MXPA02006963A - Nuevos compuestos ciclicos. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a nuevas aerotricinas representadas por la formula (I), (ver formula) en donde Rl, R2 y R3 son como se ha definido en la reivindicacion 1; y las sales farmaceuticamente aceptables de los mismos. La presente invencion se refiere tambien a una composicion farmaceutica que contiene una aerotricina de formula (I) y una carga farmaceuticamente aceptable. Ademas, la presente invencion se refiere al empleo de las aerotricinas para la preparacion de medicamentos, asi como a los procedimientos para la preparacion de las aerotricinas de formula (I).

Description

"NUEVOS COMPUESTOS CÍCLICOS" Campo de la Invención La presente invención se refiere a nuevos compuestos cíclicos que tienen una actividad antifúngica (de aquí en adelante llamadas aerotricinas) , al empleo de las aerotricinas en la terapia médica, a composiciones farmacéuticas que contienen aerotricinas, así como a procedimientos para la preparación de aerotricinas. Antecedentes de la Invención Habitualmente se emplean ampliamente agentes antifúngicos del grupo de los azoles para el tratamiento de las micosis sistémicas. Sin embargo, el empleo profiláctico a largo plazo de antifúngicos azoles da como resultado la aparición de Candida spp. resistentes al azol, debido a su acción fungiestática. Por lo tanto, los agentes fungicidas son particularmente importantes para el tratamiento de las micosis sistémicas graves, especialmente contra la aspergilosis pulmonar. Además, los agentes antifúngicos disponibles corrientemente, no son efectivos contra los Scedosporium spp. el cual es uno de los patógenos emergentes entre los pacientes inmunocomprometidos . La anfotericina B es un agente fungicida altamente efectivo empleado corrientemente clínicamente, pero su índice terapéutico (dosis efectiva frente a dosis tóxica) es más REF. : 139937 bien pequeña. Ciertos compuestos cíclicos tales como el LY303366 (EP 73"6 541), y el F11243 (EP 584 "360) son conocidos por presentar actividad fungicida mediante la inhibición de la ß-l,3-glucan sintasa. Sin embargo, tienen todavía algunos inconvenientes en cuanto al espectro antifúngico y/o el perfil de seguridad. Por este motivo, es necesario urgentemente el desarrollo de nuevos agentes fungicidas con mejor perfil de seguridad y eficacia contra patógenos sistémicos importantes incluyendo el Aspergill us fumigatus y Scedospori um spp. En particular, la presente invención se refiere a nuevas aerotricinas representados por la fórmula (I) , en donde R1 es N- (3-aminopropil) -N- [ (2S) -2, 5-diaminovaleril] amino, N- (3-aminopropil) -N- [-5-amino-2- [N,N-bis (2-amino-etil) amino] valeril] amino, N- (3-aminopropil) -N- [-5-amino-2- [N- (3-amino- propil) amino] valeril] amino, N- (2-aminoetil) -N- [-5-amino-2- [N, N-bis (2-aminoétil) amino] valeril amino u ornitil-ornitilamino; R2 es hidrógeno o metilo; R3 es hidrógeno o hidroxilo; y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Descripción de la Invención La presente invención se refiere también a una composición farmacéutica que contiene una aerotricina de fórmula (I) y un portador farmacéuticamente aceptable. Además, la presente invención se refiere al empleo de las aerotricinas para la preparación de medicamentos, así como a procedimientos para la preparación de las aerotricinas de fórmula (I). Adicionalmente, la presente- invención se refiere a un método para el tratamiento profiláctico y/o terapéutico de enfermedades infecciosas causadas por microorganismos patogénicos . En una modalidad preferida, la presente invención se refiere a las aerotricinas de fórmula (I) en donde R1 es N-(3-aminopropil) -N- [ (2S) -2, 5-diaminovaleril] amino, N- (3-amino-propil) -N- [ (2S) -5-amino-2- [N, -bis (2-aminoetil) amino] aleril] amino, N- (3-aminopropil) -N- [ (2R) -5-amino-2- [N, N-bis (2-amino-etil) amino] valeril] amino, N- (3-aminopropil) -N- [ (2S) -5-amino-2- [N- (3-aminopropil) amino] aleríl] amino, N- (2-amino-etil) -N- [ (2S) -5-amino-2- [N, N-bis (2-aminoetil) amino] -valeril] amino, ó (L) -ornitil- (D) -órnitilamino; R2 es hidrógeno o metilo, de preferencia hidrógeno; R3 es hidrógeno o hidroxilo, de preferencia hidrógeno; y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. En otra modalidad preferida, la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula (I), en donde R1 es N-(3-aminopropil) -N- [ (2S) -2, 5-diaminovaleril] amino, y R2 y R3 son átomos de hidrógeno; a saber, de la fórmula (Illa) y sales farmacéuticamente aceptables del mismo. En otra modalidad preferida, la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula (I) en donde R1 es (L) -ornitil- (D) -ornitilamino, y R2 y R3 son átomos de hidrógeno; a saber, de la fórmula (IVa) y sales farmacéuticamente aceptables del,mismo. En otra modalidad preferida, la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula (I) en donde R1 es N-(3-aminopropil) -N- [ (2S) -5-amino-2- [N, N-bis (2-aminoetil) amino] -valeril] amino, y R2 y R3 son átomos de hidrógeno; a saber, de la fórmula (Va) (Va) y sales farmacéuticamente aceptables del mismo. En otra modalidad preferida," la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula (I), en donde R1 es N-(3-aminopropil) -N- [ (2R) -5-amino-2- [N, N-bis (2-aminoetil) amino] valeril] amino, y R2 y R3 son átomos de hidrógeno; a saber, de la fórmula (Vía) y sales farmacéuticamente aceptables del mismo. En otra modalidad preferida, la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula (I), en donde R1 es N-(3-aminopropil) -N- [2S) -5-amino-2- [N- (3-aminopropil) amino] valeril] amino, y R2 y R3 son átomos de hidrógeno; a saber, de la fórmula (Vlla) y sales farmacéuticamente aceptables del mismo. En otra modalidad preferida,- la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula (I), en donde R1 es N- (2-aminoetil-N- [ (2S) -5-amino-2- [N, N-bis (2-aminoetil) amino] valeril] amino, y R2 y R5 son átomos de hidrógeno; a saber, de la fórmula (Villa) (Villa) y las sales farmacéuticamente aceptables del mismo. Las aerotricinas de acuerdo con la presente invención son aerotricinas ejemplificadas en la siguiente tabla 1. (i) Tabla 1 -NCO-CH- (CH2 ) 3NH2 Aerotricina 137 H. H N [ (CH2) 2NH2] 2 (CH2 ) 2NH2 * configuración (R) ** configuración (S) Las aerotricinas representadas por la fórmula (I) pueden obtenerse a partir de las aerotricinas 1, 2 ó 3 de acuerdo con los métodos descritos en el esquema de reacción 1 y 2, en donde el grupo protector amino Pi y P2 pueden seleccionarse del terc-butoxicarbonilo (Boc) , benciloxicarbonilo (Cbz) , fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) y similares; R2 y R3 son como se ha definido más arriba. Procedimiento A __ Los compuestos de partida, las aerotricinas de fórmula (II) , pueden obtenerse cultivando un microorganismo que pertenece a Deuteromycotina, capaz de producir las aerotricinas 1, 2 y 3 [la aerotricina 3 (= WF11243) está descrita en la referencia del ejemplo 1] en condiciones aeróbicas en un medio acuoso o sólido y aislando las aerotricinas 1, 2 y/o 3 del cultivo. [en donde R2 es hidrógeno o metilo; R3 es hidrógeno o hidroxilo ] Los compuestos de fórmula II pueden convertirse en compuestos. de fórmula I mediante los siguientes procedimientos B ó C: PROCESO B de Reacción 1 (continuaci (Pi Y ?2 son grupos de protección de radicales apuno) Esquema de Reacción 1 Compuesto (X) (Ver Esquema de Reacción 1) n (V, VI): n = 3 (VIII): n = 2 Esquema de Reacción 1 (continuación) Procedimiento C (Pi y P2 son grupos de protección de radicales OV) amino) Esquema de Reacción 2 Los procedimientos A a C pueden ilustrarse con más detalle como sigue: ~ Procedimiento A El microorganismo empleado en la presente invención puede ser cualquier cepa incluyendo los mutantes y variantes pertenecientes a los Deuteromycotina capaces de producir las aerotricinas 1, 2 y 3. Es especialmente preferida la cepa NR 7379 la cual se aisla de las hojas caídas recogidas en Kagoshima pref. en Japón, identificada como una cepa perteneciente a los Deuteromycotina . El cultivo y las características morfológicas de la cepa NR 7379 son como sigue: 1. Características del cultivo Agar de harina de maíz (CMA) : El crecimiento no fue muy extenso: Las colonias alcanzaron 11 mm de diámetro a partir del inoculo (taco de agar de 4.5 mm de diámetro) después de 14 días a 25°C. Eran planas y de color amarillo crema pálido. La cara opuesta era de color amarillo crema pálido. Estaban presentes exudados incoloros y mucilaginosos . Medio de Miura (LCA) : El crecimiento no fue muy extenso. Las colonias alcanzaron 11 mm de diámetro a partir del inoculo después de 14 días a 25°C. Eran planas y de color amarillo crema pálido. La cara opuesta era de color amarillo crema pálido. No habían exudados presentes.

Agar de extracto de malta (MEA) : El crecimiento no fue muy extenso. Las "colonias eran pustuliformes y alcanzaron un diámetro de 18 mm a partir del inoculo después de 14 días a 25°C. El color de las colonias era pardo amarillento claro. La cara opuesta era del mismo color. Los exudados eran incoloros y mucilaginosos. Agar de patata-dextrosa (PDA) : El crecimiento no fue muy extenso. Las colonias eran pustuliformes y alcanzaron 14 mm de diámetro a partir del inoculo después de 14 días a 25°C. El color y la textura de las colonias era similar a los de MEA. Los exudados eran incoloros y mucilaginosos. Se observó una germinación entre 5°C y 30°C con CMA, LCA, MEA y PDA. 2. Características morfológicas Los micelios estaban parcialmente sumergidos, en parte en la superficie, ramificados, formando tabiques y de color pardo a color amarillo crema. Los conidioforos se formaron a partir del micelio sumergido. Eran hialinos, en forma de tabiques, ramificados, irregulares. Habían células conidio-genas sobre evidentes conidioforos o hifas irregulares. Eran enteroblásticos, fialídicos, terminales o subterminales . Las fialidas terminales o subterminales eran de longitud y forma variables. Eran desde cilindricas hasta planas y su longitud y ancho eran desde 5.5 hasta 10 µm y 2.5 a 5.5 µm, respectivamente. A menudo se formaron conidioforos filiformes irregulares con células conidiogenas laterales inmediatamente debajo de tabiques. Los conidios eran mono-celulares, hialinos, lisos, globosos a subglobosos, de 2.0 a 5.5 µm de longitud y 2.0 a 5.0 µm de ancho . Sobre la base de estas inconfundibles características de cultivo y morfológicas, la presente cepa pertenecía a la Deuteromycotina designada como Deuteromicotina NR 7379. La cepa indicada como Deuteromicotina NR 7379 ha sido depositada en el National Institute of Bioscience and Human- Technology ("Instituto Nacional de Biociencia y Tecnología Humana") Agency of Industrial Science and Technology ("Agencia de Ciencia y Tecnología Industrial"), Japón, con el nombre de Nippon Roche K.K., de 6-1, Shiba 2-chome, Minato-ku Tokio, 105 Japón, el 16 de Junio de 1998 bajo el tratado de Budapest, como sigue: Deuteromicotina NR 7379 (FERM BP-6391) . El cultivo de acuerdo con el procedimiento descrito por la presente invención, puede efectuarse en un medio de cultivo que contiene los nutrientes habitualmente empleados en el cultivo de microorganismos. Como fuentes de carbono pueden mencionarse por ejemplo, la glucosa, sacarosa, almidón, glicerina, melazas, dextrina y mezclas de los mismos. Fuentes de nitrógeno son, por ejemplo, harina de soya, harina de semilla de algodón, extracto de carne, peptona, levadura anhidra, extracto de levadura, extracto de germen de maíz, sulfato de amonio, nitrato de sodio y mezclas de los mismos. Además, puede añadirse al medio de cultivo otras substancias orgánicas o inorgánicas para promover el crecimiento de los microorganismos y para el aumento de producción de la aerotricina 1. Ejemplos de las substancias son las sales inorgánicas tales como carbonato de calcio, cloruro de sodio, fosfatos y similares. El cultivo se efectúa en condiciones aeróbicas de preferencia en un medio líquido mediante fermentación sumergida, o en un medio sólido mediante fermentación estática. Una temperatura de 20°C a 30°C con una temperatura óptima de 27°C, es adecuada para el cultivo El cultivo se efectúa de preferencia a un pH de 3 a 9. El tiempo de cultivo depende de las condiciones bajo las cuales se efectúa el cultivo. En general, es suficiente efectuar el cultivo de 20 a 360 horas. Para recoger las deseadas aerotricinas 1, 2 y 3, a partir de los cultivos, pueden emplearse correctamente los métodos de aislamiento que se emplean habitualmente para aislar los metabolitos obtenidos por microbios a partir de sus cultivos. Por ejemplo, la aerotricina 1, la cual es una substancia anfótera extraible con metanol, se recupera ventajosamente mediante los siguientes procedimientos. El cultivó sólido completo obtenido ~ mediante fermentación al estado sólido, se extrae con un disolvente apropiado para recuperar el producto propuesto. Los disolventes que pueden emplearse para extraer el compuesto en cuestión a partir del sólido total cultivado incluyen disolventes orgánicos solubles en agua o una solución hídrica de disolventes orgánicos solubles en agua, tales como el metanol, etanol y alcoholes hídricos. Para la separación de las sales, substancias solubles en agua, etc. a partir de los extractos resultantes se utiliza con ventaja, el reparto entre agua y disolventes orgánicos no miscibles en aguar tales como el n-butanol, acetato de etilo, etc. Para la separación de substancias colorantes, substancia soluble en grasas o similares a partir del extracto, se utiliza con ventaja la purificación mediante el metanol, etanol, una mezcla de acetonitrilo -ácido trifluoroacético acuoso al 0.1%, etc. Para la completa purificación de la aerotricina, es ventajoso el empleo de la cromatografía de columna. Las cargas que pueden emplearse en la cromatografía de columna son tales como YNC-GEL ODS (Yamamura Chemical Laboratories, Japan) ó Preparative C18 (Waters Millipore Corporation) . Como eluyente, se emplea un sistema disolvente que consiste en una mezcla de ácido trifluoroacético acuoso y disolventes orgánicos apropiados solubles en agua, tales como el metanol, etanol, acetonitrilo, etc. La fracción eluída así purificada, la cual contiene cada componente, puede someterse a concentración o liofilización para pulverizar las aerotricinas 1, 2 y 3. Las aerotricinas 1, 2 y 3 fueron aislados como sal del ácido trifluoroacético, pero las aerotricinas 1, 2 y 3 libres pueden prepararse mediante el siguiente ^procedimiento. La sal de las aerotricinas 1, 2 y 3 con el ácido trifluoroacético, se disolvió en agua, a la cual se añadió un equivalente de hidróxido de sodio, y la mezcla se sometió a una cromatografía de columna con Sephadex LH-20, seguida de una elución con un alcohol hídrico tal como el metanol-agua, etc. para obtener las aerotricinas 1, 2 y 3 (forma libre) , respectivamente . Procedimiento B El compuesto de fórmula (III) puede prepararse a partir de las aerotricinas de fórmula (II) [en donde R1 es un grupo amino; R2 y R3 son como se ha definido más arriba] en 4 pasos: (1) N-alquilación con acrilonitrilo, (2) acilación con ornitina N-protegida, (3) eliminación de los grupos de protección de los radicales amino (Pi y P2) , y (4) reducción del grupo ciano.

El compuesto de fórmula (V, VI) puede prepararse a partir de las ae btricínas de fórmula (II) [en donde R1 es un grupo amino; R2 y R3 son como se ha definido más arriba] en 6 pasos: (1) N-alquilación con acrilonitrilo, (2) acilación con ornitina N-protegida, (3) eliminación del radical amino protegida (Pi) , (4) N-alquilación reductora con amino-acetaldehido N-protegido, (5) eliminación del grupo de protección del radical amino (P2) , y (6) reducción del grupo ciano . El compuesto de fórmula (VIII) puede prepararse a partir de las aerotricinas de fórmula (II) [en donde R1 es un grupo amino; R2 y R3 son como se ha definido más arriba] en 6 pasos: (1) N-alquílación reductora con amino-acetaldehido N-protegido, (2) acilación con ornitina N-protegida, (3) eliminación del grupo de protección del radical amino (Pi) , (4) N-alquilación reductora con amino-acetaldehido N-protegido, (5) eliminación del grupo protector del radical amino (Pi) , y (6) reducción del grupo ciano. El 'compuesto de fórmula (VII) puede prepararse a partir de las aerotricinas de fórmula (II) [en donde R1 es un grupo amino; R2 y R3 son como se ha definido más arriba] en 6 pasos: (1) N-alquilación con acrilonitrilo, (2) acilación con ornitina N-protegida, (3) eliminación del grupo de protección del radical amino (Pi) , (4) N-alquilación con acrilonitrilo, (5) eliminación del grupo de protección del radical amino (P2) , y (6) reducción del grupo ciano. Procedimiento C El compuesto de fórmula (IV) puede prepararse a partir de las aerotricinas de fórmula (II) [en donde R1 es un grupo amino; R2 y R3 son como se ha definido más arriba] en 4 pasos: (1) acilación con ornitina N-protegida, (2) eliminación del grupo de protección del radical amino (Pj.) , (3) acilación con ornitina N-protegida, y (4) eliminación del grupo de protección del radical amino (P2) . En los procedimientos anteriores B y C; (a) La N-monoalquilación de un grupo amino puede hacerse empleando el acrilonitrilo de acuerdo con el método descrito en Organic Synthesis ("Síntesis Orgánica") col. vol. III, página 93. (b) N-alquilación del radical amino primario o secundario puede hacerse mediante la alquilación reductora convencional con aminoacetaldehido N-protegido empleando un agente reductor tal como el cianoborohidruro de sodio en presencia o ausencia de un ácido débil tal como el ácido acético. La reacción puede efectuarse a temperatura ambiente en un disolvente tal como el metanol, etanol, ácido acético y similares . (c) La reducción del grupo nitrilo puede llevarse a cabo mediante hidrogenación catalítica o reducción con borohidruro de sodio/cloruro" de cobalto, complejo borano/surlfuro de metilo y similares [ver J. Meed. Chem., 37, 222 (1994)]. (d) La N-acilación de un grupo amino puede hacerse con ornitina N-protegida empleando agentes de condensación tales coma la diciclohexilcarbodiimida, B0P, HBTU, TNTU, PyBroP™, PyBOP™ , TBTU, TSTU, HOBt y similares, o la combinación de dos de ellos. La reacción puede efectuarse en un disolvente tal como el metanol, etanol, piridina, N,N-dimetilformamida, N-metilpirrolidona y similares en presencia o ausencia de una base tal como la trietilanina, di-isopropiletilamina, piridina y similares a una temperatura entre -20°C y +50°C, de preferencia, entre 0°C y +25°C. (e) La eliminación del grupo protector del radical amino puede hacerse mediante un método ya conocido por los expertos en la especialidad, por ejemplo, tratamiento con ácido trifluoroacético para el grupo Boc, o piperidina para el grupo Fmoc. La presente invención se refiere también a las sales de adición acida de las aerotricinas. La sal de adición acida puede obtenerse como sal del ácido trifluoroacético después del curso normal de la separación. La sal así obtenida puede disolverse en agua y pasada a través de una columna de intercambio aniónico que lleva el anión deseado. El eluato que contiene la sal deseada puede ser concentrado para recuperar la sal "co o un producto sólido. Las aerotricinas de fórmula (I) pueden ser convertidos en una sal correspondiente en virtud de la presencia de átomos de nitrógeno terciarios . La sal de adición acida de las aerotricinas de fórmula (I) pueden obtenerse por tratamiento de la base libre de las aerotricinas con por lo menos una cantidad estequiométrica de un ácido apropiado, tal como ácidos minerales, por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico y similares, y ácidos orgánicos, por ejemplo, ácido acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido málico, ácido malónico, ácido succínico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido cinámico, ácido mandélico, ácido metansulfónico, ácido etansulfónico, acida p-toluensulfónico, ácido salicílico y similares. Típicamente, la base libre se disuelve en un disolvente orgánico inerte tal como el etanol, metanol y similares, y el ácido se añade en un disolvente similar. La temperatura se mantiene alrededor de 40°C. La sal resultante precipita espontáneamente o puede extraerse de la solución con un disolvente menos polar. Las sales de adición acida de las aerotricinas de fórmula (I) pueden convertirse en las correspondientes bases libres por tratamiento con por lo menos una cantidad estequiométrica de una base adecuada tal como el hidróxido de sodio o de potasio, carbonato de potasio, bicarbonato de sodio, amoniaco y similares. Las aerotricinas proporcionadas por la presente invención presentan una amplia actividad fungicida contra varios hongos y pueden ser empleados como agentes para el tratamiento y profilaxis de enfermedades infecciosas fúngicas. La actividad antifúngica in vitro e in vivo (ver tablas 2,3-1 y 3-2) así como la toxicidad a los hepatocitos (ver tabla 4) de las aerotricinas representativas de fórmula (I) se comprueba como sigue: 1. Actividades antifúngicas in vitro Las actividades antifúngicas in vitro de las aerotricinas representativas, del presente estudio, se evaluó determinando la concentración inhibitoria del 80% (IC8o) , la cual se calculó como la concentración más baja de un antifúngico para inhibir el crecimiento de hongos hasta un 20% de turbidez comparada con el crecimiento del control exento de fármaco, espectrofotométricamente. Los valores de IC8o se determinaron mediante el procedimiento de microdilución del caldo, basado sobre el í NCCLS Approved Standard ("Estándar aprobado por la NCCLS) con las siguientes pequeñas modificaciones ("Comité Nacional para Estándares Clínicos de Laboratorio") (1997) . Un método de referencia para el ensayo de la susceptibilidad antifúngica por dilución del caldo, para levaduras. Estándar aprobado. Documento M27-A") . Se empleó el "Yeast Nitrogen Base" ("Base de nitrógeno para levaduras") (YNB; Difco Lab.) suplementado con 1% de glucosa y 0.25% de K2HP04, como medio de ensayo para levaduras, y el mismo medio solidificado con 0.2% de agarosa de bajo punto de fusión (BRL) , se empleó para los hongos filamentosos. El tamaño del inoculo fue de 1-3 x 103 células/ml, y la incubación se efectuó durante 1-2 días a 35°C. Tabla 2: Actividad antifúngica in vitro, IC8o (µg/ml) Candida albicans Aspergillus fúmigatus Scedosporium CY1002 CF1003 apiospermum CF1077 Aerotricina 132 0.28 2.9 0.38 Aerotricina 134 0.37 0.58 0.37 Aerotricina 135 0.41 0.37 0.35 Aerotricina 136 0.33 0.38 0.34 2. Eficacia antifúngica in vivo 2-1: Candidiasis sistémica en ratones. La eficacia antifúngica in vivo de las aerotricinas de la presente invención contra la candidiasis sistémica, se muestra en la siguiente tabla 3-1. Se emplearon ratones de una cepa de ratón inmunocompetente convencional,' Crj:CD-l (ICR) , para modelos de una infección experimental de candidiasis sistémica. Se emplearon ratones Crj:CD-l (ICR) de 4 semanas de edad, para la candidiasis sistémica mediante la inyección de Candida albicans 5x1O6 conidios/ratón en la vena caudal. Los compuestos de ensayo se administraron por vía intravenosa (i.v.), en una sola vez, inmediatamente después de la infección para la candidiasis sistémica. El día 7, se calcularon, para cada dosis, los valores del 50% de la dosis efectiva (ED50) , a partir del número de supervivientes. Tabla 3-1: Actividad antifúngica in vivo, contra la candidiasis sistémica en ratones, ED50 (mg/kg) el día 7 Aerotricina 132 0.43 Aerotricina 133 0.35 Aerotricina 135 0.35 2-2: Aspergillosis pulmonar en ratones La eficacia antifúngica in vivo de las aerotricinas de la presente invención contra la aspergillosis pulmonar, se muestra en la siguiente tabla 3-2. La aspergillosis pulmonar en ratones fue creada en ratones macho ICR tratados con cortisona (250 mg/kg, tratamiento subcutáneo en dos veces, en los 3 días antes y el mismo día de la infección) . Se infectaron conidios de A. fumigatus (2.5 x 105) intratraquealmenife en estos ratones, y los tratamientos se efectuaron una vez diariamente durante 4 días . La eficacia de cada fármaco se determinó por el número de supervivientes, y se calculó el 50% de la dosis efectiva (ED50) a partir del número de supervivientes en cada dosis a los 14 días. Tabla 3-2: Actividad antifúngica in vivo contra la aspergillosis pulmonar en ratones, ED50 (mg/kg) el día 14 Aerotricina 132 5.2 Aerotricina 134 5.8 Aerotricina 137 5.2 Acrotricina 3 > 15 3. Ensayo de hepatotoxicidad in vitro Se aislaron hepatocitos de ratón mediante digestión con colagenasa y se cultivaron en placas de microtitulación. Las monocapas de hepatocitos se expusieron al ensayo con aerotricinas en el sistema de cultivo durante 1 día. Después del período de cultivo, los hepatocitos fueron observados con un microscopio y evaluados morfológicamente. El grado de alteración morfológica (degeneración) de los hepatocitos en el ensayo de aerotricinas se comparó con WF11243 y LY303366.

Tabla 4: Citotoxicidad para los hepatocitos (µg/ml) Aerotricina 132 ~>100 Aerotricina 134 >100 Aerotricina 135 >100 WF11243 100 (=Aerotricina 3] LY303366 10 mg/kg y 30 mg/kg de administración de aerotricina 132 (una vez al día: i.v.) a ratones durante 2 semanas no mostraron ninguna toxicidad grave. Por lo tanto, las nuevas aerotricinas de fórmula (I) así como las sales farmacéuticamente aceptables de las mismas tienen una potente actividad antifúngica contra varias infecciones fúngicas, incluyendo la Aspergillosis, en ratones en un amplio margen de dosificaciones y son útiles como agentes antifúngicos . Además, las aerotricinas proporcionadas por esta invención son mucho menos citotóxicas para los hepatocitos que los conocidos derivados peptídicos cíclicos (WF11243 y LY303366) . Las aerotricinas de la presente invención pueden también ser útiles para la inhibición o alivio de las infecciones por Pneumocistis carinii en pacientes inmunscomprometidos .

La presente invención se refiere además a las composiciones farmacéuticas que contienen las nuevas aerotricinas de fórmula (I) así como sales farmacéuticamente aceptables de las mismas. Las nuevas aerotricinas de fórmula (I) así como sus sales farmacéuticamente aceptables de las mismas son agentes activos altamente fungicidas. Son activos contra una gran variedad de especies fúngicas incluyendo Candida spp., AspergilZL us spp. , Scedosporium ssp. , Mucor ssp. , y Absidia spp. . Así, las aerotricinas de la presente invención son útiles para tratamiento tópico y sistémico de micosis en animales así como en humanos. Por ejemplo, son de utilidad en el tratamiento tópico y mucósico de infecciones fúngicas causadas por Candida spp. , Trichophyton spp. , y Mi crosporum spp. . Pueden emplearse también en el tratamiento de infecciones fúngicas sistémicas causadas por ejemplo, por Candida ssp. , Aspergillus spp. , ó Scedospori um spp. Para el empleo clínico, las nuevas aerotricinas de fórmula (I) así como las sales farmacéuticamente aceptables de las mismas pueden ser administrados solas, aunque generalmente serán administrados en una mezcla farmacéutica formulada como apropiada para el uso particular y propósito deseado, mezclando el excipiente, agente aglomerante, lubricante, agente desintegrante, material de recubrimiento, emulsionante, agente para la" suspensión, "disolvente, estabilizante, potenciador de la absorción y/o base para ungüentos. La mezcla puede emplearse para administración oral, inyectable, nasal, rectal o tópica. Las formulaciones farmacéuticas de las aerotricinas para administración oral, pueden ser granulos, comprimido, comprimido con recubrimiento de azúcar, cápsula, pildora, suspensión o emulsión. Para la inyección parenteral, por ejemplo, intravenosa, intramuscular o subcutánea, las aerotricinas de fórmula (I) pueden emplearse en forma de una solución acuosa estéril la cual puede contener otras substancias, por ejemplo, sales o glucosa para hacer la solución isotónica. Estas composiciones pueden ser presentadas también en una forma de dosificación unitaria en ampollas o en envases multidosis, de preferencia con conservantes añadidos. Alternativamente, los ingredientes activos pueden ser en forma de polvo para ser reconstituidos con un vehículo adecuado antes de la administración. Las aerotricinas pueden ser administrados también en forma de un supositorio o pesario, o pueden ser aplicados tópicamente en forma de una loción, solución, crema, ungüento o polvo fino.

El nivel de dosificación diario de las aerotricinas de fórmula (I) es de 0.1 a 50 mg/kg (en dosis divididas) cuando son administrados tanto por una ruta oral como por una ruta parenteral. Así, "los comprimidos y cápsulas de aerotricinas pueden contener apropiadamente de 5 mg a 0.5 g de compuesto activo para la administración de uno solo, o dos o más a la vez. En cualquier caso, la dosificación real puede determinarse por el médico y puede variarse según la edad, peso y respuesta del paciente particular. Cuando las aerotricinas son para empleo antifúngico, puede emplearse cualquier método de administración. Para el tratamiento de infecciones micóticas, se emplea habitualmente la administración oral o intravenosa. Cuando las aerotricinas son para emplear para el control de infecciones pneumocísticas, es deseable tratar directamente el pulmón y los bronquios. Por esta razón, se prefieren los métodos de inhalación. Para la administración mediante inhalaciones o por vía nasal, las aerotricinas de la presente invención se suministran convenientemente en forma de una presentación de spray aerosol a partir de recipientes presurizados o nebulizadores. El sistema de suministro preferido para la inhalación o vía nasal es un aerosol para inhalación de dosis medida, la cual puede formularse como un polvo, suspensión o solución de un compuesto de fórmula (I) en propelentes adecuados tales como los fluorocarbonos o hidrocarburos .

Aunque las aerotricinas de la presente invención pueden ser empleadas como comprimidos cápsulas, composiciones tópicas, polvos para insuflación, supositorios y similares, la solubilidad de las aerotricinas de la presente invención en el agua y medios acuosos los convierten en adaptables para el empleo en formulaciones inyectables y también en composiciones liquidas adecuadas para sprays de aerosol. Los siguientes ejemplos ilustran los métodos preferidos para la preparación de las aerotricinas de la presente invención, las cuales no se pretende que limiten el ámbito de la invención a las mismas. En los siguientes ejemplos, los productos se analizaron y purificaron mediante CLAR empleando una columna de fase invertida seleccionada de las que figuran en la relación de más adelante. El disolvente mezclado consistió en ácido trifluoroacético 0.05% - agua: ácido trifluoroacético 0.05% -acetonitrilo, con la proporción adecuada descrita en cada ejemplo de trabajo.

Columnas de CLAR: Columna A CAPCELL PAK C18, UG-120, 4.6 x 250 mm Columna B CAPCELL PAK C18, UG-120, 10 x 250 mm Columna C CAPCELL PAK C18, UG-80, 20 x 250 mm Columna D; CAPCELL PAK C18, 50-120, 4.6 x 250 mm Columna E : CAPCELL PAK C18, 50-120, 10 x 250 mm Columna F: TSK GEL ODS-SOTs, 20 x 250 mm ~ En los siguientes ejemplos de trabajo, las aerotricinas se obtuvieron como sales de ácido tricloroacético, a no ser que se indique otra cosa. Ejemplo de referencia 1 Preparación de las aerotricinas 1, 2 y 3 a) Fermentación sólida Una porción de 0.1 mi del cultivo congelado de Deuteromycotina NR 7379 (FERM BP-6391) en 10% (v/v) de solución de glicerina se descongeló e inoculó en un matraz Erlenmeyer de 500 mi que contenía 100 mi de un medio consistente en glucosa 2%, almidón de "patata 1%, glicerina 1.5%, Toast soya 1% (Nissin Seiyu) , 0.35% de extracto de levadura (Nippon Seiyaku) , 0.25% de Polypepton (Nihon Seiyaku) , 0.3% de NaCl, 0.5% de CaC03, 0.005% de ZnSO4.7H20, 0.0005% de CuS0 .5H20, y 0.0005% de MnSO4.4H20. El pH del medio no se ajustó. El cultivo sembrado se incubó en un agitador rotativo a 27°C durante 7 días a 220 rpm. 2 mi de cultivo sembrado se transfirió a un matraz Erlenmeyer de 3 litros que contenía un medio sólido consistente en 200 g de cebada prensada, 0.12 g de extracto de levadura (Difco), 0.06 g de tartrato de sodio, 0.06 g de KH2P04 y 120 mi de agua. La fermentación se efectuó a 27°C en condición estática. La producción alcanzó un máximo a alrededor de las 240 horas de fermentación y el cultivo se sometió al procedimiento de aislamiento de las aerotricinas 1, 2 y 3. Al sólido cultivado (10 kg) obtenido, se le añadió metanol (40 litros) y la mezcla se agitó eliminándose a continuación por filtración para obtener el extracto de métanol (39 litros) . El extracto de metanol así obtenido se concentró hasta sequedad a presión reducida, y el residuo (64.8 g) se añadió a acetato de etilo (1 litro) y agua (1 litro) . Y la mezcla se agitó, seguido por la eliminación de la capa de acetato de etilo. Además, la capa acuosa se lavó igualmente con acetato de etilo (1 litro) dos veces. La capa acuosa restante se extrajo con n-butanol (1 litro) tres veces: Los extractos así obtenidos se combinaron y concentraron a sequedad a presión reducida, y el residuo (28.5 g) se disolvió en una mezcla (250 mi) de acetonitrilo - ácido trifluoroacético acuoso 0.1% (1:1). Después de eliminar los materiales insolubles por centrifugación, la solución así obtenida se evaporó hasta sequedad a presión reducida y el residuo se añadió a metanol (300 mi) y la mezcla se agitó, seguido de la eliminación por filtración para obtener la solución en metanol (280 mi) . Los materiales solubles en metanol (9.3 g) así obtenidos fueron sometidos a continuación a una cromatografía de columna sobre silica gel de fase invertida C18~ (1 litro) . La columna se eluyó en etapas empleando una mezcla de metanol - ácido trifluoroacético acuoso 0.1% (2:8, 4:6, 5:5, 6:4, 7:3, y 8:2) . Las aerotricinas 1, 2 y 3 eluidos en esta orden con metanol - ácido trifluoroacético acuoso 0.1% (7:3) se concentraron a sequedad al vacío para obtener un polvo blanco de la sal del ácido trifluoroacético de la aerotricina 3 (731 mg) y la sal del ácido trifluoroacético de la aerotricina 1 (747 mg) , respectivamente. Las fracciones que contenían la aerotricina 2 se concentraron a presión reducida y a continuación se purificaron por CLAR bajo las siguientes condiciones: columna: Capcall Pak C18 (d.i. 30 x 250 mm, Shiseido Co . , LTD.); fase móvil: acetonitrilo ácido trifluoroacético acuoso 0.1% (45:55); velocidad de flujo: 40 ml/minuto; detección: UV 220 nm. Los eluatos apropiados obtenidos en las condiciones antes mencionadas, se concentraron a sequedad al vacío para obtener un polvo blanco de la sal del ácido trifluoroacético . y la aerotricina 2 (42 mg) . b) Fermentación en matraz Una porción de 2 mi del cultivo congelado del Deuteromicotina NR 7379 (FERM BP-6391) en solución al 10% (v/v) con glicerina, se descongeló e inoculó en un matraz Erlenmeyer de 500 mi que contenía 100 mi de un medio consistente en 1% de glucosa, 1% de harina de avena, % de pasta de tomate, 0.5% de extracto de germen de trigo (Ando kasei) , 0.001% de FeSO4.7H20, 0.001% de MnSO4.4H20, 0.0001% de CaCl2/ 0.0002% de ZnS04.7H20, 0.00002% de (NH4) 6Mo02.4H20, y 0.00006% de H3BO3. El pH del medio se ajustó a 6.8 antes de la esterilización. El cultivo sembrado se incubó en un agitador rotativo a 27°C durante 3 días a 220 rpm. 2 mi del primer cultivo sembrado se transfirió a matraces Erlenmeyer de 500 mi conteniendo 100 mi del mismo medio y se incubaron en un agitador rotativo en las mismas condiciones durante 3 días. 2 mi del segundo cultivo sembrado se inoculó en matraces Erlenmeyer de 500 mi que contenían 100 mi de un medio consistente en 8.5% de glicerina, 1% de pectina de citrus, 0.4% de polvo de cacahuete, 0.4% de caseína de leche exenta de vitaminas, 0.4% de pasta de tomate, 0.4% de extracto de germen de trigo (Ando kasei), 0.2% de glicina, y 0.2% de KH2P04. El pH del medio se ajustó a 7.0 antes de la esterilización. La fermentación se efectuó a 27°C con agitación a 220 rpm. Después de 10 días de cultivo, la producción alcanzó un máximo y todo el cultivo se sometió al procedimiento de aislamiento de las aerotricinas 1, 2 y 3. c) Fermentación en tinajas Una porción de 2 mi de cultivo congelado de Deuteromy- cotina NR 7379 (FERM BP-6391) en solución al 10% de glicerina (v/v) se descongeló y se inoculó "en un matraz Erlenmeyer de 500 mi que contenía 100 mi del mismo medio de siembra como el descrito más arriba. El matraz se sacudió a 220 rpm durante 3 días a 27°C. 2 mi del primer cultivo sembrado se transfirió en matraces Erlenmeyer de 500 mi que contenían 100 mi del mismo medio de siembra y se incubó en un agitador rotativo en las mismas condiciones durante 3 días. Seiscientos mi del segundo cultivo de siembra se inocularon en una tinaja de fermentación de 50 litros que contenía 30 litros del mismo medio de producción como se ha descrito más arriba y 0.4% de disfoam (Nissan Disfoam CA-123) . La fermentación se efectuó a 27°C, con una aireación de 30 litros/minuto y una agitación de 400 rpm. La producción alcanzó un máximo alrededor de las 168 horas de fermentación, y todo el cultivo se sometió al procedimiento de aislamiento de las aerotricinas 1, 2 y 3. Aerotricina 1 1) Aspecto: Sólido blanco 2 ) Peso molecular (método FAB-MS ] m/z 1547 (M+H) + 3 ) Fórmula molecular : C72H118N14 O23 4) Espectroscopia de masas de alta resolución (para M+H") + : Encontrado: 1547.8568 Calculado para C72H?19N14023: 1547.8572 5) Espectro UV (fig. 1) : en metanol: ?(e)máx(en MeOH) : 225+5 (10600 sh) , 270+5 (2000), 278+5 (2100) ?(e)max (en NaOH N/10-MeOH) 240+5 (7700), 268+5 (1800), 298+5 (1800) 6) Espectro IR (KBr) (Fig. 2) : Los números de onda (cirf1) de la absorción principal son como sigue: 3379, 2927, 2855, 1740, 1660, 1535, 1453, 1203, 1139, 837 7) Espectro 1H-BMN (fig. 3) : 400 MHz, en CD3OD 8) Espectro 13C-RMN (Fig. 4) : 100 MHz, en CD3OD 9) Solubilidad: Soluble: agua, metanol, sulfóxido de dimetilo 10) Reacción coloreada: Positivo: ninhidrina, anisaldehído-ácido sulfúrico, vapores de yodo, vainillina-ácido sulfúrico, reactivo de Rydon-Smith, ácido molibdofosfórico Negativo: reactivo de Sakaguchi, verde de bromo cresol, 2, 4-dinitrofenilhidrazlna-ácido sulfúrico 11) Cromatografía en capa fina (CCI) : Soporte Disolvente Rf Silicagel F254 n-BuOH: acetona :AcOH:H20 0.74 (4:5:1:1) MeOH:H20 (95:5) 0.12 *1 E. Merck AG., Alemania 12) Cromatografía líquida de alta resolución: Soporte: Capcell Pak C18 gel S120A, 4.6x250mm (fabricada por Shiseido, Co . , LTD) Fase móvil: acetonitrilo: ácido trifluoroacético acuoso 0.05% Velocidad de flujo: 1 ml/minuto Rt = 12.1 ± 0.5 13) Análisis de aminoácidos: Se calentó la aerotricina 1 a 120°C en HCl 6N durante 24 horas, y a continuación se sometió al análisis de aminoácidos para detectar la treonina, 3 unidades de allo-treonina, glicina, alanina, valina, tirosina, ornitina, 3-hidroxiprolina, 4-hidroxiprolina, 3-hidroxiglutamina. Aerotricina 2 1) Aspecto: Sólido blanco 2) Peso molecular (método FAB-MS) : m/z 1549 "(M+H)'1' 3) Fórmula molecular: 4) Espectroscopia de masas de alta resolución (para M+H)+: Encontrado: 1549.8384 Calculado para C7iH??7Ni4?24: 1549.8365 5) Espectro UV (fig. 5) : en metanol: ?(e)max(en MeOH) : 225+5 (10200 sh) , 275±5 (1900), '278+5 (2000) ?(e)max(en NaOH N/10-MeOH) : 240±5 (7700), 293+5 0) 6) Espectro IR (KBr) (fig. 6) : Los números de onda (cpf1) de la absorción principal son como sigue: 3323, 2928, 2856, 1740, 1670, 1531, 1450, 1203, 1137, 837 7 ) Espectro ^-RMN ( fig . 7 ) : 400 MHz, en CD3OD 8 ) Espectro 13C-RMN ( fig . 8 ) : 100 MHz, en CD30D 9) Solubilidad: Soluble: agua, metanol, sulfóxido de dimetilo ) Reacción coloreada: Positivo": ninhidrina, anisaldehido-ácido" sulfúrico, vapores de yodo, vainillina-ácido sulfúrico, reactivo de Rydon-Smith, ácido molibdofosfórico. Negativo: reactivo de Sakaguchi, verde de bromo-cresol, 2, 4-dinitrofenilhidrazina-ácido sulfúrico 11) Cromatografía en capa fina (CCI) : Soporte Disolvente Rf Silicagel F254 n-BUOH: acetona :AcOH:H20 0.29 ' (4:5:1:1) MeOH:H20 (95:5) 0.15 *1 E. Merck AG., Alemania 12) Cromatografía liquida de alta resolución: Soporte: Capcell Pak C18 gel S120A, 4.6 x 250mm (fabricada por Shiseido, Co . , LTD) Fase móvil: acetonitrilo: ácido trifluoroacético acuoso 0.05% = 1:1 Velocidad de flujo: 1 ml/minuto Rt = 9.9 ± 0.5 13) Análisis de aminoácidos: Se calentó la aerotricina 2 a 120°C en HCl 6N durante 24 horas, y a continuación se sometió al análisis de aminoácidos para detectar la treonina, 3 unidades de allo-treonina, glicina, alanina, valina, 3-hidroxitirosml (DOPA) , ornitina, 3-hidroxiprolina, 4-hidroxiprolina, 3-hidroxi-glutamina. & Aerotricina 3 1) Aspecto: Sólido blanco 2) Peso molecular (método FAB-MS) : m/Z 1533 (M+H)+ 3) Fórmula molecular: CllHn6 i4 ?23 4) Espectro UV: en metanol: ?(e)max (en MeOH) : 225±5 (11000 sh) , 275±5 (2000), 280+5 (1900) ?(e)max (en NaOH N/10-MeOH) : 243±5 (7800), 295±5 (1800) 5) Espectro IR (KBr) : Los números de onda (cm"1) de la absorción principal son como sigue: 3334, 2928, 2852, 1742, 1662, 1520, 1449, 1202, 1136, 836 6) Solubilidad: Soluble: agua, metanol, sulfóxido de dimetilo 7) Reacción coloreada: Positivo: ninhidrina, anisaldehido-ácido sulfúrico, vapores de yodo, vainillina-ácido sulfúrico, reactivo de Rydon-Smith, ácido molibdofosfórico Negativo:" reactivo de Sakáguchi, verde de bromo- cresol, 2, 4-dinitrofenilhidrazina-ácido sulfúrico 8) Cromatografía en capa fina (CCI) Soporte Disolvente Rf Silicagel F254*1 n-BuOH: acetona :AcOH:H20 0.26 (4:5:1:1) MeOH:H20 (95:5) 0.09 *1 E. Merck AG., Alemania 9) Cromatografía líquida de alta resolución: 'Soporte: Capcell Pak C18 gel S120A, 4.6x250 mm (fabricada por Shiseido, Co., LTD) Fase móvil: acetonitrilo: ácido trifluoroacético acuoso 0.05% = 1:1 Velocidad de flujo: 1 ml/minuto ' Rt = 9.1 + 0.5 10) Análisis de aminoácidos: Se calentó la aerotricina 3 a 120°C en HCl 6N durante 24 horas, y a continuación se sometió al análisis de aminoácidos para detectar la treonina, 3 unidades de allo-treonina, glicina, alanina, valina, tirosina, ornitina; 3-hidroxiprolina, 4-hidroxiprolina, 3-hidroxiglutamina.

Ejemplo 1 Preparación "de la aerotricina" 132 (a) A una mezcla de aerotricina 3 (500 mg, 0.326 mmoles) y trietilamina (628 µl, 4.89 mmoles) en MeOH (10 mi), se añadió acrilonitrilo (214 µl, 3.27 inmoles) a temperatura ambiente. La mezcla se agitó durante 20 horas a temperatura ambiente. Después de evaporar el disolvente al vacío, se disolvió el residuo en n-butanol y se lavó con ácido clorhídrico diluido y agua sucesivamente. La capa orgánica se evaporó al vacío. El residuo crudo se purificó mediante CLAR invertida preparativa, y las condiciones detalladas de la misma se muestran más adelante. Las fracciones apropiadas se juntaron, se congelaron y liofilizaron obteniéndose 207 mg de aerotricina 120 (compuesto de fórmula (I) en donde R2 y R3 son hidrógeno y R es (2-cianoetil) -amino) en forma de un sólido amorfo incoloro. CLAR (T.r.) 27.5 minutos (columna F velocidad de flujo: 10 ml/mm, eluyente: ácido trifluoroacético 0.05%: ácido trifluoroacético 0.05% - acetonitrilo = 5a.47); FAB-MS (m/z) : 1586 [M+H] + . (b) A una solución agitada de Boc-L-Orn (Boc) -OH (46 mg, 0.138 mmoles) en DMF (2 mi) se añadió reactivo BOP (62 mg, 0.14 mmoles), HOBT hidrato (22 mg, 0.144 mmoles) y N-etildiisopropila ina (24 µl, 0.138 mmoles). Después de agitar durante 2 horas a temperatura ambiente, se añadió una solución de aerótricina 120 (100 mg, 0.063 mmoles) y N-etildiisopropilamina (24 µl, 0.138 mmoles) en DMF (2 mi) a la mezcla de reacción. Después de agitar durante 20 horas a temperatura ambiente, el disolvente se evaporó al vacío. Una solución del residuo crudo obtenido más arriba en TFA (3 mi) se agitó a 0°C durante 30 minutos. El recipiente de reacción se abrió y se evaporó el TFA en una corriente de nitrógeno seco. El residuo se purificó mediante CLAR de fase invertida ** preparativa, las condiciones detalladas de la cual se muestran más adelante. Las fracciones puras se juntaron, se congelaron y liofilizaron obteniéndose 60.5 mg del compuesto 1 en forma de un sólido amorfo incoloro. CLAR (T.r.) 20.7 minutos (columna F, velocidad de flujo: 10 ml/min, eluyente: ácido trifluoracético 0.05%: ácido trifluoracético 0.05% - acetonitrilo = 57:43 ); FAB-MS (m/z) :1700 [M+H]+. (c) A una mezcla del compuesto 1 (60.5 mg, 0.0356 mmoles) en dioxano (2 mi) y agua (2 mi) se añadió paladio 10% sobre carbón (10 mg) , y el recipiente de reacción se llenó con hidrógeno. Después de agitar durante 14 horas a temperatura ambiente, la mezcla se filtró a través de un filtro de membrana (tamaño de poro: 0.2 mm) y el disolvente se evaporó al vacío. El residuo crudo se purificó mediante CLAR invertida preparativa, cuyas condiciones detalladas se indican a continuación. Las "fracciones apropiadas se juntaron, se congelaron y liofilizaron obteniéndose 27.8 mg de aerotricina 132 en forma de un sólido amorfo incoloro. CLAR (T.r.) 18.9 minutos (columna F, velocidad de flujo: 10 ml/min, eluyente: ácido trifluoroacético 0.05%: ácido trifluoroacético 0.05% - acetonitrilo 60:40); FAB-MS (m/z) :1704 [M+H]+. Ejemplo 2 Preparación de la aerotricina 134 (a) A una solución agitada de Fmoc-L-Orn (Boc) -OH (379 mg, 0.834 mmoles) en DMF (6 mi) se añadió reactivo BOP (368 mg, 0.832 mmoles), HOBT hidrato (128 mg, 0.836 mmoles) y N-etildiisopropilamina (145 µl, 0.832 mmoles). Después de agitar durante 2 horas a temperatura ambiente, se añadió una solución de aerotricina 120 (600 mg, 0.378 mmoles) y N-etildiisopropilamina (145 µl, 0.832 mmoles) en DMF (3 mi) a la mezcla de reacción. Después de agitar durante 18 horas a temperatura ambiente, se añadió piperidina (3 mi) a la mezcla. La mezcla de reacción se agitó durante 10 minutos a temperatura ambiente. El disolvente se evaporó al vacío. El residuo se lavó con diclorometano y dietiléter para eliminar los reactivos. El producto crudo se utilizó para el próximo paso sin purificación posterior. (b) A una s"olución del producto crudo (320 mg) obtenido más arriba en MeOH (10 mi) se añadieron éster terc-butílico del ácido (2-oxo-etil) carbámico (crudo, 530 mg) , AcOH (2 mi) y NaBH3CN (210 mg, 3.342 mmoles) en MeOH (4 mi). Después de agitar la mezcla durante 20 horas a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se concentró al vacío. El residuo se disolvió en n-butanol y se lavó con ácido clorhídrico diluido y agua sucesivamente. La capa orgánica se evaporó al vacío. Una solución del residuo crudo obtenido más arriba en TFA (6 mi) se agitó a 0°C durante 30 minutos. El recipiente de reacción se abrió y se evaporó el TFA en una corriente de nitrógeno seco. El residuo se purificó mediante CLAR invertida preparativa, cuyas condiciones detalladas se muestran más adelante. Las fracciones apropiadas se juntaron, se congelaron y liofilizaron obteniéndose 88-.2 mg del compuesto 2 en forma de un sólido amorfo de color blanco. CLAR (T.r.) 22.4 minutos (columna F, _ velocidad de flujo: 10 ml/min, eluyente: ácido trifluoroacético 0.05%: ácido trifluoroacético 0.05% - acetonitrilo = 60:40); c) A una mezcla del compuesto 2 (88.2 mg, 0.0494 mmoles) en dioxano (1.5 mi) y agua (1.5 mi) se añadió paladio 10% sobre carbón (20 mg) , y el recipiente de reacción se llenó con hidrógeno. Después de agitar durante 16 horas a temperatura ambiente, la mezcla se filtró a través de un filtro de membrana (tamaño "de poro: 0.2 mm) "y el disolvente s*e evaporó al vacío. El residuo crudo se purificó mediante CLAR invertida preparativa, cuyas condiciones detalladas se indican a continuación. Las fracciones apropiadas se juntaron, se congelaron y liofilizaron obteniéndose 22.0 mg de aerotricina 134 en forma de un sólido amorfo incoloro. CLAR (T.r.) 25.7 minutos (columna F, velocidad de flujo: 10 ml/min, eluyente: ácido trifluoroacético 0.05%: ácido trifluoroacético 0.05% - acetonitrilo = 63:37); FAB-MS (m/z) :1790 [M+H]+. Ejemplo 3 Preparación de la aerotricina 135 La aerotricina 135 se preparó de acuerdo con un método similar al descrito en el ejemplo 2: CLAR (T.r.) 25.5 minutos (columna F, velocidad de flujo: 10 ml/min, eluyente: ácido trifluoroacético 0.05%: ácido trifluoroacético 0.05% - acetsnitrilo = 63:37); FAB-MS (m/z) : 1790" [M+H] + . Ejemplo 4 Preparación de la aerotricina 136 (a) A una solución agitada de Fmoc-L-Orn (Boc) -OH (379 mg, 0.834 mmoles) en DMF (6 mi) se añadió reactivo BOP (368 mg, 0.832 mmoles), HOBT hidrato (128 mg, 0.836 'inmoles) y N-etildiisopropilamina (145 µl, 0.832 mmoles). Después de agitar durante 2 horas a temperatura ambiente, se añadió una solución de aerotricina 120 (600 mg, 0.378 mmoles) y N-etildiisopropilamina (145 µl, 0.832 inmoles) en DMF (3 mi) a la mezcla de reacción. Después de agitar durante 18 horas a temperatura ambiente, se añadió piperidina (3 mi) a la mezcla. La mezcla de reacción se agitó durante 10 minutos a temperatura ambiente. El disolvente se evaporó al vacío. El residuo se lavó con diclorometano y dietiléter para eliminar los reactivos. El producto crudo se utilizó para el próximo paso sin purificación posterior. (b) A una solución del producto crudo (300 mg) obtenido más arriba en EeOH (10 mi) se añadieron acrilonitrilo (110 µl, 1.68 mmoles) y N-etildiisopropilamina (44 µl, 0.253 mmoles) . Después de agitar la mezcla durante 14 horas a temperatura ambiente, se añadieron acrilonitrilo (440 µl, 6.72 mmoles) y N-etildiisopropilamina (44 µl, 0.253 mmoles). Después de agitar la mezcla durante 22 horas a temperatura ambiente, se añadieron acrilonitrilo (220 µl, 3.36 mmoles) y N-etildiisopropilamina (44 µl, 0.253 mmoles). Después de agitar la mezcla durante 6 horas a temperatura ambiente, se concentró al vacío la mezcla de reacción. El residuo se lavó con diclorometano" y dietiléter para eliminar los reactivos. Una solución del residuo crudo obtenido más arriba en TFA (3 mi) se agitó a 0°C durante 30 minutos. El recipiente de reacción se abrió y se evaporó el TFA en una corriente de nitrógeno seco. El residuo se purificó mediante CLAR invertida preparativa, cuyas condiciones detalladas se muestran más adelante. Las fracciones apropiadas se juntaron, se congelaron y liofilizaron obteniéndose 104.6 mg del compuesto 3 en forma de un sólido amorfo de color blanco. CLAR (T.r.) 27.8 minutos (columna F, velocidad de flujo: 10 ml/min, eluyente: ácido trifluoroacético 0.05%: ácido trifluoroacético 0.05% - acetonitrilo = 57:43). (c) A una mezcla del compuesto 3 (104.6 mg, 0.0596 mmoles) en dioxano (3 mi) y agua (3 mi) se añadió paladio 10% sobre carbón (25 mg) , y el recipiente- de reacción se llenó con hidrógeno. Después, de agitar durante 16 horas a temperatura ambiente, la mezcla se filtró a través de un filtro de membrana (tamaño de poro: 0.2 mm) y el disolvente se evaporó al vacío. El residuo crudo se purificó mediante CLAR invertida preparativa, cuyas condiciones detalladas se indican a continuación. Las fracciones apropiadas se juntaron, se congelaron y liofilizaron obteniéndose 40.3 mg de aerotricina 136 en forma de un sólido amorfo incoloro.

CLAR (T.r.) 25.8 minutos (columna F, velocidad de flujo: 10 ml/mm, eluyente; ácido trifluoroacético 0.05%: ácido trifluoroacético 0.05% - acetonitrilo = 63:37); FAB-MS (m/z) :1761 [N+H]+.

Ejemplo 5 Preparación de la aerotricina 133 (a) A una solución de la sal de aerotricina 3 de mono TFA (2.5 g) , en DMF (10 mi) se añadieron Fmoc-D-Orn (Boc) OH (850 mg) , BOP (180 mg) , HOBT (279 mg) y N-etildiisopropilamina (0.795 mi). Después de agitar la mezcla durante 3 horas a temperatura ambiente, se añadió piperidina (4.0 mi) . La agitación se continuó durante 30 minutos a temperatura ambiente, y a continuación se evaporó el disolvente al vacío. El residuo se disolvió en diclorometano, y la adición gota a gota de éter proporcionó el producto crudo en forma de un polvo amorfo de color blanco. Se lavó con éter y se empleó en el próximo paso sin posterior purificación. (b) El producto crudo obtenido más arriba, se disolvió en DMF (20 mi). A esta solución se añadió Boc-L-Orn (Boc) OH (656 mg) , BOP (872 mg) , HOBT (302 mg) y N— etildiisopropilamina (0.793 mi). Después de agitó la mezcla durante 3 horas a temperatura ambiente, el disolvente se evaporó al vacío . (c) Se añadió TFA (15 mi) a al residuo obtenido más arriba. Después de agitar la mezcla durante 30 minutos a 0°C, se añadió éter gota a gota, obteniéndose un precipitado de color blanco. Se lavó con éter y se purificó mediante CLAR preparativa de fase invertida. Las fracciones puras se juntaron, se congelaron y liofilizaron obteniéndose 515 mg de aerotricina 133 en forma de un sólido amorfo incoloro. CLAR (T.r.) 19.7 minutos (columna F, velocidad de flujo: 10 ml/min, eluyente: ácido trifluoroacético 0.05%: ácido trifluoroacético 0.05% - acetonitrilo = 60:40); FAB-MS (m/z) :1761 [M+H]+. Ejemplo 6 Preparación de la aerotricina 137 (a) A una solución de la sal de aerotricina 3 de mono TFA (622 mg) , en diclorometano (16 mi) y MeOH (4 mi) se añadieron N-Boc-aminoetanol (120 mg) y N-etildiisopropilamina (0.072 mi). Después de agitar durante 1 hora a temperatura ambiente, se añadió a la mezcla de reacción cianoborohidruro de sodio (48 mg) y ácido sulfúrico (0.04 mi). Después de agitar la mezcla de reacción durante 72 horas a temperatura ambiente, se evaporó el disolvente al vacío y a continuación se añadió HCl 0.1 N. Se extrajo con nBuOH y se concentró. (b) El residuo se disolvió en DMF (6 ml)_ al cual se había añadido ácido 2- (S) - [bis- (2-Boc-aminoetil) amino] -5-Boc-pentanoico (294 mg) , HOAt (77 mg) , HBTU (215 mg) y N-etildiisopropilamina (0.148 mi). Después de agitar durante 48 horas a temperatura ambiente, el disolvente se evaporó al vacío, y el residuo se disolvió en diclorometano. A esta solución se añadió éter obteniéndose un precipitado de color blanco. Se lavó con éter y se empleó en el próximo paso sin posterior purificación. (c) A continuación, se añadió TFA (3 mi) al compuesto obtenido más arriba, a 0°C. Después de agitar durante 30 minutos a 0°C, se añadió éter a la mezcla de reacción, obteniéndose un precipitado de color blanco. Se lavó con éter y se purificó mediante CLAR preparativa de fase invertida. Las fracciones puras se juntaron, se congelaron y liofilizaron obteniéndose 95 mg de aerotricina 137 en forma de un sólido amorfo incoloro. CLAR (T.r.) 14.6 minutos (columna F, velocidad de flujo: 10 ml/min, eluyente: ácido trifluoroacético 0.05% agua: ácido trifluoroacético 0.05% - acetonitrilo = 61:39); FAB-MS (m/z) :1776 [M+H]+.

Ejemplo A Se prepararon soluciones inyectables conteniendo cada una de ellas los siguientes ingredientes, en la forma convencional per se: Aerotricina 132 20 mg Fosfato disódico, anhidro 7.6 mg Difostato de sodio dihidrato 2.0 mg Alcohol etílico 150 mg Agua destilada,, desionizada, estéril 850 mg Total 1029.6 mg Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (19)

1. R E I V I N D I C A C I O N E S Habiéndose "descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Aerotricinas representadas por la fórmula (I), caracterizadas porque R1 es N- (3-aminopropil) -N- [ (2S) -2, 5-diaminovaleril] amino, N- (3-aminopropil) -N- [-5-amino-2- [N, N-bis (2-aminoetil) amino] valerillamino, N- (3-aminopropil) -N- [-5-amino-2- [N- (3-aminopropil) amino] valeril] amino, N- (2-aminoetil) -N- [-5-amino-2- [N,N-bis (2-aminoetil) amino]valeril] amino u ornitil-ornitilamino; R2 es hidrógeno o metilo; R3 es hidrógeno o hidroxilo; y las sales farmacéuticamente aceptables de las mismas, excepto en donde ~R2 y "R3 sean hidrógeno y R1 sea {R) -ornitil- (R) -ornitilamino .
2. 2. Aerotricina de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque R1 .es N- (3-aminopropil) -N- [ (2S) -2, 5-diaminovaleril] amino, N- (3-aminopropil) -N- [ (2S) -5-amino-2-[N, N-bis (2-aminoetil) amino] valeril] amino, N- (3-aminopropil) -N- [ (2R) -5-amino-2- [N, N-bis (2-aminoetil) amino] valeril] amino, N- (3-aminopropil) -N- [ (2S) -5-amino-2- [N- (3-aminopropil) amino] valeril] amino, N- (2-aminoetil) -N- [ (2S) -5-amino-2- [N, N-bis (2-aminoetil) amino] aleril] amino, ó (L) -ornitil- (D) -ornitilamino.
3. 3. Aerotricinas de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 6 2, caracterizadas porque R2 y R3 son hidrógeno .
4. 4. Aerotricina de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque R1 es N-(3-aminopropil) -N- [ (2S) -2, 5-diaminovaleril] amino.
5. 5. Aerotricina de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque R1 es (L)-ornitil- (D) ornitilamino .
6. 6. Aerotricina de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque R1 es N-(3-aminopropil) -N- [ (2S) -5-amino-2- [N, N-bis (2-aminoetil) amino) valeril] amino .
7. 7. Aerotricina de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque R1 es N-(3-aminopropil) -N- [ (2R) -5-amino-2- [N,N-bis (2-aminoetil) amino] valeril] amino.
8. 8. Aerotricina de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque R1 es N-(3- "I5 aminopropil) -N- [ (2S) -5-amino-2- (N- (3-aminopropil) ammo] valeril] amino .
9. 9. Aerotricina de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque R1 es N- (2-aminoetil) -N- [ (2S) -5-amino-2- [N, N-bis (2-aminoetil) amino] valeril] amino .
10. 10.* Aerotricina de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque R1 es N-(3-aminopropil) -N- [ (2S) -2, 5-diaminovaleril] amino, y R2 y R3 son hidrógeno.
11. 11. Un procedimiento para la preparación de un compuesto de la reivindicación 4, caracterizado porque el procedimiento comprende (a) la N-alquilación de un compuesto de fórmula (II) [en donde R1 es un grupo amino; R2 y R3 son como se ha definido en la reivindicación 1] con acrilonitrilo, (b) acilación del compuesto resultante con ornitina N-protegida, (c) eliminación de los grupos de protección de los radicales amino (Pi y P2) y (d) reducción del grupo ciano.
12. 12. Un procedimiento para la preparación de los compuestos de las reivindicaciones 6 y 7, caracterizado porque el procedimiento comprende (a) la N-alquilación de un compuesto de fórmula (II) [en donde R1 es un grupo amino; R2 y R3 son como se ha definido en la reivindicación 1] con acrilonitrilo, (b) acilación del compuesto resultante con ornitina N-protegida, (c) eliminación del grupo de protección del radical amino adyacente al grupo cetónico (Pi) , (d) N-alquilación reductora con amino-acetaldehído N-protegido, (e) eliminación del grupo de protección del radical amíno restante (P2) , y (f) reducción del grupo ciano.
13. 13. Un procedimiento para la preparación de un compuesto de la reivindicación 9, caracterizado porque el procedimiento comprende (a) la N-alquilación reductora de un compuesto de fórmula (II) [en donde R1 es un grupo amino; R2 y R3 son como se ha definido en la reivindicación 1] con amino-acetaldehído N-protegido, (b) acilación del compuesto resultante con ornitina N-protegida, (c) eliminación del grupo de protección del radical amino adyacente al grupo cetónico (Pi) , (d) N-alquilación reductora con amino-acetaldehído N-protegido, (e) eliminación del grupo de protección del radical amino restante (P2) , y (f) reducción del grupo ciano .
14. 14. Un procedimiento para la preparación de un compuesto de la" reivindicación 8, caracterizado porque el procedimiento comprende (a) la N-alquilación de un compuesto de fórmula (II) [en donde R1 es un grupo amino; R2 y R3 son como se ha definido en la reivindicación 1] con acrilonitrilo, (b) acilación del compuesto resultante con ornitina N-protegida, (c) eliminación del grupo de protección del radical amino, adyacente al grupo cetónico (Pi) , (d) N-alquilación con acrilonitrilo, (e) eliminación del grupo de protección del radical amino restante P2), y (f) reducción del grupo ciano.
15. 15. Un procedimiento para la preparación de un compuesto de la reivindicación 5, caracterizado porque el procedimiento comprende (a) la acilación de un compuesto de fórmula (II) [en donde R1 es un grupo amino; R2 y R3 son como se ha definido en la reivindicación _ 1] con ornitina N-protegida, (b) eliminación del grupo de protección del radical amino adyacente al grupo cetónico (Pi) , (c) acilación con ornítina N-protegida, y (d) eliminación del grupo de protección del radical amino restante (P2) . 16". Aerotricinas de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, para el empleo en terapia médica. 17. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, y una carga farmacéuticamente aceptable. 18. El empleo de un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, para la preparación de medicamentos para el tratamiento o profilaxis de micosis. 19. Un método para el tratamiento profiláctico y/o terapéutico de enfermedades infecciosas causadas por microorganismos patogénicos, caracterizados porque comprende la administración de un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, a un ser humano o un animal.