MXPA02004307A - Promotor de semilla seleccionada de cebada. - Google Patents

Abstract

La presente invencion proporciona una composicion y metodo para regular la expresion de las secuencias de nucleotido heterologas en un vegetal. La composicion es una secuencia de acido nucleico novedosa para un promotor de semilla seleccionada. Tambien se proporciona un metodo para expresar una secuencia de nucleotido heterologa en un vegetal la utilizando la secuencia promotora. El metodo comprende transformar una celula vegetal para contener una secuencia de nucleotido heterologa unida operablemente al promotor de semilla seleccionada de la presente invencion y regenerar un vegetal establemente transformado a partir de la celula del vegetal transformado.

Description

? PROMOTOR DE SEMILLA SELECCIONADA DE CEBADA DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona al campo de biología molecular vegetal, más particularmente a la 5 regulación de la expresión de gen en vegetales. La expresión de las secuencias de ADN heterólogas en un huésped de vegetal es dependiente en la presencia de un promotor unido operablemente que es funcional dentro del huésped de vegetal. La elección de la secuencia promotora determinará cuándo y dónde dentro del vegetal la secuencia de ADN heteróloga se expresa. Cuando la expresión continua se desea durante todas las células de un vegetal, los promotores constitutivos se utilizan. En contraste, cuando la expresión de gen en respuesta a un estímulo se desea, los promotores inducibles son el elemento regulador de elección. Cuando la expresión en los tejidos específicos u órganos se desea, se utilizan los promotores preferidos de tejido. Esto es, estos promotores pueden dirigir la expresión en tejidos u órganos especificos. Las secuencias reguladoras adicionales corriente arriba y/o corriente abajo de la secuencia promotor de núcleo pueden incluirse en los casetes de expresión de los vectores de transformación para provocar aproximadamente niveles de variación de expresión de secuencias de nucleótido heterólogas en un vegetal transgénico. Ver, por ejemplo, Patente Norteamericana No. 5,850,018.

Las secuencias reguladoras pueden también utilizarse en expresión espacial y/o temporal determinante de ADN endógeno. Por ejemplo, los tejidos especializados están implicados en ?a fertilización y desarrollo de semilla. Es de interés la identificación de promotores que son activos en estos tejidos de semilla. En cultivos de granos de importancia agronómica, la formación de semilla es la última meta de desarrollo vegetal. Las semillas se cosechan para uso en alimentación, alimentos, y productos industriales. Las cantidades y proporciones de proteína, aceite y componentes de almidón en esas semillas determinan su utilidad y valor. El tiempo de desarrollo de -semilla es crítico. Las condiciones ambientales en cualquier punto anterior a la fertilización a través de la maduración de la semilla pueden afectar la calidad y cantidad de semilla producida. En particular, los primeros 10 a 12 días después de la polinización (fase de retraso) son críticos en desarrollo de semilla de maíz. Varios acontecimientos de desarrollo durante la fase de retraso son determinantes importantes del destino del crecimiento y desarrollo de semilla subsecuente (Cheikh, N. et al., Plant Physiology 106:45-5L (1994)). Por lo tanto, un medio para influir en el desarrollo del vegetal, particularmente en la respuesta a la tensión durante esta fase de crecimiento, es de interés. La identificación de una secuencia promotora activa en tejidos de semillas en desarrollo expuestas a tensiones abióticas sería útil. Los tejidos vegetales especializados son centrales al desarrollo de semilla. Siguiendo la fertilización, las semillas en desarrollo se vuelven sumideros para carbón desplazados a través del tejido vegetal de los sitios de fotosíntesis. Sin embargo, las semillas de cereal de desarrollo no tienen conexiones vasculares directas con el vegetal; en su lugar, un mecanismo de transporte de corta distancia opera para mover las similitudes de los tejidos vasculares al endosperma y embrión. Por ejemplo, en el maíz, el fotosintato entra a la semilla a través del pedículo; en trigo y cebada; a través de la proyección nucelar y la capa aleurona. Es posible que esta trayectoria de similitud de distancia corta entre el tejido vegetal y el endosperma puede operar para regular la velocidad de transporte de sacarosa dentro del grano (Be ley, J.D., and M. Black. Sedes : Physiology of Development and Germination . N.Y., Plenum Press, 1985, pp. 38-39) . Por lo tanto, un promotor activo en la expresión del gen dentro de estos tejidos especializados, tales como la proyección o pedículo nucelar, puede tener efectos significativos en el desarrollo del grano. Durante el rápido crecimiento de semilla, la sacarosa sé descarga de manera pasiva del tejido vegetal dentro del apoplasto del parencima de pedículo e invertido en azúcares de hexosa por una invertasa de ácido de unión de pared celular. La hidrólisis de sacarosa en el apoplasto mantiene un gradiente favorable para continuar descargando del tejido vegetal y proporcionar hexosas que se to an por las células endosper as básales. Se ha mostrado que las semillas de maíz inducen a aborto, in vi tro, tienen únicamente niveles bajos de actividad de invertasa en el pedículo. (Hanft. J.M. et al. (1986) Plant Physiol. 81:503-510) . Las tensiones de agua en el vegetal alrededor de la antesis con frecuencia resultan en la absorción de semilla o desarrollo restringido. Estudios sugieren que la sacarosa continúa para descargarse del tejido vegetal en un bajo potencial de agua de ovario, pero se acumula en el simplas a y apoplasma del pedículo debido a la baja actividad invertasa. (Zinselmeier, C, et al . , (1995) Plant Physiol. 107:385-391). Esta conclusión se soporta por los descubrimientos de Miller and Chourey (Plant Cell 4: 297-305 (1992) ) , quienes muestran que la falla desarrollada de semillas miniatura -1 de maíz se unen a la falta de la actividad de invertasa en el tejido pedículo durante las etapas tempranas de desarrollo de semilla. Otros tejidos vegetales especializados se implican también estrechamente en los procesos críticos "de fertilización y desarrollo de semilla. Por ejemplo, en maíz, carpelos, los cuales constituyen la pared del ovario, convierte el pericarpo, una cubierta de semilla exterior protectora, resistente. El escutelo, junto con el endosperma, se implica en el desplazamiento de similitudes al embrión en desarrollo. La aleurona, la capa de superficie de las células de endosperma, se desarrollan para servir como una fuente de enzimas necesaria en la germinación. (Kiesselbach, T.A. The Structure and Reproduction of Com. N.Y., Cold Spring Harbor Press, 1999) . En la claridad de las contribuciones importantes de estos tejidos de semilla especializados para el- desarrollo de granos adecuados, la identificación de una secuencia promotora que afectan la expresión del gen en estos tejidos sería útil. Además, sería deseable identificar una secuencia promotora activa en estos tejidos específicos en tiempos apropiados, críticos. Aún más deseable sería la identificación de una secuencia promotora activa en estos tejidos específicos en tiempos apropiados, críticos, que no se afectan negativamente por tensión ambiental en el vegetal. El gen de maíz Glbl que codifica globulina-1, una proteína de almacenamiento de embrión principal. (Kriz, A.L., et al . (1986) Plant Physiol. 82:1069-1075) Glbl se expresa en la semilla de maíz de desarrollo durante el desarrollo de embrión. (Belanger, F.C., et al . (1989) Plant Physiol. 96:636-643) . La región promotora de Glbl ha sido identificada, clonada, e introducida en las vegetales de tabaco por la transformación mediada por Agrobacterium . (Liu, S., et al . (1996) Plant Cell Reports 16:158.162). Los vegetales transformados demuestran que el promotor Glbl tiene especificidad deseable temporal y de tejido. Sin embargo, el promotor Glbl se regula positivamente por ácido abscísico (ABA). (Kriz, A.L., et al . (1990) Plant Physiol. 92:538-542; Paiva, R., et al . , (1994) Vegetal 192:332-339). Los niveles de la hormona ABA en el vegetal son conocidos para fluctuar bajo condiciones de frío o desecación. (Himmelbach, A., et al . (1998) Phil. Trans. R. Soc. Lond. 353:1439-1444). Así, la actividad del promotor Glbl puede afectarse diferencialmente por tensión ambiental. Existe una necesidad para una secuencia promotora activa en tejidos relacionados a la semilla específica en tiempos críticos en desarrollo de semilla y los cuales no se impactan negativamente por tensiones ambientales al vegetal. En particular, es deseable que la actividad promotora no sea des-regulada por tensiones ambientales. Es un objeto de la presente invención proporcionar una secuencia de nucleótido novedosa para modular la expresión del gen en un vegetal. Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar un promotor aislado capaz de dirigir la transcripción en una manera preferida de semilla.

Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar un método de control mejorado de un producto endógeno o exógeno en la semilla de un vegetal transformado. Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar un método para efectuar cambios útiles en el fenotipo de una semilla de un vegetal transformado. Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar un método para producir cambios útiles en el fenotipo de una semilla de un vegetal transformado. Es un objeto adicional de .la presente invención proporcionar un método para producir un producto novedoso en la semilla de un vegetal transformado. Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar un método para producir una función novedosa en la semilla de un vegetal transformado. Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar un método para modular el tiempo o velocidad de desarrollo de la semilla de un vegetal transformado. Es uh objeto adicional de la presente invención proporcionar un método para regular la acumulación de productos fotosintéticos en la semilla en desarrollo de un vegetal transformado. Es un objeto adicional de la presente invención proporciona un método para regular la producción de fitohormonas implicadas en desarrollo de semilla.

Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar un método para regular la maquinaria de ciclo celular de semillas durante su desarrollo. Por lo tanto, en un aspecto, la presente invención se relaciona a un ácido nucleico aislado que comprende un miembro seleccionado del grupo que consiste de: a) ácido nucleico, capaz de dirigir la expresión en el carpelo, escutelo de embrión, pedículo, núcelo, pericarpo, aleurona, o región que forma el pedículo de una semilla en desarrollo; b) los ácidos nucleicos capaces de dirigir la expresión en el carpelo, escutelo de embrión, pedículo, núcelo, pericarpo, aleurona, o región que forma pedículo de una semilla en desarrollo durante los periodos críticos de desarrollo de semilla; c) los ácidos nucleicos capaces de dirigir la expresión en el carpelo, escuelo de embrión, pedículo, núcelo, pericarpo, aleurona, o región que forma pedículo de una semilla en desarrollo durante las condiciones de crecimiento favorables o desfavorables; d) los ácidos nucleicos que comprenden una variante o fragmento de por lo menos 20 nucleótidos contiguos de la secuencia establecida en la SECUENCIA DE IDENTIDAD NO 1; e) el segmento de ácido nucleico establecido en la SECUENCIA DE IDENTIDAD NO: 1; f) los ácidos nucleicos que hibridizan a cualesquiera de uno de a), b) , c) , o d) , bajo condiciones severas; en donde las condiciones severas incluyen: una hibridización a 42 °C en una solución del 50" (p/v) de formamida, 6X SSC, 0.5% de SDS, 100 µg/ml de esperma de salmón, lavado con 0.5% de SDS y 0. IX de SSC en aproximadamente 65°C durante 30 minutos y repetido; g) ácidos nucleicos que tienen por lo menos 65% de identidad de secuencia a la SECUENCIA DE IDENTIDAD NO. 1 en donde el % de la identidad de secuencia se basa en la secuencia completa y se determina por análisis GAP bajo parámetros predefinidos. En otros aspectos, la presente invención se relaciona a casetes de expresión que comprenden el promotor enlazado operablemente a una secuencia de nucleótido, los vectores que contienen el cásete de expresión, y vegetales establemente transformadas con por lo menos un cásete de expresión. En un aspecto adicional, la presente invención se relaciona a un método para modular la expresión en la semilla de un vegetal establemente transformada que comprende las etapas de (a) que transforman una célula vegetal con un cásete de expresión que comprende el promotor de la presente invención, operablemente enlazado a por lo menos una secuencia de nucleótido; (b) desarrollar la célula vegetal bajo condiciones de desarrollo vegetal y (c) regenerar un vegetal establemente transformado a partir de la célula vegetal en donde tal secuencia de nucleótido unida se expresa en la semilla. De acuerdo con la invención, se proporciona una secuencia de nucleótido que permite la iniciación de la transcripción en la semilla. La secuencia de la invención comprende las regiones de iniciación transcripcional asociadas con la formación de semilla y tejidos de semilla. Así, las composiciones de la presente invención comprenden una secuencia de nucleótido novedosa para . un promotor vegetal, más particularmente un promotor seleccionado de semilla. Por ""semilla" o "pepita" se pretende incluir el grano u óvulo maduro de un vegetal, o más ampliamente, una estructura vegetal propagativa. Los términos "semilla" y "pepita" se utilizan intercambiablemente en la presente. Por "semilla preferida" se pretende la expresión favorable en la semilla, incluyendo en por lo menos uno de embrión, semilla o pepita, pericarpo, endosperma, proyección nucelar, núcelos, aleurona, pedículo, y similares. Por "secuencia de nucleótido heterólogo" se pretende una secuencia que no ocurre naturalmente con la secuencia promotora. Mientras esta secuencia de nucleótido es heteróloga a la secuencia promotora, ésta puede ser homologa (nativa) o heteróloga (extraña) en el alojamiento del vegetal. Por "promotor" se pretende una región reguladora de ADN que comprende usualmente una caja TATA capaz de dirigir la polimerasa de AR? II para iniciar la síntesis de AR? en el sitio de iniciación de transcripción apropiada para una secuencia de codificación particular. Un promotor puede comprender adicionalmente otras secuencias de reconocimiento generalmente colocadas corriente arriba o 5' a la caja TATA, mencionada como elementos promotores corriente arriba, que influencia la velocidad de iniciación de transcripción. Se reconoce que han identificado las secuencias de nucleótido para la región promotora descrita en la presente, está dentro del estado de la técnica para aislar e identificar los elementos reguladores adicionales en la región no traducida ' corriente arriba de la región promotora particular identificada en la presente. Así la región promotora descrita ? en la presente se definió además generalmente comprendiendo elementos reguladores corriente arriba tales como aquellos confiables para el tejido y expresión temporal de la secuencia de codificación, mejoradores y similares. En la misma manera, los elementos promotores que permiten la expresión en el tejido deseado tal como la semilla puede identificarse, aislarse, y utilizarse con otros promotores de núcleo para confirmar la expresión preferida de semilla.

La secuencia promotora aislada de la presente invención puede modificarse para proporcionar un rango de niveles de expresión de la secuencia de nucleótido heteróloga. Menor que la región promotora completa puede utilizarse y la capacidad para dirigir la expresión preferida de semilla retenida. Sin embargo, se reconoce que los niveles de expresión de ARNm pueden disminuirse con eliminaciones de porciones de la secuencia promotora. Así, el promotor puede modificarse para ser un promotor débil o fuerte. Generalmente, por "promotor débil" se pretende un promotor que dirige la expresión de una secuencia que codifica en un nivel inferior. Por "nivel inferior" .se pretende niveles de aproximadamente 1/10, 000 transcripciones a aproximadamente 1/100,000 transcripciones a aproximadamente 1/500,000 transcripciones. Inversamente, un promotor fuerte dirige la expresión de una secuencia de codificación en un nivel elevado, o a aproximadamente 1/10 transcripciones a aproximadamente 1/100 transcripciones a aproximadamente 1/1,000 transcripciones. Generalmente, por lo menos aproximadamente 20 nucleótidos de una secuencia de promotor aislada será utilizada para dirigir la expresión de una secuencia de nucleótido. Sin embargo, los segmentos más cortos de un promotor pueden ser efectivos dirigiendo la expresión, y pueden particularmente mejorar la expresión dentro de los tejidos específicos.

Se reconoce que para los niveles de transcripción incrementados, pueden utilizarse mejoradores en combinación con las regiones promotoras de la invención. Los mejoradores son secuencias de nucleótido que actúan para incrementar la expresión de una región promotora. Los mejoradores se conocen en la técnica e incluyen la región mejoradora SV40, el elemento mejorador 35S, los similares. El término "aislado" se refiere al material, tal como un ácido nucleico o una proteina, la cual es: (1) sustancial o esencialmente libre de componentes los cuales normalmente acompañan o interactúan con éste como se encuentra en su ambiente natural. El material aislado opcionalmente comprende material no encontrado con el material en su ambiente natural; o (2) si el material está en su ambiente natural, el material ha sido alterado sintéticamente o producido sintéticamente por intervención humana deliberada y/o colocado en una ubicación diferente dentro de la célula. La alteración o creación sintética del material puede realizarse sobre el material dentro o aparte de su estado natural. Por ejemplo, un ácido nucleico que ocurre naturalmente se convierte en un ácido nucleico aislado si éste es alterado o producido por métodos sintéticos, no naturales, o si éste se transcribe de ADN que ha sido alterado o producido por métodos no naturales, sintéticos. El ácido nucleico aislado _puede también producirse por la re-disposición sintética ("redistribución") de una parte o partes de uno o más formas alélicas del gen de interés. Así mismo, un ácido nucleico que ocurre naturalmente (por ejemplo, un promotor) se convierte a aislado, si éste se introduce en un lugar diferente del genoma. Los ácidos nucleicos los cuales se "aislan", como se define en la presente, se refieren también como ácidos nucleicos "heterólogos" . Los métodos para aislamiento de regiones promotoras son bien conocidos en la técnica. Se describe un método en la solicitud de patente Norteamericana No. 60/098,690, presentada el 31 de agosto de 1998, incorporada en la presente para referencia. La secuencia para la región promotora de la presente invención se establece en la SECUENCIA DE IDENTIDAD NO: 1. La región promotora de la invención puede aislarse a partir de cualquier vegetal, incluyendo, pero no limitada a, cebada {Hordeum vulgare) , maíz { Zea mays) , cañóla {Brassica napus, Brassica rapa ssp. ) , alfalfa {Medicago sativa) , arroz { Oryza sativa) , centeno { Sécale cereale) , sorgo {Sorghum bicolor, Sorghum vulgare) , girasol {Helianthus annuus) , trigo { Tri ticum aestivum) , soya { Glycine max) , tabaco {Nicotiana tabacum) , papa {Solanum tuberosum) , cacahuate {Arachis hypogaea) , algodón { Gossypi um hirsutum) , papa dulce { Ipomoea bata tus) , mandioca {Manihot esculenta) , café { Cofea spp. ) , coco { Cocos nucífera) , piña { ananas comosus) , árboles cítricos { Ci trus spp) , cacao { Theobroma cacao) , té { Camellia sinensis) , plátano {Musa spp . ) , aguacate { Persea americana) , higo { Ficus casica) , guayaba { Psidium guajava) , mango {Mangifera índica) , olivo { Olea europaea) , avena {Avena sativa) , vegetables, ornamentales, y coniferas. Preferiblemente, los vegetales incluyen cebada, maíz, soya, girasol, cártamo, cañóla, trigo, centeno, alfalfa y sorgo. Las secuencias promotoras de otros vegetales pueden aislarse de acuerdo a técnicas bien conocidas basadas en su homología de secuencia a la secuencia promotora establecida en la presente. En estas técnicas, toda o parte de la secuencia promotora conocida se usa como una sonda la cual hibridiza selectivamente a otras secuencias presentes en una población de fragmentos de ADN genómicos clonados (es decir, bibliotecas genómicas) de un organismo elegido. Los métodos están fácilmente disponibles en la técnica para la hibridización de las secuencias de ácido nucleico. La secuencia promotora completa o porciones de la misma pueden utilizarse como una prueba capaz de hibridizar específicamente a secuencias promotoras correspondientes. Para lograr la hibridización específica bajo una variedad de condiciones, tales sondas incluyen secuencias que son únicas y son preferiblemente por lo menos aproximadamente 10 nucleótidos en longitud, y más preferiblemente por lo menos aproximadamente 20 nucleótidos en longitud. Tales sondas pueden utilizarse para amplificar secuencias promotoras correspondientes de un organismo elegido por el proceso bien conocido de la reacción de cadena polimerasa (PCR) . Esta técnica puede utilizarse para aislar las secuencias promotoras adicionales de un organismo deseado o como un ensayo diagnóstico para determinar la presencia de la secuencia promotora en un organismo. Ejemplos incluyen tamizar la hibridización de bibliotecas de ADN enchapadas (ya sea placas o colonias; ver por ejemplo Innis et al . , eds., (1990) PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press) . Los términos "condiciones severas" o "condiciones de hibridización severa" incluyen referencias en condiciones bajo las cuales una sonda hibridizará a su secuencia objetivo, a un grado detectablemente mayor que otras secuencias (por ejemplo, por lo menos 2-veces sobre la base) . Las condiciones severas son dependientes de secuencia objetivo y diferirán dependiendo en la estructura del polinucleótido. Al controlar la severidad de la hibridización y/o condiciones de lavado; las secuencias objetivo pueden identificarse las cuales son complementariamente 100° en una sonda (sondeo homólogo) . Alternativamente, las condiciones severas pueden ajustarse para permitir algún desequilibrio en secuencias de manera que los grados inferiores de similaridad se detectan (sondeo heterólogo) . Generalmente, las sondas de este tipo están en un rango de aproximadamente 1000 nucleótidos en longitud a aproximadamente 250 nucleótidos en longitud. Una guía extensa a la hibridización de los ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization wi th Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 "Overview of principies of hybridization and the strategy of nucleic acid probé assays", Elsevier, New York (1993) ; y Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Ausubel, et al . , Eds., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1995). Ver también Sambrook et al . (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.) . En general, las secuencias que corresponden a la secuencia promotora de la presente invención e hibridizan a la secuencia promotora descrita en la presente serán por lo menos 50% homologa, 70% homologa, y aún 85% homologa o más con la secuencia descrita. Esto es, la similaridad de secuencia entre la sonda y el objetivo puede variar, compartiendo por lo menos aproximadamente 50": , aproximadamente 70%, y aún aproximadamente 85% de similaridad de secuencia.

La especificidad es normalmente la función de lavados post-hibridización, siendo los_ factores críticos la resistencia iónica y la temperatura de la solución lavada final. Generalmente, las condiciones de temperatura de lavado severas se seleccionan para ser aproximadamente 5°C a aproximadamente 2°C inferior que el punto de fusión (Tm) para la secuencia específica en una resistencia y pH iónicos definidos. El punto de fusión, o desnaturalización, del ADN ocurre durante un rango de temperatura estrecho y representa la disrupción de la doble hélice dentro de sus únicas hebras complementarias. El proceso se describe por la temperatura del punto medio de transición, Tra, el cual es también llamado la temperatura de fusión. Las fórmulas están disponibles en la técnica para la determinación de las temperaturas de fusión. Las condiciones de hibridización preferidas para la secuencia promotora de la invención incluyen hibridización a 42°C en 50% (p/v) de formamida, 6 X de SSC, 0.5% (p/v) de SDS, 100 µg/ml de ADN de esperma de salmón. Las condiciones inferiores de lavado severas ejemplares incluyen la hibridización a 42°C en una solución de 2X de SSC, 0.5% (p/v) de SDS durante 30 minutos y repitiendo. Las condiciones severas moderadas ejemplares incluyen un lavado en 2X de SSC, 0.5% (p/v) de SDS a 50°C durante 30 minutos y repitiendo. Las condiciones severas elevadas ejemplares incluyen un lavado en 2X de SSC, 0.5^ (p/v) de SDS, a 65°C durante 30 minutos y repitiendo. Las secuencias que corresponden al promotor de la presente invención pueden obtenerse utilizando todas las condiciones anteriores. Para propósitos de definir la invención, se utilizan las condiciones severas elevadas. Los métodos de alineamiento de secuencias para comparación son bien conocidos en la técnica. El alineamiento óptimo de secuencias para comparación puede conducirse por el algoritmo de homología local de Smith and Waterman, Adv. Appl . Math . 2:482 (1981); por el algoritmo de alineamiento de homología de Needleman and Wunsch, J. Mol . Biol . . 48: 443 (1970) ; por la búsqueda para el método de similitud de Pearson and Lipman, Proc. Nati . Acad. Sci . 85:2444 (1988); por implementaciones co putarizadas de estos algoritmos, incluyendo, pero no limitado a: CLUSTAL en el programa PC/Gene por Intelligenetics, Mountain, View, California; GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA en the Wisconsin Genetics Software Package; Genetics Computer Group (GCG) , 575 Science Dr., Madison, Wisconsin, USA; el programa CLUSTAL se describe bien por Higgins and Sharp, Gene 73: 237-244 (1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5: 151-153 (1989); Corpet, et al . , Nucleic Acids Research 16: 10881-90 (1988); Huang, et al . , Computer Applications in the Biosciences 8: 155-65 (1992), y Pearson, et al . , Methods in Molecular Biology 24:307-331 (1994).

Los fragmentos de secuencia con identidad de elevado porcentaje a la secuencia de la presente invención también se refieren a aquellos fragmentos de una secuencia de nucleótido promotora particular descrita en la presente que opera para promover la expresión preferida de semilla de una secuencia de nucleótido heteróloga operablemente unida. Estos fragmentos comprenderán por lo menos aproximadamente 20 nucleótidos contiguos, preferiblemente por lo menos aproximadamente 50 nucleótidos contiguos, más preferiblemente por lo menos aproximadamente 75 núcleotidos contiguos, aún más preferiblemente por lo menos aproximadamente 100 nucleótidos contiguos de la secuencia de nucleótido promotora particular descrita en la presente. Los nucleótidos de tales fragmentos usualmente comprenderán la secuencia de reconocimiento TATA de la secuencia promotora particular. Tales fragmentos pueden obtenerse por el uso de las enzimas de restricción para desdoblar las secuencias de nucleótido promotoras que ocurren naturalmente descritas en la presente; sintetizando una secuencia de nucleótido a partir de la secuencia de ADN promotora que ocurre naturalmente; o puede obtenerse a través del uso de tecnología PCR. Ver particularmente, Mullis et al . (1987) Methods Enzymol . 155:335-350, y Erlich, ed. (1989) PCR Technology (Stockton Press, New York) . Nuevamente, variantes de estos fragmentos promotores, tales como aquellos que resultan de la mutagénesis dirigida del sitio, se abarcan por las composiciones de la presente invención. Se abarcan las secuencias de nucleótido que comprenden por lo menos aproximadamente 20 secuencias contiguas de la secuencia establecida en la SECUENCIA DE IDENTIDAD NO: 1. Estas secuencias pueden aislarse por hibridización, PCR, y similares. Tales secuencias abarcan fragmentos capaces de dirigir la expresión preferida de semilla, fragmentos útiles como sondas para identificar secuencias similares, así como elementos responsables para especificidad temporal o de tejido. Las variantes biológicamente activas de la secuencia promotora se abarcan también por la composición de la presente invención. Una "variante" reguladora es una forma modificada de una secuencia reguladora en donde una o más bases han sido modificadas, removidas o agregadas. Por ejemplo, una manera rutinaria para remover parte de una secuencia de ADN es para utilizar una exonucleasa en combinación con la amplificación de ADN para producir eliminaciones nidificadas unidireccionales de los clones de ADN dobles trenzados. Un equipo comercial para este propósito es vendido bajo el nombre comercial Exo-Size™ (New England Biolabs, Beverly, Mass.). Brevemente, este procedimiento implica la incubación de exonucleasa III con ADN para remover progresivamente nucleótidos en, la dirección 3' a 5' en proyecciones 5' , extremos o muescas despuntados en la plantilla de ADN. Sin embargo, la exonucleasa III es incapaz de remover nucleótidos en las proyecciones 3', de base 4. La digestión cronometrada de un clon con esta enzima produce eliminaciones nidificadas unidireccionales. Un ejemplo de una variante de secuencia reguladora es un promotor formado por una o más eliminaciones a partir de un promotor extenso. La porción 5' de un promotor hasta la caja TATA cerca del sitio de inicio de transcripción puede eliminarse sin cancelar la actividad promotora, como se describió por Zhu et al . , The Plant Cell 7: 1681-89 (1995). Tales variantes deben retener la actividad promotora, particularmente la capacidad para dirigir la expresión en semilla o tejidos de semilla. Las variantes biológicamente activas incluyen, por ejemplo, las secuencias promotoras nativas de la invención que tienen una o más sustituciones, eliminaciones o inserciones de nucleótido. La actividad promotora puede medirse por análisis Northern blot, mediciones de actividad reportera cuando se utilizan fusiones transcripcionales, y similares. Ver, por ejemplo, Sambrook et al . (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.), incorporada en la presente para referencia. La secuencia de nucleótido para el promotor de la invención, así como fragmentos y variantes del mismo, pueden proporcionarse en casetes de expresión junto con secuencias de nucleótido heterólogas para la expresión en el vegetal de interés, más particularmente en la semilla del vegetal. Tal cásete de expresión se proporciona con una pluralidad de sitios de restricción para inserción de la secuencia de nucleótido para estar bajo la regulación transcripcional del promotor. Estos casetes de expresión son útiles en la manipulación genética de cualquier vegetal para lograr una respuesta fenotípica deseada. Los genes de interés expresados por el promotor de la invención pueden utilizarse variando el fenotipo de las semillas. Esto puede lograrse incrementando la expresión de productos endógenos o exógenos en semillas. Alternativamente, los resultados pueden lograrse proporcionando para una reducción de expresión de uno o más productos endógenos, particularmente enzimas o cofactores en la semilla. Estas modificaciones pueden resultar en un cambio en el fenotipo de la semilla transformada. Las categorías generales de genes de interés para el propósito de la presente invención incluyen, por ejemplo aquellos genes implicados en la información, tales como dedos de Zinc, aquellos implicados en la comunicación, tales como cinasas, y aquellos implicados en eX cuidado de la casa, tales como proteínas de choque caliente. Categorías más específicas de transgenes incluyen genes que codifican rasgos importantes para calidad agronómica, resistencia a insectos, resistencia a enfermedad, resistencia a herbicida, y características de grano. Aún otras características de transgenes incluyen genes para inducir la expresión de productos exógenos tales como enzimas, " cofactores, y hormonas de vegetales y otros eucariotes así como organismos procarióticos. Se reconoce que cualquier gen de interés, incluyendo la secuencia de codificación nativa, puede unirse operablemente al promotor de la invención y expresarse en la semilla. Las modificaciones que afectan los rasgos de grano incluyen alterar los niveles de ácidos grasos saturados y no saturados. Así mismo, incrementando los niveles de aminoácidos que contienen lisina y azufre pueden desearse, así como modificaciones de la cantidad y/o tipo de almidón contenido en la PCT/US94/382 presentada el 10 de abril de 1997; PCT/US96/08219 presentada el 26 de marzo de 1997; PCT/US96/08220 presentada el 26 de marzo de 1997 y la Patente Norteamericana No. 5,703,409, expedida el 30 de diciembre de 1997; las descripciones de las cuales se incorporan en la presente para referencia. Ejemplos adicionales son proteínas de semilla rica en lisina y/o azufre codificadas por la albúmina 2S de soya descrita en PCT/US97/04409 presenta el 20 de marzo de 1996, y el inhibidor de quimotripsina de cebada, Williamson et al . (1987) Eur. J. Biochem. 165:99-106, las descripciones de las cuales se incorporan para referencia. En una modalidad más preferida, el promotor de la presente invención modula genes que codifican proteínas las cuales actúan como reguladores de ciclo celular, o los cuales controlan el metabolismo de carbohidrato o niveles de fitohormona, como ha sido mostrado en tabaco y cañóla con otros promotores seleccionados de tejido. (Ma, Q.H., et al., (1998) Australian Journal of Plant Physiology 25(1): 53-59; Roeckel, P., et al., (1997) Transgenic Research 6(2):133-141) . La expresión de los nucleótidos endógenos o heterólogos bajo la dirección del promotor puede resultar en el mantenimiento de un fenotipo de semilla deseable bajo condiciones ambientales adversas. Los derivados de los siguientes genes pueden hacerse por mutagénesis dirigida de sitio para incrementar el nivel de aminoácidos preseleccionados en el polipéptido codificado. Por ejemplo, el gen que codifica el polipéptido de lisina elevado de cebada (BHL) , se deriva del inhibidor de quimotripsina de cebada, PCT/US97/20441 presentada el 1 de noviembre de 1996 y PCT/US97/20441 presentada el 31 de octubre de 1997; las descripciones de cada una se incorporan en la presente para referencia. Otras proteínas incluyen proteínas vegetales ricas en metionina tales como semilla de girasol, Lilley et al . (1989) Proceedings of the World Congress on Vegetable Protein Utilization in Human Foods and Animal Feedstuffs, Applewhite, H. (ed.); American Oil Chemists Soc., Champaign, IL: 97-502, incorporada en la presente para referencia; maíz, Pedersen et al . (1986) J. Bdol . . Chem. 261-6279; Kirihara et al . (1988) Gene 71:359, ambas incorporadas en la presente para referencia; y arroz, Musumura et al (1989) Plant Mol. Biol. 12:123 incorporada en la presente para referencia. Otros genes importantes que codifican látex, Floury 2, factores de_ crecimiento, factores de almacenamiento de semilla y factores de transcripción. Los rasgos agronómicos en semillas pueden mejorarse alterando la expresión de genes que afectan la respuesta del crecimiento y desarrollo de la semilla durante la tensión ambiental, Cheikh-N et al . , (1994) Plant Physiol . 106(1) :45-51, y genes que controlan el metabolismo de carbohidrato para reducir el aborto de semilla en maíz, Zínselmeier et al . (1995) Plant Physiol . 107 (2) : 385-391. Los genes de resistencia de insectos pueden codificar resistencia a plagas que tienen mayor obstáculo de producción tal como gusano de raíz, gusano de corte, European Corn Borre, y similares. Tales genes incluyen, por ejemplo, genes de endotoxina de Bacillus thuringiensis, Patentes Norteamericanas Nos. 5,366,892; 5,747,450; 5,737,514; 5,723,756; 5,593,881; Geiser et al . (1986) Gene 48:109; lecitinas, Van Damme et al . (1994) Plant Mol . Biol . 24:825; y similares . Los genes que codifican rasgos resistentes a la enfermedad incluyen genes de destoxificación, tales como contra fumonosina (PCT/US95/10284 presentada el 7 de junio de 1995) ; avirulencia (avr) y genes de resistencia a enfermedad (R) Jones et al. (1994) Science 266:789; Martín et al . (1993) Science 262:1432; Mindrinos et al . (1994) Cell 78:1089; y similares . Las alteraciones en la expresión del gen pueden también afectar el tipo o cantidad de productos de interés comercial; por ejemplo almidón para la producción de papel, textiles y etanol. Otro uso comercial importante de vegetales transformados es la producción de polímeros y bioplásticos tales como se describen en la Patente Norteamericana No. 5,602,321, expedida el 11 de febrero de 1997. Los genes tales como B-Ketotiolasa, PHBase (polihidroxibutirato sintasa) y acetoacetil-CoA "reductasa (ver Schubert et al . (1988) J. Bacteríol 170 (12) : 5837-5847) facilita la expresión de polihidroxialcanoatos (PHAs) . La secuencia de nucleótido unida operablemente al promotor descrito en la presente puede ser una secuencia antisentido para un gen objetivo. Por "secuencia de nucleótido de ADN antisentido" se pretende una secuencia que es una orientación inversa en la orientación normal 5' -a-3' de aquella secuencia de nucleótido. Cuando se suministra en una célula vegetal, la expresión de la secuencia de ADN antisentido impide la expresión normal de la secuencia de nucleótido de ADN para el gen objetivo. La secuencia de nucleótido antisentido codifica una transcripción de ARN que es complementaria a, y capaz de hibridizar con el ARN mensajero endógeno (ARNm) producido por la transcripción de la secuencia de nucleótido de AD? para el gen objetivo. En este caso, la producción de la proteína nativa codificada por el gen objeto se inhibe para lograr una respuesta fenotípica deseada. De esta manera la secuencia promotora descrita en la presente puede unirse operablemente a secuencias de AD? antisentido para reducir o inhibir la expresión de una proteína nativa en la semilla del vegetal. El cásete de expresión también incluirá en el término 3' de la secuencia de nucleótido heteróloga de interés, una región de terminación transcripcional y transnacional funcional en vegetales. La región terminal puede ser nativa con la secuencia de nucleótido promotora de la presente invención, puede ser nativa con la secuencia de AD? de interés, o puede derivarse de otra fuente. Las regiones de terminación convenientes .están disponibles del plásmido Ti de A. tumefaciens, tal como las regiones de terminación de octopina sintasa y nopalína sintasa. Ver también, Guerineau et al . (1991) Mol . Gen. Genet . 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon et al . (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen et ai. (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe et al . (1990) Gene 91:151-158; Bailas et al . 1989) Nucleic Acids Res . 17:7891-7903; Joshi et al . (1987) Nucleic Acid Res . 15:9627-9639. Los casetes de expresión pueden contener adicionalmente 'secuencias líderes 5' . Tales secuencias líderes pueden actuar para mejorar la traducción. Los líderes de traducción se conocen en la técnica e incluyen: líderes de picornavirus, por ejemplo, líder EMCV (región 5' de Encephalomyocarditis no codificada), Elroy-Stein et al . (1989) Proc. Nat . Acad. Sci . USA 86:6126-6130; líderes potivirus, por ejemplo, líder TEV (Tobacco Etch Virus) , Allison et al . (1986); líder MDMV (Maize Dwarf Mosaic Virus), Virology 154:9-20; proteína de enlace de cadena pesada de in unoglobina humana (BiP) , Macejak et ai. (1991) Nature 353:90-94; líder no traducido del ARNm de proteína recubierta del virus mosaico de alfalfa (AMV RNA 4), Jobling et al . (1987) Nature 325: 622-625) ; líder del virus de mosaico de tabaco (TMV), Gallie et al . (1989) Molecular Biology of RNA, páginas 237-256; y líder del virus moteado clorótico de maíz (MCMV) Lommel et al . (1991) Virology 81:382-385. Ver también Della-Cioppa et al . (1987) Plant Physiology 84:965-968. El cásete puede también contener secuencias que mejoran la traducción y/o estabilidad de ARNm tales como intrones.

En aquellos casos en donde se desea tener el producto expresado de la secuencia de nucleótido heteróloga dirigida a un organelo particular, particularmente el plásmido, amiloplasto, o al retículo endoplásmico, o secretado en la superficie de la célula o extracelularmente, el cásete de expresión puede además comprender una secuencia de codificación para un péptido de tránsito. Tales péptidos de tránsito son bien conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, el péptido de tránsito para la proteína portadora de acilo, la subunidad pequeña de RUBISCO, vegetal EPSP sintasa, y similares. Al preparar el cásete de expresión, los diversos fragmentos de ADN pueden manipularse, de manera que se proporcionan para las secuencias de ADN en la orientación adecuada y, como es apropiada, en el marco de lectura apropiado. Hacia este fin, los adaptadores o enlazadores pueden emplearse para unir los fragmentos de ADN u otras manipulaciones pueden implicarse para proporcionar sitios de restricción convenientes, remoción de ADN suplerfluo, remoción de sitios de restricción, o similares. Para este propósito, la mutagénesis in vitro, reparador del cebador, extractos de restricción, templado y resustituciones, tales como transiciones y transversiones, pueden implicarse. Como se observó en la presente, la presente invención proporciona vectores capaces de expresar genes de interés bajo el control del promotor. En general, los vectores deben ser funcionales en células vegetales. A veces, puede ser preferible tener vectores que son funcionales en E. coli (por ejemplo, producción de proteína elevando anticuerpos, análisis de secuencia de ADN, construcción de insertos, obteniendo cantidades de ácidos nucleicos) . Los vectores y procedimientos para clonación y expresión en E. coli se discuten en Sambrook et al . (supra) . El vector de transformación que comprende la secuencia promotora de la presente invención unido operablemente a una secuencia de nucleótido heterólogo en un cásete de expresión, puede también contener por lo menos una secuencia de nucleótido adicional para un gen para co-transformarse en el organismo. Alternativamente, las secuencias adicionales pueden proporcionarse en otro vector de transformación. Los vectores que son funcionales en vegetales pueden ser plásmidos binarios derivados de Agrobacterium. Tales vectores son capaces de transformar células vegetales. Estos vectores contienen secuencias de bordes izquierdo y derecho que se requieren para la integración dentro del cromosoma huésped (vegetal) . Como mínimo, entre estas secuencias de borde es el gen para expresarse bajo el control del promotor. En las modalidades _ preferidas, un marcador seleccionable y un gen reportero se incluyen también. Para facilidad de obtener cantidades suficientes del vector, se prefiere un origen bacterial que permite la replicación en E. coli. Los genes reporteros pueden incluirse en los vectores de transformación. Ejemplos de genes reporteros adecuados conocidos en la técnica pueden encontrarse en, por ejemplo, Jefferson et al. (1991) en Plant Molecular Biology Manual, ed. Gelvin et al. (Kluwer Academic Publishers), pp. 1-33; DeWet et al. (1987) Mol. Cell. Biol. 7:725-737; Goff et al. (1990) EMBO J. 9:2517-2522; Kain et al. (1995) BioTechniques 19:650-655; y Chiu et al. (1996) Current Biology 6:325-330. Los genes marcadores seleccionables para la selección de células o tejidos transformados pueden incluirse en los vectores de transformación. Estos pueden incluir genes que confieren resistencia antibiótica o resistencia a herbicidas. Ejemplos de genes marcadores seleccionables adecuados incluyen, pero no se limitan a, genes que codifican resistencia a cloranfenicol, Herrera Estrella et al. (1983) EMBO J. 2:987-992; metotrexato, Herrera Estrella et al. (1983) Nature 303:209-213; Meijer et al. (1991) Plant Mol.

Biol.. 16:807-820; higromicina, Waldron et al. (1985) Plant Mol. Biol.. 5:103-108; Zhijian et al. (1995) Plant Science 108:219-227; estreptomicina, Jones et al. (1987) Mol. Gen. Genet. 210:86.91; espectinomicina, Bretagne-Sagnard et al. (1996) Transgenic Res . 5:131-137; bleomicina, Hille et al . (1990) Plant Mol . Biol . 7:171-176; sulfonamida, Guerineau et al . (1990) Plant Mol . Biol . 15:127-136; bromoxinil, Stalker et al . (1988) Science 242:419-423; glifosato, Shaw et al . (1986) Science 233:478-481; fosfinotricina, DeBlock et al. (1987) EMBO J. 6:2513-2518. Otros genes que podrían servir de utilidad en la recuperación de eventos transgénicos, pero no podrían requerirse en el producto final incluirían, pero no se limitan a, ejemplos tales como GUS (ß-glucuronidasa) , Jefferson (1987) Plant Mol . Biol . Rep. 5:387); GFP (proteína fluorescente verde), Chalfie et al . (1994) Science 264:802; luciferasa, Teeri et al . (1989) EMBO J. 8:343; y los genes de maiz que codifican para la producción de antocianina, Ludwig et al . (1990) Science 247:449. El vector de transformación que comprende la secuencia promotora particular de la presente invención, unido operablemente a una secuencia de nucleótido heteróloga de interés en un cásete de expresión, puede utilizarse para transformar cualquier vegetal. En esta forma, los vegetales genéticamente modificados, células vegetales, tejido vegetal, semilla, y similares pueden obtenerse. Los protocolos de transformación pueden variar dependiendo del tipo vegetal o célula vegetal, es decir, monocotiledónea o dicotiledónea, objetivos para transformación. Los métodos adecuados para transformar células vegetales incluyen microinyección. Crossway et al. (1986) Biotechniques 4:320-334; electroporación, Riggs et al. (1986) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 83:5602-5606; transformación mediada por Agrobacterium, ver por ejemplo, Townsend et al. Patente Norteamericana 5,563,055; transferencia de gen directo, Paszkowski et al. (1984) EMBO J. 3:2717-2722; y aceleración de partícula balística, ver por ejemplo, Sanford et al. Patente Norteamericana 4,945,050; Tomes et al. (1995) en Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg and Philips (Springer-Verlag, Berlin); y McCabe et ai. (1988) Biotechnology 6:923-926. También ver Weissinger et al. (1988) Annual Rev. Genet. 22: 421-477 ; Sanford et al. (1987) Particulate Science and Technology 5:27-37 (onion); Christou et al. (1988) Plant Physiol. 87:671-674 (soya); McCabe et al. (1988) Bio/Technology 6:923-926 (soya); Datta et al. (1990) Biotechnology 8:736-740 (arroz); Klein et al. (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:4305-4309 (maíz); Klein et al. (1988) Biotechnology 6:559-563 (maíz); Klein et al. (1988) Plant Physiol. 91:440-444 (maíz); Fromm et al. (1990) Biotechnology 8:833-839; Hooydaas-Van Slogteren et al. (1984) Nature (London) 311:763-764; Bytebier et al. (1987) Proc. Nati.

Acad. Sci. USA 84:5345-5349 (Liliaceae) ; De Wet et al. (1985) en The Experimental Manipulation of Ovule Tisuues, ed. G.P. Chapman et al. (Longman, New York), pp. 197-209 (pollen) ; Kaeppler et al . (1990) Plant Cell Reports 9:415-418; y Kaeppler et al . (1992) Theor. Appl . Genet . 84:560-566 (transformación mediada por bigotes); D. Halluin et al . (1992) Plant Cell 4:1495-1505 (electroporación); Li et al . (1993) Plant Cell Reports 12:250-255 y Christou et al . (1995) Annals of Botany 75:407-413 (arroz); Osjoda et al . (1996) Nature Biotechnology 14:745-750 (maíz a través de Agrobacterium tumefaciens) ; todas de las cuales se incorporan en la presente para referencia.. Las células que han sido transformadas pueden desarrollarse en vegetales de acuerdo con formas convencionales. Ver, por ejemplo, McCormick et al . (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Estos vegetales pueden entonces desarrollarse, y polinizarse con la misma cepa transformada o cepas diferentes. El híbrido resultante que tiene expresión de semilla seleccionada de la característica fenotípica deseada puede entonces identificarse. Dos o más generaciones pueden desarrollarse para asegurar que la expresión de semilla seleccionada de la característica fenotípica deseada se mantiene establemente y se hereda. Los siguientes ejemplos se proponen a manera de ilustración y no a manera de limitación. EJEMPLOS El gen estructural Nucí de cebada se aisló previamente y caracterizó por Doan et al . (Plant Molecular Biology 31:877-886, 1996). Los siguientes ejemplos describen el aislamiento y clonación del promotor Nuclc. de cebada y la prueba de su actividad en maíz. Ejemplo 1: Aislamiento del Promotor Nuclc: Se diseñaron tres cebadores basados en la secuencia de ARNm Nucí (Acceso Genbank Z69632) : SEC. ID. No. 2 CACTCGCAGGCGTAGTCGGAGAACTC SEC. ID. No. 3 TGCAGGCGGTAAGTGCGTCCTTCCT SEC. ID. No. 4 TACCGGCGCACTTGATCTTGCAGAGCCA Los cebadores y AND genómico de cebada se usaron en unión con el Equipo GenomeWalker (Clontech) para aislar el promotor. El protocolo de los fabricantes se siguió y aproximadamente 1.3 Kb de la secuencia 5' se obtuvo. El análisis de la secuencia corriente arriba reveló motivos de elemento de control obvios. Un fragmento 1-Kb aproximadamente de la secuencia corriente arriba 5' , inicio en la primer metionina de la secuencia de codificación de cebada, se aisló entonces. Dos cebadores (SEC. ID. No. 5: CCCAAGCTTTACGTTTGAGACGTATCATGTCG y SEC. ID. No. 6: CGGGATCCCGCTCCTTGCTCGTGCTGGCGAAG) con sitios de restricción se diseñaron y el PCR se utilizó para aislar el fragmento utilizando técnicas conocidas por aquellos de experiencia en la técnica. El fragmento fue 1091 bp de longitud (SEC DE ID NO. 1), y se diseñó Nuclc. El ?DN se insertó en un vector de transformación (ver Ejemplo 2, siguiente) . La construcción se transformó en maíz y las vegetales se utilizaron para evaluar la actividad promotora. Ejemplo 2: Resumen de Expresión para Promotor Nuclc: La cepa Agrobacteri um utilizada en este ejemplo se modificó para contener ácido nucleico que codifica el promotor Nuclc y un gen reportero GUS para expresarse en las células transformadas. El ácido nucleico a ser transferido se incorporó en la región T y se flanqueó por al menos una secuencia de borde ADN-T. En el plásmido Ti, la región T es distinta de la región vir cuyas funciones son responsables para la transferencia e integración. Los sistemas de vector binario han sido desarrollados donde el ADN-T desactivado manipulado que porta el ADN extraño y las funciones vir se presentan en plásmidos separados. De esta manera, una región de ADN-T que comprende ADN extraño (el ácido nucleico a ser transferido) se construye en un plásmido pequeño el cual replica en E. coli . Este plásmido se transfiere conjugativamente en un c apareamiento tri-parental en A. tumefaciens el cual contiene un gen de virulencia que porta plásmido compatible. Las funciones vir se suministran en trans para transferir el ADN- T en el genoma vegetal . Los vectores preferidos son vectores super-binarios . Ver, por ejemplo, Patente Norteamericana No. 5,591,616 y EPA 0604662A1, incorporada en la presente para referencia. Tal vector super-binario se ha construido conteniendo una región de ADN que se origina a partir de la región de virulencia del plásmido Ti pTiBo542 (Jin et al . (1987) J. Bacteriol 169: 4411-4425 ) contenida en un Agrobacterium tumefaciens A281 super virulento que exhibe eficiencia de transformación extremadamente elevada (Hood et al . (1984) Biotechnol . 2:702-709; Hood et al . (1986) J. Bacteriol . 168: 1283-1290 ; Komari et al . (1986) J. Bacteriol . 166: 88-94 ; Jin et al . (1987) J. Bacteriol . 169 : 4411-4425 ; Komari T. (1989) Plant Science 60:223-229; Acceso ATCC No. 37394) . Los vectores super-binarios se conocen en la técnica e incluyen pTOK162 (Solicitud de Patente Japonesa (Kokai) No. 4-222527, EP-A-504, 869, EP-A-604, 662, y Patente Norteamericana No. 5,591,616 incorporada en la presente para referencia) y pTOK233 (Komari, T. (1990) Plant Cell Reports 9:303-306; e Ishida et al . (1996) Nature Biotechnology 14 : 145 ; incorporada en la presente para referencia). Otros vectores super-binarios pueden construirse por los métodos establecidos en las referencias anteriores. Por ejemplo, el vector super-binario pTOK162 es capaz de replicación en E. coli y en A. tumefaciens . Adicionalmente, el vector contiene los genes virB, virC y virG a partir de la región de virulencia de pTiBo542. El plásmido también contiene un gen de resistencia antibiótico, un gen marcador seieccionable, y el ácido nucleico de interés para ser transformado en el vegetal. La región T de los vectores super-binarios y otros vectores para uso en la expresión del gen se construyen para tener sitios de restricción para la inserción de los genes a ser suministrados. Alternativamente, el ADN a ser transformado puede insertarse en la región de ADN-T del vector utilizando recombinación homologa in vivo . Ver, Herrera-Esterella et al . (1983) EMBO J. 2:987-995; Horch et ai. (1984) Science 223:496-498). Se cree en el hecho de la recombinación homologa que el vector super-binario tiene una región homologa con una región de pBR322 u otro plásmido similar. Así, cuando los dos plásmidos se reúnen en un gen deseado se inserta en el vector super-binario por recombinación genética a través de las regiones homologas. Los vectores de este ejemplo se construyen utilizando técnicas de biología molecular estándar conocidas por aquellos de experiencia ordinaria en la técnica. Un gen reportero y un gen marcador seleccionable se insertaron entre los bordes de ADN-T de un vector superbinario . El gen reportero fue el gen ß-glucorinadasa (GUS) (Jefferson, R.A. et al., 1986 Proc . Nati . Acad. Sci . (USA) 83:8447-8451) dentro de cuya región de codificación se insertó el segundo intron a partir del gen ST-LS1 de papa (Vancanneyt et al., Mol . Gen . Genet . 220:245-250, 1990), para producir el intron-GUS, para evitar la expresión del gen en Agrobacterium (ver Ohta, S. et al., 1990, Plant Cell Physiol . 31 ( 6) : 805-813) . Un fragmento que contiene bases 2 a 310 a partir del terminador del gen inhibidor de proteinasa de papa (pinll) (An et al., Plant Cell 1:115-122, 1989) fue el extremo despuntado corriente debajo de la secuencia de codificación GUS, para crear el cásete expresión GUS. Para el marcador seleccionable, un promotor de Virus 35S Mosaico de Coliflor con una región mejoradora duplicada (2X35S; bases -421 a -90 y -421 a +2 de Gardner et al., Nucí . Acids Res . 9:2871-2888, 1981) se creó. Un fragmento que contiene secuencia líder Omega-cebadora (Gallie, D.R., et aJ . , 1987, Nucleic Acids Research 15 (8) : 3257-3273) se insertó corriente . abajo del promotor 35S seguida por un fragmento que contiene el primer intron del gen ADH1-S de deshidrogenasa de alcohol de maíz (Dennis et al., Nucí . Acids Res . 12:3983-3990, 1984). La secuencia de codificación BAR (Thompson et al., EMBO J. 6:2519-2523, 1987) se clonó corriente debajo de la secuencia líder, con el terminador pinll ligado corriente debajo de BAR, para crear el cásete de expresión BAR. En resumen, el plásmido se construyó insertando el cásete de expresión GUS y el cásete de expresión BAR entre los bordes de ADN-T derecho e izquierdo en pSBll. El cásete GUS se insertó próximo al borde ?e ADN-T derecho. El fragmento promotor Nuclc se insertó en el vector en frente del gen GUS-intron. El plásmido pSBll se obtuvo a partir de Japan Tobacco Inc. (Tokio, Japan) . La construcción de pSBll de pSB21 y la construcción de pSB21 a partir de vectores iniciales se describió por Komari et al. (1996, Plant J. 10:165-174). El 7?ND-T de este plásmido se integró en el plásmido superbinario pSBl (Saito et al., EP 672 752 Al) por recombinación homologa entre los dos plásmidos. El plásmido pSBl se obtuvo también de Japan Tobacco Inc. La cepa E. coli HB101 que contiene el plásmido que contiene el promotor Nuclc se apareo con la cepa Agrobacterium LBA4404 albergando pSBl para crear el plásmido co-integrado en la cepa Agrobacterium tumefaciens LBA4404 utilizando el método de Ditta et al., { Proc. Nati . Acad. Sci . USA 77;7347-7351, 1980). { Ver también, Solicitud de Patente No. 08/788,018, Publicación WO No. 98/32326, para una discusión adicional de la transformación mediada por Agrobacterium, incorporada en la presente para referencia) . El plásmido co-integrado resultante, el producto del apareamiento tri-parental descrito anteriormente, se transformo en los genotipos (1) Hi-II y (2) Hi-II x PHN46. (Ver, Patente Norteamericana No. 5,567,861 para mayor información acerca de PHN46) . Las vegetales T0 se generaron y el análisis promotor se condujo en la semilla Tl a partir de ambos genotipos.

Los granos inmaduros de 21 casos transgénicos se recolectaron en intervalos específicos después de la polinización, iniciando en 0 DAP y extendiéndose a 20 DAP. Cada grano se analizó verticalmente de cicatriz de seda a pedículo y se examinó por tinción histoquímica. Específicamente, cada sección se incubó en una solución de regulador de fosfato de sodio 0.1 M, pH 7.0, conteniendo 0.5 % de X-gluc (ácido 5-bromo-4-cloro-3-indolil-ß-D-glucurónico, sal sódica, primero disuelta en DMSO) y 0.1% de Tritón X-100. Las secciones se incubaron durante la noche a 37 °C. Más casos inicialmente exhibieron la expresión GUS en la cicatriz de seda, pedículo o región funicular hiliar placentaria (<3DAP) , entonces la expresión se ubicó principalmente en la mitad inferior de la región del núcelo y pedículo (3 DAP a 12 DAP) La expresión GUS se volvió no detectable tiñendo después de 12 DAP en más casos. Las sedas, cascarillas, follajes y raíces se analizaron también, y ninguna expresión consistente se observó en ninguno de estos tejidos. El tejido y especificidad temporal del promotor se confirmó en la generación subsecuente. Todas las publicaciones y solicitudes de patente mencionadas en la especificación son indicativas del nivel de aquellos expertos en la técnica a los cuales esta invención pertenece. Todas las publicaciones y solicitudes de patente se incorporan en la presente para referencia al mismo alcance como si cada publicación individual o solicitud de patente se incorporara específica e individualmente para referencia. Aunque la invención anterior ha sido descrita en algún detalle a manera de ilustración y ejemplo para propósitos de claridad de entendimiento, será obvio que ciertos cambios y modificaciones pueden practicarse dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. Depósito Los plásmidos que contienen secuencias de polinucleótido de la invención se depositaron el 29 de junio del 2000, con the American Type Culture Collection (ATCC) , 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia USA, 20110-2209, y No. de Acceso asignado PTA-2176. Este depósito será mantenido bajo los términos del Tratado de Budapest en el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para los Propósitos del Procedimiento de Patente. Además, durante la dependencia de esta solicitud de patente, el acceso a los cultivos depositados será disponible al Comisionado de Patentes y Marcas y a personas determinadas por el Comisionado a ser nominado en la misma bajo 37 C.F.R. § 114 y 35 U.S.C. § 122. Este depósito se hace simplemente como una conveniencia por aquellos de experiencia en la técnica y no es una admisión que un depósito se requiere bajo 35 U.S.C. § 112. Todas las restricciones impuestas por el depositante en la disponibilidad al público del material depositado serán eliminadas irrevocablemente en el otorgamiento de una patente. Sin embargo, debe entenderse que la disponibilidad de un depósito no constituye una licencia para practicar la invención objeto en derogación de derechos de patente concedidos por la acción del gobierno.

Claims (17)

REIVINDICACIONES 1. Un promotor aislado que es capaz de dirigir la transcripción en una forma preferida de la semilla, en donde tal promotor comprende un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste de: a) un polinucleótido que comprende una variante o fragmento funcional de por lo menos 20 nucleótidos contiguos de la secuencia establecida en la SECUENCIA DE IDENTIDAD NO.

1; b) un polinucleótido de la SEJC. DE ID. NO. 1; c) los polinucleótidos que tienen por lo menos 65% de identidad de secuencia a la SEC. ID. NO. 1, en donde la identidad de la secuencia por ciento se basa en la secuencia completa y se determina por análisis GAP bajo parámetros defectuosos; y d) cualquier polinucleótido, la hebra complementaria de la cual hibridiza a cualquiera de a) , b) o c) bajo condiciones severas, en donde las condiciones severas incluyen hibridización a 42°C en una solución de 50% (p/v) de formamida, 6X SSC, 0.5% de SDS, 100 µg/ml de esperma de salmón, lavando con 0.5% de SDS y 0. IX de SSC a aproximadamente 65°C durante 30 minutos y repitiendo.

2. Un polinucleótido de . conformidad con la reivindicación 1, aislado de cebada.

3. Un cásete de expresión que comprende un promotor de conformidad con la reivindicación 1, y una secuencia de nucleótido unida operablemente a tal promotor, caracterizado porque el promotor es capaz de iniciar la transcripción y expresión de la secuencia de nucleótido en una semilla de un vegetal transformada con el cásete de expresión.

4. Un vector de transformación que comprende un cásete de expresión de conformidad con la reivindicación 3.

5. Un vegetal, o sus partes, transformada establemente con un cásete de expresión de conformidad con la reivindicación 3.

6. Las partes del vegetal de conformidad con la reivindicación 5, caracterizadas porque las partes del vegetal se seleccionan del grupo que consiste de: células, protoplastos, cultivos de tejido celular, callosidades, aglomeraciones celulares, embriones, polen, óvulos, semillas, flores, granos, espigas, mazorcas, follajes, cascarillas, tallos, raíces, puntas de raíz, estambres y seda.

7. El vegetal de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque el vegetal es una monocotiledónea.

8. El vegetal de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque la monocotiledónea es maíz, cebada, trigo, avena, centeno, sorgo o arroz.

9. El vegetal de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque el vegetal es una dicotiledónea.

10. El vegetal de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la dicotiledónea es soya, alfalfa, cártamo, tabaco, girasol, algodón o cañóla.

11. Las semillas del vegetal de conformidad con la reivindicación 5.

12. Un método para expresar selectivamente una primera secuencia de nucleótido en una semilla vegetal, tal método comprende transformar un vegetal con un vector de transformación que comprende un cásete de expresión, el cásete de expresión comprende un promotor y una primera secuencia de nucleótido unida operablemente al promotor, en donde el promotor es capaz de iniciar la transcripción y expresión de la primera secuencia de nucleótido en una semilla de vegetal, en donde el promotor comprende una segunda secuencia de nucleótido seleccionada del grupo que consiste de: a) polinucleótidos que comprenden una variante o fragmento funcional de por lo menos 20 nucleótidos contiguos de la secuencia establecida en la SECUENCIA DE IDENTIDAD NO. 1; b) un polinucleótido de la SECUENCIA DE IDENTIDAD NO. 1; c) un polinucleótido que tiene por lo menos 65% de identidad de secuencia a la SECUENCIA DE IDENTIDAD NO. 1 en donde el % de identidad de secuencia se basa en la secuencia completa y se determina por análisis GAP bajo parámetros defectuosos; y d) un polinucleótido, el complemento del cual hibridiza a cualquiera de a) , b) o c) bajo condiciones severas.

13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la primera secuencia de nucleótido codifica un polipéptido implicado en el metabolismo de ácido graso.

14. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la primera secuencia de nucleótido codifica un polipéptido implicado en el metabolismo de la proteína.

15. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la primera secuencia de nucleótido codifica un polipéptido implicado en el metabolismo del carbohidrato .

16. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la primera secuencia de nucleótido codifica un polipéptido implicado en la biosíntesis de fitohormona.

17. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la primera secuencia de nucleótido codifica un polipéptido implicado en .la regulación del ciclo celular.