MXPA02008705A - Tecnologia para encapsular delta endotoxina de bacillus thuringiensis variedad israelensis para prolongar su actividad sobre larvas de mosquitos. - Google Patents
Tecnologia para encapsular delta endotoxina de bacillus thuringiensis variedad israelensis para prolongar su actividad sobre larvas de mosquitos.Info
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Abstract
Se presenta la formulacion de un insecticida biologico obtenido a partir de la mezcla espora-cristal de la bacteria Bacillus thuringiensis variedad israelensis que tiene actividad biologica con alta residualidad sobre larvas de diversas especies de mosquitos en las que se incluyen Anopheles y Aedes, insectos vectores de enfermedades como paludismo y dengue. La formulacion de encapsulacion descrita en la presente invencion en la que se utiliza la mezcla de tres colorantes permite prolongar la actividad de la proteina por un periodo de por lo menos 60 dias en condiciones naturales con la luz solar a diferencia de la proteina sin encapsular y encapsulada con cada colorante independiente se desnaturaliza desde en unos pocos dias hasta en un periodo menor a un mes.
Description
TECNOLOGÍA PARA ENCAPSULAR DELTA ENDOTOXINA DE bacillus thuríngiensis variedad israelensis PARA PROLONGAR SU ACTIVIDAD SOBRE LARVAS DE MOSQUITOS
DESCRIPCIÓN
OBJETO DE LA INVENCIÓN Se presenta la formulación de un insecticida biológico obtenido a partir de la mezcla espora- cristal de la bacteria Bacillus thuríngiensis variedad israelensis que tiene actividad biológica con alta residualidad sobre larvas de diversas especies de mosquitos en las que se incluyen Anopheles y Aedes, insectos vectores de enfermedades como paludismo y dengue. La formulación de encapsulación descrita en la presente invención en la que se utiliza la mezcla de tres colorantes permite prolongar la actividad de la proteína por un periodo de por lo menos 60 días en condiciones naturales con la luz solar a diferencia de la proteína sin encapsular y encapsulada con cada colorante independiente se desnaturaliza desde en unos pocos días hasta en un periodo menor a un mes.
ANTECEDENTES El principal agente biológico utilizado para el control biológico de vectores de enfermedades como el paludismo y el dengue es la bacteria Bacillus thuríngiensis variedad israelensis. Una de las características más importante de esta bacteria es que produce una toxina de carácter proteico que es altamente específica sobre larvas de 72 especies de mosquitos, especialmente sobre 21 del género Anopheles, vector transmisor del paludismo y 21 del género Aedes, vector transmisor del dengue entre otros. Una vez que ha actuado sobre las larvas de estos mosquitos causándoles la muerte la proteína se desnaturaliza no afectando la flora, la fauna y al hombre. El uso de esta proteína llamada delta endotoxina está limitado debido a la baja eficacia que tiene en las aplicaciones en campo ya que a los pocos días pierde su actividad debido principalmente a las condiciones ambientales entre ellas que la proteína se deposita en el fondo del agua originando que la larva no tenga acceso a esta, absorción de la proteína por la materia orgánica, consumo por otros organismos para los que no es toxica y la más importante que se desnaturaliza por los rayos de la luz ultravioleta del sol. La bacteria Bacillus thuringiensis variedad israelensis es una bacteria gram positiva que forma la toxina proteica durante la etapa de esporulación y los fabricantes de este producto biológico la utilizan en forma de una mezcla espora-cristal proteico que la formulan utilizando aditivos y tienen las presentaciones en forma de suspensión concentrada o bien de polvo humectable. El liquido concentrado o bien el polvo humectable es mezclado con agua y las partículas son lo suficientemente finas para ser asperjadas sobre la superficie de agua en la que se encuentran las larvas de mosquitos (U.S. Patent 4 166 112). Alternativamente se han desarrollado otras formulaciones como gránulos, arena que tienen un tamaño que oscila entre la malla 20 y la malla 40 contienen la mezcla espora-cristal proteico integrada a los materiales utilizados para la formulación.
Estos productos que se han desarrollado tienen una gravedad específica que es mayor a la del agua y como consecuencia se depositan en el fondo del agua teniendo como consecuencia que las larvas de mosquito no tengan acceso a esta y por lo tanto provocan una baja eficiencia del producto. Por otro lado los productos que son emulsificables y se mantienen mas tiempo en la superficie del agua son desnaturalizados por la luz ultravioleta del sol en unos pocos días, siendo esta otra causa de baja eficiencia del producto
Otro producto que ha sido desarrollado es el briquett que son partículas en forma de dona compuestas de plaster y corcho en la cual se encuentra integrada la mezcla espora-cristal proteico, este producto tiene una menor gravedad específica que el agua y como consecuencia se deposita en la superficie desintegrándose lentamente y de esa manera proporciona una mayor residualidad de la mezcla espora cristal (U.S Patent 4 631 857). El mayor inconveniente que tiene este producto es que se deposita cerca de las orillas de los sitios en donde se encuentra el agua y por lo tanto las larvas no tienen acceso a la proteina y en el momento de liberarse la mezcla espora-cristal esta es desnaturalizada por la luz ultravioleta en pocas horas. Algunos autores han sugerido que para proteger a la proteína de la desnaturalización de la luz ultravioleta del sol esta se debe encapsular. En algunas industrias como en la de los alimentos es común que se utilicen agentes encapsulantes como son los derivados del almidón, maltodextrinas, materiales celuloliticos, polisacáridos, gelatinas entre otros En la bacteria Bacillus sphacricus se ha utilizado carboximetilcelulosa y sulfato de aluminio para encapsular la mezcla espora-proteína que es tóxica contra larvas de mosquitos, sin embargo en estos estudios se han dirigido a incrementar la viabilidad de la espora en vez de proteger a la proteína de la luz ultravioleta ya que ésta no la afecta.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En esta sección se describen las características de la presente invención y se muestra como se puede preparar la mezcla espora-cristal de Bacillus thuringiensis variedad israelensis micro-encapsulada con carboximetilcelulosa. sulfato de aluminio Y los colorantes rojo congo, rojo de ponceau y verde de malaquita en porcentajes precisos. Las micro-cápsulas formadas que contienen la mezcla espora-cristal al ser evaluadas con radiaciones de luz ultravioleta en el laboratorio y en condiciones naturales de luz ultravioleta del sol han demostrado no perder su actividad biológica sobre las larvas de Aedes aegypti mosquito transmisor de la enfermedad del dengue clásico y del dengue hemorrágico, no ocurriendo lo mismo con la mezcla espora-cristal sin encapsular y encapsulada sólo con carboximetilcelulosa y sulfato de aluminio.
Para obtener las micro-capsulas de la mezcla espora-cristal aproximadamente se parte de un caldo fermentado de Bacillus thuringiensis variedad israelensis el cual tiene el 95% de lisis celular observada esta por microscopio a 10?? por inmersión. Se recupera la mezcla espora-cristal por centrifugación a 10,000 gravedades durante 5-10 minutos. El cristal proteico que es la delta endotoxina es purificado junto con la espora a través de lavados con cloruro de sodio 0. 1 M y tritón 1 00 con una concentración entre 0.1-0.5% durante 3 a 5 ocasiones. El producto obtenido de la mezcla espora cristal se añade a una solución al 1 - 3% de carboximetilcelulosa y 1-2% de rojo congo. La solución se mantiene en agitación por un periodo de entre 12 y 18 horas a 2-4°C. A la solución obtenida se añade a una solución de verde de malaquita y rojo de ponceau al 30% y posteriormente la solución formada se añade a una solución de sulfato de aluminio 0.05 M con un pH menor de 3.4 utilizando para ello una aguja hipodérmica a razón de 20-60 gotas por minuto. La mezcla se mantiene en agitación a 2-4°C durante 12 horas hasta que se forman las micro-cápsulas, observadas éstas por microscopía. La suspensión en la que se encuentran las micro-cápsulas es centrifugada durante 5-7 minutos a 5 000 gravedades, se elimina el sobrenadante y se añade la solución de sulfato de aluminio a una molaridad mayor de 0. 15M formando una suspensión de micro cápsulas, se centrífuga nuevamente y esta operación se realiza 3 veces. El producto obtenido se seca a 60°C durante 48 horas. A continuación la potencia biológica del producto es estandarizadao utilizando larvas del 3er estadio de Aedes aegyti.
Se ha comprobado en el laboratorio que este producto tiene una actividad de matar al 100% de las larvas utilizando una concentración de 0.1 ppm. El producto no se degrada utilizando luz ultravioleta de 257 nanómetros por al menos un periodo de 48 horas.
De igual manera la proteína no se desnaturaliza en condiciones ambientales de radiación de luz ultravioleta del sol durante un periodo de 60 días por lo menos a diferencia de la encapsulación de la mezcla espora cristal sin rojo congo, rojo de ponceau y verde de malaquita que se desnaturaliza en pocos días.
Claims (1)
1. La formulación de la mezcla espora-cristal obtenida de la bacteria Bacillus thuríngiensis variedad israelensis que involucra la encapsulación con carboximetilcelulosa, sulfato de aluminio y los colorantes utilizados conjuntamente: rojo congo, verde de malaquita y rojo de ponceau para ser utilizados para proteger a la proteína contra la desnaturalización producida por la luz ultravioleta del sol y de esa manera tener una alta residualidad de actividad sobre larvas de mosquitos.
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