MXPA02007869A

MXPA02007869A - Composiciones utiles para regular la actividad del gen de la parkina.

Info

Publication number: MXPA02007869A
Application number: MXPA02007869A
Authority: MX
Inventors: Alain Fournier
Original assignee: Aventis Pharma Sa
Priority date: 2000-02-17
Filing date: 2001-02-15
Publication date: 2003-02-10
Also published as: NZ520802A; ATE466083T1; US20060287230A1; BR0108376A; IL193310A; WO2001060857A2; KR20020089352A; WO2001060857A3; AU2001235696A1; IL151211A; KR100811926B1; NO20023914D0; CY1111004T1; EP1259606A2; CA2400256C; DE60141948D1; US8273548B2; CA2400256A1; US20020155577A1; IL151211A0

Abstract

La presente invencion se relaciona con compuestos novedosos y sus usos, especialmente farmaceuticos, en diagnostico o como blancos farmacologicos. Mas particularmente, la presente invencion se relaciona con una nueva proteina, llamada PAP1, asi como peptidos novedosos y compuestos capaces de modular al menos parcialmente la actividad de la parkina.

Description

PARKINA DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con composiciones y métodos útiles para regular la actividad de la parkina. Se relaciona especialmente con una proteina novedosa, llamada PAP1, compañera de la parkina, asi como los péptidos o polipéptidos derivados u homólogos de esta proteina. Se relaciona igualmente con compuestos capaces de modular al menos parcialmente la actividad de la parkina, especialmente de interferir con la interacción entre la parkina y la PAP1. La presente invención es útil en los dominios terapéuticos, diagnósticos o para la constitución de blancos farmacológicos que permitan desarrollar medicamentos novedosos .

El gen de la parkina está mutado en ciertas formas familiares (juveniles autosómicas recesivas) de la enfermedad de Parkinson (Kitada et ai . 1998). La enfermedad de Parkinson (Lewy, 1912) es una de las enfermedades neurodegenerativas más comunes, que afectan más del 1% de la población de más de 55 años. Los pacientes que sufren de esta enfermedad tienen Ref: 141031 3ßrkmsortiano, caracterizado por una rigidez, una bradiquinesia, y un temblor en reposo. Estos síntomas son la '" consecuencia de una degeneración de las neuronas áopaminérgicos de la sustancia negra del cerebro. La mayor parte de los casos con una enfermedad d® -"ParTcinson no tienen una historia familiar. Sin embargo, „ alisten casos familiares donde ciertos corresponden a una forma monogénica de la enfermedad. En la actualidad, solamente tres genes diferentes se han identificado en ciertas formas hereditarias raras. La primera forma orresponde a una forma autosómica dominante donde el *gen responsable codifica para la alfa Sinuclema (Polymeropoulos ' Bt al . 1997). Esta proteína es un constituyente abundante de les inclusiones intracitoplásmicas, llamadas cuerpos de Lewy, que sirven de marcador de la enfermedad de Parkinson (Lßwy, 1912). La segunda forma, igualmente autosómica dominante, está ligada a una mutación en un gen que codifica para una hidrolasa llamada ubiquitin carboxi terminal hidrolasa Ll <Leroy et al . , 1998). Se supone que esta enzima hidroliza los polímeros o los conjugados de ubiquitinas en monómeros de ubiquitina. La tercera forma se distingue de las precedentes por una transmisión autosómica recesiva y un inicio con frecuencia antes de los 40 años así como por una ausencia de los cuerpos de Lewy. Estas enfermedades responden más *r ? & *.**» *: difica para los exones 3, 4 y 5 se han identificado. El más largo de los ARN mensajeros de la Parkma, presente en ßl Cerebro, contienen 2960 bases y codifica para una proteína de 465 aminoácidos. Esta proteína tienen una ba a homología en su parte ff terminal con a ubiquitma. Su porción C terminal contiene dos motivos "de anillo" separadas por un dominio IBR (Anillo Intermedio) que corresponde a una región rica en cisteína que pueden unirse a los metales como los dominios " dedo zingj" (MOrett, 1999) . Por mmunocitoquímica, se ha mostrado que la Parkma se localiza en el citoplasma y el aparato de Golgí de las neuronas de la sustancia negra que contiene la me1a i a (Shimura et al . , 1999). Además, esta proteína está presente j§n ciertos cuerpos de Lewy de los Parkinsonianos. La función celular de la Parkina no se ha demostrado aún, pero podría jugar un papel de transportador en las vesículas smáptic^s, e la maduración o degradación de las proteínas y en el control del crecimiento, de la diferenciación o el desarrollo celular. En las formas autosómicas recesivas juveniles, la Parkma está ausente, confirmando así que la pérdida de esta función es responsable de la enfermedad. La elucidación del papel exacto de la proteína Éarkina en el proceso de la degeneración de las neuronas dopammérgicas constituye por lo tanto una postura principal para la compresión y el método terapéutico de la enfermedad Parkinson y mas generalmente las enfermedades del sistema ftervioso central. La presente invención reside en la identificación de un compañero de la Parkma, que mteractúe con esta proteina en condiciones fisiológicas. Este compañero representa un nuevo blanco farmacológico para la fabricación o la investigación de compuestos capaces de modular la actividad de la parkma, especialmente su actividad en la degeneración de las neuronas dopammérgicas y/o el desarrollo de patologías nerviosas. Esta protema, los anticuerpos, los ácidos nucleicos correspondientes, así como las sondas o cebadores específicos, son igualmente útiles para la detección o la dosificación de proteínas en las muestras biológicas, especialmente las muestras de tejido nervioso. Estas proteínas o ácidos nucleicos son igualmente útiles en los métodos terapéuticos, para modular la actividad de la parkma, así como cualquier compuesto de la invención, capaces de modular la interacción entre la parkma y los polipeptidos de la invención. La presente invención resulta mas particularmente de la puesta en evidencia por la solicitante de una novedosa proteína humana, designada PAP1 (Proteína Asociada con la Parkma 1) o LY111, que mteractua con la parkma. La protema PAP1 (secuencia SEQ ID NO: 1 ó 2) presenta una cierta homología con las smaptotagminas y es capaz de ¡ teractuar más particularmente con la región central de la parkma (representada en las secuencias SEQ ID NO: 3 ó 4) . ta proteína PAP1 se ha clonado igualmente, secuenciada y aracterizada a partir de diferentes tejidos de o ige ^* humano, especialmente de pulmón (SEQ ID NO: 12, 13) y de cerebro (SEQ ID NO: 42, 43), así como las formas cortas, que corresponden a variantes de empalmes (SEQ ID NO: 14, 15, 44, 45) . La presente invención resulta igualmente d ' la identificación y de la caracterización de regiones particulares en la proteína PAP1, implicadas en la modulación de la función de la parkma. La puesta en evidencia de la existencia de esta proteína y de las regiones implicadas éh ¡gu función permiten preparar especialmente, compuestos y/o composiciones novedosas utilizables como agentes farmacéuticos y desarrollar métodos industriales de reparación de tales compuestos. Un primer objeto de la invención se relaciona por lo tanto con compuestos capaces de modular, al mßnos parcialmente, la interacción entre la proteína PAP1 (o sus homólogos) y la parkma (especialmente la parkma humana), o de interferir a nivel de la interacción entre estas proteínas. Otro objeto de la invención reside en la proteína PAP1, sus fragmentos, derivados y homólogos. ;#•« . invención reside en un ácido nucleico que codifica la proteína PAP1, sus fragmentos, derivados u homólogos, así como cualquier vector que comprenda tal ácido nucleico, cualquier célula recombmante 5 que contenga tal ácido nucleico o vector y cualquier mamífero no humano que comprenda en sus células tal ácido nucleico. La invención se relaciona también con anticuerpos capaces de unirse a la proteína PAP1, sus fragmentos, derivados y homólogos, especialmente los anticuerpos 10 policlonales o monoclonales, de manera más preferida anticuerpos capaces de ligarse a la proteína PAP1, y de inhibir al menos parcialmente su interacción con la par ina. Otro aspecto de la invención se relaciona con Sondas o cebadores nucleotídicos, específicos de PAP1, útiles 15 para detectar o amplificar el gen de la PAP1 o una región de este en cualquier muestra biológica. t* La invención se relaciona incluso con composiciones .farmacéuticas, métodos de detección de anomalías genéticas, Slétodos de detección de polipéptidos tales como los definidos 20 anteriormente, así como métodos de separación o de caracterización de compuestos activos. Como se indica anteriormente, un primer aspecto de la invención reside en un compuesto capas de interferir, al menos parcialmente, a nivel interacción entre la proteína 5 FAP1 (o sus homólogos) y la parkma. £ * * denominación proteína PAP1 designa la proteína en sí, sí como cualquiera de sus formas homologas. Por forma homóioga se entiende designar cualquier proteína equivalente a l " jßroteína considerada, de origen celular diverso y especialmente producida de células de origen humano, o de tros organismos, y que posean una actividad del mismo tipo. Tales homólogos comprenden igualmente las variantes naturales de la proteína PAP1 de las secuencia SEQ ID N02, especialmente las variantes polimorfas o de empalme. Tales homólogos pueden obtenerse por experimentos de hibridación ©ntre los ácidos nucleicos que codifican (especialmente en ácido nucleico de la secuencia SEQ ID NO: 1) . En el sentido de la invención, basta que una secuencia de este tipo presente un porcentaje de identidad significativo para Conducir a un comportamiento fisiológico asimilable que es de la proteína a PAP1 tal como la reivindicada. Se entiende por porcentaje de identidad significativo, un porcentaje de al menos 60%, de manera preferida de 80%, de manera más preferida del 90% e incluso de manera aún más preferida del 95%. A este respecto, las variantes y/u homólogos de la secuencia SEQ ID NO: 2 son descritos en la secuencia SEQ ID NO: 13, 15, 43 y 45, identificados a partir del tejido de origen humano. La denominación PAP1 engloba por lo tanto igualmente estos polipéptidos. <J? . , »»' El "porcentaje de identidad" entre dos secuencias de nucleótidos o de aminoácidos, en el sentido de la presente Invención, puede determinarse comparando dos secuencia^ alineadas de manera óptima, a través de una ventana de comparación. La parte de la secuencia nucleotídica o polipéptido ßn la ventana de comparación puede así comprender adiciones o supresiones (por ejemplo "hueco") con respecto a la secuencia de referencia (que no comprende estas adiciones o 10 supresiones) , de manera obtener una alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en la cual una base nucleica o un residuo de aminoácido idéntico se observa para las dos secuencias 15 (nucleico o peptídico) comparadas, después dividiendo el _ número de posiciones en las que hay identidad entre las dos bases de residuos de aminoácidos por el número total de posiciones en la ventana de comparación, después multiplicando el resultado por 100 con el fin de obtener el 20 resultado de identidad de secuencia. La alineación óptima de las secuencias para la comparación puede realizarse de manera informática con la ayuda de algoritmos conocidos contenidos en el paquete de» la ociedad ISCONSIN GENETICS SOFTWARE PACKAGE, GENETICS 25 COMPUTER GROUP (GCG), 575 Science Doctor, Madison, WISCONSIN.

A modo de ilustración, el porcentaje de identidad /de la secuencia podrá efectuarse con la ayuda de lógico B ST"" versiones BLAST 1.4.9 de marzo de 1996, BLAST 2.0.4 de febrero de 1998 y BLAST 2.0.6 de septiembre de 1998), utilizando exclusivamente los parámetros por defecto fAltschul et al, J. Mol . Biol . , (1990) 215 : ,403-410; Altschul et al, Nuclei c Acids Res . (1997) 25 : 3389-3402) . BLAST busca las secuencias similares/homologas a una secuencia "solicitada" de referencia, con la ayuda del 10 logaritmo de { Supra ) . La secuencia solicitada y las bases de datos utilizadas pueden ser peptídicas o nucleicas, cualquier combinación es posible. La interferencia de un compuesto de acuerdo con la invención puede manifestarse bajo diferentes aspectos. Así, 15 el compuesto puede hacer más lenta, inhibir o estimular, al «menos parcialmente, la interacción entre la proteína PAP1 o una se sus formas homologas y la parkina. Se trata de manera preferida de compuestos capaces de modular esta interacción í„n vitro, por ejemplo en un sistema del tipo doble híbrido de 20 Cualquier sistema acelular de detección de una interacción ntre dos polipéptidos. Los compuestos de acuerdo con la invención son de manera preferida compuestos capaces de modular al menos parcialmente esta interacción, de preferencia de aumentar o de inhibir esta interacción al 20% * rida del 50% o menos, con. * 4 respecto a un control en ausencia del compuesto. En un modo particular de aplicación, se trata de Compuestos capaces de interferir al nivel de la mteracCipn 5 entre la región de la parkma representada sobre las Secuencias SEQ ID NO: 4 y la región de la proteína PAP1 representada en la secuencia SEQ ID NO: 2, 13, 15, 43 ó 45. De a acuerdo a un modo particular de la invención, los compuestos son capaces de ligarse al nivel del dominio de 10 la interacción entre la proteína PAP1, o una de sus formas homologas, y la parkma. Los compuestos de acuerdo con la presente invención pueden ser de naturaleza y de origen variado. En particular, se puede tratar de compuestos del tipo peptídico, nucleico is es decir, que comprendan un encadenamiento de bases, especialmente una molécula de ADN o ARN) , lipídico, sacarídico, de un anticuerpo, y de manera más general, e cualquier molécula orgánica o inorgánica. De acuerdo con una primera variante, los compuestos 20 de la invención son de naturaleza peptídica. El término peptídico designa a cualquier molécula que comprenda un encadenamiento de aminoácidos, tal como por ejemplo un péptido, un polipéptido, una proteína, un anticuerpo (o fragmento o derivado de anticuerpo) , dado el caso modificado 25 asociado con otros compuestos o agrupamientos químicos. A específicamente a una molécula que comprende un encadenamiento de 50 aminoácidos cuando mucho, de manera más preferida de 40 aminoácidos cuando mucho. Un polipéptido (o tina proteína) comprende de manera preferida de 50 a 500 aminoácidos, o más. De acuerdo con un primer modo de aplicación preferida, los compuestos de la invención son compuestos peptídicos que comprenden todo o parte de la secuencia peptídica SEQ ID NO: 2 o uno de sus derivados, en particular toda o parte de la secuencia peptídica SEQ ID NO: 13, 15, 43, ó 45 o derivados de estas, más particularmente de la proteína &AP1 que comprende las secuencias SEQ ID NO: 2, \t> , 15, 43 ó 45. En el sentido de la presente invención, el término derivado designa cualquier secuencia diferente de la secuencia considerada debido a una degeneración del código genético, obtenida por una o varias modificaciones de naturaleza genética y/o química, así como cualquier péptido codificado por una secuencia que se hibride con la secuencia nucleica SEQ ID NO: 1 o un fragmento de esta, por ejemplo con la secuencia nucleica SEQ ID NO: 12, 14, 42 ó 44 o un fragmento de estas, y que presente la capacidad de interferir al nivel de la interacción entre la proteína PAP1 o uno de sus homólogos, y la parkina. Por modificación de naturaleza »#* ríetica y/o química, se puede entender cualquier mutación, sustitución, supresión, adición y/o modificación de uno o "varios residuos. El termino derivado comprende igualmente las secuencias homologas a la secuencia considerada, originados de otras fuentes celulares y especialmente de células de origen humano, o de otros organismos, y que poseen una actividad del mismo tipo. Tales secuencias homologas pueden a enerse por los experimentos de hibridación. Las hibridaciones pueden realizarse a partir de bancos de ácidos nucleicos, utilizando como sonda la secuencia nativa o un fragmento de esta, en las condiciones variables de hibridación (Maniantis et al., 1989). Además, el término "fragmento" o "parte" designa cualquier porción de la atolécula considerada, que comprende al menos 5 residuos consecutivos, de preferencia al menos 9 residuos consecutivos, incluso de manera más preferida al menos 15 residuos consecutivos. Los fragmentos típicos pueden comprender al menos 25 residuos consecutivos. Tales derivados o fragmentos pueden generarse para aétodos diferentes, tales como para especialmente aquella de atamentar su eficiencia terapéutica o de reducir sus efectos secundarios, o aquella de conferirles nuevas propiedades tfarmacinéticas y/o biológicas. Como péptido derivado de la proteína PAP1 y su formas homologas, podemos citar especialmente cualquier "fiéptido capaz de interactuar con la parkma, pero-, ue p?j:te •una región efectora transformada no funcional . Tales péptídos pueden obtenerse por supresión , mutación o disrupción ® *sta región efectuar de la proteína API y de f ^f homologas. Tales modificaciones pueden efectuarse por e ertiplo por mutagénesis m vitro, por introducción de elementos •adicionales o de secuencias sintéticas, o por supresiones o sustituciones de elementos originales. Cuando se realiza un derivado tal como el definido anteriormente, su actividad inhibidora parcial de la fijación de la proteína PAP1 y de sus formas homologas sobre su sitio de fijación sobre la parkma puede ponerse en evidencia. Cualquier técnica conocida por el experto en la materia puede evidentemente, utilizarse para este efecto. Se puede tratar igualmente de fragmentos de secuencias indicadas anteriormente. Tales fragmentos pueden generarse de las siguientes maneras. En particular, pueden sintetizarse por vía química, sobre la base de secuencias dadas en la presente solicitud, utilizando los smtetizadores peptidicos conocidos por el experto en la materia. Pueden igualmente ser sintetizadas por vía genética, por expresiones ?n un huésped celular de una secuencia nucieotídiCa que codifique para el peptido buscado. En este caso, la secuencia nucleotidica puede prepararse químicamente utilizando un íßAntetizador de oligonucleotidos, sobre la base de la secuencia peptídica dada en la presente solicitud y del *., Uódigo genético. La secuencia nucleotídica puede igualmente preparase a partir de secuencias dadas en la presente ©jolicitud, por cortes enzimáticos, ligación, clonación, etc, 5 -de acuerdo a las técnicas conocidas por el experto en la materia, o por tamizado de bancos de ADN con sondas ^laboradas a partir de estas secuencias. Además, los péptidos de la invención, a saber Capaces de modular al menos parcialmente la interacción entre 10 la proteína PAP1 y las formas homologas y la parkma, pueden igualmente ser péptidos que tengan una secuencia que corresponda al sitio de interacción de la proteina PAP1 y las formas homologas en la parkina. Otros peptidos de acuerdo con la invención son 15 péptidos capaces de entrar en competencia con los pépt dos -definidos anteriormente para la interacción con su blanco (jelular. Tales péptidos pueden ser sintetizados especialmente - sobre la base de la secuencia del péptido considerado, y su capacidad para entrar en competencia con los péptidos 20 definidos anteriormente puede determinarse. Un objeto especifico de la presente invención Se relación con la protema PAPl. Se trata más particularmente de la proteína PAP1 que comprende la secuencia SEQ ID NO: 2 o un fragmento derivado de esta fragmento o derivado que conserve la especificidad antigénica ¿Je Los anticuerpos de los cuales provienen. Los anticuerpos de acuerdo con la invención so© d? Éanera más preferida capaces de ligarse a las proteínas * PAP1 que comprendan la secuencia SEQ ID NO: 2, 13, 15, 43 ó 45, especialmente la región de esta proteína implicada en la i-nteracción con la parkina. Estos anticuerpos (o fragmentos derivados) son de manera más preferida capaces de unirse a un epitopo presente la secuencia comprendida entre los residuo 1 y 344 de la secuencia SEQ ID NO: 2. La invención se relaciona igualmente con compuestos no peptídicos o no exclusivamente peptídicos útiles co o «gente farmacéutico. Es en efecto posible, a partir de motivos proteicos activos descritos en la presente solicitud, realizar moléculas moduladoras de la actividad del PAP1 no exclusivamente peptídicas y compatibles con una utilización farmacéutica, en particular duplicando los motivos activos de los péptidos con una estructura no peptídica o de naturaleza no exclusivamente peptídica. La presente invención tiene igualmente por -objeto cualquier ácido nucleico que codifique para un compuesto peptídico de acuerdo a la invención. Se puede tratar en particular de un ácido nucleico que comprenda toda o parte de ía secuencia SEQ ID NO: 1, 12, 14, 42 ó 44, o uno de sus ^* ,2*J^.^ j^ de la presente invención , cualquier secuencia que se hibtide con la secuencia presentada en la secuencia de identificarían ?úmero 1, o con un fragmento de esta y que codifique par® u t5 compuesto peptídico de acuerdo con la invención? asi como las" secuencias que resalte de estas últimas por degeneración del Óódigo genético. Los ácidos nucleicos de acuerdo con la ' invención comprende por ejemplo toda o parte de la secuencia nucleica SEQ ID NO: 12, 14, 42 ó 44. 10 La presente invención es además relativa con las , secuencias que presentan un porcentaje de identidad Significativo con la secuencia presentada en la SEQ ID NO: 1 o con un fragmento de esta y que codifique para un compuesto ,„ Jpeptidico que presente un comportamiento fisiológico 15 asimilable a aquel de la PAPl. Se entiende por porcentaje de identidad significativa un porcentaje de al menos 60%, de preferencia del 80%, de manera mas preferida del 90% e incluso de manera más preferida del 95%. Lasa diferente secuencias nucieotídicas de la 20 invención pueden ser de origen artificial o no. Se puede tratar de secuencias genomicas, de ADNc, de ARN, de secuencias híbridas o de secuencias sintéticas o semismtéticas. Estas secuencias pueden obtenerse ya sea por tamizado de los bancos de ADN (banco de ADNc, banco de ADN 25 ff nomico) , ya sea por síntesis química, ya sea por métodos „ %. * «., ». jfcixtos que incluyan la modificación química o enzimátíca de ia secuencias obtenidas por tamizado de los bancos, ya sea por la búsqueda de homología en las bases de datos nucleicas ó proteicas. La hibridación mencionada anteriormente $e realiza de preferencia en las condiciones descritas por Sambrook et al (1989, páginas 9.52-9.55). Se realiza de manera ventajosa en condiciones de hibridación de fuerte astringencia o rigor. Por "condiciones de hibridación de fuerte astringencia o rigor" en el sentido 10 de la presente invención, se entenderá las condiciones siguientes : 1- Competencia de las membranas y PRE HIBRIDACIÓN Mezclar: 40µl de ADN de esperma de salmón (10 15 mg/ml) + 40 µl de ADN de placenta humana ^10 mg/ml) Desnaturalizar 5 minutos a 96°C, después Sumergir en hielo la mezcla. Quitar el amortiguador SSC 2X y verter 4 ml de 20 mezcla de formada en el tubo de hibridación que contiene las membranas . Agregar la mezcla de los dos ADN desnaturalizados . ¿ &* 21 ** Las condiciones de hibridación descritps anteriormente están adaptadas a la hibridación en las Condiciones de fuerte astringencia, de una molécula de ácidos jucleico de una longitud variable de 20 nucleótidos a varias entenas de nucleótidos. No hay que decir que las condiciones de hibridación descritas anteriormente pueden adaptarse en función de la longitud de ácido nucleico cuya hibridación se busca o del tipo de mareaje elegido, de acuerdo a las técnicas conocidas del experto en la materia. Las condiciones convenientes de hibridación pueden por ejemplo, adaptarse de acuerdo a las enseñanzas contenidas en la obra de HAMES y HIGGINS (1985) {Nucleic acid Bybridization iapractical Approach, Hames y Higgins Ed., IRL Press, Oxford) o incluso en la obra de F. AUSUBEL et al (1999) (Currents Protocols in Molecular Biology, Green Pyublishing Associates and Wiley Interscience, N.Y.). Un ácido nucleico particular en el sentido de la invención codifica para un polipéptido que comprende la secuencia SEQ ID NO: 2, o un fragmento o derivado de éste, especialmente para la proteína PAPl humana. Se trata ventajosamente de un ácido nucleico que comprende la secuencia nucleica SEQ ID NO: 1, 12, 14, 42 o 44. Tales ácidos nucleicos pueden utilizarse para la roducción de los compuestos peptídicos de la invención, a ¿&? EJ3- ***A 5* 22 ¿ presente solicitud se relaciona así con un procedimiento de preparación de tales compuestos peptídicos de acuerdo con el Cual se cultiva una célula que contiene un ácido nucleico de acuerdo con la invención, en condiciones de expresiór del cxdo nucleico, y se recupera el compuesto psptídico producido. En este caso, la parte que codifica para el compuesto peptídico se coloca generalmente bajo el control de la señal que permite su expresión en un huésped celular. La elección de estas señales (promotores, termmadores, 10 secuencia "líder" de secreción, etc.) puede variar en función del huésped celular utilizado. Además, los ácidos nucleicos, de la invención pueden formar parte de un vector que puede ser de reproducción autónoma o integrativa. Más particularmente, los vectores de reproducción autónoma pueden" *^? prepararse utilizando secuencias de reproducción autónoma en él huésped elegido. Si se trata de vectores integrativos, "éstos pueden prepararse, utilizando las secuencias homologas con ciertas regiones del genoma del huésped, que permitan, por recombinación homologa, la integración del vector. Se 20 puede tratar de un vector del tipo plasmídico, episómico, cromosómico, viral, etc. Los huéspedes celulares útiles para la producción de compuestos peptídícos de la invención por vía recombinante, son también huéspedes eucariotes más que & jprocariotes . Entre los huéspedes eucariotes que convienen, se jueden citar las células animales, las levaduras, o los hongos. En particular, si se trata de levaduras, se pueden citar las levaduras del género Saccharomyces , Kluyveromycef , Pichia , Schwanniomyces , o Hansenula . Si se trata de células animales, se pueden citar las células COS, CHO, C127, PC12, etc. Entre los hongos, se pueden citar más particularmente spergillus ssp. o Trichoderma ssp. Como huéspedes procariotes se puede preferir utilizar las bacterias Siguientes E. coll , Bacillus o Streptomyces . 10 La presente invención tiene por objeto los mamíferos no humanos que comprendan en sus células un ácido nucleico o un vector de acuerdo con la invención. Tales mamíferos, (roedores, caninos, conejos, etc.) son útiles principalmente para el estudio de las propiedades 15 $e la PAP1 y la identificación de compuestos con propósito terapéutico. La modificación del genoma de tal animal transgénico puede resultar de una alteración o una* modificación de uno o varios genes por "activación" o por "inactivación". Esta modificación puede efectuarse con la 0 Syuda de agentes alterantes o mutágenos clásicos o bien por Mutagénesis dirigida. La modificación del genoma puede- igualmente resultar de una inserción de genes o del reemplazo de genes en su (sus) forma silvestre o mutada. Las modificaciones del genoma se efectúan ventajosamente sobre las células de cepas reproductoras y venta osamente sobre los \ C pronúcleos. La transgénesis puede efectuarse por ja croinyección de un cásete de expresión que comprende los genes modificados en los dos pronúcleos fecundados. Así, un animal de acuerdo con la invención puede obtenerse por inyección de un cásete de inyección que comprende un ácido fucleico. De manera preferida, este ácido nucleico es un ADN cfue puede ser un ADN genómico (ADNg) o un ADN complementario (ADNc) . La construcción de animales transgénicos de acuerdo con la invención puede realizarse de acuerdo con las técnlpas clásicas bien conocidas por el experto en la materia. El experto en la materia podrá en particular, referirse a la producción de animales transgénicos, en particular a la producción de ratones transgénicos, tales como las descritas en las Patentes de los Estados Unidos 4,873,191, US 5, 464; 764 y US 5,789,215, el contenido de éstos documentos se incorpora aC[uí como referencia. En resumen, una construcción polinucleótida que comprende un ácido nucleico de acuerdo con la invención se inserta en un linaje de células cepas del tipo ES. La -) inserción de la construcción polinucleotídica se realiza de preferencia por electroporación, tal como se describe por Thomas et al. (1987, Cell, Vol. 51:503-512). Las células que hayan sufrido la etapa de electroporación son a continuación tamizadas por la presencia línea germinal. Los descendientes son probados a continuación con él fin de determinar aquellos que tienen integrada ¡la 'construcción polinucleotídica (del transgen) . Los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención pueden igualmente servir para la realización de oligonucleótidos antisentido o antisentido genéticos útiles como agentes farmacéuticos. Las secuencias antisentido son oligonucleótidos de tamaño pequeño, complementarios de la Hebra que codifica para un gen dado, y por este hecho capaces de hibridarse específicamente con el ARNm transcrito, -inhibiendo su producción en proteína. La invención tiene así por objeto, las secuencias antisentido capaces de inhibir al, menos parcialmente la interacción de las proteínas PAP1 sobré la parkina. Tales secuencias pueden estar constituidas por roda o parte de las secuencias nucleicas definidas anteriormente. Se trata generalmente de secuencias o de fragmentos de secuencias complementarias de las secuencias gue codifican para los péptidos que mteractúan con la , arkma. Tales oligonucleótidos pueden obtenerse por fragmentación, etc., o por síntesis química. Las secuencias reivindicadas pueden utilizarse en el marco de terapias génicas, para la transferencia y expresión m vivo de secuencias antisentido o de péptidos " ;** **; « i 27 Capaces de modular la interacción de la proteína PAP1 con la - v parkina. A este respecto, las secuencias pueden ser incorporadas en vectores virales o no virales, que permitan u administración m vivo (Kahn et al . , 1991). A título tíe -~ 5 vectores virales de acuerdo con la invención, se pueden citar tías particularmente los vectores del tipo adenovirus, retrovirus, virus asociado con el adenovirus (AAV) o virus del herpes. La presente solicitud tiene igualmente por objeto los virus recombinantes defectuosos que comprenden un ácido 10 nucleico que codifica para un polipéptido de acuerdo con la invención, especialmente un polipéptido o péptido que comprende toda o parte de la secuencia SEQ ID NO: 2, o un derivado de ésta, por ejemplo toda o parte de la secuencia SEQ ID NO: 12, 14, 42 ó 44 o de derivados de éstas. 15 La invención permite igualmente la realización de sondas nucleotidicas, sintéticas o no, capaces de hibridarse cOn las secuencias nucleotídicas definidas anteriormente o con su hebra complementaria. Tales sondas pueden utilizarse ín vi tro como herramienta de diagnóstico, para la detección 20 de la expresión o sobreexpresion de la PAP1, o incluso para la puesta en evidencia de anomalías genéticas (mal empalmado, polimorfismo, mutaciones puntuales, etc.). Estas sondas pueden igualmente utilizarse para la puesta en evidencia y el aislamiento de secuencias de acido nucleicos homólogos que 25 codifican para los péptidos tales como los definidos preferencia de células de origen humano. Las sondas de la . ^ 1'~ invención comprenden generalmente al menos 10 bases, y pueden por ejemplo, comprender hasta la totalidad de una de las Secuencias precitadas o de su hebra complementaria. De preferencia, estas sondas son marcadas previamente a su uso. Para esto, diferentes técnicas conocidas por el experto en la Materia pueden emplearse (marcado radioactivo, fluorescente, enzimático, químico, etc.). La invención se relaciona igualmente con cebadores o pares de cebadores que permiten amplificar toda o parte de un ácido nucleico que codifica una PAP1, por ejemplo un cebador de secuencia elegido entre SEQ ID NO: 16-41. La invención tiene por objeto incluso, cualquier composición farmacéutica que comprenda como principio activo ai menos un compuesto tal como el definido anteriormente, especialmente un compuesto peptídíco. Tiene particularmente por objeto cualquier composición farmacéutica que comprenda por objeto cualquier composición farmacéutica que comprenda como principio activo al menos un anticuerpo y/o un fragmento de anticuerpo, tal como el definido anteriormente, así como cualquier composición farmacéutica que comprenda como principio activo al menos un ácido nucleico o un vector tal como el definido anteriormente .

Fi - - 29 Tiene igualmente por objeto cualquier composici?ai '"farmacéutica que comprenda como principio activo una molécula" química capaz de aumentar o disminuir la interacción entre la *, proteína PAP1 y la Parkina. s Además, tiene también por objeto las composiciones farmacéuticas en las cuales los péptidos, anticuerpos, ^moléculas químicas y secuencias nucleotídicas definidas anteriormente, están asociados entre ellos o con otros principios activos. 0 Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la Invención pueden utilizarse para modular la actividad de la proteína Parkina y por este hecho mantener la supervivencia de las neuronas doparminérgicas . Más particularmente, estas Composiciones farmacéuticas están destinadas a modular la 5 interacción entre la proteína PAP1 y Par ina. Se trata de ^nera más preferida de composiciones farmacéuticas destinadas al tratamiento de enfermedades del sistema nervioso central como por ejemplo la enfermedad de Parkmson. La invención tiene también por objeto el uso de 0 moléculas descritas anteriormente para modular la actividad de la Parkina o la tipificación de enfermedades del sistema nervioso central. En particular, la invención se relaciona con el uso de estas moléculas para modular al menos parcialmente la actividad de la Parkina. í ?* La relaciona igualmente con un procedimiento para el tamizado o la caracterización efe moléculas activas sobre la función de la parkina, que comprende la selección de moléculas capaces de unirse a las 5 secuencias SEQ ID NO: 2, o la secuencia SEQ ID NO: 4, o un fragmento (o derivado) de estos. El procedimiento comprende ventajosamente la puesta en contacto, ín vi tro, de la o las moléculas de prueba con un polipéptido que comprende las Secuencias SEQ ID NO: 2, o las secuencias SEQ ID NO: 4, o 10 un fragmento (o derivado) de éstas, y la selección de moléculas capaces de unirse a la secuencia SEQ ID NO: 2 (especialmente la región comprendida entre los residuos 1 y 344) o la secuencia SEQ ID NO: 4. Las moléculas probadas pueden ser de naturaleza variada (peptido, nucleico, lípido, 15 azúcar, etc., o mezclas de tales moléculas, por ejemplo bibliotecas combinatorias, etc.). Como se indica anteriormente, las moléculas así identificadas pueden Utilizarse para modular la actividad de la proteína parkíná, y representan agentes terapéuticos potenciales para el 20 tratamiento de patologías neurodegenerativas. Otras ventajas de la presente invención aparecerán con la lectura de los ejemplos y figuras que siguen, que deben considerarse como ilustrativos y no limitantes. 25 "> ^* ~ ft*>. 31 rt " ' LEYENDAS DE LA FIGURA: Figura 1: Representación del vector pLex9-Parkina (135-290) . Figura 2: Resultados del primer experimento 57- RACE. 8 clonas se obtuvieron. La secuencia electrónica inicial se indica en la parte baja de la Figura. Figura 3: Resultados del segundo experimento 5'- RACE. Solamente dos de las 8 clonas obtenidas en el primer experimento se validan (clonas A12 y D5) . La secuencia 10 electrónica inicial se indica en la parte baja de la Figura, "ha secuencia completa del ADN y las proteínas se proporcionan en las Secuencias 12-15. Figura 4: Detalle de la organización de las clonas C5 y D4 del segundo experimento. La secuencia consenso 15 resultante se indica en lo alto de la Figura. La Figura 5: Estructura de los transcritos aislados partir del cerebro humano. Figura 6: Secuencia nucleica y proteica de LY111 {longitud completa) de cerebro humano. 20 Doble subrayado: cisteínas conservadas del dominio del dedo de zinc. Negrilla: Dominio C21, Itálica: Dominio C22. Figura 7: Secuencia nucleica y proteica de LTlll {versión corta) del cerebro humano. Doble subrayado: cisteínas conservadas del dominio del dedo de zinc. 25 Negrillas: Dominio C21, Itálica: Dominio C22.

Figura 8: Localización de la proteí?a LY111 corta (8b) o larga (8a) después de la expresión en las células Cos- 7. Figura 9: secuencia nucleica y proteica de LYlli (versión larga) de pulmón humano. Figura 10: secuencia nucleica y proteica de LY111 {versión corta) de cerebro humano.

MATERIALES Y TECNCIAS APLICADAS 1) Cepas de levadura La cepa L40 del genero S . cerevisiae (Mata, his3D200, trpl -901 , leu2-3, 112, ade2 , LYS2 : : (lexAop) 4-HIS3 , OBA3 : : (lexAop) s-La cZ, GAL4 , GAL80) se utiliza para verificar las interacciones proteína-proteína cuando una de los compañeros proteicos se fusiona con la proteína LexA. Esta última es capaz de reconocer el elementos de respuesta LexA que controla la expresión de los genes reporteros Lac y His3. Se cultiva sobre los medios de cultivo siguientes: Medio YPD completo: - Extracto de levadura (10 g/1) (Difco) - Bactopeptona (20 g/1) (Difco) - Glucosa (20 g/1) (Merck) Este medio se vuelve sólido por la adición de 20 g/1 de agar (Difco) . aminoácidos) (6.7 g/1) (Difco) - Glucosa (20 g/1) (Merck) Este medio puede volverse sólido por la adición de 20 g/1 de agar (Difco) . Puede igualmente suplementarse con aminoácidos y/o con 3-amino-l, 2, 4-triazol por adición de medios CSM [CSM-Leu, -Trp, -His (620 mg/l), CSM -Trp (740 mg/l) o CSM -Leu, -Trp (640 mg/l) (BiolOl) ] y/o de 3-amino- 1,2,4-triazol 2.5 mM. 10 2) Cepas de bacterias La cepa TG1 de Escherichia coli , del genotipo supE, hsd?5, thi, ?(lac-proAB) , F' [tra D36 pro A+B+ lacIqlacZ?Ml5] , se emplea para la construcción de plásmidos, como medio de amplificación y de aislamiento de plásmidos recombinantes 15 utilizados. Se cultiva sobre el medio siguiente: Medio LB: - NaCl (5 g/1) (Prolabo) - Bactotryptona (10 g/1) (Difco) - Extracto de Levadura (5 g/1) (Difco) Este medio se vuelve sólido por la adición de 15 20 /1 de agar (Difco) . La ampicilina se utiliza a 100 µg/ml, este antibiótico sirve para seleccionar las bacterias que hayan recibido los plásmidos que portan como marcador en gen dß resistencia a este antibiótico. scherichia coll de genotipo "" .*, *" «ÜpE4 , aral4, galK2, lacYl, ? (gpt-proA) 62, rpsL20 {Sttr) , f ?yl-5, mtl-1, recA13, ?(mcrC-mrr), HsdS~(r~m") se emplea como -Síedio de amplificación y aislamiento de plásmídos que provienen del banco de ADNc de lmfocito humano. Se cultivan sobre Medio M9: - Na2HP04 (7 g/1) (Prolabo) - KH2P04 (3 g/1) (Prolabo) - NH4C1 (1 g/1) (Prolabo) - NaCl (0.5 g/1) (Prolabo) - Glucosa (20 g/1) (Sigma) - MgS04 (1 mM) (Prolabo) - Tiamma (0.001%) (Sigma) Este medio se vuelve sólido por la adición de 15 g i de agar (Difco) . La leucma (50 mg/l) (Sigma) y la prolma (50 mg/l) ; (Sigma) , deben agregarse al medio M9 para permitir el crecimiento de la cepa HB101. Al momento de la selección de los plásmidos que proviene del banco de dos híbridos de ADNc de linfocito, la lucma no se agrega al medio puesto que los plásmi'dos aportan un marcador de selección Leu2. 3) Plásmidos El vector pLex9 (pBTMlld) (Bartel et al., 1993| de 5kb homólogo al pGBTIO que contiene un sitio múltipla de- clonación situado corriente abajo de la secuencia que odifica para el represor bacteriano LexA, y corriente arriba de un terminado para formar una proteína de fusión. pLex-HaRas Vall2, plásmido pLex9, tal como el descrito en la solicitud 098/21327, que contiene la secuencia que codifica para la proteína HaRas mutada en la posición Vall2 conocida por interactura con la proteína Raf de mamífero (Vojtek et al., 1993). Este plásmido se utiliza para probar la especificidad de la reacción de la proteína PAP1 en la cepa L40. pLex9-CAPP plásmido pLex9 que contiene ¡ las Secuencia que codifica para el dominio citoplásmido de' la proteína APP conocida por interactuar con el dominio PTB2 de FE65. Este plásmido se utiliza para probar la especificidad de la interacción de la proteína PAP1 en la cepa L40. 4) Oligonucleótidos de síntesis: TTAAGAATTC GGAAGTCCAG CAGGTAG (SEQ ID N° 5) ATTAGGATCC CTACACACAA GGCAGGGAG (SEQ ID N° 6) •», Los oligonucleótidos que permiten obtener el fragmento de PCR correspondiente a la región central de la ^firkina limitada por los sitios EcoRI y BamHI .

* TV. ' (SEQ ID N° 7) GGTC CGGTG TGGCATC (SEQ ID N° 8) CCGCTTGCTT GGAGGAAC (SEQ ID N° 9) CGTATTTCTC CGCCTTGG (SEQ ID N° 10) AATAGCTCGA GTCAGTGCAG GACAAGAG (SEQ ID N° 11) Oligonucleótidos que sirven para secuenciar el inserto correspondiente al gen PAPl. Los oligonucleótidos son sintetizados en un aparato ABI 394-08. Son sacados de la matriz de síntesis por amoniaco y precipitados dos veces con 10 volúmenes de n-butanol después de remontados en agua. La cuantificaron se efectúa midiendo la densidad óptica (ID026o que corresponde a 30 f*g/ml) . 5) Preparación de los ADN plasmídicos La preparación es en pequeñas cantidades y en grandes cantidades de ADN plasmídico se efectúan de acuerdo a los protocolos recomendados por el fabricante Quiagen de los equipos de purificación de ADN: equipo Quiaprep Spin Miniprep, ref: 27106 - equipo Quiaprep Plasmid Maxiprep, ref: 12163. 6) Amplificación enzimática del ADN por PCR (Reacción en Cadena de Polimerasa) : Las reacciones de PCR se efectúan en un volumen final de 100 µl en presencia de la matriz de ADN, de dNTP PCR (Tris-HCl pH 8.5 10 M, WgCl2 1 mM, KCl 5 mM, gelatina 0.01%), de 10-20 picomolee ) cada uno de los oligonucleótidos de 2.5 Ul de Ampli Taq< AJM-Í -polimerasa (Perkin Elmer). La mezcla se recubre con dbs'"< « .5 gotas de aceite de parafina para limitar la evaporación de la üuestra. El aparato utilizado es el "Crocodile II" de 1 , pligen. Se utiliza una temperatura de desnaturalización en la matriz de 94 °C, una temperatura de hibridación de 52 °C y 10 una temperatura de alargamiento por encima de 72 °C. 7) Las ligaduras: Todas las reacciones de ligaduras se efectúan a 37 °C durante una hora en un volumen final de 20µl en presencia de 100 a 200 ng de vector, 0.1 a 0.5 µg de inserto, 15* 40 Ul de enzima T4 ADN ligasa (Biolas) y un amortiguador de ligadura (Tris-HCl 50 mM pH 7.8; MgCl2 10 mM; DTT 10 mM; ATP 1 mM) . El testigo negativo esta constituido por la ligadura del vector en ausencia del inserto. 8) Transformación de las bacterias: .

La transformación de las bacterias por un plásmido se efectúa de acuerdo al protocolo siguiente: lOµl del volumen de ligadura se utiliza para transformar las bacterias TG1 de acuerdo al método de Chung (Chung et al., 1989). ^ de la transformación dß la levadura por el banco de ADNc de linfocito, la levadu a'"*•"-"* Utilizada contiene el plásmido pLex9-Parkina (135-290) quei < Codifica para la parte central de la parkina fusionado a la proteína LexA. Se cultivan 200 ml de medio mínimo YNB suplementado con aminoácidos CSM-Trp a 30°C bajo agitación, hasta una densidad de 107 células/ml. Para efectuar la transformación de las levaduras siguiendo el protocoio anterior, la suspención celular se separa en 10 tubos de 50µl en los cuales 5µg del banco se agregan. El choque térmico se ve claro durante 20 minutos, después las células se recolectan por centrifugación y se resuspenden en 100 ml de medio YPD durante 1 hora a 30 °C y 100 ml de medio YNB ^uplementado con CSM-Leu, -Trp durante 3 horas y media a 30 °C. La eficiencia de la transformación se determina extendiendo diferentes diluciones de células transformadas obre medio YNB sólido suplementado en CSM-Trp, -Leu. Después de un cultivo a 30°C durante 3 días, las colonias obtenidas se cuentan y se determinan la proporción de transformación por µg de ADN del banco de linfocito. los plásmidos ' extraídos de levadura 5 ml de un cultivo de levadura incubado 16 horas a 30°C se centrifugan y se vuelven a tomar en 200µl de un amortiguador de lisado (Sorbitol 1M, KH2P04/K2HP0 0.1M pH 7-4, zimoliasa 12.5 mg/ml) y se incuba 1 hora a 37°C. El lisado se trata a continuación por el protocolo recomendado por el fabricante Quiagen del equipo de purificación de ADN equipo Quieprep Spin Miniprep, ref 27106. 13) Prueba de actividad de la ß^-galactosidasa Una hoja de nitrocelulosa se deposita previamente sobre una caja de Petri que contiene las clonas de levaduras individualizadas. Esta hoja se sumerge a continuación en nitrógeno líquido durante 30 segundos con el fin de reventar las levaduras y liberar así la actividad ß-galactosidasa. después de la descongelación, la hoja de nitrocelulosa se deposita, con las clonas hacia arriba, en otra caja de Petri que contiene un papel Whatman previamente bebido en 1.5 ml de solución PBS (Na2HP04 60 mM, Na2HP04 40 mM, KCl 10 mM, MgS04 1 mM, pH 7) que contiene 15 µl de X-Gal (5-bromo-4-cloro-3- indoil-ß-D-galactosida) con 40 mg/ml de N, N-dimetilformamida. La caja se coloca a continuación en una estufa a 37°C. La ^*v 43 *, Al momento del tamizado es necesario preservar la probabilidad de que cada plásmido independiente del banco de fusión esté presente en al menos una levadura al mismo tiempo1 que el plásmido pLex9. Parkina (135-290). Para preservar esta 5 probabilidad es importante tener una buena eficiencia de transformación de la levadura. Para esto hemos elegido un protocolo de transformación de la levadura que proporciona ß a eficiencia de 2.6 105 células transformadas por lílcrogramo de ADN. Además, como la cotransformación de la 10 levadura por dos plásmidos diferentes reduce esta eficiencia, tiernos preferido utilizar una levadura previamente transformada por el plásmido pLex9-Parkma (135-290) . Esta cepa L40 pLex9-Park?na (135-290) del fenotipo His-, Lys-, leu-, Ade- se transforma con 50 µg de ADN plasmídico del 5 banco de fusión. Esta cantidad de ADN nos permite obtener después de la estimación 1.3 107 células transformadas, lo míe corresponde al número ligeramente superior al número de plásmidos independientes que constituyen el banco. Después de este resultado podemos pensar que la casi totalidad de los 0 plasmidos de banco sirven para transformar las levaduras. La selección de las células transformadas, capaces de reconstituir un transactivador funcional, se hace sobre un medio YNB suplementado con 3-ammo-l, 2, 4-tpazol 2.5 mM y 620 mg/l de CSM (BiolOl) que no contienen histidina de leucina y 5 ds tppitofano. -restricción y separación de los fragmentos de ADN sobre gel * ¡ e agarosa. Entre las 115 clonas analizadas, una clona que , Contiene un plásmido del banco que presenta un perfi 'l -* ",, * diferente de los otros se obtiene. Este plásmido, llamado f- -pGAD-Lylllb, se ha estudiado más precisamente.

EJEMPLO 4: DETERMINACIÓN DE LA SECUENCIA DEL INSERTO CONTENIDO EN EL PLASMIDO IDENTIFICADO. El secuenciamiento del inserto contenido en el plasmido identificado se realiza en un primer tiempo a partir del oligonucleótido SEQ ID N° 7 complementario de la secuencia de GAL4TA en la proximidad del sitio EcoRI de nserción del banco de ADNc de lmfocitos. Después en un s-egundo tiempo, a partir de los oligonucleótidos SEQ ID N° 8 a SEQ ID N° 11, que corresponden a la secuencia del inserto obtenido en el curso del progreso del secuenciamiento. La secuencia obtenida esta presente en la secuencia SEQ ID N° 1. La proteína así identificada se designa PAP1 (Proteína asociada con Parkm 1) . La comparación de la secuencia de este inserto con las secuencias contenidas en los bancos de datos GENBank y EMBL (Laboratorio de Biología Molecular Europeo) a mostrado una homología del 25% a nivel proteico, con diferentes miembros de la familia de Synaptotagmmes . Los * i 48 [ "Sec encias electrónicas se han obtenido así, de 1644 pb y de 3.646 pb respectivamente, que comprenden alargamiento de 330 pb con respecto a la secuencia SEQ ID N° 1. Sin embargo, el Utólisis de estas secuencias han mostrado diferencias en lá región de consenso, aparentes después de la traducción. Asi, un ORF de 420aa se obtiene en el caso, y un ORF de 230aa con Otra secuencia. La secuencia proteica obtenida se compara con las secuencias conocidas, y ha revelado una homología del 24% sobre los 293 aminoácidos que se recubren con la > sinaptogamina humana I (p65) (p21579) . La función de la sinaptogamina I puede ser un papel regulador en las interacciones membranales en el curso del tráfico de las vesículas sinápticas en la zona de la sinapsis. Liga los fosfolípidos ácidos con una cierta especificidad. Además, una interacción dependiente del calcio entre la smaptogamina y los receptores de la proteína cinasa C activada se ha reportado. La sinaptogamina puede igualmente unir otras tres proteínas que son la neurexina, la sintaxina y ap2. Tomando en cuenta la desaparición brutal y precoz de cualquier pomología de las secuencias identificadas y la familia de las sinaptogaminas, es posible que la secuencia identificada presente una supresión con respecto a la secuencia natural. Para verificar esta hipótesis y validar las secuencias, se ha realizado un experimento de RT-PCR y secuenciamiento Utilizando la secuencia de 1644 pb. La secuencia obtenida -comprende un ORF de 420aa que presenta una homología del mismo orden con la smaptogammas . Para intentar obtener una secuencia mas grand , y verificar si la secuencia obtenida puede corresponder a una forma de empalme, se inicia un experimento de alargamiento por 5' -RACE a partir de la región 3' de la secuencia Validada, por medio de los oligos Ll y L2 sobre una preparación de ADNc de pulmón humano. Los resultados obtenidos se presentan en la figura 2, y muestran la identificación de 8 clonas que corresponden a 6 extremos 5' terminales diferentes. Tres de entre ellas, contienen un codon de paro que interrumpe el ORF (clonas A12, F2 , F12) y la clona A3 que no contienen ningún ORF. La presencia de diferentes transcritos se confirma por RT-PCR y RT-PCR empalmada (Tabla 1) .

Tabla 1 •J --A í*- TáÉfal.a 3 (Contin ació'n) Tabla 4 SEQ ID 1Y111_A TCGTAGAGCAGCAGGTCCAAG 14 a 34 46 LY111_U1 AGGGCTGCTGGCTATTTTTC 36 a 55 29 LY111_L4 TAAGAAATGGGTTGTGAAC 148 a : 166 30 1Y111_C AAGCAACAGAATCTCCCATCC 1029 a 1049 31 LY111_B GCATTGTCAAAATTGCCCATC 1147 a 1127 32 LY111_E AGGCGGAGAAATACGAAGAC 1543 a 1562 33 LY111_D GCAGAGTGAGACAGCCCTTAAC 1767 a 1746 34 lylll_L2 CTTCCTCAGGACTGGCGACTTCAG 1811 a 1782 35 lyi??_Li CAAGCGGTCGTTCATTCCAAAGAG 1934 a 1913 36 LY111_F AAGAGGAGATAACCCACCAGAG 2288 a 2269 37 El conjunto de estos resultados permite validar la secuencia consenso que corresponde al isoformo largo (Figura 9, SEQ ID NO: 12 y 13) y al isoformo corto (Figura 10, SEQ ID NO: 14 y 15) de la proteína PAP1 identificada a partir del pulmón humano. Esta proteína está designada igualmente a Continuación en los ejemplos por el término LY111. El 5 Ipor otra parte, se ha descrito que las células C2 de las proteínas de la familia RIM/rabfilína pueden unirse a Ija^s membranas a través de la interacción con los fosfolípidos. La expresión de las proteínas plylllbcompletoA/copf,letoB en las células de la línea cos-7 :colocalización con la Parkina. La secuencia codificante de los transcritos pLylllbcompietoA/compietoB se insertan en el vector de expresión eucariótico pcDNA3 en fase con la secuencia que codifica un epitopo myc N terminal (pcDNA3-mycpLylllbcomp?etoA/B) • Las células de la línea cos-7 transfectadas con ayuda de estos vectores, producen proteínas con un peso molecular aparente de aproximadamente 67 kDa (pcDNA3-mycpLylllbcompietoA) y 60 kDa (pcDNA3-mycpLylllbcompietoB) , que corresponde al peso molecular esperado. Estas proteínas, puestas en evidencia por ínmunomarcado con ayuda de un anticuerpo dirigido contra el epitopo N terminal myc, se distribuyen de manera no homogénea, puntual, en el citoplasma, las prolongaciones y a veces el núcleo de las células de la línea cos-7 (figur '8 , b, columna A) . Cuando son subexpresadas con la Parkína, reveladas con la ayuda del anticuerpo antiParkina Asp5 en las células de la línea cos-7 (figura 8a, b, columna B) , puede observarse una distribución similar y una colocalizacíón de estas proteínas (figura 8a, b, columna C) . _e$ene cause autosomal recessive juvenile parkinaonism. Na"ture. v|92, 605-608. Leroy, E. et al . (1998). The ubiquitin path-way in •"5* "T?arkinson? s disease. Na ture . 395, 451-452. «Lewy, F.H. (1912). in Handbuch der Neurologi-e llewandowski, M. , ed) pp 920 -933, Sppnger, Berlin. », Lucking, C. et aJ. (1998). Homozygous deletions in parkin gene in European and ?orth African families with 10 autosomal recessive juvenile parkinsonism. Lancet . 352, 1355- 1356. Maniatis, T. et 'al . (1989). Molecular cloning, scond edition. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, ?.Y. 15, Morett, E. (1999) . A novel transactivation domain ín parkin. Trends Biochem Sci . 24, 229-231. Peytavi, R. et al . (1999). HEED, the product of the human homolog of the murine eed gene, binds to the matrix protein of HIV-1. J. Biol . Chem . 274, 1635-1645. 20 Polymeropoulos, M.H. et al . (1997) . Mutation in the alpha-synuclein gene ídentified in families with Parkinson' s Cüsease. Science . 276, 2045-2047.

NS LISTADO DE SECUENCIAS <110> AVENTIS PHARMA INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE M 5 <120> COMPOSICIONES CAPACES DE MODULAR LA ACTIVI DAD DE LA PARKINA, SECUENCIAS NUCLEOTI DICAS Y UTILI ZACIÓN <130> PRJ00004 10 <140> <141> <160> 46 15 <170> Patentln Ver. 2. 1 <210> 1 <211> 1313 <212> ADN 20 <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1) . . (1032) 10 ggc aat ttt gac aat geet aat gtc act gga gaa ata gaa ttt gcc att 144 Gly Asn Phe Asp Asn Ala Asn Val Thr Gly Glu He Glu Phe Ala He 192 .240 ¡ , 288 85 90 95 25 ' : ago gtt ect cag agt aat gga gag ctc acá gtc cgg gct aag ctg gtt - 576 Ser Val Pro Gln Ser Asn Gly Glu Leu Thr Val Arg Ala Lys Leu Val 180 185 190 *m* Leu Pro Ser Arg Pro Arg Lys Leu Gln Glu Ala Gl? Glu Gly Thr Asp 195 200 205 FT '* cag cea tea ctt cat ggt caá ctt tgt ttg gta gtg cta ggá gcc aag 672 <31n Pro Ser Leu His Gly Gln Leu Cys Leu Val Val Leu Gly Ala Lys 210 215 220 aat tta cct gtg cgg cea gat ggc acc ttg aac tea ttt gtt aag ggc 720 Asn Leu Pro Val Arg Pro Asp Gly Thr Leu Asn Ser Phe Val Lys Gly 225 230 235 240 tgt ctc act ctg cea gac caá caá aaa ctg aga ctg aag teg cea gtc 768 Cys Leu Thr Leu Pro Asp Gln Gln Lys Leu Arg Leu Lys Ser Pro Val 245 250 255 ctg agg aag cag gct tgc ecc cag tgg aaa cae tea ttt gtc ttc agt 816 Leu Arg Lys Gln Ala Cys Pro Gln Trp Lys His Ser Phe Val Phe Ser 260 265 270 ggc gta acc cea gct cag ctg agg cag teg age ttg gag tta act gtc 864 Gly Val Thr Pro Ala Gln Leu Arg Gln Ser Ser Leu Glu Leu Leu Thr Val 275 280 285 -??'?, W '399 gat cag gcc ctc ttt gga atsg SÍ <¿ac cgc tg Ctt gga gga acc 12. €rp Asp Gln Ala Leu Phe Gly Met Asn Asp Arg Leu Lstu Gly Gly Trp 290 295 300 "* aga ctt ggt tea aag gga gac acá gct gtt ggc ggg gat gcá tgc tea 9€i rg Leu Gly Ser Lys Gly Asp Thr Ala Val Gly Gly Asp Ala Cys Ser 305 310 315 320 cta teg aag ctc cag tgg cag aaa gtc ctt tcc age cc aat cta tgg 1008 10 Efeü Ser Lys Leu Gln Trp Gln Lys Val Leu Ser Ser Pro Asn Leu Trp 325 330 335 ^ca gac atg act ctt gtc ctg cae tgacatgaag gcctcaaggt tccaggttgc 1062 t Ifir Asp Met Thr Leu Val Leu His '* l5 340 agcaggcgtg aggeactgtg cgtetgeaga ggggetaega accaggtgca gggtcccagc Ü2f2 tggagacccc tttgaccttg agcagtctcc atctgcggcc ctgtcccatg gcttaaccgc 1182^ Ctattggtat ctgtgtatat ttacgttaaa cacaattatg ttaectaage ctctggtggg 1242 2 " ttatctcctc tttgagatgt agaaaatggc cagattttaa taaaogttgt taoocatgaa 1302 aaaaaaaaaa a 1313 <210> 2 <211> 344 5 212> PRT <400> 2 (Sin Asn Leu Pro Ser Ser Pro Ala Pro Ser Thr He Phe Ser Gly Gly 10 15 Soe Arg His Gly Ser Leu He Ser He Asp Ser Thr Cys Thr Glu Met 20 25 30 10 Gly Asn Phe Asp Asn Ala Asn Val Thr Gly Glu He Glu Phe Ala He 35 40 45 His Tyr Cys Phe Lys Thr His Ser Leu Glu He Cys He Lys Ala Cys 50 55 60 15 lys Asn Leu Ala Tyr Gly Glu Glu Lys Lys Lys Lys Cys Asn Pro Tyr 65 70 75 80 Val Lys Thr Tyr Leu Leu Pro Asp Arg Ser Ser Gln Gly Lys Arg Lys 20 85 90 95 Tyr Gln Val Gln Arg Asn Thr Val Asp Pro Thr Phe Gln Glu Thr Leu 100 105 110 25 s Leu Thr Leu Pro Asp Gln in Arg leu L^s Sep Pro Val 245 250 255 Leu Arg Lys Gln Ala Cys Pro Gln Trp Lys His Ser Phe Val Phe Ser 260 265 270 Cy Val Thr Pro Ala Gln Leu Arg Gln Ser Ser Leu Glu Leu Thr Val 275 280 285 Trp Asp Gln Ala Leu Phe Gly Met Asn Asp Arg Leu Leu Gly Gly Thr 290 295 300 Arg Leu Gly Ser Lys Gly Asp Thr Ala Val Gly Gly Asp Ala Cys Ser 305 310 315 320 Leu Ser Lys Leu Gln Trp Gln Lys Val Leu Ser Ser Pro Asn Leu Trp 325 330 335 Thr Asp Met Thr Leu Val Leu His 340 <210> 3 <211> 471 <212> ADN J? Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1) (471) <400> 3 gga agt cea gca ggt aga tea ate tac aac age ttt tat gtg tat tgc 48 Gly Ser Pro Ala Gly Arg Ser He Tyr Asn Ser Phe Tyr Val Tyr Cys 10 1 5 10 15 aaa ggc ecc tgt caá aga gtg cag ceg gga aaa ctc agg gta cag tgc 96 Lys Gly Pro Cys Gln Arg Val Gln Pro Gly Lys Leu Arg Val Gln Cys 20 25 30 15l age acc tgc agg cag gca acg ctc acc ttg acc cag ggt cea tet tgc 144 Ser Thr Cys Arg Gln Ala Thr Leu Thr Leu Thr Gln Gly Pro Ser Cys 35 40 45 20 tgg gat gat gtt tta att cea aac cgg atg agt ggt gaa tgc caá tcc 192 Trp Asp Asp Val Leu He Pro Asn Arg Met Ser Gly Glu Cys Sin Ser 50 55 60 Asn SerArg Asn He Thr Cys He Thr Cys Thr Asp Val Arg Ser 100 105 110 *' "* tro Val LeuVal Phe GlnCys Asn Ser Arg His Val He Cys Leu Asp 5 115 120 125 Cys Phe HisLeu Tyr Cys Val Thr Arg Leu Asn Asp Arg Gln Phe Val 130 135 140 10 His Asp ProGln Leu GlyTyr Ser Leu Pro Cys Val 145 150 155 <210> 5 <211> 27 15 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> 223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido 20 <400> 5 ttaagaattc ggaagtccag caggtag 27 <210> 6 25 <211> 29 25 <213> Descripción de la secuencia V»Í <400> 12 §gvttgggg cactgaggga tgccagttct gcctgttcat ctggaacctg gatctaagga 60 ?jggaagaggc gttgcccctg ctggcatagt caggtaccag cccagccagg tattgaaegg Í2Q ?jctgagcttt tcatgatggt tcctgctgac ctggaaacat cttaaatgga agggcgtgag 180 cgcttggtcc atgcagtgaa gctcttccaa cctgggtcaa cgaaaacgga gaagaaatgg 2 Q !?• ccaagaaat agatctgagt gctctcaagg agttagaacg cgaggccatt ctccaggtcc 300 tgtaccgaga ccaggcggtt caaaacacag aggaggagag gacacggaaa ctgaaaacac 360 ticctgcagca tctccggtgg aaaggagcga agaacacgga ctgggagcac aaagagaagt 420 gctgtgcgcg ctgccagcag gtgctggggt tcctgctgca ccggggcgcc gtgtgccggg 480 gctgcagcca ccgcgtgtgt gcccagtgcc gagtgttcct gagggggacc catgcctgga 540 agtgcacggt gtgcttcgag gacaggaatg tcaaaataaa aactggagaa tggttctatg 600 - ggaacgagc caagaaattt ccaactggag gcaaacatga gacagttgga gggcagctct 660 tgcaatctta tcagaagctg agcaaaattt ctgtggttcc tcctactcca cctcctgtca 720 íjcgagagcca gtgcagccgc agtcctggca ggttacagga atttggtcag tttagaggat 780 tt ataagtc cgtggaaaat ttgtttctgt ctcttgctac ccacgtgaaa aagctctcca 840 aatcccagaa tgatatgact tctgagaagc atcttctcgc cacgggcccc aggcagtgtg 900 tgggacagac agagagacgg agccagtctg acactgcggt caacgtcacc accaggaagg 960 ,"gcagtgcacc agatattctg aaacctctca atcaagagga tcccaaatgc tctactaacc 1020 ctattttgaa gcaacagaat ctcccatcca gtccggcacc cagtaccata ttctctggag 1080 gttttagaca cggaagttta attagcattg acagcacctg tacagagatg ggcaattttg 1140 acaatgctaa tgtcactgga gaaatagaat ttgecattea ttattgcttc aaaacccatt 1200 ctttagaaat atgcatcaag geetgtaaga accttgccta tggagaagaa aagaagaaaa 1260 agtgcaatcc gtatgtgaag acctacctgt tgcccgacag atcctcccag ggaaagcgca 1320 agactggagt ccaaaggaac accgtggacc cgacctttca ggagaccttg aagtatcagg 1380 , „• r» «*/# tggcccctgc ccagctggtg acccggcagc tgpaggtctc ggtgtggcat .ctgggcacgc Í4JQ tggcccggag agtgtttctt ggagaagtga tcattcctct ggccacgtgg gactttgaag tSOQ ^cagcacaac acagtccttc cgctggcatc cgctccgggc 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<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Met Ala Gln Glu He Asp Leu Ser Ala Leu Lys GLy Leu Glu Arg Glu 1 5 10 15 Ala He Leu Gln Val Leu Tyr Arg Asp Gln Ala Val Gln Asp Thr Glu 20 25 30 * . * -" élu Glu Arg Thr Arg Lys Leu Lys Thr Mis Leu Gln His Leu Arg Trp 35 40 45 Lys Gly Ala Lys Asn Thr Asp Trp Glu His Lys Glu Lys Cys Cys Ala 50 55 60 Ag Cys Gln Gln Val Leu Gly Phe Leu Leu His Arg Gly Ala Val Cys 65 70 75 80 Arg Gly Cys Ser His Arg Val Cys Ala Gln Cys Arg Val Phe Leu Arg 85 90 95 Gly Thr HisAla Trp Lys Cys Thr Val Cys Phe Glu Asp Arg Asn Val 100 105 110 Lys He Lys Thr Gly Glu Trp Phe Tyr Glu Glu Arg Ala Lys Lys Phe 115 120 125 • * ! * lys' Cys SerThr Asn Pro He Leu Lys Gln Gln Asn Leu Pra Ser Ser 260 265 270 J|ro Ala Pro Ser Thr He Phe Ser Gly GLy Phe Arg His Gly Ser Leu 275 280 285 He Ser He Asp Ser Thr Cys Thr Glu Met Gly Asn Phe Asp Asn Ala 290 295 300 Asn Val Thr Gly Glu He Glu Phe Ala He His Tyr Cys Phe Lys Thr 305 310 315 320 Bis Ser Leu Glu He Cys He Lys Ala Cys Lys Asn Leu Ala Tyr Cys 325 330 335 Glu Glu Lys Lys Lys Lys Cys Asn Pro Tyr Cal Lys Thr Tyr Leu Leu 340 345 350 fro Asp Arg Ser Ser Gln Gly Lys Arg Lys Thr Gly Val Gln Arg Asn 355 360 365 Thr Val Asp Pro Thr Phe Gln Glu Thr Leu Lys Tyr Gln Val Ala Pro 370 375 380 4 % Gln Leu Val Thr Arg Gln Leu Gln Val Set Val Trp HÍS Leu Gly ?85 390 395 400 fhr Leu Ala Arg Arg Val Phe Leu Gly Glu Val He He Pro Leu Ala 405 410 415 "Bir Trp Asp Phe Glu Asp Ser Thr Thr Gln Ser Phe Arg Trp His Pro 420 425 430 Leu Arg Ala Lys Ala Glu Lys Tyr Glu Asp Ser Val Pro Gln Ser Asn 435 440 445 Gly Glu Leu Thr Val Arg Ala Lys Leu Val Leu Pro Ser Arg Pro Arg 450 455 460 ?/ s Leu Gln Glu Ala Gln Glu Gly Thr Asp Gln Pro Ser Leu His Gly 465 470 475 480 Gln Leu Cys Leu Val Val Leu Gly Ala Lys Asn Leu Pro Val Arg Pro 485 490 495 Bp Gly Thr Leu Asn Ser Phe Val Lys Gly Cys Leu Thr Leu Pro Asp 500 505 510 Lys Glß Ma Cys 515 520 525 tro Gln Trp Lys His Ser Phe Val Phe Ser Gly Val Thr Pro Ala Gln § 530 535 540 leu Arg Gln Ser Ser Leu Gu Leu Thr Val Trp Asp Gln Ala Leu Phe 545 550 555 560 10 Gly Met Asn Asp Arg Leu Leu Gly Gly Thr Arg Leu Gly Ser Lys Gly 565 570 575 sp Thr Ala Val Gly Gly Asp Ala Cys Ser Gln Ser Lys Leu Gln Trp 580 585 590 15 Sin Lys Val Leu Ser Ser Pro Asn Leu Trp Thr Asp Met Thr Leu Val 595 600 605 20 Leu His 610 <210> 14 <211> 1648 25 <212> ADN » -t $ sapiens <400> 14 gaaatcatgc ccctcgtaga gcagcaggtc caagcagggc tgctggctat ttttccaaaa 60 5 agtqaggcag tttaaaaaaa aggcggagaa ctagaattat agaataatgg cacattttgt 120 gtatttgtaa aactaacggc ttgcatggtt cacaacccat ttcttatgcc tgtgttttcc 180 ttgqcagcaa aatttctgtg gttcctccta ctccacctcc tgtcagcgag agccagtgca 240 gccgcagtcc tggcaggaag gtcagtgcac cagatattct gaaacctctc aatcaagagg 300 atcccaaatg ctctactaac cctattttga agcaacagaa tctcccatcc agtccggcac 360 0 ccagtaccat attctctgga ggttttagac acggaagttt aattagcatt gacagcacct 420 gtacagagat gggcaatttt gacaatgcta atgtcactgg agaaatagaa tttgccattc 480 attattgctt caaaacccat tctttagaaa tatgcatcaa ggcctgtaag aaccttgcct 540 atggagaaga 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Leu Gly Gly 260 265 270 €hr Arg Leu Gly Ser Lys Gly Asp Thr Ala Val Gly Gly Asp Ala Cys 275 280 285 Ser Gln Ser Lys Leu Gln Trp Gln Lys Val Leu Ser Ser Pro Asn Leu 0 290 295 300 Trp Thr Asp Met Thr Leu Val Leu His 305 310 5 tificial: 20 ificial: <400> 19 ttctgggatt tggagagett tttcac 26 <210> 20 <211> 22 <212> ADN - 213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleotido <400> 20 tctgtctgtc ccacacactg cc 22 <210> 21 <211> 19 «3212> ADN <213> Secuencia artificial ><220> <223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleotido 400> 21 ctggctcc gtctctctg 19 Va" * • m?a> 22 <2ll> 21 <212> ADN -<213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial; oligonucleótido <400> 22 .gcaacaga atctcccatc c 21 <210> 23 <211> 21 212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido ?00> 23 ?attgtcaa aattgcccat c 21 ^10> 26 211> 24 <212> ADN #€213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido <400> 26 cttcctcagg actggcgact tcag 24 <210> 27 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia artificial '<220> <223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido <400> 27 Caagcggtcg ttcattccaa agag 24 " *„ i 5 - ^10> 34 <211> 22 H* <212> ADN <213> Secuencia artificial , ß <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido gcagagtgag acagccctta ac 22 210> 35 <211> 24 <212> ADN < l3> Secuencia artificial <220> 223> Descripción de la secuencia artificial: 20 oligonucleótido <400> 35 Cttcctcagg actggcgact tcag 24 25 'wt210> 36 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido <400> 36 ?aagcggtcg ttcattccaa agag 24 <210> 37 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido <400> 37 aagaggagat aacccaccag ag 22 f Jh* j -^t* - - -V* *523.t» 42 J *y*-* <211> 2347 <212> ADN <213> Homo sapiens 5 <400> 42 ggccttgggg cactgaggga tgccagttct gcctgttcat ctggaacctg gatctaagga 60 gggaagaggc gttgcccctg ctggcatagt caggtaccag cccagccagg tattgaacgg 120 gctgagcttt tcatgatggt tcctgctgac ctggaaacat cttaaatgga agggcgtgag 180 10 cgcttggtcc atgcagtgaa gctcttccaa cctgggtcaa cgaaaacgga gaagaaatgg 240 Cccaagaaat agatctgagt gctctcaagg agttagaacg cgaggccatt ctccaggtcc 300 tgtaccgaga ccaggcggtt caaaacacag aggaggagag gacacggaaa ctgaaaacac 360 acctgcagca tctccggtgg aaaggagcga agaacacgga ctgggagcac aaagagaagt 420 gctgtgcgcg ctgccagcag gtgctggggt tcctgctgca ccggggcgcc gtgtgccggg 480 15 gctgcagcca ccgcgtgtgt gcccagtgcc gagtgttcct gagggggacc catgcctgga 540 agtgcacggt gtgcttcgag gacaggaatg tcaaaataaa aaetggagaa tggttctatg 600 p ggaacgagc caagaaattt ccaactggag gcaaacatga gacagttgga gggcagctct 660t f tgcaatctta tcagaagctg agcaaaattt ctgtggttcc tcctactcca cctcctgtca 720 gcgagagcca gtgcagccgc agtcctggca ggttacagga atttggtcag tttagaggat 780 20 ttaataagtc cgtggaaaat ttgtttctgt ctcttgctac ccacgtgaaa aagctctcca 840 aatcccagaa tgatatgact tctgagaagc atcttctcgc cacgggcccc aggcagtgtg 900 tgggacagac agagagacgg agceagtctg acactgcggt caacgtcacc accaggaagg 960 tcagtgcace agatattctg aaacctctca atcaagagga tcccaaatgc tctactaacc ^20 ctattttgaa gcaacagaat ctcccatcca gtccggcacc cagtaccata ttctctggag 1080 25 gttttagaca cggaagttta attagcattg acagcacctg tacagagatg ggcaattttg 1140 -mcaatgctaa tgtcactgga gafetagaat ttgecattea ttattgcttc aaaacccatt 12FG Ctttagaaat atgcatcaag geetgtaaga accttgccta tggagaagaa aagaagaaaa 126(3 •l te agtgcaatcc gtatgtgaag acctacctgt tgcccgacag atcctcccag' ggaaagcg a; %- l Hgactggagt ccaaaggaac accgtggacc cgacctttca ggagaccttg aagtatcagg¡ 1$§0 5 ggcccctgc ccagctggtg acccggcagc tgcaggtctc ggtgtggcat ctgggcacgc 1440 tggcccggag agtgtttctt ggagaagtga tcattcctct ggccacgtgg gactttgaag 1500 acagcacaac acagtccttc cgctggcatc cgctccgggc caaggcggag aaatacgaag 1560 acagcgttcc tcagagtaat ggagagctca cagtccgggc taagctggtt ctcccttcac 1620 .ggcccagaaa actecaagag gctcaagaag ggacagatca gccatcactt catggtcaac 1680 10 tttgtttggt agtgctagga gccaagaatt tacctgtgcg gccagatggc accttgaact 1740 catttgttaa gggctgtctc actctgccag accaacaaaa actgagactg aagtcgccag 1800 €cctgaggaa gcaggcttgc ccccagtgga aacaetcatt tgtcttcagt ggcgtaaccc 1860 cagctcagct gaggcagtcg agcttggagt taactgtctg ggatcaggcc ctctttggaa 1920 tgaacgaccg cttgcttgga ggaaccagac ttggttcaaa gggagacaca gctgttggcg 198'0 15 gggatgcatg ctcacaatcg aagctccagt ggeagaaagt cctttccagc cccaatctat 2040= ggacagacat gactcttgtc ctgcactgac atgaaggcct caaggttcca ggttgcagca 2100 -^gcgtgaggc actgtgcgtc tgcagagggg ctacgaacca ggtgcagggt cccagctgga 2160 gacccctttg accttgagca gtctccatct gcggccctgt cccatggctt aaccgcctat 2220 tqgtatctgt gtatatttac gttaaacaca attatgttac ctaagcctct ggtgggttat 2280 20 ctcctctttg agatgtagaa aatggccaga ttttaataaa cgttgttacc catgaaaaaa 2340 aaaaaaa 2347 <210> 43 <211> 610 25* <212> PRT ,»¿ *-.

Lys He Lys Thr Gly Glu f Éfee Glu Arg Ala Lys Lys Phe 115 120 125 Pro Thr Gly Gly Lys His Glu Thr Val Gly Gly Gln Leu Leu Gln Ser 5 130 135 140 Tyr Gln Lys Leu Ser Lys He Ser Val Val Pro Pro Thr Pro Pro Pro 145 150 155 160 10 Val Ser Glu Ser Gln Cys Ser Arg Ser Pro Gly Arg Leu Gln Glu Phe 165 170 175 Gly Gln Phe Arg Gly Phe Asn Lys Ser Val Glu Asp Leu Phe Leu Ser 180 185 190 15 Xeu Ala Thr His Val Lys Lys Leu Ser Lys Ser Gln Asn Asp Met Thr 195 200 205 Ser Glu Lys His Leu Leu Ala Thr Gly Pro Arg Gln Cys Val Gly Gln 20 210 215 220 Thr Glu Arg Arg Ser Gln Ser Asp Thr Ala Val Asn Val Thr Thr Arg 225 230 235 240 25 -' - -^ * tys Val Ser Ala Pro Asp le Leu Eys Pro Leu Asn Gln Gio Asp Pro 245 250 255 lys Cys Ser Thr Asn Pro He Leu Lys Gln Gln Asn Leu Pro Ser Ser 260 265 270 -Pro Ala Pro Ser Thr He Phe Ser Gly Gly Phe Arg His Gly Ser Leu 275 280 285 He Ser He Asp Ser Thr Cys Thr Glu Met Gly Asn Phe Asp Asn Ala 290 295 300 Asn Val Thr Gly Glu He Glu Phe Ala He His Tyr Cys Phe Lys Thr 305 310 315 320 fíis Ser Leu Glu He Cys He Lys Ala Cys Lys Asn Leu Ala Tyr Gly 325 330 335 vt31u Glu Lys Lys Lys Lys Cys Asn Pro Tyr Val Lys Thr Tyr Leu Leu 340 345 350 Pro Asp Arg Ser Ser Gln Gly Lys Arg Lys Thr Gly Val Gln Arg Asn 355 360 365 '-¿ . ****• 210> 44 <211> 1648 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 44 gaaatcatgc ccctcgtaga gcagcaggtc caagcagggc tgctggctat ttttccaaaa 60 agtgaggcag tttaaaaaaa aggcggagaa ctagaattat agaataatgg cacattttgt 120 - tatttgtaa aactaacggc ttgcatggtt cacaacccat ttcttatgcc tgtgttttcc 180 ttggcagcaa aatttetgtg gttcctccta ctccacctcc tgtcagcgag agecagtgea 24ft gccgcagtcc tggcaggaag gtcagtgcac cagatattet gaaacctctc aatcaagagg 300 atcccaaatg ctctactaac cctattttga agcaacagaa tctcccatcc agtccggcac 360 c agtaccat attctctgga ggttttagac acggaagttt aattageatt gacagcacct 420 gtacagagat gggcaatttt gacaatgeta atgtcactgg agaaatagaa tttgccattc 480 attattgctt caaaacccat tctttagaaa tatgeatcaa ggcctgtaag aaccttgcct 540 atggagaaga aaagaagaaa aagtgcaatc cgtatgtgaa gacctacctg ttgcccgaca 600 ctcctccca gggaaagcgc aagactggag tccaaaggaa caccgtggac ccgacctttc 660 nggagacctt gaagtatcag gtggcccctg cccagctggt gacccggcag ctgcaggtct 720 ggtgtggca tctgggcacg ctggcccgga gagtgtttct tggagaagtg atcattcctc 780 tggccacgtg ggactttgaa gacageacaa cacagtcctt ccgctggcat ccgctccggg 840 ccaaggcgga gaaatacgaa gacagcgttc ctcagagtaa tggagagctc acagtccggg 900' taagctggt tctcccttca cggcccagaa aactecaaga ggctcaagaa gggacagatc 960 agccatcact tcatggtcaa etttgtttgg tagtgctagg agecaagaat ttacctgtgc 1020 ggccagatgg caccttgaac tcatttgtta agggctgtct cactctgcca gaccaacaaa 1080 tíactgagact gaagtcgcca gtcctgagga agcaggcttg cccccagtgg aaacaetcat 1140 Jftgtcttcag tggcgtaacc ccagctcagc tgaggcagtc gagcttgfc g1 ttaactgtct 1¿00 gggatcaggc ectetttgga atgaacgacc gcttgcttgg aggaaccaga cttggttcaa 1260 agggagacac agetgttggc ggggatgcat gctcacaatc gaagetecag tggeagaaag 1320 tcctttccag ccccaatcta tggacagaca tgactettgt cctgcactga catgaaggcc 1380 tcaaggttcc aggttgcagc aggcgtgagg cactgtgegt ctgcagaggg gctacgaacc 1440 aggtgcaggg tcccagctgg agaccccttt gaccttgagc agtctccatc tgcggccctg 1500 tcccatggct taaccgccta ttggtatetg tgtatattta cgttaaacac aattatgtta 1560 ' cctaagcctc tggtgggtta tctcctcttt gagatgtaga aaatggccag attttaataa 1620 acgttgttac ccatgaaaaa aaaaaaaa 1648 10 <210> 45 <211> 313 <212> PRT <213> Homo sapiens 5 <400> 45 Met Gly Asn Phe Asp Asn Ala Asn Val Thr Gly Glu He Glu Phe Ala 1 5 10 15 0 He His Tyr Cys Phe Lys Thr Mis Ser Leu Glu He Cys He Lys Ala 20 25 30 Cys Lys Asn Leu Ala Tyr Gly Glu Glu Lys Lys Lys Lys Cys Asn Pro 35 40 45 5 Val Sys Thr Tyr Leu Leu Pro Asp Arg Ser Ser Gln Sly Lys Arg «- /& -* 50 55 60 Lys Thr Gly Val Gln Arg Asn Thr Val Asp Pro Thr Phe Gln Glu Thr 65 70 75 80 - M* . i Leu Lys Tyr Gln Val Ala Pro Ala Gln Leu Val Thr Arg Gln Leu Gln 85 90 95 10 Val Ser Val Trp Mis Leu Gly Thr Leu Ala Arg Arg Val Phe Leu Gly 100 105 110 ßu Val He He Pro Leu Ala Thr Trp Asp Phe Glu Asp Ser Thr Thr 115 120 125 15 Gln Ser Phe Arg Trp His Pro Leu Arg Ala Lys Ala Glu Lys Tyr Glu 130 135 140 Asp Ser Val Pro Gln Ser Asn Gly Glu Leu Thr Val Arg Ala Lys Leu 20 145 150 155 160 Vid Leu Pro Ser Arg Pro Arg Lys Leu Gln Glu Ala Gln Glu Gly Thr 165 170 175 *¡to< ' sp Gln Pro Ser Leu Mis «ly Gln Leu Cys Leu Val Val Leu Gly Ala 180 185 190 lys Asn Leu Pro Val Arg Pro Asp Gly Thr Leu Asn Ser Phé Val Lys „,« •5- 195 200 205 Gly Cys Leu Thr Leu Pro Asp Gln Gln Lys Leu Arg Leu Lys Ser Pro 210 215 220 0 il Leu Arg Lys Gln Ala Cys Pro Gln Trp Lys His Ser Phe Val Phe 225 230 235 240 e Gly Val Thr Pro Ala Gln Leu Arg Gln Ser Ser Leu Glu Leu Thr 245 250 255 5 -Vial Trp Asp Gln Ala Leu Phe Gly Met Asn Asp Arg Leu Leu Gly Gly 260 265 270 Thr Arg Leu Gly Ser Lys Gly Asp Thr Ala Val Gly Gly Asp Ala Cys 0 275 280 285 Ser Gln Ser Lys Leu Gln Trp Gln Lys Val Leu Ser Ser Pro Asn Leu 290 295 300 5 , t ? Thr Asp etffFhr Leu Val Leu His 305 310 <210> 46 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido <400> 46 tcgtagagca gcaggtccaa g 21

Claims

61 REIVINDICACÍOífES Habiéndose descrito la invención como antecede, $® '- * reclama como propiedad lo contenido en las sigui#üt?f í *" reivindicaciones. 1. Un compuesto, caracterizado porque es capaz de modular, al menos parcialmente, la interacción entre la p-roteína PAP1 o un homólogo de esta y la Parkina. 2. El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque hace más lenta, inhibe o estimula, al menos parcialmente dicha interacción. ' 3. El compuesto de conformidad con una de las reivindicaciones 1 6 2, caracterizado porque es capaz de unirse al dominio de interacción entre la proteína PAP1 o un homólogo de esta, y la Parkma. 4. El compuesto de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque se trata de un compuesto del tipo peptídico, nucleico, lipídico, sacarídico, * Q de un anticuerpo. 5. El compuesto de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque se trata de un compuesto pepfídico que comprende toda o parte de la secuencia peptídica SEQ ID NO: 2 o uno de sus derivados. ,« ~.3¿ reivindicación 11, caracterizado porque comprende toda o parte de la SEQ ID NO: 1, 12, 14, 42 ó 44, o una secuencia derivada de estas. -{' 5 13. Un ácido nucleico caracterizado porque codifica para un polipéptido de conformidad con la reivindicación 8 u 11. 14. Un ácido nucleico, especialmente una sonda nucleotídica, caracterizado porque es capaz de hibridarse con 10 oi*i ácido nucleico de conformidad con una de las reivindicaciones 11 a 13, o con su hebra complementaria. 15. Un vector, caracterizado porque comprende un «ácido nucleico de conformidad con una de las reivindicaciones 11 a 14. 15 16. Un virus recombmante defectuoso, caracterizado porque comprende un ácido nucleico de conformidad con una de las reivindicaciones 11 a 14. 17. Un ácido nucleico caracterizado porque se elige entre los ácidos nucleicos de la secuencia SEQ ID NO: 2? 16-41, 46. 18. Un anticuerpo o fragmento derivado de anticuerpo, caracterizado porque está dirigido contra un Compuesto peptídico de conformidad con una de las reivindicaciones 4 a 10. i' *-5?-t 64 *** 19. El anticuerpo de conformidad con reivindicación 18, caracterizado porque reconoce un jpolipéptido de conformidad con la reivindicación 9 ó 10. r* t 1 -tf 20. Una composición farmacéutica, caracterízala . "1 jlprque comprende al menos un compuesto de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 10, o un anticuerpo de * C nformid d con la reivindicación 18 ó 19. 21. Un compuesto no peptídico o un compuesto de naturaleza no exclusivamente peptídica, caracterizado porque es susceptible de modular, al menos parcialmente, la interacción de la proteína PAP1 o un homólogo de esta, con la Parkma. 22. El compuesto de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque los motivos activos ele un péptido de conformidad con una de las reivindicaciones 5 a 7, se han duplicado con una estructura no peptídica o de naturaleza no exclusivamente peptídica. 23. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende al menos un ácido nucleico de conformidad con una de las reivindicaciones 11 a 14, o un vector de Conformidad con la reivindicación 15 ó 16. 24. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende un compuesto peptídico de conformidad con una de las reivindicaciones 4 a 10. **«* novedosos y sus usos, especialmente farmacéuticos, en diagnostico o cómo blancos farmacológicos. Más particularmente, la presente invención se relaciona con una ?ueva proteína, llamada PAP1, así como péptidos novedosos y compuestos capaces de modular al menos parcialmente la actividad de la parkina. PA/a/ 2002 \ 98 ^