MXPA02010743A - Eliminacion de virus de celulas neoplasticas de composiciones celulares mezcladas. - Google Patents
Eliminacion de virus de celulas neoplasticas de composiciones celulares mezcladas.Info
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Abstract
La presente invencion se refiere a un metodo para remover las celulas neoplasticas de una composicion celular mezclada, la cual esta fuera de un organismo viviente, por el uso de un virus el cual infecta y extermina selectivamente la celula neoplastica. Una variedad de virus pueden ser utilizados en este metodo para remover las celulas neoplasticas para diferentes propositos, por ejemplo, para purificar las celulas madre hematopoyeticas previo al trasplante. Tambien se proporcionan composiciones preparadas de acuerdo con este metodo, y kits que comprenden una combinacion de virus los cuales son utiles en esta invencion.
Description
ELIMINACIÓN DE VIRUS DE CÉLULAS NEOPLÁSTICAS DE COMPOSICIONES CELULARES MEZCLADAS
Campo de la Invención La presente invención se refiere a un método para remover selectivamente las células neoplásticas de una composición celular mezclada .fuera de un organismo viviente utilizando un virus el cual infecta y extermina selectivamente las células neoplásticas. También se proporcionan composiciones preparadas de acuerdo con este método, y kits que comprenden una combinación de virus los cuales son útiles en esta invención.
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La totalidad de las publicaciones, patentes y solicitudes de patente anteriores son incorporadas aqui para referencia en su totalidad al mismo grado que si la descripción de cada publicación, patente o solicitud de patente individual indicada especifica e individualmente fuera incorporada para referencia en su totalidad.
Antecedentes de la Invención La proliferación celular es regulada tanto por las señales que promueven el crecimiento como las señales que restringen el crecimiento. Estas dos clases de señales para cada célula normalmente podrían afectar un equilibrio de una manera que refleja la necesidad del cuerpo de la célula particular. Si una célula no responde a las señales que restringen el crecimiento o tienen una respuesta mayor de la
normal a las señales promotoras del crecimiento, las mismas proliferarán anormalmente rápido (referidas como células neoplásticas) y eventualmente pueden desarrollarse en el cáncer, un neoplasma maligno. La quimioterapia, un método común para el tratamiento del cáncer, generalmente está basado en la propiedad de proliferación rápida de las células cancerosas. Puesto que las células del cáncer proliferan rápidamente, las mismas son más sensibles a los fármacos que inhiben la proliferación celular. En teoría, eligiendo cuidadosamente la dosificación de los fármacos quimioterapéuticos, se puede inhibir la proliferación de las células cancerosas sin dañar seriamente las células normales. Sin embargo, algunas células normales, tales como las células madre hematopoyéticas, también proliferan rápidamente. Por lo tanto, cualquier dosificación la cual sea perjudicial para las células cancerosas frecuentemente también es perjudicial para las células madre hematopoyéticas. Por otra parte, si la dosificación no es lo suficientemente elevada para exterminar las células del cáncer, existe el riesgo de que el cáncer pudiera reaparecer brevemente después que la quimioterapia se haya terminado. A causa de que es difícil encontrar una dosificación la cual extermine selectivamente las células cancerosas, la quimioterapia de dosis elevadas seguido por el
rasplante de células madre progenitoras he otopoyéticas autólogas • ha tenido una amplia aplicación como un método terapéutico en muchos cánceres (por ejemplo, véase Winter, 1999; Nieto y Shpall, 1999) . En este método, una porción de las células madre hematopoyéticas es removida de un paciente con cáncer, y el paciente es tratado entonces con quimioterapia de dosis elevadas la cual es letal para las células que proliferan rápidamente, tales como las células del cáncer y las células madre hematopoyéticas. Subsiguientemente, el paciente recibe el trasplante de células madre hamatopoyéticas autólogas, las cuales han sido removidas previamente del mismo paciente, para regenerar el sistema he atopoyético. Una seria desventaja de esta terapia es que cuando las células madre progenitoras hematopoyéticas son removidas de los pacientes, las mismas son contaminadas frecuentemente con células cancerosas . Esto es un problema especialmente cuando el paciente tiene un cáncer de origen hematopoyético, pero los pacientes con un tumor sólido también pueden padecer de contaminación de las células madre hematopoyéticas, particularmente si el tumor sólido ha sido sometido a metástasis. Como se resultado, cuando las células removidas son transplantadas nuevamente para restablecer el sistema hematopoyético, algunas células cancerosas también pueden ser colocadas de nuevo en el paciente con cáncer en donde las
mismas pueden proliferar nuevamente para contribuir a una recurrencia del cáncer. Por lo tanto, es deseable purificar los autoinjertos antes del trasplante. Se han empleado varios métodos para purificar los autoinjertos (Spyridonidis et al, 1998; Bensinger 1998) . El autoinjerto puede ser tratado con quimioterapia para exterminar las células neoplásticas contaminantes in vitro. Sin embargo, como se describió anteriormente, es difícil encontrar una dosificación para el fármaco quimioterapéutico el cual extermine selectivamente las células neoplásticas o las células cancerosas pero que deje intactas a las células' madre hematopoyéticas normales. Los autoinjertos también pueden ser tratados con una toxina conjugada con anticuerpos los cuales reconocen un antígeno que es específico para las células neoplásticas, pero tal antígeno específico del tumor no siempre existe. También es posible separar las células madre de las otras células con base en un marcador superficial específico de la célula madre (CD34) utilizando citometría de flujo, columnas de afinidad o perlas magnéticas. Sin embargo, seleccionando solamente ciertas células hematopoyéticas, por ejemplo, las células CD34+, otras células hematopoyéticas tales como las células T, células B, monocitos y células exterminadoras naturales, también son eliminadas, y la recuperación inmune puede ser retardada (Bensinger, 1998) . Este método también conduce a la
pérdida de aproximadamente la mitad de las células CD34+ y a la retención de algunas células cancerosas contaminantes (Spyridonidis et al, 1998) . Por lo tanto, subsiste una necesidad de un método altamente selectivo con un rendimiento razonable para purificar - los autoinjertos que puedan contener células neoplásticas .
Breve Descripción de la Invención La presente invención está dirigida a un método para remover selectivamente las células neoplásticas de una composición celular mezclada, por ejemplo un autoinjerto, utilizando un virus que exhibe un exterminio selectivo de las células neoplásticas. Una variedad de virus son capaces de remover selectivamente las células neoplásticas pero no las células normales. Por ejemplo, los reovirus exterminan selectivamente las células neoplásticas activadas con ras, los virus que expresan un gen p53 del tipo silvestre son selectivos para las células neoplásticas con un p53 disfuncional, y cualquier virus sensible al interferón es selectivo para las células neoplásticas que tienen una ruta del interferón alterada. En consecuencia, un aspecto de la presente invención está dirigido a un método para remover selectivamente las células neoplásticas de una composición
celular mezclada que se sospecha que contiene células neoplásticas en donde la composición está localizada fuera de un organismo viviente, el método comprenderlos pasos de: (a) poner en contacto la composición celular mezclada con un virus bajo condiciones que conduzcan a un exterminio substancial de las células neoplásticas; y (b) colectar la composición celular tratada. En otra modalidad de la invención, el método comprende además el paso de congelar y almacenar la composición celular tratada con el virus en una solución que contiene DMSO. El DMSO es utilizado rutinariamente para congelar y almacenar células animales pero puede desnaturalizar los virus. Por lo tanto, el tratamiento con DMSO remueve el virus infeccioso de la composición celular al mismo tiempo que preserva la actividad de la composición en el estado congelado durante un período de tiempo prolongado. En otra modalidad de la presente invención, el virus es removido de la composición celular tratada con el virus sometiendo la mezcla a los anticuerpos del antivirus que son específicos para el virus particular, o una combinación de anticuerpos de antivirus y un complemento para lisar el virus. Alternativa o adicionalmente, los anticuerpos de antivirus que reconocen una molécula sobre la superficie de la partícula del virus pueden ser utilizados para remover las partículas del virus por la inmovilización de los
anticuerpos, aplicando la composición celular a los anticuerpos inmovilizados, y colectando la parte de la composición que no se aglutina a los anticuerpos. De manera semejante, los anticuerpos específicos contra el virus particular pueden ser administrados al receptor del trasplante para eliminar el virus in vivo, o al receptor se le puede dar un estimulante del sistema inmune para lograr este propósito. En otro modalidad de la presente invención, el virus es removido de la composición celular tratada con el virus utilizando un gradiente que puede separar los virus de las células* En una modalidad preferida de esta invención, la composición celular mezclada comprende células madre hematopoyéticas. Así, las células madre hematopoyéticas pueden ser purificadas previo al trasplante, o cualquier otro uso deseado, para remover las células neoplásticas. Las células madre hematopoyéticas pueden ser colectadas de la médula ósea o de la sangre. La aplicación de esta invención no está limitada a purificar células madre hematopoyéticas. En otra modalidad de esta invención, el presente método puede ser aplicado a cualquier tejido, órgano, una combinación de diferentes tejidos/órganos, o cualquier porción de un tejido o un órgano para remover las células neoplásticas. Los tejidos u órganos
son útiles preferentemente en un trasplante subsiguiente. Sin embargo, el presente método también es útil para purificar los tejidos u órganos para cualesquiera otros propósitos en donde sea deseable remover las células neoplásticas las cuales están presentes en el tejido u órgano. En otra modalidad de la invención, un virus es utilizado para tratar las líneas celulares cultivadas para remover las células que son transformadas espontáneamente. Este método también puede ser utilizado para tratar el semen o los huevos del donador antes de la inseminación artificial u otros procedimientos relacionados con la reproducción. En otro aspecto de esta invención, el virus es un virus competente en la replicación. Como lo opuesto a un virus deficiente en la replicación, un virus competente en la replicación puede replicarse en una célula que es susceptible a este virus y frecuentemente provoca que esta célula se lise. El virus competente en la replicación útil en esta invención puede lisar selectivamente las células neoplásticas en un fenómeno llamado "oncólisis", pero no lisa las células normales . En otra modalidad de esta invención, el virus es un virus mutado o modificado seleccionado del grupo que consiste de adenovirus, virus del herpes simple, virus de vaccinia y parapoxvirus orf. Cada uno de estos virus en la forma natural ha desarrollado un mecanismo para inhibir la proteína cinasa
del ARN de doble hebra (PKR) para facilitar la síntesis de proteína viral que de otras manera es inhibida por PKR. Estos virus pueden replicarse por lo tanto en cualesquiera células sin importar la PKR. Cuando estos inhibidores de PKR viral son mutados o modificados, sin embargo, el virus es susceptible entonces a la inhibición de PKR y no se replica en las células normales, las cuales tienen una ruta de PKR funcional. Estos virus mutados o modificados pueden ser utilizados para remover selectivamente las células neoplásticas activadas con ras a causa de que las células neoplásticas activadas con ras son deficientes en la función de PKR y por consiguiente no inhiben la replicación de estos virus . En otro aspecto de esta invención, el virus extermina selectivamente las células neoplásticas llevando un gen supresor del tumor. Por ejemplo, p53 es un supresor del tumor celular el cual inhibe la proliferación no controlada de las células normales . Aproximadamente la mitad de todos los tumores tienen el p53 dañado funcionalmente y proliferan de una manera no controlada. Por lo tanto, un virus que expresa el gen p53 del tipo silvestre puede exterminar selectivamente las células neoplásticas las cuales llegan a ser neoplásticas debido a la inactivación del producto del gen p53. Una modalidad semejante involucra los inhibidores
virales de los genes supresores del tumor celular. Ciertos virus codifican una proteína que inhibe a los supresores del tumor, por lo cual permiten la replicación viral en la célula. Por la mutación de estos inhibidores virales, un virus es generado el cual no se replica en las células normales debido a la presencia de los supresores del tumor. Sin embargo, el mismo se replica en las células neoplásticas que han perdido los supresores del tumor y pueden ser utilizados para exterminar selectivamente las células neoplásticas en la presente invención. En otra modalidad de la invención, un virus sensible al interferón es utilizado para exterminar selectivamente las células neoplásticas. Un virus sensible el interferón es inhibido por el interferón y no se replica en una célula normal que tiene una ruta del interferón intacta. Puesto que algunas células neoplásticas tienen su ruta del interferón alterada o interrumpida, las mismas pueden ser exterminadas selectivamente por un virus sensible al interferón. El virus sensible al interferón es preferentemente el virus de estomatitis vesicular (VSV) . El interferón puede ser agregado opcionalmente en compañía del virus sensible al interferón para remover las células neoplásticas. También se proporcionan composiciones celulares las cuales han sido tratadas con un virus para remover las
células neoplásticas y dejar células no neoplásticas viables. Tales composiciones pueden ser utilizadas para la investigación in vitro, o en el trasplante, inseminación, u otros procedimientos in vivo. El trasplante puede ser autólogo, alogenéico, o aún xenogenéico. Preferentemente el -trasplante es autólogo. Más preferentemente, la composición comprende células madre hematopoyéticas. Otro aspecto de la invención proporciona un kit que comprende al menos dos virus con diferente selectividad, tales como reovirus, un virus que expresa una proteína p53 funcional, Delta2 , ONYX-015, virus de la enfermedad de
Newcastle o virus de estomatitis vesicular.
Breve Descripción de los Dibujos
Figura 1 Las Figuras 1A-1C muestran el número de células viables en MCF7 (Figura ÍA) , SKBR3 (Figura IB) o HTB 132
(Figura ic) que fueron infectadas con el reovirus vivo, el virus muerto o ningún virus como está indicado. La Figura ID muestra el porcentaje de células MCF7 que estuvo viable en varios puntos del tiempo después de la infección con el reovirus .
Figura 2 Las Figuras 2A-2C demuestran el porcentaje del ADN que fue fragmentado después de la infección con el reovirus. La Figura 2D muestra el porcentaje del teñido con el marcador apoptótico Annexin V después de la infección con el reovirus. Las Figuras 2E-2G muestran el porcentaje de células AP02.7+ en cada tipo de célula como está indicado. En general, las Figuras muestran que la apoptosis fue inducida por la infección con el reovirus en las células MCF7, SKBR3 o HTB 132. Figura 3 La Figura 3A muestra el número de células viables en varios puntos del tiempo después que las células madre CD34+ han sido infectadas con el reovirus. La Figura 3B muestra el efecto del reovirus sobre el cultivo de las células madre a largo plazo. Las células madre fueron infectadas con el reovirus e incubadas durante 2 , 24, 48 o 72 horas, respectivamente, luego las células fueron diluidas y cultivadas durante 14 días para dejar que se formen colonias individuales. El número de cada clase de colonia, granulocitos (G) , eritroides (E) o megacariocitos del macrófago eritroide del granulocito (GEMM) , fue determinado entonces para las células infectadas con ningún virus (NV) o el virus vivo (LV) , respectivamente. Por ejemplo, V-G significa las colonias de granulocitos derivadas de las
células las cuales fueron tratadas sin virus, y LV-G significa aquellas derivadas de las células que fueron tratadas con el. reovirus vivo.
Figura 4 Las Figuras 4A-4C muestran los efectos purificadores del reovirus sobre las mezclas del producto de aféresis con las células de MCF7, MDA MB 468 o SKBR3, respectivamente .
Descripción Detallada de la Invención La presente invención está dirigida a un método para remover selectivamente las células neoplásticas de una composición celular mezclada, por ejemplo un autoinjerto utilizando un virus el cual exhibe un exterminio selectivo de las células neoplásticas. Una variedad de virus son útiles en esta invención. Por ejemplo, una composición celular mezclada puede ser tratada con el reovirus, el cual extermina selectivamente las células neoplásticas activadas con ras. Las células neoplásticas activadas con ras también pueden ser removidas selectivamente con un virus en el cual el inhibidor viral de la proteína cinasa de doble hebra (PKR) es mutada o modificada. Si la composición se sospecha que contiene células del tumor deficientes en p53, la misma puede ser tratada con un virus que expresa el gen supresor del tumor de
p53, el cual induce la apoptosis en las células del tumor con el daño funcional en el producto del gen p53 (Wiman, 1998;
Nielsen et al, 1998) . El virus de estomatitis vesicular
(VSV) u otros virus sensibles el interferón pueden ser utilizados en la presencia del interferón para exterminar a las células neoplásticas con una ruta de int-erferón alterada. Otros ejemplos de virus útiles en esta invención incluyen el virus de vaccinia, virus de influenza, virus de varicela, virus del sarampión, virus del herpes y Virus de la Enfermedad de Newcastle, los cuales se reportó que van a estar asociados con la regresión del tumor o la muerte (Nemunaitis, 1999). Sin embargo, esta invención abarca cualquier virus que sea capaz de exterminar selectivamente las células neoplásticas. Previo a la descripción de la invención con detalle adicional, los términos utilizados en esta descripción son definidos como sigue a menos que se indique de otra manera.
Definiciones "Virus" se refiere a cualquier virus, ya sea en la forma natural, atenuada o modificada. Los virus modificados incluyen los virus modificados químicamente o los virus modificados de manera recombinante. Un virus modificado de manera recombinantemente puede ser un virus mutado, un virus recombinante o un ' virus reordenado . Un virus mutado es un
virus en el cual el genoma viral ha sido mutado, especialmente que tiene inserciones, deleciones y/o substituciones de nucleótidos. Un virus recombinante es un virus que tiene proteínas de recubrimiento de diferentes subtipos, usualmente preparadas coinfectando una célula con más de un subtipo del virus, conduciendo a virus los cuales son envueltos por las proteínas de recubrimiento codificadas por diferentes subtipos. Un virus reordenado es un virus de segmentos múltiples en el cual los segmentos han sido reordenados, usualmente por coinfección de una célula con más de un subtipo de esta virus de modo que los segmentos de diferentes subtipos se mezclen y se adapten en la célula. Las "células neoplásticas", también conocidas como "células con un trastorno proliferativo", se refieren a células las cuales proliferan sin las propiedades de inhibición del crecimiento normales . Un nuevo crecimiento que comprende células neoplásticas es un neoplasma o tumor. Un' neoplasma es un crecimiento de tejido anormal, que forma generalmente una masa distinta, la cual crece por la proliferación celular más rápidamente que el crecimiento del tejido normal. Los neoplasmas pueden mostrar la falta parcial o total de organización y la coordinación funcional con el tejido normal. Cuando se utilice aquí, un neoplasma está propuesto para abarcar los neoplasmas hematopoyéticos así como neoplasmas sólidos.
Un neoplasma puede ser benigno (tumor benigno) o maligno (tumor maligno o cáncer) . Los tumores malignos pueden ser clasificados ampliamente en tres tipos" principales. Los neoplasmas malignos que surgen de las estructuras epiteliales son llamados carcinomas, los neoplasmas malignos que se originan de los tejidos conectivos tales como músculos, cartílagos o el hueso, son llamados sarcomas y los tumores malignos que afectan las estructuras hematopoyéticas (estructuras que pertenecen a la formación de células sanguíneas) incluyendo los componentes del sistema inmune, son llamados leucemias y linfomas. Otros neoplasmas incluyen, pero no están limitados a neurofibromatosis. Las "células neoplásticas activadas con ras" o "células neoplásticas mediadas con ras" se refieren a células que proliferan a una velocidad anormalmente elevada debido, al menos en parte, a la activación de la ruta de ras. La ruta de ras puede ser activada por medio de la mutación estructural del gen ras, el nivel elevado de la expresión del gen ras, la estabilidad elevada del mensaje del gen ras, o cualquier mutación u otro mecanismo el cual conduzca a la activación de ras o un factor o factores antes o después de ras en la ruta de ras, por lo cual se incrementa la actividad de la ruta de ras. Por ejemplo, la activación del receptor de EGF, el receptor de PDGF o Sos conduce a la activación de la ruta de ras. Las células neoplásticas mediadas por ras
incluyen, pero no están limitadas a, las células cancerosas mediadas por ras, las cuales son células que proliferan de una manera maligna debido a la activación de la ruta de ras. "Composición celular" significa una composición que comprende células. La composición puede contener materia no celular. Por ejemplo, la sangre entera es una composición celular que contiene plasma, plaquetas, hormonas y otra materia no celular además de las células tales como eritrocitos y leucocitos. Una composición celular puede contener células de varios tipos, origen u organización. Por ejemplo, los tejidos y órganos que contienen diferentes tipos' de células arreglados en estructuras definidas se consideran composiciones celulares. Una "composición celular mezclada" es una composición celular que contiene al menos dos clases de células. Típicamente, la composición celular mezclada contiene tanto células normales como células neoplásticas. Se' prefiere que la mayoría de las células en la composición celular sean células que se pueden dividir, y que el virus extermine selectivamente las células neoplásticas pero deje otras células que se pueden dividir esencialmente intactas. Una composición celular "sospechosa de contener células neoplásticas" es una composición celular la cual puede contener células neoplásticas. Por ejemplo, cualquiera autoinjerto obtenido de un sujeto que lleva un neoplasma
puede contener células neoplásticas. Un cultivo celular el cual ha estado en cultivo durante un intervalo de tiempo considerable puede contener células neoplásticas espontáneas. "Exterminio substancial" significa una reducción de al menos aproximadamente 20% de viabilidad de las células neoplásticas de objetivo. La viabilidad puede ser determinada por un conteo de células viables de las células tratadas, y el grado de reducción puede ser determinado comparando el número de células viables en las células tratadas con respecto a aquellas en las células no tratadas, o comparando el conteo de células viables antes y después del tratamiento' con el virus. La reducción en la viabilidad es preferentemente de al menos aproximadamente 50%, más preferentemente de al menos aproximadamente 70%, todavía más preferentemente de al menos aproximadamente 80%, y aún más preferentemente de al menos aproximadamente 90%. Las células neoplásticas pueden ser exterminadas de varias maneras. Por ejemplo, las mismas pueden ser usadas por un virus el cual es capaz de infección lítica de las células neoplásticas (oncólisis) . Las células neoplásticas pueden padecer apoptosis la cual es inducida directa o indirectamente por el virus . Las células también pueden ser exterminadas, aunque menos preferentemente, por el sistema inmune el cual ha sido activado por el virus. Por ejemplo, el virus puede inducir la producción de citocina, la cual activa
las células exterminadoras naturales, las cuales a su vez exterminan selectivamente las células neoplásticas (Zorn et al, 1994) . Un virus "competente en la replicación" es un virus que es capaz de replicación en al menos un tipo de célula. Como lo opuesto a un virus competente en la replicación, un "virus incompetente en la replicación" contiene una mutación en una región de su genoma la cual es esencial para su replicación, y por consiguiente no es capaz de replicación en ninguna célula. "Adenovirus" es un virus de ADN de doble hebra de aproximadamente 3.6 kilobases. En los seres humanos, los adenovirus pueden replicarse y provocar la enfermedad en los ojos y en los tractos respiratorio, gastrointestinal y urinario. Aproximadamente una tercera parte de los 47 serotipos humanos conocidos son responsables de la mayoría de los casos de la enfermedad del adenovirus humano (Brooks et al, 1998) . El término "adenovirus mutado" o "adenovirus modificado" significa, cuando se utilice aquí, que el producto o productos del gen el cual previene la activación de PKR está faltando, está inhibido o está mutado de tal modo que la activación de PKR no esté bloqueada. El adenovirus codifica varios productos del gen que contrarrestan los mecanismos de defensa antivirales del huésped. El ARN
asociado con el virus (ARN del VAI o ARNX de VA) del adenovirus, son ARNs estructurados, pequeños, que se acumulan en concentraciones elevadas en el citoplá-sma en un tiempo posterior después de la infección por el adenovirus. Estos ARNs de VAI se aglutinan al AR? de doble hebra (dsAR?) que aglutina porciones de PKR .y bloquea la activación dependiente de ds R? de la PKR por autofosforilación. Por consiguiente, PKR no es capaz de funcionar y el virus puede replicarse dentro de la célula. La sobreproducción de viriones eventualmente conduce a la muerte de la célula. En un adenovirus mutado o modificado, los AR?s de VAI preferentemente no son transcritos . Tales adenovirus mutados
0 modificados podrían no ser capaces de replicarse en las células normales que no tienen una ruta de Ras activada; sin embargo, podrían ser capaces de infectar y replicarse en las células que tienen una ruta de Ras activada. "Virus del herpes simple" (VHS) se refiere al virus'
1 del herpes simple (VHS-1) o virus del herpes simple 2 (VHS-2). El gen ??34.5 de VHS codifica la proteína 34.5 de la célula infectada con el producto del gen (ICP34.5) que puede prevenir los efectos antivirales ejercidos por la PKR. La ICP34.5 tiene un mecanismo único de prevención de la actividad de PKR por la interactuación con la fosfatasa 1 de la proteína y redirigiendo su actividad para desfosforilar eIF-2a (He et al, 1997) . En las células infectadas con ya sea
el virus del tipo silvestre o el virus diseñado genéticamente del cual son delecionados los genes de ??34.5, el eIF-2a es fosforilado y la síntesis de la proteína ~es desactivada en las células infectadas con el virus menos ??34.5. Se podría esperar que el virus menos ??34.5 podría ser competente en la replicación en las células con una ruta de Ras activada en la cual la actividad de ICP34.5 podría ser redundante. El término "VHS mutado" o "VHS modificado" significa, cuando se utiliza aquí, que el producto o productos del gen que previenen la activación de PKR están faltando, están inhibidos o mutados de tal modo que la activación de PKR no esté bloqueada. Preferentemente, el gen ?l34.5 de VHS no es transcrito. Tal VHS mutado o modificado podría no ser capaz de replicarse en las células normales que no tienen una ruta de Ras activada, sin embargo, podría ser capaz de infectar y replicarse en las células que tienen una ruta de Ras activada. "Parapoxvirus orf" es un poxvirus. El mismo es un virus que induce las lesiones cutáneas agudas en diferentes especies de mamífero, incluyendo los seres humanos. El parapoxvirus orf infecta naturalmente a las ovejas, cabras y seres humanos a través de la piel rota o dañada, se replica en las células epidérmicas en regeneración e induce lesiones pustulares que se convierten en costras (Haig et al, 1998) . El parapoxvirus orf codifica el gen OV20.0L que está
involucrado en bloquear la actividad de PKR. El término "parapoxvirus orf mutado' "parapoxvirus orf modificado" significa, cuando se utilice aquí, que el producto o productos del gen que previenen la activación de PKR están faltando, están inhibidos o mutados, de tal modo que la activación de PKR no sea bloqueada. Preferentemente, el gen OV20.0L no es transcrito. Tal parapoxvirus mutado o modificado podría no ser capaz de replicarse en células normales que no tienen una ruta de Ras activada, sin embargo podría ser capaz de infectar y replicarse en células que tienen una ruta de Ras activada. "Virus de vaccinia" se refiere al virus del género ortopoxvirus que infecta a los seres humanos y produce lesiones localizadas (Brooks et al, 1998) . El virus de vaccinia codifica dos genes que desempeñan un papel en la regulación descendente de la actividad de PKR a través de dos mecanismos completamente diferentes. El gen E3L codifica dos proteínas de 20 y 25 kDa que son expresadas inicialmente en la infección y tienen una actividad de aglutinación de dsARN que puede inhibir la actividad de PKR. La deleción o alteración del gen E3L crea una replicación viral permisiva en las células que tienen una ruta de Ras activada. El gen K3L del virus de vaccinia codifica pK3, un pseudosubstrato de PKR. El término "virus de vaccinia mutado" o "virus de
vaccinia modificado" significa, cuando son utilizados aquí, que el producto o productos del gen que previenen la activación de PKR están faltando, están inhibidos o mutados de tal modo que la activación de PKR no sea bloqueada. Preferentemente, al gen E3L y/o el gen K3L no son transcritos. Tal virus de vaccinia mutado o modificado podría no ser capaz de replicarse en las células normales que no tienen una ruta de Ras activada, sin embargo, podría ser capaz de infectar y replicarse en las células que tienen una ruta de Ras activada. Un "virus sensible al interferón" es un virus el' cual no se replica en o extermina las células normales en la presencia del interferón. Una célula normal no es una célula la cual no sea neoplástica como se definió anteriormente. Para probar si un virus es sensible el interferón, un cultivo de células normales puede ser incubado con el virus en la presencia de concentraciones variables de interferón, y la tasa de supervivencia de las células es determinada de acuerdo con los métodos bien conocidos en el arte. Un virus es sensible al interferón si menos del 20%, preferentemente menos del 10%, de las células normales, es exterminado a una concentración elevada del interferón (por ejemplo 100 unidades por ml) . La "resistencia" de las células a la infección viral significa que la infección de las células con el virus
no conduce a una producción o rendimiento viral significativo . Un "oncolisado viral" es una composición preparada por el tratamiento de las células del tumor con un virus oncolítico in vitro, tal composición es administrada subsiguientemente a un paciente con el tumor con la misma clase de tumor para inducir la inmunidad en el paciente con el tumor contra este tumor. Como tal, los oncolisados virales son membranas celulares de cáncer modificadas esencialmente con el virus . Cuando se utilice aquí, un "receptor del trasplante" es un mamífero que recibe un trasplante de las composiciones celulares. Preferentemente el receptor es un ser humano, y- más preferentemente, el receptor es un ser humano- que está recibiendo el trasplante en el tratamiento del cáncer.
Método La presente invención se refiere al uso de un virus para remover selectivamente las células neoplásticas de las composiciones celulares mezcladas las cuales son sospechosas de contener las células neoplásticas. Se puede utilizar una variedad de virus en este método, cada uno de los cuales es selectivo para un neoplasma o un grupo de neoplasia. Aunque el reovirus es utilizado como un ejemplo posteriormente, una
persona de experiencia ordinaria en el arte puede seguir las instrucciones de aquí y aplicar el método para purificar cualquier composición celular mezclada utilizando los virus diferentes del reovirus.
1. Reovirus Se ha descubierto recientemente que el reovirus lisa selectivamente las células neoplásticas activadas con ras in vitro r in vivo y ex vivo (Coffey et al, 1998; WO 99/08692) . Normalmente, las células no son susceptibles a la infección con el reovirus. Sin embargo, si la ruta de ras es activada, el reovirus puede replicarse exitosamente en las células y eventualmente conduce a la lisis de las células huésped. Por ejemplo, cuando las células de NIH 3T3 resistentes al reovirus fueron transformadas con Ras o Sos activados, una proteína la cual activa Ras, la infección con el reovirus fue mejorada (Strong et al, 1998) . De manera semejante, los fibroblastos del ratón que son resistentes a la infección con el reovirus llegan a ser susceptibles después de la transfección con el gen receptor de EGF o el oncogen de v-erbB (Strong et al, 1993; Strong et al, 1996) . Sin que esté limitado a una teoría, parece que la replicación del reovirus es regulada al nivel traduccional (Strong et al, 1998; Norman et al, 2000) . En las células NIH 3T3 no transformadas, los transcritos virales iniciales
activan la proteína cinasa (PKR) activada con el ARN de doble hebra, la cual inhibe la traducción, por lo cual inhibe la replicación viral. El ras activado (o un elemento activado de la ruta de ras) presumiblemente inhibe o invierte la activación con PKR. Por lo tanto, la síntesis de proteína viral procede, las partículas virales son hechas, y las células son usadas eventualmente. El oncogen de ras tiene importancia para un gran número de tumores. La activación de las mutaciones del gen ras ocurren por sí mismas en aproximadamente 30% de todos los tumores humanos (Bos, J.L., 1989), principalmente en los carcinomas pancreáticos (90%), colorectal esporádico (50%) y del pulmón (40%) , y la leucemia mieloide (30%) . La activación de los factores arriba o abajo de ras en la ruta de ras también está asociada con los tumores. Por ejemplo, la sobreexpresión de HER2/?eu/ErbB2 o el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF) es común en el cáncer del pecho' (25-30%) , y la sobreexpresión del receptor del factor de crecimiento derivado de los plaquetas (PDGF) o receptor de EGF es prevaleciente en los gliomas y glioblastomas (40-50%) . El receptor EGF y el receptor PDGF ambos se sabe que activan ras durante la aglutinación a su ligando respectivo, y v-erbB codifica un receptor activado constitutivamente que carece del dominio extracelular. Primero se determinó la capacidad del reovirus para
exterminar las células cancerosas. El reovirus provocó eficientemente la oncólisis de tres sistemas de modelo del cáncer del pecho, MCF7, SKBR3 y HTB 132, induciendo la apoptosis en las células infectadas (Ejemplo 1) . Por consiguiente, el tratamiento con el reovirus condujo a una reducción marcada en la viabilidad de las células MCF7, SKBR3 y HTB 132, mientras que los controles tratados sin el virus o con el virus muerte crecieron normalmente (Figuras 1A-1D) . La reducción en la viabilidad estuvo acompañada por características las cuales están asociadas con la apoptosis, tales como la fragmentación del ADN, la positividad con el teñido con annexin V o APO 2.7 (Figuras 2A-2G) y efectos citopáticos, tales como el ampollado de la membrana celular, la condensación nuclear y la condensación de cromatina observada bajo el microscopio. Puesto que la infección por el reovirus está bloqueada usualmente al nivel traduccional en las células' normales pero no en las células neoplásticas mediadas por ras, se examinó el grado síntesis de la proteína en las células MCF7 tratadas con el reovirus y las células madre CD34+ (Ejemplo 2) . Realmente, las proteínas virales fueron sintetizadas en la línea celular del cáncer infectada con el reovirus, pero no en las células madre CD34+ las cuales también fueron tratadas con el reovirus (datos no mostrados) . Este resultado sugiere que será seguro tratar las células
madre hematopoyéticas con el reovirus, puesto que las proteínas reovirales no fueron sintetizadas en las células madre tratadas con el reovirus y la síntesis de la proteína celular procedió normalmente. Para confirmar este punto, la viabilidad de las células CD34+ tratadas con el reovirus se determinó en varios puntos del tiempo después del tratamiento con el reovirus (Ejemplo 3) . Los números de células en las poblaciones tratadas con el reovirus vivo o sin el virus, fueron semejantes después de cada instante del tiempo (Figura 3A) , indicando que las células CD34+ no son susceptibles a la infección con el reovirus . Para que el reovirus sea útil en la purificación de las células madre hematopoyéticas en tratamientos de quimioterapia de dosis elevadas, es esencial que el tratamiento con el reovirus no altere la capacidad de las células madre para diferenciarse en cada una y en cada linaje hematopoyético para reconstituir el sistema hematopoyético' completo. Por lo tanto, el efecto a largo plazo del tratamiento con el reovirus fue evaluado (Ejemplo 3) . Las células CD34+ tratadas ya sea sin el virus o con el virus vivo no mostraron esencialmente ninguna diferencia en su capacidad para diferenciarse en granulocitos, eritroides, o megacariocitos del macrófago eritroide del granulocito aún después de 72 horas de tratamiento con el reovirus (Figura 3B) . La relación entre estos tres linajes también permaneció
idéntico después de este tratamiento prolongado. En consecuencia, el tratamiento con el reovirus ni exterminó las células CD34+ ni cambió el potencial de ellas para reconstituir el sistema hematopoyético. Además, el reovirus es capaz de purificar una composición celular mezclada, como se demuestra por el exterminio selectivo de las células MCF7, SKBR3 o HTB 132 en una mezcla de células cancerosas y el producto de aféresis el cual contuvo las células madre CD34+ (Ejemplo 4) . Por la medición de CD34 y la citoqueratina, un marcador específico para las células epiteliales tales como MCF7, SKBR3 o HTB
132, se mostró que el reovirus eliminó esencialmente las células del cáncer de la composición celular mezclada
(Figuras 4A-4C) mientras que se dejan las células madre intactas. Por lo tanto, el tratamiento con el reovirus es un método eficiente para retirar las células neoplásticas de las composición de la célula madre hematopoyética. En consecuencia, en una modalidad de esta invención, los autoinjertos que contienen la célula madre, son tratados con el reovirus previo al trasplante para remover las células neoplásticas activadas con ras contaminantes o espontáneas . Esto incrementa la eficacia del tratamiento del trasplante de la célula madre hematopoyética autóloga/quimioterapía de dosis elevadas. Será de interés particular el tratamiento de la enfermedad de Hodgkin,
mieloma múltiple, linfoma "No. de Hodgkin", leucemia mielogenosa aguda, cánceres de las células germinales (testiculares), .tumores del cerebro, y tumores del pecho, puesto que la quimioterapia de dosis elevadas y el trasplante de células madre autólogas ha sido efectuada eficientemente en pacientes con estos tumores. Sin embargo, se contempla que el presente método será útil en otros cánceres así como para remover cualesquiera células neoplásticas mediadas por ras, puesto que la activación de la ruta de ras puede ocurrir en cualquier tipo de célula o tejido. Las células madre progenitoras hematopoyéticas pueden ser obtenidas de la médula ósea del paciente previo al tratamiento. Alternativamente, en un paciente con cáncer quien ha estado recibiendo la quimioterapia de dosis no elevadas, tradicional, muchas células madre típicamente aparecen en la sangre periférica con o sin una preparación del factor estimulante de las colonias. Por lo tanto, la célula madre progenitora hematopoyética puede ser obtenida de la sangre como el producto de aféresis, el cual puede ser almacenado durante un período de tiempo prolongado antes de ser trasplantado. La presente invención puede ser aplicada a los autoinjertos que contienen las células madre las cuales fueron colectadas de cualquier fuente del tejido, incluyendo la médula ósea y la sangre. Además de las células madre hematopoyéticas, la
presente invención puede ser aplicada ampliamente para remover las células neoplásticas activadas con ras de muchas otras composiciones celulares. Por ejemplo,~el reovirus puede ser utilizado como una práctica de rutina para "limpiar" (remover las células neoplásticas activadas con ras de) cualquier tejido o trasplante de órgano. La aplicación de la presente invención no está limitada por el tipo de célula o tejido a causa de que como se describió anteriormente, el receptor para el reovirus es ubicuo, y el mecanismo en las células normales para inhibir la replicación del reovirus, PKR, también es ubicuo. Por lo tanto, cualquier célula puede llegar a ser una célula neoplástica activada con ras y llega a ser susceptible a la infección con el reovirus. Será de interés particular el uso de los métodos reivindicados para limpiar la sangre entera o cualquier porción de la misma para una transfusión subsiguiente. De manera semejante, el trasplante de un tejido u órgano ha llegado a ser crecientemente común, y será benéfico si el trasplante puede ser tratado para remover las células neoplásticas activadas con ras antes del trasplante. Las células del hígado, riñon, corazón, córnea, injerto de la piel, del islote pancreático, la médula ósea o cualesquiera porciones de las mismas, son sólo algunos ejemplos de los tejidos u órganos a los cuales esta invención puede ser aplicada. El tejido u órgano puede ser autólogo, alogenéico o
xenogenéico. El tejido u órgano también puede ser derivado de un animal transgénico, de un tejido/órgano el cual el desarrollado in vitro de las células maclre, o puede ser expandido ex vivo. El tejido u órgano que va a ser tratado con el reovirus puede ser de un origen embriónico o de adulto. Por ejemplo, las células neuronales embriónicas pueden ser tratadas antes ' que sean trasplantadas en un paciente con la enfermedad de Alzheimer. De manera semejante, la invención puede ser utilizada para tratar el semen o los huevos del donador ex vivo. La aplicación de la presente invención no está limitada a los trasplantes. En lugar de esto, cualesquiera composiciones celulares pueden ser "limpiadas" con el reovirus para cualquier propósito. Por consiguiente, todos los ejemplos descritos anteriormente son aplicables aún si el tejido u órgano no está propuesto para el trasplante. Las líneas celulares también pueden ser tratadas dé la manera acostumbrada para protegerlas contra las células neoplásticas activadas con ras espontáneas o contaminantes . Nuevamente, cualquier línea celular será un buen candidato para este método, excepto, por supuesto, una línea celular transformada por medio de la activación de la ruta de ras. Recientemente, muchos laboratorios han estado intentando establecer seriamente xenoinjertos trasplantables del tejido de cáncer de la próstata humana inoculados en
ratones inmuno-comprometidos. Sin embargo, la contaminación con las células del cáncer del ratón frecuentemente ocurre durante el paso en serie de los xenoinjertos y estas células pueden pasar eventualmente a las células humanas del cáncer de la próstata (Gao et al, 1999) . La presente invención será una solución simple a este problema- si el cáncer contaminante está mediado por ras y el xenoinjerto no lo está. La presente invención- es distinta de un método de preparación de los oncolisados virales. Las células del tumor son frecuentemente inductores pobres de la respuesta inmune y pueden escapar así al ataque del sistema inmune. Los oncolisados virales, esencialmente las membranas de la célula del tumor modificadas con el virus, son utilizadas en un método para mejorar la inmunogenicidad de las células del tumor. Para preparar los oncolisados virales, las células del tumor son removidas de un sujeto que lleva el tumor, e infectadas con un virus el cual lisa las células del tumor.' La substancia resultante es administrada entonces a un sujeto que lleva el tumor, y la inmunidad es inducida frecuentemente contra las células del tumor no infectadas. El mecanismo por el cual la infección con el virus de las células del tumor induce una inmunidad para las células del tumor no infectadas, es desconocido, pero la xenogenización con el virus de las células del tumor puede estar involucrada (Steele, 2000) .
Los oncolisados del melanoma infectado con el virus de influenza, carcinoma vulvar y carcinoma de los ovarios, así como los oncolisados del carcinoma del colon infectados con el virus de la enfermedad de Newcastle y los oncolisados del virus de vaccinia, todos han sido utilizados contra varios tumores. Por ejemplo, un paciente con melanoma recibió oncolisados después de la escisión por cirugía del tumor. El oncolisado viral fue administrado por semana a la semana 4, cada dos semanas hasta la semana 52, cada 3 semanas hasta la semana 120, y cada seis semanas hasta la semana 160. En otro caso clínico, el programa de administración del oncolisado de NDV autólogo contra el cáncer colorectal fue iniciado 2 semanas después de la cirugía y se repitió 5 veces a intervalos de 2 semanas, seguido por un refuerzo 3 meses más tarde (?emunaitis, 1999) . Los estudios mostraron una respuesta clínica en algunos pacientes o la generación de una inmunidad activa contra los antígenos del tumor (Steele,' 2000) . La presente invención es distinta de los oncolisados virales en que no están relacionados con las células del tumor modificadas con el virus. En contraste con los oncolisados virales, las células neoplásticas lisadas pueden ser, y preferentemente son, removidas de la composición celular tratada con el virus sin afectar la eficacia de la presente invención. Además, los oncolisados
virales son preparados utilizando la mayoría de las células del tumor, mientras que la composición celular mezclada en la presente invención contiene preferentemente menos del 60% de células neoplásticas, más preferentemente menos del 40%, todavía más preferentemente menos del 20%, y aún más preferentemente menos del 10% "de células neoplásticas.
2. Otros virus los cuales exterminan selectivamente las células neoplásticas activadas con ras Normalmente, cuando el virus se introduce a una célula, la ARN Cinasa (PKR) de doble hebra es activada y bloquea la síntesis de la proteína, y el virus no puede replicarse en esta célula. Algunos virus han desarrollado un sistema para inhibir la PKR y facilitar la síntesis de proteína viral así como la replicación viral. Por ejemplo, el adenovirus fabrica una gran cantidad de ARN pequeño, ARN de
VAI. El ARN de VAI tiene estructuras secundarias extensas y se aglutina a PKR competición con el ARN de doble hebra
(dsAR?) el cual normalmente activa la PKR. Puesto que se requiere una longitud mínima de dsPKR, el ARN de VAI no activa la PKR. En lugar de esto, el mismo captura la PKR en virtud de su gran cantidad. En consecuencia, la síntesis de proteína no es bloqueada y el adenovirus puede replicarse en la célula. El virus de vaccinia codifica dos productos del
gen, K3L y EL3, los cuales regulan descendentemente la PKR con diferentes mecanismos. El producto del gen de K3L tiene homología limitada con la región N-terminal de eIF-2 , el substrato natural de PKR, y puede actuar como un pseudosubstrato para PKR. El producto del gen E3L es una proteína de aglutinación de dsARN y aparentemente funciona capturando los dsARNs del activador. De manera semejante, el gen y?34.5 del virus del herpes simple (VHS) codifica la proteína 34.5 de la célula infectada con el producto del gen (ICP34.5) que puede prevenir los efectos antivirales ejercidos por la PKR. El' virus de parapoxvirus orf codifica el gen OV20.0L que está involucrado en el bloqueo de la actividad de PKR. Por consiguiente, estos virus pueden infectar exitosamente las células sin que sean inhibidas por PKR. Como se describió anteriormente, las células neoplásticas activadas con ras, no están sujetas a lá inhibición de la síntesis de la proteína por PKR, a causa de que ras inactiva la PKR. Estas células por lo tanto son susceptibles a infección viral aún si el virus no tiene un sistema inhibidor de PKR. En consecuencia, si los inhibidores de PKR en el adenovirus, virus de vaccinia, virus del herpes simple o virus paraporxvirus orf son mutados para no bloquear la función de PKR de ninguna manera, los virus resultantes no infectan las células normales debido a la inhibición de la
síntesis de la proteíná por PKR, pero los mismos se replican en las células neoplásticas activadas con ras las cuales carecen de actividades de PKR. En consecuencia, la presente invención proporciona un método para remover las células neoplásticas activadas con ras de una composición celular mezclada utilizando el adenovirus, virus de vaccinia, virus del herpes simple o virus del parapoxvirus ofr el cual está modificado o mutado de tal modo que el mismo no inhiba la función de PKR. El virus modificado o mutado se replica selectivamente en las células neoplásticas activadas con ras mientras que las células normales son resistentes. Preferentemente el adenovirus es mutado en la región VAI, el virus de vaccinia es mutado en la región K3L y/o E3L, el virus del herpes simple es mutado en el gen ??34.5, y el virus del parapoxvirus ofr es mutado en el gen OV20.0L en esta modalidad. Los virus pueden ser modificados o mutados de' acuerdo con la región de la función estructural conocida de los inhibidores de PKR virales. Por ejemplo, puesto que la región amino terminal de la proteína E3 interacciona con el dominio de la región carboxi-terminal de PKR, la deleción o mutación puntual de este dominio previene la función anti-PKR
(Chang et al, 1992, 1993, 1995; Sharp et al, 1998; Romano et al, 1998) . El gen K3L del virus de vaccinia codifica pK3, un pseudosubstrato de PKR. Existe una pérdida de función de la
mutación dentro de K3L. Ya sea cortando o colocando mutaciones puntuales dentro de la porción C-terminal de la proteína K3L, .homologas con respecto a los residuos 79 a 83 en eIF-2a se anula la actividad inhibidora de PKR (Kawagishi-Kobayashi et al, 1997) .
3. Virus que llevan los genes supresores del tumor o los genes relacionados con el supresor del tumor En otro aspecto de esta invención, el virus extermina selectivamente las células neoplásticas llevando un gen supresor del tumor. Por ejemplo, p53 es un supresor del tumor celular el cual inhibe la proliferación no controlada de las células normales. Sin embargo, la mitad aproximada de todos los tumores tienen un p53 dañado o alterado funcionalmente y prolifera de una manera no controlada. Por lo tanto, un virus que expresa el gen p53 del tipo silvestre puede exterminar selectivamente las células neoplásticas qué llegan a ser neoplásticas debido a la inactivación del producto del gen p53. Tal virus ha sido construido y se ha mostrado que induce la apoptosis en las células del cáncer que expresan el p53 mutante (Blagosklonny et al, 1996) . Un enfoque semejante involucra inhibidores virales de los supresores de tumores. Por ejemplo, ciertos adenovirus, SV40 y el virus del papiloma humano incluyen proteínas las cuales inactivan p53, por lo cual permiten su
propia replicación (Ne unaitis 1999) . Para el serotipo 5 del adenovirus, esta proteína es una proteína de 55 Kd codificada por la región E1B. Si la región E1B. "que codifica esta proteína de 55 kd es delecionada, como en el virus de ONYX-015 (Bischoff et al, 1996; Heise et al, 2000; WO 94/18992), el inhibidor p53 -de 55 kd ya no está presente. Como resultado, cuando O YX-015 se introduce a una célula normal, p53 funciona para suprimir la proliferación celular así como la replicación viral, la cual está basada en la maquinaria proliferativa celular. Por lo tanto, ONYX-015 no se replica en las células normales. Por otra parte, en las células neoplásticas con la función p53 alterada, O?YX-015 puede replicarse y eventualmente provocar que la célula muera. En consecuencia, este virus puede ser utilizado para infectar y remover selectivamente las células neoplásticas deficientes en p53 de una composición celular mezclada. Una persona de experiencia ordinaria en el arte también puede mutar y alterar el gen inhibidor p53 en el adenovirus 5 u otros virus de acuerdo con las técnicas establecidas, y los virus resultantes son útiles en el presente método para remover las células neoplásticas de las composiciones celulares mezcladas. Otro ejemplo es el virus Delta 24 el cual es un adenovirus mutante que lleva una deleción de 24 pares base en la región ElA (Fueyo et al, 2000) . Esta región es responsable
de la aglutinación al supresor Rb del tumor celular y de la inhibición de la función de Rb, por lo cual permite que la maquinaria proliferativa celular, y por~ consiguiente la replicación del virus, proceda de una manera no controlada. Delta24 tiene una deleción en la región de aglutinación de Rb y no se aglutina a Rb. Por lo tanto, la replicación del virus mutante es inhibida por Rb en una célula normal. Sin embargo, si Rb es inactivado y la célula llega a ser neoplástica, Delta24 ya no es inhibida. En lugar de esto, el virus mutante se replica eficientemente y lisa la célula deficiente en Rb. Nuevamente, este virus es selectivo para las células' neoplásticas y puede ser utilizado para purgar las composiciones celulares mezcladas y remover las células deficientes en Rb.
4. Otros virus El virus de estomatitis vesicular (VSV) extermina selectivamente las células neoplásticas en la presencia de interferón. Los interferones son factores de circulación que se aglutinan a los receptores de la superficie de la célula lo cual por último conduce tanto a una respuesta antiviral como a una inducción de las señales apoptóticas y/o inhibidoras del crecimiento en las células de objetivo. Aunque los interferones pueden ser utilizados teóricamente para inhibir la proliferación de las células del tumor, este
intento no ha sido muy exitoso a causa de las mutaciones específicas para el tumor de los elementos de la ruta del interferón. ~~ Sin embargo, alterando la ruta del interferón para evitar la inhibición del crecimiento ejercida por el interferón, las células del tumor pueden comprometer simultáneamente su respuesta antiviral. Realmente, se ha mostrado que el VSV, un virus de ARN de sentido negativo, envuelto, se replicó rápidamente en, y exterminó una variedad de líneas celulares del tumor, humanas, en la presencia del interferón, mientras que los cultivos de células primarias humanas normales fueron protegidos aparentemente por el interferón. Una inyección intratumoral del VSV también redujo la carga del tumor de los ratones desnudos que llevan xenoinjertos de melanoma humano subcutáneos (Stojdl et al, 2000) . En consecuencia, en otra modalidad de la presente invención, el VSV es utilizado para remover las células neoplásticas de una composición celular mezclada en la presencia del interferón. Además, se contempla que este aspecto de la invención sea aplicado a cualquier otro virus sensible al interferón (WO 99/18799) , especialmente un virus el cual no se replica en una célula normal en la presencia de interferones. Tal virus puede ser identificado por el crecimiento en un cultivo de las células normales, poniendo
el contacto el cultivo con el virus de interés en la presencia de concentraciones variables de interferones, luego determinar el porcentaje de exterminio de las células después de un período de incubación. Preferentemente, menos de 20% de las células normales es exterminado y más preferentemente, menos del 10% es exterminado. También es posible aprovechar la ventaja del hecho de que algunas células neoplásticas expresan niveles elevados de una enzima y construyen un virus el cual es dependiente de esta enzima. Por ejemplo, la reductasa del ribonucleótido es abundante en la metástasis del hígado pero escasa en el hígado normal. Por lo tanto, un mutante del virus 1 del herpes simple (VHS-1) el cual es defectuoso en la expresión de la reductasa del ribonucleótido, hrR3, se mostró que se replica en las células del carcinoma del colon pero no en las células del hígado normales (Yoon et al, 2000) . Además de los virus descritos anteriormente, una variedad de otros virus han estado asociados con el exterminio de los tumores, aunque el mecanismo implícito no siempre está claro. El virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) se replica preferentemente en las células malignas, y la cepa utilizada más comúnmente es 73-T (Reichard et al, 1992; Zorn et al, 1994; Bar-Eli et al, 1996) . Las actividades antitumor clínicas en donde el VD reduce la carga del tumor después de la inoculación intratumor también fueron observadas en una
variedad de tumores, incluyenco el cáncer cervical, colorectal, del páncreas, gástrico, melanoma y renal (WO 94/25627; Nemunaitis, 1999) . Por lo tanto, el NDV puede ser utilizado para remover las células neoplásticas de una composición celular mezclada. Además, el virus de vaccinia se propagó en varias líneas de las células del tumor maligno. El virus de encefalitis se mostró que tiene un efecto oncolítico en un tumor de sarcoma de ratón, pero la atenuación puede ser requerida para reducir su capacidad de infección en las células normales. La regresión del tumor ha sido descrita en los pacientes con tumores infectados con herpes zoster, virus de hepatitis, influenza, varicela, y virus del sarampión
(para una r-evisión, véase Nemunaitis, 1999) . De acuerdo con los métofdos descritos aquí y las técnicas bien conocidas en el arte, un artesano experto puede probar la capacidad de estos y otros virus para exterminar selectivamente las células neoplásticas para decidir cual virus puede ser utilizado para remover las células neoplásticas de una composición celular mezclada de interés.
4. Remoción de los virus después del tratamiento del virus Aunque el virus utilizado en la presente invención no se replica en las células normales, se puede desear remover el virus previo al uso de la composición celular
tratada con el virus. Por ejemplo, el reovirus no está asociado con cualquier enfermedad conocida, pero puede ser más infeccioso para los pacientes con cáncer cuyos sistemas inmunes fueron debilitados debido a la quimioterapia. Por lo tanto, si el reovirus es utilizado para tratar una composición que comprende las células madre hematopoyéticas las cuales subsiguientemente serán trasplantadas a un paciente con cáncer, el reovirus puede ser removido previo al trasplante de la composición celular. En consecuencia, en otra modalidad de esta invención, las composiciones celulares que han sido tratadas con un virus son congeladas en una solución que contiene DMSO y descongeladas previo al trasplante. Aunque el DMSO habitualmente es utilizado para congelar y almacenar células 'animales1, el mismo desnaturaliza los virus, por lo cual remueve el virus infeccioso de la preparación de la célula madre. Esto reduce el riesgo de que el virus pueda provocar infecciones indeseables cuando el mismo es introducido en el receptor . del trasplante por medio del trasplante de las células madre. En otra' modalidad, las composiciones de las células tratadas con el virus, son tratadas con anticuerpos específicos contra el virus particular o una combinación de los anticuerpos y complementos específicos para inactivar o lisar el virus. Alternativa o adicionalmente, los anticuerpos
específicos que reconocen una molécula sobré la superficie del virus particular pueden ser utilizados para remover las partículas del virus de la composición celular tratada con el virus. Por consiguiente, los anticuerpos son inmovilizados o fijados a una columna, perlas o cualquier otro material o dispositivo conocido en el arte, la composición celular es aplicada a los anticuerpos inmovilizados, y la parte de la composición la cual no se aglutina a los anticuerpos es colectada de acuerdo con un procedimiento adecuado para el método particular de inmovilización. Otro método el cual puede ser utilizado para remover el virus de la mezcla tratada con el virus es someter la mezcla a un gradiente el cual separa las células del virus, y colectar la capa que contiene solamente las células. ' f En otra modalidad, al receptor del trasplante se le proporcionan tratamientos para estimular el sistema inmune para reducir el riesgo de infección por el virus. Este tratamiento puede ser efectuado previo a, contemporáneamente con, o después del trasplante, pero preferentemente es efectuado previo al trasplante. Como un tratamiento alternativo p en ' conjunción con el estimulante del sistema inmune, al receptor se le pueden dar anticuerpos específicos contra el virus particular para reducir el riesgo de la infección del virus.
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Composición La presente invención proporciona una composición la cual es preparada sometiendo una composición celular mezclada al tratamiento con el virus en donde el virus conduce al exterminio substancial de las células neoplásticas contenidas en esta composición celular. Esta composición no es un oncolisado viral. Un oncolisado viral es la composición que resulta de la oncólisis de las células del tumor por un virus, que contiene las membranas de la célula del tumor modificadas con el virus del componente activo. En la presente invención, por el contrario, los componentes activos en una composición, celular tratada con el virus son las células neoplásticas supervivientes .
I I ;'Kit Todos los virus descritos anteriormente pueden ser utilizados para purgar las composiciones celulares mezcladas las cuales pueden contener células neoplásticas. Si se desea, se puede determinar primero, cual virus o cuales virus pueden ser utilizados para purificar la composición celular particular. -Por ' ejemplo, cuando la composición celular mezclada comprende células madre hematopoyéticas obtenidas de un paciente con cáncer, una biopsia del cáncer puede ser colectada previo a, y probada con virus diferentes para determinar cual virus puede exterminar eficientemente las
células del cáncer. El virus puede ser utilizado entonces para purificar. las células madre hematopoyéticas. Alternativamente, la composición celular mezclada puede ser tratada^, con un cóctel de virus sin determinar primero la eficacia de cada virus. En consecuencia, esta invención proporciona un kit que comprende un grupo de virus con especificidades diferentes o superpuestas. Por ejemplo, el kit puede contener el reovirus para las células neoplásticas activadas con ras, un virus que expresa p53 para las células neoplásticas deficientes en p53, Delta24 para células neoplásticas deficientes en Rb, Onyx-015 para células neoplásticas deficientes en' p53, virus de estomatitis vesicular para las células neoplásticas resistentes a interferón, .o subconjuntos de las mismas. : f Los siguientes ejemplos son ofrecidos para ilustrar esta invención y no están propuestos de ninguna manera como limitativos del alcance de la presente invención.
Ejemplos En los ejemplos posteriores, las siguientes abreviaturas r. tienen los siguientes significados. Las abreviaturas no definidas tienen sus significados aceptados generalmente .
°C = grados Celsius
h = hora min = minuto µM = micromolar mM = .milimolar M = molar ml = mililitro µl = microlitro mg = miligramo µg = microgramo PAGE = electrofóresis en gel de poliacrilamida rpm = revoluciones por minuto FBS = suero de bovino fetal DTT = ditiotreitol SDS ,. = dodecil sulfato de sodio !' PBS = solución salada amortiguada con fosfato
DMEM = medio de Eagle modificado de Dulbecco a-MEM = medio de Eagle a-modificado ß-ME = ß-mercaptoetanol MOI = multiplicidad de infecciones PFU = unidades formadoras de placa PKR . = ' proteína cinasa activada por el ARN de doble hebra EGF = factor de crecimiento epidérmico PDGF = factor del crecimiento derivado de las plaquetas
DMSO = sulfóxido de dimetilo CPE = efecto citopático __ GCSF = . factor estimulante de las colonias de _ granulocitos
Ejemplo 1 Oncólisis inducida por el reovirus y apoptosis en las células del cáncer del pecho Para determinar el efecto del reovirus sobre la viabilidad de las células neoplásticas, primero se usaron tres sistemas modelo del cáncer del pecho,- MCF7 (ATCC numero
HTB-22), SKBR3 (ATCC número HTB-30) y MDA MB 468 (ATCC número
HTB 132) . Las células de cada línea celular se hicieron crecer a una confluencia de 50-60% y se infectaron con el serotipo 3 .del reovirus, cepa Dearing, en una multiplicidad f 'de sitios de infección de 40. El reovirus fue obtenido y mantenido como se describe en la Patente U.S. No. 6,136,307.
Las células infectadas y no infectadas del reovirus fueron colectadas a las 0, 24, 48 y 72 horas después de la infección y la viabilidad fue determinada. Los resultados son mostrados en las Figuras 1A-1D.
El conteo de las células viables en las células MCF7 infectadas con el reovirus (Figura ÍA) , SKBR3 (Figura IB) o MDA MB 468 (Figura 1C) se. redujo significativamente después de la infección, mientras que las células infectadas con el virus muerto o sin el virus proliferaron como se esperaba. El
tratamiento con el reovirus provocó que la viabilidad de MCF7
(Figura ID) y SKBR3 se redujera desde 93% hasta 16% a las 72 horas después de la infección. En las células MDA MB 468, los números de células intactas tratadas con el virus se redujeron a 12.7%, 8.8% y 3.6% de los conteos de las células originales, respectivamente, a las 24, 48 y 72 horas después de la infección. Así, el reovirus provocó la oncólisis eficientemente en la totalidad de las tres clases de células cancerosas. Las células murieron por apoptosis. Los marcadores apoptóticos típicos tales como CPE, Annexin V y el escalónala!ento del ADN pudieron ser observados en un curso del tiempo paralelo a la reducción de la viabilidad. Las
Figuras 2A-2G muestran el porcentaje de fragmentación del ADN f 2A-2C),' el teñido con Annexin V (2D) o las células AP02.7
(2E-2G) en varios puntos del tiempo después de la infección con el reovirus . Las células tratadas con el reovirus exhibieron todas las señales de apoptosis a un nivel dramático comparado con los controles del virus muerto o sin virus, demostrando que el reovirus indujo la apoptosis en la totalidad detestas tres líneas celulares. La apoptosis en los controles parece que se incrementa lentamente también con el tiempo, probablemente a causa de que empezaron a morir cuando las mismas han crecido muy densamente.
Ejemplo 2 El reovirus inhibió selectivamente la síntesis de la proteina en las células- del cáncer pero no en las células madre CD34+ Para probar adicionalmente la infección viral selectiva de las células del cáncer, se llevó a cabo la etiquetación con 35S/SDS/PAGE de las proteínas virales. La síntesis de las proteínas virales fue evidente después de 1-2 días en las células de MCF7 infectadas con el reovirus, mientras que la síntesis de la proteína celular se redujo al mismo tiempo, indicando que el reovirus ha tomado el mando de la maquinaria celular. A los 4 días después de la infección, ninguna síntesis de la proteína podría ser detectada más, sugiriendo que todas las células han sido exterminadas. En los experimentos de control en donde las células fueron infectadías con el reovirus muerto o sin el virus, no existió la síntesis de la proteína viral, mientras que la síntesis de la proteína celular estuvo en el nivel normal . Por el contrario, la etiquetación con 35S de las células madre CD344 en la presencia o ausencia del reovirus no mostró la síntesis de la proteína viral hasta 72 horas después de la adición del virus. Por lo tanto, el reovirus infecta selectivamente a las células MCF7 pero no a las células madre CD34+.
Ejemplo 3 El tratamiento con el reovirus no inhibió la proliferación celular ni alteró la diferenciación potencial de las células CD34+ De manera consistente con los resultados de la síntesis de proteínas, el conteo de células viables indicó que el tratamiento con el reovirus no redujo el número de células viables en las células CD34+ (Figura 3A) cuando se compara con el control sin el virus. Aunque el número de células CD34+ no fue afectado por la infección del reovirus, subsiste la cuestión de que si el reovirus cambió el potencial de las células madre CD34+ para diferenciarse en todos los linajes hematopoyéticos en la proporción apropiada. Si este fue el caso, las células madre tratadas con el reovirus podrían no ser un buen candidato para la reconstitución del sistema hematopoyético completo. Para investigar esta posibilidad, las células CD34+ fueron incubadas con el reovirus durante 2, 24, 48 o 72 horas, respectivamente. El reovirus fue removido entonces y las células fueron diluidas y cultivadas en un medio fresco durante 14 días para dejar que se formen las colonias. Cada colonia fue examinada para determinar si la misma pertenece a los linajes de granulocitos, eritroides, o agacariocitos del macrófago eritroide del granulocito. Como se muestra en la Figura 3B, las células madre tratadas con el virus vivo (LV) produjeron número semejantes de granulocitos (G) , eritrocitos
(E) o megacariocitos del macrófago eritroide del granulocito (GEMM) como el control sin el virus (NV) . .Por lo tanto, el tratamiento con el reovirus no cambió el potencial de diferenciación de las células CD34+.
Ejemplo 4 El reovirus removió selectivamente las células del cáncer de una composición celular mezclada Las células neoplásticas fueron mezcladas con el producto de aféresis y se sometieron a la infección con el reovirus para investigar si el reovirus puede remover selectivamente las células neoplásticas de la composición celular mezclada. El producto de aféresis fue preparado de acuerdo con un procedimiento descrito previamente (Stewart et al, 1999; (Duggan et al, 2000) . Cuando las mezclas del producto-í de aféresis (90%) y MCF7 (10%) fueron tratadas con el reovirus y probadas diariamente para el conteo celular y la viabilidad, existió una disminución de 100 veces en los números de las células de MCF7 positivas a la citoqueratina mientras que las células madre CD34+ permanecieron intactas y viables. Las figuras 4A-4C muestran el efecto de limpieza del reovirus con .respecto a las mezclas del producto de aféresis con las células MCF7, SKBR3 o MDA MB 468. Estos resultados demuestran que el reovirus puede exterminar selectivamente las células neoplásticas en una mezcla de células y dejar intactas a las células madre.
Se hace constar que con relación a esta fecha el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.
Claims (25)
- REGVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones . 1. Un método para remover selectivamente las células neoplásticas de una composición celular mezclada en donde la composición está localizada fuera de un organismo viviente, el método está caracterizado porque comprende los pasos de: (a) poner en contacto la composición celular mezclada con un virus bajo condiciones que conducen al exterminio substancial de las células neoplásticas para que sean removidas selectivamente las células neoplásticas de la composición; y f -' (b)' colectar la composición celular tratada.
- 2. El método de la Reivindicación 1, caracterizado porque la composición celular mezclada comprende células madre hematopoyéticas .
- 3. El método de la Reivindicación 2, caracterizado porque las células madre hematopoyéticas han sido colectadas dé la médula ósea.
- 4. El método de la Reivindicación 2, caracterizado porque las células madre hematopoyéticas han sido colectadas de la sangre.
- 5. El método de la Reivindicación 1, caracterizado porque la composición celular comprende un tejido, un órgano o cualquier porción de _un tejido o un órgano .
- 6. El método de la Reivindicación 5, caracterizado porque el tejido u órgano se selecciona del grupo que consiste del hígado, riñon, corazón, córnea, piel, pulmón, células del islote pancreático, y sangre entera.
- 7. El método de la Reivindicación 5, caracterizado porque el tejido, órgano o porción del tejido u órgano es útil para el trasplante.
- 8. El método de la Reivindicación 1, caracterizado porque la composición celular comprende células cultivadas, semen o huevos.
- 9.. El método • de la Reivindicación 1, i -caracterizado porque el virus es un virus competente en la replicación.
- 10. El método de la Reivindicación 1, caracterizado porque el virus no es un reovirus.
- 11. El método de la Reivindicación 1, caracterizado porque el virus es seleccionado del grupo que consiste del. ade?ovirus, virus del herpes simple, virus de vaccinia y parapoxvirus orf.
- 12. El método. de la Reivindicación 11, caracterizado porque el virus es mutado o modificado de tal modo que el virus no produzca un producto del gen el cual inhiba la ARN cinasa de doble hebra (PKR) .
- 13. El método de la Reivindicación 11, caracterizado porque el adenovirus ha sido mutado en la región ElA de tal modo que el producto del gen ElA resultante no se aglutine a Rb.
- 14. El método de la Reivindicación 11, caracterizado porque el adenovirus ha sido mutado en la región ElB de tal modo que el producto del gen ElB resultante no se aglutine a p53.
- 15. El método de la Reivindicación 11, caracterizado porque el adenovirus es capaz de expresar una proteína p53 del tipo silvestre.
- 16. El método de la Reivindicación 1, caracterizado porque además comprende agregar interferón a la I composición celular mezclada.
- 17. El método de la reivindicación 16, caracterizado porque el interferón es agregado previo a, o simultáneamente con, el virus .
- 18. El método de la Reivindicación 16, caracterizado porque el virus es un virus sensible al interferón.
- 19. El método de la Reivindicación 18, caracterizado porque el virus es el virus de la estomatitis vesicular (VSV) .
- 20. El método de la Reivindicación 1, caracterizado porque el virus no es el virus de la Enfermedad de Newcastle (NDV) .
- 21. El método de la Reivindicación 1, caracterizado porque además comprende el paso de remover el virus de la composición celular tratada con el virus.
- 22. El método de la Reivindicación 1, caracterizado porque además comprende el paso de almacenar la composición celular tratada con el virus.
- 23. El método de la Reivindicación 22, caracterizado porque la composición celular es almacenada en una solución que contiene DMSO.
- 24. Una composición de células no neoplásticas viables, caracterizada porque comprende la composición celular trabada con el virus de la Reivindicación 1. í" '' '
- 25. Un kit, caracterizado porque comprende al menos dos virus seleccionados del grupo que consiste del reovirus, un virus que expresa una proteína p53 funcional, Delta24, ONYX-015, el virus de la enfermedad de Newcastle y el virus de estomatitis vesicular.
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| FG | Grant or registration |