MXPA02009543A

MXPA02009543A - Metodo para identificar inhibidores de tie-2.

Info

Publication number: MXPA02009543A
Application number: MXPA02009543A
Authority: MX
Inventors: Cornelia Bellamacina
Original assignee: Abbott Gmbh & Co Kg
Priority date: 2000-03-29
Filing date: 2001-03-20
Publication date: 2005-08-26
Also published as: HK1053844A1; WO2001072778A2; CA2404532A1; AU2001287268A1; EP1268549A2; WO2001072778A3; JP2004514405A

Abstract

La presente invencion se refiere a polipeptidos que comprenden el dominio de union de ligando de Tie-2, formas cristalinas de estos polipeptidos y el uso de estas formas cristalinas para determinar la estructura tridimensional del dominio catalitico de Tie-2. La invencion tambien se refiere al uso de la estructura tridimensional del dominio catalitico de Tie-2 tanto solo como en complejo con inhibidores, metodos para disenar y/o identificar inhibidores potenciales de la actividad de Tie-2, por ejemplo, compuestos que inhiben la union de un substrato nativo al dominio catalitico de Tie-2.

Description

METODO PARA IDENTIFICAR INHIBIDORES DE TIE-2 SOLICITUD RELACIONADA Esta solicitud reclama el beneficio de la solicitud provisional de E.U.A. No. 60/192,920, presentada el 29 de Marzo del 2000. Todas las enseñanzas de. la solicitud anterior se incorporan aquí por referencia.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION La angiogénesis es un procedimiento fundamental a través del cual se forman nuevos vasos sanguíneos a través de brotación, ramificación, proliferación y formación de túbulos mediante células endoteliales de vasculatura existentes. En seres humanos saludables, esta neovascularización está bajo un severo control, normalmente ocurriendo durante el desarrollo embriónico, regulación endometrial, lactancia y reparación de heridas. Sin embargo, en muchas condiciones patológicas, tales como artritis reumatoide, tumores sólidos, sarcoma de Kaposi, ceguera debido a neovascularización ocular, psoriasis y aterosclerosis, la progresión de la enfermedad depende de la angiogénesis persistente, la vasculatura, la cual es el conducto para el suministro de fármacos, es uno de los tejidos más accesibles en el cuerpo. Cada célula endotelial de vasos tumorales se estima que soporta de 100 a 1000 células circundantes, aún en ausencia de una célula endotelial de estímulo angiogénico típicamente dividida solamente una vez cada 1000 días. Se ha descubierto un número de factores de crecimiento de polipéptido y sus receptores específicos de célula endotelial asociados, los cuales son principalmente responsables de la estimulación del crecimiento de célula endotelial, diferenciación y el establecimiento de nueva vasculatura. Estos receptores de factor de crecimiento incluyen receptores de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR) Flk-1 (ratón), KDR/VEG-FR-2 (humano), Flt-1/VEGFR-1, y Flt-4/VEGFR-3. Los receptores que son responsables de la neuvascularización también incluyen las cinasas de tirosina de receptor Tie-1 y Tie-2. Debido a este papel en la regulación del nuevo desarrollo vascular, Tie-2 es un objetivo potencial para terapias dirigidas a controlar enfermedades que dependen de angiogénesis persistente. El desarrollo de ensayos bioquímicos para Tie-2 ha permitido que el descubrimiento de fármacos prosiga a lo largo de las trayectorias para identificar inhibidores de Tie-2 principales a través de la clasificación de alta producción de colecciones de compuesto y probando compuestos que imitan la estructura del substrato; sin embargo, no ha sido posible el diseño racional basado en estructura hasta este punto, debido a la falta de datos estructurales tridimensionales exactos para receptores de Tie-2.

COMPENDIO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a un polipéptido que comprende el dominio catalítico de Tie-2, una forma cristalina de este polipéptido y el uso de información estructural derivada de la forma cristalina del polipéptido para diseñar y/o identificar inhibidores potenciales de la unión de uno o más ligandos nativos al dominio catalítico de Tie-2. En una modalidad, la presente invención también se refiere a un polipéptido que comprende el dominio catalítico de Tie-2 y que tiene la secuencia de aminoácido establecida en SEC ID NO:2. En otra modalidad, la invención se refiere a una forma cristalina de este polipéptido o el polipéptido en complejo con el ligando. En otra modalidad, la invención proporciona un método para determinar la estructura tridimensional de un polipéptido cristalino que comprende el dominio catalítico de Tie-2. En una modalidad, el método comprende los pasos de, (1) obtener un cristal del polipéptido comprendiendo el dominio catalítico de Tie-2; (2) obtener datos de difracción de rayos X para dicho cristal; y (3) resolver la estructura de cristal de dicho cristal. El método opcionalmente comprende el paso adicional de obtener el polipéptido, con la estructura tridimensional que será determinada, antes de obtener el cristal de dicho péptido. En otra modalidad, el método comprende los pasos de, (1) obtener un cristal del polipéptido comprendiendo el dominio catalítico de Tie-2; (2) obtener datos de difracción de rayos X para dicho cristal; y (3) resolver la estructura de cristal de dicho cristal utilizando datos de difracción de rayos X y las coordenadas atómicas para el dominio catalítico de Tie-2 de un segundo polipéptido. El método opcionalmente comprende el paso adicional de obtener el polipéptido, con la estructura tridimensional que será determinada, antes de obtener el cristal de dicho péptido. La invención además se refiere a un método para identificar un compuesto que inhibe la actividad catalítica de Tie-2, por ejemplo, inhibiendo la unión de substratos naturales tales como el polipéptido tirosilo o proteína o ATP, al dominio catalítico de Tie-2. Dicho compuesto es denominado en la presente como un "inhibidor de Tie-2". El método comprende los pasos de (1) utilizar una estructura tridimensional de Tie-2 como se define por las coordenadas atómicas del dominio catalítico de Tie-2; (2) emplear la estructura tridimensional para diseñar o seleccionar un inhibidor potencial; y (3) determinar la habilidad del compuesto seleccionado para inhibir la cantidad catalítica de Tie-2. El método también incluye el paso de proporcionar el compuesto diseñado o seleccionado en el paso 2, por ejemplo, sintetizando el compuesto u obteniendo el compuesto a partir de una colección de compuesto. Además, el método puede incluir el paso de determinar la habilidad del compuesto identificado para unirse al dominio catalítico de Tie-2 y/o determinar la habilidad del compuesto identificado para inhibir la unión de un ligando natural de Tie-2.

En otra modalidad, el método para identificar un compuesto que inhibe la actividad catalítica de Tie-2, comprende el paso de determinar la habilidad de uno o más grupos funcionales y/o porciones del compuesto, cuando está presente en, o unido al dominio catalítico de Tie-2, para interactuar con uno o más subsitios del dominio catalítico de Tie-2. En general, el dominio catalítico de Tie-2 se define por. las secuencias homologas conservadas cuando se compara con otras cinasas de tirosina conocidas. Si el compuesto es capaz de interactuar con un número de preseleccionado o grupo de subsitios, obtiene una energía de interacción calculada dentro de una escala deseada o preseleccionada, el compuesto es identificado como un inhibidor potencial de Tie-2. La invención además proporciona un método para diseñar un compuesto, el cual sea un potencial inhibidor de la actividad catalítica de Tie-2. El método incluye los pasos de, (1) identificar uno o más grupos funcionales capaces de interactuar con uno o más subsitios del dominio catalítico de Tie-2; y (2) identificar un andamio que presente el grupo funcional, o grupos funcionales, identificados en el paso 1 en una orientación adecuada para interactuar con uno o más subsitios del dominio catalítico de Tie-2. El compuesto que resulta de la unión de los grupos o porciones funcionales identificados al andamio identificado es un inhibidor potencial de Tie-2. El dominio catalítico de Tie-2, en general, se define por las coordenadas atómicas de un polipéptido comprendiendo el dominio catalítico de Tie-2.

En otra modalidad más, la invención proporciona compuestos que inhiben la actividad catalítica de Tie-2 y que se fijan, o se unen al dominio catalítico de Tie-2. Dichos compuestos típicamente comprenden uno o más grupos funcionales que, cuando el compuesto se une en el dominio catalítico de Tie-2, interactuan con uno o más subsitios del dominio catalítico. En general, el dominio catalítico e Tie-2 se define por. la secuencia homologa conservada cuando se compara con otras cinasas de tirosina conocidas. En una modalidad particular, el inhibidor de Tie-2 es un compuesto que es identificado o diseñado por un método de la presente invención. La presente invención además proporciona un método para tratar una condición mediada por Tie-2 en un paciente. El método comprende administrar al paciente una cantidad terapéutica o profilácticamente efectiva de un compuesto que inhibe la actividad catalítica de Tie-2, tal como un inhibidor de Tie-2 de la invención, por ejemplo, un compuesto identificado como un inhibidor de Tie-2 o diseñado para inhibir Tie-2 a través de un método de la presente invención. La presente invención proporciona varias ventajas. Por ejemplo, la invención proporciona las primeras estructuras tridimensionales detalladas del dominio de unión de ligando de una proteína Tie-2. Los métodos descritos aquí pueden ser utilizados para facilitar la formación de cristales de Tie-2, los cuales tienen difracción a alta resolución. Estas estructuras permiten el desarrollo racional de inhibidores de Tie-2 permitiendo el diseño y/o identificación de estructuras moleculares que tienen características que facilitan la unión al dominio de unión de Tie-2. Los métodos para utilizar las estructuras aquí descritas, de esta manera, permiten el descubrimiento más rápido de compuestos que sean potencialmente útiles para el tratamiento de condiciones que son mediadas, por lo menos en parte, por la actividad de Tie-2.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS La Figura 1 presenta la secuencia de aminoácido de Tie-2 humano (SEC ID NO:1). La Figura 2 presenta la secuencia de aminoácido que incluye el dominio catalítico de Tie-2 humano del aminoácido 802 al aminoácido 1124, y tiene una mutación de punto catalíticamente inactiva en el aminoácido 964 (SEC ID NO:2). Las Figuras 3A-300 presentan las coordenadas atómicas para el complejo de SEC ID NO 2/inhibidor I. Las Figuras 4A-400 presentan las coordenadas atómicas para el complejo de SEC ID NO 2/inhibidor II. Las Figuras 5A-5RR presentan las coordenadas atómicas para el complejo de SEC ID NO 2/inhibidor III. Las Figuras 6A-6NN presentan las coordenadas atómicas para el complejo de SEC ID NO 2/inhibidor IV. La Figura 7 muestra la estructura de una cinasa prototipica, cinasa de receptor de insulina.

La Figura 8 muestra regiones identificadas de un inhibidor de pirrolopirimidina (es decir, inhibidor I), el cual interactúa con el dominio catalítico de Tie-2. La Figura 9 muestra un modelo de dominio catalítico de Tie-2 unido al inhibidor I. Los subsitios se muestran de colores diferentes.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La presente invención se refiere al estudio cristalográfico de rayos X de polipéptidos que comprenden el dominio catalítico de Tie-2. Las coordenadas atómicas que resultan de este estudio son para utilizarse en la identificación de compuestos que se fijan en el dominio catalítico y, por lo tanto, son inhibidores potenciales de Tie-2. Estos inhibidores de Tie-2 son cada uno para utilizarse en métodos para tratar a un paciente que tenga una condición que es modulada por o que depende de la actividad de Tie-2, por ejemplo, una condición dependiente en angiogénesis persistente. Existen por lo menos 400 enzimas identificadas como cinasas de proteína. Estas enzimas catalizan la fosforilación de substratos de proteína objetivo. La fosforización usualmente es una reacción de transferencia de un grupo de fosfato a partir de ATP al substrato de proteína. La estructura específica en el substrato objetivo al cual se transfiere el fosfato, es un residuo de tirosina, cerina o treonina. Ya que estos residuos de aminoácido son las estructuras objetivo para la transferencia de fosforílo, estas enzimas de cinasa de proteína son comúnmente denominadas como cinasas de tirosina o cinasas de serina/treonina. Las reacciones de fosforilación, y las reacciones de fosfatase para contrarrestar, en los residuos de tirosina, serina y treonina están involucradas en innumerables procedimientos celulares que subrayan respuestas a diversas señales intraceluiares (típicamente mediadas a través de receptores celulares), regulación de funciones celulares y activación o desactivación de procedimientos celulares. Una cascada de cinasas de proteína por lo general participan en la transducción de señal intracelular y es necesaria para la realización de estos procedimientos celulares. Debido a su ubicuidad en estos procedimientos, las cinasas de proteína se pueden encontrar como una parte integral de la membrana del plasma o como enzimas citoplásmicas o localizadas en el núcleo, por lo general como componentes de complejos de enzimas. En muchos casos, estas cinasas de proteína son un elemento esencial de complejos de enzima y proteína estructural que determinan cuando y donde ocurre un procedimiento celular dentro de una célula. Cinasas de Tirosina de Proteína. Las cinasas de tirosina de proteina (PTKs) son enzimas que catalizan la fosforilación de residuos específicos de tirosina en proteínas celulares. Esta modificación de post-traducción de estas proteínas de substrato, por lo regular las mismas enzimas, actúan como un conmutador molecular regulando la proliferación, activación o diferenciación de célula (para revisión, ver Schlessinger y Ulrich, 1992, Neuron 9:383- 391). Se ha observado una actividad aberrante o excesiva de PTK en muchos estados de enfermedad, incluyendo trastornos proliferativos benignos y malignos así como enfermedades que resultan de la activación inapropiada del sistema inmune (por ejemplo, trastornos autoinmunes), rechazo de haloinjerto y enfermedad de injerto contra huésped. Además, las PTKs de receptor específico de célula endotelial, tales como KDR y Tie-2, median el proceso angiogénico, y de esta manera están involucradas en apoyar la progresión de cánceres y otras enfermedades que involucran vascularización inapropiada (por ejemplo, retinopatía diabética, neovascularización coroidal debido a degeneración macular relacionada con la edad, soriasis, artritis reumatoide, retinopatía de prematuro, hemangiomas infantiles, psoriasis y aterosclerosis). Las cinasas de tirosina pueden ser del tipo de receptor (teniendo dominios extracelular, de transmembrana e intracelular) o del tipo que no es de receptor (siendo completamente intracelulares).

Cinasas de Tirosina de Receptor (RTKs). Las cinasas de tirosina de receptor (RTKs) comprenden una gran familia de receptores de transmembrana con diversas actividades biológicas. En la actualidad, se han identificado por lo menos diecinueve (19) distintas subfamilias de RTK. La familia de cinasa de tirosina de receptor (RTK) incluye receptores que son cruciales para el crecimiento y diferenciación de una variedad de tipos de célula (Yarden y Ulrich, Ann. Rev. Biochem. 57:433-478, 1988; Ulrich y Schlessinger, Cell 61:243-254, 1990). La función intrínseca de las RTKs es activada después de la unión de ligando, ía cual da como resultado la fosforilación del receptor y múltiples substratos celulares, y subsecuentemente una variedad de respuestas celulares (Ulrich & Schlessinger, 1990, Cell 61:203-212). De esta manera, la transducción de serial mediada por cinasa de tírosina de receptor es iniciada por la interacción extracelular con un factor de crecimiento específico (ligando), típicamente seguido por dimerización de receptor, restimulación de la actividad de cinasa de tírosina de proteína intrínseca y trans-fosforilación de receptor. De esta manera. se crean sitios de unión para moléculas de transducción de señal intracelular y conducen a la formación de complejos con un espectro de moléculas de señalización citoplásmicas que facilitan la respuesta celular apropiada (por ejemplo, división celular, diferenciación, efectos metabólicos, cambios en el microambiente extracelular), ver, Schlessinger y Ulrich, 1992, Neuron 9:1-20. Las proteínas con dominios de unión de SH2 (homología src-2) o en fosfotirosina (PTB) unen receptores de cinasa de tírosina activados y sus substratos con alta afinidad para propagar señales hacia las células. Ambos dominios reconocen la fosfotirosina. (Fantl y otros, 1992, Cell 69:413-423; Songyang y otros, 1994, Mol. Cell. Biol.. 14:2777-2785; Songyang y otros, 1993, Cell 72:767-778; y Koch y otros, 1991, Science 252:668-678; Shoelson, Curr. Opin. Chem. Biol. (1997), 1(2), 227-234; Cowburn, Curr. Opin. Struct. Biol. (1997), 7(6), 835-838). Varias proteínas de substrato intracelular que se asocian con cinasas de tírosina de receptor (RTKs) han sido identificadas. Estas pueden ser divididas en dos grupos principales: (1) substratos que tienen un dominio catalítico; y (2) substratos que carecen de dicho dominio pero sirven como adaptadores y se asocian con moléculas catalíticamente activas (Songyang y otros, 1993, Cell 72:767-778). El carácter específico de las interacciones entre receptores o proteínas y los dominios SH2 o PTB de sus substratos es determinado a. través de los residuos de aminoácido inmediatamente rodeando el residuo de tirosina fosforilada. Por ejemplo, las diferencias en las afinidades de unión entre los dominios SH2 y las secuencias de aminoácido que circundan los residuos de fosfotirosina en receptores particulares se correlacionan con la diferencias observadas en sus perfiles de fosforilación de substrato (Songyang y otros, 1993, Cell 72:767-778). La observación sugiere que la función de cada cinasa de tirosina de receptor es determinada no solamente por su patrón de expresión y disponibilidad de ligando, sino que también por la disposición de trayectorias de transducción de señal corriente abajo que son activadas por un receptor particular, así como el tiempo y duración de esos estímulos. De esta manera, la fosforilación proporciona un paso regulador importante que determina la selectividad de trayectorias de señalización enganchadas por receptores de factor de crecimiento específicos, así como receptores de factor de diferenciación. Varias cinasas de tirosina de receptor, tales como FGFR-1, PDGFR, TIE-2 y c- et, y factores de crecimiento que se unen a las mismas, han sido sugeridos para jugar un papel importante en la angiogénesis, aunque algunos pueden promover angiogénesis indirectamente (Mustonen y Alitalo, J. Cell. Biol. 129:895-898, 1995). Tie-2 (TEK) es un miembro de una familia recientemente descubierta de cinasas de tirosina de receptor específico de célula endotelial, en cual está involucrado en procedimiento angiogénicos críticos, tales como ramificación, brotación, remodelación, maduración y estabilidad de vasos. Tie-2 es la primera cinasa de tirosina de receptor de mamífero para la cual se han identificado tanto ligandos agonistas (por ejemplo, angiopoietina 1 ("Ang1"), que estimula la autofosforilación de receptor y transducción de señal), como ligandos antagonistas (por ejemplo, angiopoietina 2 ("Ang2")). La manipulación fuera de combate y transgénica de la expresión de Tie-2 y sus ligandos indica un control espacial hermético y temporal de la señalización de Tie-2 que es esencial para el desarrollo apropiado de la nueva vasculatura. El modelo actual sugiere que la estimulación de cinasa de Tie-2 por el ligando Ang1 está directamente involucrada en la ramificación, brotación y crecimiento de nuevos vasos, y reclutamiento e interacción de células de soporte periendoteliales importantes para mantener la integridad del vaso e inducir inmovilidad. La ausencia de estimulación de Ang1 de Tie-2 o la inhibición de autofosforilación de Tie-2 mediante Ang2, que se produce a altos niveles en sitios de regresión vascular, puede ocasionar una pérdida en la estructura vascular y los contactos de matriz pueden dar como resultado la muerte de célula endotelial. especialmente en ausencia de estímulos de crecimiento/supervivencia. Sin embargo, la situación es más compleja ya que por lo menos dos ligandos Tie-2 adicionales (Ang3 y Ang4) recientemente han sido reportados, y se ha demostrado la capacidad para la heterooligomerizaación de las varias angiopoietinas agonísticas y antagonisticas, modificando así su actividad. La activación de interacciones de receptor de ligando de Tie-2 como un aspecto terapéutico anti-angiogénico es de esta manera menos favorable y se prefiere una estrategia inhibidora de cinasa. El dominio extracelular soluble de Tie-2 ("ExTek") puede actuar para interrumpir el establecimiento de vasculatura de tumor en un xenoinjerto de tumor de pecho y modelos de metástasis de pulmón y en neovascularización ocular mediada por célula de tumor. Por infección adenoviral la producción in vivo de niveles de mg/ml de ExTek en roedores se puede lograr durante 7-10 días sin ningún efecto lateral adverso. Estos resultados sugieren que la interrupción de las trayectorias de señalización de Tie-2 en animales saludables normales puede ser bien tolerada. Estas respuestas inhibidores de Tie-2 para ExTek pueden ser una consecuencia de secuestro de ligando(s) y/o generación de un heterodímero no productivo con Tie-2 de longitud completa. Recientemente, se ha encontrado que la sobrerregulación significativa de la expresión de Tie-2 dentro del pannus sinovia! vascular de articulaciones artríticas de seres humanos, de acuerdo con un papel importante en la neovascularicación inapropiada. Este hallazgo sugiere que Tie-2 juega un papel importante en la progresión de artritis reumatoide. Las mutaciones de punto que producen formas constitutivamente activadas de Tie-2 han sido identificadas en asociación con trastornos de mal formación venosa humanos. Por lo tanto, los inhibidores de Tie-2 son útiles para tratar dichos trastornos, y otras situaciones de neovascularización inapropiada. Los ejemplos de la presente describen la preparación y cristalización de polipéptidos que comprenden el dominio catalítico de Tie-2 humano. Como se utiliza aquí, el término "dominio catalítico" se refiere a un módulo específico común de todas las cinasas que unen ATP, tales como el sitio de unión de tirosilo, el sitio en donde ATP se une, incluyendo la región de unión de metal-ion, y el sitio en donde ocurre la transferencia de fosforilo. Para Tie-2, el dominio catalítico es definido a través de residuos de aminoácido de aproximadamente el residuo 828 a aproximadamente el residuo 985 de SEC ID NO:1, con los residuos 828-840, 853-855, 872, 873, 876, 879, 880, 885-888, 900, 902-909, 912, 954, 955. 960. 964, 968-971, y 980-985 incluidos en el dominio catalítico. Las secuencias de aminoácido de Tie-2 humano nativo (SEC ID NO:1) se toman como se define en SWISS-PROT (Ziegler, y otros. Oncogene 8:663 (1993)). Como se describe en los ejemplo, ciertos de estos cristales fueron examinados a través de cristalografía de rayos X y se obtuvieron coordenadas atómicas para péptido. En ciertos casos, el polipéptido no fue ligado, es decir, no está en complejo con un ligando. En otros casos, el polipéptido formó complejo con un ligando y también se obtuvieron las coordenadas atómicas del ligando unido al dominio catalítico de Tie-2. Tie-2 se somete a autofosforilación y transfosforilación a través de otras proteínas. El estado de fosforilación es una modificación de post-traducción particularmente importante de considerar. Una construcción de tipo silvestre (es decir, sin la mutación de D964N) teniendo los residuos 802-1124 de SEC ID NO:1 se aisló de un sistema de expresión como una especie fosforilada en forma individual o múltiple. Una especie individualmente fosforilada tiene su fosfato ya sea en Y897 o Y899. En las especies fosforiladas en forma múltiple, la fosforilación puede estar en combinaciones de muchos residuos Y sobre la proteína. Una especie disfosforilada se cristalizó en el grupo de espacio P2(1 )2(1 )2(1 ) con las dimensiones de célula unitaria de a=54.320 Á, b= 75.872 A, c=78.143 A, y a=ß=?=90.0°. El término "grupo de espacio" es un término en la técnica que se refiere a la colección de elementos de simetría de la célula unitaria de un cristal. Otros sitios de fosforilación se describen por Jones, N. y otros, J. Biol.. Chem. (1999), 274(43):30896. Un mutante catalíticamente inactivo de Tie-2 (SEC ID NO:2) también fue cristalizado. El mutante catalíticamente inactivo tuvo la misma secuencia como los residuos 802 al 1124 de Tie-2 humano, excepto que el residuo 964, el cual es ácido aspártico en Tie-2 humano de tipo silvestre, se reemplazó con asparagina. Esta substitución hizo al mutante catalíticamente inactivo. SEC ID NO:2 se cristalizó en el grupo de espacio C222 (1), que tuvo las dimensiones de célula unitaria de a=75.195 Á, b= 116.28 Á, c=95.060 A, y a=ß=?=90.0°. Las coordenadas atómicas para cuatro cristales de los complejos Tie-2/liga.ndos examinados a través de cristalización de rayos X se presentan en las Figuras 3A-300, 4A-400, 5A-5RR y 6A-6NN. El término "coordenadas atómicas) (o "coordenadas estructurales") se refiere a coordenadas matemáticas derivadas de ecuaciones matemáticas relacionadas con los patrones obtenidos en la difracción de rayos X a través de átomos (centros de difusión) de un polipéptido cristalino que comprende una molécula de dominio catalítico de Tie-2. Los datos de difracción se utilizan para calcular un mapa de densidad de electrones de la unidad de repetición del cristal. Los mapas de densidad de electrones son utilizados para establecer las posiciones los átomos individuales dentro de la célula unitaria del cristal. Las coordenadas atómicas pueden ser transformadas como es conocido en la técnica, a diferentes sistemas de coordenada sin afectar las posiciones relativas de los átomos. En particular, se obtuvieron cuatro estructuras de cristal de alta resolución para SEC ID NO:2, en complejo con uno a cuatro diferentes inhibidores, como se muestra a continuación: ?? Inhibidor III Inhibidor IV Los resultados de la determinación de estructura de cristal de rayos X para SEC ID NO:2, el dominio catalítico de Tie-2 humano, muestran las siguientes características: La estructura total adoptó un doblez de cinasa reconocible con un lóbulo N-terminal y un lóbulo C-terminal un poco más grande. La unión de ATP en la superficie colindante de los dos lóbulos con los inhibidores también uniendo en esta región. Los elementos estructurales secundarios principales del lóbulo N-terminal fueron una hoja beta de cinco estructuras de cadena y una hélice alfa larga. El lóbulo C-terminal principalmente fue un grupo de hélices alfa con una hoja beta corta, de dos estructuras de cadena, cerca de la superficie colindante con el lóbulo N-terminal. La Figura 7 muestra una cinasa de tirosína de receptor prototípica, cinasa de receptor de insulina que ilumina las características estructurales asociadas con cinasas conocidas. La estructura del dominio catalítico de Tie-2, mostrada en la Figura 9, tiene características similares a esto. La región de gozne conecta los lóbulos N-terminal y C-terminal. La porción del gozne que forma parte de la región de unión de ATP/inhibidor presenta varios patrones de unión de hidrógeno. Los átomos de carbonilo-oxígeno de E903, A905 y P906 y los protones de amida de estructura de cadena de A905, H907 y G908 se presentaron en la cavidad. Las cadenas laterales de L900, I902, Y904 y A905 ayudaron a definir el tamaño, forma y naturaleza de la cavidad de unión. La región de unión de núcleo de purina fue la región en donde los lóbulos N-terminal y C-terminal de la proteína cooperan para formar una región de unión predominantemente hidrofóbica, plana, la cual es la ubicación tradicional para el anillo de purina de ATP en otras estructuras de cinasa. Los residuos que contribuyen a esta región incluyeron I830, A853, V838, I886, L971 y A981. Las cadenas laterales de residuos en la región de gozne, I902, Y904 y A905 también contribuyeron al carácter hidrofóbico de esta región. El carbonilo-oxígeno de I830 y el protón de amida de V838 también presentaron un sitio de interacción con esta región. A través de anología a las estructuras de cinasa conocidas, el anillo de ribosa de ATP tradicionalmente puede ocupar un área entre G831 en el lóbulo N-terminal y N909 en el lóbulo C-terminal denominado la cavidad de azúcar extendida. Los protones de amida de estructura de base de G831, E832 y N909, el carbonilo-oxígeno de R968 y las cadenas laterales de E832, N909 y D912 presentaron patrones de enlace de hidrógeno. Por analogía a estructuras de cinasa conocidas, el ?-fosfato de ATP puede ocupar un área alrededor de las cadenas laterales de los residuos D964 (N964 en el mutante catalíticamente inactivo, SEC ID NO:2). La cadena lateral de R968 también contribuye a esta región. El tipo de interacción disponible predominante fue el enlace de hidrógeno, con algo de coordinación compleja. El lazo de unión de nucleótido, o lazo rico en glicina, fue un lazo de tipo aleta en el lóbulo N-terminal que cubrió la porción frontal de la región de unión de ATP. Los residuos todavía no descritos en otras áreas de unión incluyen D828, V829, G833, N834, F835, G836, Q837, L839, y K840. Los residuos I830, G831, E832 y V838 también fueron parte de este elemento estructural, pero ya habían sido incluidos en otras regiones de unión descritas anteriormente. Este lazo usualmente se considera como muy flexible y que es capaz de alterar la forma y el tamaño de la región de unión de ATP. Los átomos de carbonilo-oxígeno, los átomos de la cadena lateral N834 y los protones de amida de estructura de base de G833, N834 y F835 están potencialmente disponibles para el enlace de hidrógeno. Los átomos de cadena lateral de D828 y K840 estuvieron disponibles para interacciones de unión iónica/de hidrógeno. Estos átomos de cadena lateral de V829, 1830, F835 y L839 pueden contribuir a interacciones hidrofóbicas. El lazo de activación anterior fue un lazo flexible largo conteniendo por lo menos un residuo, la fosforilación del cual, generalmente se cree que determina el estado de activación de la proteína. El lazo comienza en el sitio de unión de ATP y termina en el lóbulo C-terminal en el área que muy probablemente corresponde a la unión de substrato. Los residuos F983, G984 y L985 forman parte del sitio de unión de ATP y también estuvieron en el sitio N-terminal del lazo de activación. Los protones de carboxiio-oxígeno y amida de F983 y G984 y el protón de amida de L985 estuvieron disponibles para la unión de hidrógeno y las cadenas laterales de F983 y L985 pueden contribuir a interacciones hidrofóbicas. K855, por homología a cinasas conocidas, es parte del mecanismo catalítico de la cinasa. El grupo amino puede participar en interacciones de unión iónica o de hidrógeno y los grupos metileno pueden contribuir a interacciones hidrofóbicas. La cadena lateral es muy móvil.

La cavidad hidrofóbica distante se caracteriza por una cavidad hidrofóbica enterrada. Esta porción de la región de unión ATP no está ocupada por ningún átomo ATP en estructuras de cinasa conocidas. Los residuos que contribuyen a esta cavidad incluyen L873, L876, L879, 1885, L888, Y954, L955, F960 y 1980. 1886, A981 y F983 de regiones ya descritas también contribuyen a interacciones hidrofóbicas para esta región. Además, existe un número de patrones de unión de hidrógeno de estructura de base disponibles en esta área. Estos patrones incluyen los átomos de carbonilo-oxígeno de ?88T, L879 y G880. Con la interacción aparente de la hélice alfa-C, los átomos de carbonilo-oxígeno de E882, L873 y L876 también están disponibles. El protón de amida de estructura de base de los residuos I886 y L888 también estuvo disponible en esta región. Varios residuos contribuyeron al sitio de unión de ATP/inhibidor pero no parecen ser parte de una subregión que se puede definir. Estos residuos son I854, E872, N887, I970 y 1980. E872 por lo general forma una interacción iónica con la lisina catalítica en estructuras de cinasa conocidas. N887 puede contribuir a la cavidad hidrofóbica distante. Las cadenas laterales de 1854 e 1970 miran lejos de la cavidad ATP, sin embargo, los átomos de carbonilo-oxígeno de estos residuos así como 1980 se presentaron hacia la región de unión. La estructura del complejo de SEC ID NO:2/inhibidor tuvieron las siguientes características: La resolución final de la estructura fue de 2.8 A en el grupo de espacio C2221, con las coordenadas finales determinadas para átomos de estructura de base de los residuos 818-857, 864-965; 1001-1116. El anillo de pirrolopirimidina del inhibidor I formó enlaces de hidrógeno con los residuos en la región del gozne e interactúa con la región de núcleo de purina. El núcleo del inhibidor presentó un donador de enlace de hidrógeno en la forma del protón amino del substituyente 4-NH2, para el carbonilo-oxígeno de E903. El átomo N3 del anillo pirimidina aceptó un enlace de hidrógeno de N-H de estructura de base de A905. Este sistema de anillo del núcleo presentó una cara plana a los residuos tanto de los lóbulos C-terminal como N-terminal. Los residuos en estas áreas presentan una superficie hidrofóbica que, "empareda" el núcleo plano del inhibidor. Los residuos involucrados en esta región de emparedado hidrofóbica incluyen I830, V838, I86, I902 y L971. Los átomos N1 y N7 del núcleo inhibidor que mira al solvente expusieron la boca de la cavidad de unión. El átomo C6 del inhibidor que mira a lo largo del eje del lazo de unión de nucleótido del lóbulo N-terminal de la proteína. El anillo de ciclopentano de N7 del inhibidor I fue dirigido hacia el solvente, pero sigue dentro de la cavidad de la proteína. Esta región se describió anteriormente como la cavidad de azúcar extendida. Esta región se caracterizó por interacciones hidrofóbicas principalmente con I830 y L971. Los grupos metileno de E832 también contribuyen de esta manera.

El anillo fenilo unido a C5 del anillo pirrolopirimidina fue un área predominantemente hidrofóbica, generada por residuos de la región de núcleo de purina, la cavidad hidrofóbica distante y grupos metileno de la Usina catalítica, K855. Los contactos hidrofóbicos fueron con los residuos V838, 1886. 1902, L971 y A981. La lisina 855 fue altamente móvil, de manera que también fue posible que el anillo meta para pirrolopirimidina del átomo de cloro fue recibido como un enlace de hidrógeno. El enlazador de sulfonamida puede hacer un enlace de hidrógeno transparente con un protón de amida de D982 y también puede hacer un enlace de hidrógeno con el protón de amida de F983.

El anillo fenilo terminal fue localizado en la cavidad hidrofóbica distante. Los contactos primarios fueron con L876, I886, L888 y F983. La estructura de los complejos de SEC ID NO:2/inhibidor II, SEC IDNO:2/inhibidor III y SEC ID NO: 2/¡n hibidor IV tuvieron las siguientes características: Los residuos 818-857, 864-995, 1001-1116 han sido modelados a la estructura resuelta. Se observó un grupo de espacio P42212. Todo el doblamiento es un doblamiento de dominio catalítico de cinasa estándar aún y las regiones de unión descritas anteriormente para SEC ID NO:2/inhibidor I siguen perteneciendo. El núcleo de pirrolopirimidina, anillo B, enlazador y anillo C del inhibidor II en el complejo de SEC ID NO:2/inhibidor se encontró de la misma forma como el inhibidor I. Además, el grupo ?-7-ciclohexil- N-metilpiperacinilo ocupó la cavidad de azúcar extendida e hizo una fuerte interacción-iónica con D912. La pirrolopirimidina del inhibidor II se unió de la misma manera en el complejo de SEC ID NO:2/inhibidor III como el inhibidor I. El grupo ?-7-ciclohexil-N-metilpiperacinilo ocupó las cavidades de azúcar extendida e hizo una fuerte interacción iónica con D912 como en el complejo de SEC ID NO:2/inhibidor II. El anillo B se unió en una forma similar al inhibidor I, sin embargo, la unión de hidrógeno entre halógenos, flúor en este caso, y K855 fue más clara. Los sulfoniloxiloxigenos del enlazador de sulfonamida hicieron dos enlaces de hidrógeno transparente para protones de amida de estructura de cadena de D983 y F983. El anillo C ocupó la cavidad hidrofóbica distante con interacciones principales viniendo de L876, I886, L888, L900, I900, I902 y F983. El núcleo de pirrolopirimidina del inhibidor IV en el complejo de SEC ID NO:2/inhibidor IV se encontró igual como el inhibidor I. El grupo ?-7-ciclohexil-N-metilpiperacinilo ocupa la cavidad de azúcar extendida y hace una fuerte interacción iónica con D912 como en SEC ID NO:2/inhibidor II. El anillo B se une en una forma similar al inhibidor I, sin embargo, no hay ningún átomo de halógeno que actúe como un patrón de enlace de hidrógeno potencial en el inhibidor IV. El átomo de oxígeno del enlazador aceptó un enlace de hidrógeno de la lisina catalítica, K855. El anillo C del inhibidor IV ocupó la cavidad hidrofóbica distante con las interacciones principales viniendo de L876, I886, I902 y F983.

En análisis de la estructura tridimensional del dominio catalítico de Tie-2 ha indicado la presencia de un número de subsitios, cada uno de los cuales incluye grupos funcionales moleculares capaces de ¡nteractuar con porciones complementarias de un inhibidor. Los subsitios 1 a 9 del dominio catalítico de Tie-2 como se definió anteriormente. Un resumen de las propiedades de las porciones químicas presentes en cada subsitio se presenta más adelante. Los subsitios se caracterizan más delante de acuerdo con las propiedades de las porciones químicas con las cuales son complementarios, o con los cuales pueden ¡nteractuar. Dichas porciones pueden incluir aceptores de enlace de hidrógeno, tales como átomos de hidroxilo, amino, éter, tioéter, carboxilo, P=0, y grupos carbonilo, átomos de halógeno tales como átomos de flúor, cloro, bromo y yodo; y otros grupos incluyendo un átomo heterogéneo que tiene por lo menos un par largo de electrones tales como grupos que contienen átomos de fósforo trivalentes, átomos de azufre di y tetravalente, átomos de oxígeno y nitrógeno; donadores de enlace de hidrógeno, tales como hidroxilo, tiol, un protón de amida, protones de amina, grupos de ácido carboxílico y cualquiera de los grupos listados bajo los aceptores de átomo de hidrógeno a los cuales está unido un átomo de hidrógeno; grupos hidrofóbicos, tales como alquil lineal, ramificado o cíclico, éter o grupos tioalquilo; grupos alquenilo lineales, ramificados y cíclicos; grupos alquinilo lineales, ramificados o cíclicos; grupos arilo, tales como grupos hidrocarbilo aromáticos mono y policíclicos y grupos heterocíclicos mono y policíclicos o heteroarilo; grupos positivamente cargados, tales como grupos de amonio cuaternario primario, secundario y terciario, imidazolio y otras porciones heteroalquilo y heteroarilo protonadas, grupos guanidinio substituido y no substituido, grupos sulfonio y grupos fosfonio; y grupos negativamente cargados, tales como carboxilato, fenilato, tiolato, sulfonamida, sulfamato, boronato, vanadato, sulfonato,. sulfinato, fosfinato, tetrasolato, y otros aniones heteroarilo, N-óxidos heterociclicos y grupos fosfonato. Una porción química proporcionada puede contener uno o más de estos grupos. Subsitio 1: Región de gozne. Aceptores de hidrógeno: Carbonilo-oxígeno de estructura de base de los residuos E903, A905 y P906 de los aceptores de protón de la presente. Donadores de hidrógeno: Los protones de amida de estructura de base de los residuos de donadores de protón de la presente A905, H907 y G908. Grupos hidrofóbicos: Las cadenas laterales de L900, 1902, Y904 y A905 presentan grupos hidrofóbicos.

Subsitio 2: La Región de Unión del Núcleo de Purina. Grupos Hidrofóbicos: Los residuos 1830, A853, V838, 1886, L971, A981 y las cadenas laterales de los residuos I902. Y904 y A905 representan grupos hidrofóbicos. Aceptores de hidrógeno: Carbonilo-oxígeno de I830 presenta un aceptor de protón.

Donadores de hidrógeno: El protón amida de V838 presenta un donador de protón.

Subsitio 3: La Cavidad de Azúcar Extendida. Aceptores de hidrógeno: El carbonil-oxígeno de estructura de base de R968 y el carbonilo-oxígeno de cadena lateral de E832, N909 y D912 presentan aceptores de proteína. Donadores de hidrógeno: Los protones de amida de estructura de cadena de donadores de protón G831, E832 y N909 presentes.

Subsitio 4: Región ?-fosfato Extendida. Grupos de unión de hidrógeno: residuos D964 (N964 en el mutante catalíticamente inactivo), N969 y D982 presentan tanto grupos donadores de protón como aceptores de protón.

Subsitio 5: Lazo de Unión de Nucleótido. Aceptores de hidrógeno: El carboni-oxígeno de la cadena lateral de N834, residuo, presenta un aceptor de protón. Donadores de hidrógeno: Los protones de amida de estructura de base de los residuos G833, N834 y F835 presentan donadores de protón. Grupo positivamente cargado: La cadena lateral de K840 presente en un sitio positivamente cargado. Grupo negativamente cargado: La cadena lateral de D828 presenta un sitio negativamente cargado.

Grupos hidrofóbicos: Los residuos de V829, 1830, F835 y L839 presentan grupos hidrofóbicos.

Subsitio 6: Lazo de Activación Temprana. Aceptores de hidrógeno: El carbonilo-oxígeno de la estructura de base de los residuos de base de los residuos F983 y G984 presenta un aceptor de protones. Donadores de hidrógeno: Los protones de amida de estructura de base de los residuos F983, G984 y L985 presentan donadores de protón. Grupos hidrofóbicos: Las cadenas laterales de F983 y L985 presentan grupos hidrofóbicos.

Subsitio 7: La Lisina Catalítica. Grupo positivamente cargado: La cadena lateral de K855 presenta un sitio positivamente cargado. Grupo hidrofóbico: Los grupos metileno de la cadena lateral de K855 presentan un grupo hidrofóbico.

Subsitio 8: La cavidad hidrofóbica distante. Grupos hidrofóbicos: Los residuos L873, L876, L879. I885, L888, Y954, L955, F960, I980, I886, A981 y F983 de la presente invención. Aceptores de hidrógeno: Carboni-oxígeno de estructura de base de los residuos I886, L879, G880, E872, L873 y L876 presentan aceptores de protón.

Donadores de hidrógeno: Los protones de amida de estructura de base de los residuos I886 y L888 presentan donadores de protón.

Subsitio 9: Varios sitios de interacción que contribuyen al sitio de unión de ATP. Aceptores de hidrógeno: Los carbonilo-oxfgenos de estructura de base de los residuos. I854, I970 e I980 presentan aceptores de protón en la región de unión de ATP. Grupos negativamente cargados: E872 presenta un grupo negativamente cargado, el cual por lo regular forma un enlace iónico con el residuo de lisina catalítica K855.

La Figura 9 proporciona un modelo del dominio catalítico de Tie-2 unido al inhibidor I. Los subsitios 1-9 del dominio catalítico cada uno está representado en un color diferente como sigue: la región de gozne (azul oscuro), el núcleo de purina (azul claro), la cavidad de azúcar extendida (púrpura claro), la región de ?-fosfato (amarillo oscuro), el lazo de unión de nucleótido (rojo), el lazo de activación temprana (verde oscuro), la lisina catalítica (verde claro), la cavidad hidrofóbica distante (púrpura oscuro), y los varios sitios de interacción (café). El inhibidor está presentado en un color amarillo claro. En una modalidad, la presente invención proporciona polipéptidos que comprenden el dominio catalítico de Tie-2. formas cristalinas de estos polipéptidos, opcionalmente en complejo con un ligando, y la estructura tridimensional de los polipéptidos, incluyendo la estructura tridimensional del dominio catalítico Tie-2. En general, estas estructuras tridimensionales son definidas por coordenadas atómicas derivadas de estudios cristalográficos de rayos X de los polipéptidos. El dominio catalítico puede ser no fosforilado, monofosforilado o fosforilado en forma múltiple. La fosforilación típicamente ocurre . en los residuos de tirosina. Una especie monofosforilada tiene un grupo fosfato en Y897 o Y899. Los polipéptidos pueden incluir el dominio catalítico de Tie-2 a partir de cualquier especie, tal como una levadura u otro organismo unicelular, un invertebrado o un vertebrado. Preferiblemente, el polipéptido incluye el dominio catalítico de un Tie-2 de mamífero, tal como Tie-2 de murino. Muy preferiblemente, el polipéptido incluye el dominio catalítico de Tie-2 humano. Los polipéptidos de la invención también incluyen polipéptidos que comprenden polimorfismos de nucleótido individual del dominio catalítico de Tie-2 humano o Tie-2 de murino. En una modalidad, los polipéptidos de la invención, y sus formas cristalinas incluyen una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad al dominio catalítico de Tie-2 humano o Tie-2 de murino. Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácido, las secuencias son alineadas para propósitos de comparación óptimos (por ejemplo, se pueden introducir huecos en una o ambas de una primera y una segunda secuencia de aminoácido o de ácido nucleico para una alineación óptima, y secuencias no homólogas (diferentes) pueden ser desechadas para propósitos de comparación). En una modalidad preferida, la longitud de una primera secuencia alineada para propósitos de comparación es por lo menos 30%, de preferencia por lo menos 40%, muy preferiblemente por lo menos 50%, de preferencia por lo menos 60%, y aún muy preferiblemente 70%, 80% o 90% de la longitud de la segunda secuencia. Los residuos de aminoácido en las posiciones de aminoácido correspondientes después son comparados. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo residuo de aminoácido como la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias, tomando en cuenta el número de huecos, y la longitud de cada hueco, que necesita ser introducido para una alineación óptima de las dos secuencias. La invención también abarca polipéptidos que tienen un grado menor de identidad pero que tienen una homología suficiente con el fin de realizar una o más de las mismas funciones realizadas por los polipéptidos Tie-2 descritos aquí a través de la secuencia de aminoácido. La homología para un polipéptido se determina a través de sustitución de aminoácido conservadora. Dichas substituciones son aquellas que substituyen un aminoácido dado en un polipéptido por otro aminoácido de características similares. Las substituciones conservadoras probablemente pueden ser fenotípicamente silenciosas. Típicamente visto como substituciones conservadoras son los reemplazos, uno por otro, por ejemplo, entre los aminoácidos alifáticos Ala, Val, Leu, y He; intercambio de los residuos de hidroxilo Ser y Thr, intercambio de los residuos ácidos Asp y Glu, substitución entre los residuos de amida Asn y GIn, intercambio de los residuos básicos Lys y Arg, o reemplazo entre los residuos aromáticos Phe, Tyr.y Trp. La guía con respecto a que cambios de aminoácido van a ser probablemente silenciosos en forma fenotípica se encuentra en Bowie y otros, Science 247:1306-1310 (1990). La comparación de secuencias y determinación del porcentaje de identidad y homología entre dos secuencias se pueden lograr utilizando un algoritmo matemático. {Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed. Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W. ed. Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis oí Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds. Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereaux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991). En una modalidad preferida, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácido se determina utilizando el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Biol. (48:444-453 (1970)), el cual ha sido incorporado en el programa de GAP en el paquete de software de GCG (disponible el 29 de marzo del 2000 en http://www.gcg.com), utilizando ya sea una matriz Blossom 62 o una matriz PA 250, y un peso de hueco de, por ejemplo, 14, 16, 12, 10, 8, 6 o 4 y un peso de longitud, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 o 6. En otra modalidad preferida, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótido se determina utilizando el programa de GAP en el paquete de software GCG (Devereux, J., y otros, Nucleic Acids Res. 12(1):387 (1984)) (disponible el 29 de marzo del 2000 en http://www.gcg.com), utilizando la matriz NWSgapdna.CMP y un peso de hueco de, por ejemplo, 40, 50, 60, 70 u 80 y un peso de longitud de, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 o 6. En otra modalidad, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácido de nucleótido se determina utilizando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (CABIOS, 4:11-17 (1989)), el cual ha sido incorporado en el programa de ALIGN (versión 2.0), utilizando, por ejemplo, una tabla de residuo de peso PAM120, una penalidad de longitud de hueco de 12 y una penalidad de hueco de 4. Las secuencias de proteina de la presente invención, por ejemplo, los aminoácidos 802-1124 de Tie-2 humano (SEC ID NO:1), además se pueden utilizar como una "secuencia de pregunta" para realizar una búsqueda contra bases de datos para, por ejemplo, identificar otros miembros de familia o secuencias relacionadas. Dichas investigaciones pueden ser realizadas utilizando los programas NBLAST y XBLAST (versión 2.0) de Altschul, y otros (J. Mol. Biol. 215:403-10 (1990)). Las búsquedas de proteina BLAST pueden ser realizadas con el programa XBLAST, por ejemplo, clasificación = 50, longitud de palabra = 2, para obtener secuencias de aminoácido homólogas a las proteínas de la invención. Para obtener alineaciones con hueco para propósitos de comparación, se puede utilizar BLAST con hueco como se describe por Altschul y otros, {Nucleic Acids Res. (25(17):3389-3402 (1997)). Cuando se utilizan los programas BLAST y BLAST con hueco, los parámetros por omisión de los programas respectivos (por ejemplo, XBLAST y NBLAST) se pueden utilizar como se da el 29 de marzo de 2000 en http://www.ncbi.nlm.nih.gov. La homología para secuencias de aminoácido puede ser definida en términos de los parámetros establecidos por la investigación de Advanced Blast disponible de NCBI (the National Center for Biotechnology Information; ver, para Advanced BLAST, www.ncbi.nlm.nih.Qov/cQ¡-bin/BLAST/nph-newblast?Jform= (marzo 29, 2000). Estos parámetros por omisión recomendados por una molécula de pregunta de longitud mayor que 85 residuos de aminoácido o nucleótidos han sido establecidos como sigue: costo de existencia de hueco, 11, por costo de hueco de residuo, 1; relación de Lambda, 0.85. Más explicación de la versión 2.0 de BLAST se puede encontrar en páginas de sitio web relacionadas y en Altschul, S. F. y otros, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997). En una modalidad, el polipéptido incluye los aminoácidos 802 a 1124 de SEC ID NO:1. los poiipéptidos también pueden tener los aminoácidos 782 a 1124, 782 a 1124, 772 a 1124, 812 a 1124, 822 a 1124, 832 a 1124, 802 a 1114, 802 a 1104, o 802 a 1094 de SEC ID NIO.-1. En otra modalidad, el polipéptido puede ser un mutante catalíticamente inactivo de Tie-2, tal como SEC ID NO:2, en donde el aminoácido asparagina en T64 es reemplazado con un aminoácido de ácido aspártico (designado como el mutante D964N). Otros mutantes catalíticamente inactivos incluyen substitución del aminoácido asparagina en 964 con alanina, serina, treonina o glicina. En otra modalidad, el dominio catalítico, el cual es cristalizado, puede tener eliminaciones de aminoácidos de la secuencia nativa, por ejemplo, un polipéptido que es adecuado para la cristalización puede incluir los aminoácidos 802 a 918 de SEC ID NO:1 fusionados a los aminoácidos 934 al 1124 de SEC ID NO:1 u otras eliminaciones de "dominio de inserto de cinasa" relacionados. El polipéptidos cristalino, preferiblemente además incluye un ligando unido al dominio catalítico de Tie-2. El ligando, preferiblemente, es una molécula orgánica pequeña (peso molecular menor que aproximadamente 1500), por ejemplo, el inhibidor I, II, III o IV. En una modalidad, la invención se refiere a un método para determinar la estructura tridimensional de un primer polipéptido que comprende el dominio catalítico de una proteína Tie-2. El método incluye los pasos de (1) obtener un cristal comprendiendo el primer polipéptido; (2) obtener datos de difracción de rayos X para dicho cristal; y (3) utilizar los datos de difracción de rayos X y las coordenadas atómicas de un segundo polipéptido comprendiendo el dominio catalítico de una proteína Tie-2 para resolver la estructura de cristal del primer polipéptido, determinando así la estructura tridimensional del primer polipéptido. El segundo polipéptido puede incluir el mismo dominio catalítico Tie-2 como el primer polipéptido, o un dominio catalítico Tie-2 diferente. Cualquiera o ambos de ios primero y segundo polipéptidos, opcionalmente puede formar complejo con un ligando. Es decir, el cristal del primer polipéptido puede comprender un complejo del primer polipéptido con un ligando. Las coordenadas atómicas del segundo polipéptido, opcionalmente, pueden incluir las coordenadas atómicas de una molécula de ligando unida al segundo polipéptido. Las coordenadas atómicas del segundo polipéptido, en general, han sido obtenidas previamente, por ejemplo, a través de análisis cristalográfico de rayos X de un cristal comprendiendo el segundo polipéptido o un complejo el segundo polipéptido con un ligando. Las coordenadas atómicas del segundo polipéptido pueden ser utilizadas para resolver la estructura de cristal utilizando métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, reemplazo molecular o reemplazo isomorfo. De preferencia, el segundo polipéptido comprende el dominio catalítico de un Tie-2 de mamífero, muy preferiblemente, Tie-2 humano. Por ejemplo, las coordenadas atómicas que pueden ser utilizadas incluyen las coordenadas atómicas presentadas aquí, de preferencia las coordenadas atómicas presentadas en las Figuras 3-7. La invención también proporciona un método para identificar un compuesto que es un inhibidor potencial de Tie-2. El método comprende los pasos de (1) obtener un cristal de un polipéptido que comprende el dominio catalítico de Tie-2; (2) obtener las coordenadas atómicas del polipéptido través de estudios de difracción de rayos X utilizando dicho cristal; (3) utilizar dichas coordenadas atómicas para definir el dominio catalítico de Tie-2; y (4) identificar un compuesto que se ajuste al dominio catalítico. El método además puede incluir los pasos de obtener, por ejemplo, a partir de una colección de compuesto, o sintetizando el compuesto identificado en el paso 4, y determinar la habilidad del compuesto identificado para inhibir la actividad enzimática de Tie-2. El polipéptido preferiblemente comprende el dominio catalítico de un Tie-2 en mamífero. Muy preferiblemente, el polipéptido comprende el dominio catalítico de Tie-2 humano en una modalidad preferida, el polipéptido es un polipéptido de la presente invención, como se describió anteriormente. El polipéptido puede ser cristalizado utilizando métodos conocidos en el campo, tales como los métodos descritos en los ejemplos, para dar cristales de polipéptido que son adecuados para estudios de difracción de rayos X. Un complejo de polipéptido/ligando cristalino puede ser producido remojando el polipéptido cristalino resultante en una solución incluyendo el ligando. De preferencia, la solución del ligando está en un solvente en donde el polipéptido es insoluble. Las coordenadas atómicas del polipéptido (y ligando) pueden ser determinadas, por ejemplo, a través de cristalografía de rayos X utilizando métodos conocidos en el campo. Los datos obtenidos de la cristalografía pueden ser utilizados para generar coordenadas atómicas, por ejemplo, de los átomos del polipéptido y el ligando, si están presente. Como es conocido en ia técnica, la solución y refinamiento de la estructura de cristal de rayos X puede dar como resultado la determinación de coordenadas para algunos o todos los átomos que no son de hidrógeno. Las coordenadas atómicas pueden ser utilizadas, como es conocido en la técnica, para generar una estructura tridimensional del dominio catalítico de Tie-2. Esta estructura también puede ser utilizada para determinar la habilidad de cualquier compuesto dato, preferiblemente utilizando métodos a base de computadora, para fijarse en el dominio catalítico. Un compuesto se fija en el dominio catalítico si éste es de un tamaño y forma adecuados para recibir físicamente en el dominio catalítico, es decir, si tiene una forma que es complementaria al dominio catalítico y puede residir en el dominio catalítico sin interaciones estéricas o de van der Waals importantes desfavorables. De preferencia, el compuesto incluye uno o más grupos y/o porciones funcionales que interactúan con uno o más subsitios dentro del dominio catalítico. Los métodos computacionales para evaluar la habilidad del compuesto para fijarse en el dominio catalítico, como se definió por las coordenadas atómicas del polipéptido, son conocidos en la técnica, y a continuación se proporcionan ejemplos representativos. En otra modalidad, el método para identificar un inhibidor potencialmente Tie-2 comprende el paso de determinar la habilidad de uno o más grupos y/o porciones funcionales del compuesto, cuando están presentes en el dominio catalítico de Tie-2 para interactuar con uno o más subsitios del dominio catalítico de Tie-2. Preferiblemente, el dominio catalítico de Tie-2 es definido por las coordenadas atómicas de un polipéptido que comprende el dominio catalítico de Tie-2. Si el compuesto es capaz de interactuar con un número o grupo preseleccionado de subsitios, el compuesto es identificado como un inhibidor potencial de Tie-2. Un grupo o porción funcional del compuesto se dice que "interactúa" con un subsitio del dominio catalítico de Tie-2 si éste participa en una interacción energéticamente favorable estabilización con una o más porciones complementarias dentro del subsitio. Dos porciones químicas son "complementarias" si son capaces de, cuando se colocan convenientemente, participar en una interacción atractiva o de estabilización, tal como una interacción electrostática o de van der Waals. Típicamente, la interacción atractiva es un enlace de ion-ion (o puente de sal), ión-dipolo, dipolo-dipolo, dihidrógeno, o interacción pi-pi o hidrofóbica. Por ejemplo, una porción negativamente cargada y una porción positivamente cargada son complementarias ya que, si se colocan en forma adecuada, puede formar un puente de sal. Asimismo, un donador de enlace de hidrógeno y un aceptor de enlace de hidrógeno son complementarios si se colocan convenientemente. Típicamente, una determinación de interacciones entre el compuesto de prueba y el dominio catalítico de Tie-2 puede emplear métodos computacionales a base de computadora, tales como aquellos conocidos en la técnica, en donde se evalúan posibles interacciones de un compuesto con la proteína, según definido por las coordenadas atómicas, con respecto a la resistencia de interacción calculando la energía de interacción sobre la unión del compuesto a la proteína. Los compuestos que tienen energías de interacción calculadas dentro de una escala pre-seleccionada o las cuales de otra manera, en la opinión del químico computación que emplea el método, tienen el mayor potencial como inhibidores de Tie-2, pueden ser provistos, por ejemplo, de una colección de compuesto o a través de síntesis, y analizarse para la habilidad para inhibir Tie-2. La energía de interacción para un compuesto dado generalmente depende de la habilidad del compuesto para interactuar con uno o más sitios dentro del dominio catalítico de proteína. En una modalidad, las coordenadas atómicas utilizadas en el método son las coordenadas atómicas establecidas en las Figuras 3A-300, 4A-400, 5A-5RR y 6A-6NN. Se debe entender que las coordenadas establecidas en las Figuras 3-6 pueden ser transformadas, por ejemplo, a un sistema de coordenadas diferente, en formas conocidas por aquellos expertos en el campo sin cambiar substancialmente la estructura tridimensional representada ahí. En ciertos casos, una porción del compuesto puede interactuar con un subsitio a través de dos o más interacciones individuales. Una porción del compuesto y un subsitio pueden interactuar si tienen propiedades complementarias y están colocados en una cercanía suficiente y en una orientación adecuada para que ocurra una interacción de estabilización. La posible escala de distancia para la porción del compuesto y el subsitio dependen de la dependencia de distancia de la interacción, como es conocidos en la técnica. Por ejemplo, un enlace de hidrógeno típicamente ocurre cuando un átomo donador de enlace de hidrógeno, el cual lleva un átomo de hidrógeno, y un átomo aceptor de una unión de hidrógeno se separan por aproximadamente 2.5 A y aproximadamente 3.5 A. Los enlaces de hidrógeno son bien conocidos en la técnica (Pimentel y otros, The Hydrogen Bond, San Francisco: Freeman (1960)). En general, toda la interacción, o unión, entre el compuesto y el dominio catalítico Tie-2 dependerán del número y resistencia de estas interacciones individuales. La habilidad de un compuesto de prueba para interactuar con uno o más subsitios del dominio catalítico de Tie-2 se puede determinar evaluando computacionalmente interacciones entre grupos funcionales, o porciones, del compuesto de prueba y una o más cadenas laterales de aminoácido en un subsitio de protefna particular, tal como los subsitios 1 a 9 anteriores. Típicamente, un compuesto que es capaz de participar en interacciones de estabilización con un número preseleccionado de subsitios, preferiblemente sin participar en forma simultánea en interacciones de desestabilización importantes, es identificado como un inhibidor potencial de Tie-2. Dicho compuesto interactuará con uno o más subsitios, preferiblemente con dos o más subsitios y, muy preferiblemente, con tras o más subsitios. La invención además proporciona un método para diseñar un compuesto que sea un inhibidor potencialmente Tie-2. El método incluye los pasos de (1) identificar uno o más grupos funcionales capaces de interactuar con uno o más subsitios del dominio catalítico de Tie-2; y (2) identificar un andamio que presente el grupo funcional o grupos funcionales identificados en el paso 1 en una orientación adecuada para interactuar con uno o más subsitios del dominio catalítico de Tie-2. El compuesto que resulta de la unión de los grupos o porciones funcionales identificados al andamio identificado es un inhibidor potencial de Tie-2. El dominio catalítico de Tie-2, generalmente, es definido por la secuencia homologa conservada cuando se compara con otras cinasas de tirosina conocidas, por ejemplo, las coordenadas atómicas establecidas en las Figuras 3A-300, 4A-400, 5A-5RR y 6A-6NN. Los métodos adecuados, como es bien conocido en la técnica, pueden ser utilizados para identificar porciones químicas, fragmentos o grupos funcionales que sean capaces de interactuar favorablemente con un subsitio particular o grupos de subsitios. Estos métodos incluyen, pero no se limitan a: gráficas moleculares interactivas; mecánica molecular; análisis conformacional; evaluación de energía; acoplamiento; búsqueda de base de datos; modelación de farmacóforo; diseño y estimación de propiedad de nodo. Estos métodos también pueden ser empleados para ensamblar porciones químicas, fragmentos o grupos funcionales en una sola molécula inhibidora. Estos mismos métodos pueden ser usados para determinar si una porción química dada, fragmento o grupo funcional es capaz de interactuar favorablemente con un subsitio particular o grupo de subsitios. En una modalidad, el diseño de inhibidores de Tie-2 humano potenciales comienza desde la perspectiva general de la forma tridimensional y complementaridad electrostática para el dominio catalítico, abarcando los subsitios 1-9, y subsecuentemente, se pueden aplicar técnicas de modelación molecular interactivas por cualquier experto en la técnica para visualmente inspeccionar la calidad de ajuste de un inhibidor candidato moldeado al sitio de unión. Los programas de visualización adecuados incluyen INSIGHTII (Molecular Simulations Inc., San Diego, CA), QUANTA (Molecular Simulations Inc., San Diego, CA), SYBYL (Tripos Inc., St. Louis, MO), RASMOL (Roger Sayle y otros, Tends Biochem Sci. 20:374-376 (1995)), GRASP (Nicholls y otros, Proteins 11:281-289 (1991)), y MIDAS (Ferrin y otros, J. Mol. Graphics (6:13-27 (1988)). Una modalidad adicional de la presente invención utiliza un programa de búsqueda de base de datos que es capaz de explorar una base de datos de moléculas pequeñas de estructura tridimensional conocida para candidatos que se fijen al sitio de unión de proteína objetivo. Los programas de software adecuados incluyen CATALYST (Molecular Simulations Inc., San Diego, CA), UNITY (Trypos inc, St. Louis, MO), FLEXX (Rarey y otros, J. Mol. Biol. 261:470-489 (1996)), CHEM-3DBS (Oxford Molecular Group, Oxford, UK), DOCK, (Kuntz y otros, J. Mol. Biol. 161:269-288 (1982)), y MACCS-3D (MDL Information Systems Inc., San Leandro, CA). No se espera que las moléculas encontradas en la búsqueda necesariamente sean conducidas por si mismas, ya que necesariamente se hará una evaluación completa de todas las interacciones durante la búsqueda inicial. Más bien, se anticipa que dichos candidatos deben actuar como la estructura para un diseño adicional, proporcionando esqueletos moleculares a los cuales se pueden hacer reemplazos atómicos apropiados. Claro que, la complementaridad química de esas moléculas puede ser evaluada, pero se espera que el andamio, grupos funcionales, enlazadores y/o monómeros puedan ser cambiados para incrementar al máximo las interacciones electrostáticas, de unión de hidrógeno e hidrofóbicas con la enzima. Goodford (Goodford J. Med. Chem. 28:849-857 (1985)) ha producido un programa en computadora, GRID, que busca determinar regiones de alta afinidad para diferentes grupos químicos (denominados sondas) sobre la superficie molecular del sitio de unión. El programa GRID de esta manera proporciona una herramienta para sugerir modificaciones a ligandos conocidos que puedan mejorar la unión. Una escala de factores, incluyendo interacciones electrostáticas, unión de hidrógeno, interacciones hidrofóbicas, efectos de desolvatación, tensión o movilidad conformacional, quelatación e interacción y movimientos cooperativos de ligando y enzima, todos tienen influencia en el nivel de unión y deben ser tomados en cuenta en intentos para diseñar inhibidores bioactivos. En otra modalidad más de un método de diseño molecular ayudado por computadora para identificar inhibidores, comprende buscar fragmentos que se ajusten a un subsitio de región de unión y se enlacen a un andamio predefinido. El mismo andamio puede ser identificado de dicha forma. Los programas adecuados para la búsqueda de dichos grupos funcionales y monómeros incluyen LUDI (Boehm, J. Comp. Aid. Mol. Des. 6:61-78 (1992)), CHAVETA (Bartlett y otros, en "Molecular Recognition in Chemical and Biological Problems", special publication of The Royal Chem. Soc, 78:182-196 (1989)) y MCSS (Miranker y otros, Proteins 11:29-34 (1991)). En otra modalidad de un método de diseño molecular ayudado por computadora para identificar inhibidores de la fosfatase principal comprende la síntesis de nodo de inhibidores potenciales a través de conexión algorítmica de pequeños fragmentos moleculares que exhibirán la complementaridad estructural y electrostática deseada con el sitio activo de la enzima. La metodología emplea un grupo de plantilla grande de moléculas pequeñas que son perforadas interactivamente juntas en un modelo del sitio activo de Tie-2. Los programas adecuados para esta tarea incluyen GROW (Moon y otros, Proteins 11:314-328 (1991)) y SPROUT (Gillet y otros, J. Comp. Aid. Mol. Des. 7:127 (1993)). En otra modalidad más, la conveniencia de candidatos individuales puede ser determinada utilizando una función de clasificación empírica, la cual puede clasificar las afinidades de unión para un grupo de inhibidores. Para un ejemplo de dicho método ver Muegge y otros, y referencias (Muegge y otros, J. Med. Chem. 42:791-804 (1999)). Se pueden utilizar otras técnicas de modelación de acuerdo con esta invención, por ejemplo, aquellas descritas por Cohén y otros, {J. Med. Chem. 33:883-894 (1994)); Navia y otros (Current Optlons in Structural Biology 2:202-210 (1992)); Baldwin y otros, (J. Med. Chem. 32:2510-2513 (1989)); Appelt y otros, (J. Med. Chem. 34:1925-1934 (1991)); y Ealick y otros (Proc. Nat. Acad. Sc/.USA 88:11540-11544 (1991)). Un compuesto que es identificado por uno de los métodos anteriores como un inhibidor potencial de Tie-2 puede ser obtenido entonces, por ejemplo, a través de la síntesis o de una colección de compuesto y determinarse para la habilidad para inhibir Tie-2 in vitro. Dicho ensayo in vitro puede ser realizado como es conocido en ia técnica, por ejemplo, poniendo en contacto Tie-2 en solución con el compuesto de prueba en presencia de un substrato para Tie-2. La velocidad de transformación del substrato puede ser determinada en presencia del compuesto de prueba y compararse con el régimen en ausencia del compuesto de prueba. Los ensayos adecuados para la actividad biológica de Tie-2 se describen en el Ejemplo 4. Un inhibidor identificado o diseñado por un método de la presente invención puede ser un inhibidor competitivo, un inhibidor no competitivo o un inhibidor que no es competitivo. Un inhibidor "competitivo", es uno que inhibe la actividad de Tie-2 uniéndose total o parcialmente dentro de la misma región de Tie-2, como ATP, compitiendo así directamente con ATP para el sitio activo de Tie-2.

Un inhibidor "no competitivo" inhibe Tie-2 uniéndose a una región diferente de la enzima que ATP. Dichos inhibidores se unen a Tie-2 ya unido con ATP y no a la enzima libre. Un inhibidor "que no es competitivo" es uno que puede unirse ya sea a la forma libre o unida ATP de Tie-2. En algunos casos, un inhibidor puede inhibir la actividad catílica de enzimas impidiendo la unión de múltiples substratos (por ejemplo, ATP y substratos de tirosilo). Esto puede lograrse ocluyendo total o parcialmente los sitios de unión de substrato múltiples, u ocupando un sitio que reduce haloestéricamente y conformacionalmente afinidades para substratos o liberación de producto de bloques. En otra modalidad, la presente invención proporciona inhibidores de Tie-2 y métodos para utilizar los mismos, los cuales son capaces de unirse al dominio catalítico de Tie-2, por ejemplo, los compuestos que son identificados como inhibidores de por lo menos una actividad biológica de Tie-2 o los cuales están diseñados por los métodos descritos anteriormente para inhibir por lo menos una actividad biológica de Tie-2. Por ejemplo, la invención incluye compuestos que interactúan uno con otro, preferiblemente dos o ás, y muy preferiblemente tres o más de Tie-2 subsitios 1 a 9. En una modalidad, el inhibodor de Tie-2 de la invención comprende una porción o porciones colocadas para interactuar con el subsitio 1, subsitio 2 y, opcionalmente con por lo menos otro subsitio, cuando está presente en el dominio catalítico de Tie-2. Por ejemplo, un grupo funcional que puede interactuar con el subsitio 1 puede ser un donador de enlace de hidrógeno, un aceptor de enlace de hidrógeno, o una porción hidrofóbica. Un grupo funcional que puede interactuar con el subsitio 2 puede un grupo hidrofóbico, un donador de enlace de hidrógeno, o un aceptor de enlace de hidrógeno. En otra modalidad, el inhibidor Tie-2 de la invención comprende grupos funcionales colocados para interactuar con los subsitios 1, 2 y 3 y, opcionalmente uno o más subsitios adicionales. Los inhibidores de Tie-2 de la invención también incluyen compuestos que tienen grupos funcionales colocados para interactuar con el subsitio 1, subsitio 2, subsitio 8 y opcionalmente, uno o más subsitios adicionales. En otra modalidad, el inhibidor tiene grupos funcionales colocados para interactuar con el subsitio 1, subsitio 2, subsitio 3, subsitio 8, y, opcionalmente, uno o más subsitios adicionales. En otras modalidades, los inhibidores de Tie-2 de la invención incluyen compuestos que tienen grupos funcionales colocados para interactuar con los siguientes grupos de subsitios, cada uno de los cuales puede, opcionalmente, incluir uno o más subsitios adicionales: subsitios 1, 4, y 5; subsitios 1, 2, 7 y 8; subsitios 1, 2, 3, 7 y 8; subsitios 1, 2, 3, 7 y 8; subsitios 1, 2, 4, 6 y 8; subsitios 1. 2, 3, 4 y 8; subsitios 1, 2, 3, 4, 6 y 8. Una porción del compuesto inhibidor se "coloca para interactuar" con un subsitio dado, si, cuando se coloca dentro del dominio catalítico de Tie-2, como se define por las coordenadas atómicas presentadas en las Figuras 3-6, la porción está cerca de, y orientada apropiadamente con relación a las cadenas laterales de aminoácido apropiadas dentro el subsitio. Como se indicó en la descripción de los subsitios anterior, varios subsitios 1-9 potencialmente puede interactuar con dos o más tipos de porciones. Para cada uno de los subsitios listados más adelante, se indica el tipo preferido de porción que va a interactuar colocada por el inhibidor potencial. Subsitio 1: donador de enlace de hidrógeno (E903) y aceptor de enlace de hidrógeno (A905). Subsitio 2: porción hidrofóbica, preferiblemente aromática (I830, V838, I886, I902 y L971). Subsitio 3: porción hidrofóbica, preferiblemente alquilo (I830 y L971) y una porción positivamente cargada (D912). Subsitio 4: porción de aceptor de hidrógeno (D982 y F938). Subsitio 8: porción hidrofóbica, preferiblemente aromática (L876, I886, L888 y F983). Un inhibidor de Tie-2 preferido de la invención inhibe la actividad enzimática de Tie-2 con un valor de Ki de por lo menos aproximadamente 1 mM, de preferencia por lo menos alrededor de 100 µ y muy preferiblemente por lo menos alrededor de 10 µ?. En otra modalidad, un inhibidor de Tie-2 se une selectivamente a un receptor de Tie-2 sobre otros receptores de cinasa de tirosina, tales como receptor de insulina o Csk, KDR, Ick, o zap. En una modalidad preferida, el inhibidor tiene un valor e K¡ de 0.1 veces o menos para un receptor de Tie-2 que para un receptor de insulina o Csk. En una modalidad más muy preferida, el inhibidor tiene un valor de K¡ de 0.01 veces o menos para un receptor de Tie-2 que para un receptor de insulina o Csk. En una modalidad muy preferida, el inhibidor tiene un valor de K¡ de 0.001 veces menor que o menor para un receptor Tie-2 que para un receptor de insulina o Csk. En una modalidad preferida, el inhibidor de Tie-2 para la invención comprende dos o más de lo siguiente cuando está presente en, o unido al dominio catalítico de Tie-2: (a) un donador de enlace de hidrógeno colocado para interactuar con Glu 903 de Tie-2 humano; (b) un aceptor de enlace de hidrógeno colocado para interactuar con Ala 905 de Tie-2 humano; (c) un donador de enlace de hidrógeno colocado para interactuar con Ala 905 de Tie-2 humano; (d) una porción hidrofóbica colocada para interactuar con uno o más de He 830, Val 838, Ala 853, lie 886, lie 902, Tyr 904, Ala 905 y Leu 971 de Tie-2 humano; (e) un donador de enlace de hidrógeno o grupo funcional positivamente cargado colocado para interactuar con Asp 912 de Tie-2 humano; (f) un donador de enlace de hidrógeno o aceptor de enlace de hidrógeno colocado para interactuar con Asn 909 de Tie-2 humano; (g) una porción hidrofóbica colocada para interactuar con uno o más de Val 838, Lys 855, lie 886, lie 902, Leu 971 y Ala 981 de Tie-2 humano; (h) un aceptor de enlace de hidrógeno o grupo funcional negativamente cargado colocado para interactuar con Lys 855 de Tie-2 humano; (i) un aceptor de enlace de hidrógeno colocado para interactuar con Asp982 de Tie-2 humano; (j) un aceptor de enlace de hidrógeno colocado para interactuar con Phe 983 de Tie-2 humano; (k) una porción hidrofóbica colocada para interactuar con uno o más deLeu 873, Leu 876, lie 885, lie 886, Leu 888, Leu 900, Me 902, Ala 981 y Phe 983 de Tie-2 humano; (I) un donador de enlace de hidrógeno o grupo funcional positivamente cargado colocado para interactuar con Asp 982 de Tie-2 humano; (m) un donador de enlace de hidrógeno colocado para interactuar con lie 886 de Tie-2 humano; (n) un donador de enlace de hidrógeno colocado para interactuar con Leu 769 de Tie-2 humano; (o) un aceptor de enlace de hidrógeno colocado para interactuar con Gly 831 de Tie-2 humano; (p) un donador de enlace de hidrógeno o grupo funcional positivamente cargado colocado para interactuar con Glu 832 de Tie-2 humano; (q) un aceptor de enlace de hidrógeno o grupo funcional negativamente cargado colocado para interactuar con Lys 840 de Tie-2 humano; (r) un aceptor de enlace de hidrógeno o grupo funcional negativamente cargado colocado para interactuar con Lys 916 de Tie-2 humano; (s) un aceptor de enlace de hidrógeno o grupo funcional negativamente cargado colocado para interactuar con Arg 968 de Tie-2 humano; (t) un donador de enlace de hidrógeno colocado para interactuar con Arg 968 de Tie-2 humano. En modalidades preferidas, los inhibidores de Tie-2 de la invención comprenden (b) y (d); (d) y por lo menos uno de (a), (b) y (c); (d) y por lo menos dos de (a), (b) y (c); (d) y por lo menos dos de (a), (b) y (c), y por lo menos uno de (e) y (f); (d) y (g), y por lo menos dos de (a), (b) y (c); (d), (g), y por lo menos dos de (a), (b) y (c) y por lo menos uno de (e) y (f); (d), (g), (k), y por lo menos dos de (a), (b) y (c); (d), (g), (k), y por lo menos uno de (e) y (f), por lo menos dos de (a), (b), y (c); (d), por lo menos uno de (i) y (j), y por lo menos dos de (a), (b) y (c); (d) y por lo menos dos de (a), (b) y (c), por lo menos uno de (e) y (f), y por lo menos uno de (i) y (j); (d), (9). (k). por lo menos uno de (i) y (j), y por lo menos dos de (a), (b) y (c); y (d), (g), (k), por lo menos uno de (e) y (f), y por lo menos uno de (a), (b) y (c). Los inhibidores de Tie-2 preferidos de la invención comprenden un andamio o estructura molecular, a la cual las porciones y/o grupos funcionales que interactúan con los subsitios de Tie-2 están unidas, ya sea directamente o a través de una porción de intervención. El andamio puede ser, por ejemplo, un péptido o estructura de base mimética de péptido, una porción cíclica o poiicíclica, tal como una porción monocíclica, bicíclica o tricíclica, y puede incluir uno o más anillos hidrocarbonilo o heterocíclicos. El andamio molecular presenta las porciones de interacción unidas en ia configuración u orientación apropiada para la interacción con los residuos apropiados del Tie-2. Las pirrolopirímidinas, tales como el inmhibidor I, II, III o IV, son inhibidores de Tie-2 preferidos. Los métodos para sintetizar pirrolopirimidina se describen en la solicitud de PCT No. WO 99/21560, las enseñanzas de la cual se incorporan aquí por referencia en su totalidad. En una modalidad, los inhibidores de la invención no incluyen las pirrolopirimidinas representadas por la fórmula estructural V: y sus sales farmacéuticamente aceptables, en donde: El anillo A es un anillo aromático de seis miembros o un anillo heteroaromático de 5 o 6 miembros, el cual está opcionalmente substituido con uno o más substituyentes seleccionados del grupo que consiste de un grupo alifático substituido o no substituido, un halógeno, un grupo aromático substituido o no substituido, un grupo heteroaromático substituido o no substituido, cicloalquilo substituido o no substituido, heterocicloalquilo substituido o no substituido, aralquilo substituido o no substituido, heteroaraiquiio substituido o no substituido, ciano, nitro, -NR4 5. -C(0)2H, -OH, un alcoxi carbonilo substituido o no substituido, -C(0)2-haloalquilo, un alquiltioéter substituido o no substituido, un alquilsulfóxido substituido o no substituido, una alquilsulfona substituida o no substituida, un ariltioéter substituido o no substituido, un arilsulfóxido substituido o no substituido, una arilsulfona substituida o no substituida, un alquilcarbonilo substituido o no substituido, -C(0)-haloalquilo, un éter alifático substituido o no substituido, un éter aromático substituido o no substituido, carboxamido, tetrasolilo, trifluorometil sulfonamido, trifluorometil carbonilamino, un alquinilo substituido o no substituido, un alquilamino substituido o no substituido, un arilamido substituido o no substituido, -N g5C(0)Rg5l un estirilo substituido o no substituido, y un aralquilamido substituido o no substituido, en donde R95 es un grupo alifático o un grupo aromático; L es -O-; -S-; -S(O)-: -S(0)2-; -N(R)-; -N(C(0)OR)-; -N(C(0)R)-; -N(S02R); -CH20-; -CH2S-; -CH2N(R)-; -CH(NR)-; -CH2N(C(0)R))-; -CH2N(C(0)OR)-; -CH2N(S02R)-; -CH(NHR)-; -CH(NHC(0)R)-; -CH(NHS02R)-; -CH(NHC(0)OR)-; -CH(OC(0)R)-; -CH(OC(0)NHR)-; -CH = CH; -C( = NOR)-; -C(O)-; -CH(OR)-; -C(0)N(R)-; -N(R)C(0)-; -N(R)S(0)-; -N(R)S(0)2-; -OC(0)N(R)-; -N(R)C(0)N(R)-; -NRC(0)0-; -S(0)N(R)-; -S(0)2N(R)-; N(C(0)R)S(0)-; N(C(0)R)S(0)2-; -N(R)S(0)N(R)-; N(R)S(0)2N(R)-; -C(0)N(R)C(0)-; -S(0)N(R)C(0)-; -S(0)2N(R)C(0)-; -OS(0)N(R)-; -OS(0)2N(R)-; N(R)S(0)0-; -N(R)S(0)20-; -N(R)S(0)C(0)-; -N(R)S(0)2C(0)-; -SON(C(0)R)-; -S02N(C(0)R)-; -N(R)SON(R)-; -N(R)S02N(R)-; C(0)0-; -N(R)P(OR')0-; -NKRJPÍOR1)-; -N(R)P(0)(0')0-; -N(R)P(0)(OR')-; -N(C(0)R)P(OR')0-; -N(C(0)R)P(OR')-; -N(C(0)R)P(0)(OR')0- o -N(C(0)R)P(OR')-, en donde R y R' son cada uno, independientemente, -H, un grupo acilo, un grupo alifático substituido o no substituido, o un grupo aromático substituido o no substituido, un grupo heteroaromático substituido o no substituido, o un grupo cicloalquilo substituido o no substituido; o L es -RbN(R)S(0)2-, -RbN(R)P(0)-, o -RbN(R)P(0)0-, en donde Rb es un grupo alquileno, el cual cuando se toma junto con el grupo sulfonamida, fosfinamida o fosfonamida al cual está unido, forma un anillo de 5 o 6 miembros fusionado al anillo A; o L está representado por una de las siguientes fórmulas estructurales: en donde R85 tomado junto con la fosfinamida o fosfonamida es un sistema de anillo aromático, heteroaromático o heterocicloalquilo de 5, 6, o 7 miembros; Ri es un grupo alifático substituido, un cicloalquilo substituido, un bicicloalquilo substituido, un cicioalquenilo substituido, un grupo aromático opcionalmente substituido, un grupo heteroaromático opcionalmente substituido, un eteroaralquilo opcionalmente substituido, un heterocicloalquilo opcionalmente substituido, un heterobicicloalquilo opcionalmente substituido, un alquilamido opcionalmente substituido, y arilamido opcionalmente substituido, o -S(0)2-alquilo opcionalmente substituido o -S(0)2-cicloalquilo opcionalmente substituido, un C(0)-alquilo o un C(0)-alquilo opcionalmente substituido, siempre que cuando Ri sea un grupo alifático o grupo cicloalquilo, Ri no está exclusivamente substituido con uno o más substituyentes seleccionados del grupo que consiste de hidroxilo y alquiléteres inferiores, siempre que el heterocicloalquilo no sea 2-fenil-1 ,3-dioxan-5-ilo, y siempre que un grupo alifático no sea substituido exclusivamente con uno o más grupos alifáticos, en donde uno o más substituyentes se seleccionan del grupo que consiste de un grupo alifático substituido o no substituido, un grupo aromático substituido o no substituido, un heteroaromático substituido o no substituido, un aralquilo substituido o no substituido, un heteroaralquilo substituido o no substituido, un cicloalquilo substituido o no substituido, un heterocicloalquilo substituido o no substituido, un éter aromático substituido o no substituido, un éter alifático substituido o no substituido, un alcoxicarbonilo substituido o no substituido, un alquilcarbonilo substituido o no substituido, un arilcarbonilo substituido o no substituido, un heteroarilcarbonilo substituido o no substituido, ariloxicarbonilo substituido o no substituido, -OH, un aminocarbonilo substituido o no substituido, una oxima, un azabicicloalquilo substituido o no substituido, heterocicloalquilo, oxo, aldehido, grupo alquilsulfonamido substituido o no substituido, un grupo arilsulfonamido substituido o no substituido, un bicicloalquilo substituido o no substituido, un heterobicicloalquilo substituido o no substituido, ciano, NH2, un alquilamino, ureído, tioureido y -B-E; B es un cicloalquilo substituido o no substituido, heterocicloalquilo substituido o no substituido, un aromático substituido o no substituido, un heteroaromático substituido o no substituido, un alquileno, un aminoalquilo, un alquilencarbonilo, o un aminoalquilcarbonilo; E es un azacicloalquilo substituido o no substituido, un azacicloalquilcarbonilo substituido o no substituido, un azacicloalquilsulfonilo substituido o no substituido, un azacicloalquilalquilo substituido o no substituido, un heteroarilo substituido o no substituido, un heteroarilcarbonilo substituido o no substituido, un heteroarilsulfonilo substituido o no substituido, un heteroaralquilo substituido o no substituido, un alquilsulfonamido substituido o no substituido, un arilsulfonamido substituido o no substituido, un bicicloalquilo substituido o no substituido, un ureido substituido o no substituido, un tioureido substituido o no substituido, o un arilo substituido o no substituido; R2 es -H, un grupo alifático substituido o no substituido, un cicioalquilo substituido o no substituido, un halógeno, -OH, ciano, un grupo aromático substituido o no substituido, un grupo heteroaromático substituido o no substituido, un heterocicloalquilo substituido o no substituido, un aralquilo substituido o no substituido, un heteroaralquilo substituido o no substituido, -NR4R5 o -C(0)NR4R5; R3 es un grupo alifático substituido o no substituido, un grupo alquenilo substituido o no substituido, un cicioalquilo substituido o no substituido, un grupo aromático substituido o no substituido, un grupo heteroaromático substituido o no substituido, o un grupo heterocicloalquilo substituido o no substituido; Siempre que L sea -SN(R)-, -S(0)N(R)-, -S(0)2N(R)-, -N(R)S-, -N(R)S(0)-, -N(R)S(0)2-, -N(R)SN(R')-. -N(R)S(0)N(R')-. o -N(R)S(0)2N(R')- cuando R3 sea un grupo alifático substituido o no substituido, un grupo alquenilo substituido o no substituido; Siempre que j sea 0 cuando L sea -O-, -CH2NR-, -C(0)NR- o -NRC(O)-, y R3 sea azacicloalquilo o azaheteroarilo; Siempre j sea 0 cuando L sea -O-, y R3 sea fenilo; , R5 y el átomo de nitrógeno conjuntamente forman un heterocicloalquilo substituido o no substituido, heterobicicloalquilo substituido o no substituido, o un heteroaromático substituido o no substituido, de 3, 4, 5, 6 o 7 miembros; o R4 y R5 son cada uno independientemente H, azabicicloalquilo, hetericicloalquilo, un grupo alquilo substituido o no substituido, o Y-Z; Y se selecciona del grupo que consiste de -C(O)-, -(CH2)P-, -S(0)2-, -C(0)0-, -S02NH-, -CONH-, (CH2)pO-, -(CH2)PNH-, -(CH2)PS-, -(CH2)pS(0)-, y -(CH2)pS(0)2-; p es un entero de 0 a 6; Z es -H, un alquilo substituido o no substituido, un amino substituido o no substituido, un arilo substituido o no substituido, un heteroarilo substituido o no substituido, o un grupo heterocicloalquilo substituido o no substituido; y j es un entero de 0 a 6. Como se utiliza en la presente, los grupos aromáticos incluyen sistemas de anillo carbocíclico (por ejemplo, fenilo y cinamilo) y sistemas de anillo aromático policíclicos (por ejemplo, naftilo y 1, 2, 3, 4-tetrahidronaftilo). Los grupos aromáticos también son denominados en la presente como grupos arilo. Los grupos heteroaromáticos, como se utiliza en la presente, incluyen sistemas de anillo heteroarilo (por ejemplo, tienilo, piridilo, pirazol, izoxazolilo, tiadiazolilo, oxadiazolilo, indazolilo, furanos, pirróles, imidazoles, pirazoles, triazoles, pirimidinas, pirazinas, tlazoles, izoxazole, izotiazoles, tetrazoles u oxadiazoles), y sistemas de anillo heteroarilo en donde un anillo aromático carbocíclico, un anillo no aromático carbocíclico o un anillo heteroarilo está fusionado a uno o más de los otros anillos heteroarilo (por ejemplo, benzo(b)tienilo, bencimidazol, indol, tetrahidroindol, azaindol, indazol, quinolina, imidazopiridina, purina, pirrolo[2,3-d]pirimidina, pirazolo[3,4-d]pirimidina) y sus N-óxidos.

Un grupo aralquilo, como se utiliza en la presente, es un substituyente aromático que está enlazado a un compuesto a través de un grupo alifático que tiene 1 a aproximadamente 6 átomos de carbono. Un grupo heteroaralquilo, como se utiliza en la presente, en un substituyente heteroaromático que está enlazado a un compuesto a través de un grupo, alifático teniendo de 1 a aproximadamente 6 átomos de carbono. Un grupo heterocicloalquilo, como se utiliza en la presente, es un sistema de anillo no aromático que tiene de 3 a 8 átomos e incluye por lo menos un átomo heterogéneo, tal como nitrógeno, oxígeno o azufre. Un grupo azilo, como se utiliza en la presente, es un grupo -C(0)NRxRz, -C(0)OR„, -C(0)Rx, en donde Rx y Rz son cada uno independientemente -H, un grupo alifático substituido o no substituido, o un grupo aromático substituido o no substituido. Como se utiliza en la presente, los grupos alifáticos incluyen hidrocarburos de 1 a 8 átomos de carbono de cadena recta, ramificada o cíclica, los cuales están completamente saturados o los cuales contienen una o más unidades de instauración. Un "grupo alquilo inferior" es un grupo alifático saturado teniendo de 1 a 6 átomos de carbono. El inhibidor I unido al mutante catalíticamente inactivo de Tie-2 (para secuencia y ver Figura 3 para coordenadas atómicas) se cristalizó en el grupo de espacio C2221. La estructura cristalográfica de rayos X relevó las siguientes interacciones: El anillo de pirrolopirimidina del inhibidor I forma enlaces de hidrógeno para residios en la región de gozne e interactúa con la región de núcleo de purina. El núcleo del inhibidor presenta un donador de enlace de hidrógeno en la forma del protón amino y el substituyente 4-NH2 para el carbonilo-oxígeno de E903. El átomo N3 del anillo pirimidina acepta un enlace de hidrógeno de la estructura de base N-H de A905. El sistema de anillo del núcleo presenta una cara plana para los residuos tanto de los nodulos C-terminal como N-terminal. Los residuos en estas áreas presentan una superficie hidrofóbica que "empareda" el núcleo plano de inhibidor. Los residuos involucrados en esta región de emparedado hidrofóbica incluyen I830, V838, I86. I902 y L971. Los átomos N1 y N7 del núcleo miran al solvente expuesto en la boca de la cavidad de unión. El átomo C6 mira al eje largo del lazo de enlace de nucleótido del lóbulo N-terminal de la proteína. El anillo ciclopentano de N7 está dirigido hacia el solvente, pero sigue estando dentro de la cavidad de proteína. Esta región fue descrita anteriormente como la cavidad de azúcar extendida después del modo de unión del anillo ribosa de ATP observado en otras estructuras de cinasa. Esta región se caracteriza por interacciones hidrofóbicas principalmente con I830 y L971. Los grupos metilo de E832 también contribuyen en esta forma. El anillo fenilo unido a C5 del anillo pirrolopirimidina es un área predominantemente hidrofóbica, generada por residuos de la región de núcleo de purina, la calidad hidrofóbica distante y grupos metileno de la lisina catalítica, K855. Los contactos hidrofóbicos son con los residuos V838, 1886, 1902, L971 y A981. La lisina 855 es altamente móvil, de manera que también es posible que el átomo meta C1 al anillo de pirroiopirimidina esté recibiendo un enlace de hidrógeno. El enlazador de sulfonamida hace un enlace claro de hidrógeno con un protón de amida de D982 y también hace un enlace de hidrógeno al protón de amida de F983. El anillo fenilo terminal (marcado como anillo C) está localizado en la cavidad hidrofóbica distante. Los contactos primarios son con L876, I886, L888 y F983. El inhibidor II unido al mutante catalíticamente inactivo de Tie- 2 (ver Figura 2 para secuencia y Figura 4 para coordenadas atómicas) se cristalizó en el grupo de espacio P42212. La estructura cristalográfica de rayos X reveló las siguientes interacciones adicionales: El núcleo de pirroiopirimidina, anillo B, el enlazador y el anillo C se unen de la misma manera como el inhibidor I. El grupo cicIo exil-N-metil-pirazinilo de N-7 ocupa la cavidad de azúcar extendida y hace una fuerte interacción iónica con D912. El inhibidor III se une al mutante catalíticamente inactivo de Tie-2 (ver Figura 2 para secuencia y Figura 1 para coordenadas atómicas) se cristalizó en el grupo de espacio P42212. La estructura cristalográfica de rayos X reveló las siguientes interacciones adicionales: El núcleo de pirrolopirimidina se une de la misma forma como el inhibidor I. El grupo ciclohexil-N-metil-piperazinilo de N-7 ocupa la cavidad de azúcar extendida y hace una fuerte interacción iónica con D912 como en Tie-2/inhibidor II. El anillo B se une de la misma forma al inhibidor I, sin embargo, el enlace de hidrógeno entre un halógeno, flúor en este caso, y K855 es más claro. El enlazador hace dos enlaces de hidrógeno claros a los protones de amida de estructura de base de ?T83 y F983. El anillo C ocupa la cavidad hidrofóbica distante con las interacciones principales viniendo de L876, I886, L888, L900, I902 y F983. El inhibidor IV se une al mutante catalíticamente inactivo de Tie-2 (ver Figura 2 para secuencia y ver Figura 4 para coordenadas atómicas) se cristalizó en el grupo de espacio P42212. La estructura cristalográfica de rayos X reveló las siguientes interacciones adicionales: El núcleo de pirrolopirimidina se une de la misma manera como el inhibidor I. El grupo ciclohexil-N-metil-piperazinilo de N-7 ocupa la cavidad de azúcar extendida y hace una fuerte interacción iónica con D912 como en Tie-2/inhibidor II. El anillo B se une en una forma similar al inhibidor I, sin embargo, no existe ningún átomo de cloro para actuar como un patrón de enlace de hidrógeno potencial. En enlazador en este caso es un átomo de oxígeno, el cual acepta un enlace de hidrógeno de la lisina catalítica, K855. El anillo C ocupa la cavidad hidrofóbica distante con las interacciones principales viniendo de L876, 1886, 1902 y F983. En una modalidad, la presente invención se refiere a un método para tratar una condición dependiente de Tie-2 en un paciente. El método comprende el paso de administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de Tie-2 como se describió anteriormente. El paciente puede ser cualquier animal, y de preferencia, es un mamífero, y muy preferiblemente un ser humano. Una "condición dependiente de Tie-2" es una enfermedad o condición médica en donde la actividad catalítica Tie-2 juega un papel importante, por ejemplo, en el desarrollo de la enfermedad o condición. Por ejemplo, en una modalidad, la condición se caracteriza por proliferación vascular excesiva. Los inhibidores de Tie-2 son útiles para el tratamiento de trastornos dependientes de angiogénesis y trastornos que involucran interacciones aberrantes endoteliales-periendoteliales (por ejemplo, restenosis). Las condiciones dependientes de Tie-2 incluyen trastornos hiperproliferativos, cáncer, una condición cardiovascular, una condición ocular, la enfermedad de von Hippel Lindau, penfigoide, soriasis, enfermedad de Paget, enfermedad poliquística de riñon, fibrosis, sarcoidosis, cirrosis, tiroiditis, enfermedad de Osler-Weber-Rendu, inflamación crónica, sinobitis, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn, artritis reumatoide, osteoartritis, artritis psoriática, úlcera y sepsis. Además un inhibidor de Tie-2 puede ser utilizado para reducir la fertilidad de un paciente. Los métodos preferidos de tratamiento son en donde el cáncer es un tumor sólido, un sarcoma, fibrosarcoma, osteoma, melanoma, retinoblastoma, un radomiosarcoma, gioblastoma, neoblastoma, teratocarcinoma, una malignidad hetopoietica, azitos malignos, sarcoma de Kaposi, enfermedad de Hodgkin, linfoma, mieloma o leucemia. Otro método preferido del tratamiento es donde existe condición cardiovascular, aterosclerosis, restenosis, daño por isquemia/reperfusión, enfermedad pulmonar crónica oclusiva, oclusión vascular, enfermedad de obstrucción de carótidas, síndrome de Crow-Fukase (POE S), anemia, isquemia, infarto, trastornos de derrame vascular. Otro método preferido adicional de tratamiento es cuando la condición ocular es edema ocular o macular, enfermedad neovascular ocular, escleritis, quetotomia radial, uveitis, vitritis, miopía, manchas ópticas, separación retinal crónica, complicaciones de tratamiento después de láser, conjuntivitis, enfermedad de Stargardt, enfermedad de Eales, retinopatía, degeneración macular o microangiopatía. Un inhibidor de Tie-2 también puede ser utilizado en un método para promover angiogénesis o vasculogénesis. Además, un inhibidor de Tie-2 puede ser administrado como un factor de crecimiento pro-angiogénico. Una cantidad terapéuticamente efectiva, como se utiliza en la presente, es una cantidad que da como resultado la inhibición parcial o completa de la progresión o síntomas de la enfermedad. Dicha cantidad dependerá, por ejemplo, del tamaño y género del paciente, la condición que será tratada, la severidad de los síntomas y el resultado buscado, y puede ser determinada por algún experto en la técnica. El compuesto de la invención puede, opcionalmente, ser administrado en combinación con uno o más fármacos adicionales o terapias los cuales, por ejemplo, son conocidos por tratar y/o aliviar los síntomas de la condición mediada por Tie-2. El fármaco adicional puede ser administrado simultáneamente con el compuesto de la invención, o secuencialmente. Por ejemplo, el inhibidor de Tie-2 puede ser administrado en combinación con otro agente anticáncer, como es conocido en la técnica. Las terapias adicionales que pueden ser co-administradas pueden incluir, por ejemplo, terapia de radiación, irradiación ultravioleta, hipertermia, irradiación láser, radionúclidos activados y bombardeo de neutrones. La invención además proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más de los inhibidores de Tie-2 anteriormente descritos. Dichas composiciones comprenden una cantidad terapéuticamente (o profilácticamente) efectiva de uno o más inhibidores de unión de Tie-2, como se describe anteriormente, y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Dichos vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen, pero no se limitan a, salina, salina regulada en su pH, dextrosa, agua, glicerol, etanol, y combinaciones de los mismos. El vehículo y la composición pueden ser estériles. La formulación debe adaptarse al modo de administración.

Los vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen, pero o se limitan a, agua, soluciones de sal (por ejemplo, NaCI), alcoholes, goma arábiga, aceites vegetales, alcoholes bencílicos, glicoles polietiiénicos, gelatina, carbohidratos tales como lactosa, amilosa o almidón, ciclodextrina, estearato de magnesio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, aceite de perfume, ésteres de ácido graso, hidroximetilcelulosa, polivinilpirrolidona, etc. Las preparaciones farmacéuticas pueden ser esterilizadas y, si se desea, mezclarse con agentes auxiliares, por ejemplo, lubricantes, conservadores, estabilizadores, agentes humectantes, emulsificantes, sales para influenciar la presión osmótica, reguladores de pH, substancias de color, de sabor y/o aromáticas, y similares, que no reaccionan en forma dañina con los compuestos activos. La composición, si se desea, también puede contener cantidades menores de agentes humectantes o emulsificantes, o agentes reguladores de pH. La composición puede ser una solución liquida, suspensión, emulsión, tableta, pildora, cápsula, formulación de liberación sostenida, o polvo. La composición puede ser formulada como un supositorio, con aglutinantes y vehículos tradicionales tales como triglicéridos. La formulación oral puede incluir vehículos estándares tales como grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, polivinilpirrolidinona, sacarina de sodio, celulosa, carbonato de magnesio, etc.

La composición puede ser formulada de acuerdo con los procedimientos de rutina como una composición farmacéutica adaptada para administración intravenosa a seres humanos. Típicamente, las composiciones para administración intravenosa son soluciones en un regulador de pH acuoso, isotónico, estéril. Cuando es necesario, la composición puede incluir un agente de solubilización y un anestésico local para mitigar el dolor en el sitio de la inyección. En general, los ingredientes son suministrados ya sea en forma separada o mezclados conjuntamente en una forma de dosis unitaria, por ejemplo, como un polvo liofilizado seco o un concentrado libre de agua en un contenedor herméticamente sellado tal como una ampolleta o bolsa pequeña indicando la cantidad de agente activo. Cuando la composición va a ser administrada a través de infusión, esta puede ser dispensada con una botella de infusión conteniendo el agua, salina o dextrosa/agua de grado farmacéutico. Cuando la composición se administra a través de inyección, una ampolleta de agua estéril para inyección o salida puede ser provista de manera que los ingredientes pueden ser mezclados antes de la administración. Las composiciones farmacéuticas de la invención también pueden incluir un agente que controla la liberación de compuesto inhibidor de Tie-2, proporcionando así una composición liberada en tiempo o sostenida. El inhibidor de Tie-2 puede ser administrado subcutánea, intravenosa, parenteral, intraperitoneal, intradérmica, intramuscular, intraocular, tópicamente, enteral (por ejemplo, oralmente), rectal, nasal, bucal, sublingual, vaginalmente, a través de aspersión de inhalación, a través de una goma de fármaco, o a través de un depósito implantado en formulaciones de dosis que contienen los portadores o vehículos fisiológicamente aceptables, no tóxicos, convencionales. El método preferido de administración es a través de administración oral. La forma en la cual se administra (por ejemplo, jarabe, elixir, cápsula, tableta, solución, espumas, emulsión, gel, sol) dependerá en parte de la ruta a través de la cual se administra. Por ejemplo, para administración mediante glucosa (por ejemplo, mucosa oral, rectal, mucosa ocular, mucosa intestinal, mucosa de bronquios), se pueden utilizar gotas nasales, aerosoles, inhalantes, nebulizadores, gotas para los ojos o supositorios. Los compuestos y agentes de esta invención pueden ser administrados juntos con otros agentes biológicamente activos, tales como analgésicos, agentes antiinflamatorios, anestésicos y otros agentes que pueden controlar uno o más síntomas u ocasionar una condición dependiente de Tie-2.

En una modalidad específica, puede ser deseable administrar los agentes de la invención localmente a un área localizada con la necesidad de tratamiento; esto puede lograrse, por ejemplo, y sin limitación, a través de infusión local durante cirugía, aplicación tópica, parches transdérmicos, mediante inyección, mediante un catéter, mediante un supositorio, o mediante un implante, dicho implante siendo de un material poroso, no poroso o gelatinoso, incluyendo membranas, tales como membranas sialásticas o fibras.

Por ejemplo, el agente puede ser inyectado en las articulaciones.

EJEMPLOS EJ EMPLO 1 Purificación de Proteína (His)eTie-2 802-1 124, D964N, la cual contiene un péptido de escisión de proteasa TEV, fue expresado recombinantemente a través de infección de baculovirus de células SF-9. Las células fueron tizadas en un regulador de pH conteniendo 20 mM Tris pH 8.0, 1 37 mM NaCI, 1 0% glicerol, 1 % Tritón X-100, 1 mM ADP. 5 mM Mg CI2, e inhibidor de proteasa completo, coctel libre de EDTA de Boehringer Mannhein. El ligando ADP/Mg se mantuvo en esta concentración en reguladores de pH de todos los pasos de purificación subsecuentes. El lisato de células se centrífugo y el sobrenadante se aplicó a una columna de sefarosa de quelatación Ni", la cual había sido equilibrada en 50 mM de H EPES, pH 7.5, 0.3 M de NaCI. El Tie-2 fue eluido mediante competencia con 100 mM de imidazol. El (H is)e Tie-2 eluido fue digerido con proteasa Tev u dializado contra 50 mM de H EPES, pH 7.5, 0.25 M de NaCI, 5 mM de DTT. La muestra dializada se centrifugó para remover cualquier proteína precipitada, y el Tie-2 se un ió a una col umna de intercambio de anión MonoQ y se eluyó con un g radiente de volumen de columna 20 lineal de 0.025-0.2 M de NaCI. Típicamente, las diferencias en la monodispersidad de las fracciones de elusión temprana contra elusión tardía pueden ser detectadas utilizando Difusión de Luz Dinámica (DLS). La pureza de la muestra fue determinada con SDS-PAGE, PAGE nativo, y análisis de masa total de LC/MS. Las fracciones con características similares de DLS fueron combinadas y se concentraron a más de 2 mg/ml utilizando ultrafracción a -80°C. las muestras ultracentrifugadas fueron utilizadas en experimentos cristalográficos descritos más adelante. El Cuadro I lista una escala de condiciones adecuadas para la cristalización.

EJEMPLO 2 I. Tie-2 802- 124 de Difosforilado A. Condiciones de Cristalización: La proteína Tie-2 802-1124 (2P04) fue cristalizada en una geometría de cadena de acentamiento o colgante utilizando un método de difusión de vapor. La concentración de proteína fue de 5 mg/ml y la solución de la cadena fue de 10% de PEG 6000; 0.1 M de HEPES, pH 7.5; 5% de MPD (2-metil-2,4-pentanodiol). Las gotas fueron fijadas utilizando volúmenes iguales de proteína y la solución de cavidad conteniendo 500 µ? de inhibidor. Los cristales se desarrollaron por rutina a 0.4 mm x 0.1 mm x 0.1 mm x 0.01 mm en aproximadamente 1 semana. Los cristales fueron del grupo de espacio P2(1 )2(1 )2(1 ) con dimensiones de célula unitaria de a = 54.320 A, b=75.872 A, c=78.143 A. y a=ß=?=90.0ß. El Cuadro I lista una escala de condiciones que son adecuadas para la cristalización.

B. Recolección de datos Los datos sobre cristales unidos a ligandos se reunieron en un generador de ánodo de rotación Rigaku RU300 corriendo a 50 kV 150 mA equipado con un detector de placa de fosfoimagen R-Axis II. Los rayos X fueron monocromatizados a través de espejos grandes y se filtraron con un filtro de níquel de 0.0065 µp?. Los datos fueron procesados y reducidos con DENZO y SCALEPACK (Minor, W. 1993). Los datos fueron reunidos a una resolución de 3.5 A.

C. Procesamiento de Datos Se utilizaron los programas en CCP4 (Proyecto Computacional Colaborativo, Número 4, 1994) (tomtz, trunc, cad y ecalc) para formatear y procesar los datos para reemplazo molecular. Se utilizó exitosamente el programa de reemplazo molecular AMORE (Navaza, J. 1994) para encontrar fases para los datos fijados utilizando un modelo inicial. El modelo inicial estuvo compuesto de una porción carboxi-terminal (residuo 566-575 y 592-672) del dominio de cinasa de FGFR cortado a poli-alanina (número de acceso de PDB, 1FGK). Una segunda ronda de AMORE con un modelo más completo (residuos 464-485, 491-500, 505-575 y 592-762) también fue realizada para confirmar la solución de formación de fase.

D. Optimización del Modelo Varias rondas de minimización de mínimos cuadrados utilizando CNS (Brunger, A. T. y otros, 1998) alternando con reconstrucción manual, utilizando el programa gráfico O, versión 6.2.1 (Jones, A., 1997; Kleywegt G. J., 1995) también se realizó iterativamente para mejorar el modelo mientras se comprada con mapas de densidad de electrón generados . para cada ronda con coeficientes 2fo-fc encontrados a un nivel de 1.0 sigma.

II- Tie-2 (D964N) 802-1124 (SEC ID IMO:2) A. Condiciones de Cristalización Se cristalizó la proteína Tie-2 (D964N) 802-1124 purificada en una geometría de calidad de acentamiento utilizando el método de difusión de vapor. La concentración de proteína fue de 2.5 mg/ml y la solución de cavidad fue de 1.0 a 1.5 M de sulfato de amonio, 0.1 M de MES, pH 6.5, 5% de díoxano (1 ,4-dioxano). Las caídas fueron fijadas utilizando volúmenes iguales de proteina y de solución de cavidad conteniendo 100-300 µ? de inhibidor. Los cristales por rutina crecieron a 0.3 mm x 0.05 mm x 0.01 mm en aproximadamente 2-3 días. Los cristales de ???-2/inhibidor I fueron del grupo de espacio C222 (1) con dimensiones de célula unitaria de a = 75.195 A, b = 116.287 A, c=95.060 A, y a = ß=?=90.0°. Los cristales del complejo de Tie-2/inhibidor II, III o IV fueron del grupo de espacio P42212 con dimensiones de célula unitaria de a = b=86.0 A, c=112.0 A, y a=ß=?=90.0ß.

?. Recolección de Datos Los datos en un cristal unido al ligando (Tie-2 (D964N) 802-1124 en complejo con los inhibidores I, II, III o IV fueron recogidos en la línea de haz de luz X25 en Brookhaven National Laboratory (Upton, NY), equipada con un detector de Brandéis B4, CCD. Los datos fueron procesados y se redujeron con DENZO y SCALEPACK (Minor, W. 1993). Los datos para el complejo de Tie-2/inhibidor I fueron reunidos completos a una resolución de 2.75 A, con reflexiones de resolución más altas visibles a una resolución de 2.0 A.

C. Procesamiento de Datos Se utilizaron los programas en CCP4 (Proyecto Computacional Colaborativo, Número 4, 1994) (tomtz, trunc, cad y ecalc) para formatear y procesar los datos para reemplazo molecular. Se utilizó exitosamente el programa de reemplazo molecular AMORE (Navaza, J. 1994) para encontrar fases para la fijación de datos utilizando un modelo inicial. El modelo inicial estuvo compuesto de una porción conservadora del dominio de cinasa de FGFR (numeración de residuo de Tie-2 818-830, 841-842, 850-857, 866-890, 900-916, 935-981, 1001-1093). El modelo, en su mayoría poli-alanina, se cortó de regiones de lazo que divirgieron después d la superposición de cinco estructuras de cinasa de tirosina (IRK, HCK, SRC, FGFR, y LCK).

Además, este modelo incluyó solamente aquellos residuos de cadena lateral en posiciones en donde se encontró una cadena lateral idéntica en el modelo de FGFR.

D. Optimización del Modelo Varias rondas de minimización de mínimos cuadrados utilizando CNS (Brunger, A. T. y otros, 1998) alternando con reconstrucción manual, utilizando el programa de gráficos O, versión 6.2 (Jones. A., 1997; Kleywegt G. J., 1995) se realizaron para mejorar iterativamente el modelo mientras se comparaba con dos mapas de densidad de electrón; uno generado con coeficientes 2fo-fc encontrados a un nivel de 1.0 sigma y el otro generado con coeficientes fo-fc encontrados a un nivel de 1.5 sigma.

E. Acoplamiento de Inhibidor Se encontró que el inhibidor I está unido al sitio activo. Inicialmente se acopló manualmente en O inspeccionando visualmente los mapas de densidad de electrón y ajustando los ángulos de torsión del inhibidor. Se generaron archivos de parámetro y topología para CNS utilizando el programa de X-util Xplo2d (Kleywegt G. J. y Jones, T.A. 1997) y se modificaron ligeramente para modelar con propiedad cloro en el inhibidor.

III. Tie-2 (D964N) 802-1124 (SEC ID NO 2) A. Condiciones de Cristalización La proteína (construcción Tie-2D964N) se proporcionó en un regulador de pH conteniendo 25 mM de HEPES, pH de 7.5, 50 mM de NaCI, 5 mM de MCI2, 1 mM de ADP y 5 mM de DTT. La concentración de proteína fue de aproximadamente 2.3 mg/ml según determinado como un ensayo de Coomassie Plus, BSA como estándar. El inhibidor III se disolvió en DMSO para dar una solución de abastecimiento de 50 mM. La solución de abastecimiento fue agregada a la solución de proteína para una concentración de inhibidor mínima de 2 mM. Las condiciones de cristalización fueron clasificadas con la pantalla de cristal de clasificación de Hampton, pantalla de cristal 2, Membfac, y pantalla de Natrix y PEG/ión a temperatura ambiente y a 4°C. Los cristales se desarrollaron con regulador de pH de precipitación: 20% de PEG3350, 0.2 M de citrato de tri-litio, pH 8.1, (pantalla de PEG/ion de clasificación Hampton, Nr.45) caída de acentamiento o colgante: 750 µ? de regulador de pH en el depósito en la caída, típicamente 1 µ I — 2 I de proteína y 1 µ? - 2 µ? de solución de depósito se mezclaron. La adición de los siguientes aditivos (10% en volumen para la caída) también produjeron cristales: Clasificación Ad. I Nr.:01 0.1M cloruro de Ba Clasificación Ad. I Nr.:03 0.1M cloruro de Ca Clasificación Ad. 1 Nr.:06 0.1 M cloruro de Mg Clasificación Ad. 1 Nr.:16 0.1 M trimetifamina Clasificación Ad. I Nr.:22 30% etanol Clasificación Ad. II Nr.:08 30% xilitol Clasificación Ad. II Nr.:13 30% 1 ,5diclorohidrato de diaminopentano Clasificación Ad. II Nr.:14 30% diaminooctano Clasificación Ad. I Nr,:17 0.1M tricloruro de hexaaminocobalto Clasificación Ad. III Nr.:02 1.0M cloruro de cesio Clasificación Ad. III Nr.:04 1.0M cloruro de litio Clasificación Ad. III Nr.:06 0.5M fluoruro de sodio Clasificación Ad. III Nr.:16 40% acetonitrilo Clasificación Ad. III Nr.:18 40% n-propanol Clasificación Ad. III Nr.:19 5% acetato de etilo Clasificación Ad. III Nr.:20 40% acetona Clasificación Ad. III Nr.:21 2,5% diclorometano Clasificación Ad. III Nr.:22 7% n-butanol Clasificación Ad. III Nr.:0.1M 1,4 ditio-DL-treitol B. Recolección de Datos Los datos fueron medidos en la línea de haz de luz BW 6 de Max-Planck-Society en DESY, Hamburgo. Los cristales fueron enfriados mediante choque a 100 K; el crio-regulador de pH fue regulador de pH de cristalización más 20- 30% de glicerol. 213 marcos con delta phi=0.25 grados se recogieron con un detector de MAR CCD, a una distancia de detector de cristal de 120 mm y una longitud de onda de 1.072 A. Los cristales son de un grupo de espacio tetragonal con dimensiones de célula unitaria de a=b=86.0 A y c=112 A. Todas las dimensiones de célula de diferentes cristales varían (para a y b de entre 85 y 87 A, para c de entre 97 y 113). Las extinciones indican el grupo de espacio P42212, el cual se confirmó a través de reemplazo molecular.

CUADRO II Condiciones de cristalización para complejos de Tie-2/inhlbidor Condición Tie-2802-1124 D964N Tie-2802-1124 (difosforilado) Concentración de proteína 2.5 mg/ml óptimo 5 mg/ml óptimo escala 1.5-4 mgml escala 2.5- 10 mi límites 1.0-5.0 mg/ml Concentración de regulador de pH 100 m MES óptimo 100 mM HEPES óptimo escala 50-250 mM escala 50-100 mM límites 20-30 mM límites 20-300 mM PH 6.5 óptimo 7.5 óptimo escala 5.5-7.5 escala 7.0-7.7 límites 6.5-8.0 Identidad de regulador de pH Reguladores de pH capaces de (igual) regular el pH en una escala similar de pH esperaron dar resltados similares Precipitante (NH,)_S04 10% PEG 6000 óptimo escala 1.0 - .5 M escala de conc.5-15% límites 0.7- 1.8 M límite de conc.1-20% escala de MW 4000 - 8000 limites de MW pueden ser más amplios Parámetros de Aditivo 5% 1 ,4-dioxano escala óptima 0- 5% MPD (2-Me-2,4-pentanedi 10% (concentraciones más altas óptimo atacan el vaso de plástico en rango 0 - 10% donde se realiza el experimento; pueden ser posibles concentraciones más altas en un vaso resistente) 1.3-dioxano, moléculas similares, o mezclas en varías relaciones también deben dar resultados similares Identidades de aditivo ejemplos que han sido agregados (igual) exitosamente: 1 ,5-diaminopentano glicerol (1-10%) etilen glicol (1-10%) Esperomidina (10-300 mM) Combinaciones, en varías relaciones, pueden dar resultados similares Volúmenes y relaciones de caída 2 pL de proteína + 2 µ?_ de solución (igual) de cavidad óptima Escala de volumen total: hasta 200 pL, asumiendo una geometría de asiento para volúmenes más grandes Escala de relación en volumen: 1 parte de proteína a 0.5 - 2.0 partes de solución de cavidad Volumen de cavidad (para 4 pL de Escala 500 - 1000 pL (igual) caída de cristalización) Limites 250 - volumen grande (limitado por la distancia entre la caída y la superficie de la solución de cavidad permitido por la geometría de vaso, ver más abajo Distancia de solución de caída- 2 cm óptimo (igual cavidad rango 1-4 cm límites 0.1 cm - 5 cm Temperatura Temperatura ambiente óptima (22- (igual) 25"C) Límites 17 - 30°C Ligandos DP/Mg" y análogos (igual) Inhibidores: Inhibidores l-IV, análogos Esperar resultados similares de ligandos que se unen reversiblemente bajo condiciones de cristalización con valores de Kn < 1mM Construcciones Variantes en secuencia de (igual) aminoácido que cristaliza en el mismo grupo de espacio y la unidad de célula debe ser considerada como equivalente Las construcciones adicional podrían incluir la eliminación de términos no construidos según determinado por la estructura cristalina de esta construcción. Por ejemplo, la eliminación de 24 residuos de C-terminal (dejando 802-1 00) ha sida preparada, la cual probablemente es para producir resultados similares Modificación después de Las variantes en la modificación de 2 formas de fosfato han sido traducción traducción posterior que cristaliza cristalizadas. Esta proteína en el mismo grupo de espacio y la contiene un fosfato ya sea en Y897 célula unitaria debe ser o Y899 y uno de cinco residuos T, considerada equivalente en los aminoácidos 1012, 1024, 1040 y 1048 Otras formas fosforilarJas pueden dar resultados similares. Se observó una sola especie de fosfato, en donde el fosfato ya sea en Y897 o Y899 ha sido aislado. Además, 3 y 4 especies de fosfato han sido aisladas, las cuales pueden cristalizarse. Grupo de espacio C222(1 ) P2(1)2(1)2(1 ) Célula unitaria a = 75.195 A, b = 116.287 A, c = a = 54.320 A, b = 75.872 A, c = 95.060 A 78.143 A Variaciones de + 2% deben ser Variaciones de ± 2% deben ser consideradas equivalentes consideradas equivalentes Angulos: a = b= c = 90° Angulos: a = b= c = 90° Variaciones observadas de + 1% Variaciones observadas de + 1 % deben ser consideradas deben ser consideradas equivalentes equivalentes Otros trucos de cristalización que Baja gravedad (igual) deben dar por lo menos resultados equivalentes Oscilacbnes de temperatura Presencia de protector crio (15- 25% de glicerol agregado antes de colección de datos) Variaciones en geometría de charola de cristalización Temperatura de recolección de datos (escala: -80 a más de 25°C) REFERENCIAS: Brunger. A. T., Adams, P. D., Clore, G. M., DeLano, W. L. Gros, P. Grosse-Kunstleve, R. W., Jiang, J-S., Kuszewski. J., Jigels, M., Pannu, N. S., Read, R. J., Rice, L. M., Simonson. T., y Warren, G. L. (1998) Acta Cryst. D54, 905-921. Collaborative Computational Project, Number 4 (1994) The CCP4 Suite: Programs for Protein Crystallography. Acta Cryst. D50. 760-763. Jones, A. T. and Kjeldgaard, M. (1997) Methods in Enzymology 277, 173-208. Kleywegt G. J. and Jones, T. A. (1997) Methods in Enzymology 277, 525-545. Kleywegt G. J., (1995) ESF/CCP4 Newsletter 31, 45-50. Minor, W. XDISPLAYF program, Purdue University (1993). Navaza, J. (1994) Acta Cryst. A50, 157-163.

EJEMPLO 3 Prueba de Potencia In Vitro de Inhibidores Tie-2 La potencia in vitro de los compuestos para inhibir estas cinasas de proteína puede ser determinada a través de los procedimientos detallados a continuación. La potencia de los compuestos puede ser determinada a través de la cantidad de inhibición de la fosforilación de un substrato exógeno (por ejemplo, péptido sintético (Z. Songyang y otros, Nature. 373:536-539) a través de un compuesto de prueba relativo al control.

Producción y Purificación de Cinasa de Tie-2 Humana La secuencia de codificación para el dominio intercelular de Tie-2 humano (aa775-1124) se generó a través de PCR utilizando ADNcs aislados de placenta humana como una plantilla. Se introdujo una secuencia de poli-His6 en el término N y está construcción fue clonada al vector de transfección pVL 1939 en el sitio Xba 1 y Not 1. Se generó BV recombinante a través de co-transfección utilizando el reactivo de transfección BaculoGoId (PharMingen). El BV recombinante fue purificado en la placa y verificado a través de análisis Western. Para la producción de proteína, se desarrollaron células SF-9 de insecto en un medio SF-900-II a 2 x 106/ml, y fueron infectadas a una MOI de 0.5. La purificación de la cinasa marcada con His utilizada en la clasificación fue análoga a aquella descrita para KDR.

Fuente de Cinasa de Tirosina de EGFR El EGFR se compró en Sigma (Catálogo # E-3641; 500 unidades/50 I) y el ligando EGF fue adquirido de Oncogene Research Products/Calbiochem (Catálogo # PF011-100).

Ensayo con Inmunoabsorbente Ligado a Enzima (ELISA) para PTKs Se utilizaron ensayos con inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA) para detectar y medir la presencia de la actividad de cinasa de tirosina. El ensayo ELISA se condujo de acuerdo con los protocolos conocidos, los cuales se describen en, por ejemplo Voller y otros, 1980, "Enzyme-Linked Immunosorbent Assay", In: Manual of Clinical Immunology 2o. ed., editado por Rose y Friedman, pág. 359-371 Am. Soc. of Microbiology, Washington, D. C. El protocolo descrito fue adaptado para determinar (a actividad con respecto a una PTK específica. Por ejemplo, los protocolos preferidos para conducir los experimentos de ELISA se proporcionan a continuación. La adaptación de estos protocolos para determinar la actividad de un compuesto para otros miembros de la familia de receptor de PTK, asi como cinasas de tirosina que no son de receptor, están dentro de las habilidades de aquellos expertos en la técnica. Con el propósito de determinar la selectividad del inhibidor, se empleó un substrato universal de PTK (por ejemplo, copolímero aleatorio de poli(Glu4 Tyr), 20,000-50,000 MW) junto con ATP (típicamente 5 µ?) a concentraciones aproximadamente del doble del valor de Km aparente en este ensayo. Se utilizó el siguiente procedimiento para analizar el efecto inhibidor de ios compuestos de esta invención sobre la actividad de cinasa de tirosina de Tie-2.

Reguladores de pH y Soluciones: PGTPoli (Glu, Tyr) 4:1 Almacenar el polvo a -20°. Disolver el polvo en salina regulada en pH con fosfato (PBS) para una solución de 50 mg/ml. Almacenar alícuotas de 1 mi a -20°C. Cuando se hacen las placas diluir a 250 g/ml en Gibco PBS. Regulador de pH de reacción: 100 mM de Hepes, 20 mM de MgCI2, 4 mM de MnCI2, 5 mM de DTT, 0.02% de BSA, 200 µ? de NaV04, pH 7.10. ATP: Almacenar alícuotas de 100 mM a -20°C. Diluir a 20 µ? en agua. Regulador de pH de lavado: PBS con 0.1% de Tween 20 Anticuerpo para Diluir Regulador de pH: 0.1% de albúmina de suero de bovino (BSA) en PBS. Substrato de TMB: mezclar el substrato de TMB y soluciones de peróxido, 9:1 justo antes de uso o utilizar substrato K-Blue de Neogen. Detener solución: 1M de ácido fosfórico.

Procedimiento 1. Preparación de la Placa Diluir el material de abastecimiento de PGT (50 mg/ml, congelado) en PBS a 250 µg/ml. Agregar 125 µ? por cavidad de placas de ELISA de alta afinidad de fondo plano modificadas con Corning (Corning #25805-96). Agregar 125 µ? de PBS a las cavidades vacías. Cubrir con cinta selladora e incubar durante la noche a 37°C. Lavar una vez con 250 pl de regulador de pH de lavado y secar durante aproximadamente 2 horas en un incubador de secado a 37°C. Almacenar las placas cubiertas en bolsas selladas a 4°C hasta que se utilicen. 2. Reacción de Cinasa de Tirosina Preparar soluciones de inhibidor a una concentración de 4x en 20% de DMSO en agua. - Preparar regulador de pH de reacción. Preparar una solución de enzima de manera que las unidades deseadas estén en 50 µ?, por ejemplo, para KDR hacer 1 ng/1 para un total de 50 ng por cavidad en las reacciones. Almacenar sobre hielo. - Hacer 4x de solución de ATP a 20 µ? a partir de una solución de abastecimiento de 100 rti en agua. Almacenar sobre hielo. Agregar 50 µ? de la solución de enzima por cavidad (típicamente 5-50 ng de enzima/cavidad dependiendo de la actividad específica de la cinasa). - Agregar 25 µ? de 4x inhibidor. Agregar 25 µ? de 4x de ATP para ensayo de inhibidor. Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente. Detener la reacción agregando 50 µ? de 0.05 N de HCI por cavidad. - Lavar la placa.

** Concentraciones finales para ia reacción: 5 µ? de ATP, 5% de DMSO. 3. Unión de Anticuerpo - Diluir una alícuota de 1 mg/ml del anticuerpo PY20-HRP (Pierce) (un anticuerpo de fosfotirosina) a 50 ng/ml en 0.1% de BSA en PBS a través de una dilución de dos pasos (100x, después 200x).

Agregar 100 µ? de Ab por cavidad. Incubar durante 1 hora a temperatura ambiente. Incubar durante 1 hora a 4°C. - Lavar 4x la placa. 4. Reacción del color Preparar el substrato de TMB y agregar 100 µ? por cavidad. Verificar OD 650 nm hasta alcanzar un valor de 0.6. - Detener con 1M de ácido fosfórico. Agitar sobre el lector de placa. Leer OD inmediatamente a 450 nm. Los tiempos de incubación óptimos y las condiciones de reacción de enzima varían ligeramente con las preparaciones de enzima y se determinan empíricamente para cada lote.

EJEMPLO 4 Ensayo Celular para Determinar la Potencia de Inhibidores de Tle-2 Se puede utilizar el siguiente ensayo celular para determinar la potencia de un inhibidor de Tie-2.

"Línea de Célula NIH-3T3/hTEK Un vector de expresión retroviral conteniendo ADNc de Tie-2 de longitud completa, LNCX6 h-TEK, se proporcionó por el Dr. Kevin Peters. Una sublínea tumorigénica de células NIH 3T3 fue infectada con 10 ig de LNCX6 h-TEK a través del método de precipitación de fosfato de calcio y se seleccionó con 400 íg/ml de neomicina. Se aislaron y se analizaron clones individuales para la presencia de proteína de TIE-2 a través de tinción Western. Se observó una máxima expresión de Tie-2 en el clon #67. La expresión del mensaje de angiopoietina 1 ha sido mostrada utilizando PCR y un lazo de autocrina se reveló en presencia de vanadato.

Ensayo Celular de Tie-2 Se midió la autofosforilación celular de Tie-2 utilizando la línea de célula NIH-3T3/hTEK (hTEK). Las células se sembraron en placas de 96 cavidades durante la noche. El medio se removió y las células se trataron con el inhibidor durante 20 minutos y con el inhibidor de fosfatasa NaV03 (2 mM) durante 15 minutos más. Las células fueron lisadas con regulador de pH de RIPA y los lizatos fueron inmunoprecipitados utilizando un anticuerpo monoclonal a-Tie-2 específico (KP33, provisto por el Dr. Kevin Peters) y la proteína de IP'd corrió sobre SDS-PAGE. El nivel de fosfotirosina en la proteína de Tie-2 después fue determinado a través de anticuerpos a-fosfotirosina (4G10, Upstate Biotechnology) en tinciones Western. Las películas fueron exploradas y se determinó el porcentaje de inhibición según comparado con el control no tratado".

EQUIVALENTES Aunque esta invención ha sido particularmente mostrada y descrita con referencias a sus modalidades preferidas, se entenderá por aquellos expertos en la técnica que se pueden hacer varios cambios en la forma y detalles de la presente sin apartarse del alcance de la invención abarcado por las reivindicaciones anexas.

Claims

REIVINDICACIONES

1.- Un polipéptido cristalino, el polipéptido comprendiendo el dominio catalítico de una proteína de Tie-2.

2.- El polipéptido cristalino de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el polipéptido comprende el dominio catalítico de Tie-2 humano.

3.- Un complejo de poliéptido-ligando cristalino, en donde el polipéptido comprende el dominio catalítico de una proteína de Tie-2.

4.- El complejo de polipéptido/ligando cristalino de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el polipéptido comprende el domino catalítico de Tie-2 de mamífero.

5. - El complejo de polipéptido/ligando cristalino de acuerdo con la reivindicación 4, en donde la proteína de Tie-2 de mamífero es Tie-2 humano.

6. - El complejo de polipéptido/ligando cristalino de acuerdo con la reivindicación 5, en donde el polipéptido comprende los aminoácidos 802-1124 de SEC ID NO:1.

7. - El complejo de polipéptido/ligando cristalino de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el ligando es de la fórmula:

8.- El complejo de polipéptido/ligando cristalino de acuerdo con la reivindicación 7, que tiene los parámetros de célula unitaria en donde a es de aproximadamente 96 A, b es aproximadamente 118 A, c es aproximadamente 78 A y a=ß=?=90°.

9.- El complejo de polipéptido/ligando cristalino de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el ligando es de la fórmula:

10. - El complejo de polipéptido/ligando cristalino de acuerdo con la reivindicación 9, que tiene los parámetros de célula unitaria en donde a y b son de aproximadamente 86.0 A, c es aproximadamente 112.0 A y a = IS=y=90e.

11. - El complejo de polipéptido/ligando cristalino de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el ligando es de la fórmula:

12.- El complejo de polipéptido/ligando cristalino de acuerdo con la reivindicación 11, que tiene los parámetros de célula unitaria en donde a y b son de aproximadamente 86.0 A, y c es aproximadamente 112.0 Á y a=ß=?=90°.

13.- El complejo de polipéptido/ligando cristalino de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el ligando es de la fórmula:

14. - El complejo de polipéptido/ligando cristalino de acuerdo con la reivindicación 13, que tiene los parámetros de célula unitaria en donde a y b son de aproximadamente 86.0 A, c es aproximadamente 112.0 A y a=ß=?=90°.

15. - Un método para determinar la estructura tridimensional de un primer polipéptido, que comprende el dominio catalítico de una proteína de Tie-2, dicho método comprende los pasos de: (a) obtener un cristal del primer polipéptido comprendiendo el dominio catalítico de Tie-2; (b) obtener datos de difracción de rayos X para dicho cristal; y (c) resolver la estructura de cristal de dicho cristal utilizando las coordenadas atómicas de un segundo polipéptido y dichos datos de difracción de rayos X, el segundo polipéptido comprendiendo el dominio catalítico de una proteína de Tie-2.

16. - El método de acuerdo con la reivindicación 15, en donde el cristal del primer polipéptido comprende un primer polipéptido en complejo con un ligando.

17. - El método de acuerdo con la reivindicación 15, en donde el primer polipéptido comprende el dominio catalítico de una proteína de Tie-2 de mamífero.

18. - El método de acuerdo con la reivindicación 17, en donde el primer polipéptido y el segundo polipéptido, independientemente, comprenden el dominio catalítico de una proteína de Tie-2 humano.

19. - El método de acuerdo con la reivindicación 18, en donde el primer polipéptido comprende el dominio catalítico de Tie-2 humano de tipo silvestre y el segundo polipéptido comprende el dominio catalítico de Tie-2 humano de tipo silvestre.

20. - El método de acuerdo con la reivindicación 19, en donde el primer polipéptido comprende el dominio catalítico de Tie-2 humano de tipo silvestre.

21. - Un método para identificar un compuesto, el cual es un inhibidor de una proteína de Tie-2, dicho método comprende los pasos de: (a) obtener las coordenadas atómicas de un cristal de un polipéptido comprendiendo el dominio catalítico de una proteína de Tie-2; (b) utilizar las coordenadas atómicas para definir los subsitios activos de Tie-2; y (c) identificar un compuesto que se une a uno o más de los subsitios activos; en donde el compuesto que se une al subsitio o sitios activos es un inhibidor de una proteína de Tie-2.

22. - El método de acuerdo con la reivindicación 21, que comprende además el paso de: (d) determinar la habilidad del compuesto identificado en el paso (c) para inhibir Tie-2.

23. - El método de acuerdo con la reivindicación 21, en donde la proteína de Tie-2 es una proteína de mamífero.

24. - El método de acuerdo con la reivindicación 22, en donde la proteina de Tie-2 es una proteína humana.

25. - El método de acuerdo con la reivindicación 24, en donde la proteína de Tie-2 es Tie-2 humano de tipo silvestre.

26.- El método de acuerdo con la reivindicación 21, en donde el cristal además comprende un ligando unido a dicho dominio catalítico.

27.- El método de acuerdo con la reivindicación 24, en donde el polipéptido comprende los aminoácidos 802-1124 de SEC ID NO:1.

28.- El método de acuerdo con la reivindicación 24, en donde el ligando es de la fórmula:

29.- El método de acuerdo con la reivindicación 28, en donde el cristal tiene parámetros de célula unitaria en donde a es aproximadamente 96 A, b es aproximadamente 118 Á, c es aproximadamente 78 Á y a = ß=?=90°?.

30.- El método de acuerdo con la reivindicación 24, en donde el ligando es de la fórmula:

31.- El método de acuerdo con la reivindicación 30, en donde el cristal tiene parámetros de célula unitaria en donde a y b son aproximadamente 86.0 A, c es aproximadamente 112.0 A y a = ß=?=90°.

32.- El método de acuerdo con la reivindicación 24, en donde el ligando es de la fórmula:

33.- El método de acuerdo con la reivindicación 32, en donde el cristal tiene parámetros de célula unitaria en donde a y b son aproximadamente 86.0 A, y c es aproximadamente 112.0 A y a=ß=?=90°.

34.- El método de acuerdo con la reivindicación 24, en donde el ligando es de la fórmula:

35. - El método de acuerdo con la reivindicación 34, en donde el cristal tiene parámetros de célula unitaria en donde a y b son aproximadamente 86.0 A, c es aproximadamente 112.0 A y a = ß = ?=90°.

36. - Un método para identificar un compuesto, el cual es un inhibidor potencial de una proteína de Tie-2, dicho método comprende el paso de diseñar un compuesto que interactuará con uno o más subsitios en el dominio catalítico de la proteína de Tie-2, basándose en las coordenadas de la estructura de cristal de un polipéptido comprendiendo el dominio catalítico; en donde el compuesto está identificado como un inhibidor potencial de la proteína de Tie-2.

37. - El método de acuerdo con la reivindicación 36, en donde la proteína de Tie-2 es una proteina de mamífero.

38. - El método de acuerdo con la reivindicación 37, en donde la proteína de Tie-2 es una proteína humana.

39. - El método de acuerdo con la reivindicación 38, en donde la proteína de Tie-2 es Tie-2 humano de tipo silvestre.

40.- El método de acuerdo con la reivindicación 39, en donde el polipéptido comprende los aminoácidos 802-1124 de SEC ID NO:1.

41.- El método de acuerdo con la reivindicación 38, en donde las coordenadas de estructura de cristal se establecen en la Figura 3.

42.- El método de acuerdo con la reivindicación 38, en donde las coordenadas de estructura de cristal se establecen en la Figura 4.

43. - El método de acuerdo con la reivindicación 38, en donde las coordenadas de estructura de cristal se establecen en la Figura 5.

44. - El método de acuerdo con la reivindicación 38, en donde las coordenadas de estructura de cristal se establecen en la Figura 6.

45. - El método de acuerdo con la reivindicación 38, en donde el compuesto interactúa con uno o más de los subsitios 1 a 9.

46. - El método de acuerdo con la reivindicación 45, en donde el compuesto interactúa con uno o más de los subsitios 1 a 9.

47. - El método de acuerdo con la reivindicación 46, en donde el compuesto interactúa con uno o más de los subsitios 1 a 9.

48. - El método de acuerdo con la reivindicación 46, en donde el compuesto interactúa con un grupo de subsitios que comprenden el subsitio 1 y el subsitio 2.

49. - El método de acuerdo con la reivindicación 47, en donde el compuesto interactúa con un grupo de subsitios que comprenden el subsitio 1, subsitio 2 y subsitio 3.

50. - El método de acuerdo con la reivindicación 47, en donde el compuesto interactúa con un grupo de subsitios que comprenden el subsitio 1, subsitio 2 y subsitio 8.

51. - El método de acuerdo con la reivindicación 47, en donde el compuesto interactúa con un grupo de subsitios que comprenden el subsitio 1, subsitio 2, subsitio 3 y subsitio 8.

52. - El método de acuerdo con la reivindicación 47, en donde el compuesto interactúa con un grupo de subsitios que comprenden el subsitio 1, subsitio 4 y subsitio 5.

53. - El método de acuerdo con la reivindicación 47, en donde el compuesto interactúa con un grupo de subsitios que comprenden el subsitio 1, subsitio 2, subsitio 7 y subsitio 8.

54. - El método de acuerdo con la reivindicación 47, en donde el compuesto interactúa con un grupo de subsitios que comprenden el subsitio 1, subsitio 2, subsitio 3, subsitio 7 y subsitio 8.

55. - El método de acuerdo con la reivindicación 47, en donde el compuesto interactúa con un grupo de subsitios que comprenden el subsitio 1, subsitio 2, subsitio 3, subsitio 7 y subsitio 8.

56. - El método de acuerdo con la reivindicación 47, en donde el compuesto interactúa con un grupo de subsitios que comprenden el subsitio 1, subsitio 2, subsitio 4, subsitio 6 y subsitio 8.

57. - El método de acuerdo con la reivindicación 47, en donde el compuesto interactúa con un grupo de subsitios que comprenden el subsitio 1, subsitio 2, subsitio 3, subsitio 4, subsitio 6 y subsitio 8.

58. - El método de acuerdo con la reivindicación 47, en donde el compuesto interactúa con un grupo de subsitios que comprenden el subsitio 1, subsitio 2, subsitio 3, subsitio 4, subsitio 6 y subsitio 8.

59. - Un inhibidor de Tie-2 que comprende dos o más de lo siguiente: (a) un donador de enlace de hidrógeno colocado para interactuar con Glu 903 de Tie-2 humano; (b) un aceptor de enlace de hidrógeno colocado para interactuar con Ala 905 de Tie-2 humano; (c) un donador de enlace de hidrógeno colocado para interactuar con Ala 905 de Tie-2 humano; (d) una porción hidrofóbica colocada para interactuar con uno o más de Me 830, Val 838, Ala 853, Me 886, He 902, Tyr 904, Ala 905 y Leu 971 de Tie-2 humano; (e) un donador de enlace de hidrógeno o grupo funcional positivamente cargado colocado para interactuar con Asp 912 de T¡e-2 humano; (f) un donador de enlace de hidrógeno o aceptor de enlace de hidrógeno colocado para interactuar con Asn 909 de Tie-2 humano; (g) una porción hidrofóbica colocada para interactuar con uno o más de Val 838, Lys 855, lie 886, Me 902, Leu 971 y Ala 981 de Tie-2 humano; (h) un aceptor de enlace de hidrógeno o grupo funcional negativamente cargado colocado para interactuar con Lys 855 de Tie-2 humano; (i) un aceptor de enlace de hidrógeno colocado para interactuar con Asp 982 de Tie-2 humano; (j) un aceptor de enlace de hidrógeno colocado para interactuar con Phe 983 de Tie-2 humano; (k) una porción hidrofóbica colocada para interactuar con uno o más de Leu 873, Leu 876, lie 885, lie 886, Leu 888, Leu 900, Me 902, Ala 981 y Phe 983 de Tie-2 humano; (I) un donador de enlace de hidrógeno o grupo funcional positivamente cargado colocado para interactuar con Asp 982 de Tie-2 humano; (m) un donador de enlace de hidrógeno colocado para interactuar con Me 886 de Tie-2 humano; (n) un donador de enlace de hidrógeno colocado para interactuar con Leu 768 de Tíe-2 humano; (o) un aceptor de enlace de hidrógeno colocado para interactuar con Gly 831 de Tie-2 humano; (p) un donador de enlace de hidrógeno o grupo funcional positivamente cargado colocado para interactuar con Glu 832 de Tie-2 humano; (q) un aceptor de enlace de hidrógeno o grupo funcional negativamente cargado colocado para interactuar con Lys 840 de Tie-2 humano; (r) un aceptor de enlace de hidrógeno o grupo funcional negativamente cargado colocado para interactuar con Lys 916 de Tie-2 humano; (s) un aceptor de enlace de hidrógeno o grupo funcional negativamente cargado colocado para interactuar con Arg 968 de Tie-2 humano; (t) un donador de enlace de hidrógeno colocado para interactuar con Arg 968 de Tie-2 humano.

60. - El inhibidor de Tie-2 de acuerdo con la reivindicación 59, que comprende (b) y (d).

61. - El inhibidor de Tie-2 de acuerdo con la reivindicación 59, que comprende (d) y por lo menos uno de (a), (b) y (c).

62. - El inhibidor de Tie-2 de acuerdo con la reivindicación 59, que comprende (d) y por lo menos dos de (a), (b) y (c).

63. - El inhibidor de Tie-2 de acuerdo con la reivindicación 62, que comprende además por lo menos uno de (e) y (f).

64. - El inhibidor de Tie-2 de acuerdo con la reivindicación 62, que comprende además (g).

65. - El inhibidor de Tie-2 de acuerdo con la reivindicación 63, que comprende además (g).

66.- El inhibidor de Tie-2 de acuerdo con la reivindicación 64, que comprende además (k).

67. - El inhibidor de Tie-2 de acuerdo con la reivindicación 65, que comprende además (k).

68. - El inhibidor de Tie-2 de acuerdo con la reivindicación 62, que comprende además por lo menos uno de (i) y (j).

69. - El inhibidor de Tie-2 de acuerdo con la reivindicación 63, que comprende además por lo menos uno de (i) y (j).

70. - El inhibidor de Tie-2 de acuerdo con la reivindicación 66, que comprende además por lo menos uno de (i) y (j).

71.- El inhibidor de Tie-2 de acuerdo con la reivindicación 67, que comprende además uno de (i) y (j).

72.- El inhibidor de Tie-2 de acuerdo con la reivindicación 59, en donde el inhibidor tiene un valor de Ki de por lo menos aproximadamente 1 mM.

73.- El inhibidor de Tie-2 de acuerdo con la reivindicación 59, en donde el inhibidor tiene un valor de Ki de por lo menos aproximadamente 100 µ?.

74.- El inhibidor de Tie-2 de acuerdo con la reivindicación 59, en donde el inhibidor tiene un valor de Ki de por lo menos aproximadamente 10 µ?.

75. - El inhibidor de Tie-2 de acuerdo con la reivindicación 59, en donde el inhibidor selectivamente une receptores de Tie-2.

76. - Un método para tratar una condición dependiente de Tie-2 en un paciente, que comprende el paso de administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de Tie-2 de la reivindicación 59.

77. - El método de acuerdo con la reivindicación 76, en donde el paciente es un ser humano.

78. - El método de acuerdo con la reivindicación 76, en donde la condición dependiente de Tie-2 se caracteriza por una proliferación vascular excesiva.

79. - El método de acuerdo con la reivindicación 78, en donde la condición dependiente de Tie-2 es un trastorno hiperproliferativo, cáncer, una condición cardiovascular, una condición ocular, la enfermedad de von Hippel Lindau, penfigoide, psoriasis, enfermedad de Paget, enfermedad poliquística de riñón, fibrosis, sarcoidosis, cirrosis, tiroiditis, enfermedad de Osler-Weber-Rendu, inflamación crónica, sinobitis, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn, artritis reumatoide, osteoartritis, artritis psoriática, úlcera y sepsis.

80. - El método de acuerdo con la reivindicación 79, en donde la condición es un cáncer seleccionado del grupo que consiste de tumores sólidos, sarcoma, fibrosarcoma, osteoma, melanoma, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, glioblastoma, neuroblastoma, teratocarcinoma, una malignidad hematopoiética, ascitos malignos, sarcoma de Kaposi. enfermedad de Hodgkin, linfoma, mieloma y leucemia.

81.- El método de acuerdo con la reivindicación 79, en donde la condición es una condición vascular seleccionada del grupo que consiste de aterosclerosis, restenosis, daño por isquemia/reperfusión, enfermedad pulmonar oclusiva crónica, oclusión vascular, e.nfermedd obstructiva de carótidas, síndrome de Crow-Fukase (POEMS), anemia, isquemia, infarto y trastornos de derrame vascular.

82.- El método de acuerdo con la reivindicación 79, en donde la condición es una condición ocular seleccionada del grupo que consiste de edema ocular o macular, enfermedad neovacular ocular, escleritis, queratotomía radial, uveítis, vitritis, miopía, puntos ópticos, separación retinal crónica, complicaciones después de tratamiento con láser, conjuntivitis, enfermedad de Stargardt, enfermedad de Eales, retinopatía, degeneración macular y microangiopatía.

83. - El método de acuerdo con la reivindicación 76, en donde el trastorno involucra interacciones aberrantes endoteliales-perioendoteliales.

84. - Un método para reducir la fertilidad en un paciente, que comprende el paso de administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de Tie-2 de la reivindicación 59.

85.- Un método para promover angiogénesis o vasculogénesis en un paciente, que comprende el paso de administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de Tie-2 de la reivindicación 59.

86. - El método de acuerdo con la reivindicación de acuerdo con la reivindicación 85, en donde el inhibidor de Tie-2 es administrado en combinación con un factor de crecimiento pro-angiogénico.

87. - Un método para determinar la estructura tridimensional de un polipéptido, que comprende el dominio catalítico de una proteína de Tie-2, el método comprende los pasos de: (a) obtener un cristal del polipéptido comprendiendo el dominio catalítico de Tie-2; (b) obtener datos de difracción de rayos X para dicho cristal; y (c) resolver la estructura de cristal de dicho cristal.

88. - Un polipéptido cristalino, el polipéptido comprendiendo una secuencia que tiene 80% de homología con el dominio catalítico de una proteína de Tie-2.