MXPA02010075A - Celulas pluripotentes que comprenden nucleos alogenicos y mitocondria. - Google Patents

Abstract

Se proporcionan celulas ES aloquimericas que tienen nucleos de un individuo de una especie y mitocondria de un individuo diferente de la misma especie. Las celulas pueden usarse para la diferenciacion en tipos de celulas diferenciadas para la terapia o para el estudio de varios procesos de desarrollo en la formacion de embriones y la diferenciacion.

Description

CÉLULAS PLURIPOTENTES QUE COMPRENDEN NÚCLEOS ALOGENICOS Y MITOCONDRIA Campo de la Invención El campo de la invención es la manipulación de células para proporcionar oocitos no humanos, para procedimientos de transferencia nuclear, en donde tales unidades de transferencia nuclear poseen núcleos alógenos y mitocondria de dos diferentes fuentes celulares de la misma especie. Antecedentes de la Invención La demostración de que los núcleos se pueden transferir de una célula diferenciada a una célula terminal enucleada, resultando en una célula pluripotente desdiferenciada, proporciona amplias oportunidades para la manipulación biológica, investigación y terapia. Existe una oportunidad creciente para corregir defectos biológicos y condiciones médicas adversas, al usar células u órganos que pueden sustituir o complementar tal defecto o condición. En el caso del transplante, se ha tenido hasta ahora la confianza en los órganos obtenidos de donadores, en donde el donador está muerto o existían dos copias del órgano y el donador cedió una de las copias. A pesar de los esfuerzos para alentar a las personas para suministrar después de su muerte sus órganos para usarse, permanece una limitación importante de órganos disponibles y una amplia lista de espera. En aquellos Ref: 142582 casos en donde la falla en el reemplazo del órgano defectuoso es mortal, existe un periodo limitado de tiempo en el cual se encuentre un órgano de reemplazo. No solamente están los órganos en un suministro limitado, sino que el donador debe ser histocompatible con el receptor. Aún con un acoplamiento cercano de histocompatibilidad entre el donador y el receptor, el receptor debe soportase normalmente en fármacos ínmunorepresores para evitar el rechazo del injerto. Estos fármacos tienen frecuentemente serios efectos adversos en el receptor del injerto, pero se padecen debido a que- la pérdida del injerto serla mortal. A medida que se han expandido las capacidades quirúrgicas, hay un número creciente de posibilidades para injertos celulares y de órganos, para corregir un amplio número de indicaciones. Las células madre embriónicas ("ES") ofrecen oportunidades para producir células diferenciadas, órganos e individuos completos a solicitud, de manera que uno puede clonar un genotipo particular. En el caso de los animales de ganado, por ejemplo los ungulados, los núcleos de embriones similares de ganado de preimplante, soportan el desarrollo de oocitos enucleados hasta el final (Smith y colaboradores, Biol Reprod. 40:1027-1035 (1989); Keefer, y colaboradores, ibid 50:935-939 (1994)). Debido al interés e importancia de la células ES, ha existido un gran número de documentos que reportan diversos aspectos de esta tecnología. Por ejemplo, Notarianni y colaboradores, J. Reprod. Fert. Suppl. 43:255-260 (1991) , reporta el desarrollo de líneas celulares estables, pluripotentes de blastocistos de cerdo y de ovejas; Gerfen y colaboradores, Anim. Biotech. 6:1-14 (1995) reportan el aislamiento de líneas celulares embriónicas de blastocistos de porcinos, cuyas células se diferencian en varios tipos de células diferentes durante el cultivo; Chemy y colaboradores, Theriogenology 41:175 (1994) reportan líneas celulares derivadas de células germinales primordiales de bovino pluripotentes, mantenidas en cultivos de largo plazo, que formaron cuerpos embrioides y que se diferencian espontáneamente en al menos dos tipos diferentes de células; Campbell y colaboradores, Nature 380:64-68 (1996) reportan la producción de corderos vivos después de la transferencia nuclear de células de disco embriónico cultivadas ("ED") desde los embriones de ovino del día 9 cultivados bajo condiciones que promueven el aislamiento de las líneas celulares ES en el ratón; Van Stekelenburg-Hamers y colaboradores, Mol. Reprod. Dev. 40:444-454 (1995) reportan el aislamiento y caracterización de líneas celulares permanentes a partir de células de una masa celular interior ("ICM") de blastocistos de bovino, Smith y colaboradores, WO 94/24274, publicada el 7 Octubre del 1994 y Wheeler y colaboradores, WO 94/26889, publicada el 24 Noviembre de 1994, reportan la derivación de células ES pluripotentes de bovino y de porcino, útiles para la producción de animales transgénicos; Collas y colaboradores, Mol. Reprod. Dev. 38:264-267 (1994) reportan el transplante nuclear de ICM de bovino por la microinyección de células donadoras lisadas en oocitos maduros enucleados (ver también, Keefer y colaboradores, supra); Sims y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6143-6147 (1993) reportan la producción de becerros por la transferencia de núcleos de células ICM de bovino cultivadas in vitro de corto plazo, en oocitos maduros enucleados (ver también, Stice y colaboradores, Biol. Reprod. 54:100-110 (1996). Finalmente, Robl y colaboradores, PCT/US97/12919 reportan células ES que resultan de un transplante nuclear entre especies de cruza. Las oportunidades extraordinarias que proporciona la manipulación de las células ES, garantizan la investigación continua y la mejora en el carácter de las células ES, las fuentes de las cuales se pueden derivar, la forma en la cual se expanden y se llevan a término, y similares. Por lo tanto, existe un interés substancial en encontrar formas para permitir los usos expandidos de las células ES en el desarrollo de células y órganos o fragmentos de órganos para transplantes, la cría de animales domésticos y la investigación de procesos de desarrollo que conducen a la diferenciación de células y a la formación de organoides, órganos y porciones de los mismos. Breve Descripción de la Invención Se proporciones métodos y composiciones que se refieren a oocitos modificados y células ES capaces de expandirse en cultivo y diferenciarse hacia diferentes tipos de célula, células ES preparadas por ingeniería, células diferenciadas derivadas de las mismas, órganos o porciones de los mismos y organismos derivados de ellos . Los métodos comprenden el empleo de una célula de embrión alogénico, en donde el alogénico pretende las especies finales pretendidas por la célula, que está enucleada y dentro de la cual se introduce un núcleo xenogénico, para proporcionar una célula quimérica que tiene un citoplasma y mitocondria de una especie y un núcleo de una especie diferente. Después de la expansión de la célula quimérica para proporcionar una unidad de transferencia nuclear (NT) de la cual las células ES se pueden derivar, las células ES se pueden usar para una expansión adicional e investigación científica, o la unidad NT se pueden transferir dentro de un útero hospedador alogénico, singénico, u otro xenogénico compatible (con base en el oocito original) para la preñez y nacimiento. Los oocitos de este animal Fl se pueden después cosechar, enuclear e introducir un núcleo alogénico para proporcionar una célula de embrión que pueda suministrar células que tienen proteínas de una especie simple, que sean inmunológicamente competentes y que se puedan aceptar con un riesgo reducido de rechazo cuando se implantan en un hospedador alogénico. Para los propósitos de esta aplicación, estas células y su progenie se referirán como "aloquiméricas" . De interés particular es el uso de núcleos de un hospedador a quien se le darán células aloquiméricas diferenciadas . Descripción de las Modalidades Específicas Las células aloquiméricas se suministran para comprender la mitocondria de un primer individuo de una primera especie, y un núcleo de un segundo individuo de la misma primera especie. Ampliamente hablando, las células pluripotentes capaces de desarrollarse en un feto o en una pluralidad de diferentes tipos de célula, se producirán al comprender mitocondria de una especie alogénica, en donde la especie alogénica pretende la especie de interés, y un núcleo xenogénico, en donde el núcleo genogénico pretende la especie en la cual las células se implantarán o una especie diferente compatible con el implante de las células y las células que se diferencian en un feto. El feto desarrollado o maduro, se usará después para cosechar oocitos, enuclear los oocitos e introducir un núcleo de la misma especie que la mitocondria. Las células aloquiméricas resultantes, se pueden usar in vitro e in vivo para estudiar la diferenciación, para producir células a lo largo de diferentes trayectorias de diferenciación, por ejemplo, ectodermo, endodermo o mesodermo, y células dentro de estas clasificaciones tales como células neuronales, neuronas, astrocitos, células gliales, gangliones, etc, células hematopoyéticas, por ejemplo, linfocitos, macrófagos, células NK, eritrocitos, megacariocitos, etc, fibroblastos, mioblastos, etc. La metodología objeto involucra la siguientes etapas primarias : 1. Cosechar y enuclear células de embriones. 2. Introducir los genes nucleares de la mitocondria a partir de una especie diferente de las células de embriones en el genoma nuclear de células somáticas de las especies diferentes. 3. Introducir núcleos de una especie diferente de las células embriónicas en las células embriónicas enucleadas para proporcionar células quiméricas. 4. Expandir las células quiméricas para proporcionar células quiméricas ES competentes o la incubación para desarrollar unidades de transferencia nuclear (NT) . 5. I-nseminar las unidades quiméricas NT competentes en un hospedador hembra compatible. 6. Permitir que las unidades quiméricas ?T crezcan hasta un feto, o finalizar y proporcionar un neonato.

Hacer crecer en neonato hasta una edad para proporcionar oocitos quiméricos. 8 Cosechar oocitos quiméricos de la progenie. 9, Enuclear los oocitos quiméricos e introducir núcleos alogénicos a la mitocondria del oocito para proporcionar unidades NT aloquiméricas . 10 Cultivar la unidades NT aloquiméricas para proporcionar células ES. 11. Modificar genéticamente en forma opcional las células ES aloquiméricas. 12. Usar las células ES aloquiméricas para producir otros tipos de células . Cada una de esta etapas en el proceso objeto se elaborarán ahora . 1. Cosecha y enucleación de las células de embrión Se pueden cosechar células de embrión de cualquier huésped conveniente de interés, para el cual se desea la mitocondria de una especie de interés. Así, cualquier especie de mamífero de interés, puede servir como la fuente de las células de embrión, particularmente animales domésticos, más particularmente animales domésticos grandes, ejemplificados con equinos, bovinos, ovinos, porcinos, felinos, caninos, lagomorfos, murinos, etc, y primates, ejemplificados por humanos, monos y simios. Los oocitos se pueden cosechar de cualquier forma conveniente, dependiendo de si son fuentes de folículos de animales sacrificados o de que se requiera un procedimiento quirúrgico. De interés particular son las células de primates, más particularmente las células humanas que pueden servir para la producción de células diferenciadas. Las células pueden venir de cualquier miembro de las especies, ya que el núcleo que se empleará posteriormente determinará la especie y la histocompatibilidad de las células. La invención objeto encuentra aplicación particular con células humanas, aunque habrán casos con otras especies en donde las células aloquiméricas puedan jugar un papel, por ejemplo, animales raros y valiosos, animales para los cuales la fertilización in vitro no es razonablemente factible y similares. Se han aislado y enucleado células humanas. En Zhang y colaboradores, J. Assist. Reprod. Genet. 12:361-8 (1995), los óvulos fetales humanos se aislan y crioconservan y al deshielarse se encuentra que son capaces de madurase hasta la formación de cuerpos polares. La aspiración folicular se describe en Messinnis, y colaboradores, Br. J. Obstet. Gynaecol. 93:39-42 (1986); Pellicer, y colaboradores, Hum. Reprod. 4:536-40 (1989); Wahlstrom y colaboradores, Ann. N. Y. Acad. Sci. 442:402-7 (1985); y Wood y colaboradores, Br. J. Obstet. Gynaecol. 88: 756-60 (1981).

Las técnicas para la enucleación siguen a las técnicas utilizadas para otras especies y se describen de un modo particular en la sección Experimental. Las células de embrión se pueden madurar in vitro de conformidad con técnicas conocidas usando un medio adecuado de maduración. Los oocitos que tienen cuerpos polares (oocitos de la metafase II) se pueden emplear como las células huésped. Ver por ejemplo, Prather y colaboradores, Differentiation 48:1-8 (1991) y Seshagine y colaboradores, Biol. Reprod. 40:544-606 (1989)). La enucleación se alcanza de conformidad con vías convencionales, usando convenientemente una micropipeta para separar cuerpos polares y el citoplasma circundante. Los oocitos se separan después para establecer la enucleación exitosa. 2. Introducción de genes nucleares de la mitrocondria a partir de una especie diferente de células de embrión dentro del genoma nuclear de células somáticas de la especies diferentes Los núcleos somáticos se pueden preparar por ingeniería, mediante la introducción de genes importantes para la función de la mitocondria en el tipo de mitocondria presente en la célula de embrión. La invención objeto encuentra una aplicación particular en la introducción de genes humanos de la mitocondria nuclear en el animal, particularmente células somáticas de bovino para facilitar la función celular de una célula animal con la mitocondria humana. 3. Introducción de los núcleos de una especie diferente de las células de embrión dentro de las células de embrión enucleadas para proporcionar células quiméricas Se pueden emplear una amplia variedad de huéspedes mamíferos como la fuente de los núcleos, en donde la cuestión será principalmente una de conveniencia. Además de la necesidad de crecer la unidad NT quimérica hasta el final, serán de facilidad otras consideraciones en la selección de la fuente del hospedador para cosechar los oocitos del hospedador, facilidad de manipulación y crecimiento en el cultivo, madurez de la tecnología, tasa de éxito previo en lograr la progenie, facilidad de crecimiento del hospedador, y habilidad de los oocitos quiméricos resultantes, número de oocitos disponibles, compatibilidad de la mitocondria con el núcleo hospedador, así como otras consideraciones prácticas. Aunque se puede emplear cualquier hospedador mamífero, son de interés particular los animales domésticos, más particularmente los animales o primates domésticos grandes diferentes a los humanos. Los mamíferos ejemplares incluyen ungulados, bovinos y ovinos, porcino, felinos, equinos, lagomorfos, murinos, caninos, etc. Los oocitos aislados se maduran in vitro y se seleccionan para la presencia de cuerpos polares.

Los núcleos pueden venir de cualquier fuente, células somáticas o germinales, que puede proporcionar la producción de progenie. Por lo tanto, los núcleos pueden venir de células fetales, células de neonatos, células maduras, células producidas en un medio de cultivo o similares. Generalmente, los núcleos de células neoplásticas no se usarán, pero pueden tener aplicación dependiendo de la naturaleza del neoplasma. La fuente puede ser células diferenciadas, que pueden ser quiescentes, G0 o en un estado activo, por ejemplo, Gi ó G2. Los tipos de células incluyen embriones o pronúcleos de una célula (cigotos) , células de embriones, blastómeros, células epiteliales, células endoteliales, células de músculo, queratinocitos, células de la piel, células alveolares, hepatocitos, células renales, células neuronales, células hematopoyéticas, fibroblastos, células endoteliales, células parenquimales, células adiposas, células gliales, células foliculares, etc, en donde la elección se puede determinar por diversos factores asociados con el propósito final . Existen diversas técnicas para introducir el núcleo dentro de la célula de embrión enucleada. La fusión e inyección ha demostrado ser eficiente en donde la célula, que es la fuente del núcleo, se coloca en el espacio de la perivitelina del oocito enucleado y se fusiona en una cámara de fusión por medio de un pulso eléctrico o utilizando una aguja de vidrio fina, el núcleo del donador o el pronúcleo de un oocito fertilizado se puede aislar y suministrar en el citoplasma del embrión receptor. Estos pronúcleos pueden ser de animales cuyos genomas se han modificado para incluir genes nucleares de la mitocondria de la misma especie que el oocito receptor (ver por ejemplo, Prather y colaboradores, patente E.U.A. no. 4,997,384). La fusión también se puede lograr por el uso de pulsos eléctricos o por el uso de diversos reactivos fusogénicos, por ejemplo, el virus Sendai . (Ver por ejemplo, Graham, Wister Inot. Symp. Monogr. 9:19 (1969) y Collas y Barnes, Mol. Reprod. Dev. 38: 264-267 (1994) ) . 4. Expansión de las células quiméricas para proporcionar células ES quiméricas competentes o la incubación para desarrollar unidades de transferencia nuclear (NT) Después de la fusión, las unidades de transferencia nuclear fusionadas resultantes ("NT") se colocan en un medio adecuado hasta la activación, por ejemplo medio CRIaa. Típicamente, la activación se efectuará poco tiempo después, usualmente dentro de 24 horas, más usualmente 4-9 horas después. La activación se puede lograr por métodos conocidos por células de mamíferos, tal como el cultivo de la unidad NT a una temperatura sub-fisiológica, por ejemplo, temperatura ambiente, penetración de oocitos por esperma, choque eléctrico y químico, etc. Ver por ejemplo, Susko-Parrish y colaboradores, patente E.U.A. No. 5,496,720. Otros métodos incluyen efectuar un incremento simultáneo o secuencial de los niveles de cationes divalentes en el oocito, por ejemplo, calcio, magnesio, bario, o estroncio, convenientemente en forma de un ionóforo, al usar choque eléctrico, tratamiento con etanol y o tratamiento con queladores en jaulas; o reducir la fosforilación de proteínas en el oocito, empleando inhibidores de cinasa, por ejemplo, 6-dimetilaminopurina, estaurosporina, roscovitina, butirolactona, 2-aminopurina, y esfingosina, o introduciendo una o más fosfatasas dentro del oocito, por ejemplo, fosfatasa 2A ó 2B. Una técnica de interés para la activación es: activación de la unidades NT dentro de 18 a 30 horas después del comienzo del cultivo en el medio de maduración. Las unidades NT se separan después de los medios de cultivo y se colocan en medios de activación (2ml de Hepes TL con 2 mg de albúmina de suero de bovino, 5 mM de Ionomicina y 2 mM de 6-DMAP por 4 minutos en un calentador de tapa corrediza. Al final de los 4 minutos, las unidades NT se enjuagan en Hepes TL y se colocan en medios de cultivo con 2 mM de 6-DMAP a 38.5° y 5% C02 por 2 hasta 5 horas. Al final de este periodo, las unidades NT se enjuagan 4 veces con Hepes TL y se colocan en cultivo. Cuando se alcanza la etapa de desarrollo deseada, se derivarán las células ES o las unidades NT se transferirán a las hembras receptoras.

Las unidades NT activadas de células quiméricas se pueden después cultivar en un medio de cultivo adecuado in vitro o in vivo, hasta la generación de células ES y colonias de células que desarrollan embriones tales como blastocistos . Los medios de cultivo adecuados para el cultivo y maduración de las células y embriones ES son bien conocidos en el arte. Las células quiméricas se pueden tratar como células de la especie del núcleo, que tienen las proteínas de membrana de superficie, proteínas nucleares y citoplásmicas definidas por los genes nucleares. Ejemplos de los medios conocidos incluyen suero de becerro fetal al 10% + F-10 de Ham ("FCS"), medio de cultivo de tejidos -199 ("TCM-199") + 10% de suero de becerro fetal, tirodespalbúmina-lactato-piruvato ("TALP"), solución salina amortiguada de fosfato de Dulbeco ("PBS"), medios de Eagle y Whitten. Un medio común es TCM-199 o DMEM y 5 hasta 20% de suero de becerro fetal o una fuente equivalente de factores para apoyar el crecimiento tal como suero de recién nacido, suero de vaca en celo, suero de cordero o suero de res. Un medio ejemplar es el TCM-199 con sales Earl, suero de becerro fetal al 10%, piruvato de Na 0.2mM y 50µg/ml de gentamicina. Estos medios puede usarse con líneas de células para proporcionar un medio acondicionado, con el uso de células granulosas, células de oviducto, células BRL, células uterinas y células STO. Alternativamente, pueden usarse los medios descritos por Rosenkrans, jr. , Patente E.U.A. No. 5,096,822. Este medio referido como CR1 contiene L-lactato de hemicalcio en desde alrededor de 1 hasta lOmM, usualmente 1 hasta 5 mM, cloruro de sodio, cloruro de potasio, bicarbonato de sodio, y una cantidad menor de albúmina de suero de bovino libre de ácido graso, y cuando se agregan aminoácidos esenciales y no esenciales, el medio se refiere como CRlaa. Un medio CR1 ejemplar comprende NaCl 114.7 mM, KCl 3.1 mM, Na2C03 26.2 mM, L-lactato de hemicalcio 5 mM y 3 mg/ml de albúmina de suero de bovino libre de ácido. Convenientemente, las células ES quiméricas de unidad NT activadas se colocan en un medio CRlaa que contiene DMPA 1.9 mM durante alrededor de 4 horas, seguido por un lavado con HECM y después se cultivan en CRlaa que contiene BSA, a alrededor de 38.5°C, C02 al 5%, durante alrededor de 4-5 horas. Las unidades NT cultivadas se lavan usualmente y se colocan en un medio apropiado acondicionado para el crecimiento. Un medio efectivo es el medio CRlaa que contiene FCS al 10% y 6 mg/ml de BSA. Las capas alimentadoras apropiadas incluyen fibroblastos y células epiteliales, particularmente células epiteliales uterinas, de fuentes tales como células de ungulados, pollos, de murino, STO, SI-m-220 y BRL. Los fibroblastos embriónicos de ratón se han encontrado que son particularmente útiles. Después de un tiempo suficiente, que podrá variar con la especie del núcleo, se obtienen células ES quiméricas que pueden servir ahora para la inseminación en un hospedador apropiado. 5. Inseminación de unidades NT quiméricas competentes en un hospedador hembra compatible. 6. Permiso a las unidades NT quiméricas para crecer hasta un feto o hasta el final y proporcionar un neonato. Estas etapas están bien establecidas en la literatura por un número de especies, que incluyen de murino y ungulados. Para la inseminación, las unidades NT se transfieren a los úteros. Después de la inseminación, el hospedador se observa para asegurar que las unidades NT se han implantado exitosamente. Dependiendo de la naturaleza del hospedador, el hospedador puede restringirse para prevenir un aborto espontáneo . La entrega de los fetos o neonatos puede ser un aborto espontáneo o inducido, entrega natural o sección por cesárea. 7. Crecimiento del neonato hasta una edad para proporcionar oocitos quiméricos. ,, . 8. Cosecha de oocitos quiméricos de la progenie. Las etapas anteriores dependerán de la naturaleza del hospedador. El mantenimiento normal del hospedador se emplea para permitir al neonato crecer como un hospedador saludable. La cosecha de los oocitos puede realizarse como se describe arriba. 9. Enucleado de los oocitos quiméricos e introducción de los núcleos alogénicos a la mitocondria del oocito para proporcionar las unidades NT aloquiméricas. La manera de la enucleación e introducción de los núcleos ya se ha discutido. La selección de las especies para suministrar el núcleo dependerá del propósito para el cual se usarán las células . Las células pueden usarse para clonar una especie particular, particularmente donde los oocitos son solo de crecimiento difícil en la especie, tales como humanos o especies raras, o como una fuente de células de diferenciación, donde las células tienen tanto un núcleo como mitocondria de la misma especie. Diferente al humano, otra - especie que encuentra aplicación con la invención objeto incluye clonar animales raros y en peligro de extinción. 10. Cultivar las unidades NT aloquiméricas para proporcionar células ES . Se cultivan unidades NT en la capa, alimentadora hasta que las unidades NT alcanzan un tamaño apropiado para el aislado de células ES, generalmente requiere al menos de 4 células, preferiblemente al menos 50 células, y usualmente no excediendo 400 células. El cultivo usualmente empleará condiciones de 38.5°C y C0 al ' 5%, con el medio de cultivo cambiado alrededor de cada 1-5 días. La etapa final involucra remover mecánicamente las unidades NT del cultivo, aislar las células de la porción interior de la unidad NT, no obstante que las células de otras porciones de la unidad NT pueden encontrar aplicación, lavar las células de la unidad NT y colocar las células en una capa alimentadora, por ejemplo células de fibroblastos irradiadas, de la misma o diferente especie del núcleo. Las células se mantienen en la capa alimentadora en un medio de crecimiento apropiado, por ejemplo alfa-MEM complementado con FCS al 10%, ß-mercaptoetanol y L-glutamina 0.1 M. El medio de crecimiento se cambia convenientemente alrededor de cada 1-3 días En el caso de una célula ES aloquimérica humana, las células individuales no están bien definidas y el perímetro de la colonia es refractivo y uniforme en apariencia. Las células no poseen una apariencia tipo epitelial. Se pueden usar las células de unidad NT para proporcionar células de masa celular interna (ICM) de blastocistos. Las células ICM pueden crecer en el cultivo usando capas alimentadoras, por ejemplo STO (fibroblastos de ratón) con suero despojado con carbón mineral. 11. Modificación genética opcional de las células ES aloquiméricas . _ „ . Las células ES pueden modificarse con ADN de conformidad con las técnicas convencionales. Puede introducirse ADN descubierto, ADN recubierto por recA, virus, plásmidos, YAC, ADN extracromosorna1 , fragmentos cromosomales, ADNc u otra fuente del gen deseado, secuencia reguladora o similares, en las células ES, con el uso de un medio apropiado, liposomas, secuencias transportadoras, permeación, electrofusión o similares. Ver, por ejemplo, Schneike y colaboradores, Science 278:2130-3 (1997). Las modificaciones pueden proporcionarse para la expresión constitutiva o inducible de un producto particular, por ejemplo factores de angiogénesis de insulina, citocinas, por ejemplo interleucinas, interferones y factores estimulantes de la colonia, factores sanguíneos, por ejemplo albúmina de suero, trombina, fibrinógeno, trombopoyetina, eritropoyetina, activador del plasminógeno de tejido, etc, hormonas, por ejemplo hormonas del crecimiento, factores del crecimiento, por ejemplo factor del crecimiento epidermal, factor del crecimiento de fibroblastos básicos, factor del crecimiento neurotrófico derivado del glial, etc, enzimas, inhibidores de enzimas, por ejemplo a-antitripsina, proteínas asociadas con el telomero, por ejemplo Sir, telomerasa, etc, proteínas neuronales, por ejemplo neutrofin-3 , 4/5, factor neutrófico ciliar, etc, proteínas pancreáticas, proteínas básales, proteínas del gusto primordio, proteínas de los ojos, hemoglobina, factores de transcripción, lipoproteínas, inmunoglobulinas, receptores de la membrana de superficie, por ejemplo receptor de insulina, represores oncógenos, L-dopamina, e inhibidores de la angiogénesis. Alternativamente, para corregir un defecto o fenotipo indeseable, puede usarse la recombinación homologa en el núcleo que se empleará para producir las células ES aloquiméricas. Por- ejemplo, los núcleos de sujetos que sufren de anemia de célula falciforme, pueden modificarse genéticamente para proporcionar células que proporcionan una hemoglobina nativa; sujetos que sufren de hemofilia pueden tener el gen mutante del factor sanguíneo corregido, por ejemplo el Factor VIIIc o VIIIvw, factor Christmas; sujetos susceptibles a enfermedades debido a los factores genéticos, puede tener sus núcleos modificados para proporcionar alelos menos susceptibles a tales enfermedades, por ejemplo SIDA, diabetes de inicio juvenil, atrofia muscular, enfermedad de Alzheimer, mal de Parkinson, y otras.

En lugar de introducir una capacidad genética, en algunas situaciones puede desearse apagar una capacidad genética o hacer al gen inducible. Los genes ilustrativos que pueden ponerse fuera de circulación incluyen oncógenos, proteínas histocompatibles, proteínas de tipo sanguíneo y otros genes cuya expresión dominante lleva a la patología. Puede usarse la recombinación homologa o separación por exclusión células en las cuales se presenta la agenicidad deseada . 12. Uso de las células ES aloquiméricas para producir otros tipos de células.

Pedersen, Reprod. Fértil . Dev. 6:543-52 (1994) revisa un número de artículos concernientes con la diferenciación de células ES. El autor reporta la producción de células diferenciadas que expresan los marcadores CD específicos para el tipo de célula y etapa de diferenciación o productos producidos por las células, cuyos productos se producen normalmente por las células al nivel de diferenciación de las células ES. El desarrollo de células ES en tipos de célula específica puede encontrarse en Bain y colaboradores, Dev. Biol. 168:342-357 (1995) (células neurales); Palacios y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7530-7537 (1995) (células hematopoyéticas); y Rathjen y colaboradores, Reprod. Fértil. Dev. 10:31-47 (1998). Las células de interés incluyen células hematopoyéticas, células neuronales, células de músculo esqueletal y cardiaco, células de la piel, células epiteliales, células endoteliales, células estructurales, osteoclastos y osteoblastos, células foliculares, células de los ojos, células asociadas con la sensibilidad, tales como células del oído interno del gusto primordio, células óseas, células renales, hepatocitos, células pancreáticas, por ejemplo células de isleta ß, fibroblastos, y condrocitos. Las células ES diferenciadas pueden encontrar aplicación en una amplia variedad de jurisdicciones. Las células tienen mitocondria alogénica y células que proporcionan núcleos que representan células normales que comprenden ADN de una especie sencilla. De esta manera, las cuestiones referentes a la incompatibilidad entre la mitocondria y el núcleo son obvias, las proteínas que se presentan en el citoplasma son todas de la misma especie, la interacción entre el núcleo y la mitocondria, por ejemplo el transporte de proteínas es natural, y las secuencias inmunodominantes presentes en la superficie de la célula todas formarán la misma especie. Adicionalmente, también serían naturales los procesos celulares que dependen de la interacción entre la mitocondria y otros compartimientos intracelulares. Las células ES y las células de diferenciación ofrecen muchas oportunidades para la disección de los procesos celulares, respuesta a agentes exógenos, por ejemplo genes, fármacos, factores, etc, usados para separar el efecto de estos agentes exógenos en el desarrollo de fármacos, identificar alelos específicos o mutaciones asociadas con la respuesta a estos agentes externos, e investigar variaciones y la expresión en respuesta a diversos agentes. Además, debido a que las células ES pueden mantenerse en cultivo y expandirse, pueden producirse repetitivamente las células diferenciadas, donde las células se basan en el mismo genotipo. La invención objeto también ofrece la capacidad de usar el núcleo de un individuo para la investigación y diagnóstico. De esta manera, puede determinarse la susceptibilidad de un individuo particular a agentes externos, tales como carcinógenos, alergénicos, toxinas, y mutágenos donde hay una célula completa de una especie sencilla que tiene el metabolismo nativo de tal especie. También puede investigarse la respuesta celular a un régimen particular, por ejemplo régimen de fármaco, para determinar el efecto de las células normales de un paciente particular. Para la administración crónica de un régimen, existe un tiempo suficiente para usar el óvulo almacenado enucleado de la especie de interés como un receptáculo para la introducción de núcleos de células de diferenciación de un individuo particular de tal especie. Se tienen entonces las células ES que pueden dirigirse para producir diversas células diferenciadas en diferentes etapas de diferenciación, que pueden someterse al régimen y cambios en el carácter de las células determinadas . Habrán situaciones donde la invención objeto permita estudiar los procesos de la mitocondria en conjunto con un núcleo particular. Por ejemplo, en donde un individuo puede tener un núcleo que es defectuoso para proporcionar proteínas que se usan por la mitocondria en este proceso, la metodología objeto permite la clonación de tales células y prever el efecto de la diferenciación en el proceso mitocondrial y el efecto en los patrones de crecimiento, fenotipo, etc.

En aquellas instancias donde las células ES o las unidades NT se usan para la maduración de un feto y la producción de un neonato, el uso de la mitocondria nativa evita la incompatibilidad cuando se aparean el individuo resultante con otros individuos de la misma especie. De esta manera, es menos probable el rechazo del feto por la madre y menos probables las respuestas inmunes a las células hospedadoras, como un resultado de que están presentes proteínas mitocondriales foráneas. Las composiciones que encuentran uso en la invención objeto son oocitos que comprenden mitocondria de una especie y un núcleo de una especie diferente, aislada y en cultivo. Para la mayor parte, el núcleo y la mitocondria serán de especies que son substancialmente diferentes, generalmente son de géneros diferente y aún de familias diferentes. Convenientemente, el núcleo se elegirá para proporcionar una fuente útil del óvulo enucleado, tal como de animales domésticos (ungulados) , por ejemplo bovino, ovino y porcino, y de animales de laboratorio, por ejemplo murino. También se incluyen en la invención objeto los óvulos que comprenden mitocondria de un individuo y un núcleo de un individuo diferente de la misma especie, las células ES se derivan de estos, los cultivos que comprenden tales células ES, células diferenciadas derivadas de estos, y cultivos que comprenden tales células diferenciadas.

Las composiciones incluyen oocitos aloquiméricos y células ES en cultivos de crecimiento para la expansión de las células. Las composiciones también incluyen mezclas de células aloquiméricas y células diferenciadas de masas celulares internas o crecimiento concomitante o mantenimiento de las células ES y las células diferenciadas en el medio de cultivo para la diferenciación de células. Para células hematopoyéticas, un medio de cultivo que comprende monocapas de células estromales de médula ósea R.P.0.10 tratadas con mitomicina C (5-10µg/ml a 37°C durante 3-4 horas) o irradiadas (2-4 x 103 radiaciones de rayos ?; 1 radiación = 0.01 G?) en placas de seis pozos Costar, en presencia de interleucina-3 recombinante (rIL-3) (100-300 unidades/ml) , rIL-6 y F (concentración final 10% v/v) de sobrenadantes de cultivos de 2 días de células estromales de hígado fetal FLS4.1 confluentes . El sobrenadante FLS4.1 contiene el ligando FLT3 , factor de acero y un nuevo factor que soporta el crecimiento de células madre hematopoyéticas en 2-2.5 ml de medio de cultivo [medio modificado Iscove Dulbecco/50µM 2-mercaptoetanol/L-glutamina 2mM/gentamicina a 50µg/ml/FCS al 7.5% v/v] a 37°C en una atmósfera de 7.5% de C02/92.5% de aire. Cada 5-7 días, las células se cosecharon y se sub-cultivaron en placas de 6 pozos Costar nuevas que contienen células estromales R.P.0.10 tratadas con mitomicina C y medio de cultivo complementado con citocina recientemente preparado. (Palacios, y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7530 (1995)) . Se entenderá que pueden- usarse otras líneas de células que proporcionan un medio acondicionado análogo, así como otros constituyentes que proporcionan actividades análogas. Para las células neuronales, las células ES se someten a un procedimiento de inducción de 8 días, que consiste de 4 días de cultivo como agregados sin ácido retinoico (RA) seguido por 4 días de cultivo en presencia de RA. El medio es DMEM (alta glucosa con L-glutamina, sin piruvato; GIBCO 11965-043), suero de bovino fetal al 10%, suero de becerro recién nacido al 10% y solución de reserva de nucleósidos. Otros medios pueden emplearse para la diferenciación dirigida en otros tipos de células, con el uso de factores que existen naturalmente y afectan la diferenciación in vivo, tales como factores hematopoyéticos, por ejemplo G-CSF, M-CSF, GM-CSF, interleucinas, interferones y otras citocinas y factores del crecimiento. Los oocitos enucleados, todos teniendo la misma mitocondria, pueden almacenarse congelados en un medio apropiado por periodos prolongados y después descongelarse cuidadosamente antes de usarse . Las células diferenciadas, si están modificadas genéticamente o no, encuentran uso en la terapia, donde las células saludables pueden introducirse en el compartimiento apropiado para realizar una función deseada. Por ejemplo, los miocitos pueden usarse para injertarse al tejido del miocardio u otro tejido muscular, donde las células naturales o modificadas genéticamente pueden proporcionar una ventaja, por ejemplo la corrección de una proteína mutante, como en el caso de atrofia muscular. Ver, por ejemplo, Patente E.U.A. 5,602,301. Las células hematopoyéticas pueden infundirse a un paciente, tales como linfocitos, células eliminadoras naturales, megacariocitos, eosínófilos, basófilos, células mononucleares, o los precursores de las mismas, donde los precursores pueden dedicarse a un tipo de célula específico o pueden ser multipotentes y diferenciarán diversos tipos diferentes de células. Las células de isleta ß pueden injertarse en el páncreas o proporcionarse en un recipiente protector que puede inervarse por un suministro sanguíneo para el tratamiento de la diabetes . Pueden introducirse células neuronales en la cavidad cerebral para proporcionar terapias para el mal de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, parálisis cerebral, y similares, al proporcionar una fuente de L-dopamina, NGE u otros factores u otra composición que puede afectar la función cerebral . Otras indicaciones para el uso de las células ES objeto o su progenie diferenciada incluye lesiones de la espina dorsal, esclerosis múltiple, enfermedades del hígado, enfermedades vasculares, reemplazo de cartílago quemado, enfermedades cardiacas, enfermedades del riñon, enfermedades del tracto urinario, enfermedades de la próstata, y enfermedades que resultan de la edad. Las células objeto pueden usarse para proporcionar suministros aumentados de factores particulares, constitutivamente o induciblemente. Pruschy y colaboradores, Chem. Biol. 1:163-72 (1997) proporcionan modificaciones que permiten la producción inducida de un producto al tomar oralmente una pildora, que activa un factor de la transcripción. De esta manera, puede inducirse la producción de tejido plasminógeno activador en el caso de ataque cardiaco, producción de insulina por diabéticos, activación de linfocitos en caso de infección, durante la introducción de receptores no humanos tales como el receptor de ecdisona, y similares. Los siguientes ejemplos están a modo de ilustración y a modo de limitación. EXPERIMENTAL Materiales y Métodos Oocitos humanos receptores : Oocitos de fetos humanos : Se obtienen ovarios fetales de fetos humanos de 16-20 semanas de gestación., después de un aborto selectivo. Se desmenuzaron tejidos de ovarios en ~lmm de tamaño y se cultivaron en un medio complementado con suero de bovino fetal al 15% (v/v), 0.13 IU/ml de FSH y 35 ng/ml de insulina. El tejido se cultivó a 37°C en aire de C02 al 5% durante 5-25 días en platos Falcon y 3-40 días en membranas Costar Transwell-COL antes de la inducción de la maduración final en presencia de LH y fluido folicular humano. Los fragmentos de monocapa que consisten de fibrolastos se forman dentro de 2-3 días del cultivo del tejido fresco. Después de 1 semana de cultivo, los folículos se separan del tejido de ovario, pero permanecen enlazados a la monocapa. El número máximo de folículos que se separan del tejido aparece alrededor de 1 semana después de iniciar el cultivo. Después de 40 días de cultivo en los platos Costar, una fracción significante del óvulo alcanza un diámetro de más de 80µ, del cual alrededor de un tercio se rodea por la zona pelúcida. Después de la inducción de la maduración final, la extrusión del primer cuerpo polar se nota en el ovario que creció en los platos Costar durante 40 días. El óvulo maduro puede colectarse y usarse directamente para la enucleación. Oocitos de hembras humanas maduras : Se obtienen óvulos humanos con el uso de la técnica de Trotnow y colaboradores, Arch. Gynecol. 236:211-7 (1985). Se emplea un aditamento de dirección con el transductor del explorador de sector Diasonics DS 1 empleando una aguja de aspiración deslizada a través de un trocar, con una imagen sonográfica continua de la aguja de aspiración. Se le da al paciente anestesia epidural.

Pueden emplearse otras técnicas, que incluyen administrar una hormona estimulante de folículo de conformidad con el régimen descrito por Mercan y colaboradores, Hum. Reprod. 12: 1886-9 (1997). Los oocitos pueden madurarse después in vitro como sigue. Los oocitos inmaduros se lavan en medio amortiguador TL-HEPES que contiene 3 mg/ml de albúmina de suero de bovino (Fracción V) . Los oocitos acumulados en complejos se colocan en TCM-199 que contiene suero de becerro fetal al 10%, LH y/o FSH y estradiol a 39°C. Después de alrededor de 20 horas en el medio de maduración, los oocitos se remueven y se colocan en TL-HEPES con 1 mg/ml de hialuronidasa y las células acumuladas se remueven por pipeteo repetido a través de una pipeta de diámetro fino. Los oocitos agotados se separaron de los cuerpos polares y aquellos que contenían cuerpos polares (oocitos de metafase II) se seleccionaron para uso adicional. Células donadoras de bovinos : Se sobre-ovularon e inseminaron artificialmente vaquillas. Se recogieron los embriones del tracto reproductivo al día 5 ó 6 después de establecer el estro. Los embriones se retiraron del tracto reproductivo con PBS y se recolectaron. Los embriones madurados in vitro, fertilizados y cultivados se usaron como embriones donadores al día 5 de la fertilización. El proceso de fertilización se describe en Keefer y colaboradores, Mol. Reprod. Dev. 36:469-74 (1993).

Enucleación: La enucleación se realizó con el uso de una micropipeta biselada a aproximadamente 18 horas después del inicio de la - maduración (hpm) . La enucleación se confirmó en el medio TL- HEPES más bis-bencimida (Hoechst 33342, 3µg/ml) . Transferencia nuclear: Se colocaron células donadoras individuales en el especio perivitelino del oocito enucleado receptor. El citoplasma del oocito humano y el núcleo donador de bovino (unidad NT) se fusionaron juntos con el uso de electrofusión: un pulso de fusión de 90V durante 15 µseg a 24 horas después del inicio de la maduración de los oocitos. Las unidades NT resultantes se colocaron en un medio CRlaa hasta 28 horas después del inicio de la maduración, tiempo al cual se activaron de conformidad con el siguiente proceso. Las unidades NT se expusieron durante 4 minutos a ionomicina-6- DMAP (2mM) seguido por 4 horas en DMAP solo (2mM) en TL-HEPES complementado con 1 mg/ml de albúmina de suero y después se lavaron durante 5 minutos en TL-HEPES complementado con 30 mg/ml de albúmina de suero. Las unidades NT se transfieren después en una micro-gota de medio de cultivo CRlaa más FCS ai 10% y 6 mg/ml de albúmina de suero en 4 pozos de placas que contienen una capa alimentadora confluente de fibroblastos embriónicos de ratón. Las unidades NT se cultivan durante 3 días más a 38.5°C y C02 al 5%. El medio de cultivo se cambió cada 3 días hasta el día 12 después del inicio de la activación. En este momento, deberían formarse alrededor de 50 células, cuyas células se remueven mecánicamente de la zona y se usan para producir líneas de células embriónicas. Capa alimentadora de fibroblasto embriónica de ratón: Se obtienen cultivos primarios de fibroblastos embriónicos de ratón de fetos de murino de 14-16 días de edad. Después de que se remueven asépticamente la cabeza, hígado, corazón y tracto alimentario, los embriones se desmenuzaron y se incubaron durante 30 minutos a 37°C en solución de EDTA tripsina pre-calentada (tripsina al 0.05%/EDTA al 0.02%; GIBCO, Grand Island, NY) . Se sembraron células de fibroblastos en los matraces de cultivo de tejido y se cultivaron en un medio alfa-MEM (BioWhittaker, Walkersville, MD) complementado con FCS al 10%, penicilina (lOOIU/ml) y estreptomicina (50µl/ml) . Tres hasta cuatro días después de pasar, se irradiaron los fibroblastos embriónicos en placas de cultivo 35 x 10 Nunc (Baxter Scientific, McGaw Park, IL) . Los fibroblastos irradiados se hicieron crecer y se mantienen en una atmósfera humidificada con C02 al 5% en aire a 37°C. Las placas de cultivo que tiene una monocapa uniforme de células se usan para cultivar líneas de células embriónicas.

Producción de líneas de células embriónicas: Células de unidad NT obtenidas como se describe arriba se lavaron y se colocaron directamente en células de fibroblastos alimentadoras irradiadas (ver arriba) . Estas células incluyen aquellas de la porción interior de la unidad NT. Las células se mantienen en un medio de crecimiento que consiste de alfa-MEM complementado con FCS al 10% y 0. lmM de ß-mercaptoetanol. El medio de crecimiento se intercambia cada 2 hasta 3 días . La colonia inicial se observa por el segundo o tercer día de cultivo. La colonia se propaga y exhibe una morfología similar a las células madre (ES) embriónicas de bovino y ratón previamente descritas. Las células individuales dentro de la colonia no están bien definidas y el perímetro de la colonia es refractivo y uniforme en apariencia. Las células tienen una apariencia epitelial. Producción de unidades NT de bovino quiméricas : Las unidades NT quiméricas se seleccionan e implantan en vacas de conformidad con el siguiente procedimiento: se implantan 1-5 unidades NT en el útero. Los becerros resultantes crecen hasta la etapa apropiada para desarrollar oocitos, momento en el cual los óvulos se aspiran y aislan. Alternativamente, se obtienen oocitos de hembras adultas por la sobre-ovulación y por la recuperación de oocitos guiada por ultrasonido o de ovarios de vacas sacrificadas.

Producción de células humanas aloquiméricas : Los óvulos quiméricos obtenidos como se describe arriba se tratan como se describe arriba para crecimiento y enucleación, y después están listos para usarse para la recepción de núcleos humanos. Se raspan ligeramente células epiteliales humanas del interior de la boca de adultos humanos con consentimiento con un portaobjeto de vidrio regular. Las células se lavan completamente del portaobjeto en una caja de Petri que contiene PBS con Ca o Mg. Las células se pipetean a través de una pipeta de diámetro pequeño para romper los cúmulos de células en una suspensión celular sencilla. Las células se transfieren después en una micro-gota de medio TL-HEPES que contiene FCS al 10% bajo aceite para la transferencia nuclear de oocitos de bovino quiméricos enucleados que comprenden mitocondria humana con el uso del procedimiento descrito arriba. Las células aloquiméricas pueden emplear núcleos de substancialmente cualquier fuente celular humana conveniente, tales como fibroblastos, células epiteliales, queratinocitos, linfocitos de sangre o células epiteliales de glándulas. Las células aloquiméricas se hacen crecer en cultivo y se dirigen en varios patrones de diferenciación, como se describe por Stice y colaboradores (1998) , supra, que incluye la preparación de miocitos.

De conformidad con la invención objeto, se proporcionan células humanas aloquiméricas que tienen núcleos humanos y mitocondria humana de diferentes individuos. Estas células encuentran un extenso uso en que proporcionan una célula humana natural simulada para estudiar los procesos celulares en el desarrollo de embriones y la diferenciación para tipos diferenciados de células. Las células también pueden usarse para producir células diferenciadas por terapia de células o producción de factores humanos. Las células objeto proporcionan células que producen solo proteínas humanas, así como también es menos probable que induzcan una respuesta inmune, permiten la manipulación genética del núcleo, para proporcionar células humanas que puedan introducirse en un individuo que es la fuente de los núcleos, pero en donde los núcleos se modifican para propósitos terapéuticos u otros, y proporcionan una fuente de células genotípicamente idénticas, que pueden usarse para clonar un genotipo particular. Las referencias citadas en esta solicitud se incorporan en la presente para referencia como se han colocado completamente en la especificación. Todos los procedimientos y métodos se incluyen como si se colocaran y fueran parte de los procedimientos de esta solicitud, cuando se aplican a la materia objeto de esta solicitud de conformidad con aquellos expertos en la técnica.

La invención que se ha descrito ahora completamente, será aparente para alguien de experiencia ordinaria en la técnica que pueden hacerse muchos cambios y modificaciones a ésta sin salirse del espíritu o alcance de las reivindicaciones adjuntas. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (20)

1. Reivindicaciones . Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones . 1. Un método para producir células aloquiméricas que comprenden mitocondria de un primer humano y un núcleo de un segundo y diferente humano, el método caracterizado porque comprende : enuclear un oocito de un primer humano; introducir el núcleo de una especie diferente al humano en el oocito enucleado para proporcionar un primer oocito quimérico; expandir la primer célula quimérica en el cultivo para proporcionar unidades NT; inseminar la célula ES en un hospedador hembra compatible y permitir que las unidades NT crezcan hasta al menos un feto que comprende los segundos oocitos quiméricos; cosechar y aislar al menos uno de los segundos oocitos quiméricos; enuclear al menos uno de los segundos oocitos quiméricos e introducir un núcleo humano en el segundo oocito quimérico para proporcionar una unidad NT aloquimérica; y cultivar la unidad NT aloquimérica en el cultivo para proporcionar células ES aloquiméricas.
2. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las células ES aloquiméricas crecen en cultivo bajo condiciones que resultan • en células diferenciadas .
3. 3. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque las células diferenciadas son células neuronales, musculares o hematopoyéticas.
4. 4. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la especie es un ungulado y el hospedador hembra es un ungulado.
5. 5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el núcleo humano es de una célula humana diferenciada.
6. 6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el núcleo de una especie diferente al humano se introduce por medio de electrofusión.
7. 7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende la etapa adicional de modificar genéticamente las células ES aloquiméricas.
8. 8. Un método para producir células aloquiméricas que comprenden mitocondria de un primer humano y un núcleo de un segundo y diferente humano, el método caracterizado porque comprende : enuclear un oocito de un primer humano; introducir el núcleo de un ungulado en el oocito enucleado para proporcionar un primer oocito quimérico; expandir la primer célula quimérica en el cultivo para proporcionar al menos 4 células ES; inseminar la célula ES en un ungulado que es al mismo tiempo la fuente del núcleo y permitir que la célula ES crezca hasta al menos un feto que comprende los segundos oocitos quiméricos; cosechar y aislar al menos uno de los segundos oocitos quiméricos; enuclear al menos uno de los segundos oocitos quiméricos e introducir un núcleo humano de una célula humana diferenciada en el segundo oocito quimérico para proporcionar un oocito aloquimérico; y expandir el oocito aloquimérico en el cultivo para proporcionar células ES aloquiméricas.
9. 9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque las células ES aloquiméricas crecen en cultivo bajo condiciones que resultan en células diferenciadas en las trayectorias neuronales, musculares o hematopoyéticas .
10. 10. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque comprende la etapa adicional de modificar genéticamente las células ES aloquiméricas.
11. 11. Un método para tratar un hospedador humano para una indicación susceptible al tratamiento con células aloquiméricas, el método caracterizado porque comprende: producir células aloquiméricas diferenciadas de conformidad con la reivindicación 2; e introducir las células aloquiméricas en el hospedador humano en el sitio a tratar la indicación.
12. 12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque las células ES aloquiméricas se modifican genéticamente antes de la diferenciación.
13. 13. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el núcleo humano es del hospedador humano .
14. 14. Una composición, caracterizada porque comprende una pluralidad de células ES humanas aloquiméricas.
15. 15. La composición de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque las células ES humanas aloquiméricas están en cultivo.
16. 16. Una composición, caracterizada porque comprende una pluralidad de células aloquiméricas diferenciadas en otro hospedador humano diferente.
17. 17. La composición de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque las células aloquiméricas diferenciadas están en cultivo.
18. 18. La composición de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque las células aloquiméricas diferenciadas están en las trayectorias neuronales, musculares o hematopoyéticas.
19. 19. Una composición, caracterizada porque comprende una mezcla de células ES aloquiméricas y células aloquiméricas diferenciadas en cultivo.
20. 20. Una composición, caracterizada porque comprende una pluralidad de células ES aloquiméricas genéticamente modificadas como resultado de la introducción in vitro de ADN exógeno en al menos una célula ES aloquimérica.