MXPA02003801A - Metodos para tratar o prevenir dano en celulas, tejidos y organos utilizando el factor inhibitorio progenitor de miloide-1 (mpfi-1) humano. - Google Patents

Abstract

Se describen composiciones terapeuticas y metodos que utilizan moleculas de acidos nucleicos aislados que codifican un polipeptido del factor inhibitorio progenitor de mieloide-1 (MPIF-1) humano (previamente llamado MIP-3 y quimosina beta-8 (Ckbeta-8 o ckb-8)), asi como el propio polipeptido MPIF-1, como son vectores, celulas huesped y metodos recombinantes para producir los mismos.

Description

/ MÉTODOS PARA TRATAR O PREVENIR DAÑO EN CÉLULAS, TEJIDOS Y ÓRGANOS UTILIZANDO EL FACTOR INHIBITORIO PROGENITOR DE MIELOIDE-1 (MPIF-1) HUMANO ANTECEDENTES DE LA INVENCION Campo de la Invención La presente invención se refiere a métodos novedosos para utilizar polipéptido factor inhibitorio progenitor de mieloide-1 humano (MPIF-1) (previamente denominado MIP-3 y quimosina QK8 o ckb-8)), así como polinucleótidos aislados que codifican MPIF-1. También se proporcionan vectores, células huésped y métodos recombinantes para producir M.PIF-1. Técnica Relacionada Las quimosinas, también referidas como intercrina citoquinas, son una subfamilia de citoquinas estructural y funcionalmente relacionadas. Estas moléculas tienen 8-14 kd de tamaño. En general, las quimosinas exhiben 20% a 75% de homología a nivel de aminoácido y se caracterizan por cuatro residuos cisteína conservados que forman dos enlaces bisulfuro. Con base en el arreglo de los dos primeros residuos cisteína, las quimosinas se han clasificado en dos subfamilias, alfa y beta. En la subfamilia alfa, las dos primeras cisteínas se separan por un aminoácido y por lo tanto se refieren como la subfamilia "C-X-C" . En la subfamilia beta, las dos cisteínas están en una posición adyacente y por lo tanto se refieren como la subfamilia -C-C- . De esta manera, al menos ocho diferentes miembros de esta familia se han identificado en humanos. Las intercrinas citoquinas exhiben una amplia variedad de funciones. Una característica distintiva, es su capacidad para producir migración quimiotáctica de distintos tipos de células incluyendo monocitos, neutrófilos, linfocitos T, basófilos y fibroblastos. Muchas quimosinas tienen actividad pre-inflamatoria y están involucradas en múltiples etapas durante una reacción inflamatoria. Estas actividades incluyen estímulo de liberación de histamina, enzima lisosomal y liberación de leucotrieno, incrementada adherencia de células inmune objetivo a células endoteliales, enlace mejorado de proteínas complemento, expresión inducida de moléculas de adhesión de granulocito y receptores complemento y estallido respiratorio. Además de su participación en inflamación, ciertas quimosinas se han mostrado que exhiben otras actividades. Por ejemplo, la proteína inflamatoria macrófago 1 (MIP-1) es capaz de suprimir proliferación de células básales hematopoyéticas el factor de plaquetas-4 (PF-4) es un inhibidor potente de crecimiento celular endotelial, interleucina- 8 (IL-8) promueve proliferación de queratinocitos, y GRO es un factor de crecimiento autócrino para células de melanoma. A la luz de las diversas actividades biológicas, no es sorprendente que las quimosinas estén implicadas en una cantidad de condiciones fisiológicas y de enfermedad, incluyendo tráfico de linfocitos, sanado de heridas, regulación hematopoyética y desordenes inmunológicos tales como alergia, asma y artritis. Un ejemplo de un regulador del linaje hematopoyético es IP-1. MIP-l originalmente se identificó como una citoquina pro-inflamatoria inducida por endotoxi?a producida a partir de macrófagos. Estudios subsecuentes han mostrado que MIP-1 está compuesto de dos diferentes pero relacionadas proteínas MIP-1 y MIP-1 . Tanto MIP-1 como MIP-1 son quimioatrayentes para macrófagos, monocitos y linfocitos T. De manera interesante la purificación bioquímica y el análisis de secuencia subsecuente de un inhibidor de célula basal multi -potente (SCI) reveló que SCI es idéntico a MIP-1. Además, se ha mostrado que MIP-1 puede contra-atacar la capacidad de MIP-1 para suprimir proliferación de células básales hematopoyéticas. Este hallazgo llega a la hipótesis de que el papel fisiológico primordial de MIP-1 es regular la hematopoyesis en médula osea, y que la función inflamatoria propuesta es secundaria. El modo de acción de MIP-1 como un inhibidor de células básales se relaciona a su capacidad por bloquear el ciclo celular en la interfase G2S . Además, el efecto inhibitorio de MIP-1 parece estar restringido a células progenitoras inmaduras y actualmente estimula a 5 progenitores tardíos posteriores en lá presencia de factor estimulante de colonia de granulocito macrófagos (GM-CSF) . • MIP-1 murino es una proteína secretada mayor de RAW 264.7 estimulado por lipopolisacárido, una línea 10 celular de tumor de macrófago murino. Se ha purificado y encontrado que consiste de dos proteínas relacionadas, MIP-1 y MIP-1. Varios grupos han clonado lo que son probables homólogos humanos MIP-1 y IP-1. En todos los casos, 15 .ADNcs se aislaron de bibliotecas preparadas contra ARN de células T activado. Proteínas MIP-1 pueden detectarse en células de inflamación inicial o temprana de herida y han mostrado que inducen producción de IL-1 e IL-6 a partir de células 20 de fibroblastos de herida. Además, MIP-1 nativo purificado (que comprende MIP-1, MIP-1 y polipéptidos MIP-1) provoca inflamación aguda cuando se inyectan ya sea subcutáneamente en las plantas de las patas de ratones o intracisternalmente en los fluidos 25 cerebroespinales de conejos (Wolpe y Cerami, FASEB J. 3:2565-73 (1989)). Además de estas propiedades pro-inflamatorias de MIP-1, que pueden ser directas o indirectas, MIP-1 se ha recuperado durante las fases tempranas inflamatorias de sanado de herida en un modelo de ratón experimental que emplea cámaras de heridas estériles (Fahey, y colaboradores . Cytokine, 2:92 (1990)). Por ejemplo, la solicitud del PCT, U.S. 92/05198 presentada por Chiron Corporation, describe una molécula de .ADN que es activa como una plantilla para producir proteínas inflamatorias de macrófago de mamífero (MIPs) en levadura. El MIP-1 murino y MIP-1 son citoquinas distintas pero cercanamente relacionadas. Mezclas parcialmente purificadas de las dos proteínas afectan función de neutrófilo y provocan inflamación local y fiebre. MIP-1 se ha expresado en células de levadura y purificado a homogeneidad. Análisis estructural confirma que MIP-1 tiene una estructura secundaria y terciaria muy similar al factor de plaquetas 4 (TF-4) e interleucina 8 (IL-8) con la cual comparten homología de secuencia limitada. También se ha demostrado que MIP-1 es activo in vivo para proteger células .básales de ratón contra subsecuente exterminio in vi tro por timidina tritiada.

MIP-1 también mostró que mejora la proliferación de células formadq as d , colonig. _de ^g^anulacito macrófago progenitor más comprometidas en respuesta al factor estimulador de colonia de macrófago granulocito (Clemens, J.M. y colaboradores, Cytokine 4:76-82 (1992)). 5 El polipéptido de la presente invención MPIF-1 (también referido en ocasiones como MIP-3 y Ck-8) es un nuevo miembro de la familia quimosina basado en la homología de secuencia de aminoácido. COMPENDIO DE LA INVENCIÓN 10 De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporcionan métodos novedosos para evitar o tratar lesiones a células, tejidos y órganos utilizando polipéptidos MPIF-1 de longitud íntegra o maduros, así como fragmentos análogos y derivados de los mismos 15 biológicamente activos, útiles para diagnóstico o útiles terapéuticamente. En otro aspecto, la invención proporciona métodos para tratamiento o prevención utilizando polipéptidos MPIF-1 que codifican polinucleótidos 20 aislados. El MPIF-1 de la presente invención de * preferencia es de origen animal y más preferiblemente de origen humano . La invención también proporciona polipéptidos MPIF-1 y polinucleótidos aislados (.ADN o ARN) que 25 codifican estos polipéptidos, .incluyendo ARNms, ADNs, ADNcs, ADN genómico así como sus fragmentos análogos y derivados biológicamente activos o útiles para diagnóstico o terapéuticamente. Polinucleótidos MPIF-1 . La presente invención 5 también proporciona moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden, o en forma alterna consisten de, un polinucleótido que codifica el polipéptido MPIF-1 que tiene la secuencia de aminoácido mostrado en la Figura 1 (ID de SEC NO. : 2) o la secuencia de aminoácidos 10 codificada por el clon .ADNc depositado como número de depósito de ATCC 75676 en febrero 9 de 1994. La secuencia de nucleótidos determinada al secuenciar el clon MPIF-1 depositado, que se ilustra en la Figura 1, (ID de SEC NO.: 1) contiene un marco de lectura abierto 15 que codifica un polipéptido de 120 residuos aminoácido con una secuencia principal de aproximadamente 21 residuos aminoácido, y un peso molecular pronosticado para la proteína madura de aproximadamente 11 kDa en forma no glicosilada, y aproximadamente" 11-14 kDa en 20 forma glicosilada dependiendo de la proporción de -• glicosilación. La secuencia de aminoácidos de la proteína MPIF-1 madura se ilustra en la Figura 1) . De esta manera, un aspecto de la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislado que 25 comprende o en forma alterna consiste de, un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo que consiste de: (a) una secuencia de nucleótido que codifica un polipéptido MIPF-1 que tiene la secuencia de aminoácidos completa en la Figura 1 (ID de SEC NO. : 2) ; (b) una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido MPIF-1 que tiene la secuencia de aminoácidos completa en la Figura 1 (ID de SEC NO. : 2) , pero menos el residuo metionina N-terminal; (c) una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido 10 MPIF-1 maduro que tiene la secuencia de aminoácidos en las posiciones 22-120 en la Figura 1 (ID de SEC NO . : 2 ) ; (d) una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido MPIF-1 que tiene la secuencia de aminoácidos completa codificada por el clon ADNc contenida en el 15 depósito ATCC No. 75676; (e) una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido MPIF-1 maduro que tiene la secuencia de aminoácidos codificada por el clon ADNc contenido en el depósito ATCC No. 75676; y (f) una secuencia de nucleótidos complementaria a cualquiera de 20 las secuencias de nucleótidos en (a) , (b) , (c) , (d) , o (e) anterior. Variantes de polinucleótido MPIF-1 . La presente invención además se relaciona a variantes de los polinucleótidos previamente descritos que codifican 25 fragmentos análogos y derivados del polipéptido que tienen una secuencia de aminoácidos deducida de la Figura 1 (ID de SEC NO. : 2) o los polipéptidos codificados por el ADNc de el o los clones depositados. Las variantes de los polinucleótidos pueden ser una variante alélica de origen natural de los polinucleótidos o una variante de origen no natural de los polinucleótidos. Polinucleótido MPIF-1 homólogos . Adicionales modalidades de la invención incluyen moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden un polinucleótido con una secuencia nucleótido de al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a cualquiera de las secuencias de nucleótido in (a) , (b) , (c) , (d) , (e) , o (f) , anterior, o un polinucleótido que hibridiza bajo condiciones de hibridización estrictas a un polinucleótido en (a) , (b) , (c) , (d) , (e) , o (f) , anterior. Estos polinucleótidos que hibridizan, no hibridizan bajo condiciones de hibridización estrictas a un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que consiste de solo residuos A o de solo residuos T. Sondas de Ácido Nucleico . De acuerdo todavía con otro aspecto de la presente invención, también se proporcionan sondas de ácido nucleico que comprenden o en forma alterna consisten de, moléculas de ácido nucleico de longitud suficiente para hibridizar específicamente a la secuencia de ácido nucleico MPIF-1.

Vectores Recombinantes, Células huésped, y Expresión . La presente invención también se refiere a vectores recombinantes, que incluyen las moléculas de ácido nucleico aisladas de la presente invención, y a células huésped que contienen los vectores recombinantes, así co o métodos para producir estos vectores y células huésped y para utilizarlos en la producción de polipéptidos MPIF-1 o péptidos por técnicas recombinantes . Polipéptidos MPIF-1 . . La invención además proporciona un polipéptido MPIF-1 aislado que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: (a) la secuencia de aminoácidos del polipéptido MPIF-1 que tiene la secuencia completa de 120 aminoácidos, incluyendo la secuencia líder mostrada en la Figura 1 (TD de SEC NO. : 2) ; (b) la secuencia de aminoácidos del polipéptido MPIF-1 que tiene la secuencia completa de 120 aminoácidos, incluyendo la secuencia líder mostrada en la Figura 1 '(ID de SEC NO.: 2) pero menos el residuo metionina N-terminal; (c) la secuencia de aminoácidos del polipéptido MPIF-1 maduro, (sin el líder) que tiene la secuencia de aminoácidos en las posiciones 22-120 en la Figura 1 (ID de SEC NO. : 2) ; (d) la secuencia de aminoácidos del polipéptido MPIF-1 que tiene la secuencia de aminoácidos completa, incluyendo el líder, codificado por el clon ADNc contenido en el depósito ATCC No. 75676; y (e) la secuencia de aminoácidos del polipéptido MPIF-1 maduro que tiene la secuencia de aminoácidos codificada por el clon ADNc contenido en el depósito ATCC No. 75676. Polipéptidos MPIF-1 homólogos . Polipéptidos de la presente invención también incluyen polipéptidos homólogos que tienen una secuencia de aminoácidos con al menos 95% de identidad con aquellos descritos en (a) , (b) , (c) , (d) , o (e) anteriormente, así como polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a aquellos anteriores. Epítope MPIF-1 que contiene Polipéptidos y Polinucleótidos de codificación . Una modalidad adicional de este aspecto de la invención se relaciona a un péptido o polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos y una porción que contiene epítope de un polipéptido MPIF-1 que tiene la secuencia de amino ácidos descrita en (a) , (b) , (c) , (d) , o (e) , anterior. Péptidos o polipéptidos que tienen la secuencia de amino ácidos de una porción que contiene epítope de un polipéptido MPIF-1 de la invención incluyen porciones de estos polipéptidos con al menos seis o siete de preferencia al menos nueve, y más preferiblemente cuando menos de aproximadamente 30 amino ácidos hasta aproximadamente 50 amino -ácidos, aunque polipéptidos que contienen epítope de cualquier longitud hasta e incluyendo toda la secuencia de amino ácidos de un polipéptido de la invención descrito anteriormente también se incluyen en la invención. Una modalidad de ácido nucleico adicional de la invención se relaciona a una molécula de ácido nucleico aislada que comprende o en forma alterna consiste de, un polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de una porción que contiene epítope de • un polipéptido MPIF-1 que tiene la secuencia de aminoácidos (a) , (b) , (c) , (d) , o (e) , anterior. Anticuerpos MPIF-1 . De acuerdo con un aspecto aún adicional de la presente invención, se proporciona un anticuerpo contra estos polipéptidos. En otra modalidad, la invención proporciona un anticuerpo aislado que liga específicamente a un polipéptido MPIF-1 que tiene una secuencia de aminoácidos descrita en (a) , (b) , (c) , (d) , o (e) , anterior. La invención además proporciona métodos para aislar anticuerpos que se ligan específicamente a un polipéptido MPIF-1 que tiene una secuencia de aminoácidos como se describe aquí. Estos anticuerpos son útiles para diagnóstico o * terapéuticamente como se describió anteriormente . Antagonis tas MPIF-1 y Métodos . De acuerdo con aún otro aspecto de la presente invención, se proporcionan antagonistas o inhibidores de estos polipéptidos, que puede emplearse para inhibir la acción de estos polipéptidos, por ejemplo en el tratamiento de arterioesclerosis, enfermedades auto inmunes, inflamatorias crónicas e infecciosas, condiciones alérgicas mediadas por histamina, síndrome hipereosinofílico, silicosis, sarcoidosis, enfermedades inflamatorias del pulmón, inhibición de IL-1. y TNF, anemia aplástica, y síndrome mielodisplástico. En forma alterna, estos polipéptidos pueden emplearse para inhibir producción de IL-1 y TNF-, para tratar anemia aplástica, síndrome mielodisplástico, asma y artritis. Ensayos de Diagnóstico . De acuerdo con aún otro aspecto de la presente invención, se proporcionan ensayos de diagnóstico para • detectar enfermedades relacionadas a la sub-expresión y sobre-exprésion de los polipéptidos y para detectar mutaciones de las secuencias de ácido nucleico que codifican estos polipéptidos. . De acuerdo con aún otro aspecto de la presente invención, se proporciona un proceso para utilizar estos polipéptidos, o polinucleótidos que codifican estos polipéptidos como reactivos de investigación para propósitos in vi tro relacionados a investigación científica, síntesis de ADN y fabricación de vectores de ADN con el propósito de desarrollar agentes terapéuticos y de diagnóstico para el tratamiento de enfermedades humanas . — La presente invención también proporciona un método de monitoreo para identificar compuestos capaces de mejorar o inhibir una respuesta celular inducida por un polipéptido MPIF-1, que involucra contactar células que expresan el polipéptido MPIF-1 con el compuesto candidato, ensayar una respuesta celular, y comparar la respuesta celular con una respuesta celular estándar, el estándar se ensaya cuando se hace contacto en ausencia del compuesto candidato; con lo que una respuesta celular incrementada sobre el estándar indica que el compuesto es un agonista y una respuesta celular disminuida sobre el estándar indica que el compuesto es un antagonista. Para una cantidad de desordenes, se considera que niveles significativamente superiores o inferiores de expresión de gen MPIF-1 pueden detectarse en ciertos tejidos o fluidos corporales, (por ejemplo suero, plasma, orina, fluido sinovial o fluido espinal) que se toman de un individuo que tiene este desorden, respecto a un nivel de expresión de gen MPIF-1 "estándar", es decir, el nivel de expresión MPIF-1 en tejido o fluidos corporales de un individuo que no tiene el desorden. De esta manera, la invención proporciona un método de diagnóstico útil durante diagnóstico de un desorden, que involucra: (a) ensayar el nivel de expresión de gen MPIF-1 en células o fluido corporal de un individuo; (b) comparar el nivel de expresión de gen MPIF-1, con un nivel de expresión de gen MPIF-1 estándar, con lo que un incremento o decremento en el nivel de expresión de gen MPIF-1 ensayado comparado con el nivel de expresión estándar es indicativo de un desorden. Estos desordenes incluyen leucemia, inflamación crónica, enfermedades auto inmunes, tumores sólidos y toxicidad por radiación y quimioterapia . Composiciones Farmacéuticas . La presente invención también proporciona en otro aspecto, composiciones farmacéuticas que comprenden al menos uno de un polinucleótido MPIF-1, sonda, vector, célula huésped, polipéptido, fragmento, variante, derivado, porción que contienen epítope, anticuerpo, antagonista o agonista . Métodos Terapéuticos . De acuerdo con un aspecto aún adicional de la presente invención, se proporciona un procedimiento para utilizar estos polipéptidos, o polinucleótidos que codifican estos polipéptidos para propósitos terapéuticos, por ejemplo para proteger células básales de médula ósea contra agentes quimioterapéuticos durante quimioterapia, para retirar células de leucemia, para estimular una respuesta inmune, para regular hematopoyesis y tráfico o migración de linfocitos, tratamiento de psoriasis, tumores sólidos, para mejorar defensas de huésped contra infección resistente y aguda y crónica, y para estimular sanado de heridas . Un. "aspecto adicional de la invención se relaciona a un método para tratar a un individuo que requiere un nivel incrementado de actividad MPIF-1 en el cuerpo, que comprende administrar a este individuo una composición que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido MPIF-1 aislado de la invención o un agonista del mismo, respectivamente. Un aspecto aún adicional de la invención se relaciona a un método para tratar a un individuo que requiere un nivel disminuido de actividad MPIF-1 en el cuerpo, que comprende administrar a este individuo una composición que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista MPIF-1. Estos y otros aspectos de la présente invención deberán ser aparentes a aquellos con destreza en la especialidad de las enseñanzas presentes.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Los siguientes dibujos son ilustrativos de modalidades de la invención y no se pretende que limiten el alcance de la invención como se abarca por las reivindicaciones. La Figura 1 exhibe la secuencia ADNc que codifica (ID de SEC. NO. : 1) y la secuencia de aminoácidos reducida correspondiente (ID de SEC. NO.: 2) . Los 21 aminoácidos iniciales representan la secuencia líder putativa. Todas las secuencias de señales fueron como se determina por el secuenciado de péptido N-terminal de la proteína expresada baculovirus . La Figura 2 ilustra la homología de aminoácidos entre MPIF-1 (superior) (ID de SEC. NO. : 2) y MIP-1 humano (fondo) (ID de SEC. NO. : 36) . Las cuatro cisteínas características de todas las quimosinas se ilustran. La Figura 3 es una fotografía de un gel SDS-PAGE después de expresión y purificación de tres etapas de MPIF-1 en un sistema de expresión baculovirus. Las Figuras 4A-4B. La actividad quimoatrayente de MPIF-l se determina con ensayos de quimotaxia utilizando un dispositivo de micro cámara con 48 pozos (Neuro Probé, Inc.). El procedimiento experimental fue como se describe en el manual de los fabricantes. Por cada concentración de MPIF-1 probado, se examinó migración en 5 campos de alta potencia. Los resultados presentados representan los valores promedio que se obtienen de dos experimentos independientes. Se ilustra la actividad quimioatrayente en células THP-1 (A) y PBMCs (B) humano. La Figura 5. Cambio en concentración de calcio intracelular en respuesta a MPIF-1 se determinó utilizando un espectrofotómetro fluorescente Hitachi F-2000. MPIF-1 expresado bacterial se agrega a células THP-1 cargadas de Indo-1 a una concentración final de 50 nM y el nivel intracelular de concentración de calcio se monitoreó. La Figura 6, una población de baja densidad de células de médula osea de ratón se revistió (1,500 células/plato) en medio que contiene agar con o sin las quimosinas indicadas (100 ng/ml) , pero en la presencia de IL-3 (5 ng/ml) , SCF (100 ng/ml) , IL-1 (10 ng/ml) , y M-CSF (5 ng/ml) . Los datos mostrados representan el promedio obtenido de dos experimentos independientes (cada uno realizado en duplicado) . Se contaron colonias 14 días después de revestimiento. El número de colonias generadas en la presencia de quimosinas se expresa como un porcentaje promedio de aquellas producidas en la ausencia de cualesquiera quimosinas agregadas.

Figuras 7A-7B ilustran el efecto de MPIF-1 y M-CIF en formación de colonia de médula osea de ratón por HPP-CFC (A) y LPP-CFC (B) . La Figura 8 ilustra el efecto de MPIF-1 expresado-baculovirus y M-CIF en M-CFS 'y formación de colonia estimulada por SCF de células de médula osea recientemente aisladas. La Figura 9 ilustra el efecto de MPIF-1 y M-CIF en IL3 y proliferación estimulada por SCF y diferenciación de la población lin- de células de médula ósea. Las Figuras 10A-B muestran el efecto de MPIF-1 y M-CIF en la generación de población positiva de Gr.l y Mac-1 (marcadores superficiales) células de población agotada de linaje de células de médula ósea. Células lin" se incubaron en medio de crecimiento de medio de cultivo suplementado con IL-3 (5 ng/ml) y SCF (100 ng/ml) solo (a) con MPIF-1 (50 ng/ml) (b) o M-CIF (50 ng/ml) (c) . Células luego se tiñeron con anticuerpos monoclonales contra antígenos superficiales de diferenciación mieloide Gr.l, Mac-1, Sca-1, y CD45R y analizaron por FACScan. Los datos se presentan como porcentaje de células positivas tanto 'en poblaciones celulares grandes (Figura 10A) y pequeñas (Figura 10B) .

La Figura 11 ilustra que la presencia de proteína MPIF-1 inhibe ,formación de colonia de células de médula ósea en respuesta a IL3 , M-CSF y GM-CSF. La Figura 12. Respuesta de dosis de MPIF-1 inhibe formación de colonia de células de médula ósea. Las células se aislaron y trataron como en la Figura 13. Las células tratadas se revistieron a una densidad de 1,000 células/plato en ensayos de formación de colonia basados en agar en la presencia de IL-3, GM-CSF o M-CSF (5 ng/ml) con o sin MPIF-1 a 1, 10, 50 y 100 ng/ml. Los datos se presentan como formación de colonia como un porcentaje del número de colonias formadas con el factor específico solo. Los datos se ilustran como el promedio de platos duplicados con barras de error indicando la desviación estándar. La Figura 13. Expresión de .ARN que codifica MPIF-1 en monocitos humanos. .ARN total de monocitos elutriados frescos se aisla y trata con 100 U/ml hu rIFN-g, 100 ng/ml LPS, o ambos. ARN (8 µg) de cada tratamiento se separó electroforéticamente en un gel de agarosa 1.2% y transfiere a una membrana de nylon. ARNm MPIF-1 se cuantifica al sondear con ADNc etiquetado 32p y las bandas en autoradiografía resultante se cuantificaron densitométricamente . ~~ La Figura 14. .Análisis de secuencia de aminoácidos de MPIF-1 (ID de SEC NO.: 2), Regiones alfa, beta, de vuelta y enrollada; hidrofilicidad e hidrofobicidad; regiones anfipáticas; regiones flexibles ,-índice antigénico; y probabilidad de superficie se ilustran. En la gráfica "índice .Antigénico Jameson-Wolf" los residuos amino ácidos 21-30, 31-44, 49-55, 59-67, 72-83, 86-103 y 110-120 en la Figura 1 (ID de SEC NO. : 2) , o cualquier rango o valor ahí, en la Figura 1 (ID de SEC NO. : 2) corresponden a las regiones altamente antigénicas mostradas de la proteína MPIF-1. Figuras 15A-B. (A) muestra el efecto míeloprotector de MPIF-1 en el exterminio inducido con 5-Fu de células LPP-CFC. (B) muestra el efecto mieloprotector de MPIF-1 en el exterminio inducido por Ara-C de células LPP-CFC. La Figura 16 muestra el efecto de pre-tratamiento MPIF-1 de ratones en la reducción inducida por 5 -Fu en las cuentas BC de circulación. La Figura 17 muestra el diseño experimental que involucra tres grupos de ratones (6 animales por grupo) que se trataron como sigue: Grupo- 1, inyectado con salino en días 1, 2, y 3 ; Grupo-2, inyectado con 5 -Fu los días 0 y 3; y Grupo-3, inyectado con 5-Fu los días 0 y 3 y MPIF-1 los días 1, 2, y 3. Se cosecha médula ósea los días 6 y 9 para determinar las frecuencias HPP-CFC y LPP-CFC utilizando un ensayo clonogénico. La Figura 18 muestra el efecto de administración de MPIF-1 antes de la segunda dosis de 5-Fu en las frecuencias HPP-CFC y LPP-CFC en la médula ósea. La Figura 19 muestra las variantes MPIF-1. Los primeros 80 de la secuencia de 120 amino ácidos de MPIF-1 (Figura 1 (ID de SEC NO.: 2)) se muestran utilizando un solo código de letra de amino ácido, del cual los primeros 21 residuos muestran características de una secuencia de señal que se escinde para dar lugar a una proteína tipo silvestre madura. Los mutantes-1 y -6 contienen metionina como el residuo N-terminal, que no está presente en el tipo silvestre. También, los primeros cuatro amino ácidos (HAAG) del Mutante-9 no están presentes en la proteína MPIF-1 tipo silvestre. Los Mutantes-1, -6 y -9 corresponden a ID SEC NOS : 3 , 4 y 5, respectivamente. El Mutante-2 corresponde a los residuos amino ácidos 46-120 en ID de SEC NO.: 2. El Mutante-3 corresponde a los residuos amino ácidos 45-120 en ID de SEC NO.: 2. El Mutante-4 corresponde a los residuos amino ácidos 48-120 en ID de SEC NO.: 2. El Mutante-5 corresponde a los residuos amino ácidos 49-120 en ID de SEC NO.: 2. El Mutante- 7 corresponde a los residuos amíno ácidos 39-120 en ID de SEC NO..- 2. El Mutante-8 corresponde a los residuos amino ácidos 44-120 en ID de SEC NO . : 2. Figuras 20A-B. La Figura 20A muestra la secuencia de nucleótido de un ADNc variante de lisado MPIF-1 humano (ID de SEC NO. : 6) . Esta secuencia ADNc se ilustra junto con el cuadro de lectura abierto que codifica por una proteína de 137 amino ácidos (ID de SEC NO. : 7) utilizando un código de amino ácidos de una sola letra. Los 21 amino ácidos N-terminales que están subrayados representan la secuencia líder putativa. La inserción de secuencia de 18 amino ácidos no representada en la secuencia MPIF-1 pero única para la variante SP1 está resaltada con itálicas. La Figura 20B muestra la comparación de la secuencia de amino ácidos de la variante MPIF-1 (ID de SEC NO. : 7) con la de la molécula MPIF-1 tipo silvestre (ID de SEC NO. : 2) ., La Figura 21 muestra las concentraciones de proteínas mutantes MPIF-1 requeridas para 50% de máxima respuesta de movilización de calcio inducida por MIP-1 en monocitos humanos . Las Figuras 22A-22B. Los cambios en la concentración de calcio libre intracelular se miden en monocitos humanos en respuesta a las proteínas indicadas a 100 ng/ml como se describe en la leyenda de la Figura 21. La Figura 23 muestra la capacidad de mutantes MPIF-1 para desensibilizar la movilización de calcio estimulada por MIP-1 en monocitos humanos (compendio) . La Figura 24 muestra las respuestas quimiotácticas de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC = Peripheral Blood Mononuclear Cells) a mutantes MPIF-1. Números dentro del paréntesis reflejan el número de estímulo de qumiotaxia sobre el fondo observado en el rango de concentración indicado. La Figura 25 muestra el efecto de variantes MPIF-1 en el * crecimiento y diferenciación de células formadoras de colonia potenciales bajas proliferativas (LPP-CFC = Low Proliferative Potential Colony- forming Cells) in vi tro . La Figura 26 muestra la movilización de células básales en ratones normales en respuesta a la administración de MPIF-1. La Figura 27 muestra una comparación del efecto de MPIF-1 con G-CSF en la recuperación de plaquetas después de dos ciclos de tratamiento de 5-Fu como se determina por el método FACS Vantage . La Figura 28 muestra una comparación del efecto de MPIF-1 con G-CSF en la recuperación de células dobles positivas Gra.l y Mac .1 en la sangre después de dos ciclos de tratamiento 5-Fu. La Figura 29 muestra una comparación del efecto de MPIF-1 con G-CSF en la recuperación de células dobles positivas Gra.l y Mac .1 en médula ósea después de dos ciclos de tratamiento 5-Fu como se determina por el método FACS Vantage . La Figura 30 muestra una comparación del efecto de MPIF-l con G-CSF en la recuperación de progenitores hematopoyéticos en médula ósea siguiendo dos ciclos de tratamiento de 5-Fu. La Figura 31 muestra una representación esquemática del vector de expresión pHE4-5 (ID de SEC NO. : 37) y la secuencia de codificación .ADNc MPIF-1 23 sub-clonada. Las ubicaciones del gen marcador de resistencia a canamicina, la secuencia de codificación MPIF-1 23, la secuencia oriC y la secuencia de codificación laclq se indican.

La Figura 32 muestra una vista panorámica del proceso de fermentación para la producción de MPIF-1 23. La Figura 33 muestra un diagrama de flujo de los métodos empleados para recuperar MPIF-1 23 producido por el procedimiento mostrado en la Figura, 32.

La Figura 34 muestra el proceso para la purificación de MPIF-1 23 producido y recuperado por los procesos mostrados en las Figuras 32 y 33. La Figura 35 muestra la secuencia de nucleótidos de los elementos regulatorios del promotor pHE (ID de SEC NO. : 38) . Las dos secuencias de operador lac, la secuencia de Shine-Delgarno (S/D) , y los sitios de restricción terminal HindII I y Ndelt (cursivas) se indican. Las Figuras 36A-36E muestran la secuencia de nucleótidos completa del vector pHE4-5 (ID de SEC NO.: 37) . La Figura 37 muestra la protección MPIF-1 del tracto gastrointestinal contra daño inducido por radiación durante monitoreo de corto plazo. Ratones hembra C57B1/6 se trataron antes o después de recibir una dosis de radiación sub-letal (2 x 4.5gy 4 horas espaciadas de una fuente 13Cs) . Se verificaron ratones por supervivencia, condición y peso los días mostrados. Los datos ilustran el cambio porcentual en peso para cada grupo con base en cada peso de ratón individual el día indicado como un por ciento de su peso al inicio del experimento . La Figura 38 muestra protección MPIF-1 del tracto gastrointestinal por daño inducido por radiación durante monitoreo de largo plazo. Ratones hembra C57B1/6 se trataron antes o después de recibir una dosis de radiación sub-letal (2 x 4.5gy 4 horas espaciadas de una fuente 137Cs) . Los ratones se verificaron por supervivencia, condición y peso en los días mostrados. Los datos ilustran el cambio porcentual en peso por cada grupo con base en el peso de cada ratón individual el día indicado como un porcentaje de- su peso al inicio del experimento . La curva se presenta en dos segmentos . El segmento izquierdo representa cambios dentro de los primeros 18 días y el segmento derecho representa los pesos en todos los grupos los días de terminación. La Figura 39 muestra la protección _de MPIF-1 del tracto gastrointestinal contra daño inducido por radiación durante monitoreo de corto plazo. Ratones hembra C57B1/6 se trataron antes o después de recibir una dosis de radiación sub-letal • (2 x 5.5gy 4 horas espaciadas de una fuente 137Cs) . Se monitorearon o determinaron ratones por supervivencia, condición y peso los días mostrados. Los datos muestran el cambio porcentual en peso por cada grupo con base en el peso de cada ratón individual el día indicado como un porcentaje de su peso al inicio del experimento. La Figura 40 muestra la protección MPIF-1 del tracto gastrointestinal por daño inducido por radiación durante monitoreo de largo plazo. Ratones hembra C57BI/6 se trataron antes o después de recibir una dosis de irradiación sub-letal (2 x 5.5gy, 4 horas espaciadas utilizando una fuente 137Cs) . Se monitorearon ratones por supervivencia, condición y peso los días mostrados. Los datos muestran el cambio porcentual en peso para cada grupo con base en el peso de cada ratón individual el día indicado como un porciento de su peso al inicio del experimento . La Figura 41 muestra un esquemático del programa de tratamiento para el • modelo de protección in vivo de protección contra irradiación letal en el ratón. La Figura 42 muestra que MPIF-1 mejora la supervivencia de ratones irradiados letalmente. .Análisis estadístico se realizó utilizando datos y no paramétricos de rango log se presentan como una curva de supervivencia aplan-Meier . El experimento se termina el día 54 posterior a irradiación. La Figura 43 muestra un esquemático del programa de tratamiento para el modelo de protección in vivo contra irradiación sub-letal en el ratón. La Figura 44 muestra que MPIF mejora la recuperación de precursores de médula ósea comprometidos por linaje en ratones irradiados sub-letalmente .

La Figura 45 muestra que MPIF mejora la recuperación de progenitores de médula ósea multipotenciales en ratones irradiados sub-letalmente . La Figura 46 muestra el -efecto de MPIF en la proliferación de células progenitoras CD34+ humanas in vi tro .

La Figura 47 muestra el efecto de MPIF en exterminio inducido por droga citotóxica in vi tro . La Figura 48 muestra un resumen de los estudios in vivo en MPIF. Las Figuras 49A-B muestran el efecto de pretratamiento con MPIF en toxicidad inducida por 5 -FU en células progenitoras mieloide in vivo. (A) El efecto de MPIF en formación de colonia total. (B) El efecto de MPIF en recuperación de WBC. Los resultados son el promedio de ocho experimentos . La Figura 50 muestra el efecto quimioprotector de MPIF en múltiples ciclos de terapia. La Figura 51 muestra el efecto de programa de dosificación MPIF en la cinética de recuperación de médula ósea después de tratamiento con 5 -FU. La Figura 52 muestra un resumen de estudios de toxicidad de múltiples dosis.

La Figura 53 muestra un resumen de observaciones para estudios de toxicología clínica. Las Figuras 54A-54B muestran una comparación de la farmacocinética de MPIF después de dosificación intravenosa o subcutánea. (A) Perfil farmacocinético de 0 a 24 horas. (B) Perfil de 0 a 4 horas. La dosis MPIF fue de 20 mg/kg. La Figura 55 muestra la evolución de composición de células de sangre periférica en sujetos humanos. La Figura 56 muestra la evolución de la cuenta de monocitos absoluta promedio en voluntarios humanos sanos por grupo de tratamiento. La Figura 57 muestra la concentración MPIF (ng/ml) en voluntarios sanos. Figuras 58A-58E muestran la estructura de MPIF-1. (A) y (B) La superposición de las estructuras de alineado simulado (SA = Simulated Annealing) respecto a la estructura promedio de MPIF-1, residuos 1-77. (C) Lo mismo que en A y B excepto porque los residuos N-terminal (1-10) y C-terminal (67-77) se han omitido por claridad. (D) y (E) Una representación esquemática de MPIF-1 en la misma orientación que se ilustra en el panel C creado utilizando el programa MOLMOL (Koradi, R. , y colaboradores . , J. Mol . Graph . 14:29-42 (1996)).

Las Figuras 59A-59F muestran la distribución de rms atómicos de las 30 estructuras de alineación simuladas sobre la estructura promedio mejor ajustada para los residuos 11-66 para los átomos de estructura principal (A) y todos los átomos pesados (B) . También se ilustran el parámetro de orden angular (S) para (C) , para (D) , y 1 (E) y el área accesible de solvente fraccional (F) . Las Figuras 60A-60G muestran los datos de dinámica 15N de MPIF-1 como una función del residuo. La 15N T1 Tt, proporción Tx/T, , y -NOE se ilustran en los paneles A, B, C y D respectivamente. Los parámetros dinámicos calculados para ajustar los datos 15N T.. T , NOE se ilustran en los paneles restantes; parámetro de orden, Sz (E) ; tiempo de correlación interna, Te (F) y velocidad de intercambio conformacional (G) . Las Figuras 61A-61D muestran una comparación de MPIF-1 y otras estructuras CC quimosina, MIP-1, HCC-2, RANTES y MCP-1. Los residuos 11 a 66 de MPIF-1 se superponen en los residuos 11 a 66 de MIP-1, residuos 6 a 61 de HCC2, residuos 10 a 65 de RANTES y residuos 11 a 67 de MCP-3. Por claridad, los residuos de los extremos N-y C- no se exhiben. La Figura 62 muestra el alineamiento de las secuencias de amino ácidos de MPIF-1 y otras CC quimosinas. Las cisteínas conservadas están en tipo negritas. Los residuos hidrofóbico conservado y cargado conservado se describen en el Ejemplo 36. Las Figuras 63A-63D muestran la distribución de carga superficial MPIF-1 utilizando el programa MOLMOL (Koradi, R. , y colaboradores, J Mol . Graph . 14:29-42 (1996) ) . Regiones cargada positiva y negativamente se ilustran en azul y rojo, respectivamente. Por claridad, no se ilustran los residuos 1-10 y 69-77. Descripción Detallada de las Modalidades Preferidas La presente invención proporciona composiciones de diagnóstico o terapéuticas y métodos que utilizan moléculas de polinucleótido aisladas que codifican polipéptidos, o los propios polipéptidos, como polipéptidos de factor inhibitorio progenitor de mieloide humano-1 (MPIF-1) (previamente denominado MIP-3 y quimosina 8 (CK 8 o ckb-8)) y proporcionan vectores, células huésped y métodos recombinantes o sintéticos para producir los mismos . Polinucleótidos MPIF-1 De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporcionan ácidos nucleicos aislados (polinucleótidos) que codifican el polipéptido MPIF-1 de longitud íntegra o maduro que tiene la secuencias de amino ácidos reducida de la Figura 1 (ID de SEC NO.: 2) y para el polipéptido MPIF-1 maduro codificado por el ADNc del clon depositado como depósito ATCC No. 75676 en febrero 9 de 1994. La dirección de la Colección de Cultivos Tipo Americano (American Type Culture Collection) es: Patent Depository, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209. El clon depositado está contenido en el plásmido pBluescript SK(-) (Stratagene, LaJolla, CA) . El o los depósitos referidos aquí se mantendrán bajo los términos del tratado de Budapest en el reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para propósitos de procedimientos de patentes. Estos depósitos se proporcionan simplemente como conveniencia para aquellos con destreza en la especialidad y no son una admisión de que un depósito se requiere bajo 35 U.S.C. sección 112. La secuencia de polinucleótidos contenidos en los materiales depositados, así como la secuencia de amino ácidos de los polipéptidos de esta manera codificados, se incorporan aquí por referencia y son de control en el caso de cualquier conflicto con descripción de secuencias presentes. Una licencia puede ser requerida para producir, utilizar o vender los materiales depositados y no se otorga por la presente dicha licencia.

Polinucleótidos que codifican polipéptidos de la presente invención se relacionan estructuralmente al super gen pro-inflamatorio "intercrina" que está en la familia citoquina o quimosina. MPIF-1 es un homólogo MIP-1 y es más homólogo a MIP-1 que a MIP-1. El polinucleótido que codifica MPIF-1 se deriva de una blibioteca .ADNc de endotelio aórtico y contiene un marco de lectura abierto que codifica un polipéptido de 120 residuos amino ácidos, que exhibe homología significante a una cantidad de quimosinas. La superior correspondencia es a la proteína inflamatoria de macrófago humano 1 alfa que muestra 36% de identidad y 66% de similaridad (Figura 2) . Los polinucleótidos de la presente invención pueden estar en la forma de .ARN o en la forma de .ADN, este .ADN incluye ADNc, ADN genómico y ADN sintético. El ADN puede ser de doble hebra o de una sola hebra, y si es de una sola hebra puede ser la hebra de codificación o la hebra de no codificación (antisentido) . La secuencia de codificación que codifica el polipéptido maduro puede ser idéntico a la secuencia de codificación mostrada en la Figura 1 o 20A (ID de SEC NO . : 1 o 6) o la del clon depositado o puede ser una secuencia de codificación diferente esta secuencia de codificación como resultado de la redundancia o degeneración del código genético, codifica el mismo polipéptido maduro que el ADN de la Figura 1 o 20A (ID de SEC NO. : 1 o 6) o el ADNc depositado. Los polinucleótidos que codifican por el polipéptido maduro de la Figura 1 (ID de SEC NO. : 2) o para el polipéptido maduro codificado por el ADNc depositado pueden incluir: solo la secuencia de codificación para el polipéptido maduro; la secuencia de codificación para el polipéptido maduro y la secuencia de codificación adicional tal como una secuencia líder o secretoria o una secuencia de pro-proteína; la secuencia de codificación para el polipéptido maduro (y opcionalmente adicional secuencia de codificación) y secuencia de no codificación, _ tal como intrones o secuencia de no codificación 5 ' y/o 3 ' de la secuencia de codificación para el polipéptido maduro. De esta manera, el término "polinucleótido que codifica un polipéptido" abarca un polínucleótido que incluye solo secuencia de codificación para el polipéptido así como un polinucleótido que incluye secuencia de codificación y/o no codificación adicional . La presente invención también se dirige a variantes de la secuencia de polinucleótido descrita en (ID de" SEC NO. : 1 o 6) , la hebra complementaria y/o la secuencia de ADNc contenida en un clon depositado.

"Variante" se refiere a un polinucleótido o polipéptido diferente de polinucleótido o polipéptido MPIF-1, pero que retiene sus propiedades esenciales. En general, variantes son cercanamente similares, y en muchas regiones idénticas al polinucleótido o polipéptido MPIF-1. A menos que de otra forma se indique, todas las secuencias de nucleótido determinadas por secuenciado de una molécula .ADN aquí, se determinaron utilizando un secuenciador ADN automatizado (tal como el modelo 373 de Applied Biosystems, Inc.), y todas las secuencias de amino ácidos de polipéptidos codificados por moléculas de ADN aquí determinadas se pronostican por producción de una secuencia de ADN determinada como con anterioridad. Por lo tanto, como se conoce en la técnica para cualquier secuencia de ADN determinada por este enfoque automatizado, cualquier secuencia de nucleótidos determinada aquí puede contener algunos errores . Secuencias de nucleótidos determinadas por automatización, típicamente son cuando menos aproximadamente 90% idénticas, más típicamente al menos aproximadamente 95% hasta al menos aproximadamente 99.9% idénticas a la secuencia actual de nucleótidos de la molécula de .ADN secuenciada. La secuencia actual puede ser determinada en forma precisa por otros enfoques incluyendo métodos de secuenciado de ADN manual bien conocidos en la técnica. Como también e conoce en la especialidad, una sola inserción o eliminación en una secuencia de nucleótidos determinada en comparación con una secuencia actual provocará un desplazamiento de cuadro en traducción de la secuencia de nucleótidos tal que la secuencia de amino ácidos pronosticada codificada por una secuencia de nucleótidos determinada será completamente diferente de la secuencia de amino ácidos que actualmente se codifica por la molécula de ADN secuenciada, empezando en el punto de esta inserción o eliminación . A menos de que de otra forma se indique, cada "secuencia de nucleótidos" establecida aquí, se presenta como una secuencia de deoxirribonucleótidos (abreviados A, G, C y T) . Sin embargo, por "secuencia de nucleótidos" de una molécula de ácido nucleico o polinucleótido se pretende, para una molécula de ADN o polinucleótido, una secuencia de deoxirribonucleótidos, y para una molécula ARN ?> polinucleótido, la correspondiente secuencia de ribonucleótidos (A, G, C y U) , en donde cada timidina deoxirribonucleótido (T) en la secuencia de deoxirribonucleótido especificada se reemplaza por ribonucleótido uridina (U) . Por ejemplo, referencia a una molécula ARN que tiene la secuencia de ID SEC; NO. : 1 o 6, como se establece utilizando abreviaturas deoxirribonucleótido se pretende que indique una molécula de ARN que tiene una secuencia en donde cada deoxirribonucleótido A, G o C de ID de SEC NO. : 1 o 6 sea reemplazado por el ribonucleótido correspondiente A, G o C, y cada deoxirribonucleótido T se ha reemplazado por un ribonucleótido U. Utilizando la información aquí proporcionada, tal como la secuencia de nucleótido en la Figura 1, una molécula de ácido nucleico de la presente invención que codifica un polipéptido MPIF-1, puede obtenerse utilizando procedimientos de clonación y monitoreo estándar, tales como aquellos para cloran .ADNcs utilizando .ARNm como material de,partida. La presente invención además se relaciona a variantes de los polinucleótidos previamente descritos que codifican fragmentos, análogos y derivados del polipéptido que tiene la secuencia de amino ácidos deducida de la Figura 1 (ID de SEC NO. : 2) o los polipéptidos codificados por el ADNc del clon depositado. Las variantes de los polinucleótidos pueden ser una variante alelica de origen natural de los polinucleótidos o una variante de ocurrencia no natural de los polinucleótidos.

La presente invención también incluye polinucleótidos que codifican el mismo polipéptido maduro que se ilustra en la Figura 1 (ID de SEC NO. : 2) o los mismos polipéptidos maduros codificados por el .ADNc del clon depositado así como variantes de estos polinucleótidos, estas variantes codifican un fragmento, derivado o análogo del polipéptido de la Figura 1 (ID de SEC NO.: 2) o los polipéptidos .codificados por el ADNc del clon depositado. Estas variantes de los polinucleótidos incluyen variantes de eliminación, variantes de substitución y variantes de adición o inserción. Como se indicó previamente, el polinucleótido puede tener una secuencia de codificación que es una variante alélica de origen natural de la secuencia de codificación mostrada en la Figura 1 (ID de SEC NO. : 2) o de la secuencia de codificación del clon depositado. Como se conoce en la técnica, una variante alélica es una forma alterna de una secuencia de polinucleótidos que puede tener una substitución, eliminación o adición de uno o más nucleótidos, que substancialmente no alteran la función del polipéptido codificado. La presente invención también incluye polinucleótidos en donde la secuencia de codificación para el polipéptido maduro puede fusionarse en el mismo cuadro de lectura a una secuencia de polinucleótido que ayuda en la expresión y secreción de un polipéptido desde una célula huésped, por ejemplo una secuencia líder que funciona como una secuencia secretoria para controlar transporte de un polipéptido desde las células. El polipéptido que tiene una secuencia líder es una preproteína y puede tener la secuencia líder escindida por la célula huésped para constituir la forma madura del polipéptido. Los polinucleótidos también pueden codificar una pro-proteína que es la proteína madura más residuos amino ácido N-terminal adicionales. Una proteína madura que tiene una prosecuencia es una proproteína y es una forma inactiva de la proteína. Una vez que se escinde la consecuencia permanece una proteína madura activa. De esta manera, por ejemplo los polinucleótidos de la presente invención pueden codificar para una proteína madura, o para una proteína que tiene una prosecuencia o para una proteína que tiene tanto una pro-secuencia como una pre-secuencia . (secuencia líder) . Los polinucleótidos de la presente invención también pueden tener la secuencia de codificación fusionada en cuadro a una secuencia marcadora que permite purificación de los polipéptidos de la presente invención. La secuencia marcadora puede tener una etiqueta hexa-histidina suministrada por un vector pQE-9 para proporcionar purificación del polipéptido maduro fusionado al marcador en el caso de un huésped bacterial, o por ejemplo la secuencia del marcador puede ser una etiqueta hemaglutinina (HA) , cuando se emplea un huésped mamífero, por ejemplo células COS- 7. La etiqueta HA corresponde a un epítope derivado de la proteína hemaglutinina de influenza (Wilson, I., y colaboradores, Cell , 37:767 (1984) ) . El término "gen" significa el segmento de ADN involucrado para producir una cadena de polipéptido; incluye regiones precedentes y siguientes a la región de codificación (líder y final o de cola) así como secuencias intercaladas (introhes) entre segmentos de codificación individual (exones) . Como se indica, moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden estar en la forma de .ARN, tal como ARNm, o en la forma de ADN, incluyendo por ejemplo ADNc y ADN genómico obtenido por clonación o producido sintéticamente. El ADN puede ser de doble hebra o hebra sencilla. ADN o ARN de hebra sencilla puede ser la hebra de codificación también conocida como la hebra de sentido, o puede ser la hebra de no codificación también referida como la hebra antisentido.

El término "aislado" significa que el material se retira de su ambiente original (por ejemplo, el ambiente natural si es de origen natural) . Por ejemplo, un polinucleótido o polipéptido de origen natural presente en un animal vivo no está aislado, pero los mismos polinucleótidos o .ADN o polipéptidos separados de algunos o todos los materiales coexistentes en el sistema natural están aislados. Estos polinucleótidos pueden ser parte de un vector y/o esos polinucleótidos o polipéptidos pueden ser parte de una composición, y aún están aislados ya que este vector o composición no es parte de su ambiente natural. Moléculas de .ARN aisladas incluyen transcripciones ARN ín vivo o in vi tro de las moléculas de .ADN de la presente invención. Moléculas de ácido nucleico aisladas de acuerdo con la presente invención además incluyen estas moléculas producidas sintéticamente. Sin embargo, un ácido nucleico contenido en un clon que es un miembro de una biblioteca por ejemplo una biblioteca genómica o .ADNc que no se ha aislado de otros miembros de la biblioteca (por ejemplo en la forma de una solución homogénea que contiene el clon y otros miembros de la biblioteca) o que está contenido en una preparación de cromosomas (por ejemplo una dispersión de cromosomas) o un ácido nucleico presente en una preparación de ADN genómico (por ejemplo intacto, rompimiento y/o cortado con una o más enzimas de restricción) que no se ha aislado de otros ácidos nucleicos en la preparación, no es "aislado" para los propósitos de esta invención. Moléculas de ácido nucleico aisladas de la presente invención incluyen moléculas de ADN que comprenden o en forma alterna consisten de un cuadro de lectura abierto (ORF = Open Reading Frame) para un ADNc MPIF-1; moléculas de ADN que comprenden una forma alterna consisten de, la secuencia de codificación para una proteína MPIF-1 madura; y moléculas de ADN que comprenden una secuencia substancialmente diferente de aquellas descritas anteriormente, pero que, debido a la degeneración del código genético, aún, codifican un polipéptido MPIF-1. Por supuesto, el código genético es bien conocido en la técnica. De esta manera, será rutinario para una persona con destreza en la técnica el generar las variantes degeneradas anteriormente descritas . La presente invención además se relaciona a polinucleótidos que hibridizan a las secuencias previamente descritas si al menos hay 95% de identidad entre las secuencias. La presente invención se relaciona particularmente a polinucleótidos que hibridizan bajo condiciones estrictas a los polinucleótidos previamente descritos. Como se emplea aquí, el término "condiciones estrictas" significa que ocurrirá hibridización solo si hay al menos 95% y de preferencia menos de 97% de identidad entre las secuencias. Los polinucleótidos que hibridizan a los polinucleótidos • previamente descritos en una modalidad preferida, codifican polipéptidos que retienen substancialmente la misma función biológica o actividad que el polipéptido maduro codificado por el ADNc de la Figura 1 (ID de SEC NO. : 1) o el ADNc depositado. En forma alterna, el polinucleótido puede tener al menos 20 bases, de preferencia 30 bases, y más preferible al menos 50 bases que hibridizan a un polinucleótido de la presente invención, y que tiene una identidad al mismo, como se describió previamente, y que puede o no retener actividad. Por ejemplo, los polinucleótidos pueden ser empleados como sondas para el polinucleótido de (ID de SEC NO.: 1) por ejemplo para recuperación del polinucleótido o como una sonda de diagnóstico o un PCR. En otro aspecto, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada, que comprende, o en forma alterna consiste de, * un polinucleótido que hibridiza bajo condiciones estrictas de hibridización a una porción del polinucleótido en una molécula de ácido nucleico de la invención descrita anteriormente, por ejemplo el clon .ADNc contenido en el depósito ATCC 75676 (MPIF-1) . Por "condiciones estrictas de hibridización" se pretende incubación durante la noche a 42 °C en una solución que consiste de 50% de formamida, 5x SSC (NaCI,750 mM, citrato trisodio 75 mM) , fosfato de sodio 50 mM (pH 7.6), solución de Denhardt 5x, dextran sulfato al 10%, y 20 µg/ml de ADN de esp'erma de salmón cizallado desnaturalizado, seguido por el lavado de los filtros en 0. lx SSC a aproximadamente 65°C. Por un polinucleótido que hibridiza a una "porción" de un polinucleótido se pretende un polinucleótido (.ADN o ARN) que hibridiza al menos aproximadamente 15 nucleótidos (nt) , y más preferible al menos aproximadamente 20 nt, o más preferible al menos aproximadamente 30 nt, y de preferencia aproximadamente 30-70 nt del polinucleótido de "referencia. También se pretende un polinucleótido que hibridiza cuando menos aproximadamente 15 nucleótidos (nt) , y más preferiblemente al menos aproximadamente 20 nt, más preferible al menos aproximadamente 25 nt, de preferencia al menos aproximadamente 30 nt, y en especial de preferencia aproximadamente 30-70 (por ejemplo, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, y/o 70 (por supuesto longitudes de fragmento además de aquellas aquí descritas también son útiles)) nt del polinucleótido de1-referencia. Estas son útiles como sondas de diagnóstico y cebadores como se discutió anteriormente y con más detalle a continuación. Por supuesto, polinucleótidos que hibridizan en una gran porción del polinucleótido de referencia (por ejemplo el clon .ADNc depositado) , por ejemplo, una porción 50-750 nt de longitud, o incluso toda la longitud del polinucleótido de referencia, también son útiles como sondas de acuerdo con la presente invención, al igual que polinucleótidos que corresponden a la mayoría si no toda la secuencia de nucleótido del ADNc depositado o la secuencia de nucleótido como se ilustra en ID SEQ NO.: 1 o 6 (MPIF-1) . Por una porción de un polinucleótido de "al menos 20 nt de longitud, " por ejemplo, se pretenden 20 o más nucleótidos contiguos para una secuencia de nucleótidos del polinucleótido de referencia. Como se indica, estas porciones son útiles como diagnóstico ya sea como una sonda de acuerdo con la técnica de hibridización de ADN convencionales o como cebadores para amplificación de una secuencia objetivo por reacción de cadena polimerasa (PCR), como se describe por ejemplo en Molecular Cloning, (Clonación Molecular) A Labora tory Manual , (Un manual de laboratorio) segunda, edición, Sambrook, J. , Fritsch, E. F. y Maniatis, T., eds., Cold Spring -Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) , toda la descripción de la cual aquí se incorpora por referencia. Ya que un clon ADNc MPIF-1 se ha depositado y se proporciona subsecuente nucleótido determinado, genera polinucleótidos que hibridizan' a una porción de la molécula ADNc MPIF-1 será rutinario para el diestro en la especialidad. Por ejemplo, escisión o cizallado de endonucleasa de restricción por sonicación de un clon ADNc MPIF-1 puede realizarse fácilmente para generar porciones ADN de diversos tamaños que son polinucleótidos que hibridizan a una porción de la molécula ADNc MPIF-1. En forma alterna, los polinucleótidos hibrizantes de la presente invención pueden generarse sintéticamente de acuerdo con técnicas conocidas . Por supuesto, un polinucleótido que hibridiza solo a una poli A secuencia (tal como el tracto poli (A) terminal 3 ' de ADUc o a un trecho complementario de residuos T (o U) no se incluirá en un polinucleótido de la invención empleado para hibridizar a una porción de un ácido nucleico de la invención, ya que dicho polinucleótido hibridizará a cualquier molécula de ácido nucleico que contiene un tramo (A) o su complemento (por ejemplo prácticamente cualquier ADNc de doble hebra) . Como se indica, moléculas de ácido nucleico de la presente invención que codifican un polipéptido MPIF-1 pueden incluir, pero no están limitadas a aquellas que codifican la secuencia de amino ácidos del polpéptido maduro, por sí; la secuencia de codificación para el polipéptido maduro y secuencias adicionales, tales como aquellas que codifican la secuencia líder o secretoria, tales como la secuencia pre-, o pro- o pre-pro-proteína; la secuencia de codificación del polipéptido maduro, con o sin la secuencia de 'codificación adicional anteriormente mencionadas, junto con secuencias de no codificación adicionales incluyendo por ejemplo, pero no limitado a intrones y secuencias 5 ' y 3 ' de no codificación, tales como las secuencias no traducidas, transcritas que juegan un papel en transcripción, procesamiento .ARNm incluyendo señales de escisión o ruptura y poliadenilación, por ejemplo unión de ribosoma y estabilidad de ARNm; una secuencia de codificación adicional que codifica amino ácidos adicionales tales como aquellos que proporcionan funcionalidades adicionales. De esta manera, la secuencia que codifica el polipéptido puede fusionarse a _ una secuencia marcadora, tal como una secuencia que codifica un péptido que facilita purificación del polipéptido fusionado. En ciertas modalidades preferidas de este aspecto de la invención, la secuencia de amino ácido marcador es un péptido hexa-histidina, tal como la etiqueta que se proporciona en un vector pQE (Qiagen, Inc.), entre otros, muchos de los cuales están comercialmente disponibles.

Como se describe en Gentz y colaboradores, Proc . Na ti .

Acad. Sci . USA 86:821-824 (1989), por ejemplo hexa-histidina proporciona purificación conveniente de la proteína de fusión. La etiqueta "HA" es otro péptido útil para purificación que corresponde a un epítope derivado de la proteína hemaglutinina de influenza, que se ha descrito por Wilson y colaboradores, , Cell 37: 767 (1984) . Como se discute a continuación, otras de estas proteínas de fusión incluyen un polipéptido MPIF-1 o fragmento fusionado a Fc en el extremo-C o - La presente invención además se relaciona a variantes de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención, que codifican porciones, análogos o derivados de un polipéptido MPIF-1. Variantes pueden ocurrir naturalmente, tales como una variante alélica natural. Por una "variante alélica" se pretende una de varias formas alternas de un gen que ocupa un sitio determinado en un cromosoma de un organismo. Genes V, Lewin, B., ed. , Oxford University Press, New York (1994). Variantes de origen no natural pueden producirse utilizando técnicas de mutagénesis conocidas en la técnica.

Estas variantes incluyen aquellas producidas por substituciones, eliminaciones o adiciones de nucleótido. Las substituciones, eliminaciones o adiciones pueden involucrar uno o más nucleótidos. Las variantes pueden ser alteradas en regiones de codificación, regiones de no codificación o ambas. Alteraciones en las regiones de codificación pueden producir substituciones, eliminaciones o adiciones de amino ácidos conservadores o no conservadores . En especial se prefieren entre estas substituciones adiciones o eliminaciones silenciosas que no alteran las propiedades y actividades de un polipéptido MPIF-1 o sus porciones . También se prefieren en especial en este aspecto substituciones conservadoras. Más altamente preferidas son moléculas de ácido nucleico que codifican la proteína madura o la secuencia de amino ácido madura codificada por el clon .ADNc depositado como aquí se describe. Polinucleótidos Homólogos MPIF-1 . La presente invención además se dirige a polinucleótidos que tienen al menos 95% de identidad a un polinucleótido que codifica el polipéptido de ID de SEC NO.: 2, así como sus fragmentos, estos fragmentos tienen al menos 30 bases y de preferencia al menos 50 bases y a polipéptidos codificados por estos polinucleótidos.

Adicionales modalidades de la invención incluyen moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden -- o en forma alterna, consisten de -- un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos de al menos 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntico a (a) una secuencia de nucleótido que codifican un polipéptido MPIF-1 o fragmento, que tiene una secuencia de amino ácido de ID de SEC NO. : 2 incluyendo la secuencia líder pronosticada; (b) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido MPIF-1 o fragmento, que tiene una secuencia de amino ácido de ID de SEC NO. : 2 NO. : 2 incluyendo la secuencia líder pronosticada pero menos el residuo metionina N-terminal; (c) una secuencia de nucleótido que codifica el polipéptido MPIF-1 maduro (polipéptido completo con el líder retirado) ; (d) una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de longitud íntegra con la secuencia de amino ácidos completa incluyendo el líder codificado por el clon ADNc depositado; (e) una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido maduro que tiene la secuencia de amino ácidos codificada por el clon ADNc depositado; o (f) una secuencia de nucleótidos complementaria a cualquiera de las secuencias de nucleótidos en (a) , (b) , (c) , (d) , o (e) .

Por un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos al menos, por ejemplo de 95% "idéntico" a una secuencia de nucleótido de referencia que codifica un polipéptido MPIF-1 se pretende que la secuencia de nucleótidos del polinucleótido sea idéntica a la secuencia de referencia excepto porque la secuencia de polinucleótidos puede incluir hasta cinco mutaciones punto por cada 100 nucleótidos de la secuencia de nucleótido de referencia que codifica el polipéptido. En otras palabras, para obtener un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótido al menos 95% idéntica a una secuencia de nucleótidos de referencia, hasta 5% de los nucleótidos en la secuencia de referencia puede ser eliminado o substituido con otro nucleótido o una cantidad de nucleótidos hasta el 5% del total de nucleótidos en la secuencia de referencia pueden insertarse en la secuencia de referencia. Estas mutaciones de la secuencia de referencia pueden ocurrir en las posiciones terminales 5 ' o 3 ' de la secuencia de nucleótidos de referencia o cualquiera entre esas posiciones terminales, intercalados ya sea individualmente entre nucleótidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia.

Como cuestión práctica, si cualquier molécula de ácido nucleico particular es al menos 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a, por ejemplo, la secuencia de nucleótidos mostrada en la Figura 1 o a la secuencia de nucleótidos del clon ADNc depositado, puede determinarse convencionalmente utilizando programas de computadora conocidos tales como el programa Bestfit (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wl 53711. Bestfit utiliza el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Advances in Applied Mathematics 2: 482-489 (1981), para encontrar el mejor segmento de homología entre las dos secuencias, cuando se utiliza Bestfit o cualquier otro programa para alineamiento de secuencia para determinar si una secuencia particular por ejemplo es 95% idéntica a una secuencia de referencia de acuerdo 'con la presente invención, los parámetros se establecen por supuesto de manera tal que el porcentaje de identidad se calcula sobre toda la longitud de la secuencia de nucleótidos de referencia y que se permiten espacios en la homología hasta 5% del número total de nucleótidos en la secuencia de referencia. Como cuestión práctica, ya sea cualquier molécula o polipéptido de ácido nucleico particular es al menos 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntico a una secuencia de nucleótidos de la presente invención, puede determinarse convencionalmente utilizando programas de computadora conocidos. Un método preferido para determinar la mejor correspondencia total entre una secuencia de interrogación (una secuencia de la presente invención) y una secuencia objeto, también referida como un alineamiento dé secuencia global, puede determinarse utilizando el programa de computadora FASTDB con base en el algoritmo de Brutlag y colaboradores , ( Comp . App . Biosci . 6:237-245 (1990).) En un alineamiento de secuencia, las secuencias de interrogación y sujeto son ambas secuencias de ADN. Una secuencia de ARN puede compararse al convertir U's a T's. El resultado de alineamiento de secuencia global es en por ciento de identidad. Parámetros preferidos utilizados en un alineamiento FASTDB de secuencias de ADN para calcular identidad en por ciento son: Matriz=Unitario, k-tuple=4, Penalidad de apareamiento incorrecto=l, Penalidad de unión-30, Longitud de Grupo de aleatorización = 0, calificación de corte = 1, Penalización de espacio = 5, Penalidad de tamaño de espacio = 0.05, Tamaño de ventana = 500 o a la longitud de la secuencia de nucleótido objetivo, lo que sea más corto.

Si la secuencia objetivo es más corta que la secuencia de interrogación debid'o a las eliminaciones 5 ' o 3' no debido a eliminaciones internas, debe efectuarse una corrección manual a los resultados. Esto es debido a que el programa FASTDB no toma en cuenta los truncados 5 ' y 3' de la secuencia objetivo, cuando se calcula por ciento de identidad. Para secuencias objetivo truncadas en los extremos 5 ' o 3 ' , respecto a la secuencia de interrogación, el por ciento de identidad se corrige al calcular el número de bases de la secuencia de interrogación que son 5' y 3' de ' la secuencia objetivo, y no están acopladas/alineadas, como un por ciento del total de bases de la secuencia de interrogación. Si un nucleótido es apareado/alineado, se ( determina por resultados del alineamiento de secuencia FASTDB. Este porcentaje luego se sustrae del por ciento de identidad, calculado por el programa anterior FASTDB utilizando los parámetros especificados, para llegar a una calificación de identidad en por ciento final. Esta calificación corregida es la que se utiliza para propósitos de la presente invención. Solo bases fuera de las bases 5' y 3' de la secuencia objetivo, como se describe por el alineamiento FASTDB, que no son apareadas/alineadas con la secuencia de interrogación, se calculan para los propósitos de ajustar manualmente la calificación de por ciento de identidad. Por ejemplo, una secuencia objetivo de 90 bases se alinea con una secuencia de interrogación de 100 base para determinar el por ciento de identidad. Las eliminaciones ocurren en el extremo 5 ' de la secuencia objetivo y por lo tanto, el alineamiento FASTDB no muestra un apareado/alineado de las primeras 10 bases en el extremo 5'. Las 10 bases no apareadas representan 10% de la secuencia (número de bases en los extremos 5 ' y 3 ' no apareado/número total de bases en la secuencia de interrogación) de manera tal que el 10% se sustrae de la calificación de por ciento de identidad calculada por el programa FASTDB. Si las restantes 90 bases eran perfectamente apareado, el porciento de identidad final será 90%. En otro ejemplo, una secuencia objeto de 90 bases se compara con una secuencia de interrogación de 100 bases. Esta vez, las eliminaciones son eliminaciones internas de manera tal que no hay bases en 5 ' o 3 ' de la secuencia objeto que no están apareadas/alineadas con la interrogación. En este caso, el por ciento de identidad calculado por FASTDB no se corrige manualmente. De nuevo, solo las bases 5' y 3' dé la secuencia objeto que no están apareadas/alineadas con la secuencia de interrogación se corrigen manualmente. Ninguna otra corrección manual se hará para - los propósitos de la presente invención. De preferencia, los programas descritos anteriormente se utilizan para alinear un polinucleótido de la presente invención (la secuencia de referencia) y una segunda secuencia, y el por ciento de identidad se calcula manualmente. El porciento de identidad es el número de nucleótidos individúales que son idénticos entre dos secuencias, dividido por el número total de secuencias de nucleótido en la secuencia de referencia, multiplicado por 100%. Por ejemplo, para determinar el por ciento de identidad de los nucleótidos 1 a 360 de ID SEQ NO. : 1 a una segunda secuencia, el número de apareamientos incorrectos de nucleótido (es decir, mutaciones punto: inserciones, eliminaciones y substituciones) se cuenta y substrae de 360 (el número de nucleótidos en la secuencia de referencia) para obtener el número de nucleótidos idéntico. El número resultante se divide por 360 y luego multiplica por 100. Si hay apareamientos incorrectos (es decir mutaciones punto: inserciones, eliminaciones y substituciones de nucleótidos inhibidores) en las posiciones 1-5, 18, 201-210, 300, 302,318-328,330, 336, 341 y 349-352 de ID de SEC NO.: 1, el % de identidad será 90%. (5+1+10+1+1+11+1+1+1+3=36. 360-36=324. 324/360=0.9. 0.9x100=90%) El por ciento de identidad de los polipéptidos se calculará en forma análoga. Como una persona con destreza ordinaria en la especialidad apreciará, debido a las posibilidades de errores de secuenciado discutidos anteriormente, así como la variabilidad de sitios de escisión para líderes en diferentes proteínas conocidas, el polipéptido MPIF-1 maduro codificado con el ADNc depositado comprende aproximadamente 99 amino ácidos, pero puede estar en cualquier parte en el rango de 75-120 amino ácidos; y la secuencia líder actual dé esta proteína es aproximadamente 21 amino ácidos, pero puede estar en cualquier parte en el rango de aproximadamente 15 a aproximadamente 35 amino ácidos. Las variantes MPIF-1 pueden contener alteraciones en las regiones de codificación, regiones de no codificación o ambas. Se prefiere en especial variantes de polinucleótido que contienen alteraciones que producen substituciones, adiciones o eliminaciones silenciosas que no alteran las propiedades y actividades del polipéptido codificado. Variantes de nucleótido producidas por substituciones silenciosas debido a la degeneración del código genético, se prefieren. Aún más, variantes en donde 5-10, 1-5, o 1-2 amino ácidos están substituidos, eliminados o agregados en cualquier combinación, también se prefieren. Variantes de polinucleótidos MPIF-1 puede producirse por una variedad de razones, por ejemplo para optimizar expresión de codón para un huésped particular (colores de cambio en el .ARNm humano a aquellos preferidos por un huésped endoterial tal como E.coli) . Variantes MPIF-1 de origen natural se denominan "variantes alelicas" y se refieren a una de varias formas alternas de un gen que ocupa un sitio determinado en un cromosoma de un organismo (Genes II, Lewin, B., ed. , John Wiley & Sons, New York (1985) .) Estas variantes alélicas pueden variar en cualquiera del nivel del polinucleótido y/o polipéptido, y se incluyen en la presente invención. En forma' alterna, variantes de origen no natural pueden producirse por técnica de mutagénesis o por síntesis directa. Sondas de ácido nucleico . Estas moléculas aisladas, particularmente moléculas de .ADN son útiles como sondas para mapeo de genes, por hibridización in si tu con cromosomas y para detectar expresión de un gen MPIF-1 en tejido humano, por ejemplo por análisis Northern blot. La presente inve.nción además se dirige a fragmentos de las moléculas de ácido nucleico aisladas descritas aquí. Por un fragmento de una molécula de ácido nucleico aislado que tiene la secuencia de nucleótidos del ADNc MPIF-1 depositado, o una secuencia de nucleótidos mostrada en la Figura 1 o 20A (ID de SEC NO. : 1 o 6) se pretenden en fragmentos de al menos aproximadamente 15 nt y más preferible al menos aproximadamente 20 nt, aún más preferible al menos aproximadamente 30 nt y en especial al menos aproximadamente 40 nt de longitud que con útiles como sondas de diagnóstico y cebadores puede ser como se discutie aquí. Por supuesto, fragmentos más grandes de 50 a 500 nt de longitud también son útiles de acuerdo con la presente invención al igual que fragmentos correspondientes a la mayoría sino toda la secuencia de nucleótidos del .ADNc MPIF-1 depositado, o como se ilustra en la Figura 1 o 20A (ID de SEC NO. : 1 o 6) . Por un fragmento al menos de 20 nt de longitud, por ejemplo se entienden fragmentos que incluyen 20 o más bases contiguas de la , secuencia de nucleótido del .ADNc depositado o la secuencia de nucleótido o como se ilustra en la Figura 1 o 20A (ID de SEC NO. : 1 o, 6) . Ya que el gen ha sido depositado y la secuencia de nucleótidos mostrada en la Figura 1 o 20A (ID de SEC NO. : 1 o 6) se proporciona, generar estos fragmentos de ADN será rutinario para la persona con destreza en la especialidad. Por ejemplo, si sellado o escisión de endonucleasa de restricción por sonicación puede emplearse fácilmente para generar fragmentos de diversos tamaños. En forma alterna, estos fragmentos pueden generarse sintéticamente. La presente solicitud se dirige a moléculas de ácido nucleico al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idénticas a las secuencias de ácido nucleico aquí descritas, (por ejemplo, codificar un polipéptido que tiene una secuencia de amino ácidos de una eliminación de terminal" N y/o C descrita a continuación como m-n de ID de SEC NO. : 2 o 7) , independientemente de si codifican un polipéptido que tiene actividad funcional MPIF-1. Esto es debido a que incluso cuando una molécula de ácido nucleico particular no codifica un polipéptido que tiene una actividad funcional MPIF-1, una persona con destreza en la especialidad aún sabrá como utilizar la molécula de ácido nucleico, por ejemplo con una sonda de hibridización o un cebador de reacción de cadena polimerasa (PCR) . Usos de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención que no codifican un polipéptido que tiene actividad funcional MPIF-1, incluyen, entre otros (1) aislar un gen MPIF-1 o variantes alélicas o de escisión del mismo en una biblioteca .ADNc; (2) hibridización in si tu (por ejemplo "FISH") a dispersiones cromosomales metafase para proporcionar ubicación cromosomal precisa del gen MPIF-1 como se describe en t Verma y colaboradores , Human Chromosomes : A Manual of Basic Techniques, (Cromosomas humanos: un manual de técnicas básicas) Pergamon Press, New York (1988) ; y (3) análisis Northern blot para detectar expresión .ARNm MPIF-1 en residuos específicos. Sin embargo, se prefieren moléculas de ácido nucleico que tienen secuencias al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idénticas a las secuencias de ácido nucleico aquí descritas, que, de hecho codifican un polipéptido que tiene actividad funcional MPIF-1. Por "polipéptido que tiene actividad funcional MPIF-1" se pretenden polipéptidos que exhiben actividad similar, pero no es esencialmente idéntica a una actividad funcional de los polipéptidos MPIF-1 de la presente invención (por ejemplo, MPIF-1 completo) de toda la longitud, MPIF-1 maduro, y MPIF-1 soluble, (por ejemplo que tiene _ secuencias contenidas en el dominio extra celular de MPIF-1 (como se mide, por ejemplo en un ensayo biológico o en un ensayo particular. Por ejemplo, una actividad funcional MPIF-1 puede medirse rutinariamente al determinar la capacidad de un polipéptido MPIF-1 para unir un ligando MPIF-1. La actividad funcional MPIF-1 también puede medirse al determinar la capacidad de un polipéptido, tal como ligando específico, que está libre o expresado en una superficie de células, para inducir células que expresen el polipéptido. Fragmentos del gen de longitud completa de la presente invención pueden utilizarse como una sonda de liibridización para una biblioteca ADNc para aislar el ADNc de longitud completa y aislar otros ADNcs, que tienen alta similaridad de secuencia al gen o actividad biológica similar. Sondas de este tipo de preferencia tienen al menos 30 bases y pueden contener por ejemplo 50 o más bases. La sonda también puede utilizarse para identificar un clon ADNc correspondiente a una transcripción de longitud completa y un clon o clones genómicos que contienen el gen completo incluyendo regiones regulatorias y promotoras, exones e intrones. Un ejemplo de un monitoreo comprende aislar la región de codificación del gen al utilizar la secuencia ADN conocida para sintetizar una sonda oligonucleótido. Oligonucleótidos etiquetados que tienen una secuencia complementaria a la del gen de la presente invención, se utilizan para monitorear una biblioteca de .ADNc humano, ADN genómico o ARNm para determinar que miembros de la biblioteca hibridiza la sonda. La presente invención también se dirige a fragmentos polinucleótidos de los polinucleótidos de la invención. En la presente invención, un "fragmento polinucleótido" se refiere a un corto polinucleótido que tiene una secuencia de ácido nucleico que: es una porción del contenido de un clon depositado, o codifica el polipéptido codificado por ADNc en un clon depositado; es una porción de aquel mostrado en (ID de SEC NO. : 1 o 6) , o la hebra complementaria, o es una porción de una secuencia de polinucleótido que codifica el polipéptido de ID de SEC NO. : 2. Los fragmentos de nucleótido de la invención de preferencia son de al menos aproximadamente 15 nt, más preferible al menos aproximadamente 20 nt , aún más preferible al menos 30 nt y aún más preferible, aproximadamente 40 nt, al menos aproximadamente 50 nt, al menos aproximadamente 75 nt o al menos aproximadamente 150 nt de longitud. Un fragmento de "al menos 20 nt de longitud" por ejemplo se pretende que incluya 20 o más bases contiguas de la secuencia ADNc contenida en un clon depositado o la secuencia de nucleotido mostrada en ID SEC NO.: 1 o 6. En este contexto "aproximadamente" incluye el valor particularmente descrito, un valor mayor o menor por varios nucleótidos (5, 4, 3, 2 o 1) en cualquier extremo o en ambos extremos. Estos fragmentos nucleótido tienen usos que incluyen, pero no están limitados a, como sondas de diagnóstico y cebadores como se discute aquí. Por supuesto, se prefieren más grandes fragmentos (por ejemplo 50, 150, 500, 600, 2000 nucleótidos) . Además, la invención incluye un polinucleótido que comprende, o consiste alternativamente de, cualquier porción de al menos aproximadamente 25 nucleótidos, al menos aproximadamente 30 nucleótidos, al menos aproximadamente 35 nucleótidos, al menos aproximadamente 40 nucleótidos, al menos aproximadamente 45 nucleótidos, de preferencia al menos aproximadamente 50 nucleótidos, al menos aproximadamente 60 nucleótidos, al menos aproximadamente 70 nucleótidos, al menos aproximadamente 80 nucleótidos, al menos aproximadamente 90 nucleótidos o al menos aproximadamente 100 nucleótidos de ID de SEC NO. : 1 o 6 del residuo 50-599, 100-599, 200-599, 300-599, 400-599, 500-599, 600-1800, 50-500, 100-500, 200-500, 300-500, 400-500, 50-400, 100-400, 200-400, 300-400, 50-300, 100-300, 200-300, 50-200, 100-200, y 50-100. Aún más, ejemplos representativos de fragmentos polinucleótido de la invención incluyen por ejemplo fragmentos que comprenden, o alternativamente consisten de una secuencia de aproximadamente nucleótido número 1-50, 51-100, 101-150, 151-200, 201-250, 251-300, 301-350, 351-400, 401-450, 451-500, 501-550, o 551 al extremo de ID SEC NO. : 1 o 6 o su hebra complementaria, o el .ADNc contenido en el clon depositado. En este contexto "aproximadamente" incluye los rangos particularmente descritos y rangos más grandes o más pequeños por varios nucleótidos (5, 4, 3, 2, o 1) nucleótidos en cualquier extremo o en ambos extremos. De preferencia, estos fragmentos codifican un polipéptido que tiene actividad biológica. Más preferiblemente estos polinucleótidos pueden emplearse como sondas o cebadores como se discute aquí. Polinucleótidos que hibridizan a estas moléculas de ácido nucleico bajo condiciones de hibridización descritas o condicionéis menos estrictas también se abarcan por la invención, al igual que polipéptidos codificados por estos polinucleótidos. En la presente invención, un "fragmento polipéptido" se refiere a una secuencia amino ácido que es una porción de aquel contenido en ID SEC NO. : 2 o codificado por el ..ADNc contenido en el clon depositado. Vectores, Células Huésped y Expresión de Proteína . La presente invención también se refiere a vectores que contienen las moléculas de ácido nucleico aisladas de la presente invención, células huésped de ingeniería genética que contienen los vectores recombinantes y la producción de polipéptidos MPIF-1 o sus fragmentos por técnicas recombinantes. La presente invención además se relaciona a vectores de expresión novedosos útiles para la producción de proteínas en sistemas bacterianos. Estos vectores novedosos se ejemplifican por la serie pHE4 de vectores y en particular, el vector pHE4-5 (Figuras 31 y 36A-E) . El polinucleótido que codifica la proteína de la presente invención puede unirse a un vector que contiene un marcador seleccionable para preparación en un huésped. Como se discute en detalle a continuación, en general un vector plásmido se introduce en una célula huésped en un precipitado, tal como precipitado de fosfato de calcio, o en un complejo con un líquido cargado. Si el vector es un virus, puede empacarse in vi tro utilizando una línea celular de empaque apropiada y luego transducido en células huésped. Preferidos para utilizar en la práctica de la presente invención son vectores que comprenden regiones de control de acción Cis, que están enlazadas operativamente con el polinucleótido de interés. Regiones de control de acción Cis incluyen secuencias de mejorador y operador. Como se emplea aquí, el término "operador" se refiere a una secuencia de nucleótido, usualmente compuesta por .ADN, que controla la transcripción de una secuencia de nucleótido adyacente. Secuencias de operador en general se derivan de cromosomas bacterianos .

Transcripción de las secuencias nucleótido que codifican los polipéptidos de la presente invención por superiores eucariotas, puede incrementarse al insertar una secuencia mejoradora en el vector. Mejoradores son elementos de acción Cis usual de aproximadamente 10 a 30 bp, que actúan para incrementar la actividad de transcripción de un promotor en un tipo de célula huésped determinado. Ejemplos de mejoradores incluyen el mejorador SV40, que se localiza en el lado posterior del origen de replicación en bp 100 a 270, el mejorador promotor anterior citomegalovirus, el mejorador polioma en el lado posterior del origen de replicación y mejoradores de adenovirus. Factores de acción trans apropiados pueden suministrarse por el huésped, suministrarse por un vector de complemento o suministrarse por el propio vector ante introducción al huésped. En ciertas modalidades preferidas en este aspecto, los vectores proporcionan expresión específica, que puede ser inducible y/o específica del tipo de célula. Se prefieren en particular entre estos vectores aquellos inducibles por factores ambientales que son fáciles de manipular tales como temperatura y aditivos nutrientes. También se prefiere ' para expresión de MPIF-1 el vector pHE4-5 descrito en el Ejemplo 30.

Vectores de expresión adicionales útiles de la presente invención incluyen vectores derivados de cromosoma, episoma y virus, por ejemplo, vectores derivados de plásmidos bacterianos, bacteriófago, episomas de levadura, elementos cromosomales de levadura, virus tales como baculovirus, papova virus, virus de vacuna (vaccinia) , adenovirus, virus de viruela de aves, virus de pseudorabia y retrovirus, y vectores derivados de sus combinaciones tales como cósmidos y fagémidos. La secuencia de ácido nucleico apropiada puede insertarse en el vector por una variedad de procedimientos. En general, la secuencia de ácido nucleico se inserta en uno o varios sitios de endonucleasa de restricción apropiados por procedimientos conocidos en la técnica. Estos procedimientos y otros se consideran dentro del alcance de aquellos con destreza en la técnica. El inserto de ácido nucleico deberá ser enlazado operativamente con un promotor apropiado tal como el promotor fago lambda PL, los promotores E. col i lac, trp y tac, los promotores temprano y posterior SV40 y promotores de LTRs retrovirales y otros promotores conocidos que controlan la expresión de genes en células procarióticas o eucarióticas o sus virus. Otros promotores convenientes serán conocidos por la persona con destreza en la especialidad. Como se emplea aquí, el término "promotor" se refiere a una secuencia de nucleótidos o un grupo de secuencias de nucleótidos que, como mínimo proporciona un sitio de unión o ~ sitio de iniciación para acción de polimerasa .ARN. La expresión construcciones además contiene sitios para inicio de transcripción, terminación y, en la región transcrita, un sitio de unión de ribosoma para traducción. La porción de codificación de las transcripciones maduras expresadas por las construcciones, de preferencia incluirán una traducción que se inicia al principio y un codón de terminación (UAA, UGA o UAG) colocado apropiadamente al final del polipéptido a traducir. El vector también puede incluir secuencias apropiadas para amplificar expresión. Como se emplea aquí, la frase "enlazado operativamente" se refiere a un enlace en donde se conecta una secuencia nucleótido a otra secuencia (o secuencias) nucleótido de manera tal que se pueda alterar el funcionamiento de la secuencia (o secuencias) . Por ejemplo, una secuencia de codificación de proteína, que se enlaza operativamente con un promotor/operador coloca expresión de la secuencia de codificación de proteína bajo la influencia o control de estas secuencias. Dos secuencias de nucleótido (tales como la secuencia de codificación de proteína y una secuencia de la región de promotor enlazada al extremo 5 ' de la secuencia de codificación) se dice que están enlazadas operativamente si la inducción de la función promotor resulta en la transmisión de la secuencia de codificación de proteína ARNm y si la naturaleza del enlace entre las dos secuencias de nucleótido no, (1) resulta en la introducción de una mutación con desplazamiento de cuadro ni (2) evita las secuencias regulatorias de expresión para dirigir la expresión del ARNm o proteína. De esta manera una región promotora será enlazada operativamente a una secuencia de nucleótidos, si el promotor fuera capaz de efectuar transcripción de esa secuencia de nucleótido. Como se emplea aquí, la frase "vector de clonación" se refiere a un plásmido o ácido nucleico fago u otra secuencia de ácido nucleico que sea capaz de replicar autónomamente en una célula huésped, y que se caracteriza por uno o un número pequeño de sitios de reconocimiento de endonucleasa en los cuales estas secuencias de ácido nucleico pueden cortarse en una forma determinable sin pérdida de una función biológica esencial del vector, en la cual puede lisar o romper el ácido nucleico a fin de lograr su replicación y clonación. El vector de clonación además puede contener un marcador conveniente para utilizar en la identificación de células transformadas con el vector de clonación. Marcadores, por ejemplo son resistencia a canamicina y eritromicina. El término "vehículo" en ocasiones se utiliza para "vector" . Como se emplea aquí, la frase "vector de expresión" se refiere a un vector similar a un vector de clonación que es capaz de expresar un gen estructural clonado en el vector de expresión, después de transformación del vector de expresión en un huésped. En un vector de expresión, el gen estructural clonado (cualquier secuencia de codificación de interés) se coloca bajo el control de (es decir enlazado operativamente con) ciertas secuencias que permiten que este gen sea expresado en un huésped específico. En el vector pHE4-5, por ejemplo, el gen estructural se enlaza operativamente a una secuencia promotor fago T5 y dos secuencias operador lac. Secuencias de control de expresión variarán y adicionalmente pueden tener elementos de transcripción tales como secuencias de terminación y/o elementos de traducción tales como sitios de inicio y terminación. Como se indicó anteriormente, los vectores de expresión de preferencia incluyen al menos un marcador seleccionable. Estos marcadores incluyen dihidrofolato reductasa o resistencia a neomicina para cultivo de células eucarióticas y genes de resistencia a tetraciclina, canamicina, o ampicilina para cultivar en E. coli y otras bacterias. Ejemplos representativos de huéspedes apropiados incluyen, pero no están limitados a, células bacterianas tales como células de E. coli , Streptomyces y Salmonella typhimurium; células fúngales, tales como células de levadura (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae o Pichia pastoris (Acceso ATCC No. 201178)); células de insecto tales como células de Drosophila S2 y Spodoptera Sf9; células de animales tales como CHO, COS, 293 y células de melanoma Bowes, y células de planta. Medios de condiciones de cultivo apropiados para las células huésped anteriormente descritas se conocen en la especialidad. Además del uso de vectores de expresión en la práctica de la presente invención, la presente invención además incluye novedosos vectores de expresión que comprenden elementos promotores y operadores enlazados operativamente con secuencias de nucleótidos que codifican una proteína de interés. Un ejemplo de este vector es pHE4-5 (ID SEC NO. : 37) que se describe en detalle tanto a continuación como en el Ejemplo 14. El vector pHE4-5 se depositó en septiembre 30 de 1997 en la Colección de Cultivo Tipo Americano Depósito de Patente, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, y se le otorgó el número de acceso ATCC 209311- Como se resume en las Figuras 31 y 36, los componentes del vector pHE4-5 (ID SEC NO. : 37) incluyen: (1) un gen neomicinfosfotransferasa como un marcador de selección, (2) un origen de replicación de _ E. coli (3) una secuencia de promotor T5 fago, (4) dos secuencias de operador lac, (5) una secuencia de nucleótido que codifica MPIF-1 23 (ID SEC NO. : 27) , (6) una secuencia a Shine-Delgarno, (7) el gen represor operon lactosa, (laclq) . El origen de replicación (oriC) se deriva de pUC19 (LTI, Gaíthersburg, MD) . -La secuencia de promotor fue y las secuencias operadoras se hicieron científicamente. Producción sintética de secuencias de ácido nucleico_ es bien conocida en la técnica. CLONTECH 95/96 Catálogo, páginas 215-216y CLONTECH, 1020 East Meadow Circle, Palo Alto, CA 94303. Como se notó anteriormente, el vector pHE4-5 contiene un gen laclq. laclq es un alelo del gen lacl que confiere estricta regulación del operador lac . Amann, E. y colaboradores, Gene 69:301-315 (1988); Stark, M., Gene 51:255-267 (1987). El gen laclq codifica una proteína represora que liga a secuencias operadoras lac y bloquea transcripción de secuencias corriente abajo (es decir 31) . Sin embargo, el producto gen laclq se disocia del operador lac en la presencia de cualquiera de lactosa o ciertos análogos de lactosa, por ejemplo isopropil B-D-tiogalactopiranosida (IPTG) . MPIF-1 23 de esta manera no se produce en cantidades aprecíables en células huésped no inducidas que contienen el vector pHE4-5. La inducción de estas células huésped por adición de un agente tal como IPTG, sin embargo, resulta en la expresión de la secuencia de codificación MPIF-1 23. Las secuencias de promotor/operador (ID de SEC NO. : 38) del vector pHE4-5 comprenden un promotor fago T5 y dos secuencias de operador lac . Un operador está localizado 5 ' al sitio de inicio de transcripción y el otro está localizado 3' al mismo sitio. Estos operadores, cuando están presentes combinación con el producto de gen laclq, confieren represión estricta de secuencias corriente abajo en la ausencia de un inductor operon lac por ejemplo, IPTG. La expresión de secuencias enlazadas operativamente localizadas corriente abajo de los operadores lac puede ser inducida por la adición de un inductor operon lac tal como IPTG. El enlace de un inductor lac, a las proteínas laclq resulta en su liberación de las secuencias de operador lac y el inicio de transcripción de secuencias enlazadas operativamente. La regulación del operon Lac de la expresión de gen se revisa en Devlin, T. , TEXTBOOK OF BIOCHEMISTRY WITH CLINICAL CORRELATIONS (LIBRO DE TEXTO DE BIOQUÍMICA CON CORRELACIONES CLÍNICAS), 4a. Edición (1997), páginas 802-807. La serie de vectores pHE4 contiene todos los componentes del vector pHE4-5 excepto por la secuencia de codificación MPIF-1 23. Características de los vectores pHE4 incluyen promotor fago T5 sintético optimizado, operador lac y secuencias Shine-Delagarno. .Además, estas secuencias también están espaciadas óptimamente de manera tal que la expresión de un gen insertado puede regularse apretadamente y ocurre alto nivel de expresión ante inducción. Entre promotores bacterianos conocidos adecuados para utilizar en la producción de proteína de la presente invención, incluyen, los promotores E. col i lacl y lacZ , los promotores T3 y T7, el promotor gpt , los promotores PR y PL lambda y el promotor trp .

Promotores eucarióticos convenientes incluyen el promotor anterior inmediato CMV, el promotor de timidina cinasa HSV, los promotores anteriores posteriores SV40 el promotor de LTRs retrovirales tales como aquellos del Virus Rous Sarcoma (RSV) , y promotores de metalotioneina, tales como el promotor metalotioneina-I de ratón. El vector pHE4-5 también contiene una secuencia Shine-Delgarno 5' al codón de inicio AUG. Secuencias Shine-Delgarno son secuencias cortas generalmente localizadas aproximadamente 10 _ nucleótidos corriente arriba (es decir, 51) del codón de inicio AUG. Estas secuencias esencialmente dirigen ribosomas procarióticos al codón de inicio AUG. De esta manera, la presente invención también se dirige a vectores de expresión útiles para la producción de las proteínas de la presente invención en bacterias. Este aspecto de la invención se ejemplifica por el vector pHE4-5 (ID SEC NO. : 37)~ (acceso ATCC No. 20931) y sus variaciones. Vectores adicionales preferidos para utilizar en la expresión de las proteínas de la presente invención en bacterias incluyen pQE70, pQE60 y pQE-9, (Qiagen); vectores pBS vectores, pDlO, vectores Phagescript, vectores pBluescript, vectores • pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A, disponible de Stratagene; y ptrc99a, pKK233-3, pDR540, pRIT5 disponible de Pharmacia. Entre vectores eucarioticos preferidos están pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTl y pSG disponible de Stratagene; y pSVK3 , pBPV, pMSG y pSVL disponible de Pharmacia. Otros vectores adecuados serán fácilmente aparentes a la persona con destreza e incluyen pBR322 (ATCC 37017) , pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden) y GEMÍ (Promega Biotec, Madison, Wl , USA) . Estas secciones de "estructura principal" pBR322 se combinan con un promotor apropiado y la secuencia estructural a expresar. Después de transformación de una cepa huésped conveniente y crecimiento de la cepa huésped a una densidad celular apropiada, el promotor selecto se induce por medios apropiados (por ejemplo el desplazamiento de temperatura o inducción química) y se cultivan células por un periodo adicional . En una modalidad adicional, la presente invención se refiere a células huésped que contienen la construcción anteriormente descrita. La célula huésped puede ser una célula eucariótica superior, tal como una célula de mamífero o una célula eucariótica inferior, tal como una célula de levadura, o la célula huésped puede ser una célula procariótica tal como una célula bacteriana. La introducción de la construcción en la célula huésped puede efectuarse por transfección de fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano transfección mediada por lípido catiónico, electroporación, transducción, infección u otros métodos. Estos métodos se describen én muchos manuales de laboratorio estándar, tales como Davis y colaboradores, BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (MÉTODOS BÁSICOS EN BIOLOGÍA MOLECULAR) (1986) . Pueden introducirse construcciones recombinantes en células huésped utilizando técnicas bien conocidas tales como infección, transducción, transfección, transvección, electroporación y transformación. El vector puede por ejemplo ser un fago, plásmido, vector viral o retroviral. Vectores retrovirales pueden ser competentes para replicación o defectuosos para replicación. En este último caso, la propagación viral en general ocurrirá s lo en células huésped de complemento. Células huésped se someten a ingeniería genética (transducidas o transformadas o trasfectadas) con los vectores de la invención que pueden por ejemplo ser un vector de clonación o un vector de expresión. El vector puede estar, por ejemplo, en la forma de un plásmido, una partícula viral, un fago, etc. Las células huésped de ingeniería pueden cultivarse en medio nutriente convencional modificado según sea apropiado para activar promotores, seleccionar transformantes o amplificar el MPIF-1 y genes. Las condiciones de cultivo tales como temperatura, pH y semejantes son aquellas previamente empleadas con la célula huésped selecta para expresión, y serán aparentes a la persona con destreza en la especialidad ordinaria. Los polinucleótidos de la presente invención pueden ser empleados para producir- polipéptidos por técnicas recombinantes. De esta manera, por ejemplo la secuencia de polinucleótidos puede incluirse en cualquiera de una variedad de vehículos de expresión, en particular vectores o plásmidos para expresar un polipéptido. Estos vectores incluyen secuencias de ácido nucleico cromosomal, no cromosomal y sintético, por ejemplo derivados se SV40; plásmidos bacterianos; ácido nucleico fago; plásmidos de levadura; vectores derivados de combinaciones de plásmidos y ácido nucleico fago, ácido nucleico viral tales como virus de la vacuna de viruela, adenovirus, virus de viruela de aves, alfavirus y enfermedad de Aujeszky. Sin embargo, puede emplearse cualquier otro plásmido o vector siempre que sea replicable y viable en el huésped. Como se notó anteriormente, el vector que contiene la secuencia de ácido nucleico apropiada como se describió anteriormente, así como secuencia de control o promotor apropiado, puede emplearse para transformar un huésped apropiado para permitir que el huésped exprese la proteína . Como ejemplos representativos de huéspedes apropiados, pueden mencionarse: células bacterianas tales como E. coli , Streptomyces, Salmonella typhimurium; células fúngales tales como levaduras; células de insecto tales como Drosophila y Sf9; células animales tales como CHO, COS o melanoma Bowes; células de planta, etc. La selección de un huésped apropiado se considera dentro del alcance de aquellos con destreza en la especialidad a partir de las presentes enseñanzas. De manera más particular, la presente invención también incluye construcciones recombinantes que comprenden una o más de las secuencias como se describió ampliamente con anterioridad. Las construcciones comprenden un vector, tal como un plásmido o vector viral en el cual se ha insertado una secuencia de la invención, en una orientación directa o inversa. En un aspecto preferido de esta modalidad, la construcción además comprende secuencias regulatorias, incluyendo por ejemplo un promotor, enlazado operativamente con la secuencia. Grandes números de vectores y promotores convenientes se conocen por aquellos con destreza en la especialidad, y están comercialmente disponibles. A manera de ejemplo se proporcionan los siguientes vectores. Bacterial: pQE70, PQE60, pQE-9 (Qiagen), pBS, pDlO, phagescript, psiX174, pBluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A 5 (Stratagene); ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia) . Eucariótico: pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTl , pSG (Stratagene) pSVK3 , pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia) . it— Sin embargo, cualquier otro plásmido o vector puede emplearse siempre que sea replicable y viable en el 10 huésped. Las construcciones en células huésped pueden emplearse en una forma convencional para producir el producto gen codificado por la secuencia recombinante.

^ En forma alterna, los polipeptidos de la invención pueden 15 producirse sintéticamente por sintetizadores de péptido convencionales . Proteínas maduras pueden expresarse en células de mamífero, levadura, bacterias u otras células bajo el control de los promotores apropiados. Sistemas de 20 traducción libres de células también pueden emplearse para producir estas proteínas utilizando .ARNs derivados de las construcciones de ácido nucleico de la presente invención. Vectores de expresión y clonación apropiados para utilizar con huéspedes procarióticos y eucarióticos 25 se describen por Sambrook, y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Clonación molecular: un manual de laboratorio) , Segunda Edición, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), la descripción del cual aquí se incorpora por referencia. En general, los vectores de expresión recombinantes incluirán orígenes de replicación y marcadores seleccionables que permiten transformación de la célula huésped, por ejemplo, el gen de resistencia a ampicilina del gen E. coli y S . cerevisiae TRP1, y promotor derivado de un gen altamente expresado para dirigir transcripción de una secuencia estructural corriente abajo. Estos promotores pueden derivarse de operones que codifican enzimas glicolíticas tales como 3-fosfoglicerato cinasa (PGK) , factor-, fosfatasa acida, o proteínas de choque térmico, entre otros. La secuencia estructural heteróloga se ensambla en fase apropiada con secuencias de terminación e inicio de traducción, y de preferencia una secuencia líder capaz de dirigir la secreción de la proteína traducida en el espacio periplásmico o medio extracelular. Opcionalmente, la secuencia heteróloga puede codificar una proteína de fusión incluyendo un péptido de identificación N-terminal que imparte características deseadas, por ejemplo estabilización o purificación simplificada del producto recombinante expresado.

Vectores de expresión útiles para uso bacterial se construyen al insertar una secuencia de ácido nucleico estructural que codifica una proteína deseada junto con señales de inicio y terminación de traducción convenientes en fase de lectura operable con un promotor funcional . El vector comprenderá uno o más marcadores seleccionables fenotípicos y un origen de replicación para asegurar mantenimiento del vector y para, si se desea proporcionar amplificación dentro del- huésped. Huéspedes procarióticos convenientes para transformación incluyen E. coli , Bacillus subtili , Salmonella typhimurium y diversas especies dentro de los géneros Pseudomonas, Streptomyces, y Staphylococcus , aunque otros también pueden ser empleados como cuestión de elección. Las células típicamente se cosechan por centrifugación, rompen por medios físicos o químicos, y el extracto crudo resultante se retiene para mayor purificación . Células microbianas empleadas en la expresión de proteínas pueden ser interrumpidas por cualquier método conveniente, incluyendo ciclos de congelamiento-descongelamiento, sonicación, ruptura mecánica, o uso de agentes de lisis celular, tales métodos son bien conocidos por aquellos con destreza en la especialidad.

Diversos sistemas de cultivo celular de mamíferos también pueden emplearse para expresar proteína recombinante. Ejemplos de sistemas de expresión de mamíferos incluyen líneas COS- 7 de fibroblastos de riñon de mono, descritos por Gluzman, Cell 23: 175 (1981), y otras líneas celulares capaces, de expresar un vector compatible, por ejemplo las líneas celulares C127, 3T3, CHO, HeLa y BHK. Vectores de expresión de mamífero comprenderán un origen de replicación, un promotor conveniente y mejorador, y también cualesquiera sitios de unión de ribosoma necesarios, sitio de poliadenilación, donador, sitios donador y aceptor de lisado, secuencias de terminación de transcripción y secuencias no transcritas de flanqueo 5 ' . Secuencias de ácido nucleico derivadas de lisado SV40 y sitios de poliadenilación pueden emplearse para proporcionar los elementos genéticos no transcritos requeridos. Polipéptidos MPIF-1, y de preferencia en la forma secretada, también pueden recuperarse de: productos purificados de fuentes naturales, incluyendo fluidos corporales, tejidos y células, ya sea directamente aislados o cultivados; productos de procedimientos sintéticos químicos; y productos producidos por técnicas recombinantes de un huésped procariótico o eucariótico, incluyendo por ejemplo células bacterianas, de levadura, de plantas superiores, insectos y mamíferos. Dependiendo del huésped empleado en un procedimiento de producción recombinante, los polipéptidos MPIF-1 pueden ser glicosílados o pueden ser no glicosilados. Además, polipéptidos MPIF-1 también _pueden incluir un residuo metionina modificado inicial, en algunos casos como resultado de procesos mediados por huésped. De esta manera, es bien conocido en la técnica que la metionina N-terminal codificada por un codón de inicio de traducción generalmente se retira con alta eficiencia de cualquier proteína después de traducción en todas las células eucarióticas. Mientras que la metionina N-terminal en la mayoría de las proteínas también se retira eficientemente en la mayoría de los procariotas, para algunas proteínas, este proceso de remoción procariótica es ineficiente, dependiendo de la naturaleza del amino ácido al cual se enlaza covalentemente la metionina N-terminal . Además de abarcar células huésped que contienen las construcciones de vector aquí discutidas, la invención también abarca células huésped primarias y secundarias e inmortalizadas de origen vertebrado, particularmente origen de mamífero, que se han sometido a ingeniería para eliminar o reemplazar material genético endógeno (por ejemplo secuencia de codificación MPIF-1) , y/o para incluir' material genético (secuencias polinucleótido heterólogas) que se asocia operativamente con polinucleótidos MPIF-1 de la invención, y que activa, altera y/o amplifica polinucleótidos MPIF-1 endógenos. 5 Por ejemplo, técnicas conocidas en la especialidad pueden emplearse para asociar en forma operable regiones de control heterólogas (por ejemplo promotor y/o mejorador) W ) y secuencias de polinucleótido MPIF-1 endógenas mediante recombínación homologa (ver por ejemplo la Patente de los 10 E.U.A. No. 5,641,670, otorgada en junio 24, 1997; La Publicación Internacional No. WO 96/29411, publicada en septiembre 26, 1996; Publicación Internacional No. WO 94/12650, publicada en agosto 4, 1994; Koller y colaboradores, Proc. Nati . Acad. Sci . USA 86T8932-8935 15 (1989); y Zijlstra y colaboradores j Nature 342:435-438 (1989) , la descripición de cada una de las cuales aquí se incorpora por referencia totalmente) . Polipéptidos MPIF-1 La invención además proporciona un polipéptido 20 MPIF-l aislado que tiene la secuencia de amino ácidos codificada por el ADNc depositado, o la secuencia de amino ácidos en la Figura 1 (ID SEC NO . : 2) , o un péptido o polipéptido que comprende, o consiste en forma alterna de una porción de los polípéptidos anteriores.

Los términos "péptido" y "oligopéptido" se consideran sinónimos (como se reconoce comúnmente) y cada término puede emplearse en forma intercambiable según requiere el contexto para indicar una cadena de al menos dos amino ácidos acoplados por el peptidilo. La palabra "polipéptido" se emplea aquí para cadenas que contienen más de diez residuos amino ácidos. - Todas las fórmulas y secuencias de oligopéptidos y polipéptidos presentes están escritas de izquierda a derecha y en la dirección de extremo amino a extremo carboxi. La invención además proporciona las proteínas que contienen, o en forma alterna comprenden, o en forma alterna consisten de, secuencias polipéptido codificadas por los polinucleótidos de la invención. La presente invención también abarca variantes de - la secuencia de polipéptídos descrita en ID SEC NO.: 2 y/o codificada por un clon depositado. "Variante" se refiere a un polinucleótido o polipéptido MPIF-1, que difiere de polinucelótido o polipéptido MPIF-1 pero que retiene sus propiedades esenciales. Las variantes son cercanamente similares y en muchas regiones idénticas al polinucleótido o polipéptido MPIF-1. De preferencia, los fragmentos polinucleótidos de la invención codifican un polipéptido que demuestra una actividad funcional MPIF-1. _ Por un polipéptido que demuestra una "actividad funcional" MPIF-1, se entiende un polipéptido capaz de exhibir una o más actividades funcionales conocidas asociadas con una proteína MPIF-1 (completa) de toda su longitud. Estas actividades funcionales incluyen, pero no están limitadas a actividad biológica, antigenicidad (capacidad de enlace) o competencia con un polipéptido MPIF-1 para enlace (con un anticuerpo anti-MPIF-1) , inmunogenicidad (capacidad por generar anticuerpos que liga a _ un polipéptido MPIF-1) , capacidad para formar multímeros polipéptidos MPIF-1 de la invención y capacidad por ligar a un receptor o ligando para un polipéptido MPIF- . La actividad funcional de los polipéptidos MPIF-1, y sus fragmentos variantes derivados y análogos pueden ensayarse por diversos métodos . Por ejemplo, en una modalidad en donde se ensaya la capacidad por ligar o competir con polipéptido MPIF-1 de longitud completa para enlazar con anticuerpo anti-MPIF-1, pueden emplearse diversos inmuno ensayos conocidos en la especialidad, incluyendo pero no limitado a, sistemas de ensayos competitivo y no competitivo utilizando técnicas tales como radio inmuno ensayos, ensayo inmuno solvente enlazado por enzima (ELISA = Enzyme Linked Immunosorbent Assay) , inmunoensayo "emparedado", ensayos inmunoradiométricos, reacciones de precipitación de difusión en gel, ensayos de inmunodifusión, inmunoensayos ín si tu (utilizando oro coloidal, etiquetas de radio isótopo, o enzima, por ejemplo, Western blots, reacciones- de precipitación, ensayos de aglutinación) por ejemplo ensayos de aglutinación en gel, ensayos de hemaglutinina), ensayos de fijación de complemento, ensayos de inmunofluorescencia, ensayos de proteína A, y ensayos de inmunoelectroforésis, etc. En una modalidad, el enlace de anticuerpos se detecta al detectar una etiqueta en el anticuerpo primario. En otra modalidad, el anticuerpo primario se detecta por enlace de un anticuerpo o reactivo secundario al anticuerpo primario. En una modalidad adicional, se etiqueta el anticuerpo secundario. Se conocen muchos medios en la técnica para detectar unión en un inmunoensayo y están dentro del alcance de la presente invención. En otra modalidad, en donde un receptor o ligando MPIF-1 se identifica, o la capacidad de un fragmento variante derivado polipéptido de la invención para multimerizar, se evalúa, puede ensayarse unión, por ejemplo por medios bien conocidos en la especialidad tal como por ejemplo cromatografía de gel de reducción y no reducción, cromatografía de afinidad de proteína y tinción de afinidad. Ver en general Phizicky, E., y colaboradores, 1995, Microbiol . Rev. 59:94-123. En otra modalidad, puede ensayarse correlaciones fisiológicas de MPIF-1 a substratos (transducción de señal) . Además, los ensayos aquí descritos (ver ejemplos) y de otra forma conocidos en la especialidad pueden aplicarse rutinariamente para medir la capacidad de polípéptidos y de fragmentos, derivados variantes y sus análogos de MPIF-1 para producir actividad biológica relacionada a MPIF-1 (ya sea in vi tro o in vivo) . Otros métodos serán conocidos por la persona con destreza en la especialidad y están dentro del alcance de la invención. Las proteínas MPIF, o sus fragmentos de la invención pueden estar en monómeros o multímeros (es decir dímeros, trímeros, tetrámeros, y multímeros superiores. De acuerdo con esto, la presente invención se relaciona con monómeros y multímeros de proteínas MPIF de la invención, su preparación y composiciones (de preferencia, composiciones farmacéuticas) que los contienen. En modalidades específicas, los polipéptidos de la invención son monómeros, dímeros, trímeros o tetrámeros. En modalidades adicionales, los multímeros de la invención son al menos dímeros, al menos trímeros o al menos tetrámeros .

Multímeros abarcados por la invención pueden ser homómeros o heterómeros . Como se emplea aquí, el término homómero, se refiere a un multímero que contiene solo proteínas MPIF de la invención (incluyendo fragmentos variantes y proteínas de fusión de MPIF, como se describe aquí) . Estos homómeros pueden contener proteínas MPIF que tienen secuencias de polipéptido idénticas o diferentes. En una modalidad específica, un homómero de la invención es un multímero que solo contiene proteína MPIF que tienen una secuencia de polipéptido idéntica. En otra modalidad específica, un homómero de la invención es un multímero que contiene proteínas MPIF que tienen diferentes secuencias polipéptído. En modalidades específicas, el multímero de la invención es un homodímero (por ejemplo que contiene proteínas MPIF que tienen secuencias polipéptido idénticas o diferentes) o un homotrímero (por ejemplo que contiene proteínas MPIF con secuencias polipéptido idénticas o diferentes) . En modalidades adicionales, el multímero homomérico de la invención es al menos un homodímero, al menos un homotrímero o al menos un homotetrámero . Como se emplea aquí, el término heterómero se refiere a un multímero que contiene proteínas heterólogas (es decir proteínas que contienen solo secuencias polipéptido que no corresponden a secuencias polipéptido codificadas por el gen MPIF) además de las proteínas MPIF de la invención. En una modalidad específica, el multímero de la invención es un ' heterodímero, un heterotrímero o un heterotetrámero . En modalidades adicionales, el multímero homomérico de la invención es al menos un homodímero, al menos un homotrímero o al menos un homotetrámero. Multímeros de la invención pueden ser el resultado de asociaciones hidrofóbicas, hidrofílicas, iónicas y/o covalentes y/o pueden estar enlazadas indirectamente por ejemplo .por formación de liposomas. De esta manera, en una modalidad, multímeros de la invención, tales como por ejemplo homodímeros u homotrímeros se forman cuando proteínas de la invención contactan entre sí en solución. En otra modalidad, heteromultímeros de la invención, tales como por ejemplo heterotrímeros o heterotetrámeros, se forman cuando proteínas de la invención contactan anticuerpos con los polipéptidos de la invención (incluyendo anticuerpos a la secuencia de polipéptido heterólogo en una proteína de fusión de la invención (en solución) . En otras modalidades, se forman multímeros de la invención por asociaciones covalentes con y/o entre las proteínas MPIf de la invención. Estas asociaciones covalentes pueden involucrar uno más residuos de amino ácido contenidos en la secuencia de polipéptido de la secuencia de polipéptido descrita en ID de SEC NO. : 2 y contenido en el polipéptido codificado por el clon ADNc contenido en el depósito ATCC No. 75676. En una instancia, las asociaciones covalentes se entrelazan entre residuos cisteína reubicados dentro de las secuencias polipéptido de las proteínas que interactúan en el polipéptido nativo (es decir de origen natural) . En otra instancia, las asociaciones covalentes son . la consecuencia de manipulación química o recombinante. En forma alterna, estas asociaciones covalentes pueden involucrar uno o más residuos amino ácidos contenidos en la secuencia de polipéptido heterólogo en una proteína de fusión MPIF. En un ejemplo, asociaciones covalentes están entre la secuencia heteróloga contenida en una proteína de fusión de la invención (ver por ejemplo la Patente de los E.U.A. No. 5,478,925) . En un ejemplo específico, las asociaciones covalentes están entre la secuencia heteróloga contenida en una proteína de fusión MPIF-Fc de la invención (como aquí se describe) . En otra modalidad, los polipéptidos MPIF de la presente invención y sus fragmentos que contienen epítope están fusionados con antígeno heterólogo (por ejemplo polipéptido, carbohidrato, fósfolípido o ácido nucleico) .

En modalidades específicas, el antígeno heterólogo es un inmunógeno. En una modalidad más específica, el antígeno heterólogo es la proteína GP120 de la HIV o su fragmento. Polinucleótidos que codifican estos polipéptidos también están abarcados por la invención. Los multímeros de la invención pueden generarse utilizando técnicas químicas conocidas en la especialidad. Por ejemplo, proteínas que se desea estén contenidas en los multímeros de la invención, pueden entrelazarse químicamente utilizando moléculas enlazadoras y técnicas de optimización de longitud de molécula enlazadora conocidas en la especialidad (ver por ejemplo la Patente de los E.U.A. No. 5,478,925, que aquí se incorpora por referencia totalmente) . Adicionalmente, multímeros de la invención también pueden generarse utilizando técnicas conocidas en la especialidad para formar uno o más entrelazamientos intermoléculas entre los residuos cisteína ubicados dentro de la secuencia de polipéptido de las proteínas que se desean contenidas en el multímero (ver por ejemplo la Patente de los E.U.A. No. 5,478,925, que aquí se incorpora por referencia totalmente) . Además, proteínas de la invención pueden modificarse rutinariamente por la adición de cisteína o biotina al extremo de C o extremo N de la secuencia de polipéptido de la proteína y técnicas conocidas en la especialidad pueden aplicarse para generar multímeros que contienen una o más de estas proteínas modificadas (ver por ejemplo la Patente de los E.U.A. No. 5,478,925, que aquí se incorpora por referencia totalmente) . Adicionalmente, técnicas conocidas en la especialidad pueden ser aplicadas para generar liposomas que contienen los componentes de proteínas que se desea estén contenidos en el multímero de la invención (ver por ejemplo la Patente de los E.U.A. No. 5,478,925, que aquí se incorpora por referencia completamente) . En forma alterna, pueden generarse multímeros de la invención utilizando técnicas de ingeniería genética conocidas en la especialidad. En una modalidad, proteínas contenidas en multímeros de la invención, se producen recombinantemente utilizando tecnología de proteína de fusión aquí descrita o de otra forma conocida en la especialidad (ver por ejemplo la Patente de los E.U.A. No. 5,478,925, que aquí se incorpora por referencia completamente) . En una modalidad específica, polinucleótidos que codifican un homodímero de la invención, se generan al ligar una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido de la invención con una secuencia que codifica un polipéptido enlazador y luego además a un polipéptido sintético que codifica el producto traducido del polipéptido en la orientación inversa desde el • extremo C original al extremo N (que carece de la secuencia líder) (ver por ejemplo la Patente de los E.U.A. No. 5,478,925, que aquí se incorpora por referencia completamente) . En otra modalidad, técnicas recombinantes aquí descritas o de otra forma conocidas en la especialidad, se aplican para generar polipéptidos recombinantes de la invención que contienen un dominio trasmembrana y que puede ser incorporado por técnicas de reconstitución de membranas en liposomas (ver por ejemplo la Patente de los E.U.A. No. 5,478,925, que aquí se incorpora por referencia completamente) . Además, proteínas de la invención pueden sintetizarse químicamente utilizando técnicas conocidas en la especialidad (por ejemplo ver Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular Principies (Proteínas: Estructuras y Principios Moleculares), W.H. Freeman & Co . , N.Y. , y Hunkapiller, M., y colaboradores, Nature 310: 105-111 (1984)). Por ejemplo, un péptido que corresponde a un fragmento de los polipéptidos MPIF de la invención, puede ser sintetizado por uso de un sintetizador de péptido. Además, si se desea, amino ácidos no clásicos o análogos de amino ácidos químicos, pueden ser introducidos como una substitución o adición en la secuencia de polipéptido MPIF. Amino ácidos no clásicos, incluyen, pero no están limitados a, los isómeros-D de los ácidos comunes, ácido 2, 4-diaminobutírico, ácido a-amino isobutírico ácido 4-aminobutírico, Abu, ácido 27amino butírico, g-.Abu, e-.Ahx, ácido 6-amino hexanoico, Aib, ácido 2 -amino isobutírico, ácido 3 -amino propiónico, ornitina, norleucina, norvalina, hidroxiprolina, sarcosina, citrulina, homocitrulina, ácido cistéico, t-butilglicina, t -butilalanina , fenilglicina, ciclohexilalanina , b-alanina, fluoro-amino ácidos, amino ácidos de diseñador tales como b-metil amino ácidos, Ca-metil amino ácidos, Na-metil amino ácidos, y análogos de amino ácidos en general. Además, el amino , ácido puede ser D (dextrorrotario) o L (levorrotatorio) . ~ Pueden producirse variantes de origen no natural utilizando técnicas de mutagénesis conocidas en la especialidad, que incluyen pero no están limitadas a mutagénesis mediada por oligonucleótido, exploración de alanina, mutagénesis PCR, mutagenésis, dirigida en sitio ( ver por ejemplo, C rter y colaboradores, Nucí . Acids Res . 13:4331 (1986); y Zoller y colaboradores, Nucí .

Acids Res . 10:6487 (1982)), mutagénesis de cassette ( ver por ejemplo Wells y colaboradores, Gene 34:315 (1985)), mutagénesis de selección de restricción ( ver por ej emplo Wells y colaboradores, Philos . Trans . R . Soc . London SerA 317:415 (1986) ) . La invención adicionalmente abarca polipéptidos MPIF que se modifican diferencialmente durante o después de traducción, por ejemplo por glicosilación, acetilación, fosforilación, amidación, derivatización por grupos de bloqueo/protectores conocidos, escisión proteolítica, enlace a molécula de anticuerpo u otro ligando celular, etc. Cualquiera de numerosas modificaciones químicas puede llevarse a cabo por técnicas conocidas, incluyendo pero no limitado a, escisión química específica por bromuro de cianógeno, tripsina, quimotripsina, papaína, proteasa V8 , NaBH4 acetilación, formilación, oxidación, reducción, síntesis metabólica en la presencia, de tunicamicina; etc. Modificaciones post --traducción adicionales abarcadas por la invención, incluyen, por ejemplo cadenas carbohidrato N-enlazadas u O-enlazadas, procesamiento de extremos N-terminal o C-terminal) , conexión de porciones químicas a la estructura principal amino ácido, modificaciones químicas de cadenas carbohidrato N-enlazadas u O-enlazadas, y adición o eliminación de un residuo metionina N-terminal como resultado de expresión de célula huésped procariótica. Los polipeptidos también pueden ser modificados con una etiqueta detectable tal como una etiqueta enzimática, fluorescente, isotópica o de afinidad para permitir detección y aislamiento de la proteín . También por la invención- se proporcionan derivados químicamente modificados de MPIF, que pueden proporcionar ventajas adicionales tales como incrementada solubilidad, estabilidad y tiempo de circulación del polipéptido, o disminuida inmunogenicidad (ver Patente de los E.U.A. No. 4,179,337) . Las porciones químicas para derivatización, pueden seleccionarse de polímeros solubles en agua tales como polietilen glicol, copolímeros de etilen glicol/propilen glicol, carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol polivinilo, y semejantes. Los polipéptidos pueden ser modificados en posiciones aleatorias dentro de la molécula, o en posiciones predeterminadas dentro de la molécula y pueden incluir una, dos, tres o más porciones químicas agregadas . El polímero puede ser de cualquier peso molecular, y puede estar ramificado o sin ramificar.

Para polietilen glicol, el peso molecular preferido está entre aproximadamente 1 kDa y aproximadamente 100 kDa (el término "aproximadamente" indica que en preparaciones de polietilen glicol, algunas moléculas pesarán más, algunas menos que el peso molecular establecido) para facilidad de manejo y fabricación. Otros tamaños pueden ser empleados, dependiendo del perfil terapéutico deseado (por ejemplo la duración de liberación sostenida deseada, los efectos, de haber, en actividad biológica, la facilidad de manejo, el grado o Carencia de antigenicidad y otros efectos conocidos de polietilenglicol a una proteína terapéutica o análogo. Por ejemplo, el polietilen glicol puede tener un peso molecular promedio de aproximadamente 200, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500, 10,000, 10,500, 11,000, 11,500, 12,000, 12,500, 13,000, 13,500, 14,000, 14,500, 15,000, 15,500, 16,000, 16,500, 17,000, 17,500, 18,000, 18,500, 19,000, 19,500, 20 , 000 , ' 25 , 000 , 30,000, 35,000, 40,000, 50,000, 55,000, 60,000, 65,000, 70,000, 75,000, 80,000, 85,000, 90,000, 95,000, o 100,000 kDa. Como se notó anteriormente, el polietilen glicol puede tener una estructura ramificada. Polietilen glicoles ramificados se describen por ejemplo, en la Patente de los E.U.A. No. 5,643,575; Morpurgo y colaboradores, Appl . Biochem . Biotechnol . 56:59-72 (1996) ; Vorobjev y colaboradores , Nucl eosides Nucl eo tides (Nucleósidos, nucleótidos) 18 :2745-2750 (1999) ; y Caliceti y colaboradores , Bioconjug. Chem . 10:638-646 (1999), las descripciones de cada una de las cuales aquí se incorporan por referencia. Las moléculas de polietilen glicol (u otras porciones químicas) deberán conectarse a la proteína con consideración a efectos en el dominio funcional o antigénico de la proteína. Hay una cantidad de métodos de conexión disponibles para aquellos con destreza en la especialidad, por ejemplo EP 0 401 384, aquí incorporado por referencia (acoplar PEG a G-CSF) , ver también Malik y colaboradores, Exp. Hematol . 20:1028-1035 (1992) (reporte pegilacíón (modificación con polietilen glicol) de GM-CSF utilizando cloruro de tresilo) . Por ejemplo, polietilen glicol puede enlazarse covalentemente a través de residuos amino ácido mediante un grupo reactivo, tal como un grupo amino libre o carboxilo. Grupos reactivos son aquellos a los cuales puede ligarse una molécula de polietilen glicol activada. Los residuos amino ácidos que tienen un grupo amino libre pueden incluir residuos lisina y los residuos amino ácido N-terminal; aquellos que tienen un grupo carboxilo libre pueden incluir residuos de ácido aspártico, residuos de ácido glutámico, y el residuo amino ácido C-terminal. Grupos sulfhidrilo también pueden emplearse como un grupo reactivo para conectar las moléculas de polietilen glicol. Para propósitos terapéuticos se prefiere la conexión en un grupo amino, tal como la conexión en el extremo N o el grupo lisina. Como se sugirió anteriormente, polietilen glicol puede conectarse a proteínas por enlace a cualquiera de una cantidad de residuos amino ácidos. Por ejemplo, puede enlazarse polietilen glicol a proteínas mediante enlaces covalentes con lisina, histidina, ácido aspártico, ácido glutámico, o residuo cisteína. Una o más químicas de reacción pueden emplearse para conectar polietilen glicol a residuos amino ácidos específicos (por ejemplo lisina, histidina, ácido aspártico, ácido glutámico, o cisteína) de la proteína o a más de un tipo de residuo amino ácido (por ejemplo lisina, histidina, ácido aspártico, ácido glutámico, cisteína y sus combinaciones) de la proteína. Se puede desear específicamente proteínas modificadas químicamente en el extremo N. Utilizando polietilen glicol como una ilustración de la presente composición, se puede seleccionar de una variedad de moléculas de polietilen glicol (por peso molecular, ramificación, etc.), la proporción de moléculas de polietilen glicol a moléculas de proteína (o péptido) en la mezcla de reacción, el tipo de reacción de pegilación a realizar, y el método para obtener la proteína N-terminalmente pegilada selecta. El método debe tener la preparación N-terminalmente pegilada (es decir separar esta porción de otras porciones monopegiladas de ser necesario) puede ser por purificación del material N-terminalmente pegilado de una población de moléculas de proteína pegiladas. Proteínas selectivas modificadas químicamente en la modificación de extremo N puede lograrse por alquilación reductiva que explota reactividad diferencial de diferentes tipos de grupos amino primarios (lisina contra N-terminal) disponibles para derivatización en una proteína particular. Bajo las condiciones de reacción apropiadas, se logra una derivatización substancialmente selectiva de la proteína en el extremo N con un polímero que contiene grupo carbonilo. Como se indicó anteriormente, la pegilación de las proteínas de la invención puede lograse por cualquier cantidad de medios. Por ejemplo, polietilen glicol puede conectarse a la proteína ya sea directamente o por un enlazador intercalado. Sistemas sin enlazador para conectar polietilen glicol a proteínas se describen por Delgado y colaboradores y Cri t . Rev. Thera . Drug Carrier Sys . 9:249-304 (1992); Francis y colaboradores, Intern.

J. of Hema tol . 68:1-18 (1998); Patente de. los E.U.A. No. 4,002,531; Patente de los E.U.A. No. 5,349,052; WO 95/06058; y WO 98/32466, las descripciones de cada una de las cuales de incorporan aquí por referencia.^ Un sistema para conectar polietilen glicol directamente a residuos amino ácidos de proteínas sin un enlazador intercalado, emplea (MPEG) tresilado que se produce por la modificación de monometoxi polietilen glicol (MPEG) utilizando cloruro de tresilo (ClS02CH2CFj) . .Ante reacción de proteína con MPEG tresilado, polietilen glicol se conecta directamente' a grupos amina de la proteína. De esta manera, la invención incluye conjugados de proteína-polietilen glicol producidos por reacción de proteínas de la invención con una molécula de polietilen glicol que tiene un grupo 2 , 2 , 2-trifluoroetan sulfonilo. Polietilen glicol también puede conectarse a proteínas utilizando una cantidad de diferentes enlazadores intercalados. Por ejemplo, la Patente de los E.U.A. No. 5,612,460, la descripción de la cual aquí se incorpora por referencia, describe enlazadores uretanos para conectar polietilen glicol a proteínas. Conjugados de proteína-polietilen glicol en donde el polietilen glicol se conecta a la proteína por un enlazador, también pueden producirse por reacción de proteínas con compuestos tales como MPEG-succinimidilsuccinato, MPEG activado con 1 , 1 ' - carbonildiimidazol , MPEG-2,4, 5-triclorofenilcarbonato, MPEG-p-nitrofenolcarbonato, y diversos derivados MPEG-succinato. Una cantidad de derivados polietilen glicol adicionales y químicas de reacción para conectar polietilen glicol a proteínas se describen en WO 98/32466, toda la descripción de la cual aquí se incorpora por referencia. Productos de proteína pegilados producidos utilizando las químicas de reacción establecidas aquí, se incluyen dentro del alcance de la invención. El número de porciones polietilen glicol conectadas a cada proteína de la invención (es decir el grado de substitución) también puede variar. Por ejemplo, las proteínas pegiladas de la invención pueden enlazarse en promedio a l, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 17, 20, o más moléculas de polietilen glicol. Similarmente, el grado promedio de substitución en rangos tales como 1-3, 2-4, 3-5, 4-6, 5-7, 6-8, 7-9, 8-10, 9-11, 10-12, 11-13, 12-14, 13-15, 14-16, 15-17, 16-18, 17-19, O 18-20 de porciones polietilen glicol por molécula de proteína. Métodos para determinar el grado de substitución se discuten por ejemplo, en Delgado y colaboradores, Cri t . Rev. Théra . Drug Carrier Sys . 9 :249-304 (1992) . Por "un polipéptido que tiene actividad MPIF-1" se entienden polipéptidos que exhiben actividad similar, pero no necesariamente idéntica, a una actividad de la proteína MPIF-1 de la invención (ya sea la proteína de longitud íntegra o de preferencia la proteína madura) como se mide en un ensayo biológico particular. Actividad de proteína MPIF-1 pueden unirse por el ensayo establecido en los Ejemplos 9, 10, así como en la Figura 5. Por ejemplo, actividad de proteína MPIF-1 medida utilizando el ensayo in vi tro de mieloprotección descrito en el Ejemplo 9, abajo. Brevemente, poblaciones agotadas de linaje de células (células Lin") se aislan de médula ósea de ratón e incuban en la presencia de múltiples citosinas con o sin MPIF-1. Después de 48 horas, un juego de cada cultivo recibe 5-Fu y la incubación luego se continua por 24 horas adicionales, en cuyo punto los números de células formadoras de colonia potenciales proliferativas bajas supervivientes (LPP-CFC) se determina por cualquier ensayo clonogénico conveniente conocido por aquellos con destreza en la especialidad. Un gran porcentaje (por ejemplo >. 30-50%, tal como >40%) de LPP-CFC se protege de la citotoxicidad inducida por 5-Fu en la presencia de MPIF-1, mientras que poca protección (<5%) de LPP-CFC se observará en la ausencia de MPIF-1 en la presencia de una proteína no relacionada. En este ensayo, células formadoras de colonia potenciales altamente proliferativas (HPP-CFC) pueden ser adicionalmente protegidas de la citotoxicidad inducida por 5-Fu en la presencia de MPIF-1, pero en algunos casos no. HPP-CFC en general no se protegen cuando LPP-CFC no se protegen. La actividad de proteína MPIF-1 también puede medirse por los modelos sub-letal y letal descritos en los Ejemplos 16 a 18, y el método de citoprotección descrito en el Ejemplo 19. De esta manera, "un polipéptido que tiene actividad de proteína MPIF-1" incluye polipéptidos que exhiben actividad MPIF-1, en el ensayo anteriormente descrito. Aunque el grado de actividad no requiere ser idéntico a aquel de la proteína MPIF-1, de preferencia, "un polipéptido que tiene actividad de proteína MPIF-1" exhibirá substancialmente similar actividad en comparación con la proteína MPIF-1 ( es decir, el polipéptido candidato exhibirá mayor actividad o no más que aproximadamente 20 veces menos y de preferencia no más que aproximadamente 10 veces menos actividad respecto a la proteína MPIF-1 de preferencia) . La presente invención además se relaciona a un polipéptido MPIF-1 que tiene la secuencia de amino ácido deducida de la Figura 1 (ID de SEC NO. : 2) o que tiene la secuencia de amino ácidos codificada por el .ADNc depositado, así como fragmentos, análogos y derivados de este polipéptido. Los términos "fragmento", "derivado", y "análogo" cuando se refieren al polipéptido de la Figura 1 (ID de SEC NO. : 2) o codificado por el ADNc depositado, significan un polipéptido que retiene esencialmente la misma función o actividad biológica que ese polipéptido. De esta manera, un análogo incluye una proproteína que puede activarse por escisión de la porción de proproteína para producir un polipéptido maduro activo. El polipéptido de la presente invención puede ser un polipéptido recombinante, un polipéptido natural, o un polipéptido sintético, de preferencia un polipéptido recombinante. El fragmento, derivado o análogo del polipéptido de la Figura 1 (ID de SEC NO. : 2) o aquel codificado por el .ADNc depositado puede ser (i) uno en donde uno o más de los residuos amino ácidos se substituyen con un residuo amino ácido conservado o no conservado (de preferencia un residuo amino ácido conservado) y estos residuos aminoácidos substituidos están o no están codificados por el código genético, o (ii) en donde uno o más de los residuos amino ácido incluyen un grupo substituyente, o (iii) uno en donde los polipéptidos maduros se fusionan con otro compuesto, tal como un compuesto para incrementar la vida media del polipéptido (por ejemplo polietilen glicol) , o (iv) uno en donde los amino ácidos adicionales se fusionan a los polipéptidos maduros, tales como una secuencia líder o secretoria o una secuencia que se emplea para purificación de los polipéptidos maduros o una secuencia proproteína. Estos fragmentos", derivados y análogos se consideran dentro del alcance de. aquellos con destreza en la especialidad a partir de las presentes enseñanzas. Cualquier polipéptido MPIF-1 puede emplearse para generar proteínas de fusión. Por ejemplo, el polipéptido MPIF-1 cuando se fusiona a una segunda proteína, puede emplearse como una etiqueta antigénica. .toticuerpos desarrollados contra el polipéptido MPIF-1 pueden emplearse para detectar indirectamente la segunda proteína por unión al MPIF-1. Aún más, debido a que las proteínas secretadas hacen objetivo o blanco en sitios celulares con base en señales de tráfico, los polipétidos MPIF-1 pueden emplearse como moléculas objetivo una vez fusionados a otras proteínas. Ejemplos de dominios que pueden fusionarse a polipéptidos MPIF-1 incluyen no solo secuencias de señal heterólogas, sino también otras regiones funcionales heterólogas . La fusión no necesariamente requiere ser directa, pero puede ocurrir a través de secuencias enlazadoras . Los polipéptidos de la presente invención de preferencia se proporcionan en una forma aislada, y de preferencia se purifican a homogeneidad. Los polipéptidos de la presente invención incluyen el polipéptido de ID de SEC NO. : 2 (en particular el polipéptido maduro) así como polipéptidos que tienen al menos 95% de similaridad (aún más preferible cuando menos 95% de identidad) al polipéptido de ID de SEC NO. : 2 y también incluyen porciones de estos polipéptidos con al menos 25 amino ácidos, al menos 30 amino ácidos, al menos 35 amino ácidos, al menos 40 amino ácidos, al menos 45 amino ácidos, y más preferible al menos 50 amino ácidos, al menos 55 amino ácidos, al menos 60 amino ácidos, al menos 65 amino ácidos, al menos 70 amino ácidos, al menos 75 amino ácidos, al menos 80 amino ácidos, al menos 85 amino ácidos, al menos 90 amino ácidos, al menos 95 amino ácidos, y al menos 100 amino ácidos. Fragmentos de proteína (polipéptido) pueden ser "autónomos" o comprendidos dentro de un mayor polipéptido en donde el fragmento forma una parte o región, más preferible una sola región continua. Ejemplos representativos de fragmentos polipéptido de la invención incluyen por ejemplo fragmentos que comprenden, o alternativamente consisten de aproximadamente el número de amino ácido 1-20, 21-40, 41-60, 61-80, 81-100, 102-120, 121-140, 141-160, o 161 al fin de la región de codificación. Aún más, fragmentos polipéptidos pueden ser aproximadamente 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, o 150 amino ácidos en longitud. En este contexto "aproximadamente" incluye los rangos o valores particularmente descritos y rangos o valores mayores o más pequeños por varios (5, 4, 3, 2, o l) amino ácidos, en cualquier extremo o en ambos extremos. Polinucleótidos que codifican estos polipéptidos también están abarcados por la invención. Incluso si la eliminación de uno o más amino ácidos del extremo N de una proteína resulta en la modificación o pérdida de una o más funciones biológicas de la proteína, aún pueden retenerse otras actividades funcionales (por ejemplo actividades biológicas, capacidad para multimerizar, capacidad para unir ligando MPIF-1) . Por ejemplo, la capacidad de proteínas MPIF-1 recortadas en inducir y/o ligar con anticuerpos que reconocen las forma completa o madura de los polipéptidos, generalmente se retendrá cuando menos que la mayoría de los residuos del polipéptido completo o maduro se retiran del extremo N. Si un polipéptido particular carece residuos N- terminales de 'un polipéptido completo, retiene estas actividades inmunológicas, puede determinarse fácilmente por métodos rutinarios aquí descritos y de otra forma conocidos en la técnica. No es 5 poco probable que una muteína MPIF-1 con una gran cantidad de residuos amino ácido N-terminal eliminados pueda retener algunas actividades biológicas o ^ inmunogénicas. De hecho, péptidos compuestos de tan pocos como 6 residuos amino ácido MPIF-1 a menudo pueden 10 evocar una inmuno respuesta. De acuerdo con esto, fragmentos polipéptidos incluyen la proteína MPIF-1- secretada así como la forma madura. Fragmentos polipéptido adicionales incluyen la ^ protelna MPIF-1 secretada o la forma madura que tiene una 15 serie continua de residuos eliminados del extremo amino o carboxi o ambos. Por ejemplo, cualquier cantidad de amino ácidos en el rango de 1 a 60, puede ser eliminado del extremo amino ya sea del polipéptido MPIF-1 secretado o la forma madura. Similarmente, cualquier cantidad de 20 amino ácidos en el rango de 1 a 30, puede ser eliminado del extremo carboxi de la proteína MPIF-1 secretada o en forma madura. Aún más, cualquier combinación de las eliminaciones de extremo carboxi y amino anteriores se prefieren. Similarmente, también se prefieren polinucleótidos * * que " codifican estos fragmentos polipéptido. Como se conoce en la técnica "similaridad" entre dos polipéptidos se determina al comparar la secuencia de amino ácidos y sus substitutos de amino ácidos conservados de un polipéptido con la secuencia un segundo polipéptido. Por supuesto, debido a la degeneración del código genético, una persona con destreza ordinaria en la especialidad inmediatamente reconocerá que una gran cantidad de moléculas de ácido nucleico que tiene una secuencia de al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% idéntica a la secuencia de ácido nucleico del .ADNc depositado (ATCC 75676) o la secuencia de ácido nucleico mostrado en la Figura 1 o 20A (ID ^ SEC NO.: 1 o 6) codificará un polipéptido "que tiene actividad de proteína MPIF-1". De hecho, ya que variantes degeneradas de estas secuencias de nuc?eótidos todas codifican el mismo polipéptido, esto será claro para la persona con destreza en la especialidad, incluso sin realizar el ensayo de comparación anteriormente descrito. Además se reconocerá en la técnica que, para estas moléculas de ácido nucleico que no son variantes degeneradas, una cantidad razonable también codificará un polipéptido que tiene actividad de proteína MPIF-1. Esto es debido a que la persona con destreza está totalmente consciente de las substituciones amino ácido que ya es menos probable o no probable que afecten significativamente la función de proteína (por ejemplo reemplazando un amino ácido alifático con un segundo amino ácido alifático) como se describe más a continuación. Como cuestión práctica, el que cualquier polipéptido particular sea al menos 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntico, por ejemplo, a las secuencias amino ácido de ID de SEC NO. : 2 o a la secuencia de amino ácido codificada por ADNc contenido en un clon depositado, puede determinarse convencionalmente utilizando conocidos programas de computadora. Un método preferido para determinar el mejor ajuste total entre una secuencia de interrogación (una secuencia de la presente invención) y una secuencia objeto, también se refiere como un alineamiento de secuencia global, lo que puede determinarse utilizando el programa de computadora FASTDR con base en el algoritmo de Brutlag y colaboradores , ( Comp . App . Biosci . 6:237-245 (1990)). En un alineamiento de secuencia las secuencias de interrogación y objeto ya son ambas secuencias de nucleótido o ambas secuencias de amino ácido. El resultado del alineamiento de secuencia global es en por ciento de -identidad. Parámetros preferidos utilizados en* un alineamiento de amino ácido FASTDB son: Matriz=PAM 0, k-tuple=2, Penalidad de apareamiento incorrecto=l, Penalidad de unión=20, Longitud de Grupo de aleatorización = 0, calificación de corte = 1, Tamaño de ventana = longitud de secuencia, Penalidad de espacio = 5, Penalidad de tamaño de espacio = 0.05, Tamaño de ventana = 500 o la longitud de la secuencia aminoácido objeto, lo que sea más corto. Si la secuencia objeto es más corta que la secuencia de interrogación debido a eliminaciones de terminal -C o - , no debido a eliminaciones internas, debe efectuarse una corrección manual a los resultados . Esto es debido a que el programa FASTDB no toma en cuenta truncados terminal -C y - , de la secuencia objeto cuando se calcula identidad en porciento global. Para secuencias objeto truncadas en los extremos C y - , respecto a la secuencia de interrogación, el por ciento de identidad se corrige al calcular el número de residuos de la secuencia de interrogación que es terminal -C y - , de la secuencia objeto, que no están apareados/alineados, con un residuo objeto, como un por ciento del total de bases de la secuencia de interrogación. El que un residuo esté apareado/alineado, se determina por resultados del alineamiento de secuencia FASTDB. Este por ciento luego se substrae de la identidad en por ciento, calculado por el programa FASTDB anterior utilizando los parámetros especificados, para llegar a una calificación de por ciento de identidad final. Esta calificación de por ciento de identidad final es lo que se utiliza para propósitos de" la presente invención. Solo residuos a los extremos-C y - de la secuencia objeto, que no están apareados/alineados con la secuencia de interrogación, se consideran para los propósitos de ajustar manualmente la calificación de por ciento de identidad. Esto es, solo posiciones de residuo de interrogación fuera de los residuos de terminal -C y -más alejados de la secuencia objeto. Por ejemplo, una secuencia objeto con residuo de 90 amino ácidos se alinea' con una secuencia de interrogación de 100 residuos para determinar el por ciento de identidad. La eliminación ocurre en el extremo N de la secuencia objeto y por lo tanto, el alineamiento FASTDB no muestra apareamiento/alineamiento de los primeros 10 residuos en el extremo N. Los 10 residuos no apareados representan 10% de la secuencia (número de residuos en los extremos-C y - no apareados/número total de residuos en la secuencia de interrogación) de manera ta que el 10% se sustrae de la calificación de identidad en por ciento calculada por el programa FAS DB. Si los 90 residuos restantes se aparearan perfectamente, el por ciento de identidad final será 90%. En otro ejemplo, una secuencia objeto de 90 residuos se compara con una secuencia de interrogación de 100 residuos. Esta vez, las eliminaciones son eliminaciones internas de manera tal que no hay residuos en los extremos -C o - de la secuencia objeto que no están apareados/alineados con la interrogación. En este caso, el por ciento de identidad calculado por FSTDB no se corrige manualmente. De nuevo, solo posiciones de residuo fuera de los extremos -C terminal y - de la secuencia objeto, como se describe en el alineamiento FASTDB, que no están apareadas/alineadas con la secuencia de interrogación son corregidas manualmente. Ninguna otra corrección manual se realizará para los propósitos de la presente invención. De preferencia, los programas descritos anteriormente se utilizan para alinear un polipéptido de la presente invención (la secuencia de referencia) y una segunda secuencia, y el por ciento de identidad se calcula manualmente. El por ciento de identidad es el número de amino ácidos individuales que son idénticos entre dos secuencias, divididos por el número total de residuos amino ácido en la secuencia de referencia, multiplicado por 100%. Por ejemplo, para determinar el por ciento de identidad de los amino ácidos 1 a 100 de ID de SEC NO. :2 a una segunda secuencia, el número de apareamientos incorrectos de amino ácido (es decir, mutaciones punto: inserciones, eliminaciones y substituciones) es contado y sustraído de 100 (el número de amino ácidos en la secuencia de referencia) para obtener el número de amino ácidos idénticos . El número resultante se divide por 1O0 y luego multiplica por 100%. Si hay apareamientos incorrectos (es decir mutaciones punto: inserciones, eliminaciones y substituciones de amino ácidos individuales) en las posiciones 1, 5, 21-23, 41 y 96-100 de ID de SEC NO.:2, el % de identidad sería 90%. (1+1+3+1+4=10.100-10=90. 90/100=0.9. 0.9x100=90%) ) . Por ejemplo, guía referente a como hacer substituciones de amino ácido fenotípicamente silenciosas se proporciona en Bowie, J. U. y colaboradores, "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to .Amino Acid Substitutions, " (Descifrar el mensaje en secuencias de proteína: tolerancia a substituciones de amino ácido) Science 247:1306-1310 (1990), en donde los autores indican que hay dos estrategias principales para estudiar la tolerancia de una secuencia de amino ácido a cambio . La primer estrategia explota la tolerancia de las substituciones de amino ácido por selección natural durante el proceso de evolución. Al comparar secuencias de amino ácido en diferentes especies, pueden identificarse amino ácidos conservados. Estos amino ácidos conservados probablemente son importantes para función de proteínas. En contraste, las posiciones de amino ácido en donde se han tolerado substituciones por selección natural, indican que estas posiciones no son críticas para la función de proteína. De esta manera, posiciones que toleran la substitución de amino ácido pueden ser modificadas mientras que se mantiene la actividad biológica de la proteína. La segunda estrategia utiliza ingeniería genética para introducir cambios de amino ácidos en posiciones específicas de un gen clonado para identificar regiones críticas para función de proteína. Por ejemplo, mutagenesis dirigida de sitio o mutagénesis de exploración de alanina (introducción de mutaciones sencillas de alanina en todo residuo en la molécula) pueden ser utilizadas. (Cunningham y Wells, Sci ence 244: 1081-1085 (1989) .) Las moléculas mutantes resultantes luego pueden probarse por afinidad biológica. Como establecen los autores, estas dos estrategias han revelado que las proteínas son sorprendentemente tolerantes de substituciones de amino ácido. Los autores además indican que cambios de amino ácido probablemente sean permisivos en ciertas posiciones de amino ácido en la proteína. Por ejemplo, la mayoría de los residuos amino ácidos enterrados (dentro de la estructura terciaria de la proteína (requieren cadenas laterales no polares, mientras que en general se conservan pocas características de las cadenas laterales de superficie. Aún más, substituciones de amino ácidos conservadoras toleradas involucran el reemplazo de los amino ácidos alifáticos o hidrofóbicos Ala, Val, Leu e lie; reemplazo de los residuos 'de hidroxilo Ser y Thr; reemplazo de los residuos acídicos Asp and Glu; reemplazo de los residuos amida Asn y Gln, reemplazo de los residuos básicos Lys, Arg, y His; reemplazo de los residuos aromáticos Phe, Tyr, y Trp, y reemplazo de los amino ácidos de tamaño pequeño Ala, Ser, Thr, Met, y Gly. Fragmentos o porciones del polipéptido de la presente invención pueden emplearse para producir el polipéptido de longitud completa correspondiente por síntesis de péptido; por lo tanto, los fragmentos pueden emplearse como intermediarios para producir los polipéptidos de longitud completa. Fragmentos o porciones de los polinucleótidos de la presente invención pueden ser utilizados para sintetizar polinucleótidos de longitud completa de la presente invención. Para secreción de la proteína producida en el lumen del retículo endoplásmico, en el espacio periplásmico o en el ambiente extracelular, pueden incorporarse señales de secreción apropiadas en el polipéptido expresado. Las señales pueden ser endógenas al polipéptido o pueden ser señales heterólogas. El polipéptido puede ser expresado en una forma modificada, tal como una proteína de fusión, y puede incluir no solo regiones de secreción sino también regiones funcionales heterólogas adicionales. Por ejemplo, una región de amino ácidos adicionales, particularmente amino ácidos cargados, puede agregarse al extremo N del polipéptido para mejorar e'stabilidad y persistencia en la célula huésped, durante purificación, o durante subsecuente manejo y almacenamiento. También pueden agregarse porciones péptido al polipéptido para facilitar la purificación. Estas regiones pueden retirarse antes de preparación final del polipéptido. La adición de porciones péptido a polipéptidos para engendrar secreción o excreción para mejorar estabilidad y facilitar purificación, entre otras, son técnicas familiares y rutinarias en la especialidad. Una proteína de fusión preferida comprende una región heteróloga de inmunoglobulina que es útil para solubilizar proteínas. Por ejemplo EP-A-0 464 533 (contra parte canadiense 2045869) describe proteínas de fusión que comprenden diversas porciones de región constante de moléculas de inmunoglobulina con otra proteína humana o parte de la misma. En muchos casos, la parte Fc en una proteína de fusión es completamente ventajosa para utilizar en terapia y diagnóstico y de esta manera resulta por ejemplo en propiedades farmacocinéticas mejoradas (EP-A 0232 262) . Por otro lado, para algunos usos, sería conveniente el poder eliminar la parte Fc después de que se ha expresado, detectado y purificado la proteína de fusión en la forma ventajosa descrita. Este es el caso cuando la porción Fc demuestra ser un impedimento para utilizar en terapia y diagnóstico, por ejemplo cuando la proteína de fusión se va a utilizar como antígeno para inmunizaciones. En descubrimiento de drogas por ejemplo proteínas humanas, tales como receptor hIL5 se ha fusionado con porciones Fc por el propósito de ensayos de clasificación de alto rendimiento para identificar antagonistas de hIL-5. Ver, D. Bennett y colaboradores, Journal of Molecular Recogni tion, (Revis ta de reconocimien to mol ecular) Vol. 8:52-58 (1995) y K.

Johnson y colaboradore , The Journal of Biological Chemis try, (Revista de Química Biológica) Vol. 270, No. 16:9459-9471 (1995) . La proteína MPIF-1 puede ser recuperada y purificada de cultivos de células recombinantes por métodos bien conocidos, incluyendo sulfato de amonio o precipitación de etanol, extracción con ácido, cromatografía de intercambio de aniones o cationes, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de afinidad, cromatografía de hidroxilapatita y cromatografía de lecitina. Más preferible, se emplea para purificación cromatografía de líquido con alto desempeño ("HPLC = high performance liquid chromatography") . Polipéptidos de la presente invención incluyen productos purificados naturalmente, productos de procedimientos sintéticos químicos, y productos elaborados por técnicas recombinantes a partir de un huésped procariótico o eucariótico, incluyendo por ejemplo células bacterianas, de levadura, de plantas superiores, insectos y de mamíferos. Dependiendo del huésped empleado en un procedimiento de producción recombinante, los polipéptidos de la presente invención pueden ser glicosilados o pueden no ser glicosilados. Además, polipéptidos de la invención también pueden incluir un residuo metionina modificado inicial, en algunos casos como resultado de procesos mediados por huésped. Variantes Polipéptido MPIF-1 . Se reconocerá en la técnica que algunas secuencias del amino ácido del polipéptido MPIF pueden variarse sin efecto significante en la estructura o función de la proteína. Si esas diferencias en secuencias se contemplan, se recordará que habrá áreas críticas en la proteína -que determinan la actividad. En general, es posible reemplazar residuos que forman la estructura terciaria, siempre que se utilicen residuos que realicen una función similar. En otras instancias, el tipo de residuo puede ser completamente no importante si la alteración ocurre en una región no crítica de la proteína. De esta manera, la invención además incluye variaciones de polipéptido MPIF-1 que muestran, respectivamente actividad de polipéptido MPIF-1 substancial o que incluye regiones de una proteína MPIF tal como las porciones dé proteína discutidas a continuación. Estos mutantes incluyen eliminaciones, inserciones, inversiones, repeticiones y substituciones de tipo (por ejemplo substituir un residuo hidrofílico por otro, pero no fuertemente hidrofílico por fuertemente hidrofóbico como una regla) . Pequeños cambios o estas substituciones de amino ácido "neutros" generalmente tendrán poco efecto en la actividad. Visto típicamente como substituciones conservadoras son los reemplazos," uno por otro, entre los amino ácidos alifáticos Ala, Val, Leu y lie; intercambio de los residuos de hidroxilo Ser y Thr, intercambio de los residuos acídicos Asp y Glu, substituciones de los residuos amida Asn y Gln, cambio de los residuos básicos Lys y Arg y reemplazos entre los residuos aromáticos Phe, Tyr . ; De adicional interés especial también están substituciones de amino ácidos cargados con otro amino ácido cargado o con amino ácidos neutros. Esto puede resultar en proteínas con mejoradas características tales como menos agregación. La prevención de agregación es altamente conveniente. La agregación de proteínas no solo puede resultar en una actividad reducida sino ser problemática cuando se preparan formulaciones farmacéuticas debido a que pueden ser inmunogénicas. (Pinckard y colaboradores, Clin. Exp. Immunol . 2:331-340 (1967), Robbins y colaboradores, Diabetes 36: 838-845 (1987), Cleland y colaboradores, Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems 10:307-377 (1993). El reemplazo de amino ácidos también puede cambiar la selectividad del enlace a los receptores en la superficie de célula. Ostade y colaboradores, Nature 361: 266-268 (1993), describe ciertas alfa mutaciones TNF que resultan en enlace selectivo de TNF alfa solo a uno de los dos receptores TNF conocidos . Como se indicó en detalle anteriormente, más guía respecto a que cambios de amino _ cido probablemente sean fenotípicamente silenciosos- (es decir probablemente no tengan un efecto nocivo significante en una función) pueden encontrarse en Bowie, J.U., y colaboradores, "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions, " (Descifrando el Mensaje en Secuencias de Proteína: Tolerancia a Substituciones de .Amino ácidos) Science 247:1306-1310 (1990) (ver Tabla 1). Como se indica, los cambios de preferencia de una naturaleza menor, tal como substituciones de amino ácido conservadores, que no afectan significativamente la actividad o plegado de la proteína (ver Tabla 1) . TABLA 1. Substituciones de Amino Ácido Conservador Pequeño Alanina " Serina Treonina Metionina Glicina Por supuesto, el número de substituciones de amino ácido que hará una persona con destreza en la especialidad depende de muchos factores, incluyendo aquellos descritos anteriormente y a continuación. Hablando en general, el número' de substituciones para cualquier polipéptido MPIF-1 o su mutante no será mayor a 50, 40, 30, 20, 10, 5, o 3, dependiendo del objetivo. A continuación se describen substituciones de amino ácido MPIF-1 específicas. Un aspecto adicional de la presente invención también incluye la substitución de amino ácido. De interés especial son substituciones de amino ácido conservadoras que no afectan significativamente el doblado de la proteína. Ejemplos de substituciones de amino ácidos conservadores conocidas por aquellas con destreza en la especialidad se establecen en la Tabla 1, anterior. De interés especial adicional también están substituciones de amino ácidos cargados con otro amino ácido cargado o con amino ácidos neutros . Esto puede resultar en proteínas con características mejoradas tales como menos agregación. La prevención de agregación es altamente conveniente. La agregación de proteínas no solo puede resultar en una actividad reducida sino ser problemática cuando se preparan formulaciones farmacéuticas debido a que pueden ser inmunogénicas si (Pinckard y colaboradores, Clin . Exp . Immunol . 2:331-340 (1967), Robbins y colaboradores, Diabetes 36:838-845 (1987) , Cleland y colaboradores , Cri t . Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems 10:307-377 (1993) ._ La proteína MPIF-1 puede contener una o varias substituciones, eliminaciones o .adiciones de amino ácido ya sea de manipulación de mutación natural o humana. Ejemplos de algunas mutaciones preferidas de la secuencia de amino ácido mostrada en la Figura 1 (ID de SEC NO. : 2) se proporciona a continuación. (Por la designación, por ejemplo, Ala (21) Met se pretende que Ala en la posición 21 de la Figura 1 (ID de SEC NO. : 2) se reemplace por Met.) Ala (21) Met Asp (53) Ser Thr (24) Ala Asp (53). Thr Lys (25) Asn Asp (53) Met Asp (26) Ala Ser (51) Gly Asp (45) Ala Ser (34) Gly Asp (45) Gly Glu (30) Gln Asp (45) Ser Glu (28) Gln Asp (45) Thr Pro (60) Thr Asp (45) Met Ser (70) Ala Asp (53) Ala Asp (53) Gly Por ejemplo, cambios . dirigidos por sitio a nivel de amino ácido de MPIF-1, pueden realizarse al -reemplazar un amino ácido particular con un amino ácido conservador. Mutaciones conservadoras preferidas incluyen: por ejemplo mutaciones complementarias preferidas que incluyen: Ml reemplazado con A, G, I, L, S, T, o V; K2 reemplazado con H, o R; V3 reemplazado con A, G, I, L, S, T, o M; S4 reemplazado con A, G, I, L, T, M, o V; V5 reemplazado con A, G, I, L, S, T, o M; A6 reemplazado con G, I, L, S, T, M, o V; A7 reemplazado con G, I, L,S, T, M, o V; L8 reemplazado con A, G, I, S, T, M, o V; S9 reemplazado con A, G, I, L, T, M, o V; Lll reemplazado con A, G, I, S, T, M, o V; M12 reemplazado con A, G, I, L, S, T, o V; L13 reemplazado con A, G, I, S, T, M, o V; V14 reemplazado con A, G, I, L, S, T, o M; T15 reemplazado con A, G, I, L, S, M, o V; A16 reemplazado con G, I, L, S, T, M, o y; L17 reemplazado con A, G, I, S, T, M, o V; G18 reemplazado con A, I, L, S, T, M, o V; S19 reemplazado con A, G, I, L, T, M, o V; Q20 reemplazado con N; A21 reemplazado con G, I, L, S, T, M, o V; R22 reemplazado con H, o K; V23 reemplazado con A, G,I, L, S, T, o M; T24 reemplazado con A, G, I, L, S, M, o V; K25 reemplazado con H, o R; D26 reemplazado con E; A27 reemplazado con G, I, L, S, T; M, O V; E28 reemplazado con D; T29 reemplazado con A,G, I, L, S, M, o V; E30 reemplazado con D; F31 reemplazado con W, o Y; M32 reemplazado con A, G, I, L, S, T, o V; M33 reemplazado con A, G, I, L, S, T, o V; S34 reemplazado con A, G, I, L, T, M, o V; K35 reemplazado con H, o R; L36 reemplazado con A, G,I,S, T, M, o V; L38 reemplazado con A, G, I, S, T, M, o V; E39 reemplazado con D; N40 reemplazado con Q; V42 reemplazado con A, G, I, L, S, T, o M; L43 reemplazado con A, G, I, S, T, M, o V; 'L44 reemplazado con A, G, I, S, T,M, o V; D45 reemplazado con E; R46 reemplazado con H, o K; F47 reemplazado con W, o Y; H48 reemplazado con K, o R; A49 reemplazado con G, I, L, S, T, M, o V; T50 reemplazado con A, G, I, L, S, M, o V; S51 reemplazado con A, G, I, L, T, M, o V; A52 reemplazado con G, I, L, S, T, M, o V; D53 reemplazado con E; 156 reemplazado con A, G, L, S, T, M, o V; S57 reemplazado con A, G, I, L, T, M, o V; Y58 reemplazado con F, o W; T59 reemplazado con A, G, I, L, S, ' M, o V; R61 reemplazado con H, o K; S62 reemplazado con A, G, I, L, T, M, o V; 163 reemplazado con A, G, L, S, T, M, o V; S66 reemplazado con A, G, I, L, T, M, o V; L67 reemplazado con A, G, I, S, T, M, o V; L68 reemplazado con A, G,I,S, T, M, o V; E69 reemplazado con D; S70 reemplazado con A, G, I, L, T, M, o V; Y71 reemplazado con F, o W; F72 reemplazado con W, o Y; E73 reemplazado con D; T74 reemplazado con A, G, I, L, S, M, o V; N75 reemplazado con Q; S76 reemplazado con A, G, I, L, T, M, o V; E77 reemplazado con D; S79 reemplazado con A, G, I, L, T, M, o V; K80 reemplazado con H, o R; G82 reemplazado con A, I, L, S, T, M, o V; V83 reemplazado con A, G, I, L, S, T, o M; 184 reemplazado con A, G, L, S, T, M, o V; F85 reemplazado con W, o Y; L86 reemplazado con A, G, I, S, T, M, o V; T87 reemplazado con A, G, I, L, S, M, o V; K88 reemplazado con H, o R; K89 reemplazado con H, o R; G90 reemplazado con A, I, L, S, T, M, o V; R91 reemplazado con H,o K; R92 reemplazado con H, o K; F93 reemplazado con W, o Y; A95 reemplazado con G, I, L, S, T, M, o,V; N96 reemplazado con Q; S98 reemplazado con A, G, I, L, T,M, o V; D99 reemplazado con E; K100 reemplazado con H, o R; Q101 reemplazado con N; V102 reemplazado con A, G, I, L, S, T, o M; Q103 reemplazado con N; V104 reemplazado con A, G, I, L, S, T, o M; M106 reemplazado con A, G, I, L, S, T, o V; R107 reemplazado con H, o K; M108 reemplazado con A, G, I, L, S, T, o V; L109 reemplazado con A, G, I, S, T, M, o V; K110 reemplazado con H, o R; Lili reemplazado con A, G, I, S, T, M, o V; D112 reemplazado con E; T113 reemplazado con A, G, I, L, S, M, o V; R114 reemplazado con H, o K; 1115 reemplazado con A, G, L, S, T, M, o V; K116 reemplazado con H, o R; T117 reemplazado con A, G, I, L, S, M, o V; R118 reemplazado con H, o K; K119 reemplazado con H, o R; N120 reemplazado con Q. Las construcciones ' resultantes pueden clasificarse rutinariamente por actividades o funciones descritas a través de la especificación y conocidas en la especialidad. De preferencia, las construcciones resultantes tienen una actividad o función MPIF-1 incrementada y/o disminuida, mientras que se mantienen las actividades o funciones MPIF-1 restantes. Más preferible, las construcciones resultantes tienen más de una actividad o función MPIF-1 incrementada y/o disminuida, mientras que las actividades o funciones MPIF restantes se mantienen. Además de substitución en el ácido conservador, variantes de MPIF-1 incluyen (i) substituciones con uno o más de los residuos amino ácidos no conservados, en donde los residuos amíno ácidos substituidos pueden o no ser uno codificado por el código genético, o (ii) substitución con uno o más de residuos amino ácidos que tienen un grupo substituyente o (iii) función del polipéptido maduro con otro compuesto, tal como un compuesto para incrementar la estabilidad y/o solubilidad del polipéptido (por ejemplo polietilen glicol) o (iv) fución del polipéptido con amino ácidos adicionales tales como por ejemplo un péptido de región de fusión IgG Fc o secuencia líder o secretoria o una secuencia que facilita la purificación. Estos polipéptidos variantes se consideran dentro del alcance de aquellos con destreza en la técnica a partir de las presentes enseñanzas. Por ejemplo, variantes de polipéptido MPIF-1 que contienen substituciones amino ácido, de amino ácidos cargados con otros amino ácidos cargados o neutros, pueden producir proteínas con características mejoradas tales como menos agregación. La agregación de formulaciones farmacéuticas tanto reduce la actividad como incrementa la liberación debido a la actividad inmunogénica del agregado (Pinckard y colaboradores, Clin. Exp . Immunol . 2:331-340 (1967); Robbins y colaboradores, Diabetes 36: 838-845 (1987); Cleland y colaboradores . , Cri t . Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems 10:307-377 (1993).) Por ejemplo, substituciones no conservadoras preferidas de MPIF-1 incluyen: Por ejemplo mutaciones no complementarias preferidas incluyen: Ml reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; K2 reemplazado con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; V3 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; S4 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; V5 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; A6 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; A7 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F,W, Y, P, o C; L8 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; S9 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W/ Y, P, o C; CIO reemplazado con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, o P; Lll reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; M12 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; L13 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; V14 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; T15 reemplazado con D,E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; A16 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; L17 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C;G18 reemplazado con D, E,' H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; S19 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; Q20 reemplazado con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, o C; A21 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; R22 reemplazado con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, , Y, P, o C; V23 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; T24 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; K25 reemplazado con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; D26 reemplazado con H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; A27 reemplazado con D, E, H, K,R, N, Q, F, W, Y, P, o C; E28 reemplazado con H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, O C; T29 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P,o C; E30 reemplazado con H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; F31 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; M32 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; M33 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; S34 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; K35 reemplazado con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; L36 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F,' W, Y, P, o C; P37 reemplazado con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, o C; L38 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; E39 reemplazado con H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; N40 reemplazado con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F,' W, Y, P, o C; P41 reemplazado con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, o C; V42 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; L43 reemplazado con D, E, H, K, R, N,Q, F, W, Y, P, o C; L44 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; D45 reemplazado con H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; R46 reemplazado con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, O C; F47 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; H48 reemplazado con D; E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; A49 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; T50 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; S51 reemplazado con D, E, H, K, R7 N, Q, F, W, Y, P, o C ; A52 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; D53 reemplazado con H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; C54 reemplazado con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, o P; C55 reemplazado con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, ' o P; 156 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; S57 reemplazado con D, E,H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; Y58 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M,( V, P, o C; T59 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W,Y, P, o C; P60 reemplazado con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, o C; R61 reemplazado con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; S62 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; 163 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; P64 reemplazado con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, o C; C65 reemplazado con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, o P; S66 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; L67 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; L68 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; E69 reemplazado con H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; S70 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; Y71 reemplazado con D, E,H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; F72 reemplazado con D, E, H, K, R, N? Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; E73 reemplazado con H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; T74 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; N75 reemplazado con D, E, H, K, R, A, G, X, L, S, T, M,V, F, W, Y, P, o C; S76 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; E77 reemplazado con H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; C78 reemplazado con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, o P; S79 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; K80 reemplazado con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; P81 reemplazado con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, o C; G82 reemplazado con D,E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o. C; V83 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; 184 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; F85 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; L86 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; T87 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; K88 reemplazado con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; K89 reemplazado con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; G90 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; R91 reemplazado con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; R92 reemplazado 'con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; F93 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; C94 reemplazado con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, o P; A95 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; N96 reemplazado con D,E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, o C; P97 reemplazado con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, o C; S98 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; D99 reemplazado con H, K, R, A, G, I,' L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; K100 reemplazado con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; QlOl reemplazado con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, o C; V102 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W,Y, P, o C; Ql03 ""reemplazado con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, o C; V104 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; C105 reemplazado con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, o P; M106 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F,' W, Y, P, o C; R107 reemplazado con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; M108 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; LIO 9 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q,F, W, Y, P, o C; K110 reemplazado con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; Lili reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, O C; D112 reemplazado con H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; T113 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; R114 reemplazado con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; 1115 .reemplazado con D, E, ?, X, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; K116 reemplazado con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; T117 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; R118 reemplazado con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q7 F,W, Y, P, o C; K119 reemplazado con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; N120 reemplazado con D, E, H, K, R, A, G, I, L. Las construcciones resultantes pueden . monitorearse rutinariamente por actividades o ,funciones descritas a través de la especificación y conocidas en la especialidad. De preferencia, la construcción resultante tienen una actividad o función MPIF-1 incrementada y/o disminuida mientras que se mantienen la o las actividades o funciones MPIF-1 restantes. Más preferiblemente las construcciones resultantes tienen más de una actividad o función MPIF-l incrementada y/o disminuida, mientras que las restantes funcionan o actividad MPIF-1 se mantienen.

Adicionalmente, más de un amino ácido (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10) puede ser reemplazado con los amino ácidos substituido como se describió anteriormente (ya sea conservadores o no conservadores) . Los amino ácidos substituidos pueden ocurrir en la forma de longitud integra, madura o proproteína de la proteína MPIF-1, así como los mutantes de eliminación de terminal -C y -'N, que tienen la fórmula general m-n, enlistados a continuación. Una modalidad adicional de la invención se relaciona a un polipéptido que comprende la secuencia amino ácido de un polipéptido MPIF-1 que tiene una secuencia de amino ácidos que contiende al menos una substitución de amino ácido, pero no más de 50 substituciones de amino ácido, aún más preferible no más de 40 substituciones de amino ácido, aún más preferible no más de 30 substituciones de amino ácido, y todavía más preferible, no más de 20 substituciones de amino ácido. Por supuesto, a fin de la preferencia siempre incrementada, es altamente preferible "que un polipéptido tenga una secuencia amino ácido que comprende la secuencia amino ácido de un polipéptido MPIF-1, que contiene al menos 1, pero no más de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 substituciones amino ácido. En modalidades específicas, el número de adiciones, substituciones y/o eliminaciones en la secuencia de amino ácidos de la Figura 1 o sus fragmentos, (por' ejemplo la forma madura y/u otros fragmentos aquí descritos) es . 1-5, 5-10, 5-25, 5-50, 10-50 o 50-150, son preferibles substituciones de amino ácido conservador. Como se mencionó anteriormente, los polipéptidos MPIF-1 pueden comprender o consistir de la secuencia de amino ácido de ID de SEC NO . : 2, TD de SEC NO. : 7, o las secuencias de amino ácidos codificadas por los clones .ADNc depositados, excepto por una o más substituciones, eliminaciones o adiciones de ácido. También como se describió anteriormente, el polipéptido MPIF-l puede ser al menos 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntico a ID de SEC NO.: 2, ID de SEC NO.: 7, o a los polipéptidos codificados por los clones ADNc depositados. En una modalidad, estas variantes polipéptido también tienen una estructura igual o substancialmente igual que la del MPIF-1 o al menos una región del mismo. La estructura por ejemplo puede ser la estructura de solución como se determina por RMN (ver Ejemplo 37) . Polinucleótidos que codifican estos polipéptidos también están abarcados por la invención. Por ejemplo, el polipéptido MPIF-1 puede contener uno o varios cambios de amino ácido (substituciones, eliminaciones o adiciones) pero sin cambios en residuos o posiciones particulares. Posiciones en las cuales substituciones, eliminaciones o adiciones pueden ser excluidas incluyen residuos conservados tales como los cuatro residuos Cys en las posiciones Cys-54 (Cys-11 en Ej. ' 37) , Cys-55 (Cys-12 en Ej . 37), Cys-78 (Cys-35 en Ej . 37), y Cys-94 (Cys-51 en Ej . 37) de ID de SEC NO.: 2. Residuos conservados también incluyen los dos residuos Cys en las posiciones Cys-65 (Cys-22 en Ej . 37), y Cys-105 CCys-62 en Ej . 37) de ID SEC NO. :2. Cualquiera una o una combinación de estas posiciones puede ser excluida de ser substituida, eliminada o agregada. De preferencia, la variante de MPIF-1 contiene substituciones, eliminaciones o adiciones, excepto en cada uno de los seis residuos Cys de MPIF-1. Residuos adicionales que pueden ser excluidos de cambio incluyen residuos conservadoramente substituidos tales como Ile-56 (Ile-13 en Ej . 37) , Tyr-58 (Tyr- 15 en Ej . 37), Arg-61 (Arg-18 en Ej . 37), y Ile-63 (Ile-20 en Ej . 37) de ID de SEC NO.: 2 . Cualquiera o una combinación de estas posiciones puede ser excluida de ser substituida, eliminada o agregada. De preferencia, la variante MPIF-1 contiene substituciones, eliminaciones o adiciones, excepto en cada uno de estos residuos. En forma alterna, estos residuos conservadoramente substituidos pueden cambiarse por substituciones conservadoras . Residuos adicionales que pueden excluirse de cambio incluyen los residuos conservadoramente substituidos tales como Ile-56 (Ile-13 en Ej . 37) , Tyr-58 (Tyr-15 en Ej . 37) , Arg-61 (Arg-18 en Ej . 37) , Thr-74 (Thr-31 en Ej . 37) y Thr-87 (Thr-44 en Ej . 37) de ID SEC NO : 2. Cualquiera o una combinación de estas posiciones puede excluir de ser substituida, eliminada o agregada. De preferencia, la variante MPIF-1 ~ contiene substituciones, eliminaciones, o adiciones, excepto en cada uno de estos residuos. En forma alterna, estos residuos conservadoramente substituidos pueden cambiarse por substituciones conservadoras. Residuos adicionales que pueden excluirse de cambio incluyen los residuos conservadoramente substituidos tales como Ile-56 (íle-13 en Ej . 37) , Tyr-58 (Tyr-15 en Ej . 37), Arg-61 (Arg-18 en Ej . 37), Ile-63 (Ile-20 en Ej . 37), Thr-74 (Thr-31 en Ej . 37) y Thr-87 (Thr-44 en Ej . 37) de ID de SEC NO.: 2, Cualquiera o una combinación de estas posiciones puede ser excluida de ser substituida, eliminada o agregada. De preferencia, la variante MPIF-1 contiene substituciones, eliminaciones, o adiciones, excepto en cada uno de estos residuos. En forma alterna, estos residuos conservadoramente substituidos pueden cambiarse por substituciones conservadoras. Residuos conservadoramente substituidos incluyen Ile-63 (Ile-20 en Ej . 37), Leu-68 (Leu-25 en Ej . 37), Tyr-71 (Tyr-28 en Ej.37), Phe-72_ (Phe-29 en Ej . 37), Val-83 (Val-40 en Ej . 37), Ile-84 (Ile-41 en Ej . 37) , Phe-85 (Phe-42 en Ej . 37) , Phe-93 (Phe-50 en Ej . 37), Ala-95 (Ala-52 en Ej . 37), Val-102 (Val-59 en Ej . 37), Met-106 (Met-63 en Ej . 37), y Leu-109 (Leu-66 en Ej . 37) de ID de SEC NO.: 2. Cualquiera o una combinación de estas posiciones puede 'ser excluida de ser substituida, eliminada o agregada. De preferencia, la variante MPIF-1 contiene substituciones, eliminaciones, o adiciones, excepto en cada uno de estos? residuos. En forma alterna, estos residuos conservadoramente substituidos pueden cambiarse por substituciones conservadoras . Adicionales residuos conservadoramente substituidos incluyen adicionales Ile-56 (Ile-13 en Ej . 37), Arg-61 (Arg-18 en Ej . 37)', Tyr-58 (Tyr-15 en Ej . 37), Thr-74 (Thr-31 en Ej . 37), y Gly-82 (Gly-39 en Ej . 37) de ID SEC NO : 2. Cualquiera o una combinación de estas posiciones puede ser excluida de ser substituida, eliminada o agregada. De preferencia, la variante MPIF-1 contiene substituciones, eliminaciones, o adiciones, excepto en cada uno de estos residuos. En forma alterna, estos residuos conservadoramente substituidos pueden cambiarse por substituciones conservadoras. Más residuos conservadoramente substituidos incluyen Pro-64 (Pro-21 en Ej . 37) , y Pro- 97 (Pro-54 en Ej . 37) de ID de SEC NO.: 2. Cualquiera o una combinación de estas posiciones puede ser excluida de ser substituida, eliminada o agregada. De preferencia, la variante MPIF-1 contiene substituciones, eliminaciones, o adiciones, excepto en todos estos residuos. En forma alterna, estos residuos conservadoramente substituidos pueden cambiarse por substituciones conservadoras. Más residuos conservadoramente substituidos "incluyen Gln-101 (Gln-58 en Ej . '37) de ID de SEC NO.: 2. De preferencia, este residuo se- excluye de ser substituido, eliminado o agregado. De preferencia, conservadoramente substituido. Más preferible, está substituido con un amino ácido que carece de una cadena lateral voluminosa. De esta manera, es preferible esté substituido con un amino ácido diferente a por ejemplo a Trp. Adicionales residuos substituidos conservadoramente incluyen Arg-61 (Arg- 18 en Ej . 37) , Lys-88 (Lys-45 en Ej . 37) , y Arg-91 (Arg-48 en Ej . 37) de ID de SEC NO. : 2. Cualquiera o una combinación de estas posiciones puede excluirse de ser substituida, eliminada o agregada. De preferencia, la variante MPIF-1 contiene substituciones, eliminaciones, o adiciones, excepto en todos estos residuos. En forma alterna, estos residuos conservadoramente substituidos pueden cambiarse por substituciones conservadoras. Más adicionales residuos conservadoramente substituidos incluyen Lys-89 (Ly's-46 en Ej . 37) , Lys-100 (Lys-57 en Ej . 37) , Arg-107 (Arg-64 en Ej . 37) , y Lys -1ID (Lys-67 en Ej . 37) de ID de SEC NO.: 2. Cualquiera o una combinación de estas posiciones puede ser excluida de ser substituida, eliminada o agregada. De preferencia, la variante MPIF-1 contiene substituciones, eliminaciones, o adiciones, excepto en todos estos residuos. En forma alterna, estos residuos substituidos en forma conservadora pueden cambiarse por substituciones conservadoras . ' Además de las combinaciones preferidas anteriores, una combinación preferida de residuos conservadoramente substituidos incluyen Thr-74 (Thr-31 en Ej . 37), Gly-82 (Gly-39 en Ej . 37), Tyr-58 (Tyr- 15 en Ej . 37), Cys-54 (Cys-11 en Ej . 37), Cys-55 (Cys-12 en Ej . 37), y Cys-94 (Cys-51 en Ej . 37) de ID de SEC NO.: 2. De preferencia, la variante MPIF-1 contiene substituciones, eliminaciones, o adiciones, excepto en cada uno de estos residuos. En forma alterna, estos residuos pueden cambiarse por substituciones conservadoras. De preferencia, la variante MPIF-1 contiene cambios de amino ácido excepto por al menos uno o todos los residuos substituidos en forma conservadora. En forma alterna, al menos uno o todos los residuos substituidos en forma conservadora anteriores, pueden ser cambiados por substituciones conservadoras. De preferencia, la variante MPIF-1 contiene cambios de amino ácido excepto por al menos uno o todos los residuos substituidos conservados anteriores (es decir, uno o más residuos Cys) y al menos uno o todos los residuos -substituidos conservadoramente (al menos uno o todos los residuos restantes anteriores) - En forma alterna, al menos uno o todos los residuos substituidos conservados pueden cambiarse por substituciones conservadoras . Variante Usada de MPIF-1 . Además, variantes de MPIF-1 se han identificado y caracterizado. Varios de estos análogos comprenden truncados termínales amino. Además, un análogo MPIF-1 que aparentemente resulta de un sitio de lisado alterno también se ha identificado y caracterizado (Figura 20 (ID de SEC N0.:7)). Ejemplo 11 describe la actividad biológica de estos análogos MPIF-1. Las secuencias de estos análogos se ilustran en la Figura 19 (ID de SEC NOS. : 3, 4, y 5," así como residuos amino ácido 46-120, 45-120, 48-120, 49-120, 39-120, y 44-120 en ID de SEC NO. : 2) . En otro aspecto, la presente invención incluye substituciones amino ácido en la variante de lisado de amino ácido 137 de MPIF-1. Por ejemplo, substituciones conservadoras incluyen: Ml reemplazado con A, G, I, L, S, T, o V; K2 reemplazado con H, o R; V3 reemplazado con A, G, I, L, S, T, o M; S4 reemplazado con A, G, I, L, T, M, o V; V5 reemplazado con A, G, I, L, S, T, o M; A6 reemplazado con G, I, L, S, T, M, o V; A7 reemplazado con G, I, L, S, T, M, o V; L8 reemplazado con A, G, I, S, T, M, o V; S9 reemplazado con A, G, I, L, T, M, o V; Lll reemplazado con A, G, I, S, T, 'M, O V; M12 reemplazado con A, G, I, L, S, T, o V; L13 reemplazado con A, G, I, S, T, M, o V; V14 reemplazado con A, G, I, L, S, T, o M; T15 reemplazado con A, G, I, L, S, , M, o V; A16 reemplazado con G, I, L, S, T, M, o V; L17 reemplazado con A, G, I, S, T, M, o V; G18 reemplazado con A, I, L, S, T, M, o V; S19 reemplazado con A, G, I, L, T, M, o V; Q20 reemplazado con N; A21 reemplazado con G, I, L, S, T, M, o V; R22 reemplazado con H, o K; V23 reemplazado con A, G, I, L, S, T, o M; T24 reemplazado con A, G, I, L, S, M, o V; K250 reemplazado con H, o R; D26 reemplazado con E; A27 reemplazado con G, I, L, S, T, M, o V; E28 reemplazado con D; T29 reemplazado con A, G, I, L, S, M, o V; E30 reemplazado con D; F31 reemplazado con W, o Y; M32 reemplazado con A, G, I, L, S, T, o V; M33 reemplazado con A, G, I, L, S, T, o V; S34 reemplazado con A, G, I, L, T, M, o V; K35 reemplazado con H, o R; L36 reemplazado con A, G, I, S, T, M, o V; L38 reemplazado con A, G, I, S, T, M, o V; E39 reemplazado con D; N40 reemplazado con Q; V42 reemplazado con A, G, I, L, S, T, o M; L43 reemplazado con A, G, I, S, T, M, o V; L44 reemplazado con A, G, I, S, T, M, o V; D45 reemplazado con E; M46 reemplazado con A,,, G, I, L, S, T, o V; L47 reemplazado con A, G, I, S, T, M, o V; W48 reemplazado con F, o Y; R49 reemplazado con H, o K; R50 reemplazado con H, o K; K51 reemplazado con H, o R; 152 reemplazado con A, G, L, S, T, M, o V; G53 reemplazado con A, I, L, S, T, M, o V; Q55 reemplazado con N; M56 reemplazado con A, G, I, L, S, -T, O V; T57 reemplazado con A, G, I, L, S, M, o V; L58 reemplazado con A, G, I, S, T, M, o V; S59 reemplazado con A, G, I, L, T, M, o V; H60 reemplazado con K, o R; A61 reemplazado con G, I, L, S, T, M, o V; A62 reemplazado con G, I, L, S, T, M, o V; G63 reemplazado con A, I, L, S, T, M, o V; F64 reemplazado con W, o Y; H65 reemplazado con K, o R; A66 reemplazado con G, I, L, S, T, M, o V; T67 reemplazado con A, G, I, L, S, M, o V; S68 reemplazado con A, G, I, L, T, M, o V; A69 reemplazado con G, I, L, S, T, M, o V; D70 reemplazado con E; 173 reemplazado con A, G, L, S, T, M, o V; S74 reemplazado con A, G, I, L, T, M, o V; Y75 reemplazado con F, o W; T76 reemplazado con A, G, I, L, S, M, o V; R78 reemplazado con H, o K; S79 reemplazado con A, G, I, L, T, M, o V; 180 reemplazado con A, G, L, S, T, M, o V; S83 reemplazado con A, G, I, L, T, M, o V; L84 reemplazado con A, G, I, S, T, M, o.V; L85 reemplazado con A, G, I, S, T, M, o V; E86 reemplazado con D; S87 reemplazado con A, G, I, L, T, M, o V; Y88 reemplazado con F, o W; F89 reemplazado con W, o Y; E90 reemplazado con D; T91 reemplazado con A, G, I, L, S, M, o V; N92 reemplazado con Q; S93 reemplazado con A, G, I, L, T, M, o V; E94 reemplazado con D; S96 reemplazado con A, G, I, L, T, M, o V; K97 reemplazado con H, o R; G99 reemplazado con A, I, L, S, T, M, o V; V100 reemplazado con A, G, I, L, S, T, o M; 1101 reemplazado con A, G, L, S, T, M, o V; F102 reemplazado con W, o Y; L103 reemplazado con A, G, I, S, T, M, o V; T104 reemplazado con A, G, I, L, S, M, o V; K105' reemplazado con H, o R; K106 reemplazado con H, o R; G107 reemplazado con A, I, L, S, T, M, o V; R108 reemplazado con H, o K; R109 reemplazado con H, o K; F110 reemplazado ?on W, o Y; A112 reemplazado con G, I, L, S, T, M, o V; N113 reemplazado con Q; S115 reemplazado con A, G, I, L, T, M, o V; D116 reemplazado con E; K117 reemplazado con H, o R; Q118 reemplazado con N; V119 reemplazado con A, G, I, L, S, T, o M; Q120 reemplazado con N; V121 reemplazado con A, G, I, L, "S, T, o M; M123 reemplazado con A, G, I, L, S, T, o V; R124 reemplazado con H, o K; . M125 reemplazado con A, G, I, L, S, T, o V; L126 reemplazado con A, G, I, S, T, M, o V; K127 reemplazado con H, o R; L128 reemplazado con A, G, I, S, T, M, o V; D129 reemplazado con E; T130 reemplazado con A, G, I, L, S, M, o V; R131 reemplazado con H, o K; 1132 reemplazado con A, G, L, S, T, M, o V; K133 reemplazado con H, o R; T134 reemplazado con A, G, I, L, S, M, o V; R135 reemplazado con H, o K; K136 reemplazado con H, o R; y/o N137 reemplazado con Q de ID de SEC NO . : 7. Por ejemplo, substituciones no conservadoras en la variante de lisado de amino ácidos 137 incluye: Ml reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; K2 reemplazado con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; V3 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; S4 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; V5 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; A6 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, .o C; A7 reemplazado con D,- E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; L8 reemplazado con D, E, H,. K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; S9 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; CIO reemplazado con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, o P¡ Lll reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C¡ M12 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, O C; L13 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; V14 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, O C, T15 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, O C; Al6 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, O C; L17 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C, G18 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; S19 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; Q20 reemplazado con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, o C; A21 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; R22 reemplazado con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; V23 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; T24 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; K25 reemplazado con D( E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; D26 reemplazado con H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; A27 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; E28 reemplazado con H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; T29 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; E30 reemplazado con H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; F31 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; M32 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; M33 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; S34 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; K35 reemplazado con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; L36 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; P37 reemplazado con D, E, H, K,' R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, o C; L38 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; E39 reemplazado con H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; N40 reemplazado con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, o C; P41 reemplazado con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, o C; V42 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; L43 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C ; L44 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; D45 reemplazado con H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; M46 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; L47 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; W48 reemplazado conD, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; R49 reemplazado con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; R50 reemplazado con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; K51 reemplazado con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; 152 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; G53 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; P54 reemplazado con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, o C; Q55 reemplazado con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, O C; M56 reemplazado con D, E, H, K,R,N,Q, F, W, Y, P, o C; T57 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; L58 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; S59 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, oC;H60reemplazado con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; A61 reemplazado con D, E H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; A62 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; G63 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; F64 reemplazado con n D, E, H, K, R, N, Q, A, G, T, L, S, T, M, V, P, o C; H65 reemplazado con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, _ Q, F, W, Y, P, o C;A66 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; T67 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; S68 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; A69 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; D70 reemplazado con H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; C71 reemplazado con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, o P; C72 reemplazado con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, o P; 173 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; S74 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; Y75 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; T76 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; P77 reemplazado con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, o C; R78 'reemplazado con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, O C; S79 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; 180 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; P81 reemplazado con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, o C; C82 reemplazado con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, o P ; S83 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; L84 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; L85 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C;E86 'reemplazado con H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, Ñ, Q, F, W, Y, P, O C; S87 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; Y88 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; F89 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; E90 reemplazado con H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C;T91 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; N92 reemplazado con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, o C; S 93 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; E94 reemplazado con H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; C95 reemplazado con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, o P; S96 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; K97 reemplazado con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; P98 reemplazado con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, C; G99 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; V100 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; 1101 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; F102 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; L103 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y,_ P, o C; T104reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; K105 reemplazado con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, _ P, o C; K106 reemplazado con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; G107 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; R108 reemplazado con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; R109 reemplazado con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; F110 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; Clll reemplazado con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y,oP;A112reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W~, Y, P, o C; N113 reemplazado con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, o C; P114 reemplazado con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, o C; S 115' reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; D 116 reemplazado con H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; K117 reemplazado con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; Q118 reemplazado con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, o C; V119 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; Q120 reemplazado con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, o C; V121 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; C122 reemplazado con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, o P;M123 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; R124 reemplazado con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; M125 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; L126 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; K127 reemplazado con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; L128 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; D129 reemplazado con H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; T130 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; R131 reemplazado con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, O C; 1132 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; K133 reemplazado con D,E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; T134 reemplazado con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; R135 reemplazado con D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, _ W, Y, P, o C; K136 reemplazado con P, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; y/o N137 reemplazado con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, o C de ID SEC NO.: 7. A fin de mejorar o alterar las características del o los polipéptidos MPIF-1, puede emplearse ingeniería de proteínas. Tecnología de ADN recombinante conocida por aquellos con destreza en la especialidad puede emplearse para crear proteínas novedosas. Muteínas y eliminaciones o proteínas de fusión pueden mostrar, por ejemplo actividad mejorada o estabilidad incrementada. Además, pueden ser purificadas con superiores rendimientos y mostrar mejor solubilidad al menos bajo ciertas condiciones de purificación y almacenamiento. A continuación se establecen ejemplos adicionales de mutaciones que pueden ser construidas. Eliminaciones Carboxi - terminal y Amino - terminal MPIF-1 : Gamma interferona muestra hasta 10 veces superiores actividades al eliminar de 8 a 10 residuos amino ácido del extremo carboxi de la proteína (Dóbeli y colaboradores, J. of Biotechnology 7:199-216(1988) . Ron y colaboradores, J. Biol . Chem . , 268 (4) : 2984-2988 (1993) reporta proteínas KGF modificadas que tienen actividad de unión de heparina, incluso si estuvieran faltantes los residuos amino ácido amino terminales 3, 8, o 27. Muchos otros ejemplos se conocen por cualquiera con destreza en la especialidad. Particularmente, eliminaciones N-terminal del polipéptido MPIF-1 pueden describirse por la fórmula general m-120, en donde m es un entero de 2 a 115, en donde m corresponde la posición del residuo amino ácido identificado en ID de SEC NO.: 2. Más particularmente, la invención proporciona polinucleótidos que codifican polipéptidos que comprenden, o en forma alterna consisten de la secuencia de amino ácidos de residuos: K-2 a N-120; V-3 a N-120; S-4 a N-120; V-5 a N-120; A-6 a N-120; A-7 a N-120 L-8 a N-120; S-9 a N-120; C-10 a N-120; L-ll a N-120 M -12 a N-120; L-13 a N-120; V-14 a N-120; T-15 a N-120 A-16 a N-120; L-17 a N-120; G-18 a N-120; S-19 a N-120 ~Q-20 a N-120; A-21 a N-120; R-22 a N-120; V-23 a NT- 120 T-24 a N-120; K-25 a N-120; D-26 a N-120; A-27 a N-120 E-28 a N-120; T-29 a N-120; E-30 a N-120; F-31 a N-120 M -32 a N-120; M-33 a N-120; S-34 a N-120; K-35 a N-120 L-36 a N-120; P-37 a N-120; L-38 a N-120; E-39 a N-120 N-40 a N-120; P-41 a N-120; V-42 a N-120; L-43 a N-120 L-44 a N-120; D-45 a N-120; R-46 a N-120; F-47 a N-120 H-48 a N-120; A-49 a N-120; T-50 a N-120; S-51 a N-120 A-52 a N-120; D-53 a N-120; C-54 a N-120; C-55 a N-120 1-56 a N-120; S-57 a N-120; Y-58 a N-120; T-59 a N-120 P-60 a N-120; R-61 a N-120; S-62 aN-120; 1-63 a N-120; P-64 a N-120; C-65 a N-120; S-66 a N-120; L-67 a N-120; L-68 a N-120; E-69 a N-120; S 70 a N-120; Y-71 a N-120; F-72 a N-120; E-73 a N-120; T-74 a N-120; N-75 a N-120; S-76 a N-120; E-77 a N-120; C-78 a N-120; S-79 a N-120; K-80 a N-120; P-81 a N-120; G-82 a N-120; V-83 a N-120; 1-84 a N-120; F-85 a N-120; L-86 a N-120; T-87 a N-120; K-88 a N-120; K-89 a N-120; G-90 a N-120; R-91 a N-120; R-92 a N-120; F-93 a N-120; C-94 a N-120; A-95 a N-120; N-96 a N-120; P-97 a N-120; S-98 a N-120; D-99 a N-120; KrlOO a N-120; Q-101 a N-120; V-102 a N-120; Q-103 a N-120; V-104 a N-120; C-105 a N-120; M-106 a N-120; R-107 a N-120; M-108 a N-120; L-109 a N-120; K-110 a N-120; L-lll a N-120; D-112 a N-120; T-113 a N-120; R-114 a N-120; 1-115 a N-120; de ID de SEC NO.: 2. Polinucleótidos que codifican estos polipéptidos también están abarcados por la invención. También como se mencionó anteriormente, incluso si la eliminación de uno o más amino ácidos del extremo C de una proteína resulta en modificación o pérdida de una o más funciones biológicas de la proteína, otras actividades funcionales (por ejemplo actividades biológicas, habilidad por multimerizar, habilidad por ligar receptor MPIF-1) aún pueden ser retenidas. Por ejemplo, la capacidad de la muteína MPIF-1 recortada para inducir y/o ligar anticuerpos que reconocen la forma completa o madura del polipéptido, en general se retendrán cuando menos de la mayoría de los residuos del polipéptido completo o maduro se retiran, del extremo C. Si un polipéptido particular que carece de residuos C-terminal de un polipéptido completo retiene estas actividades inmunológicas, puede determinarse fácilmente por métodos rutinarios aquí descritos y de otra forma conocidos en la especialidad. No es poco probable que una proteína MPIF-1 con una gran cantidad de residuos amino ácido C-terminal eliminados puada retener algunas actividades biológicas o inmunogénícas . De hecho, péptidos compuestos de tan pocos como seis residuos amino ácido MPIF-1 a menudo pueden evocar una respuesta inmune. De acuerdo con esto, la presente invención además proporciona polipéptidos que tienen uno o más residuos eliminados de extremo carboxi de la secuencia amino ácido del polipéptido MPIF-1 ilustrado em la Figura 1 (ID de SEC NO. : 2) , como se describe por la formula general fórmula I -n, en donde n es un entero de 6 a 119, en donde n corresponde a la posición del residuo amino ácido identificado en ID de SEC, NO.: 2. Más particularmente, la invención proporciona polinucleótidos que codifican polipéptidos que comprenden, o en forma alterna consisten de la secuencia de amino ácidos de los residuos: A-27 a K-119; A-27 a R-118; A-27 a T-117; A-27 a K-116; A-27 a 1-115; A-27 a R-114; A-27 a T-113; A-27 a D-112; A-27 a L-lll; A-27 a K-110;A-27 a L-109; A-27 a M-108; A-27 a R-107; A-27 a M-1Ó6; A-27 a C-105; A-27 a V-104; A-27 a Q-103; A-27 a V-102; A-27 a Q-101; A-27 a K-100; A-27 a D-99; A-27 a S-98; A-27 a P-9y; A-27 a N-96; A-27 a A-95; A-27 a C-94; A-27 a F-93; A-27 a R-92; A-27 a R-91; A-27 a G-90; A-27 a K-89; A-27 a K-88;A-27 a T-87; A-27 a L-.86; A-27 a F-85; A-27 a 1-84; A-27 a V-83; A-27 a G-82; A-27 a P-81; A-27 a K-80; A-27 a S-79; A-27 a C-78; A-27 a E-77; A-27 aS-76; A-27 a N-75; A-27 a T-74; A-27 a E-73; A-27 a F-72; A-27 a Y-71; A-27 a S-70; A-27 a E-69; A-27 a L-68; A-27 á L-67; A-27 a S-66; A-27 a C-65; A-27 a P-64; A-27 a 1-63; A-27 a S-62; A-27 a R-61; A-27 a P-60; A-27 a T-59; A-27 a Y-58; A-27 a S-57; A-27 a 1-56; A-27 a C-55; A-27 a C-54; A-2.7 a D-53; A-27a A-52; A-27 a S-51; A-27 a T-50; A-27 a A-49; A-27 a H-48; A-27 a F-47; A-27 a R-46; A-27 a D-45; A-27 a L-44; A-27 a L-43; A-27 a V-42; A-27 a P-41;A-27 a N-40; A-27 a E-39; A-27 a L-38; A-27 a P-37; A-27 a^L-36; A-27 a K-35; A-27 a S-34; A-27 a M-33; A-27 a M-32; A-27 a F-31; A-27 a E-30; A-27 a T-29; A-27 a E-28; M-l a D-26; M-l a K-25; M-l a T-24; M-l a V-23; M-l a R-22; M-l a A-21; M-l a Q-20; M-l a S-19; M-l a G-18; M-la L-17; M-l a A-16; M-l a T-15; M-l a V-14; M-l a L-13; M-l a M-12; M-l a L-ll; M-l a C-10; M-l a S-9; M-l a L-8; M-l a A-7; de ID de SEC NO.: 2. Polinucleótidos que codifican estos polipéptidos también se abarcan por la invención. Aún más, una secuencia de señal puede agregarse a estas construcciones C-terminal. Por ejemplo, los amino ácidos de 1-26 de ID SEC NO. : 2, amino ácidos 2-26 de ID de SEC NO.: 2, amino ácidos 3-26 de ID de SEC NO.: 2, amino ácidos 4-26 de ID de SEC NO.: 2, amino ácidos 5-26 de ID de SEC NO.: 2, amino ácidos 6-26 de ID de SEC NO. : 2, amino ácidos 7-26 de ID de SEC NO. : 2, amino ácidos 8-26 de ID de SEC NO.: 2, amino ácidos 9-26 de ID de SEC NO.: 2, amino ácidos 10-26 de ID de SEC NO.: 2, amino ácidos 11-26 de ID de SEC NO.: 2, amino ácidos 12-26 de ID de SEC NO. : 2, amino ácidos 13-26 de ID de SEC NO. : 2, amino ácidos 14-26 de ID de SEC NO. : 2, amino ácidos 15-26 de ID de SEC NO. : 2, amino ácidos 16-26 de ID de SEC NO.: 2, amino ácidos 17-26 de ID de SEC NO.: 2, amino ácidos 18-26 de ID de SEC NO.: 2, amino ácidos 19-26 de ID de SEC NO.: 2, amino ácidos 20-26 de ID de SEC NO.-: 2, amino ácidos 21-26 de ID de SEC NO.: 2, amino ácidos 22-26 de ID de SEC NO.: 2, amino ácidos 23-26 de ID de SEC NO.: 2, amino ácidos 24-26 de ID de SEC NO.: 2, amino ácidos 25-26 de ID de SEC NO. : 2, amino ácidos 26 de ID de SEC NO. : 2 pueden agregarse al extremo N de cada construcción C-terminal enlistada anteriormente.

Además, cualquiera de las eliminaciones N o C-terminal anteriormente enlistadas pueden combinarse para producir un polipéptido MPIF-1 eliminado N y C-terminal. La invención' también proporciona polipéptidos que tienen uno o más amino ácidos eliminados tanto de los extremos amino como carboxilo puede describirse en general que tiene residuos m-n de ID de SEC NO. : 2, en donde n y m son enteros se describió anteriormente. Polinucleótidps codifican estos polipéptidos también están abarcados por la invención Fragmentos de polipéptidos preferidos adicionales comprenden, o en forma alterna consisten de, la secuencia de amino ácidos de residuos: M-l a T-15; K-2 a A-16; V-3 a L-17; S-4 a G-18; V-5 a S-19; A-6 a Q-20; A-7 a A-21; L-8 a R-22; S-9 a V-23; C-10 a T-24; L-ll a K-25; M-12 a D-26; L-13 a A-27; V-14 a E-28; T-15 a T-29; A-16 a E-30;L-17 a F-31; G-18 a M-32; S-19 a M-33; Q-20 a S-34; A-21 a K-35; R-22 a L-36; V-23 a P-37; T-24 a L-38; K-25 a E-39; D-26 a N-40; A-27 a P-41 ;E-28 a V-42; T-29 a L-43; E-30 a L-44; F-31 a D-45; M-32 a R-46; M-33 a F-47; S-34 a H-48, K-3,5 a A-49; L-36 a T-50; P-37 a S-51; L-38 a A-52;E-39 a D-53; N-40 a C-54; P-41 a C-55; V-42 a 1-56; L-43 a S-57; L-44 a Y-58; D-45 a T-59; R-46 a P-60; F-47 a R-61; H-48 a S-62; A-49 a I-63;T-50 a P-64; S-51 a C-65; A-52 a S-66; D-53 a L-67; C-54 a L-68; C-55 a E-69; 1-56 a S-70; S-57 a Y-71; Y-58 a F-72; T-59 a E-73; P-60 a T-74;H-61 a N-75; S-62 a S-76; 1-63 a E-77; P-64 a C-78; C-65 a S-79; S-66 a K-80; L-67 a P-81; L-68 a G-82; E-69 a V-83; S-70 a 1-84; Y-71 a F-85;F-72 a L-86; E-73 a T-87; T-74 a K-88; N-75 a K-89; S-76 a G-90; E-77 a R-91; C-78 a R-92; S-79 a F-93; K-80 a C-94; P-81 a A-95; G-82 a N-96;V-83 a P-97; 1-84 a S-98; F-85 a D-99; L-86 a K-100; T-87 a Q-101; K-88 a V-102; K-89 a Q-103; G-90 a V-104; R-91 a C-105; R-92 a M-106; F-93a R-107; C-94 a M-108; A-95 a L-109; N, 96 a K-110; P-97 a L-ll-1; S-98 a D-112; D-99 a T-113; K-100 a R-114; Q-101 a 1-1-15; V-102 a K-116;Q-103 a T-117; V-104 a R-118; C-105 a K-119; M-106 a N-120. Estos fragmentos polipéptidos pueden retener la actividad biológica de los polipéptidos MPIF-1 de la invención y pueden ser útiles para generar anticuerpos, como se describe más a continuación, polinucleótidos que codifican estos fragmentos polipéptidos también se abarcan por la invención. También se incluye la secuencia de nucleótido que codifica un polipéptido que consiste de una porción de la secuencia de amino ácido MPIF-1 completa codificada por el clon ADNc contenido en el depósito ATCC No. 75676, en donde esta porción excluye cualquier entero de residuos amino ácido de 1 a aproximadamente 110 amino ácidos del extremo amino de la secuencia de amino ácidos completa codificada por el clon ADNc Contenido en el depósito ATCC No. 75676, o cualquier entero de residuos amino ácido de 1 a aproximadamente 110 amino ácidos del extremo carboxi o cualquier combinación de las eliminaciones de terminal carboxi y terminal amino anteriores de la secuencia de amino ácidos completa codificada por el clon .ADNc contenido en el depósito ATCC No. 75676. Polinucleótidos que codifican todas las formas polipéptido mutante de eliminaciones anterior también se proporcionan. La presente solicitud también se dirige a proteína que contienen polipéptidos al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idénticos a la secuencia de polipéptidos MPIF-1 establecida aquí m-n. En modalidades preferidas, la solicitud se dirige a proteínas que contienen polipéptidos al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idénticos a polipéptidos que tienen la secuencia de amino ácidos de las eliminaciones N- y C-terminal MPIF-1 específicas aquí descritas. Polinucleótídos que codifican estos polipéptidos también se abarcan por la invención. Polipéptidos MPIF-1 particularmente preferidos de la secuencia de amino ácidos ilustrada en la Figura 1 (ID de SEC NO. : 2) se ilustran a continuación. Val (23) Asn (120) Val (23) Lys (119) Thr (24) Asn (120) Thr (24) Arg (118) Lys (25) Asn (120) Lys (25) Thr (117) Asp (26) Asn (120) Asp (26) Lys (116) Ala (27) Asn (120) Ala (27) --- lie '(115) Glu (28) Asn (120) Glu (28) Arg (114) Thr (29) Asn (120) Thr (29) Thr (113) Glu (30) Asn (120) Thr (29) Asp (112) Phe (31) Asn (120) Thr (29)---- Leu (111) Met (32) Asn (120) Thr (29) Lys (110) Met [33) Asn (120) Met (33) Leu (109) Ser [34) Asn (120) Ser (34) Met (108) Lys '35) Asn (120) Ser (34) Arg (107) Leu 36) Asn (120) Ser (34) Met (106) Pro 37) Asn (120) Ser (34) Cys(105) Leu 38) Asn (120) Ser (34) Val (104) Glu 39) Asn (120) Ser (34) Gln (103) Asn 40) Asn (120) Ser (34) Val (102) PrO ( 41) Asn (120) Ser ( 34) - -- Gln (101) Val ( 42) Asn (120) Ser (34) Lys (100) LCU ( 43) Asn (120) Ser (34) Asp (99) LCU ( 44) Asn (120) Ser (34) Ser (98) ASP ( 45) Asn (120) Ser (34) Pro '(97) Afg ( 46) Asn (120) Ser (34) Asn (96) Phe ( 47) Asn (120) Ser (34) Ala (95) His ( 48) Asn (120) Ser (34) Cys (94) Ala (49) Asn (120) Ser ((34) Phe (93) Thr (50) Asn (120) Ser ( (34) Arg (92) Ser (51) Asn (120) Ser ( (34) Arg (91) Ala (52) Asn (120) Ser ( (34)' --- Gly (90) Asp (53) Asn (120) Ser ( (34) Lys (89) Ser { (34) --- He (84) Ser ( (34) Ser ((79) Ser ( (34) Asn (75) Ser ( (34) Phe (72) SSeerr ((34) Leu (68) De esta manera, en un aspecto, mutantes de eliminación N-terminal MPIF-1 se proporcionan por la presente invención. Estos mutantes incluyen aquellos que comprenden o en forma alterna consisten de una secuencia de amino ácido mostrada en la Figura 1 (ID de SEC NO. : 2) que tiene una eliminación de al menos .os primeros 22 residuos amino ácido N-terminal (es decir, una eliminación de al menos Met (1) -- .Arg (22)) pero no más de los primeros 60 residuos amino ácido N-terminal de la Figura 1 (ID de SEC NO. : 2) . En forma alterna, la eliminación incluirá al menos los primeros 22 residuos amino ácido N-terminal pero no más que los primeros 53 residuos amino ácido N-terminal de la Figura 1 (ID de SEC NO.: 2) . En forma alterna, la eliminación incluirá al menos los primeros 33 residuos amino ápido N-terminal pero no más que los primeros 53 residuos amino ácido N-terminal de la Figura 1 (ID de SEC NO. : 2) . En forma alterna, la eliminación incluirá al menos los primeros 37 residuos amino ácido N-terminal (es decir una eliminación 5 de al menos Met (1) -- Pro (37)) pero no más que los primeros 53 residuos amino ácido N-terminal de la Figura 1 (ID de SEC NO. : 2) . En forma- alterna, la eliminación ? incluirá al menos los primeros 48 residuos amino ácido N-terminal pero no más que los primeros 53 residuos amino 10 ácido N-terminal de la Figura 1 (ID de SEC NO. : 2) . Además de los rangos de mutantes de eliminación N-terminal MPIF-1 anteriormente descritos, la presente invención también se dirige a todas las combinaciones de ^W los rangos anteriormente descritos, por ejemplo 15 eliminaciones de al menos los primeros 22 residuos amino ácido N-terminal pero no más que- los primeros 48 residuos amino ácido N-terminal de la Figura 1 (ID de SEC NO. : 2) ; eliminaciones de al menos los primeros 37 residuos amino ácidos N-terminal pero no más que los primeros 48 20 residuos amino ácido N-terminal de la Figura 1 (ID de SEC NO.: 2); eliminaciones de al menos los primeros 22 residuos amino ácido N-terminal pero no más que los primeros 37 residuos amino ácido N-terminal de la Figura 1 (ID de SEC NO. : 2) ; eliminaciones de al menos los 25 primeros 22 residuos amino ácidos N-terminal pero no más que los primeros 36 residuos amino ácido N-terminal de la Figura 1 (ID de SEC NO. : 2 ) ; eliminaciones de al menos los primeros 33 residuos amino ácidos N-terminal pero no más que los primeros 37 residuos amino ácido N-terminal de la Figura 1 (ID de SEC NO. : 2) y eliminaciones de al menos los primeros 33 residuos amino_ ácidos N-terminal pero no más que los primeros 48 residuos amino ácido N-terminal de la Figura 1 (ID de SEC NO. : 2) . En otro aspecto, los mutantes de eliminación C-terminal MPIF-1 se proporcionan por. la presente invención. De preferencia, el residuo amino ácido N-terminal de los mutantes de eliminación C-terminal MPIF-1 es residuo amino ácido 1 (Met? o 22 (Arg) de la Figura 1 (ID de SEC NO. : 2) . Estos mutantes incluyen aquellos que comprenden, o alternativamente consisten de, una secuencia de amino ácido mostrada en la Figura 1 (ID de SEC NO. : 2) que tiene una eliminación de al menos el último residuo amino ácido C-terminal (Asn (120)) pero no más que los últimos 52 residuos amino .ácido C-terminal (por ejemplo una eliminación de residuos amino ácido Glu (69) -Asn (120) de la Figura 1 (ID de SEC NO.: 2)). En forma alterna," la eliminación incluirá al menos los últimos 10 o 15 residuos amino ácido C-terminal, pero no más que los últimos 52 residuos amino ácido C-terminal de la Figura 1 (ID de SEC NO.: 2)). En forma alterna, la eliminación incluirá al menos los últimos 20 residuos amino ácido C-terminal, pero no más que los últimos 52 residuos amino ácido C-terminal de la Figura 1 (ID de SEC NO. : 2) ) . En forma alterna, la eliminación incluirá al menos los últimos 30 residuos amino ácido C-terminal, pero no más que los últimos 52 residuos amino ácido C-terminal de la Figura 1 (ID de SEC NO.: 2)) . En forma alterna, la eliminación incluirá al menos los últimos 36 residuos amino ácido C-terminal, pero no más que los últimos 52 residuos amino ácido C-terminal de la Figura 1 (ID de SEC NO.: 2)) . En forma alterna, la eliminación incluirá al menos los últimos 41 residuos amino ácido C-terminal, pero no más que los últimos 52 residuos amino ácido C-terminal de la Figura 1 (ID de SEC NO.: 2)) . En forma alterna, la eliminación incluirá al menos los últimos 45 residuos amino ácido C-terminal, pero no más que los últimos 52 residuos amino ácido C-terminal de la Figura 1 (ID de SEC NO.: 2)) . En forma alterna, la eliminación incluirá al menos los últimos 48 residuos amino ácido C-terminal, pero no más que los últimos 52 residuos amino ácido C-terminal de la Figura 1 (ID de SEC NO . : 2 ) ) . Además de los rangos los mutantes de eliminación C-terminal anteriormente descritos, la presente invención también se dirige a todas las combinaciones de los rangos anteriormente descritos, por ejemplo eliminaciones de al menos el último residuo amino ácido C-terminal, pero no más que los últimos 48 residuos amino ácido C-terminal de la Figura 1 (ID de SEC NO.: 2) ) ; eliminaciones de al menos el último residuo amino ácido C-terminal, pero no más que los últimos 45 residuos amino ácido C-terminal de la Figura 1 (ID de SEC NO. : 2)) ; eliminaciones de al menos el último residuo amino ácido C-terminal, pero no más que los últimos 41 residuos amino ácido C-terminal de la Figura 1 (ID de SEC NO. : 2) ) ; eliminaciones de al menos el último residuo amino ácido C-terminal, pero no más que los últimos 36 residuos amino ácido C-terminal de la Figura 1 (ID de SEC NO.: 2)) ; eliminaciones de al menos el último residuo amino ácido C-terminal, pero no más que los últimos 10 residuos amino ácido C-terminal de la Figura 1 (ID de SEC NO. : 2)); eliminaciones de al menos los últimos residuos amino ácido C-terminal, pero no más que los últimos 20 residuos amino ácido C-terminal de la Figura 1 (ID de SEC NO.: 2)) ; eliminaciones de al menos los últimos 10 residuos amino ácido C-terminal, pero no más que los últimos 30 residuos amino ácido C-terminal de la Figura 1 (ID de SEC NO. : 2) ) ; eliminaciones de al menos los últimos 10 residuos amino ácido C-terminal, pero no más que los últimos 36 residuos amino ácido C-terminal de la Figura 1 (ID de SEC NO. : 2) ) ; eliminaciones de al menos los últimos 20 residuos amino ácido C-terminal, pero no más que los últimos 30 residuos amino ácido C-terminal de la Figura 1 (ID de SEC NO. : 2)); etc. etc. etc Todavía en otro aspecto, también incluido por la presente invención están mutantes de eliminación MPIF-1 que tienen amino ácidos eliminados tanto por los residuos -terminal y C-terminal. Estos mutantes incluyen todas las combinaciones de los mutantes de eliminación N-terminal y los mutantes de eliminación C-terminal descritos anteriormente. Estos mutantes incluyen aquellos comprendidos o que consisten en forma alterna de una secuencia de amino ácido mostrada en la Figura 1 (ID de SEC NO. : 2) , que tiene una eliminación de al menos los primeros 22 residuos amino ácido N-terminal, pero no más que los primeros 52 residuos amino ácido N-terminal de la Figura 1 (ID de SEC NO. : 2) y una eliminación de al menos el último residuo amino ácido C-terminal, pero no más que los últimos 52 residuos amino ácido C-terminal de la Figura 1 (ID de SEC NO. : 2) . En forma alterna, una eliminación puede incluir al menos primeros 33, 37 o 48 amino ácidos N-terminal, pero no más que pero no más que los primeros 52 residuos amino ácido N-terminal de la Figura 1 (ID de SEC NO . : 2) y una eliminación de al menos los últimos 10, 20, 30, 36, 41, 45 o 48 residuos amino ácido C-terminal, pero no más que los últimos 52 residuos amino ácido C-terminal de la Figura 1 (ID de SEC NO. : 2) . Además se incluyen todas las combinaciones de los rangos anteriormente descritos. Entre los fragmentos especialmente preferidos de la invención están fragmentos caracterizados por atributos estructurales o funcionales de MPIF-1. Estos fragmentos incluyen residuos amino ácido, que comprenden regiones de hélice alfa y regiones de formación -de hélice alfa ("regiones alfa", hoja beta y regiones de formación de alfa beta ("regiones beta") , regiones de vuelta y formación de vuelta ("regiones de vuelta"), regiones enrolladas y regiones de formación de enrollado ("regiones enrolladas"), regiones hidrofílicas, regiones hidrofóbicas, regiones alfa anfipáticas, regiones formadoras de superficie, y regiones de alto índice antigénico (es decir, que contienen cuatro o más amino ácidos contiguos que tienen un índice antigénico mayor que o igual a 1.5, como se identifica utilizando los parámetros predefinidos del programa Jameson-Wolf) de MPIF-1 completo (es decir, de longitud integra) (ID de SEC NO. : 2) . Ciertas regiones preferidas son aquellas establecidas en la Figura 14 e incluyen, pero no están limitadas a regiones de los tipos anteriormente mencionados identificados por análisis de la secuencia de amino ácido ilustrada en la Figura 1 (ID de SEC NO. : 2) , estas regiones preferidas incluyen; regiones alfa pronosticadas Garnier-Robson, regiones beta, regiones de vuelta y regiones enrolladas; regiones alfa pronosticadas Chou-Fasman, regiones beta, regiones de vuelta y regiones enrolladas; regiones hidrofílicas e hidrofóbicas pronosticadas Kyte-Doolittle regiones anfipáticas alfa y beta de Eisenberg; regiones formadoras de superficie Emini; y regiones de alto índice antigénico Jameson-Wolf, como se pronostica utilizando los parámetros predefinidos de estos programas de computadora. Polinucleótidos que codifican estos polipéptidos también se abarcan por la invención. En modalidades adicionales, los polinucleótidos de la invención codifican atributos funcionales de MPIF-1. Modalidades preferidas de la invención en este aspecto incluyen fragmentos que- comprenden regiones de hélice alfa y regiones de formación de hélice alfa ("regiones alfa"), regiones de hoja beta y regiones de formación de hoja beta"), regiones de vuelta y de formación de vuelta ("región de vuelta"), regiones enrolladas y regiones de formación de enrollado ("regiones enrolladas"), regiones hidrofílicas, regiones hidrofóbicas, regiones anfipáticas, regiones beta anfipáticas, regiones flexibles, regiones de formación de superficie y regiones de alto índice antigénico de MPIF-1. • ' Regiones preferidas adicionales con aquellas establecidas en el Ejemplo 37. Los datos que representan los atributos estructurales o funcionales de MPIF-1 establecidos en la Figura 14 se describieron anteriormente, fueron generados utilizando los diversos módulos y algoritmos de DNA*STAR establecido en parámetros predefinidos. En una modalidad preferida, los datos presentados en la Figura 14 pueden utilizarse para determinar regiones MPIF-1 que exhiben un alto grado de potencial por antigenicidad. Regiones de alta antigenicidad se determinan a partir de los datos presentados al seleccionar valores que representan regiones del polipéptido que probablemente se expongan en la superficie del polipéptido en un ambiente en el que puede ocurrir reconocimiento de antígeno en el proceso de inicio de una respuesta inmune. Las regiones preferidas anteriormente mencionadas establecidas en la Figura 14, incluyen, pero no están limitadas a, regiones de los tipos anteriormente mencionados identificados por análisis de la secuencia de amino ácidos establecida en la Figura 1. Como se establece en la Figura 14, estas regiones preferidas incluyen regiones alfa Garnier Robson regiones beta, regiones de vuelta y regiones enrolladas, regiones ChouFasman, regiones beta y regiones enrolladas. Regiones hidrofílicas KyteDoolittle y regiones hidrofóbicas Eisenberg, regiones alfa y beta anfipáticas, regiones flexibles- KarplusSchulz , regiones de formación- de superficie Emini y regiones JamesonWolf de alto índice antigénico. Entre los fragmentos altamente preferidos en este aspecto se encuentran aquellos que comprenden regiones de MPIF-1 que combinan varias características estructurales, tales como varias de las características establecidas anteriormente o a continuación. En una modalidad, variantes y/o fragmentos MPIF-1 pueden tener igual o - substancialmente igual estructura que MPIF-1 o al menos una región del mismo, por ejemplo la estructura de solución como se determina por espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) (ver ejemplo 37) o la estructura como se determina por otras técnicas. De esta manera, las variantes y/o fragmentos MPIF-1 pueden tener una secuencia de amino ácidos diferente de aquella de ID de SEC NO. : 2 o ID de SEC NO. : 7 o de la secuencia de amino ácidos de los polipéptidos codificados por los • clones ADNc depositados, pero que sin embargo tienen la misma o substancialmente la misma estructura que MPIF-1 o al menos una región del mismo. Polinucleótidos que codifican -estos polipéptidos también están abarcados por la invención. La variante y/o fragmento MPIF-1 puede tener la misma o substancialmente la misma estructura que al menos una región de MPIF-1. Regiones de MPIF-1 incluyen el ciclo N-terminal, ciclo 310, primer hebra, vuelta primer tipo III, segunda hebra, vuelta tipo I. tercer hebra, vuelta segundo tipo III, y hélice descrita en el Ej . 37, es decir, los amino ácidos 56-63 (numerados 13-20 en el Ej . 37), 64-67 (21-24 en el Ej . 37), 70-74 (27-31 en el Ej . 37), 75-81 (32-38 en el Ej . 36), 82-87 (39-44 en el Ej . 37), 88-90 (45-47 en el Ej . 36), 91-95 (48-52 en el Ej . 37), 96-98 (53-55 en el Ej . 37), y 99-109 (56-66 en el Ej . 37) de ID de SEC NO.: 2. Regiones MPIF-1 también incluyen amino ácidos 44-120 (1-77 en el Ej . 37), 44-53 (1-10 en el Ej . 37), 54-109 (11-66 en el Ej . 37), 54-105 (11-62 in Ex. 37), 56-109 (13-66 en el Ej . 37), 106-120 (63-77 en el Ej . 37), 110-120 (67-77 en el Ej . 37) de ID de SEC NO. : 2, las regiones mostradas en la Figura 14, y otras como se describe aquí, o pronosticables por análisis de secuencia de amino ácidos. La variante y/o fragmento de polipéptido MPIF-1 puede tener igual o substancialmente igual estructura que una o una combinación de estas regiones MPIF-1.

Para una variante y/o fragmento MPIF-1 que tiene la misma o substancialmente la misma estructura además de una región de MPIF-1, las estructuras pueden ser contiguas entre si. En una modalidad, las estructuras no son contiguas entre sí, es decir están separadas por uno o más residuos amino ácido. De preferencia, las estructuras se alinean por aquello de MPIF-1, de preferencia, las estructuras se superponen en aquellos de MPIF-1. En una modalidad preferida, las estructuras tienen las mismas estructuras entre sí (es decir la misma estructura terciaria) que las estructuras correspondientes en el MPIF-1. Por ejemplo, la variante y/o fragmento MPIF-1 puede tener la misma o substancialmente la misma estructura que el ciclo N-terminal, primer hebra, segunda hebra, tercer hebra y hélice de MPIF-1. De esta manera, en una terminación preferida, la variante y/o fragmento MPIF-1 tiene la misma o substancialmente la misma estructura que los amino ácidos 56-63 (13-20 en el Ej . 37), 70-74 (27-31 en el Ej . 37) 82-87 (39-44 en el E . 37)_,91-95 (48-52 en el Ej . 37), y 99-109 (56-66 en el Ej . 37) de ID de SEC NO.: 2. Como otro ejemplo, la variante y/o fragmento MPIF-1 tiene la misma o substancialmente la misma estructura que el ciclo N-terminal, ciclo 310, primer hebra, primer vuelta tipo III segunda hebra, vuelta tipo I, tercer hebra, vuelta segundo tipo III y hélice de MPFI-1. De esta manera, la variante y/o fragmento MPIF-1 tiene la misma o substancialmente la misma estructura que los amino ácidos 56-63 (numerados 13-20 en el Ej . 37), 64-67 (21-24 en el Ej . 37) 70-74 (27-31 en el Ej . 37), 75-81 (32-38 en el Ej . 36), 82-87 (39-44 en el Ej . 37), 88-90 (45-47 en el Ej 36), 91-95 (48-52 en el Ej . 37), 96-98 (53-55 en el Ej . 37), y 99-109 (56-66 en el Ej . 37) de ID de SEC NO. : 2. En una modalidad preferida, la variante y/o fragmento MPIF-1 tiene la misma o substancialmente la misma estructura que los amino ácidos 56-109 (13-66 en el Ej . 37) de ID de SEC NO . : 2. En otra modalidad, el polipéptido MPIF-1 puede comprender o consistir de la secuencia de amino ácido de una o más regiones de MPFI-1. Para un polipéptido que comprende o consiste de la secuencia de amino ácido de dos o más regiones, las regiones pueden ser contiguas entre sí. En una modalidad, las regiones no son contiguas entre sí, es decir están separadas por uno o más residuos amino ácido. De preferencia, las secuencias amino ácido alinean con las secuencias amino ácido de las regiones correspondientes de MPIF-1 tal que están separadas por el mismo número de residuos amino ácido que los separan en MPIF-1. Todavía en otra modalidad, variantes y/o fragmentos MPIF-1 contienen cambios amino ácido (substituciones, eliminaciones e inserciones) en una o más de las regiones anteriores, pero no contienen cambios en una o más otras regiones. Los polinucleótidos que codifican estos polipéptidos también están abarcados por la invención. Otros fragmentos polipéptido preferidos son fragmentos MPIF-1 biológicamente activos. Fragmentos biológicamente activos sin aquellos que exhiben actividad similar, pero no necesariamente idéntica, a una actividad del polipéptido MPIF-1. La actividad biológica a los fragmentos puede incluir una actividad deseada mejorada o una actividad no deseable disminuida. Polinucleótidos codifican estos fragmentos polipéptidos también están embarcados por la invención. Sin embargo, muchas secuencias polinucleótido, tales como secuencias EST, están publicamente disponibles y accessibles a través de base de datos de secuencia. Algunas de estas secuencias se relacionan a ID de SEC NO. : 1 o 6, y puede haber pago públicamente disponible antes de concepción de la presente invención. De preferencia, estos polinucleótidos relacionados se excluyen específicamente del alcance de la presente invención. Hacer una lista de cada secuencia relacionada puede ser problemático. De acuerdo con esto, de preferencia se excluye de la presente invención uno o más polinucleótidos que comprenden, o alternativamente consisten de, una secuencia de nucleótido descrita por la fórmula general de a-b, en donde a es cualquier entero entre 1 a 349 de ID de SEC NO . : 1, b es un entero de 15 a 363, en donde tanto a como b corresponden a las posiciones de residuos nucleótidos ilustradas en ID de SEC NO. : 1, en donde b es mayor .que o igual a + 14. Eliminaciones Amino- terminal y carboxi - terminal de la variante de lisado MPIF-1 de amino ácido 137 : Como se indicó anteriormente, la presente invención además proporciona una variante de lisado de MPIF-1 humano. La secuencia ADNc y la secuencia de amino ácido 137 se ilustran en la Figura 20A (ID de SEC NO. : 6 y 7, respectivamente) . Utilizando sistemas de expresión eucariótica, los presentes inventores han descubierto tres mutantes de eliminación N-terminal de esta variante lisada de MPIF-1. Estas incluyen His (60) - Asn (137) ; Met (46) - Asn (137); y Pro (54) - Asn (137). De esta manera en un aspecto adicional, mutantes de eliminación N-terminal variante de lisado de MPIF-1, se proporcionan por la presente invención. - Estos mutantes incluyen aquellos que comprenden o en forma alterna consisten de una secuencia de amino ácido mostrada en la Figura 20A (ID de SEC NO. : 7) que tiene una eliminación de al menos los primeros 45 residuos amino ácido N-terminal pero no más que los primeros 59 residuos amino ácido N-terminal de la Figura 20A (ID de SEC NO . : 7) . En forma alterna, la eliminación incluirá al menos los primeros 45 residuos amino ácido N-terminal, pero no más que los primeros 53 residuos amino ácido N-terminal de la Figura 20A (ID de SEC NO. : 7) . Adicionales eliminaciones N-terminal del polipéptido variante de lisado de amino ácido 137 de la invención mostrado como ID de SEC NO. : 7. incluye los polipéptidos que comprenden, o en forma alterna consisten de la secuencia de amino ácido de los residuos: K-2 a N-137; V-3 a N-137; S-4 a N-137; V-5 a N-137; A-6 a N-137; A-7 a N-137; L-8 a N-137; S-9 a N-137; C-10 a N-137; L-ll a N-137; M-12 a N-137; L-13 a N-137; V-14 a N- 37; T-15 a N.-137; A-16 a N-137; L-17 a N-137; G-18 a N-137; S-19 a N-137; Q-20 a N-137; A-21 a N-137; R-22 a N-137; V-23 a N-137; T-24 a N-137; K-25 a N-137; D-26 a N-137; A-27 a N-137; E-28 a N-137; T-29 a N-137; E-30 a N-137; F-31 a N-137; M-32 a N-137; M-33 a N-137; S-34 a N-137; K-35 a N-137; L-36 a N-137; P-37 a N-137; L-38 a N-137; E-39 a N-137; N-40 a N-137; P-41 a N-137; V-42 a N-137; L-43 a N-137; L-44 a N-137; D-45 a N-137; M-46 a N-137; L-47 a N-137; W-48 a N-137; R-49 a N-137; R-50 a N-137; K-51 a N-137; 1-52 a N-137; G-53 a N-137; P-54 a N-137; Q-55 a N-137; M-56 a N-137; T-57 a N-137; L-58 a N-137; S-59 a N-137; H-60 a N-137; A-61 a N-137; A-62 a N-137; G-63 a N-137; F-64 a N-137; H-65 a N-137; A-66 a N-137; T-67 a N-137; S-68 a N-137; A-69 a N-137; D-70 a N-137; C-71 a N-137; C-72 a N-137; 1-73 a N-137; S-74 a N-137; Y-75 a N-137; T-76 a N-137; P-77 a N-137; R-7,8 a N-137; S-79 a N-137; 1-80 a N-137; P-81 a N-137; C-82 a N-137; S-83 a N-137; L-84 a N-137; L-B5 a N-137; E-86 a N-137; S-87 a N-137; Y-88 a N-137; F-89 a N-137; E-90 a N-137; T-91 a N-137; N-92 a N-137; S-93 a N-137; E-94 a N-137; C-95 a N-137; S-96 a N-137; K-97 a N-137; P-98 a N-137; G-99 a N-137; V-100 a N-137; 1-101 a N-137; F-102 a N-137; L-103 a N-137; T-104 a N-137; K-105- a N-137; K-106 a N-137; G-107 a N-137; .R-108 a N-137; R-109 a N-137; F-110 a N-137; C-lll a N-137; A-112 a N-137; N-113 a N-137; P-114 a N-137; S-115 a N-137; D-116 a N-137; K-117 a N-137; Q-118 a N-137; V-119 a N-137; Q-120 a N-137; V-121 a N-137; C-122 a N-137; M-123 a N-137; R-124 a N-137; M-125 a N-137; L-126 a N-137; K-127 a N-137; L-128 a N-137; D-129 a N-137; T-130 a N-137; R-131 a N-137; o 1-132 a N-137 de ID de SEC NO. : 7.

Igualmente, la eliminación C-terminal del polipéptido variante de lisado de amino ácido 137 de la invención mostrado como ID de SEC NO . : 7 incluye polipéptidos que comprenden la secuencia de amino ácido de residuos: M-l a K-136; M-l a R-135; M-l a T-134; M-l a K-133; M-l a 1-132; M-l a R-131 M-l a T-130; M-l a D-129; M-l a L-128; M-l a K-127 M-l a L-126; M-l a M-125; M-l a R-124; M-l a M-123 M-l a C-122; M-l a V-121; M-l a Q-120; M-l a V-119 M-l a Q-118; M-l a K-117; M-l a D-116; M-l a S-115 M-l a P-114; M-l a N-113; M-l a A-112; M-l a C-lll M-l a F-110; M-l a R-109; M-l a R-108; M-l a G-107 M-l a K-106; M-l a K-105; M-l a T-104; M-l a L-103 M-l a F-102; M-l a 1-101; M-l a V-100; M-l a G-99; M-l a P-98; M-l a K-97; M-l a S-96; M-l a C-95; M-l a E-94; M-l a S-93; M-l a N-92; M-l a T-91; M-l a E-90; M-l a F-89; M-l a Y-88; M-l a S-87; M-l a E-86; M-l a L-85; M-l a L-84; M-l a S-83; M-l a C-82; M-l a P-81; M-l a 1-80; M-l a S-79; M-l a R-78; M-l a P-77; M-l a T-76; M-l a Y-75; M-l a S-74; M-l a 1-73; M-l a C-72; M-l a C-71;.M-1 a D-70; M-l a A-69; M-l a S-68; M-l a T-67; M-l a A-66; M-l a H-65; M-l a F-64; M-l a G-63; M-l a A-62; M-l a A-61; M-l a H-60; M-l a S-59; M-l a L-58; M-l a T-57; M-l a M-56; M-l a Q-55; M-l a P-54; M-l a G-53; M-l a 1-52; M-l a K-51; M-l a R-50; M-l a R-49; M-l a W-48; M-l a L-47; M-l a M-46; M-l a D-45; M-l a L-44; M-l a L-43; M-l a V-42; M-l a P-41; M-l a N-40; M-l a E-39; M-l a L-38; M-l a P-37; M-l a L-36; M-l a K-35; M-l a S-34; M-l a M-33; M-l a M-32; M-l a F-31; M-l a E-30; M-l a T-29; M-l a E-28; M-l a A-27; M-l a D-26; M-l a K-25; M-l a T-24; M-l a V-23; M-l a R-22; M-l a A-21; M-l a Q-20; M-l a S-19; M-l a G-18; M-l a L-17; M-l a A-16; M-l a T-15; M-l a V-14; M-l a L-13; M-l a M-12; M-l a L-ll; M-l a C-10; M-l a S-9; M-l a L-8; o M-l a A- 7 de ID de SEC NO. : 7. Los polipéptidos de la presente invención de preferencia se proporcionan en una forma aislada y de preferencia están substancialmente purificados. Una versión producida de manera recombinante del polipéptido MPIF- 1 puede purificarse substancialmente por el método de una etapa descrito por Smith y Johnson, Gene 67:31-40 (1988) . Los polipéptidos de la presente invención incluyen el polipéptido codificado por el ADNc depositado incluyendo el líder ( es decir, la proteína de longitud completa) , el polipéptido codificado por el ADNc depositado menos el líder (es decir, la proteína madura), el polipéptido de la Figura 1 (ID de SEC NO. : 2) incluyendo el líder, el polipéptido de la Figura 1 (ID de SEC NO. : 2) incluyendo el líder, pero menos el residuo metionina N-terminal, el polipéptido de la Figura 1 (ID de SEC NO. : 2) menos el líder, así como polipéptidos que tienen al menos 80%, 85%, 90%, 92%, o 95% de similaridad, y aún más preferible cuando menos 96%, 97%, 98% o 99% de similaridad a aquellos descritos anteriormente. Adicionales polipéptidos de la presente -# invención incluyen polipéptidos al menos 80%, 85%, 90% o 95% idénticos, aún más preferible al menos 96%, 97%, 98% or 99% idénticos al polipéptido codificado por el ADNc depositado, al polipéptido de la Figura 1 (ID de SEC NO. : 2) y también incluyen porciones de estos polipéptidos con al menos 30 amino ácidos y más preferiblemente al menos 50 amino ácidos. Por "% de similaridad" para dos polipéptidos se pretende una calificación de similaridad producida al comparar las secuencias amino ácido de los dos polipéptidos utilizando el programa Bestfit (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wl 53711) y los ajustes predefinidos para determinar similaridad. Bestfit utiliza ,el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (Advances in Applied Mathema tics 2:482-489, 1981) para encontrar el mejor segmento de similaridad entre dos secuencias.

Por un polipéptido que tiene una secuencia de amino ácido al menos 95% "idéntica" a una secuencia amino ácido de -referencia de un polipéptido MPIF-1, se pretende que la secuencia de amino ácido del polipéptido sea idéntica a la secuencia de referencia excepto porque la secuencia de polipéptido puede incluir hasta 5 alteraciones amino ácido por cada 100 amino ácidos de la secuencia de amino ácido de referencia de un polipéptido MPIF-1. En otras palabras, para obtener un polipéptido que tiene una secuencia amino ácido de al menos 95% idéntica a una secuencia de amino ácido de referencia, hasta 5% de los residuos amino ácidos en la secuencia de referencia pueden eliminarse lo suficiente con otro amino ácido, o una cantidad de amino ácidos hasta 5% del total de residuos amino ácido en la secuencia de referencia pueden insertarse en la secuencia de - referencia . Estas alteraciones de la secuencia de referencia pueden ocurrir en las posiciones amino o carboxi terminal de la secuencia de amino ácidos de referencia o cualquiera entre esas posiciones terminales, intercaladas ya sea individualmente entre residuos" en la secuencia de referencia o en uno o más grupos continuos dentro de la secuencia de referencia. Como cuestión práctica cualquier pslipéptido particular es al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntico a, por ejemplo la secuencia amino ácido mostrada en la Figure 1 (ID de SEC NO. : 2) o la secuencia amino ácido ADNc depositado, puede determinarse convencionalmente utilizando los programas de computadora conocidos tales como el programa Bestfit (Wisconsin Sequence .Analysis Package, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, Uníversity Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wl 53711. Cuando se utiliza Bestfit o cualquier otro programa de alineamiento de secuencia, para determinar si una secuencia particular por ejemplo es 95% idéntica a una secuencia de referencia de acuerdo con la presente invención, los parámetros se establecen por supuesto de manera tal que el por ciento de identidad se calcula sobre toda la longitud de la secuencia de amino ácido de referencia y que se permiten e'spacios en homología de hasta 5% del número total de residuos de amino ácido en la secuencia de referencia. El polipéptido de la presente invención puede utilizarse como un marcador de peso molecular en geles SDS-PAGE o en columnas de filtración en gel de tamiz molecular, utilizando métodos bien conocidos por aquellos con destreza en la especialidad. Como se describe en detalle a continuación, los polipéptidos de la presente invención también pueden utilizarse para desarrollar anticuerpos policlonales y monoclonales, qµe son útiles para ensayos para detectar la expresión de proteína MPIF-1 como se describe a continuación o agonistas y antagonistas capaces de mejorar o eludir función de proteína MPIF--1. Además, estos polipéptidos pueden utilizarse en el sistema de dos híbridos de levadura para "capturar" proteínas de enlace de proteína MPIF-1, que también - son - agonista y antagonista candidato de acuerdo con la presente • invención. El sistema de dos 'híbridos de levadura se 10 describe por Fields y Song, Na ture 340:245-246 (1989) . Polipéptidos que contienen epítope MPIF-1 En otro aspecto la invención proporciona ' un péptido o polipéptido que comprende -- o en forma alterna, consiste de -- una porción que contiene epítope de un polipéptido 15 de la invención. El epítope de la porción polipéptido es un epítope inmunogenico o antigénico de un polipéptido de la invención. Un "epítope inmunogénico" se define como parte de una proteína que produce una respuesta de anticuerpo cuando toda la proteína es el inmunógeno. 20 Estos epítopes inmunogénicos se consideran confinados en • unos cuantos sitios de la molécula. Por otra parte, una región de una molécula de proteína en la cual un anticuerpo puede ligar que se define como un "Epítope antigenico" . El número de epítope inmunogénico de una 25 proteína en general es menos que el número de epítopes antigénicos. Ver por ejemplo Geysen y colaboradores, Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 81:3998-4002 (1983). Fragmentos que funcionan como epítope pueden ser producidos por cualesquiera medios convencionales. (Ver por ejemplo, Houghten, R. A . , Proc . Na ti . Acad . Sci .

USA 82:5131-5135 (1985) descrito adicionalmente en la Patente de los E.U.A. No. 4,631,211). En cuanto a la selección de péptidos o polipéptidos que contienen un epítope antigénico (es decir, que contiene una región de una molécula de proteína a la cual puede ligarse un anticuerpo) , es bien conocido en la técnica que péptidos sintéticos relativamente cortos que imitan parte de una secuencia de proteína, rutinariamente son capaces de producir un antisuero que reacciona con lá proteína parcialmente imitada. Ver por ejemplo, Sutcliffe, J. G. , Shinnick, T.

M., Green, N. y Learner, R.A. , Science 219:660-666 (1983) . Péptidos capaces de producir sueros reactivos de proteína, frecuentemente se representan en la secuencia primaria de una proteína, pueden caracterizarse por un conjunto de reglas químicas simples, y están confinados ni a regiones inmunodominantes de proteínas intactas (es decir epítopes inmunogénicos) ni a las terminales amino o carboxilo. Péptidos q u e s o n extremadamente hidrofóbicos y aquellos de seis o menos residuos, generalmente son ineficaces para inducir anticuerpos que ligan a la proteína imitada. Péptidos más largos, especialmente aquellos que contienen residuos prolina usualmente son efectivos. Sutcliffe y colaboradores, supra , en 661. Por ejemplo, 18 de 20 péptidos diseñados de acuerdo con estas guías, contienen 8 a 39 residuos que cubren 75% de la secuencia de la cadena polipéptido HAl hemaglutinina de virus influenza, inducen anticuerpos que reaccionan con la proteína HAl o virus intacto, y 12/12 péptidos de MuLV polimerasa y 18/18 de la glicoproteína de rabia inducen anticuerpos que precipitan las proteínas respectivas. Péptidos y polipéptidos que contienen epítope antigénico de la invención por lo tanto son útiles para desarrollar anticuerpos, incluyendo anticuerpos monoclonales, que ligan específicamente a, un polipéptido de la invención. De esta manera, una alta proporción de hibridomas obtenidos por fusión de células de bazo de donadores inmunizados con un péptido que contiene epítope antígeno, generalmente secretan anticuerpo reactivo con la proteína nativa. Sutcliffe y colaboradores, arriba , en 663. Los anticuerpos desarrollados por péptidos o polipéptidos que contienen epítope antigénico, son útiles para detectar la proteína indicada, y anticuerpos a diferentes péptidos, pueden ser utilizados para dar seguimiento al destino de diversas regiones de un precursor de proteína que somete a proceso post-traducción. Los anticuerpos de antipéptido y péptidos pueden utilizarse en una variedad de ensayos cualitativos o cuantitativos para la proteína imitada, por ejemplo en ensayos de competencia, ya que se ha mostrado que incluso cortos péptidos (por ejemplo aproximadamente de 9 amino ácidos) pueden ligar y desplazar los péptidos más grandes en ensayos de inmunoprecipitación. Ver por ejemplo Wilson y colaboradores, Cell 37:767-7718 (1984) en 777.

Los anticuerpos antipéptido de la invención también son útiles para purificación de la proteína imitada, por ejemplo por cromatografía de adsorción utilizando métodos bien conocidos en la especialidad. Péptidos y polipéptidos que contienen epítope antigénico de la invención diseñados de acuerdo con las guías anteriores de preferencia contienen una secuencia de al menos siete, más preferiblemente al menos nueve y en particular entre aproximadamente 15 a aproximadamente 30 amino ácidos contenidos dentro de la secuencia de amino ácidos de un polipéptido de la invención. Sin embargo, péptidos o polipéptidos que comprenden, o alternativamente consisten de, una gran proporción de una secuencia de amino ácidos de un polipéptido de la invención, contienen 30 a aproximadamente 50 amino ácidos, o cualquier longitud hasta e incluyendo toda la secuencia de amino ácidos de un polipéptido de la invención, también se consideran péptidos o polipéptidos que contienen epítope de la invención, y también son útiles para inducir anticuerpos que reaccionan con la proteína imitada. De preferencia, la secuencia de amino ácidos del péptido que contiene epítope, se elige parta proporcionar solubilidad substancial en solventes acuosos (es decir la secuencia incluye residuos relativamente hidrofílicos y secuencias altamente hidrofóbicas de preferencia se indican) ; y secuencias que contienen residuos prolina son particularmente preferidas. En la presente invención, epítopes antigénicos de preferencia contienen una secuencia de' al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, más preferible al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 15, al menos 20, al menos 25, y de preferencia entre aproximadamente 15 y aproximadamente 30 amino ácidos. Polipéptidos preferidos comprenden, o en forma alterna consisten de, epítopes inmunogénicos o antigénicos, son de al menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, o 100 residuos amino ácidos de longitud.

Ejemplos no limitantes de polipéptidos o péptidos antigénicos que pueden utilizarse para asegurar anticuerpos específicos del MPIF-1, incluyen: un polipéptido que comprende, o en forma alterna consiste de, residuos ammo acido de aproximadamente 21 a aproximadamente 30 en ID de SEC NO.: 2; un polipéptido que comprende, o en forma alterna consiste de, residuos amino ácido de aproximadamente 31 a aproximadamente 44 en ID de SEC NO.: 2; un polipéptido que comprende residuos amino ácido de aproximadamente 49 a aproximadamente 55 en ID de SEC NO.: 2; un polipéptido que comprende residuos amíno ácido de aproximadamente 59 a aproximadamente 67 en ID de SEC NO.: 2; un polipéptido que comprende residuos amino ácido de aproximadamente 72 a aproximadamente 83 en ID de SEC NO.: 2; un polipéptido que comprende residuos amino ácido de aproximadamente 86 a aproximadamente 103 en ID de SEC NO. : 2; un polipéptido que comprende residuos amino ácido de aproximadamente 110 a aproximadamente 120 en ID de SEC NO.: 2. ' Como se indicó anteriormente, los inventores han determinado que los fragmentos polipéptido anteriores son regiones antigénicas de la proteína MPIF-1. Polipéptidos o péptidos antigénicos adicionales que pueden emplearse para generar anticuerpos específicos MPIF-1 incluyen eliminación N- y C-terminales anteriormente descritas. La invención también proporciona fragmentos de epítope de la variante de lisado de ami?o ácido 137 de MPIF-1 (ID de SEC NO . : 7) . Más particularmente, la invención proporciona polinucleótidos que tienen la secuencia de amino ácidos de los residuos: M-l a T-15; K-2 a A-16; V-3 a L-17; S-4 a G-18; V-5 a S-19; A-6 a Q-20; A-7 a A-21; L-8 a R-22; S-9 a V-23; C-10 a T-24; L-l a K-25; M-12 a D-26; L-13 á A- 21 ; V-14 a E-28; T-15 a T-29; A-16 a E-30; L-17 a F-31; G-18 a M-32; S-19 a M-33; Q-20 a S-34; A-21 a K-35; R-22 a L-36; V-23 a P-37; T-24 a L-38; K-25 a E-39; D-26 a N-40; A-27 a P-41; E-28 a V-42; T-29 a L-43; E-30 a L-44; F-31 a D-45; M-32 a M-46; M-33 a L-47; S-34 a W-48; K-35 a R-49; L-36 a R-50; P-37 a K-51; L-38 a 1-52; E-39 a G-53; N-40 a P-54; P-41 a Q-55; V-42 a M-56; L-43 a T-57; L-44 a L-58; D-45 a S-59; M-46 a H-60; L-47 a A-61; W-48 a A-62; R-49 a G-63; R-50 a F-64; K-51 a H-65; 1-52 a A-66; G-53 a T-67; P-54 a S-68; Q-55 a A-69; M-56 a D-70; T-57 a C-71; L-58 a C-72; S-59 a 1-73; H-60 a S-74; A-61 a Y-75; A-62 a T-76; G-63 a P-77; F-64 a R-78; H-65 a S-79; A-66 a 1-80; T-67 a P-81; S-68 a C-82; A-69 a S-83; D-70 a L-84; C-71 a L-85; C-72 a E-86; 1-73 a S-87; S-74 a Y-88; Y-75 a F-89; T-76 a E-90; P-77 a T-91; R-78 a N-92; S-79 a S-93; 1-80 a E-94; P-81 a C-95; C-82 a S-96; S-83 a K-97; L-84 a P-98; L-85 a G-99; E-86 a V-100; S-87 a 1-101; Y-88 a F-102; F-89 a L-103; E-90 a T-104; T-91 a K-105; N-92 a K-106; S-93 a G-107; E-94 a R-108; C-95 a R-109; S-96 a F-110; K-97 a C-lll; P-98 a A-112; G-99 a N-113; V-100 a P-114; 1-101 a S-115; F-102 a D-116; L-103 a K-117; T-104 a Q-118; K-105 a V-119; K-106 a Q-120; 'G-107 a V-121; R-108 a C-122; R-109 a M-123; F-110 a R-124; C-lll a M-125; A-112 a L-126; N-113 a K-127; P-114- a L-128; S-115 a D-129; D-116 a T-130; K-117 a R-131; Q-118 a 1-132; V-119 a K-133; Q-120 a T-134; V-121 a R-135; C-122 a K-136; or M-123 a N-137 de ID de SEC NO.: 7. Los péptidos y polipéptidos que contienen epítope de la invención pueden ser producidos por cualesquiera medios convencionales para la elaboración de péptidos o polipéptidos, incluyendo medios recombinantes que utilizan moléculas de ácido nucleico de la invención. Por ejemplo, una secuencia de amino ácidos que contiene epítope corto puede fusionarse a un polipéptido más grande que actúa como un portador durante producción y purificación recombinante, así como durante inmunización para producir anticuerpos anti -péptidos . Péptidos que contienen epítope también pueden sintetizarse utilizando métodos conocidos de síntesis química. Por ejemplo, Houghten ha descrito un método simple para síntesis de grandes cantidades de péptidos, tales como 10-20 mg de 248 diferentes péptidos de 13 residuos que representan variantes de amino ácido simples de un segmento del polipéptido HAl que se prepararon y caracterizaron (por estudios de enlace tipo ELISA) en menos de cuatro semanas. Houghten, R. A. (1985) "General method for the rapid solid-phase synthesis of large numbers of peptides: specificity of antigen-antibody interaction at the level of individual amino acids" (Método general para la síntesis en fase sólida rápida de grandes cantidades de péptidos: especificidad de reacción antígeno-anticuerpo al nivel de amino ácidos individuales) . Proc . Na ti . Acad.

Sci . USA 82:5131-5135. Este proceso de síntesis de múltiples péptidos simultánea (SMPS = Simultaneous Múltiple Peptide Synthesis) se describe adicionalmente en la Patente de los E.U.A. No. 4,631,211 otorgada a Houghten y colaboradores . (1986). En este procedimiento, las resinas individuales para la síntesis en fase sólida de diversos péptidos están comprimidas en paquetes permeables a solventes separados, permitiendo el uso óptimo de muchas etapas repetitivas idénticas involucradas en los métodos de fase sólida. Un procedimiento completamente manual permite 500-1000 o más síntesis se realicen simultáneamente. Houghten y colaboradores, arriba , en 5134. Fragmentos de ácido nucleico preferidos de la presente invención incluyen moléculas de ácido nucleico que codifican porciones que contienen epítope de la proteína MPIF-1. En particular, estos fragmentos del ácido nucleico del MPIF-1 un polipéptido que comprende o en forma alterna consiste de, _ residuos amino ácido aproximadamente 21 a aproximadamente 30 en ID de SEC NO.: 2; un polipéptido que comprende residuos amino ácido aproximadamente 31 a aproximadamente 44 en ID de SEC NO.: 2; un polipéptido que comprende residuos amino ácido aproximadamente 49 a aproximadamente 45 en ID de SEC NO. : 2 un polipéptido que comprende residuos amino ácido aproximadamente 59 a aproximadamente 67 en ID de SEC NO.: 2; un polipéptido que comprende residuos amino ácido aproximadamente 32 a aproximadamente 53 en ID de SEC NO.: 2; un polipéptido que comprende residuos amino ácido aproximadamente 86 a aproximadamente 103 en ID de SEC NO.: 2; un polipéptido que comprende residuos amino ácido aproximadamente 110 a aproximadamente 120 en ID de SEC NO.: 2, o cualquier rango o valor ahí. Los inventores han determinado que los fragmentos polipéptido anteriores son regiones antigénicas de la proteína MPIF-1. Métodos para determinar otras de estas porciones que contienen epítope de la proteína MPIF-1 se describen en detalle a continuación. Polipéptidos que contienen epítope de la presente invención pueden utilizarse para inducir anticuerpos de acuerdo con métodos bien conocidos en la especialidad, incluyendo pero no limitados a, inmunización, in vivo, inmunización in vi tro, y métodos de exhibición fago. Ver, por ejemplo, Sutcliffe y colaboradores , arriba; Wilson y colaboradores , arriba, y Bittle y colaboradores, J. Gen . Virol . 66:23472354 (1985) . Si se utiliza inmunización in vivo, pueden inmunizarse animales con el polipéptido libre; sin embargo, puede reforzarse título de anticuerpo antipéptido al acoplar el . péptido a un portador macromolecular, tal como hemocianina de erizo de mar (KLH = keyhole limpet hemacianine) o toxoide de tétano. Por ejemplo, péptidos que contienen esta cisteína pueden acoplarse a un portador utilizando un enlazador tal como él m-maleimidobenzoil-N-hidroxis'uccinimida éster (MBS) , mientras que otros péptidos pueden acoplarse a portador utilizando un agente de enlace más general tal como glutaraldehído. Animales tales como conejos, ratas y ratones se inmunizan ya sea con los péptidos libres -o acoplados con portador, por ejemplo por inyección intraperitoneal y/o intradérmica de emulsiones que contienen aproximadamente 100 g de proteína de portador o péptido, y adyuvante de Freund. Varías inyecciones de refuerzo pueden ser requeridas, por ejemplo a intervalos de aproximadamente 2 semanas, para proporcionar un título útil de anticuerpo anti-péptido, que puede ser respetado por ejemplo por ensayo ELISA utilizando péptido libre adsorbido a una superficie sólida. el título de anticuerpos anti-péptido de un animal inmunizado puede incrementarse por selección de anticuerpos anti-péptido, por ejemplo por adsorción al péptido en un soporte sólido y elución de los anticuerpos selectos de acuerdo con métodos bien conocidos en la especialidad. Péptidos que contienen' epítope inmunogénico de la invención, es decir, aquellas partes de una proteína que producen una respuesta de anticuerpo cuando toda la proteína es un inmunogeno, se identifican de acuerdo con métodos conocidos en la especialidad. Por ejemplo, Geysen y colaboradores , arriba, describe un procedimiento para la síntesis concurrente rápida en soportes sólidos de cientos de péptidos con pureza suficiente para reaccionar en un ensayo inmunosorbente enlazado por enzima. Interacción de los péptidos sintesizados con anticuerpos luego se detecta fácilmente sin retirarlos del soporte. De esta manera, un péptido que contiene un epítope inmunogénico de una proteína deseada, puede notificarse rutinariamente por una persona con destreza ordinaria en la especialidad. 'Por ejemplo, el epítope inmunológicamente importante en la proteína de revestimiento de virus de enfermedad de fiebre aftosa, se localizó por Geysen y colaboradores, con una resolución de siete amino ácidos por síntesis de un juego superpuesto de todos los 208 hexapéptidós posibles que cubren toda la secuencia de 213 amino ácidos de la proteína. Luego, un juego de reemplazo completo de péptidos en donde todos los 20 amino ácidos se substituyeron a su vez en cada posición dentro del epítope se sintetizaron, y los amino ácidos particulares que confieren especificidad para la reacción con anticuerpo, se determinaron. De esta manera, análogos péptido de los péptidos que contienen epítope de la invención pueden elaborarse rutinariamente por este método. La Patente de los E.U.A. No. 4,708,781 otorgada Geysen (1987) , además describe este método para identificar un péptido que contiene un epítope inmunogénico de- una proteína deseada. Aún más, la Patente de los E.U.A. No 5,194,392 de Geysen (1990) describe un método general para detectar o determinar la secuencia de monómeros (amino ácidos u otros compuestos) que es un equivalente topológico del epítope ( es decir, un "mimotope") que es complementario a un paratope particular (sitio de enlace antígeno) de un anticuerpo de interés. Más generalmente, la Patente de los E.U.A. No. 4,433,092 de Geysen (1989) describe un método para detectar o determinar una secuencia de monómeros que es un equivalente topográfico de un ligando que es complementario al sitio de enlace de ligando de un receptor particular de interés. Similarmente, la Patente de los E.U.A. No. 5,480,971 de Houghten, R. A. y colaboradores, (1996) de mezclas oligopéptidos peralquiladas, describen oligopéptidos peralquilados con 1 a 7 átomos de carbono lineales y juegos y bibliotecas de estos péptidos, así como métodos para utilizar estos juegos de oligopéptidos y bibliotecas para determinar la secuencia de un oligopéptido peralquilado que de preferencia se liga a una molécula aceptora de interés. De esta manera, análogos no péptidos de los péptidos que contienen epítope de la invención también pueden elaborarse rutinariamente por estos métodos. Toda la descripción de cada documento citado en esta sección en "Polipéptidos y Péptidos" aquí se incorpora por referencia.

Como apreciará una persona con destreza en la especialidad, polipéptidos MPIF-1 de la presente invención y sus fragmentos que contienen epítope descritos anteriormente pueden combinarse con partes del dominio constante de inmunoglobulinas (IgG), que resulta en polipéptidos quiméricos. Estas proteínas de fusión facilitan la purificación y muestran una vida media incrementada in vivo . Esto se ha mostrado, por ejemplo para proteínas quiméricas que consisten de los primeros dos dominios del CD4 -polipéptido humano y diversos dominios de regiones constantes de las cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulinas de mamíferos (EPA 394,827; Traunecker y colaboradores, Na ture 331:84-86 (1988)).

Proteínas de fusión que tienen estructura dimérica enlazada disulfuro, debido a la parte IgG también puede ser más eficiente para ligar y neutralizar otras moléculas que la proteína o fragmento de proteína MPIF-1 monómerica MPIF-1 sola (Fountoulakis y colaboradores , J Biochem 270:3958-3964 (1995)) . Como apreciará una persona con destreza en la especialidad y discutido anteriormente, los polipéptidos de la presente invención que comprenden, o en forma alterna consisten de, un epítope inmunogénico o antigénico, pueden fusionarse a secuencias de polipéptido heterólogas. Por ejemplo, los polipéptidos de la presente invención pueden fusionarse con el dominio constante de inmunoglobulina (IgA, IgE, IgG, IgM) , o sus porciones (CH^ CH2, CHj, cualquier combinación de los mismos incluyendo ambos dominios completos y sus porciones) que resultan en polipéptidos diméricos. Estas proteínas de fusión facilitan la purificación, y muestran una vida media incrementada in vivo . Esto ha sido mostrado, por ejemplo para proteínas quiméricas, que consisten de los primeros dos dominios de CD4 polipéptido humano y diversos dominios de las regiones constantes de las cadenas pesada o ligera de inmunoglobulinas de mamíferos. Ver por ejemplo, EPA 0,394,827; Traunecker y colaboradores, Nature 331:8486 (1988). Proteínas de fusión que tienen una estructura dimérica enlazada con disulfúro debido a la porción IgG, también puede ser más eficientes para unir y neutralizar otras moléculas que los polipéptidos monoméricos o sus fragmentos solos. Ver por ejemplo Fountoulakis y colaboradores , J. Biochem. 270:39583964 (1995). Ácidos nucleicos que codifican los epítopes anteriores, también pueden recombinarse con un gen de interés como una etiqueta de epítope para ayudar en detección y purificación del polipéptido expresado.

Proteínas de fusión adicionales de la invención pueden generarse a través de las técnicas de entremezclado de genes, entremezclado de motivo, entremezclado de exon, y/o entremezclado de codón (colectivamente referidos como "entremezclado de ADN") . entremezclado de ADN puede emplearse para modular las actividades de polipéptidos que corresponden a ID de SEC NO.: 2, de esta manera generando efectivamente agonistas y antagonistas de los polipéptidos. Ver en general las Patentes de los E.U.A. Nos. 5,605,793, 5,811,238, 5,830,721, 5,834,252, y 5,837,458, y Patten, P.A., y colaboradores . , Curr. Opinión Biotechnol . 8:724-33 (1997); Harayama, S., Trends . Biotechnol . 16(2):76-82 (1998); Hansson, L.O., y colaboradores, J. Mol . Biol . 287:265-76 (1999); y Lorenzo, M. M. y Blasco, R., Biotechniques 24(2):308-13 (1998) (cada, una de estas patentes y publicaciones aquí se incorpora por referencia) . En una modalidad, alteración de polinucíeótidos correspondientes a ID de SEC NO. : 1 o 6 y correspondientes polipéptidos puede lograrse por entre mezclado de .ADN. El entremezclado de ADN involucra el ensamblado de dos o más segmentos ADN en una molécula mezclada correspondiente a ID de SEC NO. : 1 o 6 polinucleótidos de la invención por recombinación homologa, o específica del sitio. En otra modalidad, polinucleótidos correspondientes a ID de SEC NO.: 1 o 6 y correspondientes polipéptidos pueden alterarse al someterse a mutagénesis aleatoria por PCR tendiente a error, inserción de nucleótido aleatoria u otros métodos antes de recombinación. En otra modalidad, uno o más 'componentes, motivos, secciones, partes, dominios, fragmentos, etc. del polinucleótido de codificación correspondiente a ID de SEC NO.: 1 o 6, o el polipéptido de esta manera codificado, pueden recombinarse con uno o más componentes, motivos, secciones, partes, dominios, fragmentos, etc., de una o más moléculas heterologas . Purificación y Aislamiento de Polipéptidos .

MPIF-1 se recupera y purifica a partir de cultivos de células recombinantes por métodos que incluyen precipitación de etanol o sulfato de amonio, extracción de ácido, cromatografía de intercambio de aniones o cationes, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de hidroxilapatita, cromatografía de. afinidad y cromatografía de lectina. Pueden emplearse etapas de redoblado de proteína, según sea necesario, para completar la configuración de la proteína madura. Finalmente, puede emplearse cromatografía de líquido de alto desempeño (HPLC) para etapas de purificación finales.

Los polipéptidos de la presente invención pueden ser un producto naturalmente" purificado, o un producto de procedimientos sintéticos químicos, o producirse por técnicas recombinantes a partir de un huésped procariótico o eucariótico (Por ejemplo, por células bacterianas, de levadura, de plantas superiores, insectos y mamíferos en cultivo) . Dependiendo del huésped empleado en un procedimiento de producción recombinante, los polipéptidos de la presente invención pueden glicosilarse con carbohidratos de mamíferos u otros eucarióticos, o pueden no ser glicosilados. Polipéptidos de la invención también pueden incluir un residuo amino ácido metionina inicial. Además, polipéptidos de la invención pueden sintetizarse químicamente utilizando técnicas conocidas en la especialidad (por ejemplo ver Creighton, 1983, Proteins : Structures and Molecular Principies, (Proteínas: Estructuras y Principios Moleculares) W.H. Freeman & Co . , N.Y., y Hunkapiller y colaboradores . , Na ture 310:105-111 (1984)). Por ejemplo, un polipéptido correspondiente a un fragmento de un polipéptido MPIF-1 puede sintetizarse por uso de un sintetizador de péptido. Además, si se desea amino ácidos no clásicos o análogos amino ácidos químicos pueden introducirse como una substitución o adición en la secuencia de polipéptido MPIF-1. Amino ácidos no clásicos incluyen, pero no están limitados a, los isómeros D de los amino ácidos comunes, ácido 2 , 4 -diaminobutírico, ácido a-amino isobutírico, ácido 4 -aminobutírico, ácido 2-amino butírico, ácido gAbu, eAhx, ácido 6-amino hexanoico, Aib, ácido 2-amino isobutírico, ácido 3 -amino propionico, ornitina, norleucina, norvalina, hidroxiprolina, sarcosina, citrulina, homoc i t ul ina , ácido cisteico, t -but ilglicina , t -but ilalanina , feni Igl icina , ciclohexilalanina, b-alanina, fluoro-amino ácidos, amino ácidos de diseñador tales como b-metil amino ácidos, Ca-metil amino ácidos, Na-metil amino ácidos, y análogos de amino ácidos en general. Además, el amino ácido puede ser D (dextrorrotario) o L (levorrotario) . La invención abarca polipéptidos MPIF-1 que se modifican diferencialmente durante y después de traducción, por ejemplo por glicosilación, acetilación, fosforilación, amidación, derivatización por grupos de bloqueo/protección conocidos, escisión proteolítica, enlace a una molécula de anticuerpo, u otro ligando celular, etc. Cualquiera de numerosas modificaciones químicas puede llevarse a cabo por técnicas conocidas, incluyendo pero no limitado a, escisión química específica por bromuro de cianógeno, tripsina, quimotripsina, papaína, V8 proteasa, NaBH4 ; acetilación, formilación, oxidación, reducción; síntesis metabólica en la presencia de tunicamicina; etc. Modificaciones de post-traducción adicionales abarcadas por la invención incluyen por ejemplo cadenas carbohidrato N-enlazadas u O-enlazadas, procesamiento de extremos N-terminal o C-terminal) , conexión de porciones químicas a la estructura principal de amino ácido, modificaciones químicas de cadenas carbohidrato N-enlazadas u O-enlazadas, y adición o eliminación de un residuo metionina N-terminal como resultado de expresión de célula huésped procariótica. Los polipéptidos también pueden modificarse con una etiqueta detectable tal como una etiqueta enzimática fluorescente, isotópica, o de actividad para permitir detección y aislamiento de la proteína. También se proporcionan por la invención derivados químicamente modificados de los polipéptidos de la invención que pueden proporcionar ventajas adicionales como incrementada solubilidad, estabilidad, y tiempo de circulación del polipéptido, o disminuida inmunogenicidad (Ver Patente de los E.U.A. No. 4,179,337), las porciones químicas para derivatizar pueden seleccionarse de polímeros solubles en agua tales como polietilen glicol, copolimeros de etilen glicol/propilen glicol, carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol polivinilo y semejantes. Los polipéptidos pueden modificarse en posiciones aleatorias dentro de la molécula, o en posiciones predeterminadas dentro de la molécula y pueden incluir uno o dos o tres o más porciones químicas conectadas. El polímero puede ser de cualquier peso molecular, puede ser ramificado o no ramificado. Para polietilen glicol, el peso molecular preferido está entre aproximadamente 1 kDa y aproximadamente 100 kDa (el término "aproximadamente" indica que en preparaciones de polietilen glicol, algunas moléculas pesarán más, algunas menos que en el peso molecular establecido) para facilidad de manejo y fabricación. - Pueden emplearse otros tamaños, dependiendo del perfil terapéutico deseado (por ejemplo la duración de liberación sostenida deseada, los efectos, de haber, en la actividad biológica, la facilidad de manejo, el grado o carencia de antigenicidad y otros efectos conocidos del polietilen glicol a una proteína terapéutica o análogo) . Las moléculas de polietilen glicol (u otras porciones químicas) deberán agregarse a la proteína sin consideración a efectos de dominios funcionales o antigénicos de la proteína. Hay una cantidad de métodos de conexión disponibles para aquellos con destreza en la especialidad, por ejemplo EP 0 401 384, aquí incorporada por referencia (acoplamiento de PEG a GCSF),ver también Malik y colaboradores, Exp . Hematol . 20:10281035 (1992) (reporte de pegilación (modificación con polietilen glicol) de GMCSF utilizando cloruro de tresilo) . Por ejemplo, polietilen glicol puede ligarse covalentemente a través de residuos amino ácidos mediante un grupo reactivo, tal como un grupo amino o carboxilo libre. Grupos reactivos son aquellos en los cuales puede ligarse una molécula de polietilen glicol activada. Los residuos amino ácido que tienen un grupo amino libre pueden incluir residuos lisina y los residuos amino ácido N-terminal; aquellos que tiene un grupo carboxilo libre pueden incluir residuos de ácido aspártico, residuos de ácido glutámico y los residuos de amino ácido C-terminal. Grupos sulfhidrilo también pueden emplearse como un grupo reactivo para conectar las moléculas de polietilen glicol. Para propósitos terapéuticos se prefiere la conexión en un grupo amino, tal como la conexión en el extremo N o el grupo lisina. Específicamente se pueden desear proteínas químicamente modificadas en el extremo N. Utilizando polietilen glicol como una ilustración de la presente composición, se puede elegir de una variedad de moléculas de polietilen glicol (por peso molecular, ramificación, etc.), la proporción de moléculas de polietilen glicol a moléculas de proteína (polipéptido) en la mezcla de reacción, el tipo de reacción de pegilación a realizar, y el método para obtener la proteína N-terminalmente pegilada selecta. El método para obtener la preparación N-terminalmente pegilada ( es decir, separar esta porción de otras porciones monopegiladas, de ser necesario) puede ser por purificación del material N-terminalmente pegilado de una población de- moléculas de proteína pegiladas. Proteína selectiva típicamente modificadas en la modificación de extremo N pueden lograrse por alquilación reductiva que explota actividad diferencial de diferentes tipos de grupos amino primario (lisina contra N-terminal) disponibles para derivatización en una proteína particular. Bajo las condiciones de reacción apropiadas, una derivatización substancialmente selectiva de la proteína en el extremo N con un grupo carbonilo que contiene polímero se logra. Anticuerpos . Anticuerpos específicos de proteína MPIF-1 para utilizar en la presente invención, pueden desarrollarse contra la proteína MPIF-1 intacta o un fragmento polipéptido antigénico -de la misma, que puede presentarse junto con una proteína portadora, tal como albúmina, a un sistema animal (tal como conejo o ratón) o si es suficientemente largo (al menos aproximadamente 25 amino ácidos) , sin un portador. Como se emplea aquí, el término "anticuerpo" (Ab) o "anticuerpo monoclonal" (Mab) se entiende que incluye moléculas intactas así como fragmentos de anticuerpo (Tal como por ejemplo fragmentos Fab y F(ab') que son capaces de unir específicamente a la proteína MPIF-1. Los fragmentos Fab y F(ab')2 carecen del fragmento Fc de anticuerpo intacto, se liberan más rápidamente la circulación y pueden tener menos unión de tejido no específico de un anticuerpo intacto (Wahl y colaboradores, J. Nucí . Med. 24:316-325 (1983)). De esta manera se prefieren los fragmentos . Los polipéptidos, sus fragmentos u otros derivados, o sus análogos o células que no se expresan, pueden ser utilizados como un imunógeno para producir anticuerpos. Estos anticuerpos pueden por ejemplo ser anticuerpos policlonales o monoclonales. La presente invención también incluye anticuerpos quiméricos, de cadena sencilla o humanizados, así como fragmentos Fab, o el producto de una biblioteca de- expresión Fab. Diversos procedimientos conocidos en la especialidad pueden utilizarse para la producción de estos anticuerpos y fragmentos .

La presente invención también se dirige a fragmentos polipeptido que comprenden, o en forma alterna consisten de, un epítope de una secuencia de polipéptido mostrada en ID de SEC NO. : 2 o 7, o la secuencia de polipéptido codificada por ADNc contenido en un clon depositado. polinucleótidos codifican estos epítopes (tal como por ejemplo la secuencia descrita en ID de SEC NO. : 1 o 6) también están abarcados por la invención, como las secuencias de nucleotidos de la hebra complementaria de los polinucleótidos que 'codifican estos epítopes. Y polinucleótidos que hibridizan a la hebra complementaria bajo condiciones "de hibridización descritas o condiciones menos estrictas. En la presente invención, "epítopes" se refieren a fragmentos polipéptido que tienen actividad antigénica o inmunogénica en un animal, especialmente en un humano. Una modalidad preferida de la presente invención se refiere a un fragmento polipéptido que comprende, o alternativamente consiste de, un epítope, así como el polinucleótido que codifica este fragmento. Una región de una molécula de proteína a la cual puede ligarse un anticuerpo se define como un "epítope antigénico." En contraste, un "epítope inmunogénico" se define como parte de una proteína que produce una respuesta de anticuerpo. (Ver por ejemplo, Geysen y colaboradores, Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 81 : 3998 -4002 ( 1983 ) . ) Epitopes antigénicos, son útiles por ejemplo para desarrollar anticuerpos, incluyendo anticuerpos monoclonales, que ligan específicamente el epítope. (Ver por ejemplo, Wilson y colaboradores, Cell 37:767-778 (1984); Sutcliffe y colaboradores, Science 219:660-666 (1983) .) Similarmente, pueden emplearse epítopes inmunogénicos, por ejemplo para inducir anticuerpos de acuerdo con métodos bien conocidos en la especialidad.

(Ver por ejemplo, Sutcliffe y colaboradores, arriba ; Wilson y colaboradores, arriba ; Chow y colaboradores, Proc. Na ti . Acad. Sci . USA 82:910-914; y Bittle y colaboradores, J. Gen . Virol . 66:2347-2354 (1985).) Un epítope inmunogénico preferido incluye la proteína secretada. Los epítopes inmunogénicos pueden presentarse junto con una proteína portadora, tal como albúmina, a un sistema animal (tal como conejo o ratón) o, si es suficientemente largo (al menos aproximadamente 25 amino ácidos) , sin un portador. Sin embargo, epítopes inmunogénicos que comprenden tan pocos como 8 a 10 amino ácidos se ha mostrado que son suficientes para desarrollar anticuerpos capaces de ligar a, como mínimo epítopes lineales en polipéptido desnaturalizado (por ejemplo en Western blot) . La presente invención además se refiere a anticuerpos y receptores de antígeno célula T (TCR) que ligan específicamente los polipéptidos de la presente invención. Los anticuerpos de la presente invención incluyen IgG (incluyendo IgG1# IgG_, IgGá, y IgG4) , IgA (incluyendo IgA2 y IgA. , IgD, IgE, IgM, y IgY. Como se emplea aquí, el término "anticuerpo" (.Ab) se entiende que incluye anticuerpos completos, incluyendo anticuerpos completos de cadena sencilla y sus fragmentos de enlace antígeno. Más preferiblemente, los anticuerpos son fragmentos de anticuerpo de unión de antígeno humano de la presente invención e incluyen, pero no están limitados a Fab, Fab' y F(ab')^, Fd, Fvs de cadena sencilla (scFv) , anticuerpos de cadena sencilla, Fvs de c'adena enlazados disulfuro (sdFv) y fragmentos que comprenden de cualquiera de un dominio VL o VH_ Los anticuerpos pueden ser de cualquier origen animal incluyendo aves y mamíferos. De preferencia, los anticuerpos son humano, murino, conejo, cabra, conejillo de Indias, camello o pollo . Fragmentos de anticuerpo que ligan antígeno, incluyendo anticuerpos de cadena sencilla, pueden comprender la o las regiones variables solas o en combinación con todo o parte de lo siguiente: región de pivoteo, dominios CHj., CH_, y CH.¡ . También se incluye en la invención cualesquiera combinaciones de la o las regiones variables y regiones de pivoteo, CH^ CH2, y CH3_ La presente invención además incluye anticuerpos monoclonales, policlonales, quiméricos, humanizados, y monoclonales humanos y policlonales humanos, que específicamente ligan los polipéptidos de la presente invención. La presente invención además incluye anticuerpos que son anti-idiotípicos ta los anticuerpos de la presente invención. Los anticuerpos de la presente invención pueden ser monoespecíficos, biespecíficos, triespecíficos o de mayor muí tiespecif icidad . Anticuerpos de multiespecificidad pueden ser específicos para diferentes epítopes de un polipeptido de la presente invención o pueden ser específicos tanto para un polipeptido de la presente invención como para composiciones heterólogas, tal como un polipéptido heterólogo o material de soporte sólido. Ver por ejemplo WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; Tutt, y colaboradores . , J Immunol . 147:60-69 (1991); Patentes de los E.U.A. Nos. 5,573,920, 4,474,893, 5,601,819, 4,714,681, 4,925,648; Kostelny y colaboradores, J. I unol . 148:15-47-1553 (1992).

Anticuerpos de la presente invención pueden describirse o especificarse en términos del o los epítopes o la o las porciones de un polipeptido de la presente invención que se reconocen o ligan específicamente por el anticuerpo. El o los epítopes o la o las porciones del polipéptido pueden especificarse como aquí se describe por ejemplo por posiciones N-terminal y C-terminal, por tamaño en residuos amino ácidos contiguos o enlistados en las Tablas y Figuras. Anticuerpos que ligan específicamente cualquier epítope o polipéptido de la presente invención también puede ser excluido. Por lo tanto, la presente invención incluye anticuerpos que ligan específicamente polipéptidos de la presente invención, y permite la exclusión de los mismos. .Anticuerpos de la presente invención también pueden ser descritos o especificados en términos de su reactividad cruzada. Anticuerpos que no ligan a cualquier otro análogo, ortólogo y homólogo de los polipéptidos de la presente invención se incluyen. Anticuerpos que no ligan polipéptidos con menos de 95%, menos de 90%, con menos de 85%, con menos de 80%, con menos de 75%, con menos de 70%, con menos de 65%, con menos de 60%, con menos de 55%, y con menos de 50% identidad (como se calcula utilizando métodos conocidos en la especialidad y descritos aquí) a un polipéptido de la presente invención también se incluyen en la presente invención. Además se incluyen en la presente invención anticuerpos que solo ligan polipéptidos codificados por polinucleótidos que hibridizan a un polinucleótido de la presente invención bajo estrictas condiciones de hibridización (como aquí de describe) . Anticuerpos de la presente invención también pueden ser descritos o especificados en términos de su afinidad de unión. Afinidades de unión preferidas incluyen aquellas con una constante de disociación o Kd menor a 5X10"6M, 10"bM, 5X10~7M, 10~7M, 5X10~ftM, 10"M, 5X10~"M, 10"9M, 5X10 lnM, 10"10M, 5X10" M 10" M,5X10~12M, 10"17M, 5X10~13M, 10_liM, 5X10"14M, 10~14M, 5X10"lr,M, y 10"1M. .Anticuerpos de la presente invención tienen uso que incluyen, pero no están limitados a, métodos bien conocidos en la técnica para purificar, detectar y hacer objetivo los polipéptidos de la presente invención, incluyendo tanto métodos de diagnóstico como terapéuticos in vi tro, in vivo . Por ejemplo, en los anticuerpos tienen uso en inmunoensayos para niveles de medición cualitativos y cuantitativos de los polipéptidos de la presente invención en muestras biológicas . Ver por ejemplo Harlow y colaboradores, Antibodies : a Labora tory Manual , (.Anticuerpos: un Manual de Laboratorio) (Cold Spring Harbor Laboratory Press, — 2a. ed. 1988) (incorporada por referencia completamente) . Los anticuerpos de la presente invención pueden emplearse ya sea solos o en combinación con otras composiciones. Los anticuerpos además pueden fusionarse de manera recombinante con un polipéptidó heterólogo en el extremo N o C, o conjugarse químicamente (incluyendo conjugado covalentes y no covalentes) en polipéptidos u otras composiciones. Por ejemplo, anticuerpos de la presente invención pueden fusionarse recombinantemente o conjungarse en moléculas útiles como etiquetas en ensayos de detección y moléculas efectoras tales como polipéptidos heterologos, drogas o toxinas. Ver por ejemplo, WO 92/08495; WO 91/14438; WO 89/12624; Patente de los E.U.A. No. 5,314,995; y EP 0 396 38'7. Los anticuerpos de la presente invención pueden ser preparados por cualquier método conveniente conocido en la especialidad. Por ejemplo, un polipéptido de la presente invención o un fragmento antigénico del mismo puede ser administrado a un animal para inducir la producción de suero que contiene anticuerpos policlonales. El término "anticuerpos monoclonales" no está limitado a anticuerpos producidos a través de tecnología de hibridoma. El término "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo que se deriva de un solo clon, incluyendo cualquier clon eucariótico, procariótico o fago, y no el método por el cual se produce. Pueden prepararse anticuerpos monoclonales utilizando una amplia variedad de técnicas conocidas en la especialidad, incluyendo el uso de tecnología de hibridoma, recombinante y exhibición fago. Técnicas de hibridoma incluyen aquellas conocidas en la especialidad e ilustradas por Harlow y colaboradores, Antibodies : a Labora tory' Manual , (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a. ed. 1988); Hammerling, y colaboradores . , in: Monoclonal Antibodies and T cell Hybridomas (.Anticuerpos monoclonales e hibridomas de célula T) 563681 (Elsevier, N.Y., 1981) (las referencias se incorporan por referencia aquí completamente) . Los fragmentos Fab y_F(ab')2 pueden ser producidos por escisión proteolítica, utilizando enzimas tales como papaína (para producir fragmentos Fab) o pepsina (para producir fragmentos F(ab') J • En forma alterna, anticuerpos de la presente invención pueden producirse a través de la aplicación de tecnología .ADN recombinante y exhibición de fago o a través de química de síntesis utilizando métodos conocidos en la especialidad. Por ejemplo, los anticuerpos de la presente invención pueden prepararse utilizando diversos métodos de exhibición de fago conocidos en la técnica. En métodos de exhibición de fago, dominios de anticuerpo funcional se exhiben en la superficie de una particular de fago que transporta secuencias de polinucleótidos que las codifican. Fago con una propiedad de unión deseada se elige de un repertorio o biblioteca de anticuerpos cor?binatoria, (por ejemplo humana o murina) al seleccionar directamente con antígeno, típicamente antígeno ligado o capturado en una superficie o cuenta sólida. Fagos utilizados en estos métodos típicamente son fagos filamentosos incluyendo Fd y M13 con Fav, Fd o dominios de anticuerpo Fv estabilizados con dominios de anticuerpos fusionados recombinantemente ya sea a la proteína gen VIII o fago gen III. Ejemplos de métodos de exhibición de fago que pueden emplearse para producir los anticuerpos de la presente invención incluyen aquellos descritos en Brinkman y colaboradores, J. Immunol . Methods 182:41-50 (1995); Ames y colaboradores, J. Immunol . Methods 184:177-186 (1995); Kettleborough y colaboradores, Eur. J. Immunol . 24:952-958 (1994); Persic y colaboradores, Gene 187:9-18 (1997); Burton y colaboradores, Advances in Immunology 57:191-280 (1994); PCT/GB91/01134 ; WO 90/0280^; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; y las 'Patentes de los E.U.A. Nos. 5,698,426, 5,223,409, 5,403,484, 5,580,717, 5,427,908, 5,750,753, 5,821,047, 5,571,698, 5,427,908, 5,516,637, 5,780,225, 5,658,727 y 5,733,743 (las referencias se incorporan aquí completamente) . Como se describe en las referencias anteriores, después de exhibición de fago, las regiones de codificación de anticuerpo del fago pueden aislarse y utilizarse para generar anticuerpos completos,, incluyendo anticuerpos humanos, o cualquier otro fragmento de unión de antígeno deseado, y expresarse en cualquier huésped deseado incluyendo células de mamífero, células de insectos, células de plantas, levaduras y bacterias. Por ejemplo, técnicas para producir de manera recombinante fragmentos Fab, Fab' and F(ab').. también pueden ser empleadas utilizando métodos conocidos en la especialidad tales como aquellos descritos en WO 92/22324; Mullinax et al . , BioTechniques 12 (6) : 864-869 (1992); y Sawai y colaboradores, AJRI 34:26-34 (1995); y Better y colaboradores, Science 240: 1041-1043 (1988) (las referencias se incorporan aquí completamente) . Ejemplos de técnicas que pueden utilizarse para producir Fvs de cadena sencilla y anticuerpos, incluyen aquellos descritos en las Patentes de los E.U.A. Nos. 4,946,778 y 5,258,498; Huston y colaboradores, Methods in Enzymology (Método en Enzimología) 203:46-88 (1991); Shu, L. y colaboradores , PNAS 90:7995-7999 (1993); y Skerra y colaboradores, Science 240:1038-1040 (1988). Para algunos usos, incluyendo uso in vivo de anticuerpo en humano y ensayos de detección in vitro, puede ser preferible el utilizar anticuerpos quiméricos, humanizados, o humanos. Métodos para producir anticuerpos quiméricos se conocen en la especialidad. Ver por ejemplo, Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi y colaboradores, BioTechniques (Biotécnicas) 4:214 (1986); Gillies y colaboradores, J. Immunol . Methods 125:191-202 (1989); y la Patente de los E.U.A. No. 5,807,715. Los anticuerpos pueden ser humanizados utilizando una variedad de técnicas incluyendo injertos CDR (EP 0 239 400; WO 91/09967; Patentes de los E.U.A. Nos. 5,530,101; y 5,585,089), revestimiento o acabado superficial (EP 0 592 106; ?P 0 519 596; Padlan E.A., Molecular Im unology (Inmunología Molecular) 28 (4/5) : 489-498 (1991); Studnicka y colaboradores , Protein Engineering (Ingeniería de proteínas) 7(6) : 805-814 (1994); Roguska. y colaboradores, PNAS 91 :969-973 (1994)), y entremezclado de cadena (Patente de los E.U.A. NO. 5,565,332). Anticuerpos humanos pueden elaborarse por una variedad de métodos conocidos en la especialidad incluyendo métodos de exhibición de fago descritos anteriormente. Ver también las Patentes de los E.U.A. Nos. 4,444,887, 4,716,111, 3,545,806, 5,814,318; y WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735, "y WO 91/10741 (las referencias se incorporan aquí completamente) . Además se incluyen en la presente invención anticuerpos fusionados de manera recombinante o conjugados químicamente (incluyendo tanto conjugados covalentes como no-covalentes) a un polipéptido de la presente invención. Los anticuerpos pueden ser específicos para antígenos diferentes a polipéptidos de la presente invención. Por ejemplo, pueden emplearse anticuerpos para hacer blanco u objetivo a los polipéptidos de la presente invención a tipos de células particulares, ya sea in vitro o in vivo, al fusionar o conjugar los polipéptidos de la presente invención con anticuerpos específicos para receptores de superficie celular particular. .Anticuerpos fusionados o conjugados a los polipéptidos de presente invención también pueden ser utilizados en ensayo in vitro y métodos de purificación que utilizan métodos conocidos en la especialidad. Ver por ejemplo, Harbor y colaboradores , arriba y WO 93/21232; EP 0 439 095; Naramura y colaboradores, Im unol Let t . 39:91-99 (1994); Patente de los E.U.A. No. 5,474,981; Gillies y colaboradores, PNAS 89: 1428-1432 (1992); Fell y colaboradores, J. Immunol . 146:2446-2452(1991) (las referencias se incorporan aquí completamente) . La presente invención además incluye composiciones que comprenden los polipéptidos de la presente invención fusionados o conjugados con dominios de anticuerpo diferentes a las regiones variables . Por ejemplo, los polipéptidos de la presente invención pueden ser fusionados o conjugados a una región Fc de anticuerpo, o una porción de la misma. La porción de anticuerpo fusionada a un polipéptido de la presente invención puede comprender la región de pivoteo, dominio CHj., dominio CH_ y dominio CH3 o cualquier combinación de dominios enteros o porciones • de los mismos . Los polipéptidos de la presente invención también pueden fusionarse o conjugados a las porciones de anticuerpo anteriores para incrementar la vida media in vivo de los polipéptidos o para utilizar en inmuno ensayo utilizando métodos conocidos en la especialidad. Los polipéptidos también pueden ser fusionados o conjugados a las porciones de anticuerpo anteriores para forma multímeros. Por ejemplo, porciones Fc fusionadas para polpeptidos de la presente invención pueden formar dímeros a través de unión disúlfuro entre las porciones ' Fc . Formas multiméricas superiores pueden elaborarse al fusionar los polipéptidos a las porciones de IgA y IgM. Métodos para fusionar o conjugar los polipéptidos de la presente invención en porciones de anticuerpo, se conocen en la técnica. Ver por ejemplo Patentes de los E.U.A. Nos. 5,336,603, 5,622,929, 5,359,046, 5,349,053, 5,447,851, 5,112,946; EP 0 307 434, EP 0 367 166; WO 96/04388, WO91/06570; Ashkenazi y colaboradores , , PNAS 88:10535-10539 (1991); Zheng y colaboradores, J. Immunol . 154:5590-5600 (1995); y Vil y colaboradores, PNAS 89: 11337-11341 (1992) (las referencias se incorporan aquí completamente) . La invención además se relaciona a anticuerpos que actúan como agonistas o antagonistas de los polipéptidos de la presente invención. Por ejemplo, la presente invención incluye anticuerpos que rompen las interacciones receptor/ligando con los polipéptidos de la invención, ya sea parcial o completamente. Se incluyen tanto anticuerpos específicos de receptor como anticuerpos específicos de ligando. Se incluyen anticuerpos específicos de receptor que no evitan unión de ligando pero evita activación de receptor. Activación de receptor (es decir señalización) puede determinarse por las técnicas aquí descritas o de otra forma conocidas en la especialidad. También se incluyen anticuerpos específicos de receptor que tanto evitan unión de ligando como activación de receptor. _ Igualmente se incluyen anticuerpos de neutralización que unen el ligando y ubican unión de ligando con el receptor, así como anticuerpos que unen el ligando, de esta manera evitando activación de receptor, pero que 'no evitan que el ligando se una al receptor. Además se incluyen anticuerpos que activan el receptor. Estos anticuerpos pueden actuar como agonistas, ya sea para todo o menos que todas o menos que todas las actividades biológicas afectadas por la activación de receptor mediada por igandos. Los anticuerpos pueden especificarse como agonistas o antagonistas para actividades biológicas que comprenden las actividades específicas aquí descritas. Los agonistas de anticuerpo anteriores, pueden elaborarse utilizando métodos conocidos en la especialidad. Ver por ejemplo WO 96/40281; Patente de los E.U.A. No. 5,811,097; Deng y colaboradores, Blood 92 (6) : 1981-1988 (1998) ; Chen, y colaboradores , Cáncer Res . 58 (16) =3668-3678 (1998); Harrop y colaboradores, J.

I munol . 161 (4) : 1786-1794 (1998); Zhu y colaboradores, Cáncer Res . 58 (15) : 3209-3214 (1998); Yoon, y colaboradores , J. Immunol . 160 (7) : 3170-3179 (1998); Prat y colaboradores, J. Cell . Sci 111 (Pt2 ): 237-247 (1998); Pitard y colaboradores, J. Immunol Methods 205(2): 177-190 (1997) ; Liautard y colaboradores , Cytokine 9(4) :233-241 (1997); Carlson y colaboradores, J. Biol .

Chem . 272 (17) : 11295-11301 (1997) Taryman y colaboradores, Neuron 14 (4) : 755-762 (1995); Muller y colaboradores, Structure 6 (9) : 1153 -1167 (1998); Bartunek y colaboradores, Cytokine 8(1) : 14-20 (1996) (las referencias aquí se incorporan completamente) . Como se discutió con anterioridad, anticuerpos a los polipéptidos de la invención pueden a su vez ser utilizados para generar anticuerpos _ anti-idiotipo que "imitan" polipéptidos de la invención utilizando técnicas bien conocidas por aquellos con destreza en la especialidad (Ver por ejemplo, Greenspan & Bona, FASEB J. 7 (5) :437-444; (1989) y Nissinoff, J. I munol . 147 (8) :2429-2438 (1991)) . Por ejemplo, anticuerpos que ligan a e inhiben en forma competitiva la multimerización de polipéptido y/o unión de un polipéptido de la invención a ligando, pueden ser utilizados para generar anti-idiotipos que "imitan" la multimerización del polipéptido y/o dominio de unión y, como consecuencia, se unen a y neutralizan polipéptido y/o su ligando. Estos anti-idiotipos de neutralización o -fragmentos Fab de estos anti-idiotipos pueden utilizarse en regímenes terapéuticos para neutralizar ligandos polipéptidos. Por ejemplo, estos anticuerpos anti-idiotípicos pueder utilizarse para ligar un polipéptido de la invención y/o ligar sus ligandos/receptores, y de esta manera bloquear su actividad biológica. .Anticuerpos generados contra los polipéptidos que corresponden a una secuencia de la presente invención o su receptor i vivo pueden 'obtenerse por inducción directa de los polipéptidos en un animal o al administrar los polipéptidos a un animal, de preferencia no humano. El anticuerpo así obtenido luego unirá los propios polipéptidos. De esta manera, incluso una secuencia que codifica solo un fragmento de los polipéptidos puede ser empleada para generar un anticuerpo que unen todos los polipéptidos así. Estos anticuerpos luego pueden ser utilizados para aislar los polipéptidos de tejido que expresa ese polipéptido. Para preparación de anticuerpos monoclonales, puede utilizarse cualquier técnica que proporciona anticuerpos producidos por cultivos de línea celular continuos. Ejemplos incluyen la técnica de hibridoma (Kohler y Milstein, 1975, Nature, 256:495-497), la técnica de trioma, la técnica de hibridoma de célula B humana (Kozbor y colaboradores, 1983, Immunology Today 4:72), y la técnica de hibridoma EBV para producir anticuerpos monoclonales humanos (Colé, y colaboradores., 1985, en anticuerpos monoclonales y terapia de Cáncer) Alan R. Liss, Inc., p . 77-96). Técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena sencilla (Patente de los E.U.A. No. 4,946,778) pueden ser adaptadas para producir anticuerpos de cadena sencilla a productos polipéptidos inmunogénicos de esta invención. Los anticuerpos de la presente invención pueden prepararse por cualquiera de una variedad de métodos. Por ejemplo células que expresan la proteína MPIF-1 o un fragmento antigénico de la misma, pueden ser administradas a un animal a fin de inducir la producción de suero que contiene anticuerpos policlonales. En un método preferido, una preparación de proteína MPIF-1, se realiza y purifica para producirla substancialmente libre de contaminantes naturales. Esta preparación luego se introduce en un animal a fin de producir antisueros policlonales de mayor actividad específica. En el método más prefe.rido, los, anticuerpos de la presente invención son anticuerpos monoclonales (o sus fragmentos de unión de proteína CBPC-1) . Estos anticuerpos monoclonales pueden prepararse utilizando tecnología de hibridoma (Kohler y colaboradores, Na ture 256:495 (1975); Kohler y colaboradores, Eur J. Immunol . 6:511 (1976); Kohler y colaboradores, Eur. J. Immunol . 6:292 (1976); Hammerling y colaboradores, In: Monoclonal Antibodies and T- Cell Hybridomas, (.Anticuerpos monoclonales e hibridomas de células T) Elsevier, N.Y., (1981) pp . 563-681) . En general, estos procedimientos involucran inmunizar un animal (de preferencia un ratón) con un antígeno de proteína MPIF-1 o en forma más preferible con una célula que expresa proteína MPIF-1. Células convenientes pueden reconocerse por su capacidad por unir anticuerpo de proteína anti-MPIF-1. Estas células pueden cultivarse en cualquier medio de cultivo de tejido conveniente; sin embargo es preferible cultivar células en medio Earle modificado con Eagle suplementado con suero bovino fetal al 10% (inactivado a aproximadamente 56 °C) , y suplementado con aproximadamente 10 g/1 de amino ácidos no esenciales, aproximadamente 1,000 U/ml de penicilina, y aproximadamente 100 g/ml de estreptomicina. Los esplenocitos de estos ratones se extraen y fusionan con una línea celular de mieloma conveniente. Cualquier línea celular de mieloma conveniente puede emplearse de acuerdo con la presente invención; sin embargo, es preferible emplear la línea celular del mieloma padre (SP20) o disponible de American Type Culture Collection, Rockville, Maryland. Después de fusión, las células de hibridoma resultantes se mantienen selectivamente en medio HAT, y luego clonan por dilución limitante como se describe por Wands y colaboradores .

(Gastroenterology 80:225-232 (1981)). Las células de hibridoma obtenidas a través de esta selección luego se ensayan para identificar ciónos que secretan anticuerpos capaces de ligar el antígeno de proteínas MPIF-1. En forma alterna, anticuerpos adicionales capaces de ligar al antígeno de proteína MPIF-1, pueden producirse en un procedimiento de dos etapas a través del uso de anticuerpos anti-idiotípico. Este método utiliza el hecho de que los anticuerpos por sí son antígenos y que, por lo tanto es posible obtener un anticuerpo que liga a un segundo anticuerpo. De acuerdo con este método, anticuerpos específicos de proteína MPIF-1 se emplean para inmunizar un animal, de preferencia un ratón. Los esplenocitos de esta animal luego se utilizan para producir células de hibridoma y las células de hibridoma se monitorean para identificar ciónos que producen un anticuerpo cuya capacidad de ligar al anticuerpo específico de proteína MPIF-1 puede ser bloqueado por el antígeno de proteína MPIF-1. Estos anticuerpos comprenden anticuerpos anti-idiotípicos al anticuerpo específico de proteína MPIF-1 y pueden utilizarse para inmunizar un animal para inducir formación de adicionales anticuerpos específico de proteína MPIF-1. Se apreciará que Fab y F (ab ' ) ¿ y otros fragmentos de anticuerpo de la presente invención pueden utilizarse de acuerdo con los métodos aquí descritos. Estos fragmentos típicamente se producen por escisión proteolítica, utilizan enzimas tales como papaína (para producir fragmentos Fab) o pepsina (para producir fragmentos F(ab')2) . En forma alterna, fragmentos de unión de proteína MPIF-1, pueden producirse a través de la aplicación de tecnología de .ADN recombinante o a través de química de síntesis. Puede ser preferible el utilizar anticuerpos monoclonales quiméricos "humanizados". Estos anticuerpos pueden producirse utilizando construcciones genéticas derivadas de células de hibridoma que producen los anticuerpos monoclonales anteriormente descritos. Métodos para producir anticuerpos quiméricos se conocen en la especialidad. Ver para revisión, Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi y colaboradores, BioTechniques 4:214 (1986) ; Cabilly y colaboradores, Patente de los E.U.A. No. 4,816,567; Taniguchi y colaboradores, EP 171496; Morrison y colaboradores, EP 173494; Neuberger y colaboradores, WO 8601533; Robinson y colaboradores, WO 8702671; Boulianne y colaboradores, Na ture 312:643 (1984); Neuberger y colaboradores, Nature 314:268 (1985). Adicionales etiquetas convenientes para los anticuerpos específicos de proteína MPIF-1 de la presente invención, se proporcionan a continuación. Ejemplos de etiquetas de enzima convenientes incluyen malato dehidrogenasa, nucleasa de estafilococo, delta-5-esteroide isomerasa, levadura-alcohol dehidrogenasa, alfa-glicerol fosfato dehidrogenasa, triosa fosfato isomerasa, peroxidasa, fosfatasa alcalina, asparaginasa, glucosa oxidasa, beta-galactosidasa, ribonucleasa, ureasa, catalasa, glucosa-6-fosfato dehidrogenasa, glucoamilasa, y acetilcolina esterasa. Ejemplos de etiquetas _ radioisotópicas convenientes incluyen 3H, mIn, 125I, 1 1I, 32P, 35S, C, 51Cr , ^'7To , "HCo , sqFe , 7 SSe , l c,?Eu , °Y , ^Cu , 217Ci , 211At , 212 Pb, Se, *Pd, etc LIn es un isótopo preferido en donde se utiliza formación de imagen in vivo ya que evita el problema de deshalogenar el anticuerpo monoclonal etiquetado con 125I o 131I por el hígado. Además, este radionuclido tiene una energía de emisión gamma más favorable para formación de imagen (Perkins y colaboradores, Eur. J. Nucí . Med. 10:296-301 (1985); Carasquillo y colaboradores . , J. Nucí . Med. 28:281-287 (1987) ) . Ejemplos de etiquetas isotópicas no-radioactivas convenientes incluyen 157Gd, 55Mn, 16~Dy, 5-Tr, y fFe. Ejemplos de etiquetas fluorescentes convenientes incluyen una etiqueta lc,2Eu, una etiqueta de fluoresceína, una etiqueta de isotiocianato, una etiqueta rodamina, una etiqueta ficoeritrina, una etiqueta ficocianina, una etiqueta aloficocianina, una etiqueta o-ftaldehído y una etiqueta de fluorescamina. Ejemplos de etiquetas de toxina convenientes incluyen toxina difteria, ricina y toxina cólera. Ejemplos de etiquetas químioluminescentes incluyen una etiqueta luminal, una etiqueta isoluminal, una etiqueta éster acridino aromático, una etiqueta imidazol, una etiqueta de sal acridinio, una etiqueta éster oxalato, una etiqueta luciferina, una etiqueta luciferasa y una etiqueta aecuorina. Ejemplos de agentes de contraste de resonancia magnética incluyen núcleos de metal pesado tales como Gd, Mn, y hierro.

Técnicas típicas para unir las etiquetas anteriormente descritas a anticuerpos se proporcionan por Kennedy y colaboradores, Clin . Chim . Acta 70:1-31 (1976), y Schurs y colaboradores, Clin . Chim . Acta 81: 1-40 (1977) . Técnicas de acoplamiento mencionadas en lo último son el método de glutaraldehído, el método de peroyiato,el método de dimaleimida, el método de m-maleimidobencil-N-hidroxi-succinimida éster, todos los cuales métodos, aquí se incorporan por referencia. Ensayos de Cromosomas . Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención también son valiosos para identificación de cromosoma. La secuencia se hace objetivo específicamente y puede hibridizar con un sitio particular en un cromosoma humano individual. Aún más, hay necesidad actual por identificar sitios particulares en el cromosoma. Pocos reactivos de marcado de cromosoma basados en datos de secuencia actual (polimorfismos de repetición) , actualmente están disponibles para marcar un sitio cromosomal. El mapeo de ADNc a cromosomas de acuerdo con presente invención es una primer etapa importante para correlacionar estas secuencias con genes asociados con enfermedad. En ciertas modalidades preferidas en este apsecto, el ADNc aquí descrito se utiliza para clonar el ADN genómico de un gen de proteína MPIF-1. Esto puede lograrse utilizando una variedad de técnicas y bibliotecas bien conocidas, que en general están disponibles comercialmente. El .ADN genómico luego se emplea para mapeo de cromosomas in si tu utilizando técnicas bien conocidas para ese propósito. Típicamente, de acuerdo con procedimientos rutinarios para mapeo de cromosomas, puede ser necesaria algo de prueba y error para identificar una sonda genómica que da una buena señal de hibridización in si tu . Brevemente, pueden apearse • secuencias a cromosomas al preparar cebadores PCR (de preferencia 15 a 25 bp) del .ADNc. Análisis de computadora del ADNc se utiliza para seleccionar rápidamente cebadores que no se extiende un exon en el ADN genómico, de esta manera complicando el proceso de amplificación. Estos cebadores luego se emplean para monitoreo de PCR de híbridos se células somáticas que contienen cromosomas humanos individuales. Solo aquellos híbridos que contienen el gen humano correspondiente al- cebador' producirán un fragmento amplificado. Mapeo de PCR de híbrido de células somáticas es un procedimiento rápido para asignar un ADN particular a un cromosoma particular. Utilizando la presente invención con los mismos cebadores de oligonucleótido, puede lograrse sub- localización con paneles de- porciones de cromosomas específicos o recolectado de grandes clones genómicos en una forma análoga. Otras estrategias de mapeo que pueden emplearse similarmente para mapear a su cromosoma, incluyen hibridización in si tu, pre-monitoreo con cromosomas clasificados por flujo etiquetados y preselección por hibridización para construir bibliotecas ADNc específicas de cromosoma. Hibridización in si tu por fluorescencia ("FISH" = Florescence in si tu hibridization) de un clon ADNc a una extensión cromosomal metafase, puede utilizarse para proporcionar una ubicación cromosomal precisa en una etapa. Esta técnica puede emplearse con sondas del .ADNc tan cortas como de 50 o 6.0 b . Para una revisión de esta técnica, ver Verma y colaboradores , Human Chr orno s orne s : A Manual Of Basic Techniques, (Cromosomas humanos: un manual de técnicas básicas) Pergamon Press, New York (1988) . Una vez que se ha mapeado una secuencia a una ubicación cromosomal precisa, la posición física de la secuencia en el cromosoma puede correlacionarse con datos de mapa genético. Estos datos se encuentran por ejemplo en V. McKusick, Mendel ian Inheri tance In Man, (Herencia Mendeliana en el hombre) disponible en línea a través de Johns Hopkins University, Welch Medical Library. La relación entre genes y enfermedades que se han mapeado a la misma región cromosomal luego se identifica a través de análisis de enlace (co-herencia de genes físicamente adyacentes) . A continuación, es necesario determinar las diferencias en el ADNc o secuencia genómica entre individuos afectados y no afectados. Si se observa una mutación en algunos o todos los individuos afectados, pero no en ningún individuo normal, luego, la mutación es probable que sea el agente causante de la enfermedad. Con la actual resolución de^ técnicas de mapeo físico y mapeo genético, un ADNc ubicado precisamente en una región de cromosoma asociada con la enfermedad puede ser uno de entre 5 y 500 genes causativos potenciales. Esto considera una resolución de mapeo de una mega base y un gen por 20 kb . Comparación de individuos afectados y no afectados generalmente involucra primero buscar alteraciones estructurales en los cromosomas, tales como eliminaciones o translocaciones que son visibles de extensiones de cromosomas o detectables utilizando PCR con base en esta secuencia de .ADNc. Finalmente, el secuenciado completo de genes de varios individuos se requiere para confirmar la presencia de una mutación y para distinguir mutaciones de polimorfismos. La presente invención además se dirige a dirigir MPIF-1 in vivo por el uso de tecnología antisentido. Puede emplearse tecnología antisentido para controlar expresión de gen a través de formación triple-hélice o .ARN o ADN antisentido, ambos de cuyos métodos se basan en unión de un poligonucleotido a .ADN o ARN. Por ejemplo, la porción de codificación 5' de la secuencia polinucleótido, que codifica los polipéptidos de la presente invención, se utiliza para diseñar un oligonucleótido .ARN antisentido de aproximadamente 10 a 40 pares base de longitud. Se diseña un oligonucleótido ADN para ser complementario con una región del gen involucrada en transcripción (triple hélice -ver Lee y colaboradores, Nucí. Acids Res., 6:3073 (1979); Cooney y colaboradores, Science, 241:456 (1988); y Dervan y colaboradores, Science, 251: 1360 (1991)), de esta manera evitando transcrición y la producción de MPIF-1. El oligonucleótido ARN antisentido hibridiza al ARNm in vivo y bloquea la traducción de la molécula .ARNm en la proteína MPIF-1 (antisentido -- Okano, \ Neurochem . 56:560 (1991.); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibi tors of Gene Expression, (Oligodeoxinucleótidos como inhibidores antisentido de expresión de gen) CRC Press, Boca Ratón, FL (1988)). En forma alterna, los oligonucleótidos anteriormente descritos pueden suministrarse a células por procedimientos en la especialidad tal que el .ARN o .ADN antisentido puede expresarse in vivo para inhibir producción de MPIF-1 en la forma anteriormente descrita.. De acuerdo con esto, construcciones antisentido al MPIF-1 pueden emplearse para tratar desordenes que ya son inducidos o .mejorados por MPIF-1, por ejemplo, aterosclerosis, esclerosis auto-inmune, por ejemplo esclerosis múltiple, y diabetes dependiente de insulina, y enfermedades infecciosas e inflamatorias crónicas, reacciones alérgicas mediadas por histamina, artritis reumatoide, silicosis, sarcoidosis, fibrosís pulmonar idiopática y otras enfermedades inflamatorias crónicas del pulmón, síndrome hiper-eosinofílico idiopático, choque endotóxico, reacciones alérgicas mediadas por histamina, fiebre independiente de prostaglandina y anemia aplástica, y otros casos de falla de médula ósea. Antagonis tas, Agonis tas y Métodos . Esta invención además proporciona métodos para monitorear compuestos para identificar agonistas y antagonistas a los quimosina polipéptidos de la presente invención. Un agonista es un compuesto que tiene funciones biológicas similares o mejora las funciones de los polipéptidos, mientras que los antagonistas bloquean estas funciones. La quimiotaxia puede ensayarse al colocar células, que son quimioatraídas por cualquiera de los polipéptidos de la presente invención, sobre un filtro con poros de diámetro suficiente para admitir las células (aproximadamente 5 µm) . Soluciones de agonistas potenciales se colocan en el fondo de la cámara con un medio de control apropiado en el compartimiento superior, y de esta manera se mide un gradiente de concentración de agonista al contar células que migran dentro a través de la membrana porosa, con el tiempo. Cuando se ensayan antagonistas, los quimosina polipéptidos de la presente invención se colocan en la cámara de fondo y el antagonista potencial se agrega para determinar sí se evita quimotaxia de las células . En forma alterna, una preparación de membrana o célula de mamífero que expresa los receptores de los polipéptidos, se incubará con un quimosina polipéptido etiquetado, por ejemplo radioactividad en la presencia del compuesto. La capacidad del compuesto para bloquear esta interacción luego puede ser medida. Cuando se ensayan agonistas de esta manera, las quimosinas estarán ausentes y la capacidad del propio agonista para interactuar con el receptor, se medirá. Ejemplos de antagonistas MPIF-1 potenciales incluyen anticuerpos, o en algunos casos oligonucleótidos, que ligan a los polipéptidos. Otro ejemplo de un antagonista potencial es un mutante dominante negativo de los polipéptidos. Mutantes dominantes negativos son polipéptidos ' que ligan al receptor del polipéptido tipo silvestre pero fallan en retener la actividad biológica. Construcciones antisentido preparadas utilizando tecnología antisentido también son antagonistas potenciales. Puede emplearse tecnología antisentido para controla expresión de gen a través de formación triple-hélice o .ADN o ARN antisentido, ambos de cuyos métodos se basan en unir un polipéptido con 4ADN o ARN. Por ejemplo, la porción de codificación 5' de la secuencia polinucleótido, que codifica los polipéptidos maduros de la presente invención, se utiliza para diseñar un olinucleotido .ARN antisentido o de aproximadamente 10 a 40 pares base de longitud. Un oligonucleótido ADN se diseña para ser complementario a una región del gen involucrado en transcripción (triple-hélice, ver Lee y colaboradores al . , Nucí . Acids Res . 6:3073 (1979); Cooney y colaboradores, Science 241:456 (1988); y Dervan y colaboradores, Science 251:1360 (1991)), de esta manera evitando transcripción y la producción de los quimosina polipéptido. El oligonucleótido .ARN antisentido hibridiza al ARNm in vivo y bloquea la traducción de la molécula .ARNm en los polipéptidos (antisentido- Okano, J. Neurochem. 56:560 (1991); " Qligodeoxynucl eotides as An ti sense Inhibi tors of Gene Expressi on " (oligodeoxinucleótidos como inhibidores antisentido de Expresión de Gen, CRC Press, Boca Ratón, ,FL (1988)). Los oligonucleótidos descritos anteriormente también pueden suministrarse a células tal que el .ARN o .ADN antisentido pueda ser expresado in vivo para inhibir la producción de los quimosina polipéptidos. Otra antagonista quimosina potencial es un derivado péptido de los polipéptidos que son análogos modificados naturalmente o en forma sintética de los polipéptidos que han perdido la función biológica, sin embargo aún reconocen y ligan a los receptores de los polipéptidos, para de esta manera bloquear efectivamente a los receptores. Ejemplos de derivados de péptido incluyen pero no están limitados a, pequeños péptidos o moléculas tipo péptido.

Los antagonistas pueden emplearse para tratar desordenes que ya son inducidos .o mejorados en MPIF, por ejemplo enfermedades inflamatorias e infecciosas auto- inmunes y crónicas. Ejemplos de enfermedades auto-inmune esclerosis múltiple y diabetes dependiente de insulina . Los antagonistas también pueden emplearse para tratar enfermedades infecciosas incluyendo silicosis, sarcoidosis, fibrosis pulmonar idiopática, al evitar el reclutamiento y activación de fagocitos mononucleares. También pueden emplearse para tratar síndrome hiper-eosinofílico idiopático al evitar la producción y migración de eosinófilos. Choque endotóxico también puede tratarse por los antagonistas al evitar la migración de macrófagos y su producción de los quimosina polipéptidos de la presente invención. Los antagonistas también pueden ser empleados para tratar aterosclerosis, para evitar infiltración en monocitos en la pared arterial. Los antagonistas también pueden ser empleados para tratar reacciones alérgicas mediadas por histamina y desordenes inmunológicos incluyendo reacciones alérgicas de fase tardía, urticaria crónica y dermatitis atópica, al inhibir células cebadas inducidas por quimosinas y desgranulación de basófilo y liberación de histamina.

Reacciones alérgicas mediadas por IgE tales como asma alérgico, rinitis, y eczema también pueden tratarse. Los antagonistas también pueden ser empleados para tratar inflamación crónica y aguda al evitar la atracción de monocitos a un área de herida. También pueden emplearse para regular poblaciones de macrófagos pulmonares normales, ya que las enfermedades pulmonares inflamatorias agudas y crónicas, están asociadas con secuestro de fagocitos mononucleares en el pulmón. También pueden emplearse antagonistas para tratar artritis reumatoide al evitar la atracción de monocitos en fluidos sinovial en las- articulaciones de los pacientes. El flujo de ingreso de monocitos y la activación juegan un papel significante en la patogénesis tanto de artropatías degenerativas tanto como inflamatorias". Los antagonistas también pueden emplearse para interferir con las cascadas nocivas atribuidas primordialmente a IL-1 y TNF, que evitan las biosíntesis de otras citosinas inflamatorias. De esta manera, los antagonistas pueden ser empleados para evitar inflamación. Los antagonistas también pueden emplearse para inhibir fiebre independiente de prostaglandina inducida por quimosinas.

Los antagonistas también pueden ser empleados para tratar casos de falla de médula osea, por ejemplo anemia aplástica y síndrome mielodisplástico.. Los antagonistas también pueden ser empleados para tratar asma y alergia al evitar acumulación de eosinófilos en el pulmón. Los antagonistas también pueden emplearse para tratar fibrosis de membrana basal subepitelial , que es una característica prominente del pulmón asmático. Agonistas . Agonistas MPIF-1 incluyen cualquier molécula pequeña que tiene una actividad similar a cualquiera uno o más que estos polipép'tidos, como se describe aquí. Por ejemplo, pueden emplearse agonistas MPIF-1 para mejorar la actividad MPIF-1. Por ejemplo, para mejorar mieloprotección inducida por MPIF-1 en pacientes que se someten a quimioterapia, o transplante de médula ósea. Diagnóstico y Prognosis de Enfermedad . Ciertas enfermedades o desordenes, como se discute a continuación, pueden estar asociadas con niveles mejorados de la proteína MPIF-1 y 4R m que codifican la proteína MPIF-1, cuando se comparan con un mamífero "estándar" correspondiente, es decir, un mamífero de la misma especie que no tiene la enfermedad o el desorden.

Además, se considera que niveles mejorados de la proteína MPIF-1 puede detectarse en ciertos fluidos corporales (por ejemplo suero, plasma, orina, y fluido espinal) de mamíferos con una enfermedad o desorden cuando se comparan con sueros de mamíferos de la misma especie que no tienen la enfermedad o el desorden. De esta manera, la invención proporciona un método de diagnóstico que involucra ensayar el nivel de expresión del gen que codifica la proteína MPIF-1 en células de mamífero o fluido corporal y comparar el nivel de expresión de gen con un nivel de expresión de gen MPIFrl estándar, con lo que un incremento en el nivel dé expresión de gen sobre el estándar es indicativo de ciertas enfermedades o desordenes . Cuando un diagnóstico de enfermedad o desorden ya se ha realizado de acuerdo con métodos convencionales, la presente invención es útil como un indicador de pronóstico, con lo que los pacientes que exhiben expresión de gen MPIF-1 mejorada, experimentarán un resultado clínico peor respecto a pacientes que expresan el gen a un nivel inferior. Por "ensayar el nivel de expresión del gen que codifica la proteína MPIF-1" se pretende medir o estimar en forma cualitativa o cuantitativa el nivel de proteína MPIF-1 o el nivel de .ARNm que codifica la proteína MPIF-1 o el nivel de ARNm que codifica la proteína MPIF-1 en una primer muestra biológica ya sea directamente (por ejemplo al determinar o estimar nivel de proteína absoluta o nivel de .ARNm) o en forma relativa (por ejemplo al comparar al nivel de proteína MPIF-1 o al nivel .ARNm en una segunda muestra biológica) . De preferencia, el nivel de proteína MPIF-1 o nivel de ARNm en la primer muestra biológica se mide o estima y compara con un nivel de proteína MPIF-1 estándar o nivel ARNm, el estándar se toma de una segunda muestra biológica que se obtiene de un individuo que no tiene la enfermedad o el desorden. Como se apreciará en la técnica, una vez que se conoce un nivel de proteína MPIF-l estándar o nivel de ARNm, puede emplearse respectivamente como un estándar .para comparación. Por "muestra biológica" se entiende cualquier muestra biológica que se obtiene de un individuo, línea celular, cultivo de tejido u otra fuente que contiene proteína MPIF-1 o ARNm. Muestras biológicas incluyen fluidos corporales (tales como suero, plasma, orina, fluido sinovial y fluido espinal) que contienen proteína MPIF-1 madura secretada y también incluyen tejido de ovario, próstata, corazón, placenta, páncreas, ascitos, músculo, piel, glandular, riñon, hígado bazo, pulmón, médula ósea, ocular, nervio periférico, nervioso central, de pecho y umbilical. Métodos para obtener biopsias de tejido y fluidos corporales de mamíferos son bien conocidos en la técnica. Cuando la muestra biológica va a incluir ARNm, una biopsia 'de tejido es la fuente preferida. La presente invención es útil para detectar enfermedades en mamíferos. En particular, la invención es útil para diagnóstico o tratamiento de diversos desordenes relacionados al sistema inmune en mamíferos, de preferencia humanos. Estos desordenes incluyen tumores, cánceres y cualquier desregulación de la función celular inmune incluyendo pero no limitado a, autoinmunidad, artritis, leucemias, linfomas, inmunosupresión, sepsis, sanado de herida, infección aguda y crónica, inmunidad mediada por células, inmunidad humoral, enfermedad de intestino inflamatorio, mielosupresión y semejantes. Mamíferos preferidos incluyen simios, gatos, perros, vacas, cerdos, caballos, conejos y humanos. Se prefiere en particular humanos. ARN celular total puede aislarse de una muestra biológica utilizando cualquier técnica conveniente, tal como el método de una sola etapa de guanidinio- tiocianato-fenol-cloroformo descrito por Chomczynski y Sacchi, Anal. Biochem . 162:156-159 (1987).

Niveles de .ARNm que codifican la proteína MPIF-1 luego se ensayan utilizando cualquier método apropiado. Estos incluyen análisis Northern blot, mapeo de nucleasa SI, la reacción de cadena polimerasa (PCR) , transcripción inversa en combinación con la reacción de cadena polimerasa (RT-PCR) , y transcripción inversa en combinación con la reacción de cadena ligasa (RT-LCR) . .Análisis Northern blot puede realizarse como se describe en Harada y colaboradores, Cell 63:303-312 (1990) . Brevemente, ARN total se prepara a partir de una muestra biológica como se describe anteriormente. Para Northern blot, el ARN se desnaturaliza en un amortiguador apropiado, (Tal como amortiguador glioxal/dimetil sulfóxido/fosfato de sodio) , sometido a electroforesis en gel de agarosa, y transferido a un filtro de nitrocelulosa. Después de que los .ARNms se han enlazado al filtro por un enlazador W, el filtro 'se prehibridiza en una solución que contiene formamida, SSC, solución de Denhardt, esperma de salmón desnaturalizado, SDS, y amortiguador de fosfato de sodio. .ADNc MPIF-1 etiquetado de acuerdo con cualquier método apropiado (tal como un sistema de etiquetado ADN multicebado ' P (Amersham) ) se emplea como sonda. Después de hibridización durante la noche, el filtro se lava y expone a película de rayos X. ADNc para utilizar como sonda de acuerdo con la presente invención se describe en las secciones anteriores y de preferencia será de al menos 15 bp de longitud. Mapeo SI puede realizarse como se describe en Fujita y colaboradores, Cell 49:357-367 (1987). Para preparar ADN sonda para utilizar en mapeo SI, la hebra sentido del ADNc anteriormente descrito se emplea como una plantilla para sintetizar ADN antisentido etiquetado. El ADN antisentido luego puede ser digerido utilizando endonucleasa de restricción apropiada para generar más sondas ADN de una longitud deseada. - Estas sondas antisentido son útiles para visualizar bandas protegidas correspondientes al ARNm objetivo (es decir -ARNm que codifica la proteína MPIF-1) . Análisis Northern blot pueden realizarse como se describió anteriormente. De preferencia, niveles de ARNm que codifica la proteína MPIF-1 se ensayan utilizando el método RT-PCR descrito en Makino y colaboradores, Technique 2:295-301 (1990) . Por este método, las radioactividades de los "amplicones" las bandas de gel de poliacrilamida se relacionan linealmente a la concentración inicial del .ARNm objetivo. Brevemente, este método involucra agregar a ARN total aislado de uno o masa biológica en una muestra de reacción que contiene un cebador RT y amortiguador apropiado. Después de incubar para alinear cebador, la mezcla puede suplementarse con un amortiguador RT, dNTPs, DTT, . inhibidor de Rnasa y transcriptasa inversa. Después de incubación para lograr transcripción inversa del .ARN, los productos RT luego se someten a PCR utilizando cebadores etiquetados. En forma alterna, en vez de etiquetar los cebadores, un dNTP etiquetado puede incluirse en la mezcla de reacción PCR. Puede realizarse amplificación PCR en un ciclador térmico de ADN, de acuerdo con técnicas convencionales. Después de un número conveniente de ciclos para lograr la amplificación, la mezcla de reacción PCR se somete a electroforésis en un gel de poliacrilamida. Después de secar el gel, la radioactividad de las bandas apropiadas (correspondiente al ARNm que codifica la proteína MPIF-1) se cuantifica utilizando un analizador de formación de imagen. Condiciones e ingredientes de reacción PCR y RT, concentraciones de reactivo y gel, y métodos de •etiquetado son bien conocidos en la especialidad.

Variaciones del método RT-PCR serán aparentes para la persona con destreza en la especialidad. Cualquier juego de cebadores de oligonucleótido que amplifique ARNm objetivo de transcripción inversa puede emplearse y puede diseñarse según se describe en las secciones anteriores. Ensayar niveles de proteína MPIF-1 en una muestra biológica puede ocurrir utilizando cualquier método conocido en la especialidad. Se prefieren para ensayar niveles de proteína MPIF-1 una muestra biológica técnicas basadas en anticuerpo. Por ejemplo, la expresión de proteína MPIF-1 en tejidos, puede ser estudiada por métodos inmunohistológicos clásicos. En estos, se proporciona el reconocimiento específico por el anticuerpo primario (policlonal o monoclonal) , pero el sistema de detección secundario puede utilizar fluorescente, enzima, u otros anticuerpos secundarios conjugados. Como resultado, se obtiene una tinción inmunohistológica de sección de tejido para examen patológico. También pueden extraerse tejidos, por ejemplo con urea y detergente neutro, para la liberación de proteína MPIF-1 para ensayo punto/ranura o Western blot (Jalkanen, M., y colaboradores, J. Cell . Biol . 101:976-985 (1985); Jalkanen, M., y colaboradores, J.

Cell . Biol . 105:3087-3096 (1987)). En esta técnica, que se basa en el uso de fases sólidas catiónicas, puede lograrse cuantificación de proteína MPIF-1 utilizando proteína MPIF-1 aislada como estándar. Esta técnica también puede aplicarse a fluidos corporales. Con estas muestras, una concentración molar de proteína MPIF-1 ayudará a establecer valores estándar de contenido de proteína MPIF-1 para diferentes fluidos corporales como suero, plasma, orina, fluido espinal, etc. La apariencia normal de cantidades de proteína MPIF-1 luego puede ajustarse utilizando valores para individuos sanos que pueden compararse con aquellos que se obtienen de un sujeto de prueba. Otros métodos basados en anticuerpo útiles para detectar expresión de gen MPIF-1 incluyen inmunoensayos, tales como el ensayo inmunosorbente enlazado por enzima (ELISA) y el radioinmunoensayo (RÍA) . Por ejemplo, anticuerpos monoclonales específicos de proteína MPIF-1 pueden utilizarse tanto como un inmunoabsorbente como una sonda etiquetada con enzima, para detectar y cuantificar la proteína MPIF-1. La cantidad de proteína en el MPIF-1 presente en una muestra puede calcularse por referencia a la cantidad presente en una preparación estándar utilizando un algoritmo de computadora con regresión lineal. En otro ensayo ELISA, pueden emplearse dos anticuerpos monoclonales específicos distintos para detectar proteína MPIF-1 en un fluido corporal. En este ensayo, uno de los anticuerpos se utiliza como el inmunoabsorbente y el otro como la sonda etiquetada con enzimas . Las técnicas anteriores pueden utilizarse esencialmente como un ensayo de "una etapa" o "dos etapas". El ensayo de "una etapa" involucra contactar proteína MPIF-1 con anticuerpo inmovilizado y sin lavar, contactar la mezcla con el anticuerpo etiquetado. El ensayo de "dos etapas" involucra lavar antes de contactar la mezcla con el anticuerpo etiquetado. Otros métodos convencionales también pueden emplearse como sea conveniente. Usualmente es conveniente el inmovilizar un componente del sistema de ensayo en un soporte, de esta manera permitiendo que se pongan en contacto otros componentes del sistema con el componente y se retiren fácilmente de la muestra. Etiquetas de enzima convenientes incluyen, por ejemplo aquellas del grupo oxidasa, que cataliza la producción de peróxido de hidrógeno al reaccionar con substrato. Glucosa oxidasa se prefiere particularmente, ya que tiene buena estabilidad y su substrato (glucosa) es fácilmente disponible. La afinidad de una etiqueta oxidasa puede ensayarse al medir la concentración de peróxido de hidrógeno formado por la reacción del substrato/anticuerpo etiquetado con enzima. Además de enzimas, otras etiquetas ' convenientes incluyen radioisótopos, tales como yodo (^1, 171I), carbón ( 1 C) , azufre f'S) , tritio (3H) , indio (112In) , y tecnecio (99mTc) , y etiquetas fluorescentes tales como , fluoresceína y rodamina, y biotina.

Los polipéptidos de la presente invención, y polinucleótidos que codifican estos polipéptidos, pueden ser empleados como reactivos de investigación para propósitos in vi tro relacionados a investigación científica, síntesis de ADN y fabricación' de vectores de ADN, y con el propósito de desarrollar agentes terapéuticos y de diagnóstico, para el tratamiento de enfermedades humanas. Por ejemplo, el MPIF-1 puede emplearse para la expansión de células progenitoras hematopoyéticas inmaduras, por ejemplo granulocitos, macrofágos o monocitos, al evitar temporalmente su diferenciación. Estas células de médula ósea pueden cultivarse in vi tro . Fragmentos del gen MPIF-1 de longitud íntegra pueden emplearse como una sonda de hibridización para una biblioteca ADNc, para aislar el gen de longitud íntegra o completa y para aislar otros genes que tienen una alta similaridad de secuencia al gen o actividad biológica similar. De preferencia, sin embargo las sondas tienen al menos 30 bases y pueden contener por ejemplo 50 o más bases. La sonda también puede utilizarse para identificar un clon de .ADNc correspondiente a una transcripción de longitud completa y un clon o clones genómicos que contienen genes completos incluyendo regiones exones, e intrones regulatorios y promotores.

Un ejemplo de un monitoreo que comprende aislar la región de codificación de los genes utilizando la secuencia ADN conocida para sintetizar una sonda oligonucleótido. Oligonucleótidos etiquetados que tienen una secuencia complementaria a la de los genes de la presente invención, se utilizan para clasificar una biblioteca de ADNc humano, ADN genómico o ARNm, para determinar que miembros de la biblioteca hibridizan la sonda. Esta invención también se relaciona al uso del gen MPIF-1 como parte de un ensayo de diagnóstico, para detectar enfermedades o susceptibilidad a enfermedades relacionadas a la presencia de mutaciones en la secuencias de ácido nucleico. Estas enfermedades se relacionan a sub-expresión de los quimosina polipéptidos. Individuos que transportan mutaciones en el gen MPIF-1 pueden detectarse al nivel ADN por una variedad de técnicas. Ácidos nucleicos para diagnóstico pueden obtenerse de las células de un paciente, tales como de la sangre, orina, saliva, biopsia de tejido y material de autopsia. ADN genómico pueden emplearse directamente para detección o puede amplificarse enzimáticamente al utilizar PCR (Saiki y colaboradores, Nature 324:163-166 (1986)) antes de análisis. ARN o ADNc también pueden emplearse con el mismo propósito. Como un ejemplo, cebadores de PCR complementarios al ácido nucleico que codifica MPIF-1 y pueden utilizarse para identificar y analizar MPIF-1 y mutaciones. Por ejemplo, eliminaciones e inserciones pueden detectarse por un cambio en tamaño del producto amplificado, en comparación con el genotipo normal. Mutaciones punto pueden identificarse al hibridizar ADN amplificado a ARN MPIF-1 radioetiquetado o en forma alterna secuencias ADN antisentido MPIF-1 radioetiquetado. Secuencias perfectamente apareadas, pueden distinguirse de duplexes apareados incorrectamente por digestión RNasa A o por diferencias en temperaturas de fusión. Pruebas genéticas con base en diferencias de secuencia de ADN pueden lograrse por detección de alteración en movilidad electroforética de fragmentos de ADN en geles con o sin agentes de desnaturalización. Eliminaciones e inserciones de secuencia pequeña pueden visualizarse por electroforésis en gel de alta resolución. Fragmentos de .ADN de diferentes secuencias pueden distinguirse al desnaturalizar genes de gradiente de formamida en donde las movilidades de diferentes fragmentos de .ADN se retardan en el gel a diferentes posiciones de acuerdo con sus temperaturas de fusión parcial o fusión específicas (ver por ejemplo Myers y colaboradores, Science 230:1242 (1985)).

Cambios de secuencia en sitios específicos también pueden revelarse por ensayos de protección de nucleasa, tales como RNasa y protección SI o el método de escisión química (por ejemplo Cotton y colaboradores, PNAS, USA 85:4397-4401 (1985)). De esta manera, la detección de una secuencia de .ADN específica puede lograrse por métodos tales como hibridización, protección de RNasa, escisión química, secuenciado de .ADN directo o . el uso ' de enzimas de restricción (por ejemplo polimorfismos de longitud de fragmento de restricción (RFLP = Restriction Fragment Length Polymorphisms) ) y Southern blot de .ADN genómico. Además de electroforésis en gel más convencional y secuenciado de ADN, también pueden detectarse mutaciones por análisis in si tu . La presente invención también se refiere a un ensayo de diagnóstico para detectar niveles alterados de proteína MPIF-1 en diversos tejidos ya que una sobre-expresión de las proteínas comparada con muestras de tejido de control normal, puede detectar la presencia de una enfermedad o susceptibilidad a una enfermedad, por ejemplo un tumor. Ensayos empleados para detectar niveles de proteína MPIF-1 en una muestra derivada de un huésped, son bien conocidos por aquellos con destreza en la especialidad e incluyen radio inmunoensayos, ensayos de enlace competitivo, análisis Western blot, ensayos ELISA y ensayo de "emparedado" (sandwich) . Un ensayo ELISA (Coligan, y colaboradores, Current Protocols in Immunology (Protocolos actuales en inmunología 1 (2) ) 1(2), Capitulo 6, (1991)) inicialmente comprende preparar un anticuerpo específico a los antígenos MPIF-1, de preferencia un anticuerpo monoclonal. Además, un anticuerpo reportero se prepara contra el anticuerpo monoclonal . Al anticuerpo reportero se conecta un reactivo detectable tal como radioactividad, radiofluorescencia o en este ejemplo ,una enzima de peroxidasa de rábano. Una muestra se retira de un huésped e incuba en un soporte sólido, por ejemplo un plato de poliestireno, que liga la proteína en la muestra. Cualesquiera sitios de unión de proteína libre en el plato luego se cubren al incubar con una proteína no específica como BSA. A continuación, el anticuerpo monoclonal se incuba en el plato, durante cuyo tiempo los anticuerpos monoclonales se conectan a cualesquiera proteína MPIF-1 conectadas al plato de poliestireno. Todo el anticuerpo monoclonal no ligado se lava por arrastre con amortiguador. El anticuerpo reportero enlazado a peroxidasa de rábano ahora se coloca en el plato resultando en unión del anticuerpo reportero a cualquier anticuerpo monoclonal ligado a MPIF-1. .Anticuerpo reportero no conectado luego se lava por arrastre. Substratos de peroxidasa luego se agregan al plato y la cantidad de color desarrollado en un periodo de tiempo determinado, es una medida en la cantidad de proteína MPIF-1 presente en un volumen determinado de muestra de paciente, cuando se compara contra una curva estándar. Un ensayo de competencia puede emplearse, en donde anticuerpos específicos a MPIF-1 se conectan a un soporte sólido y el MPIF etiquetado y una muestra derivada del huésped, se pasan sobre el soporte sólido y la cantidad de etiqueta detectada como por ejemplo por cromatografía de destelleo de líquido, pueden correlacionarse a una cantidad de proteína en la muestra. Un ensayo "emparedado" es similar a un ensayo ELISA. En un ensayo "emparedado" MPIF-1 se pasa sobre un soporte sólido y liga a anticuerpo conectado a un soporte sólido. Un segundo anticuerpo luego se liga al MPIF-1. Un tercer anticuerpo que es etiquetado y específico al segundo anticuerpo luego se pasa sobre el soporte sólido y liga al segundo anticuerpo y una cantidad luego puede cuantificarse. Esta invención proporciona un método para identificación de los receptores para ' los quimosina polipéptidos. El gen que codifica el receptor puede. identificarse por numerosos métodos conocidos por aquellos con destreza en la especialidad, por ejemplo toma panorámica de ligando y clasificación FACS (Coligan, y colaboradores, Current Protocols in Immun . 1(2), Capitulo 5, (1991)) . De preferencia, clonación de expresión se emplea en donde el ,ARN de poliadenilación se prepara a partir de una célula que responde a los polipéptidos y una biblioteca .ADNc creada de ese ARN se divide en grupos, y usa para transf ctai células COS u otras células que no responden a los polipéptidos. Células transfectadas que se desarrollan en porta objetos se exponen a los polipéptidos etiquetados. Los polipéptidos pueden ser etiquetados por una variedad de medios incluyendo yodación o inclusión de un sitio de reconocimiento para una proteína cinasa específica de sitio. Después de fijación e incubación, los porta objetos se someten a análisis autoradiográficos . Grupos positivos se identifican y se prepararán sub-grupos y retransfectan utilizando un proceso de formación de sub-grupos y re-monitoreo interactivo, y eventualmente produciendo clones sencillos que codifican el receptor putativo. Como un enfoque alterno para identificación de receptor, los polipéptidos etiquetados pueden enlazarse por fotoafinidad con membrana celular o preparaciones de extracto que expresan la molécula receptora. Material entrelazado se resuelve por análisis PAGE y expone a película de rayos X. El complejo etiquetado que contiene los receptores de los polipéptidos puede ser cortado, resuelto en fragmentos de péptido, y sometido a icrosecuenciado de proteínas . La secuencia de amino ácidos obtenida de microsecuenciado - se utilizará para diseñar un conjunto de sondas oligonucleótido degeneradas para clasificar una biblioteca de ADNc para identificar los genes que codifican los receptores putativos. Terapéutica . Polipéptidos de la presente invención pueden ser utilizados en " una variedad de funciones inmunoreguladoras e inflamatorias y también en una cantidad de condiciones de enfermedad. MPIF-1 está en la familia quimosina y por lo tanto es un quimoatrayente _ para leucocitos (tales como monocitos, neutrófilos, linfocitos T, eosinófilos, basófilos, etc.). .Análisis Northern blot muestran que MPIF-1 se expresa predominantemente en tejidos de origen hemopoyetico . Aplicaciones de diagnóstico/Terapéuticas MPIF-1 . MPIF-1 se muestra que juega un papel importante en la regulación de la inmuno respuesta e inflamación.

En la Figura 13, se muestra que lipopolisacarido inducen la expresión de MPIF-1 de monocitos humanos. De acuerdo con esto, en respuesta a la presencia de una endotoxina, MPIF-1 se expresa de monocitos y por lo tanto puede emplearse la administración de MPIF-1 para regular la innmuno respuesta de un huésped MPIF-1. MPIF-1 puede utilizarse como un agente anti-inflamatorio. Como se ilustra en la Figura 4, la actividad quimoatrayente de MPIF-1 en células THP-1 (A) y PBMCs (B) es significante. MPIF-1 también induce significante movilización de calcio en células THP-1 (Figura 5) , mostrando que MPIF-1 tiene un efecto biológico en monocitos. Además, MPIF-1 produce una respuesta de movilización de calcio y quimiotáctica dependiente de dosis en monocitos humanos. Además, los polipéptidos de la presente invención pueden ser útiles en terapia antitumor, ya que evidencia de que células que expresan quimosina en mitad de tumores, han provocado regresión de tumor, por ejemplo en el tratamiento de sarcoma de Kaposi. MPIF-1 puede inducir células para secretar TNF-, que es un agente conocido para regresión de tumores, en -cuyo caso esta proteína puede utilizarse para inducir regresión de tumor. MPIF-1 también puede inducir que monocitos humanos secreten otros agentes inhibidores de tumor y cáncer tales como IL-6, IL-1 y G-CSF. También, MPIF-1, y estimula la invasión y activación de células defensa huésped (tumoricida) , por ejemplo células T citotóxicas y macrofagos por su actividad quimiotáctica, y de esta manera también puede utilizarse para tratar tumores sólidos . Mieloprotección . Los polipéptidos también pueden emplearse para inhibir la prolif ración y diferenciación de células hematopoyéticas, por lo tanto pueden emplearse para proteger células básales de médula ósea contra agentes quimoterapéuticos durante quimoterapia . Las Figuras 6 y 7 ilustran que MPIF-1 que inhibe formación de colonia por células formadoras de colonia potenciales bajas proliferativas (LPP-CFC = Low Proliferative Potential Colony Forming Cells) . La Figura 8 ilustra que M-CIF . específicamente inhibe formación de colonias estimuladas por M-CSF, mientras que MPIF-l no. Ya que MPTF-1 inhibe significativamente el crecimiento y/o diferenciación de células de médula ósea, este efecto antiproliferativo puede permitir administración de dosis superior de agentes quimioterapéuticos y por lo tanto tratamiento quimioterapéutico más efectivo. El efecto inhibitorio de polipéptidos MPIF-1 en la sub-población de células progenitoras comprometidas, (por ejemplo granulocito, y células de macrófago/monocito) pueden emplearse terapéuticamente para inhibir proliferación de células de leucemia. Además, los inventores han encontrado que MPIF-1, y sus variantes (por ejemplo, MPIF-1 23), inhiben proliferación ín vi tro y diferenciación de precursores de granulocito y mieloide humano. Similarmente, estudios en animales han mostrado que MPIF-1 23, por ejemplo, específicamente inhibe el desarrollo de células formadoras de colonia de potencial proliferativo bajo (LPP-CFCs) y progenitores comprometidos de monocito/granulocito tanto in vi tro como ín vivo . Estos hallazgos indican que MPIF-1 tiene aplicación terapéutica como un agente quimioprotector que puede salvar a los anteriores progenitores mieloide contra los efectos citotóxicos de las drogas quimioterapéuticas comúnmente empleadas . Debido a que MPIF-1, y sus variantes, tienen la capacidad por inhibir selectivamente células progenitoras mieloide, MPIF-1 puede emplearse para tratar desordenes mieloproliferativos tales como trombocitosis esencial (ET = Essential Trombocytosis) , policitemia vera (PV) , o metapolasia mieloide agnogénica (AMM = Agnogenic Myeloid Metaplasia) , que están clínicamente relacionadas muy cerca. Cada desorden resulta de una mutación adquirida de una sola célula basal hematopoyética que da a la progenie de esa célula basal una ventaja de crecimiento. La patofisiología de estos desordenes es distinta ya que hay una sobre producción de diferentes tipos de células. En PV, hay una sobreproducción dé eritrocitos, granulocitos, y megacariocitos . En ET, por definición sobreproducción de plaquetas así como leucocitos . .AMM también muestra trombocitosis o leucocitosis además de fibrosis de médula ósea. La estabilización de pacientes PV puede atenderse al retirar glóbulos rojos por flebotomía. Sin embargo, no hay terapia comparable para niveles de plaquetas elevados en pacientes ET. Se han estudiado varias terapias mielosupresoras para reducir el riesgo de trombocitosis. El tratamiento con fósforo radioactivo, hidroxiurea, agentes alquilantes (busulfan clorambucil) , interferonas, o anagrelide todos han mostrado efectos secundarios significantes. En particular, hay un riesgo incrementado de leucemia aguda con cada terapia mielosupresiva excepto anagrelide. Anagrelide es una terapia promisora. Sin embargo, reacciones adversas a anagrelide son de consideración y su potencial de toxicidad crónica no se ha establecido. 'interferonas en la actualidad se consideran terapia de segunda línea debido al costo, efecto secundarios y la inconveniencia de administración parenteral. Estos hallazgos indican que todavía hay necesidad substancial por terapia en estas enfermedades . Estudios in vivo en ratones pre-tratados con MPIF-1 23 y luego tratados con 5-FU demuestran una inhibición de proliferación de células progenitoras de plaquetas . La presente invención 'además abarca el uso de MPIF-1, y sus variantes, en combinación con otras terapias y agentes mielosupresivos . En las Figuras. 9, 10 y' 11, las células comprometidas de los linajes celulares utilizados, se retiraron y la población resultante de células se contacta con M-CIF o MPIF-1. M-CIF provoca un decremento en la población positiva Mac-1 de células casi en 50%, que es consistente con los resultados de la Figura 8, que muestra que M-CIF induce inhibición de células formadoras de colonia que responden a M-CSF. MPIF-1 como se ilustra en la Figura 11, inhibe la capacidad de células progenitoras comprometidas para formar colonias en respuesta a IL-3, GM-CSF y M-CSF. Además, como se ilustra en la Figura 12, una respuesta de dosis de MPIF-1 se ilustra que inhibe formación de colonias. Esta inhibición puede deberse a un bloqueo especial de la señal diferenciadora mediada por estos factores o a un efecto citotóxico en las células progenitoras. Además, los ejemplos 9 y 10 demuestran que MPIF-1 tiene actividad de mieloprotección in vi tro e in vivo contra citotoxicidad de drogas quimoterapéuticas . De esta manera, MPIF-1 puede ser útil como un mieloprotector para pacientes que se someten a quimioterapia. Como se notó anteriormente, una complicación principal que resulta de quimioterapia y terapia de radiación, es la destrucción de tipos de células no patológicas. La presente invención proporciona métodos para mieloprotección contra . radiación y agentes quimioterapéuticos al suprimir la proliferación de células mieloide en un individuo. Estos métodos involucran la administración de una cantidad mielosupresora de MPIF-1, ya que solo o junto con una o más quimosinas seleccionadas del grupo que consiste de proteína inflamatoria de macrófago-1 (MIP-1) , proteína inflamatoria de macrófago-2 (MIP-2), factor de plaquetas 4 (pF4), Interleucina-8 (IL-8), factor quimotáctico y de activación de macrófago (MCAF) , .y proteína relacionada a proteína inflamatoria de macrófago-2 (MRP-2) a un individuo como parte de un tratamiento de radiación o régimen quimioterapéutico. Las composiciones mielosupresoras de la presente invención de esta manera proporcionan efectos mieloprotectores y son útiles en conjunto con terapias que tienen efecto adverso en células mieloide. Esto es debido a que las composiciones mielosupresoras de la presente invención colocan a las células mieloide en un estado de ciclado lento, de esta manera proporcionando protección contra daño celular provocado por ejemplo terapia _ de radiación o quimioterapia utilizando drogas activas de cicio celular tales como citosina, arabinosida, hidroxiurea, 5-Fu y Ara-C. Una vez que la droga quimioterapéutica ha librado el sistema del individuo, sería conveniente el estimular la amplificación y diferenciación rápida de células progenitoras que estaban protegidas por MPIF-1 utilizando por ejemplo mieloestimulantes , tales como Interleucina-11 (IL-11) , eritropoyetina (EPO) , GM-CSF, G-CSF, factor de célula basal (SCF) , y trombopoyetina. (Tpo) . La capacidad de MPIF-1 para conferir mieloprotección in vivo en la presencia de un agente quimioterapéutico se muestra en el Ejemplo 13. El Ejemplo 13 muestra que la administración de MPIF-1 a un individuo antes de la administración del agente quimoterapéutico acelera la recuperación de plaquetas en la sangre e incluso después de múltiples ciclos de tratamiento 5-Fu. Los experimentos establecidos en el Ejemplo 13 también demuestran que el tratamiento MPIF-1 durante ciclos múltiples de tratamiento 5-Fu, resulta en más rápida recuperación de granulocitos. Además, los resultados del Experimento 13, también sugieren que MPIF-1 y G-CSF ejercen efectos aditivos cuando se co-administran. Como se indicó, los inventores han encontrado que MPIF-1, y sus variantes , exhiben potente supresión in vi tro de células formadoras de colonia de bajo potencial de proliferación (LPP-CFCs) para médula ósea. LPP-CFCs son progenitores hematopoyéticos bipotenciales que dan lugar a linajes de granulocitos y monocitos. MPIF-1 tambiém inhibe en forma reversible lá formación de colonia por células CD34+ humanas derivadas de células formadoras de colonia de granulocitos y monocitos. Los experimentos quimioprotectores in vi tro de los inventores han mostrado protección de esos progenitores hematopoyéticos por MPIF-1 23 contra los efectos citotóxicos de las drogas 5-fluorouracilo (5-Fu) , citosina arabinósido, y TaxolMB. El uso de una variante MPIF-1 (23) en un modelo quimoterapéutico in vivo han mostrado que produce una recuperación más rápida tanto de células progenitoras de médula ósea como poblaciones celulares periféricas de neutrófilos y plaquetas. Además, como se ilustra en los Ejemplos 10 y 13, la administración de MPIF-1 resulta en la recuperación acelerada de neutropenia y trombocitopenia en animales experimentales tratados con 5-Fu. De esta manera, MPIF-1, y sus variantes acortan el periodo de aplasia de médula ósea, granulopenia, y trombocitopenia asociadas con los agentes quimioterapéuticos y de esta manera reducen la probabilidad de infección en pacientes que se someten a tratamientos con estos agentes. De esta manera, la invención se refiere a métodos para proteger células progenitoras mieloide y para acelerar la recuperación de plaquetas y granulocitos, que comprenden la administración de MPIF-1 a un individuo que se somete a terapia que de preferencia extermina las células de inhibición (por ejemplo, terapia de radiación o tratamiento con una droga activa de ciclo celular) . MPIF-1 se administra en cantidad suficiente para proporcionar mieloprotección in vivo contra tratamientos y agentes que de preferencia exterminan células divisoras. Por "MPIF-1 se administra" se entiende que MPIF-1, un análogo de MPIF-1, o su combinación se administran en una cantidad terapéuticamente efectiva. Modos de administración de MPIF-1 se discuten en detalle a continuación.

MPIF-1 puede administrarse antes de, después o durante la terapia en donde de preferencia se determinan células divisoras. En una modalidad preferida, se administra MPIF-1 antes de terapias de radiación o administración de una droga activa de ciclo celular y se permite tiempo suficiente para que MPIF-1 suprima la proliferación de células mieloide. Además se contempla por la presente invención el uso se MPIF-1 para proteger células mieloide durante múltiples vueltas de terapia en donde de preferencia se exterminan célula' divisoras. En este caso, MPIF-1 puede administrarse ya sea en una sola dosis o múltiples dosis en diferentes puntos en tiempo en el régimen de tratamiento o terapia. Como se indicó anteriormente, MPIF-1 solo o en conjunto con uno o más mieloestimuladores . Los mieloestimuladores actualmente se emplean en la técnica para estimular la proliferación de células mieloide después de su agotamiento en una terapia o tratamiento de radiación al que se somete el individuo' con una droga activa de filtro celular. Ver por ejemplo Kannan, V. y colaboradores, Int . J. Radiat . Oncol . Biol . Phys . 37:1005-1010 (1997); Engelhardt, M. y colaboradores, Bone Marrow Transplant 19:529-537 (1997); Vadhan-Raj , S. y colaboradores, Ann In tern Med. 126:673-681 (1997); Harker, L. y colaboradores, , Blood 89:155-165 (1997); Basser, R, y colaboradores, Lancet 348:1279-1281 (1996); Grossman, A. y colaboradores, Blood 88:3363-3370 (1996); Gordon, M. y colaboradores, Blood 87:3615-3624 (1996). MPIF-1 por ejemplo puede administrarse antes de terapia que determina células divisoras y uno o más mieloestimuladores se administran después o durante el curso de su terapia. En este caso, MPIF-1 protegerá células mieloide de la terapia y' administración del o los mieloestimuladores luego resultará en expansión de la población de células mieloide protegidas . Los mieloestimuladores típicamente se administran a pacientes que se someten a tratamiento con un agente quimioterapéutico ~ en cantidades terapéuticamente efectivas. Formulación de dosis y modo de administración puede variar con una cantidad de factores incluyendo al individuo tratado, la condición de las células que se estimulan, lá etapa de tratamiento en el régimen quimioterapéutico y el o los mieloestimuladores empleados. GM-GSF y G-CSF, por ejemplo, son efectivos terapéuticamente a dosis de aproximadamente l/kg y 5 a 10/kg de peso corporal, respectivamente y pueden administrase diariamente por inyección subcutánea. Ver, por ejemplo, Kannan, V. y colaboradores, Int . J. Radia t . Oncol . Biol . Phys . 37: 1005-1010 (1997) ,- Engelhardt, M. y colaboradores , Bone Marrow Transplant 19:529-537 (1997); Sniecinski, I y colaboradores, Blood 89: 1521-1528 (1997). IL-11 puede administrarse por inyección subcutánea diaria a un rango de dosis de hasta 100/kg de peso corporal. Gordon, M. et al . , arriba . Dosis de IL- 11 por debajo de 10/kilogramo, sin embargo se considerarán efectivas para reducir trombocitopenia inducida por quimioterapia. Tpo puede administrarse por inyección intravenosa a un rango de dosis de 0.3 a 2.5 g/kilogramo de peso corporal. Ver por ejemplo, Vadhan-Raj , S. et al . , Ann . Intern . Med. 126:673-681 (1997); Harker, L. et al . , Blood 89:155-165 (1997) . Como reconocerá una persona con destreza en la especialidad, la formulación de dosis es óptima y el modo de administración variará, con una cantidad de factores incluyendo aquellos anteriormente anotados . La formulación de dosis y modo de administración para adicionales mieloestimuladores, se conocen en la técnica. La sincronización de administración de mieloestimuladores como parte del protocolo de tratamiento que involucra terapia que de preferencia extermina células divisoras, también puede variar con los factores anteriormente descritos para formulación de dosis y modo de administración. Se ha publicado una cantidad de reportes que describen la administración de míeloestimuladores a individuos como parte de protocolo de tratamiento que involucran terapia de radiación o drogas activas de ciclo celular. Vadhan-Raj, S., y colaboradores arriba, por ejemplo reportan el uso de una sola dosis intravenosa de Tpo tres semanas antes de la administración de un agente quimioterapéutico. Papadimitrou, C. y colaboradores Cáncer 79:2391-2395 (1997) and Whiteheadj R. y colaboradores J. Clin . Oncol . 15:2414-2419 (1997) reportan métodos de tratamiento quimioterapéutico que involucran la administración de agentes quimioterapéuticos en el curso de varias semanas. En cada uno de estos casos, dosis de G-GSF se administran en múltiples puntos en tiempo después del primer día y antes del último día de tratamiento con el agente quimioterapéutico. Uso similar tanto de IL-11 como GM-CSF se reporta en Gordon, M. y colaboradores arriba , y Michael, M. , y colaboradores Am . J. Clin. Oncol . 20:259-262 (1997). Una persona con destreza en la especialidad reconocerá sin embargo que la sincronización óptima de la administración de mieloestimuladores variará con los mieloestimuladores particulares empleados y las condiciones bajo las cuales se administran. De esta manera, la administración de mieloestimuladores para aliviar efecto citotóxicos con terapias que exterminan preferencialmente células divisoras tienen en células de mieloide, se conoce en la técnica. Los mieloestimuladores pueden administrarse por varias rutas, incluyendo inyección intravenosa y subcutánea. Las concentraciones de mieloestimuladores administrados variarán ampliamente con numerosos factores pero en general estarán en el rango de 0.1 a 100 g/kilogramo de peso corporal y pueden administrarse en una sola dosis o en múltiples dosis en diversos puntos en tiempo en el régimen de tratamiento radiológico o quimoterapéutico. En general se administran mieloestimuladores, sin embargo antes de o después de administración del agente quimioterapéutico o tratamiento radiológico. Como comprenderá un persona con destreza en la técnica, las condiciones bajo las cuales se utilizan los mieloestimuladores se emplean variarán tanto con el mieloestimulador particular como con el régimen de tratamiento. Como una persona con destreza en la especialidad apreciará, MPIF-1 puede emplearse como se describió anteriormente para mejorar la efectividad de los factores de crecimiento hematopoyético en general. Estos factores de crecimiento hematopoyético incluyen eritropoyetina, que estimula la producción de eritrocitos. Y IL-3, un factor de crecimiento de multilinaje estimula células básales más primitivas, de esta manera incrementando el número de todos los tipos de células de sangre. Otros incluyen factor de célula basal; GM-CSF; y de moléculas híbridas de G-CSF y eritropoietina; IL-3 y SCF; y GM-CSF y G-CSF. Las composiciones farmacéuticas mielosupresoras de la presente invención también son útiles en el tratamiento de leucemia, que provoca un estado celular mieloide hiperproliferativo. De esta manera, la invención además proporciona métodos para tratar leucemia, que involucran administrar a un paciente de leucemia una cantidad mielosupresora de MPIF-1, ya sea solo o junto con una o más quimosinas seleccionadas de MIP-1, MIP-2, PF4 , IL-8, MCAF, y MRP-2. Por "suprimir proliferación de célula mieloide" se pretende disminuir la proliferación celular de células mieloide y/o incrementar el por ciento de células mieloide en la fase de ciclo lento. Como con anterioridad, por "individuo" se pretenden animales mamíferos, de preferencia humanos. Preincubación de las composiciones mielosupresoras de la presente invención con acetonitrilo ACN) mejora significativamente la actividad específica de estas quimosinas para supresión de células progenitoras mieloide. De esta manera, de preferencia antes de administración, las composiciones mielosupresoras de la presente invención se pre-tratan con ACN como se describe por Broxmeyer H. E., y colaboradores Ann- Hematol . 71 (5) : 235-46 (1995) y la Publicación PCT WO 94/13321, todas las descripciones de las cuales aquí se incorporan por referencia. Las composiciones mielosupresoras de la presente invención pueden emplearse en combinación con una variedad de agentes quimioterapéuticos incluyendo agentes alquilantes tales como mostazas de nitrógeno, etileniminas, metilmelaminas, alquil sulfonatos, nitrosuoureas, y triazenos; antimetabolitos tales como análogos de ácido fólico, análogos de pirimidina; en particular fluorouracilo y citosina arabinosida, y análogos de purina; productos naturales tales como vinca alcaloides, epipodofilotoxinas, antibióticos, enzimas y modificadores de respuesta biológica;- y productos misceláneos tales como complejos de coordinación de platino, antracendiona, urea substituida tal como hidroxiurea, derivados de metil hidrazina, y supresor adrenocorticoide .

Agentes quimioterapéuticos pueden ser administrados a concentraciones conocidas de acuerdo con técnicas conocidas, . Las composiciones míelosupresoras de la presente invención pueden ser co-administradas con un agente quimioterapéutico o administrar por separado, ya sea antes o después de administración quimioterapéutica. Ciertas quimosinas tales como MlP-lß, MIP-2ß y GRO-, inhiben (al menos bloquean parcialmente) los efectos supresores mieloide de las composiciones mileosupresoras de la presente invención. De esta manera, en una modalidad adicional, la invención proporciona métodos para inhibir mielosupresión, que involucra administrar una cantidad efectiva de un inhibidor mielosupresor seleccionado del grupo que consiste de MlP-lß, MIP-2ß y GRO- a un mamífero previamente expuesto al agente mielosupresor MPIF-1 ya sea solo o junto con uno o más de MIP-1, MIP-2, PF4 , IL-8, MCAF, y MRP-2. Protección Contra Daño Inducido por Agentes Ci totóxicos . Los polipéptidos de la presente invención también pueden ser empleados para reducir o evitar lesión/daño inducido por agentes citotóxicos, a células, tej idos y órganos . Daño a tej ido normal ocurre como una consecuencia de exposición a agentes citotóxicos.

Agentes citotóxicos incluyen radiación y quimioterapéuticas. La radiación puede ser accidental, ambiental, ocupacional, de diagnóstico, y exposición terapéutica para radiación. Daño de tejido normal también es por un efecto secundario común del tratamiento de cáncer tal como radioterapia, quimioterapia y combinación de radioterapia y quimioterapia. Este daño a tejido normal comúnmente es referido como "efectos" de tejido normal, "toxicidad" de tejido, "morbidez" "complicaciones" y "reacciones" de tejido (agudas, subagudas o tardías) . De esta manera, la presente invención proporciona composiciones y métodos para tratar y evitar daño a tejido normal provocado por radiación, terapia de radiación, quimioterapia y otros agentes citotóxicos. Toxicidad de tejido normal, especialmente toxicidad aguda (es decir, que ocurre dentro de días o semanas de tratamiento) provoca dolor y lleva adicionales complicaciones tales como infección. Aún más, la toxicidad aguda limita la dosis de agente terapéutico de cáncer, de esta manera comprometiendo el tratamiento de cáncer efectivo. Adicionalmente, aún cuando los efectos tóxicos tempranos son sub-clínicos (es decir, no provocan morbidez y no son limitantes de dosis) , pueden conducir a efectos tardíos (también conocidos como crónicos) ( es decir, que ocurren meses o años después de tratamiento) .

Los efectos tardíos incluyen, por ejemplo esterilidad, necrosis y fibrosis de inicio tardío o posterior, y cáncer inducido por nitrógeno. La presente invención proporciona composiciones y métodos para tratar y evitar toxicidad de tejido aguda, sub-aguda y normal tardía. Están involucradas varias rutas en daño inducido por agentes citotóxico, tal como inducido por radiación y de quimioterapia a células normales y tejido. El daño puede ser directo o indirecto. • Daños directo resulta por la acción del agente citotóxico en constituyentes de las células e incluye rupturas de hebra sencilla y hebra doble en cromosomas, y daño a las membranas celulares y otros componentes de célula por especies de oxígeno reactivo y radicales libres. Daño indirecto- resulta por eventos corriente abajo de la acción inicial del agente citotóxico. Estos eventos corriente abajo incluyen liberación de radicales libres por células o tejido necrótico, lesión vascular, inmunorespuestas normales y respuestas inflamatorias. Los polipéptidos y polinucleótidos de la presente invención tratan y evitan daño a células, tejidos y órganos inducido por agente citotóxico al modular al menos una de las rutas directas o indirectas anteriores . El daño puede ser provocado por agotamiento de células potencialmente mitóticas (conocido como modelo de célula basal) ; lesión vascular que provoca hipoxia y otros efectos; respuestas de reparación de huésped normal incluyendo inducción de genes tempranos inmediatos tales como jun y EGR1 , inducción de citosinas proinflamatorias tales como interleucinas y TNF, inducción de citosinas inflamatorias tales como TGF, PDGF, BFGF, e inducción of de una o varias cascadas de citosinas secundarias; efectos de respuestas inflamatorias; interacciones entre tipos de múltiples células tales como células inflamatorias, células funcionales estromales y fibroblastos. Los polipéptidos y polinucleótidos de la presente invención modulan al menos una de las causas anteriores de daño . Puede inducirse fibrosis en una o más vías : monocitos y macrófagos presentes en el tejido irradiado se induce que produzcan citosinas proinflamatorias, de esta manera reclutando macrófagos adicionales en una respuesta inflamatoria; la pérdida inicial de células epiteliales y estromales induce inflamación; irradiación induce expresión de citosinas fibrogenícas a través de una inducción de AP-1. Los polipéptidos y polinucleótidos de la presente invención modulan al* menos una de las rutas que llevan a fibrosis. Las células responden a radiación y otros agentes citotóxicos en varias' formas : formación de ceramida de esfingomielina de membrana activa la ruta JNK y lleva a apoptosis, marcada por la formación de cuerpo apoptósico; apoptosis inducida por otra ruta; muerte enlazada por mitosis, marcada por la formación de micronúcleos (MN) ; y senescencia inducida por citotoxina, en donde las células son metabólicamente activas pero incapaces de dividir. Los polipéptidos y polinucleótidos de la presente invención modulan al menos una de las anteriores respuestas celulares a radiación y otros agentes citotóxicos . Agentes, tales como el polipéptido de la presente invención, que modulan toxicidades de tejido normal, se refieren como modificadores clínicos, protectores de toxicidad, agentes protectores, citoprotectores y agentes de rescate. Estos agentes son útiles para reducir o evitar los efectos secundarios de terapia de cáncer y para evitar o tratar daño de tejido contra exposición a radiación. Como se emplea aquí, el término agente citotóxico se refiere a agentes quimioterapéuticos (también conocidos como agentes antineoplásticos) y radiación tal como radiación accidental, radiación ocupacional, radiación ambiental, radiación, terapéutica, incluyendo, por ejemplo, radioterapia fraccionada, radioterapia no fraccionada, y radioterapia hiperfraccionada, y radiación y quimioterapia en combinación. Tipos de radiación también incluyen radiación ionizante, (gamma) radiación de partículas, transmisión de baja energía (LET = low energy transmission) , transmisión de alta energía (HET = high energy transmission) , radiación ultravioleta, radiación infrarroja, luz visible, y radiación fotosensibilizante . Agentes citotóxicos incluyen agentes que de preferencia exterminan células neoplásticas o rompen el ciclo celular de células rápidamente proliferantes, e incluyen agentes empleados terapéuticamente para evitar o reducir el crecimiento de células neoplásticas. Agentes quimiterapéuticos también se conocen como drogas antineoplásticas, y son también conocidos en la especialidad. Como se discutió aquí, quimioterapia incluye tratamiento con un solo agente quimioterapéutico o con una combinación de agentes. En un sujeto que recibe tratamiento, la quimioterapia puede combinarse con tratamiento quirúrgico o terapia de radiación, o con otras modalidades de tratamiento antineoplástico. La radiación también incluye radiación ionizante, que es la radiación de alta energía, tal como rayos X o un rayo gamma, se interactúa para producir pares de iones en la materia, y radiación de transferencia de alta energía lineal, y radiación de transferencia de baja energía lineal, rayos alfa, rayos beta, haces de neutrones, haces de electrones acelerados y rayos ultravioleta. La radiación también incluye neutrones de espectro de escisión y fotones. Los polipéptidos y ' polinucleótidos de la presente invención protegen células y tejidos normales contra los efectos de agentes citotóxicos tales como radiación y quimioterapéutica, aquí descritos. Agentes quimioterapéuticos ejemplares son vinca alcaloides, epipodofilotoxinas, antibióticos de antraciclina, actinomicina D, plicamicina, puromicina, gramicídina D, paclitaxel (TaxolMR, Bristol Myers Squibb) , colchicina, citochalasina B, emetina, maitansina, y amsacrina (o "mAMSA"). La cl se vinca alcaloide se describe en Goodman and Gilman ' s The Pharmacological Basis of Therapeu tics (La base farmacológica de terapéutica) (7a. ed.), (1985), pp . 1277-1280. Ejemplares de vinca alcaloides son vincristina, vinblastina, y vindesina. La clase epipodofillotoxina se describe en Goodman and Gilman ' s The Pharmacological Basis of Therapeutics ( l > ed.), (1985), pp . 1280-1281. Ejemplares de epipodofilotoxinas son etopósido, etopósido ortoquinona, y tenipósido. La clase antibiótico antraciclina se describe en Goodman and Gilman ' s The Pharmacological Basis of Therapeutics (7a ed. ) , (1985), pp . 1283-1285. Ejemplares de of antibiótico antraciclina son daunorubicina, doxorubicina, mitoxantraona, y bisanthreno. Actinomicina D, también denominada Dactinomicina, se describe en Goodmand and Gilman ' s The Pharmacological Basis of Therapeutics ( Ia ed.), (1985), pp . 1281-1283. Plicamicina, también denominado mitramicina, se describe, eri Goodmand and Gilman ' s The Pharmacological Basis of Therapeu tics (7a ed.), (1985), pp . 1287-1288. Agentes qumioterapéuticos adicionales incluyen cisplatina (PlatiholMR) , Bristol Myers Squibb) , carboplatina (ParaplatinR) , Bristol Myers Squibb) , mitomicina (MutamycinMR, Bristol Myers Squibb) , altretamina (HexalenMR, U.S. Bioscience, Inc.), ciclofosfamida (CytoxanMR, Bristol Myers Squibb) , lomustina (CCNU) (CeeNU*", Bristol Myers Squibb) , carmustína (BCNU) (BiCNUMR, Bristol Myers Squibb) . Agentes terapéuticos adicionales pueden administrarse en combinación con polinucleótidos y polipéptidos de la invención también incluyen aclacinomicina A, aclarubicina, acroni?a, acronicina, adriamicina, aldesleucina (interleucina-2) , altretamina (hexamietilmelamina) , aminoglutetimida, aminoglutetimida (citadren) , aminoimidazol carboxamida, amsacrina (m-.AMSA; amsidina) , anastrazol (arimidex) , ancitabina, antracilina, antramicina, asparaginasa (elspar) , azacitdina, azacitidina (ladacamicina) , azaguanina, azaserina, azauridina, 1, 1 ' , 1 ' ' -fosfinotpioilidinetris a z i r i d i n a , a z i r i n o ( 2 ' , 3 ' : 3,4)pirrol (1, 2-a) indol-4, 7-diona, BCG (teracis) , BCNU, BCNU cloroetil nitrosoureas, benzamida, ácido 4- (bis (2-cloroetil) amino) benzenbutanoico, bicalutamida, biscloroetil nitrosourea, bleomicina, bleomicina (blenozan) , bleomicinas, bromodeoxiuridina, broxuridina, busulfano (myleran) , etil éster de ácido carbámico, carboplatina, carboplatina (paraplatina) , carmustina, carmustina (BCNU; BiCNU) , clorambucil (leuqueran) , cloroetil nitrosoureas, corozotocina (DCNU) , cromomicina A3 , ácido cis-retinoide, cisplatina (cis-ddpl; platinol), cladribina (2-clorodeoxiadenosina; 2cda; leustatina) , coformicina, cicloleucina, ciclofosfamida, ciclofosfamida anhidra, clorambucil, citarabina, citarabina, citarabina H c l ( c i t o s a r - u ) , 2 - d e o x i - 2 - ( ( (metilnitrosoamino) carbonil) amino) -D-glucosa, dacarbazina, dactinomicina (cosmegen) , daunorubicina, Daunorubincina HCl (cerubidina) , decarbazine, decarbazine (DTIC-dome) , demecolcina, dexametasona, dianhidrogalactitol, diazooxonorleucina, dietilstilbestrol , docetaxel (taxotere), doxorubicina HCl (adriamicina) , hidrocloruro de doxorubicina, eflornitina, estramustina, estramustina fosfato sodio (emcyt) , aceite etiodizado, etoglucida, etil carbamato, etil metanesulfonato, etoposido (VP16-213), fenretinida, floxuridina, floxuridina (fudr) , fludarabina (fludara) , fluorouracilo (5-FU) , fluoximesterona (halotestina) , flutamida, flutamida (eulexina) , fluxuridina, nitrato de galio (granite) , gemcitabina (gemzar) , genisteina, 2-deoxi-2- ( 3 -metil - 3 -nitrosoureido) -D-,glucopiranosa, goserelina (zoladex) , hexestrol, hidroxiurea (hydra) , idarubicina (idamycin) , ifosfagemcitabina, ifosfamida (iflex) , ifosfamida con mesna (MAID) , interferona, alfa interferona, alfa-2a interferona, alfa-2b, alfa-n3, interleucina-2 , iobenguana, iobenguana iobenguana, irinotecana (camptosar) , isotretinoina (accutane) , cetoconazol, 4- (bis (2 -cloroetil) amino) -L-fenilalanina, L-serina diazoacetato, lentinan, leucovorina, leuprolido acetato (LHRH-analog) , levamisol (ergamisvl) , lomustina (CCNU; cee-NU) , mannomustina, maitansina, mecloretamina, mecloretamina HCl (mostaza de nitrógeno) , medroxiprogesterona acétate (provera, depo provera) , megestrol acetato (menace) , melengestrol acetato, melfalan (alkeran) , menogarila, mercaptopurina, mercaptopurina (purinethol) , mercaptopurina anhidra, MESNA, mesna (mesne) , ácido metánesulfóni'co, etil éster, metotrexato (mtx; methotrexate) , metil-ccnu, mimosina, misonidazol, mitramicina, mitoantrona, mitobronitol, mitoguazona, mitolactol, mitomicina (mutamicina) , mitomicina C, mitotan (o,p'-DDD; lisodren) , mitoxantrona, mitoxantron HCl (novantrone) , mopidamol, N , N - b i s ( 2 - c l o r o e t i l ) -tetrahidro-2H-l, 3 , 2-oxazafosforina-2-amina-2-óxido, N- ( 1 -metiletil) -4 - ( (2 -metilhidrazino) metil ) benzamida, N-metil-bis (2-cloroetil) amina, hicardipina, nilutamida (nilandron) , nimustina, nitracrina, mostaza de nitrógeno, nocodazol, nogalamicina, octreotida (sandostatin) , pacilataxel (taxon) , paclitaxel, pactamicina, pegaspargasa (PEGx- 1 ) , pentostat ina (2 ' -deoxicof ormicina) , peplomicina, peptichemio, fotof oresis, picamicina (mithracin) , picibanil, pipobroman, plicamicina, podofilox, podof illotoxina, porf iromicina, prednisona, procarbazina, procarbazina HCl (matulane) , prospidio, puromicina, puromicina aminonucleosido, PWA (psoralen +ultravioleta a) , copolímero pirana, rapamicina, s-azacitidina, 2 , 4 , 6- tris (1- aziridinilo) -s-triazina, semustina, showdomicina, sirolimo, estreptozocina (zanosar) , suramina, citrato de tamoxifen (nolvadex) , taxon, tegafur, teniposida (VM-26; vumon) , ácido tenuazonico, TEPA, testolactona, tio-tepa, tioguanina, tiotepa (thioplex) , tilorona, topotecan, tretinoina (vesanoid) , triaziquona, tricodermina, trietilen glicol diglicidil éter, trietilenemelamina, . trietilenef osf oramida , trietilenetiof osf oramida, trimetrexato (neutrexin) , t r i s ( 1 - a z i r i d i n i l o ) f o s f i n a ó x i d o , t r i s ( l - a z i r i d i n i l o ) f o s f ina s u l f uro , t r i s ( a z i r i d i n i l o ) - p - b e n z o q u i n o n a , tris (aziridinilo) fosf ina sulfuro, uracilo mostaza, vidarabina, vidarabina fosfato, vinblastina, vinblastina sulfato (velban) , vincristina sulfato (oncovin) , vindesina, vinorelbina, vinorelbina tartrato (navelbina) , ( 1 ) - m i m o s i n a , 1 - ( 2 - c í o r. o e t i l ) - 3 - (4 -me t ilciclohexil ) - 1 -ni trosourea , (8 S-cis) - 10- ( (3 -amino- 2 , 3 , 6- trideoxi -alf a-L- lixo-hexopiranosil) -oxi) -7 , 8 , 9 , 10-tetrahidro-6 , 8 , ll-trihidroxi-8- (hidroxiacetilo) -1 -metoxi -5 , 12-naf tacendiona, 131-meta- iodobencilo guanidina (1-131 MIBG) , 5 (3 , 3-dimetil-l-triazenilo) -1H- imidazol -4 -carboxamida , 5 - (bis ( 2 -cloroet il) amino) -2 , 4 (1H, 3H) -pirimidinediona , 2,4,6-tris (1-azíridinilo) -s-tiazina, 2,3, 5-tris (1 -aziridinilo) -2 , 5 - c i c l o h e x a d i e n - l , 4 - d i o n a , 2 -cloro-N- (2 -cloroetil ) -N-metiletanamina , N , N - b i s ( 2 - c l o r o e t i l ) t e t r a h i d r o - 2 H -1,3, 2-oxazaf osf orina- 2 -amina- 2 -óxido, 3 -deazauridina, 3-yodobencilguanidina, 5, 12-naf tacenediona, 5 - a z a c i t i d i n a , 5 - f l u o r o u r a c i l o , (laS, 8S, 8aR, 8bS) -6 -amino- 8- ( ( (aminocarbonilo) oxi) metil) -1 , 1 a , 2 , 8 , 8 a , 8 b - h e x a h i d r o - 8 a -metoxi-5 -met i laz i riño (2 ' ,3 ' :3,4)pirrol (1,2-a) indol -4,7-diona, 6-azauridina, 6 -mercaptopurina, 8-azaguanina, y sus combinaciones. Agentes y combinaciones terapéuticas preferidas que pueden administrarse en combinación con poligonucleotidos y polipéptidos de la invención incluyen Doxorubicin y Doxetaxel, Topotecan, Paclitaxel, Carboplatina y Taxol, Taxol, Cisplatina y Radiación, 5-fluorouracilo (5-FU) , 5-FU y Radiación, Toxotere, Fludarabina, Ara C, Etoposide, Vincristina, y Vinblastina . Agentes quimioterapéuticos ejemplares también incluyen doxetaxel (ToxotereMR) y topotecan (HycamtinMR) .

Agentes quimioterapéuticos adicionales y otros agentes citotóxicos incluyen aquellos descritos a continuación bajo "Composición Farmacéutica." Adicionales agentes terapéuticos y otros agentes citotóxicos incluyen aquellos descritos a continuación bajo "epítopes y anticuerpos" y en otra parte aquí, y otros que son bien conocidos en la especialidad . Polinucleótidos y polipéptidos de la invención pueden ser empleados profiláctica y/o terapéuticamente para daño por radiación. Polinucleótidos y polipéptidos de la invención administrados profiláctica y/o terapéuticamente para la producción de células, tejidos y órganos contra dosis bajas, moderadas o altas de la invención, protegerán a individuos y poblaciones de humanos o animales, contra daño debido a exposición a radiación. Este daño incluye desordenes del sistema gastrointestinal, pérdida de peso, enfermedad por radiación, quemaduras por radiación, desordenes endocrinólogos, gota, enfermedades de los ojos tales como síndrome de ojo seco, enfermedades inflamatorias, desordenes psicológicos, desordenes del sistema respiratorio, desordenes del sistema genitourinario, desordenes del sistema circulatorio y cánceres tales como leucemia y carcinoma de tiroides, así como los desordenes bien conocidos en la especialidad. Daños debido a exposición de radiación incluye daño a células y tejido tal como aquellos anteriormente descritos, daño al .ADN celular; ruptura' en la función celular tal como por la ruptura de la función de ADN, muerte celular, inducción de cáncer incluyendo inducción de tumor secundario, inducido por terapias y otras inducciones de cáncer. La proliferación de armas nucleares e incidencia de pruebas nucleares está creciendo en algunas áreas del mundo. Adicionalmente, el uso de generación de energía nuclear y el desarrollo de industrias tales como el tratamiento de combustible nuclear y 'el desmantelado de armas nucleares ha incrementado el riesgo de exposición a radiación. Por ejemplo durante los últimos 50 años cuatro accidentes radioactivos industriales principales se reportaron en Kistym (USSR) y Wind-Scale (Inglaterra) en 1957, Three Mile Island (USA) en 1979 y en Chernobyl (USSR) en 1986. Estas liberaciones de radiación resultaron en alta exposición a diversos niveles de radioactividad. Debido al accidente en la planta nuclear en Chernobyl, lbs habitantes y animales tales .como animales domésticos dentro y fuera de la región han tenido serios efectos .

A principios de la década de 1950 se encontró que las histiaminas y aminoalquiltioles relacionados pueden proteger a organismos contra radiación. En particular, cuando se administraron estas substancias a ratones antes de exposición a rayos x, las substancias redujeron el efecto letal en radiación de rayos x. La búsqueda está en proceso para .descubrir, mejor agentes protectores contra radiación, por ejemplo, amifostine y otros aminoalquil dihidrógeno fosforotioatos (Patente de los E.U.A. No 3,892,824) se desarrollaron originalmente como agentes protectores, en particular para utilizarse contra rayos X o radiación nuclear que puede encontrarse durante conflictos militares. El agente más promisorio fue amifostina (WR 2721 ácido (S-2 (3 -aminopropilamino) -etil-fosforotioico) ) , que se descompone en el cuerpo a un aminoalquil tiol y este efecto es similar al de cisteamina. Sin embargo, el uso de WR 2721 se ha limitado por deficiente tolerancia clínica (Cairnie, Radiation Res . 94:221 (1983); Turrisi y colaboradores , en Radioprotectors and Anticarcinogens , Nygaard and Simic, Eds., Academic Press, New York, p. 681-694 (1983) ; Blumberg, Int. J. Radia tion Oncology Biol . Phys . 8:561 (1982)).

La presente invención proporciona un método para proteger contra daño inducido por radiación que es susceptible a pre- y/o concurrente y/o administración pre- y/o concurrente o post-radiación y que es efectivo a concentraciones no tóxicas relativamente bajas para permitir uso en mamíferos tales como humanos y también permite administraciones múltiples así como simples, como se describe a continuación. Como se describió anteriormente, polipéptidos y polinucleótidos de la invención protegen, mejoran y tratan células, tejidos y órganos contra daño debido a radiación u otros agentes citotóxicos, e incrementan la supervivencia de individuos expuestos a agentes citotóxicos tales como radiación. 'polipéptidos y polinucleótidos de la invención, administrados antes de, durante y/o después de exposición eliminarán o reducirán la severidad de daño provocado por radiación. Exposición a radiación puede ser como resultado, por ejemplo accidental, intencional, interna, externa, ocupacional, exposición ambiental, radón, contaminación nuclear e incluye radiación liberada por ejemplo por una explosión nuclear, un accidente nuclear o una explosión solar. Esta exposición puede ocurrir por ejemplo en trabajadores de la industria de energía nuclear, en personal militar, en civiles, en personal de emergencia, en supervivientes de explosiones nucleares y accidentes nucleares, en trabajadores en el campo, de cuidado de la salud, en pacientes, y en astronautas. También puede ser útiles polinucleótidos y polipéptidos de la invención para proporcionar tratamiento o protección contra otras fuentes de radiación tal como puede encontrar personal de emergencia, civiles o personal militar o por viajeros del espacio. De esta manera, polinucleótidos y polipéptidos de la invención pueden administrarse profilácticamente o terapéuticamente para evitar, reducir o tratar daño debido a la exposición a radiación. La presente invención proporciona un método para proteger o tratar un individuo contra daño debido a radiación, que comprende administrar al individuo una cantidad efectiva de polipéptidos o polinucleótidos de la invención. Polipéptidos y polinucleótidos de la invención son agentes protectores contra' daño debido a radiación, y pueden administrarse antes de, y durante y/o subsecuente a la exposición a radiación. Como se describe anteriormente y a continuación, agentes protectores tales como polinucleótidos y polipéptidos de la invención son útiles en métodos de mejoramiento profiláctico y terapéutico.

Polipeptidos y polinucleótidos de la invención son útiles para tratamiento profiláctico y terapéutico de individuos que es probable que expongan a radiación tales como trabajadores en la industria de energía nuclear, personal militar, astronautas, trabajadores en capo médico que participan en métodos de diagnóstico y terapéutico que involucra radiación, o pacientes que tienen que ser expuestos a radiación, con el propósito de diagnóstico y tratamiento. Como se describe en otra parte aquí, polipéptidos y polinucleótidos de la invención también son útiles como auxiliares en la radioterapia de cáncer, en donde los polipéptidos o polinucleótidos protegerán selectivamente tejido normal permitiendo que el tejido canceroso se destruya por la terapia de radiación. Por lo tanto, polipéptidos y polinucleótidos de la invención pueden ser administrados profiláctica o terapéuticamente a individuos con riesgo de exposición a radiación. Uso profiláctico evitará o reducirá daño a radiación posible, y uso terapéutico tratará o reducirá el daño actual y frenará, reducirá o evitará daño adicional . La cantidad efectiva deberá comprenderse como una cantidad de polipéptidos o polinucleótidos de la invención que sea suficiente para lograr el efecto deseado. Este efecto puede ser un efecto profiláctico o un efecto terapéutico o ambos. La cantidad efectiva depende de diversos factores, ' incluyendo el tipo y cantidad de radiación a la cual se expone el individuo, y el régimen de administración, etc., como es bien conocido en la técnica o descrito a continuación., Por ejemplo, dosis son aquellas que se describen a continuación y a través de la especificación. Los polipéptidos de la presente invención han mostrado que protegen el tracto gastrointestinal durante tratamiento con agentes quimioterapéuticos de radiación (ver Ejemplos 16 a 18) . Además, se ha mostrado que los polipéptidos de la presente invención, reducen daño inducido por radiación en el tracto gastrointestinal cuando se utilizan después de radiación (ver ejemplos 16-18) . De esta manera, los polipéptidos de la presente invención pueden ser empleados para proteger epitelio. "Epitelio" se refiere a la cubierta de superficies internas y externas del cuerpo, incluyendo el forro o revestimiento de vasos y otras pequeñas cavidades. Consiste de células unidas por pequeñas cantidades de substancias cementantes. El epitelio se clasifica en tipos, en base al número de profundidad de capas y formas de las células superficiales. Células epiteliales incluyen anterius corneae, epitelio de Barrett, epitelio capsular, epitelio ciliado, epitelio columnar, epitelio córneo, epitelio cúbico, epitelio de ductus semicircularis, epitelio de esmalte, epitelio falso, epitelio germinal, epitelio gingival, epitelio glandular, epitelio glomerular, epitelio laminado, epitelio de lend, epitelio mesenquimal, epitelio olfatorio, epitelio de pavimento, epitelio pigmentario, epitelio protector, epitelio pseudoestratificado, epitelio piramidal, epitelio respiratorio, epitelio de varilla, epitelio seminífero, epitelio sensorial, epitelio simple, epitelio escamoso, epitelio estratificado, epitelio subcapsular, epitelio sulcular epitelio, epitelio teselado, epitelio de transición y células epiteliales del ojo, lengua, glándulas, mucosa oral, duodeno, íleo, yeyuno, ciego, pasajes nasales, esófago, colon, glándulas mamarias, y los sistemas reproductores masculino y femenino. "Glándulas" se refieren a la agregación de células, especializadas para secretar o excretar materiales no relacionados a sus necesidades metabólicas ordinarias. Ejemplos de glándulas que pueden incluir células epiteliales incluyen: absorbentes, glándulas accesorios, glándulas auxiliares, glándulas acidas, glándulas admaxilares, glándulas adrenales, glándulas agregadas, glándulas de Albarran, glándulas anales, glándulas alveolares, 'glándulas anteprostáticas, glándulas aórticas, glándulas apicales de la lengua, glándulas apocrínas, glándulas areoláres, glándulas arteriales, glándulas arteriococcígeas, glándulas aritenoides, glándulas de Aselli, glándulas de Avicenna, glándulas atribiliares, glándulas axilares, glándulas de Bartholin, glándulas de Bauhin, glándulas de Baumgarten, "glándulas de la mucosa biliar, glándulas de Blandin, glándulas de bazo sanguíneo, glándulas de Boerhaave, glándulas de Bonnot, glándulas de Bowman, glándulas braquiales, glándulas bronquiales, glándulas de Bruch, glándulas de Brunner, glándulas bucales, glándulas bulbocavernosas, glándulas cardíacas, glándulas carótidas, glándulas celíacas, glándulas ceruminosas, glándulas cervicales del útero, glándulas coroide, glándulas Ciaccio, glándulas ciliares de la conjuntiva, circumanales, glándulas de Cloquet, glándulas de Cobelli, glándulas coccígeas, glándulas de bobina, glándulas compuestas, glándulas conglobadas, glándulas conjuntivas, . glándulas de Cowper, glándulas cutáneas, glándulas citogénicas, glándulas sin ducto, glándulas duodenales, glándulas de Duverney, glándulas de Ebner, glándulas ecrinas, glándulas de Eglis, glándulas endocrinas, glándulas endoepiteliales, glándulas esofágicas, glándulas excretorias, glándulas exócrinas, glándulas foliculares del ducto, glándulas gástricas, glándulas gástricas, glándulas gastroepiplóicas, glándulas de Gay, glándulas genitales, glándulas gingivales, glándulas de Gley, glándulas globadas, glándulas glomerulares, glándulas glosopalatinas, glándulas de Guerin, glándulas guturales,, glándulas de Haller, glándulas de Harder, glándulas haversianas, glándulas hedónicas, glándulas hemales, glándulas de linfa hemal, glándulas hematopoyéticas, glándulas de hemolinfa, glándulas de Henle, glándulas hepáticas, glándulas heterócrinas, glándulas de hibernación, glándulas holócrinas, y glándulas incretorias . Adicionales ejemplos de glándulas incluyen glándulas intercarótidas, glándulas intermedias, glándulas interescapulares, glándulas intersticiales, glándulas intestinales, glándulas intraepiteliales, glándulas intramusculares, glándulas de la lengua, glándulas yugulares, glándula de Krause, glándulas labiales, glándulas de la boca, glándulas lacrimales, glándulas lacrimales auxiliares, glándulas lactíferas, glándulas del intestino grueso, glándulas de transpiración, glándulas laríngeas, glándulas lenticulares del estómago y lengua, glándulas de Lieberkuhn, glándulas linguales, glándulas linguales anteriores, glándulas de Littre, glándulas de Luschka, glándulas linfáticas, glándulas linfáticas extraparótidas, glándulas malares, glándulas mamarias, glándulas mamarias accesorias, glándulas mandibulares, glándulas de Manz , glándulas de Mehlis, glándulas de meibomianas, glándulas merócrinas, glándulas mesentéricas, glándulas mesocólícas, glándulas mixtas, glándulas molares, glándulas de Molí, glándulas monoptíficas, glándulas de Montgomery, glándulas de Morgagni, glándulas de la boca, glándulas mucilaginosas, glándulas mucíparas, glándulas mucosas, glándulas de mucosa lingual, glándulas mucosas del tubo auditivo, glándulas mucosas del duodeno, glándulas mucosas de la trompa de Eustaquio, glándulas multicelulares, glándulas miometriales, glándulas de Naboth, glándulas nabotianas, glándulas nasales, glándulas del cuello, glándulas odoríferas de prepucio, glándulas de aceite, glándulas olfatorias, glándulas oxínticas, glándulas pachonianas, glándulas palatinas, glándulas, pancreaticoesplénicas , glándulas parafrenales, glándulas paratiroides, glándulas paruretrales, glándulas parótidas, glándulas parótidas accesorias, glándulas pectorales, glándulas pépticas, glándulas perspiratorias, glándulas de Peyre, glándulas faríngeas, glándulas de Philip, glándulas pineales y glándulas pituitarias. Otros ejemplos de glándulas incluyen glándulas de Poirier, glándulas poliptichich, glándulas preen, glándulas de embarazo, glándulas prehioide, glándulas de prepucio, glándulas de próstata, glándulas de pubertad, glándulas pilóricas, glándulas racemosa, glándulas retrolinguales, glándulas retromolares, glándulas Rivinus, glándulas Rosenmuller, glándulas saculares, glándulas salivales, glándulas salivares abdominales, glándulas salivales externas, glándulas salivales internas, glándulas salivales externas, glándulas de Sandstrom, glándulas de Schuller, glándulas sebáceas, glándulas sebáceas de la conjuntiva, glándulas sentinales, glándulas seromucosas, glándulas serosas, glándulas de Serres, glándulas de Sigmunds, glándulas de Skene, glándulas simples, glándulas para intestino delgado, glándulas solitarias de intestino grueso, glándulas esplenoides, glándulas de. Stahr, glándulas estafilinas, glándulas subauriculares, glándulas sublinguales, glándulas submandibulares , glándulas suboriferas, glándulas suprarenales, glándulas suprarenales accesorios, glándulas de Suzanne, glándulas sudoríparas, glándulas sinoviales, glándulas tarsales, glándulas de Theile, glándulas de timo, glándulas tiroides, glándulas tiroides accesorias, glándulas de la lengua, glándulas traqueales, glándulas de tacoma, glándulas tubulares, glándulas de túbulo acinares, glándulas timpánicas, glándulas de Tyson, glándulas unicelulares, glándulas uretrales, glándulas uretrales de la uretra femenina, glándulas uropigiales, glándulas uterinas, glándulas ufriculares, glándulas vaginales, glándulas vasculares, glándulas vestibulares, (mayor y menor) , glándulas de Virchow, glándulas vitelinas, glándulas bulbovaginales, glándulas de Waldeyer, glándulas de Weber, glándulas de Wolfring, glándulas de Zeis y glándulas de Zuckerkandl . Ejemplos adicionales de glándulas incluyen glándulas albuminosas, glándulas agminato, glándulas de tubo auditivo, glándulas de sudor auxiliares, glándulas bulbouretrales, glándulas cardíacas, glándulas del esófago, glándulas de la trompa- de Eustaquio, glándulas foliculares, glándulas de Galeati, glándulas genales, glándulas de Harver, glándulas inguinales, glándulas interrenales, glándulas de Knoll, glándulas císticas de Luschka, glándulas malpigianas, glándulas de linfa de médula, glándulas maestras, glándulas maxilares, glándulas de Mery, glándulas de Nuhn, glándulas parpebrales, glándulas peritraqueales, glándulas de píleo, glándulas seminales, glándulas submaxilares, glándulas sudoríferas, glándulas suprahioides, glándulas de Terson, glándulas de Tiedemann, glándulas tubuloalveolar, glándulas de tacoma, glándulas vulvovaginal, glándulas de Wasmann, glándulas de Wepfer, y glándulas de Wolfer. De esta manera, MPIF-1 puede emplearse para proteger cualquiera de estas células o células dentro de estas glándulas. MPIF-1 puede emplearse para proteger o reducir lesión inducida por agentes citotóxico, en células de músculo tales como células de músculo cardíaco, células de músculo esquelético, y células de músculo liso; células epiteliales tales como células epiteliales escamosas, incluyendo células endoteliales, células epiteliales cuboide y células epiteliales columnares; células de tejido nervioso, tales como neuronas y neuroglia. MPIF-1 también puede emplearse para proteger o reducir lesión inducida por agente citotóxico, al tejido de músculo, tejido nervioso, tejido epitelial, tejido endotelial y tejido conectivo. Además, MPIF-1 puede emplearse para proteger o reducir lesión inducida por accidente citotóxico a células divisoras y células no divisoras, células diferenciadas terminalmente, células básales pluripotentes, células progenitoras comprometidas, y células básales no comprometidas. De esta manera, MPIF-1 puede emplearse para tratar daño a células del sistema nervioso tales como: neuronas, incluyendo neuronas corticales, -inter neuronas, neuronas efectoras centrales, neuronas efectoras periféricas, y neuronas bipolares; y neuroglia, incluyendo células de Schwann, oligodendrocitos, astrocitos, microglia y epéndimo . Adicionalmente, células endocrinas y asociadas con endocrino también pueden tratarse o protegerse contra agentes citotóxicos utilizando MPIF-1, células tales como: células de glándula pituitaria incluyendo células epiteliales, pituicitos, neuroglia-, cromófobos agranulares, cromófilos granulares (acid filos y basófilos) ; células de glándula adrenal incluyendo células secretoras de epinefrina, células no secretoras de epinefrina, células medulares, células corticales, (células de la glomerulosa, fasciculata y reticularis) ; células de glándula tiroides incluyendo células epiteliales (principales y parafolicular) ; células de glándula paratiroide pituitaria incluyendo células epiteliales (células principales y oxófilos) ; células de páncreas incluyendo células de las isletas de Langerhans (células alfa, beta y delta) ; células de glándula pineal incluyendo células parenquimales y células neurogliales; células de timo incluyendo células parafoliculares; células de testis o testículos incluyendo células de tubo seminífero, células interstitiales ("células de Leydig"), espermatogenia, espermatocitos (primeros 'y secundarios) , espermátidos, espermatozoide, células de Sertoli y células mioide; células del ovario incluyendo huevos, oogonios, oocitos, células granulosas, células teca (internas y externas) , células epiteliales germinales y células de folículo (primordiales, vesiculares, maduras y atrésicas) . MPIF-1 puede emplearse para tratar lesión inducida por agente citotóxico de lesión de músculo liso inducido por agente citotóxico' tal como miofibrilas, fibras intrafúsales y extrafúsales . MPIF-1 puede emplearse para tratar lesión de células del sistema esquelético inducida por agente citotóxico, tal como osteoblastos, osteocitos, osteoclastos y sus células progenitoras . Células del sistema circulatorio también pueden tratarse o protegerse contra agentes citotóxicos utilizando MPIF-1, células tales como: células del corazón, (células del miocardio) ; células de sangre y linfa incluyendo células básales sensibles a eritropoyetina, eritrocitos, leucocitos (tales como eosinófilos, basófilos y neutrófilos (células granulares) y linfocitos y monocitos (células agranulares) ) , trombocitos, macrófagos de tejido (histiocitos) , fagocitos específicos de órgano (tales como células de Kupffer, macrófagos alveolares y microglia) , B-linfocitos, T-linfocitos (tales como células T citotóxicas, células T auxiliares, y células T supresoras), megaloblastos, monoblastos,- mieloblastos, linfoblastos, proeritroblastos , megacarioblastos , promonocitos , promielocitos, prolinfocitos , normoblastos tempranos, megacariocitos, normoblastos intermedios, metamielocitos (tales como metamielocitos juveniles, met amieloci t os segmentados y granulocitos polimorfonucleares) , normoblastos posteriores o tardíos, reticulocitos y de células de médula osea. Células del sistema respiratorio tales como células endoteliales capilares- y células alveolares también pueden tratarse con MPIF-1 para reducir o evitar daño inducido por agentes citotóxicos. Células del sistema urinario tales como nefroñas, células endoteliales capilares, células granulares, células de túbulo endotelial y podocitos también pueden tratarse o protegerse. Células del sistema digestivo también pueden tratarse o protegerse utilizando MPIF-1, tal como: células epiteliales columnares simples, células mucosales, células acinares, células parietales, células jefe, células, zimogénicas, células pépticas, células enterocromafinas, células en forma de copa, células Argentaffen y células G. Células sensoriales tales como células del sistema auditivo (células de cabello) ; células del sistema olfatorio, incluyendo células receptoras olfatorias y células epiteliales columnares, células del aparato vestibular/equilibrio incluyendo células de cabello y células de soporte; células del sistema visual incluyendo células de pigmento, células epiteliales, neuronas foto-receptoras (varillas y conos), células de ganglio, células amacrinas, células bipolares y células horizontales pueden tratarse con MPIF-1 para evitar o reducir daño citotóxico. Adicionalmente, células mesenquimales , células estromales, células/folículos del cabello, células adiposas (grasa), células de tejidos epiteliales simples, (epitelio escamoso, epitelio cuboide, epitelio columnar, epitelio columnar ciliado y epitelio columnar ciliado pseudoestratificado) _ células de tejidos epiteliales estratificados (epitelio escamoso estratificados (queratinizado y no queratinizado) , epitelio cuboide estratificado y epitelio transicional) , células en forma de copa, células endoteliales del mesenterio, células endoteliales de intestino delgado, células endoteliales de intestino grueso, células endoteliales de capilares de la vasculatura, células endoteliales de la micro vasculatura, células endoteliales de las arterias, células endoteliales de las arteriolas, células endoteliales de las venas, células endoteliales de las vénulas, etc., células endoteliales de la vejiga, pueden tratarse con MPIF-1 para reducir o evitar daño citotóxico. MPIF-1 también protege y trata daño citotóxico en células de tejido conectivo tales como tejido conectivo suelto (areolar) incluyendo la dermis, tejido conectivo fibroso denso, tejido conectivo elástico, tejido conectivo reticular y tejido conectivo adiposo. Células del tejido conectivo que también se protegen por y tratan con MPIF-1, incluyen condrocitos, células adiposas, células periósteas, células endósteas, odontoblastos, osteoblastos, osteoclastos y osteocitos. MPIF-l también protege células endoteliales, hepatocitos, queratinocitos y queratinocitos básales, células musculares, células de los sistemas nervioso central y periférico, células de próstata y células de pulmones . MPIF-1 también protege células epiteliales en el pulmón, pecho, páncreas, estómago, intestino delgado e intestino grueso. MPIF-1 también protege células * * 316 ' ' ' epiteliales tales como sebocitos, folículos del cabello, hepatocitos, pneumocitos tipo II, células goblet que producen mucina y otras células epiteliales y sus progenitores contenidos dentro de la piel, pulmón, hígado y tracto gastrointestinal. MPIF-1 protege hepatocitos, de esta manera MPIF-1 puede emplearse profilácticamente o terapéuticamente para evitar o atenuar hepatitis aguda o crónica "así como falla de ' hígado ' fulminante o subfulminante provocada por terapia de cáncer (por ejemplo quimioterapia y/o terapia de radiación) y exposición de radiación ambiental o accidental. MPIF-1 también puede emplearse para reducir los efectos secundarios de toxicidad de intestino que resulta por tratamiento con agente citotóxico tales como radiación o quimioterapia. MPIF-1 tiene efecto citoprotector en la mucosa del intestino delgado. MPIF-1 también puede emplearse profiláctica o terapéuticamente para evitar o atenuar mucositis y reducir mucositis (por ejemplo úlceras orales, esofágicas, intestinales, colonicas, rectales, y anales) que. resultan de quimioterapia y otros agentes citotóxicos. Enfermedades de intestino - inflamatoria, tal como enfermedad de Crohn y colitis ulcerativa, son enfermedades que resultan en destrucción de la superficie de mucosa de intestino delgado o grueso, respectivamente. De esta manera, MPIF-1 puede emplearse para promover la "recuperación de la superficie mucosal para ayudar en sanado más rápido y evitar avance de enfermedad de intestino inflamatoria. El tratamiento con MPIF-1 se espera que tenga un efecto significante en la producción de mucosa a través del tracto gastrointestinal y puede emplearse para proteger la mucosa intestinal contra agentes citotóxicos. De esta manera, la presente invención también proporciona un método para evitar o tratar enfermedades o eventos patológicos de la mucosa, incluyendo colitis ulcerativa, enfermedad de Chron, y otras enfermedades en donde la mucosa se daña, que comprende la administración de una cantidad efectiva de MPIF-1. La presente invención similarmente proporciona un método para evitar o tratar mucositis oral (incluyendo odinofagia asociada con lesión mucosal en la faringe e hipofaringe) , esofágica, gástrica, intestinal, colónica y rectal provocadas por agentes citotóxicos. Aún más, MPIF-1 puede emplearse para evitar reducir daño a* los pulmones debido a diversos agentes. MPIF-1 puede evitar o tratar daño de alvéolos y epitelio bronquiolar. Por ejemplo, lesiones de inhalación, es decir, que resultan de inhalación de humo y lesión de radiación, que provocan necrosis de epitelio bronquiolar y alvéolos pueden tratarse efectivamente con MPIF-1. También MPIF-1 puede emplearse para proteger neumocitos tipo II. MPIF-1 puede ser clínicamente útil para tratar o evitar daño de la dermis y epidermis, tejido de ojos, tejido dental, cavidad oral y complicaciones asociadas con tratamiento sistémico o local con terapia de radiación y drogas antineoplásticas. MPIF-1 también puede emplearse para tratar pérdida dérmica. MPIF-1 también puede emplearse para reducir los efectos secundarios de toxicidad de intestinos que resultan por radiación, quimioterapia u otros tratamientos citotóxicos. MPIF-1 tiene un efecto citoprotector en la mucosa de intestino delgado. MPIF-1 también puede emplearse profiláctica o terapéuticamente para evitar o atenuar mucositis o para tratar mucositis (Por ejemplo, úlceras orales, esofágicas, intestinales, colónicas, rectales, y anales) que resultan de quimioterapia y otros agentes citotóxicos. De esta manera, la presente invención también proporciona un método para evitar o tratar enfermedades, o eventos patológicos de la mucosa, incluyendo colitis ulcerativa, enfermedad de Crohn y otras enfermedades en donde la mucosa se daña, que comprende la administración de una cantidad- efectiva de MPIF-1. La presente invención similarmente proporciona un método para evitar o tratar mucositis oral (incluyendo odinofagia asociada con lesión mucosal en la faringe e hipofaringe) esofágica, gástrica, intestinal, colónica y rectal independientemente del agente o modalidad que provoca este daño. Además, MPIF-1 puede emplearse para tratar y/o evitar ampollas y quemaduras debido a productos químicos; lesión de los ovarios debido a tratamiento con quimioterapéuticos, por ejemplo cistitis inducida por radiación o quimioterapia y lesión intestinal inducida por altas dosis de quimioterapia. MPIF-1 puede emplearse para evitar o reducir nefrotoxicidad inducida por agentes quimioterapéuticos, radiación u otros tratamientos citotóxicos. La presente invención también proporciona un método para proteger a un individuo contra los efectos de radiación; quimioterapia o tratamiento con otros agentes citotóxicos, que comprende la administración de una cantidad efectiva de MPIF-1. La presente invención además proporciona un método para reducir o evitar daño protegido que resulta por exposición a radiación, agentes quimioterapéuticos, u otros agentes citotóxicos que comprenden la administración de una cantidad efectiva de MPIF-1. Un individuo puede ser expuesto a radiación por una cantidad de razones, incluyendo propósitos terapéuticos (por ejemplo para el tratamiento de desordenes hiperproliferativos) ,' como resultado de una liberación accidental de un isótopo radioactivo en el ambiente, o durante procedimientos de diagnóstico médicos invasivos o no invasivos (por ejemplo rayos X) . Además, una cantidad substancial de individuos se exponen a radón radioactivo en su sitio de trabajo y casa. Exposición ambiental continua a largo plazo se ha empleado para calcular estimados de expectativa de vida perdida. Johnson, W. y Kearfott, K. , Heal th Phys . 73:312-319 (1997) . Como se ilustra en los Ejemplos 17 a 18, las proteínas de la presente invención mejoran la supervivencia de animales expuestos a radiación. De esta manera, MPIF-1 puede emplearse para -incrementar la proporción de supervivencia de individuos que sufren lesiones inducidas por radiación, para proteger a individuos contra dosis de radiación sub-letales y para incrementar la proporción terapéutica de irradiación en el tratamiento de afecciones tales como desordenes hiperproliferativos . MPIF-1 también pueden emplearse para proteger a individuos contra dosis de radiación, drogas quimioterapéuticas u otros agentes citotóxicos que normalmente no serían toleradas. Cuando se utilizan de esta manera, o como de otra forma se describe aquí, MPIF-1 puede administrarse antes de, después y/o durante terapia de exposición a radiación, quimioterapia o tratamiento con/exposición a otros agentes citotóxicos. Altas dosis de radiación y agentes quimiterapéuticos pueden ser especialmente útiles cuando se trata a un individuo que tiene etapa avanzada de una afección o mal tal como un desorden hiperprofilerativo . En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para evitar o tratar condiciones tales como lesión gastrointestinal y oral inducida por radiación, mucosis, fibrosis intestinal, proctitis, fibrosis pulmonar inducida por radiación, pneumonitis inducida por radiación, retracción pleural inducida por radiación, síndrome hemopoyético. inducido por radiación, y mielotoxicidad inducida por radiación que comprende administrar una cantidad efectiva de MPIF-1 a un individuo. De esta manera, polinucleótidos y polipéptidos MPIF de la invención se emplean para inhibir daño celular normal, incluyendo daño a progenitores de médula ósea, durante terapia de radiación, quimioterapia y radioterapia dirigida tal como radio inmunoterapia de malignidades, metástasis y desordenes relacionados tales como leucemia (incluyendo leucemias agudas (por ejemplo leucemia linfocitica _aguda, leucemia mielocitica aguda (incluyendo m i e 1 ob 1 á s t i ca , p rom i e 1 o c í t i c a , mielomonocítica, monocítica, y . eritroleucemia) ) y leucemias crónicas (por ejemplo, leucemia mielocítica crónica (granulocítica) y leucemia linfocítica crónica) ) , policitemia vera, linfomas (por ejemplo enfermedad de Hodgkin) mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom, enfermedad de cadena pesada, y tumores sólidos incluyendo pero no limitados a, sarcomas y carcinomas tales como fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogénico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, cáncer gástrico, cáncer pancreático, cáncer de pecho, cáncer de ovario, cáncer de próstata, carcinoma de célula escamosa, carcinoma de célula basal, adenocarcinoma, carcinoma de glándula sudorípara, carcinoma de glándula sebácea, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de célula renal, hepatoma, carcinoma de ductos biliares, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrional, tumor de Wilm, cáncer cervical, tumor testicular, carcinoma de pulmón, carcinoma de célula pequeña de pulmón, carcinoma de vejiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, c r an i o f ar i ng i orna , ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, menangioma, melanoma, neuroblastoma, y retinoblastoma. Estos desordenes también incluyen cáncer de tiroides medular metastático, anaplástico, astrocitoma, glioblastoma, linfomas foliculares, " cáncer de colon, tumores cardíacos, cáncer de pulmón, 'cáncer intestinal, cáncer testicular, cáncer de estómago, mixoma, mioma, línfoma, endotelioma, osteoblastoma, osteoclastoma, osteosarcoma, condrosarcoma, adenoma, cáncer de pecho, cáncer de próstata, sarcoma de Kaposi, y cáncer de ovario. Desordenes adicionales se pueden tratar utilizando los polipéptidos, o fragmentos de polipéptidos y variantes, agonistas y antagonistas (incluyendo anticuerpos) y otros anticuerpos de la invención son bien conocidos en la técnica y también pueden ser descritos aquí. MPIF-1 puede emplearse solo o en conjunto con uno o más agentes adicionales que contienen protección contra radiación u otros agentes. Un número de citocinas (Por ejemplo, IL-1, TNF, IL-6, TL-12;) se han mostrado que contienen esta protección. Ver por ejemplo ver por ejemplo, Neta, R. y colaboradores, J. Exp . Med . 173: 1177 (1991) . Adicionalmente, IL-11 se ha mostrado que protege células mucosas de intestino delgado después de regresión combinada y quimioterapia, Du, X.X. y colaboradores . , Blood 83:33 (1994), y lesión toráxica inducida por radiación. Redlich, C.A. y colaboradores , J. Immun . 157:1705-1710 (1996)-. Varios factores de crecimiento también se han mostrado que confieren protección a exposición ole radiación, por ejemplo factor de crecimiento de fibroblastos, y facto de crecimiento de transformación beta-3. Ding, I. y colaboradores, Acta Oncol . 36:337-340 (1997); Potten, C. y colaboradores, Br.

J. Cáncer 75:1454-1459 (1997). Agentes de protección de radiación adicionales que pueden administrase con cualesquiera, polipéptidos y polinucleótidos de la invención, incluyen antagonistas de calcio (WO 93/02670), polietilen glicol (Patente de los E.U.A. No. 4,676,979), polivinilpirrolidona (Patente de los E.U.A. No. 4,676,979), polietilenglicolmonometiléter (Patente de los E.U.A. No. 4,676,979), amidas y aminas y sales de metoxipolietilen glicoles y agentes quelantes tales como EDTA, DTPA, y EGTA (WO 98/47858) , manganeso y otras substancias que inducen metalotioneina (Patente de los E.U.A. No. 5,008,119), WR-2721 (Patente de los E.U.A. No. 5,424,471), WR-1065, otros, fosforobioatos (Patente de los E.U.A. No. 5,869,338), poliamida tioles (Patente de los E.U.A. No. 5,217,964), combinación de SCF/IL-3/GM-CSF o regímenes terapéuticos sencillos (Patente de los E.U.A. No. 5,620,685), beta caroteno y preparaciones de alga Dunaliella (Patente de los E.U.A.

No. 5,948,823), derivados de fósforo de alcaloides (Patente de los E.U.A. No. 5,981,512), timalina y L-Glu-L-Trp (Patente de los E.U.A. No. 5,770,576), citocinas tales como IL-1, factor de necrosis de tumor, factor de célula basal y IL-12 (Neta, Stem Células 15 (Suppl 2 ) :207-10 (1997) ) , quelatos de cobre (Sorenson y colaboradores, Proc . Soc . Exp . Biol .~ Med. 210:191-204 (1995) ) , factor-D (crecimiento/hormona/lL-1) factor de necrosis de tumor en combinación o regímenes terapéuticos sencillos (Patente de los E.U.A. No. 5,843,422), Actihaemyl (CAS RN No. 37239-28-4) , Amifostine (WR 2721) , 2-amino-etanetiol dihidrógeno _ fosfato _ (éster) sal monosodio (cistafos, fosfocisteamina) , 3- (bis (2-cloroetil) carbamato) estradiol (estramustina), 2-amíno-etanetiol (cisteamina) , 2 , 2 ' -ditiobis (etilamina) (cistamina) , hidrobromuro bromuro de S-2-aminoetiltiouronio (AET) , quelatos de cobre tales como Cu (II) 2 (3, 5-diisopropil-salicilato) 4 (Cu(II) 2 (3, 5, -DIPS) 4) , quelatos de metaloelemento esencial de Fe, Mn, y Zn (Sorenson y colaboradores , Proc . Soc . Exp . Biol . Med. 210:191-204 (1995), 2-(aliltio) pirazina, derivados de fósforos de alcaloides (Patentes Austríacas Nos. 377 988 y 354 644; Patente de los E.U.A. 5,981,512), etc., y sus combinaciones. Polinucleótidos y polipéptidos de la invención también pueden administrarse con antiheméticos tales como 2- (etiltio) -10- (3- (4 -metil - 1-piperazinilo) propil ) -10H-f eno t iaz ina ( e t il t ioperaz ina ) , 1- (p - cloro - al f a -fenilbenzil) -4- (m-metilbencil) -piperazina (meclozine, meclizine) , etc., y sus combinaciones, polinucleótidos y polipéptidos de la invención también pueden administrarse con otros agentes terapéuticos y sus combinaciones, aquí descritos o conocidos en la especialidad. Cistitis hemorrágica es un síndrome asociado con ciertos estados de enfermedad así como exposición a drogas, a virus, y toxinas. Se manifiesta como sangrado difuso del forro endotelial de vejiga. Tratamientos conocidos incluyen terapias intravesical, sistémica, y no farmacológica (West, N.J., Pharmacotherapy 17:696-706 (1997) . Algunos agentes citotóxicos utilizados clínicamente tienen efectos secundarios que resultan en la inhibición de la proliferación del epitelio normal en la vejiga, los que conduce a ulceración que amenaza potencialmente la vida y ruptura del forro epitelial. Por ejemplo, ciclofosfamida es un agente citotóxico que es biotransformado principalmente en el hígado a metabólitos de alquilación activos por un sistema oxidasa microsomal de función mixta. Estos metabolitos interfieren con el crecimiento de células malignas rápidamente proliferante susceptible.- El mecanismo de acción se considera que involucra entrelazamiento de ADN de célula de tumor (Physicians' Desk Reference, 1997). Ciclofosfamida es un ejemplo de un agente citotóxico que provoca cistitis hemorrágica en algunos pacientes, una complicación que puede ser severa y en algunos casos fatal. Fibrosis de la vejiga ordinaria también puede desarrollarse con o sin cistitis. Esta lesión se considera provocada por metabolitos de ciclofosfamida secretados en la orina. Hematuria provocada por ciclofosfamida usualmente está presente por varios días, pero puede persistir. En varios casos, se requiere tratamiento médico y quirúrgico. Instancias de cistitis hemorrágica severa resultan en terapias de ciclofosfamida interrumpida. Además, malignidades de vejiga urinaria generalmente ocurren dentro de dos años de tratamientos de ciclofosfamida y ocurren en pacientes 32§ que previamente han tenido cistitis hemorrágica (ver inserto en el paquete de Cytoxant) . La ciclofosfamida tiene efectos tóxicos en la próstata y én los sistemas reproductores masculinos. Tratamiento con ciclofosfamida puede resultar en el desarrollo de esterilidad y resulta en cierto grado de atrofia testicular. Una persona con destreza ordinaria apreciará que cantidades efectivas de los polipéptidos MPIF-1 para tratar un individuo que requiere nivel incrementado de actividad MPIF-1 (incluyendo cantidades de polipéptidos MPIF-1 efectivas para mielosupresión con o sin agentes mielosupresores o inhibidores 'mielosupresores) pueden determinarse empíricamente por cada condición en donde se indica la administración de MPIF-1. El polipéptido que tiene actividad MPIF-1 puede administrarse en composiciones farmacéuticas en combinación con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. MPIF-1 también puede emplearse para tratar leucemia y células anormalmente proliferantes, tales como células de tumor al inducir apoptosis. MPTF-1 induce apoptosis en una población de células progenitoras hematopoyéticas. MPIF-1 puede emplearse para la expansión de células progenitoras hematopoyéticas inmaduras tales como granulocitos, macrófagos o monocitos, al evitar temporalmente su diferenciación. Estas células de médula ósea pueden cultivarse in vivo . De esta manera, MPIF-1 también puede ser útil como un modulador de células básales hematopoyéticas in vi tro con el propósito de transplante de médula ósea y/o terapia de genes. Ya que las células básales son raras y son más útiles para introducir genes para terapia de genes, MPIF puede emplearse para aislar poblaciones enriquecidas de células básales. Las células básales pueden ser .enriquecidas al cultivar células en la presencia de citotoxinas, tales como 5-Fu, que extermina rápidamente células divisoras, en donde las células básales se protegerán por MPIF-1. Estas células básales pueden regresarse a un paciente de transplante de médula ósea o luego pueden emplearse para transfección del gen deseado para terapia de genes. Además, MPIF-1 puede inyectarse en individuos que resultan en la liberación de células básales de la médula ósea del individuo en la sangre periférica. Estas células básales pueden aislarse con el propósito de transplante de médula ósea autólogo o manipulación de terapia de genes. Después de que el paciente ha terminado quimioterapia o tratamiento de radiación, las células básales aisladas pueden regresarse al paciente. Además, ya que MP1F-1 tiene efectos en linfocitos T, así como macrófagos, MPIF-1 puede mejorar la capacidad de células que presentan antígeno (APCs) para recoger - virus, bacterias y otras substancias extrañas, procesarlas y presentarlas a los linfocitos responsables por respuestas inmunes. MPIF-1 también puede modular la interacción de APCs con linfocitos T y linfocitos B. MPIF-1 puede proporcionar una señal co-estimuladora durante presentación de antígeno que dirige a la célula que responde para sobrevivir, proliferar, diferenciar, secretar adicionales citocinas o mediadores solubles, o retira selectivamente la célula de respuesta al inducir apoptosis u otros mecanismos de muerte celular. Ya que APCs se ha mostrado que facilitan la transferencia de HIV a linfocitos T CD4+, MPIG-1 también puede influenciar esta capacidad y evitar la infección de linfocitos por HIV u otros virus mediados a través de APCs. Esto también es cierto para la infección inicial de APCs, linfocitos T u otros tipos de células por HIV es EBV, o cualquiera de estos virus. Además, reciente demostración de que el receptor MS-1 sirve como un co-factor para facilitar la entrada de HIV en monocitos humanos y linfocitos T, desarrolla una posibilidad interesante de que MPIF-1 y sus variantes pueden interferir con el proceso de la entrada de HIV en las células (ver Ejemplo 11) . De esta manera, MPIF-1 puede ser útil como un agente antiviral para virus y retrovirus cuya entrada se facilita por el receptor MPIF-1. MPIF-1 puede actuar como un factor para mejora inmune al estimular la actividad intrínseca del linfocito T para combatir infección bacterial y viral, así como otros cuerpos extraños. Estas actividades son útiles para respuesta normal a antígenos extraños tales como infección de alergias así como inmunorespuestas a crecimiento neoplástico o benigno incluyendo tanto tumores sólidos como leucemias. Por estas razones, la presente invención es útil para diagnóstico o tratamiento de diversos desordenes relacionados al sistema inmune en mamíferos, de preferencia humanos. Estos desordenes incluyen tumores, cánceres y cualquier desregulación de la función celular inmune incluyendo pero no limitada a, autoinmunidad, artritis, leucemias, linfomas, inmunosupresión, sepsis, sanado de herida, infección aguda y crónica, inmunidad mediada por células, inmunidad humoral, enfermedad de intestino inflamatorio, mielosupresión y semejantes. De acuerdo con esto, MPIF-1 puede emplearse para facilitar el sanado de heridas, al controlar la infiltración de células inmuno objetivo al área de la herida. De manera similar, los polipéptidos de la presente invención pueden mejorar defensas de huésped contra infecciones crónicas, por ejemplo micro materiales, por atracción y activación de leucocitos microbicidas . Los polipéptidos de la presente invención y los polinucleótidos que codifican estos polipéptidos, pueden ser empleados como reactivos de investigación para propósitos in vi tro relacionados a investigación científica, síntesis de .ADN y fabricación de vectores de ADN, y con el propósito de desarrollar agentes terapéuticos y de diagnóstico para ~el tratamiento de enfermedades ?e humanos. Por ejemplo MPIF-1 puede emplearse para la expansión de células progenitoras hematopoyéticas inmaduras, por ejemplo granulocitos, macrófagos o monocitos, al evitar temporalmente su diferenciación. Estas células de médula ósea pueden ser cultivadas in vi tro . Otro uso de los polipéptidos es la inhibición de proliferación de células T o inhibición de biosíntesis LIL-2, por ejemplo en enfermedades auto inmunes y leucemia linfocítica. MPIF-1 también puede ser útil para inhibir proliferación de queratinocitos epidérmicos, que tienen utilidad en psoriasis (hiper proliferación de queratinocitos) ya que las células de Langerhann en la piel se ha encontrado que producen MPIF-1. MPIF-1 puede emplearse para evitar cicatrización durante sanado de herida tanto por el reclutamiento de células inflamatorias y promotoras de tejido conectivo y de limpieza de desechos, y por su control de excesiva fibrosis mediada por TGF, además este polipéptido puede emplearse para tratar ataque, trombosis, embolia pulmonar, y desordenes mieloproliferativos , ya que MPIF-1 incrementa la permeabilidad vascular. Composiciones farmacéuticas . La composición farmacéutica de polipéptido MPIF-1 comprende una cantidad efectiva de un polipéptido MPIF-1 aislado de la invención, particularmente una forma madura del MPIF-1 efectiva para incrementar el nivel de actividad MPIF-1 en dicho individuo. Estas composiciones pueden formularse y dosificarse en una forma consistente como la buena práctica médica, tomando en cuenta la condición clínica del paciente individual (especialmente los efectos secundarios del tratamiento con el polipéptido MPIF-1) , el sitio de suministro de la composición de polipéptido MPIF-1, el método de administración, el programa de administración, dichos factores conocidos a los practicantes. La "cantidad efectiva" de polipéptido MPIF-1 para los propósitos presentes, de esta manera se determinan por esta consideraciones. Polipéptidos, antagonistas, o antagonistas de la presente invención pueden ser empleados en combinación con un portador farmacéutico conveniente. Estas composiciones comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de la proteína y un excipiente o portador farmacéuticamente aceptable. Este portador incluye, pero no está limitado a, salino, salino amortiguado, dextrosa, agua, glicerol, etanol y sus combinaciones. La formulación deberá ajustarse al modo de administración. Por "portador farmacéuticamente aceptable" se entiende que un relleno sólido, semi-sólido o líquido no tóxico, diluyente, material encapsulante o formulación auxiliar de cualquier tipo. El término "parenteral" como se emplea aquí se refiere a modos de administración que incluyen inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intraperi tonal , intraes ternal , subcutánea e intrarticular . El polipéptido MPIF-1 es también convenientemente administrado por sistemas de liberación sostenida. Ejemplos convenientes de composiciones de liberación sostenida incluyen matrices de polímeros semipermeables en la forma de artículos conformados, por ejemplo películas o microcápsulas. Matrices de liberación sostenida incluyen poliláctidas (Patente de los E.U.A. No. 3,773,919, EP 58,481), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma-etil-L- glutamato (Sidman, U. colaboradores, Biopolymers 22:547-556 (1983)), poli (2-hidroxietil metacrilato) (R. Langer y colaboradores, J. Biomed. Ma ter . Res . 15: 167-277 (1981), y R. Langer, Chem. Tech . 12:98-105 (1982)), etilen vinil acetato (R.

Langer y colaboradores , Id. ) ácido poli-D- (-) -3-hidroxibutirico (EP 133,988) Composiciones de polipéptido MPIF-1 de liberación sostenida también incluyen polipéptido MPIF-1 atrapado liposomalmente. Los liposomas que contienen polipéptido MPIF-1 se preparan por métodos conocidos per se: DE 3,218,121; Epstein y colaboradores, Proc . Na ti . Acad. Sci . ( USA) 82:3688-3692 (1985); Hwang y colaboradores, Proc . Nati . Acad . Sci .

( USA) 77:4030-4034 (1980); EP 52,322; EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949; EP 142,641; la solicitud de Patente Japonesa No. 83-118008; Patentes de los E.U.A. Nos. 4,485,045 y 4,544,545; y EP 102,324. Ordinariamente, los liposomas son del tipo unilaminar pequeños (aproximadamente 200-800 Angstroms) en donde el contenido de lípidos es mayor que aproximadamente 30 % en mol de colesterol, la proporción selecta se ajusta para la terapia óptima de polipéptido MPIF-1. Para administración parenteral, en una modalidad, el polipéptido MPIF-1 se formula generalmente al mezclarlo al grado deseado de pureza, en una forma inyectable de dosis unitaria .(solución, suspensión o emulsión) con un portador farmacéuticamente aceptable, es decir uno que no sea tóxico a los receptores en las dosis y concentraciones empleadas y compatible con otros ingredientes de la formulación. Por ejemplo, la formulación de preferencia no incluye agentes oxidantes y otros compuestos que se conocen nocivos para los polipéptidos . En general, las formulaciones se preparan al contactar el polipéptido MPIF-1 de manera uniforme íntima con portadores lípidos o portadores sólidos finamente divididos o ambos. Luego, de ser necesario el producto se constituye en la formulación deseada. De preferencia, el portador es un formulador parenteral, más preferiblemente, una solución que es isotónica con la sangre del receptor. Ejemplos de estos vehículos portadores incluyen agua, salino, solución de Ringer y solución de dextrosa. Vehículos no acuosos tales como aceites fijados y etil aleato son también útiles aquí, así como liposomas.

El portador contiene convenientemente cantidades menores de aditivos tales como substancias que mejoran la isotonicidad y estabilidad química. Estos materiales no son tóxicos a los receptores en las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen amortiguadores tales como fosfato, citrato, succinato, ácido acético y otros ácidos orgánicos o sus sales; antioxidantes tales como ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (menos que aproximadamente 10 residuos), por ejemplo poliarginina o tripéptidos; proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulina; polímeros hidrofílicos tales como polivinil pirrolidona; amino ácidos tales como glicina ácido glutámico, ácido aspártico o arginina, monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos incluyendo celulosa o sus derivados, glucosa, mañosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA, azúcar, alcoholes tales como manitol o sorbitol; contra iones tales como sodio; y/o surfactantes no iónicos tales como polisorbatos , poloxameros, o PEG. El polipéptido MPIF-1 típicamente se formula con estos vehículos a concentraciones de aproximadamente 0.1 mg/ml a 100 mg/ml, de preferencia 1 a 10 mg/ml a un pH de aproximadamente 3 a 8. Se entenderá que el uso de ciertos de los anteriores excipientes, portadores o estabilizantes resultará en la formulación de sales polipéptido MPIF-1. Cuando MPIF-1 y/o una variante de la misma, se administra como un mieloprotector como parte de un régimen terapéutico para el tratamiento de desordenes hiperproliferativos en humanos, un rango "de dosis conveniente para administración intravenosa es 0.01 g/kg a 10 g/kg de peso corporal. Además, MPIF-1 puede administrarse intravenosamente en una dosis de 0.1, 1.0, 10, y 100 g/kg de peso corporal. La extrapolación de datos a partir de estudios de animales indica que una dosis de MPIF-1 adecuada para mieloprotección en humanos, es 0.016 g/kg de peso corporal. Cuando MPIF-1 y/o una variante de la misma, se administra como un tratamiento para daño citotóxico a células, tejidos y órganos puede administrarse a un humano después de exposición al agente citotóxico. Cuando se utiliza como un preventivo, para daños citotóxico a células, tejidos y órganos, MPIF-1 y/o una variante del mismo puede administrarse antes de exposición, o puede administrarse tanto antes como después de exposición al agente citotóxico. Además, MPIF-1 y/o una variante del mismo puede administrarse una vez diariamente por un número especificado de días ~ (por ejemplo tres días) . Además, cuando se emplea en un régimen quimioterapéutico, MPIF-1 puede administrarse a un humano antes de la administración del o de los agentes quimioterapéuticos. Por ejemplo, MPIF-1 puede administrarse dos días antes, un día antes y el día de administración de uno o varios agentes quimioterapéuticos. Cuando MPIF-1 y/o una variante del mismo se administra a un humano para el tratamiento de desordenes mieloproliferativos, las dosis administradas pueden ser las mismas que cuando MPIF-1 se emplea como un mieloprotector . Cuando se administra a un humano o para el tratamiento de desordenes mieloproliferativos, MPIF-1 puede administrarse subcutáneamente. El polipéptido MPIF.l a utilizarse para la administración terapéutica debe ser estéril. La esterilidad se logra fácilmente por filtración a través de membranas de filtración estéril (por ejemplo membranas de 0.200 miera) . Composiciones de "polipéptido MPIF-1 terapéuticas, en general se colocan en un' recipiente que tiene una compuerta de acceso estéril, por ejemplo una bolsa o ampolleta de solución intravenosa que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica. El polipéptido MPIF-1 ordinariamente es almacenada en recipientes de dosis unitarias o múltiples dosis, por ejemplo ampolletas selladas, como una solución acuosa o como una formulación liofilizada para reconstitución. Como un ejemplo de una formulación liolizada, ampolletas de 10 ml se llenan con 5 ml de solución de polipéptido MPIF-1 acuosa 1% (p/v) filtrada estéril, y la mezcla resultante se liofiliza. La solución de infusión se prepara al reconstituir MPIF-1 liofilizado utilizando agua - para - inye c c i ón bacterioestática . La invención también proporciona un paquete o equipo farmacéutico que comprende uno o más recipientes llenos con uno o más de los ingredientes de las composiciones farmacéuticas de la invención. Asociados con este o estos recipientes puede estar un aviso en la forma predeterminada con una agencia gubernamental que regula la fabricación, uso o venta de productos farmacéuticos o biológicos, este aviso refleja la aprobación por la agencia de fabricación, uso o venta para administración en humanos. Además, los polipéptidos de la presente invención pueden emplearse en conjunto con otros compuestos terapéuticos. La invención también proporciona métodos de tratamiento y/o prevención de enfermedades o desordenes (tal como por ejemplo cualquiera una o más de las enfermedades o desordenes aquí descritos) por la administración a un sujeto de una cantidad efectiva de un agente terapéutico. Por agentes terapéuticos se entienden polinucleótidos o polipéptidos (incluyendo fragmentos y variantes) , agonistas o antagonistas de los mismos y/o anticuerpos en combinación con un tipo portador farmacéuticamente aceptable (por ejemplo un portador estéril) . MPIF-1 se formulará y dosificará en una forma consistente con la buena práctica médica, tomando en cuenta la condición clínica del paciente individual, (especialmente los efectos secundarios de tratamiento con MPIF-1 solo) el sitio de suministro, el método de administración, la programación de administración y otros factores conocidos a quienes lo practican. La "cantidad efectiva" para los presentes propósitos de esta manera se determina por estas consideraciones. Como una proposición general, la cantidad efectiva farmacéuticamente total de MPIF-1 suministrada parenteralmente por dosis estará en el rango de aproximadamente 1 µg/kg/día a 10 µg/kg/día de peso corporal del paciente, aunque como se notó anteriormente, eso estará sujeto a lesión terapéutica. Más preferiblemente, esta dosis es al menos 1 µg/kg/día, y en especial para humanos entre aproximadamente .01 a 1 µg/kg/día para la hormona. Si se suministrara continuamente, MPIF-1 se administra típicamente a una velocidad de dosis de aproximadamente 1 µg/kg/hora a aproximadamente 50 µg/kg/hora ya sea por una a cuatro inyecciones por día o por infusiones subcutáneas continuas, por ejemplo utilizando una mini bomba. Una solución de bolsa intravenosa también puede ser empleada. La longitud de tratamiento requerida para observar cambios y el siguiente intervalo de tratamiento para que fueran respuestas p'arece variar dependiendo del efecto deseado . MPIF1, puede administrarse oralmente, rectalmente, parenteralmente, intracisternalmente, intravaginalmente, intraperitonealmente, tópicamente (mediante polvos, ungüentos, geles, gotas o parche transdérmico) bucalmente o como un roclo oral o nasal. "Portador farmacéuticamente aceptable" se refiere a un relleno sólido, semi-sólido, o líquido no tóxico, diluyente, material encapsulado o formulación auxiliar de cualquier tipo. El término "parenteral" como se emplea aquí, se refiere a modos de administración que incluyen inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intraesternal , subcutánea e intrarticular . MPIF-1 también se administra convenientemente por sistemas de liberación sostenida. Ejemplos convenientes de MPIF-1 de liberación sostenida se administran oralmente, rectalmente, parenteralmente, intracisternalmente, intravaginalmente, intraperitonealmente, tópicamente (mediante polvos, ungüentos, geles, gotas o parche transdérmico) bucalmente o como un rocío oral o nasal. "Portador farmacéuticamente aceptable" se refiere a un relleno sólido, semi-sólido, o líquido no tóxico, diluyente, material encapsulado o formulación auxiliar de cualquier tipo. El término "parenteral" como se emplea aquí, se refiere a modos de administración que incluyen inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intraesternal, subcutánea e intrarticular . MPIF-1 también se administra convenientemente por sistemas de liberación sostenida. Ejemplos convenientes de MPIF-1 de liberación sostenida incluyen materiales poliméricos convenientes (tales como por ejemplo matrices poliméricas impermeables en la forma de artículos conformados, por ejemplo películas o micro cápsulas) , materiales hidrofóbicos convenientes (por ejemplo como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, y derivados escasamente solubles (tales como por -ejemplo una sal escasamente soluble) . Matrices de liberación sostenida incluye un polilactida (Patente de los E.U.A. No. 3,773,919, EP 58,481), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma-etil-L-glutamato (Sidman, y colaboradores, Biopolymers 22:547-556 "(1983)), poli (2 -hidroxietil metacrilato) (Langer, y colaboradores J". Biomed . Ma ter. .Res. 15:167-277 (1981); Langer, Chém . Tech . 12:98-105 (1982) ) , etilen vinil acetato (Langer y t colaboradores , Id. ) o ácido poli- D- ( - ) -3-hidroxibutírico (EP 133,988). MPIF-1 de liberación sostenida también incluye MPIF-l atrapado liposomalmente (ver en general, Langer, Science 249: 1527- 1533 (1990); Treat, y colaboradores, in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cáncer, (Liposomas en la terapia de enfermedaes infecciosas y cáncer) Lopez-Berestein y Fidler (eds.), Liss, New York, pp . 317-327 y 353-365 (1989)). Liposomas que contienen MPIF-1 se preparan por métodos conocidos per se: DE 3,218,121; Epstein, y colaboradores, Proc .

Nati . Acad. Sci . (USA) 82:3688-3692 (1985); Hwang, y colaboradores, Proc . Na ti . Acad. Sci . (USA) 77:4030-4034 (1980); EP 52,322; EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949; EP 142,641; Solicitud de Patente Japonesa 83-118008; Patentes de los E.U.A. Nos. 4,485,045 y 4,544,545; y EP 102,324. Ordinariamente, los liposomas son del tipo unilaminar pequeños (aproximadamente 200-800 Angstroms) en donde el contenido de lípido es mayor que aproximadamente 30 % en mol. de colesterol, la proporción selecta se ajusta para la terapéutica óptima. En una modalidad todavía adicional, MPIF-1 se suministra mediante una bomba ( ver Langer, arriba ; Sefton, CRC Crit. Ref.- Bio ed. Eng. 14:201 (1987); Buchwald, y colaboradores, Surgery 88:507 (1980); Saudek, y colaboradores, N. Engl . J. Med. 321:574 (1989)) Otros sistemas de liberación controlada se discuten en la revisión por Langer (Science 249: 1527- 1533 (1990) ) . Para administración parenteral, en una modalidad, MPIF-1 se formula generalmente al mezclarlo al grado deseado de pureza, en una forma inyectable en dosis unitaria (solución, suspensión, o ^emulsión) , con un portador farmacéuticamente aceptable, es decir uno que no es tóxico a receptores en las dosis de concentraciones amplias y sea compatible con otros ingredientes de la formulación. Por ejemplo, la formulación de preferencia no incluye agentes oxidantes, u otros compuestos que se conoce son nocivos para MPIF-1. En general, las formulaciones se preparan al contactar un MPIF-1 de manera uniforme e íntima, con portadores líquidos o portadores sólidos generalmente divididos o ambos.

Luego, de ser necesario, el producto se configura en la formulación deseada. De preferencia, el portador es un portador parenteral, más preferiblemente una solución que es isotónica con la sangre del recipiente. Ejemplos de estos vehículos portadores incluyen agua, salino, solución de Ringer y solución de dextrosa. Vehículos no acuosos tales como aceites fijos y etil oleato también son útiles aquí así como liposomas. El portador contiene convenientemente cantidades menores de aditivos tales como substancias que mejoran la isotonicidad y estabilidad química. Estos materiales no son tóxicos a los receptores en las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen amortiguadores tales como fosfato, citrato, succinato, ácido acético y otros ácidos orgánicos o sus sales; antioxidantes tales como ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (menos que aproximadamente 10 residuos) , por ejemplo poliarginina o tripéptidos; proteínas tales como albúmina, suero, gelatina o inmunoglobulina; polímeros hidrofílicos tales como polivinil pirrolidona; amino ácidos tales como glicina ácido glutámico, ácido aspártico o arginina, monosacáridos, disacárídos, y otros carbohidratos incluyendo celulosa o sus derivados, glucosa, mañosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA, azúcar, alcoholes tales como manitol o sorbitol; contra iones tales como sodio; y/o surfactantes no iónicos tales como polisorbatos, poloxámeros, o PEG. El MPIF-1 se formula típicamente en estos vehículos a concentraciones de aproximadamente 0.1 mg/ml a 100 mg/ml, de preferencia 1 a 10 mg/ml a un pH de aproximadamente 3 a 8. Se entenderá que el uso de ciertos de los anteriores excipientes, portadores o estabilizantes resultará en la formulación de sales • polipéptido . 10 Cualquier producto farmacéutico empleado para administración terapéutica puede ser estéril. La esterilidad se logra fácilmente por filtración a través de membranas de filtración estéril (por ejemplo membranas de 0.200 "miera) . MPIF-1 en general se coloca en un 15 recipiente que tiene una compuerta de acceso estéril, por ejemplo una bolsa o ampolleta de solución intravenosa que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica . El MPIF-1 ordinariamente se almacenará en 20 recipientes de dosis unitarias o múltiples dosis, por ejemplo ampolletas selladas, como una solución acuosa o como una formulación liofilizada para reconstitución. Como un ejemplo de una formulación liolizada, ampolletas de 10 ml se llenan con solución de MPIF-1 acuosa al 1% 25 (p/v) filtrada estéril, y la mezcla resultante se liofiliza. La solución de infusión se prepara al reconstituir el MPIF-1 liofilizado utilizando agua-para-inyección bacterioestática. La invención también proporciona un paquete o equipo farmacéutico que comprende uno o más recipientes llenos con uno o más de los ingredientes de MPIF-1. Asociado con este o estos recipientes puede estar un aviso en la forma predeterminada con una agencia gubernamental que regula la fabricación, uso o venta de productos farmacéuticos o productos biológicos, este aviso refleja aprobación por la agencia, de la fabricación, uso o venta para administración para humanos. Además, el MPIF-1 puede emplearse en conjunto con otros compuestos terapéuticos . MPIF-1 puede administrarse solo o en combinación con adyuvantes. Adyuvantes que pueden administrarse con MPIF-1 incluyen, pero no están limitados a, alumbre, alumbre más deoxicolato (ImmunoAg) , MTP-PE (Biocine Corp.), QS21 (Genentech, Inc.), BCG, y MPL. En una modalidad específica, MPIF-1 se administra en combinación con alumbre. En otra modalidad específica, MPIF-1 se administra en combinación con QS-21. Adicionales adjuvantes que pueden administrarse con MPIF-l incluyen, pero no están limitados a, inmunomodulador monofosforil lípido, AdjuVax 100a, QS-21, QS- 18, CRL 1005, sales de aluminio, MF-59, y tecnología adyuvante virosomal . Vacunas que pueden administrarse con MPIF-1 incluyen, pero no están limitadas , vacunas dirigidas hacia protección contra MMR (measles, mumps, rubella) , polio, varicela, tétanos/difteria, hepatitis A, hepatitis B, influenza hemófila B, tos ferina, neumonía, influenza, enfermedad de Lyme, rotavirus, colera, fiebre amarilla, encefalitis Jaóponesa, poliomielitis, rabia, fiebre tifoidea, y pertusis. Combinaciones pueden administrarse ya sea concomitantemente, por ejemplo como una mezcla, separadamente, pero en forma simultánea o concurrente, o secuencialmente. Esto incluye presentaciones en las que los agentes combinados se administran en conjunto con una mezcla terapéutica, y también procedimientos en los que los agentes combinados se administran por separado pero simultáneamente, por ejemplo como a través de líneas intravenosas separadas en el mismo individuo. Administración "en combinación" además incluye la administración separada de uno de los compuestos o agentes dados primero, seguido por el segundo . MPIF-1 puede administrarse solo o en combinación con otros agentes terapéuticos . Agentes terapéuticos que puedan administrarse en combinación con MPIF-l incluyen pero no están limitados a, otros miembros de la familia TNF, agentes citotóxicos, agentes quimioterapéuticos, radiación, sensibilizantes de radiación, radioterapia dirigida, antibióticos, antivirales, anti-inflamatorios esferoidales y no esferoidales agentes inmunoterapéuticos, agentes de radioinmunodetección, citocinas y/o factores de crecimiento. Combinaciones pueden administrarse ya sea de manera concomitante por ejemplo como una mezcla, separadamente pero en forma simultánea, concurrente o secuencialmente. Esto incluye presentaciones en donde los agentes combinados se administran junto como una mezcla terapéutica y también procedimientos en donde los agentes combinados se administran por separado pero en forma simultánea, por ejemplo a través de líneas intravenosas separadas en el mismo individuo . La administración comienza "en combinación" además incluye la administración separada de uno de los compuestos o agentes primero suministrados seguido por el segundo. En una modalidad, MPIF-1 se administra en combinación con miembros de la familia TNF. Moléculas TNF, relacionadas al TNF o tipo TNF que puede administrarse con MPIF-1 incluyen, pero no están limitadas a, formas soluble de TNF-alfa, linfotoxina-alfa (LT-alfa, también conocido como TNF-beta) , LT-beta (encontrado en heterotrímera complejo LT-alfa2-beta) , OPGL, FasL, CD27L, CD3OL, CD40L, 4-1BBL, DcR3 , OX40L, TNF-gamma (Publicación Internacional No. WO 96/14328) , AIM-I (Publicación Internacional No. WO 97/33899), endocina-alfa (Publicación Internacional No. WO 98/07880) , TR6 (Publicación Internacional No. WO 98/30694), OPG, y neutrocina-alfa (Publicación Internacional No. WO 98/18921, OX40, y factor de crecimiento de nervios (NGF) , y formas solubles Fas, CD30, CD27, CD40 y 4-IBB, TR2 (Publicación Internacional No. WO 96/34095) , DR3 (Publicación Internacional No. WO 97/33904) , DR4 (Publicación Internacional No. WO 98/32856) , TR5 (Publicación Internacional No. WO 98/30693) , TR6 (Publicación Internacional No. WO 98/30694) , TR7 (Publicación Internacional No. WO 9a/41629) , TRANK, TR9 (Publicación Internacional No. WO 98/56892) , TRIO (Publicación Internacional No. WO 98/54202) , 312C2 (Publicación Internacional No. WO 98/06842), y TR12, y formas solubles CD154, CD70, y CD153. En ciertas modalidades, MPIF-1 se administra en combinación con agentes antiretrovirales, inhibidores de transcriptasa inversa nucleótidos, inhibidores de transcriptasa inversa no nucleótidos y/o inhibidores de proteasa. Inhibidores de transcriptasa inversa nucleótidos que pueden administrarse en combinación con MPIF-1, incluyen pero no están limitados a RETROVIR™ (zidovudina/AZT) , VIDEX™ (didanosina/ddl) , HIVID™ (zalcitabina/ddC) , ZERIT™ (stavudina/d4T) , EPIVIR™ (lamivudina/3TC) , y COMBIVIR™ (zidovudina/ lamivudina) .

Inhibidores de transcriptasa inversa "no nucleótidos que pueden administrarse en combinación con MPIF-1, incluyen pero no están limitados a, VIRAMUNE™ (nevirapina) , RESCRIPTOR™ (delavirdina) , y SUSTIVAT [efavirenz) Inhibidores de proteasa que pueden administrarse en combinación con MPIF-1, incluyen pero no están limitados a, CRIXIVAN™ (indinavir) , NORVIR™ (ritonavir) , INVIRASE™ (saquinavir) , y VIRACEPT™ (nelfinavir) . En una modalidad específica, agentes antiretroviral, inhibidores de transcriptasa inversa nucleótidos, inhibidores de transcriptasa inversa no . nucleótidos y/o inhibidores de proteasa que pueden administrarse en cualquier combinación con MPIF-1 para tratar SIDA (AIDS) y/o para evitar o tratar infección HIV. En otras modalidades, MPIF-l puede administrarse en combinación con agentes e infección anti-oportunistico. Agentes anti-oportunísticos pueden administrarse en combinación con MPIF-1, incluyen pero no están limitados a, TRIMETHOPRIM-SULFAMETHOXAZOLE™, DAPSONE™, PENTAMIDINE™, ATOVAQUO?sTE™, ISONIAZID™, RIFAMPIN™, PYRAZINAMIDE™, ETHAMBUTOL™, RIFABUTIN™, CLARITHROMYCIN™, AZ ITHROMYCIN™ , GANCICLOVIR™ , FOSCARNET™, CIDOFOVIR™, FLUCONAZOLE™, ITRACONAZOLE™, KETOCONAZOLE™, ACYCLOVIR™, FAMCICOLVIR™, PYRIMETHAMINE™, LEUCOVORIN™, NEUPOGEN™ (filgrastim/G-CSF) , y LEUKINE™ (sargramostim/GM-CSF) . En una modalidad específica, MPIF-1 se emplea en cualquier combinación con TRIMETHOPRIM-SULFAMETHOXAZOLE™, DAPSONE™, PENTAMIDINE™, y/o ATOVAQUONE™ para tratar o evitar profilácticamente una infección de neumonía Pneumocystis carinii . En otra modalidad específica, MPIF-1 se emplea en cualquier combinación con ISONIAZID™, RIFAMPIN™, PYRAZINAMIDE™, y/o ETHAMBUTOL™ para tratar o evitar profilácticamente una infección oportunista de Mycobacterium avi um . En otra modalidad específica, MPIF-1 se emplea en cualquier combinación con RIFABUTIN™, CLARITHROMYCIN™, y/o AZITHROMYCIN™ para tratar o evitar profilácticamente una infección oportunista de Mycobacterium tuberculosis. En otra modalidad específica, MPIF-1 se emplea en cualquier combinación con GANCICLOVIR™, FOSCARNET™, y/o CIDOFOVIR™ para tratar o evitar profilácticamente una infección oportunista de cytomegalovirus . . En otra modalidad específica, MPIF-1 se emplea en cualquier combinación con FLUCONAZOLE™, ITRACONAZOLE™, y/o KETOCONAZOLE™ para tratar o evitar profilácticamente una infección fungal oportunista. En otra modalidad específica, MPIF-1 se emplea en cualquier combinación con ACYCLOVIR™ y/o FAMCICOLVIR™ para tratar o evitar profilácticamente una infección de tipo I y/o tipo II de virus herpes simplex oportunista. En otra modalidad específica, MPIF-1 se emplea en cualquier combinación con PYRIMETHAMINE™ y/o LEUCOVORIN™ para tratar o evitar profilácticamente una infección Toxoplasma gondii oportunista. En otra modalidad específica, MPIF-1 se emplea en cualquier combinación con LEUCOVORIN™ y/o NEUPOGEN™ para tratar o evitar profilácticamente una infección bacterial oportunista . En una modalidad adicional, MPIF-1 se administra en combinación con un agente antiviral. Agentes antivirales que pueden administrarse con MPIF-1 incluyen, pero no están limitados a, aciclovir, ribavirina, amantadina, y remantidina. En una modalidad adicional, MPIF-1 se administra en combinación con un agente antibiótico. Agentes antibióticos que pueden administrarse con MPIF-1 incluyen, pero no están limitados a, amoxicilina, beta- lactamasas , aminoglicosidos , beta-lactama (glicopépt ido) , beta - lactamasas , Clindamicina, cloramfenicol, cefalosporinas, ciprofloxacina , ciprofloxacina, eritromicina, fluoroquinolonas , macrolidas, metronidazol, penicilinas, quinolonas, rifampina, estreptomicina, sulfonamida, tetraciclinas, trimetoprima, trimetoprima-sulfamtoxazol , y vancomicina. Agentes inmunosupresores " no específicos convencionales que pueden administrase en -combinación con MPIF-1 incluyen, pero no están limitados a, esteroides, ciclosporina, análogos de ciclosporina, ciclofosfamida metilprednisona, prednisona, azatioprina, FK-506, 15-deoxispergualina, y otros agentes inmunosupresores que actúan al suprimir la función de células T resporidentes . En modalidades específicas, MPIF-1 se administra en combinación con _ inmunosupresores. Preparaciones inmunosupresoras que pueden administrarse con MPIF-1 incluyen, pero no están - limitados a, ORTHOCLONE' (OKT3) , SANDIMMUNE™/NEORAL™/SANGDYAt (cyclosporin) , PROGRAF™ (tacrolimus) , CELLCEPT™ (mycophenolate) , Azatioprina, glucorticosteroides, y RAPAMUNE™ (sirolimus) . En una modalidad específica, pueden emplearse imunosupresores para evitar rechazo de órganos o transplante de médula ósea. En una modalidad adicional, MPIF-1 se administra solo o en combinación con uno o más preparaciones de inmunoglobulina - intravenosa. Preparaciones de inmunoglobulina intravenosa que pueden administrarse con MPIF-1 incluyen pero no están limitadas a GAMMAR™, IVEEGAM™, SANDOGLOBULIN™, GAMMAGARD S/D™, y GAMIMUNE™. En una modalidad específica, MPIF-1 se administra en combinación con -preparaciones de inmunoglobulina intravenosa en terapia de transplante (por ejemplo transplante de médula ósea) . En una modalidad adicional, MPIF-1 se administra solo o en combinación con un agente anti-inflamatorio. Agentes anti-inflamatorios que pueden administrarse con - MPIF-1 incluyen pero no están limitadas a, glucocorticoides y los anti-inflamatorios no esferoidales, derivados de ácido aminoarilcarboxílico, derivados de ácido arilacético, derivados de ácido arilbutírico, derivados de ácido arilcarboxílicos, y derivados de ácido arilpropiónico, pirazoles, pirazolonas, derivados de ácido salicílico, t iazincarboxamidas , ácido e-acetamidocapróico , S-adenosilmetionina, ácido 3-amino-4-hidroxibutírico, amixetrina, bendazac, bencildamina, bucoloma, difenpiramida, ditazol, emorfazona, guaiazulena, nabumetona, nimesulida, orgoteina, oxaceprol, paranilina, perisoxal, pifoxima, proquazona, proxazol , y tenidap. En otra modalidad, composiciones de MPIF-1 se administran en combinación con un agente químioterapéutico. Los agentes quimioterapéuticos que pueden administrarse con MPIF-1 incluyen pero no están limitados a, derivados antibióticos -(por ejemplo, doxorubicina (Adriamycin™) , bleomicina, daunorubicina, y dactinomicina) ; antiestrógenos (por ejemplo, tamoxifen) ; antimetabolitos (por ejemplo, fluorouracilo, 5-FU, metotrexato, floxuridina, interferona alfa-2b, ácido glutámico, plicamicina, mercaptopurina, y 6-tioguanina) ; agentes citotóxicos (por ejemplo, carmustina, BCNU, lomustina, CCNU, citosina arabinósido, ciclofosfamida, estramustina, hidroxiurea, procarbazina, mitomicina, busulfan, cis-platina, y vincristina sulfato) ; hormonas (por ejemplo, medroxiprogesterona, estramustin fosfato sodio, etinil estradiol, estradiol, megestrol acetato, metiltestosterona, dietilstilbestrol difosfato, clorotrianiseno, y testolactona) ; derivados de mostaza de nitrógeno (por ejemplo, mefalen, corambucil, mecloretamina (mostaza de nitrógeno) y tiotepa) ; esteroides y combinaciones (por ejemplo, fosfato de betametasona sodio) ; y otros (por ejemplo, dicarbazina, asparaginasa, mitotano, vincristina sulfato, vmblastina sulfato, y etopóside) . En una modalidad específica, MPIF-1 se administra en combinación con CHOP (ciclofosfamida, doxorubicina, vincristina, y prednisona) o cualquier combinación de los componentes de CHOP. En otra modalidad, MPIF-1 se administra en combinación con Rituximab . En una modalidad adicional, MPIF-1 se administra con Rituxmab y CHOP, o Rituxmab y cualquier combinación de los componentes de CHOP. En una modalidad 'adicional, MPIF-1 se administra con citocinas. Citocinas que pueden administrarse con MPIF-1 incluye, pero no está limitado a, IL2, IL3, IL4 , IL5 , IL6 , IL7, IL10, IL12, IL13 , IL15, anti-CD40, CD40L, IFN-gamma y TNF-alfa. En otra modalidad, MPIF-1 puede administrarse con cualquier interleucina, incluyendo, pero no limitado a, IL-lalfa, IL-lbeta, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, y TE-21. En una modalidad adicional, MPIF-1 se administra en combinación con proteínas angiogénicas. Proteínas angiogénicas pueden administrarse con MPIF-1 incluyen, pero no está limitadas a, factor de crecimiento derivado de Glioma (GDGF = Glioma Derived Growth Factor) , como se describe en la Patente Europea No. EP-399816; Factor de crecimiento derivado de plaquetas-A (PDGF-A) , como se describe en la Patente Europea No EP-682110; Factor de crecimiento derivado de plaquetas -B (PDGF-B) , como se describe en la Patente Europea No. EP-282317; Factor de crecimiento de placenta (PIGF = Placental Growth Factor), como se describe en ,1a Publicación Internacional No. WO 92/06194; Factor de crecimiento de placenta-2 (P1GF-2) , como se describe en Hauser, y colaboradores . , Growth Factors (Factores de Crecimiento) 4:259-268 (1993); Factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF = Vascular Endothelial Growth Factor) como se describe en la Publicación Internacional No. WO 90/13649; Factor de crecimiento endotelial vascular-A (VEGF-A) , como se describe en la Patente Europea No.

EP-506477; Factor de crecimiento endotelial vascular-2 (VEGF-2) , como se describe en l'a Publicación Internacional No. WO 96/39515; Factor de crecimiento endotelial vascular B (VEGF-3); Factor de crecimiento endotelial vascular B-186 (VEGF-B186) , como se describe en la Publicación Internacional No. 96/26736; Factor de crecimiento endotelial vascular-D (VEGF-D) , como se describe en la Publicación Internacional No. WO 98/02543; Factor de crecimiento endotelial vascular-D (VEGF-D) , como se describe en la Publicación Internacional No. WO 98/07832; y Factor de crecimiento endotelial vascular-E (VEGF-E) , como se describe en la Patente Alemana No. DE19639601. Las referencias anteriormente mencionadas se incorporan aquí por referencia. En una modalidad adicional, MPIF-1 se administra en combinación con factores de crecimiento hematopoyético. Los factores de crecimiento hematopoyéticos que pueden administrarse con MPIF-1 incluyen, pero no están limitados a, LEUKINETM (SARGRAMOSTIM™) y NEUPOGEN™ (FILGRASTIM™) . En una modalidad adicional, MPIF-1 se administra en combinación con factores de crecimiento de Fibroblastos . Factores de crecimiento de Fibroblastos que pueden administrarse con MPIF-1 incluyen, pero no están limitados a, FGF-1, FGF-2, FGF-3, FGF-4, FGF-5, FGF-6, FGF-7, FGF-8, FGF-9, FGF-10, FGF-11, FGF- 12, FGF-13, FGF- 14, y FGF- 15. En modalidades adicionales, MPIF-1 se administra en combinación con _^. otros regímenes terapéuticos o profilácticos tal como por,ejemplo terapia de radiación. En modalidades adicionales los polinucleótidos, polipéptidos, agonistas y/o agonistas de la presente invención también pueden administrarse solos con factores anti-angiogénicos . Ejemplos representativos de factores anti-angiogénicos Incluyen: factor Anti-Invasivo, ácido retinoico y sus derivados, paclitaxel, Suramin, inhibidor _ de tejido de Metalloproteinasa-1 , inhibidor de , tejido de Metaloproteínasa-2 , inhibidor de activador de Plasminogeno-1, inhibidor de activador de Plasminogeno-2 y diversas formas de los métales de transición más ligeros del "grupo d" .

Metales de transición del "grupo d" más ligeros incluyen, por ejemplo, las especies de vanadio, molibdeno, tungsteno, titanio, niobio, y tantalio. Estas especies de metal de transición pueden formar complejos de metal de transición. Complejos adecuados para las especies de metal de transición anteriormente mencionadas incluyen complejos de metal de transición oxo. Ejemplos representativos de complejos de vanadio incluyen complejos de vanadio oxo tales como complejos de vanadato y vanadilo. Adecuados complejos de vanadato incluyen complejos de metavanadato y ortovanadato tales como por ejemplo metavanadato de amonio, metavanadato de sodio, metavanadato y ortovanadato de sodio. Complejos de vanadilo convenientes incluyen por ejemplo vanadil .acetilacetonato y vanadil sulfato incluyendo vanadil sulfato hidratos tales como vanadil sulfato mono- y trihidratos . Ejemplos representativos de complejos de tungsteno y molibdeno también incluyen complejos oxo. Adecuados complejos oxo tungsteno incluyen tungstato y óxido de tungsteno. Complejos de tungstato convenientes incluyen tungstato de amonio, tungstato de calcio, tungstato de sodio dihidrato, y ácido túngstico. Óxidos de tungsteno convenientes incluyen óxido de tungsteno (IV) y óxido de tungsteno (VI) . Complejos oxo molibdeno convenientes incluyen molibdato, óxido de molibdeno, y complejos molibdenilo. Complejos de molibdeno convenientes incluyen molibdato de amonio y sus hidratos, molibdato de amonio y sus hidratos, y molibdato de potasio y sus hidratos. Óxidos de molibdeno convenientes incluyen óxido de 'molibdeno incluyen óxido de molibdeno (VI) , óxido de molibdeno (VI) , y ácido molíbdico. Complejos de molibdenilo convenientes incluyen for ejemplo, molibdenil acetilacetonato. Otros complejos de tungsteno y molibdeno convenientes incluyen derivados hidroxo, derivados de, por ejemplo, glicerol, ácido tartárico y azúcares . Una amplia variedad de otros factores anti-angiogénicos también puede emplearse en el concepto de la presente invención. Ejemplos representativos incluyen factor de plaquetas 4; sulfato de protamina; derivados de quitina sulfatados (preparados a partir de conchas de cangrejo reina) , (Murata y, colaboradores , Cáncer Res . 51:22-26, 1991); Complejo peptidoglican polisacárido sulfatado (SP- PG) (la función de este compuesto puede ser mejorada por la presencia de esteroides tales como estrógeno, y tamoxifen citrato) ; Estaurosporina; moduladores de metabolismo de matriz incluyen por ejemplo análogos de prolina, cishidroxiprolína, d, L-3 , 4-dehidroprolina, Tiaprolina, alfa, alfa-dipiridilo, aminopropioñitrilo fumarato; 4-propil-5- (4-piridinil) -2- (3-H) -oxazolona; Metotrexato; Mitoxantrona; Heparina; ínterferonas( - 2 suero- Macroglobulina; ChIMP-3 (Pavloff y colaboradores, J. Bio .

Chem. 267:17321-17326, 1992); Quimiostatína (Tomkinson y colaboradores , Biochem J. 286:475-480, 1992! Ciclodextrina Tetradecasulfato ; Eponemic ina ; Camptotecina; Fumagilina (Ingber y colabqradores , Na ture 348:555-557, 1990); tiomalato de oro sodio ("GST"; Matsubara y Ziff, ". Clin . Invest . 79:1440-1446, 1987); suero-anticolagenasa; alfa2-antiplasmina (Holmes y colaboradores, ". Biol . Chem. 262 (4) : 1659-1664 , 1987); Bisantrene (National Cáncer Institute) ; Lobenzarit disodio ácido (N- (2) -carboxifenil-4- cloroantronilico o "CCA"; Takeuchi y colaboradores . , Agents Actions 36:312-316, 1992); Talidomida; esteroide angostático; AGM-1470; carboxinaminoimidazol ; e inhibidores de metaloproteinasa tales como BB94. Modos de administración . , Se apreciará que condiciones provocadas por un decremento en el nivel estándar o normal de actividad MPIF-1 en un individuo, pueden tratarse por administración de proteína MPIF-1. De esta manera, la invención además proporciona un método para tratar un individuo que requiere un nivel incrementado de actividad de MPIF-1, que comprende administrar a este individuo una composición farmacéutica que comprende la cantidad efectiva de un polipéptido MPIF-1 aislado de la invención, particularmente una forma madura del MPIF-1 efectiva para incrementar el nivel de actividad el MPIF-1 no era ese individuo. Las cantidades y regímenes de dosis de MPIF-1 administradas a un sujeto dependerán de una cantidad de factores tales como el modo de administración, la naturaleza de la condición a tratar y el juicio del médico que receta. Las composiciones farmacéuticas se administran en una cantidad que es efectiva para tratar y/o profilaxis de la indicación especifica. En general, los polipéptidos se administran en una .cantidad de al menos aproximadamente 10 µg/kg de peso corporal y en la mayoría de los casos se administrarán en una cantidad que no excede aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal por día y de preferencia la dosis es de 10 µg/kg de peso corporal por día tomando en cuenta las rutas de administración, síntomas, etc. Como una proposición general, la cantidad efectiva farmacéuticamente total de polipéptido MPIF-1 administrado parenteralmente por dosis, más preferiblemente está en el rango de 1 g/kg/día a 10 mg/kg/día de peso corporal del paciente, aunque como se notó anteriormente, este será sujeto a discreción terapéutica. Aún más preferible, esta dosis es al menos 0.01 mg/kg/día, y más preferible para humanos entre aproximadamente 0.01 y 1 mg/kg/día. Si se suministra continuamente, el polipéptido MPIF-1 típicamente se administra a una velocidad de dosis de aproximadamente 1 g/kg/hora a aproximadamente 50 g/kg/hora, ya sea por 1 a 4 inyecciones por día o por infusiones subcutáneas continuas por ejemplo utilizando una mini bomba. Una solución de bolsa intravenosa también puede emplearse. La longitud o duración del tratamiento también fue requerida para observar cambios y el intervalo después de tratamiento para que ocurran respuestas parecen variables dependiendo del efecto deseado. Composiciones farmacéuticas que contienen MPIF-1 de la invención pueden administrarse oralmente, rectalmente, parenteralmente, intracisternalmente, intravaginalmente, intraperitonealmente, tópicamente (tal como por polvos, ungüentos, gotas o transdérmico) , bucalmente, o como un rocío oral o nasal. Terapia de Genes Los quimosina polipéptidos y agonistas o antagonistas que son polipéptidos pueden emplearse de acuerdo con la presente invención por expresión de estos polipéptidos in vivo, que a menudo se refieren como "terapia de genes". De esta manera, por ejemplo células de un paciente pueden someterse a ingeniería con un polinucleótido (.ADN o ARN) que codifica un polipéptido ex vivo, con las células de ingeniería que se proporcionan a un paciente a atrapar con los polipéptidos. Estos métodos son bien conocidos en' la especialidad. Por ejemplo, pueden someterse células a ingeniería por procedimientos conocidos en la especialidad por uso de una partícula retroviral que contiene .ARN que codifica los polipéptidos de la presente invención. Similarmente, células pueden ser sometidas a ingeniería in vivo para expresión de polipéptidos in vivo, por ejemplo por procedimientos conocidos en la especialidad. Como se conoce en la técnica, una célula productora de una partícula retroviral que contiene ARN que codifica los polipéptidos de la -presente invención, puede administrarse a un paciente para someter a ingeniería las células in vivo y expresión de los polipéptidos in vivo . Estos y otros métodos para administrar polipetidos de la presente invención, por este método deberán ser aparentes a aquellos con destreza en la especialidad a partir de las enseñanzas de la presente invención. Por ejemplo, el vehículo de expresión para células sometidas a ingeniería puede ser diferente a un retrovirus, por ejemplo un adenovirus que puede emplearse para someter células a ingeniería in vivo después de combinación con un vehículo de suministro conveniente . Los vectores plásmido retrovirales pueden derivarse de retrovirus que incluyen, pero no están limitados a, virus Sarcoma Murine Moloney, virus de leucemia Murino Moloney, virus de necrosis de bazo, virus de Sarcoma de Rous y virus de Sarcoma de Harvey. . En una modalidad preferida, el vector de expresión retroviral, pMV-7, está flanqueado por las repeticiones terminales largas (LTRs = long terminal repeats) de virus sarcoma murino Moloney, y contiene el gen de resistencia a drogas seleccionable de neo bajo la regulación del promotor timidina cinasa (tk) de virus herpes simplex (HSV) . Sitios únicos EcoRI y HindIII facilitan la introducción de la secuencia de codificación (Kirschmeier, P.T. y colaboradores, DNA (ADN) 7:219-25 (1988) ) . Los vectores incluyen uno o más promotores convenientes que comprenden, pero no están limitados a, el LTR retroviral; el promotor SV40, y el promotor citomegalovirus humano (CMV) descrito en Miller, y colaboradores, Biotechniques, Vol. 7, No. 9:980-990 (1989) , o cualquier otro promotor (por ej mplo .

Promotores celulares tales como promotores celulares eucarióticos, incluyendo pero no limitados a, histona, pol III, y promotores-actina) . La selección de un promotor conveniente será aparente para aquellos con destreza en la especialidad a partir de , las enseñanzas aquí contenidas . La secuencia aquí contenida de ácido nucleico que codifica el polipéptido de la presente invención está bajo el control de un promotor conveniente que incluye, pero no está limitado a promotores de timidina cinasa viral, tales como promotor de timidina cinasa de herpes simplex, LTRs retrovirales, el promotor-actina, y el promotor nativo que controla la codificación de gen del polipéptido. El vector plásmido retroviral que se emplea para transducir líneas de células de empaque para formar líneas de células productoras. Ejemplos de células de empaque que pueden transfectarse incluyen pero no están limitadas a, PE501, PA317 y GP+aml2. El vector puede transducir las células de empaque a través de cualquier medio conocido en la técnica. Estos medios incluyen, pero no están limitados a, electroporación, el uso de liposomas, y precipitación de CaP04. La línea de célula productora genera partículas de vector retroviral infeccioso que incluyen la secuencia de ácido nucleico que codifican los polipéptidos. Estas partículas de vector retroviral luego pueden emplearse, para transducir células eucarióticas, ya sea in vi tro o m v o . Las células eucarióticas transducidas expresarán la o las secuencias de ácido nucleico que codifican el polipéptido. Células eucarióticas que pueden transducirse, incluyen pero no están limitadas a Fibroblastos y células endoteliales. Otro aspecto de la presente invención son métodos de terapia de genes joara tratar desordenes, enfermedades y condiciones. Los métodos de terapia de genes se relacionan a la introducción de secuencias ácido nucleico (ADN, ARN y ADN o ARN antisentido) en un animal para lograr expresión del polipéptido MPIF-1 de la presente invención. Este método requiere un polinucleótido que codifica para un polipéptido MPIF-1 enlazado operativamente a un promotor y cualesquiera otros elementos genéticos necesarios para la expresión del polipéptido por el tejido objetivo. Estas técnicas de suministro y terapia de gen se conocen en la especialidad, ver por ejemplo WO 90/11092 , que se incorpora aquí por referencia. De esta manera, por ejemplo dos células de un paciente pueden someterse a ingeniería con un polinucleótido (.ADN o ARN) que comprende un promotor enlazado operativamente con un polinucleótido MPIF- 1 ex vivo, con las células de ingeniería que luego se proporcionan a un paciente a tratar con el polinucleótido. Estos métodos son bien conocidos en la especialidad, por ejemplo ver Belldegrun, A. , y colaboradores, J. Nal t . Cáncer I?is t . . 85: 207-216 (1993); Ferrantini, M. y colaboradores, Cáncer Research 53:1107-1112 (1993); Ferrantini, M. y colaboradores, J.

Immunology 153: 4604-4615 (1994); Ka'ido, T., y colaboradores, Int . J. Cáncer 60: 221-229 (1995); Ogura, H. , y colaboradores, Cáncer Research 50: 5102-5106 (1990) ; Santodonato, L. , y colaboradores , Human Gene Therapy 7:1-10 (1996); Santodonato, y colaboradores, Gene Therapy 4:1246-1255 (1997); and Zhang, J.-F. y colaboradores, Cáncer Gene Therapy 3: 31-38 (1996)), que aquí se incorporan por referencia. En una modalidad, las células que se someten a ingeniería son células arteriales . Las células arteriales pueden reintroducirse al paciente a través de inyección directa a la arteria, los tejidos que circulan la arteria o a través de una inyección por catéter. Como se discute con más detalle a continuación las construcciones de polinucleótido MPIF-1 pueden suministrarse por cualquier método que proporcione materiales inyectables a las células de un animal, tales como inyección en el espacio intersticial de reactivos (corazón, músculo, piel, pulmón, hígado y semejantes). Las construcciones de polinucleótidos MPIF-1 pueden suministrarse en un portador acuoso o líquido farmacéuticamente aceptable. En una modalidad, el polinucleótido MPIF-1 se suministra como un polinucleótido desnudo. El término polinucleótido "desnudo", ADN o ARN se refiere a secuencias que están libres de cualquier vehículo de suministro que actúa para ayudar, promover o facilitar la entrada en la célula, incluyendo secuencias virales, partículas virales, formulaciones de liposomas, lipofectina o agentes de precipitación y semejantes. Sin embargo, también puede suministrarse polinucleótidos MPIF-1 en formulaciones de liposomas y formaciones de lipofectína y semejantes que pueden prepararse por métodos bien conocidos por aquellos con destreza en la especialidad. Estos métodos describen por ejemplo en las Patentes de los E.U.A. Nos. 5,593,972, 5,589,466, y 5,580,859, que aquí se incorporan por referencia. Las construcciones de vector polinucleótido MPIF-1 empleadas en el método de terapia de genes son de preferencia construcciones que no se integrarán en el genoma huésped ni contendrán secuencias que permiten replicación. Vectores apropiados incluyen pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTl y pSG disponibles de Stratagene; pSVK3, pBPV, pMSG y pSVL disponible de Pharmacia; y pEFl/V5, pcDNA3.1, y pRc/CMV2 disponible de Invitrogen. Otros vectores convenientes serán fácilmente aparentes Para la persona con destreza en la especialidad. Cualquier promotor fuerte conocido por aquellos con destreza en la especialidad puede ser empleado para dirigir la expresión de la secuencia de polinucleótido MPIF-1. Promotores convenientes incluyen promotores adenovirales, tales como el promotor posterior principal adenoviral; o promotores heterólogos, tales como el promotor citomegalovirus (CMV) ; el promotor de virus sincitial respiratorio (RSV) ; promotores inducibles, tales como el promotor MMT, el promotor metalotioneina,-promotores de choque térmico; el promotor de albúmina; el promotor ApoAI; promotores de globina humana; promotores de timidina cinasa viral, tales como promotor de timidina cínasa de Herpes Simplex; LTRs retroviral; el promotor b-actina; y promotores de hormona de crecimiento humano. El promotor también puede ser el promotor nativo para MPIF-1. A diferencia de otras técnicas de terapia de gen, una ventaja principal de introducir secuencia de ácido nucleico desnudas en células objetivo es la naturaleza transitoria en la síntesis de polinucleótido en las células. Estudios han mostrado que secuencias de ADN no replicantes pueden introducirse en células para proporcionar la producción del polipéptido deseado por periodos de hasta seis meses. La construcción de polinucleótido MPIF-1 puede suministrarse al espacio intersticial de tejidos dentro del animal, incluyendo músculo, piel, cerebro, pulmón, hígado, bazo, médula ósea, timo, corazón, linfa, sangre, hueso, cartílago, páncreas, riñon, vejiga, estómago, intestino, testículos, ovarios, útero, recto, sistema nervioso, ojo, glándula, y tejido conectivo. El espacio intersticial de los tejidos comprende la matriz mucopolisacárido, fluido, intercelular, entre las fibras reticulares el tejido de órgano, fibras elásticas, fibras elásticas en las paredes de vasos o cámaras, fibras de colágeno de tejidos fibrosos, o esta misma matriz dentro del tejido conectivo forra o cubre células de músculo o en lagunas de huesos. Es similarmente el espacio ocupado por el plasma de la circulación y el fluido de linfa de los canales linfáticos. El suministro al espacio intersticial del tejido muscular se prefiere por las razones discutidas a continuación. Puede ser suministrado convenientemente por inyección en los tejidos que comprenden estas células. De preferencia se suministran a y expresan en células persistentes, divisoras en ciertas modalidades, las construcciones de polinucleótido MPIF-1 se complejan en una preparación de liposoma. Preparaciones liposomales para utilizar en la presente invención incluyen preparaciones catiónicas (cargadas positivamente) , aniónicas (cargadas negativamente) y neutras. Sin embargo, liposomas catiónicos se prefieren particularmente debido a que un complejo de carga cerrada puede formarse entre el liposoma cationico y el ácido nucleico polianiónico. Liposomas catiónicos se han mostrado que median el suministro intracelular de .ADN plásmido (Felgner y colaboradores, Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 84:74137416 (1987) , que aquí se incorpora por referencia) ; ARNm (Malone y colaboradores, Proc . Nati . Acad. Sci . USA 86:60776081 (1989), que aquí se incorpora por referencia) ; y factores de transcripción purificados (Debs y colaboradores, Biol . Chem . 265:1018910192 (1990), que aquí se incorpora por referencia) , en forma funcional . Liposomas catiónicos están fácilmente disponibles. Por ejemplo liposomas de N-[12,3-dioleiloxi) -propil] -N,N,N-trietilammonio (DOTMA) son particularmente útiles y están disponibles bajo la marca Lipofectin, de GIBCO BRL, Grand Island, N.Y. (Ver, también, Felgner y colaboradores, Proc . Nati Acad. Sci .

USA 84:74137416 (1987), (que aquí se incorpora por referencia) . Otros liposomas comercialmente disponibles incluyen transfectasa (DDAB/DOPE) y DOTAP/DOPE (Boehringer) . Otros liposomas catiónicos pueden prepararse a partir de materiales fácilmente disponibles utilizando técnicas bien conocidas en la especialidad. Ver por ejemplo Publicación PCT No. WO 90/11092 (que aquí se incorpora por referencia) para una descripción de la síntesis de liposomas DOTAP (1, 2-bis (oleoiloxi) -3 - (trimetilamonio) propano) . Preparación de liposomas DOTMA se explica en la literatura, ver, por ejemplo, P. Felgner y colaboradores, Proc. Nati . Acad. Sci . USA 84:74137417, (que aquí se incorpora por referencia) . Métodos similares pueden emplearse para preparar liposomas y otros materiales lípidos catiónicos.

Símílarmente, liposomas aniónicos y neutros están fácilmente disponibles, tal como de (Birmingham, Ala.) o pueden prepararse fácilmente utilizando materiales fácilmente disponibles. Estos materiales incluyen fosfatidil colina, colesterol, fosfatidil etanolamina, dioleoilfosfatidil - colina (DOPC) , dioleoilfosfatidil glicerol (DOPG), _ dioleoilfosfatidil etanolamina (DOPE), entre otros. Estos materiales también pueden mezclarse con DOTMA y los materiales de partida DOTAP y en proporciones apropiadas. Métodos para producir liposomas utilizando estos materiales son bien conocidos en la especialidad. Por ejemplo, los comercialmente disponibles, dioleoilfosfatidil colina (DOPC) , dioleoilfosfatidil glicerol (DOPG) y dioleoilfosfatidil etanolamina (DOPE), pueden emplearse en diversas combinaciones para producir liposomas convencionales, con o sin la adición de colesterol. De esta manera, por ejemplo vesículas de DOPG/DOPC pueden prepararse al secar 50 mg cada uno de DOPG y DOPC bajo una corriente de gas de nitrógeno en una ampolleta de sonicación. La muestra se coloca bajo una bomba de vacío durante la noche y se hidrata al siguiente día con agua desionizada. La muestra luego se sónica por 2 horas en una ampolleta tapada, utilizando un sonicador Heat Systems modelo 350 equipado con una sonda de copa * < invertida (tipo baño) al ajuste máximo mientras que el baño se circula a 15EC. En forma alterna, vesículas cargadas negativamente pueden prepararse sin sonicación para producir vesículas multilaminares o por exclusión a través de membranas de núcleo _ de poros para producir vesículas unilaminares de tamaño discreto. Se conocen otros métodos y están disponibles para aquellos con destreza en la especialidad. Los liposomas pueden comprender vesículas multilaminares (MLVs) , vesículas unilaminares pequeñas (SWs) , o grandes vesículas unilaminares, (LWs) , prefiriÉndose SUVs . Los diversos compuestos de ácido liposomenucleico se preparan utilizando métodos bien conocidos en la especialidad. Ver por ejemplo Straubinger y colaboradores, Methods of Immunolog? (Métodos de Inmunología) 101:512527 (1983), que aquí se incorpora por referencia. Por ejemplo, , MLVs contiene ácido nucleico pueden prepararse "al depositar una película delgada de fosfolípido en las paredes de un tubo de vidrio y subsecuentemente enlazar con una solución del material a encapsular. SUVs se preparan por sonicación extendida de MLVs para producir una población homogénea de liposomas unilaminares. El 'material a atraparse se agrega a una suspensión de MLVs preformado y luego sónica. Cuando se utilizan liposomas que contienen lípidos catiónicos, la película de lípido seca pero suspende en una solución apropiada tal como agua estéril o una solución de amortiguador isotópico tal como Tris/NaCl 10 mM, sónica, y luego los liposomas preformados se mezclan directamente con el ADN. El liposoma y el ADN forman un complejo muy estable debido a la unión de los liposomas cargados positivamente al ADN catiónico. SUVs encuentra uso con pequeños fragmentos de ácido nucleico. LWs se preparan por una cantidad de métodos, bien conocidos en la especialidad. Métodos comúnmente empleados incluyen quelación de Ca2+-EDTA (Papahadjopoulos y colaboradores, Biochim. Biophys . Acta 394:483 (1975); Wilson y colaboradores, Cell 17:77 (1979)),- inyección de éter (Deamer, D. and Bangham, A., Biochim . Biophys . Acta 443:629 (1976); Ostro y colaboradores, Biochem. Biophys . Res . Commun . 76:836 (1977); Fraley y colaboradores,' Proc . Na ti . Acad. Sci .

USA 76:33*48 (1979) ; diálisis de detergente (Enoch, H. and Strittmatter, P., Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 76:145 (1979) ) ; y evaporación inversa (REV) (Fraley y colaboradores, J. Biol . Chem. 255:10431 (1980); Szoka, F. and Papahadjopoulos, D., Proc. Nati . Acad. Sci . USA 75: 145 (1978); SchaeferRidder y colaboradores, Science 215:166 (1982)), que aquí se incorporan por referencia. En general la proporción de ADN a liposomas será de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 1:10. De preferencia, la proporción será de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 1:5. Más preferible, la proporción será de aproximadamente 2:1 a aproximadamente 1:3. Aún más preferible, la proporción será de aproximadamente 1:1. La Patente de los E.U.A. No. 5,676,954 (que aquí se incorpora por referencia) reporta la inyección de material genético, complejado con liposomas catiónicos, portadores en ratones. Las Patentes de los E.U.A. Nos. 4,897,355, 4,946,787, 5,049,386, 5,459,127, 5,589,466, 5,693,622, 5,580,859, 5,703,055, y la Publicación Internacional No. WO 94/9469 (que aquí se incorporan por referencia) proporciona lípidos catiónicos para uso en transceptar ADN en células y mamíferos. Las Patentes de los E.U.A. Nos. 5,589,466, 5,693,622, 5,580,859, 5,703,055, y la Publicación Internacional No. WO 94/9469 (que aquí se incorporan por referencia) proporcionan métodos para suministrar complejos de lípido catiónico-ADN a mamíferos. Entre otras modalidades, células se someten a ingeniería, ex vivo utilizando una partícula retroviral que contiene .ARN, que comprende una secuencia que codifica MPIF-1. Retrovirus de los cuales pueden derivarse vectores plásmidos retrovirales, incluye pero no están limitados a virus de leucemia murina Moloney, virus de necrosis de bazo, virus de Sarcoma de Rous y virus de Sarcoma de Harvey, virus de leucocis aviana, virus de leucemia de simio gibón, virus de inmunodeficiencia humana, virus de Sarcoma Mieloproliferativo, y virus de tumor mamario. El vector plásmido retroviral se emplea para transmitir línea de células de empaques para formar células productoras. Ejemplos de células de empaque que pueden transceptarse incluyen pero no están limitadas a, las lineas celulares PE501, PA317, R-2, R-AM, PA12, T19-14X, VT-19-17-H2, RCRE, RCRIP, GP+E-86, GP+envAml2, y DAN se describen en Miller, Human Gene Therapy (Terapia de Genest Humanos) 1:5-14 (1990), que se incorpora aquí por referencia completamente. El vector puede transducir las células de empaque a través de cualesquiera medios conocidos en la especialidad. Estos medios incluyen, pero no están limitados a, electroporación, el uso de liposomas y precipitación CaP04. En una alternativa, el vector plásmido retroviral puede encapsularse en un liposoma, o acoplarse a un lípido y luego administrarse a un huésped.

La línea de células productoras genera partículas de vector _ retroviral infecciosas que incluyen polinucleótido que codifica MPIF-1. Estas partículas de vector retroviral luego pueden emplearse, para transducir células eucarioticas, ya sea in vi tro o in vivo . Las células eucarioticas transducidas expresarán MPIF-1. En ciertas otras modalidades, las células se someten a ingeniería, ex vivo o in vivo, con polinucleotico MPIF-1 contenido en un vector de adenovirus. Puede manipularse adenovirus tal que codifica y expresa MPIF-1 y al mismo tiempo está inactivo en términos de su capacidad para replicar un ciclo de vida viral litica normal. Expresión de adenovirus se logra sin integración del ADN viral en el cromosoma de célula huésped de esta manera aliviando consideraciones respecto a mutagenesis de inserción. Además, los adenoviruses se han empleado como vacunas entéricas vivas por muchos años, con un excelente perfil e seguridad (Schwartz, A. R. y colaboradores . Am . Rev. Respir. Dis . 109:233-238 (1974)). Finalmente, transferencia mediada por adenovirus se han mostrado por un número de instancias incluyendo transferencia de alfalantítripsina y CFTR a los pulmones de ratas de algodón (Rosenfeld, M. A. y colaboradores, Scince 252:431-434 (1991); Rosenfeld y colaboradores, Cell 68:143-155 (1992)). Aún más, estudios extensos para intentar establecer adenovirus como un agente -causativo en cáncer humano fueron uniformemente negativo (Green, M. y colaboradores . Proc . Na ti . Acad . J5ic. USA 16 : 6606 (1979) ) . Vectores adenovirales convenientes de la presente invención se describen, por ejemplo, en Kozarsky and Wilson, Curr. Opin . Genet . Devel . 3:499-503 (1993); Rosenfeld y colaboradores, Cell 68:143-155 (1992); Engelhardt y colaboradores, Human Genet . Ther. 4:759-769 (1993); Yang y colaboradores, -Nature Genet . 7:362-369 (1994); Wilson y colaboradores, Na ture 365:691-692 (1993); y la Patente de los E.U.A. "5,652,224, que se incorpora aquí por referencia. Por ejemplo, el vector de adenovirus Ad2 es útil y puede desarrollarse en 293 células de humano. Estas células contienen la región El de adenovirus y expresan constitutivamente Ela y Elb, que complementan los adenovirus defectuosos al proporcionar los productos de los genes eliminados del vector. Además de Ad2 , otras variedades de adenovirus (por ejemplo, Ad3 , AdS, y Ad7) también son útiles en la presente invención.

De preferencia, los adenoviruses empleados en la presente invención son deficientes de replicación. Adenovirus deficientes de replicación requieren el auxilio de un virus auxiliar y/o línea celular de empaque para formar partículas infecciosas. El virus resultante es capaz de infectar células y puede expresar un polinucleótido de interés que se enlaza operativamente con un promotor, pero que no puede replicarse en la mayoría de las células. Adenovirus deficientes de replicación pueden eliminarse en uno o más de todo o una porción después de los siguientes genes: Ela, Elb, E3 , E4, E2a, o Ll a L5. En ciertas otras modalidades, las células se someten a ingeniería, ex vivo o in vivo, utilizando un virus asociado adeno (.ZVAV) . AAVs son virus defectuosos de origen natural que requieren virus auxiliares para producir partículas infecciosas (Muzyczka, N. , Curr.

Topics in Microbiol . Immunol . 158:97 (1992] También uno de los pocos virus que pueden integrar su ADN en células no divisoras. Vectores que contienen tan poco como 300 pares base de .AAV pueden empacarse, pueden integrar, pero el espacio para ADN exógeno se limita a aproximadamente 4.5 kb. Métodos para producir y utilizar estos AAVs se conocen en la especialidad. Ver por ejemplo las Patente de los E.U.A. Nos. 5,139,941, 5,173,414, 5,354,678, 5,436,146, 5,474,935, 5,478,745, y 5,589,377. Por ejemplo, un vector AAV asociado para utilizar en la presente invención incluirá todas las secuencias necesarias para replicación, encapsidación, e integración de células huésped de ADN. La construcción de polinucleótido MPIF-1 se inserta en el vector AAV utilizando métodos de clonación estándar, tales como aquellos encontrados en Sambrook y colaboradores , Molecular Cloning: A Labora tory Manual , (Clonación Molecular: Un Manual de Laboratorio) Cold Spring Harbor Press (1989) . El vector AAV recombinante se transfecta en células de empaque que están infectadas con un virus auxiliar, utilizando cualquier técnica estándar, incluyendo lipofección, electroporación, precipitación de fosfato de calcio, etc. Virus auxiliares apropiados incluyen adenovirus, citomegalovirus, virus de la vacuna que produce inmunidad contra la . viruela o virus herpes. Una vez que las células de empaque se transfectan e infectan, producirán partículas virales AAV infecciosas que contienen la construcción de polinucleótido MPIF-1. Estas partículas virales luego se emplean para transducir células eucarióticas, ya sea ex vivo o in vivo. Las células transducidas contendrán la construcción de polinucleótído MPIF-1 integrado en su genoma expresarán MPIF-1. Otro método de terapia de 'gen involucra asociar operativamente regiones de control heterólogas y secuencias de polinucleótido endógenas (por ejemplo purificando MPIF-1) mediante recombinación homologa (por ejemplo la Patente de los E . lf. A. No. 5,641,670, otorgada en junio 24, 1997; Publicación Internacional No. WO 96/29411, publicada en septiembre 26, 1996; Publicación Internacional. WO 94/12650, publicada en agosto 4, 1994; Koller y colaboradores, Proc. Na ti . Acad. Sic. USA 86:89328935 (1989); y Zijlstra y colaboradores, Na ture 342:435438 (1989). Este método involucra la activación de un gen que está presente en las células objetivo, pero que normalmente no se expresará en la célula, o se expresa a un nivel inferior que el deseado. Se elaboran construcciones de polinucleótidos utilizando técnicas estándar conocidas en la especialidad, que contienen el promotor con secuencias objetivo flanqueando al promotor. Promotores convenientes se describen aqui. La secuencia objetivo es suficientemente complementaria a una secuencia endógena para permitir recombinación homologa de la secuencia de objetivo de promotor, con la secuencia endógena. La secuencia de objetivo será suficientemente cercana al extremo 5 ' la secuencia polinucleótida endógena deseada del MPIF1 de manera tal que el promotor se enlaza operativamente con la secuencia ndógena ante recombinación homologa. El promotor y las secuencias de objetivo pueden amplificarse utilizando PCR. De preferencia, el promotor amplificado contiene distintos sitios de enzima de restricción en los extremos 5' y 3' . De preferencia, el extremo 3' de la primer secuencia objetivo contiene el mismo sitio de enzima de restricción que el extremo 5 ' del promotor amplificado y el extremo 5 ' de la segunda secuencia objetivo contiene el mismo sitio de restricción que el extremo 3 ' y el promotor amplificado. El promotor amplificado y las secuencias objetivo se digieren y ligan en conjunto. La construcción de secuencia objetivo de un promotor se suministra a las células, ya sea como polinucleótido desnudo o en conjunción con agentes que facilitan la transfección, tales como liposomas, secuencias virales, partículas virales, virus enteros, lipofección, agentes de precipitación, etc., descritos con más detalle anteriormente. La secuencia objetivo-promotor P puede suministrarse por cualquier método, incluido inyección de aguja directa, inyección intravenosa, administración tópica, infusión de catéter, aceleradores de partículas, etc. Los métodos se describen con más detalle a continuación. La construcción de secuencia objetivo-promotor se recupera o se absorbe por las células. La combinación homologa entre la construcción y la secuencia endógena se lleva a cabo, tal que una secuencia MPIF-1 endógena se coloca bajo el control de promotor. El promotor luego dirige la expresión de la secuencia MPIF-1 endógena. Los polinucleótidos que codifican MPIF-1 pueden administrase junto con otros polinucleótidos que codifican una proteína angiogénica. Ejemplos e proteínas angiogénicas incluyen pero no están limitados a factores de crecimiento de Fibroblastos acídicos y básicos, VEGF-1, VEGF-2, VEGF-3, factor de crecimiento epidérmico alfa y beta, factores de crecimiento de células endoteliales derivados de plaquetas, factor de necrosis de tumor alfa, factor de crecimiento de hepatocitos, factor de crecimiento de insulina, factor de estimulo de colonia, factor de estimulo de colonia de macrófago, factor de estímulo de colonia macrófagos/granulocitos y óxido nítrico sintasa. De preferencia, el polinucleótido que codifica MPIF-1 que contiene una secuencia de señal secretoria que facilita la secreción de la proteína. Típicamente, la secuencia de señal se coloca en la región de codificación del polinucleótido para expresarse hacia o en el extremo 5' de la región de codificación. La secuencia se señal puede ser homologa o heteróloga al polinucleótido interés y puede ser homologa o heteróloga a las células a transfectar. Adicionalmente, la secuencia de señal puede ser sintetizada químicamente utilizando métodos conocidos en la especialidad. Cualquier modo de administración o cualquiera de las construcciones de polinucleótidos anteriormente descritos pueden emplearse siempre que el modo resulta en la expresión de una o más moléculas de una cantidad suficiente para proporcionar un efecto terapéutico. Esto incluye inyección de aguja directa, inyección sistémica, infusión de catéter, inyectores biolísticos, aceleradores de partículas, (es decir "pistolas de genes"), depósitos de esponja gel-espuma, u otros materiales de depósito comercialmente disponibles, bombas osmóticas (por ejemplo, mini bombas Alza) , formulaciones farmacéuticas sólidas (tabletas o pildoras) orales o de supositorio y aplicaciones de decantado o tópicas durante cirugía. Por ejemplo, inyección directa de plásmido precipitado por fosfato de calcio desnudo de hígado de rata y bazo de rata o un plásmido revestido con proteína en la vena portal ha resultado en expresión del gen extraño en los hígados de rata (Kaneda y colaboradores, Science 243:375 (1989) ) . Un método preferido de administración local es por inyección directa. De preferencia, una molécula 5 recombinante de la presente invención complejada con un vehículo de suministro, se suministra por inyección directa dentro o localmente dentro un área de las k arterias. Administración de una composición localmente dentro del área de arterias se refiere a inyección de la 10 composición en centímetros y de preferencia en milímetros dentro de las arterias . Otro método de administración local es _ contactar una construcción de polinucleótido de la ^^ presente invención en o alrededor de una herida 15 quirúrgica. Por ejemplo, un paciente puede someterse a cirugía y la construcción de polinucleótido puede revestirse en la superficie de tejido dentro de la herida o la construcción puede inyectarse en áreas de tej ido dentro de la herida. 20 Composiciones terapéuticas útiles en la ^k administración sistémica, incluyen moléculas recombinantes de la presente invención complejadas a un vehículo de suministro objetivo de la presente invención. Vehículos de suministro convenientes para utilizar con 25 administración sistémica comprende liposomas que comprenden ligandos para ser objetivo al vehículo en un sitio particular. Métodos preferidos de administración sistémica, incluyen suministro de inyección intravenosa, aerosol, oral y percutánea (tópica) . Inyecciones intravenosas pueden realizarse utilizando métodos estándar en la técnica. Suministro de aerosol también puede realizarse utilizando métodos estándar en la técnica (Ver por ejemplo, Stribling y colaboradores, Proc . Na ti . Acad. Sic. USA 189:1 1277-11281, 1992, que aquí se incorpora por referencia. El suministro oral puede realizarse al complejar una construcción de- polinucleótidos de la presente invención a un portador capaz de soportar degradación por enzimas digestivas en los intestinos de un animal. Ejemplos de estos portadores, incluyen tabletas o cápsulas de plástico tales como aquellos conocidos en la técnica. Suministro tópico puede realizarse al mezclar la construcción de polinucleótidos de la presente invención con un reactivo lipofílico (por ejemplo, DMSO) que es capaz de pasar dentro de la piel. El determinar la -cantidad efectiva de substancia a suministra, puede depender de una cantidad de factores incluyendo, por ejemplo la estructura química, actividad biológica de la substancia, la edad y peso del animal, la condición precisa que requiere tratamiento y su debilidad, y la ruta de administración. Las secuencias del tratamiento dependen de una cantidad de factores, tal como la cantidad de construcciones polinucleótido administradas por dosis, así como la salud y la historia del sujeto. La cantidad precisa, número de dosis, y sincronización de dosis, se determinará por el médico o veterinario que atiende.' Composiciones terapéuticas de la presente invención pueden administrarse en cualquier animal, de preferencia a mamíferos y aves. Mamíferos preferidos incluyen humanos, cerdos, gatos, ratones, ratas, conejos, ovejas, ganado, caballos y cerdos, prefiriéndose en particularmente humanos . Antisentido y ribosimas (antagonistas) . En modalidades específicas, antagonistas de acuerdo con la presente invención son ácidos nucleicos correspondientes a las secuencias contenidas en ID de SEC NO. ; 1 o 6, o su hebra complementaria, y/o a secuencias de nucleótidos contenidas en el clon depositado 75676. Ep una modalidad, secuencias antisentido se genera internamente por el organismo, en otra modalidad, la secuencia antisentido se administra separadamente (ver, por ejemplo O 'Connor, J".

Neurochem. 56:560 (1991); Oligodeoxynucleotides as An ti s ense Inhibi tors of Gene Expressi on , (Oligodeoxinucleótidos como inhibidores antisentido de expresión de gen) CRC Press, Boca Ratón, FL (1988) . La tecnología antisentido puede emplearse para controlar expresión de gen a través de ADN o ARN antisentido, o a través de formación de triple-hélice. Técnicas antisentido se discuten por ejemplo en Okano, J.

Neurochem. 56:560 (1991); Oligodeoxynucleotides as An ti s ense Inhibi tors of Gene Expressi on , (Oligodeoxinucleótidos como inhibidores antisentido de expresión de gen) CRC Press, Boca Ratón, FL (1988) . Formación triple hélice se discute por ejemplo en Lee y colaboradores , Nucleic Acids Researph (Investigación de Ácidos Nucleicos) 6:3073 (1979); Cooney y colaboradores, Science 241:456 (1988); y Dervan y colaboradores, Science 251:1300 (1991) . Los métodos se basan en unión de un polinucleótido a un .ADN o ARN complementario. Por ejemplo, el uso de construcciones ARN antisentido c-myc y c-myb para inhibir el crecimiento de la línea celular de leucemia no linfocítica HL-60 y otras líneas, se describió previamente (Wickstrom y colaboradores , (1988) ; Anfossi y colaboradores , (1989) ) .

Estos experimentos se realizaron in vitro al incubar células con el oligoribonucleótido. Un procedimiento similar para uso in vivo se describe en WO 91/15580. Brevemente, un par de oligonucleótidos para un ARN antisentido determinado se produce como sigue: una secuencia complementaria para las primeras 15 bases del marco de lectura abierto está flanqueada por un sitio EcoRl en el extremo 5 y un sitio HindIII en el extremo 3. A continuación, el par de oligonucleótidos se calienta a 90°C por un minuto y luego alineadas en amortiguador de ligación 2X (20mM Tris HCl pH 7.5, lOmM MgCl^, 10 mM ditiotreitol (DTT) y 0.2 mM ATP) y luego liga al sitio EcoRl/Hind III del vector retroviral MMV7 (WO 91/15580) . Por ejemplo, la porción de codificación 5' de un polinucleótido que codifica el polipeptido maduro de presente invención, puede utilizarse para diseñar un oligonucleótido .ARN antisentido desde aproximadamente 10 a 40 pares base de longitud. Un oligonucleótido ADN se diseña para ser complementario a una 'región de gen involucrado en transcripción de esta manera evitando transcripción y la producción del receptor. El oligonucleótido ARN antisentido hibricLiza al .ARNm ín vivo y bloquea la traducción de la molécula .ARNm en el polipéptido receptor. En una modalidad, el ácido nucleico antisentido MPIF-1 de la invención se produce intracelularmente por transcripción de una secuencia exógena, por ejemplo un vector o una porción del mismo, se transfiere produciendo un ácido nucleico antisentido (.ARN) de la invención. Este vector contendrá una secuencia que codifica el ácido nucleico antisentido MPIF-1. Este vector puede permanecer episomal o puede volverse integrado cromosomáticamente, siempre que pueda transferirse para producir el ARN antisentido deseado. Estos vectores pueden construirse por métodos' de tecnología de ADN recombinante estándar en la técnica. Los vectores pueden ser plásmido viral u otros conocidos en la técnica, utilizados para replicación y expresión en células de vertebrados. Expresión de la secuencia que codifica el MPIF-1 o sus fragmentos puede ser por cualquier promotor conocido en la técnica para actuar en células de vertebrados, de preferencia de humanos. Estos promotores pueden ser inducibles o constitutivos. Estos promotores incluyen, pero no están limitados a, la región de promotor temprano SV40 (Bernoist and Chambón, Na ture 29:304-310 (1981), el promotor contenido en la repetición terminal larga 3 ' del virus sarcoma Rous (Yamamoto y colaboradores, Cell 22:787-797 (1980), el promotor timidina herpes (Wagner y colaboradores, Proc . Na ti .

Acad. Sci . U. S. A. 78: 1441-1445 (1981), las secuencias regulatorias del gen metalotioneina (Brinster, y colaboradores . , Nature 296:39-42 (1982)), etc. Los ácidos nucleicos antisentido de la invención comprenden una secuencia complementaria cuando menos una porción de la transcripción ARN de un gen MPIF-1. Sin embargo, no se requiere absoluta complementaridad, aunque se prefiere. Una secuencia "complementaria cuando menos a una porción de un ARN", aquí referida, significa una secuencia que tiene complementaridad suficiente para poder hibridizar con el .ARN, formando un dúplex estable, en el caso de ácidos nucleicos antisentido MPIF-1 de doble hebra, una sola hebra del ADN dúplex de esta manera puede probarse o puede ensayarse formación triplex. La capacidad de hibridizar dependerá tanto del grado de complementaridad como la longitud del ácido nucleico antisentido. En general, entre más grande sea el ácido nucleico hibridizante, más apareamientos incorrectos con un ARN MPIF-1 puede contener y aún formar un dúplex estable (o triplex según sea el caso) . Una persona con destreza en la especialidad puede evaluar un grado tolerable de apareamiento incorrecto por uso de procedimientos estándar para determinar el punto de fusión del complejo hibridizado.

Oligonucleótidos que son complementarios en el extremo 5' del mensaje, por ejemplo la secuencia no traducida 5 ' hasta e incluyendo el codón de inicio Aug deberá trabajar más eficientemente para inhibir la producción. Sin embargo, secuencias complementarias a las secuencias no traducidas 3 ' de ARNms se han mostrado efectiva para inhibir traducción de los ARNms por igual. Ver en general Wagner, R. , 1994, Na ture 372:333-335. De esta manera, oligonucleótidos complementarios a cualquiera de las reacciones de no codificación, no traducidas 5' o 3' de MPIF-1 mostradas en la Figura 20 pueden emplearse en un enfoque antisentido para inhibir la producción de ARNm MPIF-1 endógeno. Oligonucleótidos complementarios a la región no. producida 5 ' del ARNm deberán incluir el complemento del codón de partida Aug. Oligonucleótidos antisentido complementarios a las regiones de codificación ARNm son inhibidores de traducción menos eficientes pero pueden utilizarse de acuerdo con la invención. Ya sea diseñados para hibridizar la región 5' o 3' de codificación de ARNm MPIF-1, los ácidos nucleicos antisentido deberán ser de al menos seis nucleótidos de longitud,, y de preferencia son oligonucleótidos en el rango de 6 a aproximadamente 50 nucleótidos de longitud. En aspectos específicos, el oligonucleótido es de al menos 10 nucleótidos, al menos 17 nucleótidos, al menos 25 nucleótidos, o al menos 50 nucleótidos . Los polinucleótidos de la invenpión pueden ser ADN o ARN o mezclas quiméricas o derivados o versiones modificadas de los mismos, de una sola hebra o de una hebra. El oligonucleótido puede modificarse en la porción base, porción azúcar o estructura principal fosfato, por ejemplo para mejorar la estabilidad de la molécula, hibridización, etc. Él oligonucleótido puede incluir otros grupos agregados tales como péptidos por ejemplo para hacer objetivo al receptor de célula huésped in vivo (o agentes que facilitan el transporte a través de la membrana celular) ver por ejemplo, Letsinger y colaboradores, Proc. Na ti- Acad. Sic . U. S . A . 86:6553-6556 (1989); Lemaitre y colaboradores, Proc. Na ti . Acad. Sic. 84-:648-652 (1987); Publicación PCT No. WO88/09810, publicada en diciembre 15, 1988). o la barrera de sangre-cerebro (ver por ejemplo, Publicación PCT No. WO89/10134, publicada en abril 25, 1988) , agentes de escisión disparados por hibridización (ver por ejemplo, Krol y colaboradores , Biotechniques (Biotécnicas) 6.-958-976 (1988)) o agentes intercalantes. (Ver por ejemplo, Zon, Pharm. Res. 5:539-549 (1988)). Para este objetivo, el oligonucleótido puede conjugarse con otra molécula, por ejemplo, un péptido, agente de entrelazamiento disparado por hibridización, agente de transporte, agente de escisión disparado por hibridización, etc. El oligonucleótido antisentido puede comprender 4 8 al menos una porción base modificada que se elige del grupo que incluye, pero no está limitado a, 5 f luorouracil , 5 -bromouracil , 5 - clorouraci 1 , 5-iodouracil, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5 - ( c a rb o x i h i d r o x i l m e t i l ) u r a c i l , 5 - carboximet i l aminomet i l - 2 - t iouridina , 5 - carb oxi me t ilaminomet i 1 uracil , dihidrourac i 1 , bet a - D - ga l ac to s i l queos i na , i no s i na , N-6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2 , 2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3 -metilcitosina, 5 -metilcitosina, . N-6-adenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracil , 5-metoxiaminometil-2-thiouracil, beta-D-mannosilqueosina, 5 'metoxicarboximetiluracil, 5-metoxiuracil, 2 -metiltio-N- 6 -isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético (v) , wibutoxosina, pseudouracil , queosina, 2 - t ioci tosina , 5 -met i 1 - 2 - t iouracil, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, metiléster de ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético (v) , 5-metil-2-tiouracilo, 3 (3 -amino-3 -N2 -'carboxypropyl ) uracil, (acp3)w, y 2 , 6-diaminopurina. El oligonucleótido antisentido puede comprender al menos una porción azúcar modificada seleccionada del grupo que incluye pero no está limitada a, arabinosa, 2-fluoroarabinosa, xilulosa, y hexosa. Todavía en otra modalidad, el oligonucleótido antisentido comprende al menos una estructura principal fosfato modificada que se selecciona del grupo que incluye pero no limitada a, fosforotioato, un fosforoditioato, un fosforamidotioato, un fosforamidato, un fosfordiamidato, un metilfosfonato, un alquil fosfotriester, y un formacetal o análogos de los mismos. Todavía en otra modalidad, el oligonucleótido antisentido oligonucleótido a-anomérico. Un oligonucleótido a-anomérico forma híbridos de doble hebra específicos con .ARN complementarios, en donde contrario a las b-unidades usuales, las hebras corren paralelas entre sí (Gautier y colaboradores, Nucí .' Acids Res . 15:6625-6641(1987)) . El oligonucleótido es un 2 ' -O-metilribonucleótido (Inoue y colaboradores , Nucí .

Acids Res . 15:6131 -6148(1987)), o un análogo ARN-ADN quimérico (Inoue y colaboradores . , FEBSLett . 215:327-330 (1987) ) .

Los polinucleótidos de la invención pueden sintetizarse por métodos est ndar conocidos en la especialidad, por ejemplo por el uso de un sintetizador de ADN automatizado (tal como el - comercialmente disponible de Biosearch, Applied Biosystems, etc.). Como ejemplos pueden sintetizarse fosforotioato oligonucleótidos por el método de Stein y colaboradores. (1988, Nucí . Acids Res . 16:320-9), metilfosfonato oligonucleótidos pueden prepararse por uso de soportes de polímero con vidrio de poro controlado (Sarin y colaboradores . , Proc . Na ti . Acad. Sci . U. S . A . 85:7448-7451(1988)), etc. Mientras que los nucleótidos antisentido complementarios a la secuencia de región de codificación MPIF-1 pueden emplearse, aquellos complementarios a la región no traducida transcrita son más preferidos . .Antagonistas potenciales de acuerdo con la invención también incluyen ARN catalítico, o una ribozima (ver por ejemplo la Publicación Internacional PCT WO 90/11364, publicada en octubre 4 de 1990; Sarver y colaboradores, Science 247:1222-1225 (1990,). Mientras que las ribozimas se escinden a .ARNm en secuencias de reconocimiento específicas de sitio pueden emplearse para destruir ARNms MPIF-1, el uso de ribozimas cabeza de martillo, se prefiere. Las ribozimas cabeza de martillo escinden ARNms en sitios dictados por regiones de flanqueo que forman pares base complementarios con el ARNm objetivo. El único requerimiento es que ARNm objetivo tenga las siguientes secuencia de dos bases 5'-UG-3'. La construcción y producción de ribozimas cabeza de martillo es bien conocido en la especialidad y se describe más completamente por Haseloff y Gerlach, Nature 334:585-591 (1988). Hay numerosos sitios de escisión de ribozimas cabeza de martillo de escisión de ribozimas cabeza de martillo potencial dentro de la secuencia de nucleótido MPIF-1 (Figuras 1A-B) . De preferencia, la ribozima se somete a ingeniería, de manera tal que el sitio de reconocimiento de escisión se localiza cerca del extremo 5' del ARNm MPIF-1; es decir para incrementar la eficiencia y minimizar la acumulación intracelular de transcripciones .ARNm no funcionales . Como en el enfoque antisentido, las ribozimas de la invención pueden estar compuestas por oligonucleótidos modificados (por ejemplo para estabilidad mejorada, hacer objetivo, etc.) y deberá suministrarse a células que expresan MPIF-1 in vivo. Construcciones de ADN que codifican la ribozima puede introducirse en las células en la misma forma que se describe anteriormente para la introducción de ADN que codifican antisentido. Un método preferido de suministro involucra utilizar una construcción de ADN "que codifica" la ribozima bajo el control de un promotor constitutivo fuerte tal como por ejemplo el promotor pol III o pol II, de manera tal que las células transfectadas produzcan cantidades suficientes de las ribozimas para destruir mensajes MPIF-1 endógenos e inhibir la traducción. Ya que las ribozimas a diferencia de las moléculas antisentido son catalíticas, se requiere para eficiencia de una menor concentración intracelular. Compuestos antagonistas/agonistas pueden ser empleados para inhibir los efectos de proliferación de crecimiento celular de los polipéptidos de la presente invención en células y tejidos no plásticos, es decir estimulación de angiogénesis de tumores, y por lo tanto para retardar o evitar el crecimiento y prolif ración celular normal, por ejemplo un crecimiento o formación de tumor . El antagonista/agonista también puede emplearse para evitar enfermedades intravasculares y evitar la proliferación de células de lentes epiteliales después de cirugía de cataratas extravascular. La prevención de la actividad mitogénica de los polipéptidos de la presente invención también puede ser mezclada en casos totales como restenosis después de angioplastía de globo.

El antagonista/agonista también puede emplearse para tratar las enfermedades aquí descritas . De esta manera, la invención proporciona un método para tratar desordenes o enfermedades, incluyendo pero no limitados a los desordenes o enfermedades enlistados a través de esta solicitud, asociados con una sobre expresión de un polinucleótido de la presente invención al administrar a un paciente (a) una molécula antisentido dirigida al polinucleótido de la presente invención y/o (b) una ribozima dirigida al polinucleótido de la presente invención. Epí topes y Anticuerpos La presente invención abarca polipéptidos que comprende, o en forma alterna consisten 'de, un epítope del polipéptido que tiene una secuencia de amino ácido de ID de SEC NO. : 2, o un epítope de la secuencia de polipéptido codificada como una secuencia de polinucleótido contenida en el depósito ATCC NO. 75676 o codificada por un polinucleótido que hibridiza al complemento de la secuencia de ID de SEC NO. : 1 o 6 o contenido en el depósito ATCC No. 75676 bajo estrictas condiciones de hibridización o condiciones de hibridización menos estrictas como se definió anteriormente .

La presente invención además abarca secuencias de polinucleótidos que codifican un epítope de una secuencia de polipéptido de la invención (tal como por ejemplo, la secuencia descrita en ID de SEC NO. : 1 o 6) , secuencias de polinucleótidos de- la hebra complementaria de una secuencia de polinucleótido que codifica un epítope de la invención, y secuencias de polinucleótido que hibridizan a la hebra complementaria bajo estrictas condiciones de hibridización o condiciones de hibridización menos estrictas definidas arriba. El término "epítopes," como se emplea aquí, se refiere a porciones de un polipéptido que tiene una actividad antigénica o inmunogénica en un animal, y más preferiblemente en un humano'. En una modalidad preferida, la "presente invención abarca un polipéptido que comprende un epítope, así como el polinucleótido que codifica el polipéptido. Un "epítope inmunogénico," como se emplea aquí, se define como una porción de una proteína que produce una respuesta de anticuerpo en un animal, como se determina por cualquier método conocido en la especialidad, por ejemplo por los métodos para generar anticuerpos descritos arriba. (Ver por ejemplo Geysen y colaboradores, Proc . ' Na ti . Acad . Sic . USA 81:3998- 4002 (1983)) . El término "epítope antigénico," como se emplea aquí, se define como una porción de una proteína a la cual un anticuerpo puede ligar inmuno-específicamente su antígeno como se determina por cualquier método descrito en la especialidad, por ejemplo por los inmunoensayos aquí descritos. La unión inmuno-específica excluye unión no específica pero no necesariamente excluye reactividad cruzada con otros antígenos. Epítopes antigénicos no requieren necesariamente ser inmunogénicos. Fragmentos que funcionan como epítopes pueden producirse por cualquier medio convencional. (Ver, por ejemplo, Houghten, Proc . Na ti . Acad. Si c . USA 82:5131-5135 (1985), descrito adicionalmente en la Patente de los E.U.A. No. 4,631,211). En la presente invención, epítopes antigénicos de preferencia contienen una secuencia de al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, más preferible al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 20, al menos 25, al menos 30, al menos 40, al menos 50, y más preferible entre aproximadamente 15 a aproximadamente 30 amino ácidos. Polipéptidos preferidos que comprenden epítopes inmunogénicos o antigénicos son al menos de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, o 100 residuos amino ácidos de longitud. Epítopes antigénicos preferidos no exclusivos adicionales incluyen los epítopes antigénicos aquí descritos, así como sus porciones. Epítopes antigénicos son aquellos por ejemplo, para desarrollar anticuerpos, incluyendo anticuerpos monoclonales, que ligan específicamente el epítope. epítopes antigénicos preferidos incluyen los epítopes antigénicos aquí descritos, así como cualquier combinación de dos, tres, cuatro, cinco o más de esos epítopes antigénicos. epítopes antigénicos pueden utilizarse como las moléculas objetivo en inmunoensayos. (Ver por ejemplo Wilson y colabor tador s . , Cell 37:767-778 (1984); Sutcliffe y colaboradores, Science 219:660-666 (1983)). Similarmente, epítopes inmunogénicos pueden utilizarse por ejemplo para inducir anticuerpos de acuerdo con métodos bien conocidos en la especialidad. (Ver, por ejemplo, Sutcliffe y colaboradores, arriba, Wilson colaboradores, arriba ; Chow y colaboradores , Proc. Na ti . Acad. Sic . USA 82:910-914; and Bittle y colaboradores, J. Gen . Virol . 66:2347-2354 (1985). epítopes inmunogénicos preferidos incluyen los epítopes inmunogénicos aquí descritos, así como cualquier combinación de combinación de dos, tres, cuatro, cinco o más de esos epítopes inmunogénicos. Los polipéptidos comprenden o en forma alterna consisten de, uno o más epítopes inmunogénicos, pueden presentarse para producir una respuesta de anticuerpos junto con una proteína tal como una albúmina, a un sistema animal (tal como conejo o ratón) o si el polipéptido es de longitud suficiente (al menos aproximadamente 25 amino ácidos) , el polipéptido puede presentarse sin un portador. Sin embargo, epítopes inmunogénicos que comprenden tan pocos como 8 a 10 amino ácidos se ha mostrado que son J suficientes para desarrollar anticuerpos capaces de ligar a, como mínimo, epítopes lineales en un polipéptido desnaturalizado (por ejemplo en Western blotting) . Polipéptidos que contienen epítope de la presente invención pueden utilizarse para inducir anticuerpos de acuerdo con métodos bien conocidos en la especialidad incluyendo pero no limitados a, inmunización in vivo, inmunización in vitro, y métodos de exhibición de fago. Ver por ejemplo Sutcliffe y colaboradores, arriba; Wilson y colaboradores , arriba; y Bittle y colaboradores, J. Gen . Virol . , 66:2347-2354 (1985). Si se utiliza inmunización in vivo, los animales pueden inmunizarse con péptido libre, sin embargo, título de anticuerpo anti-péptido puede ser reforzado al acoplar el péptido a un portador macromolecular, tal como hemocianina de erizo de mar (KLH = keyhole limpet hemocyanin) o toxoide de tétanos. Por ejemplo, péptidos que contienen residuos cisteínas pueden acoplarse a un portador utilizando un enlazador tal como maleimidobenzoil-N-hidroxisucinimida ester (MBS), mientras que otros péptidos pueden acoplarse a portadores utilizando un agente de enlace más general tal como glutaraldehído. .Animales tales como conejos, ratas o ratones se inmunizan ya sea con péptidos acoplados a portador o libres, por ejemplo por inyección intraperitoneal y/o trasdérmica de emulsiones que contienen aproximadamente 100 µg de péptido o proteína portadora y adyuvantes de Freund o cualquier otro adyuvante conocido para estimular una inmuno respuesta. Pueden, requerirse varias inyecciones de refuerzo, por ejemplo a intervalos de aproximadamente 2 semanas, para proporcionar un título útil de anticuerpo anti-sentido que puede ser detectado, por ejemplo poliensayo ELISA utilizando el péptido libre absorbido en una superficie sólida. El título de anticuerpo anti-péptido y el suero de un animal inmunizado puede incrementarse por selección de anticuerpos anti-péptido, por ejemplo, por adsorción al péptido y un soporte sólido y emulsión de los anticuerpos selectos de acuerdo con métodos bien conocidos en la especialidad.

Como una persona con destreza en la especialidad apreciará, y como se discutió anteriormente, los polipéptidos de la presente invención que comprenden un epítope inmunogénico o antigénico, pueden fusionarse a otros subsecuentes polipéptidos. Por ejemplo, los polipéptidos de la presente invención pueden ser fusionados con el dominio constante de inmunoglobulinas (IgA, IgE, IgG, IgM) , o sus porciones (CH^ CH2, CH.,, o cualquier combinación de las mismas y porciones de las mismas) que resultan en polipéptidos quiméricos. Estas proteínas de fusión pueden facilitar la purificación y pueden incrementar la vida media in vivo. Esto se ha mostrado para proteínas quiméricas que consisten de los primeros dos dominios del polipéptido CD4 humano y diversos dominios de las regiones constantes de las cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulinas de mamíferos. Ver por ejemplo, EP 394,827; Traunecker y colaboradores, Na ture, 331:84-86 (1988). Suministro mejorado de un antígeno a través de la barrera epitelial al sistema inmune, se han demostrado para antígenos (por ejemplo, insulina) conjugado con un socio de unión de FcRn tal como fragmentos IgG o Fc (ver por ejemplo, las Publicaciones PCT WO 96/22024 y WO 99/04813) . Proteínas de fusión IgG que tienen una estructura dimérica enlazada disulfuro debido a la porción IgG enlaces disulfuro de porción IgG también han mostrado ser más eficientes y unir y localizar otras moléculas de los polipéptidos monómericos o sus fragmentos solos. Ver por ejemplo Fountoulakis y colaboradores, J. Biochem. , 270:3958-3964 (1995) . Ácidos nucleicos que codifican los epítopes anteriores también pueden recombinarse con una etiqueta epítope (por ejemplo la etiqueta- hemaglutinina ("HA") o etiqueta bandera) para ayudar en detección y purificación del polipéptido expresado por ejemplo, un sistema descrito por Janknecht y colaboradores . Permite la fácil purificación de proteínas de fusión no desnaturalizadas que se expresan en líneas de células humanas (Janknecht y colaboradores 1991, Proc . Na ti .

Acad. Sic. USA 88:8972-897). En este sistema, el gen de interés se sub-clona en un plásmido de recombinación de virus de la vacuna que produce inmunidad contra la viruela (vaccinia) de manera tal que el cuadro o marco de lectura abierto del gen se fusiona a manera de traducción a una etiqueta amino terminal que consiste de seis residuos histidina. La etiqueta sirve como un dominio de unión de matriz para la proteína de fusión. Extractos de células infectadas con el virus de la vacuna recombinante, se cargan en columnas de agarosa-ácido nitriloacético en el Ni"+ y proteínas etiquetadas con histidina, pueden eluirse selectivamente con amortiguadores que contienen imidazol. Proteínas de fusión adicionales de la invención pueden generarse a través de la técnica de entremezclado de genes, entremezclado de motivo, entremezclado de exón y/o el entremezclado de codón (referido colectivamente como "entremezclado de ADN"). El entremezclado de ADN puede emplearse para modular las actividades de polipéptidos de la invención. Estos métodos pueden emplearse para generar polipéptidos con actividad alterada, así como agonistas y antagonistas de los polipéptidos. Ver en general, las Patentes de los E.U.A. "Nos. 5,605,793; 5,811,238; 5,830,721; 5,834,252; y 5,837,458, y Patten y colaboradores , ' Curr. Opinión Biotechnol . 8:724-33 (1997); Harayama, Trends Bio technol . 16(2) :76-82 (1998); Hansson, y colaboradores, J. Mol .

Biol . 287:265-76 (1999); y Lorenzo y Blasco, Biotechniques (Biotécnicas) 24(2) :308- 13 (1998) (cada una de estas patentes y publicaciones aquí se incorporan por referencia totalmente) . En una modalidad, alteraciones de polinucleótidos correspondientes a ID de SEC NO.: 1 o 6 y los polipéptidos codificados por estos polinucleótidos pueden lograrse por entremezclado de .ADN. En otra modalidad, alteración de polinucleótidos codifican el polipéptido mostrado en la ID de SEC NO. : 2 y los polipéptidos codificados por estos polinucleótidos pueden lograrse por el entremezclado de ADN. El entremezclado de ADN involucra el ensamblado de dos o más segmentos de .ADN por recombinación homologa específica de sitio para generar variaciones de secuencia de polinucleótido. En otra modalidad, polínucleótidos de la invención, o los polipéptidos codificados, pueden alterarse al someterse a mutaciones aleatorias por PCR tendientes a error, inserciones nucleótido aleatorias u otros métodos antes de recombinación. En otra modalidad, uno o más componentes, motivos, secciones, partes, dominios, fragmentos, etc. De un polinucleótido que codifica un polipéptido de la invención, pueden recombinarse con uno o más componentes, motivos, secciones, partes, dominios, fragmentos, etc. De una o más moléculas heterólogas. Anticuerpos . Adicionales polipéptidos de la invención se relacionan a anticuerpos y receptores de antígeno a células T (TCR) que ligan inmuno-específicamente un polipéptido, un fragmento polipéptido, o una variante de ID de SEC NO.: 2, y/o un epítope, de la presente invención (como se determina por inmuno ensayos bien conocidos en la especialidad para ensayar unión de antígeno-anticuerpo específica) . Anticuerpos de la invención incluyen, pero no están limitados a, anticuerpos policlonales, monoclonales, muítiespecífieos, humanos, humanizados o quiméricos, anticuerpos de cadena sencilla, fragmentos Fab, fragmentos, F(ab') fragmentos producidos por biblioteca de expresión Fab, anticuerpos anti-idiotípicos (anti-Id) (incluyendo, por ejemplo, anticuerpos anti -Id, a anticuerpos de la invención) , y fragmentos de unión epítope • de cualquiera de los anteriores. El término "anticuerpo," como se emplea aquí, se refiere a moléculas de inmunoglobulina y porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina, es decir moléculas que contienen un sitio de unión de antígeno que liga específicamente un antígeno. Las moléculas de inmunoglobulina de la invención pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, y IgY). , clase (por ejemplo, IgGx, IgG2, IgGj, IgG4, IgAl7 y IgA2) o 'sub-clase de molécula de inmunoglobulina . Más preferiblemente, los anticuerpos son fragmentos de anticuerpo de unión de antígeno humano de la presente invención e incluyen pero no están limitados a anticuerpos Fab, Fab' y F(ab')2, Fd, de cadena sencilla Fvs (scFv) , anticuerpos de cadena sencilla, Fvs enlazados con disulfuro (sdFv) y fragmentos que comprenden ya sea un dominio, V, o VH Fragmentos de anticuerpos de antígeno, incluyendo anticuerpos de cadena sencilla, pueden comprender la o las regiones variables solas o en combinación con todo o una porción-" de lo siguiente. Región de pivoteo, dominios CHl7 CH2 , y CHj . También se incluye en la invención fragmentos de Los antígenos que también comprenden una combinación de una o más regiones variables con una región de pivoteo, dominios CHl7 CH, , y CH.,. Los anticuerpos de la invención pueden ser de cualquier origen animal incluyendo aves y mamíferos. De preferencia, los anticuerpos son humanos, murinos, (por ejemplo de ratón y rata) de burro, ovejas, conejo, cabra, conejillo de Indias, camellos, caballos, o pollos. Como se emplea aquí, anticuerpos "humanos" incluyen anticuerpos que tienen la secuencia de amino ácidos de una inmunoglobulina humana e' incluyen anticuerpos aislados de bibliotecas de inmunoglobulina humana o de animales transgénicos de nina o más inmunoglobulinas humanas y que no expresan inmunoglobulina de endógeno, como se describió arriba y por ejemplo en la Patente de los E.U7A, NO.. 5,939,598 . por- "Kucherlapati y colaboradores . Loa anticuerpos de la presente invención pueden ser monoespecíficos, biespecíficos, tries^pecíficos o de mayor multiespecificidad. .Anticuerpos multiespecíficos pueden ser específicos para diferentes epítopes de un polipéptido de la presente invención o pueden ser específicos tanto para un polipéptido de la presente invención como para un epítope heterólogo, tal como un polipéptido heterólogo o material de soporte sólido. Ver por ejemplo las Publicaciones PCT WO 93/17715, WO 92/08802; WO 91/00360; WO ' 92/05793; Tutt, y colaboradores, J. Immunol . 147:60-69 (1991); Patentes de los E.U.A. Nos. 4,474,893; 4,714,681; 4,925,648; 5,573,920; 5,601,819; Kostelny y colaboradores, J.

Immunol . 148:1547-1553 (1992) .

Anticuerpos de la presente invención pueden describirse o especificarse en términos del o los epítopes y la o las porciones de un polipéptido de la presente invención que reconocen 'o ligan específicamente. El o los epítopes la o las porciones del polipéptido pueden especificarse como se describe, por ejemplo por posiciones N-terminal y C-terminal, por tamaño en residuos amino ácido contiguos, o como se enlista en las Tablas y figuras. Anticuerpos que ligan específicamente cualquier epítope o polipéptido de la presente invención también pueden ser excluidos. Por lo tanto, la presente invención incluye anticuerpos que ligan específicamente polipéptidos de la presente ' invención y permiten exclusión de los mismos.

Anticuerpos de la presente invención también pueden describirse o especificarse en términos de su reactividad cruzada. .Anticuerpos que no ligan cualquier otro análogo, ortólogo u homólogo de un polípéptido de la presente invención se incluyen. .Anticuerpos que ligan polipéptidos con al menos 95%, al menos 90%, al menos 85% al menos 80%, al menos 75%, al menos 70%, al menos 65%, al menos 60%, al menos 55%, y al menos 50% de identidad (como se calcula utilizando métodos conocidos en la especialidad y descritos aquí) a un polipéptido de la presente invención también se incluye en la presente invención. En modalidades específicas, anticuerpos de la presente invención reaccionan en forma cruzada con homólogos murinos, de rata y/o conejo de proteínas humanas y sus epítopes correspondientes . Anticuerpos que no ligan polipéptidos con menos de 95%, al menos 90% y al menos 90%, al menos 85% al menos 80%, al menos 75%, al menos 70%, al menos 65%, al menos 60%, al menos 55%, y al menos 50% de identidad (como se calcula utilizando métodos conocidos en la especialidad y descritos aquí) a un polipéptido de la presente invención también se incluye en la presente invención. En una modalidad específica, la reactividad cruzada anteriormente descrita con respecto a cualquier polipéptido inmunogénico o antigénico específico sencillo o la o las combinaciones de dos, tres, cuatro, cinco o más de los polipéptidos específicos antigénicos y/o inmunogénicos aquí descritos. Además incluye la presente invención anticuerpos que ligan polipéptidos codificados por polinucleótidos que hibridizan a un polinucleótido de la presente invención bajo estrictas condiciones de hibridización (como se describe aquí) . .Anticuerpos de la presente invención también pueden describirse o especificarse en términos de su afinidad de enlace a un polipéptido de la invención. Afinidades de enlace preferidas incluyen aquellas con una constante de disociación o Kd o al menos 5 X 10~2 M, 10~2 M, 5 X 10~3 M, 10~3 M, 5 X 10"4 M, .10""" M, 5 X 10~5 M, 10" M, 5 X 10*6 M, 10~6 M, 10~7M, 5 X 10"7 M, 10"R M, 5 X 10~8 M, 10~9 M, 5 X 10 M, 5 X 10~9 M, 1010 M, 5 X 10"10 M, 10~ M, 5 X 10~n M, 10~12 M, 5 X 10~12 M, 10" M, 5 X 10"" M, 10~14 M, 5 X10"15 M, o 10"" M. La invención también proporciona anticuerpos que inhiben en forma consecutiva el enlace de un anticuerpo con un epítope de la invención como se determina por cualquier método conocido en la especialidad para determinar enlace competitivo, por ejemplo los inmuno ensayos aquí descritos. En modalidades preferidas, el anticuerpo inhibe competitivamente el enlace al epítope por al menos de 95%, al menos 90% y al menos 90%, al menos 85% al menos 80%, al menos 75%, al menos 70%, al menos 65%, al menos 6O%, al menos 55%, y al menos 50%. La invención también proporciona anticuerpos que inhiben competitivamente la unión de un anticuerpo monoclonal a un polipéptido de esta invención, de preferencia un polipéptido de ID de SEC NO.: 2. Inhibición competitiva puede determinarse por cualquier método conocido en la especialidad, por ejemplo utilizando los ensayos de unión competitivos aquí descritos. En modalidades preferidas, ' el anticuerpo inhibe competitivamente el enlace de un anticuerpo monoclonal de la invención en al menos 90%, al menos 80%, al menos 70%, al menos 60%, o al menos 50% al polipéptido de ID de SEC NO.: 2. Anticuerpos de la presente invención pueden actuar como agonistas o antagonistas de los polipéptidos de la presente invención. Por ejemplo, la presente invención incluye anticuerpos que interrumpen las interacciones receptor/ligando con los po?ipéptidos de la invención, ya sea parcial o completamente. De preferencia, anticuerpos de la presente invención ligan a un epítope antigénico aquí descrito, o una porción del mismo. La invención caracteriza tanto anticuerpos específicos de receptor como anticuerpos específico de ligando. La invención también caracteriza anticuerpos específicos de receptor que no indican enlace de ligando pero evitan activación de receptor. Activación de receptor (es decir señalización) pueden determinarse por técnicas descritas aquí o de otra forma conocidas en la especialidad. Por ejemplo, activación de receptor puede determinarse al detectar la fosforilación (por ejemplo tirosina o serina/treonina) y del receptor o su substrato por inmunoprecipitación seguido por análisis Western blot (Por ejemplo como se describió arriba) . En modalidades específicas, se proporcionan anticuerpos que inhiben actividad de ligando o actividad de receptor por al 95%, al menos 90% y al menos 90%, al menos 85% al menos 80%, al menos 75%, al menos 70%, al menos 65%, al menos 60%, al menos 55%, y al menos 50% de la actividad en la ausencia del anticuerpo. La invención también caracteriza anticuerpos específicos de receptor que tanto evitan el haz de ligando como activación de receptor así como anticuerpos que reconocen el complejo ligando-receptor y de preferencia no reconocen específicamente el receptor no ligado o el ligando no unido. Igualmente, se incluyen en la invención anticuerpos neutralizantes- que unen el ligando y evitan unión de ligando con el receptor, así como anticuerpos que unen el ligando, de esta manera evitando activación de receptor, que no evitan que el ligando una al receptor. Además incluidos en la invención están anticuerpos que activan al receptor. Estos anticuerpos pueden actuar como agonistas receptores, es decir potencian ? activan cualquiera de todas o un subconjunto de las actividades biológicas de la activación de receptor mediada por ligando, por ejemplo al inducir hibridización del receptor. Los anticuerpos pueden ser especificados como agonistas, antagonistas o agonistas inversos para actividades biológicas que comprenden las actividades biológicas específicas de los péptidos de la invención aquí descritos. Los agonistas de anticuerpo anteriores pueden elaborarse utilizando métodos conocidos en la especialidad. Ver por ejemplo la Publicación del PCT WO 96/40281; la Patente de los E.U.A. No. 5,811,097; Deng y colaboradores, Blood 92(6): 1981-1988 (1998); Chen y colaboradores, Cáncer Res . 58 (16) : 3668-3678 (1998); Harrop y colaboradores, J. I muno 1 . 161 (4) : 1786-1794 (1998); Zhu y colaboradores, y colaboradores, Cáncer Res . 58 (15) :3209-3214 (1998); Yoon y colaboradores, J. Immunol . 160 (7) : 3170-3179 (1998); Prat y colaboradores, J. Cell . Sci . 111 (Pt2) :237-247 (1998); Pitard y colaboradores, J. Inmuno 1 . Methods 205(2): 177-190 (1997) ; Liautard y colaboradores, Cytokine (Ci tocina) 9(4):233-241 (1997); Carlson y colaboradores, J. Biol .

Chem . 272(17) : 11295-11301 (1997); Taryman y colaboradores , Neuron (Neurona) 14 (4) : 755-762 (1995); Muller y colaboradore , Structure (Es tructura) 6 (9) : 1153-1167 (1998); Bartunek y colaboradores, Cytokine 8(1) : 14-20 (1996) (todas incorporadas aquí por referencia completamente) . .Anticuerpos de la presente" invención pueden ser empleados, por ejemplo pero no limitados a, para purificar, para detectar y hacer objetivo o blanco los polipéptidos de la presente invención, incluyendo tanto métodos de diagnóstico como terapéuticos in vivo e in vitro. Por ejemplo, los anticuerpos tienen uso en inmuno ensayo para medir en forma cualitativa y cuantitativa niveles de los polipéptidos de la presente invención en muestras biológicas. Ver por ejemplo Harlow y colaboradores, Antibodies : A Laboratory , Manual , (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988) (incorporada por referencia aquí completamente) . Como se discute con más detalle a continuación, los anticuerpos de la presente invención pueden ser empleados ya sea solos o en combinación con otras composiciones. Los anticuerpos además pueden ser fusionados de manera recomendante a un polipéptido heterologo en el extremo -N o -C o conjugados químicamente (incluyendo conjugaciones covalentes y no covalentes) a polipéptidos u otras composiciones. Por ejemplo, anticuerpos de la presente invención pueden fusionarse como conjugantes de manera recombinante con moléculas útiles como etiquetas para ensayo de detección y moléculas tales como polipéptidos heterólogos, drogas, radionúclidos, o toxinas. Ver por ejemplo la Publicación del PCT WO 92/08495; WO 91/14438; WO 89/12624; la Patente de los E.U.A. No. 5,314,995; y EP 396,387. Los anticuerpos de la invención incluyen derivados que están modificados, es decir por la conexión covalente de cualquier tipo de molécula al anticuerpo tal que la conexión covalente no evita que el anticuerpo genere una respuesta anti-idiotípica . Por ejemplo, no a manera de limitación, los derivados de anticuerpos incluyen anticuerpos que se han modificado, por ejemplo por glicosilación, acetilación, pegilación, fosfilación, amidación, derivatización por grupos protectores/bloqueo conocidos, escisión proteolítica, enlace a un ligando celular u otra proteína, etc. Cualquiera de numerosas modificaciones químicas pueden llevarse a cabo por técnicas conocidas, incluyendo pero no limitado a escisión química específica, acetilación, formilación, síntesis metabólica de tunicamicina , etc. Adicionalmente, el derivado puede contener uno o más amino ácidos no clásicos. Los anticuerpos de la presente invención pueden ser generados por cualquier método conveniente conocido en la especialidad. Anticuerpos policlonales a un antígeno-de interés puede producirse por diversos procedimientos bien conocidos en la especialidad. Por ejemplo, un polipéptido de la invención pueden administrarse a diversos animales huésped, incluyendo pero no limitados a conejos, ratones, ratas, etc, para inducir la producción de suero que contienen anticuerpos monoclonales específicos para el antígeno. Pueden emplearse diversos adyuvantes para incrementar la respuesta inmunológica, dependiendo de las especies huésped, e incluye pero no limitado a, Freund (completo e incompleto) , geles minerales tales como hidróxido de aluminio, substancias activas tales como lisolecitina, pluronic polioles, polianiones, péptidos, emulsiones de aceite, hemocianina de erizo de mar, dinitrofenol , y adyuvantes humanos potencialmente útiles tales como BCG (bacilo Calmette-Guerin) y corynebacterium parvum. Estos adyuvantes también son bien conocidos en la especialidad.

Pueden prepararse anticuerpos monoclonales utilizando una amplia variedad de técnicas conocidas en la especialidad incluyendo el uso de hibridoma, recombinante, y exhibidor de fago, o una combinación de las mismas. Por ejemplo, anticuerpos monoclonales pueden producirse utilizando técnicas de hibridoma que incluyen aquellas conocidas en la especialidad ilustradas por ejemplo en Harlow y colaboradores , Antibodies: A Laboratory Manual (Anticuerpos: Un Manual de laboratorio, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988) ; Hammerling, y colaboradores , in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas (Anticuerpos monoclonales e hibridomas de Célula T) 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981) (las referencias aquí se incorporan completamente) . El término "anticuerpo monoclonal" como se emplea aquí, no se limita a anticuerpos producidos a través de tecnología de hibridoma. El término "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo que se deriva de un solo clon, incluyendo cualquier clon eucariótico, procariótico o fago y no al método por el cual se produce. Métodos para producir y monitorear anticuerpos específicos utilizando tecnología de hibridomas son rutina y bien conocidos en la especialidad y se discuten en detalle en los Ejemplos (e.g. los Ejemplos 22 y 30) . En un ejemplo no limitante, pueden inmunizarse ratones con un polipéptido de la invención o una célula que expresa este péptido. Una vez que se detecta una inmunorespuesta, por ejemplo anticuerpos específicos para el antígeno se detectan en el suero de ratón, el bazo de 5 ratón se cosecha y se aislan esplenocitos. Los esplenocitos luego se fusionan por técnicas bien conocidas con cualesquiera células de mieloma convenientes, por ejemplo células de la línea celular • SP20 disponibles de ATCC. Hibridomas se eligen y clonan 10 por dilución limitada. Los clones de hibridoma luego se ensayan por métodos conocidos en la especialidad para células que secretan anticuerpos capaces de enlace de un polipéptido de la invención. Fluido de ascitos que generalmente contiene otros niveles de anticuerpos, puede 15 generarse al inmunizar a ratones con clones de hibridoma positivos . De acuerdo con esto, la presente invención proporciona métodos para generar anticuerpos monoclonales, así como anticuerpos producidos por los 20 métodos, que comprenden cultivar una célula de hibridoma que secreta un anticuerpo de la invención en donde de • preferencia, el hibridoma se genera al fusionar esplenocitos de un ratón inmunizado con un antígeno de la invención con células de mieloma y luego monitorear los 25 hibridomas que resultan de la fusión de clones de hibridoma que secretan un anticuerpo capaz de ligar un polipetido de la invención. Fragmentos de anticuerpo que reconocen epítopes específicos pueden ser generados por técnicas conocidas. Por ejemplo fragmentos Fab y F(ab')2 de la invención pueden producirse por escisión proteolítica de moléculas de inmunoglobulina, utilizando enzimas tales como papaína (para producir fragmentos Fab) o (para producir fragmentos F(ab') . Fragmentos F(ab')2 contienen la región variable, la región constante , de cadena ligera y el dominio Oíx de la cadena pesada . .Por ejemplo, los anticuerpos de la presente invención también pueden generarse utilizando varios métodos de exhibición fago conocidos en la especialidad. En métodos de exhibición fago, se exhiben dominios de anticuerpos funcionales en la superficie de partículas fago que transportan las secuencias de polinucleótido que las codifican. En una modalidad particular, este fago puede utilizarse para exhibir dominios de enlace de antígeno expresados a partir de un repertorio o biblioteca de anticuerpos combinatoria (por ejemplo humano o murino) . Un fago que expresa un dominio de enlace antígeno que liga el antígeno de interés, puede seleccionarse o identificarse con antígeno, por ejemplo utilizando antígeno etiquetado o antígeno ligado o capturado en una cuenta o superficie sólida. El fago empleado en estos métodos típicamente son fagos filamentosos que incluyen dominios de enlace fd y M13 expresados del fago con Fab o dominios de anticuerpo Fv estabilizado con bisulfuro fusionados recombinantemente ya sea al gen fago III o proteína de gen VIII. Ejemplos de métodos de exhibición de fago que pueden emplearse para producir los anticuerpos de la presente invención incluyen aquellos descritos en Brinkman y colaboradores , J. Immunol . Methods 182:41-50 (1995); y colaboradores, J.

Immunol . Me thods 184:177-186 (1995); Kettleborough y colaboradores, Eur. J. Immunol . 24:952-958* (1994); Persic y colaboradores, Gene 187:9-18 (1997); Burton y colaboradores, Advances in Immunology 57:191-280 (1994); Solicitud de Patente No. PCT/GB91/01134 ; Publicaciones del PCT WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; y las Patentes de los E.U.A. Nos. 5,698,426; 5,223,409 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780,225; 5,658,727 5,733,743 y 5,969,108; cada una de las cuales aquí se incorpora completamente por referencia. Como se describe en las referencias anteriores, después de selección de fago, las regiones de codificación del anticuerpo del fago pueden aislarse y utilizarse para generar anticuerpos enteros incluyendo anticuerpos humanos, o cualquier otro fragmento de antígeno deseado, y expresados en cualquier huésped deseado, incluyendo células de mamífero, células de insecto, células de planta, o levaduras y bacterias, por ejemplo como se describe en detalle a continuación. Por ejemplo, técnicas para producir en forma recombinante fragmentos Fab, Fab' y F(ab')2 también pueden ser empleadas utilizando métodos conocidos en la especialidad tales como aquellos descritos en las Publicaciones PCT Nos. WO 92/22324; Mullinax y colaboradores, Biotechniques (Bíotécnícas) 12 (6) : 864-869 (1992); y Sawai y colaboradores, AJRI 34:26-34 (1995); y Better y colaboradores, Science (Ciencia) 240 : 10*41-1043 (1988) (las referencias se incorporan aquí completamente) . Ejemplos de técnicas que pueden emplearse para producir Fvs de cadena sencilla y anticuerpos incluyen aquellas descritas en las Patentes de los E.U.A. Nos. 4,946,778 y 5,258,498; Huston y colaboradores, Methods in Enzymology (Métodos en Enzimología) 203:46-88 (1991); Shu y colaboradores, PNAS 90:7995-7999 (1993); y Skerra y colaboradores, Science 240:1038-1040 (1988). Para aLgunos usos, incluyendo uso in vivo de anticuerpos en humanos y ensayos de detección in vitro, puede ser preferible el utilizar anticuerpos quiméricos humanizados, o humanos. Un anticuerpo quimérico es una 5 molécula en donde diferentes porciones del anticuerpo se derivan -de diferentes especies de animales, tales como anticuerpos que contienen una región variable de un anticuerpo monoclonal murino y una región constante de • inmunoglobulina humana. Métodos para producir 10 anticuerpos quiméricos se conocen en la especialidad. Ver por ejemplo, Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi y colaboradores, Biotechniques 4:214 (1986); Gillies y colaboradores, J. I munol . Methods 125: 191-202 (1989); Patentes de los E.U.A. Nos. 5,807,715; 4,816,567; y 15 4,816397, que aquí se incorporan por referencia completamente. .Anticuerpos humanizados son moléculas de anticuerpo, de anticuerpos de especies no humanas que ligan el antígeno deseado, que tiene uno r o más regiones de determinación de complementaridad (CDRs 20 complementarity determining regions) de las especies no • humanas y una o más regiones del marco de una molécula de inmunoglobulina humana. A menudo, residuos de marco en las regiones de marco humano se substituirán con el residuo correspondiente del anticuerpo donador CDR para alterar, de preferencia mejorar, enlace de antígeno. Estas substituciones de marco se identifican por métodos bien conocidos en la especialidad, por ejemplo al modelar las interacciones de los residuos de marco CDR para 5 identificar residuos de marco importantes para enlace de antígeno y comparación de secuencia para identificar residuos de marco no usuales en posiciones particulares (ver por ejemplo, Queen y colaboradores , en la Patente de • los E.U.A. No. 5,585,089; Riechmann y colaboradores, 10 Na ture 332:323 (1988), (que se incorporan aquí por referencia completamente) . Pueden humanizarse anticuerpos utilizando una variedad de técnicas conocidas en la especialidad, incluyendo por ejemplo injertos CDR (EP 239,400; Publicación PCT WO 91/09967; Patentes de los 15 E.U.A. Nos. 5,225,539; 5,530,101; y 5,585,089), revestimiento delgado o renovación de superficie (EP 592,106; EP 519,596; Padlan, Molecular Immunology (Inmunología Mol ecular) 28 (4/5) : 489-498 (1991); Studnicka y colaboradores, Protein Engineering (Ingeniería de 20 Proteínas) 7(6) :805-814 (1994); Roguska . y colaboradores, • PNAS 91:969-973 (1994)), y entremezclado de cadena (Patente de los E.U.A. No. 5,565,332).

Anticuerpos humanos completamente son particularmente deseables para tratamiento terapéutico de pacientes humanos . .Anticuerpos humanos pueden elaborarse por una variedad de métodos conocidos en la especialidad incluyendo métodos de escisión de fgo descritos anteriormente utilizando bibliotecas de anticuerpos derivadas de secuencias de inmunoglobulina humana . Ver también Patentes de los E.U.A. Nos. 4,444,887 y 4,716,111; y Publicaciones PCT WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735, y WO 91/10741; cada una de las cuales aquí se incorpora completamente por referencia. Anticuerpos humanos también pueden producirse utilizando ratones transgénicos que son incapaces de expresar inmunoglobulinas endógenas funcionales, pero que pueden expresar genes de inmunoglobulina humana. Por ejemplo, en los complejos de gen de inmunoglobulina de cadenas pesada y ligera humanas, pueden introducirse aleatoriamente o por recombinación homologa en células de tallo embriónicas de ratón. En forma alterna, la región variable humana, región constante y región de diversidad pueden introducirse en células 'de tallo embriónicas de ratón además de los genes de cadena pesada y ligera humano. Los genes de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera de ratón pueden hacerse no funcionales por separado o simultáneamente con la introducción de sitios de inmunoglobulina humana o recombinación homologa. En particular, eliminación homozigótica de la región JH evita producción de "anticuerpos endógenos. Las células de tallo embriónicas modificadas se expanden y micro inyectan en blastocitos para producir ratones quiméricos. Los ratones quiméricos luego se desarrollan para producir descendencia homozigótica que expresan anticuerpos humanos. Los ratones transgénicos se inmunizan en la forma normal con un antígeno selecto por ejemplo todo o una porción del polipéptido de la invención. Anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno pueden obtenerse de los ratones transgénicos inmunizados utilizando tecnología de hibdridoma convencional . Los transgénicos de inmunoglobulina humana contenidos por los ratones transgénicos se rearreglan durante diferenciación de células B, y subsecuentemente se someten a cambio de clase y mutación somática. De esta manera, utilizando esta técnica, es posible producir anticuerpos IgG, IgA, IgM, y IgE terapéuticamente útil, para una revisión de esta tecnología para producir anticuerpos humanos, ver Lonberg and Huszar, Jnt. Rev. Im unol . 13:65-93 (1995).

Para una discusión detallada de esta tecnología para producir anticuerpos humanos y anticuerpos y protocolos monoclonales humanos para producir estos anticuerpos, ver por ejemplo las Publicaciones de WO 98/24893; WO 92/01047; WO 96/34096; WO 96/33735; Pétente Europea No. 0 598 877; Patentes " de los ~?.U.A._ NOS. 5,413,923; 5,625,126; 5,633,425; 5,569,825; 5,661,016; 5,545,806; 5,814,318; 5,885,793; 5,916,771; y 5,939,598, que se incorporan por referencia aquí completamente. Además, compañías tales como 'Abgenix, Inc. (Freemont, CA) y Genpharm (San José, CA) pueden contactarse para proporcionar anticuerpos humanos dirigidos contra un antígeno selecto utilizando tecnología similar a la descrita anteriormente. Anticuerpos completamente humanos que reconocen un epítope selecto pueden generarse utilizando una técnica referida como "selección guiada." En este enfoque un anticuerpo monoclonal no humano selecto, por ejemplo un anticuerpo de ratón, se utiliza para guiar la selección de un anticuerpo humano completamente que reconoce el mismo epítope (Jespers y colaboradores , Bio/technology 12:899-903 (1988)). .Además, anticuerpos a los polipéptidos de la invención a su vez pueden utilizarse para generar anticuerpos anti-idiotipo que "imitan" polipéptidos de la invención utilizando técnicas bien conocidas para aquellos con destreza en la especialidad. (Ver por ejemplo Greenspan & Bona, FASEB J. 7 (5) : 437-444 ; (1989) y Nissinoff, J., Immunol . 147 (8) : 2429-2438 (1991)). Por ejemplo, anticuerpos que ligan e inhiben competitivamente multimerización de polipéptido y/o ligan de un polipéptido de la invención con un ligando pueden 5 utilizarse para generar anti-idiotipos que "imitan" la multimerización de polipéptido y/o dominio de unión y, como consecuencia, ligan con y neutralizan polipéptido ^ - ^ y/o su ligando. Estos anti-idiotipos de neutralización o fragmentos Fab anti-idiotipos pueden emplearse en 10 regímenes terapéuticos para neutralizar ligando polipéptido. Por ejemplo estos anticuerpos anti-idiotípicos pueden utilizarse para ligar un polipéptido de la invención y/o unir sus ^ ligandos/receptor y de esta manera bloquear su actividad 15 biológica El término "ligar un polipéptido de la invención con un ligando", incluye pero no está limitado a, la unión de un ligando o polipéptido ligando de la presente invención al receptor; la unión de un 20 polipéptido receptor de la presente invención con un ligando; la unión de un anticuerpo de la presente invención con un antígeno o epítope; la unión de un antígeno o epítope de la presente invención a un anticuerpo; la unión de un anticuerpo de la presente 25 invención a un anticuerpo anti-idiotípico; la unión de un anticuerpo anti-idiotípico de la presente invención a un ligando; la unión de un anticuerpo anti-idiotípico de la presente invención a un receptor; la unión de un anticuerpo anti-idiotípico de la presente invención a un 5 ligando, receptor o anticuerpo, etc. Como otro ejemplo, anticuerpos que ligan a y activan competitivamente el polipéptido de la invención o su ligando pueden emplearse para generar anticuerpos anti- idiotípicos que imitan el dominio de unión o enlace 10 de polipéptido y/o dominio de activación y como consecuencia, y a ligar a y activar el polipéptido y/o su ligando. Estos idiotipos de activación o fragmentos Fab estos anti-idiotipos pueden utilizarse en los regímenes terapéuticos para activar ligandos polipéptidos. Por 15 ejemplo, estos anticuerpos anti -idiotípicos pueden utilizarse para ligar un polipéptido de la invención para de esta manera iniciar su actividad biológica y/o unir un ligando/receptor al polipéptido de la invención para de esta manera iniciar su actividad biológica. 20 Polinucleótidos que Codifican Anticuerpos . La invención además proporciona polinucleótidos que comprenden o en forma alterna consisten de, una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo de la invención y sus fragmentos. La invención también abarca 25 polinucleótidos que hibridizan bajo condiciones de hibridización estrictas o menos estrictas, por ejemplo como se define arriba, a polinucleótidos que codifican un anticuerpo, de preferencia que liguen específicamente a polipéptido de la invención, de preferencia, un 5 anticuerpo que liga a un polipéptido que tiene una secuencia amino ácidos de ID de SEC NO. : 2'. Pueden obtenerse los polinucleótidos y la secuencia de nucleótidos de los polinucleótidos determinada, por cualquier método conocido en la 10 especialidad. Por ejemplo, si la secuencia de nucleótido del anticuerpo no se conoce, un polinucleótido que codifica el anticuerpo puede ser ensamblado a partir del oligonucleótidos químicamente sintetizados (por ejemplo como se describe en Kutmeier y colaboradores , 15 Biotechniques 17:242 (1994)), que brevemente involucra la síntesis de oligonucleótido superpuestos que contienen porciones de la secuencia que codifica el anticuerpo, alinear y ligar esos oligonucleótidos y luego amplificación de los oligonucleótidos ligados por PCR. 20 En forma alterna, un polinucleótido que codifica un anticuerpo puede ser generado de ácido nucleico a partir de una fuente conveniente. Si un clon que contiene un ácido nucleico que codifica un anticuerpo particular, no está disponible, pero la secuencia de la 25 molécula anticuerpo se conoce, un ácido nucleico que codifica la inmunoglobulina puede sintetizarse químicamente u obtenerse de una fuente conveniente (por ejemplo una biblioteca .ADNc anticuerpo, o una biblioteca ADNc generada de, o ácido nucleico, de preferencia poli A+ aislado de, cualquier tejido o célula que expresa el anticuerpo, tal como células de hibridoma seleccionadas para expresar un anticuerpo de la invención (con anticipación PCR utilizando cebadores sintéticos hibridizables a los extremos 3 ' y 5 ' de la secuencia de codificación de anticuerpo o accionar utilizando una sonda oligonucleótido específica para la secuencia de gen particular a identifucar, por ejemplo un clon .ADNc y una biblioteca ADNc que codifica el anticuerpo. Ácidos nucleicos amplificados generador por PCR luego pueden clonarse en vectores de clonación replicable utilizando cualquier método bien conocido en la especialidad. Una vez que la secuencia del nucleótido y la secuencia de amino -ácido correspondientes del anticuerpo se determinan, la secuencia de nucleótidos del anticuerpo pueden manipularse utilizando métodos bien conocidos en la especialidad para la manipulación de secuencias de nucleótidos, por ejemplo técnicas de .ADN recombinante, mutagénesis dirigida a sitio, PCR, etc. (ver por ejemplo las técnicas descritas en Sambrook y colaboradores , Molecular Cloning, A Labora tory Manual , (Clonación Molecular: Un Manual de Labora torios) 2a Edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1990) y Ausubel y colaboradores, eds . , Curren t Protocols in Molecular Biology, (Actuales protocolos en biología molecular) John Wiley & Sons, NY, (1998) ambas incorporadas por referencia aquí completamente) para generar anticuerpos que tienen una secuencia de amino ácidos diferente para crear substituciones, eliminaciones y/o inserciones de amino ácido. En una modalidad específica, la secuencia de amino ácidos de los dominios variables de cadena pesada y/o ligera puede inspeccionarse para identificar las secuencias de las secciones de terminación de complementaridad (CDRs) por métodos bien conocidos en la especialidad, por ejemplo por comparación con secuencias de amino ácidos conocidas de otras regiones variables de cadena pesada y ligera para determinar las regiones de inter variabilidad de secuencia. Utilizando técnicas de .ADN recombinantes rutinarias, una o más de las CDRs puede insertarse dentro de regiones de marco, en regiones de marco humano para humanizar un anticuerpo' a humano, como se describió arriba. Las regiones de marco pueden ser de marco de origen natural o consenso, y de preferencia regiones de marco humano (ver por ejemplo Chothia y colaboradores, J. Mol . Biol . 278:457-479 (1998) para una lista de regiones de marco humano) . De preferencia, el polinucleótido generado por la combinación de regiones de marco y las CDRs codifica un anticuerpo que liga 5 específicamente un polipéptido de la invención. De preferencia, como se describió anteriormente, una o más substituciones de amino ácido pueden realizarse dentro de las regiones de marco y de preferencia las substituciones de amino ácido mejoran la unión del anticuerpo a su 10 antígeno. Adicionalmente, estos métodos pueden emplearse para hacer substituciones o eliminaciones de amino ácido de uno o más de residuos cisteína de región variable que participan en un enlace disulfuro intra cadena para generar moléculas de anticuerpo que carecen uno o más *> 15 enlaces desulfuro intracadena. Otras alteraciones al polinucleótido están abarcadas por la presente invención y dentro de la destreza de la especialidad. Además, pueden emplearse técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos" (Morrison 20 y colaboradores, Proc . Nati . Acad . Sic . 81:851-855 (1984); Neuberger y colaboradores , Na ture 312:604-608 (1984); Takeda y colaboradores . , Na ture 314:452-454 (1985) ) por lisado de genes de una molécula de anticuerpo de ratón con especificidad de antígeno apropiada junto 44Q con genes de una molécula de anticuerpo humano de actividad biológica apropiada. Como se describió anteriormente, un anticuerpo quimérico es una molécula en donde diferentes porciones se derivan de diferentes especies animales, tales como aquellas que tienen una región variable derivada de un mAb murino y una región constante de inmunoglobulina humana, por ejemplo anticuerpos humanizados. En forma alterna, técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena sencilla (Patente de los E.U.A. No. 4,946,778; Bird, Science 242:423- 42 (1988) ; Huston y colaboradores , Proc. Nati . Acad. Sic.

USA 85:5879-5883 (1988); y Ward y colaboradores, Na ture 334^544-54 (1989)) pueden adaptarse para producir anticuerpos de cadena sencilla. .Anticuerpos de cadena sencilla se forman al enlazar los fragmentos de cadena pesada y ligera de la región Fv mediante un puente amino ácido, resultando en un polipéptido de cadena sencillo. Técnicas para el ensamblado de fragmentos Fv funcionales E. coli también pueden emplearse (Skerra y colaboradores , Science 242:1038-1041 (1988)). Métodos para Producir Anticuerpos . Los anticuerpos de la invención pueden producirse por cualquier método conocido en la especialidad para la síntesis de anticuerpos, en particular por síntesis química o de preferencia por técnicas de expresión recombinante . Expresión recombinante de un anticuerpo de la invención, o su fragmento o derivado o—análogo, para este ejemplo, una cadena pesada o ligera del anticuerpo de la invención o un anticuerpo de cadena simple de la invención (requiere construcción de un vector de expresión que contiene un polinucleótido que codifica el anticuerpo. Una vez que un polinucleótido codifica una molécula del anticuerpo o una cadena pesada o ligera de un anticuerpo, o una porción del mismo (de preferencia que contiene el dominio variable de cadena pesada o ligera) de la invención se ha obtenido, el vector para la producción de la molécula de anticuerpo puede producirse por tecnología .ADN recombinante utilizando técnicas bien conocidas en la especialidad. De esta manera, se describen aquí métodos para preparar una proteína al expresar un polinucleótido que contiene una secuencia de nucleótido que codifica el anticuerpo. Métodos que son bien conocidos por aquellos con destreza en la especialidad, pueden ser utilizados para construir vectores de expresión que contienen secuencias de codificación del anticuerpo y señales de control de transcripción y traducción apropiadas. Estos métodos incluyen, por ejemplo técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas y de recombinación genética in vivo. La invención de esta manera proporciona vectores replicables que comprenden una secuencia de nucleótidos 5 que codifica una molécula de anticuerpo de la invención, o una cadena pesada o ligera de la misma, o de dominio variable de cadena pesada o ligera enlazado operativamente a un promotor. Estos vectores, pueden incluir la secuencia de la misma, o un dominio variable 10 de cadena pesada o ligera enlazado operativamente a un promotor. Estos vectores, pueden incluir la secuencia de nucleótido que codifica la región constante de la molécula anticuerpo (ver por ejemplo la Publicación del PCT WO 86/05807; Publicación del PCT WO 89/01036; y la 15 Patente de los E.U.A No. 5,122,464) y el dominio variable del anticuerpo puede clonarse en este vector para expresión de toda la cadena pesada o' ligera. El vector de expresión se transfiere a una célula huésped por técnicas convencionales y las células 20 transceptoras se cultivan por técnicas convencionales para producir un anticuerpo de la invención. De esta manera, la invención incluye células huésped que contienen un polinucleótido que codifica un anticuerpo de la invención, o una cadena pesada o ligera del mismo, o 25 un anticuerpo de cadena sencilla de la invención enlazado operativamente con un promotor heterólogo. En modalidades preferidas para la expresión de los anticuerpos de doble cadena, vectores que codifican tanto las cadenas pesadas como ligera pueden co-expresarse en la célula huésped o para expresión de toda la molécula de inmunoglobulina, como se detalla a continuación. Una variedad de sistemas de vector de exprésion-huésped puede utilizarse para expresar las moléculas anticuerpo de la invención. Estos sistemas de expresión-huésped representan vehículos por los cuales las secuencias de codificación de interés pueden producirse y subsecuentemente purificarse, pero también representan células que pueden, cuando se transforman o transfectan con las secuencias de precipitación de nucleótido apropiadas, expresar una molécula de anticuerpo de la invención in situ. Estas incluyen, pero no están limitadas a microorganismos tales como bacterias (por ejemplo E. coli, B. subtílis) transformadas con ADN bacterial, ADN plásmido, o expresión de ADN cósmido que contienen secuencias de codificación de anticuerpo; levadura (por ejemplo, Saccharomyces, Pichia) transformado con vectores de expresión de levadura recombinantes que contienen secuencias de codificación de anticuerpo; sistemas de células de insecto infectados con vectores de expresión de virus recombinante (por ejemplo, baculovirus) que contienen secuencias de codificación de anticuerpo; sistemas de células de planta infectados con vectores de expresión de vidrio recombinante (por ejemplo virus mosaico de coliflor, CaMV; virus de mosaico de tabaco, TMV) o transformados con vectores de expresión de plásmido recombinante (por ejemplo plásmido Ti) que contienen secuencias de codificación de anticuerpos; o sistemas de células de mamíferos (por ejemplo, COS, CHO, BHK, 293, 3T3 células) que alojan construcciones de expresión recombinante que contienen promotores derivados del genoma de células de mamífero (por ejemplo, promotor de metalotioneina) o de virus de mamífero (por ejemplo, el promotor posterior de adenovirus ; el promotor 7.5 k de virus de la vacuna de la viruela) . De preferencia, células bacterianas tales como Escherichia coli, y más preferiblemente células eucarióticas, en especial para la expresión de molécula de anticuerpo recombinante entera, se emplea para la expresión de una molécula de anticuerpo recombinante. Por ejemplo, células de mamífero tales como células de -ovario de hámster Chino (CHO) , en conjunto con un vector tal como el elemento promotor de gen anterior intermedio principal del citomegalovirus humano es un sistema de expresión effectívo para anticuerpos (Foecking y colaboradores , Gene 45: 101 (1986) ; Cockett y colaboradores , Bio/Technology 8:2 (1990)). En sistemas bacterianos, una cantidad de vectores de expresión puede seleccionarse ventajosamente dependiendo del uso pretendido para la molécula anticuerpo expresado. Por ejemplo, cuando una gran cantidad de esta proteína se va a producir, para la generación de composiciones farmacéuticas de una molécula de anticuerpo, vectores que dirigen la expresión de altos niveles de productos de proteína de fusión que se depositan fácilmente, puede ser conveniente. Estos vectores incluyen, pero no están limitados al vector de expresión E. Coli pUR278 (Ruther y colaboradores, EMBO J. 2 : 1791 (1983)), en donde la secuencia de codificación de anticuerpo puede ligarse individualmente en el vector en cuadro con la región de codificación lac Z, de manera tal que se produce una proteína de fusión; vectores pIN (Inouye & Inouye, Nucleic Acids Res . 13:3101-3109 (1985); Van Heeke & Schuster, J. Biol . Chem. 24:5503-5509 (1989)); y semejantes. Vectores pGEX también pueden emplearse para expresar polipéptidos ajenos como proteínas de fusión con glutationa S-transferasa (GST) . En general, estas proteínas de fusión son solubles y pueden purificarse fácilmente a partir de células lisadas por adsorción y enlace a cuentas de agarosa-glutationa en matriz seguido por elución en la presencia de glutationa libre. Los vectores GEX se diseñan para incluir trombina o sitios de escisión factor Xa proteasa de manera tal que el producto o gen objetivo clonado pueda liberarse de la porción GST. En un sistema de insecto, virus de polihedrosis nuclear de autógrafa (AcNPV) se emplea como un vector para expresar genes e'xtraños . El virus crece en células de Spodoptera frugiperda . La secuencia de codificación de anticuerpo puede clonarse individualmente en las regiones esenciales (por ejemplo el gen polihedrina) del virus y coloca bajo el control de un AcNPV (por ejemplo el promotor polihedrina) . En células huésped de un mamífero, una cantidad de sistemas de expresión de base viral puede ser utilizado. En casos en donde se utiliza un adenovirus como un vector de expresión, la secuencia de codificación de anticuerpo de "interés puede ligarse a un complejo control de traducción/transcripción de adenovirus, por ejemplo el promotor posterior y secuencia líder tripartita. Este gen quimérico luego puede insertarse en el genoma de adenovirus por recombinación in vitro o in vivo. Inserción en una región esencial de genoma viral (por ejemplo región El o E3) resultará en un virus recombinante que es viable y capaz de expresar la molécula de anticuerpo en huéspedes infectados. (Ver por ejemplo Logan & Shenk, Proc . . Na ti . Acad. Sic . USA 8.1:355-359 (1984)). Señales de iniciación específicas también pueden ser requeridas para traducción eficiente de secuencias de codificación de anticuerpo insertadas. Estas señales incluyen las secuencias adyacentes y codón de inicio ATG . Además, el codón de inicio debe estar en fase con el marco de lectura de la secuencia de codificación deseada para asegurar traducción de todo el insecto. Estas señales de control de traducción exógenas y codones de inicio pueden ser de una variedad de orígenes, tanto naturales como sintéticos. La eficiencia de expresión puede mejorarse por la inclusión de elementos mejoradores de transcripción apropiados, terminada la transcripción, etc (ver Bittner y colaboradores, Methods in Enzymol . 153:51 -544 (1987)). Además, una cepa de célula huésped puede seleccionarse que module la expresión de las secuencias insertada, o modifique y procese el producto de gen en la forma específica deseada. Estas modificaciones (por ejemplo, glícosilación) y procesamiento (por ejemplo escisión) de productos de proteína, puede ser importante para la función de la proteína. Diferentes células huésped tienen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento sin modificación post-producción de proteínas y productos de gen. Líneas celulares o sistemas huésped apropiados pueden seleccionarse para asegurar la modificación y procesamiento correctos de la proteína extraña expresada. Para este objetivo, células huésped eucarióticas que poseen la maquinaria celular para adecuado procesamiento de la transcripción primaria, glicosilación, y fosforilación del producto de gen, pueden ser utilizadas. Estas células huésped de mamíferos incluyen pero no están limitadas a CHO, VERY, BHK, Hela, COS, MDCK, 293, 3T3, WI38, y en particular, líneas de células de cáncer de pecho tales como por ejemplo BT483, Hs578T, HTB2 , BT20 y T47D, y líneas de células de glándula mamaria normal tales como por ejemplo CRL7030 y Hs578Bst. Para producción con alto rendimiento a largo plazo, de proteínas recombinantes, se prefiere expresión estable. Por ejemplo, líneas celulares que expresan en forma estable la molécula anticuerpo, pueden ser sometidas a ingeniería. En lugar de utilizar vectores de expresión que contienen orígenes virales de replicación, pueden transformarse células huésped con 4DN controlado por elementos de control de expresión apropiados (por ejemplo, promotor, mejorador, secuencias, terminadores de transcripción, sitios de poliadenilación, etc.), y un marcador seleccionable pero no funcional u origen viral intacto. Siguiendo la introducción de .ADN extraño, o ajeno, células de ingeniería pueden -permitirse que crezcan por uno o dos días en un medio enriquecido, y •A w luego conmutarse a un medio selectivo. El marcador seleccionable . en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite que las células integren en forma estable el plásmido en sus cromosomas y crezcan para formar focos que a su vez pueden clonarse y expanderse en líneas celulares. Este método puede emplearse ventajosamente para someter a ingeniería líneas de células que expresan en la molécula de anticuerpo. Estas líneas de células de ingeniería pueden ser útiles particularmente en monitoreo y evaluación de compuestos que interactuan directa o indirectamente con la molécula anticuerpo. Una cantidad de sistemas de selección pueden ser empleados incluyendo pero no limitados a timidina cinasa virus herpes simplex (Wigler y colaboradores , Cell 11 : 223 (1977) ) , hipoxantina-guanina fosforibosiltransferasa (Szybalska & Sz'ybalski, Proc .

Nati . Acad. Sci . USA 48:202 (1992)), y adenina fosforibosiltransferasa (Lowy y colaboradores , Cell 22:817 (1980)) genes pueden ser empleados en células -tk, -hgprt o -aprt, respectivmente. También puede emplearse resistencia antimetabo?ito como la base para la selección de los siguientes genes: dhfr, que confiere resistencia a metotrexato (Wigler y colaboradores, , Na ti .

Acad . Sci . USA 77:357 (1980); O ' Haré y colaboradores, Proc . Nati . Acad. Sci . USA 78:1527 (1981)); gpt, que confiere resistencia a ácido micofenólico (Mulligan & Berg, Proc . Nati . Acad. Sic. USA 78:2072 (1981)); neo, que confiere resistencia al aminoglicósido G-418 Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu y Wu, Biotherapy 3:87-95 (1991); Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol . Toxi col . 32:573-596 (1993); Mullígan, Science 260:926-932 (1993); y Morgan y -Anderson, Ann . Rev. Biochem. 62: 191 -217 (1993); May, 1993, TIB TECH 11 (5) : 155-215) ; e higro, que confiere resistencia a higromicina (Santerre y colaboradores , Gene 30: 147 (1984)) . Métodos comúnmente conocidos en la tecnología de .ADN recombinante, pueden aplicarse rutinariamente para seleccionar el clon recombinante deseado, y estos métodos se describen, por ejemplo en Ausubel y colaboradores . [eds.), Current Protocols in 453. Molecular Biology (Protocolos Actuales en Biología Molecular) , John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Labora tory Manual (Transferencia y Expresión de Gen; Un Manual de Labora torio) , Stockton Press, NY (1990); y en Capítulos 12 y 13, Dracopoli y colaboradores . , (eds), Current Protocols ín Human Genetics (Protocolos Actuales en Genética Humana) , John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin y colaboradores, J". Mol . Biol . 150:1 (1981), que se incorporan por referencia completamente. Los niveles de expresión de una molécula anticuerpo pueden incrementarse por amplificación de vector (para una revisión, ver Bebbington y Hentschel) , el uso de vectores con base en amplificación de gen para la expresión de genes clonados en células de mamíferos) en DNA Cloning, (Clonación de ADN) Vol . 3 , (Academic Press, New York, 1987) ) . Cuando un marcador en el anticuerpo que expresa el sistema de vector es amplificable, el incremento en el nivel de inhibidor presente en el cultivo de célula huésped aumentará el número de copias del marcador. Ya que la región amplificada se asocia con el gen anticuerpo, la producción del anticuerpo también se incrementará) . (Crouse y colaboradores, Mol . Cell . Biol . 3:257 (1983)). La célula huésped puede ser co-transfectada con dos vectores de expresión de la invención. El primer vector, que codifica un polipéptído derivado de cadena pesada y el segundo vector que codifica un polipéptido derivado de cadena ligera. Los dos vectores pueden contener marcadores seleccionables idénticos que permiten expresión igual de polipéptidos de cadena pesada y ligera. En forma alterna, un solo vector puede utilizarse que codifica, y es capaz de expresar, tanto polipéptidos de cadena pesada como ligera. En estas situaciones, la cadena ligera deberá colocarse mientras que la cadena pesada para evitar un exceso de cadena pesada libre tóxica (Proudfoot, Nature 322:52 (1986); Kohler, Proc . Nati . Acad. Sic . USA 77:2197 (1980)). Las secuencias de codificación para las cadenas pesada y ligera pueden comprender ADNc o ADN genómico. Una vez que la molécula de anticuerpo de la invención se ha producido por un animal, sintetizado químicamente o expresado de manera recombinante, puede purificarse por cualquier método conocido en la especialidad para purificación de una molécula de inmunoglobulina, por ejemplo por cromatografía (Por ejemplo intercambio de iones, afinidad, particularmente por afinidad para el antígeno específico después de proteína A, y cromatografía en columna de apresto) centrifugación, solubilidad diferencial o por cualquier otra técnica estándar para la purificación de proteína. Además, los anticuerpos de a presente invención o sus fragmentos pueden fusionarse a secuencias de polipéptido heterólogo o descritas aquí o de otra forma conocidas en la especialidad para facilitar purificación. La presente invención ^abarca anticuerpos fusionados de manera , recombinante o conjugados químicamente (incluyendo tanto conjugaciones covalentes como no covalentes) a un polipéptido (o por ser del mismo, de preferencia de al menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 amino ácidos del polipéptido) de la presente invención para generar proteínas de fusión. La fusión no necesariamente requiere ser directa, pero puede ocurrir a través de secuencias enlazadoras. Los anticuerpos pueden ser específicos para antígenos diferentes que polipéptidos (o su porción, de preferencia de al menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 amino ácidos del polipéptido) de la presente invención. Por ejemplo, pueden emplearse anticuerpos para hacer objetivo o blanco en los polipéptidos de la presente invención a tipos de células particulares, ya sea in vitro o in vivo, por fusión o conjugado de los polipéptidos de la presente invención y con anticuerpos específicos para receptores de superficie celular particulares. .Anticuerpos fusionados o conjugados con los polipéptidos de la presente invención también pueden ser utilizados en inmunoensayos in vitro y métodos de purificación utilizando métodos conocidos en la especialidad. Ver por ejemplo 'Harbor y colaboradores, arriba, y Publicación de PCT WO 93/21232; EP 439,095; Naramura y colaboradores, Immunol . Lett . 39:91-99 (1994); Patente de los E.U.A. No. 5,474,981; Gillies y colaboradores , PNAS 89:1428-1432 (1992); Fell y colaboradores, J. I munol . 146:2446-2452(1991), que aquí se incorporan por referencia completamente . Conjugados y Quelatos . La presente invención además incluye composiciones que comprenden los polipéptidos de la presente invención fusionados o conjugados con dominios de anticuerpo diferentes a las regiones variables. Por ejemplo, los polipéptidos de la presente invención pueden fusionarse o conjugarse a una región Fc de anticuerpo o una porción de la misma. La porción anticuerpo fusionada a un polipéptido de la presente invención puede comprender la región constante, región de pivoteo, dominio _ CH1( dominio CH2/ y dominio CH3 o cualquier combinación de sus dominios enteros o porciones. Los polipéptidos también pueden fusionarse o conjugarse a las porciones de los cuerpos anteriores para formar multímeros. Por ejemplo, porciones Fc fusionadas a los polipéptidos de la presente invención, pueden formar dímeros a través de unión de disulfuro entre las porciones Fc . Formas multiméricas superiores, pueden elaborarse al fusionar los polipéptidos a porciones de IgA y IgM. Métodos para fusionar o conjugar los polipéptidos de la presente invención a porciones de anticuerpo, se conocen en la .especialidad. Ver por ejemplo las Patentes de los E.U.A. Nos. 5,336,603; 5,622,929; 5,359,046; 5,349,053; 5,447,851; 5,112,946; EP 307,434; EP 367,166; Publicaciones de PCT WO 96/04388; WO 91/06570; Ashkenazi y colaboradores, Proc . Nati . Acad.

Sic. USA 88:10535-10539 (1991); Zheng, y colaboradores, J. Immunol . 154: 5590-5600 (1995); y Vil y colaboradores, Proc . 'lla tl . Acad. Sic . USA 89:11337-11341(1992) (las referencias se incorporan _ aquí por referencia completamente) . Como se discutió anteriormente, los polipéptidos correspondientes a un polipéptido, fragmento polipéptido o una variante de ID de SEC NO: 2 pueden fusionarse o conjugarse a las porciones de anticuerpo anteriores para incrementar la vida media in vivo de los polipéptidos o para utilizar en inmuno ensayos utilizando métodos conocidos en la especialidad. Además, los polipéptidos correspondientes a ID de SEC NO. : 2 pueden fusionarse o conjugarse a las porciones de anticuerpo anteriores para facilitar la purificación. Un ejemplo reportado describe proteínas quiméricas que consisten de los dos primeros dominios del polipéptido CD4 humano y diversos dominios de las regiones constantes de las cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulinas de mamífero. (EP 394,827; Traunecker y colaboradores, Na ture 331:84-86 (1988) . Eos polipéptidos de la presente invención, fusionados o conjugados a un anticuerpo que tienen estructuras diméricas . enlazadas a disulfuro (debido a IgG) , también puede ser más eficiente para enlazar y neutralizar otras moléculas, que la proteína secretada monomérica o el fragmento _ de proteína solo. (Fountoulakís y colaboradores, J. Biochem . 270:3958-3964 (1995) ) . En muchos casos, la parte Fc en una proteína de fusión, es benéfica en terapia y diagnóstico y de esta manera puede resultar por ejemplo en propiedades farmacocinéticas mejoradas. (EP A 232,262). En forma alterna, sería conveniente eliminar la parte Fc después que la proteína de fusión se ha expresado, detectado, y purificado. Por ejemplo, la porción Fc puede impedir terapia y diagnóstico si la proteína de fusión se utiliza como un antígeno para inmunización. En descubrimiento de drogas, por ejemplo, proteínas humanas, tales como hIL-5, se han fusionado con porciones Fc para el propósito de ensayos de monitoreo de alto rendimiento para identificar antagonistas de hIL-5. (Ver, Bennett y colaboradores , J. Molecular Recogni tion 8:52-58 (1995); Johanson y colaboradores, J. Biol . Chem . 270:9459-9471 (1995) . Aún más, los anticuerpos o sus fragmentos de la presente invención pueden fusionarse a secuencias marcadoras tales como un péptido, para facilitar la purificación. En modalidades preferidas, la secuencia amino ácido marcador es un péptido hexa-histidina, tal como la etiqueta que se proporciona en un vector pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311), entre otros, muchos de los cuales están comercialmente disponibles. Como se describe en Gentz y colaboradores, Proc . Na ti . Acad. Sic . USA 86:821-824 (1989), por ejemplo, hexa-histidina proporciona una purificación conveniente de la proteína de fusión. Otras etiquetas péptido útiles para purificación incluyen, pero no están limitadas a la etiqueta "HA" que corresponde a un epítope derivado de la proteína hemaglutinina influenza (Wilson y colaboradores, Cell 37 : 767 ( 1984 ) ) la etiqueta "Bandera" . Como se indicó anteriormente, anticuerpos que ligan específicamente al menos un epítope de MPIF-1 se incluyen, y anticuerpos que ligan específicamente cualquier epítope o polipéptido de la presente invención también pueden ser excluidos. De esta manera, los anticuerpos pueden ser específicos para MPIF-1 o pueden ser específicos para polipéptidos y epítopes diferentes a MPIF-1. La presente invención además abarca anticuerpos o sus fragmentos conjugados a un agente de diagnóstico o terapéutico. Los anticuerpos pueden emplearse a manera de diagnóstico por ejemplo, para monitorear el desarrollo o avance de un tumor como parte de un procedimiento de prueba química, por ejemplo, para determinar la eficacia de un régimen de tratamiento determinado. La detección puede facilitarse al acoplar el anticuerpo a una substancia detectable. Ejemplos de substancias detectables incluyen diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminescentes, materiales bioluminescentes, materiales radioactivos, metales que emiten positrones utilizando diversas tomografías de emisión de positrón, e iones de metal paramagnético no-radioactivo. La substancia detectable puede acoplarse ó conjugarse ya sea directamente al anticuerpo (o su fragmento) o indirectamente, a través de un intermediario (tal como por ejemplo, un enlazador conocido en la técnica) utilizando técnicas conocidas en la especialidad. Ver por ejemplo, la Patente de los E.U.A. No. 4,741,900 para iones de metal que pueden conjugarse ~a anticuerpos para utilizar como diagnóstico de acuerdo con la presente invención. Ejemplos de enzimas convenientes incluyen peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa, o acetilcolinesterasa; ejemplos de complejos de grupo prostético convenientes incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; ejemplos de materiales fluorescentes convenientes incluyen umbelliferona, fluoresceína, isotiocianato fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo o icoeritrina; un ejemplo- de un material luminescente incluye luminol; ejemplos de materiales bioluminescentes, incluyen luciferasa, luciferina, y aecuorina; y ejemplos de material radioactivo conveniente incluyen 125I, 131I, mIn, o 99Tc . Además, un anticuerpo o fragmento del mismo puede conjugarse a una porción terapéutica tal como una citotoxina, por ejemplo, un agente citotóxico, citoestático o citocida, un agente terapéutico o un ion de metal radioactivo, por ejemplo, alfa-emisores tales como, por ejemplo, 213Bi . Una citotoxina o agente citotóxico incluye cualquier agente_ que es nocivo para las células. Ejemplos incluyen paclitaxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etoposida, tenoposida, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorubicina, daunorubicina, dihidroxi antracina diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-dehidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lídocaína, propranolol, y puromicina y sus análogos u homólogos. Agentes terapéuticos incluyen, pero no están limitados a, antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato, 6 -mercaptopurina, 6-tioguaniha, citarabina, 5-fluorouracilo decarbazina) , agentes alquilantes (por ejemplo, mecloretamina, tioepa clorambucilo, melfalan, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU) , ciclotosfamida, busulfan, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C, y cis-diclorodiamina platino (II) (DDP) cisplatina) , antraciclinas (por ejemplo, daunorubicina (anteriormente daunomicina) y doxorubicina) , antibióticos (por ejemplo, dactinomicina (anteriormente actinomicina) , bleomicina, mitramicina, y antramicina (AMC) ) , ' y agentes anti-mitóticos (por ejemplo, vincristina y vinblastina). Los conjugados de la invención pueden emplearse para modificar una respuesta biológica determinada y la *- ,. 462 inmuno eµsayos o purificación del antígeno objetivo. sóßortés solidos incluyen pero no están limitados a, vidrio, ^ celulosa, políacrilamida, nylon, poliestireno, clorurp dé polivinilo o polipropileno. 5 Ademas, polipéptidos MPIF, variantes, í .'- * "fragmentos, agonistas, y antagonistas de los mismos, 1 t pueden ser conjugados a un agente de diagnóstico o terapéutico tal como aquellos anteriores y aquí u otros bien conocidos en la especialidad. Conjugados MPIF 10 pueden emplearse para propósitos de diagnóstico o terapéuticos aquí descritos y bien conocidos en la A * „ especialidad. Por ejemplo, MPIF pueden conjugarse a un radioisótopo y utilizarse para diagnóstico o terapia. 15 Técnicas para conjugar esta porción terapéutica a anticuerpos son bien conocidas, por ejemplo i- ver, Arnon y colaboradores , "Monoclonal Antibodies For s e d e , , a suministro de droga) en Controlled Drug Delivery *i ~>l h •* fr ? {Suministro controlado de drogas) (2 ° Edición) , Rob son it1 -V Y colaboradores . _ (eds.) , Marcel Dekker, Inc. (1987) , pp . . f ? 623-53; Thorpe ,_ "Antibody Carriers Of Cytatoxic Agents In ' * ±* 5. Cáncer Therapy: A Review" (Portadores de anticuerpos de agentes cítotoxicos,, en terapia de cáncer: una revisión) en Monoclonal Antibod?es 84 : B ological And Cl mcal Applica tions, (Anticuerpos monoclonales ' 84.- Aplicaciones Biológicas y Clínicas) Pinchera y colaboradores , (eds.), ' 10 (1985) pp. 475-506; "Analysis, Results, And Future i 'Prospectíve Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled 4Ant?body In Cáncer Therapy", (Análisis resultados y prospectos futuros de uso terapéutico de anticuerpo radíoetiquetado en terapia de cáncer) en Monoclonal 15 Antibodies For Cáncer Detection And Therapy (Anticuerpos monoclonales para detección y terapia de cáncerl, Baldwin y colaboradores , (eds.), Academic Press (1985), pp . 303- 16; y Thorpe y colaboradores, Immunol . Rev. 62: 119-58 (1982) . 20 Anticuerpos, proteínas, incluyendo polipéptidos de la invención, y pequeñas moléculas pueden ser utilizados como moléculas objetivo y pre-objetivo . Estas moléculas de la presente invención pueden ser radioetiquetas por métodos bien conocidos por aquellos con destreza ordinaria en la especialidad, que incluye, pero" no están limitados a, quelación radioetiquetada del anticuerpo y bibliotecas fago del anticuerpo para radioinmuno terapéutica de objetivo. Ver por ejemplo DeNardo, y colaboradores, Cl in . Cáncer Res . 5 (IOS) :32l3s-3218s (1999); Quadri , y colaboradores, Q . J.

Nucí . "Med. 42:250-261 (1998); los contenidos de cada una de las cuales se incorporan aquí por referencia completamente. Para quelación, diferentes enlaces químicos pueden "insertarse entre el anticuerpo y el quelato radioetiquetado. Anticuerpos monoclonales radioetiquetados reactivos con antígeno objetivo puede suministrar selectivamente isótopos citotóxicos o de diagnóstico a células malignas in vivo . La construcción de moléculas pre-objetivo puede proporcionarse utilizando la diversidad y maleabilidad de los genes anticuerpo. Conjuntos diversos de fragmentos de anticuerpo de cadena sencilla (es decir, scFvs) pueden obtenerse que sean residuos con un antígeno objetivo _por selección de bibliotecas de .anticuerpo fago' nativo humano. ScFvs también pueden clonarse directamente a partir de hibridomas para construcción de bibliotecas fago que facilitan subsecuente manipulación: por ejemplo, maduras en afinidad y modificación de especificidad. Afinidad ScFvs 'seleccionada de estas fuentes a su objetivo de antígeno específico han demostrado un amplio espectro de características de enlace. Los genes jpesado de (V(H)) y ligero (V(L)) del anticuerpo de ScFvs selectos pueden clonarse como cassettes en moléculas de vía cuerpo. Esta solicitud se discute más a continuación en el método de destrucción específica de células al administrar polipéptidos de la invención en asociación con toxinas o pro-drogas citotóxicas. En forma alterna, puede conjugarse un anticuerpo a un segundo anticuerpo para formar un heteroconjugado como se describe por Segal en la Patente de los, E.U. . No. 4,676,980, que aquí se incorpora por referencia completamente. Un anticuerpo, con o sin una porción terapéutica conjugada con él, administrado solo o en combinación con uno o varios factores citotóxicos y/o citocinas puede utilizarse como un agente terapéutico. Anticuerpo, proteínas y pequeñas moléculas que se radioetiquetan son agentes citotóxicos y pueden ser empleados en radioterapias de objetivo tal como radioinmunoterapia o en radioinmuno detección tal como inmuno diagnóstico y radio formación de imagen. Para proteger o tratar tejidos células y órganos normales, puede administrarse MPIF-1 antes de, durante, o después de administración de anticuerpos proteínas y pequeñas moléculas radioetiquetadas . Como se indicó anteriormente, anticuerpos que ligan específicamente al menos un epítope de MPIF-1, se incluyen, y anticuerpos que ligan específicamente cualquier epítope o polipéptido de la presente invención también pueden ser excluidos. De esta manera, los anticuerpos pueden ser específicos para MPIF-1 o pueden ser específicos para pslipéptidos y epítopes diferentes para MPIF-1. En una modalidad, un anticuerpo radioetiquetado, proteína o pequeña molécula se administran en combinación con Un polipéptido MPIF durante el inmunoterapia para cáncer u otra enfermedad. El polipéptido MPIF protege y/o trata en células normales tales como progenitores de médula ósea, y otras células tejidos u órganos normales contra daño cuando se administra antes de, durante o después de administración del agente radioinmunoterapéutico. En otra modalidad preferida, las composiciones de la invención se administran en combinación con Rituxímab, (anticuerpo monoclonal anti-CD20; Rituxan™) , Ibritumomab tiuxetan (anticuerpo monoclonal anti-CD20 conjugado con 90Y; Zevalin™) , Tositumomab (conjugado con 131I; Bexxar™) , Rituximab (Rituxan™) , Trastuzumab (Herceptin™) , OvaRex MoAb (anticuerpo monoclonal a CA 125 en cáncer de ovario) , Denileukin difitox (Conjugado de toxina difteria; OntakMR) , AA98 (Ab monoclonal que liga microvasculatura pero no tejido normal (Xiyun y colaboradores, Clin Cáncer Res . 5 (suppl) : abstract 82 (1999) ) , Adrecolomab (antígeno de anti-panadenocarcinoma) , anticuerpos anti-CEA (conjugado con 131 (Behr y colaboradores, Amer. Soc. of Clin. Oncol. 35th Annual Meeting, Atlanta; abstract 1025 (1999)), anticuerpo de glicoproteína anti-TAG72, anticuerpos anti-PMSA, anticuerpos anti-HLA-DRIO, anticuerpos anti-VEGF, anticuerpos anti-CXCR4, CH225 (anticuerpo anti-EGFr quimerizado) (Mendelsohn y colaboradores, Amer. Soc. of Clin. Oncol. 35th .Ann.

Meeting, Atlanta; abstract 1502 (199?)), CP-358,774 (Karp y colaboradores, Amer. Soc. Clin. Onc. 35t'h .Ann. Meeting, Atlanta, GA; abstract 1499 (1999) ) y ZD 1839 (Karp y colaboradores, Amer. Soc. Clin. Onc. 35th .Ann. Meeting, Atlanta, GA; abstract 1500 (1999) ) (Ambos son inhibidores de moléculas pequeñas de EGFr) , IDEC-Y2B8 (anticuerpo anti- CD20 conjugado a una molécula que liga 90Y (Witzig y colaboradores, "Phase I/II trial of IDEC-Y2B8 radioimmunotherapy for treatment of relapsed or refractory CD20 -positive B-cell non-Hodgkin ' s lymphoma, " (Prueba fase I/II de radioinmunoterapia IDEC-Y2B8 para tratamiento de linfoma non-Hodgkin de células B positivo CD20 recurrente o refractario) J Clin Oncol. 1999 (en impresión); Bastión y colaboradores, Blood. 1995; 86 : 3257-3262. T, ?I-MN-14 F(ab)2 anti- carcinoembryonic antigen monoclonal antibody (.Anticuerpo monoclonal antígeno anti-carcinoembriónico 131I-MN-14 F(ab) (Juweid y colaboradores, J Nucí Med 2000 Jan;41 (1) : 93-103; comenta en: J Nucí Med 2000 Jan;41 (1) :104-6) , 67Cu-2IT-BAT-Lym-l (Lym-1 es un anticuerpo monoclonal de ratón que hace objetivo preferencial en linfocitos malignos, el agente quelante es ácido 1,4,7,11 -tetraazaciclotetradecano-N, N' ,N" ,N" ' -tetraacetico, que liga 67Cu (O'Donnell y colaboradores, J Nucí Med 1999 Dec; 40 (12) : 2014-20) ) , anticuerpo antígeno anti-NCA etiquetado con renio-188 BW 250/183 (anti -granulocito; método de radioetiquetado directo utilizando tris- (2-carboxietil) fosfina (TCEP) (Seitz y colaboradores, Eur J Nucí Med 1999 Oct ; 26 (10) : 1265-73) ) , IDEC-Y2B8 ( qGY ibritumomab tiuxetan; un anticuerpo monoclonal anti-CD20 kappa IgG? murino que liga covalentemente MX-DTPA (tiuxetan) , que quela el radioisótopo itrio-90 (Witzig J. Clin. Oncol. 1999 Dec; 17 (12) :3793-803) ) , 213Bi-HuM195 (anti-CD33 (Sgouros y colaboradores, J Nucí Med 1999 " Nov;40(ll): 1935-46)), 6 7 C o b. r e - 2 - i m i n o t i o l a n o - 6 - [ p -(bromoacetamido) bencilo] -TETA-Lym-1 (O'Donnell y colaboradores., Clin. Cáncer Res. ' 1999 Oct; 5 (10 Suppl) :3330s-3336s) ) , 90Y-BC-4 (Mab murino que reconoce tenascina; conjugados Mab etiquetados con 90Y estables pueden prepararse utilizando el quelador derivado p-isotiocianatobencil de ácido dietílentriaminepentaacético (ITC-Bz-DTPA) (Riva y colaboradores , Clin. Cáncer Res. 1999 Oct;5(10 Suppl ): 3275s-3280s) ) , anticuerpo monoclonal quimérico cG250 etiquetado ?I G250 IcG250) (Steffens y colaboradores., Clin. Cáncer Res. ,1999 Oct;5(10 S up p l ) : 3 2 6 8 s - 3 2 74 s ) ) , a n t í g e n o anti-carcinoembriogenico/ácido/anti-dietilentriaminpentaa cetico biespecífico (DTPA) anticuerpo y 131I Di-DTPA hapten (Vuillez y colaboradores . , Clin Cáncer Res 1999 Oct; 5 (10 Suppl): 3259s-3267s) ) , y objetivos adicionales para radioinmunoterapia incluyen HLA-DR, CD19, y CD22. Métodos para analizar protección de tejido normal* por composiciones de la invención durante radioinmunoterapia son bien conocidos en la especialidad e incluyen modelos in vivo para estudiar daño a médula ósea utilizando infusión de 89-Estroncio, que busca hueso y de esta manera irradia a los constituyentes de hueso. Los siguientes artículos de revisión también proporcionan guía para uso de anticuerpos, t radioterapia e inmunoradioterapia : "Physical and biological targeting of radiotherapy" (Hacer blanco físico y biológico de radioterapia) Acta Oncol. 1999; 38 Suppl 13:75-83; "Radioimmunodiagnosis and therapy" (Radio inmunodiagnostico y terapia) Cáncer Treat Rev. 2000 Feb;26(l) :3-10; ".Antibodies in the therapy of colon cáncer" (Anticuerpos en la terapia de cáncer de colon) Semin. Oncol. 1999 Dec; 26 (6) : 683-90 ; "Overview of the clinical development of rituximab: first monoclonal antibody approved for the treatment of lymphoma" (revisión de desarrollo clínico de —rituximab : primer anticuerpo monoclonal aprobado para tratamiento de linfoma) Semin. Oncol.. 1999 Oct; 26(5 Suppl 14) .-66-73; "Radiolabeled antibody therapy of B-cell lymphomas" (Terapia de anticuerpo radioetiquetado de linfomas de célula B) de Semin . Oncol . 1999 Oct; 26(5 Suppl 14) : 58-65; "Strategies for developing effective radioimmunotherapy for solid tümors" (Estrategia para desarrollar radioinmunoterapia efectiva para tumores sólidos) Clin . Cáncer Res . 1999 Octj5(10 Suppl) : 3219s-3223s; "Technical advances in radiotherapy of head and neck tumors" (Avances técnicos en radioterapia de tumores de cabeza y cuello) Hematol. Oncol Clin. North- Am. 1999 Aug; 13 (4) : 811-23 ; and "Use of monoclonal antibodies for the diagnosis and treatment of bladder cáncer" (Uso de anticuerpos monoclonales para el diagnóstico y tratamiento de cáncer de vejiga) Hybridoma. 1999 Jun; 18 (3) : 219-24.. En otra modalidad, la invención proporciona un método para suministrar composiciones que contienen los polipéptidos de la invención (por ejemplo, composiciones que contienen polipéptidos MPIF o anticuerpos anti-MPIF asociados con polipéptidos heterólogos, ácidos nucleicos heterólogos, toxinas, o pro-drogas) a células objetivo tales como por ejemplo células B o T, monocitos, macrófagos, y neutrófilos que expresan MPIF. polipéptidos MPIF o anticuerpos anti-MPIF de la invención puede ser asociado con polipéptidos heterólogos, ácidos nucleicos heterólogos, toxinas, o pro-drogas mediante interacciones hidrofóbicas, hidrofílica, iónicas y/o covalentes . En una modalidad, la invención proporciona un método para el suministro específico de composiciones de la invención a células al administrar polipéptidos de la invención (por ejemplo, polipéptidos MPIF o anticuerpos anti-MPIF) que están asociados con polipéptidos heterólogos o ácidos nucleicos. En un ejemplo, la invención proporciona un método para suministrar una proteína terapéutica en la célula objetivo. En otro ejemplo, la invención proporciona un método para suministrar un ácido nucleico de hebra- sencilla (por ejemplo, antisentido o ribozimas) o ácido nucleico de doble hebra (por ejemplo, ADN que puede integrarse en el genoma de la célula o replicar episomáticamente y luego ser transcrito) en la célula objetivo. En otra modalidad, la invención proporciona un método para la destrucción específica de células (por ejemplo, la destrucción de células de tumor) al administrar polipéptidos de la invención (por ejemplo, polipéptidos MPIF o anticuerpos anti-MPIF) en asociación con toxinas o pro-drogas citotóxicas. Por ejemplo, MPIF conjugado a un radioisótopo puede administrarse para destruir células de leucemia, de esta manera tratando leucemia. En una modalidad específica, la invención proporciona un método para la destrucción específica de células de linaje de células T o B (por ejemplo linfomas o leucemia relacionadas a células T o B) al administrar polipéptidos MPIF en asociación con toxinas o pro-drogas citotóxicas . En otra modalidad específica, la invención proporciona un método para la destrucción específica de células de linaje monocíticas (por ejemplo, leucemias o linfomas monocíticos) al administrar anticuerpos anti-MPIF en asociación con ' toxinas o pro-drogas citotóxicas . En otra modalidad específica, la invención proporciona un método para la destrucción específica de células (por ejemplo, la destrucción de mediadores celulares de inflamación) para administrar polipéptidos de la invención ((por ejemplo, polipéptidos MPIF o anticuerpos anti-MPIF) en asociación con toxinas o pro-drogas citotóxicas . Mediadores celulares de inflamación incluyen, por ejemplo, células ' T, monocitos, células dendríticas, astrocitos, células mesangiales de riñon, macrófagos, neutrófilos, y células involucradas en rechazo de injerto (agudo o crónico) . En otra modalidad, moléculas no-MPIF en asociación con toxinas o pro-drogas citotóxicas, se administran en combinación con MPIF-1, tal que MPIF-1 evita o trata el daño de células, tejidos u órganos normales, o protege células progenitoras de médula ósea.

Por "toxina" se entienden compuestos que ligan y activan sistemas efectores citotóxicos endógenos, radioisótopos, holotoxinas, toxinas modificadas, subunidades catalíticas de toxinas, otros agentes citotóxicos, o cualesquiera moléculas o enzimas que normalmente no están presentes en o sobre la superficie de la célula que bajo condiciones definidas provocan la muerte de la célula. Toxinas que pueden emplearse de acuerdo con los métodos de la invención incluyen, pero no están limitadas a, radioisótopos . conocidos en la técnica, compuestos tales como por ejemplo anticuerpos (o complemento de fijado que contienen porciones) que ligan un sistema efector citotóxico endógeno inducido, timidina cinasa, endonucleasa, ARNasa, alfa toxina, ricina, abrina, exotoxina A de Pseudomonas, toxina de difteria, saporina, momordina, gelonína, proteína antiviral de minutita, alfa-sarcina y toxina de cólera. "Toxina" también incluye un agente citotóxico, citostático o citocida, un agente terapéutico o un ion de metal radioactivo, por ejemplo, alfa-emisores tales como por ejemplo, "1JBi, u otros radioisótopos tales como por ejemplo, 103Pd, 133Xe, 131I,68Ge, 57Co, e5Zn, 85Sr, 32P, "s, 90Y, 153Sm, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 75Se, ' 113Sn, 90itrio, estaño, 186. Renio, 166-Hrolmio, y Renio; etiquetas luminescentes, tales como luminol; y etiquetas fluorescentes tales como fluoresseína y rodamina, y biotina . Técnicas conocidas en la especialidad pueden aplicarse para etiquetar anticuerpos de la invención. Estas técnicas incluyen, pero no están limitadas al uso de agentes de conjugación bifuncionales (ver por ejemplo, las Patentes de los E.U.A. Nos. 5,756,065; 5,714,631; 5,696,239; 5,652,361; 5,505,931; 5,489,425; 5,435,990; 5,428,139; 5,342,604; 5,274,119; 4,994,560; y 5,808,003; los contenidos de cada una de las cuales aquí se incorporan por referencia completamente) . Una citotoxina o agente citotóxico incluye cualquier agente que sea nocivo a las células. Ejemplos incluyen paclitaxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etoposido, tenoposido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorubicina, daunorubicina, dihidroxi antracina diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-dehidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, y puromicina y sus análogos u homólogos. Agentes terapéuticos incluyen, pero no están limitados a, antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil decarbazina) , agentes alquilantes (Por ejemplo, mecloretamina, tioepa clorambucil, melfalan, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU) , ciclotosfamida, busulfan, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomisina C, y cis-diclorodiamina platino (II) (DDP) cisplatina) , antraciclinas (por ejemplo, daunorubicina (anteriormente daunomicina) y doxorubicina) , antibióticos (por ejemplo, dactinomicina (anteriormente actinomicina) , bleomicina, mitramicina, y antramicina (AMC) ) , y agentes anti-mitóticos (por ejemplo, vincristina y vinblastina) . Por "pro-drogas citotóxica" se entiende un compuesto no tóxico que se "convierte por una enzima, normalmente presente en las células en un compuesto citotóxico. Pro-drogas citotóxicas que pueden emplearse de acuerdo con los métodos de la invención, incluyen pero no están limitadas a derivados glutamilo de agente alquilante de mostaza-ácido benzoico, derivado de fosfato etopósido o mitomicina C, citosina arabinósido, daunorubisina, y derivados fenoxiacetamida de doxorubicina . Modalidades adicionalmente preferidas de la invención incluyen, pero no están limitadas a, el uso de polipéptidos MPIF, polinucleótidos MPIF y agonistas funcionales de los mismos en las aplicaciones que siguen a continuación. En una modalidad específica, polipéptido (s) o polinucleótido (s) MP1F de la invención, o agonista (s) o antagonista (s) (por ejemplo anticuerpos anti-MPIF) de los mismos se administran para trata'r, evitar, detectar, y/o diagnosticar leucemia mielogenosa crónica, leucemia mielogenosa aguda, leucemia, leucemia, histiocítica, leucemia monocítica (leucemia monocítica aguda) , reticulosis leucémica, leucemia monocítica de tipo Shilling, y/o otras leucemias derivadas de monocitos y/o células monocíticas y/o tejidos. De esta manera, un polipéptido (s) o polinucleótido (s) MPIF de la invención, o su agonista (s) o antagonista (s) (por ejemplo, anticuerpos anti-MPIF), se administran para tratar, enlistar, detectar y/o diagnosticar leucemias tales como leucemia linfoblástica aguda (linfocítica) (ALL= acute lymphoblastic lymphocytic leukemia) , que pueden incluir formas de célula B no diferenciadas, formas de célula B comunes, formas de célula pre-B y formas de célula B, leucemia mielogenosa aguda (mieloide o mielocitica) (AML = acute myelogenous leukemia) , que pueden incluir formas y mieloblás ticas diferenciadas (APL) , formas mielomonoblásticas, formas monoblásticas, formas eritroleucémicas, y formas megacarioblásticas; leucemia linfocítica crónica (linfática) (CLL = chronic limphocytic (leukemia) ) que pueden incluir formas de célula B formas de célula T, formas prolinfocíticas, síndrome de Sezáry (fase leucémica de linfoma de célula T cutánea) , formas de célula de cabello, y leucemia de linfoma (es decir, cambios leucémicos que se ven en etapas avanzadas de linfoma agudo) ; y leucemia mielocítica crónica (mieloide, mielogenosa o granulocítica) (CML) , por ejemplo cuando el clon neoplástico es una célula de glóbulo rojo, megacariocito, monocito, célula T o célula B. En otra modalidad específica, polipéptido (s) o polinucleótido (s) MPIF de la invención o sus agonista (s) o antagonista (s) , se administran para tratar, evitar, diagnosticar, y/o mejorar reacción leucemoide monocítica, como se ve por ejemplo con tuberculosis. En otra modalidad específica, polipéptido (s) o polinucleótido (s) MPIF de la invención o sus agonista (s) o antagonista (s) , se administran para tratar, evitar, diagnosticar, y/o mejorar leucocitosis monocítica, leucopenia monocítica, monocitopenia, y/o monocitosis. En otra modalidad específica^ polipéptido (s) o polinucleótido (s) MPIF de la invención o sus agonista (s) o antagonista (s) , se administran para tratar, evitar, diagnosticar, y/o mejorar injerto contra enfermedad de huésped o rechazo de transplante. En otra modalidad específica, polipéptido (s) o polinucleótido (s) MPIF de la invención o sus agonista (s) o antagonista (s) , se administran para tratar, diagnosticar, y/o mejorar anemia. En otra modalidad específica, p'olipéptido (s) o polinucleótido (s) MPIF de la invención o sus agonista (s) o antagonista (s) , se administran para tratar, evitar, diagnosticar, y/o mejorar malignidades de células B tales como ALL, enfermedad de Hodgkins, linfoma no Hodgkins, leucemia de linfocitos crónica, plasmacitomas, mieloma múltiple, linfoma de Burkitt, y enfermedades transformadas por EBV. En otra modalidad . polipéptido (s) o polinucléótido (s) MPIF de la invención o 'sus agonista (s) o antagonista (s) , se utilizan para tratar, evitar, y/o diagnosticar, fibrosis y condiciones asociadas con fibrosis, tales como por ejemplo, pero no limitadas a fibrosis pulmonar, fibrosis quística (incluyendo fibrosis tales como fibrosis quística del páncreas, síndrome de Clarke-Hadfield, enfermedad fibroquística de páncreas, mucoviscidosis y viscidosis) , fibrosis de endomiocardio, fibrosis retroperitoneal idiopática, fibrosis leptomeningea, fibrosis mediastinal, fibrosis epidérmica nodular, fibrosis pericentral, fibrosis perimuscular, fibrosis pipestem, fibrosis de reemplazo, fibrosis subadventitia, y fibrosis pipestem de arcilla de Symmers .

En una modalidad altamente preferida, polipéptido (s) o polinucleótido (s) MPIF de la invención o sus agonista (s) o antagonista (s) , se utilizan para tratar, evitar, y/o diagnosticar, mucositis, especialmente asociadas con quimioterapia o terapia de radiación. * i Polipéptido (s) o polinucleótido (s) MPIF de la invención o sus agonista (s) o antagonista (s) , se utilizan para tratar, evitar, y/o diagnosticar rechazo de órgano o enfermedad de huésped-contra-injerto (GVHD =graft-versus-host disease) y/o condiciones asociadas con la misma. Rechazo de órganos ocurre por destrucción de células inmunes de huésped del tejido transplantado a través de una respuesta inmune. _ Similarmente, una respuesta inmune también se ha involucrado en GVHD, pero en este caso, las células inmunes transplantadas ajenas destruyen los tejidos huésped. La administración de polinucleótidos o polipéptidos MPIF de la invención y/o agonistas y/o antagonistas de los mismos, que inhibe una respuesta inmune, particularmente la proliferación, diferenciación, o quimiotaxia de células T, monocitos u otros mediadores de inflamación, puede ser una terapia efectiva para evitar rechazo de órgano o GVHD. Aún más, se ha mostrado que la eliminación del receptor CCRl, que liga MPIF-1, en ratones resulta en supervivencia de aloinjerto prolongada (Gao y colaboradores , "Targeting of the chemokine receptor CCR1 suppresses development of acute and chronic cardiac allograft rejection, " (Haciendo objetivo al receptor quimosina CCR1 suprime desarrollo de rechazo de aloinjerto de rechazo cardíaco, agudo y crónico) J. Clin . Inves t . 2000' Jan; 105 (1) : 35-44. ) De esta manera bloqueando la interacción de MPIF-1 u otros lígandos CCR1 con su receptor CCR1, mediante un antagonista MPIF-1 por ejemplo, será útil para evitar rechazo de injerto agudo y crónico.. Similarmente, polinucleótidos o polipéptidos MPIF de la invención y/o agonistas y/o antagonistas de los mismos también pueden emplearse para modular inflamación. Por ejemplo, polinucleótidos o polipéptidos MPIF de la invención y/o sus agonistas y/o antagonistas pueden inhibir la proliferación y diferenciación de células involucradas en una respuesta inflamatoria. Estas moléculas pueden emplearse para~ tratar, evitar y/o diagnosticar condiciones inflamatorias, tanto condiciones crónicas como agudas, incluyendo prostatitis crónica, prostatitis granulomatosa y malacoplacia, inflamación asociada con infección (por ejemplo, choque séptico, sepsis, o síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS = systemic inflammatory response syndrome) ) , lesión de reperfusión- isquemia letalidad de endotoxina, artritis, rechazo hiperagudo mediado por complemento, nefritis, citosina o lesión de pulmón inducido por quimosina, enfermedad de intestino inflamatoria, enfermedad de Crohn o que resulta de una producción excesiva de citosinas (por ejemplo TNF o IL-1.) En una modalidad específica, anticuerpos anti-MPIF de la invención se utilizan para tratar, evitar, modular, detectar y/o diagnosticar inflamación. En una modalidad específica, anticuerpos anti-MPIF" de la invención se utilizan para tratar, evitar, modular, detectar y/o diagnosticar desordenes inflamatorios . En una modalidad preferida, las composiciones se administran en combinación con ligando CD40 (CD40L) , una forma soluble de CD40L (por ejemplo, AVREND-), fragmentos biológicamente activos, variantes, o derivados de CD40L, anticuerpos anti-CD40L (por ejemplo, anticuerpos agonísticos o • antagonísticos) , y/o anticuerpos anti-CD40 (por ejemplo, anticuerpos agonísticos o antagonísticos) . Como se reconoce e la especialidad, los conjugados y quelatos descritos anteriormente y aquí, con referencia a anticuerpos practican igualmente conjugados y quelatos de polipéptidos MPIF.

Caracterización de Inmunof 'eno tipo . Los anticuerpos de la invención pueden ser utilizados para caracterizar inmunofenotipo de líneas celulares y muestras biológicas . El producto de traducción del gen de la presente invención puede ser útil como un marcador específico de célula o más específicamente como un marcador celular que se expresa diferencialmente en diversas etapas de diferenciación y/o maduración de tipos de células particulares. .Anticuerpos monoclonales dirigidos contra un epítope específico, o combinación de epítopes, permitirán el monitoreo de poblaciones celulares que expresan el marcador. Pueden utilizarse diversas técnicas empleando anticuerpos monoclonales para monitorear poblaciones celulares que expresan el o los marcadores, y que incluyen separación magnética utilizando cuentas magnéticas revestidas con anticuerpos "Toma panorámica" con anticuerpo conectado a una matriz sólida (es decir, placa) , y citometría de flujo (ver por ejemplo, la Patente de los E.U.A. No. 5,985,660; y Morrison y colaboradores, Cell , 96:737-49 (1999)). Estas técnicas permiten el monitoreo de poblaciones particulares de células, tal como podría encontrarse con malignidades hematológicas (es decir enfermedad residual mínima (MRD= minimal residual disease) en pacientes leucémicos agudos) y células "no-propias" en transplantes para evitar enfermedad de injerto contra-huésped (GVHD). En forma alterna, estas técnicas permiten monitoreo de células progenitoras y de talloes hematopoyéticas capaces de someterse a proliferación y/o diferenciación, como se ha encontraría en sangre de cordón umbilical humano. Ensayos Para Enlace de Anticuerpos . Los anticuerpos de la invención pueden ensayarse para enlace inmunoespecífico por cualquier métpdo conocido en la especialidad. Los inmuno ensayos que pueden utilizarse, incluyen pero no están limitados a sistemas de ensayo competitivo y no competitivo utilizando técnicas tales como Western blot, radioinmunoensayos, ensayo inmunosorbente enlazado con enzima (ELISA = enzyme linked immunosorbent assay) , "inmuno ensayo emparedado" ensayos de inmunoprecipitación, reacciones de precipicitina con difusión de gel, de inmuno difusión, ensayos de aglutinación, ensayos de fijado de .complemento, ensayos inmunoradiométricos, inmunoensayos 'fluorescentes, inmunoensayos de proteína A, por nombrar unos cuantos. Estos ensayos son rutinarios y bien conocidos en la especialidad (ver por ejemplo, Ausubel, y colaboradores, eds., Current Protocols in Molecular Biology, (Protocolos actuales en Biología Molecular)- Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York (1994), que se incorpora aquí por referencia completamente) . Inmunoensayos ejemplares se describen brevemente a continuación (pero no se pretenden a manera de limitación) . Protocolos de inmunoprecipitación generalmente comprenden lisar una población de células en un amortiguador de lisis tal como amortiguador RIPA ( NP-40 1% o Tritón X- 100, deoxicolato de sodio 1%, SDS 0.1%, NaCl 0.15 M, fosfato de sodio 0.01 M a pH 7.2, Trasylol 1%) suplementado con inhibidores de proteasa y/o fosfatasa de proteína (por ejemplo., EDTA, PMSF, aprotinina, vanadato de sodio) , agregar el anticuerpo de interés al lisado celular, incubar por un periodo de tiempo (por ejemplo, 1 a 4 horas) a 4°C, agregar cuentas de sefarosa proteína A y/o proteína G al lisado de células, incubando por aproximadamente una hora o más a 4°C, lavar las cuentas en amortiguador de lisis y re-suspender las cuentas en amortiguador de muestra/SDS. La capacidad del anticuerpo de interés para inmunoprecipitar un antígeno particular puede estimarse por ejemplo por análisis Western blot. Una persona con destreza en la especialidad tendrá en conocimiento en cuanto a los parámetros que pueden modificarse para incrementar el enlace del anticuerpo como antígeno y disminuir el fondo (por ejemplo, pre-liberar el estado celular con cuentas de sefarosa) . Para mayor discusión respecto a protocolos de inmunoprecipitación, ver por ejemplo, Ausubel, y colaboradores, eds . , Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York (1994) en 10.16.1. .Análisis Western blot generalmente comprende preparar muestras de proteína, electro.forésis de las muestras de proteína en un gel de poliacrilamida (por ejemplo, SDS-PAGE 8%- 20% dependiendo del peso molecular del antígeno) , transferir la muestra de proteína del gel de poliacrilamida a una membrana tal como nitrocelulosa, PVDF o nylon, bloquear la membrana en solución de bloqueo (por ejemplo, PBS con 3% BSA o leche descremada) , lavar la membrana en amortiguador de lavado (por ejemplo, PBS-Tween 20) , contactar/sondear/incubar la membrana con un anticuerpo primario (el anticuerpo , de interés) diluido en amortiguador de bloqueo, lavar la membrana en amortiguador de lavado, contactar/sondear/incubar la membrana con un anticuerpo secundario (que reconoce el anticuerpo primario, por ejemplo un anticuerpo anti-humano) conjugado a un substrato enzimático (por ejemplo, peroxidasa de rábano o fosfatasa alcalina) o molécula radioactiva (por ejemplo, 32P o 1251) diluido en amortiguador de bloqueo, lavar la membrana en amortiguador de lavado, y detectar la, presencia del antígeno. Una persona con destreza _en la especialidad tendrá el conocimiento en cuanto a los ' parámetros que pueden modificarse para incrementar la señal detectada y para deducir el ruido o interferencia de fondo. Parta mayor discusión respecto a protocolos de Western blot ver, por ejemplo, Ausubel y colaboradores, eds . , Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1,. John Wiley & Sons, Inc., New York (1994), en 10.8.1. ELISAs comprende preparar antígeno, revestir los pozos de una placa de microtitulación de 96 pozos con el antígeno, agregar el anticuerpo de interés conjugado a un compuesto detectable tal como un substrato enzimático (por ejemplo, peroxidasa de rábano o fosfatasa alcalina) al pozo e incubar por un periodo de tiempo y detectar la presencia del antígeno. En los ELISA, el anticuerpo de interés no tiene que ser conjugado a un compuesto detectable; por el contrario un segundo anticuerpo (que reconoce el anticuerpo de interés) conjugado a un compuesto detectable puede agregarse a los pozos. Además, en lugar de revestir el pozo con el antígeno, el anticuerpo puede ser revestido en el pozo. En este caso, un segundo anticuerpo conjugado a un compuesto detectable puede agregarse después de la adición del antígeno de interés a el o los pozos revestidos (es decir, ELISA emparedado) . Una persona con destreza en la especialidad tendrá el conocimiento en cuanto a los parámetros que pueden modificarse para incrementar la señal detectada así como otras variaciones de ELISAS son conocidas en la especialidad. Para mayor discusión respecto a ELISAs ver por ejemplo, Ausubel y colaboradores, • eds . , Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York (1994), en 11.2.1. La afinidad de enlace de un anticuerpo con un antígeno y fuera de la velocidad (off-rate) de la interacción de anticuerpo de un antígeno, pueden determinarse por ensayos competitivos. Un ejemplo de un ensayo de unión competitivo es un radioinmunoensayo que comprende la incubación de antígeno etiquetado (por ejemplo, 3H o 125I) con el anticuerpo de interés en la presencia de cantidades incrementadas de antígeno no etiquetado, y la detección del anticuerpo ligado al antígeno etiquetado. La afinidad del anticuerpo de interés para un antígeno particular y fuera de la velocidad (off-rate) de enlace pueden determinarse a partir de los datos por análisis de gráfica Scatchard. La competencia con el segundo anticuerpo también puede determinarse utilizando radioinmunoensayo. En este caso, el antígeno se incuba con anticuerpo de interés conjugado a un compuesto etiquetado (por ejemplo, 3H o 125I) en la presencia de cantidades incrementadas del segundo anticuerpo no etiquetado. Anticuerpos -Terapéuticos . La presente invención además se dirige a terapias basadas en anticuerpos, que involucran administrar anticuerpos de la invención a un animal, o de preferencia un mamífero, y más preferiblemente a un paciente humano para tratar una o más de las enfermedades, desordenes . o condiciones descritas. Compuestos terapéuticos de la invención incluyen pero no están limitados a, anticuerpos de la invención (incluyendo fragmentos, análogos y sus derivados como se describe aquí) y ácidos nucleicos que codifican anticuerpos de la invención (incluyendo fragmentos, análogos y sus derivados y anticuerpos anti-idiotípicos como se describe aquí) . Los anticuerpos de la invención también pueden emplearse para tratar, inhibir o evitar enfermedades, desordenes o condiciones asociadas con expresión aberrante y/o actividad de un polipéptido de la invención, incluyendo pero no limitado a cualquiera una o más de las enfermedades, desordenes o condiciones aquí descritas. El tratamiento y/o prevención de enfermedades, desordenes o condiciones asociados con actividad y/o expresión aberrante de un polipéptido de la invención, incluye pero no está limitado a, aliviar síntomas asociados con estas en ermedades, desordenes o condiciones. Anticuerpos de la invención también puede proporcionarse en composiciones farmacéuticas aceptables como se conoce en la especialidad o como se describe aquí. Un compendio de las formas en donde los anticuerpos de la presente invención pueden utilizarse terapéuticamente, incluye enlazar polinucleótidos o polipéptidos de la presente invención local o sistémicamente al cuerpo o por directa citotoxicidad del anticuerpo, por ejemplo, como se media por células complemento (CDC) o por células efectoras (.ADCC) . Algunos de estos enfoques se describen con más detalle a continuación. Con las enseñanzas que aquí se proporcionan, una persona con destreza ordinaria en la especialidad conocerá como utilizar los anticuerpos de la presente invención para diagnóstico, monitoreo, o propósitos terapéuticos sin indebida experimentación. Los anticuerpos de esta invención pueden emplearse ventajosamente en combinación con otros anticuerpos monoclonales o quiméricos, o con linfocinas o factor de crecimiento hematopoyético (tales como, por ejemplo, IL-2, IL-3 y IL-7) , por ejemplo, que sirven para incrementar el número o actividad de células efectoras que interactúan con los anticuerpos.

Los anticuerpos de la invención pueden administrarse solos o en combinación on otros tipos de tratamiento (por ejemplo, terapia de radiación, quimioterapia, terapia hormonal, inmunoterapia y agentes anti-tumor) . En general, se prefiere la administración de productos de un origen de especie o ' reactividad de especie (en el caso de anticuerpos) que es la misma especie que el paciente. De esta manera, en una modalidad preferida, anticuerpos humanos, derivados de fragmentos, análogos, o ácidos nucleicos, se administran a un paciente humano para terapia o profilaxis . Se prefiere utilizar anticuerpos neutralizantes y/o inhibitorios in vivo potentes y/o de alta afinidad contra polipéptidos o polinucleótidos de la presente invención, sus fragmentos o regiones, tanto para inmunoensayos dirigidos a y terapia de desordenes relacionados a polinucleótidos o polipéptidos, incluyendo sus fragmentos de la presente invención. Estos fragmentos, anticuerpos o regiones, de preferencia tendrán afinidad para polinucleótidos o polipéptidos de la invención, incluyendo sus fragmentos. Afinidades de enlace preferidas incluyen aquellas preferidas con una constante de disociación o Kd menor a 5 X 10"2 M, 10~2 M, 5 X 10""3 M, 10"3 M, 5 X 10"" M, 10""4 M, 5 X 10'5 M, 10"5 M, 5 X 10" M, 10'fi M, 5 X 107 M, 10""7 M, 5 X 10's M, 10"R M, 5 X 10"H M, 10" 4 M , 5 X 10" -"1i0U M , 10 -"1? 0? M, 5 X 10 , - 1l 1i M , 10""" M , 5 X 10~1¿ M , 10" x" M, 5 X 10" -113 13 J M, 10"" M , 5 X 10 , -"1"4 M , 10" 1' M , 5 X 10-15 M, y 10""15 M . Terapia de Gen Anticuerpo . En una modalidad específica, ácidos nucleicos que comprenden secuencias que codifican anticuerpos o sus derivados funcionales, se administran para tratar, inhibir o evitar una enfermedad o desordenes asociado con expresión y/o actividad aberrante de un polipéptido de la invención, a manera de terapia de genes. La terapia de genes se refiere a la terapia realizada por al administración a un sujeto de un ácido nucleico o expresado o expresable. En esta modalidad de la invención, los ácidos nucleicos producen su proteína codificada que media un efecto terapéutico. Cualquiera de los métodos para terapia de genes disponibles en la técnica, pueden ser utilizados de acuerdo con la presente invención. Métodos ejemplares se describen a continuación. Para revisiones generales de los métodos de terapia de genes, ver Goldspiel y colaboradores, Clinical Pharmacy (Farmacia Clínica) 12:488-505 (1993); Wu y Wu, Biotherapy (Bioterapia) 3:87-95 (1991); Tolstoshev, Ann . Rev. Pharmacol . Tóxicol . 32:573-596 (1993); Mulligan, Science 260:926-932 (1993); y Morgan y Anderson, Ann .

Rev. Biochem . 62: 191 -217 (1993); May, TIBTECH 11 (5) : 155-215 (1993). Métodos comúnmente conocidos en la especialidad de tecnología de ADN recombinante que pueden utilizarse, se describen en Ausubel y colaboradores . (eds . ) , Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); and Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual , Stockton Press, NY (1990) . En un aspecto preferido, el compuesto comprende secuencias de ácido nucleico que codifican un anticuerpo, las secuencias de ácido nucleico son parte de vectores de expresión que expresan el anticuerpo o fragmentos o proteínas quiméricas o sus cadenas pesadas y ligeras en un huésped conveniente. En particular, estas secuencias de ácido nucleico que contienen promotores enlazados en forma operable con la región de codificación de anticuerpos, el promotor es inducible o constitutivo, y optionalmente, específico de tejido. En otra modalidad particular, moléculas de ácido nucleico se utilizan en donde la secuencia de codificación de anticuerpo y cualesquiera otras secuencias deseadas están flanqueadas por regiones que promueven recombinación homologa en un sitio deseado en genoma, de esta manera proporcionando la expresión intra cromosoma de los ácidos nucleicos que codifican con el anticuerpo (Koller y Smithies, Proc.

Na ti . Acad. Si c . USA 86:8932-8935 (1989); Zijlstra y colaboradores, Na ture 342:435-438. (1989). En modalidades específicas, la molécula de anticuerpo expresado es un anticuerpo de una sola cadena; en forma alterna, las secuencias de ácido nucleico incluyen secuencias que codifican tanto las cadenas pesadas como ligeras o sus fragmentos de anticuerpo. El suministro de los ácidos nucleicos en un paciente puede ya ser directo, en cuyo caso el paciente se expone directamente al ácido nucleico o los vectores que transportan el ácido nucleico, o indirecto, en cuyo caso, células primero se transforman con los ácidos nucleico in vitro, luego transplantan al paciente. Estos dos enfoques se conocen respectivamente como terapia de genes in vivo o ex vivo. En una modalidad específica, las secuencias de ácido nucleico se administran directamente in vivo, en donde se expresan para producir el producto codificado. Esto puede lograrse por cualquiera de novedosos métodos conocidos en la especialidad, por ejemplo por construcción de los mismos como parte de un vector de expresión de ácido nucleico apropiado y administrarlo de manera tal que se vuelva intracelular por ejemplo por infección utilizando retrovirales defectuosos o atenuados u otros vectores virales (ver Patente de los E.U.A. No. 4,980,286), o por inyección directa de .ADN desnudo, o por uso de bombardeo de micropartículas (por ejemplo, una pistola de genes; Biolistic, Dupont) , o revestir con lípidos o receptores de superficie celular o agentes de transfección, encapsulación en liposomas, micropartículas, o microcápsulas, o al administrarlos en el enlace con un péptido que se conoce entra al núcleo, o por administración de los mismos en enlace a un ligando sujeto a endocitosis mediada por receptor (ver por ejemplo., Wu y Wu, J. Biol . Chem. 262:4429-4432 (1987)) (que puede utilizarse para ser blanco en tipos de células que expresan específicamente los receptores), etc. En otra modalidad, complejos del ligando-ácido nucleico pueden formarse en donde el ligando comprende un péptido viral fusogénico para romper endosomas, permitiendo que el ácido nucleico evite degradación lisosomal . Todavía en otra modalidad, el ácido nucleico puede hacerse blanco in vivo para absorción y expresión específica de célula, al hacer blanco a un receptor específico (ver por ejemplo, Publicación de PCT WO 92/06180; WO 92/22635; WO92/20316; W093/14188, WO 93/20221) . En forma alterna, el ácido nucleico puede introducirse intracelularmente e incorporarse dentro del .ADN de célula huésped para expresión, por recombinación homologa (Koller y Smithies, Proc . Nati . Acad. Sic . USA 86:8932-8935 (1989); Zijlstra y colaboradores, Na ture 342:435-438 (1989)). En una modalidad específica,, se emplean vectores virales que contienen secuencias de ácido nucleico que codifican un anticuerpo de la invención.

Por ejemplo, un vector retroviral puede utilizarse (Ver Miller y colaboradores . , Meth . Enzymol . 217:581-599 (1993) ) . Estos vectores " retrovirales contienen los componentes necesarios para empaque correcto del genoma viral e integración en el .ADN de célula huésped. Las secuencias de ácido nucleico que codifican el anticuerpo a utilizarse en terapia de genes, se clonan en uno o más vectores, que facilitan el suministro del gen en un paciente. Más detalles respecto a vectores retrovirales pueden encontrarse en Boesen y colaboradores , Biotherapy 6:291-302 (1994), que describe el uso de un vector retroviral para suministrar el gen mdrl a células de tallo hematopoyéticas a fin de hacer las células de tallo más resistentes a quimioterapia. Otras referencias que ilustran el uso de - vectores retrovirales en terapia de genes son: Clowes y colaboradores, J. Clin . Invest . 93:644-651 (1994); Kiem y colaboradores, Blood (Sangre) 83: 1467-1473 (1994); Salmons y Gunzberg, Human Gene Therapy (Terapia de genes en humanos) 4: 129-141 (1993); y Grossman and Wilson, Curr. Opin. in Genetics y Devel . 3:110-114 (1993) . Adenovirus son otros vectores virales que pueden utilizarse en terapia de genes. Adenovirus son vehículos especiales atractivos para suministra genes a epitelio respiratorio. Adenovirus infectan naturalmente el epitelio respiratorio, en donde provocan una ligera enfermedad. Otros objetivos para sistemas de suministros basados en adenovirus son hígado, sistema nervioso central, células endoteliales, y músculo. Adenovirus tienen la ventaja de ser capaces de infectar células no divisoras. Kozarsky y Wilson, Current Opinión in Genetics and Development (Opinión actual en genética y desarrollo) 3:499-503 (1993) presenta la revisión de terapia de gen basada en adenovirus . Bout y colaboradores, Human Gene Therapy (Terapia de genes en humanos) 5:3- 10 (1994) demuestra el uso de vectores de adenovirus para transferir genes al epitelio respiratorio de simios rhesus. Otras instancias del uso de adenovirus en terapia de genes pueden encontrarse en Rosenfeld y colaboradores, Science 252:431-434 (1991); Rosenfeld y colaboradores, Cell 68: 143- 155 (1992); Mastrangeli y colaboradores, J. Clin . Invest . 91:225-234 (1993; Publicación de PCT W094/12649; y Wang, y colaboradores, Gene Therapy 2:775-783 (1995). En ' una modalidad preferida, se utilizan vectores de adenovirus. Virus adeno-asociados (.AAV) también se han propuesto para utilizar en terapia de genes (Walsh y colaboradores, Proc. Soc. Exp . Biol . Med. 204:289-300 (1993); la Patente de los E.U.A. • No. 5,436,146). Otro enfoque a terapia de- genes involucra transferir un gen a células en cultivo de tejido por métodos tales como electroporación, lipofección, trasfección mediada por fosfato de calcio, o infección viral. Usualmente el método de transferencia incluye la trasferencia de un marcador seleccionable a las células. Las células luego se colocan bajo selección para aislar estas células que han absorbido y expresan en el gen transferido. Esas células luego se comunican a un paciente . En esta modalidad, el ácido nucleico se introduce en una célula antes de administrar in vivo de la célula recombinante resultante. Esta introducción puede llevarse a cabo por cualquier método conocido en la especialidad, incluyendo pero no limitado a, transfección, electroporación, microinyección, infección con un vector bacteriófago o viral ( que contiene las secuencias de ácido nucleico, fusión celular, transferencia de gen mediada por cromosoma, transferencia de gen mediada por microcélula, fusión de esferoplasto, etc. Numerosas técnicas se conocen en la especialidad para la introducción de genes extraños en las células, (ver por ejemplo, Loeffler y Behr, Meth . Enzymol . 217:599-618 (1993); Cohén y colaboradores, Meth . Enzymol . 217:618-644 (1993); Cline, Pharmac . Ther. 29:69-92m (1985) y pueden emplearse de acuerdo con la presente invención, siempre que las funciones de desarrollo fisiológicas necesarias de las células destinatarias no se interrumpan. La técnica deberá proporcionar la transferencia necesaria del ácido nucleico a la célula, de manera tal que el ácido nucleico sea expresable por la célula y de preferencia heredable y expresable por su progenie celular. Las células recombinantes resultantes puede suministrarse a un paciente por diversos métodos conocidos en la especialidad. Células de sangre recombinantes (por ejemplo, células progenitoras o de tallo hematopoyéticas) de preferencia se administran intravenosamente. La cantidad de células previstas para uso depende del efecto deseado, estado del. paciente, etc, y pueden determinarse por una persona con destreza en la especialidad. Células en las cuales puede introducirse un ácido nucleico para propósitos de terapia de genes, abarcan cualquier tipo de célula disponible deseada, incluyen pero no están limitadas a células epiteliales, células endoteliales, queratinocitos, fibroblastos, células de músculo, hepatocitos; células de sangre tales como linfocitos-T, linfocitos-B, monocit?s, macrófagos, neutrófilos, eosinófílos, megacariocitos, granulocitos; diversas células progenitoras o de tallo, en particular células progenitoras o de tallo hematopoyéticas por ejemplo, como se obtiene de la médula ósea, sangre de cordón umbilical, sangre periférica, hígado fetal, etc. En una modalidad preferida, la célula empleada para terapia de gen es autóloga para el paciente. - En una modalidad en donde, se utilizan células recombinantes en terapia de gen, se introducen en las células secuencias de ácido nucleico que codifican un anticuerpo tal que se expresen por las células o su progenie, y las células recombinantes luego se administran in vivo para efectos terapéutico. En una modalidad específica, se utilizan células de tallo o progenitoras. Cualesquiera células de tallo y/o progenitoras que puedan aislarse y mantenerse in vitro, pueden emplearse potencialmenté de acuerdo con esta modalidad de la presente invención (ver por ejemplo, Publicación de PCT WO 94/08598; Stemple y Anderson, Cell 71:973-985 (1992); Rheinwald, Meth. Cell Bio. 21A:229 (1980); y Pittelkow y Scott, Mayo Clinic Proc . 61:771 (1986) ) . En una modalidad específicaT el ácido nucleico a introducirse para propósitos de terapia de gen, comprende un promotor inducible que se enlaza operativamente con la región de codificación, de manera tal que la expresión del ácido nucleico es controlable al controlar la presencia o ausencia del inductor de transcripción apropiado. Demostración de actividad terapéutica o profiláctica. Los compuestos o composiciones farmacéuticas de la invención de preferencia se prueban in vitro, y luego in vivo, para la actividad terapéutica o profiláctica deseada, antes de utilizar en .humanos. Por ejemplo, ensayos in vitro para demostrar la utilidad terapéutica o profiláctica de un compuesto o composición farmacéutica, incluyen el efecto de un compuesto en una línea celular o una muestra de tejido de paciente. El efecto del compuesto o composición en la línea celular y/o muestra de tejido, puede determinarse utilizando técnicas conocidas por aquellos con destreza en la especialidad incluyendo pero no limitadas a, ensayo de formación de roseta, y ensayo de lisis celular. De acuerdo con la invención, ensayos in vitro qué pueden emplearse para determinar si se indica la administración de un compuesto específico, incluyen ensayos de cultivo celular in vitro en donde una muestra de tejido de paciente se desarrolla en cultivo y expone a o de otra forma administra un compuesto, y se observa el efecto de este compuesto sobre la muestra de tejido. Adminis tración y composición Terapéutica/ 'Profiláctica- Anticuerpos . La invención proporciona métodos para tratamiento, inhibición y profilaxis por administración a un sujeto de una cantidad efectiva de un compuesto o composición -farmacéutica de la invención, de preferencia un anticuerpo dé la invención. En un aspecto preferido, el compuesto está substancialmente purificado (por ejemplo substancialmente libre de substancias que limitan su efecto, o produce efectos secundarios no deseados) . El sujeto de preferencia es un animal, incluyendo pero no limitado a animales tales como vacas, cerdos, caballos, pollos, gatos, perros, etc., y de preferencia es un mamífero y en particular un humano.

Formulaciones y métodos de administración que pueden emplearse cuando el compuesto comprende un ácido nucleico o una inmunoglobulina, se describen anteriormente; formulaciones apropiadas adicionales y rutas de administración pueden seleccionarse de entre aquellas descritas con anterioridad. Diversos sistemas de 'suministro se conocen y pueden ser utilizados para administrar un compuesto de la invención, por ejemplo, encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar el compuesto, endocitosis mediada por receptor (ver por ejemplo, Wu y Wu; J". Biol . Chem . 262:4429-4432 (1987)), construcción de un ácido nucleico como parte de un retroviral u otro vector, etc. Métodos para introducción incluyen pero no están limitados a, rutas intradérmicas, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural, y oral. Los compuestos o composiciones pueden ser administrados por cualquier ruta conveniente, por ejemplo por infusión o inyección de bolo, por absorción a través de los forros epiteliales o mucocutáneos (por ejemplo, mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.) y pueden administrarse junto con otros agentes biológicamente activos. Administración puede ser sistémica o local. Además, puede ser conveniente el introducir los compuestos o composiciones farmacéuticas de la invención en el sistema nervioso central por cualquier ruta conveniente, incluyendo inyección intraventricular e intratecal ; inyección intraventricular puede ser facilitada por un catéter intraventricular, por ejemplo conectado a un depósito, tal como un depósito Ommaya. La administración pulmonar también puede emplearse, por uso de un inhalador o nebulizador, y formulación con un agente aerosolizante . En una modalidad específica, puede ser conveniente el administrar los compuestos o composiciones farmacéuticas de la invención, localmente al área que requiere tratamiento; esto puede lograrse por ejemplo, pero no a manera de limitación, infusión local durante cirugía, aplicación tópica, por ejemplo en conjunto con una venda después de cirugía, por inyección mediante un catéter, mediante un supositorio o mediante un implante, el implante es de material poroso, no poroso o gelatinoso, incluyendo membranas tales como membranas sialásticas o fibras. De -preferencia, cuando se administra una proteína, incluyendo el anticuerpo de la invención, debe tenerse cuidado en utilizar materiales en los cuales no se absorbe la proteína. En otra modalidad, el compuesto o composición puede suministrarse en una vesícula, particularmente un liposoma (ver Langer, Science 249: 1527- 1533 (1990); Treat y colaboradores, en Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cáncer (Liposomas en la Terapia de Enfermedad Infecciosa y Cáncer) , Lopez-Berestein y Fidler, eds., Liss, New York (1989), pp . 353- 365; Lopez-Berestein, ibid. , pp. 317-327; ver en general ibid.) . Todavía en otra modalidad, el compuesto o composición puede suministrarse en un sistema de liberación controlada. En una modalidad, puede emplearse una bomba (ver Langer, arriba; Sefton, CRC Cri t . Ref .

Biomed. Eng 14:201 (1987); Buchwald y colaboradores, Surgery 88:507 (1980); Saudek y' colaboradores, N. Engl .

J. Med. 321:574 (1989)). En otra modalidad, pueden emplearse materiales poliméricos (ver Medical Applica tions of Controlled Reléase (Aplicaciones Médicas de Liberación Controlada) , Langer and Wise, eds., CRC Pres., Boca Ratón, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailabili ty, Drug Product Design and Performance Biodisponibilidad de Droga Controlada, Diseño y Desempeño de Producto de Droga) , Smolen and Ball, eds., Wiley, New York (1984) ; Ranger y Peppas, J. , Macromol . Sci . Rev. Macromol . Chem. 23:61 (1983); ver también Levy y colaboradores, Sci ence 228:190 (1985); During y colaboradores, Ann . Neurol . 25:351 (1989); Howard y colaboradores . , J. Neurosurg. 71:105 (1989)) . Todavía en otra modalidad, un sistema de liberación controlada puede colocarse en proximidad al objetivo terapéutico, es decir el cerebro, de esta manera requiriendo solo una fracción de la dosis tónica (ver por ejemplo Goodson, Medi cal Appli ca tions of Con trolled Releasej arriba , vol . 2 (1984) , pp. 115-138) . Otros sistemas de liberación controlada se discuten en la revisión por Langer '(Sci ence 249: 1527- 1533 (1990) ) . En una modalidad específica, en donde el compuesto de la invención es un ácido nucleico que codifica una proteína, el ' ácido nucleico puede administrarse in vivo para promover expresión de su proteína codificada, al construirlo como parte de un vector de expresión de ácido nucleico apropiado y administrarlo de manera tal que se vuelve intracelular, por ejemplo por uso de un vector retroviral (ver la Patente de los E.U.A. No. 4,980,286), o por inyección directa, o por uso de bombardeo de micropartículas (Por ejemplo, una pistola de genes; Biolistic, Dupont) , o revestir con lípidos o receptores de superficie celular o agentes de transfección, o al administrarlo en enlace a un péptido o homeocaja, que se conoce entra al núcleo (ver por ejemplo, Joliot et al . , Proc . Na ti . Acad. Sic.

USA 88 : .864-1868 (1991)), etc. En forma alterna puede introducirse un ácido nucleico intracelularmente e incorporarse dentro de .ADN de célula huésped para expresión, por recombinación homologa. La presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas. Estas composiciones comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto, y un portador farmacéuticamente aceptable. En una modalidad específica, el término "farmacéuticamente aceptable" significa aprobado por una Agencia Regulatoria del Gobierno Federal o estatal o enlistado la Farmacopea de los E.U.A. u otra Farmacopea generalmente reconocida para uso en animales y más particularmente en humanos. El término "portador" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente, o vehículo con el cual se administra el agente terapéutico. Estos portadores farmacéuticos pueden ser lípidos estériles tales como agua y aceites, incluyendo aquellos de petróleo, origen animal, vegetal o sintético tal como aceite de cacahuate, aceite de soya, aceite mineral, aceite de ajonjolí y semejantes. Agua es un portador preferido cuando la composición farmacéutica se administra intravenosamente. Soluciones salinas y soluciones de dextrosa y glicerol acuosas también pueden emplearse como portador de líquidos, particularmente para soluciones inyectables. Excipientes farmacéuticos convenientes incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, creta o greda, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche descremada seca, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y semejantes. La composición, si se desea también puede contener cantidades menores de agentes humectantes o emulsificantes, o agentes amortiguadores de pH. Estas composiciones pueden tomar la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, tabletas, pildoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación sostenida y semejantes. La composición puede formularse como un supositorio, con aglutinantes y portadores tradicionales tales como triglicéridos. Una formulación oral puede incluir portadores estándar tales como grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estereato de magnesio, sacarina de sodio, celulosa, carbonato de magnesio, etc. Ejemplos de portadores farmacéuticos convenientes se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences" (Ciencias Farmacéuticas de Remington) por E.W. Martin. Estas composiciones contendrán una cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto, , de preferencia en forma purificada, junto con una cantidad conveniente de portador, a fin de proporcionar la forma para administración adecuada al paciente. La formulación deberá ajustarse al modo de administración. En una modalidad preferida, la composición se formula de acuerdo con procedimientos rutinarios con una composición farmacéutica adaptada para administración intravenosa a seres humanos. Típicamente, las composiciones para administración intravenosa son soluciones en amortiguador acuoso isotónico" estéril. Cuando sea necesario, la composición también puede incluir un agente solubilizante y un anestésico local como lidocaína para disminuir el dolor en el sitio de inyección. En general, los ingredientes se suministran ya sea por separado o mezclados en conjunto en forma de dosis unitaria, por ejemplo como un polvo liofilizado seco concentrado libre de agua, en un recipiente sellado herméticamente tal como una ampolleta o saquito, indicando la cantidad de agente activo. Cuando la composición se va a administrar por infusión, puede surtirse con una botella de infusión que contiene agua o salino grado farmacéutico estéril. Cuando la composición se administra por inyección, puede proporcionarse una ampolleta de agua estéril para inyección o salino de manera tal que los ingredientes pueden mezclarse antes de administración . Los compuestos de la invención pueden formularse con formas neutras o~ sales. Sales farmacéuticamente aceptables incluyen aquellas formadas con aniones tales como aquellos derivados de ácidos clorhídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, y aquellos formados con cationes tales como aquellas derivadas de sodio, potasio, amonio, calcio, hidróxidos férricos, isopropilamina, trietilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaina, etc. La cantidad de compuestos de la invención que será efectiva en el tratamiento, inhibición y prevención de una enfermedad o desorden asociado con expresión aberrante y/o actividad de un polipéptido de la invención puede determinarse por técnicas clínicas ~~estándar. Además, ensayos in vitro pueden emplearse opcionalmente para ayudar en identificar rangos de dosis óptimo. La dosis precisa a emplearse en ' la formulación también dependerá de la ruta de administración, y la seriedad de la enfermedad de desorden, y deberá decidirse de acuerdo con el juicio del médico y las circunstancias de cada paciente. Dosis efectivas pueden extrapolarse a partir de curvas de dosis-respuestas derivadas de sistemas de prueba en modelo animal o in vitro.

Para anticuerpos, la dosis administrada a un paciente es típicamente 0.1 mg/kg a 100 mg/kg del peso corporal del paciente. De preferencia, la dosis administrada a un paciente está entre 0.1 mg/kg y 20 mg/kg del peso corporal del paciente, más preferiblemente 1 mg/kg a 10 mg/kg del peso corporal del paciente, en general, anticuerpos humanos tienen una vida media más larga dentro del cuerpo humano que los anticuerpos de otras especies debido a la respuesta inmune a los polipéptidos extraños. De esta manera, dosis menores de anticuerpos humanos y administración menos frecuente es a menudo posible. Además, la dosis de frecuencia de administración de anticuerpos .de la invención puede reducirse al mejorar la absorción y penetración de tejido (Por ejemplo en el cerebro) de los anticuerpos por modificaciones tales como por ejemplo lipidación. La invención también proporciona un equipo o paquete farmacéutico que comprende uno o más recipientes llenos con uno o más de los ingredientes de las composiciones farmacéuticas de la invención, opcionalmente asociado con ese o estos recipientes puede estar un aviso en la forma prescrita por una Agencia del Gobierno que regula la fabricación, uso o venta de productos farmacéuticos o biológicos, este aviso refleja la aprobación por la Agencia de la fabricación, uso o venta para administración humana. Diagnostico y Formación de Imagen-Anticuerpos .

Anticuerpos etiquetados y sus derivados y análogos, que ligan específicamente a un polipéptido de interés, pueden emplearse para propósitos de diagnóstico para detectar, diagnosticar y monitorear enfermedad ,y/o desordenes asociados con la expresión aberrante y/o actividad de un polipéptido de la invención. La invención permite la detección de expresión aberrante de un polipéptido de interés, que comprende (a) ensayar la expresión del polipéptido de interés en células o fluido corporal de un individuo utilizando uno o más anticuerpos específicos al polipéptido de interés y (b) comparar el nivel de expresión de gen con un nivel de expresión de gen estándar, con lo que el incremento o decremento en el nivel de expresión de gen del polipéptido ensayado en comparación con el nivel de expresión estándar es indicativo ^de expresión aberrante. La invención proporciona un ensayo de diagnóstico para diagnosticar un desorden, que comprende (a) ensayar la expresión del polipéptido de interés en células o fluido corporal de un individuo utilizando uno o más anticuerpos específicos al polipéptido de interés y (b) comparar el nivel de expresión de gen con un nivel de expresión estándar, con lo que un incremento o decremento en el nivel de expresión de gen del polipéptido ensayado en comparación con el nivel de expresión estándar, es indicativo de un desorden particular. Con respecto a cáncer, la presencia de una cantidad relativamente elevada de transcripción en_ tejido de biopsia de un individuo puede indicar una predisposición para el desarrollo de la enfermedad o puede proporcionar un método para detectar la enfermedad antes de la aparición de síntomas clínicos actuales. Un diagnóstico más definitivo de este tipo puede ' permitir a los profesionales de la salud emplear medidas preventivas o tratamiento agresivo previamente, de_ esta manera evitando el desarrollo o avance adicional -del cáncer. .Anticuerpos de la invención pueden emplearse para ensayar niveles de proteína en una muestra biológica utilizando métodos inmunohistológicos clásicos conocidos por aquellos con destreza en la especialidad (ver por ejemplo Jalkanen, y colaboradores, J. Cell . Biol . 101:976-985 (1985) ; Jalkanen, y colaboradores , J. Cell .

Biol . 105:3087-3096 (1987)). Otros métodos basados en anticuerpo útiles para detectar expresión de genes de proteína incluyen inmunoensayos, tales como ensayo inmunosorbente enlazado por enzima (ELISA) y radioinmunoensayo (RÍA) . Etiquetas de ensayo de anticuerpos convenientes se conocen en la técnica e incluyen etiquetas de enzimas tales como glucosa oxidasa; radioisótopos, tales como .yodo (125I, 121I) , carbón (14-C) , azufre (35S) , tritio (3H) , indio (112In) , y tecnecio (9qTc) ; etiquetas luminiscentes, tales como luminol; y etiquetas fluorescentes tales como fluoresceína y rodamina, y biotina. Un aspecto de la invención es la detección y diagnóstico de enfermedad o desorden asociado con expresión aberrante de un polipéptido de interés en un animal, de preferencia un mamífero y más preferiblemente un humano. En una modalidad, el diagnóstico comprende: (a) administrar (por ejemplo parenteralmente, subcutáneamente, o intraperitonealmente) a un sujeto, una cantidad efectiva de una molécula etiquetada se liga específicamente al polipéptido de interés,- (b) esperar un intervalo de .tiempo después de la administración para permitir que la molécula etiquetada se concentre preferencialmente en sitios en el sujeto en donde el polipéptido se expresa (y para la molécula etiquetada no ligada sea liberada al nivel de fondo) ; (c) determinar el nivel de fondo; y (d) detectar la molécula etiquetada en el sujeto, de manera tal que la detección de la molécula etiquetada sobre el nivel de fondo indica que el sujeto tiene una enfermedad o desorden particular asociado con la expresión aberrante del polipéptido de interés . El nivel de fondo puede determinarse por diversos métodos, incluyendo, comparar la cantidad de molécula etiquetada que se detecta con un valor estándar previamente determinado para un sistema particular. Se entenderá en la técnica que el tamaño del sujeto y el sistema de formación de imagen empleado determinarán una cantidad de la porción de formación de imagen requerida para producir imágenes de diagnóstico. En el caso de una porción de radioisótopo para un sujeto humano, la cantidad de radioactividad inyectada normalmente estará en el rango de aproximadamente 5 a 20 millicuries de 99Tc. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo etiquetado luego se acumulará de preferencia en sitios de células que contienen la proteína específica. Formación de imagen de tumor in vivo se describe por S.W. Burchiel y colaboradores, "Immunopharmacokinetics of Radiolabeled .Antibodies and Their Fragments, " (Inmunofarmacocinética ^ de anticuerpos radioetiquetados y sus fragmentos) en Tumor Imaging: The Radiochemi cal Detection of Cáncer, (Formación de imagen de tumor: La detección radioquímica de cáncer) S. W.

Burchiel y B. A. Rhodes, eds., Masson Publishing Inc. (1982) . Dependiendo de diversas variables, incluyendo el tipo de etiqueta empleada y el modo de administración, el intervalo de tiempo después de la administración para permitir el intervalo de tiempo después de la administración para permitir que la molécula etiquetada se concentre preferencialmente en sitios en el sujeto y para la molécula etiquetada no ligada sea liberada a nivel de fondo de 6 a 48 horas o 6 a 24 horas o 6 a 12 horas. En otra modalidad, el intervalo de tiempo después de administración es de 5 a 20 días o 5 a 10 días.. En una modalidad, el monitoreo de la enfermedad o desorden se lleva a cabo al repetir el método para diagnóstico de enfermedad, por ejemplo un mes después de diagnóstico inicial, 6 meses después de diagnóstico inicial, un año después de diagnóstico inicial, etc. La presencia de la molécula etiquetada puede detectarse en el paciente, utilizando métodos conocidos en la -especialidad para exploración in vivo. Estos métodos dependen del tipo de etiqueta empleada. Las personas con destreza en la especialidad son capaces de determinar el método apropiado para detectar una etiqueta particular. Métodos y dispositivos que pueden emplearse en los métodos de diagnóstico de la invención incluyen, pero no están limitados a tomografía computarizada (CT = computed tomography) , exploración completa de cuerpos tal como tomografías de emisión de posición (PET = position emission tomography) , formación de imagen por resonancia magnética (MRI = magnetic resonance imaging) y sonografía . En una modalidad específica, la molécula se etiqueta con un radioisótopo y se detecta en el paciente utilizando un instrumento quirúrgico que responde a radiación (Thurston y colaboradores, la Patente de los E.U.A. No. 5,441,050). En otra modalidad, la molécula se etiqueta con un compuesto fluorescente y se detecta en el paciente utilizando un instrumento de exploración que responde a fluorescencia. En otra modalidad, la molécula se etiqueta con un metal emisor de positrón y se detecta en el paciente utilizando tomografía de emisión de positrón. Todavía en otra modalidad, la molécula se etiqueta con una etiqueta paramagnética y se detecta en un paciente utilizando formación de imagen y resonancia magnética (MRI) . Anticuerpo y Otros Equipos . La presente invención proporciona equipos que pueden emplearse en los métodos anteriores. En una- modalidad, un equipo comprende un anticuerpo de la invención, de preferencia un anticuerpo purificado, en uno o más recipientes. En una modalidad específica, los equipos de la presente invención contienen un polipéptido aislado substancialmente, que comprende un epitope, que es específicamente inmunorreactivo con un anticuerpo incluido en el equipo. De preferencia^, los equipos de la presente invención además comprenden un anticuerpo de control que no reacciona con el polipéptido de interés. En otra modalidad específica, los equipos de la presente invención contienen un medio para detectar la unión de un anticuerpo o un polipéptido de interés por ejemplo el anticuerpo puede estar conjugado a un substrato detectable tal como un compuesto fluorescente, un substrato enzimático, un compuesto radioactivo o un compuesto luminiscente o un segundo anticuerpo que reconoce el primer anticuerpo, puede ser conjugado a un substrato detectable) . En otra modalidad específica de la presente invención, el equipo es un equipo de diagnóstico para utilizar en monitorear anticuerpos que contienen suero específicos contra polinucleótidos y polipéptidos cancerosos y/o proliferativos . Este equipo puede incluir un anticuerpo de control que no reacciona con el polipéptido de interés. Este equipo puede incluir un antígeno de polipéptido substancialmente aislado que comprende epítope que es específicamente inmunorreactivo con al menos un anticuerpo de antígeno anti-polipeptido. Además, este equipo incluye medios para detectar la unión del anticuerpo al antígeno (por ejemplo el anticuerpo puede conjugarse a un compuesto fluorescente tal como fluoresceína o rodamina que puede detectarse por citometría de flujo) . En una modalidad específica, el equipo puede incluir un antígeno de polipéptido sintetizado químicamente o producido en forma recombinante. El antígeno de polipéptido del equipo también puede conectarse a un soporte sólido. En una modalidad más específica, los medios de detección del equipo anteriormente descrito, incluyen un soporte sólido al cual se conecta el antígeno del polipéptido. Este equipo también puede incluir un anticuerpo antihumano etiquetado co-reportero no conectado. En esta modalidad, la unión del anticuerpo al antígeno del polipéptido puede detectarse por unión del anticuerpo etiquetado-reportero . En una modalidad adicional la invención incluye un equipo de diagnóstico para utilizar en monitorear antígenos que contienen suero ' del polipéptido de la invención. El equipo de diagnóstico incluye un anticuerpo substancialmente aislado específicamente inmunorreactivo con antígenos de polipéptido o polinucleótido, y medios para detectar la unión del antígeno de polinucleótido o polipéptido al anticuerpo. En una modalidad, el anticuerpo se conecta a un soporte sólido. En una modalidad específica, el anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal . Los medios de detección del equipo pueden incluir un segundo anticuerpo monoclonal etiquetado. En forma alterna, o además, los medios de detección pueden incluir un antígeno de competencia, etiquetado. En una configuración de diagnóstico, sueros de prueba se reaccionan con un reactivo de fase solida que tiene un antígeno ligado a superficie que se obtiene por los métodos de la presente invención. Después de unión con anticuerpo antígeno específico al reactivo y retirar componentes de suero no unidos por lavado, el reactivo se reacciona con anticuerpo antihumano etiquetado-reportero para ligar al reportero al reactivo en proporción a la cantidad de anticuerpos anti-antígeno ligado en el soporte sólido. El reactivo de nuevo se lava para retirar anticuerpo etiquetado no ligado y la cantidad de reportero asociada con el reactivo, se determina típicamente, el reportero es una enzima que se detecta al incubar la fase sólida en la presencia de un substrato conveniente fluorométrico, luminiscente o colorimétrico (Sigma, St. Louis, MO) .

El reactivo de superficie sólida en el ensayo anterior se prepara por técnicas conocidas para conectar material de proteína a material de soporte sólido, tales como cuentas poliméricas, barras de inmersión, placas de 96 pozos o material filtro. Estos medios de conexión generalmente incluyen adsorción no específica de la proteína al soporte o conexión covalente de la proteína, típicamente a través de un grupo amina libre, a un grupo químicamente reactivo en el soporte sólido tal como un grupo carboxilo activado, hidroxilo, o aldehido. En forma alterna, placas revestidas con estreptavidina pueden emplearse en conjunto con el o los antígenos biotinilados . De esta manera, la invención proporciona un sistema de ensayo o equipo para llevar a cabo este método de diagnóstico. El equipo en general incluye un soporte con antígenos recombinantes y ligados a superficie y un anticuerpo anti-humano etiquetado-reportero para detectar anticuerpo anti-antígeno ligad?-a superficie. A fin de facilitar la comprensión de los siguientes ejemplos, se describirán ciertos métodos y/o términos que ocurren frecuentemente . "Plásmidos" se designan por una letra p precedida y/o seguida por letras mayúsculas y/o número. Los plásmidos de partida aquí ya están comercialmente disponibles, públicamente disponibles en una base no restringida o puede construirse a partir de plásmidos disponibles de acuerdo con procedimientos publicados. Además, plásmidos equivalentes a aquellos descritos se conocen en la técnica y serán aparentes para aquellos con destreza ordinaria en la especialidad. "Digestión" ADN se refiere a escisión catalítica del ADN con una enzima de restricción que actúa solo en ciertas secuencias del ADN. Las diversas enzimas de restricción aquí empleadas están comercialmente disponibles y sus condiciones de reacción, cofactores y otros requerimientos se emplearon como será conocido por una persona con destreza ordinaria en la especialidad. Para propósitos analíticos, típicamente 1 g de plásmido o fragmento .ADN .se utiliza con aproximadamente 2 unidades de enzima en aproximadamente -t 20 1 de solución en amortiguadores. Para el propósito de aislar fragmentos de ADN para construcción de plásmido, típicamente 5 a 50 g de ADN se digieren con 20 a 250 unidades de enzima en un mayor volumen. Amortiguadores apropiados y cantidades de substrato para enzimas de restricción particulares se especifican por el fabricante. Tiempos de incubación de aproximadamente una hora a 37°C se emplean ordinariamente, pero pueden variar de acuerdo con las instrucciones de los. proveedores.

Después de digestión, la reacción somete á electroforesis directamente en un gel de poliacrilamida para aislar el fragmento deseado . Separación de tamaño de los fragmentos escindidos se realiza utilizando gel de poliacrilamida al 8 porciento descrito por Goeddel, D. y colaboradores, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980). "Oligonucleótidos" se refiere ya sea a un polideoxinucleótido de hebra sencilla o dos hebras de polideoxinucleótido complementario que pueden ser químicamente sintetizadas. Estos oligonucleótidos sintéticos no tienen fosfato 5 ' y de esta manera no ligarán con otro oligonucleótido sin agregar un fosfato con un ATP en la presencia de una cinasa. Un poligonucleótido sintético ligará a un fragmento que no se a desfosforilado . "Ligación" se refiere al proceso de formar enlaces fosfodiéster entre dos fragmentos de ácido de dobre hebra (Maniatis, T. , y colaboradores, Id., p. 146) . A menos de que se disponga de otra forma, la ligación puede lograrse utilizando conocidos amortiguadores y condiciones con 10 unidades de T4 .ADN ligasa "ligasa") por 0.5 g de cantidades de aproximadamente equimolares de los fragmentos de .ADN a ligar..

A menos de que otra forma se establezca, la transformación se realiza como se describe en el método de Graham, F. y Van der Eb, A., Virology, (Virología) 52:456-457 (1973) . Habiendo ahora descrito en general la invención, la misma será más fácilmente comprendida a través de referencia a los siguientes ejemplos que se proporcionan a manera de ilustración y no se pretenden limitantes de la presente invención. Ejemplo I Expresión Bac teriana y Puri ficación de MPIF- 1 La secuencia de ADN que codifica MPIF-1, ATCC # 75676 se amplifica inicíalmente utilizando cebadores oligonucleótido PCR correspondientes a la secuencia 5 ' y de la proteína MPIF-1 procesada (menos la secuencia péptido de señal) y las secuencias de vector 3 ' al gen MPIF-1. Uucleótidos adicionales correspondientes a Bam HId y Xbal se agregaron a las secuencias 5 ' y 3 ' respectivamente. El cebador oligonucleótido 5' tiene la secuencia 5'- TCAGGATCCGTCACAAAAGATGCAGA-3 ' (ID de SEC NO. : 8) que contiene un sitio de enzima de restricción BamHl seguido por 18 nucleótidos de secuencia de codificación MPIF-1 que parte del supuesto amino ácido terminal del codón de proteína procesada. La secuencia 3' a 5' -CGCTCTAGAGTAAAACGACGGCCAGT-3 ' (ID de SEC NO.: 9) contiene secuencias complementarias a un sitio Xbal. Los sitios de enzima de restricción corresponden a los sitios de enzima de restricción en el vector de expresión bacterial pQE-9 (Qíagen, Inc. Chatsworth, CA) . pQE-9 codifica resistencia a antibiótico (Ampr) , un origen de replicación bacteriana (ori) , un operador promotor regulable por IPTG (P/O) , un sitio de unión de ribosoma (RBS), una etiqueta 6-His y sitios de enzima de restricción. pQE-9 luego se digiere con BamHl y Xbal. Eas secuencias amplificadas se ligan en pQE-9 e insertan en cuadro con la secuencia que codifica la etiqueta de histidina y RBS. La mezcla de ligación luego se utiliza para transformar la cepa E. coli M15/rep4 disponible de Qiagen. M15/rep4 contiene múltiples copias del plásmido pREP4, que expresan el represor lacl y también confiere resistencia a canamicina (Kan1) . Los transformantes se identifican por su capacidad para desarrollar en placas LB y colonias de resistencia a ampícílina/caramicina se eligen. ADN plásmido se aisla por análisis de restricción durante la noche (O/N) en cultivo de líquido en LB suplementado tanto con Amp (100 ug/ml) como Kan (25 ug/ml) . El cultivo O/N se utiliza para inocular un gran cultivo en una proporción de 1: 100 a 1 :250. Las células de desarrollan a una densidad óptica 600 (O.D.eo°) entre 0.4 y 0.6. IPTG ("Isopropil-B-D-tiogalacto piranosida") luego se agrega a una concentración final de 1 mM. IPTG induce por inactivación el represor lacl, liberando el P/O que conduce a expresión de gen incrementada. Se desarrollan células 3 a 4 horas extras. Luego se cosechan células por centrifugación. - La pastilla o precipitado de centrifugación se solubiliza en el agente caotrópico Guanidina HCl 6 M. después de clarificación, MPIF-1 solubilizado se purifica de esta solución por cromatografía en una columna quelato de níquel bajo condiciones que permiten enlace estrecho por proteína que contiene la etiqueta 6 -His. Hochuli, E. y colaboradores, J. Chromatography 411: 177- 184 (1984). MPIF-1 (95% puro) se eluye de la columna en guanidina HCl 6 M pH 5.0 y para propósitos de ' renaturación se ajusta a guanidina HCl 3M, fosfato de sodio 100 mM, glutationa 10 mM (reducido) y glutationa 2 mM (oxidado) . Después de incubación en esta solución por 12 horas la proteina se dializa a fosfato de sodio 10 mM. En forma alterna, los siguientes cebadores no utilizados se emplearon para clonar el gen en el plásmido PQE70 : Cebador 5': 5 ' CCC GCA TGC GGG TCA CA AAG ATG CAG 3' (ID de SEC NO. : 10) Sphl Cebador 3' : 5' AAA GGA TCC TCA ATT CTT CCT GGT CTT 3' (ID de SEC NO. : 11) BamHl Stop Cons trucción de MPIF-1 Optimizado con E. coli A fin de incrementar niveles de expresión MPIF-1, un sistema de expresión E. coli , los codones del gen se optimizaron a codones E. coli altamente empleados.

Para la síntesis de la región optimizada de MPIF-1, se realizó una serie de 4 oligonucleótidos: mpif-1 oligo números 1-4 (establecido a continuación) . Estos oligos superpuestos se emplearon en una reacción PCR por siete pasos a las siguientes condiciones: Desnaturación 95 grados 20 segundos Alineado 58 grados 20 segundos Extensión 72 grados 60 segundos Siguiendo los 7 pasos de síntesis, un cebador a 5 ' a esta región, (ACÁ TGC ATG CGU GW ACC AAA GAC GCU GAA ACC GAA WC AUG AUG UCC (ID de SEC NO.: 12)) y un cebador 3' a toda esta región, (GCC CAÁ GCT TTC AGT TTT TAC GGG TTT TGA TAC GGG (ID de SEC NO.: 13)), se agregaron a una reacción PCR, que contiene 1 microlitro de la reacción inicial de los seis oligonucleótidos. Este producto se amplificó por 30 pasos utilizando las siguientes condiciones : Desnaturación 95 grados 20 segundos Alineado 55 grados 20 segundos Extensión 72 grados 60 segundos El producto elaborado por esta reacción final se restringe con Sph I y HindIII, y clona en pQE70, que también se corta con Sph I y HindIII. Estos clones se expresaron y se encontró que tiene niveles de expresión superiores sin las anteriores mutaciones. mpif oligo número 1: 5 ' GCA TGC GUG WA CCA AAG ACG CUG AAA CCG AAU UCA UGA UGU CCA AAC UGC CGC UGG AAA ACC CGG UUC,UGC UGG ACC GW UCC ACG C 3' (ID de SEC NO . : 14) mpif-1 oligo número 2: 5 ' GCU GGA AUC CUA CW CGA AAC CAÁ CUC . CGA AUG CUC CAÁ ACC GGG UGU UAU CUU CCU GAC CAÁ AAA AGG UCG UCG UUU CUG CGC UAA CCC GUC CGA CAÁ ACÁ GG3 ' (SEQID NO: 15) mpif1 oligo número 3 : 5 'AAG CTTTCA GTTTTT ACG GGTTTT GAT ACG GGT GTC CAG TTT CAG CAT ACG CAT ACÁ AAC CTG AAC CTG TTT GTC GGA CGG GTT AGC GC3 ' (ID de SEC NO. : 16) MPIF-1 oligo número 4: 5 ' GGT TTC GAA GTA GGA TTC CAG CAG GGA GCA CGG GAT GGA ACG CGG GGT GTA GGA GAT GCA GCA GTC AGC GGA GGT AGC GTG GAA ACG GTC CAG C3 ' (ID de SEC NO. : 17) Construcción de Mutantes de Eliminación MPIF-1 Mutantes de eliminación se construyeron del extremo 5' del gen MPIF-1 utilizando la construcción MP1F-1 optimizada con E. coli establecida anteriormente.

Los cebadores empleados fueron para _ construir las eliminaciones 5' establecidas a continuación. La amplificación PCR se realiza co o se estableció anteriormente para construcción MPIF-1 optimizada con E. coli. Los productos para Delta 17 -A qe6, Delta 23, Delta 28 se restringieron con Ncol para el sitio 5' y HindIII para el sitio 3 ' y clonaron en el plásmido pQE60 que se digiere con Ncol y HindIII. Todos los otros productos se restringieron con Sphl para el sitio 5' y HindIII para el sitio 3 ' y clonaron en el plásmido pQE70 que se digiere con Sphl y HindIII. Los cebadores 5' empleados son como sigue: Delta 17-A qe6 (pQE60) 5' Ncol ge gca g ccatgg aa aac ccg gtt ctg ctg gac 3' (ID de SEC NO. : 18) La secuencia de amino ácido resultante de este m u t a n t e d e e l i m i n a c i ó n : MENPVLLDRFHATSADCCISYTPRSIPCSLLESYFETNSECSKPGVIFLTKK GRRFCANPSDKQVQVCMRMLKLDTRIKTRKN (ID de SEC NO. : 19) Delta 16-A qe7 (pQE70) 5 ' Sphl ge cat g gcatgc tg gaa aac ccg gtt ctg ctg gac (ID de SEC NO. : 20) La secuencia de amino ácidos resultante de este m u t a n t e d e e l i m i n a c i ó n : MLENPVLLDRFHATSADCCISYTPRSIPCSLLESYFETNSECSKPGVIFLTK KGRRFCANPSDKQVQVCMRMLKLDTRIKTRKN (ID de SEC NO . : 21) Delta 23 (pQE60) 5' Ncol ge gca g ccatgg ac cgt ttc cae gct acc tec (ID de SEC NO. : 22) La secuencia de amino ácido resultante de este m u t a n t e d e e .l i m i 'n a c i ó n : MDRFHATSADCCISYTPRSIPCSLLESYFETNSECSKPGVIFLTKKGRRFCA NPSDKQVQVCMRMLKLDTRIKTRKN (ID de SEC NO . : 23) Delta 24 (pQE70) 5 ' Sphl gcc atg qcatqc gtt tec acg cta cct ce (SEQ ID NO: 24) La secuencia de amino ácido -resultante de este m u t a n t e d e e l i m i n a c i ó n : MRFHATSADCCISYTPRSIPCSLLESYFETNSECSKPGVIFLTKKGRRFCAN PSDKQVQVCMRMLKLDTRIKTRKN (ID de SEC NO. : 4) Delta 28 (pQE60) 5' Ncol gcg cag ccatgg cta cct ccg ctg act gct ge (ID de SEC NO. : 25) La secuencia de amino ácido resultante de este m u t a n t e d e. e l i m i n a c i ó n : MATSADCCISYTPRSIPCSLLESYFETNSECSKPGVIFLTKKGRRFCANPSD KQVQVCMRMLKLDTRIKTRKN (ID SEC NO: 26) S70 mutante A (Ser en la posición 70 se muta a Ala) (pQE70) anti-sentido ttc gaa gta ggc ttc cag cag (ID de SEC NO. : 27) sentido ctg ctg gaa gcc tac ttc gaa (ID SEC NO : 28 ) 5 ' Sphl full gcc atg gcajtgc gtg tta cea aag acg ctg aaa CC (ID SEC NO: 29) La secuencia de amino ácido resultante de este m u t a n t e d e e l i m i n a c i ó n : MRVTKDAETEFMMSKLPLENPVLLDRFHATSADCCISYTPRSIPCSLLEaY FETNSECSKPGVIFLTKKGRRFCANPSDKQVQVCMRMLKLDTRIKTRKN (ID SEC NO:30) El cebador 3 ' empleado para todas las construcciones: 3 ' Hind III gcc c aagctt tea gt m tac ggg m tga tac ggg (ID de SEC NO . : 31 ) El MPIF-1 "maduro" para expresar E. coli (Mutante - 1 en la Figura 19 ) MRVTKDAETEFMMSKLPLENPVLLDRFHATSADCCISYTPRSIPCSLLESY FETNSECSKPGVIFLTKKGRRFCANPSDKQVQVCMRMLKLDTRIKTRKN (ID SEC NO : 3 ) Ej empl o 2 La mayoría de los vectores empleados para expresión transitoria de la secuencia del gen MPIF-1 de células de mamífero, deberá transportar el origen de replicación SV40. Esto permite la replicación del vector a altos números de copia en células (por ejemplo, COS) que expresan el antígeno T requerido para el inicio de síntesis .ADN viral. Cualquier otra línea celular de mamífero también puede ser empleada para este propósito. Un vector de expresión de mamífero típico contiene el elemento o motor, que media el inicio de transcripción .ARNm, la secuencia de codificación de proteína y señales requeridas para la terminación de transcripción y poliadenilación de la transcripción. Elementos adicionales incluyen mejoradores, secuencias Kozak y secuencias intercaladas flanqueadas por sitio de donador y aceptor para lisar o romper .ARN. Transcripción altamente eficiente puede lograrse con los promotores anterior y posterior de SV40, las repeticiones de terminales largas (LTRs) de Retrovirus, por ejemplo RSV, HTLVI, HIVI y el promotor anterior de citomegalovirus (CMV) . Sin embargo, señales celulares también pueden ser empleadas (por ejemplo, promotor de actina humana) . Vectores de expresión convenientes para utilizar en la práctica de la presente invención incluyen por ejemplo vectores tales como pSVL _ pMSG (Pharmacia, Uppsala, Sweden) , pRSVcat (ATCC 37152) , pSV2dhfr (ATCC 37146) y pBC12MI (ATCC 67109) . Células de huésped de mamífero que puede emplearse incluyen células humanas HeLa, 283, H9 y Jurkart, células de ratón NIH3T3 y C127, Cos 1, Cos 7 y CV1, células de mono verde africano, células de codorniz QCl-3, células de ratón L y células de ovario de hámster chino . En forma alterna, el gen puede ser expresado en líneas celulares estables que contienen el gen integrado en cromosomas. La co-transfección con un marcador seleccionable tal como dhfr, gpt, neomicina, higromicina permite la identificación y aislamiento de las células transfectadas . El gen transfectado también puede ser amplificado para expresar grandes cantidades de la proteína codificada. El DHFR (dihidrofolato reductasa) es un marcador útil para desarrollar líneas celulares que transportan varios cientos o incluso varios miles de copias del gen de interés . Otro marcador 'de selección es la enzima glutamina sintasa (GS) (Murphy y colaboradores . , Biochem J. 227:277-279 (1991); Bebbington y colaboradores, Bio/Technology 10:169-175 (1992)). Utilizando estos marcadores, las células de mamífero se desarrollan en medio selectivo y las células con la más 5 alta resistencia se eligen. Estas líneas celulares contienen el o los genes amplificados integrados en cromosomas. Células de ovario de hámster Chino (CHO) a ^ menudo se emplean para la producción de proteínas. Los vectores de expresión pCl y pC4 contienen 10 el fuerte promotor (LTR) del virus Rous Sarcoma (Cullen y colaboradores, Molecular, and Cellular Biology (Biología Molecular y Celular) , 438-447 (March, 1985)) más un ^ fragmento de mejorador CMV (Boshart y colaboradores, Cell 41:521-530 (1985)). Múltiples sitios de clonación, 15 por ejemplo con los_ sitios de escisión de enzima de restricción BamHl, Xbal y Asp718, facilitan la clonación del gen de interés. Los vectores contienen además del intrón 3 ' , la señal de poliadenilación y terminación del gen preproinsulina de rata. ^ 20 A. Expresxon de MPIF-1 Recombinante en células COS La expresión de plásmido, CMV-MPIF-1 HA se deriva de un vector pcDNAl/Amp (Invitrogen) que contiene: (1) origen de replicación SV40, (2) gen de resistencia a ampicilina, (3) origen de replicación de E. coli, (4) promotor CMV seguido por una región polienlazador, un intrón SV40 y sitio de poliadenilación. Un fragmento de ADN que codifica todo el precursor MPIF-1 y una etiqueta HA fusionada en cuadro a su extremo 3 ' se clona en la región polienlazador del vector, por lo tanto la expresión de proteína recombinante se dirige bajo el promotor CMV. La etiqueta HA corresponde a un epitope derivado de la proteína hemaglutilina de influenza cp,p se describió previamente (Wilson, H, , y colaboradores , Cell 3 7:767 (1991)) . La infusión de la etiqueta HA a nuestra proteina objetivo, permite fácil detección de la proteína recombinante por un anticuerpo que reconoce el epitope HA. La estrategia de construcción de plásmido se describe como sigue: La secuencia ADN, ATCC # 75676, que codifica MPIF-1 se construye por PCR en el EST original clonado utilizando dos cebadores: el cebador 5' 5'-GGAAAGCTTATGAAGGTCTCCGTGGCT-3 ' (ID de SEC NO.: 32) contiene sitio HindIII seguido por 18 nucleótidos de la secuencia de codificación MPIF-1 que parte del codón de inicio; la secuencia 3' 5 ' -CGCTCTAGATCAAGCGTAGTCT-GGGACGTCGTATGGGTAATTCTTCCTGGTCTTGATCC-3' (ID de SEC NO.: 33) contiene secuencias complementarias al sitio Xba I, codón de parada de traducción, etiqueta HA y los últimos 20 nucleótidos de codificación MPIF-1 (sin incluir el codón de parada) . Por lo tanto, -el producto PCR contiene un sitio HindIII, secuencia de codificación MPIF-1 seguido por etiqueta HA fusionada en cuadro, un codón de parada de terminación de traducción siguiente a la etiqueta HA, y el sitio Xbal . El fragmento ADN amplificado por PCR y el vector, pcDNAiyAmp, se digieren con enzima de restricción HindIII y Xbal ligan. La mezcla de ligación se transforma en la cepa SURE E . col i (disponible de Stratagene Cloning_ Systems, 11099 North Torrey Pines Road, La Jolla, ' CA 92037) el cultivo transformado de reviste en placas de medio de ampicilina y se eligen colonias resistentes. ADN plásmido se aisla de transformantes y examina por análisis ,de restricción por la presencia del fragmento correcto. Para expresión de MPIF-1 recombinante, células COS se transfectan con el vector de expresión por el método DEAE-DEXTRAN (J. Sambrook, E. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press, (1989)). La expresión de la proteína MPIF-1 -HA se detecta por el método de radioetiquetado inmunoprecipitación. (E. Harlow, D. Lañe, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1988).) . Células se etiquetan por 8 horas con 35S-cisteína dos días posterior a transfección. Medios de cultivo luego se colectan y las células se lisan con detergente (amortiguador RIPA (150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS, 1% NP-40, 0.5% DOC, 50mM Tris, pH 7.5) . (Wilson, I. y colaboradores, Id. 37:767 (1984)) . Tanto el lisado celular como el medio de cultivo se precipitan con . anticuerpo monoclonal específico de HA. Proteínas precipitadas se analizan en geles 15% SDS-PAGE. . B. Clonación y Expresión en Células CHO El vector pCl se utiliza para expresión de la proteína MPIF-1. Plásmido pCl son derivados del plásmido pSV2-dhfr (ATCC No. de Acceso 37146) . Ambos plásmidos contienen el gen DHFR de ratón bajo control del promotor anterior SV40. Células de ovarios de hámster chino u otras que carecen de actividad dihidrofolato, se transfectan con estos plásmidos pueden seleccionarse al desarrollar las células en un medio selectivo (alfa menos MEM, Life Technologies) suplementado con el agente quimoterapéutico metotrexato. La amplificación de genes DHFR entró a la resistencia a metotrexato (MTX) ha estado bien documentado (ver por ejemplo, Alt, F.W., Kellems, R.M. , Bertino, J.R., y Schimke, R.T., 1978, J. Biol. Chem. 253:1357-1370, Hamiin, J.L. y Ma, C. 1990, Biochem. et Biophys. Acta, 1097 : 107-143 , Page, M.J. y Sydenham, M.A. 1991, Biotechnology Vol. 9:64-68) . Células desarrolladas en concentraciones incrementadas de MTX desarrollan resistencia a la droga al sobre producir el la enzima objetivo DHFR, como resultado de amplificación del gen DHFR. Si un segundo gen se enlaza al gen DHFR usualmente se co-amplifica y sobre-expresa. Este estado de la técnica al desarrollar líneas celulares que transportan más de mil copias por genes. Subsecuentemente, cuando el metotrexato se retira, líneas celulares que contienen el gen amplificado se integran en el o los cromosomas. El plásmido pCl que contiene la expresión de gen de interés un promotor fuerte de la repetición terminal larga (LTR) del virus sarcoma Rouse (Cullen, y colaboradores, Molecular y Cellular Biology, March 1985:438-4470) más un fragmento aislado del mejorador del gen inmediato anterior del citomegalovirus humano (CMV) (Boshart y colaboradores, Cell 41:521-530, 1985).

Corriente abajo del promotor están los sitios de escisión de enzima de restricción sencilla siguientes que permiten la integración de los genes: BamHl, seguido por el intrón 3 ' y el sitio de poliadenilación , del gen de preproinsulina de rata. Otros promotores altamente eficientes también pueden ser empleados para la expresión, por ejemplo el promotor de actina humana, los promotores anterior o posteriores SV40 de las repeticiones terminales largas de otros retroviruses, por ejemplo, HIV y HTLVI . Para la poliadenilación .ARNm otras señales, por ejemplo de la hormona de crecimiento humano, o genes globina pueden ser utilizadas por igual. Líneas de células estables que transportan un gen de interés integrado en los cromosomas, también pueden seleccionarse ante co- transfección con un marcador seleccionable tal como gpt, G418 o higromicina. Es ventajoso utilizar más de un marcador seleccionable al principio, por ejemplo G418 más metotrexato. El plásmido pC 1 se digiere con la enzima de restricción BamHl y luego desfosforila utilizando fosfatos intestinales de ternera por procedimientos conocidos en la técnica. El vector luego se aisla de un gel de agarosa al 1 % . La secuencia de ADN que codifica MPIF-1, ATCC No. 75676, se amplifica utilizando cebadores oligonucleotidos PCR correspondientes a las secuencias 5 ' y 3 ' del gen: el cebador 5' tiene la .secuencia : 5 ' AAA GGA TCC GCC ACC ATG AAG GTC TCC GTG GTC 3' BamHl KOZAK (ID de SEC NO. : 34) contiene el sitio de enzima de restricción BamHl subrayado y una porción de la secuencia de codificación de proteína MPIF-1 de la Figura 1 (ID de SEC NO. : 1) . Insertado en un vector d expresión, como se describe a continuación, el extremo 5 ' del fragmento amplificado que -codifica MPIF-1 humano proporciona un peptido de final deficiente. Una señal eficiente para el inicio de traducción en células eucarióticas, como se describe por Kozak, M., J. Mol. Biol. 196:947-950 (1987) se localiza apropiadamente en la porción de vector de la construcción . El cebador 3 ' tiene la secuencia: 5 ' AAA GGA TCC TCA ATT CTT CCA GGT CTT 3 ' BamHl Stop (ID de SEC NO.: 35) contiene el sitio de restricción Asp718 y una porción de nucleótidos complementaria a la secuenciatde_ codificación MPIF-1 establecida en la Figura 1 (ID SEC ID NO: 1) , incluyendo 1 codón de parada. Los fragmentos amplificados se íslan de un gel de agarosa al 1% como se describió anteriormente y luego digieren con las endonucleasas BamHl y Asp718 y luego se purifican de nuevo en un gel de agarosa al 1%. El fragmento aislado y el vector desfosforilado luego se ligan con T4 DNA ligasa. E. coli Células HB101 luego se transforman y bacterias identifican que contienen el plásmido pCl insertado en la orientación correcta utilizando la enzima de restricción BamHl . La secuencia del gen insertado se confirma por secuenciado de ADN. Transfección de Células CHO-DHFR Células de ovarios de hámster chino que carecen una enzima DHFR activa se utilizan para transfección. 5 g del plásmido Cl es de expresión se co-transfectan con 0.5 g del plásmido pSVneo utilizando el método de lipofección (Felgner y colaboradores , arriba) . El plásmido pSV2-neo contiene un marcador seleccionable dominante, el gen neo de TnS que codifica una enzima que confiere resistencia a un grupo de antibióticos incluyendo G418. Las células se siembran en alfa menos MEM suplementado con 1 mg/ml G418. Después de 2 días, las células se tripsinizan y siembran en placas de clonación de hibridoma (Greiner, Alemania) y cultivan de 10 a 14 días. Después de este periodo, de tripsinizan clones sencillos y luego siembran en platos petri de 6 pozos utilizando diferente concentraciones de methotrexato (25 nM, 50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM) . Clones que crecen a las más altas concentraciones de metotrexato luego se transfieren a nuevas placas de 6 pozos que contienen incluso superiores concentraciones de metotrexato (500 nM, 1 M, 2 M, 5 M) . El mismo procedimiento se repite hasta que los clones crecen a una concentración de lOO M. La expresión del producto de gen ilustrado se analiza por Western blot y SDS-PAGE. Ejemplo 3 Pa trón de Expresión de MPIF-1 en Tejido Humano .Análisis Northern blot se lleva a cabo para examinar los niveles de expresión de MPIF-1 en tejidos humanos. El total de muestras ARN celulares se aislaron con el sistema RNAzolTM B (Biotecx Laboratories, Inc. 6023 South Loop East, Houston, TX 77033) . Aproximadamente 10 ug de ARN total aislados de cada tejido humano especificado se separa en gel de agarosa al 1% y tiene en un filtro de nylon. (Sambrook, Fritsch, and Maniatis, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Press, (1989) ) . La reacción de etiquetado se realiza de acuerdo con el equipo Stratagene Prime- It con 50 ng de fragmento ADN. El ADN etiquetado se purifica con la columna Select-G-50. (5 Prime-3 Prime, Inc. 5603 Arapahoe Road, Boulder, CO 80303) . El filtro luego se hibridiza con un gen MPIF-1 de longitud completa a etiquetado reactivo a 1,000,000 cpm/ml en Ó.5 M NaP04, pH 7.4 y 7% SDS durante la noche a 65°C. Después de lavar dos veces a temperatura ambiente y dos veces a 60 °C con 0.5 x SSC, 0.1% SDS, el filtro luego se expone a -70°C durante la noche con tamiz de intensificación. Ej empl o 4 Expresión y Purificación de Quimosina MPIF-1 Utilizando un Sis tema de Expresión Baculovirus Células SF9 se infectaron con un baculovirus recombinante diseñaron para expresar el ADNc MPIF-1. Se infectaron células a un MOI de 2 y cultivaron a 28°C por 72 a 96 horas. Desechos celulares del cultivo infectado se retiran por centrifugación a baja velocidad. Se agrega cocktail inhibidor de proteasa al sobrenadante a una concentración final de 20 g/ml de Pefabloc SC, 1 g/ml de leupeptina, 1 g/ml E-64 y I mM EDTA. El nivel de MPIF-1 en el sobre nadante se monitorea al cargar 20-30 1 de sobrenadante solo geles SDS-PAGE al 15%. MPIF-1 se detecta como una banda visible de 9 Kd correspondiente a un nivel de expresión de varios mg por litro. MPIF-1 además se purifica a través de un procedimiento de purificación de tres etapas. Cromatografía de afinidad de unión de Heparina. Sobrenadante de cultivo de baculovirus se mezcla con 1/3 volumen de amortiguador que contiene HEPES/MES/NaOAc 100 mM pH 6 y filtra a través de membranas de 0.22 m. La muestra luego se aplica a una columna de enlace de heparina (HEl poros 20, Bi-Perceptive System Inc.) . MPIF-1 se eluye a aproximadamente NaCl 300 mM en un gradiente linear de NaCl 50 a 500 mM en HEPES/MES/NaOAc 50 mM a pH 6; cromatografía de intercambio de cationes. El MPIF-1M enriquecido de cromatografía de heparina se somete a una dilución de 5 veces con un amortiguador que contiene HEPES/MESlNaOAc 50 mM pH 6. La mezcla resultante luego se aplica a una columna de intercambio de cationes (S/M poros 20, Bio-Perceptive System Inc.) . MPIF-1 se eluye a NaCl 250 mM en un gradiente linear de MaCl de 25 a NaCl 300 mM en HEPES/MES/NaOAc 50 mM a pH 6; cromatografía de exclusión de tamaño. Siguiendo a cromatografía de intercambio de cationes, MPIF-1 además se purifica al aplicar una columna de exclusión de _ tamaño (HW50, TOSO HAAS, 1.4 x 45 cm) . MPIF-1 se fraccionó en una posición cercana a una norma de peso molecular de 13.7 Kd (RNasa A), correspondiente a la forma dimérica de la proteína. Siguiendo la purificación de tres etapas descrita anteriormente, el MPIF-1 resultante se juzga que es mayor a 90% puro como se determina a partir de tinción con azul Commassie de un gel SDS-PAGE (Figura 3) . El MPIF-1 purificado también se prueba por contaminación de endotoxina/LPS . El contenido de LPS fue menor a 0.1 ng/ml de acuerdo con ensayos LAL (BioWhittaker) .

Ej empl o 5 Efecto de N-CIF y MPIF-1 Expresado -Baculovirus en Formación de Colonia Estimulada con M-CSF y SCF- de Células de Médula Osea Recientemente Aisladas Una baja densidad de población de células de médula ósea de ratón se' incuba en un plato de cultivo de tejido tratado por una hora a 37°C para retirar monocitos, 'macrófagos, y otras células que se adhieren a las superficie de plástico. La población no adherente de células luego se revistió (10,000 células/plato) en medio de crecimiento que contiene agar en la presencia o ausencia de los factores mostrados en la Figura 8. Se incubaron cultivos por 10 días a 37°C (88% N2, 5% C02, y 7% O y se calificaron colonias bajo un microscopio invertido. Los datos se expresan como un número promedio de colonias y se obtienen de ensayos • realizados en triplicado . Ej empl o 6 Efecto de MPIF-1 y M-CIF en Proliferación Estimulada por SCF y Diferenciación de Población IL-3 Lin' de Células de Médula ósea Una población de células de médula ósea del ratón enriquecida en progenitores hematopoyéticos primitivos se obtiene utilizando un procedimiento de selección negativa, en donde las células comprometidas de la mayoría de los linajes se retiran utilizando un panel de anticuerpos monoclonales (antígenos anti cdllb, CD4 , CDS, CD45R, y Gr-1) y cuentas magnéticas. La población resultante de células (células agotadas de linaje) se revistieron (5 x 104 células/ml) en la presencia o ausencia de la quimosina indicada (50 ng/ml) en un medio de crecimiento suplementado con IL-3 (5 ng/ml) más factor de célula basal (SCF) (100 ng/ml) . Después de siete días de incubación a 37°C en un incubador humidificado (ambiente de 5% C02, 7% 02, y 88% N2) , se cosecharon células y ensayaron por HPP-CFC, y progenitores inmaduros. Además, se analizaron células para la expresión de ciertos antígenos de diferenciación por FACScan. Datos de colonia se expresan con un número promedio de colonias (+/- SD) y se obtuvieron de ensayos realizados en seis platos por cada población de células (Figura 9) . Ejemplo 7 MPIF-1 Inhibe Formación de Colonia en Respues ta a IL-3 , M-CSF, y GM-CSF Células de médula ósea de ratón se lavaron por arrastre tanto del fémur como la tibia, separaron en un gradiente de densidad ficoll y se retiraron monocitos por adherencia de plástico. La población resultante de células se incubó durante la noche en un medio basado en MEM suplementado con IL-3 (5 ng/ml) , GM-CSF (5 ng/ml) , M-CSF (10 ng/ml) y G-CSF (10 ng/ml) . Estas células de revistieron a 1,000 células/plato en ensayos de formación de colonia basados en agar en la presencia de IL-3 (5 ng/ml) , GM-CSF (5 ng/ml) o M-CSF (5 ng/ml) con o sin a 50 ng/ml . Los datos se presentan como formación de colonia como un porcentaje del número de colonias formadas con el factor específico solo. Ilustran dos experimentos con los datos mostrados como el promedio de platos duplicados con barras de error que indican la desviación estándar de cada experimento Los datos se presentan como formación de colonia como un porcentaje del número de colonias formadas con el factor específico solo. Se muestran dos experimentos con los datos ilustrados como el promedio de platos duplicados con barras de error que indican las desviación estándar por cada experimento (FIG. 11) . Ejemplo 8 Expresión Mediante Terapia de Genes Se obtienen fibroblastos de un sujeto por biopsia de la piel. El tejido 'resultante se coloca en medio de cultivo de tejido y separa en pequeños trozos. Pequeños trozos del tejido se colocan en una superficie húmeda de un matraz para cultivo de tejido, aproximadamente se colocan diez piezas en cada matraz . El matraz se voltea hacia abajo, y cierra herméticamente y deja a temperatura ambiente durante la noche. Después de 24 horas a temperatura ambiente, el matraz se invierte y los trozos de tejido permanecen fijos al fondo del matraz y se agrega medio fresco (por ejemplo . Ham ' s F 12 con 10% FBS, penicilina y estreptomicina) - Esto luego se incuba a 37°C por aproximadamente una semana. En este punto, se agrega medio fresco y se cambia subsecuentemente cada varios días . Después de dos semanas adicionales en cultivo, emerge una monocapa de Fibroblasto. La monocapa se tripsiniza y lleva a escala en matraces más grandes . pMV-7 (Kirschmeier, P.T. y colaboradores, DNA 7:213-25 (1988) flanqueado por las repeticiones terminales largas del virus sarcoma murino Moloney, se digieren con EcoRI y HindIII y subsecuentemente tratan con fosfatasa intestinal de ternera. El vector lineal se fracciona en gel de agarosa y purifica, utilizando cuentas de vidrio. El .ADNc que codifica un polipéptido de la presente invención se amplifica utilizando cebadores PCR que corresponden a la secuencia de extremos 5 ' y 3 ' respectivamente. El cebador 5' que contiene un sitio EcoRI y el cebador 3' contiene un sitio HindIII. Cantidades iguales de la estructura lineal del virus sarcoma murino de Moloney y el fragmento EcoRI y HindIII se agregan en conjunto en la presencia de T4 DNA ligasa. La mezcla resultante se mantiene bajo condiciones apropiadas para ligación de los dos fragmentos. La mezcla de ligación se utiliza para transformar las bacterias HB101, que luego se reviste sobre canamicina que contiene agar, con el propósito de confirmar que el vector tiene el gen de interés insertado adecuadamente. Las células de empaque pA3 17 anfotrópicas GP+aml2 se desarrollan en cultivo de tejidos a densidad confluente en medio de Eagle modificado con Dulbeccol (DMEM) con suero de ternera al 10% (CS) , penicilina y estreptomicina. El vector MSV que contiene el gen luego se agrega al medio y las células de empaque se traslucen con el vector. Las células de empaque ahora producen partículas virales infecciosas que contienen gen (las células de empaque ahora se refieren como células productoras) . Medio fresco se agrega a las células productoras traducidas y subsecuentemente, el medio se cosecha de una placa de 10 cm de células productoras confluentes. El medio agotado, que contiene las partículas virales infecciosas, se filtra a través de un filtro millipore para retirar células productoras desprendidas y este medio luego se utiliza para infectar células de fibroblasto. Se retira medio de una placa sub-confluente de fibroblastos y reemplaza rápidamente con el medio de las células productoras . Este medio se recibe y reemplaza con medio fresco. Si el título de virus es alto, entonces virtualmente todos los fibroblastos estarán infectados y no se requiere selección. Si el título es muy bajo, entonces no es necesario utilizar un vector retroviral que tenga un marcador seleccionable tal como neo o his . Los fibroblastos de ingeniería luego se inyectan a huésped, ya sea solo o después de haber sido desarrollados a confluencia en cuentas micro portadoras cytodex 3. Los fibroblastos ahora producen el producto de proteína. Ejemplo 9 Mieloprotección in Vi tro Como se demostró anteriormente, MPIF-1 es un inhibidor potente de la célula formadora de colonia de bajo potencial proliferativo (LPP-CFC) , un progenitor mieloide que da lugar a linajes de granulocitos y monocitos. Para demostrar que MPIF.-l proporciona protección para LPP-CFC de la citotoxicidad de la droga quimoterapéutica que actúa en el ciclo celular, poblaciones agotadas de linaje de células (células Lin-) se aislaron de médula ósea de ratón e incubaron en la presencia de múltiples citocinas con . ,o sin MPIF-1. Después de 48 horas, un conjunto de cada cultivo recibe 5-Fu y la incubación luego se continua por 24 horas adicionales, en cuyo punto los números de LPP-CFC supervivientes se determinaron por un ensayo clonogénico. Como se ilustra en la Figura 21A, aproximadamente 40% de LPP-CFC se protegieron de la citotoxicidad 5 -Fu-inducida en la presencia de MPIF-1, mientras que se observó poca protección (<5%) de LPP-CFC en la ausencia de MPIF-1, en la presencia de una proteína no relacionada. Células formadoras de colonia de alto potencial proliferativo (HPP-CFC) no se protegieron por MPIF-1 por las mismas condiciones de cultivo, demostrando especificidad del efecto protector MPIF-1. Experimentos similares se realizaron utilizando el agente quimoterapéutico Ara-C en lugar de 5-Fu. Como se ilustra en la Figura 15B, protección dramática de LPP-CFC tanto del MPIF-1 de tipo silvestre como un MPIF-1 mutante (es decir, mutante- 1, ver .Ejemplo 11 a continuación para descripción de este- mutante) . De esta manera, MPIF-1. es capaz de proteger LPP-CFC de la citotoxicidad inducida por ambas drogas quimoterapéuticas 5-Fu y Ara-C. Ejemplo 10 Mieloprotección In Vivo Los resultados de mieloprotección in vi tro sugieren que la mielotoxicidad producida por las drogas citotóxicas, un efecto secundario severo que se observa en pacientes de cáncer que se someten a quimoterapía, puede mejorarse si los tipos de células físicos dentro de la médula ósea pueden ser protegidos por MPIF-1 durante el periodo de acción de las drogas quimioterapéuticas . Para demostrar mieloprotección in vivo, dos tipos de experimentos se realizaron en ratones. En un experimento, un grupo de ratones (grupo-4) se inyectan (I.P.) diariamente por tres días a intervalos de 24 horas, con 1.0 mg/Kg MPIF-1, y el tercer día estos ratones también se inyectaron (I.P.) Con 5-Fu a 150 mg/Kg. .Animales inyectados ta sea con salino (Grupo- 1) , MPIF-1 solo (Grupo-2) , o 5-Fu solo (Grupo-3) sirvieron como controles. Luego, cuatro animales de cada uno de estos se sacrificaron a 3, 6, y 10 días posterior a administración de 5-Fu para determinar cuentas de leucocitos (WBC = White Blood Cell) en la sangre periférica. Como se ilustra en la Figura 16, inyección de MPIF-1 solo tiene poco efecto en las cuentas WBC. Como se espera, el tratamiento con 5-Fu resulta en una reducción dramática en las cuentas de WBC en circulación el día 6 posterior a 5-Fu. De manera significativa, animales tratados con MPIF-1 antes de administración de 5-Fu exhibieron aproximadamente dos veces superiores cuentas de WBC en la sangre en .comparación con animales tratados con 5-Fu solo. De esta manera, el tratamiento de ratones con MPIF-1 antes de 5-Fu, resulta en la recuperación acelerada de neutropenia. Células progenitoras multipotenciales y de tallo hematopoyéticas en la médula ósea son responsables por restaurar todos los linajes hematopoyéticos después de quimoterapias . En individuos normales, estas células se dividen menos frecuentemente y por lo tanto se salvan de una sola dosis de la droga, quimoterapéutica . Sin embargo, estas células se exterminan si se administra una segunda dosis de la droga dentro de tres días después de la primer dosis debido a que los tipos de células progenitoras físicas en la médula ósea se dividen rápidamente durante este periodo. Para demostrar que MPIF-1 es capaz de proteger estos tipos de células en la médula ósea, se realizó el siguiente experimento. El experimento fue realizado utilizando tres grupos de ratones (6 animales por grupo) que se trataron como sigue: . Grupo- 1, inyectado con salino los días 1, 2, y 3; Grupo-2, inyectaron con 5-Fu los días 0 y 3 ; y Grupo-3, inyectaron con 5-Fu los días 0 y 3 y MPIF-1 los días 1, 2, y 3. (Ver Figura 17.) Se cosecha médula ósea los días 6 y 9 para determinar frecuencias de HPP-CFC y LPP-CFC utilizando un ensayo clonogenico bien conocido por aquellos con destreza en la especialidad. Los resultados demuestran que la administración de M;PIF-1 antes de la segunda dosis 5-Fu resulta en una rápida recuperación de las frecuencias de HPP-CFC y LPP-CFC al día 9 en comparación con animales con 5-Fu solo. (Ver Figura 18.) Ejemplo 11 Estudios con los Mutantes MPIF-1 Una cantidad de variantes de MPIF-1 que se truncan del extremo N, se han identificado y caracterizado. Las secuencias amino terminales de estas variantes como se determinan por degradación Edman se presentan en la Figura 19. Por ejemplo, los Mutantes-2, -3, -7, y -8 surgen espontáneamente durante la purificación de la forma madura de MPIF-1 y esta preparación se denomina preparación K0871. Similarmente, Mutantes-2, -3, -4, y -5 se descubrieron en otro lote de la preparación MPIF-1 purificada (Preparación HG00300-B7) . Ya que no fue posible purificar estas variantes entre si, las Preparaciones K0871 y HG00300-B7 se utilizaron como tales en los experimentos descritos a continuación. El Mutante-6, que es idéntico al Mutante-3 con respecto a la secuencia de amino terminal excepto por metionina N-terminal se genera por mutagénesis in vi tro . El Mutante-1, que es idéntico al tipo silvestre excepto por la metionina N-terminal también se generó por mutagénesis. Además, una forma de lisado alterno de MPIF-1 (Mutante-9) , el clon ADNc del cual codifica una proteína de 137 amino ácidos (Figura 20) se descubrió (ver Figura 19) . Compariciones de la secuencia de amino ácidos para los Mutantes-9 con MPIF-1 revela una inserción de 18 amino ácidos entre los residuos 45 y 46 en la secuencia MPIF-1 y la pérdida de arginina 46 de MPIF-1 (Figura 20B) . Los siguientes resultados resumen las actividades biológicas de estas proteínas mutantes MPIF-1. Movilización de Calcio Intracelular . En los ejemplos anteriores, proteína MPIF-1 se ha mostrado que moviliza calcio en monocitos. Las proteínas MPIF-1 mutante y tipo silvestre se probaron por su capacidad para inducir movilización de calcio intracelular en monocitos humanos utilizando MIP-1 humano como un control positivo. El experimento se realizó como sigue: monocitos humanos se aislaron por elutriación y cargaron con Indo-1/acetoximetiléster por incubación de 1 x 106 células en 1 ml de HBSS que contiene CaCl2 1 mM, MgS04 2 mM, glucosa 5 mM y HEPES 10 mM, pH 7.4 más Indo-1/acetoximetiléster 2.5 mM por 30 minutos a 37°C. Luego se cosecharon células con HBSS y resuspendieron en el mismo amortiguador a 5 x 105 células/ml y estimularon com diversas concentraciones de las proteínas indicadas a 37°C. La señal fluorescente inducida en respuesta a cambio en calcio intracelular ((Ca++)i) se mide en un espectómetro de fluorescencia Hatchi F-2000 al monitorear excitación Indo-1 a 330 nm y emisión a 405 y 485 nm. Los resultados se ilustran en la Figura 21. Los resultados demuestran que las preparaciones K0871 HG00300-B7, y el Mutante-9 son 10 veces más activas que el tipo silvestre, mientras que los mutantes-6 son indistinguibles del tipo silvestre y el Mutante -1 es aproximadamente dos veces más activo que el tipo silvestre. (Ver, Figura 21) . Ya que MIP-1 y MPIF-1 son 45% idénticos con respecto a la secuencia de amino ácidos primaria fue "de interés el determinar si interactuan con el mismo receptor. Para explorar esta posibilidad, la capacidad de MPIF-1 en desensibilizar movilización de calcio inducida por MIP-1 fue estudiado. Las Figuras 22A y 22B muestran que MIP-1 y la proteína de tipo silvestre MPIF-1 puede, desensibilizarse en la capacidad entre sí para movilizar calcio en monocitos, pero no MCP-4 (otra beta-quimosina) . En experimentos similares, las preparaciones K0871, HG00300-B7, y los Mutantes- 1, -6, y -9 fueron capaces de bloquear movilización de calcio inducida por MIP-1. Este experimento se realiza como sigue: respuesta de movilización de calcio de monocitos humano a las proteínas indicadas a 100 ng/ml se mide como se indicó anteriormente para el experimento descrito en la Figura 21. Para estudios de desensibilización, primero se expusieron monocitos, a un factor y cuando la respuesta al primer tratamiento regresa a la línea base, se agrega un segundo factor a las mismas células . No se indica respuesta al segundo factor por el signo (-) y una respuesta estimulatoria al primer factor por un signo (+) . (Ver, Figura 23) . De esta manera, MPIF-1 y sus variantes mutantes parecen interactuar o compartir un componente del receptor de superficie celular para MIP-1. Reciente demostración del receptor MIP-1 sirve como un cofactor para facilitar la entrada de HIV en monocitos humanos y linfocitos T desarrolla una posibilidad interesante que de sus variantes MPIF-1 pueden interferir con el proceso de entrada de HIV en las células.

Quimiotaxia . La quimiotaxia de la fracción de célula mononuclear estable periférica humana (PBMC) (que consiste primordialmente de linfocitos y monocitos) se mide en respuesta a diversas concentraciones de MPIF-1 y sus variantes en cámaras de quimiotaxia de neurosonda de 96 pozos. El experimento se realizó como sigue: se lavaron células tres veces en HBSS con BSA 0.1% (HBSS/BSA) y resuspendieron a 2?lOß/ml para etiquetado. Calceína-AM (Molecular Probes) se agrega a una concentración final de 1. mM y las células se incubaron a 37°C por 30 minutos. Después de esta incubación, las células se lavaron tres veces en HBSS/BSA. Celdas etiquetadas luego se resuspendieron a 8 x 106/ml y 25 ml de esta suspensión (2 x ÍO^ células) se surten en cámara superior de una placa de quimiotaxia de 96 pozos. El agente quimiotáxico se distribuye a diversas concentraciones en la cámara de fondo de 'cada pozo. Las cámaras superiores y de fondo se separan por un filtro de policarbonato (tamaño de poro 3-5 mm; libre PVP; NeuroProbe, Inc.) . se dejó que células migraran por 45 a 90 minutos y luego el número de células que migraron (tanto conectadas a la superficie de sonda de filtro como en la cámara de fondo) se cuantifican utilizando un vector de placa de fluorescencia fytoflor 11 (PerSeptive Biosystems) . Valores representan concentraciones en las cuales se observa actividad pico con la inducción de doblado relativa sobre el fondo" indicado en el paréntesis . Los resultados, mostrados en la Figura 24, demuestran que las preparaciones K0871 y HG00300-B7 son inductores más potentes de quimotaxia que el tipo silvestre, mientras que los mutantes-1 y -6 fueron indistinguibles del tipo silvestre. Efectos en Formación de Colonia por LPP-CFC . Para determinar el impacto de variantes de MPIF-1 en formación de colonia por LPP-CFC, un número limitante de células de médula ósea de ratón se revistieron en medios que contienen agar suave suplementados con múltiples citocinas con o sin diversas concentraciones de variantes de MPIF-1. El experimento se realiza como sigue: una población de baja densidad de células de médula ósea de ratón se reviste (1500 células/plato de 3.5 cm de diámetro) en agar que contiene medio con o sin variantes MPIF-1 indicadas a diversas concentraciones, pero en la presencia de las siguientes citocinas murinas recombinantes y IL-3 (5 ng/ml) , SCF (100 ng/ml) , IL-1 alpha (10 ng/ml) , y M-CSF (5 ng/ml) . Platos luego se incubaron en un incubador de tejido de cultivo por 14 días en cuyo punto colonias LPP-CFC se calificaron bajo un microscopio invertido. Datos presentados en la Figura 25 se colectan de diversos experimentos diferentes en donde cada condición se ensaya en duplicado. Los resultados demuestran que la concentración efectiva requerida para 50% de inhibición máxima en el caso de las preparaciones K0871 y HG00300-B7 fue de 20 a 100 veces menor que la del tipo silvestre y para los Mutantes-6 fue de 2 a 10 veces menor. (Ver Figura 25) . De esta manera, la eliminación de los amino ácidos N-terminal de proteína MPIF-1 resulta en una potencia incrementada de la molécula. Ejemplo 1-2 Movilización de Célula de Tallo in vivo Inducida por MPIF-1 Para demostrar que MPIF-1 ' estimula la movilización de célula de tallo in vivo, se realizó el siguiente experimento. Seis ratones se emplearon por cada grupo de tratamiento (C57Black 6/J, hembra aproximadamente 6 semanas de edad) . Los ratones se inyectaron (I.P.) ya sea con salino (vehículo de control) o MPIF-1 a 5 g/ratón. Después de 30 minutos, se desangraron los ratones y analizaron por WBC mediante contador Coulter. Luego se recolectó y analizó sangre de todos los seis animales de cada grupo para las células Gr.l+ y células doble positivas CD34.Sca-l+ por FACScan.

Se expresan cuentas WBC como promedio ± S.D. y los datos FACScan como % del total de células. Ya que células doble positivas CD34.Sca-l+ se consideran que exhibe propiedades que se esperan de las células de tallo hematopoyéticas, los resultados mostrados en la Figura 26 ilustran que MPIF-1 puede emplearse como un movilizador de célula de tallo. Ej empl o 13 Resul tados de Tratamiento de MPIF-1 Durante el Tratamiento de 5-Fu en más Rápida Recuperación de Plaquetas y Granuloci tos Dos de las complicaciones principales que resultan de las quimioterapias son neutropenia (cuentas de neutrófilos en sangre reducidas) y trombocitopenia (cuentas de plaquetas reducidas) . Se emplea actualmente el factor estimulante de colonia-granulocitos (G-CSF) en la clínica para mitigar neutropenia. G-CSF se conoce que estimula la formación de colonias por granulocito-unidad formadora de colonia (CFU-G) in vi tro y estimula la producción de granulocitos en modelos de animales. Trombopoyetina (Tpo) está en pruebas clínicas para el propósito de aliviar trombocitopenia. Tpo se conoce que estimula la formación de colonias por Megacariocito-unidad formadora de colonia (CFU-Meg) in vi tro y estimula la producción de plaquetas de trombocitopenia inducidos experimentalmente en animales. Una de las principales limitaciones de G-CSF en la clínica es que no es efectiva para aliviar neutropenia en pacientes que están sujetos a múltiples ciclos de quimioterapia. Esto es probable debido al agotamiento de CFU-G en médula ósea, en la célula objetivo sobre la cual actúa G-CSF. Tpo puede también sufrir del mismo destino como se indica por los resultados de pruebas clínicas iniciales. Cualquier agente que puede evitar el agotamiento G-CSF y células objetivo Tpo durante quimioterapia será de gran valor clínico. Los datos mostrados a continuación sugieren que MPIF-l puede cumplir con esta necesidad clínica. En los ejemplos previos, MPIF-1 se ha mostrado que inhibe formación de colonias por progenitores mieloide monocito/granulocito bipotenciales in vi tro . En particular, los Ejemplos 9 y 10 proporcionan datos que demuestran que MPIF-1 protege progenitores mieloide multipotenciales primitivos contra citotoxicidad inducida por 5-Fu in vi tro e in vivo . Estos progenitores multipotenciales se espera que den lugar a progenitores más comprometidos de todo el linaje mieloide incluyendo CFU-G y CFU-Meg. El siguiente experimento se realiza para demonstrar que el tratamiento de MPIF-1 durante dos o tres ciclos del tratamiento de 5-Fu resulta en más rápida recuperación de plaquetas y granulocitos . Materiales y Métodos : Se emplearon ratones hembra C57BL6 (7 a 10 semanas de edad) con un peso corporal promedio de 19.4 g (±1.1 S.D., n=150) . Todos los ratones se alojaron bajo condiciones de dieta y alojamiento estándar de ciclo de obscuridad/luz y temperatura a través del curso del experimento. Preparación MPIF-1 (HG00304-E6) se realiza en E. coli y representa la forma truncada de MPIF-1 que carece 23 amino ácidos N-terminal de l proteína (es decir, Mutante-3 de MPIF-1 en la Figura 19 con un Met N-terminal) . Grado clínico de G-CSF (NeupogenMR) ) se adquiere de Shady Grove Pharmacy, Rockville, MD 20850 (NeupogenMR fabricado por Amgen Inc., Amgen Center, Thousand Oaks, CA 91320) . 5-Fluorouracil (5-Fu) se adquiere de Sigma Chemicals y se preparó recientemente al revolver el agua caliente antes de uso. Solución de MPIF-1 se preparó recientemente por dilución en salino normal. Igualmente, G-CSF se diluye en un amortiguador que consiste de acetato de sodio 10 mM, manitol al 5% (p/v), Tween 80 0.004% (v/v), pH 4.0. Anticuerpos monoclonales de rata conjugados con fluorócromo apropiado contra antígenos de CD41a, Gra.l, y Mac .1 se adquirieron de Pharmingen.

Cinco grupos de ratones (30 ratones por grupo) se trataron como sigue: Grupo 1 se inyectó con I.P. con 0.1 ml de salino normal los días -2, -1, 0, 6, 7, y 8 para servir como control normal . Grupo 2 se inyectó con I,P. con 0.2 ml de solución 5-Fu (a 100 mg/kg de peso corporal) los días 0 Y 8. Grupo 3 se inyectó con 5-Fu como en el Grupo 2 y además 0.1 ml de solución MPIF-1 ía 1.0 mg/Kg de peso corporal) se inyectó I.P. los días -2, -1, 0, 6, 7, y 8. Grupo 4 se inyectó con 5-Fu como en el Grupo 2 y además 0.1 ml de solución G-CSF (a 0.5 de peso corporal) se inyectó I.P. los días 1, 2, 3, 9, 10, y 11. Grupo 5 se inyectó con 5-Fu como en el Grupo 2, MPIF-1 como en el Grupo 3, y G-CSF como en el Grupo 4. Seis animales de cada uno de los grupos se analizaron en los días indicados para monitoreo de recuperación de plaqueta y granulocitos al nivel de sangre periférica y médula ósea. Deberá notarse que ratones analizados los días 6 y 8 posteriores al primer 5-Fu no reciben segundo tratamiento con MPIF-1 5-Fu. Sangre periférica se recolecta del seno retro-orbital en tubos revestidos con EDTA y se analiza inmediatamente por FACS Vantage, para determinar cuantas de plaquetas (eventos positivos CD41a) y granulocitos (de células doble positiva Gra.l y Mac.l) deberá de notarse que el método y análisis y las especies de animales empleados no permiten obtener cuentas absolutas. Por el contrario, se expresan granulocitos como porcentaje del total de glóbulos blancos y plaquetas estimados como eventos positivos CD41a 15 segundos en el clasificador. Luego se sacrificaron los ratones para obtener células de médula ósea utilizando métodos estándar. Células de médula ósea también se analizan por FACS para monitorear porcentaje de poblaciones doble positivas Gra.l y Mac.l de células en la médula ósea. Ya que la etapa en la cual estos antígenos empiezan a expresarse en el linaje de granulocitos no se conoce precisamente, células dobles positivas Gra.l y Mac.l en la médula ósea se espera que sean heterogéneas con respecto a la etapa de su potencial de desarrollo y maduración. También se analizó médula ósea para determinar la frecuencia de progenitores clonogénicos utilizando un ensayo clonogénico in vi tro . Brevemente, se realizó ensayo de células formadoras de colonias de alto potencial proliferativo (HPP-CFC) y células formadoras de colonias de bajo potencial proliferativo (LPP-CFC) en un sistema de cultivo de agar de dos capas. La capa de fondo se prepara en platos de 3.5 cm de diámetro con 1 ml de MEM suplementado con FBS al 20%, agar Difco al 0.5%, 7.5 ng/ml de mIL-3, 75 ng/ml de mSCF, 7.5 ng/ml de hM-CSF y 15 ng/ml de mIL-1. Esta capa luego se cubrió con 0.5 ml de suspensión de células de< médula ósea murina que tienen 2,000 células/plato en MEM con FBS al 20% y agar al 0.3%. El agar superior se dejó que solidificara a temperatura ambiente por aproximadamente 15 minutos. Los platos luego se incubaron por 14 días en un incubador de cultivo de tejido (37°C, 88% N2, 5% C02, y 7% 02) y calificaron colonias bajo un microscopio invertido. En este experimento se reportan total de cuentas de colonia. Datos FACS se generaron al analizar material o tejido de tres animales de cada uno de los grupos por punto en tiempo, mientras que el ensayo clonogénico se realiza con células que sostienen en seis animales de cada uno de los grupos por punto en tiempo. Finalmente, puntos de estos datos para el grupo día uno del experimento representan valores que se obtienen de ratones normales inyectados con salino (Grupo 1) . Resultados: Para monitorear la recuperación de plaquetas en la sangre periférica, los niveles de estado estable de células positivas CD41a se determina por ed by FACS Vantage. Como se ilustra en la Figura 27, el tratamiento MPIF-1 antes de 5-Fu (Grupo 3)' resulta en una recuperación mucho más rápida y más fuerte de plaquetas que la observada en ratones con salino 5-Fu + salino (Grupo 2) . Como se espera, la cinética de recuperación de plaquetas en ratones tratados con G-CSF (Grupo 4) fue indistinguible de la observada en ratones tratados con 5-Fu + salino. También, administrar G-CSF más MPIF-1 a ratones tratados con 5-Fu (Grupo 5) tuvo poco efecto en los niveles de estado estable totales de las plaquetas cuando se comparan con observar en ratones tratados con MPIF-1 solo 1 (Grupo 3) . De esta manera, el pre-tratamiento de MPIF antes del tratamiento 5-Fu resultó en una rápida recuperación de plaquetas en la sangre periférica. La recuperación de granulocitos en la sangre periférica se verifica por cuantificación de los niveles de estado estables de células doble positivas Gra.l y Mac.l en la sangre. Como se ilustra en la Figura 28, el tratamiento 5-Fu de ratones resultó en un marcado incremento en los niveles de estado estable de células doble positivas Gra.l y Mac.l en la sangre a seis días después del primero así como el segundo tratamiento de 5-Fu. El pre-tratamiento con MPIF-1 tuvo dos efectos benéficos; el grado de neutropenia (la extensión o proporción de agotamiento de células doble positivas de Gra.l y Mac.l) son mucho más pequeña y la velocidad de recuperación fue mucho más rápida en comparación con lo observado en ratones tratados con 5-Fu + salino (Grupo 2) . Como se espera, la administración de G-CSF después de tratamiento 5-Fu (Grupo 4) resultó en una rápida recuperación de células doble positivas Gra.l y Mac.l en la sangre. Sin embargo, la extensión o proporción o recuperación de neutropenia en los ratones tratados con G-CSF fue notablemente más pequeño que la observada en los ratones tratados con MPIF-1 el día 8 (Grupo 3) . El efecto de administrar MPIF-1 más G-CSF (Grupo 5) en el agotamiento de recuperación de granulocitos fue bastante dramático ya que estos ratones exhiben niveles de estado estable muy superiores a los de células doble positivas Gra.l y Mac.l en la sangre que lo observado en ratones tratados con cualquiera de MPIF-1 MPIF-1 G-CSF solos. De esta manera como se indica en la Figura 28, parece que MPIF-1 y G-CSF pueden ejercer efectos aditivos cuando se co-administran. Como se indicó anteriormente, la recuperación a nivel de médula ósea se verificó por- el método de FACS Vantage y ensayo clonogénico. Resultados obtenidos con FACS se ilustran en la Figura 29. Como se espera, el nivel de población doble positiva Gra.l y Mac.l de células en médulas tratadas con 5-Fu (Grupo 2), permaneció notablemente oprimido de los días 6 a 14 y luego se recuperó al nivel normal el día 16. Este efecto de agotamiento mediado de 5-Fu de células doble positivas Gra .1 y Mac .1 fue completamente abrogado cuando los ratones se trataron con MPIF-1 antes de 5-Fu (Grupo 3) . Sorprendentemente, G-CSF (Grupo 4) fue capaz de evitar el agotamiento de las células doble positivas Gra.l y Mac.l en respuesta a la primer dosis 5-Fu, pero no el segundo. Esto es probable debido a la disponibilidad de células objetivo G-CSF y la sincronización de administración de G-CSF. Una respuesta similar fue evidente en ratones tratados con MPIF- más G-CSF (Grupo 5) , aunque la proporción de recuperación del día 8 posterior al primer 5-Fu fue muy superior que la observada en ratones tratados con cualquiera de MPIF-1 MPIF-1 G-CSF solo. Datos de ensayos clonogénicos se presentan en la Figura 30. La frecuencia de progenitores en la médula ósea permaneció deprimida en respuesta a 5-Fu a través de los catorce días del periodo experimental con un indicio de recuperación del día 16. Esta reducción en la frecuencia de los progenitores fue abrogada en ratones que se trataron con MPIF-1 antes de 5-Fu. En contraste, el tratamiento G-CSF de ratone's no fue efectivo para sostener la frecuencia de progenitores que se encuentran ya sea en médulas normales o tratadas con MPIF-1. El efecto de administrar G-CSF más MPIF-1 en la frecuencia progenitura en la médula ósea puede ser complejo.

Resumen de Tablas de Farmacología Preclínica Las siguientes tablas (Tablas 2, 3 y 4) resumen los estudios farmacológicos de análisis secundarios in vi tro e in vivo . Tabla Clave para Lotes Referidos en las Tablas 2, 3 , y 4 . Los lotes MPIF-1 se designan por un código de múltiples componentes que indica el organismo en que fue expresada la proteína y la forma del producto expresado (por ejemplo maduro, de longitud completa o una variante) . Letras después de un guión al final de la designación indican ya sea el organismo en el que se expresó la proteína o el vector empleado para expresión (es decir B=baculovirus, células C=CHO, E=E. coli) . Los últimos tres dígitos que preceden al guión indican la forma variante de la proteína expresada (es decir, 300= MPIF-1 de longitud íntegra, 301= la variante 17 de MPIF-1, 302= MPIF-1 maduro con un residuo metionina agregado al extremo amina de la secuencia amino ácido, 304= la variante 23 de MPIF-1, 311= MPIF-1 de longitud íntegra) . De esta manera, la designación del lote indica la forma de la proteína MPIF-1 expresada, ya sea que la proteína se secrete de la célula huésped, y la forma de la proteína secretada, de haber. Por ejemplo, indica que la proteína MPIF-1 de longitud íntegra se expresa utilizando un vector baculovirus. Además, ya que MPIF-1 estaba utilizando este sistema se procesa por las células huésped de insecto, la forma secretada de esta proteína es MPIF-1 maduro. Una excepción a la nomenclatura anteriormente anotada ocurre con el lote HG00300-B7. Este lote contiene una mezcla de cuatro diferentes polipéptidos MPIF-1. Los inventores creen que estos polipéptidos se produjeron como un resultado de escisión proteolítica de MPIF-1 que ocurre durante el proceso de purificación. Las variantes de MPIF-1 presentes en el lote HG00300-B7 se discuten en el Ejemplo 11. Tabla 2 Farmacología Primaria - In Vi tro Tabla 2 Farmacología Primaria - In Vi tro (continúa) Tabla 3 Farmacología Primaria - In Vivo Tabla 3. Farmacología Primaria - .In Vivo (continúa) Tabla 4. Farmacología Secundaria - In Vitro Tabla 4. Farmacología Secundaria - Jp Vltro (continúa) Ej mplo 14 Producción, Recuperación y Purificación de MPIF-1 23 Utilizando el Vector de Expresión pHE4 -5 MPIF-1 es una quimosina humana novedosa. La forma madura de MPIF-1 se secreta como un péptido de 99 amino ácidos con una masa a molecular de 11.2 kDa. Una forma truncada (MPIF-1 23) de 76 -amino ácidos de longitud también se identificó durante los estudios de expresión inicial MPIF-1. En un sistema de expresión de baculovirus, MPIF-1 23 se aisló y subclonó subsecuentemente. Ensayos biológicos indican que la forma truncada es más activa que la 'contraparte de longitud íntegra. Clonación y Expresión El gen MPIF-1 23 originalmente aislado de una biblioteca de ácido deoxiribonucleico complementaria endotelial aórtica se ha sub-clonado en el vector de expresión pHE4 en los sitios de escisión Ndel y Asp 718 de enzima de restricción sencilla (Figura 31) y se ha transformado en la cepa E. coli derivada de K12 SG 13009 (disponible de Susan Gottesman, National Institutes of Health, Bethesda, MD . ) . cepas adicionales de E. coli pueden servir como huéspedes convenientes para expresión de proteínas utilizando pHE4 incluyen las cepas DH5 y 3110 (ATCC Acceso No. 27325) . El vector pHE4 contiene un fuerte promotor sintético con dos operadores lac. La expresión de este promotor se regula por la presencia de un represor lac, y se induce utilizando isopropíl-D-tiogalactopiranosida (IPTG) o lactosa. El plásmido también contiene un sitio de enlace ribosomal eficiente y un terminador de transcripción sintético del gen MPIF-1 23. El vector también contiene la región de replicación de los plásmidos pUC y el gen neomicinfosfotransferasa resultando en resistencia a cara icina en bacterias transformadas. Método de Fabricación Resumen de Proceso de Fermentación . El proceso de fermentación para MPIF-1 23 se perfila en las siguientes etapas y se ilustra en la Figura 32. Banco de Siembra Maestro . Un banco de células maestras (MCB) de E. coli transformadas con el plásmido que expresa MPIF-1 23 se prepara bajo las actuales buenas prácticas de fabricación, el banco se prepara en medio que contiene glicerol como crioconservador, y congela a -80° C. Después de preparación, el MCB se prueba para asegurar la ausencia de fago o contaminación con otros micro-organismos . Primera Etapa de Siembra . El cultivo de primer etapa de siembra se separa en un matraz de agitación con deflector que contiene medios de preparación inocuos . El matraz de agitación se inocula a dilución l-:2000 con material de siembra descongelado y se coloca en un agitador mantenido a 225 rpm y 37°C por 12 horas. ' Fase de Producción . El cultivo de fase de producción se prepara en un fermentador de lotes de alimentación de 100 litros equipados con D02, pH, temperatura y control de alimentación de nutrientes. Primer medio de producción (37°C) se inocula con cultivo de primer etapa de siembra para proporcionar una densidad óptica (OD) de 0.20 unidad por mililitro a 600 nm. Cuando el cultivo alcanza un OD de 10 más o menos 2 unidades por mililitro a 600 nm, se induce la expresión de proteína con la adición de IPTG (concentración final de 20 mM) . Se cosechan células 4 horas después de inducción. Fase de Cosecha de Células . Se recuperan bacterias por centrifugación a 18,000 g utilizando una centrífuga de flujo continua. ^ La pasta de células resultante se almacena a -80° C. Recuperación de MPIF-1 23 La recuperación de MPIF-1 23 se establece en la Figura 33. Lisis Celular . La pasta de células E. coli se descongela y resuspende en diez volúmenes amortiguador de resuspensión. Las células luego se rompen siguiendo su pasaje (dos veces) a través de homogeneizador a 492.1 kg/cm3 (7000 psi) . Lavado de Cuerpo de Inclusión . Se agrega NaCl al lisado de células a una concentración final de 0.5 M y luego concentra dos veces por filtración de flujo tangencial utilizando la membrana de 0.45-m. El retenido restante se diafiltra contra tres volúmenes de amortiguador de lavado -2 (Tris-HCl, NaCl 500 mM, y EDTA-Na^ 25 mM) , seguido por lavado de un volumen uno (Tris-HCl 100 mM, EDTA-Na„ 25 mM) . El retenido se diluye dos veces con amortiguador de lavado- 1 y la fracción insoluble se recolecta por centrifugación continua. En forma alterna, pueden lavarse cuerpos de inclusión por centrifugación. Solubilización de Cuerpo de Inclusión . La pastilla resultante que se obtiene después de centrifugación se suspende en un equivalente de nueve volúmenes de cuerpo de inclusión empacados de amortiguador de solubilización (Tris-HCl 100 mM, Guanidine-HCl 1.75 M, y EDTA-Na2 25 mM) . La suspensión se agita inicialmente por 2 a 4 horas a temperatura ambiente, y luego por 12 a 18 horas de 2 ° a 10 °C. Replegado . La suspensión se centrifuga y el sobrenadante se recolecta y mezcla con nueve volúmenes de amortiguador de replegado (Acetato de sodio IDO mM, NaCl 125 mM, EDTA-Na^ 2 mM) . El material diluido se mantiene por aproximadamente dos horas (2 ° a 10°C) para permitir que sedimente el precipitado. El material se filtra y luego puede procesarse inmediatamente o almacenarse por hasta 72 horas y luego procesarse. Puri f i cae i ón Cromatografía de Intercambio de Cationes InHS-50 . La ,purificación de MPIF-1 23 se establece en la Figura 34. El filtrado se carga en una columna HS-50 POROS equilibrada con NaOAc 50 mM, NaCl 150 mM, pH 5.8 a 6.2. La proteína se eluye en una forma por etapas con NaCl (300 a 1500 mM) . Las fracciones se eluyen con NaCl 500 mM y recolectan y diluyen dos veces con agua para inyección . Croma togra fía de In t ercambi o de Cationes/Aniones HQ-50/CM-20 . Las fracciones recolectadas que se obtienen después de cromatografía HS-50 se cargan en un conjunto en tándem de columnas (columna HQ-50 seguido por columna CM-20) equilibrado con amortiguador CM-1. MPIF-1 23 se eluye de la columna CM-20 con NaCl (100 a 900 mM) . Las fracciones eluídas se analizan por electroforésis en gel de poliacrilamida-dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE) y cromatografía líquida durante desempeño en fase inversa HPLC) , estas fracciones que contienen MPIF-1 23 se recolectan y concentran por ultrafiltración o pasan a través de una columna HS-50 adicional . Cromatografía con Exclusión de Tamaño . El eluato CM-20 se carga en un aparato Sephacryl -100 HR equilibrado con amortiguador S-100. Se recolectaron fracciones analizan por SDS-PAGE y PLC de fase inversa. Fracciones que contienen MPIF-1 23 se recolectan, filtran estéril utilizando un filtro 0.2 m y almacenan de 2 ° a 10°C. Especificaciones para Subs tancia a Granel Las siguientes especificaciones, enlistadas en la Tabla 5, se han establecido para MPIF-1 23 a granel. Tabla 5: Pruebas y Especificaciones, Tentativas para Liberación de MPIF-1 23 a Granel 6D1 * La pureza de las preparaciones MPIF-123 se compara con una referencia estándar, les especificaciones para las cuales actualmente se definen. Especificaciones para Producto de Droga El producto de droga terminado cumple con todas las especificaciones como se describe para la substancia a granel en la Tabla 5 y también se prueba por esterilidad (21CRF610.12) . Ejemplo 15 Inhibición Mediada por MPIF-1 23 de Formación de Colonias se Correlaciona con la capacidad de MPIF-1 para Movilizar Ca2+ Intracelular en Monocitos MPIF-1 23 inhibe la formación de colonias LPP-CFC en ensayos de agar suave in vi tro e induce movilización de calcio intracelular en monocitos incluyendo células THP- 1 Clínea celular mielomonocítica humana) . Ambos ensayos se han empleado para estimar actividad biológica de MPIF-1 23 en estudios de purificación y estabilidad. En el ensayo LPP-CFC, células de médula ósea murina recientemente aisladas se revisten en agar suave en la presencia de múltiples cítoquinas (5 ng/mL IL-3, 50 ng/mL SCF, 5 ng/mL M-CSF, y 10 ng/mL IL-1 ) . Se incuban cultivos por 14 días después de lo cuyo tiempo, se marcan colonias utilizando un microscopio Ensayos de movilización de calcio utilizan monocitos humanos recientemente aislados o células THP-1 cargadas con Fura-2 (0.2 nM por millón) . Cuando se estimulan células con MPIF-1 23; se estima movilización de Ca2* por un fluorímetro. El ensayo de movilización Ca2+ proporciona un indicador , rápido respecto a la actividad de la preparación MPIF-1 23 (Tabla 6) . Tabla 6: Inhibición Mediada por MPIF-1 23 de Formación de Colonias se Correlaciona con la Capacidad de MPIF-1 para Movilizar Ca2+ Intracelular en Monocitos * Concentración mínima requerida para movilizar calcio en monocitos humanos y/o células THP-1. 10 t Concentración que produce 50% de inhibición de • formación de colonias LPP-CFC en comparación con el contro] Formulación y Almacenamiento MPIF-1 23 a granel se fabrica asépticamente, y 15 la formulación líquida es un producto estéril de un solo uso. La proteína se amortigua en acetato de sodio en 50 mM, NaCl 125 mM, pH 5.8, llena en ampolletas "de vidrio • de tipo Wheaton Type 1 de 5 mL y almacena de 2 ° a 8°C. Estabilidad 20 El estudio de estabilidad se realiza utilizando una concentración de proteína de 1.0 mgimL amortiguado con acetato de sodio a pH 5, 6, y 7 a temperaturas de -80°C, 2° a 8°C, 20° a 25°C, y 2° a 8°C. MPIF-1 23 se ha encontrado que es estable por al menos 6 meses cuando se almacena "en o inferior a 2 ° a • 8°C en una solución de acetato de sodio 10 mM, NaCl 125 mM a pH 5 a 7. En estudios actualmente en proceso, se ensayarán muestras por apariencia, a concentración de proteína, pureza (SDS-PAGE (reducido y no reducido) ; HPLC con exclusión de tamaño y fase inversa) , y actividad (bioensayo de movilización Ca2+) para cumplir con las especificaciones previamente establecidas. Un estudio de estabilidad para el lote MPIF-1 23 (HG00304-E10) empleado eh los estudios toxicológicos preclínicos, se inició. El lote de MPIF-1 23 empleado en sus estudios se formula a una concentración de proteína de 4.0 mg/mL en NaOAc 50 mM, NaCl 125 mM, pH 5.9. Las condiciones de almacenamiento son -80°C, 2 ° a 8°C, 25°C, y 37°C, a humedad relativa de 60%, y a 45°C, a humedad relativa de 75%. La duración de estudio de estabilidad es 12 meses para temperaturas hasta de 25°C, 6 meses a 37°C, y 1 mes a 45 °C. La estabilidad se ensayará por apariencia, pH, concentración- de proteína, pureza (SDS-PAGE (reducido y no reducido) ) / HPLC de fase inversa y exclusión de tamaño) , y actividad (bioensayo de movilización Ca+) pruebas de biocarga y ensayo de endotoxina se realizarán en puntos en tiempos selectos. Ej empl o 16 MPIF-1 Protege el Tracto Gastrointes tinal contra Ci totoxicidad Inducida por Taxol Administración simultánea de 0.3 mg/kg de MPIF-1 23 (subcutánea) los días 0, 1 y 2 con 10.5 mg/kg de ratas protegidas con Taxol (intraperitoneal) contra pérdida de peso asociada con toxicidad intestinal . Ratas tratadas con 0.3 mg/kg MPIF-1 23, mantienen el peso en los días 0, 5 y de hecho ganaron peso al día 9. Ratas que reciben 0.1 mg/kg MPIF-1 23 o nada de MPIF-1 23 perdieron aproximadamente 45 gramos de peso entre los días 0 y 5. Paclitaxol (TaxolMR) y MPIF-1 23 ambos se administraron los días 0, 1 y 2, como con anterioridad. Los pesos individuales de las ratas en. todos los grupos en día -2 (es decir, dos días antes de la primer administración de paclitaxol y MPIF-1) fue aproximadamente 185 g. Al día 5, individuos en dos grupos de prueba (aquellos que reciben paclitaxol y cualquiera sin MPIF 23 o 0.1 mg/kg de MPIF 23) pesaban aproximadamente 155 g. En contraste, individuos que reciben 0.3 mg/kg de MPIF 23 pesaban aproximadamente 175 g. Individuos en el grupo de control (ratas que no reciben paclitaxol MPIF 23) alcanzaron pesos de aproximadamente* 195 g al día 5. La capacidad de MPIF-1 para proteger animales contra los efectos de toxicidad aguda de paclitaxol, demuestra su capacidad por proteger muchos tipos de células tales como células del tracto gastrointestinal, además de células de tallo hematopoyéticas contra agentes citotóxicos. Ej empl o 17 Modelo Sub-Letal de Protección Gastrointestinal Ratones hembra C57B1/6 (de 12 semanas de edad) se expusieron a un total de 9 Gy de irradiación sub-letal 137Cesio (velocidad de dosis: 25.54 cGy/min) suministrado en dos dosis iguales de 4.5 Gy 4 horas espaciadas el día 0. A un grupo de ratones designados "MPIF-1 (Pre)" se les suministró MPIF-1 (lmg/kg/BID i.p.) Por cuatro días consecutivos (día -2 a día +1) . Un grupo designado "MPIF-1 (Post)" se le dio MPIF-1 (lmg/kg/BID i.p) por siete días consecutivos empezando un día posterior a irradiación (día 1) . Un grupo de control recibió solo diluyente (HBSS + suero de ratón normal al 0.1 %) . Todos los ratones se pusieron- en agua acidificada quince días antes de irradiación. Tres días antes de irradiación, se agregó Amoxicilina al agua acidificada (0.5 mg/ml) y continuó diariamente al día 7 posterior a irradiación.

Los ratones se monitorean por supervivencia, condición y cambio de peso. Los datos se muestran como el cambio porcentual en peso por cada grupo con base en el peso de cada ratón individual el día indicado como un porcentaje de peso al inicio del experimento. (Ver Figuras 37 y 38) . La capacidad de MPIF-1 para proteger animales contra efectos de toxicidad aguda de radiación demuestra su capacidad por proteger muchos tipos de células tales como células del tracto gastrointestinal, además de células de tallo hematopoyéticas, contra agentes citotóxicos . Ej empl o 18 Modelo Sub-Letal de Protección Gastrointestinal Ratones hembra C57B1/6 (12 semanas de edad) se expusieron a un total de irradiación letal de 11 Gy de 137Cesio (velocidad de dosis: 25.54 cGy/min irradiación sub-letal 117Cesio (velocidad de dosis: 25.54 cGy/min) suministrado en dos dosis iguales de 5.5 Gy 4 horas espaciadas el día 0. A un grupo de ratones designados "MPIF-1 (Pre)" se les suministró MPIF-1 (lmg/kg/BID i.p.) Por cuatro días consecutivos (día -2 a día +1) . A un grupo designado "MPIF-1 (Post)." se le da MPIF-1 (1 mg/kg/BID i.p) por siete días consecutivos empezando un día posterior a irradiación (día 1) . Un grupo de control recibió solo diluyente (HBSS + suero de ratón normal 0.1%) . Todos los ratones se pusieron en agua acidificada quince días antes de irradiación. ' Tres días antes de irradiación, se agregó Amoxicilina al agua acidificada (0.5mg/ml) y continuó diariamente al día 7 posterior a irradiación. Los ratones se monitorean por supervivencia, condición y cambio de peso. Los datos se muestran como el cambio porcentual en peso por cada grupo con base en. el peso de cada ratón individual el día indicado como un porcentaje de peso al inicio del experimento. (Ver figuras 39 y 40.) Todos los grupos de control (que no reciben un MPIF-1) murieron al día 20 posterior _a irradiación. En contraste, 25% del grupo MPIF-1 (Post") y 57% del grupo MPIF-1 (Pre) sobrevivieron al día 38 posterior a irradiación. La capacidad de MPIF-1 en proteger animales contra radiación letal demuestra su capacidad por proteger muchos tipos de células tales como células del tracto gastrointestinal contra agentes citotóxicos. Ejemplo 19 Métodos para Determinar Ci toprotección Un método para determinar la capacidad protectora relativa de MPIF-1 con un agente citotóxico particular es estimar el factor de reducción de dosis o factor de modificación de dosis (DMF) . (Weiss, Environ .

Heal th Perspectives 105: 1473-1478 (1997).; Brown y colaboradores , Pharmacol . Ther. 39: 157-168 (1988); Yuhas et al . , Int . J. Radia t . Biol . 15:233-237 (1973); Weiss y colaboradores, en Radia tion and the In tes tinal Tract, (Radiación y el tracto intestinal) Dubois y colaboradores, eds., Boca Ratón, FL, CRC Press, pp. 183-199 (1995)) Por ejemplo, se irradian ratones en un rango de dosis con y sin MPIF-1. La protección del tracto gastrointestinal por MPIF-1 se mide por el DMF por 6 a 7 días de supervivencia después de irradiación de cuerpo entero a dosis comparativamente altas. El DMF para supervivencia de 30 días mide la protección MPIF-1 en el sistema hematopoyético. Ejemplo 20 Cons trucción de Mu tantes de Eliminación N-Terminal y/o C -Terminal El siguiente enfoque general puede emplearse para clonar un mutante de eliminación MPIF-1 N-terminal o C-terminal. En general, dos cebadores oligonucleótido de aproximadamente 15 a 25 nucleótidos" se derivan de las posiciones 5' y 3' de un polinucleótido de ID de SEC NO.: 1 o 6. Las posiciones 5' y 31 de los cebadores se determinan con base en el fragmento polinucleótido MPIF-1 deseado. Codones de inicio y parada se agregan a los cebadores 5' y 3' respectivamente, de ser necesario, para expresar el fragmento polipéptido MPIF-1 codificado por el fragmento polinucleótido. Fragmentos polinucleótido MPIF-l preferidos son aquellos que codifican los mutantes de eliminación N-terminal y C-terminal descritos anteriormente en la sección "polipeptidos MPIF-1" de la especificación. Nucleótidos adicionales que contienen sitios de restricción para facilitar clonación del fragmento polipéptido MPIF-1 en un vector deseado también pueden agregarse a las secuencias de cebador 5 ' y 3 ' . El fragmento polinucleótido MPIF-1 se amplifica de .ADN genómico o del clon ADNc depositado utilizando los cebadores oligonucleótidos PCR en condiciones apropiadas discutidas aquí o conocidas en la técnica. Los fragmentos de polipéptido MPIF-1 codificados por los fragmentos polinucleótido MPIF-1 de la presente invención pueden ser expresados y purificados en la misma forma general que los polipéptidos de longitud íntegra, aunque pueden ser necesarias modificaciones rutinarias debido a la diferencia en propiedades físicas y químicas entre un fragmento particular y un polipéptido de longitud completa .

Como un medio para ejemplificar pero no limitar la presente invención, el polinucleótido que codifica el fragmento de polipéptido MPIF-1 R-46 a N-120 se amplifica y clona como sigue: un cebador 5' se entenderá que comprende un sitio de enzima de restricción seguido por un codón de inicio en cuadro con la secuencia de polinucleótido que codifica la porción N-terminal del fragmento polipéptido que empieza con R-46. Un cebador 3 ' complementario se genera que comprende un sitio de enzima de restricción seguido por un codón de parada en cuadro con la secuencia polinucleótido que codifica la porción C-terminal del fragmento polipéptido MPIF-1 que termina con N-120. El fragmento polinucleótido amplificado y el vector .de expresión se digieren con enzimas de restricción que reconocen los sitios en los cebadores. Los polinucleótidos digeridos luego se ligan en conjunto. El fragmento polinucleótido MPIF-1 se inserta en el vector de expresión restringido, de preferencia en una forma que coloca a la región de codificación de fragmento polipéptido MPIF-1 corriente abajo del promotor. La mezcla de ligación se transforma en células E . coli competentes utilizando procedimientos estándar y como se describe en los ejemplos presentes. .ADN plásmido se aisla de colonias resistentes y la identidad del ADN clonado se confirma por análisis de restricción, secuenciado de ADN y PCR. Ej emplo 21 Proteínas de Fusión de MPIF-1 Polipéptidos MPIF-1 de preferencia se fusionan a otras proteínas. Estas proteínas de* fusión pueden utilizarse para una variedad de aplicaciones. Por ejemplo, fusión de polipéptidos MPIF-1 a His-tag, HA-tag, proteína A, dominios IgG, y proteínas de enlace maltosa facilita purificación. (Ver Ejemplo 5^ ver también EP A 394,827; Traunecker, y colaboradores, Na ture 331:84-86 (1988) .) Similarmente, la fusión a IgG-1, IgG-3, y albúmina incrementa la vida media, in vivo . Señales de localización nuclear fusionadas a polipéptidos MPIF-1 pueden hacer blanco a la proteína en un sitio subcelular específico, mientras que heterodímeros u homodímeros covalentes pueden incrementar o disminuir la actividad de una proteína de fusión. Proteínas de fusión también pueden crear moléculas quiméricas que tienen más de una función. Finalmente, proteínas de fusión puede incrementar la solubilidad y/o estabilidad de la proteína fusionada en comparación con la proteína no fusionada. Todos los tipos de proteína de fusión anteriormente descritos pueden elaborarse al modificar el siguiente protocolo, que establece la fusión de un polipéptido a una molécula IgG, por el protocolo descrito en el Ejemplo 2. Brevemente, la porción Fc humano de la molécula IgG puede ser amplificada por PCR utilizando cebadores que extienden los extremos 5 ' y 3 ' de la secuencia descrita a continuación. Estos cebadores deberán tener sitios de enzima de restricción convenientes que faciliten la clonación en un vector de expresión, de preferencia un vector de expresión mamífero. Por ejemplo, si pC4 (No. de Acceso 209646) se emplea, la porción Fc humano puede ligarse en el sitio de clonación BamHl. Hay que notar que el sitio 3' BamHl deberá destruirse. A continuación, el vector que contiene la porción FC humano se vuelve a restringir con BamHl, linearizando el vector, y el polinucleótido MPIF-l, aislado por el protocolo PCR descrito en el ejemplo 1, se liga en este sitio BamHl. Hay que notar que el polinucleótido se clona sin un codón de parada, de otra forma no se producirá una proteína de fusión. Si la secuencia de señal de origen natural se emplea para producir la proteína secretada, pC4 no requiere un segundo péptido de señal. En forma alterna, si la secuencia de señal de origen natural se emplea, el vector puede modificarse para incluir una secuencia de señal heterologa (ver por ejemplo, WO 96/34891.) Región IgG Fc humano: GGGATCCGGAGCCCAAATCTTCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCC AGCACCTGAATTCGAGGGTGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCC AAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACTCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGG ACGTAAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGT GGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTA CCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGA GTACAAGTGCAAGGTCTCCAAC?AAGCCCTCCCAACCCCCATCGAGAAAACCAT CTCCAAAGCC?AAGGGCAGCCCCGAGAACC?CAGGTGTAC?CCCTGCCCCCATC CCGGGATGAGCTGACCAAGA?CCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTT CTATCCAAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAA CTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAG CAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTC CGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTC TCCGGGTAAATGAGTGCGACGGCCGCGACTCTAGAGGAT (ID de SEC NO. : 42) . Adicionalmente, uno o más componentes, motivos, secciones, partes, dominios, fragmentos, etc., de MPIF-1 pueden recombinarse con uno o más componentes, motivos, secciones, partes, dominios, fragmentos, etc de uno o más moléculas heterólogas. En modalidades preferidas, las moléculas heterólogas son miembros de la familia quimosina. En modalidades preferidas adicionales, la molécula heteróloga es un factor de crecimiento tal como por" ejemplo el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PGDF = platelet-derived growth factor) , factor de crecimiento tipo insulina (IGFI = ínsulin-like growth factor) , factor de crecimiento de transformación (TGF = transforming growth factor) -alfa, factor de crecimiento epidérmico (EGF = epidermal growth factor) , factor de crecimiento de fibroblastos (FGS = fibroblast growth factor) , TGF-beta, proteína morfogenética de hueso (BMP =bone morphogenetic protein) -2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, activinas A y B, decapentaplégico (dpp), 60A, OP-2, dorsalina, factor de diferenciación de crecimiento (GDFs = growth differentiation factors), nodal, MIS, inhibina-alfa, TGF-betal, TGF-beta2, TGF-beta3, TGF-beta5, y factor neurotrófico derivado glial (GDNF =glial -derived neurotrophic factor) . Ej mplo 22 Producción de un Anticuerpo Tecnología de Hibridoma Los anticuerpos de la presente invención pueden prepararse por una variedad de -métodos. (Ver, Current Protocols, (Protocolos Actuales) Capítulo 2.) . Como un ejemplo de estos métodos, células que expresan MPIF-1 se administran a un animal para inducir la producción de suero que contiene anticuerpos policlonales . En un método preferido, una preparación de proteína MPIF-1 se prepara y purifica para hacerla substancialmente libre de contaminantes naturales. Esta preparación luego se introduce en un animal a fin de producir anti suero policlonal de mayor actividad específica. En el método más preferido, los anticuerpos de la presente invención son anticuerpos monoclonales (o fragmentos de unión de proteína de los mismos) . Estos anticuerpos monoclonales pueden prepararse utilizando tecnología de hibridoma (Kohler y colaboradores , Na ture 256:495 C1975) : Kohler y colaboradores, Eur . J. Immunol . 6:511 (1976: Kohler y colaboradores, Eur J. Immunol . 6:29= (1976); Hammerling y colaboradores, in: Monoclonal Antibodies and T- Cell Hybridomas , (Anticuerpos Monoclonales e Hibridomas de Células T) Elsevier, N.Y., pp . 563-681 (1981) . ) En general, estos procedimientos involucran inmunizar un animal, (de preferencia un ratón) con polipéptido MPIF-1 o más preferiblemente, con una célula que expresa polipéptido MPIF-1 secretada. Estas células puede cultivarse en cualquier medio de cultivo de tejido conveniente; sin embargo, es preferible cultivar células en medio de Earle modificado con Eagle suplementado con suero bovino fetal al 10% (inactivado a aproximadamente 56°C), y suplementado con aproximadamente 10 g/1 de amino ácidos no esenciales, aproximadamente 1,000 U/ml de penicilina, y aproximadamente 100 ug/ml de estreptomicina. Los esplenocitos de estos ratones se extraen y fusionan con una línea celular de mieloma conveniente. Cualquier línea celular de mieloma conveniente pueden emplearse de acuerdo con la presente invención; sin embargo, es preferible emplear la línea celular de mieloma principal (SP20) disponible de la ATCP . Después de fusión, las células de mieloma resultantes se mantienen selectivamente en medio HAT, y luego clonan por dilución limitante como se describe por Wands y colaboradores. (Gastroenterology (Gastroenterología) 80:225-232 (1981) .) Las células de hibridoma obtenidas a través de esta selección, luego se ensayan para identificar clones que secretan anticuerpos capaces de ligar el polipéptido MPIF-1. En forma alterna, .anticuerpos adicionales capaces de ligar al polipéptido MPIF-1 puede producirse en un procedimiento de dos etapas utilizando anticuerpos anti- idiotípicos . Este método hace uso del hecho de que los anticuerpos en sí sean antígenos y por lo tanto es posible obtener un anticuerpo que liga a un segundo anticuerpo. De acuerdo con este método, anticuerpos específicos de proteínas se utilizan para inmunizar un animal, de preferencia un ratón. Los esplenocitos de este animal luego se utilizan para producir células de hibridoma, y las células de hibridoma se monitorean para identificar clones que producen un anticuerpo cuya capacidad para ligar al anticuerpo específico de proteína MPIF-1 puede ser bloqueado por MPIF-1. Estos anticuerpos comprenden anticuerpos anti -idiotípicos ' al anticuerpo específico de proteína MPIF-1 y pueden utilizarse para inmunizar un animal para inducir formación de adicionales anticuerpos específicos de proteína MPIF-1. Será aparente que Fab y F(ab'), y otros fragmentos de los anticuerpos de la presente invención pueden utilizarse de acuerdo con los métodos aquí descritos. Estos fragmentos típicamente se producen por escisión proteolítica, utilizando _ enzimas tales como papaína (para producir fragmentos Fab) ó pepsina (para producir fragmentos F(ab')¿) . En forma alterna, fragmentos de unión de proteína MPIF-1 secretados pueden producirse a través de la aplicación de tecnología de .ADN a través de química sintética. Para uso in vivo de anticuerpos en humanos, puede ser preferible el utilizar anticuerpos monoclonales quiméricos "humanizados". Estos anticuerpos pueden producirse utilizando construcciones genéticas derivadas de células de hibridoma que producen los anticuerpos monoclonales anteriormente descritos. , Métodos para producir anticuerpos quiméricos se conocen en la especialidad. (Ver revisión, Morrison, Science 229: 1202 (1985); Oi y colaboradores, BioTechniques 4:214 (1986); Cabilly y colaboradores . , Patente de los E.U.A. No. 4,816,567; Taniguchi y colaboradores, EP 171496; Morrison y colaboradores, EP 173494; Neuberger y colaboradores, WO 8601533; Robinson y colaboradores, WO 8702671; Boulianne y colaboradores, 'Na ture 312:643 (1984); Neuberger y colaboradores, Na ture 314:268 (1985) .) Aislamiento de Fragmentos de Anticuerpo Dirigidos Contra MPIF-1 De una Biblioteca de ScFvs . Genes V de origen natural aislados de PBLs humanos se construyen en una gran biblioteca de fragmentos de anticuerpo que contienen reactividades contra MPIF-1 al cual el donador puede o no haber sido expuesto (ver por ejemplo, Patente de los E.U.A. No. 5,885,793 incorporada aquí completamente por referencia). Rescate de la Biblioteca . Una biblioteca de scFvs se construye a partir de .ARN de PBLs de humano como se describe en WO92/01047. Para rescatar fragmentos de anticuerpo que exhiben fago, aproximadamente 10q E. coli que alojan el fagémido, se emplean para inocular 50 ml de 2xTY que contiene glucosa al 1% y 100 ug/ml de ampicilina (2xTY-iMP-GLU) y desarrollan a un O.D. de 0.8 con agitación. Cinco ml de este cultivo se utilizan para inocular 50 ml de 2xTY-.?MP-GLU, 2 x 108 TU de auxiliar delta gen 3 (M13 delta gene III, ver W092/01047) se agregan y el cultivo se incuba a 37 grados C por 45 minutos sin agitación y luego a 37 grados C por 45 minutos con agitación. El cultivo se centrífuga a 4000 r.p.m. por 10 minutos y la pastilla de centrifugación se resuspende en 2 litros de 2xTY que contiene 100 ug/ml de ampicilina y 50 ug/ml de canamicina y desarrollan durante la noche. Fagos se prepan como se describe en WO92/01047. M13 delta gen III se prepara como sigue: fago auxiliar M13 delta III no codifica la proteína de gen III por lo tanto ,los fragmentos de anticuerpo que exhiben el fago (mido) tienen mayor avidez de unión al antígeno. Partículas infecciosas M13 delta gen III se elaboran al desarrollar el fago auxiliar en células que alojan un derivado pUC 19 que suministra la proteína gen III tipo silvestre durante morfogénesis de fago. El cultivo se incuba por una hora 37 grados C sin agitación y luego por una hora más a 37 grados C con agitación. Las células se centrífuga (IEC-Centra 8, 4000 revs/min por 10 minutos), resuspenden en 300 ml de caldo 2xTY que contiene 100 ug de ampicilina/ml y 25 ug de canamicina/ml (2xTY-AMP-KAN) y desarrolla durante la noche, agitando a 37°C. Partículas de fago se purifican y concentran del medio de cultivo por dos precipitaciones PEG (Sambrook y colaboradores , 1990) , resuspenden en 2 ml de PBS y pasan a través de un filtro de 0.45 um , (Minisart NML; Sartorius) para dar una concentración final de aproximadamente 101" unidades de transducción de unidades/ml (clones de resistencia a ampicilina) . Toma panorámica de la biblioteca . Se revisten durante la noche inmunotubos (Nunc) en PBS con 4 ml ya sea de 100 ug/ml o 10 ug/ml de un polipéptido de la presente invención. Se bloquean tubos con Marvel-PBS al 2% por 2 horas a 37 grados C y luego lavan tres veces en PBS. Aproximadamente 10 TU de fago se aplican al tubo e incuban por 30 minutos a temperatura ambiente, tamboreando sobre y por debajo de un agitador ondulatorio y luego se deja reposar por otras 1.5 horas. Los tubos se lavan 10 veces con PBS Tween-20 al 0.1% y 10 veces con PBS. Se eluye fago al agregar 1 ml de trietilamina 100 mM y hace girar 15 minutos en un agitador ondulatorio despuésr de lo cual la solución se neutraliza inmediatamente con 0.5 ml de Tris-HCl 1.0M, pH 7.4. Luego se emplea fago para infectar 10 ml de TG1 E. coli TG1 mid-log, al incubar fago eluido con bacterias por 30 minutos a 37 grados C. Los E. coli luego se revisten en placas TYE que contienen glucosa al 1% y 100 ug/ml de ampicilina. La biblioteca bacteriana resultante luego se rescata con fago auxiliar delta gen 3 como se describió anteriormente para preparar el fago para una vuelta subsecuente de selección. Este proceso luego se repite para un total de 4 vueltas de purificación de afinidad con lavado de tubo que se incrementa a 20 veces PBS, Tween-20 0.1% y 20 veces para las vueltas 3 4. Caracterización de Aglutinantes . Fago eluido de la tercer y cuarta vueltas de selección se utilizan para infectar E. coli a HB 2151 y scFv soluble se produce (Marks, y colaboradores, 1991) de colonias sencillas para ensayo. ELISAs se realizan con platos de microtitulación revestidas ya sea con 10 pg/ml de polipeptido de la presente invención en bicarbonato 50 mM, pH 9.6. Clones positivos en ELISA además se caracterizan por huellas dactilares de PCR (ver por ejemplo, WO 92/01047) y luego por secuenciado. Ejemplo 23 Método para Tratar Niveles Disminuidos de MPIF-1 La presente invención se refiere a un método para tratar a un individuo que requiere un nivel incrementado de un polipéptido tde la invención en el cuerpo, que comprende administrar al individuo, una composición que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un agonista de la invención (incluyendo polipéptidos de la invención) . Aún más, se apreciará que condiciones provocadas por un decremento en el nivel de expresión normal o estándar de MPIF-1 en un individuo, pueden tratarse al administrar MPIF-1, de preferencia en la forma secretada. De esta manera, la invención también proporciona un método de tratamiento de un individuo que requiere un nivel incrementado del polipéptido MPIF-1 que comprende administrar a este individuo, un agente terapéutico que comprende una cantidad de MPIF-1 para incrementar el nivel de actividad de MPIF-1 en este individuo . ~~ Por ejemplo, un paciente con niveles disminuidos de polipéptido MPIF-1 recibe una dosis diaria de 0.1-100 ug/kg del polipéptido por seis días consecutivos. De preferencia, el polipéptido está en la forma secretada. Los ^detalles exactos del esquema de dosificación, con base en la administración y formulación, se proporcionan en la presente sección "Composiciones Farmacéuticas".

Ejemplo 24 Método de Tratamiento de Niveles Incrementados de MPIF-1 La presente invención también se refiera a un método para tratar un individuo con necesidad de nivel disminuido de- un polipéptido de la invención en el cuerpo, que comprende administrar a este individuo una composición que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista de la invención (incluyendo polipéptidos y anticuerpos de la invención') . En un ejemplo, se utiliza tecnología antisentido al inhibir la producción de MPIF-1. Esta tecnología es un ejemplo de un método para disminuir niveles del polipéptido MPIF-1 con la presencia de la forma secretada, debido a una variedad de etiologías. Por ejemplo, a un paciente diagnosticado con niveles anormalmente incrementados de MPIF-1 se le administran intravenosamente polinucleótidos antisentido a 0.5, 1.0, 1.5, 2.0 y 3.0 mg/kg por día durante 21 días. Este tratamiento se repite después de un periodo de reposo de 7 días si el tratamiento fue bien tolerado. La formulación del polinucleótido antisentido se proporciona en la sección de "Composiciones Famacéuticas" presente. Ejemplo 25 Método de Tratamiento Utilizando Terapia de Gen-Ex Vivo Un método de terapia de genes, transplanta fibroblastos, que son capaces de expresar polipéptidos MPIF-1 en un paciente. En general, fibroblastos se obtienen de un sujeto por biopsia de la piel^ El tejido resultante se coloca en medio del cultivo de tejido y separa en pequeños trozos. Pequeños pedazos del tejido se colocan en una superficie húmeda de un matraz para cultivo de tejido, aproximadamente 10 pedazos se colocan en cada matraz. El matraz se voltea hacia abajo, sella hermético y deja a temperatura ambiente durante la noche. Después de 24 horas a temperatura ambiente, el matraz se invierte y los trozos de tejido quedan fijos al fondo del matraz y medio fresco (por ejemplo Ham's F12, con FBS al 10%, penicilina y estreptomicina) se agrega. Los matraces luego se incuban a 37 grados C por aproximadamente una semana. En este punto, se agrega medio fresco y subsecuentemente se cambia cada uno cuantos días". Después de dos. semanas adicionales en cultivo, emerge una monocapa de fibroblasto. La mono capa se tripsiniza y ajusta en escala en matraces más grandes . pMV-7 (Kirschmeier, P.T. y colaboradores, DNA 7:219-25 (1988)), flanqueado por las repeticiones terminales largas del virus sarcoma murino Moloney, se digiere con EcoRI y HindIII y subsecuentemente trata con fosfatasa intestinal de ternera. El vector lineal se fracciona en gel de agarosa y purifica, utilizando cuentas de vidrio. El ADNc que codifica MPIF-1 puede amplificarse utilizando cebadores PCR que corresponden a las secuencias 5 ' y 3 ' respectivamente como se establece en el Ejemplo 1. De preferencia, el cebador' 5' contiene un sitio EcoRI y el cebador 3' incluye un sitio HindIII. Cantidades iguales de la estructura principal del virus sarcoma murino Moloney y el fragmento amplificado EcoRI y HindIII se agregan en conjunto en la presencia de T4 .ADN ligasa. La mezcla resultante se mantiene bajo condiciones apropiadas para ligación de los dos fragmentos. La mezcla de ligación luego se utiliza para transformar bacterias HB101, que luego se revisten sobre y que contienen canamicina con el propósito de confirmar que el vector contiene MPIF-1 insertado adecuadamente. Las células de empaque pA317 o GP+aml 2 anfotrópicas se desarrollan en tejido de cultivo de densidad confluente en medio Eagle modificado con Dulbecco (DMEM) con suero de ternera al 10% (CS) , penicilinas y estreptomicinas. El vector MSV que contiene el gen MPIF-1 luego se agrega al medio y las células de empaque se transducen con el vector. Las células de empaque ahora producen -partículas virales infecciosas que contienen el gen MPIF-1 (las células empaque ahora se refieren como células productoras) . Medio fresco se agrega a las células productoras transducidas y subsecuentemente el medio se cosecha de una placa de 10 cm de células productoras confluentes. El medio agotado, que contiene las partículas virales infecciosas, se utiliza a través de un filtro millipore para retirar células productoras desprendidas y este medio luego se utiliza para infectar células de fibroblasto. Se retira el medio de-una placa sub-confluente de fibroblastos y rápidamente se reemplaza con el medio de las células productoras. Este medio se retira y reemplaza con medio fresco. Si el título de virus es elevado, entonces virtualmente todos los fibroblastos estarán infectados y no se requiere selección. Si el título es muy bajo, entonces es necesario utilizar un vector retroviral que tiene un marcador seleccionable, tal como neo o his. Una vez que los fibroblastos han sido eficientemente -infectados, los fibroblastos se analizan para determinar si se produce proteína MPIF-1. Los fibroblastos de ingeniería luego se transplantan en el huésped, ya sea solos o después de haber sido desarrollados confluencia en cuentas microportadoras cytodex 3.

Ej mplo 26 Terapia de Gen Utilizando Gen MPIF-1 Endógeno Otro método de terapia de gen de acuerdo con la presente invención involucra asociar en forma operativa la secuencia MPIF-1 endógena con un promotor mediante recombinación homologa como se describe, por ejemplo, en la Patente de los E.U.A. No. 5,641,670, otorgada en junio 24 de 1997; Publicación Internacional No. WO 96/29411, publicada en septiembre 26 de 1996; Publicación Internacional No. WO 94/12650, publicada en agosto 4 de 1994; Koller y colaboradores, Proc . Na ti .

Acad. Sci . USA 86:89328935 (1989); y Zijlstra y colaboradores, Na ture 342:435438 (1989). Este método involucra la activación de un gen que está presente en las células objetivo pero que no se expresa en las células, o se expresa a un nivel inferior al deseado. Construcciones de polinucleótidos se elaboran que contienen una secuencia de objetivo y promotor, que son homologas a la secuencia de no codificación 5 ' de MPIF-1 endógeno, flanqueando al promotor. La secuencia objetivo estará suficiente cerca del extremo 5' MPIF-1 de manera tal que el promotor se enlace operativamente con la secuencia endógena ente recombinación homologa. Las secuencias objetivo y promotor pueden amplificarse utilizando PCR. De preferencia, el promotor amplificado contiene sitios de enzima de restricción distintos en los extremos 5 ' y 3 ' . El extremo 3 ' de la primer secuencia objetivo contiene el mismo sitio de enzima de restricción que el extremo 51 de promotor amplificado y el extremo 5' de la segunda secuencia objetivo contiene el mismo sitio de restricción que el extremo. 3' del promotor amplificado . El promotor amplificado y las secuencias objetivo amplificadas se digieren con las enzimas de restricción apropiadas y subsecuentemente tratan con fosfatasa intestinal de ternera. El promotor digerido y las secuencias objetivo digeridas se agregan en conjunto en la presencia de ET4 ADN ligasa. La mezcla resultante se mantiene bajo condiciones apropiadas para ligación de los dos fragmentos . La construcción se fracciona en tamaño en un gel de agarosa luego purificado por extracción con fenol y precipitación de etanol . En este ejemplo, las construcciones de polinucleótido se administran como polinucleótidos desnudos por electroporacíón. Sin embargo, las construcciones polinucleótido también pueden administrarse con agentes que facilitan transfección tales como liposomas, secuencias virales, partículas virales, agentes de precipitación, etc. Estos métodos de suministro se conocen en la especialidad. Una vez que las células se transfectan, se llevará a cabo por recombínación homologa que resulta en que el promotor se enlace operativamente por la secuencia MPIF-1 endógena. Esto resulta en las expresiones MPIF-1 en las células. La expresión puede detectarse por tinción inmunológica o cualquier otro método conocido en la especialidad. Se obtienen fibroblastos de un sujeto con biopsia de piel. El tejido resultante se coloca en DMEM + de ternera fetal al 10%. Fibroblastos de fase estacionaria temprana o de crecimiento exponencial se tripsinízan y enjuagan de la superficie de plástico con medio nutriente. Una alícuota de la suspensión celular se retira para conteo, y las células restantes se someten a centrifugación. El sobrenadante se aspira y la pastilla de centrifugación se resuspende en 5 ml de amortiguador de electroporación (HEPES 20 mM pH 7.3, NaCl de 137 mM, Kcl de 5 mM, Na HP04 de 0.7 M, dextrosa 6 mM) . Las células se re-centrifugan, el sobrenadante se aspira, y las células se resuspenden en amortiguador de electroporación que contiene 1 mg/ml de albúmina y suero bovino acetilado. La suspensión celular final que contiene aproximadamente 3X10r células/ml La electroporación deberá realizarse inmediatamente después de resuspensión. ADN plásmido se prepara de acuerdo con las técnicas estándar. Por ejemplo, para construir un plásmido para hacer blanco al sitio MPIF-1, plásmido pUC18 (MBI Fermentas, Amherst, NYT se" digiere con HindlIX. " El promotor CMV se amplifica por PCR con un sitio Xbal en el extremo 5 ' y un sitio BamHl en el extremo 3'. Dos secuencias no codificantes MPIF-1 se amplifican por PCR: una secuencia no codificante MPIF-1 (fragmento 1 de MPIF-1) se amplifica con un sitio HindIII en el extremo 5' y un sitio Xba en el extremo 3'; la otra secuencia no codificante MPIF-1 (fragmento 2 de MPIF-1) se amplifica con un sitio BamHl en el extremo 5 ' y un sitio HindIII en el extremo 3' . El promotor CMV y los fragmentos MPIF-1 (1 y 2) se digieren con las enzimas apropiadas (promotor CMV - Xbal y BamHl; fragmento 1 de MPIF-1 - Xbal; fragmento 2 MPIF-1 - BamHl) y ligan unidos. El -producto de ligación resultante se digiere con HindIII, y liga con el plásmido pUC 18 digerido con HindIII. ADN plásmido se agrega a una cubeta estéril con espacio de electrodo de 0.4 cm (BioRad) . La concentración de .ADN final generalmente es al menos 120 µg/ml . Luego se agrega 0.5 ml de la suspensión celular (que contiene aproximadamente 1.5 X 10e células) luego se agregan a la cubeta y la suspensión celular y las soluciones de ADN se mezclan suavemente. Se realiza la electroporación con una aparato GenePulser (BioRad) .. Se establecen capacitancia y voltaje a 960 µF y 250-300 V, respectivamente. Conforma aumenta el voltaje, disminuye la supervivencia de células, pero el porcentaje de células supervivientes que incorporan en forma estable el .ADN introducido en su genoma, se incrementa dramáticamente. Dados estos parámetros, deberá observarse tiempo de pulso de aproximadamente 14-20 mSeg. Células electroporadas se mantienen a temperatura ambiente por aproximadamente 5 minutos, y los contenidos de la cubeta luego se retiran usualmente por una pipeta de transferencia estéril. Las células se agregan directamente a 10 ml de medio nutriente precalentado (DMEM con suero de ternera al 15%) en un plato de 10 cm e incuban a 37 grados C. Al día siguiente, el medio se aspira y reemplaza con 10 ml de medio fresco e incuba por 16 a 24 horas más. Los fibroblastos de ingeniería luego se inyectan en el huésped, ya sea solos o después de haber sido desarrollados a confluencia en cuentas microportadora cytodex 3. Los fibroblastos ahora producen el producto de proteína. Los fibroblastos luego pueden introducirse en el paciente como se describió con anterioridad . Ejemplo 27 Método de Tratamiento Utilizando Terapia de Genes - in ivo Otro aspecto de la presente invención es utilizar métodos de terapia de genes in vivo para tratar desordenes y enfermedades y condiciones. El método de terapia de gen se refiere a la introducción de secuencias MPIF-1 de ácido nucleico desnudo (.ADN, ARN, y ADN o ARN antisentido) en un animal, para incrementar o disminuir la expresión del polipéptido MPIF-1. El polinucleótido MPIF-1 puede enlazarse operativamente a un promotor o cualesquiera otros elementos genéticos necesarios para la expresión del polipéptido MPIF-1 por el tejido objetivo. Estas técnicas y métodos de terapia y suministro de genes se conocen en la técnica, ver por ejemplo WO90/11.092, W098/11779; Patentes de los E.U.A. Nos. 5693622, 5705151, 5580859; Tabata H. y colaboradores Cardiovasc . Res . 35(3) :470-479 (1997), Chao J y colaboradores . Pharmacol . Res . 35(6) :517-522 (1997), Wolff J.A., Neuromuscul . Disord. 7(5) :314-318 (1997), Schwartz B. y colaboradores . Gene Ther. 3(5) :405-411 (1996) , Tsurumi Y. y colaboradores . Circula tion 94 (12) :3281-3290 (1996) (incorporadas aquí por referencia) . Las construcciones de polinucleótidos MPIF-1 pueden suministrarse por cualquier método que proporcione materiales inyectables a las células de un animal, tales como .inyección en el espacio intersticial tejido (corazón, músculo, piel, pulmón, hígado, intestino y semejantes) . Las construcciones de polinucleótido MPIF-1 pueden administrarse en un portador acuoso o líquido farmacéuticamente aceptable. El término polinucleótido "desnudo", ADN o ARN, se refiere a secuencias que están libres de cualquier vehículo de suministro que actúan para ayudar, promover o facilitar la entrada en las células, incluyendo secuencias virales, partículas virales, formulaciones de liposomas, agentes precipitantes _ > lipofectina y semejantes. Sin embargo, los polinucleótidos MPIF-1 también pueden suministrarse en formulaciones de liposomas (tales como aquellas mostradas en Felgner P.L. y colaboradores . Ann . NY Acad . Sci . 772:126-139 (1995) y Abdallah B. y colaboradores . Biol . Cell 85(1) :l-7 (1995) ) que pueden prepararse por métodos bien conocidos por aquellos con destreza en la especialidad.

Las construcciones del vector polinucleótido MPIF-1 empleadas en el método de terapia de genes, son de preferencia construcciones que no se integran en el genoma huésped ni tienen secuencias que permiten replicación. Cualquier fuerte- promotor conocido por aquellos con destreza en la especialidad puede utilizarse para dirigir expresión de ADN. A diferencia de otras técnicas de terapias de genes, una ventaja principal de introducir estas secuencias de ácido nucleico en células objetivo es la naturaleza transitoria de la síntesis de polinucleótidos en la célula. Estudios han mostrado que secuencias de .ADN no replicantes pueden introducirse en células para proporcionar solución- del polipéptido deseado por periodos de hasta 6 meses. La construcción de polinucleótido MPIF-1 puede suministrarse al espacio intersticial de tejidos dentro del animal, incluyendo músculos, piel, cerebro, pulmón, hígado, bazo, médula osea, timo, corazón, linfa, sangre, hueso, cartílago, páncreas, riñon, vesícula biliar, estómago, intestinos, testículos, ovarios, útero, recto, sistema nervioso, ojo, glándula, y tejido conectivo. El espacio intersticial de los tejidos comprende el fluido intercelular, matriz mucopolisacárido entre las fibras reticulares de tejidos de órganos, fibras elásticas en las paredes de vasos o cámaras, fibras de colágeno de tejidos fibrosos o esta misma matriz del tejido conectivo que forma las células de músculo o en lagunas de hueso. Similarmente es el espacio ocupado por el plasma de la circulación y el fluido de linfa de los canales linfáticos. El suministro al espacio intersticial del tejido muscular se prefiere por razones que se discuten a continuación. Pueden suministrarse convenientemente por inyección- en los tejidos que comprenden estas células . De preferencia se suministran a y expresan en células nó divisoras persistentes que son diferenciadas, aunque el suministró y expresión pueden lograrse en , células no diferenciadas o menos completamente diferenciadas, tales como por ejemplo células básales, células de tallo de sangre o fibroblastos de piel . Células de músculo in vivo son particularmente competentes en su capacidad para absorber y expresar polinucleótidos. Para la inyección de polinucleótido MPIF-1 desnudo, una cantidad de dosis efectiva de .ADN o .ARN estará en el rango de aproximadamente 0.05 g/kg de peso corporal hasta aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal. De preferencia, la dosis será de aproximadamente 0.005 m£f/kg a aproximadamente 20 mg/kg y más preferible de aproximadamente de 0.05 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg. Por supuesto, como la persona con destreza ordinaria apreciará, que esta dosis variará de acuerdo con el sitio de inyección en el tejido. La dosis apropiada y efectiva de secuencia de ácido nucleico puede determinarse fácilmente por aquellos con destreza ordinaria en la especialidad y puede depender de la condición tratada y la ruta de administración. La ruta preferida de la invención es por la ruta de inyección parenteral en el espacio intersticial de los tejidos. Sin embargo, pueden también emplearse rutas parenterales tales como inoculación de una formulación aerosol, particularmente para suministro a los pulmones o tejidos bronquiales, de la garganta, o membranas mucosas de la nariz. Además, en arterias pueden suministrarse construcciones de polinucleótido MPIF-1 desnudas, durante angioplastia por el catéter empleado en el procedimiento. Los efectos de respuesta de dosis de polinucleótido MPIF-1 inyectado en músculo in vivo se determinan como sigue. .ADN plantilla MPIF-1 para producción de ARNm que codifica para polipéptido MPIF-1, se prepara de acuerdo con - una metodología ADN recombinante estándar. El ADN plantilla que puede ya ser circular o lineal, ya sea se emplea como ADN desnudo o complejado con liposomas. Los músculos cuadríceps de ratones luego se inyectan con diversas cantidades del ADN plantilla.

Ratones macho y hembra Balb/C de ciño a seis semanas de edad, se anestesian por inyección intraperitoneal con 0.3 ml de Avertina 2.5%. Una incisión de 1.5 cm se practica en el muslo anterior y el músculo cuadríceps se visualiza directamente. El .ADN plantilla de MPIF-1 se inyecta en 0.1 ml de portador y una jeringa de 1 ce a través de una aguja calibre 27 durante un minuto. Aproximadamente 0.5 cm del sitio de inserción distante del músculo en lá rodilla y aproximadamente a 0.2 cm de profundidad. Puede ponerse una sutura sobre el sitio de inyección para futura localización y la piel se cierra con grapas de acero inoxidable. Después de un tiempo de incubación apropiado (por ejemplo 7 días) se preparan- extractos de músculo al acortar todo el cuadríceps . Cada quinta sección transversal 15 um de los músculos cuadríceps del individuo se tiñen histoquímicamente para expresión de proteína MPIF-1. Uñ curso de tiempo para la expresión de proteína MPIF-1 puede efectuarse en formas similares excepto que el cuadríceps de ratones diferentes se cosechan en tiempos diferentes. La persistencia de ADN de MPIF-1 en el músculo después de cuya inyección puede determinarse por análisis Southern blot después de preparar sobrenadantes HIRT y ADN " celular _ total de ratones inyectados y de control. Los resultados de la experimentación anterior en ratones pueden emplearse para extrapolar dosis adecuadas y otros parámetros de tratamiento en humanos y otros animales utilizando ADN desnudo MPIF-1. Ejemplo 28 Animales Transgénicos MPIF-1 Los polipéptidos MPIF-1 también pueden expresarse en animales transgénicss . Animales de cualquier especie incluyen, pero no- están limitados a, ratones, ratas, conejos, hamsters, conejillos de Indias, perros, micro cerdos, cabras, ovejas, vacas y primates no humanos, por ejemplo, mandriles, simios, y chimpancés, pueden emplearse para generar anim les transgénicos. En una modalidad específica, técnicas aquí descritas o de otra forma conocidas en la especialidad se utilizan para expresar polipéptidos de la invención en humanos, como parte de un protocolo de terapia de genes . Cualquier técnica conocida en la especialidad, puede utilizarse para introducir el transgen (es decir, polínucleótidos de la invención) en anímales para producir las línea fundadoras de animales transgénicos. Estas técnicas incluyen, pero no están limitadas a, micro inyección pronuclear (Paterson y colaboradores, Appl .

Microbiol . Biotechnol . 40:691-698 (1994); Carver y colaboradores, Biotechnology (NY) 11:1263-1270 (1993); Wright y colaboradores, Biotechnology (NY) 9:830-834 (1991); y Hoppe y colaboradores, Patente de los E.U.A.

No. 4,873,191 (1989)); transferencia de genes mediada por retrovirus en líneas germinales (Van der Putten y colaboradores, Proc. Na ti . Acad. Sci . , USA 82:6148-6152 (1985)), blastocistos o embriones; hacer blanco con genes en células de tallo embriónicas) (Thompson y colaboradores, Cell 56:313-321 (1989)); Electroporación de células o embriones (Lo, Mol Cell . Biol . 3:1803-1814 (1983)); introducción de los . polinucleótidos de la invención utilizando una pistola de genes (ver por ejemplo, Ulmer y colaboradores, Science 259:1745 (1993); introducir construcciones de ácido nucleico en células de tallo pleuripotentes embriónicas y transferir las células de tallo de regreso al blastocisto; y transferencia de genes mediados por esperma (Lavi trano y colaboradores, Cell 51 . - 111 - 123 (1989); etc. Para uña revisión de esta técnica ver Gordon, "Transgenic .Animáis, " (Animales transgénicos) Intl . Rev. Cytol . 115 :171-229 (1989), que aquí se incorpora por referencia completamente . Cualquier técnica conocida en la especialidad puede utilizarse para producir clones transgénicos que contienen polinucleótidos de la invención. Por ejemplo, transferencia nuclear en oocitos enucleados de núcleos de células embriónicas cultivadas, fetales, o adultas, inducidas a inactividad (Campell y colaboradores, Nature 380:64-66 (1996); Wilmut y colaboradores, Na ture 385:810-813 (1997) ) . La presente invención proporciona animales transgénicos que transportan el transgen en todas su células, así como animales que transportan el transgen en algunas, pero no en todas sus células, es' decir animales mosaicos o quiméricos. " El transgen puede ser integrado como un solo transgen o como múltiples copias tales como en concatámeros , por ejemplo en tándem, cabeza-a-cabeza, o tándem cabeza-a-cola. El transgen también puede ser introducido selectivamente en y activado en un tipo de célula particular seguir por ejemplo las enseñanzas de Lasko y colaboradores (Lasko y colaboradores, Proc . Na ti .

Acad. Sci . USA 89: 6232-6236 (1992)) Las secuencias regulatorias requeridas para esta activación específica del tipo de célula dependerán del tipo de célula particular de interés, y serán aparentes para aquellos con destreza en la especialidad. Cuando se desea que el transgen polinucleótido se integre en el sitio cromosomal el gen endógeno, se prefiere hacer blanco u objetivo de genes . Brevemente, cuando esta técnica se va a utilizar, vectores que contienen algunas secuencias de nucleótido homologas al gen endógeno, se diseña con el propósito de 'integrar, mediante recombinación homologa con secuencias cromosomales en el interior e interrumpiendo la sección de la secuencia de nucleótido del gen endógeno. El transgen también puede introducirse selectivamente en un tipo de célula particular, de esta manera inactivando el gen endógeno de solo este tipo de células, al seguir por ejemplo las enseñanzas de Gu y colaboradores (Gu y colaboradores, Science 265:103-106 (1994)) . Las secuencias regulatorias requeridas para esta inactivación específica de tipo de célula dependerá del tipo de célula particular o de interés, y serán aparentes para aquellos con destreza en la especialidad.

Los contenidos de cada uno de los documentos descritos en esté párrafo se incorporan por referencia completamente. En forma similar, el ADN que codifica la proteína MPIF-1 de longitud íntegra, puede insertarse también en un vector para expresión específica de tejido utilizando los siguientes cebadores. Además de expresar el polipéptido de la presente invención en una forma específica de tejido ubicua en animales transgénicos, también sería rutinario para una persona con destreza en la técnica, generar construcciones que regulan expresión del polipéptido por una variedad de otros medios (por ejemplo desarrollo o expresión químicamente regulada) . 5 Una vez que se han generado animales transgénicos, la expresión del gen recombinante puede ensayarse utilizando técnicas estándar. Monitoreo ,^ inicial puede lograrse por análisis Southern blot o por técnicas PCR para analizar tejidos de animal para 10 verificar que se ha llevado a cabo la integración del transgen. El nivel de expresión de ARNm del transgen en los tejidos de los animales transgénicos también puede estimarse utilizando técnicas que incluyen pero no están ) limitadas a análisis Northern blot de muestras de tejido 15 que se obtienen del animal, análisis de hibridización in situ y PCR de transcriptasa inversa (rt-PCR) . Muestras de tejido de expresión de gen transgénico también pueden ser evaluadas inmuno citoquímicamente o inmuno histoquímicamente utilizando anticuerpos específicos para 20 el producto de transgen. Una vez que se producen los animales • fundadores, pueden ser criados,- de crianza externa o exogamia, crianza interna o endogamia o de cruzamiento híbrido para producir colonias del animal particular. 25 Ejemplos de estas estrategias de cruzamiento, incluyen pero no están limitados: exogamia de animales fundadores con más de un sitio de integración sin establecer líneas separadas; endogamia de líneas separadas a fin de producir transgénicos compuestos que expresan el transgen a niveles superiores debido a los efectos de expresión aditiva de cada transgen; cruzamiento de animales transgénicos heterocigotos para producir animales homocigotos para un ciclo de interacción determinado a fin tanto de aumentar expresión como eliminar la necesidad del monitoreo de animales por análisis de .ADN; cruza de líneas homocigotas para producir líneas heterocigotas u homocigotas compuestas, y cría para colocar el transgen en un fondo distinto que es apropiado para un modelo de interés experimental . Animales transgénicos de la invención tienen usos que incluyen, pero no están limitados a sistemas de modelos de animal útiles para elaborar la función biológica de polipéptidos MPIF-1, estudiar condiciones y/o desordenes asociados con la expresión MPIF-1 aberrante y para monitorear compuestos excesivos para mejorar estas condiciones y/o desordenes. Ejemplo 29 Animales Inactivados de MPIF-1 Expresión de gen MPIF-1 endógeno también puede reducirse por inactivación del gen MPIF-1 y/o su promotor utilizando recombinación homologa dirigida a objetivo. Por ejemplo (ver Smithies y colaboradores , Na ture 317:230-234 (1985); Thomas & Capecchi , Cell 51:503-512 (1987); Thompson y colaboradores, Cell 5:313-321 (1989); cada una de las cuales se incorpora aquí completamente por referencia) . Por ejemplo, un polinucleótido no funcional mutante, de la invención (o una secuencia .ADN completamente no relacionada) flanqueado por ADN homólogo a la secuencia polinucleótído endógena (ya sea a las secciones de codificación o regiones regulatorias del gen) puede ser utilizado, con o sin un marcador seleccionable y/o un marcador seleccionable negativo, para transfectar células que expresan polipéptidos de la invención in vivo. En otra modalidad, técnicas conocidas en la especialidad se emplean para generar inactivaciones en células que contienen, pero no expresan el gen de interés . Inserción de la construcción de .ADN mediante recombinación homologa dirigida a objetivo, resulta en inactivación del gen objetivo! Estos enfoques son particularmente adecuados en campos de investigación y agrícolas en donde pueden emplearse modificaciones a células de tallo embriónicas para generar progenie de animales con un gen objetivo inactivo (por ejemplo, ver Thomas & Capecchi 1987 y Thompson 1989, arriba) . Sin embargo, este enfoque puede ser adaptado rutinariamente para utilizar en humanos, siempre que las construcciones de ADN recombinantes se administren directamente o dirijan al sitio requerido in vivo utilizando vectores virales apropiados que serán aparentes para aquellos con destreza en la especialidad. En adicionales modalidades de la invención, las células que se someten a ingeniería genética para expresar los polipéptidos de la invención o en forma alterna que se someten a ingeniería genética para no expresar los polipéptidos de la invención (por ejemplo, inactivaciones), se administran a un paciente in vivo. Estas células pueden obtenerse de un paciente (Es decir, animales, incluyendo humanos) un donador compatible MHC que pueden incluir, pero no están limitadas a fibroblastos, células de médula ósea, células de sangre (por ejemplo, linfocitos), adipocitos, células de músculo, células endoteliales, etc. Las células de la ingeniería genética in vitro utilizando técnicas de ARN recombinante para introducir la secuencia de codificación de polipéptidos de _ la invención en las células, o en forma alterna para romper o interrumpir la secuencia de codificación y/o secuencia regulatoria y endógena asociada -8n los polipéptidos de la invención, por ejemplo, por traducción (utilizando vectores virales y de preferencia vectores que integran el transgen en el genoma de célula) o procedimientos de transfección incluyendo pero no limitado al uso ' de plásmidos, cósmidos, YACs,*"ADN desnudo, electroporación, liposomas, etc. La secuencia de codificación de los polipéptidos de la invención puede colocarse bajo el control de un promotor inducible o fácilmente consecutivo o promotor/mejorador para lograr expresión, y de preferencia secreción de los polipéptidos MPIF-1. Las células de ingeniería se .expresan y de preferencia secretan los polipéptidos de la invención pueden introducirse en el paciente sistémicamente, por ejemplo en la circulación o intraperitonealmente. En forma alterna, las células pueden incorporarse en una matriz e implantarse en el cuerpo, por ejemplo fibroblastos sometidos a ingeniería genética pueden implantarse como parte de un inserto de piel; células sometidos a ingeniería -_ genética pueden implantarse como parte de un inserto linfático o vascular. (Ver por ejemplo, Anderson y colaboradores en la Patente de los E.U.A. No. 5,399,349; y Mulligan & Wilson, en la Patente de los E.U.A. No. 5,460,959 cada una de las cuales aquí se incorpora completamente por referencia) . Cuando las células a administrarse son células no autólogas o no compatibles con MHC, pueden administrarse utilizando técnicas bien conocidas que evitan el desarrollo de una inmuno respuesta huésped contra las células introducidas. "-Por ejemplo, las células pueden ser introducidas en una forma encapsulada que, mientras que permiten intercambio de 'componentes con el ambiente extra celular inmediato, no permiten que las células introducidas se reconozcan por el sistema inmune huésped. .Animales desactivados de la invención tienen usos, que incluyen pero que no están limitados a, sistemas de modelo de animal útiles para elaborar la función biológica de polipéptidos MPIF-1, estudiar condiciones y/o desordenes asociados con la expresión MPIF-l aberrante, y para monitorear compuestos efectivos para mejorar estas condiciones y/o desordenes. Ejemplo 30 Producción de un Anticuerpo Tecnología de Hibridoma Los anticuerpos de la presente invención pueden prepararse por una variedad de métodos. (Ver Protocolos Actuales, capítulo 2) . Como un ejemplo de estos métodos, células que expresan polipéptido (s) de a invención se administran a un animal para inducir la producción del suero que contiene anticuerpos policlonales. En un método preferido, una preparación de el o los compuestos de los polipéptidos de la invención se prepara y purifica para hacerlo substancialmente libre de contaminantes naturales . Esta preparación luego se introduce en un animal a fin de producir antisuero policlonal de mayor actividad específica. .Anticuerpos monoclonales específicos para el o los polipéptidos de la invención se preparan utilizando tecnología de hibridoma (Kohler, y colaboradores, Na ture 256:495 (1975); Kohler, y colaboradores, Eur. J Immmunol . 6:511 (1976); Kohler, y colaboradores, Eur. J Immmunol . 6:292 (1976); Hammerling, y colaboradores . , en Monoclonal An tibodi es and T-Cell Hybridomas , (Anticuerpos monoclonales e hibridomas de célula T) Elsevier, N.Y. (1981) , pp . 563-681) . En general, un animal (de preferencia un ratón) se inmuniza Con el o los polipéptidos de la invención o, más preferiblemente, con una célula que expresa polipéptido secretado. Estas células que expresan polipéptido se cultivan en cualquier medio de cultivo de tejido conveniente, de preferencia en medio Earle, suplementado con suero bovino fetal al 10% (inactivado a aproximadamente 56°C) , y suplementado con aproximadamente 10 g/1 de amino ácido no esencial, aproximadamente I , 00O U/ml de penicilina, y aproximadamente 100 g/ml de estreptomicina. Los esplenocitos de estos ratones se extraen y fusionan con la línea celular de mieloma conveniente. Cualquier línea celular de mieloma conveniente puede emplearse de acuerdo con la presente invención; sin embargo, es preferible emplear la línea celular de mieloma principal padre (SP20) , disponible de ATCC. Después de fusión, las células de hibridomas resultantes se mantienen selectivamente en medio HAT, y luego clonan por dilución limitante como se describe por Wands, y colaboradores . ( Gas troen terology (Gastroenterología) 80:225-232 (1981)) . Las células de hibridoma obtenidas a través de esta selección luego se ensayan para identificar clones que secretan anticuerpos capaces de unir el o los polipéptidos de la invención. En forma alterna, -anticuerpos adicionales capaces de unir o ligar a el o los polipéptidos de la invención pueden producirse en el procedimiento de dos etapas utilizando anticuerpos anti-idiotípicos . Este método emplea el hecho de que los propios anticuerpos son antígenos, y por lo tanto es posible tener un anticuerpo que liga a un segundo anticuerpo. De acuerdo con este método, anticuerpos específicos de proteínas se utilizan para inmunizar un animal, de preferencia un ratón. Los esplenocitos de este animal luego se utilizan para producir células de hibridoma, y las células de_ hibridoma se monitorean para identificar' clones que produce un anticuerpo cuya capacidad para unir al anticuerpo específico de proteína puede bloquearse por el o los polipéptidos de la invención. Estps anticuerpos comprenden anticuerpos anti-idiotípicos al anticuerpo especifico de proteína y se utilizan para inmunizar a un animal para inducir formación de más anticuerpos específicos de proteína. Para uso in vivo de anticuerpos en humanos, un anticuerpo se "humaniza" . Estos anticuerpos pueden producirse utilizando construcciones genéticas derivadas de células de hibridoma produciendo anticuerpos monoclonales anteriormente descritos . , Métodos para producir anticuerpos quiméricos y humanizados se conocen en la especialidad y se discuten aquí. (Ver, para revisión Morríson, Science 229: 1202 (1985); Oi y colaboradores, BioTechniques 4:214 (1986); Cabilly y colaboradores, Patente de los E.U.A. No. 4,816,567; Taniguchi y colaboradores, EP 171496; Morrison y colaboradores, EP 173494; Neuberger y colaboradores, WO 8601533; Robinson y colaboradores, WO 8702671; Boulianne y colaboradores, Na ture 312:643 (1984); Neuberger y colaboradores, Nature 314:268 (1985).) Aislamiento de Fragmentos de Anticuerpo que se Dirigen contra uno o varios Polipeptido de una Biblioteca de se Fvs Genes V de origen natural aislados de PBLs humanos se construyen en una biblioteca de fragmentos de anticuerpo que contienen reactividades , contra uno o varios polipéptidos de la invención a los cuales el donador puede o no haber sido expuesto (ver por ejemplo, la Patente de los E.U.A. No. 5,885,793 incorporada aquí por referencia completamente) . Rescate de la Biblioteca . Una biblioteca de scFvs se construye a partir del ARN de PBLs humano como se describe en la Publicación PCT WO 92/01047. Para rescatar fragmentos de anticuerpo que tienen fago, aproximadamente 10Q E. coli que alojan el fagémido se emplean para inocular 50 ml de 2xTY que contiene glucosa al 1% y 100 g/ml de ampicilina (2xTY-AMP-GLU) y se desarrollan a un O.D. de 0.8 con agitación. Cinco ml de este cultivo se emplean para inocular 50 ml de 2xTY-AMP-GLU, 2 x 10* TU de auxiliar delta gen 3 (M13 delta gen III, ver Publicación PCT WO 92/01047) se agregan y el cultivo se incuba a 37°C por 45 minutos sin agitación y luego a 37°C por 45 minutos con agitación. El cultivo se centrifuga a 4000 r.p.m. por 10 minutos y la pastilla de centrifugación se vuelve , a suspender en dosis de 2 litros de 2xTY que contienen 100 g/ml de ampicilina y 50 ug/ml canamicina y desarrollan o cultivan durante la noche . Fagos se preparan como se describe en Publicación PCT WO 92/01047. M13 delta gen III se prepara como sigue: fago auxiliar M13 delta gen III no codifica la proteína gen III, por lo tanto fragmentos de anticuerpo que exhiben fago (mido) tienen una mayor avidez de enlace o de unión al antígeno. Células M 13 delta gen III, infecciosas se elaboran al desarrollar el fago auxiliar en células que alojan un derivado pUC19 que suministra la proteína gen III tipo silvestre durante morfogénesis de fago. El cultivo se incuba por 1 hora a 37°C sin agitación y luego por una _hora más a 37°C con agitación. Células se centrifugan (IEC-Centra 8,400 r.p.m. por 10 minutos), resuspenden en 300 ml de caldo 2xTY que contiene 100 g/ml de ampicilina y 25 g/ml de canamicina (2XTY-4AMP-KAN) y desarrollan durante la noche, agitando a 37°C. Partículas de fago se purifican y concentran en el medio de cultivo por dos precipitaciones con PEG (Sambrook, y colaboradores , 1990) , resuspendidas en 2 ml de PBS que pasan a través de un filtro de 0.45 m (Minisart NML; Sartorius) para dar una concentración final de aproximadamente l?" unidades de transducción/ml (clones resistentes a ampicilina) . Toma panorámica de la Biblioteca . Inmunotubos (Nunc) se revisten durante la noche en PBS con 4 ml ya sea de 100 g/ml o 10 g/ml de un -polipeptido de la presente invención. Se bloquean tubos con Marvel-PBS al 2% por 2 horas a 37°C y luego lavan tres veces en PBS. Aproximadamente 101 TU de fago se aplican al tubo e incuban por 30 minutos a temperatura ambiente tamboreo en un agitador ondulatorio y luego se dejan que reposen por otras 1.5 horas. Se lavan tubos 10 veces con PBS Tween-20 al 1% y 10 veces con PBS. Se eluyen fagos al agregar 1 ml de trietilamina 100 mM y giran 15 minutos en un agitador ondulatorio después de lo cual la solución se neutraliza inmediatamente con 0.5 ml de Tris-HCl 1.0 M, pH 7.4. Luego se emplean fagos para infectar 10 ml de TG1 E. coli mid-log al incubar fago eluído con bacterias por 30 minutos a 37°C. Las E. coli luego se revisten en placas TYE que contienen glucosa al 1% y 100 g/ml ampicilina. La biblioteca bacterial resultante luego se rescata con fago auxiliar delta gen 3 como se describió anteriormente para preparar el fago para una vuelta subsecuente de selección. Este proceso luego se repite para un total de cuatro vueltas de purificación de afinidad con lavado de tubo incrementado a 20 veces con PBS, Tween-20 0.1% y 20 veces con PBS para las vueltas 3 Y 4. Caracterización de Aglutinantes . Fago eluido de la tercery cuarta vueltas de 'selección se emplea para infectar E coli HB 2151 y scFv soluble se produce (Marks y colaboradores , 1991) de colonias sencillas para ensayo.

Se realizan ELISAS con placas de 'microtitulación revestidas ya sea con 10 pg/ml del polipéptido de la presente invención en bicarbonato 50 mM, pH 9,6. Clones positivo en ELISA además se caracterizan por huellas digitales de PCR (Ver por ejemplo, Publicación PCT WO 92/01047) y luego por el secuenciado. Estos clones positivos ELISA también pueden ser adicionalmente caracterizados por técnicas conocidas -en la especialidad, tales como por ejemplo mapeo de epítope, afinidad de enlace, transducción de señal de -receptor,' capacidad para bloquear o inhibir en forma competitiva unir anticuerpo/antígeno y actividad agonista o antagonista competitiva . Ejemplo 31 Modelo de Irradiación Letal Un esquemático del protocolo experimental del Ejemplo 18 se ilustra en la Figura 41. Como se muestra en la Figura 42, MPIF-1 (23) mejora la supervivencia de ratones irradiados letalmente. La capacidad de MPIF para mejorar la supervivencia varía con las condiciones experimentales . El estudio mostrado en este ejemplo prueba la actividad de MPIF-1 (23) . Sin embargo, una persona con destreza ordinaria en la especialidad fácilmente puede modificar los estudios ejemplificados, para probar la actividad de MPIF-1 de longitud íntegra, o sus fragmentos así como polinucleótidos (por ejemplo, por terapia de gen) agonistas, y/o antagonistas de MPIF-1. Ejemplo 32 Mieloprotección in vivo contra Radiación Experimentos que muestran MPIF-1 incrementa la supervivencia de ratón después de radiación letal (ver Ejemplo 18) , sugieren que esta quimosina actúa como un agente radioprotector . Para investigar adicionalmente esta actividad, se examinaron cambios en donde niveles de proteína progenitores de médula ósea en ratones letalmente radiados para determinar si MPIF-1 mejora la recuperación de estos progenitores después de irradiación.

Un esquemático del protocolo experimental se ilustra en la Figura 43. Esta es una modificación del protocolo en el Ejemplo 17. El MPIF-1 utilizado fue MPIF-1 (23) lote HG00304-E11. Un grupo de control negativo (IRR) recibió solo vehículo (HBSS + suero de ratón normal al 0.1 % i.p.) Del día -3 al día +3, excepto porque los ratones se dejaron reposar 24 horas antes y después de irradiación. Para comparación en el análisis de médula ósea, un grupo de control (normal) de ratones no recibieron irradiación. Para examinar adicionalmente los efectos de la droga de estudio en representación de monocitos, se calcula la fuente de monocitos absoluta (AMC) . Esto se realiza en la misma forma que se calculan las cuentas de neutrófilos absolutos utilizando la siguiente fórmula: AMC = cuenta WBC x % monocitos (de la cuenta diferencial) x 1000 Los resultados se presentan en la Figura 56. El decremento esperado en .AMC no se observa durante el tratamiento de MPIF cuando los monocitos se cuantificaron por medios morfológicos. De hecho, se observó un ligero incremento durante el periodo de tratamiento, ocurriendo a dosis de MPIF 1 g/kg y superiores, con un retorno a cuenta de línea base dentro de 2 a 3 días después de la última dosis.

La interpretación más simple de los datos de monocitos es que MPIF provocó un cambio dependiente de dosis en quimiotaxia de monocitos, resulta en un flujo de monocitos que no contienen CD14. Esto puede tomarse en cuenta para el incremento en monocitos absoluto modesto y la reducción de monocitos que contienen CD14 observada por citometría de flujo. Por cualquier método, hubo clara evidencia de actividad biológica transitoria y reversible. Seguridad . Una indicación pretendida para MPIF es la protección de células precursoras mieloide en pacientes que reciben quimioterapia mielosupresora. En pruebas químicas controladas con placebo de este agente, el AE reportado más frecuente, se amplifica como mielosüpresión y sus complicaciones infecciosas y hemorrágicas relacionadas a administración de quimioterapia concomitante. En los estudios pre-clínicos y clínicos, los efectos de MPIF han sido transitorios, reversibles y limitados a células de linaje mieloide. Aunque se espera que MPIF reduzca la frecuencia, severidad y duración de citopenias inducidas por quimioterapia, una acción inesperadamente prolongada puede empeorar potencialmente las citopenias . En el estudio de voluntarios sanos fase 1 00304-CRX-HV-01, dieciocho sujetos (14 con activo, 4 con placebo) experimentaron un total de 32 eventos adversos (25 con activo, 7 con placebo) . Eventos adversos se codificaron por el investigador ya sea como "asociados con la administración de la droga de estudio", "no asociados con la administración de la droga de estudio", o "relación a la administración de prueba de estudio desconocida" . A fin de estandarizar reporte de eventos adversos en términos de causalidad, esos eventos adversos codificados por el investigador "relación a la administración de droga de estudios desconocida", se consideraron por el patrocinador que tenga posible causalidad y por lo tanto han sido reportados bajo "relacionado AE" . Con base en estos criterios, 11 de 25 sujetos tratados con MPIF experimentaron al menos un evento adverso que se considera asociado con la administración de MPIF. Tres de cinco sujetos que reciben placebo experimentaron al menos un evento adverso que se considera asociado con la administración de la droga. La incidencia de eventos adversos entre sujetos tratados con agente activo y placebo (44% vs . 60%, respectivamente) fue comparable. Veintinueve de los treinta y dos eventos adversos reportados fueron con severidad grado 1 o 2 NCI CTC. Dos fueron de severidad desconocida. Los eventos adversos más frecuentemente reportados fueron dolores de cabeza (5 sujetos, 4 con activo/l con placebo), somnolencia (3 sujetos, 2 con activo/l con placebo), y leucopenia (3 sujetos, 2 con activo/l con placebo) . Un resumen de todos los AE reportados para el estudio fase I se presenta en la Tabla 9. Un evento adverso se reporta como serio y severo. Una mujer blanca de 72 años de edad experimentó vértigo manifestado por mareo, náusea y vómito, e inestabilidad de Ga aproximadamente 56 horas después de la administración final de MPIF (30 g/kg) . Se hospitalizó el sujeto durante la . noche para observación y evaluación. Exámenes de laboratorio, CT de cabeza y ultrasonido de carótida no fueron revelantes. El sujeto tuvo un episodio similar en el pasado distante. Los síntomas se resolvieron rápidamente y el sujeto fue dado de alta del hospital la mañana siguiente, sin evidencia de secuelas y completó el estudio. La relación de este evento adverso al medicamento de estudio se reporta por el investigador como "desconocido" .

Tabla 9 Compendio de. Eventos Adversos por Sistema de Cuerpo, COSTART y Tratamiento -. Intención para Tratar Sistema de Píacebo Tratamiento Cuerpo 0.1' g/kg 1.0 g/kg 10 g/kg (COSTART) N % N% N% N% Sistema Hémico/Linfático 1 20 2 40 1 20 0 0 Anemia 0 0 0 0 1 20 0 0 Equimosis 0 0 1 20 0 0 0 0 Leucocitosis 0 0 0 0 0 0 0 0 Leucopenia 1 20 1 20 1 20 0 0 Sistema Muscular esquelético 0 0 0 0 1 20 0 0 Mialgia 0 0 0 0 1 20 0 0 Sistema Nervioso 1 20 0 0 2 40 0 0 Mareo 1 20 0 0 0 0 0 0 Parálisis Facial 0 0 0 0 0 0 0 0 Sistema de Cuerpo Placebo Tratamiento (COSTART) 30 g/Kg N 100 g/kg T o d o % N% Activo N% Cuerpo como un todo 0 0 1 20 5 20 Dolor Abdominal 0 0 0 0 0 0 Astenia 0 0 0 0 1 4 Dolor de Espalda 0 0 0 0 1 4 Dolor de Cabeza 0 0 0 0 4 16 Edema en sitio de Inyección 0 0 1 20 1 4 Dolor en sitio de 0 0 1 20 1 4 Inyección Sistema Digestivo 0 0 0 0 1 4 Diarrea 0 0 0 0 1 4 Estomatitis 0 0 0 0 0 0 Sistema Hémico/Linfático 0 0 1 20 4 16 Anemia 0 0 0 0 1 4 Equimosis 0 0 0 0 1 4 Leucocitosis 0 0 1 20 1 4 Leucopenia 0 0 0 0 2 8 Sistema Muscular esquelético 0 0 0 0 1 4 Mialgia 0 0 0 0 1 4 Sistema de Cuerpo Placebo Tratamiento (COSTART) 30 g/Kg N 100 ?f/kg T o d o s % N% Activos N% Somnolencia 0 0 0 0 2 8 Vasodilatación 0 0 0 0 1 4 Vértigo 1 20 0 0 1 4 Sistema Respiratorio 1 20 0 0 1 4 Faringitis 1 20 0 0 1 4 Piel 0 0 ' 0 0 1 4 Prurito 0 0 0 0 1 4 Sistema Urogenital 0 0 1 20 2 8 Metrorragia 0 0 0 0 1 4 Vagimtis 0 0 1 20 1 4 Parámetros Farmacocinéticos Se evaluaron parámetros farmacocinéticos en el estudio 00304 -CRX-HV- 01. Muestras de plasma se obtuvieron en línea base y siguiendo la administración inicial a 5, 10, 15 y 30 minutos, 1, 2, 4 y 24 horas. Se obtuvieron muestras adicionales antes de y después de la administración final para evaluar la acumulación de droga . Los datos se resumieron en la Figura 57. Niveles de sangre en circulación fueron detectados fácilmente en cohortes de 0.1 y 1.0 g/kg por hasta 30 minutos y 1 hora, respectivamente. Dosis superiores resultaron en niveles detectables por 24 horas posteriores a infusión. AUC y CMAX fueron proporcionales a dosis administradas. Entre los sujetos que reciben los niveles de dosis más altas (30 y 100 g/kg) , la T, ,2 fue aproximadamente 0.8 hora. Niveles de plasma antes de la administración final de la droga de estudio el día 6 no indicaron evidencia de acumulación de droga . Estos estudios indican que MPIF-1 no provoca los efectos secundarios asociados con el gen G-CSF, tales como dolor esquelético, alopecia, diarrea, fiebre neutropénica, mucositis, fiebre, fatiga, anorexia, etc. Los estudios descritos en este ejemplo prueban la actividad de MPIF-1 (23) . Sin embargo, una persona con destreza en la especialidad fácilmente puede modificar los estudios ejemplificados para probar la actividad MPIF-1 de longitud íntegra, o sus fragmentos así como polinucleotidos (por ejemplo, por terapia de genes) agonistas, y/o antagonistas de MPIF-1. Ejemplo 36 Resumen de Datos y Guía para el Inves tigador Compendio de Da tos Pre - clínicos . Estudios in vivo muestran que MPIF es un potente protector para células progenitoras hematopoyéticas. La inhibición de colonias de progenitoras comprometidos" y multipotenciales murinos se observó a concentraciones en el rango de 0.1 a 100 ng/mL. Experimentos in vi tro han mostrado que MPIF confiere citoprotección de los efectos de antimetabolitos, antibióticos antitumor, inhibidores de topoisomerasa, y taxa os. En estudios in vivo, la consecuencia de esta protección es una recuperación más rápida de progenitores de médula ósea y poblaciones de células periféricas después de quimioterapia citotóxica. MPIF puede administrarse diariamente (en forma intravenosa) por periodos tan largos como 14 días sin toxicidad significante. No se observaron efectos adversos en animales hasta la dosis equivalente humana de 1.67 mg/kg. No se observaron efectos adversos en animales en estudios de toxicología de dosis repetidas de 28 días a dosis y hasta 20 mg/kg. MPIF no tuvo efecto promotor de crecimiento detectable en líneas de células de tumor en más de 270 experimentos in vi tro . Compendio de Datos Clínicos . MPIF se administró seguramente y fue bien tolerado en voluntarios sanos (n=25) que reciben dosis repetidas en un estudio con escala de dosis, controlado por placebo de fase I (en el rango de dosis: 0.1-100 g/kg) : No se consideran eventos adversos serios relacionados a la administración de MPIF observados en voluntarios sanos . Decrementos dependientes de dosis transitorias en expresión de CD14 se observaron en monocitos de sangre periférica y análisis de citometría de flujo. Cuentas de neutrófilos y monocitos absolutas como se determina por cuentas diferencial o conteo diferencial no se afectaron. MPIF fue detectable hasta 24 horas posterior a tratamiento. MPIF no fue inmunogénico cuando se administra a voluntarios sanos. Riesgos Posibles y Efectos Secundarios . Los efectos de MPIF han sido transitorios, reversibles, y limitados a células de linaje mieloide en estudios pre-clínicos y clínicos . Aunque el MPIF se espera que reduzca la frecuencia, severidad, y duración de citopenias inducidas por quimioterapia, una acción inesperadamente prolongada puede empeorar potencialmente citopenias. Eventos adversos transitorios, con frecuencia y severidad comparables con placebo, se observaron el estudio clínico inicial de voluntarios sanos que reciben múltiples dosis intravenosas de hasta 100 g/kg de MPIF. No se observaron reacciones agudas que se consideran relacionadas a la administración de MPIF. MPIF fue no inmunogénico en voluntarios sanos. Aunque se han asociado unos cuantos eventos adversos con administración de MPIF, la introducción de una proteína exógena puede resultar potencialmente en reacciones sistémicas o locales mediadas inmunológicamente. Sujetos pueden experimentar reacciones alérgicas agudas (tales como fiebre, urticaria, hiper- o hipotensión, y broncoespasmo) u otras reacciones tales como vasculitis, o enfermedad de suero. La posibilidad de disfunción renal, disfunción hepática, inmunosupresión, coagulopatía y neuropatía, aunque remotas no pueden ser excluidas . Los sujetos deberán ser monitoreados cercanamente durante y después de administración por cualquier signo de reacción adversa aguda. Suministros de emergencia (incluyendo epinefrina, corticoesteroides, agentes presores, y equipo desfibrilador cardíaco) habrán de ser fácilmente disponibles para uso, en caso de que ocurriera una reacción aguda. Contraindicaciones . La seguridad de este producto para utilizar durante embarazo o con madres lactantes, no se ha demostrado en pruebas clínicas. Precauciones Información para Pacientes . MPIF, como con todos los productos de investigación solo habrá de emplearse bajo la dirección de un investigador o médico de prueba clínica que se ha familiarizado con este producto. La seguridad de este producto para utilizarlo durante embarazo o con madres lactantes no se han demostrado en pruebas clínicas. Estudios experimentales en animales para estimar la seguridad con respecto a desarrollo del embrión o feto, es su aceptación y desarrollo peri- y post -natal no se han conducido. Cualquier mujer que haya perdido un periodo menstrual deberá considerarse embarazada hasta que se demuestre lo contrario. Solo investigaciones imperativas por lo tanto deberán llevarse a cabo durante el embarazo cuando el probable beneficio exceda el riesgo incurrido por la madre y el feto. No se conoce si MPIF se distribuye en la leche. La lactancia deberá ser interrumpida si se encuentra necesario una administración de la droga de estudio. Pruebas de Laboratorio . Cuentas de sangre periféricas deberán ser monitoreadas cercanamente en pacientes tratados con MPIF. . Pruebas de laboratorio puedan llevarse a cabo de acuerdo con el protocolo clínico acompañante.

Interacciones de Producto . MPIF no se anticipa que provoque ninguna interacción seria con otras drogas . Carcinogénesis , Mu tagénesis , Deterioro de Fertilidad . Estudios en animales para examinar el potencial carcinogénico y mutagénico no se han conducido con MPIF. Estudios in vi tro indican que MPIF no tiene efecto detectable en líneas de células de tumor. Abuso y Dependencia del Producto . El potencial de abuso y dependencia del producto MPIF no se han examinado en estudios no clínicos y clínicos, pero se espera que sean despreciables . Sobredosis . No hay experiencia clínica con sobredosis de MPIF. No se ha observado toxicidad en animales cuando se da una dosis hasta 20 mg/kg por 14 días consecutivos. Este es equivalente a una dosis de 1.67 mg/kg en humano. Dosis y Administración . El régimen de dosificación de dosis óptimas para MPIF no se ha determinado. Estudios iniciales evaluaron la seguridad y dosificación diaria de 0.1 a 100 g/kg de MPIF administrado intravenosamente por hasta 6 días. Estudios fase 2A para determinar la actividad biológica de eficacia preliminar se valoran en un rango de dosis de 1-100 g/kg. Regímenes de dosis subsecuentes se determinarán a partir de los resultados de estos estudios de eficacia tempranos . Suminis tro y Almacenamiento . MPIF se suministra como una formulación líquida estéril. Este producto debe ser almacenado entre 2 o y 8°C, en un área accessible solo a personal autorizado. La droga diluida para administración a pacientes se ha mostrado que es • estable por hasta 12 horas a temperatura ambiente sin degradación del producto. 10 Los estudios descritos en este ejemplo prueban la actividad de MPIF-1 ( 23) . Sin embargo, una persona con destreza en la especialidad puede fácilmente modificar los estudios ejemplificados para probar la actividad de MPIF-1 de longitud íntegra, o sus fragmentos 15 así como polinucleóutidos (por ejemplo, por terapia de genes), agonistas, y/o antagonistas de MPIF-1. Ejemplo 37 Es tructura de Solución y Dinámica de MPIF- 1 Compendi o + 20 El factor inhibitorio progenitor mieloide-1 (MPIF-1) es un inhibidor de células progenitoras y un activador de monocitos. La estructura de solución de MPIF-1 se ha determinado por espectroscopia de resonancia magnética magnética nuclear (NMR) . A diferencia de muchas quimosinas CC, la estructura MPIF-I muestra que es un monómero. La estructura está bien definida excepto por los residuos extremo y adopta un doblez quimosina característico de 3 hebras- y una hélice- superpuesta. Además de las cuatro cisteínas que caracterizan la mayoría de quimosinas, MPIF-1 tiene dos cisteínas adicionales que forman un enlace disulfuro. La dinámica de su prueba principal indica que los residuos N-terminal funcionalmente importantes, residuos del bucle N-terminal, y residuos adyacentes a los enlaces disulfuro muestran dinámicas significantes en comparación con el núcleo de la proteína. MPIF-1 se procesa a partir de una pro-proteína de 99 amino ácidos en el extremo N y esta última también es funcional, aunque con actividad reducida y es un monómero 'bajo una variedad de condiciones de solución. MPIF-1 por lo tanto es único, conforme pre-proteínas más largas de todas las otras quimosinas se asocian. Estos estudios son consistentes con la idea de que un monómero es suficiente para activar receptores 7-TM en leucocitos. .Análisis de células de médula ósea. Ratones de cada grupo se sacrificaron los días 4, 14, 21, y 38, y se tomaron muestras de médula ósea (BM = Bone Marrow) . Ensayos de formación de colonias en agar suave se emplean para determinar los números de progenitores mieloide (unidad formadora de colonia (CFU) -c y macrófago megacariocito eritroide granulocito-CFU (CFU-GEMM) ) de médula ósea. Ver, por ejemplo, Grzegorzewski y colaboradores, Blood 183:377 (1994); and Metcalf, The Hematopoietic Colony Stimulating Factors, (Los factores de es tímulo de colonias hematopoyéti cas) Ams terdam, Holanda, Elsevier (1984) en página 27. Se cultivaron células utilizando un sistema de ensayo basado en agar de una sola capa con eritropoyetina humana recombinante (rhEpo) (8 U/ml) e interleucina-3 de ratón recombinante (rmIL-3) (100_~ U/ml) . Colonias multipotenciales que contienen linajes de macrófago, megacariocito, eritroide, granulocito, se calificaron como CFU-GEMM, mientras que colonias de un solo linaje, que contienen monocitos (CFU-M) , granulocito (CFU-G), eritrocito (tanto CFU,E como unidad formadora de BU1 (BFU) -E) o células precursoras de granulocito/monocito (CFU-GM) se designaron como CFU-c. El ensayo CFU-GEMM proporciona información en la recuperación de células progenitoras multipotenciales en la médula ósea, mientras que el ensayo CFU-c proporciona información en la recuperación progenitores más comprometidos de cada linaje mieloide. Como se ilustra en las Figuras 44-45, la administración de MPIF-1 resulta en un incremento significante en los niveles de progenitores de médula ósea maduros e inmaduros . Los estudios descritos, en este ejemplo prueban la actividad de MPIF-1 (23) . Sin embargo, una persona con destreza en la especialidad puede modificar fácilmente los estudios ejemplificados para probar la actividad de MPIF-1 en longitud íntegra, o sus fragmentos así como polinucleotidos (por ejemplo, por terapia de genes), agonistas, y/o antagonistas de MPIF-1. Ej emplo 33 Propiedades Físicas , Químicas y Farmacéuticas de MPIF Forma de Dosificación, Clase Farmacológica y Adminis tració . El factor inhibitorio de progenitor mieloide es una quimosina-proteína humana recombinante truncada de (8.85 kDa) . MPIF se ha expresado en E. coli y se ha purificado a homogeneidad. MPIF se proporciona como una solución incolora estéril preferida para inyección. El MPIF se formula como una solución estéril que contiene diversas concentraciones variantes (2-8 mg/mL) de MPIF amortiguado a pH 6.0 +. 0.2 con acetato de sodio y cloruro de sodio. La solución se llena en ampolletas de vidrio de un solo uso tipo 1. Retención de bioactividad se ha demostrado por al menos 1 año de 2° a 8°C. MPIF se administrará intravenosamente . La proteína MPIF consiste de 77 amino ácidos (23 más un residuo Met N-terminal) y tiene una masa molecular de 8.85 kDa. Descripción General de Especificaciones de Fabricación . MPIF se expresa en y purifica de Escherichia coli. La proteína MPIF está presente dentro de estructuras de proteína comúnmente .referidas como cuerpos de inclusión. La insolubilidad natural de estos cuerpos de inclusión permite un proceso de purificación que retira componentes de E. coli contaminantes antes de solubilización de la proteína. Métodos de cromatografía y filtración se utilizan para aislar y purificar la proteína MPIF. Las etapas de aislamiento y purificación de monitorean como sigue : Los perfiles de resolución de productos intermedios eluidos de las columnas cromatográficas se monitorean continuamente por absorbancia ultravioleta a 280 nm. El contenido y pureza de proteina MPIF a diferentes etapas de purificación se determinan por RP-HPLC analítica.

Se emplean métodos analíticos para determinar la concentración de MPIF, pureza, e identidad, así como para detectar impurezas potenciales tales como .ADN, endotoxina, y biocarga microbiológica. Con trol de Calidad . El producto droga MPIF es una solución clara, incolora. Se observa una sola banda en electroforésis de gel de poliacrilamida-dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE) tanto en condiciones de reducción como no reducción siguiendo la tinción de Coomassie. Un pico sencillo eluye en cromatografía de líquido de alto desempeño con exclusión de tamaño (SE-HPLC =Size Exclusión High-Performance Liquid Chromatography) . Un pico principal (290%) con dos picos menores se observan por cromatografía de alto desempeño de fase inversa (RP-HPLC = Reversed Phase High-Performance Liquid Chromatography) . Ambos picos menores tienen la misma masa molecular y las mismas secuencias de extremo N (degradación Edman) , como un pico principal de MPIF. Mapeo de péptido con digestión con tripsina de diversos lotes de MPIF consistentemente muestra el mismo número de péptidos que están en el proceso de ser más caracterizados. La masa molecular de MPIF determinada por espectrómetro de masa es 8.85 kDa. Se emplean dos bioensayos para determinar la actividad de MPIF. Un ensayo de movilización de calcio en células de tumor mieolide humano THP-1 mide la consecuencia inmediata de unión de MPIF a su único receptor conocido, CCR1. Un ensayo de quimioprotección proporciona un medio para evaluar la capacidad del compuesto para proteger progenitores de médula de ratón contra los efectos citotóxicos de 5-Fu. Los estudios descritos en este ejemplo forman la actividad de MPIF-1 (23) . Sin embargo, una persona con destreza en la especialidad puede modificar fácilmente los estudios ejemplificados para probar la actividad de MPIF-1 en longitud íntegra, o sus fragmentos así como polinucleótidos (por ejemplo, por terapia de genes), agonistas, y/o antagonistas de MPIF-1. Ej empl o 34 Estudios No clínicos Introducción y Resumen . La mielosupresión es una de las toxicidades limitantes de dosis más comunes de la quimioterapia citotóxica. Esta supresión resulta por la pérdida de progenitores mieloide en la médula ósea y cuando es severa, incrementa el riesgo de complicaciones hemorrágicas e infecciosas. Se desarrolla el factor inhibitorio progenitor mieloide (MPIF) como un agente quimioprotecto . MPIF se ha caracterizado como una quimosina - humana . Las quimosinas (citocinas quimotácticas) son proteínas solubles secretadas por una variedad de tipos de células en respuesta a lesión, infección o activación del sistema inmune. Estas proteínas se relacionan estructuralmente en virtud de homología de secuencia y están relacionadas funcionalmente por su capacidad para inducir respuestas quimiotácticas entre poblaciones de leucocitos. Los efectos biológicos de MPIF en células progenitoras mieloides distinguen esta quimosina de todas las quimosinas conocidas y citocinas (Premack, B.A. y Schall, U. , Na ture Med. 2(11): 1174-1178 (1996); Rollins, B.J., Blood 90 (3) : 909-928 (1997)). Estudios no clínicos muestran que esta quimosina novedosa limita la proliferación y/o diferenciación de células progenitoras, de esta manera protegiendo las células contra los efectos citotóxicos de agentes quimiterapéuticos (Patel y colaboradores, J. Exp . Med. 185: 1163 (1997)) MPIF exhibe potente inhibición in vi tro de células formadoras -de -colonia-de -baj o-potencial -proliferativo (LPP-CFC) de médula ósea. LPP-CFC son progenitores hematopoyéticos bipotenciales que dan lugar a los linajes de granulocitos y monocitos. MPIF también inhibe en forma reversible formación de colonia por células formadoras de colonia de monocitos y granulocitos derivadas de célula de tallo muy fino. Experimentos de quimioprotección in vi tro han mostrado que MPIF protege estos progenitores hematopoyéticos contra los efectos citotóxicos de antimetabolitos (5-FU, ARA-C) , antibióticos antitumor, inhibidores de topoisomerasa I y taxanos . MPIF protege células progenitoras mieloide in vivo cuando se administra inmediatamente antes de cada ciclo de quimioterapia. El tratamiento con el MPIF también resulta en una recuperación más rápida tanto de células progenitoras de médula ósea como poblaciones de células periféricas en neutrófilos y plaquetas que en control en un modelo quimioterapéutico in vivo .

Combinado con los resultados de estudios in vi tro estos resultados muestran una aplicación clínica potencial de MPIF como protector de células progenitoras hematopoyéticas contra mielosupresión inducida por quimioterapia . El inicio de terapia con MPIF se hace al principio de la quimioterapia cuando el conjunto precursor es más grande, puede resultar en conservación de conjuntos progenitores durante ciclos posteriores de quimioterapia. Una vez confirmado en la clínica, este resultado representa un avance sobre lo que puede lograrse con factor de crecimiento tales como factor estimulante de colonia-de-granulocitos (G-CSF = Granulocyte Colony Stimulating Factor) o factor estimulante de colonia de gracnulocitos y monocitos (GM-CSF = Granulocyte and Monocyte-Colony Stimulating Factor) que han sido incapaces de evitar la pérdida progresiva de reserva de células progenit'oras después de cursos repetidos de quimioterapia. Además, la intervención con MPIF después de múltiples ciclos de quimioterapia será útil para ayudar en recuperación de neutropenia y trombocitopenia, incluso en pacientes con evidencia de reserva celular progenitora reducida. Un estudio a escala de dosis, controlado con placebo fase I, conduce en voluntarios sanos (n=25) que reciben dosis de tejido (n=6) . La dosificación -se inicia a un nivel calculado que es 2 logs por detíajo de la dosis protectora óptima en el ratón y lleva a escala a una dosis de 100 g/kg., que es más de un log por debajo de la dosis más alta que no produce efectos adversos detectables en estudios toxicológicos pre-clínicos . Voluntarios sanos se trataron con 0.1, 1, 10, 30, 100 g/kg diariamente por 6 días. Una cohorte de 6 pacientes, 5 que reciben MPIF y 1 uno que recibe placebo, se afecta en cada nivel de dosis. No se. observaron eventos adversos serios considerados en relación á administración MPIF. En general, los eventos adversos reportados fueron ligeros y transitorios, y consistieron primordialmente de ligeros dolores de cabeza, mialgias y fatigas. Solo un evento adverso serio (posible TÍA) de relación desconocida del agente de estudio se describió en una mujer de 71 años de edad, 52 horas después de la infusión final. Los síntomas en la paciente se resolvieron brevemente después de admisión. No se observó respuesta inmune tal como desarrollo de anticuerpos. Análisis de datos de citometría de flujo mostró un' decremento de dependiente de dosis transitorio en monocitos positivos CD14 durante los días de administración de MPIF. Sin embargo, no se observó decremento en cuentas absolutas de monocitos o neutrófilos. No se observaron cambios principales en cuentas de sangre o evidencia en inhibición de hematopoyesis en estos voluntarios sanos con hematopoyesis normal. Estudios farmacocinéticos revelaron que la concentración pico (CMAX) y área bajo la curva de tiempo de concentración . (AUC) inicial estuvieron relacionadas a la dosis, sin evidencia de acumulación de droga después de 6 días de tratamiento . (Ejemplo 34) . Clase y Razón Fundamental Farmacológica . MPIF, una proteína humana recombinante es una forma truncada de la quimosina-humana, factor inhibitorio progenitor mieloide Factor-1 (MPIF-1) . Una indicación anticipada para MPIF es la protección de células progenitoras mieloide en pacientes que reciben quimioterapia mielosupresora . Terapia sistémica con drogas citotóxicas es la base para los tratamientos más efectivos de cánceres diseminados. Adicionalmente, quimioterapia de adyuvante a menudo se utiliza siguiendo el tratamiento de enfermedad localizada con cirugía o radioterapia. Ya que la mielosupresión es una de las toxicidades serias más comunes asociada con quimioterapia, hay una necesidad clínica significante por avance en el cuidado de soporte para pacientes que se someten a terapia mielosupresora. Estudios no clínicos muestran que MPIF tiene potencial significante como protector de células precursoras hemapoyéticas de los efectos cítotóxicos de los agentes quimioterapéuticos. Células progenitoras multipotenciales y de tallo hematopoyéticas son responsables por restaurar solo los linajes hemapoyéticos . En individuos normales, estas células se dividen menos frecuentemente y por lo tanto son relativamente resistentes a un solo punto de una droga quimioterapéutica. Sin embargo, siguiendo múltiples ciclos de quimioterapia, células progenitoras mieloide responden con proliferación incrementada y se vuelven mucho más susceptibles a los efectos tóxicos por dosis y cursos de agentes quimi terapéuticos . Múltiples cursos de quimioterapia citotóxica llevan a la pérdida progresiva de células progenitoras mieloide, lo que resulta en recuperación retardada y empeoradas de cuentas de la posición más baja o nadir para neutrófilos y plaquetas . El valor clínico de este protector es el potencial por disminuir la incidencia y/o duración de citopenias inducidas por quimioterapia, de esta manera reduciendo la probabilidad de infección y sangrado después de signos secuenciales o de alta dosis de quimioterapia. Además, MPIF proporcionará una medida de soporte para intensidad de dosis, la administración oportuna de quimioterapia intensa. Terapias Actualmente Disponibles . Factores estimulantes de colonia (CSFs) han sido empleados para soportar dosis de quimioterapia estándar e intensificadas casi por una década. Está disponible evidencia no clínica que sugiere que dosis escalonadas de quimioterapia pueden incrementar substancialmente la destrucción de células de tumor y mejorar la supervivencia en malignidades selectas, pero falta la confirmación clínica de este concepto. CSFs, se estimula en la producción de granulocitos, macrófagos, y plaquetas, se emplean después de quimioterapia para acortar la duración de neutropenia o trombocitopenia. En contraste, MPIF protege células progenitoras mieloides al limitar en forma transitoria su proliferación antes y durante exposición a quimioterapia. Este modo de hacer diferente evita la pérdida progresiva de reservas de células progenitoras que ocurre después de dosis repetidas de quimioterapia, incluso en conjunto con la administración de CSF. El uso de MPIF por lo tanto permite un incremento en intensidad de dosis de quimioterapia. Estudios No clínicos . MPIF funciona como un quimioprotector para la célula progenitura mieloide comprometida. Comparados on otros agentes quimioprotectores que han mostrado eficacia in vi tro y/o en modelos en animales, MPIF exhibe un perfil biológico único con base en su capacidad por inhibir formación de colonias y proliferación de células progenitoras CD34+ tanto por granulocitos y monocitos de unidades formadoras de colonia (CFU-GM) como células mixtas-unidades formadoras de colonia (Mezclas CFU) . Entre progenitores humanos MPIF exhibe similares actividades inhibitorias en formación de colonia CFU-GM y CFU-GEMM. De esta manera, MPIF inhibe progenitores multipotenciales CD34+, progenitores bipotenciales y progenitores comprometidos.

MPIF también funciona como un inhibidor reversible potente de células formadoras de bajo potencial proliferativo (LPP-CFC) que incluye muchos de los progenitores mieloide comprometidos ' que finalmente dan lugar a monocitos y granulocitos periféricos. MPIF también se cuenta que inhibe células formadoras de colonia de alto potencial de proliferación más primitivos (HPP-CFC) , que exhiben muchas de las propiedades de las células de tallo hematopoyéticas pluripotenciales . Expresión de Tejido de MPIF . El patrón de expresión ARNm del MPIF es complejo con mensaje originalmente detectado en el pulmón, hígado, médula ósea, monocitos activados y líneas celulares mielomonocíticas en HL-60 y THP-1. Más recientemente, transcripciones distintas se han identificado en el páncreas, corazón, músculo esquelético, y en una proporción menor, de médula ósea. Farmacología No Clínica . Los resultados de más de 270 experimentos in vi tro indican que MPIF no tiene efecto detectable en línea celular de tumor en el panel de tumores del Instituto Nacional de Cáncer (National Cáncer Institute) empleados para monitorear agentes anti-cáncer ni ninguna de las 52 líneas de células de tumor adicionales. También, más de 75 ensayos basados en células se desarrollaron para estudiar MPIF. Entre tipos de células normales, la actividad biológica de MPIF se restringe a células específicas dentro del sistema inmune periférico y el compartimiento de células progenitoras hematopoyéticas (Tabla 7) . En particular, MPIF se ha encontrado que logra lo siguiente: Induce respuestas quimotácticas en células T y monocitos en reposo. Induce movilización de Ca+ en monocitos, células dendríticas derivadas de monocitos o eosinófilos . Inhibe formación de colonia progenitora comprometida y multipotencial murina a concentraciones en el rango de 0.1 a 100 ng/mL. Inhiben proliferación de células CD34" humanas a concentraciones en .el rango' de 0.1 a 100 ng/mL . Tabla 7 .Análisis de monitoreo in vitro de MPIF Sistemas de ensayo basado en células 75-80 Célula derivada de Célula derivada de Endoderma Mesoderma Hepatocitos Endotelio vascular Epitelio de pulmón Osteoclastos/Osteoblastos Epitelio intestinal Condrocitos Piel (fibroblastos) Músculo liso (aórtico) Miocitos Célula derivada de Ectoderma Tumor Células neuronales Proliferación Astrocitos Apoptosis Neuronas corticales Diferenciación Neuronas GABAergicas Migración Células de Schwann Células epidérmicas monitoreo anti-cáncer NCI Células de sistema Inmune* Células de tallo Hematopoyéticas * *Se encontró actividad biológica Actvidad Quimotáctica de MPIF MPIF es un factor quimotáctico potente para linfocitos T en reposo con respuesta máxima notada a 10 ng/mL. MPIF no estimula quimiotaxia en célula T. activadas con anti-CD3 sobre un amplio rango (0.1 a 1000 ng/mL) . Monocitos recientemente aislados exhiben una respuesta quimotáctica a MPIF. Migración máxima se observa a 100 ng/mL, una concentración 10 veces superior que la necesaria para producir una respuesta comparable entre célula T en reposo. Una respuesta quimotáctica débil ocurrió en neutrófilos. MPIF no induce quimiotaxia en linfocitos B, eosinófilos, basófilos, células NK, o plaquetas . Efecto de MPIF en Células de Sangre Humana . MPIF tiene los siguientes efectos in vi tro en células de sangre humana . Monoci tos y macrófagos derivados de Monoci tos .

El efecto de MPIF en liberación de enzima lisosomal se determina en monocitos recientemente aislados. Una liberación lenta pero variable de N-acetil--D-glucosidasa se observa sobre un rango de 0.5 a 500 ng/mL. Aunque detectable, la liberación fue significativamente menor que la inducida por MIP-1, MIP-1, R.ANTES, o MCP-1. En otros estudios, MPIF (1 a 1000 ng/mL) no tuvo efecto en la liberación de las enzimas lisosomales elastasa, glucuronidasa, o mieloperoxidasa. MPIF (0.1 a 100 ng/mL) no induce monocitos para secretar IL- 1,' factor de necrosis de tumor (TNF-) , IL- 10, o IL-2. Aún más, no se detectó efecto en actividad citotoxica, o ráfaga oxidativa de macrófago activado Basófilos . Basófilos purificados de sangre periférica se incubaron con MPIF (1 a 1000 ng/mL) por 10 minutos y los sobrenadantes resultantes se ensayaron por liberación de histaminas. MPIF no induce liberación de histamina. Células NK. PBMC's purificados se emplearon como una fuente para la determinación del efecto de MPIF en exterminio de células mediadas por NK de células K562. MPIF (1 a 100 ng/mL) no tuvo efecto en exterminio mediado por NK estimulado por IL-2 de células K562. Plaquetas. MPIF a concentraciones de 0.1 a 100 ng/mL no induce o modula activación o agregación de plaquetas. MPIF Inhibe Proliferación de Progeni tores CD34+ Humanos Para estimar el efecto* de MPIF en proliferación de células progenitoras hemapoyéticas humanas, células CD34* se aislaron de sangre de cordón, volvieron a suspender a 5 x 104 células/mL, y cultivaron por 4 días en la presencia de IL-3 y SCF. Las poblaciones resultantes de progenitores mieloide luego se lavaron y cultivaron bajo cuatro condiciones: medio solo; medio más MPIF; medio más cocktail de citocina de IL-3, GM-CSF, y eritropoyetina (EPO) ; y medio más cocktail de citocina y MPIF. Después de 6 días adicionales, el número de células viables en cada cultivo se determina. Como se ilustra en la figura 46, progenitores mieloide no sobreviven cuando se desarrollan en medio solo o medio más MPIF. En contraste, el cocktail de citocina mejoró dramáticamente la supervivencia de progenitores . Adición de MPIF (1-1000 ng/mL) resultó en inhibición significante (20-40%) proliferación celular. (Estos resultados son representativos de tres experimentos independentes . Se reportan valores como la absorbancia promedio ± SD de los pozos triplicados.) (Figura 46) . Inhibición de CFU-GM Humano y Mezcla CFU por MPIF Para determinar si el efecto inhibitorio de MPIF hace blanco a un progenitor específico, células precursoras derivadas de CD34+ se cultivaron en medio (medio semisólido Methocult MR que contiene IL-3, GM-CSF, SCF, EPO y TPO) que soporta el desarrollo de colonias de BFU-E, CFU-G, CFU-M, CFU-GM, CFU-Meg, y mezcla CFU. Después de 14 días en cultivo, el número y fenotipo de colonias que surgen en la presencia de MPIF se compararon con aquellas que surgen en medio solo o las citocinas MPI-1 de control o proteína quimioatrayente de monocitos-4 (MCP-4) . Los resultados de los dos experimentos representativos indican que MPIF inhibe (50-64%) la formación tanto de CFU-GM como mezcla CFU. MIP-1 y MCP-4 no tiene efecto en formación de colonias de cualquier población progenitora. Estos resultados confirman los efectos inhibitorios de MPIF en un desarrollo de .—£-precursor mieloide y define MPIF como un inhibidor de células precursoras de monocitos y granulocitos humanos (Tabla 8) . Tabla 8 Efecto de MPIF en formación de progenitores CD34+ Quimioprotección In vi tro Para estimar adicionalmente el potencial protector de MPIF, células agotadas de linaje (células -Lin) se aislaron de médula ósea de ratón e incubaron en la presencia de un cocktail de citocina estándar que consiste de IL-3 (5 ng/mL) , SCF (50 ng/mL) M-CSF (5 ng/mL) , y IL-1 (10 ng/mL) con o sin MPIF. Después de 60-70 horas, se trataron los cultivos con una droga de quimioterapia y la incubación se continuó por 3 a 24 horas adicionales, en cuyo punto los números de LPP-CFC supervivientes se determinaron por ensayo clonogénico estándar. Como se ilustra en la Figura 47, los efectos citotoxicos de los agentes específicos del ciclo celular 5-FU, Ara-C, paclitaxel y daunorubicina se redujeron significativamente por MPIF. En contraste, MPIF fue incapaz de proteger progenitores de los agentes alquilantes melphalan y thiotepa. Estos resultados respaldan el papel que tiene MPIF como inhibidor de proliferación celular progenitora mieloide multipotencial y proporcionan una visión en el espectro de agentes quimioterapéuticos contra los cuales puede ser efectiva esta quimosina. En otro experimento, el efecto protector MPIF contra toxicidad inducida por 5 -FU se mide utilizando concentraciones MPIF de 0.1 a 100 ng/ml, utilizando dos bloques de fabricación de MPIF como se muestran, Lote #11 y Lote #19. Los datos indican una curva de respuesta de dosis en términos de por ciento de protección de colonia con administración de MPIF. Los datos indican que MPIF a 0.1 ng/ml confiere aproximadamente 30% de quimioprotección y MPIF a 1,000 ng/ml confiere hasta 80% de quimioprotección. (Datos no mostrados.) Compendio de Estudios In Vivo Como se ilustra en la Figura 48, los análisis in vivo de MPIF se han llevado a cabo primordialmente en ratones con estudios de soporte de seguridad del compuesto en conejos y ratas. Los resultados de estos estudios indican lo siguiente: MPIF es un mieloprotector potente para células progenitoras hematopoyéticas. La consecuencia de esta protección es una recuperación más rápida de progenitores de médula ósea en poblaciones de células periféricas que exhiben terapia en comparación -con controles . MPIF puede administrarse diariamente en forma (intravenosa) por periodos tan largos como 14 días sin toxicidad de significancia - MPIF no tiene efecto en el - sistema cardiovascular. MPIF no es pirogénico. MPIF se libera rápidamente de la circulación. Protección In vivo de Progeni tores Mieloide Se realizaron experimentos para determinar si MPIF protege progenitores mieloide ín vivo contra los efectos de un agente quimiterapéutico . Se inyectaron ratones con MPIF (1.0 mg/kg i.p.) diariamente por 3 días a intervalos de 24 horas y luego recibieron una sola inyección de 5-FU (150 mg/kg i.p.) En el tercer día. Se sacrificaron los ratones en diversos tiempos después de tratamiento con 5-FU y el número de colonia de médula ósea se calificaron en ensayos estándar HPP-CFC o LPP-CFC. Los grupos de control incluyen ratones que reciben salino solo y 5 -FU solo. Como se ilustra en la figura 49A, el número de colonias de médula ósea detectadas en ratones tratados con MPIF, regresó a niveles normales en 7 días de administración 5-Fu. En contraste, formación de colonias de médula ósea de ratones tratados con 5-Fu solo, no exhibe recuperación en este punto. Estos resultados muestran el pre-tratamiento con MPIF antes de quimioterapia permite una recuperación más rápida de células formadoras.de colonia, posiblemente a "través de la capacidad de MPIF en proteger progenitores mieloide . Una consecuencia de protección mediada por MPIF de progenitores se manifiesta en la periferia en donde los conteos de leucocitos total (WBC = White Blood Cell) se incrementó poco después de que se observó recuperación de colonias en la médula ósea. Los datos presentados en la Figura 49B resumen ocho experimentos independientes. Los valores indicados se expresan como cuentas promedio WBC a más o menos el error estándar -del promedio. Las diferencias observadas en los días 6 y 8, tienen valores p asociados menores a 0.001 y 0.0001, respectivamente. Efecto Quimioprotector de MPIF en Múl tiples Ciclos de Te api a Aunque los resultados mostrados hasta la fecha soportan el papel de MPIF como protectores precursores de médula ósea protegiendo a través de múltiples ciclos de terapia es el uso clínicamente relevante para MPIF. Los resultados de un experimento en donde el efecto quimioprotector de MPIF se determina durante tres ciclos de terapia, se presentan en la Figura 50. Análisis de formación de colonia de médula ósea utilizando médula ósea obtenida de ratones normales, ratones tratados con 5-FU solo (100 mg/kg i.p.), o ratones "tratados con 5-FU y MPIF (1.0 mg/kg i.p.) indica que MPIF protege progenitores a través de todos los tres ciclos de tratamiento con 5-FU (Grzegorzewski , K.J., y colaboradores , Blood (extracto : sup . ) (aceptado para publicación) ) . Rango de Dosis y Programa de Dosis de MPIF La respuesta de dosis no clínica de MPIF fue amplia, rangos de 0.01 a 10 mg/kg. Esta amplia respuesta fue la razón fundamental para seleccionar un rango 3 -log de dosis para pruebas clínicas.

Los diferentes programas de dosificación no clínicos probados se presentan en la Figura 51. La razón fundamental para seleccionar un programa de dosificación en humanos los días -2, -1, y 0 respecto a la administración de quimioterapia se basa en observaciones de este régimen de tratamiento proporciona la protección más consistente y reproducible de los muchos programas probados en ratones. Además, dada la vida media en suero in vivo relativamente corta de MPIF y el largo tiempo de ciclado de células de progenitores de células de tallo (McNiece y colaboradores, Int . J. Cell Cloning 8:146-160 (1990); Bertoncello _y colaboradores, Exp . Hema tol . 19:174-178 (1991)), es teóricamente benéfico el dar a los pacientes múltiples dosis de MPIF a fin de llevar al máximo exposición de células progenitoras y de esta manera la probabilidad de protección. En conjunto, los resultados in vivo e in vi tro muestran que MPIF es único en su perfil biológico. La capacidad de esta proteína para funcionar como un protector de médula potente sugiere que el encontrar la aplicación como un agente quimioprotector salvará los primeros progenitores mieloide de los efectos de drogas quimoterapéuticas comúnmente empleadas. Él valor clínico de este agente es evidente en su potencial para disminuir la incidencia y severidad de citopenias inducidas por quimioterapia, de esta manera reduciendo la probabilidad de infección y sangrado. Toxicología no Clínica Tres estudios no clínicos se han conducido bajo las guías de buena práctica de laboratorio (Good Laboratory Practice) ; un estudio en el rango de dosis de 7 días, un estudio sub-crónico de 14 días, y un estudio sub-cró?ico de 25 días. Dosis de hasta 20 mg/kg no producen toxicidad significante. Un resumen general de los estudios de múltiples dosis (Figura 52) y un resumen de observaciones clínicas para los estudios no clínicos (Figura 53) se presentan. Además, efectos no autonómicos o cardiovasculares se observaron con dosis de hasta 10 mg/kg. Absorción, Distribución, Metabolismo, y Excreción no Clínicas Estudios farmacocineticos _de MPIF se han realizado en ratones hembra B.ALB/c dada un bolo subcutáneo o intravenoso sencillo de MPIF a un dosis de 20 mg/kg. Tres ratones de cada grupo de tratamiento se sacrificaron y desangraron en cada punto en tiempo, y la concentración de MPIF se determina por ensayo inmunosorbente enlazado por enzima. Como se ilustra en la Figura 54, administración intravenosa de MPIF resulta en una liberación rápida con niveles bajos pero detectables, persistentes tales como 24 horas después de inyección. Administración subcutánea produce un perfil semejante con la diferencia principal que es un retardo de 30 minutos de la aparición de niveles pico en suero. Después de este tiempo, la liberación es indistinguible de la observada entre ratones tratados intravenosamente. La liberación de MPIF es consistente con lo esperado para pequeñas proteínas. Un segundo estudio farmacológico cinético de MPIF se lleva a cabo en ratones que se les proporciona un solo bolo intravenoso de 20 mg/kg. MPIF se libera rápidamente del suero. MPIF puede detectarse 8 horas después de administración a niveles de 0.1% de la dosis administrada . Los estudios descritos, en este ejemplo prueban la actividad de MPIF-1 ( 23) en relación al uso durante quimioterapia. Muchos de estos protocolos son igualmente aplicables a usos de MPIF-1 durante radioterapia. Adicionalmente, una persona con destreza en la especialidad fácilmente puede modificar los estudios ejemplificados para probar la actividad de MPIF-1 de longitud íntegra o sus fragmentos, así como polinucleótidos (por ejemplo, por terapia de genes) , agonistas, y/o antagonistas de MPIF- 1. Ejemplo 35 Es tudios Pre -Clínicos y Clínicos Experiencia Humana Previa Estudio clínico 00304-CRX-HV-01. Un estudio fase I se realiza para evaluar la seguridad, los efectos farmacocinéticos (PK) y farmacodinámicos en voluntarios sanos (Louie y colaboradores , Blood 90:1569A (abstr; suppl) (1997)) . Treinta sujetos (14 Masculinos, 16 Femeninos, edad promedio 46, rango: 21-73 años se aleatorizaron para recibir 6 dosis de MPIF o placebo administrado durante aproximadamente un minuto en seis días consecutivos en una prueba en escala de dosis secuencial controlado con placebo, (0.1, 1, 10, 30, 100 g/kg) . Cada cohorte de dosificación consiste de 6 sujetos aleatorizados en una proporción de activo placebo 5:1. Se estimaron eventos adversos (AE = Adverse Events) para un periodo de 4 semanas. Después de dos semanas, datos de seguridad preliminares se revisaron y se realizó una decisión para iniciar una nueva cohorte. Muestras restante se obtienen para hematología, química, PK, antigenicidad y citometría de flujo para evaluar poblaciones de células de sangre periférica.

Este fue un estudio de seguridad fase I en voluntarios sanos y como tal no fue el objetivo primario de células de cáncer, sin embargo, la evolución de los siguientes parámetros de laboratorio se evaluó: - Conteo de leucocitos (WBC = White Blood Cell) Conteo de neutrofilos absoluto (ANC = Absolute Neutrophil Count) Conteo de eritrocitos (RBC = Red Blood Cell) Conteo de plaquetas - Composición de células de_ sangre periféricas por citometría de flujo No hubo diferencias observadas entre grupos activo y tratados con placebo en términos de conteo de neutrófilos absoluto como se mide por cambio porcentual o conteo absoluto. Estos resultados son comparables con resultados de estudios pre-clínicos en animales normales. Igualmente, no se observa cambio significante de línea base para leucocitos, eritrocitos o plaquetas. Se obtuvieron observaciones de citometría de flujo en series para delinear adicionalmente los efectos de MPIF sub-poblaciones de leucocitos periféricos. El porcentaje de células mononucleares de sangre periférica (granulocitos, monocitos, y linfocitos T y B) como una función de dosis y día de estudio se presentan gráficamente en la Figura 55.

No se observó cambio significante de línea base para granulocitos, o linfocitos T o linfocítos B en cualquier tiempo durante el estudio. La carencia de efecto en conteo de granulocitos en voluntarios sanos fue consistente con la carencia de efecto observado en animales sanos en estudios pre-clínicos . Un decremento dependiente de dosis transitoria en la proporción de monocitos periféricos que contienen CD14 se observa durante los 6 días de administración de MPIF en cohortes que reciben 10-100 g/kg/día. Un cambio relativo de análisis de línea base se realiza para estimar la significancia de inhibición CD14 de monocitos durante el periodo de desplazamiento. El cambio porcentual relativo de línea base para eventos CD14+ se calcula. El valor de línea base se considera control, con cada paciente. Los niveles de línea base fueron* comparables entre brazos de tratamiento, con el valor p de comparación a manera par más bajo = 0.18 (comparaciones entre el tratamiento y placebo) . El análisis total de modelos de variantes fue significante en todos los puntos en tiempo. El cambio de línea base fue significativamente diferente de 0 para los grupos de dosis superior 10, 30, y 100 g/Kg (p=0.0001) . También hubo una diferencia significante entre placebo y estos tres brazos de tratamiento. En una diferencia significante entre el grupo de 100 g/Kg y 30 g/Kg y grupo 10 g/Kg indicando una respuesta a la dosis. Para examinar adicionalmente los efectos de la droga de estudio en la representación de monocitos, se calcula la fuente de monocitos absoluta (.AMC) . Esto se realiza en la misma forma que se calculan las cuentas de neutrófilos absolutos utilizando la siguiente fórmula: AMC = cuenta WBC x % monocitos (de la cuenta diferencial) x 1000 Los resultados se presentan en la Figura 56. El decremento esperado en AMC no se observa durante el tratamiento de MPIF cuando los monocitos se cuantificaron por medios morfológicos. De hecho, se observó un ligero incremento durante el periodo de tratamiento, ocurriendo a dosis de MPIF de 1 g/kg y superiores, con un retorno a cuenta de línea base dentro de 2 a 3 días después de la última dosis. La interpretación más simple de los datos de monocitos es que MPIF provocó un cambio dependiente de dosis en quimiotaxia de monocitos, resultando en un flujo de monocitos que no contienen CD14. Esto puede tomarse en cuenta para el incremento en monocitos absoluto modesto y la reducción de monocitos que contienen CD14 observada por citometría de flujo. Por cualquier método, hubo clara evidencia de actividad biológica transitoria y reversible . Seguridad . Una indicación pretendida para MPIF es la protección de células precursoras mieloide en pacientes que reciben quimioterapia mielosupresora. En pruebas químicas controladas con placebo en en el agente de este agente, el AE reportado más frecuente, se amplifica como mielosupresión y sus complicaciones infecciosas y hemorrágicas relacionadas a administración de quimioterapia concomitante. En los estudios pre-clínicos y clínicos, los efectos de MPIF han sido transitorios, reversibles y limitados a células de linaje mieloide. Aunque se espera que MPIF reduzca la frecuencia, severidad y duración de citopenias inducidas por quimioterapia, una acción inesperadamente prolongada puede empeorar potencialmente las citopenias . En el estudio de voluntarios sanos fase 1 00304-CRX-HV-01, dieciocho sujetos (14 con activos, 4 con placebos) experimentaron un total de 32 eventos adversos (25 con activos, 7 con placebos) . Eventos adversos se codificaron por el investigador ya sea como "asociados con la administración de la droga de estudio", "no asociados con la administración de la droga de estudio", o "relación a la administración de prueba de estudio desconocido" . A fin de estandarizar reporte de evento adverso en términos de causalidad, esos eventos adversos codificados por el investigador "relación a la administración de droga de estudios desconocida", se consideraron por el patrocinador que tenga posible causalidad y por lo tanto han sido reportados bajo "relacionado AE" . Con base en estos criterios, 11 de 25 sujetos tratados con MPIF experimentaron al menos un evento adverso que se considera asociado con la administración de MPIF. Tres de cinco sujetos que reciben placebo experimentaron menos un evento adverso que se considera asociado con la administración de la droga. La incidencia de eventos adversos entre sujetos tratados con agente activo y placebo (44% vs . 60%, respectivamente) fue comparable . Veintinueve de los treinta dos eventos adversos reportados fueron con severidad grado 1 o 2 NCI CTC. Dos fueron de severidad desconocida. Los eventos adversos más frecuentemente reportados fueron dolores de cabeza (5 sujetos, 4 con activo/l con placebo) , somnolencia (3 sujetos, 2 con activo/l con placebo) , y leucopenia (3 sujetos, 2 con activo/l con placebo) . Un resumen de todos los AE reportados para el estudio fase I se presenta en la Tabla 9. * « , 707 . Un evento adverso se reporta como serio y severo. Una mujer blanca de 72 años de edad experimentó vértigo manifestado por mareo, náusea y vómito, e inestabilidad de Ga aproximadamente 56 horas después de i. la administración final de MPIF (30 g/kg) . Se hospitalizó el sujeto durante la noche para observación y evaluación. Exámenes de laboratorio, CT de cabeza y ultrasonido de carótida no fueron revelantes. El sujeto tiene un episodio similar en el pasado distante. Los síntomas se resolvieron rápidamente y el sujeto fue dado de alta del hospital la mañana siguiente sin evidencia de secuelas y completo el estudio. La relación de este evento adverso al medicamento de estudio se reporta por el investigadorcomo "desconocido" .

Tabla 9 Compendio de Eventos Adversos por Sistema de Cuerpo, COSTART y Tratamiento - Intención para Tratar Sistema de Placebo Tratamiento Cuerpo 0.1 g/kg 1.0 g/kg 10 g/kg (COSTART) N % N% N% N% Sistema Hémico/Linfático 1 20 2 40 1 20 0 0 Anemia 0 0 0 0 1 20 0 0 Equimosis 0 0 1 20 0 0 0 0 Leucocitosis 0 0 0 0 0 0 0 0 Leucopenia 1 20 1 20 1 20 0 0 Sistema Muscular esquelético 0 0 0 0 1 20 0 0 Mialgia 0 0 0 0 1 20 0 0 Sistema Nervioso 1 20 0 0 2 40 0 0 Mareo 1 20 0 0 0 0 0 0 Parálisis Facial 0 0 0 0 0 0 0 0 Sistema de Cuerpo Placebo Tratamiento (COSTART) 30 g/Kg N 100 kg T o d o % N% Activo N% Cuerpo como un todo 0 0 1 20 5 20 Dolor .Abdominal 0 0 0 0 0 0 Astenia 0 0 0 0 1 4 Dolor de Espalda 0 0 0 0 1 4 Dolor de Cabeza 0 0 0 0 4 16 Edema en sitio de Inyección 0 0 1 20 1 4 Dolor en sitio de Inyección 0 0 1 20 1 4 Sistema Digestivo 0 0 0 0 1 4 Diarrea 0 0 0 0 1 4 Estomatitis 0 0 0 0 0 0 Sistema Hémico/Linfático 0 0 1 20 4 16 Anemia 0 0 0 0 1 4 Equimosis 0 0 0 0 1 4 Leucocitosis 0 0 1 20 1 4 Leucopenia 0 0 0 0 2 8 Sistema Muscular esquelético 0 0 0 0 1 4 Mialgia 0 0 0 0 1 4 Sistema de Cuerpo Placebo Tratamiento (COSTART) 30 g/Kg N 100 g/kg T o d o s % N% Activos N% Somnolencia 0 0 0 0 2 8 Vasodilatación 0 0 0 0 1 4 Vértigo 1 20 0 0 1 4 Sistema Respiratorio 1 20 0 0 1 4 Faringitis 1 20 0 0 1 4 Piel 0 0 0 0 1 4 Prurito 0 0 0 0 1 4 Sistema Urogenital 0 0 1 20 2 8 Metrorragia 0 0 0 0 1 4 Vaginitis 0 0 1 20 1 4 Parámetros Farmacocine ticos Se evaluaron parámetros farmacocinéticos en el estudio 00304-CRX-HV-01. Muestras de plasma se obtuvieron en línea base y siguiendo la administración inicial a 5, 10, 15 y 30 minutos, 1, 2, 4 y 24 horas. Se obtuvieron muestras adicionales antes de y después de la administración final para evaluar la acumulación de droga . Los datos se resumieron en la Figura 57. Niveles de sangre en circulación fueron detectados fácilmente en cohortes de 0.1 y 1.0 g/kg por hasta 30 minutos y 1 hora, respectivamente. Dosis superiores resultaron en niveles detectables por 24 horas posteriores a infusión. AUC y CMAX fueron proporcionales a dosis administradas. Entre los sujetos que reciben los niveles de dosis más altas (30 y 100 g/kg), la T,,2 fue aproximadamente 0.8 horas . Niveles de plasma antes de la administración final de la droga de estudio el día 6 no indicaron evidencia de acumulación de droga. Estos estudios indican que MPIF-1 no provoca los efectos secundarios asociadoscon el gen G-CSF, tales como dolor esquelético, alopecia, diarrea, fiebre neutropenica, mucositis, fiebre, fatiga, anorexia, etc. Los estudios descritos en este ejemplo prueban la actividad de MPIF-1 (23) . Sin embargo, una persona con destreza en la especialidad fácilmente puede modificar los estudios ejemplificados para probar la actividad MPIF-1 de longitud íntegra, o sus fragmentos así como polinucleótidos (por ejemplo, por terapia de genes) agonistas, y/o antagonistas de MPIF-1. Ejemplo 36 Resumen de Datos y Guía para el Investigador Compendio de Datos Pre -clínicos . Estudios in vivo muestran que MPIF es un potente protector para células progenitoras hematopoyeticas . La inhibición de colonias de progenitoras comprometidos y multipotenciales murinas se observó a concentraciones en el rango de 0. 1 a 100 ng/mL. Experimentos in ví tro han mostrado que MPIF confiere citoprotección de los efectos de antimetabolitos, antibióticos antitumor, inhibidores de topoisomerasa, y taxanos. En estudios in vivo, la consecuencia de esta protección es una recuperación más rápida de progenitores de médula osea y poblaciones de célula periférica después de quimioterapia citotoxica. MPIF puede administrarse diariamente (en forma intravenosa) por periodos tan largos como 14 días sin toxicidad significante. No se observaron efectos adversos en animales hasta la dosis equivalente humana de 1.67 mg/kg. No se observaron efectos adversos en animales en estudios de toxicología de dosis repetidas de 28 días a dosis y hasta 20 mg/kg. MPIF no tuvo efecto promotor de crecimiento detectable en líneas de células de tumor en más de 270 experimentos in vi tro . Compendio de Datos Clínicos MPIF se administró seguramente y fue bien tolerada en voluntarios sanos (n=25) que reciben dosis repetidas en un estudio con escala de dosis, controlado por placebo de fase I (en el rango de dosis: 0.1-100 g/kg) : No se consideran eventos adversos serios relacionados a la administración de MPIF observados en voluntarios sanos . Decrementos dependientes de dosis transitorias en expresión de CD14 se observaron en monocitos de sangre periférica y análisis de citometría de flujo. Cuentas de neutrofilos y monocitos absolutas como se deermina por cuentas diferencial o conteo diferencial no se afectaron. MPIF fue detectable hasta 24 horas posterior a tratamiento. MPIF no fue inmunogénico cuando se administra a voluntarios sanos. Riesgos Posibles y Efectos Secundarios . Los efectos de MPIF han sido transitorios, reversibles, y limitados a células de linaje mieloide en estudios pre-clínicos y clínicos. Aunque el MPIF se espera que reduzca la frecuencia, severidad, y duración de citopenias inducidas por quimioterapia, una acción inesperadamente prolongada puede empeorar potencialmente citopenias. Eventos adversos transitorios, con frecuencia y severidad comparable con placebo, se observaron el estudio clínico inicial de voluntarios sanos que reciben múltiples dosis intravenosas de hasta 100 g/kg de MPIF. No se observaron reacciones agudas que se consideran relacionadas a la administración de MPIF. MPIF fue no inmunogénico en voluntarios sanos. Aunque se han asociado unos cuantos eventos adversos con administración de MPIF, la introducción de 5 una proteína exógena puede resultar potencialmente en reacciones sistémicas o locales mediadas inmunológicamente. Sujetos pueden experimentar |B reacciones alérgicas agudas (tales como fiebre, urticaria, hiper- o hipotensión, y broncoespasmo) u otras 10 reacciones tales como vasculitis, o enfermedad de suero. La posibilidad de disfunción renal, disfunción hepática, inmunosupresión, coagulopatía y neuropatía, aunque remotas no pueden ser excluida . Los sujetos deberán ser monitoreados 15 cercanamente durante y después de administración por cualquier signo de reacción adversa aguda. Suministros de emergencia (incluyendo epinefrina, corticoesteroides, agentes presores, y equipo desfibrilador cardiaco) habrán de ser fácilmente disponibles para uso, en caso de que 20 ocurriera una reacción aguda. ^k Contraindicaciones . La seguridad de este producto para utilizar durante embarazo o con madres lactantes no se ha demostrado en pruebas clínicas. . Precauciones Información para Pacientes . MPIF, como con todos los productos de investigación solo habrá de emplearse, bajo la dirección de un investigador o médico de prueba clínica que se ha familiarizado con este producto. La seguridad de este producto para utilizarlo durante embarazo o con madres lactantes no se han demostrado en pruebas clínicas. Estudios experimentales en animales para estimar la seguridad con respecto a desarrollo del embrión o feto, es su aceptación y desarrollo peri- y post-natal no se han conducido.

Cualquier mujer que haya perdido un periodo menstrual deberá considerarse embarazada hasta que demuestre de otra forma. Solo investigaciones imperativas por lo tanto deberán llevarse a cabo durante el embarazo cuando el probable beneficio exceda el riesgo incurrido por la madre y el feto. No se conoce si MPIF se distribuye en la leche. La lactancia deberá ser interrumpida si se encuentra necesario una administración de la droga de estudio. Pruebas de Laboratorio . Cuentas de sangre periféricas deberán ser monitoreadas cercanamente en pacientes tratados con MPIF. Pruebas de laboratorio puedan llevarse a cabo de acuerdo -con el protocolo clínico acompañante.

Interacciones de Producto . MPIF no se anticipa que provoque ninguna interacción estéril con otras drogas . Carcinogénesis , Mutagénesis, Deterioro de Fertilidad Estudios en animales para examinar el potencial carcinogénico y mutagénico no se han conducido con MPIF. Estudios In vi tro indican que MPIF no tiene efecto detectable en líneas de células de tumor. Abuso y Dependencia del Producto . El potencial de abuso y dependencia del producto MPIF no se han examinado en estudios no clínicos y clínicos, pero se espera que sea despreciable. Sobredosis . No hay experiencia clínica con sobre dosis de MPIF. No se ha observado toxicidad en animales cuando se da una .dosis hasta 20 mg/kg por 14 días consecutivos. Este es equivalente a una dosis de 1.67 mg/kg en humano. Dosis y Administración . El régimen de dosificación de dosis óptimas para MPIF no se han determinado. Estudios iniciales evaluaron la seguridad y dosificación diaria de 0.1 a 100 g/kg de MPIF administrado intravenosamente por hasta 6 días . Estudios fase 2A para determinar la actividad biológica de eficacia preliminar se valoran en un rango de dosis de 1-100 g/kg. Regímenes de dosis subsecuentes se determinarán a partir de los resultados de estos estudios de eficacia tempranos. Suminis tro y Almacenamiento . MPIF se suministra como una formulación líquida estéril. Este producto "debe ser almacenado entre 2° y 8°C, en un área accessible solo a personal autorizado. La droga diluida para administración a pacientes se ha mostrado que es estable por hasta 12 horas a temperatura ambiente sin degradación del producto. Los estudios descritos en este ejemplo prueban la actividad de MPIF-1 ( 23) . Sin embargo, una persona con destreza en la especialidad puede fácilmente modificar los estudios ejemplificados para probar la actividad de MPIF-1 de longitud íntegra, o sus fragmentos así como polinucleoutidos (por ejemplo, por terapia de genee) , agonistas, y/o antagonistas de MPIF-1. Ejemplo 37 Es tructura de Solución y Dinámica de MPIF- 1 Compendio El factor inhibitorio progenitor mieloide-1 (MPIF-1) es un inhibidor de células progenitoras y un activador de monocitos . La estructura de solución de MPIF-1 se ha determinado por espectroscopia de resonancia magnética nuclear (NMR) . A diferencia de muchas quimosinas CC, la estructura MPIF-I _ muestra que es un monómero. La estructura está bien definida excepto por los residuos extremo y adopta un dobles quimosina característico de 3 -hebras y una hélice superpuesta. Además de las cuatro cisteínas que caracterizan la mayoría de quimosinas, MPIF-1 tiene dos cisteínas adicionales que forman un enlace disulfuro. La dinámica de su prueba principal indica que los residuos N-terminal funcionalmente importantes, residuos del bucle N-terminal, y residuos adyacentes a los enlaces disulfuro muestran dinámicas significantes en comparación con el núcleo de la proteína. MPIF-1 se procesa a partir de una pro-proteína de 99 amino ácidos en el extremo N y esta última también es funcional, aunque con actividad reducida y es un monómero bajo una variedad de condiciones de solución. MPIF-1 por lo tanto es único, conforme pre-proteínas más largas de todas las otras quimosinas se asocian. Estos estudios son consistentes con la idea de que un monómero es suficiente para activar receptores 7-TM en leucocitos. Introducción Quimosinas, (citocinas quimotácticas) median diversos procesos biológicos, incluyendo tráfico de leucocitos, hematopoyesis y angiogénesis y juegan un papel fundamental en defensa de huésped contra infección (Baggiolini, M. , y colaboradores, Annu . Rev. Immunol . 15:675-705 (1997); Rollins, B. J. , Blood 90:909-928 (1997); Luster, A. D., N. Engl . J. Med. 338:436-445 (1998) ) . Hasta la fecha se han identificado 40 quimosinas todas son de 70 a 100 amino ácidos de longitud y se caracterizan por cuatro cisteínas conservadas . Quimosinas se clasifican ampliamente en familias CC y CXC en base a si las dos primeras cisteínas están adyacentes (CC) o separadas por un amino ácido (CXC) . Las quimosinas CXC pueden además dividirse en dos subgrupos ' ELR' y 'no-?LR'. Todas las quimosinas ELR CXC activan neutrófilos, mientras que quimosinas no-ELR CXC activan diferentes subconjuntos de linfocitos. CC quimosinas activan monocitos, macrófagos, eosinófilos, basófilos, células-T pero no neutrófilos. Además, un solo miembro de una familia C que contiene solo dos cisteínas y un solo miembro de una familia CX3C se han identificado también. El Factor Inhibitorio Progenitor Mieloide-1 (MPIF-l) (también conocido como CK 8) , un miembro de la familia CC, se identificó inicialmente en un esfuerzo de secuenciado a gran escala y se expresa de manera constitutiva en hígado, pulmón, páncreas y médula ósea (Patel, V. P., y colaboradores, J. Exp . Med. 185: 1163- 1172 (1997) ) . Además de inhibición de formación de colonia de células de médula ósea que dan lugar a linajes de granulocitos y monocitos, también es quimiotáctico para monocitos y eosinófilos (Patel, V. P., y colaboradores, J. Exp. Med. 185:1163-1172 (1997); Youn, B.-S., y colaboradores, Blood 91 :3118-3126 (1998)).

Lisado o ruptura alterna resulta en dos formas de proteína, es decir CK 8 y CK 8-1, que son de 99 y 116 amino ácidos de longitud, respectivamente (Youn, B.-S., y colaboradores, Blood 91:3118-3126 (1998)). De manera interesante, una forma truncada de la proteína de 99 amino ácidos (24-99) , hasta la fecha referida como MPIF-1, se observa que es substancialmente más activa (Nardelli, B., y colaboradores, J. Immunol . 162:435-444 (1999); Berkhout, T. A., y colaboradores, Biochem .

Pharmacol . 59:591-596 (2000)). Experimentos de desensibilización cruzada en monocitos y eosinófilos indican que MPIF-1 se liga de manera predominante al receptor CCRl pero la desensibilización incompleta en ambos casos también sugiere que uno o varios receptores adicionales pueden estar involucrados (Nardelli, B., y colaboradores, ". Immunol . 162:435-444 (1999)). MPIF-1 induce una liberación dependiente de dosis rápida de ácido [3H] -araquidónico de monocitos que depende de calcio extracelular y se bloquea por inhibidores de fosfolipasa A2 (PLA2) . Además, la activación PLA2 se muestra que es necesaria para formación de actina filamentosa en monocitos . Estructuras de varias quimosinas CXC y CC se han resuelto por espectroscopia RMN y cristalografía de rayos X (Clore, G. M. , y colaboradores, Biochemistry 29: 1689-1696 (1990); Fairbrother, W. J. , y colaboradores, J.

Mol . Biol . 242:252-270 (1994); Kim, K. S., y colaboradores, J. Biol . Chem. 269:32909-32915 (1994); Malkowski, M. G., y colaboradores, J. Biol . Chem. 270:7077 (1995); Zhang, X., y colaboradores, Biochemistry, 33:8361- 8366 (1994); Lodi, P. J. , y colaboradores, Science 263:1762-1767 (1994); Skelton, N.

J. , y colaboradores, Biochemistry 34^5329-5342 (1995); Handel, T. M. , y Domaille, P. J. , Biochemistry 35.-6569-6584 (1996); Kim, K. S., y colaboradores, FEBS Lett . 395:277-282 (1996); Crump, M. P., y colaboradores, J. Biol . Chem. 273 :224 '1-2247'9 (1998); Sticht, H., y colaboradores, Biochemistry 38:5995-6002 (1999)). La mayoría de las quimosinas caracterizadas inicialmente fueron dímeros y además se observa que las quimosinas CXC y CC dímerizan utilizando diferentes regiones de las proteínas. En quimosinas CXC, la primer hebra constituye la interfase de dímero, mientras que las quimosinas CC, los residuos N-terminal constituyen la interfase del dímero. Estas observaciones y la observación de que las quimosinas CXC activan solo neutrófilos y las quimosinas CC activan oros leucocitos, llevan a la creencia de que la formación de dímero es esencial para el enlace de receptor de 7-TM leucocito. Subsecuente descubrimiento y caracterización de quimosinas tales como SDF-1 (una quimosina CXC), MCP-3, eotaxina, HCC-2, y 1-309 (quimosinas CC) , han obviado estas diferencias ya que las quimosinas son predominantemente monómeros (Kim, K. S., y colaboradores, FEBS Le t t . 395:277-282 (1996); Crump, M. P., y colaboradores, J". Biol . Chem . 273:22471-22479 (1998); Sticht, H. , y colaboradores, Biochemistry 38:5995-6002 (1999);" Crump, M. P., y colaboradores, .EMBO J. 16:6996-7007 (1997)). Estudios en solución también han mostrado que la asociación es sensible a concentración iónica, condiciones de amortiguador y pH (Mayo, K. H., y Chen, M. -J. , Biochemis try 28:9469-9478 (1989); Yang, Y., y colaboradores, J. Biol . Chem. 269:20110-20118 (1994); Lowman, H. B., y colaboradores, Protein Sci . 6:598-608 (1997) ) . Mutational studies (Estudios Mutacionales) (Czaplewski, L. G. , y colaboradores, J. Biol . Chem. 274:16077-16084 (1999); Laurence, J. S., y colaboradores, Biochemistry 39:3401-3409 (2000); Paavola, C. D., y colaboradores, J". Biol . Chem. 273:33157-33165 (1998)) y atrapar la quimosina en el estado de monómero (Rajarathnam, K. , y colaboradores, Science 264:90-92 (1994); Rajarathnam, K. , y colaboradores, J. Biol . Chem . 272: 1725- 1729 (1997)) han mostrado que un monómero es suficiente para ligar y activar los receptores 7-TM en leucocitos. Recientes estudios sugieren que la formación de dímero puede jugar un papel para ligar a proteoglicanos y establecer un gradiente de concentración, un proceso que es esencial para tráfico de leucocitos dirigido (Hoogewerf, A. J., y colaboradores, Biochemistry 36:13570-13578 (1997); Koopmann, W. , y Krangel, M. S., J". Biol . Chem. 272:10103-10109 (1997)). En este estudio, la estructura de solución y las dinámicas de estructura principal de MPIF-1 se caracterizaron por espectroscopia RMN. Además, las propensiones de asociación de MPIF- 1 y la proproteína MPIF-1 de longitud íntegra se estudiaron bajo una variedad de condiciones de solución por mediciones de ultrac ntrifugación-sedimentación. Las implicaciones de la estructura y las dinámicas y las propiedades de 5 asociación se discuten en términos de sus funciones. Los datos 'de este estudio forman la base estructural para estudios de mutación y para terapéuticos dirigidos a , estructura para enfermedades inmuno relacionada . Procedimientos Experimentales 10 Expresión y Purificación de Proteína . La secuencia de gen MPIF-1 se sintetiza químicamente con codones optimizados para expresión en E. coli . El gen luego se subclona en el vector de expresión pHE4 que contiene un fuerte promotor sintético con dos operadores 15 lac, un sitio de enlace ribosomal eficiente y un terminador de transcripción sintético corriente abajo del gen insertado. El plásmido de expresión se transforma en la cepa SG13009 derivada de E. coli K12. Después de inducción por IPTG, MPIF-1 se produce como una proteína 20 insoluble y se extrae y vuelve a doblar en HCl Guanidina 1.75 M en la presencia de cisteína 5 mM. La proteína expresada tiene un Met extra (el codón de inicio) en el extremo-N y por simplicidad se considera como el primer residuo de MPIF-1. La proteína se purifica a homogeneidad por pasos sucesivos a través de una columna de intercambio de catión fuerte (poros HS-50) , de anión (poros HQ-50) y catión (poros CM-20) y finalmente a través de una columna de exclusión de tamaño (Sephacryl 5 S-100) . El MPIF-1 maduro de 99 amino ácidos de longitud íntegra se clona, expresa y purifica como se establece para la proteína MPIF-1. ¡ Equilibrio de Sedimentación . Experimentos de ultracentrifugación analítica se realizaron en una ultra 10 centrífuga Beckman modelo XL-A a 20°C a velocidades de rotor de 23,000, 28,000 y 40,000 rpm. Se llevaron a cabo experimentos en dos diferentes concentraciones de partida en diferentes amortiguadores y concentraciones iónicas para estudiar su efecto en dimerización (Tabla 10) . Se 15 midió la absorbancia a 280 nm y los datos se recolectan como un promedio de cinco exploraciones radiales sucesivas utilizando un tamaño de escalón de 0.003 cm.

Los datos se ajustan con la siguiente ecuación: Cr = C0exp(MHd) + C02Kaexp(2MHd) + E 20 en donde d es (r2- r02) , H= (1 - up) (?2/2RT) , Cr y C0 son las concentraciones al radio r y r0 respectivamente, M es el peso molecular del monómero, u es el volumen específico parcial, p es la densidad del solvente, ? es la velocidad angular del rotor, Ka es la constante de 25 asociación del equilibrio monómero-dímero y E es el desplazamiento de línea base. Volúmenes específicos parciales se calcularon a partir del promedio en peso de los volúmenes específicos parciales para amino ácidos individuales. Se ajustaron datos a la ecuación por mínimos cuadrados no lineales, utilizando el soporte lógico o programa Microcal Origin 4.1 que se proporciona por Beckman para XL-A. La calidad del ajuste se caracteriza por X2 , la suma de los cuadrados de los residuos y examen de los residuos para desviación sistemática. Los datos se ajustaron a una sola especie o a un modelo monómero-dimero. Los pesos moleculares teóricos de MPIF-1 y MPIF-1 (1-99) son 8854.6 y 11367.6 respectivamente y los datos pudieron ajustarse a un monómero para ambas proteínas bajo todas las condiciones en solución (Tabla 10) .

Tabla 10. Estudios de Ultracentrifugación en Equilibrio de Sedimentación de MPIF-1 y MPIF-1 de Longitud Integra Proteína .Amorti- pH Temp. (°) PM Cale.1 Estado guador MPIF-1 20 mM NaPi 5. .0 23 8.8+0.6 M 20 mM NaPi 7. .0 23 9.0+0.8 M 20 mM NaPi, 100 mM NaCl 7 .0 23 7.9+1.2 M 50 mM NaPi, 100 M NaCl 7. .0 23 9.2+0.5 M MPIF-1 20 mM Oac, 100 mM NaCl 5. .0 23 9 .8+0.6 M (de longitud íntegra) 20 mM NaPi, 100 mM NaCI 5. ,0 23 11 .4+0.7 M 20 mM NaPi 7. ,0 23 11 .2 ±0 .6 M 20 mM NaPi, 100 mM NaCI 7. ,0 23 10 .0+1.0 M '''peso molecular calculado del ajuste de los datos a tres velocidades de rotor; 23,000, 28,000 y 40,000 rpm. Espectroscopia de RMN. Todos los espectros se recolectaron a 35°C en una Unidad Varían Plus 600 o un espectrómetro INOVA de 500 -MHz, ambos equipados con accesorios de gradiente de campo. La concentración potencial fue 2 mM en acetato de sodio 20 mM, azida de sodio 1 mM, pH 5.2 en 90% H2?/l0% 2H20 (v/v) o 99.99% 2H20. Desplazamientos químicos se refieren a DSS utilizando el método de Wishart y colaboradores, (Wishart, D. S., y colaboradores, J. Biomol . RMN 6: 135-140 (1995)). La asignación de las resonancias NH de cadena principal, N, C, y C se hacen con base en experimentos HNCACB y CBCA(CO)NH (Muhandiram, D. R. , y Kay, L. E. , J. Magn .

Reson. 103: 203-216 (1994)) . Los desplazamientos químicos de los átomos de cadena lateral fueron asignados a partir de espectroscopia de correlación total editada 15N (TOCSY) (Zhang, O., y colaboradores, J. Biomol . RMN 4:845-858 (1994)) y experimentos HCCH-TOCSY (Kay, L. E., y colaboradores, ". Magn. Reson . B 101:333 (1993)). Una espectroscopia de mejora Overhauser nuclear 1H-1H bidimensional de alta resolución (NOESY) , experimentos TOCSY y DQF-COSY se emplearon para asignar los fotones aromáticos. Distancias interprotones se derivaron de NOESY 15N editado (tiempos de mezclado 50 ms y 150 ms) y experimentos NOESY 15N/13C-editado (tiempo de mezclado 75 ms) (Pascal, S. M. , y colaboradores, J. Magn . Reson . B 103:197-201 (1994)). Intensidades máximas cruzadas NOE se clasificaron como fuerte, media, débil o muy débil correspondiente a restricciones de distancia superior de 2.8, 3.5, 4.0, y 5.0 Á, respectivamente. Límites superiores para protones metilo y metileno no 5 estereoespecíficamente asignados se corrigieron apropiadamente con promediado central. Además, 0.5 A se agrega a la frontera superior para corregir superior I intensidad por distancias que involucran protones metilo.

Se obtuvieron restricciones de un experimento HNHA 10 (Kuboniwa, H. , y colaboradores, Na t . Struct . Biol . 2:768 (1995) ) y la asignación estereoespecífica de los protones se obtiene de constantes de acoplamiento 3J derivadas de un experimento HACAHB (Grzesiek, S., y colaboradores, J.

Am. Chem. Soc . 117:5312-5315 (1995)), y las intensidades 15 relativas de los ?OEs de los protones ?H y CH a CH en espectros ?OESY. Asignaciones estereoespecíficas de los protones metilo Leu 25 y 66 se realizaron en base a la intensidad ?OE relativa de los protones CH a CH3 después de establecer el ángulo 1. 20 Restricciones de Enlace de Hidrógeno . Los candidatos potenciales para enlace de hidrógeno se identificaron inicialmente en base a observar protones de amida de lento intercambio de una serie de espectros 2D 1H-15? HSQC registrados dentro de 24 horas al disolver la proteína en 2H20. Por cada enlace de hidrógeno, se utilizaron dos restricciones de distancia (rNH_0, 1.8-2.3 A y rN_0, 2.4-3.3 Á) . Las restricciones de enlace de hidrógeno se utilizan solo después de que se ha calculado un conjunto de estructuras inicial. Solo los protones de amida que satisfacen las restricciones de distancia y angulares con aceptores de enlace de hidrógeno, se emplearon en los cálculos de estructura. Cálculos de Estructura y Procesamiento de Datos . Todos los espectros RMN se utilizaron procesando la suite de programas nmrPipe (Delaglio, F., y colaboradores, J. Biomol . RMN 6:277-293 (1995)). Se calcularon estructuras por el método de alineado simulado dinámico de geometría de distancia híbrida, utilizando el programa XPLOR (Brunger, A.T., XPLOR Versión 3.1 Manual, Yale University, New Haven, CT, (1993)). Un total de 713 restricciones de distancia NOE no redundantes (320 intra-residuo, 178 secuenciales, 84 de rango medio y 132 de rango largo NOEs) se utilizaron. Además, 82 dihédricas (53 y 29x) y 36 restricciones de enlace de hidrógeno (de 18 enlaces de hidrógeno) se utilizaron en los cálculos de estructura final. Las estructuras iniciales se generaron con restricciones NOE solas y en subsecuentes cálculos de estructura, se incluyeron las restricciones dihédrica y de enlace de hidrógeno. Los cálculos alineados simulados, se llevaron a cabo utilizando el conjunto de parámetros de campo de fuerza standard y archivo de topología en XPLOR versión 3.1. Un total de 50 estructuras se generaron y las mejores 30 estructuras se seleccionaron en base a las más bajas energías y buena calidad estereoquímica. Dinámicas . Experimentos 15N-Tlf T2 y I^H] -15N NOE se registraron a 35°C en un MPIF-1 uniformemente etiquetado 15N utilizando versión de gradiente de las secuencias de pulso (Farrow, N. A. , y colaboradores, Biochemistry 33:5984-6003 (1994)). Todos los espectros se adquirieron con puntos reales 544 (T2) y 128 (Tx) y un retardo de reciclo de 3 s se utilizó para los experimentos T2 y de 1.2s para T2. [1H] -15N NOEs se midió al registrar espectros HSQC con y sin saturación de protones. Los espectros sin NOE se registraron con retardos de 5 s y los espectros con NOE con retardo de 2 s y 3 s de saturación de protón para dar el mismo retardo de 5 s entre transitorios. Los espectros se procesaron utilizando NMRPipe y los primeros espectros 15N T? y T2 bidimensionales se asignaron manualmente utilizando el programa PIPP. Espectros subsecuentes se recogieron automáticamente utilizando el programa CAPP. Valores 11 y T2 se obtienen por ajuste de mínimos cuadrados no lineal de los picos cruzados a un deterioro exponencial de los parámetros . Incertidumbres en los valores Tx y T2 se toman como la desviación standard del ajuste. Valores NOE se obtienen de la relación de intensidad de picos registrados con y sin saturación de protones. Incertidumbres en los valores NOE se estimaron de la línea base de los espectros como se define por Farrow y colaboradores, 1994 (Farrow, N. A., y colaboradores, Biochemistry 33 : 5984-6003 (1994)). Resul tados Equilibro de Sedimentación . La capacidad de quimosina en asociarse depende de las condiciones en solución tales como pH y concentración iónica. Las propiedades de asociación del MPIF-1 y el MPIF-1 de longitud íntegra se estudiaron utilizando métodos de ultracentrifugación a diferentes pH y concentraciones iónicas . El resumen de los resultados se ilustra en la Tabla 10. Los datos indican que tanto las proteínas son monoméricas bajo las condiciones experimentales y demuestran tendencia para asociarse. El estado monomérico de MPIF-1 es consistente con la estructura RMN y también del cálculo del tiempo de correlación por dinámica 15N.

Estadísticas Estructurales de MPIF-1 Las estadísticas de las 30 estructuras de los alineados simulados finales (SA) se ilustran en la Tabla 11, y la superposición de las estructuras individuales en la estructura promedio se ilustra en la Figura 58 A. La estructura de la proteína está bien definida excepto por los residuos terminales 1-10 y 67-77. La calidad de las estructuras generadas se probó utilizando los programas PROCHECK (Laskowski, R. A., y colaboradores, ". Appl . Crystallogr. 26:283-291 (1993)) y VADAR (VADAR-structural analysis of protein structures (análisis estructural VADAR de estructuras de proteína) disponible de http : //www.pence.ualberta. ca) para diversos criterios tales como estereoquímica, enlaces de hidrógeno, la región de ocupación en la gráfica Ramachandran, contactos de van der Waals, residuos cargados enterrados, números de residuos enterrados y defectos de empaque. Todas las 30 estructuras cumplen con los criterios anteriores que se esperan para una estructura de alta resolución.

Tabla 11. Estadísticas estructurales y diferencias de r.m.s. atómicas para 30 estructuras MPIF- 1 calculadas Energías (kcal. mol1) NOEa 3.21±0.48 Dihédrica3 O.Ol±O.Ol enlaces 4.31±0.09 van der Waals 1.54±0.30 Deviaciones de geometría idealizadab Enlaces (Á) 0.0019±0.0001 Ángulos (°) 0.536±0.001 Impropio (°) 0.305+0.001 Diferencia de r.m.s. atómica (Á) c átomos de estructura principal (11-66) 0.57±0.08 átomos pesados (11-66) 1.09 + 0.08 a Los valores para ángulos de torsión y NOE se calcularon a partir de un potencial de pozo cuadrado con una constante de fuerza de 200 kcal. mol-1 Á2 y 50 kcal mol"1 rad"2, respectivamente. B Los valores para enlace, ángulos e impropios muestran la desviación de los valores ideales con base en estereoquímica perfecta. c Diferencias de r.m.s. de las 30 estructuras finales superpuestas en la estructura promedio. Todas las estructuras y la estructura promedio minimizada de energía, exhiben buena geometría covalente (Tabla 11) y mínimas violaciones de restricción RMN. Ninguna de las 30 estructuras SA tuvieron violaciones NOE mayores a 0.2 Á y violaciones de ángulo dihédricas mayores a 2 ° . La distribución r.m.s. para los residuos 11-66 entre todas las 30 estructuras y la estructura promedio es 0.57 Á para los átomos de estructura principal y 1.09Á para los átomos pesados (FIG. 59A, B) . La precisión de los ángulos de torsión se estima en términos del parámetro de orden S (Hyberts, S. G. , y colaboradores, Protein Sci . 1 :736-751 (1992)). El parámetro de orden para los ángulos y torsión para los residuos estructurados es 11-66 es >0.95 indicando que la estructura principal de las estructuras está bien definida (FIG. 59C, D) . El parámetro de orden para 1 se ilustra en la Figura 59. La Figura 60F muestra el área accesible de solvente y un valor bajo implica que la cadena lateral está enterrada e inaccesible al solvente en volumen. Estos residuos tienden a ser hidrofóbicos y en general están altamente estructurados como se evidencia por el parámetro de alto orden para 1 > 0.9 (FIG. 59E) . Una excepción de un gran hidrófobo que muestra un bajo S es Ile-13. Está expuesto a solvente y se conserva en varias quimosinas CXC y CC y estudios de función-estructura han mostrado un papel esencial para este residuo en enlace de receptor. Se observa que todos los ángulos de torsión en todas las 30 estructuras caen en la región favorecida de la gráfica Ramachandran. 72 % de los residuos caen en la región núcleo (más favorecida) , 23 % en la región permitida y 1 % en la región generosa. Es tructura de Solución de MPIF-1 . La estructura de MPIF-1 adopta un pliegue quimosina_ típico y consiste de un bucle extendido en el extremo N seguido por tres hebras y una hélice C-terminal (FIG. 58B) . Los primeros diez residuos que preceden al motivo CC no muestran o solo NOEs secuenciales, tienen bajos parámetros de orden para y y por lo tanto carecen de estructura definida. Esto se sigue por un bucle N-terminal que contiene una serie de vueltas (residuo 13-20) que conducen a una hélice 310 (residuos 21-24) . La primer hebra (residuos 27-31) se conecta por una vuelta tipo III a la segunda hebra (residuos 39-44) que se conectan por una vuelta tipo I a la tercer hebra (residuos 48-52) . La tercer hebra conduce a la hélice (residuos 56-66) por una vuelta tipo III. Los residuos 67-77 son substancialmente no estructurados consistentes con la carencia de NOEs, de largo rango, unos cuantos NOEs medios, y parámetros de bajo orden. Protones hidroxilo de Thr-31 y Thr-44, localizados en el extremo de la primer hebra y la segunda hebra, respectivamente, están unidos a H a los carbonilos de estructura principal a través de la hebra y por lo tanto juegan un papel estructural. De las seis cisteínas, cuatro cisteínas se caracterizan de todas las quimosinas CC: Cys- 11 forma un disulfuro con Cys-35, que es parte de la vuelta que enlaza las primeras y segundas hebras y Cys-12 forma un enlace disulfuro con Cys-51 en la tercer hebra. MPIF-1 tuvo dos cisteínas adicionales, Cys-22 en la hélice 3? y Cys-62 en la hélice . Una base de datos de desplazamientos químicos de cisteína se ha creado y se observaron desplazamientos C como únicamente diferentes en la forma libre y unida a disulfuro (resultados no publicados) . Los desplazamientos de Cys-22 y Cys-62 indican que están involucrados en formación de enlace disulfuro. La estructura revela que las cisteínas están próximas a formar un enlace disulfuro y esto también es evidente de las propiedades RMN tal como la pequeña constante de acoplamiento, protón amida de intercambio lento y patrón NOE para Cys-62 que son características de un residuo helicoidal . Enlaces disulfuro Cys- 12-Cys-51 adoptan un torcimiento de mano izquierda en la mayoría de las estructuras, mientras que los otros dos enlaces disulfuro no son estructurados. El núcleo en la estructura está bien definido por un número de contactos hidrofóbicos de rango largo (Ile-20, Leu-25, Tyr-28, Phe-29, Val- 40, Phe-42, Phe-50, Ala-52, Val-59, Met-63, y Leu-66) entre residuos de la hélice-y las hebras- . Además de los enlaces disulfuro, NOEs de rango largo entre Thr-31, Gly-39, Tyr- 15, Cys-11, Cys- 12 y Cys-51 orientan el bucle terminal N y los residuos N-terminal con respecto a la estructura núcleo que puede ser esencial por su función. Dinámicas . Los datos de relajamiento 15N Tl r T2, y NOE pueden ser obtenidos para 60 de 73 resonancias esperadas (FIG. 60A-C) . No hay datos disponibles para 4 prolinas y no pueden obtenerse para los residuos restantes Met-1, Asp-2, His- 5, Ala-6, Ser-8, Ile-13, Ser-19, Ser-33, Glu-34, Ser-36, Lys-46, Leu-66 y Lys- 67, ya sea debido a superposición del desplazamiento químico o debido a que las señales eran demasiado débiles para una cuantificación confiable de las intensidades. Los datos de relajamiento 15N T1; T2, y NOE se analizaron para describir la dinámica interna de MPIF-1, utilizando el formalismo independiente del modelo de Lipari-Szabo (Lipari, G. , y Szabo, A., J". Am . Chem . Soc. 104:4546-4559 (1982a); Lípari, G. , y Szabo, A., J". Am. Chem . Soc. 104:4559-4570 (1982b)). Datos de relajamiento por cada residuos se ajustaron a diferentes modelos que incluyen S2-c(modelo 1), S2-c-e (modelo 2), 52-c-Rex (modelo 3), S2-c- -e-R¡,? (modelo 4) y un modelo de escala de dos tiempos (modelo 5) que permite que ocurran movimientos internos a dos escalas de tiempo distintas (Clore, G., y colaboradores, ". Am . Chem . Soc. 112*:4989-4991 (1990) ) .

El modelo apropiado se seleccionó por cada residuo al evaluar la calidad del ajuste. El óptimo c se calcula inicialmente en una base por residuo al minimizar los valores experimentales y calculados Tl r T2, y NOE utilizando la función de densidad espectral isotrópica. Bajo condiciones en donde los movimientos internos son más lentos que 100 ps y T2 no está significativamente recortada debido al intercambio de conformación, la proporción r1/l2 (FIG. 60D) se considera independiente de los parámetros de orden o los movimientos internos y proporciona un estimado del tiempo de correlación total c. Estos residuos se identificaron como aquellos con valores 15N [XH] NOE < 0.65 y para los cuales la proporción Tx/T2 estaba fuera de 1 SD del promedio. En esta base, 26 residuos se excluyen y c se calcula como 4.6±0.2 ns en base a los 34 residuos restantes.

Los parámetros de orden generalizado (S2) , intercambio químico (Rex) , y tiempo de correlación local ( ß) como una función de secuencia de amino ácidos, se ilustran en las Figuras 60E-G. Parámetros de orden generalizados proporcionan una medida de la amplitud de movimiento interno, en donde 52=1 significa que el vector de enlace N-H determinado es rígido, mientras que S'2=0 indica que el movimiento no es restringido. Los residuos 67-77 en el extremo C y los residuos 1-10 precedentes a la primer cisteína en el extremo N, exhiben parámetros de baj o orden ( S2 0.7) Ambos términos se definen pobremente en las estructuras RMN y los datos dinámicos confirman que estos residuos son intrínsecamente móviles y que la carencia de estructura no se debe a la carencia de restricciones experimentales. Excluyendo los extremos, los valores promedio S2 para los residuos 11-66 son 0.8±0.06. Otros residuos que exhiben parámetros de bajo orden son Arg-18 y Ile-20 (0.7) que son parte del bucle N-terminal. Datos de relajamiento para los residuos Tyr-15, Cys-22, Thr-44, Cys-51, Ala-52, Asn-77 requieren un término de intercambio (modelo 3 o 4) y (FIG. 60G) y para los residuos C-terminales 69-73 requieren el modelo en escala de dos tiempos. Los residuos Arg-3, Phe-4 y Thr-74 no pudieron ajustarse a ningún modelo. Todos los otros residuos pudieron ajustarse al modelo simple. Discusión MPIF-1 es un monómero en solución. La determinación de estructura RMN y el cálculo del tiempo de correlación rotacional para dinámicas 15N indican que MPIF-1 existe como un monómero bajo las condiciones experimentales (acetato 50 mM, pH 5.2) . Estudios de ultra-centrifugación en una variedad de condiciones de solución también indican que MPIF-1 existe como un monómero (Tabla 10) . Estudios estructurales y de solución han proporcionado alguna visión en las propiedades de asociación en quimosinas, pero las características moleculares que contribuyen a la especificidad de las interacciones, permanecen elusivas. CC quimosinas muestran la más grande diferencia en su capacidad para asociarse y pueden existir desde polímeros de muy alto orden a monómeros. RANTES (Skelton, N. J. , y colaboradores, Biochemistry 34:5329-5342 (1995)), MIP-1 (Czaplewski, L. G., y colaboradores, ". Biol . Chem. 214 : 16011 - 16084 (1999)) MIP-1 (Lodi, P. J., y colaboradores, Science 263:1762-1767 (1994)) se asocian altamente a pH neutro (> 100 kDa) pero disocian reversiblemente a menor pH a dímeros mientras que 1-309, HCC-2 y~ MCP-3 son monoméricos (Paolini, J. F., y colaboradores, J. Immunol . 153:2704-2717 (1994); Sticht, H. , y colaboradores, Biochemistry 38:5995-6002 (1999); Kim, K. S., y colaboradores, FEBS Lett . 395:277-282 (1996) ) . CXC quimosinas por otra parte están más restringidas en su comportamiento de asociación y forman solo dímeros y tetrámeros (Clark-Lewis, I., y colaboradores, J. Leukocyte Biol . 57:703-711 (1995)). .2U_gunos de los residuos que se consideraban críticos para dimerización en base a las estructuras tuvieron poco o ningún efecto y por el contrario la mutación de los residuos remota de la interfase de dímero resulta en monómeros (Czaplewski, L. G., y colaboradores, J. Biol .

Chem. 2.74:16077-16084 (1999); Laurence, J. S., y colaboradores, Biochemistry 39:3401-3409 (2000); Paavola, C. D., y colaboradores, J". Biol . Chem. 2 73:33157-33165 (1998) ) . Claramente, una variedad de fuerzas estabilizantes o residuos que están separados en la secuencia primaria, juegan un papel para promover asociación de dímero y tetrámero.

Sin embargo, hay datos convincentes tanto para CXC y CC quimosinas que un monómero es suficiente para ligar y activar el receptor 7-TM en leucocitos. Se ha mostrado previamente al atrapar 3 quimosinas de activación de neutrófilo receptor (IL-8, NAP-2 y MGSA) en el estado monomérico, de manera tal que no puedan dimerizar, que el monómero es tan activo como la proteína nativa en los ensayos funcionales in vi tro (Rajarathnam, K., y colaboradores, Science 264:90-92 (1994); Rajarathnam, K. , y colaboradores, J". Biol . Chem. 272:1725-1729 (1997)). Similarmente, estudios de mutaciones en RANTES, MCP-1, MIP-1, y MIP-1 también han mostrado que el monómero es la especie de enlace de receptor (Czaplewski, L. G. , y colaboradores, ". Biol . Chem. 274:16077-16084 (1999); Laurence, J. S., y colaboradores, Biochemistry 39:3401-3409 (2000); Paavola, C. D., y colaboradores, J. Biol . Chem. 273:33157-33165 (1998) ) . Entonces surge la duda de exactamente cual es el papel, de haber de los dímeros y oligómeros de orden superior? Recientes estudios sugieren que este papel puede ser ligar a protoglicanos y establecer un gradiente de concentración, un proceso que es esencial para tráfico de leucocitos (Hoogewerf, A. J. , y colaboradores, Biochemistry 36:13570-13578 (1997); Koopmann, W. , y Krangel, M. S., J. Biol . Chem. 272: 10103-10109 (1997)).

Residuos que son críticos para enlace de protoglicanos son residuos básicos tales como arginina, lisina e histidina tanto en CXC y CC quimosinas y tienden a enjambrarse o agruparse y localizarse lejos de regiones que son críticas para unir a los receptores 7-TM. En este estudio, MPIF-1 no muestra ninguna propensión a formar dímeros en solución. El que MPIF-1 y otras quimosinas monoméricas 1-309 y HCC-2 dimerizan en presencia de proteoglicanos de sujperficie celular se está investigando. Una propiedad intrigante de quimosinas es la presencia de múltiples especies que se han procesado díferencialmente ya sea e el extremo N o C. Algunas quimosinas como MPIF-ly se secretan como grande precursores que se procesas proteolíticamente ya sea en el extremo N o C para producir una proteína funcional . NAP-2, -tromboglobulina (TG) , y proteína activante de tejido conectivo III (CTAP-III) son productos N-terminales de proteína básica de plaquetas (PBP= Platelet Basic Protein) y solo NAP-2 es un activador potente de neutrófilos mientras que los otros se consideran precursores inactivos. Todas las cuatro forman dímeros y tetrámeros (Yang, Y., y colaboradores, J. Biol . Chem. 269:20110-20118 (1994)); además, NAP-2 y CTAP-IIT, que se procesan diferencialmente en el extremo C, también se han aislado de cultivos celulares. (Ehlert, J. E., y colaboradores, J. Immunol . 161:4975-4982 (1998) ) . La región N-terminal de quimosinas funcionales consiste de aproximadamente 10 amino ácidos que preceden la primera cisteína conservada y estudios mutacionales han mostrado un papel esencial para estos residuos para unión de receptor y activación. CC quimosinas truncadas exhiben propiedades altamente diferenciales y no usuales (Clark-Lewis, I., y colaboradores, J". Leukocyte Biol . 57:703-711 (1995)). Por ejemplo en MCP-1, la eliminación de los primeros cuatro residuos resulta en una pérdida de actividad, mientras que la eliminación de los primeros cinco residuos resulta en recuperación substancial de actividad. Adicionales eliminaciones resultan en pérdida de función pero con una capacidad retenida para ligar el receptor y funcionar como antagonista (Gong, J.-H., y Clark-Lewis, I., ". Exp . Med. 181:631-640 (1995)).

Eliminación sucesiva en el extremo N de IL-8, una CXC quimosina resulta en actividad incrementada, pérdida de actividad y luego conversión a un antagonista (Moser, B., y colaboradores, J. Biol . Chem. 268:7125-7128 (1993)).

También se ha observado que el truncar residuos N- terminales precedentes a la primer cisteína en CC quimosinas favorecen la formación de monómeros y se ha sugerido que la longitud de los residuos N-terminales 5 juega un papel en dimerización. En forma alterna el lisado del gen MPIF-1 resulta en dos formas de proteína que son de 99 y 116 i amino ácidos respectivamente (denominadas CK 8 y CK 8-1 respectivamente) (Youn, B.-S., y colaboradores, Blood 10 91:3118-3126 (1998)). Esta observación es excepcional entre CC quimosinas ya que esta diferencia en longitud se encuentra en la región N-terminal (32 y 49 amino ácidos que preceden a la primer cisteína respectivamente) . Ambas ^formas de la proteína se mostró que tienen 15 actividad similar en inhibición de progenitor mieloide y quimiotaxia de monocitos. La expresión de la proteína de 99 amino ácidos en baculovirus resultó en tres formas de la proteína, de longitud completa y dos versiones truncadas. Las versiones truncadas se encontró que eran 20 más potentes tanto en ensayos de quimiotaxia de monocitos como inhibitorios de progenitor mieloide. Los datos para MPIF-1 y MPIF-1 de longitud íntegra bajo una variedad de condiciones de solución (Tabla 10) , indican que son monómeros y que no hay correlación entre la longitud de 25 los residuos N-terminales y la capacidad en formar dímeros. Las diferencias en potencia de las variantes de MPIF-1, como otras quimosinas, juega un papel in vivo, como el reclutamiento y activación de leucocitos se regula espacial y temporalmente. Un aspecto de activación de leucocitos es la liberación de peptidasas y proteasas que actúan en quimosinas y de esta manera modulan su actividad y función. Descripción de estructura y comparación con otras quimosinas . MPIF-1 adopta un doblez de quimosina típico de tres hebras- y una hélice- superpuesta. El núcleo de la estructura está bien definido que muestra el más bajo rmsd para la estructura principal y átomos pesados, parámetros de alto orden para , , y 1, la mayoría de las amidas de lento intercambio y aquellas que forman enlaces H entre hebras y aquellas en la hélice- . Varias estructuras de CC quimosina incluyen aquellas de MIP-1, RANTES, MCP-1, MCP-3, eotaxina, y HCC-1 se han elucidado (Lodi, P. J. , y colaboradores, Science 263: 1762-1767 (1994); Skelton, N. J., y colaboradores, Biochemistry 34:5329-5342 (1995); Handel , T. M., y Domaille, P. J., Biochemistry 35:6569-6584 (1996); Kim, K. S., y colaboradores, FEBS Lett . 395:277-282 (1996); Crump, M. y colaboradores, ". Biol . Chem . 273:22471-22479 (1998); Sticht, H., y colaboradores, Biochemistry 38:5995-6002 (1999)). Los elementos estructurales secundarios y terciarios de MPIF-1 son similares a los observados en las otras CC quimosinas (FIG. 61) aunque la identidad de secuencia entre MPIF-1 y otras CC quimosinas varía de "25 to 60 % (FIG. 62) . La superposición de la estructura principal de la región estructurada (residuos 11 a 66) de MPIF-1 y otras CC quimosinas muestran un rmsd de 1.5 a 2.0 Á. El más bajo rmsd se observa para las regiones estructuradas (las hebras y la hélice) y superiores rmsds se observan para los residuos N-terminales, bucle N-terminal y la vuelta 30s. La diferencia en secuencia más grande se observa para estas regiones de proteína y estas también son las regiones que están menos definidas relativamente son móviles y funcionalmente importantes. Además de las cuatro cisteínas (Cys-11, Cys-12, Cys-35, Cys-51), residuos Ile-13, Tyr-15, Ile-20 (bucle N-terminal) , Leu-25, Tyr-28, Phe-29, Thr-31 (1er. hebra) , Val-40, Ile-41, Phe-42, Thr-44 (2da. hebra), Phe-50, Ala-52 (3er. hebra), Val-59, Met-63 and Leu-66 (hélice -) ( numeración de acuerdo con la secuencia MPIF-1) se conservan o sustituyen en forma conservadora (FIG. 62) . La mayoría son hidrófobos voluminosos, localizados en cualquiera de las hebras o la hélice y adoptan la misma conformación de cadena lateral en diferentes estructuras y constituyen el andamio estructural. Thr-31 y Thr-44 son residuos polares que se entierran completamente y las estructuras revelan que los protones hidroxilo están ligados a H con los carbonilos de estructura principal a través de la hebra y por lo tanto juegan un papel estructural . Las estructuras revelan que el enlace disulfuro Cysl2-Cys51 adopta predominantemente una conformación espiral de sentido izquierdo. Datos de dinámica °N indican que algunas de las cisteínas y los residuos en la proximidad de todos los tres enlaces disulfuro muestran intercambio de conformación que ilustra que estas regiones de la proteína son móviles y se someten a intercambio de conformación. El enlace disulfuro Cysll-Cys35 muestra el movimiento de segmento más grande y se ha mostrado por ejemplo en IL-8, que sutiles perturbaciones al enlace disulfuro, resultan en pérdida de función significante sin cambios en la estructura (Rajarathnam, K. , y colaboradores, Biochemis try 38:7653-7658 (1999)). Se ha sugerido que la dinámica de la región N-terminal, el enlace disulfuro y la vuelta 30s juegan un papel integral en enlace y activación específicos (Clark-Lewis, I., y colaboradores, ".

Leukocyte Biol . 57:703-711 (1995)). MPIF-1 muestra la más alta homología de secuencia a HCC2 , y este último también tiene 6 cisteínas, se liga a CCRl, y es un inhibidor de proliferación de células de tallo. Una diferencia entre MPIF-1, HCC-2 y otras CC quimosinas es el residuo Trp en la posición 58 en todas las CC quimosinas además de MPIF-1, que tiene un Gln y HCC-2 que tiene Gly. Las estructuras MPIF- 1 y HCC-2 revelan que el volumen esférico de la cadena lateral indol estará en la ruta del enlace disulfuro. Además de los hidrófobos conservados, algunos de los residuos cargados también se conservan; Arg- 18 del bule N-terminal y Lys-45 y Arg-48 en la vuelta 4 Os se exponen a solvente y han sido implicados en ligar a los proteoglicanos cargados negativamente (Chakravarty, L., y colaboradores, ". Biol . Chem. . 273:29641-29647 (1998); Koopmann, W. , y colaboradores, J. Immunol . 163:2120-2127 (1999) ) . Sin embargo, la ubicación del dominio de unión-proteoglicano y la importancia relativa de los residuos cargados involucrados en la unión, varía de quimosina a quimosína. Residuos cargados en la hélice C-terminal de IL-8 (Kuschert, G. S. V., y colaboradores, Biochemistry 37: 11193 (1998)), PF-4 (Mayo, K. H. , y colaboradores, Biochem. J. 312:357-365 (1995)), y MCP-1 (Chakravarty, L. , y colaboradores, J. Biol . Chem. 273:29641-29647 (1998) ) , los residuos de la 1er hebra - en SDF-1 (Amara, A., y colaboradores, J". Biol . Chem. 27'4 : 23916-25 (1999)) y los residuos de la vuelta 40s y el bucle N-terminal en MIP-1 (Koopman, W. y Kvangel, M.S.., ". Biol . Chem. 272:10103-10109 (1997)) y MIP-1 (Koopmann, W. , y colaboradores, J. Inmuno 1 . 163:2120-2127 (1999)) han sido implicados en el enlace de proteoglicanos . MPIF- 1 es una proteína altamente básica y tiene residuos básicos adicionales en el bucle 40s (Lys-46) y en la hélice - (Lys-57, Arg-64, y Lys-67) que muestra que liga proteoglicanos más apretadamente (FIG. 63) . Es truc tura - función Activación de Monoci tos : MPIF-1 liga a CCRl con alta afinidad y se ha mostrado que es un activador potente de monocitos (Nardelli, B., y colaboradores, ".

Immunol . 162:435-444 (1999); Berkhout, T. A., y colaboradores, Biochem . Pharmacol . 59:591-596 (2000)).

MCP-3, RANTES, MIP-1 y HCC-2 también ligan y activan CCRl. Estudios de mutagénesis han indicado que los residuos N-terminales que preceden la primer cisteína y residuos del bucle N-terminal (entre la segunda cisteína y que preceden a la hélice 310) juegan papeles importantes en el enlace de receptor para ambas CXC y CC quimosinas (Clark-Lewis, I., y colaboradores, J. Leukocyte Biol . 57:703-711 (1995); Gong, J.-H., y Clark-Lewis, I., J. Ejxp . Med. 181:631-640 (1995); Moser, B., y colaboradores, 5 J". Biol . Chem. . 268:7125-7.128 (1993); Pakianathan, D. R. , y colaboradores, Biochemistry 36:9642-9648 (1997)). Se ha sugerido que los residuos de bucle N-terminal del ligando quimosina interactúan con los residuos N-terminal del receptor que constituye el sitio de desembarque 10 inicial . Esta interacción orienta en forma óptima los residuos N-terminal de ligando para interactuar con los residuos de receptor que evocan un cambio de conformación • y una respuesta funcional (Crump, M. P., y colaboradores, EMBO J. 16:6996-7007 (1997); Clark-Lewis, I., y 15 colaboradores, ". Leukocyte Biol . 57 :703-711 (1995)). En la estructura MPIF-1 los residuos de bucle N-terminal están bien definidos (S para , , > 0.95) y adopta una conformación única. Los datos de dinámicas 15N por otra parte, indican que esta región de la proteína es "^ 20 relativamente móvil y muestra fluctuaciones en el intercambio de conformación y subnanosegundo en la escala de tiempo de milisegundos más lenta. Una observación similar se ha realizado en eotaxina (Crump, M. P., y colaboradores, Protein Sci . 8:2041-2054 (1999); Ye, J. , y colaboradores, ". Biomol . RMN 15:115-124 (1999)), en vMIPII, una CC quimosina monomérica viral que liga múltiples receptores CXC y CC quimosina (LiWang, A. C, y colaboradores, Biochemistry 38:442-4*53 (1999)) y en fractalcina, una CX3C quimosina monomérica (Mizoue, L. S., y colaboradores, Biochemistry 38: 1402- 1414 (1999)).

El dominio de bucle N-terminal es adyacente y próximo a todos los tres enlaces disulfuro. .Análisis de secuencia también revela que residuos que corresponden a Ile-13, Tyr-15, Arg-18 y Ile-20 (numeración de acuerdo con MPIF-l) , se conservan o substituyen similarmente en otras CC quimocinas y mutagénesis de estos residuos resulta en el enlace reducido a sus receptores respectivos. lie-13, el primer residuo después de la segunda cisteína está expuesto a solvente en todas las CXC y CC quimosinas y más probablemente juega un papel directo en activación de receptores. En RANTES, la importancia de los residuos de bucle N-terminal se observa como específica de receptor: Arg-17 fue necesaria para ligar a CCRl, Phe-12 para ligar a CCR3 , Phe- 12 y Ile-15 para ligar a CCR5 (Pakianathan, f D. R. , y colaboradores, Biochemistry 36:9642-9648 (1997) ) . En la mayoría de las estructuras, Tyr-15 y Ile-20 están enterradas y adoptan una conformación similar y se empacan entre otros residuos hidrofóbicos indicando un papel estructural . Estas observaciones muestran que MPIF-1, Ile-13 y Arg-18 juegan un papel funcional y están involucradas directamente en el enlace 5 receptor y Tyr- 15 y Ile-20 funcionan como parte del andamio estructural . La estructura RMN y los datos de dinámica de (j^ MPIF-1 indican que los residuos N-terminal precedentes a la primer cisteína, no están estructurados. Una 10 observación similar se ha realizado en todas las estructuras RMN monoméricas y estructurs CXC diméricas que muestran que la movilidad de estos residuos es esencial para interacción óptima con el receptor. Todas ^ las CXC quimosinas que activan neutrófilos tienen la 15 secuencia 'ELR' característica que preceden a la primer cisteína que es esencial para ligar y activar (Clark-Lewis, I., y colaboradores, ". Leukocyte Biol . 57:703-711 (1995)). Esta secuencia de firma está ausente para CC quimosinas y el análisis de secuencia no 20 proporciona ninguna percepción para especificidad de j receptor. Además, CC quimosinas muestran un perfil de receptor-ligando complejo. La mayoría de CC quimosinas que activan monocitos, macrófagos, eosinófilos y receptores múltiples de unión y células T, ligan 25 múltiples receptores y la mayoría de los receptores ligan múltiples quimosinas. Por otra parte, un ejemplo de unión de ligando a solo un receptor sencillo, se conoce (LARC y CCR6) . Los residuos N-terminales de MPIF-1 muestran muy pequeña o ninguna similaridad con otras CC quimosinas que ligan CCRl (HCC-2, MCP-3, RANTES y MIP-1) . HCC-2 muestra la homología de secuencia total más alta a MPIF-1 (~60 %) pero ninguna en el extremo N. Recientes estudios de función-estructura en RANTES, que ligan múltiples receptores además de CCRl, mostraron respuesta específica de receptor al utar ciertos residuos N-terminales; Pro-2, Asp-6, y Thr-7 fueron esenciales para ligar a CCRl; Pro-2 y Tyr-3 para ligar a CCR3 ; y Tyr-3 y Asp-6 para ligar a CCR5. Ninguno de los residuos N-terminales son idénticos entre MPIF-1 y RANTES y solo un residuo se sustituye en forma conservadora (Tyr-3 en RANTES y Phe-4 en MPIF-1) . Tyr-3 muestra que juega un papel esencial en RANTES para ligar al CCR3 y si MPIF-1 puede ligar a CCR3 queda por probar. De manera interesante, se ha mostrado recientemente que la longitud de los residuos N-terminales y no la naturaleza de la cadena lateral, es crítica para unión de MCP-1 con CCR2 (Jarnagin, y colaboradores, Biochemistry 38: 16167- 16177 (1999) ) .

Supresión de Proliferación de Células Progeni toras . Todas las versiones de MPIF-1 se mostró que suprimen proliferación de célula progenitora y se observó que las versiones truncadas eran más potentes en su inhibición que las proproteínas. Notablemente, CC y CXC quimosinas tales como MIP-1, IL-8, GRO-, PF-4, IP-10, y MCP-1 se ha mostrado que suprimen proliferación de células progenitoras mientras que quimosinas relacionadas tales como GRO-, NAP-2, MIP-1 y RANTES no son supresoras. El perfil de quimosina muestra que la capacidad en modular proliferación de células progenitoras no se relaciona a activación de sus receptores quimosina específicos. Adicionalmente, una forma monomérica de MIP-l es significativamente más potente que versiones agregadas de la proteína nativa (Czaplewski, L. G., y colaboradores, J". Biol . Chem . . 274: 16077-16084 (1999)) y MPIF-1 puede actuar en forma monomérica. Estos estudios de la base molecular de la función de MPIF-1 tienen implicaciones clínicamente relevantes para pacientes con diversas enfermedades tales como pacientes que se someten a quimioterapia. Será claro que la invención puede practicarse de otra forma a como se describe particularmente en las descripciones y ejemplos anteriores.

Numerosas modificaciones y variaciones de la presente invención son posibles a la luz de las enseñanzas anteriores y por lo tanto están dentro del alcance de las reivindicaciones anexas . La descripción de todas las patentes, solicitudes de patentes y publicaciones aquí referidas aquí se incorporan por referencia. La descripción de la solicitud de patente de los E.U.A. No. 08/941,020, presentada en septiembre 30, 1997, aquí se incorpora por referencia completamente.

- LISTADO DE SECUENCIAS <110> Grzegorzewski, Krzysztof J. Rosen, Craig A. Patel, Vikra <120> Métodos para Tratar o Prevenir Daño en Células, Tejidos y Órganos Utilizando el Factor Inhibitorio Progenitor de Mieloide-1 (MPIF-1) Humano <130> 1488.033PC0P <150> US 60/159,362 <151> 1399-10-14 <150> US 60/164,059 <151> 1999-11-08 <150> US 60/172,063 <151> 1999-12-23 <150> US 60/189,048 <151> 2000-03-14 <150> US 60/199,142 <151> 2000-04-24 <150> US 60/211,458 <151> 2000-06-13 <150> US 60/212,658 <151> 2000-06-19 <160> 42 <170> Patentln versión 3.0 <210> 1 <211> 363 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1) .. (360) <400> 1 - - atg aag gtc tec gtg gct gcc etc tec tgc etc atg ctt gtt act gcc 48 Met Lys Val Ser Val Ala Ala Leu Ser Cys Leu Met Leu Val Thr Ala 1 5 10 15 ctt gga tec cag gcc cgg gtc acá aaa gat gca gag acá gag ttc atg 96 Leu Gly Ser Gln Ala Arg Val Thr Lys Asp Ala Glu Thr Glu Phe Met 20 25 30 atg tea aag ctt cea ttg gaa aat cea gta ctt ctg gac aga ttc cat 144 Met Ser Lys Leu Pro Leu Glu Asn Pro Val Leu Leu Asp Arg Phe His 35 40 45 gct act agt gct gac tgc tgc ate tec tac acc cea cga age ate ccg 192 Ala Thr Ser Ala Asp Cys Cys He Ser Tyr Thr Pro Arg Ser He Pro 50 55 60 ggt tea etc ctg gag agt tac ttt gaa acg aac age gag tgc tec aag 240 Gly Ser Leu Leu Glu Ser Tyr Phe Glu Thr Asn Ser Glu Cys Ser Lys 65 70 75 80 ccg ggt gtc ate ttc etc acc aag aag ggg cga cgt ttc tgt gcc aac 288 Pro Gly Val He Phe Leu Thr Lys Lys Gly Arg Arg. Phe Cys Ala Asn 85 90 95 ccc agt gat aag caá gtt cag gtt tgc atg aga atg ctg aag ctg gac 336 Pro Ser .Asp Lys Gln Val Gln Val Cys Met Arg Met Leu Lys Leu Asp 100 105 110 acá cgg ate aag acc agg aag aat tga 363 Thr .Arg lie Lys Thr Arg Lys Asn 115 120 <210> 2 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Lys Val Ser Val Ala Ala Leu Ser Cys Leu Met Leu Val Thr Ala 1 5 10 15 Leu Gly Ser Gln Ala Arg Val Thr Lys Asp Ala Glu Thr Glu Phe Met 20 " 25 30 Met Ser Lys Leu Pro Leu Glu Asn Pro Val Leu Leu Asp Arg Phe His 35 40 ' 45 Ala Thr Ser Ala Asp Cys Cys íle Ser Tyr Thr Pro Arg Ser He Pro 50 55 60 Gly Ser Leu Leu Glu Ser Tyr Phe Glu Thr Asn Ser Glu Cys Ser Lys 65 70 75 80 Pro Gly Val He Phe Leu Thr Lys Lys Gly Arg Arg Phe Cys Ala Asn 85 90 95 Pro Ser Asp Lys Gln Val Gln Val Cys Met Arg Met Leu Lys Leu Asp 100 105 110 Thr Arg He Lys Thr Arg Lys Asn 115 120 <210> 3 <211> 100 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Arg Val Thr Lys Asp Ala Glu Thr Glu Phe Met Met Ser Lys Leu 1 5 10 15 Pro Leu Glu Asn Pro Val Leu Leu Asp Arg Phe His Ala Thr Ser Ala 20 25 30 Asp Cys Cys He Ser Tyr Thr Pro Arg Ser He Pro Cys Ser Leu Leu 35 40 45 Glu Ser Tyr Phe Glu Thr Asn Ser Glu Cys Ser Lys Pro Gly Val He 50 55 60 Phe Leu Thr Lys Lys Gly Arg Arg Phe Cys Ala Asn Pro Ser Asp Lys 65 70 75 80 Gln Val Gln Val Cys Met Arg Met Leu Lys Leu Asp Thr Arg He Lys 85 90 95 Thr Arg Lys Asn 100 <210> 4 <211> 76. <212> PRT . <213> Homo sapiens <400> 4 - Met Arg Phe His Ala Thr Ser Ala Asp Cys Cys He Ser Tyr Thr Pro 1 5 10 15 Arg Ser He Pro Cys Ser Leu Leu Glu Ser Tyr Phe Glu Thr Asn Ser 20 25 30 Glu Cys Ser Lys Pro Gly Val He Phe Leu Thr Lys Lys Gly Arg Arg 35 40 45 Phe Cys Ala Asn Pro Ser Asp Lys Gln Val Gln Val Cys Met Arg Met 50 55 60 Leu Lys Leu Asp Thr Arg He Lys Thr Arg Lys Asn 65 70 75 <210> 5 <211> 78 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 His Ala Ala Gly Phe His Ala Thr Ser Ala Asp Cys Cys He Ser Tyr 1 5 10 15 Thr Pro Arg Ser He Pro Cys Ser Leu Leu Glu Ser Tyr Phe Glu Thr 20 25 30 Asn Ser Glu Cys Ser Lys Pro Gly Val He Phe Leu Thr Lys Lys Gly 35 40 45 Arg Arg Phe Cys Ala Asn Pro Ser Asp Lys Gln Val Gln Val Cys Met 50 55 60 Arg Met Leu Lys Leu Asp Thr Arg He Lys Thr Arg Lys Asn 65 70 75 <210> 6 <211> 599 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (35) .. (445) <400> 6 gtcctccggc cagccctgcc tgcccaccag gagg atg aag gtc tec gtg gct gcc 55 Met Lys Val Ser Val Ala Ala 1 5 etc tec tgc etc atg ctt gtt act gcc ctt ggc tec cag gcc cgg gtc 103 Leu Ser Cys Leu Met Leu Val Thr Ala Leu Gly Ser Gln Ala Arg Val 10 15 20 acá aaa gat gca gag acá gag ttg acg atg tea a g- ctt cea ttg gaa 151 Thr Lys Asp Ala Glu Thr Glu Leu Thr Met Ser Lys Leu Pro Leu Glu 25 30 35 aat cea gta ctt ctg gac atg etc tgg agg aga aag; att ggt cct cag 199 Asn Pro Val Leu Leu Asp Met Leu Trp Arg Arg Lys He Gly Pro Gln 40 45 50 55 atg acc ctt tet cat gcc gca gga ttc cat gct act agt gct gac tgc 247 Met Thr Leu Ser His Ala Ala Gly Phe His Ala Thr Ser Ala Asp Cys 60 65 70 tgc atg tec tac acc cea cga age ate ccg tgt tea. etc ctg gag agt 295 Cys Met Ser Tyr Thr Pro Arg Ser He Pro Cys Ser Leu Leu Glu Ser 75 80 85 tac ttt gaa acg aac age gag tgc tec aag ccg ggt gtc ate ttc etc 343 Tyr Phe Glu Thr Asn Ser Glu Cys Ser Lys Pro Gly Val He Phe Leu 90 95 100 acc aag aag ggg cga cgt ttc tgt gcc aac ccc agt gat aag caá gtt 391 Thr Lys Lys Gly Arg Arg Phe Cys Ala Asn Pro Ser Asp Lys Gln Val 105 110 115 cag gtt tgc atg aga atg ctg aag ctg gac acá cgg ate aag acc agg 439 Gln Val Cys Met Arg Met Leu Lys Leu Asp Thr Arg He Lys Thr Arg 120 125 130 135 aag aat tgaacttgtc aaggtgaagg ggacacaagt tgccagccac caactttctt 495 Lys Asn gcctcaacta acttcctgaa ttettttttt aagaagcatt tattcttgtg ttctggattt 555 agageaatte atcttttctc acctttaaaa aaaaaaaaaa aaaa 599 <210> 7 <211> 137 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Met Lys Val Ser Val Ala Ala Leu Ser Cys Leu Met Leu Val Thr Ala 1 5 10 _ 15 Leu Gly Ser Gln Ala Arg Val Thr Lys Asp Ala Glu Thr Glu Leu Thr 20 25 30 Met Ser Lys Leu Pro Leu Glu Asn Pro Val Leu Leu Asp Met Leu Trp 35 40 45 Arg Arg Lys He Gly Pro Gln Met Thr Leu Ser His Ala Ala Gly Phe 50 55 60 His Ala Thr Ser Ala Asp Cys Cys Met Ser Tyr Thr Pro Arg Ser He 65 70 75 80 Pro Cys Se.r Leu Leu Glu Ser Tyr Phe Glu Thr .Asn Ser Glu Cys Ser 85 90 95 Lys Pro Gly Val He Phe Leu Thr Lys Lys Gly Arg Arg Phe Cys Ala 100 105 110 Asn Pro Ser Asp Lys Gln Val Gln Val Cys Met Arg Met Leu Lys Leu 115 120 125 Asp Thr Arg He Lys Thr Arg Lys Asn 130 135 <210> 8 <211> 26 <212> ADN <213> Primer <400> 8 tcaggatccg tcacaaaaga tgcaga 26 <210> 9 <211> 26 '<212> .ADN <213> Primer <400> 9 cgctctagag taaaacgacg gccagt 26 <210> 10 <211> 27 <212> ADN <213> Primer <400> 10 cccgcatgcg ggtcacaaaa gatgcag 27 <210> 11 <211> 27 <212> ADN <213> Primer <400> 11 aaaggatcct caattcttcc tggtctt 27 <210> 12 <211> 48 <212> ADN <213> Primer <400> 12 acatgcatgc guguuaccaa agacgcugaa accgaauuca ugaugucc 48 <210> 13 <211> 36 <212> ADN <213> Primer <400> 13 gcccaagctt tcagttttta cgggttttga taeggg 36 <210> 14 <211> 88 <212> ADN - <213> Primer <400> 14 gcatgcgugu uaccaaagac gcugaaaccg aaüücaugau guccaaacug ccgcuggaaa 60 acccgguucu gcuggaccgu uuccacgc <210> 15 <211> 104 <212> ADN <213> Primer <400> 15 gcuggaaucc uacuucgaaa ccaacuccga augcuccaaa ccggguguua ucuuccugac 60 ca.a'Saaaggu cgucguuucu gcgcuaaccc guccgacaaa cagg 104 <210> 16 <211> 89 <212> ADN <213> Primer <400> 16 aagctttcag tttttacggg tgggcagacg ggtgtccagt ttcagcatac geatacaaac 60 ctgaacctgt ttgtcggacg gcttagcgc 89 <210> 17 <211> 94 <212> ADN <213> Primer <400> 17 ggtttcgaag taggattcca gcagggagca cgggatggaa cgcggggtgt aggagatgea 60 gcagtcagcg gaggtagcgt ggaaacggtc cage 94 <210> 18 <211> 32 <212> ADN <213> Primer <400> 18 gcgcagccat ggaaaacccg gttctgctgg ac 32 <210> 19 <211> 83 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Met Glu Asn Pro Val Leu Leu Asp Arg Phe His Ala Thr Ser Ala Asp 1 5 10 15 Cys Cys He Ser Tyr Thr Pro Arg Ser He Pro Cys Ser Leu Leu Glu 20 25 30 Ser Tyr Phe Glu Thr Asn Ser Glu Cys Ser Lys Pro Gly Val He Phe 35 40 -45 Leu Thr Lys Lys Gly Arg Arg Phe Cys Ala Asn Pro Ser Asp Lys Gln 50 55 60 Val Gln Val Cys Met Arg Met Leu Lys Leu Asp Thr Arg He Lys Thr 65 70 75 80 Arg Lys Asn <210> 20 <211> 35 <212> ADN <213> Primer <400> 20 gccatggcat gctggaaaac ccggttctgc tggac 35 <210> 21 <211> 84 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Met Leu Glu Asn Pro Val Leu Leu Asp Arg Phe His Ala Thr Ser Ala 1 5 10 15 Asp Cys Cys He Ser Tyr Thr Pro Arg Ser He Pro Cys Ser Leu Leu 20 25 __ 30 Glu Ser Tyr Phe Glu Thr Asn Ser Glu Cys Ser Lys Pro Gly Val He 35 40 45 Phe Leu Thr Lys Lys Gly Arg Arg Phe Cys Ala Asn Pro Ser Asp Lys 50 55 60 Gln Val Gln Val Cys Met Arg Met Leu Lys Leu Asp Thr Arg He Lys 65 70 75 80 Thr Arg Lys Asn <210> 22 <211> 32 <212> .ADN <213> Primer <400> 22 gcgcagccat ggaccgtttc cacgctacct ce 32 <210> 23 <211> 77 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Met Asp Arg Phe His Ala Thr Ser Ala Asp Cys Cys He Ser Tyr Thr 1 5 '. 10 15 Pro Arg Ser He Pro Cys Ser Leu. Leu Glu Ser Tyr Phe Glu Thr Asn 20 ' 25 30 Ser Glu Cys Ser Lys Pro Gly Val He Phe Leu Thr Lys Lys Gly Arg 35 40 ' 45 Arg Phe Cys Ala Asn Pro Ser Asp Lys Gln Val Gln Val Cys Met Arg 50 55 60 Met Leu Lys Leu Asp Thr Arg He Lys Thr Arg Lys Asn 65 70 75 <210> 24 <211> 29 <212> ADN <213> Primer <400> 24 • gccatggcat gcgtttccac gctacctcc 29 10 <210> 25 <211> 32 <212> ADN <213> Primer <40Q> 25 15 gcgcagccat ggctacctcc gctgactgct ge 32 <210> 26 <211> 73 <212> PRT <213> Homo sapiens 20 <400> 26 # Met Ala Thr Ser Ala Asp Cys Cys He Ser Tyr Thr Pro Arg Ser He 1 5 10 15 Pro Cys Ser Leu Leu Glu Ser Tyr Phe Glu Thr Asn Ser Glu Cys Ser 20 ' 25 30 Lys Pro Gly Val He Phe Leu Thr Lys Lys Gly Arg Arg Phe Cys Ala 35 40 45 25 Asn Pro Ser Asp Lys Gln Val Gln Val Cys Met Arg Met Leu Lys Leu 50 55 60 - Asp Thr Arg He Lys Thr Arg Lys Asn 65 70 <210> 27 <211> 21 <212> ADN <213> Primer <400> 27 ttcgaagtag gcttccagca g 21 <210> 28 <211> 21 <212> ADN <213> Primer <400> 28 ctgctggaag cctacttcga a 21 <210> 29 <211> 35 <212> ADN <213> Primer <400> 29 gccatggcat gcgtgttacc aaagacgctg aaacc 35 <210> 30 <211> 100 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 - - Met Arg Val Thr Lys Asp Ala Glu Thr Glu Phe Met Met Ser Lys Leu 1 5 10 15 - - Pro Leu Glu Asn Pro Val Leu Leu Asp Arg Phe His Ala Thr Ser Ala 20 25 30 Asp Cys Cys He Ser Tyr Thr Pro Arg Ser He Pro Cys Ser Leu Leu 35 40 45 Glu Ala Tyr Phe Glu Thr Asn Ser Glu Cys Ser Lys Pro Gly Val He 50 55 60 Phe Leu Thr Lys Lys Gly Arg Arg Phe Cys Ala Asn Pro Ser Asp Lys 65 70 75 80 Gln Val Gln Val Cys Met Arg Met Leu Lys Leu Asp Thr Arg He Lys 85 90 95 Thr Arg Lys Asn 100 <210> 31 <211> 36 <212> .ADN <213> Primer <40D> 31 gcccaagctt tcagttttta cgggttttga taeggg 36 <210> 32 <211> 27 <212> ADN <213> Primer <400> 32 ggaaagctta tgaaggtctc cgtggct 27 <210> 33 <211> 59 <212> ADN <213> Primer <400> 33 cgctctagat caagegtagt ctgggacgtc gtatgggtaa ttcttcctgg tcttgatcc 59 - <210> 34 <211> 33 <212> ADN <213> Primer <400> 34 aaaggatccg ccaccatgaa ggtctccgtg gtc 33 <210> 35 <211> 27 <212> ADN <213> Primer • <400> 35 10 aaaggatcct caattcttcc aggtctt 27 <210> 36 <211> 92 <212> PRT <213> Homo sapiens 15 <400> 36 Met Gln Val Ser Thr Ala Ala Leu Ala Val Leu Leu Cys Thr Met Ala 1 5 10 15 Leu Cys Asn Gln Phe Ser Ala Ser Leu Ala Ala Asp Thr Pro Thr Ala 20 25 30 20 Cys Cys Phe Ser Tyr Thr Ser Arg Gln He Pro Gln Asn Phe He Ala y Val He Phe 50 55 60 Leu Thr Lys Arg Ser Arg Gln Val Cys Ala Asp Pro Ser Glu Glu Trp 65 70 75 80 Val Gln Lys Tyr Val Ser Asp Leu Glu Leu Ser Ala 85 90 25 <210> 37 <211> 4208 - <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 37 aagettaaaa aactgcaaaa aatagtttga cttgtgagcg gataacaatt aagatgtacc 60 caattgtgag cggataacaa ttteacacat taaagaggag aaattacata tggaccgttt 120 ccacgctacc tccgctgact gctgcatctc ctacaccccg cgttccatcc cgtgctcgct 180 gctggaatcc tacttcgaaa ccaactccga atgctccaaa ccgggtgtta tcttcctgac 240 caaaaaaggt cgtcgtttct gcgctaaccc gtccgacaaa caggttcagg tttgtatgcg 300 tatgctgaaa ctggacaccc gtatcaaaac ccgtaaaaac tgataaggta cctaagtgag 360 tagggcgtcc gatcgacgga cgcctttttt ttgaattcgt aatcatggtc atagctgttt 420 cctgtgtgaa attgttatcc getcacaatt ccacacaaca tacgagccgg aagcataaag 480 tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc taaetcacat taattgcgtt gcgctcactg 540 cccgctttce agtcgggaaa cctgtcgtgc cagetgeatt aatgaatcgg ccaacgcgcg 600 gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc 660 tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc 720 aeagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg 780 aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tcx^gcccccc tgacgagcat 840 cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag 900 gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga 960 tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg 1020 tatetcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt 1080 cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac 1140 gaettatege cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc 1200 ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag aacagtattt 1260 ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc 1320 ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc 1380 agaaaaaaag gatetcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg 1440 aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat cgtcgacaat tcgcgcgcga 1500 aggcgaagcg gcatgcattt acgttgacac categaatgg tgcaaaacct ttcgcggtat 1560 ggcatgatag cgcccggaag agagtcaatt cagggtggtg aatgtgaaac cagtaacgtt 1620 atacgatgtc gcagagtatg ccggtgtctc ttatcagacc gtttcccgcg tggtgaacca 1680 ggccagccac gtttctgcga aaacgcggga aaaagtggaa gcggcgatgg cggagctgaa 1740 ttacattccc aaccgcgtgg cacaacaact ggcgggcaaa cagtcgttgc tgattggcgt 1800 tgccacctcc agtctggccc tgcacgcgcc gtcgcaaatt gtcgcggcga ttaaatctcg 1860 cgccgatcaa ctgggtgcca gcgtggtggt gtcgatggta gaacgaagcg gcgtcgaagc 1920 ctgtaaagcg gcggtgcaca atcttctcgc gcaacgcgtc agtgggctga tcattaacta 1980 tccgctggat gaccaggatg ccattgctgt ggaagctgcc tgcactaatg ttccggcgtt 2040 atttettgat gtctctgacc agacacccat caacagtatt attttctccc atgaagacgg 2100 tacgcgactg ggcgtggagc atctggtcgc attgggtcac cajcaaatcg cgctgttagc 2160 gggcccatta agttctgtct cggcg?gtct gcgtctggct ggctggcata aatatetcae 2220 tcgcaatcaa attcagccga tagcggaacg ggaaggcgac tggagtgcca tgtccggttt 2280 tcaacaaacc atgcaaatgc tgaatgaggg catcgttccc actgcgatgc tggttgccaa 2340 cgatcagatg gcgctgggcg caatgcgcgc cattacegag tccgggctgc gcgttggtgc 2400 ggatatctcg gtagtgggat aegaegatac egaagacage tcatgttata tcccgccgtt 2460 aaccaccatc aaacaggatt ttcgcctgct ggggcaaacc agcgtggacc gcttgctgca 2520 actctctcag ggccaggcgg tgaagggcaa tcagctgttg cccgtctcac tggtgaaaag 2580 aaaaacca.cc ctggcgccca atacgcaaac cgcctctccc cgcgcgttgg cegatteatt 2640 aatgcagctg gcacgacagg tttcccgact ggaaagcggg cagtgagcgc aacgcaatta 2700 atgtaagtta gcgcgaattg tcgaccaaag cggccatcgt gcctccccac tcctgcagtt 2760 cgggggcatg gatgcgcgga tagccgctgc tggtttcctg gatgccgacg gatttgcact 2820 gccggtagaa ctccgcgagg tcgtccagcc tcaggcagca gctgaaccaa ctcgcgaggg 2880 gatcgagccc ggggtgggcg aagaacteca gcatgagatc cccgcgctgg aggatcatcc 2940 agccggcgtc ccggaaaacg attccgaagc ccaacctttc atagaaggcg gcggtggaat 3000 cgaaatctcg tgatggcagg ttgggcgtcg cttggtcggt catttegaac cccagagtcc 3060 cgctcagaag aactcgtcaa gaaggcgata gaaggcgatg cgctgcgaat cgggagcggc 3120 gataccgtaa agcacgagga agcggtcagc ccattcgccg ccaagctctt cageaatate 3180 acgggtagcc aacgctatgt cctgatagcg gtccgccaca cccagccggc cacagtcgat 3240 gaatccagaa aagcggccat tttccaccat gatattcggc aagcaggcat cgccatgggt 3300 cacgacgaga tcctcgccgt cgggcatgcg cgccttgagc ctggcgaaca gttcggctgg 3360 cgcgagcccc tgatgctctt cgtccagatc atcctgatcg acaagacegg cttccatccg 3420 agtacgtgct cgctcgatgc gatgtttcgc ttggtggtcg aatgggcagg tagccggatc 3480 aagcgtatgc agccgccgca ttgeatcage catgatggat actttctcgg caggagcaag 3540 gtgagatgac aggagatcct gccccggcac ttcgcccaat ageagecagt cccttcccgc 3600 ttcagtgaca acgtcgagca cagctgcgca aggaacgccc gtcgtggcca gccacgatag 3660 ccgcgctgcc tcgtcctgca gttcattcag ggcaccggac aggtcggtct tgacaaaaag 3720 aaccgggcgc ccctgcgctg acagecggaa cacggcggca teagageage cgattgtctg 3780 ttgtgcccag tcatagccga atagcctctc cacccaagcg gccggggaac ctgcgtgcaa 3840 tccatcttgt tcaatcatgc gaaacgatcc tcatcctgtc tcttgatcag atcttgatcc 3900 cctgcgccat cagatccttg gcggcaagaa agccatccag tttactttgc agggcttccc 3960 aaccttacca gagggcgccc cagctggcaa ttccggttcg cttgctgtcc ataaaaccgc 4020 ccagtctagc tategecatg taagcccact gcaagctacc tgctttctct ttgcgcttgc 4080 gttttccctt gtccagatag cccagtagct gacatteate cggggtcagc acagtttctg 4140 cggactggct ttctacgtgt tccgcttcct ttagcagccc ttgcgccctg agtgcttgcg 4200 gcagcgtg 4208 <210> 38 <211> 112 - <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 38 aagettaaaa aactgcaaaa aatagtttga cttgtgagcg gataacaatt aagatgtacc 60 caattgtgag cggataicaa ttteacacat taaagaggag aaattacata tg 112 <210> 39 <211> 74 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39 Met His .Ala Thr Ser Ala Asp Cys Cys He Ser Tyr Thr Pro Arg Ser 1 5 10 15 He Pro Cys Ser Leu Leu Glu Ser Tyr Phe Glu Thr Asn Ser Glu Cys 20 25 30 Ser Lys Pro Gly Val He Phe Leu Thr Lys Lys Gly Arg Arg Phe Cys 35 40 45 Ala Asn Pro Ser Asp Lys Gln Val Gln Val Cys Met Arg Met Leu Lys 50 55 60 Leu Asp Thr Arg He Lys Thr Arg Lys Asn 65 70 <210> 40 <211> 79 <212> , PRT <213> Homo sapiens <400> 40 Met His .Ala Ala Gly Phe His Ala Thr Ser Ala Asp Cys Cys Met Ser 1 5 10 15 Tyr Thr Pro Arg Ser He Pro Cys Ser Leu Leu Glu Ser Tyr Phe Glu 20 25 30 Thr Asn Ser Glu Cys Ser Lys Pro Gly Val He Phe Leu Thr Lys Lys 35 40 45 Gly Arg Arg Phe Cys Ala Asn Pro Ser Asp Lys Gln Val Gln Val Cys 50 55 60 - Met ?xg Met Leu Lys Leu Asp Thr Arg He Lys Thr Arg Lys Asn 65 70 75 <210> 41 <211> 85 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41 Met Pro Gln Met Thr Leu Ser His Ala Ala Gly Phe His Ala Thr Ser 1 5 10 15 Ala Asp Cys Cys Met Ser Tyr Thr Pro Arg Ser He P?;o Cys Ser Leu 20 25 30 Leu Glu Ser Tyr Phe Glu Thr Asn Ser Glu Cys Ser Lys Pro Gly Val 35 40 45 He Phe Leu Thr Lys Lys Gly Arg Arg Phe Cys Ala Asn Pro Ser Asp 50 55 60 Lys Gln Val Gln Val Cys Met Arg Met Leu Lys Leu Asp Thr Arg He 65 70 75 80 Lys Thr Arg Lys Asn 85 <210> 42 <211> 733 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 42 gggatccgga gcccaaatct tetgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg 60 aattcgaggg tgcaccgtca gtcttcctct tccceccaaa acccaaggac accctcatga 120 tctcccggac tcctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt aagccacgaa gaccctgagg 180 tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgecaagaca aagccgcggg 240 aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact 300 ggetgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca acccccatcg 360 agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accetgcccc 420 catcccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct 480 atecaagega catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga 540 - ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg 600 acaagageag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgacgcat gaggctctgc 660 acaaccacta caegeagaag agcctctccc tgtctccggg taaatgagtg cgacggccgc 720 gactetagag gat 733

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método para tratar o evitar daño a células inducido por agente citotóxico, que comprende administrar a un individuo, una cantidad efectiva del polipéptido de ID de SEC NO. : 2 o una variante o fragmento activo del mismo, en donde las células se eligen del grupo que consiste de: (a) células de tejido conectivo, excepto por células de tallo de médula ósea, células hematopoyéticas y células progenitoras multipotenciales; (b) células epiteliales; (c) células de músculo; y (d) células del sistema nervioso. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las células de tejido conectivo se eligen del grupo que consiste de: células de sistema esquelético, osteoblastos, osteoclastos, osteocitos, condrocitos, células adiposas, células periósteas, células endósteas odontoblastos, células de la sangre, eritrocitos, leucocitos, eosinófilos, basófilos, neutrófilos, limfocitos, monocitos, trombocitos, macrófagos de tejido, fagocitos específicos de órgano, linfocitos-B, linfocitos-T, megaloblastos, monoblastos, mieloblastos , linfoblastos, proeri troblastos , megacarioblas tos , promonocitos , promielocitos , prolinfocitos, normoblastos anteriores, megacariocitos, normoblastos intermedios, metamielocitos, y normoblastos posteriores. * <? t 1 780 3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el individuo se somete a terapia que extermina células divisoras . . El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la terapia se elige de quimioterapia, terapia de radiación o radioterapia dirigida o de objetivo. 5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el individuo se somete a exposición ocupacional o accidental a agentes citotóxicos . 6. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el polipéptido se administra antes de la terapia. 7. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el polipéptido se administra durante la terapia. 8. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el polipéptido se administra después de la terapia. 9. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el polipéptido se administra antes de la exposición. 10. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el polipéptido se administra durante la exposición. 11. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el polipéptido se administra después de la exposición. 12. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la terapia es ?ß radioterapia dirigida. 10 13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la radioterapia dirigida es radio-inmunoterapia. 14. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el individuo se 15 somete a exposición no intencional a agentes citotóxicos. 15. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el agente citotóxico es radiación. 16. El método de conformidad con la 20 reivindicación 15, caracterizado porque el polipéptido se administra antes de la exposición. 17. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el polipéptido se administra durante la exposición. 18. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el polipéptido se administra después de la exposición. 19. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la radiación se debe a una explosión nuclear. 20. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el individuo tiene necesidad por protección contra o tratamiento por enfermedad de radiación o quemaduras por radiación. 21. Un método para inhibir proliferación de células de leucemia, que comprende administrar una cantidad efectiva del polipéptido de ID de SEC. NO. : 2 o una variante o fragmento activo del mismo, en donde el polipéptido, variante o fragmento se conjuga a una porción terapéutica. 22. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque la porción terapéutica es un radio-isótopo.