de la L-selectina con la sialomucina CD34 vascular. Science 262, 436-438. (6) Berg, E. L., McEvoy, L. M., Berlin, C, Bargatze, R. F., y Butcher, E. C. (1993). Enrollamiento de los leucocitos mediado por la L-selectina en MadCAM-1, Nature 366, 695-698. (7) Bricogne, G. (1993). La determinación de la fase directa mediante la maximización de la entropía y el coeficiente de la probabilidad; reporte del estado y las perspectivas. Acta Crystallogr. D49, 37-60. (8) Brunger, A. T., Adams, P. D., Clore, G. M. , DeLano, W. L., Gros, P., Grosse-Kunstleve, R. W. , Jiang, J. S., Kuszewski, J. , Nilges, M., Pannu, N. S., Read, R. J. , Rice, L. M., Simonson, T., y Warren G. L. (1998). Cristalografía y el sistema NMR: Un conjunto de programas nuevos adecuados para la determinación de la estructura macromolecular. Acta Crystallogr. D54 905-921. (9) CCP4 (1994). El CCP4 adecuado: programas para la cristalografía por ratos X. Acta Crystallogr. D50 760-763. (10) Chen, S., Alón, R. , Fuhlbrigge, R. C, y Springer, T. A. (1997). Enrollamiento y la unión transiente de los leucocitos en los anticuerpos que revela las especializaciones de selectina. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 94, 3172-3177. (11) Croce, K., Freedman, S. J., Furie, B. C, y Furie, B. (1998). Interacción entre la P-selectina soluble y el ligando 1 de la glucoproteína de la P-selectina soluble: análisis de enlace de equilibrio. Biochemistry 37, 16472-16480. (12) de la Fourtelle, E., and Bricogne, G. (1997). Los métodos de refinamiento del parámetro de la probabilidad máxima del átomo pesado para el reemplazo múltiple isomorfo y la difracción anómala de longitud de onda múltiples. Methods Enzymol. 216, 472-494. (13) Dríckamer, . (1988). Dos clases distintas de dominios de reconocimiento del carbohidrato en las lectinas de animales. J. Biol.. Chem. 263, 9557-9560. (14) Erbe, D. V., Watson, S. R. , Presta, L. G., Wolitzky, B. A., Foxall, C, Brandley, B. K. , y Lasky, L. A. (1993) . Los sitios de uso común de P- y E-selectinas para el reconocimiento del ligando del carbohidrato y la adhesión celular. J. Cell Biol.. 120, 1227-1235. (15) Erbe, D. V., Wolitzky, B. A., Presta, L. G., Norton, C. R. , Ramos, R. J. , Burns, D. K. , Rumberger, J. M. , Rao. B. N., Foxall, C, Brandley, B. K. , y Lasky, L. A. (1992) . Identificación de una región crucial de la E- selectina para el reconocimiento del carbohidrato y la adhesión celular. J. Cell Biol. 119, 215-227. (16) Foxall, C, Watson, S. R. , Dowbenko, D. , Fennie, C, Lasky, L. A., Kiso, M. , Hasegawa, A., Asa., D., y Brandley, B. K. (1992). Los tres miembros de la familia del receptor de la selectina que reconocen un epítope de carbohidrato común, el oligosacarido del sialilo de Lewisx. J. Cell. Biol. 11 1, 895-902. (17) Gibson, R. M., Kansas, G. S., Tedder, T. F. , Furie, B., y Furie, B. C. (1995). Los dominio de la lectina y del factor de crecimiento epidérmico de la P-selectina en la densidad fisiológica son la unidad de reconocimiento para la unión de los leucocitos. Blood 85, 151-158. (18) Gotees, D. J. , Greif, D. M., Ding, H., Camphausen, R. T., Howes, S., Comess, K. M. , Snapp, K. R., Kansas, G. S., y Luscinskas, F. W. (1997). La adhesión dinámica del ligando-1 de la glucoproteína P-selectina aislada con P- y E-selectina. J. Cell. Biol. 131, 509-519. (19) Graves, B. J. , Crowther, R. L., Chandran, C, Rumberger, J. M. , Li, S., Huang, K. S., Presky, D. H., Familletti, P. C, Wolitzky, B. A., y Burns, D. K. (1994). Entendimiento de la interacción E-selectina / ligando de la estructura cristalina y la mutagénesis de los dominios lee / EGF. Nature 367, 532-538. (20) Hirose, M., Kawashima, H., and Miyasaka, M. (1998). Un epítope functional en la P-selectina que soporta la unión de la P-selectina al ligando-1 de la glucoproteína de P-selectina pero no con los oligosacáridos del sialilo de Lewisx. Int. Immunol. 10, 639-640. (21) Hollenbaugh, D., Bajorath, J. , Stenkamp, R. , y Aruffo, A. (1993) . Interacción de la P-selectina (CD62) y su ligando celular: análisis de los residuos críticos. Biochemistry 32, 2960-2966. (22) Honig, B., and Nicholls, A. (1995).

Electrostática clásica en biología y química. Science 268, 114-1149. (23) Kansas, G. S. (1996). Selectinas y sus ligandos: conceptos y controversias actuales. Blood 88, 3259-3287. (24) Kansas, G. S., Saunders, K. B., Ley, K., Zakrzewicz, A., Gibson, R. M., Furie, B. C, Furie, B., y Tedder, T. F. (1994) . Una regla para el dominio similar al factor de crecimiento epidérmico de la P-selectina en el reconocimiento del ligando y la adhesión celular. J. Cell Biol. 124, 609-618. (25) Kogan, T. P., Revelle, B. M. , Tapp, S., Scott, D., y Beck, P. J. (1995). Un solo residuo de amino ácidos puede determinar la especificidad del ligando de E-selectina. J. Biol. Chem. 210, 14047-14055. (26) Kraulis, P. J. (1991). MOLSCRIPT: Un programa para producir tanto gráficas detalladas como esquemáticas de las estructuras de la proteína. J. Appl. Crystallogr. 24, 946-950. (27) Kumar, R. , Camphausen, R. T., Sullivan, F. X., y Cumminig, D. A. (1996). La actividad de la enzima Core2 b-1, 6-N-acetilglucosaminiltransferasa es crucial para el ligando-1 de glucoproteína de P-selectina que se une a la P-selectina. Blood 88, 3872-3879, (28) Lasky, L. A., Singer, M. S., Dowbenko, D. , Imai, Y., Henzel, W. J. , Grimley, C, Fennie, C, Gillett, N., Watson, S. R. , , y Rosen, S. D. (1992). Un ligando endotelial para la L-selectina es una molécula similar a la mucina novedosa. Cell 69, 927-938. (29) LaVallie, E. R. , Rehemtulla, A., Racie, L. A., DiBlasio, E. A., Ferenz, C, Grant, K. L., Light., y McCoy, J. M. (1993). Clonación y expresión funcional de ADNc que codifica la sub-unidad catalítica de la enterocinasa de bovino. J. Biol. Chem. 268, 23311-23317. (30) Leppanen, A., Mehta, P., Ouyang, Y. B., Ju, T., Helin, J. , Moore, K. L., van Die, I., Canfield, W. M. , McEver, R. P., y Cummings, R. D. (1999). Un glucosulfopéptido novedoso que se une a la P-selectina e inhibe la adhesión de los leucocitos a la P-selectina. J. Biol. Chem. 274, 24838-24848. (31) Levinovitz, A., Muhlhoff, J. , Isenmann, S., y Vestweber, D. (1993). Identificación de un ligando de glucoproteína para la E-selectina en las células mieloides de ratón. J. Cell Biol. 121 , 449-459. (32) Li, F., Wilkins, P. P., Crawley, S., Weinstein, J., Cummings, R. D., y McEver, R. P. (1996). Modificaciones post-tranduccionales del ligando-1 de la glucoproteína de P-selectina requerido para la unión con la P- y E-selectina. J. Biol. Chem. 271, 3255-3264. (33) McEver, R. P., y Cummins, R. D. (1997). El papel de PSGL-1 que se une a las selectinas en el reclutamiento de los leucocitos. J. Clin. Invest. 100, S97-103. (34) Mehta, P., Cummings, R. D., y McEver, R. P. (1998). Análisis de afinidad y cinética de la P-selectina que se une al ligando-1 de glucoproteína P-selectina. J. Biol. Chem. 213, 32506-32513. (35) Merrit, E. A., y Murphy, M. E. P. (1994). Raster3D versión 2.0: un programa para las gráficas moleculares fotorealisticas . Acta Crystallogr. D50, 869-873. (36) Moore, K. L., Stults, N. L., Diaz, S., Smith, D. F., Cummings, R. D. , Varki, A., y McEver, R. P. (1992). Identificación de un ligando de la glucoproteína especifico para la P-selectina (CD62) en las células mieloides. J. Cell Biol. 118, 445-456. (37) Ng, K. K., y Weis, W. I. (1997). Estructura de un mutante similar a la selectina de la proteína que se une a la mañosa que forma un complejo con los oligosacáridos de Lewisx sialilados y sulfatados. Biochemestry 36, 979-988. (38) Nicholls, A., Sharp, K. , and Honig, B. (1991). El plegado y la asociación de la proteína; penetración de las propiedades interfaciales y termodinámicas de los hidrocarburos. Proteins 11 , 281-296. (39) Poppe, L., Brown, G. S., Philo, J. S., Nikrad, P. V., y Shah, B. H. (1997). Conformación del tetrasacárido de Slex, libre en la solución y se une a E-, P-, y L-selectina. J. Am. Chem. Soc . 119, 1727-1736. (40) Pouyani, T., y See, B. (1995). El reconocimiento de la PSGL-1 de la P-selectina se controla por un consenso de sulfatación de la tirosina en el amino de PSGL-1. Cell. 83, 333-343. (41) Puri, K. D., Chen, S., and Springer, T. A. (1998). Modificar la propiedad mecánica y el umbral de corte de la adhesión de la L-selectina independientemente de las propiedades de equilibrio. Nature 392, 930-933. (42) Ramachandran, V., Nollert, M. U., Qiu, H., Liu, W. J. , Cummings, R. D., Zhu, C, y McEver, R. P. (1999). El reemplazo de la tirosina en el ligando-1 glucoproteína de la P-selectina afecta las distintas propiedades cinéticas y mecánicas de los enlaces con P- y L-selectina. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 96, 13771-13776. (43) Sako, D., Cheng, X. J. , Barone, K. M., Vachino.

G., White, H. M., Shaw, G., Veldman, G. M. Bean, K. M., Ahern., T. J. , Furie, B., Cumming, D. A., y Larsen, G. R. (1993) . La clonación de expresión de un ligando de glucoproteína funcional para la P-selectina: Cell. 15, 1179-1186. (44) Sako, D., Comess, K. M., Barone, K. M. , Camphausen, R. t., Cumming, D. A., y Shaw, G. D. (1995). Un segmento de péptido sulfatado en el amino terminal de PSGL-1 es crucial para la unión de la P-selectina. Cell 83, 323-331. (45) Snapp, K. R. , Craig, R. , Herrón, M., Nelson, R.

D., Stoolman, L. M., y Kansas, G. S. (1998). Dimerización del ligando-1 de la glucoproteína de la P-selectina (PSGL-1) requerido para el reconocimiento óptimo de la P-selectina. (46) Springer, T. A. (1994). Señales de trafico para la recirculación de los linfocitos y la emigración de los leucocitos: el paradigma multi-etapa. Cell 16, 301-314. (47) Vestweber, D., y Blanks, J.E. (19991). Mecanismos para regular la función de las selectinas y sus ligandos. Physiol. Rev. 79, 181-213. (48) Weis, W. I., Drickamer, K., y Hendrickson, W. A. (1992) . Estructura de una proteína que se une a la mañosa tipo C, que forma complejo con un oligosacarido . Nature 360, 127-134. (49) Wilkins, P. P., McEver, R. P., and Cummings, R.

D. (1996). Estructura de los O-glicanos en el ligando-1 glucoproteína de la P-selectina a partir de las células HL-60. J. Biol. Chem. 271, 18732-18742. (50) Wilkins, P. P., Moore, K. L., McEver, R. P., y Cummings, R. D. (1995) . Se requiere la sulfatación de la tirosina del ligando-1 glucoproteína de la P-selectina para la unión de alta afinidad con la P-selectina. J. Biol. Chem. 270, 22677-22680. (51) Yang, J. , Furie, B. C, y Furie, B. (1999). La biología del ligando-1 de la glucoproteína de la P-selectina: su papel como un contrarreceptor de la selectina en el endotelio de los leucocitos y la interacción leucocito-plaquetas. Thromb. Haemost. 81 , Al . (52) Yang, J. , Hirata, T., Croce, K., Merrill-Skoloff, G., Tchernychev, B., Williams, E., Flaumenhaft, R. , Furie, B. C, and Furie (1999). La disrupción del gen dirigida demuestra que el ligando-1 de la glucoproteína de la P-selectina (PSGL-1) se requiere para el enrollamiento y migración neutrofilica mediados por la P-selectina pero no por la E-selectina. J. Exp. Med. 190, 1769-1782. Todas las publicaciones aquí mencionadas arriba, las patentes expedidas, solicitudes pendientes, artículos publicados, depósitos de estructura de proteína, o sí de otra manera se menciona, se incorporan aquí como referencia en su totalidad. Mientras la invención antes mencionada se ha descrito con algo de detalle para los propósitos de claridad y entendimiento, se apreciará por alguien experto en la técnica, a partir de una lectura de la divulgación, que diferentes cambios en forma y en detalle pueden hacerse sin alejarse del ámbito verdadero de la invención en las reivindicaciones anexas.

Claims

REIVINDICACIONES 1.- Una P-selectina LE cristalizada.
2.- La P-selectina LE cristalizada de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada por estar en forma de placa con un grupo espacial P2?, y que tiene parámetros de célula unitarios de a = 81.0 Á, b = 60.8 A, c = 91.4 Á, y beta = 103.6°.
3.- Un complejo cristalizado de P-selectina LE y SLex.
4.- El complejo cristalizado de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado por estar en forma de placa con el grupo espacial P2?, y que tiene parámetros de célula unitarios de a = 81.1 Á, b = 60.5 A, c = 91.4 Á, y beta =
103.3°. 5.- Un complejo cristalizado de E-selectina Le y SLex.
6.- El complejo cristalizado de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado por estar en la forma de barra o varilla con un grupo espacial P2?2?2?, y que tiene parámetros de célula unitarios de a = 34.5 A, b = 72.4 A y c = 77.6 Á.
7. - Un complejo cristalizado de P-selectina LE y un péptido PSGL-1.
8.- El complejo cristalizado de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado por estar en forma bipiramidal con un grupos espacial 1222 y que tiene parámetros de célula unitarios de a = 63.4 Á, b = 96.8 A y c = 187.3 Á.
9.- Un sitio activo de una proteína o péptido que se une a SLex, caracterizado porque dicho sitio activo comprende las coordenadas estructurales relativas de los residuos de amino ácidos TYR48, GLU80, ASN82, GLU92, TYR94, PR098, SER99, ASN105, ASP106, GLU107 y el calcio de enlace de acuerdo a la Figura 3, ± una desviación de la raíz cuadrada del promedio de los cuadrados de los átomos de la cadena principal de los amino ácidos de no más de 1.5Á.
10.- El sitio activo de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque dicho sitio activo además comprende las coordenadas estructurales relativas de los residuos de los amino ácidos TYR44, SER46, SER47, ALA77, ASP78, ASN79, PR081, ASN83, ARG85, GLU88, CYS90, ILE93, LYS96, SER97, ALA100, TRP104, HIS108, LYS111 y LYS113 de acuerdo a la Figura 3, ± una desviación de la raíz cuadrada promedio de los cuadrados de los átomos de la cadena principal de los amino ácidos de no más de 1.5Á.
11.- Un sitio activo de una proteína o péptido que se une a SLex, caracterizado porque dicho sitio comprende las coordenadas estructurales relativas de los residuos de amino ácidos de TYR48, GLU80, ASN82, ASN83, GLU92, TYR94, ARG97, GLU98, ASN105, ASP106, GLU107 y el calcio de enlace de acuerdo a la Figura 4, ± una desviación de la raíz cuadrada del promedio de los cuadrados de los átomos de la columna vertebral de amino ácidos de no más de 1.5Á.
12.- El sitio activo de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque dicho sitio activo además comprende las coordenadas estructurales relativas de los residuos de amino ácidos de TYR44, SER45, PR046, SER47, ALA77, PR078, GLY79, PR081, GLU88, CYS90, LYS99, ASPlOO, TRP104, ARG108, LYS111 y LYS113 de acuerdo a la Figura 4, ± una desviación de la raíz cuadrada del promedio de los cuadrados de los átomos de la cadena principal de amino ácidos de no más de 1.5Á.
13.- Un sitio activo de una proteína o péptido que se une a PSGL-1, caracterizado porque dicho sitio activo además comprende las coordenadas estructurales relativas de los residuos de amino ácidos de ALA9, TYR45, SER46, SER47, TYR48, GLU80, ASN82, LYS84, ARG85, GLU88, GLU92, TYR94, PR098, SER99, ASN105, ASP106, GLU107, HIS107, HIS108, LEUllO, LYS111, LYS112, LYS113, HIS114 y el estroncio de enlace de acuerdo a la Figura 5, ± una desviación de la raíz cuadrada del promedio de los cuadrados de los átomos de la cadena principal de amino ácidos de no más de 1.5Á.
14.- El sitio activo de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque dicho sitio activo además comprende las coordenadas estructurales relativas a los residuos de amino ácidos de SER6, THR7 , LYS8, TYR10, SER11, TYR44, TYR49, TRP50, ALA77, ASP78, ASN79, PR081, ASN83, ASN86, ASN87, CYS90, ILE93, ILE95, LYS96, SER97, ALA100, TRP104, y CYS109 de acuerdo a la Figura 5, ± una desviación de la raíz cuadrada del promedio de los cuadrados de los átomos de la cadena principal de amino ácidos de no más de 1.5Á.
15.- Un método para identificar un agente que interactúa con la P-selectina LE, caracterizado porque comprende las etapas de: (a) generar un modelo tri-dimensional de P-selectina LE usando las coordenadas estructurales relativas de acuerdo a las Figuras 2, 3 o 5, ± una desviación de la raíz cuadrada del promedio de los cuadrados de los átomos de la cadena principal de amino ácidos de no más de 1.5Á; y (b) emplear dicha estructura tri-dimensional para diseñar o seleccionar un agente que interactúe con P-selectina LE.
16.- El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque además comprende las etapas de: (c) obtener el agente identificado; y (d) poner en contacto el agente identificado con la P-selectina LE con el objetivo de determinar el efecto que el agente tiene sobre la actividad de la P-selectina LE.
17.- Un método para identificar un activador o inhibidor de una molécula o complejo molecular que comprende un sitio de unión o que se une a SLe , caracterizado porque comprende las etapas de: (a) generar un modelo tri-dimensional de dicha molécula o complejo molecular que comprende un sitio que se une a SLex usando (i) las coordenadas estructurales relativas de acuerdo a la Figura 3 de los residuos TYR48, GLU80, ASN82, GLU92, TYR94, PR098, SER99, ASN105, ASP106, GLU107 y el calcio de enlace, ± una desviación de la raíz cuadrada del promedio de los cuadrados de los átomos de la cadena principal de amino ácidos de no más de 1.5Á, o (ii) las coordenadas estructurales relativas de acuerdo a la Figura 4 de los residuos de amino ácidos TYR48, GLU80, ASN82, GLU92, TYR94, ARG97, GLU98, ASN105, ASP106, GLU107 y el calcio de enlace, ± una desviación de la raíz cuadrada del promedio de cuadrados de los átomos de la cadena principal de amino ácidos de no más de 1.5Á; y (b) seleccionar o diseñar un candidato activador o inhibidor realizando el análisis de acoplado o ajuste por computadora con el modelo tri-dimensional generado en la etapa (a) .
18.- El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque las coordenadas estructurales relativas de la Figura 3, además comprenden los residuos de amino ácidos de TYR44, SER46, SER47, ALA77, ASP78, ASN79, PR081, ASN83, ARG85, GLU88, CYS90, ILE93, LYS96, SER97, ALA100, TRP104, HIS108, LYS111 y LYS113 ± una desviación de la raíz cuadrada del promedio de los cuadrados de los átomos de la cadena principal de amino ácidos de no más de 1.5Á.
19.- El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque las coordenadas estructurales relativas de acuerdo con la Figura 4, además comprenden los residuos de amino ácidos de TYR44, SER45, PR046, SER47, ALA77, PR078, GLY79, PR081, GLU88, CYS90, LYS99, ASPlOO, TRP104, ARG108, LYS111 y LYS113 ± una desviación de la raíz cuadrada del promedio de los cuadrados de los átomos de la cadena principal de amino ácidos de no más de 1.5Á.
20.- El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque además comprende las etapas de: (c) obtener el activador o inhibidor candidato; y (d) poner en contacto el activador o inhibidor candidato con la molécula o complejo molecular y determinar el efecto que tienen el activador o inhibidor candidato sobre la molécula o complejo molecular.
21.- El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el activador o inhibidor candidato se pone en contacto con la molécula o complejo molecular en presencia de SLex con el objetivo de determinar el efecto que tiene el activador o inhibidor candidato sobre la unión o enlace de la molécula o complejo molecular con el SLex.
22.- Un método para identificar un activador o inhibidor de una molécula o complejo molecular que comprende el sitio de unión o que se une a PSGL-1, caracterizado porque comprende las etapas de: (a) generar un modelo tri-dimensional de dicha molécula o complejo molecular que comprende una sitio que se une a PSGL-1 usando las coordenadas estructurales relativos de acuerdo a la Figura 5 de residuos de amino ácidos ALA9, TYR45, SER46, SER47, TYR48, GLU80, ASN82, LYS84, ARG85, GLU88, GLU92, TYR94, PR098, SER99, ASN105, ASP106, GLU107, HIS108, LEUllO, LYS111, LYS112, LYS113, HIS114 y el estroncio de enlace, ± una desviación de la raíz cuadrada del promedio de los cuadrados de los átomos de la cadena principal de amino ácidos de no más de 1.5Á; y (b) seleccionar o diseñar un activador o inhibidor candidato realizando el análisis de acoplado o ajuste por computadora con el modelo tri-dimensional generado en la etapa (a) .
23.- El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque las coordenadas estructurales relativas de acuerdo a la Figura 5 comprenden los residuos de amino ácidos de SER6, THR7 , LYS8, TYR10, SER11, TYR44, TYR49, TRP50, ALA77, ASP78, ASN79, PR081, ASN83, ASN86, ASN87, CYS90, ILE93, ILE95, LYS96, SER97, ALA100, TRP104, y CYS109, ± una desviación de la raíz cuadrada del promedio de los cuadrados de los átomos de la cadena principal de amino ácidos de no más de 1.5Á.
24.- El método de conformidad de la reivindicación 22, caracterizado porque además comprende las etapas de: (c) obtener el activador o inhibidor candidato; y (d) poner en contacto el activador o inhibidor candidato con la molécula o complejo molecular y determinar el efecto que tienen el activador o inhibidor candidato sobre la molécula o complejo molecular.
25.- El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el activador o inhibidor candidato se pone en contacto con la molécula o complejo molecular en presencia de PSGL-1 o un péptido de PSGL-1 con el objetivo de determinar el efecto que tienen el activador o inhibidor candidato sobre la unión o enlace de la molécula o complejo molecular con PSGL-1 o un péptido de PSGL-1.
26.- Un método para identificar un agente que interactúa con SLex, caracterizado porque comprende las etapas de: (a) generar un modelo tri-dimensional de SLex usando las coordenadas estructurales relativas de acuerdo a la Figura 3 o 4, ± una desviación de la raíz cuadrada del promedio de los cuadrados de los átomos de la cadena principal de amino ácidos de no más de 1.5Á; y (b) emplear dichas estructuras tri-dimensionales para diseñar o seleccionar un agente que interactúe con SLex.
27.- El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque además comprende las etapas de: c) obtener el agente identificado; y (d) poner en contacto el agente identificado con SLex con el objetivo de determinar el efecto que tienen el agente sobre la actividad de SLex.
28.- Un método para identificar un agente que interactúe con PSGL-1, caracterizado porque comprende las etapas de: (a) generar un modelo tri-dimensional de un péptido de PSGL-1 usando las coordenadas estructurales relativas de acuerdo a la Figura 5, ± una desviación de la raíz cuadrada del promedio de los cuadrados de los átomos de la cadena principal de amino ácidos de no más de 1.5Á; y (b) emplear dicha estructura tri-dimensional para diseñar o seleccionar un agente que interactúe con PSGL-1.
29.- El método de la reivindicación 28, caracterizado porque comprende las etapas de: c) obtener el agente identificado; y (d) poner en contacto el agente identificado con PSGL-1 o un péptido de PSGL-1 con el objetivo de determinar el efecto que tiene el agente sobre la actividad del PSGL-1 o un péptido de PSGL-1.
30.- Un agente identificado por el método de la reivindicación 15.
31.- Un activador o inhibidor identificado por el método de la reivindicación 17.
32.- Un activador o inhibidor identificado por el método de la reivindicación 22.
33.- Un agente identificado por el método de la reivindicación 26.
34.- Un agente identificado por el método de la reivindicación 28.
35.- Un método para obtener una complejo cristalizado de una molécula tipo E-selectina y un compuesto que coordina el calcio, dicho método caracterizado porque comprende las etapas de: (a) poner en contacto una molécula de tipo E-selectina cristalizada con un compuesto que coordina el calcio, en presencia de los iones de calcio y del PEG para formar una complejo cristalizado de una molécula de tipo E-selectina y dicho compuesto que coordina el calcio; y (b) poner en contacto dicho complejo cristalizado en presencia de un concentración reducida de los iones de calcio, y las concentraciones suficientes de PEG y una sal iónica para obtener un complejo final cristalizado, que luego del enfriamiento, es adecuado para elucidar o aclarar las estructuras tri-dimensionales de la molécula de tipo E-selectina y el compuesto que coordina el calcio por la difracción con rayos X del complejo final cristalizado.