MXPA02006376A - Uso de trimebutina para tratar dolor. - Google Patents

Abstract

La invencion se refiere al uso de trimebutina [maleato acido de 2-dimetilamino-2-fenilbutil- 3, 4, 5-trimetoxi-benzoato] o sus estereoisomeros correspondientes para la preparacion de un medicamento para prevenir y/o tratar dolor somatico inflamatorio asi como dolor cronico.

Description

USO DE TR1MEBUT1NA PARATRATAR DOLOR CAMPO DE LA INVENCIÓN El campo de la invención se refiere a los métodos para prevenir y/o tratar el dolor. Más particularmente la invención se refiere a la combinación de trimebutina [maleato ácido de 2-dimetilamino-2-fenilbutil-3, 4, 5-trimetoxi- benzoato] para prevenir y/o tratar dolor somático inflamatorio así como dolor crónico.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La trimebutina [maleato ácido de 2-dimetilamino-2-fenilbutil-3, 4, 5-trimetoxi-benzoato; TMB] ha sido utilizada en muchos países desde 1969 para el tratamiento de trastornos funcionales del intestino, incluyendo síndrome de intestino irritable (IBS). La eficiencia del compuesto para aliviar el dolor abdominal se demostrará en varios estudios clínicos utilizando diferentes protocolos de tratamiento (Lüttecke, 1980; Moshal y Herrón, 1979; Toussaint et al., 1981; Ghidini et al., 1986). Se encontró que a trimebutina exhibe una actividad agonista débil para los receptores opioides del cerebro de rata y del conejillo de Indias (Román et al., 1987) o de los receptores opioides intestinales de canino (Allescher et al., 1991), sin selectividad para ninguno de los subtipos µ, d y K. Esta actividad débil se confirmó cuando se utilizaron fragmentos intestinales aislados bajo estimulación trasmural (Pascaud et al., 1987). Esta propiedad podría ser responsable para la acción moduladora de la trimebutina sobre la movilidad intestinal en el perro en ayuno. La trimebutina dada ya sea intravenosamente u oralmente retrasa la aparición de una fase lll del complejo motor de migración (MMC) en el estómago y en el duodeno mediante la inducción de una fase lll prematura, que migra a lo largo del intestino completo (Bueno et al., 1987). En el hombre, la trimebutina estimula la movilidad intestinal tanto en estados de alimentación como de ayuno (Grandjouan et al., 1989). Además, la trimebutina revierte el efecto del estrés en la movilidad yeyunal (Delis et al., 1994). Más recientemente, la trimebutina ha demostrado ser capaz de influir sobre la actividad de las visceras aferentes al disminuir la intensidad del reflejo recto-colónico consecutivo a la distensión rectal (Julia et al., 1996). Este resultado puede relacionarse con los efectos benéficos encontrados con la trimebutina en pacientes con IBS y más específicamente en el tratamiento de ataques de dolor abdominal. Hay un acuerdo general (9th World Congress on Pain, Viena, Agosto 1999) de que existe una necesidad médica aún no alcanzada para el tratamiento del dolor crónico. NSAID y los opioides son muy poco eficientes en muchos casos. Los antidepresivos han sido utilizados con eficiencia inconsistente (50- 60%). Ciertos anticonvulsivos (carbamacepina, clonacepam, baclofen) pueden ser activos. En los casos extremos, la capsaicina y los anestésicos locales han sido ensayados. Sin embargo, ninguno de estos métodos es satisfactorio y algunos pacientes son refractarios a todos estos. En algunos casos como en la neuralgia trigeminal, neurocirugía (termocoagulación diferencial del ganglio Gasser) permanece como el único modo de alivio del dolor. A partir de un punto inicial en el dolor visceral, los inventores encontraron, como se confirmó en la presente solicitud, que la trimebutina tiene una acción inhibidora en la liberación de glutamato a través del bloqueo de los canales de sodio. Más particularmente, ellos encontraron que la inhibición de la liberación de glutamato sigue a un mecanismo presináptico de activación incluso cuando las propiedades del opioide de trimebutina no están implicadas en este mecanismo. Además, como se muestra a través de los resultados obtenidos en ciertos modelos in vivo y más particularmente en los modelos de hiperalgesia y dolor crónico, ellos demostraron que la trimebutina puede tener una acción sobre las condiciones de dolor diferentes a las del dolor visceral. Esto confirma que la trimebutina es útil en el tratamiento y/o la prevención de hiperalgesia y dolor crónico así como dolor somático inflamatorio.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a un producto que comprende trimebutina [maleato ácido de 2-dimetilamino-2-fenilbutil-3, 4, 5-trimetoxi-benzoato], al . .......__.......... ..... ,?? ?( ^ jilMili |M^a ^m[ menos uno de sus metabolitos o al menos uno de sus estereoisómeros para la preparación de un medicamento para prevenir y/o tratar el dolor. La invención se refiere al uso de trimebutina [maleato ácido de 2-dimetilamino-2-fenilbutil-3, 4, 5-trimetoxi-benzoato] o sus estereoisómeros correspondientes para la preparación de un medicamento para prevenir y/o tratar el dolor somático inflamatorio y dolor crónico. Para la presente invención, la trimebutina, al menos uno de sus metabolitos o al menos uno de sus estereoisómeros se administra oralmente o mediante la inyección y preferiblemente mediante inyección intravenosa a una dosis entre 50 a 900 mg/día (paciente con peso promedio de 70 kg) y preferiblemente entre 300 a 600 mg/día. Las modalidades particulares de la invención proveen el uso de trimebutina, al menos uno de sus metabolitos o al menos uno de sus estereoisómeros para la preparación de un medicamento para prevenir y/o tratar el dolor somático (por ejemplo, dolor neurológico, dolor osteo-traumático dolor de músculo esquelético, dolor de espalda, dolor somático relacionado con cáncer, neuralgias incluyendo neuralgia post-zoster, dolor somático vascular). Las modalidades particulares conciernen a un método para prevenir y/o tratar el dolor somático que comprende administrar trimebutina, al menos uno de sus metabolitos o al menos uno de sus estereoisómeros a un paciente que lo necesite. Las modalidades particulares de la invención proveen el uso de trimebutina, al menos uno de sus metabolitos o al menos uno de sus L?J**m-...^^?^t mr?tt?^t^^ estereoisómeros para la preparación de medicamentos para prevenir y/o tratar el dolor somático inflamatorio (por ejemplo, dolor neurológico, dolor osteo-traumático, dolor de espalda, dolor somático relacionado con cáncer, neuralgias incluyendo neuralgia post-zoster). Las modalidades particulares conciernen a un método para prevenir y/o tratar el dolor somático inflamatorio y/o dolor crónico que comprende administrar trimebutina a un paciente que lo necesite.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1 : concentraciones en plasma de trimebutina (TMB) y N-desmetil trimebutina (Nor-TMB) después de la administración oral de 900 mg de trimebutina. Figura 2: Efecto de TMB (A), Nor-TMB (B) y sus estereoisómeros correspondientes sobre unión de [3H]- batracotoxina a sinaptosomas corticales de rata. Las membranas se incuban con concentraciones en incremento de fármacos prueba en presencia de 25 µg de veneno de escorpión y [3H]-batracotoxina 10nM. La unión específica se determina en la presencia de veratridina 0.3 mM. Después de 90 minutos de incubación 25°C, el ligando unido se separa partir del ligando libre mediante filtración al vacío a través de filtros GF/B. La unión específica en la presencia de compuestos prueba se calcula con un porcentaje de la unión control determinada en la ausencia de i^^? ^^? ttA ?i*^*****^*. inhibidores. Los valores representados son valores medios ± DEM a partir de al menos 3 determinaciones independientes llevadas a cabo por duplicado. Figura 3: Efecto de TMB (A), Nor-TMB (B) y sus estereoisómeros correspondientes, sobre la liberación de glutamato inducida por veratridina a partir de rebanadas de médula espinal de ratas. La morfina y la bupivacaína (C) se evalúan en las mismas condiciones. Los resultados son medias ± DEM de al menos 10 determinaciones. Las rebanadas se superimpregnan 15 minutos con el compuesto prueba antes de la estimulación con veratridina (40 µM). La radioactividad colectada en fracciones de 5 minutos durante 30 minutos después de la estimulación se cuenta y el efecto de los compuestos se determina mediante la comparación de la cantidad acumulada de radioactividad liberada a la obtenida en células superimpregnadas con amortiguador solo. *P<0.05; **P<0.01 ; ***P<0.001 , prueba t de Student. Figura 4: Efecto de TMB sobre las corrientes de sodio medidas en neuronas DRG. (A) Corriente de entrada de Na+ inducida cada 10 segundos por el paso del potencial de membrana a partir de -80 a -10 mV. TMB se aplica localmente por 20 segundos a 0.1 µM (hilera superior) y a 1 µM (hilera inferior). (B) La corriente de sodio antes (control) y durante la impregnación con TMB (misma células que en A). (C) Corriente pico de sodio contra pulso de potencial en solución salina control y en la presencia de TMB a las concentraciones indicadas. La disminución en la corriente de sodio pico ocurrió homotéticamente. (D) Relación dosis-respuesta de los efectos de TMB sobre la corriente de Na+ de DRG. Los resultados se expresan como parte de fiüim.n iMniü i l? M ?? Él -¡ri - 1 f i uhiafcatt MÉH^H^ la corriente de Na+ (pico relativo de la corriente de Na+) que persiste en la presencia del bloqueador. Cada punto es la media ± DEM de 4 a 6 experimentos. Curva continua: mejor ajuste a la función de Hill con IC50 = 0.69 µM, y nH = 1.02. Figura 5: efecto de TMB sobre las corrientes de calcio y de potasio dependientes de voltaje. (A) Corrientes de calcio a partir de neuronas DRG y células GH3. Corrientes inducidas por 150 ms de despolarización a partir de -80 a -10 mV. (B) corrientes de potasio expresadas en ovocitos de Xenopus. Trazos de la corriente superimpuesta inducida por 400 ms de despolarización de -40 a +20 mV (en un paso de 10 mV a partir de -80 mV). Figura 6: efecto de TMB (A) y (S)-Nor-TMB (B) sobre el dolor inducido con formalina en la rata. El efecto se comparó con el de la morfina (C). Los compuestos se inyectaron s.c. A 100 mg/kg 30 minutos antes de la inyección de formalina. Figura 7: efecto de TMB (A), (S)-Nor-TMB (B) y morfina (C) sobre la hiperalgesia inducida por PGE2. Los compuestos se inyectaron s.c. A 100 mg/kg 30 minutos antes de la evaluación del umbral de presión. Figura 8: efecto de (S)-Nor-TMB sobre el umbral de vocalización en la pata lesionada o pata con nervio lesionada (A) y la pata contralateral (B) de ratas con mononeuropatía. Efecto de morfina en la pata lesionada o pata con nervio lesionado (C) y en la pata contralateral (D). *P<0.05; **P<0.01 Figura 9: efecto de TMB en las ratas diabéticas DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Como se mencionó previamente, la presente invención se establece a partir de una necesidad no alcanzada en el tratamiento eficiente del dolor somático. La presente invención se establece a partir de una necesidad no alcanzada en el tratamiento eficiente del dolor somático inflamatorio y como del dolor crónico. El papel primordial de glutamato y de los aminoácidos excitotóxicos (EAA) en el establecimiento de la hiperalgesia o condiciones alodínicas han sido evidenciadas por Dickerson et al., 1995. A partir de ese descubrimiento, se han establecido estrategias para hallazgo de nuevos fármacos analgésicos basados en la inhibición de receptores de glutamato y EAA. La mayoría de los inhibidores que estas estrategias han generado no pueden ser utilizados en humanos por razones de seguridad y actualmente parece que el bloqueo de los receptores de glutamato es un camino difícil para el descubrimiento de fármacos. La inhibición de la liberación de glutamato a partir de las terminales presinápticas como se describe en la presente invención, representa una estrategia más interesante debido a que el objetivo en la presente invención no es bloquear los receptores de glutamato que están implicados en los sistemas fundamentales de transmisión del sistema nervioso central. Más bien, mediante la administración de compuestos tales como aquellos descritos en la presente solicitud y los cuales son capaces de inhibir la liberación de glutamato y delimitar su acceso a los receptores .^.._.^,__^, -. ,.^^ postsinápticos EAA, será posible modular la hiperestimulación de los receptores AEE y evitar la instalación de un estado hiperalgésico que resulta a partir de un fenómeno de excitación observado en la lesión inflamatoria. En el caso de las condiciones de dolor crónico en donde el estado alodínico se establece, la reducción de la liberación de glutamato en la depresión sináptica mediante la acción de estos compuestos limitará la activación de los receptores AEE y tendrá un efecto inmediato sobre el circuito de transmisión del dolor. La presente invención provee así métodos para prevenir y/o tratar el dolor somático. La presente invención también provee métodos para prevenir y/o tratar dolor somático inflamatorio y dolor crónico. Más particularmente la invención concierne al uso de trimebutina [maleato ácido de 2-dimetilamino-2-fenilbutil-3, 4, 5-trimetoxi-benzoato], al menos uno de sus metabolitos o al menos uno de sus estereoisómeros para prevenir y/o tratar dolor somático. En particular la invención concierne al uso de trimebutina [maleato ácido de 2-dimetilamino-2-fenilbutil-3, 4, 5-trimetoxi-benzoato], al menos uno de sus metabolitos o al menos uno de sus estereoisómeros para prevenir y/o tratar dolor somático inflamatorio así como dolor crónico. Se ha demostrado que la trimebutina [maleato ácido de 2- dimetilamino-2-fenilbutil-3, 4, 5-trimetoxi-benzoato] es activa para aliviar el dolor abdominal en los humanos. Interesantemente, los inventores han establecido actualmente que la trimebutina y también algunos de sus metabolitos y preferiblemente aquellos denominados en adelante Nor-TMB (y preferiblemente el (S)- enantiómero) el cual es uno de los metabolitos principales en los humanos, inhibe la liberación de glutamato a partir de las rebanadas de médula espinal de rata, a través del bloqueo de los canales de sodio de conformidad con el mecanismo presináptico. Los resultados reportados en los ejemplos demuestran que la trimebutina, sus estereoisómeros y sus metabolitos tienen efectos inhibidores sobre el dolor somático. Además, los resultados reportados en los ejemplos demuestran que la trimebutina, sus estereoisómeros y sus metabolitos tienen efectos inhibidores sobre el dolor somático inflamatorio y el dolor crónico. Se entiende que N-desmetil trimebutina (Nor-TMB) comprende los compuestos (S)-N-desmetil trimebutina, (R)-N-desmetil trimebutina y el racemato. Además, se sabe que en humanos, después de la administración oral o iv de la trimebutina, esta última sirve como un precursor metabólico para N-desmetil trimebutina (Nor-TMB). En voluntarios a los que se les dan tabletas de 900 mg de trimebutina, se encuentra que la n-desmetil trimebutina se encuentra como siempre compuesto más importante en el plasma: una hora después de la administración oral, o no las concentraciones en plasma de TMB son máximas, las concentraciones en plasma máximas de Nor-TMB son aproximadamente 15 veces mayores. Esto indica que la trimebutina actúa como un bioprecursor de Nor-TMB significando que bajo la acción de las enzimas hepáticas, el bioprecursor trimebutina se metaboliza y da lugar a una nueva molécula. A este respecto, cualquier dato que contribuye la -Ml?MÉIÉmt*-^"*-*' caracterización farmacológica de Nor-TMB es útil para el entendimiento y la descripción de los efectos de la trimebutina. De hecho, la administración de trimebutina en humanos lleva a la exposición concomitante de trimebutina, Nor-TMB y otros metabolitos. Por lo tanto estos compuestos y particularmente la trimebutina y Nor-TMB son capaces de producir juntos sus propiedades antinociceptivas. Por consiguiente, los inventores han demostrado que la trimebutina y las moléculas relacionadas con trimebutina incluyendo Nor-TMB son capaces de exhibir propiedades antinociceptivas en varios modelos de dolor somático. Por consiguiente, los inventores han demostrado que la trimebutina y moléculas relacionadas con trimebutina incluyendo Nor-TMB son capaces de exhibir propiedades antinociceptivas en varios modelos de dolor inflamatorio y/o dolor crónico. Por lo tanto los inventores han demostrado que la trimebutina, sus estereoisómeros y también sus metabolitos tienen una acción inhibidora sobre la instalación de dolor somático mediante la inhibición de la liberación de glutamato, un efecto debido a la actividad del bloqueo de estos compuestos sobre los canales de sodio. Por lo tanto los inventores han demostrado que la trimebutina, sus estereoisómeros y también sus metabolitos tienen una acción inhibidora sobre el dolor somático inflamatorio y sobre la instalación del dolor crónico mediante la inhibición de la liberación de glutamato, un efecto debido a la actividad de bloqueo de estos compuestos sobre los canales de sodio. ^ tí?i im hm ? MÉm ?am áMM Especialmente, la trimebutina, sus estereoisómeros, y Nor-TMB han sido estudiados por su actividad hacia los canales de sodio marcados por [3H]- atracó toxina, su efecto sobre las corrientes de sodio, potasio y calcio en las neuronas del ganglio de la raíz dorsal de la rata, sobre la liberación de glutamato inducida por veratridina a partir de rebanadas de médula espinal de rata. La trimebutina y Nor-TMB han sido evaluadas en cuatro modelos de dolor somático. La trimebutina y nOR-tmb han sido evaluadas en cuatro modelos de dolor inflamatorio o dolor crónico: dolor inducido por formalina en la rata, hiperalgesia inducida por PGE2 en la rata, en un modelo en rata de mononeuropatía y en un modelo en rata de dolor crónico inducido por diabetes inducida por streptozocina. Los resultados de estos experimentos demuestran que la trimebutina y Nor-TMB son capaces de bloquear los canales de sodio y la liberación de glutamato inducida por veratridina a partir de rebanadas de médula ósea de rata. Además, la trimebutina y Nor-TMB exhiben una actividad analgésica. Por consiguiente, la presente invención se refiere el uso de trimebutina [maleato ácido de 2-dimetilamino-2-fenilbutil-3, 4, 5-trimetoxi-benzoato], al menos uno de sus metabolitos o al menos uno de sus estereoisómeros para la preparación de un medicamento para prevenir y/o tratar el dolor somático. En el contexto de la invención, el dolor somático puede significar cualquier dolor diferente a cualquiera de los dolores viscerales. - ? í miíÉmmtí im &* *m En el contexto de la invención, el dolor somático puede significar hiperalgesia somática, dolor somático inflamatorio, dolor neurológico tal como neuropatías, polineuropatías incluyendo aquella relacionadas con la diabetes, dolor de cabeza, trauma, neuralgias incluyendo neuralgia post-zoster y neuralgia trigeminal, algodistrofia, dolor relacionado con VIH, dolor de músculo esquelético tal como dolor osteo traumático, artritis, osteoartritis, espondilartritis así como dolor en extremidad fantasma, dolor de espalda, dolor vertebral, falla quirúrgica de disco desviado, dolor post quirúrgico, dolor somático relacionado con cáncer, dolor somático vascular tal como dolor que resulta partir del síndrome de Raynaud, enfermedad de Horton, arteritis, úlceras varicosas. Por consiguiente, la presente invención se refiere el uso de tpmebutina [maleato ácido de 2-dimetilamino-2-fenilbutil-3, 4, 5-trimetoxi-benzoato] o sus estereoisómeros correspondientes para la preparación de medicamento para prevenir y/o tratar dolor somático inflamatorio y dolor crónico. Debe entenderse por dolor somático inflamatorio, cualquier dolor diferente al dolor visceral que implica un proceso inflamatorio tal como artritis, poliartritis, espondilartritis. Además, la invención se refiere al uso de trimebutina o sus estereoisómeros correspondientes para la preparación de un medicamento para prevenir y/o tratar dolor crónico. -""^-fr- -^- -•*-» * ' Dolor crónico, de conformidad con la definición propuesta por the International Association for the Study of Pain (la Asociación internacional para el Estudio del Dolor), es un dolor del cual persiste más allá del tiempo de cicatrización del tejido normal (sugerido de tres meses) (International Association for the Study of Pain, classification of cronic pain. Pain, 1986, Suplemento 3, S1-S226), y esto implica un punto de transición a partir del dolor agudo. Por consiguiente y puesto que el dolor crónico resulta a partir de hiperalgesia (Dickerson et al., 1995), una modalidad de la presente invención es la prevención y/o tratamiento de hiperalgesia o dolor relacionado con condiciones de hipersensibilidad central. De hecho, la presente invención es particularmente útil para prevenir y/o tratar: - Dolor neurológico tal como neuropatías, polineuropatías incluyendo aquellas relacionadas con la diabetes, dolor de cabeza, trauma, neuralgias incluyendo neuralgia post-zoster y neuralgia trigeminal, algodistrofia, dolor relacionado con VIH, - Dolor músculo esquelético tal como dolor osteo traumático, artritis, osteoartritis, espondilartritis así como dolor de extremidad fanstasma, dolor de espalda, dolor vertebral, falla quirúrgica de disco desviado, dolor postquirúrgico, - Dolor relacionado con cáncer, - Dolor vascular tal como dolor que resulta partir del síndrome de Raynaud, enfermedad de Horton, artritis, úlceras varicosas. ^...-. ^^ ^-..¿--, ,»_-Al..^,^g En el contexto de la presente invención, la trimebutina, al menos uno de sus metabolitos o al menos uno de sus estereoisómeros se provee en una composición farmacéutica para prevenir y/o tratar los dolores anteriormente mencionados. Las composiciones farmacéuticas incluyen trimebutina, al menos uno de sus metabolitos, al menos uno de sus estereoisómeros y/o sus estereoisómeros correspondientes incluyendo sus sales y se produce mediante la formulación del compuesto activo en una forma de unidad de dosis con al menos un vehículo o excipiente sólido o líquido farmacéuticamente aceptable. Adonde es apropiado formar una sal, la sales farmacéuticamente aceptables ¡ncluyen acetato, sulfato de benceno, benzoato, bitartrato, acetato de calcio, camsilato, carbonato, citrato, edetato, edisilato, estolato, esilato, fumarato, gluceptato, gluconato, glutamato, glicoloilarsanilato, hexilresorcinato, hidrabramina, hidrobromuro, hidrocloruro, hidrogencarbonato, hidroxinaftoato, yoduro, isetionato, lactato, lactobionato, malato, maleato, mandelato, mesilato, metilnitrato, metiisulfato, mucato, napsilato, nitrato, pamoato (embonato), pantotenato, fosfato/difosfato, poligalacturonato, salicilato, estearato, subacetato, succinato o hemisuccinato, sulfato o hemisulfato, tanato, tartrato o hemi-tartrato, teoclato, trietyoduro, benzatina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilendiamina, meglumina, procaína, aluminio, amonio, tetrametil amonio, calcio, litio, magnesio, potasio, sodio, y zinc. (Véase también "Pharmaceuticals salts" por Berge S. M. et al., (1997) J. Pharm. Sci. 66:1- 19, el cual se incorpora en la presente como referencia.). ? i ' \ tmÉmi? É? ÉM Las formas de dosis sólidas para administración oral incluyen cápsulas, tabletas, pildoras, polvos, y granulos. En dichas formas de dosis sólidas, los componentes activos se mezclan con al menos un excipiente inerte habitual (o vehículo) tal como citrato de sodio o fosfato dicálcico o (a) llenadores o extensores, como por ejemplo, almidones, lactosa, sucrosa, glucosa, manitol, y ácido silícico, (b) aglutinantes, como por ejemplo, carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidona, sucrosa, y acacia, (c) humectantes, como por ejemplo, glicerol, (d) agentes desintegrantes, como por ejemplo, agar-agar, carbonato de calcio, almidón de patata o de tapioca, ácido algínico, ciertos silicatos complejos, y carbonato de sodio, (e) retardadores de solución, como por ejemplo parafina, (f) aceleradores de absorción, como por ejemplo, compuestos de amonio cuaternario, (g) agentes humectantes, como por ejemplo, cetil alcohol, y monoestearato de glicerol, (h) absorbentes, como por ejemplo, caofina y bentonita, y (i) lubricantes, como por ejemplo, talco, estearato de calcio, estearato de magnesio, polietilenglicoles sólidos, lauril sulfato de sodio, o mezclas de los mismos. En el caso de cápsulas, tabletas y pildoras, las formas de dosis pueden comprender también agentes amortiguadores. Las formas de dosis sólidas tales como tabletas, pastillas, cápsulas, pildoras, y granulos pueden prepararse con revestimientos y cubiertas, tales como revestimientos entéricos y otros bien conocidos en ia técnica. Los componentes activos también pueden estar en forma micro- • *- — *-"- -^^mmüHH 1 encapsulada, si es apropiado, con uno o más de los excipientes anteriormente mencionados. Las formas de dosis líquidas para administración oral incluyen emulsiones farmacéuticamente aceptables, soluciones, suspensiones, jarabes, y elíxires. Además de la trimebutina y/o el opioide analgésico, las formas de dosis líquidas pueden contener eluyentes inertes comúnmente utilizados en la técnica, tales como agua u otros solventes, agentes solubilizantes y emulsificantes, como por ejemplo, etil alcohol, isopropil alcohol, carbonato de etilo, acetato de etilo, bencil alcohol, y similares. Las suspensiones, además de la trimebutina y/o el opioide analgésico, pueden contener agentes de suspensión, como por ejemplo, isoestearil alcoholes etoxilados, polioxietilen sorbitol y esteres de sorbitano, celulosa microcristalina, metahidróxido de aluminio, bentonita, agar-agar y tragacanto, o mezclas de estas sustancias, y similares. Las composiciones adecuadas para inyección parenterales pueden comprender soluciones acuosas o no acuosas estériles fisiológicamente aceptables, dispersiones, suspensiones o emulsiones, y polvos estériles para reconstitución hacia soluciones o dispersiones estériles inyectables. Los ejemplos de portadores líquidos adecuados, diluyentes, solventes o vehículos incluyen agua, etanol, polioles (propilenglicol, polietilenglicol, glicerol, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. Estas composiciones también pueden contener adyuvantes tales como agentes conservadores, agentes humectantes, agentes emulsificantes, y agentes dispersantes. La prevención de la acción de microorganismos puede asegurarse mediante varios agentes antibacterianos y antifungales, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, y similares. También puede ser deseable el incluir agentes isotónicos, por ejemplo azúcares, cloruro de sodio, y similares. Preferiblemente la composición está en forma de unidad de dosis. En dicha forma, la preparación se divide hacia unidades de dosis que contienen cantidades apropiadas de trimebutina, al menos uno de sus metabolitos o al menos uno de sus estereoisómeros. La forma de unidad de dosis puede ser una preparación empaquetada, el paquete conteniendo cantidades discretas de la preparación, por ejemplo, tabletas empaquetadas, cápsulas, y polvos en viales o ampolletas. La forma de unidad de dosis también puede ser una cápsula, sello o tableta misma, o puede ser el número apropiado de cualesquiera de estas formas empaquetadas. Algunos ejemplos de formas de unidades dosis son tabletas, cápsulas, pildoras, polvos, supositorios, soluciones orales acuosas y no acuosas y suspensiones, y soluciones parenterales empaquetadas en recipientes que contienen ya sea una o algún número mayor de unidades de dosis y son capaces de ser subdivididas en dosis individuales. Por consiguiente, la trimebutina o sus estereoisómeros correspondientes, al menos uno de sus metabolitos o al menos uno de sus estereoisómeros se administran a una dosis entre 50 a 900 mg/día (paciente con un peso promedio de 70 kg) y preferencialmente entre 300 a 600 mg/día. yjUju^ !^^ »_-..-««_..-».. -.. ^,.-> .,,^ fl El término "paciente" se pretende que incluya cualquier mamífero y especialmente un humano al que se administra trimebutina. Las rutas de administración preferiblemente son las rutas orales y parenterales y especialmente las rutas de inyección y particularmente la ruta de inyección intravenosa. Sin embargo, cualquier ruta compatible tal como ruta subcutánea, intramuscular, intratecal, intraperitoneal pueden ser consideradas en el contexto de la presente invención. Otra modalidad de la invención se refiere a un método para prevenir y/o tratar dolor somático que comprende administrar trimebutina, al menos uno de sus estereoisómeros o al menos uno de sus metabolitos aún paciente que lo necesite. Otra modalidad de la invención se refiere a un método para prevenir y/o tratar dolor somático inflamatorio que comprende administrar trimebutina a un paciente que lo necesite. La presente invención también provee un método para prevenir y/o tratar dolor crónico que comprende administrar trimebutina a un paciente que lo necesite. El significado del término dolor "somático" o "crónico" es el mismo como se definió anteriormente así como "paciente". Los datos bioquímicos y farmacológicos reportados en los ejemplos permiten un mejor entendimiento del mecanismo de acción de la trimebutina en combinación con un opioide analgésico. Estos apoyan la suposición de que, además de sus efectos reguladores sobre la motilidad colónica ya reportada en el pasado y la cual se ha relacionado con sus débiles ...>.. ,.._»___É _«.._»-.......^^irM^ ^^^A l^^^^g^ propiedades opioides, la trimebutina está dotada con propiedades antinociceptivas las cuales se deben a su efecto de bloqueo sobre los canales de Na+. Estas nuevas propiedades de TMB explican cómo este compuesto en combinación con un opioide analgésico es un método útil para tratar el dolor somático. Estas nuevas propiedades de TMB explican cómo este compuesto es un método útil para prevenir y/o tratar dolor somático inflamatorio y/o dolor crónico. La presente invención se describirá adicionalmente en los siguientes ejemplos sin limitar el alcance de la invención.

EJEMPLOS Material v métodos Animales Ratas macho Sprague-Dawley (I FFA Credo, Saint Germaine sur l'Arbresle, Francia), que pesaban 225- 250 g (experimentos de unión a [3H]-batracotoxina) o 350- 375 g (experimentos de liberación de glutamato), o ratas preñadas (experimentos electrofisiológicos) se utilizaron en estos experimentos se manejaron de conformidad con las líneas guías institucionales para bienestar animal: temperatura 21 + 3 °C; luz/oscuridad: 12h/12h.

Fármacos y medios El maleato de trimebutina, (S)- Trimebutina, y (R)- Trimebutina, se sintetizan de conformidad con el procedimiento descrito en la patente francesa FR 2, 369M (1982) y la solicitud de patente japonesa publicada bajo el número 16416 (1980) e incorporada en la presente como referencia. La Flunarizina, ácido L- glutámico, hidrocloruro de lidocaína, bupivacaína, tripsina y DMEM-F12 se obtuvieron a partir de Sigma (St Quentin Fallavier, Francia), morfina a partir de Francopia (Gentilly, Francia), veratridina a partir de RBI, Bioblock Scientific (Ilikirch, Francia), gentamicina a partir de Boehringer Mannheim S.A. (Meylan, Francia). Todos los reactivos utilizados para la preparación de amortiguadores y soluciones son de grado analítico a partir de Merck (Merck-Clevenot, Nogent sur Mame, Francia). El maleato de (S)-N-desmetil-TMB se sintetizó de conformidad con el procedimiento descrito en WO 99/01417 e incorporado en la presente como referencia. El ácido L- [G-3H]- glutámico (49 Ci/mmoles), es a partir de Amersham (Les Ulis, Francia). El medio Eagfe modificado por Dulbecco, medio Neurobasal, suero de ternera fetal fueron a partir de Gibco, Life Technologies S.A.R.L. (Cergy Pontoise, Francia). El suero de caballo es a partir de Seromed, (Berlín, Alemania).

EJEMPLO 1 Unión a T3H1- batracotoxina El propósito del presente ejemplo es determinar la afinidad de los compuestos evaluados a los sitios de unión a [3H]- batracotoxina en los sinaptosomas corticales de rata, representando el sitio 2 del canal de sodio. 1.1 Materiales y métodos a) Membranas sinaptosomales Las cortezas cerebrales a partir de ratas macho Sprague-Dawley se homogeneizaron en un homogeneizador de vidrio-Teflón en diez volúmenes de sucrosa 0.32 M, K2HP04 5 mM (pH 7.4 a 4°C) enfriada con hielo. El homogeneizado se centrifugó a 1000 g por diez minutos; el concentrado nuevo se resuspendió en el mismo volumen de sucrosa y se recentrifugó. El concentrado nuevo se desechó y los dos sobrenadantes resultantes a partir de estas dos centrifugaciones se agruparon y se centrifugaron a 20,000 g por diez minutos. El concentrado resultante se resuspendió en un amortiguador de ensayo libre de sodio que contenía HEPES 50 mM (ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-etansulfónico), KCl 5.4 mM, MgS04 0.8 mM, glucosa 5.5 mM y cloruro de colina 130 mM (pH 7.4 a 25°C). b) Experimento de unión Los ensayos de unión se iniciaron mediante la adición de 150- 200 µg de proteínas sinaptosomales a un amortiguador de ensayo que contenía 25 µg de veneno de escorpión (Leireus quinquestriatus), BSA al 0.1 %, [3H]- batracotoxina 10 nM y varias concentraciones de los fármacos prueba (volumen final 250 µl). La unión no específica se determinó en la presencia de veratridina 0.3 mM. Las reacciones se incubaron por 90 minutos a 25°C y el ligando unido se separó a partir del ligando libre mediante filtración al vacío a través de filtros GF/B (Filtermate, Packard). Los filtros se lavaron con 2 x 5 ml de amortiguador (HEPES 5 mM, CaCI2 1.8 mM, MgS04 0.8 mM, cloruro de colina 130 mM, BSA al 0.01 %; pH 7.4 a 25°C) y el ligando unido se estimó mediante el uso de espectrometría de centelleo líquido (Topcount, Packard). c) Cálculos En todos experimentos que examinan el desplazamiento de la unión a [3H]- batracotoxina mediante fármacos no marcados, las curvas de concentración-respuesta se generaron utilizando seis concentraciones de fármacos. Todos ensayos se llevaron a cabo al menos tres veces, con cada determinación llevada a cabo por duplicado. Los datos expresan como valores medios ± DEM de al menos tres determinaciones. Las curvas de desplazamiento se ajustan siendo generadas por Graph-Pad Software. Las gráficas de desplazamiento se analizaron mediante un análisis de regresión no lineal utilizando el programa de computadora LIGAND (McPherson, 1985). Estos análisis generaron coeficientes de Hill (?H) y valores IC50. Los valores Ki se calcularon a partir de los valores IC50 utilizando la relación Cheng-Prusoff (1973). 1.2 resultados Los resultados presentados en la figura 2(A) muestran que la trimebutina, sus estereoisómeros y sus metabolitos desplazan [3H]-batracotoxina a partir de sus sitios de unión a los sinaptosomas corticales de rata con potencias que yacen entre la de la bupivacaína (Ki = 7.14 ± 0.96) y la de la flunarizina (Ki = 0.38 ± 0.05 µM). Para todos compuestos, el desplazamiento de [3H]- batracotoxina es completo y el coeficiente calculado de Hill es cercano a 1 (figura 2). La afinidad de la trimebutina se encuentra con Ki = 2.66 ± 0.15 µM. Para este compuesto, no es evidente ninguna estereoselectividad puesto que los estereoisómeros correspondientes exhiben afinidades similares a las de los racematos. Los valores para los enantiómeros (S) y (R) son: Ki = 3.31 ± 0.36 µM y Ki = 2.89 ± 0.88 µM respectivamente. Para Nor-TMB, los valores para los enantiómeros (S) y (R) son: Ki = 0.80 ± 0.04 µM y Ki = 1.26 ± 0.07, respectivamente. Por lo tanto, el presente ejemplo demuestra que la trimebutina, Nor-TMB y los estereoisómeros correspondientes exhiben afinidad para los sitios de unión a [3H]- batracotoxina en el mismo orden de magnitud que para bupivacaína o flunarizina, dos bloqueadores del canal de sodio.

EJEMPLO 2 Liberación de f3H1- glutamato El propósito del presente ejemplo es determinar la capacidad de la trimebutina y sus metabolitos para inhibir la liberación de glutamato a partir de rebanada de médula espinal de rata. Ejemplo muestra que la trimebutina, sus metabolitos y sus estereoisómeros correspondientes inhiben la liberación de glutamato inducida por veratridina in vitro. Se sabe que la veratridina induce la liberación de glutamato mediante la activación de los canales de Na+ dependientes de voltaje, resultando en un flujo hacia adentro del Na+ con reducción consecutiva del gradiente transmembranal (Wermelskirchen et al., 1992). 2.1 Materiales y métodos a. Amortiguadores Dos amortiguadores se prepararon: un amortiguador de incorporación (solución modificada de Krebs: NaCI 119 mM, KCl 5 mM, CaCI2 0.75 mM, MgS04 1.2 mM, NaH2P04 1 mM, HEPES 25 mM, NaHC03 1 mM, D-glucosa 11 mM, EDTA 67 µM, ácido L- ascórbico 1.1 mM (pH 7.4) gasificado — .^ ..... — ^-- A?m?iti^irtirlf itt-M^t-ÉAtf ái con 95% de 02 y 5% de C02) y un amortiguador de superimpregnación idéntico al amortiguador de incorporación excepto que el EDTA y el ácido ascórbico son omitidos. Los compuestos a ser evaluados y la veratridina se diluyen en este amortiguador de superimpregnación. b) Rebanadas de médula espinal de rata Después de la decapitación de los animales, un segmento de 1.5 cm de médula espinal lumbar se aisla después de la laminectomía lumbosacral y se sumerge en una solución de Krebs modificada enfriada con hielo gasificada con 95% de 02 y 5% de C02. Después de la remoción de la duramadre, todas las raíces centrales y dorsales se cortan en la raíz de la zona de entrada. Las rebanadas (bloques semejantes a un cubo con un grosor de 250 µm) se prepararon utilizando tres secciones sucesivas que se fragmentaron con un fragmentador de tejido Mclllwain. c) Experimentos desuperimpreqnación Las rebanadas incubaron por 5 minutos a 30°C en 5 ml de amortiguador de incorporación mantenido bajo oxigenación y que contenía ácido L- glutámico 10 µM y 4 µCi/ml de ácido [3H]- glutámico. Después de la incubación, las rebanadas se transfirieron dentro de cámaras de superimpregnación a un aparato de superimpregnación automática (Brandel). El aparato consiste de un dispositivo de 20 cámaras que permiten que corran simultáneamente 20 experimentos y se controla la secuencia de , -,-..t^.a...^^^,-, .^-^ . amortiguadores utilizados en la superimpregnación mediante la programación de una computadora Apple lie. Este sistema hace posible evaluar varios grupos experimentales en la misma corrida (4 grupos de 5 cámaras). Después de un periodo de lavado de 45 minutos, a una velocidad de flujo de 0.5 ml/minuto, la veratridina (40 µM) se añade por cinco minutos al medio de superimpregnación. Cuando los fármacos se evalúan (trimebutina y sus estereoisómeros), éstas se añaden al medio de superimpregnación 15 minutos antes y también durante la aplicación de veratridina. Las fracciones del impregnado que corresponden a 5 minutos se colectan durante los 30 minutos siguientes a la estimulación. Al término de la corrida, las rebanadas se remueven a partir de las cámaras y se añaden 2.5 ml de líquido de centelleo (Hionic Fluor, Packard) a la rebanadas y a cada una de las fracciones. La radiactividad se determina utilizando espectroscopia de centelleo líquido (Minaxi, Packard). El eflujo de radiactividad se asume que se debe principalmente al eflujo de [3H]- glutamato (Turner y Dunlap, 1989). d . Análisis de datos Todos los valores expresan como media ± DEM de al menos 5 determinaciones. La liberación de radiactividad para cada fracción se expresa en términos de liberación fraccional calculada al dividir la radiactividad en cada fracción por la cantidad remanente en el filtro. La estimulación producida por la veratridina se cuantifica mediante la acumulación de la liberación de radiactividad medida en las fracciones colectadas después de la estimulación.

El efecto de los compuestos probados se evalúa como porcentaje de inhibición al comparar las cantidades totales de radiactividad liberada en las cámaras control a aquéllas liberadas en las cámaras impregnadas con los compuestos prueba. A partir de estos porcentajes de inhibición, los valores IC50 se calculan mediante el graficado de los valores adecuados de la inhibición en contra de los valores log de las concentraciones. Los análisis estadísticos se llevan a cabo utilizando la prueba t de Student de dos colas no apareada. Las diferencias estadísticas se consideran significativas en P<0.05. 2.2 Resultados Los resultados presentados en la figura 3 demuestran que la trimebutina inhibió la liberación de glutamato inducida por veratridina de manera dosis- dependiente a concentraciones mayores de 60 µM (figura 3A). Además, de 50 a 60% de la inhibición pudo alcanzarse a concentraciones tan altas como 100 µM. La (R)- trimebutina presenta un perfil similar al del racemato mientras que (S)- trimebutina presentó una inhibición significativa a partir de la concentración de 3 µM (figura 3A). La IC50 estimada es de 15.2 µM para (S)- trimebutina, mientras ésta no pudo calcularse (IC50 > 100 µM) para trimebutina y (R)- trimebutina. Para Nor-TMB y sus estereoisómeros (figura 3B), el efecto inhibidor fue significativo (p<0.01 ) a 3, 10 y 30 µM y el valor IC50 fue de 8.4 µM. La (S)-Nor-TMB exhibió una actividad (IC50 = 6.3 µM) similar a la del racemato y similar también a la del segundo enantiómero (R)-Nor-TMB (IC50 = 16.3 µM). Estos resultados están de acuerdo con lo resultados a partir fa_?t_¿____á_M_a-.*^^^ de otros artículos que reporta que los compuestos que inactiva a los canales de Na+ dependientes de voltaje que tienen la liberación de glutamato inducida por veratridina ¡n vitro e ¡n vivo (Lees y Leach, 1993). De manera similar, el efecto de TMB y compuestos relacionados sobre la liberación de glutamato inducida por veratridina es debido a sus actividades de bloqueo sobre los canales de sodio. Cuando la bupivacaína se evalúa bajo las mismas condiciones experimentales (figura 3C), un valor IC50 de 8.2 µM puede ser estimado. La morfina se encuentra inactiva en este modelo hasta 100 µM (figura 3C). La ausencia del efecto de morfina en este modelo sugiere que los efectos de trimebutina sobre la liberación de glutamato no se deben a las propiedades opioides de los compuestos derivados de los estudios previos (Román et al., 1987). Este resultado es bastante importante dado el papel fundamental de glutamato y de los aminoácidos excitatorios (EAA) en la transmisión del mensaje nociceptivo y más particularmente en las condiciones hiperalgésicas. A este respecto, el hallazgo de que TMB y sus metabolitos son capaces de reducir las concentraciones extracelulares de glutamato mediante la inhibición de su liberación a partir de los agrupamientos presinápticos representa una propiedad excitante de TMB en este uso terapéutico como agente analgésico. _J_ -LÍ----_--M--v---------, _^-£-J-¿-¿-á.--..--.

EJEMPLO 3 Experimentos electrofisiológicos El propósito de este ejemplo es el estudio de los efectos de trimebutina y sus estereoisómeros sobre las corrientes de sodio, potasio y calcio. 3.1 Materiales y métodos a) Neuronas DRG Los experimentos sobre las corrientes de sodio se llevan a cabo utilizando ganglios cultivados de la raíz dorsal de rata (DRG) extirpados a partir de embriones de rata de 14 a 15 días de edad. Los métodos para el aislamiento de células y el cultivo se derivan a partir de aquellos descritos por Valmier et al. (1989). Las ratas Sprague-Dawley preñadas se sacrifican al colocarlas en una atmósfera de C02 por 5- 6 minutos. De tres a cinco embriones se remueven asépticamente y se colocan en una caja de Petri que contiene el siguiente medio B suplementado con antibióticos (estreptomicina, 50 µg/ml; penicilina, 50 U/ml). El medio B contienen (en mM): NaCI 137, KCl 5.4, NaHP04 0.4, MgS04 0.8, MgCI2 0.8, CaCI2 1.8, glucosa 6, HEPES 10. Los ganglios de la raíz dorsal se removieron a partir de la médula espinal escindida y se digirieron por 6 minutos en 2 ml de medio Eagle modificado por Dulbecco que contenía 0.1% de tripsina. Las células se disocian nn^^¡ ll ,lll?ll?? ,? lri-r^l. t-ÉÉ AAÉÍaM^ mecánicamente a través de pipetas Pasteur con la punta fundida al fuego y se colocan dentro de cajas cubiertas con poliornitina- laminina. El medio de cultivo es el medio Neurobasal que contiene, glutamina 0.5 mM y glutamato 25 µM. Las células se incuban a 37°C en C02 a 5%. Los experimentos electrofisiológicos se llevan a cabo de 4-6 h a 24 h después del sembrado. b) Línea celular GH3/B6 de pituitaria de rata Esta línea celular, de origen de pituitaria de rata, exhibe corrientes de calcio dependientes de voltaje de umbrales de activación bajos y altos así como corrientes de sodio sensibles a TTX (tetrodotoxina) (Matteson y Armstrong, 1984). Las células GH3 en proliferación se crecen a 37°C en un ambiente con C02 al 5%. El medio de crecimiento contiene DMEM-F12 suplementado con 12.5% de suero de caballo y 2.5% de suero de ternera fetal. Cuando las células llegan a confluencia, éstas se separan y que siembran nuevamente a 5 x 104 células en 5 ml de medio de crecimiento. c) Canales de potasio expresados en ovocitos de Xenopus Dos canales de K+ dependientes de voltaje se consideran: los canales Kv1.1 relacionados con shaker y los canales Kv1.2. Estos canales se seleccionan en vista de su ambiente en el sistema nervioso central y periférico, particularmente en los extremos nerviosos y en los nodulos de Ranvier de fibras mielinizadas (Wang et al., 1994).

Los canales rKv1.1 y rKv1.2 dependientes de voltaje de rata se expresa en ovocitos de Xenopus. Los ADNc de rKv1.1 y rKv1.2 son un regalo generoso de S. Alper (Berth Israel Hospital, Harvard Medical School, Boston MA, EUA). Las transcripciones se realizan utilizando el Ambion Megascript (Ambion, EUA) y los ARNc se almacenan en agua a 1 mg/ml. La inyección de ARNc en ovocitos de Xenopus se realiza a 2-4 ng/ml. Los ovocitos sin folículos se mantienen en medio ND96 suplementado con gentamicina 0.1 U/ml. Las corrientes se registran 1-6 días después de la inyección. d) Electrofisioloaía Se llevaron a cabo experimentos convencionales de sujeción de parche en célula completa a temperatura ambiente utilizando un amplificador de sujeción de parche EPC7 (List). Las neuronas DRG se bañan en un medio derivados de Hanks que contiene (en mM): NaCI 143; CaCI2 10; KCl 5.6, MgCI2 2, glucosa 5 y HEPES 10, pH ajustado 7.4 con NaOH (osmolaridad, 300- 310 mosm/l). Para registrar la corriente de sodio, el calcio se reemplazó por Mg2+ en la presencia de TTX 10"5 M y TEA 10 mM (tetraetilamonio). Para registrar la corriente de sodio, es calcio se reemplazó por Mg2+ en la presencia de TEA 10 mM. Los electrodos en parche utilizados para registrar corrientes de Na+ y Ca2+ se llenan con la siguiente solución salina (en mM): CsCl 140, EGTA 1.1 (ácido etilenglicol-bis (ß-aminoetil éter) N, N, N\ N' - tetraacético), HEPES 5, MgCI2 2, pH ajustado a 7.2-7.3 con CsOH (osmolaridad, 290 mosm/l). Los electrodos se jalaron en 4 pasos a partir de capilares de vidrio de . ,.. A . .-Ü .. &_-&-- .... t,-^--..- *. 1.5 mM (GC 150 TF, Clark Electromedical Instruments) utilizando un jalador P87 (Sutter Instruments) y se pulieron al fuego. La resistencia de la punta es de 2-3 MO. Los fármacos se disolvieron en el medio de baño (a partir de soluciones de almacenamiento a 10"2 M en DMSO (dimetil sulfóxido)) se aplicaron mediante presión de eyección (Pneumatic Picopump PV820, WPI) a partir de pipetas de vidrio (diámetro de punta 10-20 µm) localizadas a 50-60 µm a partir de la célula registrada. Un amplificador de dos electrodos de sujeción de voltaje (Geneclamp, 500, Axon Instruments) se utilizó para registrar las corrientes de K+ a partir de propósitos de Xenopus. Los electrodos llenados con KCl (3M) tuvieron una resistencia de punta < 1 MO. Los ovocitos se impregnaron continuamente con un medio DN96 libre de Ca2+ con el objeto de evitar una corriente grande de Cl- activada por Ca2+ presente en estas células. e) Cálculos Los datos se muestrearon a 2 kHz. El software para estimulación, adquisición y análisis se construyó en casa. Las curvas dosis-respuesta se construyeron con varias concentraciones de fármaco separadas por períodos del lavado. Cada punto es la media ± DEM de 3 a 6 experimentos. Los puntos experimentales se ajustan a la curva teórica de Hill utilizando el programa Minsq de mínimos cuadrados: y = 1/(1 + [X /ICso") en ^A? ^^*^^--*.****** **.^** * el cual y esa fracción de la corriente de Na+ que persiste en la presencia del fármaco aplicado a la concentración [X], IC5o es la concentración del fármaco que bloquea a la mitad la corriente de Na+, y n es el coeficiente de Hill que corresponde al número de fármacos requeridos para bloquear un canal de Na+. 3.2 Resultados En la figura 4A se muestran los efectos de las aplicaciones sucesivas por 20 segundos de trimebutina a 0.1 y 1 µM sobre la corriente de sodio de una neurona DRG. En este experimento representativo, TMB indujo un bloqueo reversible de la corriente que ascendió al 13% y 61% a 0.1 y 1 µM respectivamente. El bloqueo ocurrió sin ninguna evidencia de cambios en la cinética de la corriente (figura 4B) y la dependencia del voltaje (figura 4C). La curva dosis- respuesta obtenida mediante la aplicación de 0.01 , 0.1 , 1 y 10 µM de trimebutina se muestra en la figura 4 (D) como una gráfica de parte de la corriente remanente en la presencia del bloqueador. Los parámetros de inhibición calculados a partir de estas curvas son: IC50 = 1.05 ± 0.09 y nH = 1.09 ± 0.10. Los parámetros calculados para Nor-TMB son muy similares. Un estudio de cinética se llevó a cabo utilizando (R,S)-TMB. La relación de desbloqueo k desconectado se determina partir de la constante de tiempo tdes8nectado = 34 ± 4 s (n = 6) del tratamiento exponencial a partir del bloqueo: K desconectado = 1 ^desconectado = 29 10" s" . * 4 ! i ji ft^ La relación de bloqueo K conectado se deduce a partir de KD = k desconectado/k conectado; conectado = 35- 40 10" S" µM"1. Estas relaciones dß reacciones definieron a los tres fármacos como bloqueadores rápidos del canal de Na+; por ejemplo, 10 µM de (R.S)-TMB bloqueo los canales con una constante de tiempo de 2.2 s. b) Corrientes de calcio Tanto en las células GH3 como en las neuronas DRG, los tres fármacos aplicados a 10 µM no tuvieron efectos significativos ya sea sobre el bajo umbral de las corrientes transitorias de Ca2+ tipo T (pico temprano en la figura 5A) o el alto umbral de las corrientes lentamente inactivadoras de Ca2+ (corrientes de entrada en estado estacionario en la figura 5A). c) Corrientes de potasio Las pruebas se llevaron a cabo sobre los canales Kv1.1 y Kv1.2 dependientes de voltaje expresados en ovocitos de Xenopus. Los tres fármacos aplicados a 10 µM tuvieron un ligero efecto de depresión sobre las tres corrientes de K+ (media en bloque: 12 ± 4%, n = 18), el compuesto más efectivo a este respecto siendo (R.S)-TMB (corriente en bloque 23 ± 6%; figura 5B). Este efecto ocurrió sin cambios obvios en el potencial de la célula en reposo y resistencia a la entrada. Estos datos electrofisiológicos confirman los resultados sobre la unión de [3H]- batracotoxina (ejemplo 1) y liberación de glutamato (ejemplo 2) t&!j j¡Í¿ ^^¿±^^^g^^^^ fa¿j¿gr* ¿Í ni ?? ii m .ii.ii liiiíliiiii l i ífl íl 1 1 f 1 1 ¡UlMíflI mediante la demostración de que TMB y sus estereoisómeros bloquean de manera reversible las corrientes de sodio y neuronas DRG y también en células GH3 con casi la misma eficiencia (IC50 aproximadamente 1 µM). Puesto que el coeficiente de Hill es aproximadamente 1 , el bloqueo parece ocurrir de conformidad con una reacción bimolecular simple, es decir una molécula de bloqueador interactúa con un sitio sobre el canal de Na+. Por lo tanto, el valor IC50 mide la constante de disociación KD de los bloqueadores. No se pudo demostrar ningún efecto sobre las corrientes de Ca2+ medidas en células GH3 y en neuronas DRG cuando se utilizaron estos compuestos. El efecto ligero de depresión se encontró para trimebutina sobre las corrientes de K+ y de conformidad con lo resultó reportados en las células del músculo liso de íleo (Nagasaki et al., 1993b). En este trabajo, se muestra que la trimebutina inhibió una corriente entrante de manera consistente con una corriente de K+ dependiente de Ca2+ (IKCa) y una corriente de K+ independiente de Ca2+ (ikv). Tomándolos juntos r los efectos más potentes de la trimebutina se encuentran sobre los canales de Na+ en las células neuronales o células GH3 con IC50 menor que 1 µM, los efectos sobre las corrientes de Ca++ o K+ siendo observados a concentraciones 10 a 100 veces mayores. Por lo tanto, los efectos de la trimebutina y de los compuesto relacionado sobre las corrientes de Na+, los cuales parecen responsables de efecto inhibidor sobre la liberación de glutamato, indican un efecto terapéutico potencial de estos compuestos en el dolor. Se sabe que los bloqueadores del canal de sodio similares a los anestésicos locales bloquean la generación y conducción de los impulsos nerviosos al inhibir la corriente a través de los canales de Na+ abiertos por voltaje en la membrana de la célula nerviosa (Strichartz y Ritchie, 1987). El efecto de TMB y compuestos relacionados sobre las corrientes de Na+, el cual es responsable del efecto inhibidor de la liberación de glutamato, indica un efecto terapéutico potencial de estos compuestos en el dolor.

EJEMPLO 4 Dolor inducido por formalina en la rata El objetivo de este estudio es evaluar la actividad analgésica de TMB y sus metabolitos en el dolor inducido por formalina. 4.1 Materiales v métodos A) Animales: Se utilizaron ratones suizos (23 ± 3 gramos) al día de la prueba ; los animales se aclimataron al ambiente de laboratorio (24°5C<t°C< 24°8C) por al menos una hora antes de la evaluación. l-í-,i-i,- ~ *J .*lj^.. > . ???f~I?^?Írá?t»t*?LJÍii b) Prueba: Una solución de formalina al 5% se prepara en solución salina estéril (v/v) y 20 µl se inyectan bajo la superficie plantar de la pata izquierda. Después de la inyección ¡ntraplantar de la formalina (t =0), los animales se colocaron en un cilindro de vidrio y se determinó el tiempo que pasaron lamiendo la pata inyectada a partir de t =20 a t =25 minutos después de la inyección de formalina. Los fármacos se dieron mediante ruta subcutánea 10 minutos antes de la inyección de formalina (30 minutos antes de la prueba); los animales control recibieron el vehículo apropiado en las mismas condiciones experimentales. c) Análisis de datos: Los datos se representan como la media ± DEM. La significancia estadística de las diferencias entre los grupos se obtiene por medio de un análisis de varianza de un sentido seguido por una prueba de comparación de Dunnett con un nivel de significancia p<0.05. Un porcentaje de actividad se calculó como sigue: media control - media tratada X 100 media control «tt-Jbt .. i---.-, * .^, , „^.. ^.~*~± *^.^* ^ ?^M6m ¡ ID5o (12 de fármacos necesaria para reducir el tiempo de lametazos por 50% en relación al valor control) se calcula por la respuesta graduada a la dosis. 4.2 Resultados Las ratas se inyectaron s.c. con los compuestos prueba 30 minutos antes de la inyección de formalina en la pata. TMB exhibió una ED50 de 231 mg/kg (figura 6A) mientras que Nor-TMB (figura 6B) exhibió una actividad de 17 mg/kg. En las mismas condiciones experimentales, la morfina (figura 6C) exhibió una ED50 de 0.51 mg/kg. Estos resultados demuestran que la trimebutina y sus metabolitos exhiben propiedades antinociceptivas en el dolor inducido por formalina.

EJEMPLO 5 Hiperalgesia inducida por PGE_? El objetivo de este estudio es evaluar la actividad antihiperalgésica de TMB, sus estereoisómeros y sus metabolitos en hiperalgesia inducida por prostaglandina E2 (PGE2) en la rata. a) Animales: La prueba se llevó a cabo en ratas macho Sprague-Dawley (100-120 gramos) a la llegada. Estos se alojaron 5 por caja y se aclimataron a las condiciones del bioterio por 5 días bajo un ciclo de día/noche 12/12 a una temperatura ambiente constante de 22°C. El alimento y el agua se proveyeron ad libitum. b) Prueba: Una solución de PGE2 (1 mg/ml) se preparó con una solución de almacenamiento en un alcohol al 10% (v/v) en solución salina estéril apirógena y se almacenó a 4°C por 4 días. Una solución de PGE2 (1 µg/ml) se preparó recientemente dos veces al día en solución estéril y 100 µl se inyectó de manera subplantar dentro de la pata izquierda de la rata, dos veces al día por 4 días. Utilizando este protocolo, la hiperalgesia se presenta por al menos una semana siguiendo al término de cuatro días de tratamiento. Los animales control (grupo con solución salina o grupo sin afección) se les dio solución salina estéril en lugar de PGE2 en las mismas condiciones experimentales. La hiperalgesia se midió por la prueba de Randall y Selitto (Randall y Setillo, 1957) utilizando un analgesímetro (Ugo Basile). El analgesímetro es básicamente un dispositivo el cual ejerce una fuerza que se incrementa a velocidad constante. La fuerza se aplica a la pata del animal la cual se coloca sobre un pequeño embasamiento bajo un impulsador en forma de cono. El operador deprime un pedal de interruptor inicie el mecanismo del cual ejerce la fuerza. El umbral nociceptivo (denotado como umbral en las figuras 5 y 6) se define como la fuerza, expresada en gramos, a cual la rata retira su pata. El umbral se determina antes y después de tratamiento. Los fármacos se dan mediante ruta subcutánea, 30 minutos antes de la segunda determinación; los animales control (grupo con solución salina o grupo sin afección y grupo tratado con PGE2) recibieron el vehículo apropiado en las mismas condiciones experimentales. c. Análisis de datos: Los datos se presentan como la media ± DEM. El nivel de significancia estadística se determinó con la prueba t de Student (Tallarrida y Murray, 1987) para muestras apareadas y diferencias con p<0.05 son consideradas estadísticamente significativas. El % de actividad antinociceptiva o analgésica se calcula como sigue: media del grupo PGE2/tratado media del grupo PGE2/vehículo después de tratamiento con el después de tratamiento fármaco con el vehículo X 100 Media del grupo solución media del grupo PGE2/vehículo salina/vehículo después de después de tratamiento con el vehículo tratamiento con el vehículo ...ÍA-. ?*.í**??*?l +*u. r. .. ...^.....^.^^a, ^^^...a^,,.^ *****. 5.2 Resultados De conformidad con los resultados mostrados en la figura 7 (A), (R)-TMB produjo una inhibición del 57% a 100 mg/kg s.c. En las mismas condiciones, la figura 7 (B) demuestra que (S) Nor-TMB es capaz de producir una inhibición superior al 89% a 20 mg/kg s.c. Por consiguiente, (S)-Nor-TMB exhibió una ED5o de 7 mg/kg. Estos resultados demuestran que TMB y sus metabolitos son capaces de revertir la hiperalgesia producida por PGE2.

EJEMPLO 6 Mononeuropatía en rata El objetivo de estudio es evaluar el metabolito de TMB en un modelo de neuropatía en rata. 6.1 Materiales v métodos Los lineamientos éticos del Comité para Investigación y Asuntos Éticos de Asociación Internacional para Estudio de Dolor (lASP-Intemational Association for the Study of Pain) se consideraron en estos estudios. En particular, la duración de los experimentos es tan corta como es posible y el número de animales se mantuvo en un mínimo. ^jjgg^jg^^ g^|^£ g|^g | g| a) Animales: Se utilizaron las ratas macho Sprague-Dawley (Charles River, Francia, cepa de designación Crl:CD(SD)BR), n = 45, que pesaban 175- 200 gramos a la llegada . Las ratas se alojaron en las instalaciones experimentales por una semana antes de los experimentos. Estas se mantuvieron en un ciclo de luz/oscuridad de 12h y tuvieron acceso libre al alimento y agua corriente estándar del laboratorio en una temperatura ambiente de 20- 22°C. b) Cirugía: La mononeuropatía periférica unilateral se produce en la extremidad derecha trasera de conformidad con el método descrito por Bennett y Xie, 1988 y Attal et al., 1990. Las ratas se anestesiaron con pentobarbital sódico (Nembutal, 50 mg/kg i.p.). El nervio ciático común se expuso mediante disección roma a nivel del muslo medio; cuatro ligaduras (catgut crómico 5-0, con un espacio de aproximadamente 1 mm) se colocaron alrededor del nervio. c) Evaluación antinociceptiva: Los experimentos se llevaron a cabo en un cuarto tranquilo. Los animales no se aclimataron a las situaciones prueba anteriormente. El experimentador no estuvo consciente del fármaco y de las dosis utilizadas.

Cada animal recibió fármacos solamente una vez y se utilizó en solamente un experimento. La acción antinociceptiva se determinó mediante la medición del umbral de localización producido por la presión tanto en el nervio lesionado como en la pata trasera contralateral, utilizando el analgesímetro Ugo Basile (Comerio, Italia). Este instrumento genera una fuerza mecánica que se incrementa linealmente aplicada por una punta plástica con forma de domo (diámetro = 1 mm) sobre la superficie dorsal de la pata. La punta se ubica entre el tercer y cuarto metatarso (dentro de territorio de nervio ciático) y la fuerza se aplica hasta que la rata chilla. Para rata, un umbral control (media de 2 umbrales estables consecutivos expresado en g) se determina antes de inyectar los fármacos. El umbral de vocalización se mide entonces cada diez minutos, hasta que regresa al nivel de los valores control. d) Análisis de datos: Los datos expresan como media ± DEM. Las áreas bajo las curvas (AUC) se calculan utilizando la regla trapezoidal. La significancia estadística de los datos se analiza mediante un análisis de varianza de un sentido (ANOVA). La significancia observada se confirma entonces con una prueba de Turkey. Se llevan a cabo regresiones simples (modelo lineal) para establecer los efectos dosis- dependientes. El análisis estadístico se lleva a cabo utilizando un programa estadístico de computadora (Statgraphics Plus, Manugistics, Rockville, MD). P<0.05 se utiliza como el criterio para significancia estadística. ^tt^-fl*»»*.*.*..^...»^*** ,*.. ..**,.* ....-_,._., -. - - .--^.--^i-A ,^^!!,!^ 6.2 Resultados El (S)-Nor-TMB produjo un efecto antinociceptivo que es más pronunciado en la pata con nervio lesionado que en la pata contralateral (figura 8A y 8B). El efecto es significativo en todas las tres dosis evaluadas en la pata con nervio lesionado, solamente a la mayor dosis (10 mg/kg) en la pata contralateral. El efecto antinociceptivo duró más de 90 minutos. En el caso de la morfina (figura 8C y D), el umbral máximo de presión obtenido con la mayor dosis de 1 mg/kg i.v. es menor que el que se encontró con (S)-Nor-TMB de 3 mg/kg s.c.; además, la duración del efecto es menor de 60 minutos con morfina y el efecto en la pata con nervio lesionado es similar al que se encontró en la pata contralateral. En resumen, en este modelo de mononeuropatía, (S)-Nor-TMB a 3 y 10 mg/kg s.c. Produce un efecto antinociceptivo que superior al de la morfina a 1 mg/kg i.v. en términos de amplitud y de duración de acción. Esto resultados han mostrado que metabolitos de la trimebutina, (S)-Nor-TMB es capaz de incrementar el umbral de presión necesaria para producir vocalización de las ratas. Este efecto está presente a partir de la dosis de 1 mg/kg s.c. El efecto obtenido con (S)-Nor-TMB a 3 mg/kg s.c. es más potente en términos de analgesia que el obtenido con morfina a 1 mg/kg i.v.

EJEMPLO 7 Ratas diabéticas inducidas por estreptozocina El propósito de este ejemplo es demostrar el efecto nociceptivo de un metaboíitos de trimebutina en el modelo de ratas diabéticas inducidas por estreptozocina. 7.1. Materiales y métodos La estreptozocina es una toxina de célula ß pancreática, la cual ha sido utilizada para inducir diabetes experimental en animales de laboratorio (Tomlinson K.C. et al., 1992). La pérdida resultante de la insulina endógena inducida por la estreptozocina imita las características de la diabetes tipo I, o diabetes insulino-dependiente. La diabetes inducida por estreptozocina recientemente ha sido descrita como un modelo de dolor crónico en las ratas. Se ha reportado que la administración estreptozocina lleva a una hiperalgesia mecánica, térmica, y química así como hipersensibilidad mecánica (Courteix C. et al., 1993; Calcutt N.A. et al., 1996). Los síntomas más comunes de la neuropatía diabética parecen ser dolor espontáneo de ardor e hipersensibilidad mecánica en los pies o extremidades inferiores. a) Animales: La prueba se llevó a cabo con ratas macho Spargue Dawley (Iffa-Credo) que pesaban 160- 180 gramos a la llegada. Estas se alojaron 5 por caja y se aclimataron a las condiciones del bioterio por cinco días bajc un ciclo de día/noche 12/12 y a una temperatura ambiente constante de 22°C. El alimento y el agua se proveyeron ad libitum. b) Inducción de la diabetes: Los animales se inyectaron intraperitonealmente con estreptozocina 75 mg/kg. A los animales control se les dio el vehículo en las mismas condiciones. La diabetes se confirmó una vez a la semana después de la inyección mediante la medición de los niveles de glucosa en sangre de la vena de la cola con la prueba de glucemia Boehringer. Solamente los animales con un nivel final de glucosa 14 nM se incluyeron en el estudio. c) prueba de inmersión de la cola en agua: La cola de la ratas de sumergió en un baño de agua a 44°C. La reacción nociceptiva se definió como el tiempo de reacción (segundos) antes de retirar la cola. Los resultados expresan como la media ± DEM y se analizaron mediante una prueba t de Student después de un análisis de varianza (Anova de un sentido). 7.2 resultados El tratamiento con estreptozocina produjo una hiperalgesia medida en ratas como el tiempo de reacción para retirar la cola a partir del agua caliente (figura 9). Lo resultados muestran que después de un tratamiento de una sola dosis con (S)-Nor-TMB 30 mg/kg s.c. por 30 minutos o 60 minutos antes de la prueba de inmersión de la cola, el tiempo de reacción es el mismo que en las ratas control (no diabéticas). Esto resultados demuestran por lo tanto el efecto antinociceptivo de un metabolitos de trimebutina en este modelo.

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Claims (15)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- El uso de trimebutina [maleato ácido de 2-dimetilamino-2« fenilbutil-3, 4, 5-trimetoxi-benzoato], al menos uno de sus metabolitos o al menos uno de sus estereoisómeros para la preparación de un medicamento para prevenir y/o tratar dolor somático diferente al dolor visceral.

2.- El uso de trimebutina [maleato ácido de 2-dimetilamino-2-fenilbutil-3, 4, 5-trimetoxi-benzoato], al menos uno de sus metabolitos, o al menos uno de sus estereoisómeros para la preparación de un medicamento para prevenir y/o tratar dolor crónico o dolor somático inflamatorio diferente al dolor visceral.

3.- El uso como se reclama en la reivindicación 1 ó 2, en donde la trimebutina, al menos uno de sus metabolitos, o al menos uno de sus estereoisómeros se administra oralmente.

4.- El uso como se reclama en la reivindicación 1 ó 2, en donde la trimebutina, al menos uno de sus metabolitos, o al menos uno de sus estereoisómeros se administra mediante inyección y preferiblemente mediante inyección intravenosa.

5.- El uso como se reclama en cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el medicamento provee entre 50 900 mg y preferiblemente entre 300 a 600 mg de la trimebutina al paciente por día. -^^--«"^Htlftf- .-*--—- ^~~ ——M

6.- El uso como se reclama en cualesquiera de las reivindicaciones precedentes para prevenir y/o tratar hiperalgesia.

7.- El uso como se reclama en cualesquiera de las reivindicaciones precedentes para prevenir y/o tratar dolor relacionado con » 5 condiciones de hipersensibilidad central, dolor crónico o dolor somático T inflamatorio.

8.- El uso como se reclama en cualesquiera de las reivindicaciones precedentes para prevenir y/o tratar dolor neurológico.

9.- El uso como se reclama en cualesquiera de las ío reivindicaciones precedentes para prevenir y/o tratar artritis.

10.- El uso como se reclama en cualesquiera de las reivindicaciones precedentes para prevenir y/o tratar dolor osteo- traumático. a ,

11.- El uso como se reclama en cualesquiera de las reivindicaciones precedentes para prevenir y/o tratar dolor de la espalda. 15

12.- El uso como se reclama en cualesquiera de las reivindicaciones precedentes para prevenir y/o tratar dolor asociado con cáncer.

13.- El uso como se reclama en cualesquiera de las reivindicaciones precedentes para prevenir y/o tratar dolor relacionado con 20 VIH.

14.- El uso como se reclama en cualesquiera de las reivindicaciones precedentes para prevenir y/o tratar neuralgias incluyendo neuralgia post-herpética. .Ai..?A¿ ¿-^. .^..¿?^^

15.- El uso como se reclama en cualesquiera de las reivindicaciones precedentes para prevenir y/o tratar dolor vascular. •*•***«- -»» -**>• ^& ^^ ^^^^i?ÁAlí